CN101775440A - 一种转基因大豆检测用质粒标准分子及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种转基因大豆检测用质粒标准分子及其构建方法，所述质粒标准分子包含大豆内标准基因lectin特异性序列、转基因大豆MON89788的3′端转化体特异性序列和5′端转化体特异性序列。通过设计特异性定性PCR引物，扩增获得lectin基因特异性序列、MON89788大豆的3′端和5′端转化体特异性序列；通过酶切、连接、转化等分子克隆技术将上述3个特异性序列片段构建到一个质粒分子中获得人工重组质粒标准分子pMD-LM3M5。经验证，本发明中构建的质粒标准分子可以完全替代转基因大豆MON89788阳性标准品，适用于对MON89788大豆的转化体特异性定性和定量PCR分析和检测。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种转基因生物及其产品检测用质粒标准分子及构建方法，具体是一种适用于转基因大豆MON89788定性和定量PCR检测用质粒标准分子及其构建方法。
背景技术
自1996年以来，全球转基因作物种植面积以年均10％以上的速率增长，2008年达到1.25亿公顷。与转基因作物产业化的蓬勃发展相对应的，是各国民众对其安全性的担忧。为保障消费者知情权和选择权，许多国家和地区都制订了转基因生物标识管理制度，我国自2001年相继颁布了一系列法律法规，对大豆、玉米等5类转基因作物的17种产品实施强制性定性标识。
标识制度的实施依赖于转基因产品检测技术。目前主要有两类技术：一类基于核酸方法，如PCR、基因芯片等，另一类基于蛋白质方法，如ELISA、试纸条等，其中PCR方法应用最广。根据靶序列不同，PCR检测策略分为4种，即筛查、基因特异性、构建特异性、转化体特异性。转化体特异性PCR方法以外源载体与受体植物基因组的连接区序列为检测对象，具有品种特异性，已成为转基因产品检测方法的首选。
在应用PCR方法检测转基因产品时，需要设置阳性对照来对检测活动进行监控，特别是在定量PCR检测中需要用含量准确的转基因生物阳性标准品来制作标准曲线。然而，由于专利权和现有技术的限制，转基因生物阳性标准品很难获得，这种现状已成为检测方法建立和应用的瓶颈。因此亟需研制能够替代转基因生物阳性标准品的新型阳性对照材料，以满足不断发展的转基因检测需求。
经过查阅文献资料发现，质粒标准分子的概念及应用最早由日本学者Shindo等提出，相关内容发表在《Journal of AOACInternational》(国际官方农业化学家协会杂志)2002年第85卷第5期1119-1126页，文中介绍了利用质粒标准分子替代转基因生物阳性标准品用于转基因作物及其产品检测的方法。近年来，国内外众多学者报道了一些用于转基因产品检测的质粒标准分子，例如：张大兵等人于2007年构建了适用于9种转基因玉米检测的质粒标准分子。然而，在对现有专利和文献的分析中发现，还没有任何转基因大豆MON89788检测用质粒标准分子构建的专利和文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种转基因大豆MON89788转化体特异性检测用质粒标准分子及其构建方法，以克服转基因大豆MON89788转化体特异性定性和定量PCR检测中阳性标准品的匮乏，满足转基因大豆MON89788转化体特异性检测需求。
为实现上述目的，本发明提供一种转基因大豆检测用质粒标准分子，其特征在于：通过特异性PCR引物，从转基因大豆MON89788基因组DNA中扩增出大豆内标准基因lectin特异性序列、MON89788大豆3′端转化体特异性序列和5′端转化体特异性序列，利用酶切、连接、转化分子克隆技术将这3个片段依次构建到质粒载体pMD18-T中，获得质粒标准分子pMD-LM3M5。
一种转基因大豆检测用质粒标准分子的构建方法，包括以下步骤：
(1)利用GenBank数据库和相关文献检索，获得大豆内标准基因lectin、转基因大豆MON89788 3′端和5′端转化体特异性序列。
所述的大豆内标准基因lectin，是指大豆凝集素基因，在大豆基因组中高度保守，具有种间特异性、种内非特异性和单拷贝数等特点。
所述的转基因大豆MON89788 3′端转化特异性序列，是指转基因大豆MON89788外源载体3′端与大豆基因组连接区的DNA序列。
所述的转基因大豆MON89788 5′端转化特异性序列，是指转基因大豆MON89788外源载体5′端与大豆基因组连接区的DNA序列。
(2)根据lectin基因序列、MON89788大豆的3′端和5′端转化体特异性序列，设计定性PCR引物，对转基因大豆MON89788阳性标准品的基因组DNA进行PCR扩增。
所述的定性PCR引物，是指长度为25±8nt的寡核苷酸链，与lectin基因或MON89788大豆的3′端或5′端转化体特异性序列完全相同或者互补。
所述的转基因大豆MON89788阳性标准品，是指转基因含量为100％的转基因大豆MON89788籽粒。
(3)分别回收lectin基因以及MON89788大豆3′端和5′端转化体特异性序列的定性PCR产物。将lectin基因PCR回收产物构建到质粒载体pMD18-T上获得中间质粒分子pMD-L。
所述的中间质粒分子，是指在构建质粒标准分子pMD-LM3M5过程中，产生的一系列质粒分子。
(4)将中间质粒载体pMD-L和MON89788大豆3′端转化体特异性序列PCR回收产物，用限制性内切酶BamHI和EcoRI分别进行双酶切。回收这2种酶切产物，用T4DNA连接酶连接获得中间质粒分子pMD-LM3。
所述的双酶切，是指在一个反应体系中加入两种限制性内切酶和一种通用缓冲液，对同一个目标分子进行酶切。
(5)将中间质粒分子pMD-LM3和MON89788大豆5′端转化体特异性序列PCR回收产物，用限制性内切酶NcoI和EcoRI分别进行双酶切。回收这2种酶切产物，用T4DNA连接酶连接获得质粒标准分子pMD-LM3M5。
大豆内标准基因lectin特异性序列，是由SEQ ID NO1和SEQ IDNO2组成的引物对，扩增MON89788大豆获得的扩增子序列。
MON89788大豆3′端转化体特异性序列，是由SEQ ID NO3和SEQ ID NO4组成的引物对，扩增MON89788大豆获得的扩增子序列。
MON89788大豆5′端转化体特异性序列，是由SEQ ID NO5和SEQ ID NO6组成的引物对，扩增MON89788大豆获得的扩增子序列。
本发明质粒标准分子，包含SEQ ID NO7的序列。
所述的定性PCR验证，是指用定性PCR方法验证构建的质粒标准分子pMD-LM3M5中能扩增出与转基因大豆MON89788相同的大豆内标准基因lectin以及MON89788大豆3′端和5′端转化体特异性序列，且pMD-LM3M5中特异性序列的检测灵敏度能满足定性PCR检测的要求。
所述的定量PCR验证，是指用定量PCR方法分析构建的质粒标准分子pMD-LM3M5中大豆内标准基因lectin和MON89788大豆5′端转化体特异性序列的检测极限、定量极限以及重复性、重演性等特性，以鉴定该质粒标准分子替代转基因大豆MON89788阳性标准品的能力，进而验证该质粒标准分子在转基因大豆MON89788样品实际检测中的有效性。
本发明的有益效果：利用酶切、连接、转化等分子克隆技术首次构建了含有大豆内标准基因lectin以及转基因大豆MON89788的3′端和5′端转化体特异性序列的质粒标准分子pMD-LM3M5。本发明中提出该质粒标准分子可以完全替代转基因大豆MON89788阳性标准品，用于MON89788大豆转化体特异性定性和定量PCR检测，很好地解决了MON89788大豆检测过程中阳性标准品匮乏的问题。该质粒标准分子在实际检测中具有特异性好、灵敏度高等优点，应用该质粒标准分子进行实际样品定量分析时，样品检测结果的偏差在国际上广泛认可的允许范围内。
因此，本发明构建的质粒标准分子pMD-LM3M5完全适用于对转基因大豆MON89788及其产品中MON89788大豆转化体成分的定性和定量PCR检测。
附图说明
附图为本发明构建质粒标准分子pMD-LM3M5的示意图。
图中，“pMD-18T”表示用于构建质粒标准分子的载体；“BamHI”、“NcoI”、“EcoRI”分别表示存在相应的酶切位点；“lectin”表示大豆内标准基因lectin特异性序列；“MON89788-3′”表示MON89788大豆3′端转化体特异性序列；“MON89788-5′”表示MON89788大豆5′端转化体特异性序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件操作，例如Sambrook等编著的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例：质粒标准分子pMD-LM3M5的构建
一、实验材料
转基因大豆MON89788。
二、试剂
限制性内切酶BamHI、EcoRI、NcoI购自上海生工生物工程技术服务有限公司；
pMD18-T载体、T4DNA连接酶及缓冲液、ExTaq DNA聚合酶及其缓冲液、dNTPs、DL2000 Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；
PCR产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DH5α感受态菌株购自北京天根生物技术有限公司；
CTAB、Tris、EDTA等其他生化试剂购自北京鼎国生物技术有限公司；
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
三、主要仪器设备
C1000型PCR仪(Bio-Rad Laboratories，Inc.)
Gel型凝胶成像系统(Bio-Rad Laboratories，Inc.)
ND1000紫外分光光度计(NanoDrop Technologies，Inc.)
其他仪器包括：恒温水浴锅，离心机，恒温培养箱，电子天平，微量移液器等。
四、实验方法和过程
1、引物设计
通过GenBank查询获得大豆内标准基因lectin；通过检索相关文献资料和国内外，获得转基因大豆MON89788的3′端和5′端转化体特异性序列。根据获得的序列信息，利用Primer Premier 5软件，设计三对定性PCR引物，分别用于扩增lectin基因、MON89788大豆3′端转化体特异性序列和5′端转化体特异性序列。
lectin基因特异性序列扩增引物由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2组成，MON89788大豆3′端转化体特异性序列扩增引物由SEQ IDNO3和SEQ ID NO4组成，MON89788大豆5′端转化体特异性序列扩增引物由SEQ ID NO5和SEQ ID NO6组成。
2、特异性序列扩增
2.1 总DNA提取
a、取适量植物样品，在液氮中充分研磨，称取80-150mg研磨好的样品(不需研磨的可直接称取)转入1.5mL离心管中；
b、加入0.6mL CTAB提取液(15g·L-1 CTAB，50mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)，10mmol·L-1 EDTA(pH 8.0)，1mol·L-1 NaCl，7.5g·L-1 PVP)和50μg RNaseA，65℃孵育40min，期间颠倒混匀3-5次；
c、加入0.6mL氯仿，颠倒混匀1-2min，12 000rpm离心10min，转移上清至新的1.5mL离心管中，重复本步骤1次；
d、加入0.6倍体积异丙醇，轻缓颠倒混匀，室温静置10min，12 000rpm离心10min，弃上清；
e、加入1mL 70％乙醇洗涤沉淀，12 000rpm离心5min，弃上清；
f、晾干，加入100μL超纯水溶解DNA沉淀。
用ND1000分光光度计检测DNA质量和浓度，将DNA稀释至50mg·L-1，备用。
2.2 PCR扩增
根据表1列出的引物，以MON89788大豆基因组DNA为模板，进行特异性序列扩增，反应体系和程序见表1、2。获得424bp的lectin基因特异性序列，312bp的MON89788大豆3′端转化体特异性序列以及420bp的MON89788大豆5′端转化体特异性序列。
表1 构建质粒标准分子的PCR反应体系
表2 构建质粒标准分子的PCR反应程序
3、质粒标准分子构建
3.1 中间质粒分子pMD-L构建
按PCR产物回收试剂盒说明书，回收lectin基因以及MON89788大豆3′端和5′端转化体特异性序列的PCR产物。按照pMD18-T载体试剂盒说明书，将lectin基因特异性序列构建到载体上获得中间质粒分子pMD-L，并转化DH5α感受态菌株。利用菌落PCR对重组菌株进行鉴定，按照质粒提取试剂盒说明书提取中间质粒pMD-L。
3.2 中间质粒分子pMD-LM3构建
将中间质粒载体pMD-L和MON89788大豆3′端转化体特异性序列回收产物，用限制性内切酶BamHI和EcoRI分别进行双酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶回收后，用T4DNA连接酶连接获得中间质粒分子pMD-LM3。反应体系见表3，16℃孵育12h。将连接产物转化DH5α感受态菌株。利用菌落PCR对重组菌株进行鉴定，按照质粒提取试剂盒说明书提取中间质粒pMD-LM3。
表3 构建中间质粒分子pMD-LM3的连接反应体系
反应试剂 体积(μL)
10×连接酶缓冲液 1
T4连接酶 1
pMD-L质粒 2
MON89788大豆3′端转化体特异性序列 3
超纯水 3
3.3 质粒标准分子pMD-LM3M5构建
将中间质粒载体pMD-LM3和MON89788大豆5′端转化体特异性序列回收产物，用限制性内切酶NcoI和EcoRI分别进行双酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶回收后，用T4DNA连接酶连接获得质粒标准分子pMD-LM3M5。反应体系见表4，16℃孵育12h。将连接产物转化DH5α感受态菌株。利用菌落PCR对重组菌株进行鉴定，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒标准分子pMD-LM3M5。通过测序分析确定质粒标准分子中的外源序列与预期一致。
表4 构建质粒标准分子pMD-LM3M5的连接反应体系
反应试剂 体积(μL)
10×连接酶缓冲液 1
T4连接酶 1
pMD-LM3质粒 2
MON89788大豆5′端转化体特异性序列 3
超纯水 3
构建的质粒标准分子pMD-LM3M5的简要图谱如附图所示。图中“pMD-18T”表示用于构建质粒标准分子的载体；“BamHI”、“NcoI”、“EcoRI”表示存在相应的酶切位点；“lectin”表示大豆内标准基因lectin特异性序列；“MON89788-3′”表示MON89788大豆3′端转化体特异性序列；“MON89788-5′”表示MON89788大豆5′端转化体特异性序列。3段序列通过2次双酶切和3次连接转化依次构建到pMD-18T载体上，获得质粒标准分子pMD-LM3M5。质粒标准分子经测序分析，包含SEQ ID NO7的序列。
实验例：质粒标准分子pM D-LM3M5在实际检测中的应用
一、实验材料
转基因大豆MON89788。
非转基因大豆吉育84。
其他转基因材料：大豆GTS40-3-2、A5547-127，玉米MON810、MON863、NK603、GA21，棉花MON1445、MON15985、MON88913，油菜MS1、RF1、Oxy235，甜菜H7-1。
二、试剂
2×Mix TaqMan定量PCR试剂盒购自吉林省标新科技发展有限公司。
Taq DNA聚合酶及其缓冲液、dNTPs、DL2000 Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；
质粒提取试剂盒购自北京天根生物技术有限公司；
CTAB、Tris、EDTA等其他生化试剂购自北京鼎国生物技术有限公司；
TaqMan探针和引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
三、主要仪器设备
7500型实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems.)
C1000型PCR仪(Bio-Rad Laboratories，Inc.)
Gel型凝胶成像系统(Bio-Rad Laboratories，Inc.)
ND1000紫外分光光度计(NanoDrop Technologies，Inc.)
其他仪器包括：恒温水浴锅，离心机，恒温培养箱，电子天平，微量移液器等。
四、实验方法和过程
1、DNA提取
1.1 植物基因组DNA提取
a、取适量植物样品，在液氮中充分研磨，称取80-150mg研磨好的样品(不需研磨的可直接称取)转入1.5mL离心管中；
b、加入0.6mL CTAB提取液(15g·L-1 CTAB，50mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)，10mmol·L-1 EDTA(pH 8.0)，1mol·L-1 NaCl，7.5g·L-1 PVP)和50μg RNaseA，65℃孵育40min，期间颠倒混匀3-5次；
c、加入0.6mL氯仿，颠倒混匀1-2min，12 000rpm离心10min，转移上清至新的1.5mL离心管中，重复本步骤1次；
d、加入0.6倍体积异丙醇，轻缓颠倒混匀，室温静置10min，12 000rpm离心10min，弃上清；
e、加入1mL 70％乙醇洗涤沉淀，12 000rpm离心5min，弃上清；
f、晾干，加入100μL超纯水溶解DNA沉淀。
1.2 质粒标准分子pMD-LM3M5DNA提取
a、将37℃培养12h的1-5mL菌液于10 000rpm离心30s，彻底弃上清；
b、按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA。
1.3 DNA浓度测定与稀释
a、取3μL DNA样品，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，判断DNA完整性；
b、用ND1000分光光度计检测DNA纯度和浓度；
c、用超纯水将植物基因组DNA稀释至50mg·L-1，4℃保存备用；
d、根据质粒标准分子DNA初始浓度和大小，用0.1×TE缓冲液将其依次稀释成106、105、104、103、102、10和1copy·μL-1，4℃保存备用。
2、质粒标准分子pMD-LM3M5在定性PCR检测中的应用
通过检索相关文献资料，获得大豆内标准基因lectin、MON89788大豆3′端和5′端转化体特异性定性PCR检测方法。PCR反应体系和程序见表6、7。
以质粒标准分子pMD-LM3M5(106copy·μL-1)、转基因大豆MON89788、非转基因大豆吉育84和其他转基因材料的DNA为模板进行定性PCR检测，判断质粒标准分子用于定性PCR检测的特异性。
以不同浓度的质粒标准分子pMD-LM3M5的DNA样品(106、105、104、103、102、10和1copy·μL-1)为模板进行定性PCR扩增，判断质粒标准分子用于定性PCR检测的灵敏度。
表6 pMD-LM3M5用于定性PCR检测的反应体系
表7 pMD-LM3M5用于定性PCR检测的反应程序
3 质粒标准分子pMD-LM3M5在定量PCR检测中的应用
3.1 pMD-LM3M5用于定量PCR检测的检测极限和定量极限
通过检索相关文献资料，获得大豆内标准基因lectin和MON89788大豆5′端转化体特异性定量PCR检测方法。PCR反应体系和程序见表8、9。
以不同浓度的质粒标准分子pMD-LM3M5的DNA样品(106、105、104、103、102、10和1copy·μL-1)为模板进行定量PCR扩增，每个反应重复三次，根据定量PCR扩增标准曲线与扩增荧光信号间的线性关系，确定利用构建的质粒标准分子pMD-LM3M5替代转基因大豆MON89788阳性标准品时，MON89788大豆转化体特异性定量PCR检测方法的检测极限(LOD)和定量极限(LOQ)。
表8 pMD-LM3M5用于定量PCR检测的反应体系
表9 pMD-LM3M5用于定量PCR检测的反应程序
3.2 应用pMD-LM3M5对转基因大豆MON89788样品的定量分析
根据利用质粒标准分子pMD-LM3M5建立的MON89788大豆特异性定量PCR标准曲线，分别对3个转基因大豆MON89788样品(转基因质量分数分别为2％、1％和0.5％)进行分析，确定构建的质粒标准分子pMD-LM3M5是否适用于实际样品中转基因大豆MON89788的定量检测。
五、实验结果
1、质粒标准分子pMD-LM3M5在定性PCR检测中的特异性和灵敏度
利用相关文献资料的方法，对质粒标准分子pMD-LM3M5(106copy·μL-1)、转基因大豆MON89788、非转基因大豆吉育84和其他转基因材料进行定性PCR检测。结果显示，在pMD-LM3M5和MON89788大豆中均能扩增出lectin基因、MON89788大豆3′端和5′端转化体特异性序列，在非转基因大豆吉育84和其他转基因大豆中仅能扩增出lectin基因特异性序列，其他转基因材料中没有扩增出任何产物，表明质粒标准分子pMD-LM3M5与转基因大豆MON89788阳性标准品具有等效的特异性。
以不同浓度的质粒标准分子pMD-LM3M5的DNA样品(106、105、104、103、102、10和1copy·μL-1)为模板进行PCR扩增，结果显示，在pMD-LM3M5浓度为10copy·μL-1及以上的样品中均能稳定地扩增出lectin基因、MON89788大豆3′端和5′端转化体特异性序列，表明质粒标准分子pMD-LM3M5的定性PCR检测灵敏度可达10copy。
说明本发明构建的质粒标准分子pMD-LM3M5可替代转基因大豆MON89788阳性标准品，用于MON89788大豆定性PCR检测。
2、质粒标准分子pMD-LM3M5在定量PCR检测中的检测极限和定量极限
利用相关文献资料的方法，对不同浓度的质粒标准分子pMD-LM3M5的DNA样品(106、105、104、103、102、10和1copy·μL-1)进行定量PCR扩增。结果显示，质粒标准分子pMD-LM3M5的lectin基因和MON89788大豆5′端转化体特异性序列的定量PCR检测LOD均为1个拷贝，LOQ为10个拷贝，且具有很好的重复性和重演性。
以浓度为106、105、104、103、102和10copy·μL-1的质粒标准分子pMD-LM3M5为标准品建立lectin基因和MON89788大豆5′端转化体特异性序列定量PCR标准曲线，两个标准曲线的相关系数均大于0.99，斜率在-3.1～-3.6之间，具有很好的线性关系，说明本发明构建的质粒标准分子pMD-LM3M5可替代转基因大豆MON89788阳性标准品，用于MON89788大豆及其产品的定量PCR检测。
3、应用质粒标准分子pMD-LM3M5对转基因大豆MON89788样品的定量分析
根据利用质粒标准分子pMD-LM3M5建立的lectin基因和MON89788大豆5′端转化体特异性序列定量PCR标准曲线，对质量分数分别为1％、0.5％和0.1％的3个转基因大豆MON89788样品进行定量分析，定量分析结果显示3个样品的含量分别为1.22％、0.55％和0.12％，与真实值的偏差分别为22％、10％和20％，标准偏差在0.02～0.20之间。结果表明利用质粒标准分子pMD-LM3M5对实际样品分析的结果比较准确，检测结果的偏差在国际上广泛认可的0-25％范围内，表明本发明构建的质粒标准分子pMD-LM3M5可替代转基因大豆MON89788阳性标准品，完全适用于转基因大豆MON89788转化体特异性定量PCR分析和检测。
序列表
<110>吉林省农业科学院
<120>一种转基因大豆检测用质粒标准分子及其构建方法
<160>7
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(20)
<223>合成的大豆内标准基因lectin特异性定性PCR引物。
<400>1
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<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(21)
<223>合成的大豆内标准基因lectin特异性定性PCR引物。
<400>2
ccttggctac tttattgttg g 21
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(26)
<223>合成的MON89788大豆3′端转化体特异性序列定性PCR引物，5′端含BamHI酶切位点。
<400>3
cgggatccat ttggacgtga atgtag 26
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc feature
<222>(1)...(27)
<223>合成的MON89788大豆3′端转化体特异性序列定性PCR引物，5′端含EcoRI酶切位点。
<400>4
cggaattcaa agcggaaagg aaagata 27
<210>5
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(31)
<223>合成的MON89788大豆5′端转化体特异性序列定性PCR引物，5′端含NcoI酶切位点。
<400>5
catgccatgg catacttgat ttgtccctct t 31
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(28)
<223>合成的MON89788大豆5′端转化体特异性序列定性PCR引物，5′端含EcoRI酶切位点。
<400>6
ccggaattcg tcttcggtgg atgtcttt 28
<210>7
<211>1029
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(1029)
<223>人工构建的质粒标准分子外源序列
<400>7
gacgctattg tgacctcctc gggaaagtta caactcaata aggttgacga aaacggcacc 60
ccaaaaccct cgtctcttgg tcgtgccctc tactccaccc ccgtccacat ttgggacaaa 120
gaaaccggta gcgttgccag cttcgccgct tccttcaact tcaccttcta tgcccctgac 180
acaaaaaggc ttgcagatgg gcttgccttc tttctcgcac caattgacac taagccacaa 240
acacatgcag gttatcttgg tcttttcaac gaaaacgagt ctggtgatca agtcgtcgct 300
gttgagtttg acactttccg gaactcttgg gatccatttg gacgtgaatg tagacacgtc 360
gaaataaaga tttccgaatt agaataattt gtttattgct ttcgcctata aatacgacgg 420
atcgtaattt gtcgttttat caaaatgtac tttcatttta taataacgct cagactctag 480
tgactaccac cttcactctc ctcaagcatt tcagcctctt ccccgctcag actccttagc 540
tttgggagcc aaattatccc ttacgttctc gacttcaacc atatgtgata gctgcctatg 600
ataccatggc atacttgatt tgtccctctt ggcttttcta agtttgagct cgttactgct 660
gccccacaaa gcccctcgaa acttgttcct gctccactct tccttttggg cttttttgtt 720
tcccgctcta gcgcttcaat cgtggttatc aagctccaaa cactgatagt ttaaactgaa 780
ggcgggaaac gacaatctga tccccatcaa gctctagcta gagcggccgc gttatcaagc 840
ttctgcaggt cctgctcgag tggaagctaa ttctcagtcc aaagcctcaa caaggtcagg 900
gtacagagtc tccaaaccat tagccaaaag ctacaggaga tcaatgaaga atcttcaatc 960
aaagtaaact actgttccag cacatgcatc atggtcagta agtttcagaa aaagacatcc 1020
accgaagac 1029
Claims (5)
1.一种转基因大豆检测用质粒标准分子，其特征在于：通过特异性PCR引物，从转基因大豆MON89788基因组DNA中扩增出大豆内标准基因lectin特异性序列、MON89788大豆3′端转化体特异性序列和5′端转化体特异性序列，利用酶切、连接、转化分子克隆技术将这3个片段依次构建到质粒载体pMD18-T中，获得质粒标准分子pMD-LM3M5。
2.权利要求1所述的一种转基因大豆检测用质粒标准分子的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)利用GenBank数据库和文献检索，获得大豆内标准基因lectin、转基因大豆MON897883′端和5′端转化体特异性序列；
(2)根据lectin基因序列、MON89788大豆的3′端和5′端转化体特异性序列，设计特异性定性PCR引物，对转基因大豆MON89788阳性标准品的基因组DNA进行PCR扩增；
(3)分别回收lectin基因以及MON89788大豆3′端和5′端转化体特异性序列的定性PCR产物，将lectin基因PCR回收产物构建到质粒载体pMD18-T上获得中间质粒分子pMD-L；
(4)将中间质粒分子pMD-L和MON89788大豆3′端转化体特异性序列PCR回收产物，用限制性内切酶BamHI和EcoRI分别进行双酶切，回收这2种酶切产物，用T4DNA连接酶连接获得中间质粒分子pMD-LM3；
(5)将中间质粒分子pMD-LM3和MON89788大豆5′端转化体特异性序列PCR回收产物，用限制性内切酶NcoI和EcoRI分别进行双酶切，回收这2种酶切产物，用T4DNA连接酶连接获得质粒标准分子pMD-LM3M5。
3.权利要求1所述的大豆内标准基因lectin特异性序列，是由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2组成的引物对，扩增MON89788大豆获得的扩增子序列。
4.权利要求1所述的MON89788大豆3′端转化体特异性序列，是由SEQ ID NO3和SEQ ID NO4组成的引物对，扩增MON89788大豆获得的扩增子序列。
5.权利要求1所述的MON89788大豆5′端转化体特异性序列，是由SEQ ID NO5和SEQ ID NO6组成的引物对，扩增MON89788大豆获得的扩增子序列。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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