CN111433364A - 用于生物合成大麻素产物的大肠杆菌的代谢工程 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于在宿主细胞中产生萜类的方法和组合物。在一些情况下，所述萜类是大麻素。

Description

用于生物合成大麻素产物的大肠杆菌的代谢工程
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时专利申请号62/554,494的优先权，所述临时专利申请的内容整体且出于所有目的以引用方式据此并入。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且将该序列表据此以引用方式整体并入。所述ASCII副本创建于2018年10月17日，名称为NMD-003_PCT_SL.txt并且大小为109,691字节。
背景技术
植物普通大麻(Cannabis sativa)的腺毛积聚多种萜酚(terpenophenolic)化学化合物(大麻素)。这些植物来源的天然产物能够直接与遍布动物和人体内的大麻素受体(CB1和CB2)相互作用。CB-1受体主要存在于神经系统中，而CB-2受体主要存在于免疫系统或免疫衍生细胞中。
大麻素及其衍生物具有有治疗潜力的若干特性。大麻素对CB-1和/或CB-2受体的激活或阻断可以调节下游信号传导和代谢途径，并随后影响突触传递(包括疼痛和周围其他感觉信号的传递)、免疫应答和炎症。因此，对将天然或合成大麻素用于治疗目的存在兴趣。然而，低提取收率和高分离成本使得天然来源的大麻素的使用是不经济的。类似地，这些化合物的复杂性阻碍了大麻素生产的完全合成方法。
本领域已知的用于产生大麻素的异源系统依赖于真核宿主生物体产生和分泌大麻素合酶，然后所述大麻素合酶用于在体外酶催化反应中产生大麻素产物。例如，美国专利号9,587,212；9,512,391；9,394,512；9,526,715；9,359,625各自描述了使用分泌THCA合酶或CBDA合酶的重组毕赤酵母(Pichia pastoris)制备大麻素的方法和组合物以及生物反应器。然而，不幸的是，此系统需要用以生成所分泌的酶的合适底物的另外手段。因此，对于开发用于在体内产生大麻素的经济有效的异源系统存在长期且未满足的需要。
发明内容
本文描述了用于产生大麻素和萜类(terpenoid)的方法、组合物和宿主细胞。
在一个方面，本发明提供了一种表达盒，其包含与编码双功能ispDF酶的核酸可操作地连接的异源启动子。在一些实施方案中，表达盒增加其中存在表达盒的宿主细胞中通过MEP途径的流量。通过MEP途径的流量增加可以增加类异戊二烯前体的产生，所述类异戊二烯前体产生的增加适于增加香叶基磷酸(GPP)、法尼基焦磷酸(FPP)、香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)、萜类、异戊二烯、番茄红素、大麻素(例如，CBGA)、单萜、倍半萜、二萜和/或类胡萝卜素的下游产生。因此，在一些实施方案中，表达盒任选地包含番茄红素合成途径的组分(例如，crtE、crtI和/或crtB)、异戊二烯合酶、GPP合酶(例如，ispA或植物来源的GPP合酶)、单萜合酶和/或大麻素合酶。
在一些实施方案中，双功能ispDF酶与以下ispDF酶相差至少一个氨基酸：幽门螺杆菌(H.pylori)HP1020、幽门螺杆菌J99jhp0404、幽门螺杆菌HPAG1 HPAG1_0427、肝螺杆菌(H.hepaticus)HH1582、猎豹螺杆菌(H.acinonychis)Sheeba菌株Hac_1124、产琥珀酸沃廉菌(W.succinogenes)DSM 1740 WS1940、反硝化希瓦氏菌(S.denitrificans)DSM 1251Suden_1487、空肠弯曲杆菌(C.jejuni)空肠亚种NCTC11168 Cj1607、空肠弯曲杆菌RM1221CJE1779、空肠弯曲杆菌空肠亚种81-176 CJJ81176_1594，以及胎儿弯曲杆菌(C.fetus)胎儿亚种82-40 CFF8240_0409。在一些情况下，双功能ispDF酶与以下ispDF酶中的任一种具有不超过25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、90％或95％的同一性：幽门螺杆菌HP1020、幽门螺杆菌J99 jhp0404、幽门螺杆菌HPAG1 HPAG1_0427、肝螺杆菌HH1582、猎豹螺杆菌Sheeba菌株Hac_1124、产琥珀酸沃廉菌DSM1740 WS1940、反硝化希瓦氏菌DSM 1251 Suden_1487、空肠弯曲杆菌空肠亚种NCTC 11168 Cj1607、空肠弯曲杆菌RM1221 CJE1779、空肠弯曲杆菌空肠亚种81-176 CJJ81176_1594，以及胎儿弯曲杆菌胎儿亚种82-40 CFF8240_0409。在一些实施方案中，使用默认的BLAST2.7.0蛋白质:蛋白质比对设置，双功能ispDF酶与CJ-ispDF具有不超过35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％或25％的相似性。
在一些实施方案中，与编码双功能ispDF酶的核酸可操作地连接的启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，与编码双功能ispDF酶的核酸可操作地连接的启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，双功能ispDF酶包含与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ IDNo.3的25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300个连续氨基酸具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性或相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，双功能ispDF酶包含与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性或相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码双功能ispDF酶的核酸是密码子优化的。在一些实施方案中，表达盒还包含编码一种或多种、两种或更多种或所有选自由dxs、idi和ispE组成的组的酶的核酸。在一些实施方案中，表达盒还包含编码dxs和idi，以及任选的GPP合酶(例如，ispA或植物来源的GPP合酶)、单萜合酶和/或大麻素合酶的核酸。在一些实施方案中，表达盒还包含编码dxs、idi和ispE，以及任选的GPP合酶(例如，ispA或植物来源的GPP合酶)、单萜合酶和/或大麻素合酶的核酸。在一些实施方案中，大麻素合酶是CBGA合酶，优选大麻CBGA合酶。
在一些实施方案中，大麻素合酶是选自由THCA合酶、CBDA合酶和CBCA合酶组成的组的截短的大麻素合酶，其中截短是全部或部分信号肽的缺失。
在一个方面，本发明提供了一种质粒，其包含至少一个、两个、三个或更多个根据本文所述的表达盒方面、实施方案、情况或实例中的任一个的表达盒，或一个或多个其片段。在另一方面，本发明提供了多种质粒，其包含至少两个、三个、四个或更多个根据本文所述的表达盒方面、实施方案、情况或实例中的任一个的表达盒，或一个或多个其片段。
在一些实施方案中，一种或多种质粒包含含有编码异戊二烯合酶(ispS)的核酸的表达盒。在一些实施方案中，一种或多种质粒包含含有编码GPP合酶的核酸的表达盒。在一些实施方案中，GPP合酶是来源于真核生物的GPP合酶。在一些实施方案中，GPP合酶是植物来源的GPP合酶。在一些实施方案中，GPP合酶针对例如在宿主细胞中表达而进行了密码子优化。
在一些实施方案中，一种或多种质粒包含编码番茄红素合成途径的一种或多种组分(例如，crtE、crtI和/或crtB)、二萜合酶、倍半萜合酶或单萜合酶的核酸。在一些实施方案中，一种或多种质粒包含编码蒈烯合酶、月桂烯合酶或柠檬烯合酶的核酸。在一些实施方案中，一种或多种质粒包含编码大麻素合酶的核酸。
在一些情况下，大麻素合酶选自由CBGA合酶、THCA合酶、CBDA合酶和CBCA合酶组成的组。在一些实施方案中，大麻素合酶选自由大麻CBGA合酶、THCA合酶、CBDA合酶和CBCA合酶组成的组。在一些实施方案中，大麻素合酶是例如大麻CBGA合酶。在一些实施方案中，在一些实施方案中，大麻素合酶是选自由THCA合酶、CBDA合酶和CBCA合酶组成的组的截短的大麻素合酶，其中截短是全部或部分信号肽的缺失。
在一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本文所述的任何一个或多个表达盒，和/或本文所述的任何一个或多个质粒。在一些实施方案中，宿主细胞的一个或多个表达盒中的一个或多个或全部在一个基因座或多个基因座中整合到宿主细胞的基因组中。
在一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含：a).表达盒，其包含与编码双功能ispDF酶的核酸可操作地连接的启动子；以及b.)表达盒，其包含与编码萜类合酶的核酸可操作地连接的启动子。在一些实施方案中：i.)大麻素合酶、ispDF或一个或两个所述启动子与宿主细胞是异源的；ii.)编码双功能ispDF酶的核酸与可操作地连接的启动子是异源的；并且/或者iii.)编码大麻素合酶的核酸与可操作地连接的启动子是异源的。
在一些实施方案中，萜类合酶是异戊二烯合酶。在一些实施方案中，萜类合酶是番茄红素合酶途径的组分(例如，crtI、crtE或crtB)。在一些实施方案中，包含编码番茄红素合成途径的组分的核酸的宿主细胞包含编码crtI、crtE和crtB的一种或多种核酸，其中crtI、crtE和crtB处于相同或不同的表达盒中。
在一些实施方案中，萜类合酶是大麻素合酶。在一些实施方案中，大麻素合酶选自由CBGA合酶、THCA合酶、CBDA合酶和CBCA合酶组成的组。在一些实施方案中，大麻素合酶选自由大麻CBGA合酶、THCA合酶、CBDA合酶和CBCA合酶组成的组。在一些实施方案中，大麻素合酶是普通大麻的大麻素合酶。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码CBGA合酶的核酸和编码选自由THCA合酶、CBDA合酶和CBCA合酶组成的组的另一大麻素合酶的核酸，或编码其中的两种或全部的一种或多种核酸的组合。
在一些实施方案中，当宿主细胞包含含有与编码大麻素合酶的核酸可操作地连接的启动子的表达盒时，大麻素合酶是CBGA合酶。在一些情况下，包含CBGA合酶表达盒的宿主细胞还包含编码THCA合酶、CBDA合酶和/或CBCA合酶的核酸，各大麻素合酶独立地可操作地连接于相同或不同表达盒中的启动子。
在一些实施方案中，大麻素合酶或至少一种所编码的大麻素合酶是选自由THCA合酶、CBDA合酶和CBCA合酶组成的组的截短的大麻素合酶，其中截短是全部或部分信号肽的缺失。在一些实施方案中，大麻素合酶包含全部或部分跨膜或膜相关区域的缺失，使得大麻素合酶不是膜相关的。
在一些实施方案中，宿主细胞包含含有与编码GPP合酶的核酸可操作地连接的异源启动子的表达盒。在一些实施方案中，a)或b)的表达盒还包含编码GPP合酶的核酸。在一些实施方案中，宿主细胞不包含编码ispC、ispE、ispG、ispH或其组合或其全部的异源核酸。在一些实施方案中，宿主细胞不包含编码ispC、ispG、ispH、其组合或其全部的异源核酸。
在一些实施方案中，宿主细胞是原核生物，诸如埃希氏菌属(Escherichia)、泛菌属(Panteoa)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)或乳球菌属(Lactococcus)的原核生物。在一些实施方案中，细胞是大肠杆菌(E.coli)、柠檬泛菌(Panteoa citrea)、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或乳酸乳球菌(L.lactis)。
在一些实施方案中，a)和/或b)的表达盒整合到宿主细胞的基因组中。在一些实施方案中，a)的表达盒整合到宿主细胞的基因组中，而b)的表达盒不整合，或在不同基因座上整合于宿主细胞的基因组中。在一些实施方案中，b)的表达盒整合到宿主细胞的基因组中，而a)的表达盒不整合，或在不同基因座上整合于宿主细胞的基因组中。在一些实施方案中，a)的表达盒和b)的表达盒在相同或不同的基因座上整合到宿主细胞的基因组中。
在一些实施方案中，a)和/或b)的表达盒驻留在宿主细胞中的质粒上。在一些实施方案中，a)的表达盒和b)的表达盒驻留在宿主细胞中的质粒上。在一些实施方案中，宿主细胞包含含有a)和/或b)的表达盒的质粒。在一些实施方案中，宿主细胞包含含有a)的表达盒的质粒，和/或含有b)的表达盒的质粒。在一些实施方案中，a)的表达盒和b)的表达盒处于同一质粒中。在一些实施方案中，a)的表达盒与b)的表达盒处于不同的质粒中。
在一些实施方案中，包含与编码双功能ispDF酶的核酸可操作地连接的启动子的表达盒还包含与编码大麻素合酶的核酸可操作地连接的相同启动子。在一些情况下，大麻素合酶是CBGA合酶。在一些实施方案中，宿主细胞包含与组成型启动子可操作地连接的编码大麻素合酶(例如，CBGA合酶)的核酸。在一些实施方案中，宿主细胞包含与诱导型启动子可操作地连接的编码大麻素合酶(例如，CBGA合酶)的核酸。
在一些实施方案中，与编码双功能ispDF酶的核酸可操作地连接的启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，与编码双功能ispDF酶的核酸可操作地连接的启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，当宿主细胞包含两个或更多个包含不同大麻素合酶的表达盒时，每个表达盒包含与大麻素合酶可操作地连接的组成型启动子，每个表达盒包含与大麻素合酶可操作地连接的诱导型启动子，或一个或多个表达盒包含与大麻素合酶可操作地连接的组成性启动子并且一个或多个表达盒包含与大麻素合酶可操作地连接的诱导型启动子。
在一些实施方案中，当宿主细胞包含两个或更多个包含不同大麻素合酶的表达盒时，每个表达盒包含与大麻素合酶可操作地连接的诱导型启动子。在一些实施方案中，当宿主细胞包含两个或更多个包含不同大麻素合酶的表达盒时，至少一个表达盒包含与大麻素合酶可操作地连接的诱导型启动子。在一些实施方案中，当宿主细胞包含两个或更多个包含不同大麻素合酶的表达盒时，至少一个表达盒包含与大麻素合酶可操作地连接的组成型启动子。
在一些实施方案中，双功能ispDF酶包含与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ IDNo.3的25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300个连续氨基酸具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性或相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，双功能ispDF酶包含与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性或相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，双功能ispDF酶与以下ispDF酶相差至少一个氨基酸：幽门螺杆菌(H.pylori)HP1020、幽门螺杆菌J99 jhp0404、幽门螺杆菌HPAG1 HPAG1_0427、肝螺杆菌(H.hepaticus)HH1582、猎豹螺杆菌(H.acinonychis)Sheeba菌株Hac_1124、产琥珀酸沃廉菌(W.succinogenes)DSM 1740 WS1940、反硝化希瓦氏菌(S.denitrificans)DSM 1251Suden_1487、空肠弯曲杆菌(C.jejuni)空肠亚种NCTC11168 Cj1607、空肠弯曲杆菌RM1221CJE1779、空肠弯曲杆菌空肠亚种81-176 CJJ81176_1594，以及胎儿弯曲杆菌(C.fetus)胎儿亚种82-40 CFF8240_0409。在一些情况下，双功能ispDF酶与以下ispDF酶中的任一种具有不超过50％、80％、90％或95％的同一性：幽门螺杆菌(H.pylori)HP1020、幽门螺杆菌J99jhp0404、幽门螺杆菌HPAG1HPAG1_0427、肝螺杆菌(H.hepaticus)HH1582、猎豹螺杆菌(H.acinonychis)Sheeba菌株Hac_1124、产琥珀酸沃廉菌(W.succinogenes)DSM 1740WS1940、反硝化希瓦氏菌(S.denitrificans)DSM1251Suden_1487、空肠弯曲杆菌(C.jejuni)空肠亚种NCTC 11168 Cj1607、空肠弯曲杆菌RM1221 CJE1779、空肠弯曲杆菌空肠亚种81-176CJJ81176_1594，以及胎儿弯曲杆菌(C.fetus)胎儿亚种82-40CFF8240_0409。
在一些实施方案中，宿主细胞包含或还包含含有与编码一种或多种MEP途径酶的核酸可操作地连接的启动子的表达盒，所述MEP途径酶选自由以下组成的组：dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH和idi。在一些情况下，包含双功能ispDF酶的表达盒还包含编码一种或多种MEP途径酶的核酸，所述MEP途径酶选自由以下组成的组：dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH和idi。在一些情况下，包含双功能ispDF酶的表达盒还包含编码dxs和idi的核酸。在一些情况下，包含双功能ispDF酶的表达盒还包含编码ispE的核酸。在一些情况下，包含双功能ispDF酶的表达盒还包含dxs、idi和ispE。在一些情况下，包含双功能ispDF酶的表达盒不包含编码ispC、ispE、ispF、ispG或ispH中的一种或多种或全部的核酸序列。在一些情况下，包含双功能ispDF酶的表达盒不包含编码ispC、ispF、ispG或ispH中的一种或多种或全部的核酸序列。
在一些情况下，与不包含含有双功能ispDF酶的表达盒的对照细胞相比，宿主细胞包含更高的一种或多种MEP途径基因表达水平。在一些情况下，与不包含含有双功能ispDF酶的表达盒的对照细胞相比，宿主细胞包含更高的dxs和idi表达水平。在一些情况下，与不包含本文所述的一个或多个表达盒和/或一个或多个质粒中的至少一个的对照细胞相比，宿主细胞表现出更高的通过MEP途径的流量。
在一些实施方案中，宿主细胞包含含有与编码GPP合酶的核酸可操作地连接的启动子的表达盒。在一些情况下，a)的表达盒还包含编码GPP合酶的核酸。在一些情况下，b)的表达盒还包含编码GPP合酶的核酸。在一些情况下，a)的表达盒和b)的表达盒是不同表达盒。在一些情况下，a)的表达盒和b)的表达盒是同一表达盒。
在一些实施方案中，宿主细胞还包含橄榄醇酸(OA)。在一些情况下，橄榄醇酸对于宿主细胞是外源的。例如，可以将OA外源性地施加于培养宿主细胞的培养基中。
在一些实施方案中，宿主细胞包含含有与编码一种或多种糖基化途径基因的核酸可操作地连接的启动子的表达盒，其中：a)糖基化途径基因与宿主细胞是异源的；b)启动子与宿主细胞是异源的；c)启动子与一种或多种糖基化途径基因中的一种或多种是异源的；或d)表达盒与宿主细胞是异源的。在一些实施方案中，宿主细胞在1、2、3、4、5、6、7、8种或所有选自由ackA-pta、poxB、ldhA、dld、adhE、pps和atoDA组成的组的基因中包含缺失。
在第二方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含含有与编码双功能ispDF酶的核酸可操作地连接的异源启动子的表达盒，其中双功能ispDF酶包含与SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2或SEQ ID No.3的25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300个连续氨基酸具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性或相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，双功能ispDF酶包含与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQID No.3具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性或相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，宿主细胞还包含含有与编码一种或多种MEP途径酶的核酸可操作地连接的启动子的表达盒，所述MEP途径酶选自由dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH和idi组成的组，其中：a)启动子与一种或多种MEP途径酶是异源的；或b)启动子或一种或多种MEP途径酶与宿主细胞是异源的。在一些实施方案中，宿主细胞还包含含有与编码dxs和idi的核酸可操作地连接的启动子的表达盒。在一些实施方案中，宿主细胞还包含含有与编码dxs、idi和ispE的核酸可操作地连接的启动子的表达盒。
在一些实施方案中，宿主细胞还包含含有与编码ispS酶的核酸可操作地连接的启动子的表达盒。在一些实施方案中，宿主细胞还包含含有与编码GPP合酶的核酸可操作地连接的启动子的表达盒。在一些实施方案中，宿主细胞在1、2、3、4、5、6、7、8种或所有选自由ackA-pta、poxB、ldhA、dld、adhE、pps和atoDA组成的组的基因中包含缺失。在一些实施方案中，宿主细胞还包含大麻素合酶。
在一些实施方案中，宿主细胞是原核生物，诸如埃希氏菌属、泛菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属或乳球菌属的原核生物。在一些实施方案中，细胞是大肠杆菌(E.coli)、柠檬泛菌、谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸乳球菌。
在另一方面，本发明提供了一种获得目标代谢产物(例如，萜类或大麻素)的方法，所述方法包括在适于在一个或多个宿主细胞表达盒中诱导表达的条件下，在合适的培养基中培养根据本文所述的方面、实施方案、情况或实例中的任一个的宿主细胞，以及然后收获所培养的细胞或耗尽培养基，从而获得目标代谢产物。在一些实施方案中，所述方法包括培养根据本文所述的方面、实施方案、情况或实例中的任一个的宿主细胞，并且代谢产物是大麻素。在一些实施方案中，大麻素是THCA、CBDA、CBCA、CBN、THC、CBD或CBC，或其一种或多种的混合物。
在一些实施方案中，所述方法包括培养根据本文所述的方面、实施方案、情况或实例中的任一个的宿主细胞，并且代谢产物是萜类或异戊二烯。在一些实施方案中，所述方法包括收获和裂解所培养的细胞，从而产生细胞裂解物。在一些实施方案中，所述方法包括从细胞裂解物中纯化目标代谢产物，从而产生纯化的目标代谢产物。在一些实施方案中，所述方法包括从耗尽培养基中纯化目标代谢产物，从而产生纯化的目标代谢产物。
在一些实施方案中，纯化的目标代谢产物是大麻素，并且所述方法包括将大麻素配制在药物组合物中。在一些实施方案中，纯化的目标代谢产物是大麻素，并且所述方法包括形成纯化大麻素的盐、前药或溶剂化物。
以引用的方式并入
在本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文，其引用程度就如同每个单独的公布、专利或专利申请被具体和单独地指出以引用的方式并入一般。
附图说明
图1是示出普通大麻中的大麻素合成概要的图。
图2是用于在大肠杆菌中生物合成类异戊二烯前体的非依赖甲羟戊酸(MEP)的途径的图示。底物和产物在顶部示出，如下：G3P(3-磷酸甘油醛)、DOXP(1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸)、MEP(2-C-甲基赤藓醇4-磷酸)、CDP-ME(4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓醇)、CDP-MEP(4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇2-磷酸)、MECPP(2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸)、HMBPP((E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸)、IPP(异戊烯基二磷酸)、DMAPP(二甲基烯丙基二磷酸)、GPP(香叶基焦磷酸)。对应的酶在底部示出，如下：dxs(DOXP合酶)、ispC(DOXP还原酶)、ispD(2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶)、ispE(4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶)、ispF(2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶)、ispG(HMB-PP合酶)、ispH(HMB-PP还原酶)和idi(异戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸异构酶)。
图3A-B是用于在宿主细胞中过表达MEP途径的两个不同表达盒的图示。
图4示出SDS-PAGE凝胶，其示出dxs、ispD、idi和ispF在宿主细胞中的异源表达。
图5示出用于在宿主细胞中异源表达大麻萜酚酸合酶(CBGAS)的表达盒。
图6示出SDS PAGE凝胶，其示出带有聚组氨酸(6x-His)标签的芳族异戊二烯转移酶(“6x-His”公开为SEQ ID NO:43)在大肠杆菌宿主细胞中的表达和纯化。澄清的细胞裂解物在不经过纯化的情况下上样。a：未诱导的细胞裂解物；b-f：用1mM IPTG诱导的细胞的裂解物；c-f：镍-NTA柱流经级分。
图7是示出大麻萜酚酸(CBGA)的体外产生的色谱图。a线是0.0625μg/mL的CBGA标准品的色谱图；b是含有CBGAS诱导的细胞裂解物、橄榄醇酸(OA)和GPP的反应混合物，c是相同的反应混合物，但不含GPP。
图8是示出大麻萜酚酸(CBGA)在大肠杆菌中的体内产生的色谱图。a线是0.5μg/mL的CBGA标准品的色谱图；b是补充有OA和GPP的表达CBGAS的大肠杆菌生长的耗尽培养基，c是相同的反应混合物，但不含OA。
图9是用于在大肠杆菌中产生Δ(9)-四氢大麻酚酸合酶(THCAS)的表达盒的图示。
图10是含有THCAS表达盒和伴侣共表达盒的宿主细胞的图示。
图11是含有THCAS表达盒和用于异源糖基化系统的表达盒的宿主细胞的图示。
图12是低拷贝数的CBGAS表达盒的图示。
图13是含有非依赖甲羟戊酸途径表达盒以及GPP合酶(GPPS)和CBGAS表达盒的宿主细胞的图示。
图14示出针对大肠杆菌中的所指示表达构建体的优化诱导剂浓度的表格。
图15示出在不同诱导剂浓度下大肠杆菌的OD测量值。菌株B-D含有GPPS CBGAS表达盒pBAD33_GPPS_CBGAS。菌株F-J含有pBAD33_GPPS_CBGAS表达盒和MEP途径表达盒pTRC_RDE，如图13所示。
图16示出在pBAD33_GPPS_CGGAS的表达或pBAD33_GPPS_CBGAS和pTRC_RDE的共表达之后细胞裂解物的SDS PAGE分析的结果。
图17示出在所指示的诱导剂浓度下，来自诱导的表达培养物的细胞裂解物中的不同蛋白质浓度。菌株A-D含有质粒pBAD33_GPPS_CBGAS。菌株E-J含有质粒pBAD33_GPPS_CBGAS和pTRC_RDE。
图18示出在含有pTRC_RDE*表达构建体的菌株中表达ispDF之后细胞裂解物的SDSPAGE分析的结果。
图19示出从宏基因组学筛选测定中鉴定的双功能ispDF酶(ispDF1)(SEQ ID NO:1)与天然ispD和ispF(ispD-ispF)(SEQ ED NO:42)以及空肠弯曲杆菌ispDF(CJ-ispDF)(SEQ ED NO:41)的蛋白质序列比对。
图20示出pTRC_RDEE和pTRC_RDE*E表达构建体。pTRC_RDE*E含有双功能ispDF酶代替ispD和ispF酶。
图21示出针对通过MEP途径的流量增加所测试的构建体和菌株的概要。
图22示出用于异戊二烯产生的构建体和数据。除了编码ispDF的核酸是密码子优化的以外，构建体SA04与构建体SA03相同。
图23示出四种不同的大肠杆菌菌株中的番茄红素产生。SA01：pAC-LYC；SA02：pAC-LYC和pTRC-RDE；SA03：pAC-LYC和pTRC-RDEE；SA04：pAC-LYC和pTRC-RDE*；以及SA05：pAC-LYC和pTRC-RDE*E。
图24示出番茄红素的产生。
图25示出用于产生单萜蒈烯的构建体和数据。
图26示出双功能酶ispDF1、ispDF2和ispDF3的肽序列。
具体实施方式
本文描述了一种用于通过改变非依赖甲羟戊酸(MEP)途径来增加萜类的产生的代谢工程策略。MEP或萜类途径产生香叶基焦磷酸(GPP)，其为可用于多种下游工艺，以产生具有商业价值的萜类和其他化合物的产物。
本文还描述了一种双功能酶ispDF，其可以催化由天然大肠杆菌ispD和ispF两者执行的反应。双功能酶可用于多种体外或体内异戊二烯、萜类或大麻素产生系统。在一些实施方案中，本文所述的代谢工程策略(使用或不使用ispDF)可以用于增加异源宿主细胞中异戊二烯、GPP或下游萜类的产生。
GPP是大麻素途径的第一种酶大麻萜酚酸合酶(CBGAS)(芳族异戊二烯转移酶)的底物(图1)。CBGAS使用底物GPP和橄榄醇酸(OA)产生大麻萜酚酸(CBGA)。在一些情况下，CBGA可以用作底物以用于进一步体外或体内酶催化反应，诸如以通过由THCA合酶(THCAS)催化的反应产生Δ9-四氢大麻酚酸(THCA)或通过由CBDA合酶(CBDAS)催化的反应产生大麻二酚酸(CBDA)。用于产生大麻素的另外的途径包括但不限于Thakur等,Life Sciences,78(2005)454-466中所述的那些。Thakur等整体且出于所有目的以引用方式并入本文，包括但不限于其中描述的酶、产物、酶底物、途径和其部分，以及合成方案。
在一些实施方案中，涉及底物CBGA、THCA、CBDA、CBCA、THCVA、CBCVA、CBDVA及其组合的下游酶催化反应的产物可以使用化学、酶促或热手段在体外或体内脱羧以产生各种大麻素，例如如图1所示。
定义
本文使用以下缩写：“G3P”是指3-磷酸甘油醛；“DOXP”是指1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸；“MEP”是指2-C-甲基赤藓醇4-磷酸；“CDP-ME”是指4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓醇；“CDP-MEP”是指4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇2-磷酸；“MECPP”是指2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸；“HMBPP”是指(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸；“IPP”是指异戊烯基二磷酸；“DMAPP”是指二甲基烯丙基二磷酸；“GPP”是指香叶基焦磷酸。
“DXP途径”和“MEP途径”是指非甲羟戊酸途径，也称为非依赖甲羟戊酸途径。MEP途径的基因是dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH和idi。关于DXP或MEP途径基因或基因产物，或编码它们的核酸，所述基因可以是例如异源核酸驻留于其中的宿主细胞的天然基因、其密码子优化型式、衍生(例如，密码子优化的)自不同生物体的基因，或其直系同源物。
“dxs”是指DOXP合酶；“ispC”是指DOXP还原酶；“ispD”是指2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶；“ispE”是指4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶；“ispF”是指2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶；“ispG”是指HMB-PP合酶；“ispH”是指HMB-PP还原酶；“idi”是指异戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸异构酶；“ispA”是指法呢基二磷酸合酶，也称为“GPP合酶”，其可将DMAPP+IPP转化为GPP，并且将GPP+IPP转化为法呢基焦磷酸。
术语“ispDF”是指具有两个不同的活性位点并表现出ispD活性(EC2.7.7.60)和ispF活性(EC4.6.1.12)的双功能单链酶。通常，ispDF是天然存在的双功能酶，或天然存在的双功能酶的衍生物，所述衍生物具有一个或多个修饰，诸如一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代。在一些情况下，所述基因是植物来源的或大麻基因。在一些情况下，所述基因是大肠杆菌基因或其直系同源物。
“OA”是指橄榄醇酸；“CBGA”是指大麻萜酚酸；“CBNA”是指大麻橙花酸(cannabinerolic acid)；“大麻酚”或“CBN”是指6,6,9-三甲基-3-戊基苯并[c]色烯-1-酚；“CBGVA”是指次大麻萜酚酸(cannabigerivarinic acid)；“THCA”是指四氢大麻酚酸，包括Δ9异构体；“CBDV”是指次大麻二酚；“CBC”是指大麻色烯；“CBCA”是指大麻色烯酸；“CBCV”是指次大麻色烯(cannabichromevarin)；“CBG是指大麻萜酚；“CBGB”是指次大麻萜酚(cannabigerovarin)；“CBE”是指大麻艾尔松；“CBL”是指大麻环酚；“CBV”是指次大麻酚；“CBT”是指二羟基大麻酚；“THCV”是指四氢次大麻二酚(THCV)；“THC”是指四氢大麻酚；并且“Δ9-THC”是指Δ9-四氢大麻酚；“CBDA”是指大麻二酚酸。
如本文所用，“通过MEP途径的流量增加”是指IPP和/或DMAPP的产生增加。通常，通过检测由利用IPP和/或DMAPP作为反应物的报告酶的作用形成的产物间接确定IPP和/或DMAPP的产生。例如，通过使用异戊二烯合酶(ispS)作为报告基因，可以作为异戊二烯产生的增加检测到通过MEP途径的流量的增加。又如，通过使用GPP合酶作为报告基因，可以作为GPP产生的增加检测到通过MEP途径的流量的增加。在一些情况下，使用报告酶检测GPP产生。例如，可以通过使用GPP合酶和番茄红素合酶报告酶检测番茄红素产生的增加来检测GPP产生的增加，从而检测通过MEP途径的流量的增加。又如，可以通过使用GPP合酶和单萜(例如，柠檬烯、蒈烯、月桂烯)合酶报告酶检测单萜(例如，柠檬烯、蒈烯、月桂烯)的产生的增加来检测GPP产生的增加，从而检测通过MEP途径的流量的增加。又如，可以通过使用GPP合酶和大麻素(例如，CBGA)合酶报告酶检测大麻素(例如，CBGA)产生的增加来检测GPP产生的增加，从而检测通过MEP途径的流量的增加。通常，与缺乏测试菌株中的一个或多个异源表达盒的对照菌株相比，增加为至少10％。在一些情况下，与缺乏测试菌株中的一个或多个异源表达盒的对照菌株相比，增加为至少2倍。
如本文所用，术语“大麻二酚(cannabidiol)”、“CBD”或“大麻二酚(cannabidiol)”是指以下化合物中的一种或多种，并且，除非指定了特定的其他一种或多种立体异构体，否则包括化合物“Δ2-大麻二酚。”这些化合物是：(1)Δ5-大麻二酚(2-(6-异丙烯基-3-甲基-5-环己烯-1-基)-5-戊基-1,3-苯二酚)；(2)Δ4-大麻二酚(2-(6-异丙烯基-3-甲基-4-环己烯-1-基)-5-戊基-1,3-苯二酚)；(3)Δ3-大麻二酚(2-(6-异丙烯基-3-甲基-3-环己烯-1-基)-5-戊基-1,3-苯二酚)；(4)Δ3,7-大麻二酚(2-(6-异丙烯基-3-亚甲基环己-1-基)-5-戊基-1,3-苯二酚)；(5)Δ2-大麻二酚(2-(6-异丙烯基-3-甲基-2-环己烯-1-基)-5-戊基-1,3-苯二酚)；(6)Δ1-大麻二酚(2-(6-异丙烯基-3-甲基-1-环己烯-1-基)-5-戊基-1,3-苯二酚)；以及(7)Δ6-大麻二酚(2-(6-异丙烯基-3-甲基-6-环己烯-1-基)-5-戊基-1,3-苯二酚)。
这些化合物具有一个或多个手性中心和两种或更多种立体异构体，如下所述：(1)(1)Δ5-大麻二酚具有2个手性中心和4种立体异构体；(2)Δ4-大麻二酚具有3个手性中心和8种立体异构体；(3)Δ3-大麻二酚具有2个手性中心和4种立体异构体；(4)Δ3,7-大麻二酚具有2个手性中心和4种异构体；(5)Δ2-大麻二酚具有2个手性中心和4种立体异构体；(6)Δ1-大麻二酚具有2个手性中心和4种立体异构体；并且(7)Δ6-大麻二酚具有1个手性中心和2种立体异构体。在一个优选实施方案中，大麻二酚具体地是Δ2-大麻二酚。除非具体指出，否则对“大麻二酚(cannabidiol)”、“CBD”或大麻二酚(cannabidiols)或如上文提及的任何具体的大麻二酚化合物(1)-(7)的提及包括该提及所包括的所有化合物的所有可能的立体异构体。在一个实施方案中，“Δ2-大麻二酚”可以是在异源系统中部分或整体产生的Δ2-大麻二酚立体异构体的混合物。
术语“类异戊二烯”或“萜类(terpenoid)”是指包含一个或多个五碳异戊二烯构件(building block)的任何化合物，包括直链和环状萜类。如本文所用，术语“萜(terpene)”可与萜类和类异戊二烯互换。当对萜进行化学修饰时，诸如通过碳链的氧化或重排，通常将所得化合物称为萜类，也称为类异戊二烯。
萜类可以根据存在的碳原子数命名，使用5和10个碳的组作为参考。例如，半萜类(C5)具有一个异戊二烯单元(半个萜类)；单萜类(C10)具有两个异戊二烯单元(一个萜类)；倍半萜类(C15)具有三个异戊二烯单元(1.5个萜类)；并且二萜类(C20)具有四个异戊二烯单元(或两个萜类)。通常，单萜类在自然界中由C10萜类前体香叶基焦磷酸(GPP)产生。类似地，“环状单萜”是指环状或芳族萜类(即，包括环结构)。它由两个异戊二烯构件(通常由GPP产生)制备。直链单萜包括但不限于香叶醇、芳樟醇、罗勒烯和月桂烯。环状单萜(单环、双环和三环)包括但不限于柠檬烯、蒎烯、蒈烯、萜品醇、萜品油烯、水芹烯、侧柏烯、三环烯、茨醇、桧烯和莰烯。
“萜类合酶”是指能够催化一种萜类或萜类前体转化为另一萜类或萜类前体的酶。例如，GPP合酶是催化例如由萜类前体IPP和DMAPP形成GPP的酶。类似地，FPP合酶是催化例如由GPP和IPP产生FPP的酶。萜合酶是催化异戊二烯基二磷酸(诸如GPP)转化为类异戊二烯或类异戊二烯前体的酶。该术语包括直链和环状萜合酶。
“环状萜类合酶”是指能够催化修饰萜类或萜类前体以提供环结构的反应的酶。例如，环状单萜类合酶是指能够使用直链单萜作为底物产生环状或芳族(含环)单萜类化合物的酶。一个实例将是桧烯合酶，其能够催化由直链单萜前体GPP形成环状单萜桧烯。如本文所用，术语“萜合酶”与萜类合酶可互换。
异戊二烯转移酶或新异戊二烯(isoprenyl)转移酶，也称为异戊二烯或新异戊二烯合酶，是能够催化萜类或类异戊二烯化合物的焦磷酸酯前体产生的酶。示例性的异戊二烯转移酶或新异戊二烯转移酶是ispA，其能够在存在合适底物的情况下催化香叶基二磷酸(GPP)或法呢基二磷酸(FPP)的形成。
“大麻素合酶”是指催化一种或多种以下活性的酶：将CBGA环化为THCA、CBDA或CBCA；将CBGVA环化为THCVA、CBCVA、CBDVA，将橄榄醇酸异戊二烯化以形成CBGA，以及其组合。示例性大麻素合酶包括但不限于被发现在大麻属植物中天然存在的那些，诸如普通大麻的THCA合酶、CBDA合酶和CBCA合酶。
示例性的类异戊二烯、萜类、大麻素和MEP途径多肽和核酸包括KEGG数据库中描述的那些。KEGG数据库含有许多示例性类异戊二烯、萜类、大麻素和MEP途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列(参见，例如，万维网“genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html”以及其中的序列，其各自据此通过引用整体并入，特别是关于类异戊二烯、萜类、大麻素和MEP途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列)。本文所述的含有信号肽的多肽及其编码核酸应理解为进一步描述其中信号肽被去除或以其他方式不存在的截短型式。
如本文所用，术语“异源的”是指并非天然存在于一起的任何两种组分。例如，编码与可操作地连接的启动子为异源的基因的核酸是其表达在其天然状态中(例如，在非基因修饰的细胞内)不受其在特定基因组中可操作地连接的启动子的控制的核酸。如本文所提供，与非天然存在的启动子可操作地连接的所有基因被认为是“异源的”。类似地，与宿主细胞“异源的”基因是在特定生物体的非基因修饰的细胞中不存在，或在非基因修饰的细胞中存在于不同的基因组或非基因组(例如，质粒)位置上，或可操作地连接于不同启动子的基因。另外，与宿主细胞“异源的”启动子是在特定生物体的非基因修饰的细胞中不存在，或在非基因修饰的细胞中存在于不同的基因组或非基因组(例如，质粒)位置上，或可操作地连接于不同核酸的启动子。
如本文所用，“表达盒”是指包含与至少一个靶基因可操作地连接的启动子多核苷酸的多核苷酸序列，其中启动子与至少一个可操作地连接的基因是异源的，启动子与其所驻留于其中的宿主细胞是异源的，或至少一个可操作地连接的基因与宿主细胞是异源的，或其组合。
“盐”是指在本发明的方法中使用的化合物的酸或碱盐。药学上可接受的盐的例示性实例为无机酸(盐酸、氢溴酸、磷酸等)盐、有机酸(乙酸、丙酸、谷氨酸、柠檬酸等)盐、季铵(甲基碘、乙基碘等)盐。应了解，药学上可接受的盐是无毒的。合适的药学上可接受的盐的另外的信息可以在Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack PublishingCompany,Easton,Pa.,1985中找到，它通过引用并入本文。
如本文所用，术语“溶剂化物”是指通过溶剂化作用(溶剂分子与溶质的分子或离子的组合)形成的化合物，或由溶质离子或分子(即，本发明的化合物)与一个或多个溶剂分子组成的聚集体。当水为溶剂时，对应的溶剂化物为“水合物”。水合物的实例包括但不限于半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、六水合物，以及其他含水物类。本领域普通技术人员应理解，化合物的药学上可接受的盐和/或前药也可以溶剂化物形式存在。溶剂化物通常经由水合作用(其为化合物制备的一部分)或通过由本发明的无水化合物的天然吸湿而形成。一般来讲，所有物理形式都旨在处于本发明的范围内。
因此，当在根据本发明的方法中制备的或包括在根据本发明的组合物中的治疗活性剂，诸如但不限于大麻素或萜类，具有足够酸性、足够碱性，或足够酸性和足够碱性两者的官能团时，这一个或多个基团可以相应地与许多无机或有机碱以及无机和有机酸中的任一种反应，以形成药学上可接受的盐。示例性的药学上可接受的盐包括通过药理学活性化合物与无机或有机酸或无机碱的反应制备的那些盐，诸如包括以下的盐：硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、一氢磷酸盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、β-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐和扁桃酸盐。如果药理学活性化合物具有一个或多个碱性官能团，则期望的药学上可接受的盐可通过本领域中可利用的任何合适方法制备，例如，用以下处理游离碱：无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸，诸如乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸(诸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸)、α-羟基酸(诸如柠檬酸或酒石酸)、氨基酸(诸如天冬氨酸或谷氨酸)、芳族酸(诸如苯甲酸或肉桂酸)、磺酸(诸如对苯磺酸或乙磺酸)等。如果药理学活性化合物具有一个或多个酸性官能团，则期望的药学上可接受的盐可通过本领域中可利用的任何合适方法制备，例如用诸如胺(伯胺、仲胺或叔胺)、碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物等的无机或有机碱处理游离酸。合适的盐的例示性实例包括有机盐，其衍生自氨基酸(诸如甘氨酸和精氨酸)、氨、伯胺、仲胺和叔胺，和环胺(诸如哌啶、吗啉和哌嗪)；以及无机盐，其衍生自钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂。
如本文所用，“组合物”旨在涵盖包含指定量的指定成分的产品，以及由指定量的指定成分的组合产生的任何产品。“药学上可接受的”指的是载剂、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其他成分相容并且对于其受体无害。
“药学上可接受的赋形剂”是指帮助活性剂施用于受试者或被所述受试者吸收的物质。可用于本发明的药物赋形剂包括但不限于粘合剂、充填剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、调味剂和颜料(color)。本领域普通技术人员将认识到其他药物赋形剂也可用于本发明。
在一些情况下，保护基可以包括在根据本发明的方法或根据本发明的组合物中使用的化合物中。这种保护基的使用是为了防止随后的水解或可在体内发生并可降解化合物的其他反应。可被保护的基团包括醇、胺、羰基、羧酸、磷酸酯和末端炔烃。可用于保护醇的保护基包括但不限于乙酰基、苯甲酰基、苄基、β-甲氧基乙氧基乙基醚、二甲氧基三苯甲基、甲氧基甲基醚、甲氧基三苯甲基、对甲氧基苄基醚、甲硫基甲基醚、新戊酰基、四氢吡喃基、四氢呋喃、三苯甲基、甲硅烷基醚、甲基醚和乙氧基乙基醚。可用于保护胺的保护基包括苄氧羰基、对甲氧基苄基羰基、叔丁氧羰基、9-芴甲氧羰基、乙酰基、苯甲酰基、苄基、氨基甲酸酯、对甲氧基苄基、3,4-二甲氧基苄基、对甲氧基苯基、甲苯磺酰基、氯甲酸三氯乙酯和磺酰胺。可用于保护羰基的保护基包括缩醛、缩酮、缩羰酯和二噻烷。可用于保护羧酸的保护基包括甲基酯、苄基酯、叔丁基酯、2,6-二取代酚的酯、甲硅烷基酯、原酸酯和噁唑啉。可用于保护磷酸酯基的保护基包括2-氰基乙基和甲基。可用于保护末端炔烃的保护基包括炔丙醇和甲硅烷基。其他保护基是本领域已知的。
如本文所用，术语“前药”是指在施用后，在体内通过一些化学或生理过程释放生物学活性化合物的前体化合物(例如，在达到生理pH时或通过酶作用，前药被转化为生物学活性化合物)。前药本身可能缺乏或具有期望的生物学活性。因此，术语“前药”是指药学上可接受的生物学活性化合物的前体。在某些情况下，前药相对于衍生前药的母体化合物具有改善的物理和/或递送特性。前药通常提供在哺乳动物生物体中的溶解性、组织相容性或延缓释放的优点(H.Bundgard,Design of Prodrugs(Elsevier,Amsterdam,1988),第7-9,21-24页)。T.Higuchi等,“Pro-Drugs as Novel Delivery Systems,”ACS Symposium Series,第14卷和E.B.Roche编,Bioreversible Carriers in Drug Design(AmericanPharmaceutical Association&Pergamon Press,1987)中提供了前药的论述。前药的示例性优点可包括但不限于其物理特性，诸如长期储存的增强的药物稳定性。
术语“前药”还旨在包括任何共价键合的载剂，当对受试者施用前药时，所述前药在体内释放活性化合物。如本文所述，治疗活性化合物的前药可通过修饰治疗活性化合物中存在的一个或多个官能团来制备，所述治疗活性化合物包括大麻素、萜类，以及根据本发明的方法中使用的或根据本发明的组合物中包含的其他治疗活性化合物，所述修饰的方式使得所述修饰以常规操作或在体内裂解以产生母体治疗活性化合物。前药包括其中羟基、氨基或巯基与当对受试者施用活性化合物的前药时分别裂解形成游离羟基、游离氨基或游离巯基的任何基团共价键合的化合物。前药的实例包括但不限于醇的甲酸酯或苯甲酸酯衍生物或具有可用于反应的胺官能团的治疗活性剂的乙酰胺、甲酰胺或苯甲酰胺衍生物等。
例如，如果治疗活性剂或治疗活性剂的药学上可接受的形式含有羧酸官能团，则前药可包含通过将羧酸基团的氢原子替换为诸如以下的基团而形成的酯：C1-8烷基、C2-12烷酰氧基甲基、具有4至9个碳原子的1-(烷酰氧基)乙基、具有5至10个碳原子的1-甲基-1-(烷酰氧基)乙基、具有3至6个碳原子的烷氧基羰氧基甲基、具有4至7个碳原子的1-(烷氧基羰氧基)乙基、具有5至8个碳原子的1-甲基-1-(烷氧基羰氧基)乙基、具有3至9个碳原子的N-(烷氧基羰基)氨基甲基、具有4至10个碳原子的1-(N-(烷氧基羰基)氨基)乙基、3-酞基、4-巴豆酸内酯基、γ-丁内酯-4-基、二-N,N(C1-C2)烷基氨基(C2-C3)烷基(诸如(3-二甲基氨基乙基)、氨基甲酰基-(C1-C2)烷基、N,N-二(C1-C2)烷基氨基甲酰基-(C1-C2)烷基以及哌啶子基-、吡咯烷子基-或吗啉代(C2-C3)烷基。
类似地，如果所公开的化合物或所述化合物的药学上可接受的形式含有醇官能团，则前药可通过将醇基团的氢原子替换为诸如以下的基团而形成：(C1-C6)烷酰氧基甲基、1-((C1-C6))烷酰氧基)乙基、1-甲基-1-((C1-C6)烷酰氧基)乙基(C1-C6)烷氧基羰氧基甲基、N-(C1-C6)烷氧基羰基氨基甲基、琥珀酰基、(C1-C6)烷酰基、α-氨基(C1-C4)烷酰基、芳基酰基和α-氨基酰基、或α-氨基酰基-α-氨基酰基(其中各α-氨基酰基独立地选自天然存在的L-氨基酸、P(O)(OH)2、P(O)(O(C1-C6)烷基)2或糖基(所述自由基由去除半缩醛形式的烃的羟基而得到)。
如果所公开的化合物或所述化合物的药学上可接受的形式并入了胺官能团，则可以通过将胺基团中的氢原子替换为诸如以下的基团而形成：R-羰基、RO-羰基、NRR′-羰基，其中R和R′各自独立地为(C1-C10)烷基、(C3-C7)环烷基、苄基，或R-羰基是天然的α-氨基酰基或天然的α-氨基酰基-天然α-氨基酰基；C(OH)C(O)OY1，其中Y1为H、(C1-C6)烷基或苄基；C(OY2)Y3，其中Y2为(C1-C4)烷基并且Y3为(C1-C6)烷基、羧基(C1-C6)烷基、氨基(C1-C4)烷基或单-N或二-N,N(C1-C6)烷基氨基烷基；C(Y4)Y5，其中Y4为H或甲基并且Y5为单-N或二-N,N(C1-C6)烷基氨基、吗啉代、哌啶-1-基或吡咯烷-1-基。
前药系统的使用描述于T.
Figure BDA0002475767790000251
等,“Design and PharmaceuticalApplications of Prodrugs”，在Drug Discovery Handbook(S.C.Gad编,Wiley-Interscience,Hoboken,NJ,2005),第17章,第733-796页中。前药构造和使用的其他替代方案是本领域已知的。当根据本发明的方法或药物组合物使用或包括大麻素、萜类或其他治疗活性剂的前药时，可使用本领域已知的常规技术鉴定化合物的前药和活性代谢物。参见，例如，Bertolini等,J.Med.Chem.,40,2011-2016(1997)；Shan等,J.Pharm.Sci.,86(7),765-767；Bagshawe,Drug Dev.Res.,34,220-230(1995)；Bodor,Advances in Drug Res.,13,224-331(1984)；Bundgaard,Design of Prodrugs(Elsevier Press 1985)；Larsen,Design and Application of Prodrugs,Drug Design and Development(Krogsgaard-Larsen等编,Harwood Academic Publishers,1991)；Dear等,J.Chromatogr.B,748,281-293(2000)；Spraul等,J.Pharmaceutical&Biomedical Analysis,10,601-605(1992)；以及Prox等,Xenobiol.,3,103-112(1992)。
大麻素
大麻素是已知激活整个人体(包括皮肤在内)的细胞中的大麻素受体的一组化学物质。植物性大麻素是来源于大麻植物的大麻素。它们可以从植物中分离或通过合成产生。内源性大麻素是在人体中发现的内源性的大麻素。经典的植物性大麻素是带有苯并吡喃部分的ABC三环萜类化合物。
大麻素通过与细胞表面存在的大麻素受体相互作用而发挥作用。迄今为止，已经鉴定出两类大麻素受体：CB1受体和CB2受体。这两种受体具有约48％的氨基酸序列同一性，分布在不同的组织中，并且还具有不同的信号传导机制。它们对激动剂和拮抗剂的敏感性也不同。
因此，本文描述了用于筛选和鉴定用于在体内产生大麻素的基因、启动子和表达盒的体外和体内方法。
通常，本文所述的方法和组合物可用于在宿主细胞中产生一种或多种萜类(诸如大麻素)或增加其产生，或在宿主细胞中产生一种或多种萜类或大麻素前体。在一些情况下，萜类或大麻素或其前体可以纯化、衍生化(例如，形成前药、溶剂化物或盐，或由前体形成目标萜类或大麻素)，和/或配制在药物组合物中。
可以根据本发明的方法和/或使用本发明的组合物产生的大麻素包括但不限于植物性大麻素。在一些情况下，大麻素包括但不限于大麻酚、大麻二酚、Δ9-四氢大麻酚(Δ9-THC)、合成大麻素HU-210(6aR,10aR)-9-(羟甲基)-6,6-二甲基-3-(2-甲基辛-2-基)-6H,6aH,7H,10H,10aH-苯并[c]异色烯-1-酚)、次大麻二酚(CBDV)、大麻色烯(CBC)、次大麻色烯(CBCV)、大麻萜酚(CBG)、次大麻萜酚(CBGV)、大麻艾尔松(CBE)、大麻环酚(CBL)、次大麻酚(CBV)和二羟基大麻酚(CBT)。其他大麻素包括，包括四氢次大麻二酚(THCV)和大麻萜酚单甲基醚(CBGM)。另外的大麻素包括大麻色烯酸(CBCA)、Δ9-四氢大麻酚酸(THCA)；和大麻二酚酸(CBDA)；这些另外的大麻素的特征在于其结构中存在羧酸基团。
其他大麻素包括大麻隆、利莫那班(rimonabant)、JWH-018(萘-1-基-(1-戊基吲哚-3-基)甲酮)、JWH-073萘-1-基-(1-丁基吲哚-3-基)甲酮、CP-55940(2-[(1R,2R,5R)-5-羟基-2-(3-羟丙基)环己基]-5-(2-甲基辛-2-基)苯酚)、二甲基庚基吡喃、HU-331(3-羟基-2-[(1R)-6-异丙烯基-3-甲基-环己-2-烯-1-基]-5-戊基-1,4-苯醌)、SR144528(5-(4-氯-3-甲基苯基)-1-[(4-甲基苯基)甲基]-N-[(1S,2S,4R)-1,3,3-三甲基双环[2.2.1]庚-2-基]-1H-吡唑-3-羧酰胺)、WIN 55,212-2((11R)-2-甲基-11-[(吗啉-4-基)甲基]-3-(萘-1-羰基)-9-氧杂-1-氮杂三环[6.3.1.04,12]十二碳-2,4(12),5,7-四烯)、JWH-133((6aR,10aR)-3-(1,1-二甲基丁基)-6a,7,10,10a-四氢-6,6,9-三甲基-6H-二苯并[b,d]吡喃)、左那曲多(levonatradol)和AM-2201(1-[(5-氟戊基)-1H-吲哚-3-基)]-(萘-1-基)甲酮)。其他大麻素包括Δ8-四氢大麻酚(Δ8-THC)、11-羟基-Δ9-四氢大麻酚、Δ11-四氢大麻酚和11-羟基-四大麻酚。
在另一替代方案中，这些大麻素的类似物或衍生物可以通过产生大麻素前体并进一步衍生化(例如通过合成手段)而获得。合成大麻素包括但不限于以下各项中描述的那些：授予Attala等的美国专利号9,394,267；授予Herkenroth等的美国专利号9,376,367；授予Gijsen等的美国专利号9,284,303；授予Travis的美国专利号9,173,867；授予Fulp等的美国专利号9,133,128；授予Jones等的美国专利号8,778,950；授予Adam-Worrall等的美国专利号7,700,634；授予Davidson等的美国专利号7,504,522；授予Barth等的美国专利号7,294,645；授予Kruse等的美国专利号7,109,216；授予Thomas等的美国专利号6,825,209；以及授予Mittendorf等的美国专利号6,284,788。
在另一替代方案中，大麻素可以是内源性大麻素或其衍生物或类似物。内源性大麻素包括但不限于花生四烯乙醇胺(anandamide)、2-花生四烯酸甘油、2-花生四烯酸甘油醚、N-花生四烯酸多巴胺和O-花生四烯酰乙醇胺(virodhamine)。已知许多内源性大麻素类似物，包括7,10,13,16-二十二碳四烯酰基乙醇酰胺、油酰胺、硬脂酰基乙醇酰胺和高-γ-亚麻酰基乙醇胺，也是已知的。
在根据本发明的方法和组合物中产生的大麻素可以对CB2大麻素受体具有选择性，也可以对两种大麻素受体都不具有选择性，从而与CB1大麻素受体或CB2大麻素受体结合。在一些情况下，在根据本发明的方法和组合物中产生的大麻素对CB2大麻素受体具有选择性。在一些情况下，大麻素，或大麻素混合物中的大麻素中的一种是CB2的拮抗剂(例如，选择性或非选择性拮抗剂)。在一些情况下，在根据本发明的方法和组合物中产生的大麻素对CB2大麻素受体具有选择性。在一些情况下，大麻素，或大麻素混合物中的大麻素中的一种是CB1的拮抗剂(例如，选择性或非选择性拮抗剂)。
表达盒
本文描述了适于在宿主细胞中表达一种或多种靶基因的表达盒。本文所述的表达盒可以是质粒的组分或整合到宿主细胞基因组中。单个质粒可以含有一个或多个本文所述的表达盒。如本文所用，在描述两个或更多个表达盒的情况下，应理解，可替代地，两个或更多个表达盒中的至少两个可以组合以减少表达盒的数量。类似地，当多个靶基因被描述为可操作地连接于单个启动子并因此被描述为单个表达盒的组分时，应理解，单个表达盒可细分为两个或更多个含有单个所述表达盒的重叠或非重叠子集的表达盒。
本文所述的表达盒可以含有如本领域已知的合适的启动子。在一些情况下，启动子是组成型启动子。在其他情况下，启动子是诱导型启动子。在优选的实施方案中，启动子是T5启动子、T7启动子、Trc启动子、Lac启动子、Tac启动子、Trp启动子、tip启动子、λPL启动子、λPR启动子、λPRPL启动子、阿拉伯糖启动子(araBAD)等。在一些实施方案中，启动子选自由Zaslaver等,Nat Methods.2006Aug；3(8):623-8中描述的大肠杆菌启动子组成的组，所述参考文献据此通过引用整体并入，特别是关于本文所述的启动子、用于表达目标核酸的表达盒(包括质粒)、靶基因、宿主细胞以及其组合。可用于驱动一个或多个靶基因在各种宿主细胞中的表达的启动子是众多的并且是本领域技术人员熟悉的(参见，例如，WO 2004/033646；U.S.8,507,235；U.S.8,715,962；和WO 2011/017798，以及其中引用的参考文献，所述专利和参考文献各自据此通过引用整体并入，特别是关于本文所述的启动子、用于表达目标核酸的表达盒(包括质粒)、靶基因、宿主细胞以及其组合。
本文所述的方法和组合物可用于在合适的宿主细胞中表达MEP途径的一种或多种基因，和/或产生MEP途径的一种或多种产物。在一些实施方案中，通过扩增基因拷贝数和/或将内源性基因(或其拷贝)可操作地连接至强组成型或诱导型异源启动子来过表达宿主细胞的一种或多种内源性组分而增加MEP途径流量。因此，在一个实施方案中，提供了一种表达盒，其包含与编码MEP途径的一种或多种基因的核酸可操作地连接的启动子。在大肠杆菌中，内源性MEP途径基因是dxs、ispC、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH和idi。
在一些情况下，表达盒的启动子与编码MEP途径的两种或更多种基因的核酸可操作地连接。在一些情况下，表达盒的启动子与编码MEP途径的三种或更多种基因的核酸可操作地连接。在一些情况下，表达盒的启动子与编码MEP途径的四种、五种、六种或全部八种基因的核酸可操作地连接。在一些情况下，表达盒中提供的MEP途径的基因是大肠杆菌基因。在其他情况下，表达盒中提供的MEP途径的一种或多种基因是与野生型大肠杆菌异源的基因。在一些情况下，在第一表达盒中提供MEP途径的一种或多种基因，并且在第二表达盒中提供MEP途径的一种或多种基因。在一个优选实施方案中，提供了一种表达盒，其包含与dxs和idi可操作地连接的启动子。
在一些情况下，提供了一种表达盒，其包含与编码MEP途径的一种或多种基因且进一步编码GPP合酶、大麻素合酶或异戊二烯合酶的核酸可操作地连接的启动子。在一些情况下，提供了一种表达盒，其包含与编码MEP途径的一种或多种基因且进一步编码THCA合酶的核酸可操作地连接的启动子。在一些情况下，提供了一种表达盒，其包含与编码MEP途径的一种或多种基因且进一步编码CBGA合酶的核酸可操作地连接的启动子。在一些情况下，提供了一种表达盒，其包含与编码MEP途径的一种或多种基因且进一步编码CBCA合酶的核酸可操作地连接的启动子。在一些情况下，提供了一种表达盒，其包含与编码MEP途径的一种或多种基因且进一步编码CBDA合酶的核酸可操作地连接的启动子。
在一些实施方案中，提供了一种表达盒，其包含与编码双功能ispDF酶的核酸可操作地连接的启动子。ispDF基因可用作宿主细胞中天然ispD和/或ispF的过表达的补充或替代。在一些情况下，所述核酸编码ispDF蛋白，其具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：MIALQRSLSMHVTAIIAAAGEGRRLGAPLPKQLLDIGGRSILERSVMAFARHERIDDVIVVLPPALAAAPPDWIAASGRVPAVHVVSGGERRQDSVANAFDRVPAQSDVVLVHDAARPFVTAELISRAIDGAMQHGAAIVAVPVRDTVKRVDPDGEHPVITGTIPRDTIYLAQTPQAFRRDVLGAAVALGRSGVSATDEAMLAEQAGHRVHVVEGDPANVKITTSADLDQARQRLRSAVAARIGTGYDLHRLIEGRPLIIGGVAVPCDKGALGHSDADVACHAVIDALLGAAGAGNVGQHYPDTDPRWKGASSIGLLRDALRLVQERGFTVENVDVCVVLERPKIAPFIPEIRARIAGALGIDPERVSVKGKTNEGVDAVGRGEAIAAHAVALLSES。
在其他实施方案中，ispDF核酸编码相对于SEQ ID NO.1具有至少32％、40％、45％、50％、52％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的ispDF蛋白。在其他实施方案中，ispDF核酸编码相对于SEQ ID NO.1的至少300个连续氨基酸具有至少32％、40％、45％、50％、52％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的ispDF蛋白。
在一些情况下，双功能ispDF具有与以下各项的至少300个连续氨基酸具有不超过75％的同一性的一级氨基酸序列：幽门螺杆菌HP1020、幽门螺杆菌HP1020、幽门螺杆菌J99jhp0404、幽门螺杆菌HPAG1 HPAG1_0427、肝螺杆菌HH1582、猎豹螺杆菌Sheeba菌株Hac_1124、产琥珀酸沃廉菌DSM 1740 WS1940、反硝化希瓦氏菌DSM 1251 Suden_1487、空肠弯曲杆菌空肠亚种NCTC 11168 Cj1607、空肠弯曲杆菌RM1221 CJE1779、空肠弯曲杆菌空肠亚种81-176CJJ81176_1594，以及胎儿弯曲杆菌胎儿亚种82-40 CFF8240_0409。在一些情况下，双功能ispDF不是幽门螺杆菌HP1020、幽门螺杆菌HP1020、幽门螺杆菌J99jhp0404、幽门螺杆菌HPAG1 HPAG1_0427、肝螺杆菌HH1582、猎豹螺杆菌Sheeba菌株Hac_1124、产琥珀酸沃廉菌DSM 1740 WS1940、反硝化希瓦氏菌DSM 1251 Suden_1487、空肠弯曲杆菌空肠亚种NCTC11168 Cj1607、空肠弯曲杆菌RM1221CJE1779、空肠弯曲杆菌空肠亚种81-176 CJJ81176_1594，或胎儿弯曲杆菌胎儿亚种82-40 CFF8240_0409。
双功能ispDF可以由质粒内的核酸编码。可替代地，双功能ispDF可以由整合到异源宿主细胞的基因组中的核酸编码。在一些情况下，异源启动子与编码双功能ispDF的核酸可操作地连接。另外或可替代地，宿主细胞与编码双功能ispDF的核酸可以是异源的。
编码双功能ispDF的核酸可以处于MEP途径表达盒中，所述表达盒诸如含有编码MEP途径基因的核酸的前述表达盒中的任一个。在一些情况下，编码双功能ispDF的核酸可以处于含有编码大麻素合酶的核酸的表达盒中。在一些情况下，编码双功能ispDF的核酸可以处于含有编码GPP合酶的核酸的表达盒中。在一些情况下，编码双功能ispDF的核酸可以处于含有编码异戊二烯合酶的核酸的表达盒中。
本文所述的方法和组合物可以用于在合适的宿主细胞中由MEP途径中产生的前体产生GPP。因此，在一些实施方案中，提供了包含与编码GPP合酶的核酸可操作地连接的启动子的表达盒。GPP合酶可以处于还含有编码MEP途径基因的核酸的表达盒中。另外或可替代地，GPP合酶可以处于还含有编码大麻素合酶的核酸的表达盒中。在一些情况下，与编码GPP合酶的核酸可操作地连接的表达盒的启动子也与大麻素合酶可操作地连接。另外或可替代地，GPP合酶可以处于还含有编码GPP合酶的核酸的表达盒中。另外或可替代地，GPP合酶可以处于还含有编码异戊二烯合酶的核酸的表达盒中。
本文所述的方法和组合物可以用于在宿主细胞中产生大麻素。因此，在一些实施方案中，提供了包含与编码大麻素合酶的核酸可操作地连接的启动子的表达盒。大麻素合酶可以是大麻属植物内源性的大麻素合酶，或其直系同源物。在一些情况下，大麻素合酶是普通大麻或印度大麻内源性的大麻素合酶，或其直系同源物。在一些情况下，大麻素合酶是CBGA合酶、THCA合酶、CBDA合酶或CBCA合酶(例如，大麻属植物内源性的，或其直系同源物)。
可以修饰大麻素合酶以在宿主中表达。例如，可以截短一个或多个跨膜或信号肽结构域。另外或可替代地，一个或多个糖基化位点可以缺失(例如，通过一级氨基酸序列的突变)。类似地，可以将存在于其天然宿主中的天然蛋白质的分子内二硫键中的一个或多个或所有半胱氨酸突变为例如丝氨酸。类似地，可以将存在于其天然宿主中的天然蛋白质的分子间二硫键中的一个或多个或所有半胱氨酸突变为例如丝氨酸。
宿主细胞
可以将任何前述表达盒及其组合引入合适的宿主细胞中并用于产生目标萜类或大麻素。合适的宿主细胞包括但不限于原核生物，诸如埃希氏菌属、泛菌属、棒状杆菌属、芽孢杆菌属或乳球菌属的原核生物。优选的原核生物宿主细胞包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、柠檬泛菌、谷氨酸棒状杆菌、枯草芽孢杆菌和乳酸乳球菌。在一些实施方案中，本文所述的表达盒包含与编码一种或多种靶基因(例如，MEP途径基因、大麻素合酶基因、ispA、ispS、ispDF或GPP合酶)的核酸可操作地连接的启动子(例如，异源启动子)，其中针对包含表达盒的宿主细胞对编码一种或多种靶基因的核酸进行了密码子优化。
在一些情况下，宿主细胞包含MEP途径的一种或多种产物，诸如DMAPP和/或IPP。例如，与不含MEP途径表达盒的宿主细胞相比，含有如本文所述的MEP途径表达盒的宿主细胞可以包含增加量的MEP途径产物，诸如DMAPP和/或IPP。
在一些情况下，宿主细胞可以包含MEP途径下游的一种或多种产物。例如，与缺乏GPP合酶表达盒的宿主细胞相比，包含GPP合酶表达盒的宿主细胞可以包含增加量的GPP。又如，与缺乏异戊二烯合酶表达盒的宿主细胞相比，包含异戊二烯合酶表达盒的宿主细胞可以包含增加量的异戊二烯。
又如，与缺乏大麻素合酶表达盒的宿主细胞相比，包含大麻素合酶表达盒的宿主细胞可以包含增加量的大麻素。在一些情况下，大麻素是CBGA。在一些情况下，大麻素是CBCA。在一些情况下，大麻素是CBDA。在一些情况下，大麻素是THCA。在一些情况下，大麻素是CBN。在一些情况下，大麻素是CBD。在一些情况下，大麻素是THC。在一些情况下，大麻素是CBC。在一些情况下，大麻素是THCV。在一些情况下，大麻素是CBDV。在一些情况下，大麻素是CBCV。
类似地，与非诱导条件相比，当在适于诱导表达盒表达的条件下培养宿主细胞时，宿主细胞可以包含由宿主细胞中的表达盒编码的一种或多种酶的升高量的产物。例如，与在不存在诱导剂的情况下(例如，在不存在IPTG、阿拉伯糖等的情况下)培养的相同宿主细胞相比，当被诱导时，宿主细胞可以表现出增加的DMAPP和/或IPP。又如，与在不存在诱导剂的情况下(例如，在不存在IPTG、阿拉伯糖等的情况下)培养的相同宿主细胞相比，当被诱导时，宿主细胞可以表现出增加的GPP。又如，与在不存在诱导剂的情况下(例如，在不存在IPTG、阿拉伯糖等的情况下)培养的相同宿主细胞相比，当被诱导时，宿主细胞可以表现出增加的异戊二烯。又如，与在不存在诱导剂的情况下(例如，在不存在IPTG、阿拉伯糖等的情况下)培养的相同宿主细胞相比，当被诱导时，宿主细胞可以表现出增加的大麻素。
在一些实施方案中，宿主细胞包含橄榄醇酸(OA)。通过在含有OA的培养基中培养宿主细胞可以将OA引入宿主细胞中。在一些实施方案中，宿主细胞包含二茶碱酸(divarinic acid，DVA)。通过在含有DVA的培养基中培养宿主细胞可以将DVA引入宿主细胞中。
在一些实施方案中，对宿主细胞进行基因修饰以消除或降低编码减少通过MEP途径的流量的内源性酶的一种或多种基因的表达。在一些实施方案中，对宿主细胞进行基因修饰以消除或降低减少通过MEP途径的流量的内源性酶的量或活性。例如，丙酮酸盐(pyruvate)和甘油醛-3磷酸(G3P)是MEP途径的初始酶dxs的底物。可以对消耗丙酮酸盐和G3P的内源性途径进行修饰，以增加丙酮酸盐和G3P的量，从而增加通过MEP途径的流量。在一些情况下，对选自由ackA-pta、poxB、ldhA、dld、adhE、pps和atoDA组成的组的一种或多种宿主细胞内源性基因或基因产物进行修饰，以增加丙酮酸盐或G3P水平。
培养方法
本发明还提供了一种用于在诱导条件下在合适的培养基中培养根据本发明的宿主细胞，从而产生目标代谢产物的方法。目标代谢产物可以是大麻素、萜类或其前体。所述方法可以包括浓缩耗尽培养基和/或宿主细胞中的代谢物。
为了产生期望的有机-化学化合物，所产生的微生物可以连续培养—如例如WO05/021772中所述—或在分批工艺中(分批培养)或在分批补料或重复分批补料工艺中不连续地培养。关于已知培养方法的一般性质的总结在Chmiel的教材(BioprozeBtechnik.1:Einfiihrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或Storhas的教材(Bioreaktoren和periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))中可获得。
待使用的培养基或发酵培养基必须以合适的方式满足相应菌株的需求。美国细菌学学会(American Society for Bacteriology)的“Manual of Methods for GeneralBacteriology”(Washington D.C.,USA,1981)中介绍了用于各种微生物的培养基的描述。术语培养基和发酵培养基是可互换的。
作为碳源，可以使用糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、由甜菜或甘蔗加工产生的含蔗糖溶液、淀粉、淀粉水解物和纤维素；油和脂肪，例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子脂；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如甘油、甲醇和乙醇；以及有机酸，例如乙酸或乳酸。
作为氮源，可以使用有机含氮化合物，诸如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素；或无机化合物，诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单独使用或以混合物的形式使用。
作为磷源，可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或对应的含钠盐。
培养基可另外包含生长所必需的盐，例如为金属例如钠、钾、镁、钙和铁的氯化物或硫酸盐的形式，例如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，还可使用必需生长因子，诸如氨基酸，例如高丝氨酸和维生素，例如硫胺素、生物素或泛酸。
可将所述起始材料以单批的形式添加到培养基中，或在培养期间以合适的方式补料。
培养基的pH可以通过使用碱性化合物诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水；或酸性化合物诸如磷酸或硫酸以合适的方式控制。通常将pH调节至6.0至8.5，优选地6.5至8的值。为了控制起泡，可以使用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了维持质粒的稳定性，可以向培养基中添加合适的选择性物质，例如抗生素。培养优选地在有氧条件下进行。为了维持这些条件，将氧气或含氧气体混合物，例如空气引入培养基中。同样可以使用富含过氧化氢的液体。在适当时，在高压下，例如在0.03至0.2MPa的高压下进行培养。培养基的温度通常为20℃至45℃，并且优选地25℃至40℃，特别优选地30℃至37℃。在分批或补料分批工艺中，优选地继续培养，直到形成足够回收的量的期望的有机-化学化合物。这一目标通常在10小时至160小时内实现。在连续工艺中，可能需要更长的培养时间。微生物的活性导致有机-化学化合物在所述微生物的发酵培养基和/或细胞中浓缩(积聚)。
合适的培养基的实例尤其可见于专利US 5,770,409、US 5,990,350、US 5,275,940、WO 2007/012078、US 5,827,698、WO 2009/043803、US 5,756,345和US 7,138,266。
可以通过利用色谱法，优选地反相色谱法分离代谢物来进行目标代谢产物的分析，以确定培养过程中的一个或多个时间处的浓度。
可以通过光度测定方式(吸收、荧光)进行检测。
就选自由浓度(每单位体积形成的目标代谢产物)、收率(每单位消耗的碳源形成的目标代谢产物)、形成(每单位体积和时间形成的目标代谢产物)和比形成(每单位干细胞物质或干生物质和时间的目标代谢产物或者每单位细胞蛋白质和时间形成的化合物)或其他工艺参数以及其组合组成的组的一个或多个参数而言，基于使用不含根据本发明的表达盒的宿主细胞的培养方法，使用含有根据本发明的一个或多个表达盒的宿主细胞的培养方法的性能可以增加至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。就大规模工业过程而言，据认为这是非常值得的。
然后可以提供或产生或回收液体或固体形式的含有目标代谢产物的产物。
耗尽培养基是指其中宿主细胞已在一定温度下培养了一段时间的培养基。培养过程中使用的一种或多种培养基包含确保期望目标代谢产物的产生以及典型增殖和活力的所有物质或组分。当培养完成时，所得的耗尽培养基相应地包含：a)微生物的生物质(细胞团)，所述生物质是由于所述微生物的细胞的增殖而产生的；b)在培养过程中形成的期望目标代谢产物；c)在培养过程中可能形成的有机副产物；以及d)在培养中尚未消耗的所用培养基或起始材料的成分，例如维生素诸如生物素或盐诸如硫酸镁。
有机副产物包括由培养所用微生物产生的除特定的期望化合物之外的物质，并且任选地是分泌的。耗尽培养基可以从培养容器或发酵罐中取出，在适当时收集，并用于提供液体或固体形式的含有目标代谢产物的产物。在最简单的情况下，已经从发酵罐中取出的含目标代谢产物的耗尽培养基自身构成回收的产物。
在一些情况下，回收目标代谢产物(例如，萜类、大麻素或其前体)包括但不限于选自由以下组成的组的一种或多种措施：a)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或基本上完全(>80％、>90％、>95％、>96％、>97％、>98％或>99％)除去水；b)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或基本上完全(>80％、>90％、>95％、>96％、>97％、>98％或>99％)除去生物质，后者任选地在除去之前是失活的；c)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或基本上完全(>80％、>90％、>95％、>96％、>97％、>98％、>99％、>99.3％或>99.7％)除去在培养过程中形成的有机副产物；以及d)部分(>0％)至完全(100％)或基本上完全(>80％、>90％、>95％、>96％、>97％、>98％、>99％、>99.3％或>99.7％)从耗尽培养基中除去所用发酵培养基或起始材料中在培养中未被消耗的成分，从而实现期望目标代谢产物的浓缩或纯化。以此方式分离具有期望含量的所述目标代谢产物的组合物。
部分(>0％至<80％)至完全(100％)或基本上完全(>80％至<100％)除去水(措施a)也称为干燥。
在所述工艺的一种变体中，完全或基本上完全除去水、生物质、有机副产物和所用发酵培养基的未消耗成分得到纯(>80重量％、>90重量％)或高纯度(>95重量％、>97重量％或>99重量％)的产物形式的期望目标代谢产物。对于措施a)、b)、c)和d)的大量技术指导在现有技术中可获得。
根据需要，可以通过分离方法，例如离心、过滤、滗析或其组合将生物质全部或部分地从耗尽培养基中除去，或所述生物质可以完全保留在所述耗尽培养基中。在适当时，生物质或含有生物质的耗尽培养基在合适的工艺步骤中失活，例如通过热处理(加热)或添加碱或酸。
在一个程序中，生物质完全或基本上完全除去，使得在制备的产物中没有(0％)生物质或保留至多30％、至多20％、至多10％、至多5％、至多1％或至多0.1％的生物质。在另一程序中，生物质未被除去，或仅小部分被除去，使得所有(100％)或多于70％、80％、90％、95％、99％或99.9％的生物质保留在制备的产物中。因此，在根据本发明的一种工艺中，以>0％至<100％的比例除去生物质。最后，发酵后获得的发酵液在完全或部分除去生物质之前或之后可以用无机酸例如盐酸、硫酸或磷酸；或者用有机酸例如丙酸调节为酸性PH，以便改善最终产物的处置特性(GB 1,439,728或EP 1331220)。同样也可以对具有全部含量的生物质的发酵液进行酸化。最后，还可以通过添加亚硫酸氢钠(NaHC03，GB 1,439,728)或另一种盐例如硫酸的铵盐、碱金属盐或碱土金属盐而使液体培养基稳定化。
在除去生物质期间，耗尽培养基中存在的任何有机或无机固体可以部分或完全除去。有机副产物溶解在耗尽培养基中，并且发酵培养基(起始材料)的溶解的未消耗成分可以至少部分地(>0％)保留在产物中，在一些情况下其程度为至少25％，在一些情况下其程度为至少50％并且在一些情况下其程度为至少75％。在适当时，它们也完全保留(100％)或基本上完全保留(即>95％或>98％或>99％)在产物中。
随后，可以通过已知方法从耗尽培养基中除去水，或将所述耗尽培养基增稠或浓缩，例如使用旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜蒸发器，通过反渗透或纳米过滤。然后可以将这一浓缩的耗尽培养基后处理成自由流动的产物，特别是细碎粉末或优选粗颗粒，这通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾粒化的方法或通过其他工艺诸如在循环流化床中实现，如例如根据PCT/EP2004/006655所述。
药物组合物
可以将目标代谢产物配制成药物组合物。在一些情况下，将耗尽培养基或浓缩的耗尽培养基，或在本文所述的培养方法中获得的来自耗尽培养基或生物质的部分或完全纯化的目标代谢产物配制成药物组合物。
根据本发明的药物组合物可以包含一种或多种赋形剂。适合在旨在应用于皮肤的局部用组合物中使用的此类赋形剂包括但不限于：防腐剂；增稠剂；缓冲剂；液体载剂；等渗剂；润湿剂、增溶剂和乳化剂；酸化剂；抗氧化剂；碱化剂；运载剂；螯合剂；络合剂；溶剂；悬浮剂或增粘剂；油；渗透促进剂；聚合物；硬化剂；蛋白质；碳水化合物；以及填充剂(bulkingagent)。
如药物制剂领域中通常已知的，取决于赋形剂的浓度、组合物中的其他赋形剂、组合物的物理形式、组合物中活性剂的浓度、组合物的预期施用途径以及其他因素，特定赋形剂可以在特定药物组合物中实现这些功能中的一种或多种。以下类别中的特定赋形剂的列举不旨在排除另外一个或多个类别中的赋形剂的可能使用。
液体载剂可以是但不限于选自由盐水、磷酸盐缓冲盐水、甘油和乙醇组成的组的液体载剂。
增稠剂可以是但不限于选自由甘油和丙二醇组成的组的增稠剂。
等渗剂可以是但不限于：选自由甘露醇和山梨醇组成的组的多元醇；氯化钠；以及氯化钾。
润湿剂、增溶剂或乳化剂通常是表面活性剂。通常，表面活性剂选自由以下组成的组：苯扎氯铵、苄索氯铵、鲸蜡基氯化吡啶鎓、多库酯钠、壬苯醇醚9、壬苯醇醚10、辛苯醇醚9、泊洛沙姆、聚氧乙烯35蓖麻油、聚氧乙烯40、氢化蓖麻油、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯10油醚、聚氧乙烯20、鲸蜡基硬脂基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80、十二烷基硫酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、泰洛沙泊(tyloxapol)、阿拉伯树胶(acacia)、胆固醇、二乙醇胺、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇、卵磷脂、单和双甘油酯、单乙醇胺(佐剂)、油酸(佐剂)、油醇(稳定剂)、泊洛沙姆、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯35蓖麻油、聚氧乙烯40氢化蓖麻油、聚氧乙烯10油醚、聚氧乙烯20十六硬脂基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80、丙二醇二乙酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、硬脂酸、三乙醇胺、乳化蜡、聚西托醇(cetomacrogol)和鲸蜡醇。
用于局部应用的药物组合物可以包含润肤剂。如本文所用，术语“润肤剂”是指软化皮肤或其他粘膜、使其变得光滑并改善其脂质含量的疏水剂。适合使用的润肤剂的实例包括异硬脂酸衍生物、棕榈酸异丙酯、羊毛脂油、二聚酸二异丙酯、己二酸二异丙酯、二甲基异山梨醇(dimethyl isosorbide)、马来酸化大豆油、棕榈酸辛酯、异硬脂酸异丙酯、鲸蜡醇、乳酸鲸蜡酯、蓖麻醇酸鲸蜡酯、生育酚乙酸酯、乙酰化羊毛脂醇、乙酸鲸蜡酯、苯基聚三甲基硅氧烷、甘油油酸酯、生育酚亚油酸酯、小麦胚芽甘油酯、花生醇丙酸酯(arachidylpropionate)、乳酸肉豆蔻酯、油酸癸酯、丙二醇蓖麻醇酸酯、羊毛脂酸异丙酯、季戊四醇四硬脂酸酯、新戊二醇二辛酸酯/二癸酸酯、氢化椰油-甘油酯、异壬酸异壬酯、异壬酸异十三烷基酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯、柠檬酸三异鲸蜡酯、辛基十二烷醇、羟基硬脂酸辛酯、葡萄籽油、一种或多种神经酰胺、环状聚甲基硅氧烷以及其混合物。其他合适的润肤剂的其他实例还可见于Cosmetic Bench Reference,第1.19-1.22页(1996)。本领域技术人员将认识到，其他润肤剂也可用于本发明。
防腐剂可以选自由以下组成的组：苯扎氯铵、苯扎氯铵溶液、苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、对羟基苯甲酸丁酯、鲸蜡基氯化吡啶鎓、氯丁醇、氯甲酚、甲酚、脱氢乙酸、重氮烷基脲、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯钠、苯酚、苯乙醇、乙酸苯汞、硝酸苯汞、苯甲酸钾、山梨酸钾、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯钠、苯甲酸钠、脱氢乙酸钠、丙酸钠、山梨酸、硫柳汞和百里酚。
所述组合物可以包含缓冲剂，所述缓冲剂选自由以下组成的组：乙酸、碳酸铵、磷酸铵、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、柠檬酸钾、偏磷酸钾、磷酸二氢钾、乙酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠溶液、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、三(三(羟甲基)氨基甲烷)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、HEPES(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)、ACES(2-[(2-氨基-2-氧代乙基)氨基]乙磺酸)、ADA(N-(2-乙酰氨基)2-亚氨基二乙酸)、AMPSO(3-[(1,1-二甲基1-2-羟乙基氨基]-2-丙磺酸)、BES(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、Bicine(N,N-双(2-羟乙基甘氨酸)、双-三(双-(2-羟乙基)亚氨基-三(羟甲基)甲烷、CAPS(3-(环己基氨基)-1-丙磺酸)、CAPSO(3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸)、CHES(2-(N-环己基氨基)乙磺酸)、DIPSO(3-[N,N-双(2-羟乙基氨基]-2-羟基-丙磺酸)、HEPPS(N-(2-羟乙基哌嗪)-N′-(3-丙磺酸)、HEPPSO(N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、三乙醇胺、咪唑、甘氨酸、乙醇胺、磷酸盐、MOPSO(3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸)、PIPES(哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)、POPSO(哌嗪-N,N′-双(2-羟基丙磺酸)、TAPS(N-三[羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸)、TAPSO(3-[N-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基-丙磺酸)、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸、tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇和2-氨基-2-甲基-1-丙醇。
通常，酸化剂选自由以下组成的组：乙酸、柠檬酸、富马酸、盐酸、稀盐酸、苹果酸、硝酸、磷酸、稀磷酸、硫酸和酒石酸。
通常，抗氧化剂选自由以下组成的组：抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、甲醛合次硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、二氧化硫和生育酚。
通常，碱化剂选自由以下组成的组：强氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、二异丙醇胺、氢氧化钾、碳酸氢钠、硼酸钠、碳酸钠、氢氧化钠和三乙醇胺。
运载剂可以选自由以下组成的组：玉米油、矿物油、花生油、芝麻油、抑菌氯化钠和抑菌水。
螯合剂可以选自由以下组成的组：依地酸二钠、乙二胺四乙酸、柠檬酸和水杨酸盐。
络合剂可以选自由以下组成的组：乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸的盐、龙胆酸乙醇酰胺和硫酸羟喹啉。
溶剂可以选自由以下组成的组：丙酮、乙醇、稀醇、水合戊烯、苯甲酸苄酯、丁醇、四氯化碳、氯仿、玉米油、棉籽油、乙酸乙酯、甘油、己二醇、异丙醇、甲基异丁基酮、矿物油、油酸、花生油、聚乙二醇、碳酸亚丙酯、丙二醇、芝麻油、水、无菌水和纯净水。
通常，悬浮剂和/或增粘剂选自由以下组成的组：阿拉伯树胶、琼脂、藻酸、单硬脂酸铝、膨润土、纯化膨润土、乳浆膨润土(magma bentonite)、卡波姆、卡波姆934p、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠12、角叉菜胶、微晶和羧甲基纤维素钠纤维素、糊精、明胶、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸镁铝、甲基纤维素、果胶、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、聚维酮、藻酸丙二醇酯、二氧化硅、胶体二氧化硅、藻酸钠、黄蓍胶、Veegum和黄原胶。
通常，油选自由以下组成的组：花生油、矿物油、橄榄油、芝麻油、棉籽油、红花油、玉米油和大豆油。
通常，渗透促进剂选自由以下组成的组：单羟基或多羟基醇、一元或多元醇、饱和或不饱和脂肪醇、饱和或不饱和脂肪酯、饱和或不饱和二羧酸、精油、磷脂酰衍生物、脑磷脂、萜、酰胺、醚、酮和脲。
通常，聚合物选自由以下组成的组：乙酸纤维素、烷基纤维素、羟烷基纤维素、丙烯酸类聚合物和共聚物、聚酯、聚碳酸酯和聚酐。
通常，硬化剂选自由以下组成的组：氢化蓖麻油、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、鲸蜡酯蜡、硬脂、石蜡、聚乙烯赋形剂、硬脂醇、乳化蜡、白蜡和黄蜡。
通常，蛋白质选自由以下组成的组：牛血清白蛋白、人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶和酪蛋白。
通常，碳水化合物选自由以下组成的组：果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖、棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉、甘露醇、麦芽醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇和肌醇。
通常，填充剂选自由多肽和氨基酸组成的组。
所述组合物还可以包含用于皮肤的局部舒缓剂、局部抗炎剂、局部抗细菌剂、局部抗真菌剂、局部类固醇和局部抗氧化剂。
用于皮肤的局部舒缓剂通常包括洋甘菊和芦荟；其他局部舒缓剂是本领域已知的并且可以使用。
局部抗炎剂通常包括双氯芬酸、酮洛芬、布洛芬、吡罗昔康和吲哚美辛；其他局部抗炎剂是本领域已知的并且可以使用。
局部抗细菌剂通常包括杆菌肽、多粘菌素B、红霉素、磺胺乙酰钠、磺胺嘧啶银、瑞他莫林(retapamulin)、莫匹罗星(mupirocin)、新霉素和普莫卡因(pramoxine)；其他局部抗细菌剂是本领域已知的并且可以使用。
局部抗真菌剂通常包括苯甲酸、水杨酸、十一碳烯酸、酮康唑、制霉菌素、萘替芬、托萘酯、咪康唑、益康唑、环吡酮、奥昔康唑(oxiconazole)、舍他康唑(sertaconazole)、艾氟康唑(efinaconazole)、特比萘芬(terbinafine)、他伐硼罗(tavaborole)、克霉唑(clotrimazole)、硫康唑(sulconazole)和布替萘芬(butenafine)；其他局部抗真菌剂是本领域已知的并且可以使用。
局部类固醇通常包括氢化可的松、曲安西龙、氟轻松、泼尼卡酯(prednicarbate)、地奈德(desonide)、倍他米松、哈西奈德(halcinonide)、二氟拉松(diflorasone)、氟轻松、氯倍他索、脱氧米松(desoxymetasone)、莫米松、氯可托龙(clocortolone)、氟替卡松(fluticasone)、醋酸氟轻松(fluocinonide)、氟氢缩松(flurandrenolide)、阿氯米松(alclometasone)和卤倍他索(halobetasol)；其他局部类固醇是本领域已知的并且可以使用。
局部抗氧化剂通常包括维生素C、维生素E和L-硒代甲硫氨酸；其他局部抗氧化剂是本领域已知的并且可以使用。
可以包括其他活性剂。
在一个替代方案中，许多这些另外的药剂，诸如局部抗炎剂、局部抗细菌剂、局部抗真菌剂、局部类固醇和局部抗氧化剂，可以分开施用，诸如在包含一种或多种如上所述的赋形剂的一种或多种另外的药物组合物中。
在包括使用如上所述的前药的一些替代方案中，在根据本发明的方法和组合物中使用的治疗活性化合物(包括但不限于大麻素和萜类)是通过将一种或多种缀合配偶体共价交联到治疗活性化合物上而形成的。用于交联官能团的许多组合的合适试剂是本领域已知的。
例如，亲电基团可以与许多官能团反应，包括蛋白质或多肽中存在的那些。反应性氨基酸和亲电体的各种组合在本领域中是已知的并且可以使用。例如，含有巯基的N末端半胱氨酸可以与卤素或马来酰亚胺反应。已知巯基与很多偶联剂具有反应性，所述偶联剂诸如烷基卤化物、卤代乙酰基衍生物、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基衍生物、芳基化剂诸如芳基卤化物等。这些在G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”(Academic Press,SanDiego,1996),第146-150页中有描述。
半胱氨酸残基的反应性可以通过适当选择相邻的氨基酸残基进行优化。例如，与半胱氨酸残基相邻的组氨酸残基将增加半胱氨酸残基的反应性。反应性氨基酸和亲电试剂的其他组合是本领域中已知的。例如，马来酰亚胺可以与氨基反应，诸如赖氨酸侧链的ε-氨基，尤其是在较高的pH范围下。芳基卤化物也可以与此类氨基反应。卤代乙酰基衍生物可以与组氨酸的咪唑基侧链氮、甲硫氨酸侧链的硫醚基和赖氨酸侧链的ε-氨基反应。已知将与赖氨酸侧链的ε-氨基反应的许多其他亲电试剂，包括但不限于异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺酰氯、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、亚氨酯(imidoester)、碳二亚胺和酸酐。这些在G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”(Academic Press,San Diego,1996),第137-146页中有描述。
另外，已知将与羧酸根侧链(诸如天冬氨酸盐和谷氨酸盐的那些)反应的亲电试剂，诸如重氮烷和重氮乙酰基化合物、羰基二咪唑和碳二亚胺。这些在G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”(AcademicPress,San Diego,1996),第152-154页中有描述。此外，已知将与羟基(诸如丝氨酸和苏氨酸的侧链中的那些)反应的亲电试剂，包括反应性卤代烷衍生物。这些在G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”(Academic Press,SanDiego,1996),第154-158页中有描述。在另一个替代性实施方案中，亲电体和亲核体(即，与亲电体反应的分子)的相对位置是相反的，使得蛋白质具有带有与亲核体反应的亲电基团的氨基酸残基，并且靶向分子在其中包括亲核基团。这包括如上所述的醛(亲电体)与羟胺(亲核体)的反应，但比所述反应更具一般性；其他基团可以用作亲电体和亲核体。合适的基团在有机化学中是众所周知的，不需要进一步详细描述。
用于交联的反应性基团的另外的组合是本领域已知的。例如，氨基可以与异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸酯、烷化剂、酰亚胺酯、碳二亚胺和酸酐反应。巯基可以通过氧化和形成混合二硫化物的形式与卤代乙酰基或烷基卤化物衍生物、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基衍生物、酰化剂或其他巯基反应。羧基可以与重氮烷、重氮乙酰基化合物、羰基二咪唑、碳二亚胺反应。羟基可以与环氧化物、环氧乙烷、羰基二咪唑、N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯、高碘酸酯(用于氧化)、烷基卤素或异氰酸酯反应。醛和酮基团可以与肼、形成席夫(Schiff)碱的试剂，以及其他基团在还原胺化反应或曼尼希(Mannich)缩合反应中反应。适用于交联反应的其他反应是本领域已知的。此类交联剂和反应在G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”(Academic Press,San Diego,1996)中有所描述。
包括在单位剂量的根据本发明的药物组合物中的给定的治疗活性剂(诸如但不限于如上所述的大麻素或萜类)的量将取决于诸如特定的化合物、疾病病状和其严重程度、需要治疗的受试者的体征(identity)(例如体重)之类的因素而变化，但是虽然如此仍可由本领域技术人员依惯例确定。选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括特定治疗剂的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄速率、病状的严重程度、影响受试者的其他健康方面的考虑，以及受试者的肝和肾功能的状态。
它还取决于治疗的持续时间，与所采用的特定治疗剂组合使用的其他药物、化合物和/或材料，以及所治疗受试者的年龄、体重、状况、一般健康状况以及既往病史和类似因素。用于确定最佳剂量的方法在本领域中有所描述，例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,Mack Publishing Co.,第20版,2000。鉴于药剂的实验数据，本领域技术人员可以使用常规的剂量确定测试来确定一组给定条件的最佳剂量。
本发明的组合物或根据本发明使用的组合物可使用通常已知用于制备药物组合物的技术制造，例如，通过常规技术，诸如混合、溶解、制粒、制糖衣丸、浮起、乳化、包囊化、包埋或冻干。可使用一种或多种生理学上可接受的载剂以常规方式配制药物组合物，所述载剂可选自有助于将活性化合物加工成制剂的赋形剂和助剂。
通常在多个场合将根据本发明的药物组合物施用给受试者。单个剂量之间的间隔可为每周、每月或每年。如治疗反应或本领域众所周知的其他参数所指示的，间隔也可以是不规则的。可替代地，药物组合物可以作为缓释制剂施用，在这种情况下需要较低频率的施用。剂量和频率根据包含在药物组合物中的药理学活性剂在受试者中的半衰期而变化。施用剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。
在预防性应用中，在长时间段内在相对不频繁的间隔下施用相对低的剂量。一些受试者在其余生可继续接受治疗。在治疗性的应用中，有时需要在相对短的时间间隔下施用相对高的剂量，直到疾病的进展减弱或终止，并且优选地直到受试者显示疾病症状的部分或完全改善。然后，可以向受试者施用预防性方案。
公开了使用各种药理学活性剂和药物组合物治疗多种疾病和病状(包括癌症)的方法，以及确定此类药理学活性剂和药物组合物的治疗效果的方法的授予Nardella的美国专利号6,573,292、授予Nardella的美国专利号6,921,722、授予Chao等的美国专利号7,314,886和Chao等的美国专利号7,446,122全部以引用方式并入本文。
参考文献
以下出版物以引用的方式并入本文。这些出版物在本文通过以下提供的编号引用。在此出版物列表中包括任何出版物均不应被视为承认本文引用的任何出版物为现有技术。
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·Science2002,298(5599),1790-3.
实施例
实施例1：在大肠杆菌中工程化MEP途径
MEP途径因其热力学有利性和合适的细菌宿主系统的可用性而被选择。MEP途径是宿主大肠杆菌固有的。在此实验中，选择大肠杆菌BL21(DE3)作为表达宿主。将MEP途径中编码限速酶的基因过表达，以使大麻素前体的产生最大化。
MEP途径中的四个步骤最慢并且流量低。已有报道，催化这些限速步骤的酶的过表达改善通过MEP途径的流量并增加下游萜类生物合成。为了使大麻素(图1)、番茄红素、单萜或异戊二烯途径的前体异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的产生最大化，因此将非甲羟戊酸途径工程化，以引入4种不同的限速基因dxs、ispD、ispF和idi的额外拷贝(图：2)。
此过程通过聚合酶链式反应(PCR)逐步进行，并通过限制性消化和连接克隆到具有T7启动子和p15A复制起点的载体主链上，以构建具有正确取向的基因盒。然后将整个基因盒亚克隆到具有Trc启动子和pBR322复制起点的pTrc-trGPPS(CO)-LS质粒中(图3)，以获得广阔的窗口来控制基因表达并因此控制类异戊二烯前体的产生。然后将基因盒连同pTrc启动子和选择标记基因一起作为可诱导的额外拷贝整合到大肠杆菌染色体中，以提供类异戊二烯前体的过量产生。MEP途径表达盒的示意性图谱在图3中示出。通过SDSPage分析确认限速酶的过表达(图4)。
类似地，从例如植物来源克隆GPP合酶，并在大肠杆菌中表达以产生GPP，所述GPP为大麻素合酶CBGA合酶的底物和单萜合酶诸如蒈烯、月桂烯或柠檬烯合酶的底物。此外，在大肠杆菌中克隆并表达用于合成橄榄醇酸(CBGA合酶的底物)的聚酮化合物途径，或外源性地提供橄榄醇酸。因此，在原核生物宿主细胞中再现了产生CBGA的途径。
实施例2：下游途径大麻素合酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达
简介：
大麻萜酚酸(CBGA)是用于合成其他大麻素的母体化合物。CBGA是由CBGA合酶(来自芳族异戊二烯转移酶家族的酶)催化的橄榄醇酸(OA)和香叶基焦磷酸(GPP)的酶促反应产生的。此异戊二烯化产物(CBGA)的环化进一步产生由三种不同的氧化环化酶催化的三种不同的大麻素产物。Δ9-四氢大麻酚酸(THCA)合酶、大麻二酚酸(CBDA)合酶和大麻色烯酸(CBCA)合酶分别催化Δ9-四氢大麻酚酸(THCA)、大麻二酚酸(CBDA)和大麻色烯酸((CBCA)的形成。这些大麻素产物在微生物宿主(大肠杆菌)中的生物合成涉及THCA合酶、CBGA合酶、CBCA合酶、CBDA合酶以及其组合的克隆、表达和活性确定。通常，大麻素产物在表达任选地与THCA合酶、CBCA合酶和CBDA合酶中的一种或多种组合的至少CBGA合酶的微生物宿主中产生。
CBGA合酶
将针对大肠杆菌进行了密码子优化的来自普通大麻的CBGA合酶基因成功克隆到与强IPTG诱导型T5启动子可操作地连接的质粒载体中。该质粒含有高拷贝pUC复制起点，并且对卡那霉素具有抗性。CBGA合酶的质粒构建在图5中示出。CBGA合酶在大肠杆菌中的表达通过SDSPAGE分析确认(图6)。确认CBGAS的表达之后，通过将底物(OA和GPP)外源性地添加到酶溶液中来确定酶的活性，并使用内部开发的HPLC方法进行产物分布分析(productprofiling)。通过向OA和GPP的混合物中添加澄清的细胞裂解物在37℃下进行异戊二烯化反应，并使用乙酸乙酯萃取反应混合物，并在HPLC上跑样以测量产物形成。(图7)结果表明，CBGAS可以在大肠杆菌中表达，并且能够催化底物OA和GPP到CBGA的异戊二烯化反应。
在另一个实验中，在体内测试CBGA活性。在此实验中，对含有CBGAS表达质粒的宿主细胞进行培养，并在达到对数期生长(OD600＝0.6)时通过添加IPTG进行诱导。在诱导阶段期间用GPP和OA喂饲细胞，并使其生长过夜。然后将细胞悬浮液离心，并且接着将上清液注入HPLC中以确认CBGA形成。图8示出用于检测在大肠杆菌中产生的CBGA的HPLC色谱图(使用低拷贝质粒pBAD33)。从5mL培养物中粗略计算出所产生的CBGA的浓度为1.2μg/ml。
THCA合酶(THCAS)
另外将THCA合酶基因克隆到受强IPTG诱导型T5启动子控制的高拷贝的卡那霉素抗性质粒中。通过PCR和基因测序确认基因插入。THCA合酶基因的所得表达盒的示意图在图9中示出。通过IPTG诱导进行THCA合酶的表达，并且通过SDS page分析细胞裂解物以确认表达。然而，THCA合酶未成功表达到大肠杆菌中。
THCA合酶基因编码黄素酰化的氧化酶类蛋白，所述蛋白具有八个糖基化位点和N末端的28个氨基酸的信号肽。大肠杆菌产生糖基化跨膜蛋白的这些限制使得其难以表达THCA合酶类蛋白质的活性形式。为克服这一限制，已设计了多因素策略来表达没有信号肽的该基因，以确保蛋白质表达在胞质溶胶中发生，与模块伴侣共表达该基因以帮助蛋白质折叠并增加活性蛋白质的产生(例如，图10)，并与糖基化机器共表达以帮助蛋白质折叠(例如，图11)。CBDA合酶(CBDAS)也属于同一类蛋白质家族，因此同样的策略也将应用于表达CBDA合酶。类似地，CBCA合酶(CBCAS)是具有天然信号序列的糖基化蛋白，因此同样的策略也将应用于表达CBCA合酶。研究的这一部分正在进行中，并且关于THCAS考虑了以下方法，并且本领域技术人员将认识到，这些方法也可以应用于CBDAS和CBCAS。
截短的THCAS
通过从编码的N末端除去28个氨基酸(从基因序列的5’末端起84bp)将THCAS截短。
与伴侣质粒共表达
将THCA合酶基因克隆到具有氨苄青霉素抗性、pBR322复制起点、受pTRC启动子控制的质粒上，以确保其具有不同且相容的复制起点，以用于与具有伴侣系统和糖基化系统的质粒共表达(图11)。将具有和不具有信号肽的THCAS与在大肠杆菌中的蛋白质折叠中起不同但协同作用的大肠杆菌中的两种主要伴侣途径组分DnaK-DnaJ-GrpE和GroEl-GroES共表达。尽管大肠杆菌具有其天然伴侣系统，但重组蛋白的高水平产生可能使内源性伴侣系统饱和，并可能导致非生产性聚集(unproductive aggregation)。在这些条件下，限制折叠的分子伴侣的细胞内浓度的增加可以减少包含体的形成。日本的Takahashi Yura集团已经构建了处于不同启动子下，具有两个伴侣途径的基于pACYC184的质粒。该质粒(pG-KJE8)或其衍生物用于鉴定在宿主细胞中产生活性THCA合酶的条件。
与糖基化系统共表达
可能需要糖基化来增加THCA合酶在大肠杆菌中的表达、折叠、加工、溶解度和/或活性。不幸的是，大肠杆菌不具有天然的蛋白质糖基化系统。已在大肠杆菌中成功表达了来自空肠弯曲杆菌的N糖基化系统，称为pgl系统。提供了具有空肠弯曲杆菌pgl系统基因的质粒。该质粒或其衍生物用于鉴定在宿主细胞中产生活性THCA合酶的条件(图11)。
实施例3：大麻素途径基因表达的优化
为了优化CBGA在大肠杆菌中的内源性产生，将CBGA合酶与MEP途径、GPP合酶和或聚酮化合物途径组分同时共表达，以提供产生CBGA所需的底物GPP和OA。
共表达候选物包括：
·与MEP途径共表达以产生IPP和DMAPP
·与GPP合酶共表达，以由IPP和DMAPP内源性地提供GPP
·与聚酮化合物途径共表达以内源性地提供橄榄醇酸(OA)。
为了在大肠杆菌中共表达两种不同的质粒，使用具有低或中等拷贝数的质粒减少对细胞生长的有害影响，使用相容的复制起点以确保两种或更多种质粒的维持，并且使用独立的抗生素选择以用于严格选择质粒中的每一种。因此，将CBGA合酶基因克隆到低拷贝质粒pBAD33中。低拷贝CBGA合酶表达质粒的示意图在(图12)中示出。通过限制性消化和测序验证克隆的CBGAS基因。为了将CBGAS与MEP途径和GPP合酶共表达，将GPP合酶克隆到pBAD33中CBGAS的上游，然后与pTRC_RDE一起共转化(图13)。共转化后，使细胞在抗生素选择的情况下生长，并在OD600达到0.6时进行诱导。诱导剂浓度的量在图14中列出。
添加诱导剂之后，使细胞生长过夜。测量OD600以检查蛋白质产生后的细胞活力。不同培养物的OD600的比较在图15中示出。以10、15和20mM的浓度通过阿拉伯糖诱导具有pBAD33_GPPS_CBGAS的菌株。用阿拉伯糖和IPTG的不同浓度组合诱导具有pBAD33_GPPS_CBGAS和pTRC_RDE的菌株。细胞裂解后提取蛋白质，并使用Bradford方法测量蛋白质的浓度。通过SDSPAGE检查蛋白质的诱导和表达(图16)。对总提取蛋白质浓度作图(图17)以与SDSPAGE上的表达数据相比较。发现总蛋白质浓度随着诱导剂浓度的增加而增加，并且与细胞集群和生长负相关。
Lee等已经发现IPTG干扰阿拉伯糖的诱导。因此，用阿拉伯糖和IPTG浓度的不同组合检查CBGAS的表达。当用10mM阿拉伯糖和0.5mM IPTG诱导细胞时，发现总蛋白质浓度更高。维持多个质粒增加细胞上由DNA、RNA和蛋白质合成造成的代谢负担，以及细胞必须产生的抗生素抗性蛋白的总数，并导致期望的最终产物的产生降低。另外，维持不同诱导剂之间的平衡也将使得最终产物的产生水平不可再现。为了克服这一局限，将整个基因盒构建在具有在一起的MEP途径和GPPS和CBGAS操纵子的单个质粒上。另外地或可替代地，MEP途径、GPPS和/或CBGAS被整合到宿主细胞基因组中。
实施例4：MEP途径上的双功能ispDF基因的宏基因组学筛选和克隆
对来自土壤细菌的环境宏基因组进行筛选，以鉴定可替代的MEP途径基因。鉴定出非甲羟戊酸途径中比对应的大肠杆菌直系同源物活性高得多的新颖双功能酶。新的双功能酶将IspD和IspF的活性位点共定位到单个多肽支架上。针对番茄红素产生对双功能基因的活性进行评估，以作为大麻素合成的替代品。该基因称为ispDF并克隆到pTrc-RDE操纵子中，使用相同的强RBS，用ispDF替换ispD和ispF。将此工程化质粒命名为pTrc-RDE*，并转化于大肠杆菌(DE3)中。共定位ispD和ispF的活性位点的另外两种宏基因组学双功能酶分别称为ispDF2和ispDF3。
蛋白质表达研究
通过用IPTG诱导测试了携带质粒pTrc-RDE和pTrc-RDE*的菌株的蛋白质表达。使细胞在LB液体培养基中于37℃下生长达到0.6的OD600，通过向培养基中添加IPTG进行诱导，然后将培养物在30℃下孵育过夜。将从培养物中收获的细胞裂解并提取总蛋白。使用Bradford方法估算总蛋白的浓度，并在SDS-PAGE凝胶上跑样。凝胶用考马斯亮蓝G-250染料染色以进行可视化。表达后的pTrc-RDE和pTrc-RDE*质粒均在SDS-PAGE上显示出与途径酶相对应的条带。通过诱导的细胞裂解物的SDS-PAGE分析显示出ispDF表达(图18)。
建模ispDF：来自空肠弯曲杆菌的双功能ispDF被报道为CJ-ispDF。使用SwissModel，利用CJ-ispDF对我们的研究中报道的IspDF(ispDF1)进行建模。它具有约31％的序列相似性。它与CJ-ispDF以及天然ispD和ispF的比对显示出相异的氨基酸(图19)。这表明ispDF是新颖的且尚未有报道。关于活性位点共定位的更多分析正在进行中。
平台菌株的功能分析：
用含有用于将C5类异戊二烯前体转化为番茄红素的下游基因的质粒转化工程化的大肠杆菌菌株。番茄红素生物合成基因是在组成型启动子的控制下克隆的。表达番茄红素的质粒是低拷贝的并且具有复制起点相容性以用于共表达。
据报道，ispD、ispF和ispE酶形成多组分复合物，以通过三个连续的催化步骤引导(channel)代谢物。为了进一步研究这一点，我们在两个操纵子中克隆了从基因组扩增的天然ispE基因。分别将pTrc-RDE和pTrc-RDE*的变异质粒命名为pTrc-RDEE和pTrc-RDE*E(图20)。如下所述，还针对番茄红素产生对这些变体进行功能测试。
实施例5：通过MEP途径的一种或多种组分的异源表达增加萜类生物合成
产生不同的构建体，针对其支持萜类生物合成增加的能力进行测试(图21)。
异戊二烯合成
提供以下大肠杆菌菌株：亲本对照菌株(BL21)；对照菌株SA01，其含有与阿拉伯糖启动子可操作地连接的编码异戊二烯合酶(ispS)的表达盒；菌株SA02，其含有SA01中的表达盒和与Trc启动子可操作地连接的编码dxs、ispD、ispF和idi的RDE表达盒；以及菌株SA03，其含有SA01中的表达盒和与Trc启动子可操作地连接的编码dxs、ispDF1和idi的RDE*表达盒(图22，左侧)。在SA03中，名称ispDF1-表示未针对在异源宿主细胞中增加表达而对编码ispDF1的核酸进行密码子优化，而ispDF+(图22中未示出)表示对编码所述酶的核酸进行了密码子优化。培养物在密封的玻璃培养管中于30℃、230rpm下生长。达到OD 600 0.6后诱导培养物并且再孵育20h。使用0.05mM IPTG和10mM阿拉伯糖作为诱导剂。通过GC-MS分析培养物顶部空间。注入前将样品加热至70℃。使用校准曲线对异戊二烯进行定量。图22右侧示出本文所述菌株的异戊二烯产生。
番茄红素合成
获得质粒pAC-LYC(Addgene质粒#53270)。该质粒含有表达盒，所述表达盒具有与番茄红素合成基因crtE、crtI和crtB可操作地连接的组成型启动子。参见，Cunningham FXJr等,Plant Cell.1994Aug；6(8):1107-21。提供以下大肠杆菌菌株：亲本对照菌株(BL21(DE3))；菌株RDE，其含有质粒pAC-LYC和含有上述RDE表达盒的质粒；菌株RDE*(DF1-)，其含有质粒pAC-LYC和含有上述RDE*表达盒的质粒；菌株RDE*(DF1+)，其含有质粒pAC-LYC和含有具有编码密码子优化的ispDF1的核酸的RDE*表达盒的质粒；菌株RDE*(DF2+)，其含有质粒pAC-LYC和含有具有编码密码子优化的ispDF2的核酸的RDE*表达盒的质粒；以及菌株RDE*(DF3+)，其含有质粒pAC-LYC和含有具有编码密码子优化的ispDF3的核酸的RDE*表达盒的质粒。产生的另外的菌株包括含有pAC-LYC的SA01；含有pAC-LYC和pTrc-RDE的SA02；含有pAC-LYC和pTrc-RDEE的SA03；含有pAC-LYC和pTrc-RDE*的SA04；以及含有pAC-LYC和pTrc-RDE*E的SA05。ispDF1、ispDF2和ispDF3的序列在图26中示出。
对于番茄红素产生，使SA01-SA05的种子培养物在30℃的LB培养基中生长过夜。然后用新鲜培养基将这些培养物稀释至0.2的光密度，并用IPTG诱导。将生产培养物在250rpm的黑暗振荡下在30℃下孵育20h。番茄红素提取通过用2mL丙酮提取4mL培养物来进行。在HPLC上分析丙酮提取物。HPLC方法：柱–C18，流动相–甲醇:四氢呋喃:水(66:30:4)，流速–1mL/min，使用光电二极管阵列检测器在472nm波长处检测，并用内部番茄红素标准品确认番茄红素峰。图23示出IPTG诱导增加番茄红素的产生。不同菌株的最佳诱导水平不同。
在第二实验中，使培养物在LB中于30℃下生长过夜。然后用LB将这些培养物稀释至0.2的OD600。将所述培养物用IPTG诱导并使其在30℃下生长24h。将2mL培养物以8000rpm离心5min以产生细胞沉淀物。来自细胞沉淀物的番茄红素在55℃下用1mL丙酮提取15min。然后将混合物以14000rpm离心。在C-18柱上，通过HPLC，使用等度洗脱方法，利用甲醇、四氢呋喃和水(66:30:4)的混合物以1mL/min的流速分析所得的上清液。番茄红素收率作为番茄红素峰的HPLC曲线下面积进行测量。用内部标准品验证峰。相对于使用0μM IPTG的RDE菌株对面积进行归一化。结果在图24中示出。
单萜合成
图25顶部示出用于在宿主细胞中产生单萜的构建体。所述构建体包括与T7启动子可操作地连接的编码dxs、密码子优化的ispDF1(DF1+)和idi的MEP途径平台操纵子；以及与Trc启动子可操作地连接的编码GPP合酶和单萜合酶的单萜操纵子。在此实验中，单萜合酶是蒈烯合酶。
使培养物在LB+0.5％酵母提取物中于30°℃下生长过夜。然后将这些培养物用补充有2mM氯化镁的培养基稀释至0.2的OD600，在37°℃下孵育，然后在0.8的OD600下用IPTG诱导。用10％十二烷覆盖培养物。使用标准曲线在GC-MS上分析单萜浓度。结果在图25底部示出。还分别使用柠檬烯合酶和月桂烯合酶实现了单萜柠檬烯和月桂烯的成功产生。IspDF2+；ispDF3+；以及dxs、ispD、ispF和idi也能够支持单萜产生的增加。
示例性序列
本申请中提及的示例性序列包括但不限于下表列出的那些：
Figure BDA0002475767790000571
Figure BDA0002475767790000581
一些基因来自GenBank数据库，而其他基因则来自大麻基因组浏览器(genome.ccbr.utoronto.ca/cgi-bin/hgGateway)。IM00001.1是序列ID，指的是由大麻mRNA和EST的公共序列生成的去饱和酶。
示例性序列提供如下。
>AB057805.1|四氢大麻酚酸合酶(THCAS)的普通大麻mRNA，完整cds
Figure BDA0002475767790000591
>AB292682.1|大麻二酚酸合酶(CBDAS)的普通大麻CBDAS mRNA，具有转运肽
Figure BDA0002475767790000592
>IM00002.1|大麻二酚酸合酶II(CBDASII)的普通大麻CBDAS mRNA，无转运肽
Figure BDA0002475767790000601
>PK28436.1|芳族异戊二烯转移酶(PT)或香叶基焦磷酸二羟基戊基苯甲酸香叶基转移酶
Figure BDA0002475767790000602
>JN679224.1|普通大麻橄榄醇酸环化酶(OAC)mRNA，完整cds
Figure BDA0002475767790000611
>AB164375.1|二羟基戊苯合酶(OLS)的普通大麻OLSmRNA，完整cds
Figure BDA0002475767790000612
>JN717233.1|PK04797.1|酰基活化酶1(AAE1)
Figure BDA0002475767790000613
Figure BDA0002475767790000621
>JN717235.1|PK13710.1|酰基活化酶3(AAE3)
Figure BDA0002475767790000622
>PK04410.1|氢过氧化物裂解酶(HPL)
Figure BDA0002475767790000631
>PK08276.1|脂氧合酶(LOX1)
Figure BDA0002475767790000641
>IM00001.1|去饱和酶(DS)编码序列
Figure BDA0002475767790000642
Figure BDA0002475767790000651
>PK10442.1|香叶基焦磷酸(GPP)合酶大亚基|GPP合酶大亚基
Figure BDA0002475767790000652
>PK15935.1|香叶基焦磷酸(GPP)合酶小亚基|GPP合酶小亚基
Figure BDA0002475767790000653
>PK17903.1|香叶基焦磷酸(IPP)异构酶
Figure BDA0002475767790000661
>PK16122.1|1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶1(DXS1)
Figure BDA0002475767790000662
>PK26473.1|1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶2(DXS2)
Figure BDA0002475767790000671
>PK04218.1|1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶(XDR)
Figure BDA0002475767790000672
>PK03569.1|4-二磷酸胞苷-甲基赤藓醇2-磷酸合酶(MCT)
Figure BDA0002475767790000681
>PK19074.1|4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK)
Figure BDA0002475767790000682
>PK25433.1|2-C-甲基-D-赤藓醇2:4-环二磷酸合酶(MDS)
Figure BDA0002475767790000683
>PK23068.1|4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶(HDS)
Figure BDA0002475767790000691
>PK13726.1|4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(HDR)
Figure BDA0002475767790000701
>AAO73863|蒈烯合酶MonoTS
Figure BDA0002475767790000702
>EFF142281-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶Dxs[大肠杆菌B354]
Figure BDA0002475767790000703
>WP_0729720992-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶IspD/MCT
Figure BDA0002475767790000711
>WP_0865894822-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶IspF/MDS
Figure BDA0002475767790000712
>WP_115903881异戊烯基-二磷酸△-异构酶Idi
Figure BDA0002475767790000713
>AF513112.1香叶基二磷酸合酶GPPS
Figure BDA0002475767790000714
>WP_053287215香叶基转移酶IspA
Figure BDA0002475767790000715
>NP_4147151-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶IspC/DXR
Figure BDA0002475767790000716
>EGT677814-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓醇激酶IspE/CMK
Figure BDA0002475767790000721
>ANK028124-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶IspG/HDS
Figure BDA0002475767790000722
>AAL386554-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶IspH/HDR
Figure BDA0002475767790000723
>AAA24819.1八氢番茄红素合酶CrtE
Figure BDA0002475767790000724
>AAA24820.1八氢番茄红素脱氢酶CrtI
Figure BDA0002475767790000725
>AAA24821.1前植物烯焦磷酸合酶[成团泛菌(Pantoea agglomerans)]CrtB
Figure BDA0002475767790000731
>sp|Q50L36.1|ISPS_POPAL RecName：Full＝异戊二烯合酶，叶绿体；Short＝PaIspS；IspS。
Figure BDA0002475767790000732
***
本文说明性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下进行合适的实践。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被扩展地且无限制地理解。另外，本文所采用的术语和表述已用作描述性术语而非限制性术语，并且没有意图使用此类术语和表述来排除所示或所述的特征的任何等同物或其任何部分，并且认识到在所要求的本发明的范围内的各种修改是可能的。
因此，应理解，尽管本发明已由优选实施方案和任选特征来具体公开，但是本领域技术人员可采用本文所公开的本发明的修改和变型，并且此类修改和变型被认为处于本文公开的本发明的范围内。本发明已在本文中进行了广泛性和一般性的描述。落在一般性公开范围内的每个较狭义的物种和亚属群也形成这些发明的部分。这包括具有附带条件或否定限制的每个发明的一般性描述，以从类属中去除任何主题而不管删除的材料在其中是否进行了具体叙述。
此外，在根据Markush组描述了本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到本发明还因此根据Markush组的任何个别成员或成员亚组进行了描述。还应理解，以上描述意图是说明性的而非限制性的。通过查看以上描述，许多实施方案对于本领域技术人员而言将为显而易见的。因此不应参照以上描述来确定本发明的范围，而应参照所附权利要求连同所述权利要求赋予的等效物的全部范围来确定。所有文章和参考文献的公开内容，包括专利公布和数据库(例如，Genbank)登录号所引用的内容，均通过引用并入本文。

Claims (50)

1.一种表达盒，其包含与编码双功能ispDF酶的核酸可操作地连接的异源启动子。
2.如权利要求1所述的表达盒，其中所述双功能ispDF酶与以下的ispDF酶相差至少一个氨基酸：幽门螺杆菌HP1020、幽门螺杆菌J99jhp0404、幽门螺杆菌HPAG1 HPAG1_0427、肝螺杆菌HH1582、猎豹螺杆菌Sheeba菌株Hac_1124、产琥珀酸沃廉菌DSM 1740WS1940、反硝化希瓦氏菌DSM 1251Suden_1487、空肠弯曲杆菌空肠亚种NCTC 11168Cj1607、空肠弯曲杆菌RM1221 CJE1779、空肠弯曲杆菌空肠亚种81-176CJJ81176_1594和胎儿弯曲杆菌胎儿亚种82-40CFF8240_0409。
3.如权利要求1所述的表达盒，其中与编码所述双功能ispDF酶的所述核酸可操作地连接的所述启动子是组成型启动子。
4.如权利要求1所述的表达盒，其中与编码所述双功能ispDF酶的所述核酸可操作地连接的所述启动子是诱导型启动子。
5.如权利要求1所述的表达盒，其中所述双功能ispDF酶包含与SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2或SEQ ID No.3的300个连续氨基酸具有至少50％或55％同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的表达盒，其中编码所述双功能ispDF酶的所述核酸是密码子优化的。
7.如权利要求1所述的表达盒，其中所述表达盒还包含编码一种或多种、两种或更多种或所有选自由dxs、idi和ispE组成的组的酶的核酸。
8.如权利要求1所述的表达盒，其中所述表达盒还包含编码dxs和idi的核酸。
9.如权利要求1所述的表达盒，其中所述表达盒还包含编码dxs、idi和ispE的核酸。
10.如权利要求1所述的表达盒，其中所述双功能ispDF与CJ-ispDF具有不超过31％的相似性。
11.一种质粒，其包含如权利要求1-10中任一项所述的表达集。
12.如权利要求11所述的质粒，其中所述质粒还包含含有编码异戊二烯合酶(ispS)的核酸的表达盒。
13.如权利要求11所述的质粒，其中所述质粒还包含含有编码GPP合酶的核酸的表达盒。
14.如权利要求11所述的质粒，其中所述GPP合酶是来源于真核生物的GPP合酶。
15.如权利要求14所述的质粒，其中所述GPP合酶是植物来源的GPP合酶。
16.如权利要求14所述的质粒，其中编码所述GPP合酶的所述核酸是密码子优化的。
17.如权利要求13所述的质粒，其中包含编码GPP合酶的所述核酸的所述表达盒还包含编码番茄红素合成途径的一种或多种组分(例如，crtE、crtI和/或crtB)或单萜合酶的核酸。
18.如权利要求13所述的质粒，其中包含编码GPP合酶的所述核酸的所述表达盒还包含编码蒈烯合酶、月桂烯合酶或柠檬烯合酶的核酸。
19.如权利要求13所述的质粒，其中包含编码GPP合酶的所述核酸的所述表达盒还包含编码大麻素合酶的核酸。
20.如权利要求19所述的质粒，其中所述大麻素合酶选自由大麻CBGA合酶、THCA合酶、CBDA合酶和CBCA合酶组成的组。
21.一种宿主细胞，其包含如权利要求1-10所述的表达盒中的任一种和/或如权利要求11-20所述的质粒中的任一种。
22.一种宿主细胞，其包含：
a.表达盒，其包含与编码双功能ispDF酶的核酸可操作地连接的异源启动子；以及
b.表达盒，其包含与编码萜类合酶的核酸可操作地连接的异源启动子。
23.如权利要求22所述的宿主细胞，其中所述萜类合酶是异戊二烯合酶。
24.如权利要求22所述的宿主细胞，其中所述萜类合酶是番茄红素合成途径的组分。
25.如权利要求22所述的宿主细胞，其中所述萜类合酶是大麻素合酶。
26.如权利要求25所述的宿主细胞，其中所述大麻素合酶选自由以下组成的组：CBGA合酶、THCA合酶、CBDA合酶和CBCA合酶，优选大麻属的合酶。
27.如权利要求26所述的宿主细胞，其中所述大麻素合酶是选自由THCA合酶、CBDA合酶和CBCA合酶组成的组的截短的大麻素合酶，其中所述截短是全部或部分信号肽的缺失。
28.如权利要求22所述的宿主细胞，其包含含有与编码GPP合酶的核酸可操作地连接的异源启动子的表达盒。
29.如权利要求22所述的宿主细胞，其中a)或b)的所述表达盒还包含编码GPP合酶的核酸。
30.如权利要求22所述的宿主细胞，其中与不包含所述一个或多个表达盒中的至少一个的对照细胞相比，所述宿主细胞表现出更高的通过MEP途径的流量。
31.如权利要求22所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞不包含：编码ispC、ispE、ispG或ispH的异源核酸；其组合；或其全部。
32.如权利要求22-31中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞是原核细胞。
33.如权利要求22-32中任一项所述的宿主细胞，其中a)和/或b)的所述表达盒被整合到所述宿主细胞的基因组中。
34.如权利要求22-33中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含与启动子可操作地连接的编码大麻素合酶的核酸，并且与编码所述大麻素合酶的所述核酸可操作地连接的所述启动子是组成型启动子。
35.如权利要求22-33所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含与启动子可操作地连接的编码大麻素合酶的核酸，并且与编码所述大麻素合酶的所述核酸可操作地连接的所述启动子是诱导型启动子。
36.如权利要求22-35中任一项所述的宿主细胞，其中a)的所述表达盒和b)的所述表达盒存在于单个质粒中或在单个基因座处插入所述宿主细胞的基因组中。
37.如权利要求22-35中任一项所述的宿主细胞，其中a)的所述表达盒和b)的所述表达盒处于不同质粒中或在不同的基因座处插入所述宿主细胞的基因组中。
38.如权利要求22-37中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含橄榄醇酸(OA)。
39.如权利要求38所述的宿主细胞，其中所述橄榄醇酸对于所述宿主细胞是外源的。
40.如权利要求22-39中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含含有与编码一种或多种糖基化途径基因的核酸可操作地连接的异源启动子的表达盒。
41.如权利要求22-40中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞在1、2、3、4、5、6种或所有选自由ackA-pta、poxB、ldhA、dld、adhE、pps和atoDA组成的组的基因中包含缺失。
42.一种获得目标代谢产物的方法，所述方法包括在适于在一个或多个宿主细胞表达盒中诱导表达的条件下，在合适的培养基中培养根据权利要求22-41中任一项所述的宿主细胞，以及然后收获所培养的细胞或耗尽培养基，从而获得所述目标代谢产物。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述代谢产物是大麻素。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述大麻素是THCA、CBDA、CBCA、CBN、THC、CBD或CBC，或其中的一种或多种的混合物。
45.如权利要求42所述的方法，其中所述代谢产物是萜类或异戊二烯。
46.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述方法包括收获并裂解所述培养的细胞，从而产生细胞裂解物。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述方法包括从所述细胞裂解物中纯化所述目标代谢产物，从而产生纯化的目标代谢产物。
48.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述方法包括从所述耗尽培养基中纯化所述目标代谢产物，从而产生纯化的目标代谢产物。
49.如权利要求47或48所述的方法，其中所述纯化的目标代谢产物是大麻素，并且所述方法包括将所述大麻素配制在药物组合物中。
50.如权利要求47或48所述的方法，其中所述纯化的目标代谢产物是大麻素，并且所述方法包括形成所述纯化大麻素的盐、前药或溶剂化物。
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