CN116949063B - 一种低温响应转录因子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种低温响应转录因子及其应用，所述的转录因子是由核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因编码的蛋白质。本发明提供了首次从木薯中克隆获得转录因子，命名为MeMYB161，研究显示该转录因子基因定位于细胞核，对MeL2启动子转录活性有直接调控关系，将其在木薯中过表达可以显著提高MeL2基因的表达量，还能显著提高OPDA、茉莉酸含量，从而提高植物耐低温能力，而且还能降低赤霉素含量，可以用于木薯低温遗传改良等，本发明为提高植物耐低温性等方面的研究提供新的候选基因。

Description

一种低温响应转录因子及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种低温响应转录因子及其应用。
背景技术
木薯(Manihot esculenta Crantz)是一种重要的热带作物，其块根富含淀粉，是仅次于玉米的第二大淀粉供应作物和近10亿人口的主要食物来源，全世界有100多个国家在种植，具有极大的发展潜力（联合国粮农组织，Cassava's huge potential as 21stCentury crop | FAO）。
作为热带作物，木薯对低温比较敏感。我国木薯主栽区及山地种植区常有寒潮发生，木薯在苗期（2月份-4月份）及收获期（11月份-次年1月份）均易受到寒潮的危害。低温天气会造成木薯茎杆坏死、种茎发芽率低、幼苗发育受阻、块根腐烂等危害。可见，低温是限制木薯产业提质增效并保持可持续健康发展的重要环境因素之一。开展木薯耐低温遗传育种的基础研究、培育抗寒高产木薯新品种，对于木薯产业的发展具有重要的促进作用。
茉莉酸（Jasmonic acid, JA）是一类重要的生长调节物质，广泛参与植物的各种生理过程，对植物的低温耐受性具有正调控作用。对柑橘、香蕉、番茄等作物外施茉莉酸可以在低温环境下为其提供有效的保护(Zhao et al., 2013, Habibi et al., 2019, Dinget al., 2022a)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种低温响应转录因子及其应用。
本发明的第一个方面是提供一种低温响应转录因子，其是由核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示的基因编码的蛋白质。
本发明的第二个方面是提供一种编码如本发明第一个方面所述低温响应转录因子的转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的第三个方面是提供含有本发明第一个方面所述转录因子MeMYB161编码区基因的重组载体。
其中，所述重组载体原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采G1300植物表达载体等，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。
优选地，所述重组载体的原始载体为G1300植物表达载体，转录因子基因编码区位于G1300植物表达载体的Bgl II和Kpn I两限制性内切酶位点之间。
本发明的第四个方面是提供含有本发明第一个方面所述转录因子编码区基因的宿主菌或表达盒。
本发明的第五个方面是提供如本发明第一个方面所述的转录因子、或者本发明第二个方面所述的转录因子基因、或者本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌或表达盒在提高植物中OPDA含量、和/或提高茉莉酸含量、和/或降低赤霉素含量的应用。
优选地，所述植物为木薯。
本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的转录因子、或者本发明第二个方面所述的转录因子基因、或者本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌或表达盒在提高植物耐低温能力中的应用。
优选地，所述植物为木薯。
本发明的第七个方面是提供如本发明第一个方面所述的转录因子、或者本发明第二个方面所述的转录因子基因、或者本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌或表达盒在提高MeL2基因表达量中的应用，所述MeL2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第八个方面是提供如本发明第一个方面所述的转录因子、或者本发明第二个方面所述的转录因子基因、或者本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌或表达盒在调控MeL2启动子活性中的应用，所述MeL2启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明的第九个方面是提供一种MeL2启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明的第十个方面是提供一种引物对，所述引物对为： ATGGGAAGGTCTCCTTGCTG和TTATTTCATCTCCAGGCTTCTATAAT，或者所述引物对为：GAGATCTATGGGAAGGTCTCCTTGCTG和TGGTACCTTTCATCTCCAGGCTTCTATAAT。
本发明提供了首次从木薯中克隆获得转录因子，命名为MeMYB161，研究显示该转录因子基因定位于细胞核，对MeL2启动子转录活性有直接调控关系，将其在木薯中过表达可以显著提高MeL2基因的表达量，还能显著提高OPDA、茉莉酸含量，从而提高植物耐低温能力，而且还能降低赤霉素含量，可以用于木薯低温遗传改良等，本发明为提高植物耐低温性等方面的研究提供新的候选基因。
附图说明
图1为qPCR反应程序。
图2为低温处理后木薯MeL2基因表达分析。
图3为转MeL2基因阳性木薯苗Southern blot鉴定。#1-#6为转基因木薯苗，M为Marker。
图4为转MeL2基因阳性木薯苗中MeL2基因表达分析，以该基因在野生型木薯中的相对表达量为1，WT为野生型木薯，OE#1、OE#2、OE#3为转基因木薯苗，分别对应图3中的#1、#2、#3。
图5为转MeL2基因木薯阳性苗Western blot鉴定及OPDA、茉莉酸含量检测结果。M表示Western blot实验所用的蛋白Marker，WT表示野生型木薯组培苗。
图6为MeL2_OE转基因木薯接种2个月后表型。
图7为MeMYB161在拟南芥原生质体中的亚细胞定位。
图8为转录因子MeMYB161与MeL2基因转录调控关系验证。（a）MeL2启动子上可以被MYB转录因子识别的AC-element；（b）酵母单杂验证MeMYB161与MeL2启动了结合关系；（c）利用pGreenII-0800-luc和pGreenII-62-SK双荧光素酶报告基因系统验证了转录因子MeMYB161具有调控MeL2启动子转录活性的功能。
图9为转MeMYB161基因阳性木薯苗PCR鉴定及基因表达分析。MeMYB161-OE转基因木薯中MeMYB161基因表达分析，以MeMYB161基因在野生型木薯中的相对表达量为1；MeMYB161-OE转基因木薯中MeL2基因表达分析，以MeL2基因在野生型木薯中的相对表达量为1。
图10为转MeMYB161基因木薯阳性苗中OPDA、茉莉酸、赤霉素含量检测。WT表示野生型木薯组培苗。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：木薯MeL2基因的克隆
取CV60444木薯叶片，液氮冷冻研磨后，利用天根RNA提取试剂盒（DP441）提取叶片RNA；进而用天根Fastking RT Kit (with gDNase)试剂盒反转录成cDNA，以Primer F:ATGTTAAGCTCTCAGATTCA和 Primer R: TTAGATTGAAATGCTG TTAGGAA为引物，进行PCR扩增。
PCR反应体系为：PrimerSTAR buffer (2×) 25µL、10mM/µL双向引物各2µL、300ng/µL cDNA 2µL, ddH2O补足至50µL。PCR反应运行程序：98℃预变性1min；98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，15sec，35循环；72℃延伸7min。
反应结束后，回收特异片段，与pMD18-T载体连接后转化E. coli感受态细胞，经Amp抗性筛选后提取质粒分别进行PCR鉴定，将经鉴定为阳性的克隆进行测序，获得木薯茉莉酸合成基因（以下简称MeL2基因）序列，如SEQ ID No:1所示。
实施例2：低温处理后MeL2基因的表达分析
90d龄的CV60444木薯盆栽苗经4℃低温培养0h，1h，4h，12h后，取且其第二片展开叶，液氮冷冻研磨后。利用天根RNA提取试剂盒（DP441）提取叶片RNA；进而用天根FastkingRT Kit (with gDNase)试剂盒反转录成cDNA。利用TAKARA qPCR试剂（TB Green Premix ExTaqTM II (RP820)）进行MeL2基因表达分析，数据分析采用△△CT方法。
qPCR引物为Primer F: ATGTTAAGCTCTCAGATTCA和Primer R:AGAAGTGTTTCCATGGCTAC。
qPCR反应体系：
qPCR反应程序如图1所示。
结果如图2所示，低温处理显著下调MeL2基因在木薯叶片中的表达，说明MeL2基因能够响应低温，因此，可通过在木薯中过表达MeL2基因进而提高木薯耐低温能力。
实施例3：木薯MeL2基因基因转化木薯
1）转基因阳性木薯苗获得
转基因木薯叶片液氮冷冻研磨后，利用天根RNA提取试剂盒（DP441）提取叶片RNA；进而用天根Fastking RT Kit (with gDNase)试剂盒反转录成cDNA，以Primer F:CTCTAGAATGTTAAGCTCTCAGATTCA(XbaI)和Primer R: TGTCGACGATTGAAATGCTGTTAGGAA(SalI)为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系：PrimerSTAR buffer (2×) 25µL、10mM/µL双向引物各2µL、200 ng/µL cDNA 2µL, ddH2O补足至50µL。PCR反应运行程序：98℃预变性1min；98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，15sec，35循环；72℃延伸7min。
反应结束后，回收扩增产物。 采用酶切法（XbaI和SalI双酶切）将MeL2基因置换到G1300植物表达载体中。转化LBA4404农杆菌感受态细胞；采用农杆菌侵染的方法，转化木薯SC8胚性细胞，经抗性筛选、诱导产生转基因木薯株系。具体方法见：Peng Zhang andJohanna Puonti-kaerlas. Regeneration of transgenic cassava from transformedembryogenic tissus. Methods in Molecular Biology, 2005,286: 165-176。
2）Southern blot分析
a. 以G1300_MeL2载体质粒DNA为模板，以Primer F: ACGTCTGTCGAGAAGTTTCT和Primer R: TGGCGATCCTGCAAGCTCCG为引物，进行PCR扩增。PrimerSTAR buffer (2×) 25µL、10mM/µL双向引物各2µL、50 ng/µL 质粒DNA1µL, ddH2O补足至50µL。PCR反应运行程序：98℃预变性1min；98℃，10sec；55℃，5sec；72℃，5sec，35循环；72℃延伸5min。反应结束后回收目的片段测序并使用DIG（roche,11745832910）标记探针（具体操作见试剂盒说明书）；
b. 提取转基因木薯基因组DNA；
c. 将限制性内切酶Sal I酶切后的基因组进行电泳（40V，12h）和转膜（虹吸法），过夜；
上样量为40 ug；使用southern blot显色试剂盒（roche，11585762001）检测目的基因在基因组中的拷贝数。结果如图3所示：表明我们已获得了相应的转基因木薯苗，其中Line-2，Line-3，Line-6三个株系为单拷贝株系。
3）qPCR分析
采用引物：Primer F: ATGTTAAGCTCTCAGATTCA和Primer R:AGAAGTGTTTCCATGGCTAC，按照与“低温处理后MeL2基因的表达分析”相同的方法进行qPCR操作，对转基因阳性木薯苗MeL2-OE进行MeL2基因表达分析，结果如图4所示：检测的三个株系中MeL2基因的表达量较野生型木薯高出100-200倍，表明获得的木薯转基因木薯苗中MeL2基因获得过量表达。
实施例4：转MeL2基因木薯的性质
（1）Western blot
以Anti-GFP对MeL2-GFP蛋白进行检测MeL2-OE#3转基因阳性木薯组培苗（培养60天）中蛋白表达情况，具体操作如下：
a. 组织样品冷冻液氮研磨后，采用SDS裂解方法提取转基因木薯叶片蛋白；
b. 利用酶标仪A562检测蛋白浓度；
c. 分别取40μg 蛋白跑PAGE胶；
d. 使用iBlot2凝胶转膜仪进行快速干式转印；
e. 用TBST配制的5%的脱脂牛奶封闭2h；
f. 用TBST洗膜3次，10 min/次；
g. 按照一抗所需浓度用5%TBST牛奶稀释抗体，稀释比例请看说明书。放在脱色摇床上，4℃冰箱孵育过夜；
h. 用TBST洗膜3次，10 min/次；
i. 按照二抗所需浓度用5%TBST牛奶稀释。孵育1h30min；
j. 用TBST洗膜3次，10 min/次；
k. 配制发光液（试剂盒中A液：B液按 1:1配制）500u lA+500ul B=0.5ul增强剂，将转好的膜粘在曝光屏上，涂上发光液。准备好胶片，显影液定影液，在暗室曝光。
结果如图5所示。结果表明，在转基因阳性木薯苗中，MeL2-GFP蛋白表达正常。
（2）OPDA和茉莉酸的含量检测
利用乙腈溶液分离MeL2-OE#3转基因阳性木薯组培苗（培养60天）代谢产物，用微孔滤膜（0.22 μm pore size）过滤样品，并保存于进样瓶中，通过高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定浓度，计算转基因阳性木薯苗中OPDA和茉莉酸的含量。数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）（Shim-pack UFLCSHIMADZUCBM 30A，http://www.shimadzu.com.cn/）和串联质谱（Tan-demmassspectrometry，MS/MS）（Applied Biosystems 4500 QTRAP，http://www.appliedbiosystems.com.cn/）
液相条件主要包括：
1）色谱柱：Waters ACQUITY UPLC® BEH Amide 1.7 µm，2.1 × 100 mm；
2）流动相：A相为超纯水（含0.1%甲酸），B相为乙睛（含0.1%甲酸）；
3）洗脱梯度：0 min A/B 98:2 ( V/V )，0-10.0 min 为A/B5:95，10.0-11.0 min为A/B5:95，11.0-11.1 min 为A/B 98:2，11.1-14 min 为A/B98:2。
4）流速 0.40ml/min，柱温 40 ℃，进样量5 μl。
质谱条件主要包括：
质谱检测参数
质谱条件 参数
电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）温度 550 °C
离子源电压 5500 V
气帘气（curtain gas, CUR） 35 psi
碰撞诱导电离（collision-activated dissociation，CAD） 2
去簇电压（declustering potential，DP） 优化
碰撞能（collision energy，CE） 优化
转基因阳性木薯苗中OPDA（12-氧-植物-二烯酸）和茉莉酸（JA）的含量检测结果如图5和表1所示，转基因阳性木薯苗中OPDA和茉莉酸的含量明显比野生型高。可见，MeL2具有促进OPDA和茉莉酸合成的功能，能够提高植物的耐低温能力。
表1 转基因阳性木薯苗中OPDA和茉莉酸的含量检测
注：表中“SD”指标准误差范围。
（3）阳性木薯苗表型
MeL2_OE转基因木薯接种一个月内并没有出现黄化叶片的；一个半月后转基因植株从底部开始出现黄化叶片；接种，2个月后，植株下部叶片出现明显黄化（图6）。而对照组则没有，表明了MeL2基因可以促使木薯叶片的早衰，随着时间加长黄化叶片的数量逐渐增加，但是数量少于绿色叶片数量。
实施例5：MeL2基因表达受转录因子MeMYB161直接调控
1、木薯MeMYB161基因的获得
取CV60444木薯叶片，液氮冷冻研磨后，利用天根RNA提取试剂盒（DP441）提取叶片RNA；进而用天根Fastking RT Kit (with gDNase)试剂盒反转录成cDNA，以Primer F:ATGGGAAGGTCTCCTTGCTG和Primer R: TTATTTCATCTCCAGGCTTCTATAAT为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系为：PrimerSTAR buffer (2×) 25µL、10mM/µL双向引物各2µL、300 ng/µLcDNA 2µL, ddH2O补足至50µL。PCR反应运行程序：98℃预变性1min；98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，10sec；35循环后72℃延伸7min。
反应结束后，回收特异片段，与pMD18-T载体连接后转化E. coli感受态细胞，经Amp抗性筛选后提取质粒分别进行PCR鉴定，将经鉴定为阳性的克隆进行测序，获得木薯MeMYB161基因序列，如SEQ ID No:2所示。
2、木薯MeMYB161蛋白的亚细胞定位
设计木薯MeMYB161基因的全长扩增引物GAGATCTATGGGAAGGTCTCCTTGCTG（BglII）和TGGTACCTTATTTCATCTCCAGGCTTCTATAAT（KpnI），以CV60444木薯叶片cDNA为模板，扩增MeMYB161片段，经回收后，采用酶切法将片段与G1300空载体连接。经过转化Top10感受态细胞、PCR筛选阳性单克隆，测序验证正确后，瞬时转化拟南芥原生质体，3 d后使用激光共聚焦显微镜观察MeMYB16 1蛋白的定位情况。
利用拟南芥原生质体瞬时表达系统研究MeMYB161蛋白的亚细胞定位，结果如图7所示，绿色荧光蛋白（GFP）在未融合其他蛋白的情况下，普遍分散在细胞中。N端融合了MeMYB161蛋白的GFP荧光信号定位与细胞核，表明MeMYB161定位于细胞核。
3、转录因子MeMYB161具有调控MeL2启动子转录活性的功能
取CV60444木薯叶片，液氮冷冻研磨后，利用天根RNA提取试剂盒（DP441）提取叶片RNA；进而用天根Fastking RT Kit (with gDNase)试剂盒反转录成cDNA，以Primer F:CACGTTACACGTATTAGATC和Primer R: CTGAATCTGAGAGCTTAAC为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系为：PrimerSTAR buffer (2×) 25µL、10mM/µL双向引物各2µL、300 ng/µL cDNA 2µL,ddH2O补足至50µL。PCR反应运行程序：98℃预变性1min；98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，10sec；35循环后72℃延伸7min。
反应结束后，回收特异片段，与pMD18-T载体连接后转化E. coli感受态细胞，经Amp抗性筛选后提取质粒分别进行PCR鉴定，将经鉴定为阳性的克隆进行测序，获得木薯MeL2启动子序列，如SEQ ID No:3所示。
将MEL2启动子片段克隆到pHiS2载体上，构建诱饵质粒pHiS2-pMEL2，转化Y187酵母感受态细胞，涂布缺陷型筛选平板（不同浓度 3-AT的SD-TLH平板）。长出的酵母转化子随机挑取菌落进行自激活检测。结果显示，含90mM的3-AT的SD/-Leu/-Trp/-His可以有效抑制诱饵克隆。
用含有pHiS2-MEL2诱饵质粒的Y187酵母菌株作为受体菌制备感受态，将文库质粒pGADT7-cDNA转入其中，涂含90mM的3-ATSD-TLH筛选平板，然后再挑至含90mM的3-ATSD-TLH筛选平板。文库DNA转化方法如下：
1. 从SD-T平板挑取单菌种接于液体SD-T培养基50 ml，30℃，225 rpm，振荡培养18 h。
2. 转接于YPDA液体500 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600=0.6。
3.离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。
4.用30 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
5.用20 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
6.用10 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm ，5 min，弃上清。
7.向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。
50%PEG3350 1 M LiAc ssDNA (10 mg/ml) 文库质粒DNA
9.6 ml 1.44 ml 300 ul 20 ug
8. 30℃水浴孵育，30 min。
9. 42℃水浴热激，25 min。
10. 30℃水浴复苏1 h。
11.离心收菌，室温，4000 rpm ，5 min，弃上清，用10 ml无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20 ul培养物稀释后涂SD-TL平板，用于检测文库转化效率。其余涂SD-TLH+ 90mM 3AT平板，每块200 ul，共50-60块。
12. 30℃恒温培养3-7天，观察菌落生长。
13. 挑取长出的克隆单菌落，转接到SD-TLH筛选平板中继续培养3-5天。
在SD-TLH筛选平板中筛选获得阳性酵母克隆并，将阳性酵母克隆转移至SD-TLH，挑选酵母阳性克隆进行PCR和测序比对：
引物为T7：TAATACGACTCACTATAGGGC和ADR：GTGAACTTGCGGGGTTTTTC。20μlPCR反应体系为：deionized H2O 17.4μl，10×Advantage PCR Buffer 1μl，T7 Amplimer (20μM)0.4μl，ADR Amplimer (20μM) 0.4μl，50×dNTP Mix (10 mM) 0.4μl，50×AdvantagePolymerase Mix 0.4μl。PCR 程序为： 94°C 3 min；94°C 30 sec，68°C 3 min，30循环；68°C 3 min，16 °C 1 min。
PCR产物电泳检测并测序， 获得MeMYB161，将MeMYB161全长序列构建入pGADT7载体中，与共转诱饵质粒(proMeL2:AbAi)的Y1H Gold菌株在二缺培养基上都长出了克隆，说明共转化成功。将SD/-Leu/-Ura培养基上的克隆挑取至含有不同浓度AbA的SD/-Leu/-Ura培养基中生长，结果如图8b所示，pGADT7-MeMYB161与pAbAi -MeL2实验组300ng/mL浓度的SD/-Leu/-Ura中正常生长，说明转录因子MeMYB161对MeL2启动子转录活性的直接调控关系。
将MeMYB161与GFP基因融合后，构建入G1300植物表达载体中；将MeL2启动子序列构建入PGreenII 0800-LUC载体中。采用冻融法转化农杆菌GV3101菌种中。
挑取相应载体单克隆菌株于含有利福平、卡那霉素的1 ml LB液体培养中，28~30°C震荡培养。 将1 ml 过夜培养的农杆菌转接到25 ml LB液体培养基中（含抗生素）。另外加入2ul 100mM的乙酰丁香酮和100ul 0.5M MES，28度摇床培养OD值约1.0左右。4000rpm常温离心10min，收集菌体。用含10mM MgCl2重悬菌体至OD值为1.0，以每毫升菌液加入2ul100mM AS，静置3小时以上。取正处于生长期的烟草叶片，使用针头在叶片反面扎些小孔。
将侵染液装入5 ml 注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内。注射后72小时，取样通过荧光素酶检测试剂盒检测荧光信号。
结果如图8c所示，MeMYB161与MeL2启动子共转化后荧光素酶的活性增强3.4倍，说明转录因子MeMYB161与MeL2启动子结合，并可激活其基因转录活性。
实验组1 实验组2 实验组3 实验组4
MYB161-62-SK PGreenII-62-SK MYB 161-62-SK PGreenII-62-SK
pMeL2 -LUC pMeL2 -LUC PGreenII 0800-LUC PGreenII 0800-LUC
实施例5：木薯MeMYB161基因转化木薯
1、转基因阳性木薯苗获得
取木薯叶片，液氮冷冻研磨后，利用天根RNA提取试剂盒（DP441）提取叶片RNA；进而用天根Fastking RT Kit (with gDNase)试剂盒反转录成cDNA，以Primer F:GAGATCTATGGGAAGGTCTCCTTGCTG （Bgl II）和Primer R: TGGTACCTTTCATCTCCAGGCTTCTATAAT（Kpn I）为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系为：PrimerSTAR buffer (2×)25µL、10mM/µL双向引物各2µL、300 ng/µL cDNA 2µL, ddH2O补足至50µL。PCR反应运行程序：98℃预变性1min；98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，10sec；35循环后72℃延伸7min。
反应结束后，回收扩增产物。采用酶切法（Bgl II和Kpn I双酶切）将MeMYB161基因置换到G1300植物表达载体中。转化LBA4404农杆菌感受态细胞，采用农杆菌侵染的方法，转化木薯SC8胚性细胞，经抗性筛选、诱导产生转基因木薯株系。具体方法见：Peng Zhang andJohanna Puonti-kaerlas. Regeneration of transgenic cassava from transformedembryogenic tissus. Methods in Molecular Biology, 2005,286: 165-176。
2、转MeMYB161基因阳性植株中MeMYB161基因表达分析
取转MeMYB161基因阳性木薯苗叶片，利用天根RNA提取试剂盒（DP441）提取叶片RNA；进而用天根Fastking RT Kit (with gDNase)试剂盒反转录成cDNA，利用TAKARA qPCR试剂（TB Green Premix Ex TaqTM II (RP820)）进行Me MYB161基因表达分析，数据分析采用△△CT方法。qPCR引物为Primer F: AGGAATCAGCAGTAGCAGCAACG和Primer R:CTGCAGTTGTGCAGATAATCTTGTCT。反应体系为：TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseHPlus) (2×) 10µL、10µM双向引物各0.4µL、ROX Reference Dye0.4µL、300 ng/µL cDNA 1µL, ddH2O补足至20µL。PCR反应运行程序：95℃预变性30 sec；95℃，5sec；60℃，30sec；40循环后进行融解曲线分析。
基因表达分析结果表明得到了过表达MeMYB161的转基因木薯（图9左）。
3、转MeMYB161基因阳性植株中MeL2基因表达分析
取转MeMYB161基因阳性木薯苗叶片，利用天根RNA提取试剂盒（DP441）提取叶片RNA；进而用天根Fastking RT Kit (with gDNase)试剂盒反转录成cDNA，利用TAKARA qPCR试剂（TB Green Premix Ex TaqTM II (RP820)）进行MeL2基因表达分析，数据分析采用△△CT方法。qPCR引物为Primer F: ATGTTAAGCTCTCAGATTCA和Primer R:AGAAGTGTTTCCATGGCTAC。反应体系为：TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (2×) 10µL、10µM双向引物各0.4µL、ROX Reference Dye0.4µL、300 ng/µL cDNA 1µL, ddH2O补足至20µL。PCR反应运行程序：95℃预变性30 sec；95℃，5sec；60℃，30sec；40循环后进行融解曲线分析。
基因表达分析结果表明在过表达MeMYB161的转基因木薯中，MeL2基因表达明显上调（图9右），证实了转录因子MeMYB161对MeL2表达的正调控作用。
4、OPDA、茉莉酸和赤霉素的含量检测
本发明中实施例1部分证实MeL2基因的过表达能够提高OPDA、茉莉酸的含量，据此推断过表达MeMYB161也可以提高OPDA、茉莉酸的含量。因此，本发明测定了MeMYB161对于OPDA、茉莉酸等激素的调控作用。
利用乙腈溶液分离MeMYB161-OE#3转基因阳性木薯组培苗（培养60天）代谢产物，用微孔滤膜（0.22 μm pore size）过滤样品，并保存于进样瓶中，通过高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定浓度，计算转基因阳性木薯苗中OPDA、茉莉酸和赤霉素的含量。数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）（Shim-pack UFLCSHIMADZUCBM 30A，http://www.shimadzu.com.cn/）和串联质谱（Tan-demmassspectrometry，MS/MS）（Applied Biosystems 4500 QTRAP，http://www.appliedbiosystems.com.cn/）
液相条件主要包括：
1）色谱柱：Waters ACQUITY UPLC® BEH Amide 1.7 µm，2.1 × 100 mm；
2）流动相：A相为超纯水（含0.1%甲酸），B相为乙睛（含0.1%甲酸）；
3）洗脱梯度：0 min A/B 98:2 ( V/V )，0-10.0 min 为A/B5:95，10.0-11.0 min为A/B5:95，11.0-11.1 min 为A/B 98:2，11.1-14 min 为A/B98:2。
4）流速 0.40ml/min，柱温 40 ◦C，进样量5 μl。
质谱条件主要包括：
质谱检测参数
质谱条件 参数
电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）温度 550 °C
离子源电压 5500 V
气帘气（curtain gas, CUR） 35 psi
碰撞诱导电离（collision-activated dissociation，CAD） 2
去簇电压（declustering potential，DP） 优化
碰撞能（collision energy，CE） 优化
转基因阳性木薯苗中12-氧-植物二烯酸（OPDA）、茉莉酸（JA）、赤霉素（GA）的含量检测结果如图10所示，MeMYB161-OE#3转基因阳性木薯组培苗中OPDA和茉莉酸含量明显比野生型高。可见，MeMYB161具有促进OPDA和茉莉酸合成的功能，能够提高植物的耐低温能力。MeMYB161-OE#3转基因阳性木薯组培苗中赤霉素含量显著降低，可见，MeMYB161具有促进赤霉素合成的功能。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (4)

1.低温响应转录因子、或者编码所述低温响应转录因子的转录因子基因、或者含有所述转录因子基因的重组载体、或者含有所述转录因子基因的表达盒在提高木薯中MeL2基因表达量中的应用，所述MeL2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；或者
低温响应转录因子、或者编码所述低温响应转录因子的转录因子基因、或者含有所述转录因子基因的重组载体、或者含有所述转录因子基因的表达盒在提高木薯中MeL2启动子活性中的应用，所述MeL2启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述低温响应转录因子命名为MeMYB161，其是由核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因编码的蛋白质；所述转录因子基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，低温响应转录因子、或者编码所述低温响应转录因子的转录因子基因、或者含有所述转录因子基因的重组载体、或者含有所述转录因子基因的表达盒在通过提高木薯中MeL2基因的表达量从而提高木薯中OPDA含量和/或茉莉酸含量上的应用；或者
低温响应转录因子、或者编码所述低温响应转录因子的转录因子基因、或者含有所述转录因子基因的重组载体、或者含有所述转录因子基因的表达盒在通过提高木薯中MeL2基因表达量从而提高木薯耐低温能力上的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述重组载体的原始载体为G1300植物表达载体，转录因子基因位于G1300植物表达载体的Bgl II和Kpn I两限制性内切酶位点之间。
4.一种MeL2启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111269300A (zh) * 2018-12-05 2020-06-12 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一个调控木质素合成的基因及应用
CN111433364A (zh) * 2017-09-05 2020-07-17 因美制药公司 用于生物合成大麻素产物的大肠杆菌的代谢工程
CN113201549A (zh) * 2021-06-11 2021-08-03 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种提高植物低温耐受性的rna及其应用
CN115747228A (zh) * 2022-10-20 2023-03-07 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 调控木薯块根内皮颜色的基因MeMYB4及其应用
CN116162725A (zh) * 2022-11-21 2023-05-26 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种与木薯块根内皮颜色和花青素含量相关的snp标记及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111433364A (zh) * 2017-09-05 2020-07-17 因美制药公司 用于生物合成大麻素产物的大肠杆菌的代谢工程
CN111269300A (zh) * 2018-12-05 2020-06-12 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一个调控木质素合成的基因及应用
CN113201549A (zh) * 2021-06-11 2021-08-03 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种提高植物低温耐受性的rna及其应用
CN115747228A (zh) * 2022-10-20 2023-03-07 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 调控木薯块根内皮颜色的基因MeMYB4及其应用
CN116162725A (zh) * 2022-11-21 2023-05-26 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一种与木薯块根内皮颜色和花青素含量相关的snp标记及其应用

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACCESSION XM_021770542.2，PREDICTED: Manihot esculenta linoleate 13S-lipoxygenase 2-1, chloroplastic (LOC110625046), mRNA;无;《GenBank》;FEATURES和ORIGIN部分 *
ACCESSION XM_021771614.2，PREDICTED: Manihot esculenta myb-related protein 308 (LOC110625916), mRNA;无;《GenBank》;FEATURES和ORIGIN部分 *
Genome-wide characterization and expression analysis enables identification of abiotic stress-responsive MYB transcription factors in cassava (Manihot esculenta);Meng-Bin Ruan等;《J Exp Bot》;第68卷(第13期);第3657-3672页 *
无.ACCESSION XM_021770542.2，PREDICTED: Manihot esculenta linoleate 13S-lipoxygenase 2-1, chloroplastic (LOC110625046), mRNA.《GenBank》.2021,FEATURES和ORIGIN部分. *
木薯MeMYC2.2基因耐低温功能研究;于晓玲等;《生物技术通报》;第39卷(第01期);第224-231页 *
茉莉酸反应基因转录抑制因子JAZ蛋白家族研究进展;黄文峰等;《热带作物学报》;第30卷(第09期);第1383-1387页 *
茉莉酸对马铃薯苗期低温胁迫耐性的影响;刘计涛等;《广东农业科学》;第48卷(第12期);第129-137页 *
逆境信号下木薯MeMYC2转录因子表达及功能分析;于晓玲等;《热带作物学报》;第42卷(第04期);第927-935页 *

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