CN111560456A

CN111560456A - 一种检测大豆转基因成分的质粒dna标准分子及其应用

Info

Publication number: CN111560456A
Application number: CN202010434705.XA
Authority: CN
Inventors: 李飞武; 闫伟; 李葱葱; 龙丽坤; 董立明; 刘娜; 邢珍娟; 夏蔚; 谢彦博
Original assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-05-21
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2020-08-21
Anticipated expiration: 2040-05-21
Also published as: CN111560456B

Abstract

本申请公开了一种检测转基因成分的质粒DNA标准分子及其重组表达质粒。所述质粒DNA标准分子中含有SEQ ID No.2—28所示DNA片段。通过检测这些个靶标可以覆盖目前商业化的绝大部分转基因品种。本发明的重组表达质粒克服了转基因大豆筛选检测、基因特异性和转化体特异性定性和定量PCR检测中缺乏阳性标准品的技术难题，满足转基因大豆成分检测需求。并且，经试验验证，所述重组表达质粒具有很好的特异性，无假阳性和假阴性结果产生，可商业化推广应用。

Description

一种检测大豆转基因成分的质粒DNA标准分子及其应用

技术领域

本发明涉及农业转基因检测技术领域，具体涉及一种检测大豆转基因成分的质粒DNA标准分子及其应用。

背景技术

转基因作物于1996年开始大规模商业化种植，2017年全球种植面积达到1.898亿公顷，其中转基因大豆的种植面积最大，占比49.6％，全球批准上市的转基因大豆转化体有41个。自转基因作物首次商业化以来，转基因作物一直伴随着不同的声音。一方面，转基因作物确实大大增加了农作物的产量，减少了农药的使用，保护了环境；但另一方面，转基因作物对环境、社会和经济所产生的潜在不确定性遭到了多方面的质疑。因此，加强转基因安全监管，建立转基因产品标识制度已成为国际通行做法，美国、欧盟、日本、韩国等国家和地区实行定量标识，而我国实行“零阈值”的定性标识，即只要纳入标识目录的转基因产品，无论含量多少都需要标识。

无论是定量标识，还是定性标识，均依赖于对转基因成分的精准检测。目前，转基因作物的检测方法主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法两类；前者主要包括免疫试纸条法、酶联免疫吸附法、蛋白印迹法等。而后者中，应用最为广泛的为定性和定量PCR检测技术。根据靶标核酸序列的性质不同，可将PCR检测策略分为4种，即：筛选检测、基因特异性、构建特异性、转化体特异性。无论开展哪种策略的转基因成分检测，均需以阳性标准品作为参照物，特别是在定量检测中，需要用量值准确的阳性标准品制作标准曲线，进而对样品进行定值。

目前通常使用的转基因大豆标准品有两类，一类是由转基因大豆籽粒加工制成的基体标准物质，此类标准物质制备复杂，价格昂贵，且难以取得纯度符合要求的原材料；另一类是质粒DNA标准分子，此类标准品一般是将大豆内标准基因和外源DNA序列同时构建到质粒载体上获得的重组质粒DNA分子。但无论是基体标准物质还是质粒标准分子，绝大部分都是基于转化事件特异性检测的需要研制的，没有满足所有转基因筛查检测需求的标准样品。在转基因筛查检测中，要根据检测的靶标选用含有相应靶标的转基因材料作为阳性对照，通常针对多个检测靶标要设置多个阳性对照，增大了提取DNA的工作量，而且为了考察DNA质量，还要多设置内标准基因的反应，进一步推高了检测成本，增大了检测的工作量，为检测工作造成不便。针对上述技术问题，本发明以在我国已获进口许可或正在申请许可的13个转基因大豆转化体为研究对象，获取其调控元件、标记基因、外源基因和转化体特异性序列(即插入位点两端的边界序列，分为5’端序列和3’端序列)，按一定顺序进行拼接，研制出包含1种大豆内标准基因和27种转基因成分的转基因大豆检测用质粒DNA标准分子，并将所述质粒DNA标准分子插入质粒骨架载体制备得到一种重组质粒表达质粒。

发明内容

本发明的目的是提供一种能同时适用于27种大豆转基因成分定性和定量检测的质粒DNA标准分子及其重组表达质粒，以克服转基因大豆筛选检测、基因特异性和转化体特异性定性和定量PCR检测中缺乏阳性标准品的技术难题，满足转基因大豆成分检测需求。

为了实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种重组表达质粒，所述重组表达质粒能同时适用于27种大豆转基因成分定性和定量检测，所述重组表达质粒包含一段含有27种大豆基因成分的质粒DNA标准分子，所述27种大豆基因成分分别为1个内标准基因、5个调控元件、2个标记基因、3个目的基因和16个转化体特异性序列。

所述的内标准基因为lectin基因，作为大豆内参照基因，其序列如SEQ ID NO.2所示。

所述调控元件分别为T-CaMV35S、P-FMV35S、T-NOS、T-E9 3’、T-pinII，其序列分别对应SEQ ID NO.28、3、10、11、12。

所述2个标记基因为nptII基因、bar基因，优选的，其序列如SEQ ID NO.26、27所示。

所述3个目的基因分别为pat基因、CP4-epsps基因和cry1Ac基因，其序列如SEQ IDNO.14、15、16所示。

所述16个转化体特异性序列分别为MON87708 3’端序列、MON87701 5’端序列、GTS40-3-2 5’端序列、MON87705 3’端序列、A5547 5’端序列、DP356043 5’端序列、FG72 3’端序列、MON89788 5’端序列、DP305423 3’端序列、MON87769 3’端序列、CV127 5’端序列、CV127 3’端序列、A2704 5’端序列、A2704 3’端序列、DAS68416 5’端序列、DAS68416 3’端序列；其序列分别如SEQ ID NO.4、5、9、13、17、18、19、20、22、23、8、21、6、24、7、25所示。

优选的，所述部分靶标序列间隔至少2000bp，避免非预期扩增的出现；进一步地，所述需间隔的序列为MON87701 5’端序列和MON89788 5’端序列、MON87769 3’端序列和MON87705 3’端序列、MON877693’端序列和MON87708 3’端序列、MON87708 3’端序列和MON87705 3’端序列。

本申请发明人在研究中发现，上述序列间如果采取与其他序列类似的正常间隔(小于2000bp)，则均出现了不同程度的非预期扩增，如在检测MON87701 5’端序列时，出现了相当量的MON89788 5’端序列扩增，在检测MON87769 3’端序列时，出现了少量的MON87708 3’端序列，严重影响了检测结果的准确性。而通过将上述序列间采用大于2000bp的间隔则很好的解决了这个问题，多次验证均未出现非预期扩增现象的出现。

优选的，所述27个序列排列顺序如下所示：lectin、P-FMV35S、MON87708 3’、MON87701 5’、A2704 5’、DAS68416 5’、CV127 5’、GTS40-3-2 5’、T-NOS、T-E9 3’、T-pinII、MON87705 3’、pat、CP4epsps、cry1Ac、A5547 5’、DP356043 5’、FG72 3’、MON89788 5’、CV127 3’、DP305423 3’、MON87769 3’、A2704 3’、DAS68416 3’、nptII、bar、T-CaMV35S；优选的，其组合后序列如SEQ ID NO.1所示。

另外，本发明提供一种检测转基因大豆试剂盒，所述试剂盒包含上述重组表达质粒。优选的，所述试剂盒进一步包含检测所述27种大豆基因成分的引物；更优选地，所述引物分别如下述表1和/或表2中所示。

本发明的重组表达质粒能够同时适用于27种大豆转基因成分定性和定量检测，极大满足了转基因大豆成分检测需求。

附图说明

图1：质粒DNA标准分子。

图2：常规PCR检测凝胶电泳图：其中，(1)Lectin，(2)P-CaMV35S，(3)T-CaMV35S，(4)T-NOS(5)P-FMV35S，(6)T-E9-3’，(7)NPTII，(8)bar，(9)pat，(10)cry1Ac，(11)CP4-epsps，(12)MON87708，(13)MON87701，(14)MON87705，(15)MON87769，(16)A2704，(17)DAS68416，(18)CV127，(19)GTS40-3-2，(20)A5547，(21)356043，(22)FG72，(23)MON89788，(24)305423，(25)zSSIIb，(26)SPS，(27)HMG，(28)Sad-1，(29)MON810，(30)MON863，(31)Bt11，(32)MON89034，(33)MIR604，(34)TT51，(35)KF6，(36)MON1445，(37)MON15985，(38)GT73，(39)T45；

另外，每一电泳图中M为Marker、1为空白对照，2为非转基因对照，3为阳性对照，4为pUC57-SOY。

图3：以pUC57-SOY为标准样品制作的lectin基因标准曲线。

图4：以pUC57-SOY为标准样品制作的CV127转化体标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、包含质粒DNA标准分子的重组表达质粒pUC57-SOY的制备

1.检测靶标的确定

通过检索转基因生物信息学数据库、国内外专利数据库、检测方法数据库等，获得了13个转基因大豆转化体的分子特征信息，包括采用的调控元件、目的基因、标记基因及转化体特异性序列等。经过对这些转化体含有的转基因成分信息进行分析，最终确定以下25种检测靶标用于质粒DNA标准分子的构建：

(1)内标准基因：1种，lectin基因，作为大豆的内参照基因；(2)调控元件：6种，包括P-CaMV35S、P-FMV35S、T-NOS、T-E9 3’、T-pinII、T-CaMV35S；(3)标记基因：2种，包括nptII基因、bar基因，用于未经批准的转基因产品的筛查；(4)目的基因：3种，包括pat基因、CP4-epsps基因、cry1Ac基因；(5)转化体特异性序列：13种转化体，包括MON87708、MON87701、A2704-12、DAS68416、CV127、GTS40-3-2、MON87705、A5547-127、DP356043、FG72、MON89788、DP305423、MON87769。

2.检测靶标的核苷酸序列的确定

针对上述检测靶标，收集了国内外已发布实施的定性PCR和定量PCR检测方法标准中的核苷酸序列；并开展针对性序列分析，通过大量的构建实验和反复的序列分析研究，本申请确定按照以下设计原则对靶标基因进行筛选，具体原则如下：(1)有的检测靶标的核苷酸序列可以包含在其他靶标中，则无需单独选取该核苷酸序列，如P-CaMV35S序列包含在GTS40-3-2 5’端序列里，只需选择GTS40-3-2 5’端序列；(2)对转化体特异性序列，如定性PCR和定量PCR的靶标核苷酸序列在同一端(即同在5’端或3’端)，则选用同时包含定性和定量PCR检测靶标的1个转化体特异性序列；如定性PCR和定量PCR的靶标核苷酸序列不在同一端(即分别位于5’端和3’端)，则选用2个转化体特异性序列，其中CV127、A2704-12、DAS68416选了2个转化体特异性序列，其他10个转化体选了1个特异性序列。

基于上述原则，针对25种检测靶标，共确定了27个核苷酸序列，所述序列分别对应SEQ ID NO.2—28所示，其中内标准基因1个、调控元件5个、标记基因2个、目的基因3个、转化体特异性序列16个(包括MON87708 3’端序列、MON87701 5’端序列、GTS40-3-2 5’端序列、MON87705 3’端序列、A55475’端序列、DP356043 5’端序列、FG72 3’端序列、MON897885’端序列、DP305423 3’端序列、MON877693’端序列、CV127 5’端序列、CV127 3’端序列、A2704 5’端序列、A2704 3’端序列、DAS68416 5’端序列、DAS68416 3’端序列)。

3.检测靶标核苷酸序列的排列顺序

在实际过程中，先期实验发现，直接使用上述27个核苷酸序列组合制备的重组表达质粒存在部分引物间存在交叉干扰现象，部分序列能够扩增多条靶标基因，导致结果出现误差。为找出上述现象原因，发明人进行了大量分析实验，最终，发现如下问题：

通过大量的构建实验研究，结合对上述检测靶标的核苷酸序列进行比对，发现存在可能影响PCR扩增特异性的以下情况：(1)MON87701 5’端的定量PCR下游引物在MON897885’端上有结合位点，而MON89788 5’端的定量PCR探针序列在MON87701 5’端上有结合位点；(2)MON87769 3’端的定量PCR上游引物在MON87705 3’端和MON87708 3’端上均有结合位点，而MON87705 3’端的定量PCR上游引物在MON87769 3’端上有结合位点，MON87708 3’端的定性和定量PCR上游引物，在MON87705 3’端上有结合位点；(3)部分序列位置基本没有间隔，导致在进行PCR过程中，相似片段会产生错误的PCR结果，甚至出现PCR错位扩增的情况。

为解决上述问题，避免利用质粒DNA标准分子进行转基因检测时，因引物间的交叉干扰导致出现非预期扩增产物，本申请发明人在对检测靶标进行线性排列时，采用了三种策略：(1)P-CaMV35S序列包含在GTS40-3-2 5’端序列里，只需选择GTS40-3-2 5’端序列；(2)对转化体特异性序列，如定性PCR和定量PCR的靶标核苷酸序列在同一端(即同在5’端或3’端)，则选用同时包含定性和定量PCR检测靶标的1个转化体特异性序列；如定性PCR和定量PCR的靶标核苷酸序列不在同一端(即分别位于5’端和3’端)，则选用2个转化体特异性序列，其中CV127、A2704-12、DAS68416选了2个转化体特异性序列，其他10个转化体选了1个特异性序列；(3)距离间隔策略，即将上述可能产生交叉影响的靶标序列间隔至少2000bp，这样在进行定性或定量PCR应用时，通过优化PCR程序，可避免非预期扩增的出现。

基于上述原则，确定了质粒DNA标准分子上27个检测靶标核苷酸序列的拼接顺序见附图1，具体为：lectin、P-FMV35S、MON87708 3’、MON87701 5’、A2704 5’、DAS68416 5’、CV127 5’、GTS40-3-2 5’、T-NOS、T-E9 3’、T-pinII、MON87705 3’、pat、CP4epsps、cry1Ac、A5547 5’、DP356043 5’、FG72 3’、MON89788 5’、CV127 3’、DP305423 3’、MON87769 3’、A2704 3’、DAS68416 3’、nptII、bar、T-CaMV35S。

按照上述顺序获得的质粒DNA标准分子序列的分子大小为6389bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.重组表达质粒的构建

以商业化的克隆载体pUC57为骨架载体，委托上海生工生物工程有限公司采用长片段合成的方式，合成SEQ ID NO.1所示的重组DNA序列，并将其连接到pUC57的多克隆位点上，将获得的质粒DNA标准分子命名为pUC57-SOY，并将其转入大肠杆菌TOP10菌株，加入甘油，-80℃保存。

实施例2、质粒DNA标准分子pUC57-SOY的验证

1.重组大肠杆菌活化

从-80℃超低温冰箱中取出含有重组表达质粒pUC57-SOY的重组大肠杆菌，放在冰上，不要等到融化，直接用接种环(或移液器吸头)在冻存管内的冰碴上蘸一下，然后马上涂板即可。37℃培养12-16h。在无菌操作台上挑取单克隆菌落，至2-5mL已加氨苄抗生素的LB液体培养集中，37℃，200rpm培养8h。再按1:500至1:1000的比例，用加氨苄抗生素的LB液体培养基稀释菌液(25-50μL菌液+25mL含氨苄的LB液体培养基)，37℃，200rpm培养12-16h，至OD600约为0.5。

2.测序验证

以lectin基因为靶标，对菌液进行PCR验证，选取验证结果为阳性的菌液，采用QIAfilter Plasmid Midi Kits试剂盒，大量提取质粒DNA标准分子。

将提取的质粒DNA分别送至三家测序公司(分别为上海生工生物工程有限公司、北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司、上海英骏生物技术有限公司)，进行质粒DNA全测序。三家公司测序结果显示，重组质粒DNA标准分子的大小为9099bp，包括pUC57载体序列和SEQID NO.1所示的重组DNA序列，序列与预期完全一致，表明质粒DNA标准分子pUC57-SOY上的重组DNA序列(6389bp)是以单拷贝方式插入pUC57载体上。质粒DNA标准分子上包含的检测靶标核苷酸序列(如SEQ ID NO.2—28所示)的连接顺序与预期一致，且拷贝数也是一致的，即每种检测靶标在每个pUC57质粒标准分子上仅出现一次，且是按照SEQ ID NO.2—28的顺序排列。

实施例3、重组表达质粒pUC57-SOY在常规PCR检测中的应用

1.测试靶标

为测试重组表达质粒pUC57-SOY在常规PCR检测中的适用性和实用性，用灭菌去离子水将质粒DNA稀释至500copy/μL，每25μL PCR反应体系中加入2μL质粒DNA溶液作为模板，进行PCR扩增。扩增对象除了pUC57-SOY上包含的检测靶标，还选用了一些常见的其他靶标，如非大豆作物的内标准基因(玉米zSSIIb基因、水稻SPS基因、油菜HMG基因、棉花Sad-1基因)、其他转基因作物的转化体特异性序列(玉米转化体MON810、MON863、Bt11、MON89034、MIR604；水稻转化体TT51-1、KF-6；棉花转化体MON1445、MON15985；油菜转化体GT73、T45)等，以确保在实际检测中应用pUC57-SOY时，不会出现非预期扩增。使用的测试引物见下表。

表1常规PCR检测靶标及使用的引物信息

2.测试结果

测试结果如图2所示，对pUC57-SOY上包含的24种检测靶标，均可从pUC57-SOY样品中获得与预期大小一致的扩增产物，而对pUC57-SOY上没有的其他作物内标准基因及转化体，在pUC57-SOY样品中未得到扩增产物，表明质粒DNA标准分子pUC57-SOY在实际应用中具有很好的特异性，无假阳性和假阴性结果产生。

实施例4、重组表达质粒pUC57-SOY在实时荧光PCR检测中的应用

1.标准曲线制备

用灭菌去离子水将质粒DNA稀释至8×10⁷、8×10⁶、8×10⁵、8×10⁴、8×10³、800copies/uL，取2uL为模板，以大豆内标准基因lectin和CV127转化体为检测靶标，进行实时荧光PCR扩增，每个样品4次PCR平行。使用的引物探针序列见表2。

表2实时荧光PCR检测靶标及使用的引物探针信息

结果如表3所示，对内标准基因lectin及13种大豆转化体，每个浓度的质粒DNA标准分子的Ct值的SD值＜0.2，相对标准偏差(RSD值)＜1.5％，表明以重组表达质粒pUC57-SOY作为标准样品进行荧光定量PCR检测，具有很好的重复性。以lectin和CV127为例，以800～8×10⁷个拷贝的质粒DNA标准分子制作标准曲线(图3和图4)，标准曲线斜率分别为-3.318和-3.248，均介于-3.1～-3.6之间；扩增效率分别为100.2％和103.2％，均介于90％～110％；决定系数(R²值)均为1.000。表明以质粒DNA标准分子制作的标准曲线的技术参数均符合国际公认的要求，进一步证明重组表达质粒pUC57-SOY可用作实时荧光PCR检测中的标准样品。

表3质粒DNA标准分子pUC57-SOY的荧光PCR扩增结果

序列表

<110> 吉林省农业科学院

<120> 一种检测大豆转基因成分的质粒DNA标准分子及其应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6389

<212> DNA

<213> 重组质粒DNA标准分子(recombinant plasmid)

<400> 1

cgtctcttgg tcgcgccctc tactccaccc ccatccacat ttgggacaaa gaaaccggta 60

gcgttgccag cttcgccgct tccttcaact tcaccttcta tgcccctgac acaaaaaggc 120

ttgcagatgg gcttgccttc tttctcgcac aagacatcca ccgaagactt aaagttagtg 180

ggcatctttg aaagtaatct tgtcaacatc gagcagctgg cttgtgggga ccagacaaaa 240

aaggaatggt gcagaattgt taggcgcacc taccaaaagc atctttgcct ttattgcaaa 300

gataaagcag attcctctag tacaagtggg gaacaaaata acgtggaaaa gagctgtcct 360

ccatcatact cattgctgat ccatgtagat ttcccggact ttagctcaaa atgcatgtat 420

ttattagcgt tctgtctttt cgttaatttg ttctcatcat aatattgtga caaaaatata 480

gctaggaaag ctttccatgc atattttgta agcaatgaag tatatagtgg atgcaatgtc 540

tctatatatt cactagtcga gaaaattgcg gacagttctg agattgattg gcttggtgat 600

atgaagatac atgcttagca tgccccaggc acgcttagtg tgtgtgtcaa acactgatag 660

tttaaactga aggcgggaaa cgacaatctg atccccatca agcttgatat cgaattcctg 720

cagcccgggg gatccactag ttctagagcg gccgcgttaa ctgcaggtcg acggatcctg 780

agggggtcaa agaccaagaa gtgagttatt tatcagccaa gcattctatt cttcttatgt 840

cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat 900

taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat 960

tcccatggag tcaaagattc aaatagagga cctaacagaa ctcgccgtaa agactggccg 1020

ctacttgctc ttgtcgtaag tcaataaatt aatataaaaa aatacttaaa acttgttaca 1080

actaaattaa aaatttattt ttaaatcatt caagcaccag tcagcatcat cacaccaaaa 1140

gttaggcccg aatagtttga aattagaaag ctcgcaattg aggtctacag gccaaattcg 1200

ctcttagccg tacaatatta ctcaccggat cctaaccgcc ttcgccgttt agtgtatagg 1260

aaagcgcaaa ctgatgtttg gaagcttgaa acggcaataa aatatcaaaa tctttatatt 1320

aaagctgaac aaaaggggcc ctccttattt atccccttag tttttatttt catttctttc 1380

taataaaggg gcaaactagt ctcgtaatat attagaggtt aattaaattt atattcctca 1440

aataaaaccc aattttcatc cttaaacgaa cctgctttca aacccttcaa tttaaccgat 1500

gctaatgagt tatttttgca tgctttaatt tgtttctatc aaatgtttat ttttttttac 1560

tagaaataac ttattgcatt tcattcaaaa taagatcata catacaggtt aaaataaaca 1620

tagggaaccc aaatggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg cgataaagga 1680

aaggctatcg ttcaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg 1740

aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt 1800

gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttgaat cctgttgccg 1860

gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca 1920

tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca 1980

tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaagta ttatggcatt 2040

gggaaaactg tttttcttgt accatttgtt gtgcttgtaa tttactgtgt tttttattcg 2100

gttttcgcta tcgaactgtg aaatggaaat ggatggagaa gagttaatga atgatatggt 2160

ccttttgttc attctcaaat taatattatt tgttttttct cttatttgtt gtgtgttgaa 2220

tttgaaatta taagagatat gcaaacattt tgttttgagt aaaaatgtgt caaatcgtgg 2280

cctctaatga ccgaagccta gacttgtcca tcttctggat tggccaactt aattaatgta 2340

tgaaataaaa ggatgcacac atagtgacat gctaatcact ataatgtggg catcaaagtt 2400

gtgtgttatg tgtaattact agttatctga ataaaagaga aagagatcat ccatatttct 2460

tatcctaaat gaatgtcacg tgtctttata attctttgat gaaccagatg catttcatta 2520

accaaatcca tatacatata aatattaatc atatataatt aatatcaatt gggttagcaa 2580

aacaaatcta gtctaggtgt gttttgcgcc aaatcgtgaa gtttctcatc taagccccca 2640

tttggacgtg aatgtagaca cgtcgaaata aagatttccg aattagaata atttgtttat 2700

tgctttcgcc tataaatacg acggatcgta atttgtcgtt ttatcaaaat gtactttcat 2760

tttataataa cgctgcggac atctacattt ttgaattgaa aaaaaattgg taattactct 2820

ttctttttct ccatattgac catcatactc attgctgatc catgtagatt tcccggacat 2880

gaagccattt acaattgaag agactcaggg tgttgttatc actgcggttt ggcctttggg 2940

ccaaggcacc gttgtttgag ggtgttgtgg ctggtattgc ttacgctggg ccctggaagg 3000

ctaggaacgc ttacgattgg acagttgaga gtactgttta cgtgtcacat aggcatcaaa 3060

ggttgggcct aggatccaca ttgtacacac atttgcttaa gtctatggag gcgcaaggtt 3120

ttaagtctgt ggttgctgtt ataggccttc caaacgatcc atctgttagg ttgcatgagg 3180

ctttgggata cacagcccgg ggtacattgc gcgcagctgg atacaagcat ggtggatggc 3240

atgatgttgg tttttgggaa gacggtgacc gtcttcccgt taccttgcgc gggccgaaga 3300

cgccgacgcc gatcacctac cgcgtgccga tggcctccgc acaggtgaag tccgccgtgc 3360

tgctcgccgg cctcaacacg cccggcatca cgacggtcat cgagccgatc atgacgcgcg 3420

atcatacgga aaagatgctg cagggctttg gcgccaacct taccgtcgag acggatgcgg 3480

acggcgtgcg caccatccgc ctggaaggcc gcggcaagct caccggccaa gtcatcgacg 3540

tgccgggcga cccgtcctcg acggccttcc cgctggttgc ggccctgctt gttccggacc 3600

ggttacactc ccatcgacat ctccttgtcc ttgacacagt ttctgctcag cgagttcgtg 3660

ccaggtgctg ggttcgttct cggactagtt gacatcatct ggggtatctt tggtccatct 3720

caatgggatg cattcctggt gcaaattgag cagttgatca accagaggat cgaagagttc 3780

gccaggaacc aggccatctc taggttggaa ggattgagca atctctacca aatctatgca 3840

gagagcttca gagagtggga agccgatcct actaacccag ctctccgcga ggaaatgcgt 3900

attcaattca acgacatgaa cagcgcccgc cattatcgcc attccgccac gatcattaag 3960

gctatggcgg ccgcaatggc gccgccatat gaaacccgca atgccatcgc tatttggtgg 4020

catttttcca aaaacccgca atgtcatacc gtcatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 4080

gtgttatcac tcatggttat ggcagcaatg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 4140

agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 4200

cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgccttttg cccgaggtcg 4260

ttaggtcgaa taggctaggt ttacgaaaaa gagactaagg ccgctctaga gatccgtcaa 4320

catggtggag cacgacactc tcgtctactc caagaatatc aaagatacag tctcagaaga 4380

ccaaagggca gatttgatcg ggctgcagga attaatgtgg ttcatccgtc tttttgttaa 4440

tgcggtcatc aatacgtgcc tcaaagattg ccaaatagat taatgtggtt catctcccta 4500

tatgttttgc ttgttggatt ttgctatcac atgtttattg ctccaaactg ctccactctt 4560

ccttttgggc ttttttgttt cccgctctag cgcttcaatc gtggttatca agctccaaac 4620

actgatagtt taaactgaag gcgggaaacg acaatctgat ccccatcaag ctctagctag 4680

agcggccgcg ttatcaagct tctgcaggtc ctgctcgagt ggaagctaat tctcagtcca 4740

aagcctcaac aaggtcaggg tacagagtct aacagaagtt tccgttgagc tttaagacgt 4800

ttggggaagc tgtcccatgc ccatcaaaga agacagtaca cgatccgagc tacgaatgcg 4860

tcaggaataa aggaagtaca gtagaattta aaggtactct ttttatatat acccgtgttc 4920

tctttttggc tagctagtgt ttttttctcg acttttgtat gaaaatcatt tgtgtcaata 4980

gtttgtgtta tgtattcatt ggtcacataa atcaacttcc aaatttcaat attaactata 5040

gcagccaggt tagaaattca gaatcatgtt actctatacg catcctttag ggccatactc 5100

attgctgatc catgtagatt tcccggacat gaagccattt acaattgacc atcatactca 5160

aaacttcacg agcaacttgc taattttgga aaagagaaag aaaagacaag tgtcgagcat 5220

acactttaga tgcaacaagc cttcataatg ggccatgaag atggtttcca aaaagctctt 5280

tgccaaattc aattgcttgc ttttgaggta gatttaatgt tatttgattg tttgaagaat 5340

gtcaagaatg gggagttggt aagggagtct caaatggaga cttttgaaga ggcttctgga 5400

aatgagacga cctccaagga gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgccct 5460

tcccaacagt tgcgcagcct gaatgtacat taaaaacgtc cgcaatgtgt tattaagttg 5520

tctaagcgtc aatattttaa ttcttaacaa tcaatatttt aattcttaaa ctttattaaa 5580

tctaacaata aactgtaaga actaattctt aaacggctat gactgggcac aacagacaat 5640

cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt 5700

caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg 5760

gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag 5820

ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc 5880

tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatggaaggc acgcaacgcc tacgactgga 5940

cggccgagtc gaccgtgtac gtctcccccc gccaccagcg gacgggactg ggctccacgc 6000

tctacaccca cctgctgaag tccctggagg cacagggctt caagagcgtg gtcgctgtca 6060

tcgggctgcc caacgacccg agcgtgcgca tgcacgaggc gctcggatat gccccccgcg 6120

gcatgctgcg ggcggccggc ttcaagcacg ggaactggca tgacgtgggt ttctggcgct 6180

gaaatcacca gtctctctct acaaatctat ctctctctat aataatgtgt gagtagttcc 6240

cagataaggg aattagggtt cttatagggt ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc 6300

cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac 6360

caaaatccag tactaaaatc cagatcccc 6389

<210> 2

<211> 150

<212> DNA

<213> lectin序列(recombinant DNA)

<400> 2

cgtctcttgg tcgcgccctc tactccaccc ccatccacat ttgggacaaa gaaaccggta 60

gcgttgccag cttcgccgct tccttcaact tcaccttcta tgcccctgac acaaaaaggc 120

ttgcagatgg gcttgccttc tttctcgcac 150

<210> 3

<211> 210

<212> DNA

<213> P-FMV35S序列(recombinant DNA)

<400> 3

aagacatcca ccgaagactt aaagttagtg ggcatctttg aaagtaatct tgtcaacatc 60

gagcagctgg cttgtgggga ccagacaaaa aaggaatggt gcagaattgt taggcgcacc 120

taccaaaagc atctttgcct ttattgcaaa gataaagcag attcctctag tacaagtggg 180

gaacaaaata acgtggaaaa gagctgtcct 210

<210> 4

<211> 233

<212> DNA

<213> MON87708 3’端序列序列(recombinant DNA)

<400> 4

ccatcatact cattgctgat ccatgtagat ttcccggact ttagctcaaa atgcatgtat 60

ttattagcgt tctgtctttt cgttaatttg ttctcatcat aatattgtga caaaaatata 120

gctaggaaag ctttccatgc atattttgta agcaatgaag tatatagtgg atgcaatgtc 180

tctatatatt cactagtcga gaaaattgcg gacagttctg agattgattg gct 233

<210> 5

<211> 185

<212> DNA

<213> MON87701 5’端序列(recombinant DNA)

<400> 5

tggtgatatg aagatacatg cttagcatgc cccaggcacg cttagtgtgt gtgtcaaaca 60

ctgatagttt aaactgaagg cgggaaacga caatctgatc cccatcaagc ttgatatcga 120

attcctgcag cccgggggat ccactagttc tagagcggcc gcgttaactg caggtcgacg 180

gatcc 185

<210> 6

<211> 239

<212> DNA

<213> A2704 5’端序列(recombinant DNA)

<400> 6

tgagggggtc aaagaccaag aagtgagtta tttatcagcc aagcattcta ttcttcttat 60

gtcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg 120

attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga 180

attcccatgg agtcaaagat tcaaatagag gacctaacag aactcgccgt aaagactgg 239

<210> 7

<211> 221

<212> DNA

<213> DAS68416 5’端序列(recombinant DNA)

<400> 7

ccgctacttg ctcttgtcgt aagtcaataa attaatataa aaaaatactt aaaacttgtt 60

acaactaaat taaaaattta tttttaaatc attcaagcac cagtcagcat catcacacca 120

aaagttaggc ccgaatagtt tgaaattaga aagctcgcaa ttgaggtcta caggccaaat 180

tcgctcttag ccgtacaata ttactcaccg gatcctaacc g 221

<210> 8

<211> 238

<212> DNA

<213> CV127 5’端序列(recombinant DNA)

<400> 8

ccttcgccgt ttagtgtata ggaaagcgca aactgatgtt tggaagcttg aaacggcaat 60

aaaatatcaa aatctttata ttaaagctga acaaaagggg ccctccttat ttatcccctt 120

agtttttatt ttcatttctt tctaataaag gggcaaacta gtctcgtaat atattagagg 180

ttaattaaat ttatattcct caaataaaac ccaattttca tccttaaacg aacctgct 238

<210> 9

<211> 370

<212> DNA

<213> GTS40-3-2 5’端序列(recombinant DNA)

<400> 9

ttcaaaccct tcaatttaac cgatgctaat gagttatttt tgcatgcttt aatttgtttc 60

tatcaaatgt ttattttttt ttactagaaa taacttattg catttcattc aaaataagat 120

catacataca ggttaaaata aacataggga acccaaatgg aaaaggaagg tggctcctac 180

aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaag atgcctctgc cgacagtggt 240

cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg 300

tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga cgcacaatcc 360

cactatcctt 370

<210> 10

<211> 180

<212> DNA

<213> T-NOS端序列(recombinant DNA)

<400> 10

gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca 60

tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt 120

cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa 180

<210> 11

<211> 270

<212> DNA

<213> T-E9 3’端序列(recombinant DNA)

<400> 11

agtattatgg cattgggaaa actgtttttc ttgtaccatt tgttgtgctt gtaatttact 60

gtgtttttta ttcggttttc gctatcgaac tgtgaaatgg aaatggatgg agaagagtta 120

atgaatgata tggtcctttt gttcattctc aaattaatat tatttgtttt ttctcttatt 180

tgttgtgtgt tgaatttgaa attataagag atatgcaaac attttgtttt gagtaaaaat 240

gtgtcaaatc gtggcctcta atgaccgaag 270

<210> 12

<211> 310

<212> DNA

<213> T-pinII序列(recombinant DNA)

<400> 12

cctagacttg tccatcttct ggattggcca acttaattaa tgtatgaaat aaaaggatgc 60

acacatagtg acatgctaat cactataatg tgggcatcaa agttgtgtgt tatgtgtaat 120

tactagttat ctgaataaaa gagaaagaga tcatccatat ttcttatcct aaatgaatgt 180

cacgtgtctt tataattctt tgatgaacca gatgcatttc attaaccaaa tccatataca 240

tataaatatt aatcatatat aattaatatc aattgggtta gcaaaacaaa tctagtctag 300

gtgtgttttg 310

<210> 13

<211> 349

<212> DNA

<213> MON87705 3’端序列(recombinant DNA)

<400> 13

cgccaaatcg tgaagtttct catctaagcc cccatttgga cgtgaatgta gacacgtcga 60

aataaagatt tccgaattag aataatttgt ttattgcttt cgcctataaa tacgacggat 120

cgtaatttgt cgttttatca aaatgtactt tcattttata ataacgctgc ggacatctac 180

atttttgaat tgaaaaaaaa ttggtaatta ctctttcttt ttctccatat tgaccatcat 240

actcattgct gatccatgta gatttcccgg acatgaagcc atttacaatt gaagagactc 300

agggtgttgt tatcactgcg gtttggcctt tgggccaagg caccgttgt 349

<210> 14

<211> 302

<212> DNA

<213> pat序列(recombinant DNA)

<400> 14

ttgagggtgt tgtggctggt attgcttacg ctgggccctg gaaggctagg aacgcttacg 60

attggacagt tgagagtact gtttacgtgt cacataggca tcaaaggttg ggcctaggat 120

ccacattgta cacacatttg cttaagtcta tggaggcgca aggttttaag tctgtggttg 180

ctgttatagg ccttccaaac gatccatctg ttaggttgca tgaggctttg ggatacacag 240

cccggggtac attgcgcgca gctggataca agcatggtgg atggcatgat gttggttttt 300

gg 302

<210> 15

<211> 340

<212> DNA

<213> CP4epsps序列(recombinant DNA)

<400> 15

gaagacggtg accgtcttcc cgttaccttg cgcgggccga agacgccgac gccgatcacc 60

taccgcgtgc cgatggcctc cgcacaggtg aagtccgccg tgctgctcgc cggcctcaac 120

acgcccggca tcacgacggt catcgagccg atcatgacgc gcgatcatac ggaaaagatg 180

ctgcagggct ttggcgccaa ccttaccgtc gagacggatg cggacggcgt gcgcaccatc 240

cgcctggaag gccgcggcaa gctcaccggc caagtcatcg acgtgccggg cgacccgtcc 300

tcgacggcct tcccgctggt tgcggccctg cttgttccgg 340

<210> 16

<211> 330

<212> DNA

<213> cry1Ac序列(recombinant DNA)

<400> 16

accggttaca ctcccatcga catctccttg tccttgacac agtttctgct cagcgagttc 60

gtgccaggtg ctgggttcgt tctcggacta gttgacatca tctggggtat ctttggtcca 120

tctcaatggg atgcattcct ggtgcaaatt gagcagttga tcaaccagag gatcgaagag 180

ttcgccagga accaggccat ctctaggttg gaaggattga gcaatctcta ccaaatctat 240

gcagagagct tcagagagtg ggaagccgat cctactaacc cagctctccg cgaggaaatg 300

cgtattcaat tcaacgacat gaacagcgcc 330

<210> 17

<211> 317

<212> DNA

<213> A5547 5’端序列(recombinant DNA)

<400> 17

cgccattatc gccattccgc cacgatcatt aaggctatgg cggccgcaat ggcgccgcca 60

tatgaaaccc gcaatgccat cgctatttgg tggcattttt ccaaaaaccc gcaatgtcat 120

accgtcatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 180

atgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 240

tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 300

atacgggata ataccgc 317

<210> 18

<211> 145

<212> DNA

<213> DP356043 5’端序列(recombinant DNA)

<400> 18

cttttgcccg aggtcgttag gtcgaatagg ctaggtttac gaaaaagaga ctaaggccgc 60

tctagagatc cgtcaacatg gtggagcacg acactctcgt ctactccaag aatatcaaag 120

atacagtctc agaagaccaa agggc 145

<210> 19

<211> 158

<212> DNA

<213> FG72 3’端序列(recombinant DNA)

<400> 19

agatttgatc gggctgcagg aattaatgtg gttcatccgt ctttttgtta atgcggtcat 60

caatacgtgc ctcaaagatt gccaaataga ttaatgtggt tcatctccct atatgttttg 120

cttgttggat tttgctatca catgtttatt gctccaaa 158

<210> 20

<211> 223

<212> DNA

<213> MON89788 5’端序列(recombinant DNA)

<400> 20

ctgctccact cttccttttg ggcttttttg tttcccgctc tagcgcttca atcgtggtta 60

tcaagctcca aacactgata gtttaaactg aaggcgggaa acgacaatct gatccccatc 120

aagctctagc tagagcggcc gcgttatcaa gcttctgcag gtcctgctcg agtggaagct 180

aattctcagt ccaaagcctc aacaaggtca gggtacagag tct 223

<210> 21

<211> 88

<212> DNA

<213> CV127 3’端序列(recombinant DNA)

<400> 21

aacagaagtt tccgttgagc tttaagacgt ttggggaagc tgtcccatgc ccatcaaaga 60

agacagtaca cgatccgagc tacgaatg 88

<210> 22

<211> 235

<212> DNA

<213> DP305423 3’端序列(recombinant DNA)

<400> 22

cgtcaggaat aaaggaagta cagtagaatt taaaggtact ctttttatat atacccgtgt 60

tctctttttg gctagctagt gtttttttct cgacttttgt atgaaaatca tttgtgtcaa 120

tagtttgtgt tatgtattca ttggtcacat aaatcaactt ccaaatttca atattaacta 180

tagcagccag gttagaaatt cagaatcatg ttactctata cgcatccttt agggc 235

<210> 23

<211> 327

<212> DNA

<213> MON87769 3’端序列(recombinant DNA)

<400> 23

catactcatt gctgatccat gtagatttcc cggacatgaa gccatttaca attgaccatc 60

atactcaaaa cttcacgagc aacttgctaa ttttggaaaa gagaaagaaa agacaagtgt 120

cgagcataca ctttagatgc aacaagcctt cataatgggc catgaagatg gtttccaaaa 180

agctctttgc caaattcaat tgcttgcttt tgaggtagat ttaatgttat ttgattgttt 240

gaagaatgtc aagaatgggg agttggtaag ggagtctcaa atggagactt ttgaagaggc 300

ttctggaaat gagacgacct ccaagga 327

<210> 24

<211> 64

<212> DNA

<213> A2704 3’端序列(recombinant DNA)

<400> 24

gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct 60

gaat 64

<210> 25

<211> 130

<212> DNA

<213> DAS68416 3’端序列(recombinant DNA)

<400> 25

gtacattaaa aacgtccgca atgtgttatt aagttgtcta agcgtcaata ttttaattct 60

taacaatcaa tattttaatt cttaaacttt attaaatcta acaataaact gtaagaacta 120

attcttaaac 130

<210> 26

<211> 300

<212> DNA

<213> nptII 3’端序列(recombinant DNA)

<400> 26

ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 60

gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 120

caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 180

ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 240

gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 300

<210> 27

<211> 262

<212> DNA

<213> bar端序列(recombinant DNA)

<400> 27

gaaggcacgc aacgcctacg actggacggc cgagtcgacc gtgtacgtct ccccccgcca 60

ccagcggacg ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca 120

gggcttcaag agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca 180

cgaggcgctc ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa 240

ctggcatgac gtgggtttct gg 262

<210> 28

<211> 213

<212> DNA

<213> T-CaMV35S序列(recombinant DNA)

<400> 28

cgctgaaatc accagtctct ctctacaaat ctatctctct ctataataat gtgtgagtag 60

ttcccagata agggaattag ggttcttata gggtttcgct catgtgttga gcatataaga 120

aacccttagt atgtatttgt atttgtaaaa tacttctatc aataaaattt ctaattccta 180

aaaccaaaat ccagtactaa aatccagatc ccc 213

Claims

1.一种重组表达质粒，所述质粒能够同时适用于27种大豆转基因成分定性和定量检测，其特征在于所述表达质粒包含一段含有27种大豆基因成分的质粒DNA标准分子。

2.如权利要求1所述的表达质粒，其特征在于，所述质粒DNA标准分子包含27种大豆基因成分，分别为1个内标准基因、5个调控元件、2个标记基因、3个目的基因和16个转化体特异性序列。

3.如权利要求2所述的表达质粒，其特征在于，所述的内标准基因为lectin基因，作为大豆内参照基因，其序列如SEQ ID NO.2所示；所述调控元件分别为T-CaMV35S、P-FMV35S、T-NOS、T-E9 3’、T-pinII，其序列分别对应SEQ ID NO.28、3、10、11、12；所述2个标记基因为nptII基因、bar基因，优选的，其序列如SEQ ID NO.26、27所示；所述3个目的基因分别为pat基因、CP4-epsps基因和cry1Ac基因，其序列如SEQ ID NO.14、15、16所示；所述16个转化体特异性序列分别为MON87708 3’端序列、MON87701 5’端序列、GTS40-3-2 5’端序列、MON87705 3’端序列、A5547 5’端序列、DP356043 5’端序列、FG72 3’端序列、MON89788 5’端序列、DP305423 3’端序列、MON87769 3’端序列、CV1275’端序列、CV127 3’端序列、A27045’端序列、A2704 3’端序列、DAS68416 5’端序列、DAS684163’端序列；其序列分别如SEQ IDNO.4、5、9、13、17、18、19、20、22、23、8、21、6、24、7、25所示。

4.如权利要求2所述的表达质粒，其特征在于，所述DNA标准分子上的基因片段序列的顺序依次为lectin、P-FMV35S、MON87708 3’端序列、MON87701 5’端序列、A2704 5’端序列、DAS68416 5’端序列、CV127 5’端序列、GTS40-3-2 5’端序列、T-NOS、T-E9 3’、T-pinII、MON87705 3’端序列、pat基因、CP4-epsps基因、cry1Ac基因、A5547 5’端序列、DP356043 5’端序列、FG72 3’端序列、MON897885’端序列、CV127 3’端序列、DP305423 3’端序列、MON87769 3’端序列、A2704 3’端序列、DAS684163’端序列、nptII基因、bar基因、T-CaMV35S。

5.如权利要求4所述的表达质粒，其特征在于，如下序列之间间隔至少为2000bp：MON87701 5’端序列和MON89788 5’端序列、MON87769 3’端序列和MON87705 3’端序列、MON87769 3’端序列和MON87708 3’端序列、MON87708 3’端序列和MON87705 3’端序列。

6.如权利要求5中任一所述的表达质粒，其特征在于，所述质粒DNA标准分子序列如SEQID NO.1所示。

7.如权利要求1-5中任一所述的表达质粒，所述质粒是由所述质粒DNA标准分子插入pUC57质粒质粒骨架载体的多克隆位点制备得到的。

8.一种用于检测转基因大豆的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1-7中任一所述的表达质粒。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含用于检测所述质粒DNA标准分子中27种大豆基因的引物。

10.权利要求1-7任一项所述的表达质粒或权利要求8-9任一项所述的试剂盒用于大豆转基因成分定性和/或定量检测的用途。