CN102639695B

CN102639695B - 转基因植物细胞的制造方法

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Publication number: CN102639695B
Application number: CN201080048566.1A
Authority: CN
Inventors: 土岐精一; 刑部敬史
Original assignee: Japan As Represented By Director General Of Ministry Of Agriculture Forestry An
Current assignee: Japan As Represented By Director General Of Ministry Of Agriculture Forestry An; National Institute of Agrobiological Sciences
Priority date: 2009-10-26
Filing date: 2010-10-25
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2030-10-25
Also published as: CN102639695A; WO2011052539A1; KR20120098681A; EP2495313A4; JPWO2011052539A1; JP5780596B2; US20130074220A1; EP2495313A1

Abstract

通过使用人为地抑制参与通过非同源末端接合的修复的蛋白质的功能而得的植物细胞，可以在通过锌指核酸酶诱导DNA双链断裂之后的、通过非同源末端接合的修复过程中，飞跃性地提高非沉默突变的引入效率。

Description

转基因植物细胞的制造方法

技术领域

本发明涉及在染色体上的特定靶DNA部位引入了突变的植物细胞的制造方法。更详细地说，涉及：在介由通过限制性内切核酸酶的DNA双链断裂和非同源末端接合，制造在染色体上的靶DNA部位引入了突变的植物细胞的方法中，利用参与断裂的双链DNA的修复的蛋白质的功能被抑制了的植物细胞的方法。

背景技术

植物生物技术的主要焦点是作物的遗传修饰及改良。为了该目的，对于作为模型植物的拟南芥属、和/或包含稻属、玉米属、小麦属、大豆属及番茄的很多作物中，已完成大规模的基因组分析。由此可利用庞大量的基因组序列信息，以该序列信息为基础，开发能够直接改变高等植物的基因组上的目标基因的方法的必要性提高。但是，到目前为止，尚未开发出有效且通用性高的方法。

最广泛使用的定点诱变策略，是利用同源重组的基因打靶。有效的基因打靶法在酵母(非专利文献1)、小鼠(非专利文献2)中已经利用了20年以上。进而，在拟南芥属或稻属中也已进行基因打靶(非专利文献3～6)。基因打靶现象，典型地在被处理的细胞中以较少的比例发生(在酵母中每细胞10^-6～10^-2的基因打靶现象，在小鼠ES细胞中每细胞10^-7～10^-5的基因打靶现象)。在高等植物中，每细胞的基因打靶效率极低(每细胞小于10^-7的基因打靶现象)(非专利文献3、7～11)。

认为高等植物的这样低的基因打靶频率是由用于修复DNA双链断裂的、同源重组与非同源末端接合(NHEJ)的竞争而产生的，考虑主要的双链断裂的修复途径是非同源末端接合(非专利文献12、13)。作为其结果，在供体分子的末端，与同源重组相比，非同源末端接合更参与该过程，因而基因打靶效率减少。根据大范围的数据，启示高等植物中通过非同源末端接合的双链断裂的修复容易产生差错。双链断裂往往通过伴随插入和/或缺失的非同源末端接合过程而被修复(非专利文献14、15)。如果合并考虑这些观察结果，则启示：基于用于高等植物中的靶向化诱变的非同源末端接合的策略，与基于同源重组的策略相比是有效的。实际显示，在染色体上以低频率产生断裂的限制性酶I-SceI的表达，在拟南芥属、烟草属中诱导I-SceI的切割部位的突变(非专利文献16)。尽管如此，但可利用该酶的限于很少产生的天然识别部位或人工靶部位。

为了克服该问题，已开发出锌指核酸酶(ZFNs)。锌指核酸酶是由以锌指为基础的人工结合结构域和DNA切割结构域构成的嵌合蛋白质。对于锌指核酸酶，通过修饰其DNA结合部位，可特别设计成事实上能切割任何长度的双链DNA序列那样(非专利文献17、18)。

基于非同源末端接合的靶向化诱变的策略，最近通过将人工的锌指核酸酶用于产生特定基因组位点的双链断裂而在几种生物中得到发展(非专利文献19～23)。通过利用非同源末端接合的双链断裂的修复，从而屡次在结合部位产生缺失和/或插入。2组使用锌指核酸酶，在斑马鱼的胚中成功地使基因进行遗传性突变。特异的锌指结构基序已设计成识别可区别的DNA序列那样(非专利文献19、20)。将编码锌指核酸酶的mRNA导入单细胞期胚中，从而高比例的动物保持所需的突变和表型。由这些研究证实，如果利用锌指核酸酶，则可特异且有效地在生殖系列中所需的座位制作出遗传性突变，而且通过该锌指核酸酶诱导的等位基因被传播至后代。

Lloyd等(非专利文献21)，在拟南芥属中，为了定点诱变而使用了锌指核酸酶。并且报告，如预期的那样，通过诱导锌指核酸酶表达，在后代幼植物中，染色体上的识别部位以7.9％的频率产生突变。但是，在该报告中，使用了以下模型系，所述模型系使用以往所报告的对于3指型的ZFN-QQR(非专利文献24)的人工靶部位。因此，对于在拟南芥属中内源性基因的靶部位，锌指核酸酶是否有效地产生断裂、诱发突变，尚不明确。另外，最近报告了在玉米属和烟草属中可通过锌指核酸酶在内源性的基因的靶部位进行诱变(非专利文献25、26)，但关于改善突变引入效率的可能性没有报告。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开2005-237316号公报

非专利文献

非专利文献1：Rothstein R Methods Enzymol 194：281-301，1991

非专利文献2：Capecci MR Science 244：1288-1292，1989

非专利文献3：Hanin M，et al.Plant J 28：671-677，2001

非专利文献4：Halfter U，et al.Mol Gen Genet 231：186-193，1992

非专利文献5：Hrouda M & Paszkowski J Mol Gen Genet 243：106-111，1994

非专利文献6：Lee KY，et al.Plant Cell 2：415-425，1990

非专利文献7：Offringa R，et al.EMBO J 9：3077-3084，1990

非专利文献8：Paszkowski J，et al.EMBO J 7：4021-4026，1988

非专利文献9：Terada R，et al.Nat Biotechnol 20：1030-1034，2002

非专利文献10：Endo M，Osakabe K，Ichikawa H，Toki S Plant CellPhysiol 47：372-379，2006

非专利文献11：Endo M，et al.Plant J 52：157-166，2007

非专利文献12：Ray A & Langer M Trends Plant Sci 7：435-440，2002

非专利文献13：Britt AB & May GD Trends Plant Sci 8：90-95，2003

非专利文献14：Gorbunova VV & Levy AA Trends Plant Sci 4：263-269，1999

非专利文献15：Britt AB Trend in Plant Sci 4：20-25，1999

非专利文献16：Kirik A，et al.EMBO J 19：5562-5566，2000

非专利文献17：Kim YG，et al.Proc Natl Acad Sci USA 93：1156-1160，1996

非专利文献18：Cathomen T & Joung JK Mol Ther 16：1200-1207，2008

非专利文献19：Doyon Y，et al.Nat Biotechnol 26：702-708，2008

非专利文献20：Meng X，et al.Nat Biotechnol 26：695-701，2008

非专利文献21：Lloyd A，et al.Proc Natl Acad Sci USA 102：2232-2237，2005

非专利文献22：Beumer KJ，et al.Proc Natl Acad Sci USA 105：19821-19826，2008

非专利文献23：Santiago Y，et al.Proc Natl Acad Sci USA 105：5809-5814，2008

非专利文献24：Smith J，et al.Nucleic Acids Res 28：3361-3369，2000

非专利文献25：Shukla VK，et al.Nature 459：437-441，2009

非专利文献26：Townsend JA，et al.Nature 459：442-445，2009

发明内容

发明要解决的课题

本发明是鉴于这样的状况而完成的，其目的在于提供一种方法，所述方法是在利用限制性内切核酸酶，在染色体上的特定靶DNA部位引入突变的植物细胞的制造方法中，能够有效地引入突变的方法。

解决课题的方法

本发明者们为了研究是否即使在植物中的内源性基因上存在锌指核酸酶的靶DNA部位时，也产生通过锌指核酸酶的DNA双链断裂和通过其后的非同源末端接合的修复，首先，特别设计了在拟南芥属的内源性基因上具有靶DNA部位的锌指核酸酶。然后，在拟南芥属中导入表达该锌指核酸酶的载体，诱导靶DNA部位的双链断裂，进行靶DNA部位的突变的检测。其结果本发明者们发现，通过在内源性基因上的靶DNA部位的双链断裂和其后的通过非同源末端接合的修复，在拟南芥属的内源性基因上也可引入突变。但是判明了，多数靶DNA部位的突变不在其编码的蛋白质的氨基酸序列中带来变化，是不影响表型的沉默突变或点突变。即使为了通过引入突变来来植物基因的功能，或为了将作物进行遗传性改良而制作出具有有用的性状的作物，也不优选在引入的突变中以高频率产生沉默突变。另外，在点突变的情况下，可能产生回复突变，从突变的稳定性的观点出发，不优选引入的突变为点突变。

因此，本发明者们接着对于用于提高非沉默、或非点突变的突变的频率的方法进行了深入研究。在这里，本发明者们建立了参与通过非同源末端接合的修复的蛋白质的活性抑制DNA双链断裂末端的大的缺失和/或插入等剧烈突变的引入这样的假说，并且使用这些蛋白质的功能被抑制了的细胞，通过锌指核酸酶诱导靶DNA部位的双链断裂，调查其后通过非同源末端接合引入的突变。其结果判明，通过抑制这些蛋白质的功能，通过DNA双链断裂后的非同源末端接合所带来的突变频率没有变化，但产生的突变大部分成为伴随很可能影响拟南芥属的表型的缺失的突变。

到目前为止，报告了通过抑制非同源末端接合所需的蛋白质的功能，从而非同源重组的频率减少，同源重组的频率提高(专利文献1)，但本发明者们阐明，即使在抑制了这些蛋白质的功能的情况下，作为非同源重组的不正确的非同源末端接合的频率不仅没有减少，反而通过非同源末端接合引入的突变的质剧烈变化。

即，本发明者们发现，在植物中，即使在靶DNA部位存在于内源性基因上的情况下，也可以通过限制性内切核酸酶来实现DNA双链断裂，并且发现，通过使用人为地抑制了参与通过非同源末端接合的修复的蛋白质的功能的植物细胞，可以在断裂的双链DNA的通过非同源末端接合的修复过程中飞跃性地提高非沉默突变频率，从而完成了本发明。

因此，本发明涉及：利用锌指核酸酶等限制性内切核酸酶，制造在染色体上的特定靶DNA部位引入了突变的植物细胞的方法中使用人为地抑制了参与非同源末端接合的蛋白质的功能的植物细胞的方法，通过该方法制造的植物细胞，以及含有该植物细胞的植物体，更详细地说，提供下述发明。

(1)转基因植物细胞的制造方法，其中，在参与通过非同源末端接合的修复的蛋白质的功能被人为地抑制了的植物细胞中，表达限制性内切核酸酶，在该植物细胞的染色体中的限制性内切核酸酶的靶DNA部位诱导双链断裂，通过该植物细胞中的断裂的靶DNA部位的通过非同源末端接合的修复过程，在该靶DNA部位产生突变；

(2)根据(1)所述的方法，其中，参与通过非同源末端接合的修复的蛋白质为Ku70及Ku80的至少1种；

(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中，限制性内切核酸酶为锌指核酸酶；

(4)通过(1)～(3)的任一项所述的方法制造的转基因植物细胞；

(5)植物体，其含有(4)所述的细胞。

(6)植物体，其是(5)所述的植物体的后代或克隆；

(7)(5)或(6)所述的植物体的繁殖材料；

(8)包含下述(a)～(c)的至少一者的试剂盒，其用于(1)～(3)的任一项所述的方法，

(a)参与断裂的双链DNA的修复的蛋白质的功能被人为地抑制了的植物细胞；

(b)用于在植物细胞中人为地抑制参与断裂的双链DNA的修复的蛋白质的功能的DNA构建物；

(c)用于使限制性内切核酸酶在植物细胞内进行表达的DNA构建物。

发明效果

到目前为止，已知通过限制性内切核酸酶处理可以在高等植物中对靶基因引入突变，但引入的突变多为单碱基取代，突变是没有在表型中表现的沉默突变的情况较多。另外，在突变为单碱基取代的情况下，可能产生回复突变。与此相对，通过使用人为地抑制了参与非同源末端接合的蛋白质的功能的植物细胞的本发明方法，可在限制性内切核酸酶的切割部位以高频率产生数个碱基～10个碱基左右的缺失。因此，通过本发明的方法，可有效地直接诱导在植物表型中表现的可能性高的突变。

附图说明

图1是显示锌指核酸酶表达载体的构建过程的图。

图2是显示锌指核酸酶表达双元载体的T-DNA的图。图中，“LB”表示左侧边界序列；“RB”表示右侧边界序列；“gfbsd2”表示GFP与灭瘟素S耐性基因的融合基因、通过2x花椰菜花叶病毒35S基因启动子进行作用的gfbsd2表达盒、及胭脂碱合成酶基因的终止子；“Phsp18.2”表示拟南芥属HSP18.2基因启动子；“Tp5”表示作为拟南芥属的polyA结合蛋白质的PAB5基因的终止子。

图3是显示atku80细胞的ABI4基因通过锌指核酸酶而断裂后，通过非同源末端接合而修复的DNA的频率和正确性的图。(A)显示接合部的缺失的长度的分布。缺失是DNA双链断裂的两侧部位的失去碱基对的合计。(B)是在通过锌指核酸酶而断裂后，由野生型植物和atku80植物的基因组DNA得到的、修复后的DNA序列的例子。以黑体字表示锌指核酸酶识别部位。以小写字母表示推定断裂部位。用下划线表示突变，用连字符表示缺失。(C)显示通过锌指核酸酶诱导DNA双链断裂之后的突变率。不正确的末端接合的相对的频率，由相对于进行试验的DNA克隆的数的、通过SURVEYOR核酸酶分析显示阳性的DNA克隆的数算出。反复进行3次实验，将数据以平均±SD来表示。

具体实施方式

本发明基于如下的本发明者们的发现而完成：如果在制造介由通过限制性内切核酸酶诱导的DNA双链断裂而在染色体上的特定靶DNA部位引入了突变的植物细胞时，利用参与通过非同源末端接合的修复的蛋白质的功能被抑制了的植物细胞，则引入的突变的质剧烈变化。

本发明的转基因植物细胞的制造方法的特征在于，在参与通过非同源末端接合的修复的蛋白质的功能被人为地抑制了的植物细胞中，表达限制性内切核酸酶，在该植物细胞的染色体中的限制性内切核酸酶的靶DNA部位诱导双链断裂，通过该植物细胞中的断裂的靶DNA部位的通过非同源末端接合的修复过程，在该靶DNA部位产生突变

通过使用参与通过非同源末端接合的修复的蛋白质的功能被抑制了的植物细胞，可以在双链断裂的靶DNA部位的通过非同源末端接合的修复过程中，飞跃性地提高非沉默突变的频率。通过本发明，与野生型对照(参与通过非同源末端接合的修复的蛋白质的功能未被抑制的情况)相比，通常可将非沉默突变的频率提高2倍以上，优选提高2.5倍以上(例如，约2.7倍)。通过本发明的方法引入靶DNA部位的非沉默突变，典型地为碱基的缺失。如图3所示，通过本发明的方法，与野生型的情况相比，可以提高在靶DNA部位引入1～3个碱基的缺失、4～6个碱基的缺失、7～15个碱基的缺失及超过15个碱基的缺失的频率。通过本发明，特别是可以使引入4个碱基以上的缺失的频率与野生型的情况相比飞跃性地提高。

在本发明中，作为成为抑制功能的对象的“参与通过非同源末端接合的修复的蛋白质”，只要是在抑制其功能时，可以在双链断裂的靶DNA部位的通过非同源末端接合的修复过程中提高上述非沉默突变的频率的蛋白质即可，没有特别限制。优选为Ku70或Ku80。另外，关于来自拟南芥属的Ku70及Ku80基因，在文献(Tamura K，et al.Plant J，29：771-781，2002)中公开，关于来自绿豆(Mung bean)的Ku70及Ku80基因，在文献(LiuPF，et al.Biochem Biophys Acta，1769：443-454，2007)中公开。将来自拟南芥属的Ku70的氨基酸序列示于序列号1，将编码该氨基酸序列的DNA的碱基序列示于序列号2。另外，将来自拟南芥属的Ku80的氨基酸序列示于序列号3，将编码该氨基酸序列的DNA的碱基序列示于序列号4。

在本发明中所谓“蛋白质的功能的抑制”，包含蛋白质的功能的完全抑制和部分抑制的两方面的意思。作为抑制蛋白质的功能的方法，可以使用例如，利用RNA干涉技术的方法、利用反义技术的方法、利用核酶技术的方法、破坏靶基因的方法等本领域技术人员公知的方法。

在利用RNA干涉的方法中，使用编码与靶基因的转录物互补的dsRNA(双链RNA)的DNA。如果在细胞中导入约40～数百碱基对的dsRNA，则具有解旋酶结构域的称为Dicer的RNaseIII样的核酸酶在ATP存在下将dsRNA由3’末端开始以约每21～23个碱基对进行切割，产生siRNA(短干涉RNA，short interference RNA)。特异的蛋白质与该siRNA结合，形成核酸酶复合体(RISC：RNA-induced silencing complex(RNA诱导沉默复合体))。该复合体识别并结合与siRNA相同的序列，通过RNaseIII样的酶活性而在siRNA的中央部切割靶基因的转录物(mRNA)。另外，与该途径独立地，siRNA的反义链与mRNA结合并作为RNA依赖性RNA聚合酶(RsRP)的引物发挥作用，合成dsRNA。还考虑了该dsRNA再成为Dicer的底物，产生新的siRNA而放大作用的途径。

编码dsRNA的DNA包含：将编码针对靶基因的转录物(mRNA)的任一区域的反义RNA进行编码的反义DNA、和编码该mRNA的任一区域的正义RNA的正义DNA，通过该反义DNA及该正义DNA，可分别使反义RNA及正义RNA表达。另外，可通过这些反义RNA及正义RNA来制作dsRNA。

作为将sRNA的表达系统保持于载体等时的构成，存在以下情况：由同一载体来表达反义RNA及正义RNA的情况，和由不同的载体来分别表达反义RNA和正义RNA的情况。作为由同一载体来表达反义RNA及正义RNA的构成，例如，在反义DNA及正义DNA的上游分别构建各自连接有polIII系那样的能表达短RNA的启动子的反义RNA表达盒和正义RNA表达盒，将这些盒沿同方向或逆方向插入载体的构成。

另外，也可以以在不同的链上对向的形式，构成将反义DNA和正义DNA逆向配置而成的表达系统。在该构成中，具有反义RNA编码链与正义RNA编码链成对的一个双链DNA(siRNA编码DNA)，在其两侧以能由各个链表达反义RNA和正义RNA的形式对向地具有启动子。此时，为了避免在正义RNA和反义RNA的下游添加多余的序列，优选各个链(反义RNA编码链，正义RNA编码链)的3’末端分别具有终止子。该终止子可使用连续有4个以上A(腺嘌呤)碱基的序列等。另外，优选在该回文序列型的表达系统中，二个启动子的种类不同。

另外，作为由不同的载体来表达反义RNA和正义RNA的构成，例如，在反义DNA及正义DNA的上游分别构建各自连接有polIII系那样的能表达短RNA的启动子的反义RNA表达盒和正义RNA表达盒，使这些框在不同的载体中保持的构成。

作为本发明中使用的dsRNA，优选为siRNA。siRNA是指由在细胞内不显示毒性的范围的短链构成的双链RNA。只要能够抑制靶基因的表达且不显示毒性，则对其链长没有特别限制。dsRNA的链长例如为15～49个碱基对，优选为15～35个碱基对，进一步优选为21～30个碱基对。

作为编码dsRNA的DNA，也可使用在靶序列的反向重复之间插入适当的序列(优选为内含子序列)，能制成具有发夹结构的双链RNA(自身互补发夹RNA，self-complementary‘hairpin’RNA(hpRNA))这样的构成(Smith，N.A.，et al.Nature，407：319，2000，Wesley，S.V.，et al.Plant J.27：581，2001，Piccin，A.，et al.Nucleic Acids Res.29：E55，2001)。

编码dsRNA的DNA不必与靶基因的碱基序列完全一致，但具有至少70％以上、优选为80％以上、进一步优选为90％以上(例如，95％、96％、97％、98％、99％以上)的序列同一性。序列同一性可通过BLAST程序来确定。

dsRNA中的RNA彼此配对的双链RNA的部分不限于完全配对，可包含由于错配(对应的碱基非互补)、凸起(没有与其中一条链对应的碱基)等而不配对的部分。本发明中，dsRNA中的RNA彼此配对的双链RNA区域中也可包含凸起及错配的两者。

另外，在利用反义技术的方法中，使用编码与靶基因的转录物互补的反义RNA的DNA(反义DNA)。作为反义DNA抑制靶基因的表达的作用，可举出：通过三链形成的转录起始抑制、通过与由RNA聚合酶形成了局部性开环结构的部位形成杂种的转录抑制、通过与正在进行合成的RNA的形成杂种的转录抑制、通过在内含子与外显子的接合点形成杂种的剪接抑制、通过与剪接体形成部位形成杂种的剪接抑制、通过与mRNA形成杂种的由核向细胞质的转移抑制、通过与加帽部位或多聚(A)添加部位形成杂种的剪接抑制、通过与翻译起始因子结合部位形成杂种的翻译起始抑制、通过与起始密码子附近的核糖体结合部位形成杂种的翻译抑制、通过与mRNA的翻译区和/或多核糖体结合部位形成杂种的肽链延伸阻止、及通过与核酸和蛋白质的相互作用部位形成杂种的基因表达抑制等。这些作用阻碍转录、剪接或翻译的过程，抑制靶基因的表达(平岛和井上“新生化学实验讲座2核酸IV基因的复制与表达(遺伝子の複製と発现)”，日本生化学会编，东京化学同人，pp.319-347，1993)。本发明中所使用的反义DNA可通过上述的任一作用来抑制靶基因的表达。作为一个方式，如果在靶基因的mRNA的5’端附近的非翻译区设计互补的反义序列，则对基因的翻译抑制是有效的。但是，也可使用与编码区或者3’侧的非翻译区互补的序列。这样，不仅包含基因的翻译区的序列的反义序列的DNA，包含非翻译区的序列的反义序列的DNA也包含在本发明中所利用的反义DNA中。使用的反义DNA连接在适当的启动子的下游，优选在3’侧连接包含转录终止信号的序列。

反义DNA可以基于靶基因的序列信息通过硫代磷酸酯法(Stein，Nucleic Acids Res.，16：3209-3221，1988)等来调制。反义DNA的序列优选为靶基因的转录物的互补序列，但只要能够有效地抑制基因的表达，则也可以不是完全互补的。所转录的RNA相对于靶基因的转录物优选具有90％以上(例如，95％、96％、97％、98％、99％以上)的互补性。为了有效地抑制靶基因的表达，反义DNA的长度至少为15个碱基以上，优选为100个碱基以上，进一步优选为500个碱基以上。通常，所使用的反义DNA的长度比5kb短，优选比2.Skb短。

另外，在利用核酶技术的方法中，使用编码具有使靶基因的转录物特异性开裂的核酶活性的RNA的DNA。核酶中有如组I内含子型、RNaseP所含的M1RNA那样的400个核苷酸以上大小的物质，也有称为锤头型或发夹型的具有40个核苷酸左右的活性结构域的物质(小泉诚及大塚荣子，蛋白质核酸酶(タンパク質核酸酵素)，35：2191，1990)。

例如，已显示：锤头型核酶的自身切割结构域切割G13U14C15的C15的3’侧，但U14与9位的A形成碱基对对于活性是重要，15位的碱基除了C以外是A或U也可切割(Koizumi，et al.，FEBS Lett.228：225，1988)。如果设计核酶的底物结合部使其与靶部位附近的RNA序列互补，则能制作出识别靶RNA中的UC、UU或UA等序列的作为限制性酶的RNA切割核酶(Koizumi et.al.，FEBS Lett.239：285，1988，小泉诚及大塚荣子，蛋白质核酸酶，35：2191，1990，Koizumi et.al.，Nucleic.Acids.Res.17：7059，1989)。

另外，发夹型核酶对于本发明的目的也是有用的。发夹型核酶在例如烟草环斑病毒的卫星RNA的负链中发现(Buzayan，Nature 323：349，1986)。已显示该合酶也可以以引起目标特异性的RNA切割的形式来设计(Kikuchi and Sasaki，Nucleic Acids Res.19：6751，1992，菊池洋，化学与生物(化学と生物)30：112，1992)。设计成可切割目标那样的核酶，以在植物细胞中被转录的形式与花椰菜花叶病毒的35S启动子等的启动子及转录终止序列连接。将这样的构成单元串联序列，使得可切割靶基因内的多个部位，从而可以进一步提高效果(Yuyama et al，Biochem.Biophys.Res.Commun.186：1271，1992)。可以使用这样的核酶特异性地切割靶基因的转录物，从而抑制该基因的表达。

关于用于使这些抑制靶基因的功能的分子在植物细胞内表达的载体、以及将载体导入植物细胞的方法，与后述的用于表达限制性内切核酸酶的载体情况是同样的。

另外，在破坏靶基因的方法中，例如，可使用利用了同源重组的敲除技术。在敲除技术中，以在与靶基因区域之间产生同源重组的形式，将具有与该靶基因区域的至少一部分序列相同的序列的靶向性DNA构建物导入细胞中。靶向性DNA构建物典型地具有在用于破坏靶基因的DNA的各末端邻接有由与靶DNA部位的序列同源的序列构成的DNA的结构。即，同源DNA位于具有靶向性DNA构建物的左右臂，用于破坏靶基因的DNA位于该2条臂之间。在这里所谓“同源”，除了序列彼此完全(即，100％)同一的情况以外，只要能够产生同源重组即可，也包含一部分的序列不同的情况。通常至少95％以上、优选为97％以上、进一步优选为99％以上的序列同一。通过染色体上的靶基因区域与靶向性DNA构建物的同源序列相互作用，靶基因区域的特定序列与靶向性DNA构建物上的DNA交换，由此可敲除靶基因。在靶向性DNA构建物的制作中，例如，可利用在克隆化的靶基因的内部插入有标记基因的DNA。

此外，在本发明中可使用：通过转座子的转移而破坏了靶基因的植物细胞，通过紫外线等高能量的电磁波的照射或诱变性化学物质等化学地破坏了靶基因的植物细胞。

另外，关于本发明中使用的DNA的重组、载体的构建及载体向细胞的导入等的基本的操作和/或方法，参照文献(Sambrook等，分子克隆实验指南，冷泉港，NY)。

对本发明中使用的植物细胞所来源的植物没有特别限制，例如，可举出拟南芥属、稻属、大麦属、玉米属、番茄、大豆属、马铃薯、烟草属等。本发明中使用的植物细胞，除了培养细胞以外，还包含植物体中的细胞。另外，还包含各种形态的植物细胞，例如，悬浮培养细胞、原生质体、叶的切片、愈伤组织、幼胚、花粉等。

在本发明中，上述在植物细胞中，表达限制性内切核酸酶，在该植物细胞的染色体中的限制性内切核酸酶的靶DNA部位诱导双链断裂。

作为本发明中使用的限制性内切核酸酶，可以使用在靶DNA部位具有其识别序列的所需的限制性内切核酸酶。在这里所谓“靶DNA部位”，表示要介由双链断裂后的非同源末端接合引入突变的染色体上的位置。

作为本发明中使用的优选限制性内切核酸酶，是将识别特异的核苷酸序列的锌指结构域与来自限制性酶的非特异性DNA开裂结构域融合而调制的锌指核酸酶(嵌合体限制性内切核酸酶)(国际公开第00/46386号小册子，国际公开第03/080809号小册子)。在嵌合体限制性内切核酸酶的调制中，锌指结构域和非特异性DNA开裂结构域可以作为单一连续单元来调制，另外，也可在分别制造后结合。

另外，在本发明中，只要在染色体上存在该识别部位，就可以使用在染色体上以低频率产生断裂的大范围核酸酶。作为大范围核酸酶，例如，可举出识别18个碱基序列(5’-TAGGGATAA↓CAGGGTAAT-3’)并生成3’-OH的4个碱基突出末端的I-SceI，但在本发明中，根据目的，可使用I-ChuI、I-DmoI、I-CreI、I-CsmI、PI-SceI、PI-PfuI等其他各种的大范围核酸酶。另外，根据目的，在本发明中还可以使用以识别、切割与最初的大范围核酸酶不同的部位的形式进行了突变的定制大范围核酸酶(国际公开第2004/067736号小册子)。

为了产生双链断裂，限制性内切核酸酶可以作为包含编码该限制性内切核酸酶的核酸的载体而导入植物细胞中进行表达。作为用于在细胞内表达限制性内切核酸酶的载体，没有特别限制，根据目的可使用各种载体。在载体中，编码限制性内切核酸酶的核酸与至少1个的表达控制序列功能性地(即，以可细胞内表达的形式)连接。这样的表达控制序列包含启动子序列及增强子。作为用于诱导表达本发明的DNA的启动子，例如，可举出已知通过高温、低温、干燥、紫外线照射，丝状菌/细菌/病毒的感染和/或侵入、特定化合物的散布等外因而表达的启动子等。作为这样的启动子，例如，可举出通过高温诱导的拟南芥属的HSP18.2基因的启动子及稻属的hsp80基因和hsp72基因的启动子，通过低温诱导的稻属的lip19基因的启动子，通过干燥诱导的拟南芥属的rab16基因的启动子，通过紫外线照射诱导的欧芹的查尔酮合成酶基因的启动子，在厌氧条件下诱导的玉米属的乙醇脱氢酶基因的启动子，通过丝状菌/细菌/病毒的感染和/或侵入而表达的稻属几丁质酶基因的启动子及烟草属的PR蛋白质基因的启动子等。另外，稻属几丁质酶基因的启动子和烟草属的PR蛋白质基因的启动子通过水杨酸等特定的化合物的散布而被诱导，rab16通过作为植物激素的脱落酸的散布而被诱导。另一方面，作为用于组成型表达的启动子，例如，可举出花椰菜花叶病毒的35S启动子、稻属的肌动蛋白启动子、玉米属的遍在蛋白启动子等。

载体向植物细胞中的引入可以使用聚乙二醇法、电穿孔法(electroporation)、介由农杆菌的方法、基因枪法等本领域技术人员公知的各种方法。

通过限制性内切核酸酶的作用而断裂的靶DNA部位在植物细胞内受到通过非同源末端接合的修复过程。在该修复过程中，可在该靶DNA部位产生突变。通过本发明的方法制造的植物细胞优选在靶DNA部位具有上述的非沉默突变。

通过本发明的方法制造的植物细胞可通过使其再生而得到植物体。在靶DNA部位引入了非沉默突变的植物细胞其内源性基因的功能被抑制，因此由这样的植物细胞再生的植物体伴随着内源性基因的功能的抑制，表型可变化。因此，利用本发明的方法，可有效地进行植物的育种。

由植物细胞的植物体的再生可根据植物细胞的种类通过本领域技术人员公知的方法来进行。例如，对于拟南芥属，可举出Akama等(Plant CellReports 12：7-11，1992)所记载的方法；对于稻属，可举出Datta(In GeneTransfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.)pp66-74，1995)所记载的方法、Toki等(Plant Physiol.100：1503-1507，1992)所记载的方法、Christou等(Bio/technology，9：957-962，1991)所记载的方法和Hiei等(PlantJ.6：271-282，1994)所记载的方法；对于大麦属，可举出Tingay等(Plant J.11：1369-1376，1997)所记载的方法、Murray等(Plant Cell Report 22：397-402，2004)所记载的方法及Travalla等(Plant Cell Report 23：780-789，2005)所记载的方法；对于玉米属，可举出Shillito等(Bio/Technology，7：581，1989)所记载的方法、Gorden-Kamm等(Plant Cell 2：603，1990)所记载的方法；对于番茄，可举出Matsukura等(J.Exp.Bot.，44：1837-1845，1993)所记载的方法；对于大豆属，可举出专利公报(美国专利第5,416,011号)所记载的方法；对于马铃薯，可举出Visser等(Theor.Appl.Genet，78：594，1989)所记载的方法；对于烟草属，可举出Nagata和Takebe(Planta，99：12，1971)所记载的方法。

一旦得到在染色体上的靶DNA中引入了突变的转化植物体，则可能由该植物体通过有性生殖或无性生殖得到后代。另外，还可以由该植物体或其后代或克隆得到繁殖材料(例如，种子、果实、扦插枝、植株、愈伤组织、原生质体等)，基于这些繁殖材料量产该植物体。本发明包含：在染色体上的靶DNA中引入了突变的植物细胞、含有该细胞的植物体、该植物体的后代及克隆、以及该植物体、其后代及克隆的繁殖材料。

本发明还提供用于上述本发明的方法中的试剂盒。本发明的试剂盒，至少包含以下(a)～(c)的任一标品：(a)参与断裂的双链DNA的修复的蛋白质的功能被人为地抑制了的植物细胞；(b)用于在植物细胞中人为地抑制参与断裂的双链DNA的修复的蛋白质的功能的DNA构建物(例如，可表达地保持上述的编码双链RNA的DNA、编码反义RNA的DNA、或编码具有核酶活性的RNA的DNA的载体)；(c)用于使限制性内切核酸酶在植物细胞内进行表达的DNA构建物(例如，可表达地保持上述编码限制性内切核酸酶进行编码的DNA的载体)。进而，本发明的试剂盒还可包含试剂盒的使用说明书。

实施例

以下，基于实施例来更具体地说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。

(实施例1)利用锌指核酸酶在拟南芥属的ABI4基因中引入突变、以及引入的突变的Ku80缺失的效果

为了证明在拟南芥属中由锌指介导的定点诱变，本发明者们选择了ABI4基因。本发明者们在ABI4中发现了锌指核酸酶的完全共有靶部位[5’-NNCNNCNNCNNNNNGNNGNNGNN-3’(N＝A，C，G及T)/序列号5]。

在本实施例中，用于构建锌指核酸酶的模块的组建中，使用了对由Wright等(Wright DA，ea al.Nat Protoc 1：1637-1652，2006)所报告的方法进行一些改变后的方法。特异性决定残基的附近的氨基酸序列对于ZF-AAA(以GGA GGA GGA为靶)为指1“QRAHLER/序列号6”、指2“QSGHLQR/序列号7”及指3“QRAHLER/序列号8”，对于ZF-TCC(以GTG GCG GCG靶)中为指1“RSDALTR/序列号9”、指2“RSDDLQR/序列号10”及指3“RSDDLQR/序列号11”。将锌指蛋白质的这些编码序列(退火后的表1中记载的寡聚DNA)克隆到pGB-FB载体(Wright DA，eaal.Nat Protoc 1：1637-1652，2006)的XbaI部位与BamHI部位之间(图1)。

表1

通过XbaI-BamHI消化，由该载体切下ZF1/ZF2/ZF3结构域，将其插入pP1.2gfPhsZFN载体中，构建锌指表达载体“pP1.2gfbPhsZFN-ABI4”(图2)。该质粒具有拟南芥属的热激蛋白质HSP18.2基因的启动子(Takahashi T，ea al.，Plant J 2：751-761，1992)，通过热激可以瞬时表达锌指核酸酶。因此，具有能够避免细胞毒性的优点(Porteus MH，Mol Ther 13：438-446，2006)。

为了确定是否锌指核酸酶活性的诱导在体内(in vivo)消化拟南芥属基因组，从而可在拟南芥属细胞中的该锌指核酸酶的识别序列诱导突变，通过电穿孔法将该载体导入根癌农杆菌株GV3101，通过花序浸渍法(CloughSJ & Bent AF，Plant J 16：735-743，1998)导入拟南芥属中。转化植物在含有1.5μg/ml的灭瘟素-S的培养基上通过GFP荧光的出现来筛选(Ochiai-Fukuda T，ea al.J Biotechnol 122：521-527，2005)。在22℃经12天在平板上培养幼植物。其后，用塑料保鲜膜包裹平板，作为热激，在40℃在水中浸渍90分钟。幼植物在22℃进一步培养24小时，然后提取DNA。本发明者们为了进行非热诱导的对照实验，也从热诱导前的这些体统的本叶中提取了DNA。

为了确定锌指活性的诱导能够在其识别序列中诱导突变，本发明者们开发了利用错配特异性内切核酸酶的方法。在该方法中，为了检测通过锌指核酸酶诱导的ABI4基因内的突变，使用了SURVEYOR MutationDetection Kit(Transgenomic公司)。使用作为高正确性DNA聚合酶的KOD-Plus(TOYOBO社)通过PCR来扩增包围ZFN-AAA/ZFN-TCC配对部位的685个碱基对区域。PCR反应(50μl)使用2.5单位的KOD-Plus(TOYOBO社)，在含有0.2mM的dNTPs及1mM的引物(ABI4-F1：5’-TGGACCCTTTAGCTTCCCAACATCAACACA-3’/序列号24，及ABI4-R1：5’-ACCGGAACATCAGTGAGCTCGATGTCAGAA-3’/序列号25)的缓冲液中进行。使用约30ng的基因组DNA作为PCR反应的模板。PCR反应程序是，在95℃变性15秒，接着，将“在95℃15秒、在65℃15秒、在68℃60秒、在68℃最终延伸7分钟”进行35个循环。为了确定通过锌指核酸酶诱导的突变，将最初的PCR产物克隆到pCR-TOPO载体(Invitrogen公司)中，制成包含ABI4基因片段的各个单菌落。由这些菌落再次进行PCR反应，通过上述的SURVEYOR核酸酶分析来分析得到的产物，由在该分析中由显示突变的单菌落分离质粒，确定其碱基序列。

分析的结果是，在锌指核酸酶没有通过热激被诱导的对照的幼植物体中，没有发现包含突变的克隆。另一方面，在进行了热激的体系的靶序列中发现了突变，但突变的大部分是不伴随大的缺失和/或插入的取代型。

本发明者们建立了Ku蛋白质的活性抑制如DNA双链断裂末端的大的缺失和/或插入这样的剧烈修饰这样的假说，为了验证该假说，调查作为非同源末端接合缺失的拟南芥属突变体的“atku80”(West SC，et al.，Plant J31：517-528，2002)中的突变类型和频率。对于锌指核酸酶，通过PEG-钙法(Yoo S-D，et al.，Nat protocols 2：1565-1572，2007)，将pP1.2gfbPhsZFN-ABI4导入由野生型及atku80的植物调制的原生质体中，使其瞬时表达，如上述那样进行突变分析。

将野生型植物和atku80植物中的突变的频率与分布示于图3。在atku80细胞中，在表型中表现的修复的比例增加至2.7倍(图3A，B)。特别是4个碱基以上的缺失剧烈增加，与野生型相比为20倍(图3A)。但是，atku80细胞中的突变的频率与野生型为同等(图3C)。由以上数据，本发明者们得出结论：AtKu80发挥着避免通过锌指核酸酶的DNA双链断裂部位的末端分解的功能。但是，由另一方面突变的频率没有变而考虑，可能在atku80突变体中，进行DNA双链断裂末端的削切之后，通过同源重组进行正确的修复的频率变高。

产业可利用性

通过本发明，介由通过限制性内切核酸酶的DNA双链断裂后的通过非同源末端接合的修复过程的转基因植物细胞的制造中，可以飞跃性地提高在靶DNA部位内引入非沉默突变的频率。到目前为止，特别是在高等植物中，通过DNA双链断裂的非沉默突变的引入效率低，抑制了其实用化，但通过本发明，可以飞跃性地提高其效率。因此认为，本发明不仅对于植物的基因的功能分析有重大贡献，对于植物的品种改良的进展也有较大贡献。

序列表自由文本(free text)

序列号5

<223>n表示a、c、g或t

<223>ZFNs的共有靶位点

序列号6～11

<223>人工合成的锌指的氨基酸序列

序列号12～23

<223>编码人工合成的锌指的碱基序列

序列号24～25

<223>人工合成的引物的碱基序列

Claims

1.转基因植物细胞的制造方法，其中，在选自Ku70及Ku80中的至少1种蛋白质的功能被人为地抑制了的植物细胞中，表达锌指核酸酶，在该植物细胞的染色体中的锌指核酸酶的靶DNA部位诱导双链断裂，通过该植物细胞中的断裂的靶DNA部位的通过非同源末端接合的修复过程，在该靶DNA部位产生突变。

2.包含下述(a)和(b)的至少一者、以及下述(c)的试剂盒，其用于权利要求1所述的方法，

(a)选自Ku70及Ku80中的至少1种蛋白质的功能被人为地抑制了的植物细胞；

(b)用于在植物细胞中人为地抑制选自Ku70及Ku80中的至少1种蛋白质的功能的DNA构建物；

(c)用于使锌指核酸酶在植物细胞内进行表达的DNA构建物。