CN111118193A - 一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的质粒dna - Google Patents

一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的质粒dna Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的质粒DNA，具体涉及生物技术领域，包括重组质粒pDDID‑1905，所述重组质粒pDDID‑1905的序列为SEQ ID NO:1，其外源插入序列还包括18种转基因大豆转化体特征DNA序列。本发明提供的重组质粒DNA分子pDDID‑1905包含的转化体特征序列涵盖所有我国已批准进口的大豆转化体及部分未批准进口的转化体，还包括一种我国自主研发且具有极大应用前景的转化体。因此，该质粒DNA分子可用于转基因大豆转化体的鉴定和检测，解决了转基因大豆转化体阳性标准品匮乏或覆盖面不足等的问题。该质粒DNA分子的设计还具有可扩展性，可用于未来加入新的转化体特征序列。

Description

一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的 质粒DNA
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地说，本发明涉及一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的质粒DNA。
背景技术
2017年转基因大豆品种的种植面积占全球转基因作物种植面积的50％，约9490万公顷。全球1.2亿公顷的大豆种植面积中，约77％为转基因大豆。其中，美国、巴西、阿根廷、巴拉圭、南非、玻利维亚和乌拉圭等国家的转基因大豆种植面积超过该国大豆总面积的90％。这些国家都是重要的大豆出口国(Global Status of Commercialized Biotech/GMCrops:2017,http://www.isaaa.org/resources/publications/briefs/default.asp)。
目前，我国仍需要大量进口国外转基因作物产品，尤其是大豆。2019年1月8日，农业农村部发布的新一批农业转基因生物安全证书(进口)批准清单中，有10个大豆转化体。其中，8个为证书延续，有2个转化体是第一次获批进口(2018年农业转基因生物安全证书批准清单)。另外，我国国内的转基因大豆的研发也正在迅猛发展，很多转基因大豆转化体正在申报国家转基因生物安全证书。面对不断更新的转基因大豆转化体和转基因产品进口方案，转基因检测方案也要及时调整跟进。
对于转基因作物转化体的检测，目前主要还是基于核酸检测。而在检测过程中需要相应的参照物或标准分子作为阳性对照。常见参照物或标准分子包括相应转基因生物的基因组DNA、含有目的基因的质粒DNA分子等。其中含有目的基因的质粒DNA分子还可以分为两种，一种是只包含一种外源靶标序列的质粒DNA，通常称为单靶标质粒(single-targetplasmid，STP)，另一种是同时包含多种靶标序列的质粒DNA，称为多靶标质粒(multiple-target plasmid，MTP)。研究表明，含有目的基因的质粒DNA分子可以代替基因组DNA作为参照物或标准分子，尤其是多靶标质粒更是具有多种优势(Isabel Taverniers，2004，AnalBioanal Chem；Malcolm Burns，2006，Eur Food Res Technol)。
目前，我国批准境外转基因大豆品系共16种，其中14种为独立转化体，包括：A2704-12、A5547-127、CV127、DAS44406-6、DP305423、DP356043、FG72、GTS 40-3-2、MON87701、MON87705、MON87708、MON87769、MON89788、SYHT0H2等，占已经商业化转基因大豆独立转化体的56％(共25种，ISAAA发布，更新日期2019年4月)。其它两种为转化体间杂交获得的品种，分别是DP305423×GTS 40-3-2，MON87701×MON89788。另外，还有几种转化体已经或正在制定定性检测方法国家标准，包括DAS68416-4、DAS81419和SHZD32-01和MON87751。其中，SHZD32-01为我国自主研发的耐除草剂大豆。为便于转基因大豆及其衍生物的检测，亟需开发适用于上述转化体的质粒DNA分子。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的质粒DNA；通过提供一种重组质粒DNA分子pDDID-1905，可以作为阳性参照物或阳性标准分子，用于对18种转基因大豆转化体及其衍生物的特异性序列检测；这18种转基因大豆转化体特征序列，包含目前我国已批准的所有转基因大豆独立转化体，以及其杂交品种；还包括一种我国自主研发，且具有重大应用前景的转化体，因此该质粒DNA分子可用于转基因大豆转化体的鉴定和检测，解决了转基因大豆转化体阳性参照物或阳性标准品匮乏或覆盖面不足等的问题；重组质粒的外源插入序列中分布有多个单一性限制性内切酶识别位点，因此，该重组质粒还具有可更新或可扩展的特性，便于后期及时更新和扩展。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的质粒DNA，包括重组质粒pDDID-1905，主要用于以核酸为靶标的检测方法中，比如各种PCR方法，所述重组质粒pDDID-1905的序列为SEQ ID NO:1，示意图见图1。
在一个优选地实施方式中，所述重组质粒pDDID-1905的外源插入序列包括一种大豆内标准基因Lectin的部分序列，具体为SEQ ID NO:2的特征DNA序列。
在一个优选地实施方式中，所述重组质粒pDDID-1905的外源插入序列还包括18种转基因大豆转化体特征DNA序列，包括：A2704-12(SEQ ID NO:3)、A5547-127(SEQ ID NO:4)、CV127(SEQ ID NO:5)、DAS44406-6(SEQ ID NO:6)、DP305423(SEQ ID NO:7)、DP356043(SEQ ID NO:8)、FG72(SEQ ID NO:9)、GTS 40-3-2(SEQ ID NO:10)、MON87701(SEQ ID NO:11)、MON87705(SEQ ID NO:12)、MON87708(SEQ ID NO:13)、MON87769(SEQ ID NO:14)、MON89788(SEQ ID NO:15)、SYHT0H2(SEQ ID NO:16)、DAS68416-4(SEQ ID NO:17)、DAS81419(SEQ ID NO:18)、SHZD32-01(SEQ ID NO:19)和MON87751(SEQ ID NO:20)的特征DNA序列。
在一个优选地实施方式中，所述转化体特征DNA序列分别存在于18种转基因大豆转化体中以及转化体的衍生物，包括其杂交后代，相应的下游产品等。
在一个优选地实施方式中，所述重组质粒pDDID-1905的外源插入序列中分布有多个单一性限制性内切酶识别位点，便于后期对局部序列的调整或者加入新的转化体特征DNA序列，因此，该质粒具有一定的可更新或可扩展特性；
所述重组质粒的可更新或可扩展特性是指，随着技术、方法或产品的发展，可以对个别靶标序列进行更新或调整，或者加入新转化体的特征序列等；这些操作可以局部进行，而不需要对整个外源插入片段进行复杂或高成本的操作。
在一个优选地实施方式中，所述重组质粒pDDID-1905可作为阳性参照物或阳性质粒标准分子，用于定性检测A2704-12、A5547-127、CV127、DAS44406-6、DP305423、DP356043、FG72、GTS 40-3-2、MON87701、MON87705、MON87708、MON87769、MON89788、SYHT0H2、DAS68416-4、DAS81419、SHZD32-01和MON87751转化体及其衍生物。
在一个优选地实施方式中，所述重组质粒pDDID-1905可作为阳性参照物或阳性质粒标准分子，用于对1种大豆内标准基因Lectin和18种大豆转化体及其衍生物的定量检测。
在一个优选地实施方式中，所述重组质粒pDDID-1905可被直接使用，也可被包含在相应的试剂盒中。
本发明的技术效果和优点：
1、本发明首先提供一种重组质粒DNA分子pDDID-1905，可以作为阳性参照物或阳性标准分子，用于对18种转基因大豆转化体及其衍生物的特异性序列检测；这18种转基因大豆转化体特征序列，包含目前我国已批准的所有转基因大豆独立转化体，以及其杂交品种；还包括一种我国自主研发，且具有重大应用前景的转化体，因此该质粒DNA分子可用于转基因大豆转化体的鉴定和检测，解决了转基因大豆转化体阳性参照物或阳性标准品匮乏或覆盖面不足等的问题。
2、本发明重组质粒的外源插入序列中分布有多个单一性限制性内切酶识别位点，因此重组质粒还具有可更新或可扩展的特性，便于后期及时更新和扩展。
附图说明
图1为本发明的pDDID-1905质粒示意图。
图2为本发明的pDDID-1905质粒酶切鉴定图。
图3为本发明的靶标序列PCR检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
根据图1所示的一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的质粒DNA，包括重组质粒pDDID-1905，主要用于以核酸为靶标的检测方法中，比如各种PCR方法，所述重组质粒pDDID-1905的序列为SEQ ID NO:1，示意图见图1。
进一步的，所述重组质粒pDDID-1905骨架为pUC18质粒。
进一步的，所述重组质粒pDDID-1905的外源插入序列包括一种大豆内标准基因Lectin的部分序列，具体为SEQ ID NO:2的特征DNA序列。
进一步的，所述重组质粒pDDID-1905的外源插入序列还包括18种转基因大豆转化体特征DNA序列，包括：A2704-12(SEQ ID NO:3)、A5547-127(SEQ ID NO:4)、CV127(SEQ IDNO:5)、DAS44406-6(SEQ ID NO:6)、DP305423(SEQ ID NO:7)、DP356043(SEQ ID NO:8)、FG72(SEQ ID NO:9)、GTS 40-3-2(SEQ ID NO:10)、MON87701(SEQ ID NO:11)、MON87705(SEQ ID NO:12)、MON87708(SEQ ID NO:13)、MON87769(SEQ ID NO:14)、MON89788(SEQ IDNO:15)、SYHT0H2(SEQ ID NO:16)、DAS68416-4(SEQ ID NO:17)、DAS81419(SEQ ID NO:18)、SHZD32-01(SEQ ID NO:19)和MON87751(SEQ ID NO:20)的特征DNA序列。
进一步的，所述转化体特征DNA序列分别存在于18种转基因大豆转化体中以及转化体的衍生物中，所述衍生物可以为杂交后代，也可以为相应的下游产品。
进一步的，所述重组质粒pDDID-1905的外源插入序列中分布有多个单一性限制性内切酶识别位点，便于后期对局部序列的调整或者加入新的转化体特征DNA序列，因此，该质粒具有一定的可更新或可扩展特性；
所述重组质粒的可更新或可扩展特性是指，随着技术、方法或产品的发展，可以对个别靶标序列进行更新或调整，或者加入新转化体的特征序列；这些操作可以局部进行，而不需要对整个外源插入片段进行复杂或高成本的操作。
进一步的，所述重组质粒pDDID-1905可作为阳性参照物或阳性质粒标准分子，用于定性检测A2704-12、A5547-127、CV127、DAS44406-6、DP305423、DP356043、FG72、GTS 40-3-2、MON87701、MON87705、MON87708、MON87769、MON89788、SYHT0H2、DAS68416-4、DAS81419、SHZD32-01和MON87751转化体及其衍生物。
进一步的，所述重组质粒pDDID-1905可作为阳性参照物或阳性质粒标准分子，用于对1种大豆内标准基因Lectin和18种大豆转化体及其衍生物的定量检测。
进一步的，所述重组质粒pDDID-1905可被直接使用，也可被包含在相应的试剂盒中。
实施例2：
pDDID-1905质粒的构建，具体步骤如下：
S1、将19种靶标序列(SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:20)串联，期间加入适合的限制性内切酶识别位点；
S2、将设计好的序列进行化学合成，然后接入pUC18载体的HindIII和EcoRI位点之间。
实施例3：
pDDID-1905质粒的转化与鉴定，具体步骤如下：
S1、将实施例2中的连接产物转化大肠杆菌Top10菌株感受态细胞；
S2、在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB(Luria-Bertani medium)平板上，挑取若干单克隆并转接至3mL含有100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃，250rpm培养过夜；
S3、取2mL菌液进行质粒提取与纯化(方法严格参照相应试剂盒说明书进行)；
S4、对获得的质粒进行酶切鉴定(组合1：HindIII和EcoRI；组合2：HindIII、EcoRI和XhoI)，确保获得正确的单克隆(图2)；
图2中，“M”泳道为DNA标准分子量(bp)；“1”泳道为HindIII和EcoRI双酶切结果；“2”泳道为HindIII、EcoRI和XhoI三酶切结果；
S5、然后对该克隆的质粒插入片段进行全序列测定，确保其序列与预期序列完全一致，将该质粒命名为pDDID-1905，其序列为SEQ ID NO:1。
实施例4：
pDDID-1905质粒的定量，具体步骤如下：
S1、利用分光光度法测定制备好的pDDID-1905质粒浓度(50μg/mL的双链DNA的OD280＝1，仪器使用ThermoFisher Scientific NanoDrop或Eppendorf BioSpectrometer等精密微量紫外-可见光分光光度计)；
S2、对同一管质粒，多次测定(3次以上)，求平均值；
S3、然后，可根据其分子量(4.64×10^6Da)计算其拷贝数(1μg的pDDID-1905质粒的物质的量为0.215pmol)。
实施例5：
利用pDDID-1905质粒扩增目的基因，具体步骤如下：
以1000拷贝的该质粒为模板，利用PCR法检测内标准基因Lectin和18种转化体的特征序列；对应的引物见表1，结果显示，19种靶标序列均能成功扩增(图3)；
图3中，“M”泳道为DNA标准分子量，其大小依次为2000、1000、750、500、250、100bp；“-”泳道为空白对照，模板为ddH2O；“pUC18”泳道为阴性对照，模板为pUC18质粒；“1”和“2”泳道为目的引物对靶标序列的检测结果的两个重复，模板均为pDDID-1905质粒。
表1PCR引物列表
Figure BDA0002357746380000081
Figure BDA0002357746380000091
Figure BDA0002357746380000101
Figure BDA0002357746380000111
Figure BDA0002357746380000121
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的质粒DNA
SEQ ID NO:1
pDDID-1905质粒序列
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGGGTGAGGATAGGGTTCTCTGCTGCCACGGGACTCGACATACCTGGGGAATCGCATGACGTGCTTTCTTGGTCTTTTGCTTCCAATTTGCCACACGCTAGCAGTAACATTGATCCTTTGGATCTTACAAGGTTTGTGTTGCATGAGGCCATCTAAATGTGACAGATCGAAGGAAGAAAGTGTAATAAGACGACTCTCACTACTCGATCGCGCCCTCTACTCCACCCCCATCCACATTTGGGACAAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAGGCTTGCAGATGGGCTGAGGGGGTCAAAGACCAAGAAGTGAGTTATTTATCAGCCAAGCATTCTATTCTTCTTATGTCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATACCCATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGCCATTATCGCCATTCCGCCACGATCATTAAGGCTATGGCGGCCGCAATGGCGCCGCCATATGAAACCCGCAATGCCATCGCTATTTGGTGGCATTTTTCCAAAAACCCGCAATGTCATACCGTCATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCCCTTCGCCGTTTAGTGTATAGGAAAGCGCAAACTGATGTTTGGAAGCATGAAACGGCAATAAAATATCAAAATCTTTATATTAAAGCTGAACAAAAGGGGCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGTTTTTATTTTCATTTCTTTCTAATAAAGGGGCAAACTAGTCTCGTAATATATTAGAGGTTAATTAAATTTATATTCCTCAAATAAAACCCAATTTTCATCCTTAAACGAACCTGCTGGGGCCTGACATAGTAGCTTGCTACTGGGGGTTCTTAAGCGTAGCCTGTGTCTTGCACTACTGCATGGGCCTGGCGCACCCTACGATTCAGTGTATATTTATGTGTGATAATGTCATGGGTTTTTATTGTTCTTGTTGTTTCCTCTTTAGGAACTTACATGTAAACGGTAAGGTCATCATGGAGGTCCGAATAGTTTGAAATTAGAAAGCTCGCAATTGAGGTCTACAGGCCAAATTCGCTCTTAGCCGTACAATATTACGTCAGGAATAAAGGAAGTACAGTAGAATTTAAAGGTACTCTTTTTATATATACCCGTGTTCTCTTTTTGGCTAGCTAGTGTTTTTTTCTCGACTTTTGTATGAAAATCATTTGTGTCAATAGTTTGTGTTATGTATTCATTGGTCACATAAATCAACTTCCAAATTTCAATATTAACTATAGCAGCCAGGTTAGAAATTCAGAATCATGTTACTCTATACGCATCCTTTAGGGCCTTTTGCCCGAGGTCGTTAGGTCGAATAGGCTAGGTTTACGAAAAAGAGACTAAGGCCGCTCTAGAGATCCGTCAACATGGTGGAGCACGACACTCTCGTCTACTCCAAGAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAGATCTTCGGGCTGCAGGAATTAATGTGGTTCATCCGTCTTTTTGTTAATGCGGTCATCAATACGTGCCTCAAAGATTGCCAAATAGATTAATGTGGTTCATCTCCCTATATGTTTTGCTTGTTGGATTTTGCTATCACATGTTTATTGCTCCAAATTCAAACCCTTCAATTTAACCGATGCTAATGAGTTATTTTTGCATGCTTTAATTTGTTTCTATCAAATGTTTATTTTTTTTTACTAGAAATAACTTATTGCATTTCATTCAAAATAAGATCATACATACAGGTTAAAATAAACATAGGGAACCCAAATGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTTGGTGATATGAAGATACATGCTTAGCATGCCCCAGGCACGCTTAGTGTGTGTGTCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCCCCATCAAGCATGATATCGAATACCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCGTTAACTGCAGGTCGACGGATCCCAGTGATAACAACACCCTGAGTCTCTTCAATTGTAAATGGCTTCATGTCCGGGAAATCTACATGGATCAGCAATGAGTATGATGGTCAATATGGAGAAAAAGAAAGAGTAATTACCAATTTTTTTTCAATTCAAAAATGTAGATGTCCGCAGCGTTATTATAAAATGAAAGTACATTTTGATAAAACGACAAATTACGATCCGTCGTATTTATAGGCGAAAGCAATAAACAAATTATTCTAATTCGGAAATCTTTATTTCGACGTGTCTACATTCACGTCCAAATGGGGGCTTAGATGAGAAACTTCACGATTTGGCGCCATCATACTCATTGCTGATCCATGTAGATTTCCCGGACTTTAGCTCAAAATGCATGTATTTATTAGCGTTCTGTCTTTTCGTTAATTTGTTCTCATCATAATATTGTGACAAAAATATAGCTAGGAAAGCATTCCATGCATATTTTGTAAGCAATGAAGTATATAGTGGATGCAATGTCTCTATATATTCACTAGTCGAGAAAATTGCGGACAGTTCTGAGATTGATTGGCTACGCGTCCGGACATGAAGCCATTTACAATTGACCATCATACTCAAAACTTCACGAGCAACTTGCTAATTTTGGAAAAGAGAAAGAAAAGACAAGTGTCGAGCATACACTTTAGATGCAACAAGCCTTCATAATGGGCCATGAAGATGGTTTCCAAAAAGCTCTTTGCCAAATTCAATTGCTTGCTTTTGAGGTAGATTTAATGTTATTTGATTGTTTGAAGAATGTCAAGAATGGGGAGTTGGTAAGGGAGTCTCAAATGGAGACTTTTGAAGAGGCTTCTGGAAATGAGACGACCTCCAAGGACTGCTCCACTCTTCCTTTTGGGCTTTTTTGTTTCCCGCTCTAGCGCTTCAATCGTGGTTATCAAGCTCCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCCCCATCAAGCTCTAGCTAGAGCGGCCGCGTTATCAAGCATCTGCAGGTCCTGCTCGAGTGGAAGCTAATTCTCAGTCCAAAGCCTCAACAAGGTCAGGGTACAGAGTCTGAGGCACCAACATTCTTGTGGTAATATTAAATTTTCTGTTGACTTTTTTTTACGTAAATGATACTTGATTAGAAGATGACTAATAAATGAAGGCTTTACATATACTACATAAGAAGGAGGTGGAGAAAGTGTATGTAACCGACAACAAAAAACTAATAGGAATATATAGGATGAAGAGATGAGAGAACCATCACAGAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGATAGTTACTAGATCGGGAATTGGGTACCATGCCCGGGCGGCCAGCATGGCCGTATCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCTAAACCCTAAACCAATGGCACCCGCTACTTGCTCTTGTCGTAAGTCAATAAATTAATATAAAAAAATACTTAAAACTTGTTACAACTAAATTAAAAATTTATTTTTAAATCATTCAAGCACCAGTCAGCATCATCACACCAAAAGTTAGGCCCGAATAGTTTGAAATTAGAAAGCTCGCAATTGAGGTCTACAGGCCAAATTCGCTCTTAGCCGTACAATATTACTCACCGGATCCTAACCGCCCATGTGAAGAAAATCCAACCATTGGAATAAAAAATAAAGTTTTTTCTTTGGAATTGCTAATGCTACAGCACTTATTGGTACTTGTCCTAAAAATGAAACTCTAGCTATATTTAGCACTTGATATTCATGAATCAAACTTCTCTATGAAATAACCGCGGTGCGCATCGGTGCCTGTTGATCCCGCGCAAGTTGGGATCTTGAAGCAAGTTCCGCTCATCACTAAGTCGCTTAGCATGTTTGACCTTCTCGGGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCATAAGGGTGTATACTATAGTTAGTTGTATATGGCTAGTACTATGGCGGCGGTTCCGACCACCACGAGACCGTAGTACAACATGGGCATGCTGTTGCTCTTGGTTGATGGAGAGGAGGGTGGAGGAGGGGATGAGATGGTGAAGGGGCTTAGAACATCACCCATGATGGTTATAATTTAGTGTTTTGGTGAAATTCGGAGCTCTAGAGGAATAGTTAGCGAATGTGACTCGAACATTGCACGACTCCCATGACACCTGATATGTATATATAGATCCAGATGAGAGACTCACACGTACATTTTACTCATCCCAATTATAAATACATAAACACTATAGAACACCACTAAATTGCTCTTTGGAGTTTATTTTGTAGATATTTCCCCTCACTTTGGAGATCTCCAGTCAGCATCATCACACCAAAAGTTAGGCCCGAATAGTTTGAAATTAGAAAGCTCGCAATTGAGGTCTGTCATTTAAATGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC
SEQ ID NO:2
Lectin靶标序列
GGGTGAGGATAGGGTTCTCTGCTGCCACGGGACTCGACATACCTGGGGAATCGCATGACGTGCTTTCTTGGTCTTTTGCTTCCAATTTGCCACACGCTAGCAGTAACATTGATCCTTTGGATCTTACAAGGTTTGTGTTGCATGAGGCCATCTAAATGTGACAGATCGAAGGAAGAAAGTGTAATAAGACGACTCTCACTACTCGATCGCGCCCTCTACTCCACCCCCATCCACATTTGGGACAAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAGGCTTGCAGATGGGC
SEQ ID NO:3
A2704-12靶标序列
TGAGGGGGTCAAAGACCAAGAAGTGAGTTATTTATCAGCCAAGCATTCTATTCTTCTTATGTCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATaCCCATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGG
SEQ ID NO:4
A5547-127靶标序列
CGCCATTATCGCCATTCCGCCACGATCATTAAGGCTATGGCGGCCGCAATGGCGCCGCCATATGAAACCCGCAATGCCATCGCTATTTGGTGGCATTTTTCCAAAAACCCGCAATGTCATACCGTCATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGC
SEQ ID NO:5
CV127靶标序列
CCTTCGCCGTTTAGTGTATAGGAAAGCGCAAACTGATGTTTGGAAGCATGAAACGGCAATAAAATATCAAAATCTTTATATTAAAGCTGAACAAAAGGGGCCCTCCTTATTTATCCCCTTAGTTTTTATTTTCATTTCTTTCTAATAAAGGGGCAAACTAGTCTCGTAATATATTAGAGGTTAATTAAATTTATATTCCTCAAATAAAACCCAATTTTCATCCTTAAACGAACCTGCT
SEQ ID NO:6
DAS44406-6靶标序列
GGGGCCTGACATAGTAGCTTGCTACTGGGGGTTCTTAAGCGTAGCCTGTGTCTTGCACTACTGCATGGGCCTGGCGCACCCTACGATTCAGTGTATATTTATGTGTGATAATGTCATGGGTTTTTATTGTTCTTGTTGTTTCCTCTTTAGGAACTTACATGTAAACGGTAAGGTCATCATGGAGGTCCGAATAGTTTGAAATTAGAAAGCTCGCAATTGAGGTCTACAGGCCAAATTCGCTCTTAGCCGTACAATATTA
SEQ ID NO:7
DP305423靶标序列
CGTCAGGAATAAAGGAAGTACAGTAGAATTTAAAGGTACTCTTTTTATATATACCCGTGTTCTCTTTTTGGCTAGCTAGTGTTTTTTTCTCGACTTTTGTATGAAAATCATTTGTGTCAATAGTTTGTGTTATGTATTCATTGGTCACATAAATCAACTTCCAAATTTCAATATTAACTATAGCAGCCAGGTTAGAAATTCAGAATCATGTTACTCTATACGCATCCTTTAGGGC
SEQ ID NO:8
DP356043靶标序列
CTTTTGCCCGAGGTCGTTAGGTCGAATAGGCTAGGTTTACGAAAAAGAGACTAAGGCCGCTCTAGAGATCCGTCAACATGGTGGAGCACGACACTCTCGTCTACTCCAAGAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGC
SEQ ID NO:9
FG72靶标序列
TCGGGCTGCAGGAATTAATGTGGTTCATCCGTCTTTTTGTTAATGCGGTCATCAATACGTGCCTCAAAGATTGCCAAATAGATTAATGTGGTTCATCTCCCTATATGTTTTGCTTGTTGGATTTTGCTATCACATGTTTATTGCTCCAAA
SEQ ID NO:10
GTS 40-3-2靶标序列
TTCAAACCCTTCAATTTAACCGATGCTAATGAGTTATTTTTGCATGCTTTAATTTGTTTCTATCAAATGTTTATTTTTTTTTACTAGAAATAACTTATTGCATTTCATTCAAAATAAGATCATACATACAGGTTAAAATAAACATAGGGAACCCAAATGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTT
SEQ ID NO:11
MON87701靶标序列
TGGTGATATGAAGATACATGCTTAGCATGCCCCAGGCACGCTTAGTGTGTGTGTCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCCCCATCAAGCaTGATATCGAATaCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCGTTAACTGCAGGTCGACGGATCC
SEQ ID NO:12
MON87705靶标序列
CAGTGATAACAACACCCTGAGTCTCTTCAATTGTAAATGGCTTCATGTCCGGGAAATCTACATGGATCAGCAATGAGTATGATGGTCAATATGGAGAAAAAGAAAGAGTAATTACCAATTTTTTTTCAATTCAAAAATGTAGATGTCCGCAGCGTTATTATAAAATGAAAGTACATTTTGATAAAACGACAAATTACGATCCGTCGTATTTATAGGCGAAAGCAATAAACAAATTATTCTAATTCGGAAATCTTTATTTCGACGTGTCTACATTCACGTCCAAATGGGGGCTTAGATGAGAAACTTCACGATTTGGCG
SEQ ID NO:13
MON87708靶标序列
CCATCATACTCATTGCTGATCCATGTAGATTTCCCGGACTTTAGCTCAAAATGCATGTATTTATTAGCGTTCTGTCTTTTCGTTAATTTGTTCTCATCATAATATTGTGACAAAAATATAGCTAGGAAAGCATTCCATGCATATTTTGTAAGCAATGAAGTATATAGTGGATGCAATGTCTCTATATATTCACTAGTCGAGAAAATTGCGGACAGTTCTGAGATTGATTGGCT
SEQ ID NO:14
MON87769靶标序列
CCGGACATGAAGCCATTTACAATTGACCATCATACTCAAAACTTCACGAGCAACTTGCTAATTTTGGAAAAGAGAAAGAAAAGACAAGTGTCGAGCATACACTTTAGATGCAACAAGCCTTCATAATGGGCCATGAAGATGGTTTCCAAAAAGCTCTTTGCCAAATTCAATTGCTTGCTTTTGAGGTAGATTTAATGTTATTTGATTGTTTGAAGAATGTCAAGAATGGGGAGTTGGTAAGGGAGTCTCAAATGGAGACTTTTGAAGAGGCTTCTGGAAATGAGACGACCTCCAAGGA
SEQ ID NO:15
MON89788靶标序列
CTGCTCCACTCTTCCTTTTGGGCTTTTTTGTTTCCCGCTCTAGCGCTTCAATCGTGGTTATCAAGCTCCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCCCCATCAAGCTCTAGCTAGAGCGGCCGCGTTATCAAGCATCTGCAGGTCCTGCTCGAGTGGAAGCTAATTCTCAGTCCAAAGCCTCAACAAGGTCAGGGTACAGAGTCT
SEQ ID NO:16
SYHT0H2靶标序列
GAGGCACCAACATTCTTGTGGTAATATTAAATTTTCTGTTGACTTTTTTTTACGTAAATGATACTTGATTAGAAGATGACTAATAAATGAAGGCTTTACATATACTACATAAGAAGGAGGTGGAGAAAGTGTATGTAACCGACAACAAAAAACTAATAGGAATATATAGGATGAAGAGATGAGAGAACCATCACAGAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGATAGTTACTAGATCGGGAATTGGGTACCATGCCCGGGCGGCCAGCATGGCCGTATCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCTAAACCCTAAACCAATGGCAC
SEQ ID NO:17
DAS68416-4靶标序列
CCGCTACTTGCTCTTGTCGTAAGTCAATAAATTAATATAAAAAAATACTTAAAACTTGTTACAACTAAATTAAAAATTTATTTTTAAATCATTCAAGCACCAGTCAGCATCATCACACCAAAAGTTAGGCCCGAATAGTTTGAAATTAGAAAGCTCGCAATTGAGGTCTACAGGCCAAATTCGCTCTTAGCCGTACAATATTACTCACCGGATCCTAACCG
SEQ ID NO:18
DAS81419靶标序列
CCCATGTGAAGAAAATCCAACCATTGGAATAAAAAATAAAGTTTTTTCTTTGGAATTGCTAATGCTACAGCACTTATTGGTACTTGTCCTAAAAATGAAACTCTAGCTATATTTAGCACTTGATATTCATGAATCAAACTTCTCTATGAAATAACCGCGGTGCGCATCGGTGCCTGTTGATCCCGCGCAAGTTGGGATCTTGAAGCAAGTTCCGCTCATCACTAAGTCGCTTAGCATGTTTGACCTTCTCGG
SEQ ID NO:19
SHZD32-01靶标序列
GAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCATAAGGGTGTATACTATAGTTAGTTGTATATGGCTAGTACTATGGCGGCGGTTCCGACCACCACGAGACCGTAGTACAACATGGGCATGCTGTTGCTCTTGGTTGATGGAGAGGAGGGTGGAGGAGGGGATGAGATGGTGAAGGGGCTTAGAACATCACCCATGATGGTTATAATTTAGTGTTTTGGTGAAATTCG
SEQ ID NO:20
MON87751靶标序列
TAGAGGAATAGTTAGCGAATGTGACTCGAACATTGCACGACTCCCATGACACCTGATATGTATATATAGATCCAGATGAGAGACTCACACGTACATTTTACTCATCCCAATTATAAATACATAAACACTATAGAACACCACTAAATTGCTCTTTGGAGTTTATTTTGTAGATATTTCCCCTCACTTTGGAGATCTCCAGTCAGCATCATCACACCAAAAGTTAGGCCCGAATAGTTTGAAATTAGAAAGCTCGCAATTGAGGTCTGTC
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的质粒DNA，其特征在于：包括重组质粒pDDID-1905，所述重组质粒pDDID-1905的序列为SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的质粒DNA，其特征在于：所述重组质粒pDDID-1905的外源插入序列包括一种大豆内标准基因Lectin的部分序列，具体为SEQ ID NO:2的特征DNA序列。
3.根据权利要求2所述的一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的质粒DNA，其特征在于：所述重组质粒pDDID-1905的外源插入序列还包括18种转基因大豆转化体特征DNA序列，包括：A2704-12(SEQ ID NO:3)、A5547-127(SEQ ID NO:4)、CV127(SEQID NO:5)、DAS44406-6(SEQ ID NO:6)、DP305423(SEQ ID NO:7)、DP356043(SEQ ID NO:8)、FG72(SEQ ID NO:9)、GTS 40-3-2(SEQ ID NO:10)、MON87701(SEQ ID NO:11)、MON87705(SEQ ID NO:12)、MON87708(SEQ ID NO:13)、MON87769(SEQ ID NO:14)、MON89788(SEQ IDNO:15)、SYHT0H2(SEQ ID NO:16)、DAS68416-4(SEQ ID NO:17)、DAS81419(SEQ ID NO:18)、SHZD32-01(SEQ ID NO:19)和MON87751(SEQ ID NO:20)的特征DNA序列。
4.根据权利要求3所述的一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的质粒DNA，其特征在于：所述转化体特征DNA序列分别存在于18种转基因大豆转化体中以及转化体的衍生物及其相应的下游产品中。
5.根据权利要求4所述的一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的质粒DNA，其特征在于：所述重组质粒pDDID-1905的外源插入序列中分布有多个单一性限制性内切酶识别位点。
6.根据权利要求5所述的一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的质粒DNA，其特征在于：所述重组质粒pDDID-1905可作为阳性参照物或阳性质粒标准分子，用于对1种大豆内标准基因Lectin、18种大豆转化体及其衍生物、相应产品的定性检测。
7.根据权利要求6所述的一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的质粒DNA，其特征在于：所述重组质粒pDDID-1905可作为阳性参照物或阳性质粒标准分子，用于对1种大豆内标准基因Lectin和18种大豆转化体及其衍生物的定量检测。
8.根据权利要求7所述的一种适用于18种转基因大豆转化体及其衍生物特异性检测的质粒DNA，其特征在于：所述重组质粒pDDID-1905可被直接使用，也可被包含在相应的试剂盒中。
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