CN104894282A - 检测转基因玉米cbh351的引物、试剂盒和方法 - Google Patents

检测转基因玉米cbh351的引物、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测转基因玉米CBH351的引物、试剂盒和方法，引物：ZeinF：TTATGCTCCTTGGTCTTT；下游引物ZeinR：GTAATAGGGCTGATGATTG；上游引物CBH351F：TATGTTACTAGATCGCAGAT；下游引物CBH351R：AAGGTCCAATAGTGTATGT。试剂盒：HRM反应预混液10μL；引物0.2-3.4μL；DNA模版1μL；水补齐至20μL。检测方法：提取样品DNA；利用试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。目的是提供一种用于检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的引物、试剂盒及方法，试剂盒：组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确；方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。

Description

检测转基因玉米CBH351的引物、试剂盒和方法
技术领域
本发明设计一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的双重荧光PCR检测试剂盒，本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的方法。
背景技术
玉米是世界上最重要的粮食作物之一，在世界农业生产中占有重要位置。农业转基因生物技术产业化的发展既是综合国力和竞争力的标志，又是国家科技竞争优势的重要标志。农业转基因生物的推广应用，降低了生产成本，减轻了环境污染，提高了产品价格竞争力。转基因作物使产量增加，农药使用量减少，形成了巨大经济和生态效益。国际上对转基因生物安全性的争论已经不是纯粹的科学技术问题，包含政治、经济、伦理等诸多方面。很多国家将他们研究的转基因物种拿到发展中国家中进行试验研究。在转基因产品的销售过程中，经营者与消费者之间缺乏公平，消费者经常是在不知情或者是被动的情况下就进行了消费。由此，我们需要对食品及饲料中转基因玉米的品系进行鉴定。为了加强对转基因玉米特别是进口转基因玉米的品系鉴定，根据欧盟转基因品系准入相关文献，建立食品和饲料中转基因玉米品系检测方法。CBH351Starlink TM玉米Z.mays是Aventis CropScience即formerly AgrEvo公司运用现代生物技术手段开发的一种转基因玉米品系。其导入的来自苏云杆菌Bt基因可产生一种蛋白质Cry9C,具有杀虫活性,能够有效控制欧洲钻心螟虫。
针对玉米中Zein基因和CBH351基因，研究人员已开展了常规PCR和荧光PCR方法研究。目前，我国出入境检验检疫行业标准SN/T1196-2003《玉米种转基因成分定性PCR检测方法》中规定了对玉米MON810、Bt11、Evebt176、T14/T25、CBH351、GA21品系中转基因成分的定性检测。此外，农业部953号公告-2-2007《转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米CBH351及其衍生品种定性PCR方法》标准规定了转基因抗虫玉米CBH351CBH351及其衍生品种的检测。这些基因的检测方法大都采用常规PCR方法和荧光PCR方法。
但常规PCR方法需要PCR扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且容易引起污染，还需要使用可能致癌的荧光燃料。而探针法荧光PCR方法虽然灵敏准确，但TaqMan探针的线性结构导致了较高的背景荧光，如果荧光基团和淬灭基团的距离太近，在PCR扩增过程中,探针在它们之间降解的可能性将大为降低，从而起不到探针的作用。相反，如果荧光基团和淬灭基团分别置于探针两端，荧光背景信号加强，影响其检测的灵敏度。另外其合成成本较高，而且试剂有效期短，很容易降解，因而，不能在基层得到广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的引物；
本发明的另一个目的是提供一种包括上述引物且组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于双重荧光PCR检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的试剂盒；
本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的引物，其特征在于该引物的序列分别为：
上游引物ZeinF：TTATGCTCCTTGGTCTTT
下游引物ZeinR：GTAATAGGGCTGATGATTG
上游引物CBH351F：TATGTTACTAGATCGCAGAT
下游引物CBH351R：AAGGTCCAATAGTGTATGT。
一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein及内源基因Zein的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20μL反应体系包括以下组分：
其中所述上游引物ZeinF的序列：TTATGCTCCTTGGTCTTT
所述下游引物ZeinR的序列：GTAATAGGGCTGATGATTG
所述上游引物CBH351F的序列：TATGTTACTAGATCGCAGAT
所述下游引物CBH351R的序列：AAGGTCCAATAGTGTATGT。
如上所述的一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20μL反应体系包括以下组分：
一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取样品DNA；
B、利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；
C、扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。
如上所述检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的方法，其特征在于步骤B中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～95℃变性10s～30s，54℃～64℃退火10s～30s，72℃10s～30s，共进行35～45个循环；
(3)72℃延伸10s～30s。
如上所述检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的方法，其特征在于步骤C中所述高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至90℃～95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
如上所述检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的方法，其特征在于步骤A中所述提取样品DNA的具体步骤如下：
称取1g样品，加入到50mL的离心管中；加入5mL CTAB提取液和20μL蛋白酶K溶液，充分混匀。65℃孵育30min，不时振荡；吸水性大的食品样品，加入CTAB提取液的量应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定；65℃过夜后,8000r/min室温离心10min，取1ml上清液入2ml离心管中；加入700μL氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液600μL到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000×g离心10min，弃去上清，加入350μL NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350μL氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清后加入0.8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500μL 70％乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50μL TE溶液中。
本发明中标准品模板的制备：
以常规PCR方法扩增目的基因。PCR产物经1％凝胶电泳分析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
本发明中敏感性和特异性试验：
采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加入前述反应体系，采用0.1％标准品对其进行灵敏性实验。结果能达到0.1％的检测阈值，重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和Cp值之间也呈良好的线性关系R2≥0.95。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
本发明与现有技术相比，具有以下优点:
1)本发明试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于荧光PCR检测玉米Zein基因和CBH351基因；
2)本发明检测方法简化了检测流程，大大缩短了检测周期，检测时间比传统培养分析方法缩短两天左右；
3)本发明检测方法整个过程，PCR产物无需再转入其它分析装置，实现闭管操作，避免交叉污染，而且可同时完成定量分析。
4)采用本发明检测方法在同一反应体系即可实现同时检测玉米Zein基因和CBH351基因，操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
附图说明
图1为仅有玉米Zein基因检出的扩增曲线图；
图2为仅有玉米Zein基因检出的HRM分析图；
图3为仅有CBH351检出的扩增曲线图；
图4为仅有CBH351检出的的HRM分析图；
图5为玉米Zein基因和CBH351基因同时检出的扩增曲线图；
图6为玉米Zein基因和CBH351基因同时检出的HRM分析图；
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：
实施例1
本发明检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的引物，其中该引物的序列分别为：
上游引物ZeinF：TTATGCTCCTTGGTCTTT
下游引物ZeinR：GTAATAGGGCTGATGATTG
上游引物CBH351F：TATGTTACTAGATCGCAGAT
下游引物CBH351R：AAGGTCCAATAGTGTATGT。
实施例2
本发明一种检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的试剂盒，其中该试剂盒中20μL反应体系包括以下组分：
其中引物序列如下:
上游引物ZeinF：TTATGCTCCTTGGTCTTT
下游引物ZeinR：GTAATAGGGCTGATGATTG
上游引物CBH351F：TATGTTACTAGATCGCAGAT
下游引物CBH351R：AAGGTCCAATAGTGTATGT。
实施例3
本发明检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein的试剂盒，其中20.0μL反应体系由以下组分组成：
其中:
其中引物序列如下:
上游引物ZeinF：TTATGCTCCTTGGTCTTT
下游引物ZeinR：GTAATAGGGCTGATGATTG
上游引物CBH351F：TATGTTACTAGATCGCAGAT
下游引物CBH351R：AAGGTCCAATAGTGTATGT。
实施例4
本发明试剂盒中制备20μL反应体系由以下组分组成：
其中引物序列如下:
上游引物ZeinF：TTATGCTCCTTGGTCTTT
下游引物ZeinR：GTAATAGGGCTGATGATTG
上游引物CBH351F：TATGTTACTAGATCGCAGAT
下游引物CBH351R：AAGGTCCAATAGTGTATGT。
实施例5
本发明试剂盒中制备20μL反应体系由以下组分组成：
其中引物序列如下:
上游引物ZeinF：TTATGCTCCTTGGTCTTT
下游引物ZeinR：GTAATAGGGCTGATGATTG
上游引物CBH351F：TATGTTACTAGATCGCAGAT
下游引物CBH351R：AAGGTCCAATAGTGTATGT。
实施例6
本发明试剂盒中制备20μL反应体系由以下组分组成：
其中引物序列如下:
上游引物ZeinF：TTATGCTCCTTGGTCTTT
下游引物ZeinR：GTAATAGGGCTGATGATTG
上游引物CBH351F：TATGTTACTAGATCGCAGAT
下游引物CBH351R：AAGGTCCAATAGTGTATGT。
实施例7
本发明试剂盒中制备20μL反应体系由以下组分组成：
其中引物序列如下:
上游引物ZeinF：TTATGCTCCTTGGTCTTT
下游引物ZeinR：GTAATAGGGCTGATGATTG
上游引物CBH351F：TATGTTACTAGATCGCAGAT
下游引物CBH351R：AAGGTCCAATAGTGTATGT。
实施例8
本发明检测转基因抗虫玉米CBH351及内源基因Zein用的方法，
包括以下步骤：
A、提取样品DNA；
B、对步骤A中的样品DNA进行荧光PCR扩增，其中反应体系由以下组分组成：
其中引物序列如下：
上游引物ZeinF：TTATGCTCCTTGGTCTTT
下游引物ZeinR：GTAATAGGGCTGATGATTG
上游引物CBH351F：TATGTTACTAGATCGCAGAT
下游引物CBH351R：AAGGTCCAATAGTGTATGT。
所述的荧光PCR扩增按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～96℃变性5s～10s，55℃～65℃退火20s～40s，共进行35～45个循环。
C、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
其中对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至92℃～96℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
实施例4
称取1g样品，可根据样品的DNA含量，调整样品量，加入到50mL的离心管中；加入5mL CTAB提取液和20μL蛋白酶K溶液，充分混匀。65℃孵育30min，不时振荡；吸水性大的食品样品，加入CTAB提取液的量应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定；65℃过夜后,8000r/min室温离心10min，取1ml上清液入2ml离心管中；加入700μL氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液600μL到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000×g离心10min，弃去上清，加入350μL NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350μL氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清后加入0.8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500μL 70％乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50μL TE溶液中。然后取1.0μL提取物加入到以下反应体系，
其中引物序列如下：
上游引物ZeinF：TTATGCTCCTTGGTCTTT
下游引物ZeinR：GTAATAGGGCTGATGATTG
上游引物CBH351F：TATGTTACTAGATCGCAGAT
下游引物CBH351R：AAGGTCCAATAGTGTATGT。
进行荧光PCR扩增，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～96℃变性5s～10s，55℃～65℃退火20s～40s，共进行35～45个循环。
A、对扩增后的产物进行HRM分析后判定结果。
对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至92℃～96℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
本发明中标准DNA模版的制备：
以常规PCR方法扩增耐药基因目的基因ZEIN和CBH351。PCR产物经1％凝胶电泳分析，采用PCR产物回收试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒，以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
结果分析
如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值<35，而且熔解曲线有一个特异性波峰，Tm值为88.23±0.15℃，可判为玉米Zein基因检出。
如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值<35，熔解曲线有一个特异性波峰，Tm值为81.82±0.15℃，可判为CBH351检出。
如果样品荧光PCR扩增有明显扩增曲线，Ct值<35，而且有两个波峰，Tm值分别为82.51±0.15℃和87.43±0.15℃，可判为玉米Zein基因和CBH351均检出。
如果样品荧光PCR扩增曲线明显，35<Ct值<40，重复一次，如果仍有明显上升曲线，则至少有一个目的基因为检出，同时根据前述熔解曲线分析图波峰发生情况和Tm值进行相应判断。
如果样品荧光PCR扩增曲线明显Ct值>40，或无明显扩增曲线和Tm值，判为玉米Zein基因和CBH351均检测阴性。
本发明中敏感性和特异性试验：
采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加入前述反应体系，采用0.1％标准品对其进行灵敏性实验。结果能达到0.1％的检测阈值，重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和Cp值之间也呈良好的线性关系R2≥0.95。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种检测转基因玉米CBH351的引物，其特征在于该引物的序列分别为：
上游引物ZeinF：TTATGCTCCTTGGTCTTT
下游引物ZeinR：GTAATAGGGCTGATGATTG
上游引物CBH351F：TATGTTACTAGATCGCAGAT
下游引物CBH351R：AAGGTCCAATAGTGTATGT。
2.一种检测转基因玉米CBH351的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20μL反应体系包括以下组分：
其中所述上游引物ZeinF的序列：TTATGCTCCTTGGTCTTT
所述下游引物ZeinR的序列：GTAATAGGGCTGATGATTG
所述上游引物CBH351F的序列：TATGTTACTAGATCGCAGAT
所述下游引物CBH351R的序列：AAGGTCCAATAGTGTATGT。
3.根据权利要求2所述的一种检测转基因玉米CBH351的试剂盒，其特征在于该试剂盒中20μL反应体系包括以下组分：
4.一种检测转基因玉米CBH351的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取样品DNA；
B、利用如权利要求2或3所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；
C、扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。
5.根据权利要求4所述一种检测转基因玉米CBH351的方法，其特征在于步骤B中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃预变性30s；
(2)92℃～95℃变性10s～30s，54℃～64℃退火10s～30s，72℃10s～30s，共进行35～45个循环；
(3)72℃延伸10s～30s。
6.根据权利要求5所述一种检测转基因玉米CBH351的方法，其特征在于步骤C中所述高分辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行：
(1)92℃～96℃变性1min；
(2)40℃复性1min；
(3)然后初始熔解温度60℃～65℃，开始程序升温熔解至90℃～95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，15～25次/秒。
7.根据权利要求6所述一种检测转基因玉米CBH351的方法，其特征在于步骤A中所述提取样品DNA的具体步骤如下：
称取1g样品，加入到50mL的离心管中；加入5mL CTAB提取液和20μL蛋白酶K溶液，充分混匀。65℃孵育30min，不时振荡；吸水性大的样品，加入CTAB提取液的量应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定；65℃过夜后,8000r/min室温离心10min，取1ml上清液入2ml离心管中；加入700μL氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液600μL到新的2ml离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000×g离心10min，弃去上清，加入350μL NaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350μL氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清后加入0.8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500μL 70％乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50μL TE溶液中。
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CN104651487A (zh) * 2014-11-05 2015-05-27 蔡先全 检测食源性致病菌的试剂盒及多重荧光pcr检测方法

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