JP2022523992A - 異種システムにおけるテルペノイドまたはカンナビノイドの生合成のための組成物及び方法 - Google Patents

異種システムにおけるテルペノイドまたはカンナビノイドの生合成のための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

宿主細胞においてカンナビノイド及び他の代謝産物を生産するための方法及び組成物を本明細書に提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年３月６日に出願された米国仮出願第６２／８１４，８２３号及び２０１９年３月６日に出願された米国仮出願第６２／８１４，８１６号に基づく優先権を主張するものであり、これらの各々の内容全体をありとあらゆる目的のために援用する。
カンナビノイド及びその誘導体は、治療的可能性を有するいくつかの特性を有している。カンナビノイドによるＣＢ－１及び／またはＣＢ－２受容体の活性化または遮断は、下流のシグナル伝達及び代謝経路を調節し得、続いて疼痛及び他の末梢での感覚シグナルの伝達、免疫応答、ならびに炎症を含めたシナプス伝達に影響を及ぼし得る。このため、治療目的のための天然または合成カンナビノイドの使用に関心が寄せられている。しかしながら、低い抽出収率及び高い分離コストが天然由来カンナビノイドの使用を非経済的なものにしている。同様に、カンナビノイドを完全に合成的に生産する方法はこれらの化合物の複雑さによって妨げられる。
当技術分野で知られているカンナビノイドの生産のための異種システムは、カンナビノイド合成酵素の産生及び分泌を真核性宿主生物に依存しており、その後にこの酵素は試験管内酵素触媒反応においてカンナビノイド生成物を生産するために使用される。例えば、米国特許第９，５８７，２１２号、第９，５１２，３９１号、第９，３９４，５１２号、第９，５２６，７１５号、第９，３５９，６２５号は各々、ＴＨＣＡ合成酵素またはＣＢＤＡ合成酵素を分泌する組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを使用してカンナビノイドを試験管内で作るための方法及び組成物及びバイオリアクターについて記載している。しかしながら、残念なことにこのシステムは、真核生物宿主の使用、及び分泌された酵素に適した基質を生成するための追加の手段を必要とする。
生体内でのカンナビノイド産生スキームに関して、Ｃａｒｖａｌｈｏ Å，ｅｔ ａｌ．ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．２０１７は、先のカンナビノイド経路での酵素の原核生物による産生が、この酵素の膜結合、グリコシル化及びジスルフィド結合形成の必要性ゆえに実現可能でないことを教示している。詳しくは、Ｃａｒｖａｌｈｏは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣＢＧＡＳの発現がどちらかといえば起こりそうにないこと、及び機能性ＴＨＣＡＳまたはＣＢＤＡＳを発現させるための原核生物宿主の使用が除外されることを開示している。
しかも、ＣＢＧＡの生産に必要とされる芳香族プレニル転移酵素ＣＢＧＡＳの基質、オリベトレートは、一般的な原核生物システムにおいて内因的に産生することがたとえあったとしても有用なレベルではない。そのため、オリベトレートを細胞の培養培地に、またはオリベトレートの異種産生のためのまた別の生合成経路の発現によって、外来的に供給せねばならない。しかしながら、オリベトレートの生合成的生産は、微生物による生産高を劇的に低下させかねない代謝負荷である。同様に、オリベトレートは周囲の培地からは細胞内に効率的に輸送されず、それゆえ、外来的に供給されたオリベトレートは下流代謝産物の産生において律速段階を呈する。芳香族プレニル転移酵素の他の基質、例えばジバリノール酸（ＤＶＡ）は、内因的産生、異種産生の代謝負荷、及び律速的膜輸送に関して同じ問題に直面する。このように、生体内でのカンナビノイドの生産のための費用対効果の高い異種システムを開発する必要性は長年感じられるが満たされていない。
本明細書では、（例えば原核生物）宿主細胞における改善された芳香族基質のプレニル化またはその下流代謝産物の生成のための、改良された方法、組成物及び宿主細胞について記載する。本発明者らは、宿主細胞において異種輸送体として発現したときに機能性であり、（例えば原核生物）宿主細胞内へのオリベトレートなどの細胞外芳香族プレニル転移酵素基質の輸送を増進することができる膜輸送体を同定した。例えば、本発明者らは、機能性であり（例えば原核生物）宿主細胞内へのオリベトレートなどの細胞外芳香族プレニル転移酵素基質の輸送を増進することができる主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）芳香族酸アンチポーターを同定した。独立して、本発明者らは、機能性であり（例えば原核生物）宿主細胞内へのオリベトレートなどの細胞外芳香族プレニル転移酵素基質の輸送を増進することができる外膜ポリン（ＯＭＰ）スーパーファミリー輸送体を同定した。理論に拘泥することは望まないが、本発明者らは、例えばアンチポーターまたはポリンを介した細胞内へのオリベトレートなどの芳香族プレニル転移酵素基質の輸送の増進が芳香族プレニル化段階の流束を増大させ、それによって下流代謝生成物の産生を改善すると仮定する。場合によっては、増大した流束は、ゲラニルピロホスフェート（ＧＰＰ）などの有害な中間体の（例えば定常状態の）細胞内濃度を減少させ、それによって下流代謝生成物の産生を改善する。
かくして、本発明は、ａ）輸送体をコードする異種核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット、及びｂ）当該輸送体の外来芳香族基質を含む、宿主細胞を提供する。実施形態において、宿主細胞は、ａ）の発現カセットがない対照原核生物宿主細胞と比較して宿主細胞内への輸送体の芳香族基質の移入を増進することができる。
例えば、一態様において本発明は、ａ）主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）芳香族酸アンチポーターをコードする異種核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット、及びｂ）ＭＦＳ芳香族酸アンチポーターの外来芳香族基質を含む、宿主細胞を提供する。実施形態において、宿主細胞は、ａ）の発現カセットがない対照原核生物宿主細胞と比較して宿主細胞内へのＭＦＳ芳香族酸アンチポーターの芳香族基質の移入を増進することができる。別の例を挙げると、一態様において本発明は、ａ）ＯＭＰスーパーファミリーポリンをコードする異種核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット、及びｂ）ＯＭＰスーパーファミリーポリンの外来芳香族基質を含む、宿主細胞を提供する。実施形態において、宿主細胞は、ａ）の発現カセットがない対照原核生物宿主細胞と比較して宿主細胞内へのＯＭＰスーパーファミリーポリンの芳香族基質の移入を増進することができる。
いくつかの実施形態では、輸送体の芳香族基質は、宿主細胞内に発現した異種芳香族プレニル転移酵素の基質である。例えば、輸送体の芳香族基質は、宿主細胞内に発現した異種芳香族プレニル転移酵素のプレニル受容体であり得る。いくつかの実施形態では、輸送体の芳香族基質は芳香族酸である。場合によっては、輸送体の芳香族基質はオリベトレート及び／またはジバリノール酸である。場合によっては、輸送体の芳香族基質は芳香族酸の脱炭酸誘導体である。場合によっては、輸送体の基質はオリベトールである。場合によっては、輸送体の基質はジバリノールである。場合によっては、輸送体の基質は、レスベラトロール、ナリンゲニンもしくはフロルイソバレロフェノン、またはそれらの組合せである。場合によっては、輸送体の基質は、アピゲニン、ダイゼイン、ゲニステイン、ナリンゲニン、オリベトール、ＯＡもしくはレスベラトロール、またはそれらの組合せである。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は原核生物である。場合によっては、原核生物宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐａｎｔｅｏａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属の原核生物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｐａｎｔｅｏａ ｃｉｔｒｅａ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、またはＬ．ｌａｃｔｉｓである。いくつかの実施形態では、細胞はＥ．ｃｏｌｉである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ａ）主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）芳香族酸アンチポーター（例えばｐｃａＫ）またはＯＭＰスーパーファミリーポリン、例えばＯｐｒＤファミリーポリン（例えばｐｐ３６５６）などの輸送体をコードする異種核酸に機能可能に連結された原核生物プロモーターを含む発現カセットを含む、原核生物宿主細胞である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は真核生物である。いくつかの実施形態では、真核生物は、真菌細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、真核生物は真菌細胞である。いくつかの実施形態では、真核生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ属、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属、Ａｅｄｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ属、Ｅｓｔｉｇｍｅｎｅ属、Ｂｏｍｂｙｘ属及びＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ属の真核生物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである。いくつかの実施形態では、細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ａ）主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）芳香族酸アンチポーターまたは外膜ポリン（ＯＭＰ）をコードする異種核酸に機能可能に連結された真核生物プロモーターを含む発現カセットを含む、真核生物宿主細胞である。
いくつかの実施形態では、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーターはｐｃａＫまたはその機能性断片である。いくつかの実施形態では、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーターは、配列番号６（ＭＮＱＡＱＴＮＶＧＫＳＬＤＶＱＳＦＩＮＱＱＰＬＳＲＹＱＷＲＶＶＬＬＣＦＬＩＶＦＬＤＧＬＤＴＡＡＭＧＦＩＡＰＡＬＳＱＥＷＧＩＤＲＡＳＬＧＰＶＭＳＡＡＬＩＧＭＶＦＧＡＬＧＳＧＰＬＡＤＲＦＧＲＫＧＶＬＶＧＡＶＬＶＦＧＧＦＳＬＡＳＡＹＡＴＮＶＤＱＬＬＶＬＲＦＬＴＧＬＧＬＧＡＧＭＰＮＡＴＴＬＬＳＥＹＴＰＥＲＬＫＳＬＬＶＴＳＭＦＣＧＦＮＬＧＭＡＧＧＧＦＩＳＡＫＭＩＰＡＹＧＷＨＳＬＬＶＩＧＧＶＬＰＬＬＬＡＬＶＬＭＩＷＬＰＥＳＡＲＦＬＶＶＲＮＲＧＴＤＫＶＲＫＴＬＳＰＩＡＰＱＶＶＡＥＡＧＳＦＳＶＰＥＱＫＡＶＡＡＲＮＶＦＡＶＩＦＳＧＴＹＧＬＧＴＶＬＬＷＬＴＹＦＭＧＬＶＩＶＹＬＬＴＳＷＬＰＴＬＭＲＤＳＧＡＳＭＥＱＡＡＦＩＧＡＬＦＱＦＧＧＶＬＳＡＶＧＶＧＷＡＭＤＲＦＮＰＨＫＶＩＧＩＦＹＬＬＡＧＶＦＡＹＡＶＧＱＳＬＧＮＩＴＬＬＡＴＬＶＬＶＡＧＭＣＶＮＧＡＱＳＡＭＰＳＬＡＡＲＦＹＰＴＱＧＲＡＴＧＶＳＷＭＬＧＩＧＲＦＧＡＩＬＧＡＷＳＧＡＴＬＬＧＬＧＷＳＦＥＱＶＬＴＡＬＬＶＰＡＡＬＡＴＶＧＶＶＶＫＧＬＶＳＨＡＤＡＴ）に示される配列の５０連続アミノ鎖と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。いくつかの実施形態では、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーターは、配列番号６に示される配列の１００連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。いくつかの実施形態では、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーターは、配列番号６に示される配列の１５０連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。
いくつかの実施形態では、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーターはｐｃａＫまたはその機能性断片である。いくつかの実施形態では、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーターは、配列番号８（ＭＮＱＡＱＴＮＶＧＫＳＬＤＶＱＳＦＩＮＱＱＰＬＳＲＹＱＷＲＶＶＬＬＣＦＬＩＶＦＬＤＧＬＤＴＡＡＭＧＦＩＡＰＡＬＳＱＥＷＧＩＤＲＡＳＬＧＰＶＭＳＡＡＬＩＧＭＶＦＧＡＬＧＳＧＰＬＡＤＲＦＧＲＫＧＶＬＶＧＡＶＬＶＦＧＧＦＳＬＡＳＡＹＡＴＮＶＤＱＬＬＶＬＲＦＬＴＧＬＧＬＧＡＧＭＰＮＡＴＴＬＬＳＥＹＴＰＥＲＬＫＳＬＬＶＴＳＭＦＣＧＦＮＬＧＭＡＧＧＧＦＩＳＡＫＭＩＰＡＹＧＷＨＳＬＬＶＩＧＧＶＬＰＬＬＬＡＬＶＬＭＶＷＬＰＥＳＡＲＦＬＶＶＲＮＲＧＴＤＫＶＲＫＴＬＳＰＩＡＰＱＶＶＡＥＡＧＳＦＳＶＰＥＱＫＡＶＡＡＲＮＶＦＡＶＩＦＳＧＴＹＧＬＧＴＶＬＬＷＬＴＹＦＭＧＬＶＩＶＹＬＬＴＳＷＬＰＴＬＭＲＤＳＧＡＳＭＥＱＡＡＦＩＧＡＬＦＱＦＧＧＶＬＳＡＶＧＶＧＷＡＭＤＲＦＮＰＨＫＶＩＧＩＦＹＬＬＡＧＶＦＡＹＡＶＧＱＳＬＧＮＩＴＬＬＡＴＬＶＬＶＡＧＭＣＶＮＧＡＱＳＡＭＰＳＬＡＡＲＦＹＰＴＱＧＲＡＴＧＶＳＷＭＬＧＩＧＲＦＧＡＩＬＧＡＷＳＧＡＴＬＬＧＬＧＷＳＦＥＱＶＬＴＡＬＬＶＰＡＡＬＡＴＶＧＶＶＶＫＧＬＶＳＨＡＤＡＴ）に示される配列の５０連続アミノ鎖と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。いくつかの実施形態では、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーターは、配列番号８に示される配列の１００連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。いくつかの実施形態では、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーターは、配列番号８に示される配列の１５０連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。
いくつかの実施形態では、ＯＭＰはＯｐｒＤファミリーポリンである。いくつかの実施形態では、ＯｐｒＤファミリーポリンはｐｐ３６５６またはその機能性断片である。いくつかの実施形態では、ＯｐｒＤファミリーポリンは、配列番号７（ＭＳＩＡＦＫＫＴＬＡＣＳＡＴＬＬＶＡＰＹＡＳＡＡＦＶＥＤＦＫＧＳＬＥＬＲＮＦＹＹＮＲＤＦＲＮＤＧＡＴＱＳＫＲＤＥＷＡＱＧＦＩＬＮＬＱＳＧＦＴＥＧＰＶＧＦＧＩＤＡＭＧＬＬＧＶＫＬＤＳＳＰＤＲＴＧＳＧＬＬＡＹＤＳＤＲＱＶＥＤＥＹＧＫＦＶＡＴＡＫＡＲＭＧＫＴＥＬＲＩＧＧＶＮＰＬＭＰＬＬＷＳＮＮＳＲＬＬＰＱＶＦＲＧＧＳＬＴＶＮＤＩＤＫＬＴＶＴＡＴＲＩＮＡＶＫＱＲＮＳＴＤＦＥＳＬＴＡＴＧＹＡＰＶＥＡＤＨＹＮＹＬＡＦＤＦＫＰＡＫＤＭＴＦＳＬＨＡＡＥＬＥＤＬＹＫＳＹＦＡＧＩＫＶＩＫＰＬＷＥＧＮＶＩＡＤＶＲＶＦＤＡＳＥＴＧＳＫＫＬＧＥＶＤＮＲＴＬＳＳＹＦＡＹＳＩＫＧＨＴＩＧＧＧＹＱＫＡＷＧＤＴＳＦＡＦＶＮＧＴＤＴＹＬＦＧＥＳＬＶＳＴＦＴＡＰＥＥＲＶＷＦＡＲＹＤＦＤＦＡＡＬＧＶＰＧＬＬＦＴＴＲＹＭＫＧＤＤＶＮＰＤＬＬＴＳＲＱＡＡＳＬＲＬＮＧＥＤＧＫＥＷＥＲＶＴＤＩＳＹＶＩＱＳＧＰＡＫＧＶＳＦＱＷＲＮＳＴＮＲＳＴＹＡＤＳＡＮＥＮＲＬＩＭＲＹＴＦＮＦ）に示される配列の５０連続アミノ鎖と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。いくつかの実施形態では、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーターは、配列番号７に示される配列の１００連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。いくつかの実施形態では、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーターは、配列番号７に示される配列の１５０連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。
実施形態においてＯＭＰはＯｐｒＤファミリーポリンである。いくつかの実施形態では、ＯｐｒＤファミリーポリンはｐｐ３６５６またはその機能性断片である。いくつかの実施形態では、ＯｐｒＤファミリーポリンは、配列番号９（ＭＳＩＡＦＫＫＴＬＡＣＳＡＴＬＬＶＡＰＹＡＳＡＡＦＶＥＤＦＫＧＳＬＥＬＲＮＦＹＹＮＲＤＦＲＮＤＧＡＴＱＳＫＲＤＥＷＡＱＧＦＴＬＮＬＱＳＧＦＴＥＧＰＶＧＦＧＩＤＡＭＧＬＬＧＶＫＬＤＳＳＰＤＲＴＧＳＧＬＬＡＹＤＳＤＲＱＶＥＤＥＹＧＫＦＶＡＴＡＫＡＲＭＧＫＴＥＬＲＩＧＧＶＮＰＬＭＰＬＬＷＳＮＮＳＲＬＬＰＱＩＦＲＧＧＳＬＴＶＮＤＩＤＫＬＴＶＴＡＴＲＶＮＡＶＫＱＲＮＳＴＤＦＥＳＬＴＡＴＧＹＡＰＶＥＡＤＨＹＮＹＬＡＦＤＦＫＰＡＫＤＭＴＦＳＬＨＡＡＥＬＥＤＬＹＫＳＹＦＡＧＩＫＶＩＫＰＬＷＥＧＮＶＩＡＤＶＲＶＦＤＡＳＥＴＧＳＫＫＬＧＥＶＤＮＲＴＬＳＳＹＦＡＹＳＩＫＧＨＴＩＧＧＧＹＱＫＡＷＧＤＴＳＦＡＦＶＮＧＴＤＴＹＬＦＧＥＳＬＶＳＴＦＴＡＰＥＥＲＶＷＦＡＲＹＤＦＤＦＡＡＬＧＶＰＧＬＬＦＴＴＲＹＭＥＧＤＤＶＮＰＤＬＬＴＳＲＱＡＡＳＬＲＬＮＧＥＤＧＫＥＷＥＲＶＴＤＩＳＹＶＩＱＳＧＰＡＫＧＶＳＦＱＷＲＮＳＴＮＲＳＴＹＡＤＳＡＮＥＮＲＬＩＭＲＹＴＦＮＦ）に示される配列の５０連続アミノ鎖と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。いくつかの実施形態では、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーターは、配列番号９に示される配列の１００連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。いくつかの実施形態では、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーターは、配列番号９に示される配列の１５０連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。
いくつかの実施形態では、（例えば原核生物）宿主細胞は、芳香族プレニル転移酵素またはその機能性断片及び／またはその変異体をさらに含み、芳香族プレニル転移酵素は機能性であり輸送体（例えばＭＦＳ芳香族酸アンチポーターまたはＯＭＰスーパーファミリーポリン）の芳香族酸基質をプレニル化することができる。いくつかの実施形態では、芳香族酸基質はオリベトレートであり、芳香族プレニル転移酵素は機能性でありオリベトレートをプレニル化することができる。場合によっては、芳香族プレニル転移酵素は機能性でありオリベトレートをプレニル化してカンナビゲロール酸を生成することができる。
いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素は、ＣＢＧＡＳもしくはＮｐｈＢ、またはその機能性断片である。いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素は、ＣｓＰＴ４（Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２８，２０１９）、またはその機能性断片及び／またはその変異体である。
いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素はＣＢＧＡＳの機能性断片である。いくつかの実施形態では、ＣＢＧＡＳは、配列番号３（ＣＢＧＡＳ、ＡＪＮ５７７７４．１）ＭＧＬＳＳＶＣＴＦＳＦＱＴＮＹＨＴＬＬＮＰＨＮＮＮＰＫＴＳＬＬＣＹＲＨＰＫＴＰＩＫＹＳＹＮＮＦＰＳＫＨＣＳＴＫＳＦＨＬＱＮＫＣＳＥＳＬＳＩＡＫＮＳＩＲＡＡＴＴＮＱＴＥＰＰＥＳＤＮＨＳＶＡＴＫＩＬＮＦＧＫＡＣＷＫＬＱＲＰＹＴＩＩＡＦＴＳＣＡＣＧＬＦＧＫＥＬＬＨＮＴＮＬＩＳＷＳＬＭＦＫＡＦＦＦＬＶＡＩＬＣＩＡＳＦＴＴＴＩＮＱＩＹＤＬＨＩＤＲＩＮＫＰＤＬＰＬＡＳＧＥＩＳＶＮＴＡＷＩＭＳＩＩＶＡＬＦＧＬＩＩＴＩＫＭＫＧＧＰＬＹＩＦＧＹＣＦＧＩＦＧＧＩＶＹＳＶＰＰＦＲＷＫＱＮＰＳＴＡＦＬＬＮＦＬＡＨＩＩＴＮＦＴＦＹＹＡＳＲＡＡＬＧＬＰＦＥＬＲＰＳＦＴＦＬＬＡＦＭＫＳＭＧＳＡＬＡＬＩＫＤＡＳＤＶＥＧＤＴＫＦＧＩＳＴＬＡＳＫＹＧＳＲＮＬＴＬＦＣＳＧＩＶＬＬＳＹＶＡＡＩＬＡＧＩＩＷＰＱＡＦＮＳＮＶＭＬＬＳＨＡＩＬＡＦＷＬＩＬＱＴＲＤＦＡＬＴＮＹＤＰＥＡＧＲＲＦＹＥＦＭＷＫＬＹＹＡＥＹＬＶＹＶＦＩに示される配列の５０連続アミノ鎖と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。いくつかの実施形態では、ＣＢＧＡＳは、配列番号３に示される配列の１００連続アミノ鎖と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。いくつかの実施形態では、ＣＢＧＡＳは、配列番号３に示される配列の１５０連続アミノ鎖と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。
場合によっては、宿主細胞は、ＣＢＧＡ合成酵素（ＣＢＧＡＳ）などの芳香族プレニル転移酵素をコードする核酸に機能可能に連結された（例えば原核生物）プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＢＧＡＳは、配列番号３に示される配列の５０連続アミノ鎖と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。いくつかの実施形態では、ＣＢＧＡＳは、配列番号３に示される配列の１００連続アミノ鎖と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。いくつかの実施形態では、ＣＢＧＡＳは、配列番号３に示される配列の１５０連続アミノ鎖と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。
場合によっては、芳香族プレニル転移酵素（例えばＣＢＧＡＳ）は、色素体または葉緑体保持シグナルが欠損するＮ末端側切断を含む。場合によっては、芳香族プレニル転移酵素（例えばＣＢＧＡＳ）は、色素体保持シグナルが欠損するＮ末端側切断を含む。
いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素はＮｐｈＢの機能性断片である。いくつかの実施形態では、ＮｐｈＢは、配列番号４（ＮｐｈＢ、ＡＦＤ３８７４３．１）ＭＳＥＡＡＤＶＥＲＶＹＡＡＭＥＥＡＡＧＬＬＧＶＡＣＡＲＤＫＩＹＰＬＬＳＴＦＱＤＴＬＶＥＧＧＳＶＶＶＦＳＭＡＳＧＲＨＳＴＥＬＤＦＳＩＳＶＰＴＳＨＧＤＰＹＡＴＶＶＥＫＧＬＦＰＡＴＧＨＰＶＤＤＬＬＡＤＴＱＫＨＬＰＶＳＭＦＡＩＤＧＥＶＴＧＧＦＫＫＴＹＡＦＦＰＴＤＮＭＰＧＶＡＥＬＳＡＩＰＳＭＰＰＡＶＡＥＮＡＥＬＦＡＲＹＧＬＤＫＶＱＭＴＳＭＤＹＫＫＲＱＶＮＬＹＦＳＥＬＳＡＱＴＬＥＡＥＳＶＬＡＬＶＲＥＬＧＬＨＶＰＮＥＬＧＬＫＦＣＫＲＳＦＳＶＹＰＴＬＮＷＥＴＧＫＩＤＲＬＣＦＡＶＩＳＮＤＰＴＬＶＰＳＳＤＥＧＤＩＥＫＦＨＮＹＡＴＫＡＰＹＡＹＶＧＥＫＲＴＬＶＹＧＬＴＬＳＰＫＥＥＹＹＫＬＧＡＹＹＨＩＴＤＶＱＲＧＬＬＫＡＦＤＳＬＥＤに示される配列の５０連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素はＮｐｈＢの機能性断片である。いくつかの実施形態では、ＮｐｈＢは、配列番号４に示される配列の１００連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素はＮｐｈＢの機能性断片である。いくつかの実施形態では、ＮｐｈＢは、配列番号４に示される配列の１５０連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。場合によっては、ＮｐｈＢは、以下の突然変異：Ｙ２８８Ａ、Ｙ２８８Ｎ、Ｇ２８６Ｓ、Ａ２３２Ｓ、Ｆ２１３Ｈ及び／またはＹ２８８Ｖのうちの１つ以上または全てを含む。いくつかの実施形態では、ＮｐｈＢは、以下の突然変異の組合せ：Ｙ２８８Ｎ／Ｇ２８６Ｓ、Ｙ２８８Ａ／Ｇ２８６Ｓ、Ｙ２８８Ａ／Ｇ２８６Ｓ／Ａ２３２Ｓ、Ｙ２８８Ａ／Ｇ２８６Ｓ／Ａ２３２Ｓ／Ｆ２１３Ｈ、Ｙ２８８Ｖ／Ｇ２８６Ｓ、Ｙ２８８Ｖ／Ａ２３２Ｓ、またはＹ２８８Ａ／Ａ２３２Ｓのうちの１つを含む。Ｖａｌｌｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１９ １０：５６５を参照されたい。
場合によっては、宿主細胞は、ＮｐｈＢなどの芳香族プレニル転移酵素をコードする核酸に機能可能に連結された（例えば原核生物）プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮｐｈＢは、配列番号４に示される配列の５０連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。いくつかの実施形態では、ＮｐｈＢは、配列番号４に示される配列の１００連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。いくつかの実施形態では、ＮｐｈＢは、配列番号４に示される配列の１５０連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、少なくとも１つの（例えば原核生物）シャペロンをコードする異種核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。
場合によっては、宿主細胞はカンナビノイド合成酵素を含む。場合によっては、宿主細胞は、カンナビノイド合成酵素をコードする異種核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。場合によっては、カンナビノイド合成酵素はＣＢＤＡＳである。場合によっては、カンナビノイド合成酵素はＴＨＣＡＳである。
いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素は、配列番号１（カンナビジオール酸合成酵素。Ａ６Ｐ６Ｖ９．１。シグナルペプチドが除去されたもの）ＮＰＲＥＮＦＬＫＣＦＳＱＹＩＰＮＮＡＴＮＬＫＬＶＹＴＱＮＮＰＬＹＭＳＶＬＮＳＴＩＨＮＬＲＦＴＳＤＴＴＰＫＰＬＶＩＶＴＰＳＨＶＳＨＩＱＧＴＩＬＣＳＫＫＶＧＬＱＩＲＴＲＳＧＧＨＤＳＥＧＭＳＹＩＳＱＶＰＦＶＩＶＤＬＲＮＭＲＳＩＫＩＤＶＨＳＱＴＡＷＶＥＡＧＡＴＬＧＥＶＹＹＷＶＮＥＫＮＥＮＬＳＬＡＡＧＹＣＰＴＶＣＡＧＧＨＦＧＧＧＧＹＧＰＬＭＲＮＹＧＬＡＡＤＮＩＩＤＡＨＬＶＮＶＨＧＫＶＬＤＲＫＳＭＧＥＤＬＦＷＡＬＲＧＧＧＡＥＳＦＧＩＩＶＡＷＫＩＲＬＶＡＶＰＫＳＴＭＦＳＶＫＫＩＭＥＩＨＥＬＶＫＬＶＮＫＷＱＮＩＡＹＫＹＤＫＤＬＬＬＭＴＨＦＩＴＲＮＩＴＤＮＱＧＫＮＫＴＡＩＨＴＹＦＳＳＶＦＬＧＧＶＤＳＬＶＤＬＭＮＫＳＦＰＥＬＧＩＫＫＴＤＣＲＱＬＳＷＩＤＴＩＩＦＹＳＧＶＶＮＹＤＴＤＮＦＮＫＥＩＬＬＤＲＳＡＧＱＮＧＡＦＫＩＫＬＤＹＶＫＫＰＩＰＥＳＶＦＶＱＩＬＥＫＬＹＥＥＤＩＧＡＧＭＹＡＬＹＰＹＧＧＩＭＤＥＩＳＥＳＡＩＰＦＰＨＲＡＧＩＬＹＥＬＷＹＩＣＳＷＥＫＱＥＤＮＥＫＨＬＮＷＩＲＮＩＹＮＦＭＴＰＹＶＳＫＮＰＲＬＡＹＬＮＹＲＤＬＤＩＧＩＮＤＰＫＮＰＮＮＹＴＱＡＲＩＷＧＥＫＹＦＧＫＮＦＤＲＬＶＫＶＫＴＬＶＤＰＮＮＦＦＲＮＥＱＳＩＰＰＬＰＲＨＲＨに示される配列の５０連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素は、配列番号１に示される配列の１００連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素は、配列番号１に示される配列の１５０連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素は、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素は、配列番号２（テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素。ＡＢ０５７８０５．１。分泌シグナルが除去されたもの）ＮＰＲＥＮＦＬＫＣＦＳＫＨＩＰＮＮＶＡＮＰＫＬＶＹＴＱＨＤＱＬＹＭＳＩＬＮＳＴＩＱＮＬＲＦＩＳＤＴＴＰＫＰＬＶＩＶＴＰＳＮＮＳＨＩＱＡＴＩＬＣＳＫＫＶＧＬＱＩＲＴＲＳＧＧＨＤＡＥＧＭＳＹＩＳＱＶＰＦＶＶＶＤＬＲＮＭＨＳＩＫＩＤＶＨＳＱＴＡＷＶＥＡＧＡＴＬＧＥＶＹＹＷＩＮＥＫＮＥＮＬＳＦＰＧＧＹＣＰＴＶＧＶＧＧＨＦＳＧＧＧＹＧＡＬＭＲＮＹＧＬＡＡＤＮＩＩＤＡＨＬＶＮＶＤＧＫＶＬＤＲＫＳＭＧＥＤＬＦＷＡＩＲＧＧＧＧＥＮＦＧＩＩＡＡＷＫＩＫＬＶＡＶＰＳＫＳＴＩＦＳＶＫＫＮＭＥＩＨＧＬＶＫＬＦＮＫＷＱＮＩＡＹＫＹＤＫＤＬＶＬＭＴＨＦＩＴＫＮＩＴＤＮＨＧＫＮＫＴＴＶＨＧＹＦＳＳＩＦＨＧＧＶＤＳＬＶＤＬＭＮＫＳＦＰＥＬＧＩＫＫＴＤＣＫＥＦＳＷＩＤＴＴＩＦＹＳＧＶＶＮＦＮＴＡＮＦＫＫＥＩＬＬＤＲＳＡＧＫＫＴＡＦＳＩＫＬＤＹＶＫＫＰＩＰＥＴＡＭＶＫＩＬＥＫＬＹＥＥＤＶＧＡＧＭＹＶＬＹＰＹＧＧＩＭＥＥＩＳＥＳＡＩＰＦＰＨＲＡＧＩＭＹＥＬＷＹＴＡＳＷＥＫＱＥＤＮＥＫＨＩＮＷＶＲＳＶＹＮＦＴＴＰＹＶＳＱＮＰＲＬＡＹＬＮＹＲＤＬＤＬＧＫＴＮＨＡＳＰＮＮＹＴＱＡＲＩＷＧＥＫＹＦＧＫＮＦＮＲＬＶＫＶＫＴＫＶＤＰＮＮＦＦＲＮＥＱＳＩＰＰＬＰＰＨＨＨに示される配列の５０連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素は、配列番号２に示される配列の１００連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素は、配列番号２に示される配列の１５０連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素は、配列番号２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素は、配列番号１または配列番号２の１５０連続アミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素は、配列番号１または配列番号２の３００連続アミノ酸と少なくとも５０％または５５％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素は、配列番号１または配列番号２の３００または全ての連続アミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素はＣａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａカンナビノイド合成酵素である。
いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素は、配列番号３の１５０連続アミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素は、配列番号３の３００連続アミノ酸と少なくとも５０％または５５％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素は、配列番号３の３００または全ての連続アミノ酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＢＧＡ合成酵素をコードする核酸、ならびにＴＨＣＡ合成酵素及びＣＢＤＡ合成酵素からなる群から選択されるカンナビノイド合成酵素、またはそれらのうちの２つまたは全てをコードする１つ以上の核酸の組合せをコードする核酸を含む。場合によっては、ＣＢＧＡ合成酵素発現カセットを含む宿主細胞は、ＴＨＣＡ合成酵素及び／またはＣＢＤＡ合成酵素をコードする核酸をさらに含み、各合成酵素が独立して同じまたは異なる発現カセット内のプロモーターに機能可能に連結されている。
場合によっては、輸送体（例えば、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーター、例えばｐｃａＫ、またはＯＭＰスーパーファミリーポリン、例えばＯｐｒＤファミリーポリン、例えばｐｐ３６５６）をコードする異種核酸を含む発現カセットを含む宿主細胞は、芳香族プレニル転移酵素、ＴＨＣＡ合成酵素及び／またはＣＢＤＡ合成酵素をコードする核酸をさらに含み、合成酵素及び／またはプレニル転移酵素が各々独立して同じまたは異なる発現カセット内のプロモーターに機能可能に連結されている。場合によっては、輸送体（例えば、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーター、例えばｐｃａＫ、またはＯＭＰスーパーファミリーポリン、例えばＯｐｒＤファミリーポリン、例えばｐｐ３６５６）をコードする異種核酸を含む発現カセットを含む宿主細胞は、独立して同じまたは異なる発現カセット内のプロモーターに機能可能に連結された芳香族プレニル転移酵素をコードする核酸をさらに含む。場合によっては、輸送体（例えば、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーター、例えばｐｃａＫ、またはＯＭＰスーパーファミリーポリン、例えばＯｐｒＤファミリーポリン、例えばｐｐ３６５６）をコードする異種核酸を含む発現カセットを含む宿主細胞は、芳香族プレニル転移酵素及びＣＢＤＡ合成酵素をコードする核酸をさらに含み、各合成酵素及びプレニル転移酵素が独立して同じまたは異なる発現カセット内のプロモーターに機能可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素、または少なくとも１つのコードされるカンナビノイド合成酵素は、切断型ＴＨＣＡ合成酵素及び切断型ＣＢＤＡ合成酵素からなる群から選択される切断型カンナビノイド合成酵素であり、切断は、シグナルペプチド、色素体保持シグナル及び／または葉緑体保持シグナルの全てまたは一部の欠失である。いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素は、カンナビノイド合成酵素が膜結合をしない、または真核生物システムに発現しても膜結合をしないような、膜貫通または膜結合領域の全てまたは一部の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、輸送体をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターは恒常的プロモーターである。いくつかの実施形態では、輸送体をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターは誘導性プロモーターである。場合によっては、芳香族プレニル転移酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターは恒常的プロモーターである。いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターは誘導性プロモーターである。場合によっては、輸送体をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターは恒常的プロモーターであり、芳香族プレニル転移酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターは恒常的プロモーターである。場合によっては、輸送体をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターは誘導性プロモーターであり、芳香族プレニル転移酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターは誘導性プロモーターである。場合によっては、芳香族プレニル転移酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターと、輸送体をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターは、同じプロモーターである。場合によっては、芳香族プレニル転移酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターと、輸送体をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターは、異なるプロモーターである。
異なるカンナビノイド合成酵素を含む２つ以上の発現カセットを宿主細胞が含む、いくつかの実施形態では、各発現カセットは、カンナビノイド合成酵素に機能可能に連結された誘導性プロモーターを含む。異なるカンナビノイド合成酵素を含む２つ以上の発現カセットを宿主細胞が含む、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの発現カセットは、カンナビノイド合成酵素に機能可能に連結された誘導性プロモーターを含む。異なるカンナビノイド合成酵素を含む２つ以上の発現カセットを宿主細胞が含む、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの発現カセットは、カンナビノイド合成酵素に機能可能に連結された恒常的プロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターは恒常的プロモーターである。いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターは誘導性プロモーターである。異なるカンナビノイド合成酵素を含む２つ以上の発現カセットを宿主細胞が含む、いくつかの実施形態では、各発現カセットは、カンナビノイド合成酵素に機能可能に連結された恒常的プロモーターを含む。
異なるカンナビノイド合成酵素を含む２つ以上の発現カセットを宿主細胞が含む、いくつかの実施形態では、各発現カセットは、カンナビノイド合成酵素に機能可能に連結された誘導性プロモーターを含む。異なるカンナビノイド合成酵素を含む２つ以上の発現カセットを宿主細胞が含む、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの発現カセットは、カンナビノイド合成酵素に機能可能に連結された誘導性プロモーターを含む。異なるカンナビノイド合成酵素を含む２つ以上の発現カセットを宿主細胞が含む、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの発現カセットは、カンナビノイド合成酵素に機能可能に連結された恒常的プロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ及びｉｄｉからなる群から選択される１つ以上のＭＥＰ経路酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、またはさらに含む。場合によっては、宿主細胞は、二機能性ＭＥＰ経路酵素ｉｓｐＤＦをコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、またはさらに含む。場合によっては、二機能性ｉｓｐＤＦ酵素を含む発現カセットは、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ及びｉｄｉからなる群から選択される１つ以上のＭＥＰ経路酵素をさらに含む。場合によっては、二機能性ｉｓｐＤＦ酵素を含む発現カセットは、ｄｘｓ及びｉｄｉをさらに含む。
場合によっては、宿主細胞は、二機能性ｉｓｐＤＦ酵素を含む発現カセットを含まない対照細胞と比較して１つ以上のＭＥＰ経路遺伝子のより高いレベルの発現を含む。場合によっては、宿主細胞は、二機能性ｉｓｐＤＦ酵素を含む発現カセットを含まない対照細胞と比較してｄｘｓ及びｉｄｉのより高いレベルの発現を含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ｉｓｐＤＥ二機能性ＭＥＰ経路酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、またはさらに含む。いくつかの実施形態では、二機能性ＭＥＰ経路酵素は、柔軟なリンカーペプチドをｉｓｐＤドメインとｉｓｐＥドメインとの間に含む。いくつかの実施形態では、柔軟なリンカーは、ＳＬＧＧＧＧＳＡＡＡの配列を含む。場合によっては、リンカー配列は、ＧＯＲアルゴリズム、バージョンＩＶ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９９６ Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｅｄ．，ｖｏｌ ２６６，５４０－５５３）によって決定したとき、６５％より高いランダムコイル形成を有する。
いくつかの実施形態では、ｉｓｐＤＥ二機能性ＭＥＰ経路酵素は、配列番号１０（ＭＡＴＴＨＬＤＶＣＡＶＶＰＡＡＧＦＧＲＲＭＱＴＥＣＰＫＱＹＬＳＩＧＮＱＴＩＬＥＨＳＶＨＡＬＬＡＨＰＲＶＫＲＶＶＩＡＩＳＰＧＤＳＲＦＡＱＬＰＬＡＮＨＰＱＩＴＶＶＤＧＧＤＥＲＡＤＳＶＬＡＧＬＫＡＡＧＤＡＱＷＶＬＶＨＤＡＡＲＰＣＬＨＱＤＤＬＡＲＬＬＡＬＳＥＴＳＲＴＧＧＩＬＡＡＰＶＲＤＴＭＫＲＡＥＰＧＫＮＡＩＡＨＴＶＤＲＮＧＬＷＨＡＬＴＰＱＦＦＰＲＥＬＬＨＤＣＬＴＲＡＬＮＥＧＡＴＩＴＤＥＡＳＡＬＥＹＣＧＦＨＰＱＬＶＥＧＲＡＤＮＩＫＶＴＲＰＥＤＬＡＬＡＥＦＹＬＴＲＴＩＨＱＥＮＴＳＬＧＧＧＧＳＡＡＡＭＲＴＱＷＰＳＰＡＫＬＮＬＦＬＹＩＴＧＱＲＡＤＧＹＨＴＬＱＴＬＦＱＦＬＤＹＧＤＴＩＳＩＥＬＲＤＤＧＤＩＲＬＬＴＰＶＥＧＶＥＨＥＤＮＬＩＶＲＡＡＲＬＬＭＫＴＡＡＤＳＧＲＬＰＴＧＳＧＡＮＩＳＩＤＫＲＬＰＭＧＧＧＬＧＧＧＳＳＮＡＡＴＶＬＶＡＬＮＨＬＷＱＣＧＬＳＭＤＥＬＡＥＭＧＬＴＬＧＡＤＶＰＶＦＶＲＧＨＡＡＦＡＥＧＶＧＥＩＬＴＰＶＤＰＰＥＫＷＹＬＶＡＨＰＧＶＳＩＰＴＰＶＩＦＫＤＰＥＬＰＲＮＴＰＫＲＳＩＥＴＬＬＫＣＥＦＳＮＤＣＥＶＩＡＲＫＲＦＲＥＶＤＡＶＬＳＷＬＬＥＹＡＰＳＲＬＴＧＴＧＡＣＶＦＡＥＦＤＴＥＳＥＡＲＱＶＬＥＱＡＰＥＷＬＮＧＦＶＡＫＧＡＮＬＳＰＬＨＲＡＭＬ）に示される配列の５０連続アミノ酸と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一である、または同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
場合によっては、宿主細胞は、二機能性ＭＥＰ経路酵素ｉｓｐＤＦをコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、またはさらに含む。場合によっては、二機能性ｉｓｐＤＥ酵素を含む発現カセットは、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ及びｉｄｉからなる群から選択される１つ以上のＭＥＰ経路酵素をさらに含む。場合によっては、二機能性ｉｓｐＤＥ酵素を含む発現カセットは、ｄｘｓ、ｉｓｐＦ及びｉｄｉをさらに含む。場合によっては、二機能性ｉｓｐＤＥ酵素を含む発現カセットは、二機能性ｉｓｐＤＦ酵素をさらに含む（ＰＣＴ／ＣＡ２０１８／０５１０７４参照）。場合によっては、二機能性ｉｓｐＤＥ酵素を含む発現カセットは、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ及びｉｄｉからなる群から選択される１つ以上のＭＥＰ経路酵素をさらに含む。
場合によっては、宿主細胞は、二機能性ｉｓｐＤＥ酵素を含む発現カセットを含まない対照細胞と比較して、１つ以上のＭＥＰ経路遺伝子のより高いベルの発現を含む。場合によっては、宿主細胞は、二機能性ｉｓｐＤＥ酵素を含む発現カセットを含まない対照細胞と比較してｄｘｓ及びｉｄｉのより高いレベルの発現を含む。場合によっては、宿主細胞は、二機能性ｉｓｐＤＥ酵素を含む発現カセットを含まない対照細胞と比較して１つ以上のＭＥＰ経路遺伝子のより高いレベルの発現を含む。場合によっては、宿主細胞は、二機能性ｉｓｐＤＥ酵素を含む発現カセットを含まない対照細胞と比較してｄｘｓ及びｉｄｉのより高いレベルの発現を含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、輸送体（例えば、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーターまたはＯＭＰスーパーファミリーポリン、例えばＯｐｒＤファミリーポリン、例えばｐｐ３６５６）の基質（例えば、オリベトレート（ＯＡ）を含む培養培地の中に入っている。場合によっては、基質（例えば、オリベトレート（ＯＡ）は、宿主細胞にとって外来性である。例えば、基質（例えばＯＡ）は、宿主細胞を中で培養する培養培地に、外来的に供給され得る。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ａｃｋＡ－ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｌｄｈＡ、ｄｌｄ、ａｄｈＥ、ｐｐｓ及びａｔｏＤＡからなる群から選択される遺伝子のうちの１、２、３、４、５、６、７、８個または全てにおける欠失を含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞はＰＤＨバイパスを含む。例えば、Ｖａｌｌｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１９を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＰＤＨバイパスは、異種発現したピルビン酸酸化酵素及びリン酸アセチル転移酵素を含む。
実施形態において、１つ以上、または２つ以上、または全ての発現カセットは宿主細胞のゲノムに組み込まれている。さらなる、または代わりの実施形態において、１つ以上の発現カセットは宿主細胞のゲノムに組み込まれていない。
第２の態様において、本発明は、（例えば原核生物）宿主細胞内へのＭＦＳ芳香族酸アンチポーターの芳香族基質の輸送を増進する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の宿主細胞を、輸送体またはその機能性断片の発現に適した条件の下、芳香族基質を含有する培養培地の中で培養することを含む。
別の態様において、本発明は、基質（例えば、輸送体（例えば、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーターまたはＯＭＰスーパーファミリーポリン、例えばＯｐｒＤファミリーポリン、例えばｐｐ３６５６）のオリベトレート（ＯＡ））をプレニル化する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、輸送体の芳香族基質、及び芳香族プレニル転移酵素を含有する培養培地の中で本明細書に記載の宿主細胞を培養し、それによって輸送体の芳香族基質をプレニル化することを含む。いくつかの実施形態では、基質はオリベトレートである。いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素は機能性であり（例えばゲラニルジホスフェートからの）ゲラニル部分を芳香族基質に転移させることができる。いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素は機能性であり（例えばファルネシルジホスフェートからの）ファルネシル部分を芳香族基質に転移させることができる。いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素は機能性であり（例えばネリルジホスフェートからの）ネリル部分を芳香族基質に転移させることができる。いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素は機能性であり（例えばゲラニルジホスフェートからの）ゲラニル部分及び／または（例えばネリルジホスフェートからの）ネリル部分を芳香族基質に転移させることができる。いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素は機能性であり、（例えばゲラニルジホスフェートからの）ゲラニル部分、（例えばファルネシルジホスフェートからの）ファルネシル部分及び／または（例えばネリルジホスフェートからの）ネリル部分を芳香族基質に転移させることができる。
いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素はゲラニルジホスフェート：オリベトレートゲラニル転移酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素は、ＣＢＧＡ合成酵素、その相同分子種、またはその機能性断片である。いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素は、配列番号３の配列を有するＣＢＧＡ合成酵素またはその機能性断片である。いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素は、ＮｐｈＢ、その相同分子種またはその機能性断片である。いくつかの実施形態では、芳香族プレニル転移酵素は、配列番号４の配列を有するＮｐｈＢまたはその機能性断片である。いくつかの実施形態では、芳香族酸はオリベトレートであり、芳香族プレニル転移酵素はＣＢＧＡ合成酵素またはＮｐｈＢであり、方法は、カンナビゲロール酸を生成することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、輸送体が発現しないかまたはより低い量もしくは活性のそれが発現する条件の下で実施される対照方法と比較して、芳香族プレニル転移酵素及び芳香族酸基質のプレニル化生成物の生成量を増加させる。いくつかの実施形態では、方法は、輸送体が発現しないかまたはより低い量もしくは活性のそれが発現する条件の下で実施される対照方法と比較して、プレニル化されたオリベトレート生成物の生成量を増加させる。
いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の宿主細胞発現カセットにおける発現を誘導するのに適した条件の下、好適な培養培地の中で本明細書に記載の原核生物宿主細胞を培養し、その後、培養された細胞または使用済み培地を採集し、それによって目的代謝生成物を得ることを含む。いくつかの実施形態では、目的代謝生成物は、ＴＨＣＡ、ＣＢＤＡ、ＣＢＣＡ、ＣＢＧＡ、ＣＢＮ、ＣＢＣ、ＴＨＣもしくはＣＢＤ、またはその１つ以上の混合物である。いくつかの実施形態では、培養培地は外来オリベトレートを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は外来ＤＶＡを含む。いくつかの実施形態では、方法は、オリベトレートを培養培地に添加すること及び／またはオリベトレートを含む培養培地を提供すること、ならびに提供された培養培地の中で宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＤＶＡを培養培地に添加すること及び／またはＤＶＡを含む培養培地を提供すること、ならびに提供された培養培地の中で宿主細胞を培養することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、培養された細胞を採集し溶解させてそれによって細胞溶解物を生成することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞溶解物から目的カンナビノイドを精製してそれによって精製目的カンナビノイドを生成することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、使用済み培養培地から目的カンナビノイドを精製してそれによって精製目的カンナビノイドを生成することを含む。
いくつかの実施形態では、精製目的代謝生成物はカンナビノイドであり、方法は、カンナビノイドを医薬組成物に製剤化することを含む。いくつかの実施形態では、精製目的代謝生成物はカンナビノイドであり、方法は、精製カンナビノイドの塩、プロドラッグまたは溶媒和物を形成することを含む。いくつかの実施形態では、精製目的代謝生成物はカンナビノイドであり、方法は、精製カンナビノイドの脱炭酸体を形成することを含む。いくつかの実施形態では、脱炭酸体は、精製目的代謝生成物を加熱することによって形成される。いくつかの実施形態では、方法は、宿主細胞、宿主細胞溶解物または使用済み培養培地を加熱して目的代謝生成物を脱炭酸することを含む。
参照による援用
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許及び特許出願を、各個の刊行物、特許または特許出願について参照により援用することを具体的かつ個別に示した場合と同じ程度に、参照により本明細書に援用する。
ＣＢＧＡ、ＣＢＧＶＡ、ＴＨＣＡ、ＣＢＤＡ、ＣＢＣＡ、ＴＨＣＶＡ、ＣＢＣＶＡ、ＣＢＤＶＡ、ＣＢＮ、ＴＨＣ、ＣＢＤ、ＣＢＣ、ＴＨＣＶ、ＣＢＣＶ及びＣＢＤＶからなる群から選択される１つ以上のカンナビノイドの生産のためのカンナビノイド経路の模式図を示す。 ｐｃａＫ（左）及びｐｐ３６５６（右）発現プラスミドを示し、ｐｃａＫまたはｐｐ３６５６導入遺伝子の発現はアラビノースプロモーターの制御下にある。 Ｂ５発現プラスミド構築物を示す。Ｂ５プラスミドは、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路のためのＩｓｐＤＦ１キメラ、ｉｄｉ及びｄｘｓを発現させ、ＧＰＰの生産のためのＧＰＰ合成酵素を発現させ、ＯＡ及びＧＰＰからのＣＢＧＡの生産のための最適化ＮｐｈＢ変異型芳香族プレニル転移酵素を発現させる。 ＮｐｈＢ発現プラスミドと、ｐｃａＫ発現プラスミド（Ｂ５－ｐｃａＫ）、ｐｐ３６５６発現プラスミド（Ｂ５－３６５６）または対照発現プラスミド（Ｂ５－ｐＢＡＤ）とを内包するＥ．ｃｏｌｉの発現培養物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。ｐｃａＫの予測サイズは４７．１ｋＤＡであり、ｐｐ３６５６の予測サイズは４６．７ｋＤａであり、ＮｐｈＢの予測サイズは３３．７ｋＤＡである。 芳香族輸送体の存在下または非存在下におけるオリベトレート透過性の比較を示す。 芳香族輸送体ｐｃａＫの存在下、異なる温度でのオリベトレート細胞透過性の比較を示す。 芳香族輸送体ｐｃａＫの存在下での異なるインキュベーション時間におけるオリベトレート細胞透過性を示す。 異種輸送体が発現していない対照細胞と比較したときの、ｐｃａＫまたはｐｐ３６５６が発現している細胞の内部への増進されたオリベトレート取込みを示す。付加的な輸送体の発現がないＢＬ２１対照と比較して、ｐＢＡＤ－ｐｃａＫ及びｐＢＡＤ－３６５６の発現及び誘導の後には細胞の内部への増進されたＯＡ取込みが２４～４８時間にわたって検出された。 オリベトレートプレニル化について最適化されたＮｐｈＢ変異体（Ｖａｌｌｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１９ １０：５６５参照）が発現しているが異種輸送体は発現していない対照細胞と比較したときの、ＮｐｈＢとｐｃａＫかｐｐ３６５６かのどちらかとが発現している細胞におけるＣＢＧＡの増加した生成量を示す。 ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの生産のための非メバロン酸経路をコードする発現構築物を示す。 芳香族プレニル転移酵素、ＣＢＧＡＳ酵素をコードする発現構築物を示す。 芳香族プレニル転移酵素ＮｐｈＢをコードする発現構築物を示す。 ＴＨＣＡＳ酵素をコードする発現構築物を示す。 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって示されたＥ．ｃｏｌｉにおける新規ＩｓｐＤＦの発現を示す。レーン１及びレーン５はそれぞれＩｓｐＤＥ１抽出物の全体及び精製物であり、レーン２及びレーン６はそれぞれＩｓｐＤＦ２抽出物の全体及び精製物であり、レーン４及びレーン７はそれぞれＩｓｐＤＦ３抽出物の全体及び精製物であり、レーン３及びレーン８はタンパク質ラダーである。 様々なＩｓｐＤＥ融合タンパク質のタンパク質配列アラインメントを示す。 ｐＳＡＳＤＦＩの可溶性タンパク質画分のＳＤＳ／ＰＡＧＥ画像を示す。レーン１はＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）であり、レーン２はタンパク質ラダーであり、レーン３及びレーン４はＳＡＳＤＦＩである。タンパク質に対応するバンドは、Ｄｘｓ（バンドａ、６８．２ｋＤａ）、ＩｓｐＤ（バンドｂ、２５．７ｋＤａ）、ＩｓｐＦ（バンドｄ、１６．９ｋＤａ）及びＩｄｉ（バンドｃ、２１．２ｋＤａ）である。 （ａ）～（ｂ）は、ＭＥＰ経路流束に対する律速段階の影響を示す。（ａ）リコペン生成量、（ｂ）イソプレン生成量。誘導のために用いたＩＰＴＧ濃度を凡例に示す。第１のＹ軸はテルペン力価であり、第２のＹ軸は正規化テルペン力価である。 （ａ）～（ｂ）は、ＭＥＰ経路流束に対する新規ＩｓｐＤＦ融合体の影響を示す。（ａ）リコペン生成量、（ｂ）イソプレン生成量。誘導のために用いたＩＰＴＧ濃度を凡例に示す。第１のＹ軸はテルペン力価であり、第２のＹ軸は正規化テルペン力価である。 （ａ）～（ｄ）は、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬツールによって生成された、融合タンパク質に対する相同性モデルを示す。（ａ）ｃｊＩｓｐＤＦ（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１８ Ｆｅｂ ２８；３８（１）：ＢＳＲ２０１７１３７０）、（ｂ）ＩｓｐＤＦ１、（ｃ）ＩｓｐＤＦ２、及び（ｄ）ＩｓｐＤＦ３。ＩｓｐＤドメインは桃色であり、ＩｓｐＦドメインは青色であり、リンカーは緑色である。Ｎ末端側残基を黒色で色付けし、Ｃ末端側残基を橙色で色付けしている。 ＩｓｐＥ過剰発現がリコペン生成量に及ぼす作用を示す。誘導のために用いたＩＰＴＧ濃度は、各構築物について左から右に、０μＭ、２５μＭ及び５０μＭである。第１のＹ軸はテルペン力価であり、第２のＹ軸は正規化テルペン力価である。 （ａ）～（ｂ）は、ＩｓｐＤＦ１のためのリンカー、及びそれがＭＥＰ経路流束に及ぼす作用を示す。（ａ）は、Ｄｘｓ、ＩｓｐＤＦキメラ及びＩｄｉが過剰発現している株であり、（ｂ）は、Ｄｘｓ、ＩｓｐＤＦキメラ、ＩｓｐＥ及びＩｄｉが過剰発現している株である。誘導のために用いたＩＰＴＧ濃度は、各構築物について左から右に、０μＭ、２５μＭ及び５０μＭである。第１のＹ軸はテルペン力価であり、第２のＹ軸は正規化テルペン力価である。 （ａ）～（ｂ）は、Ｅ．ｃｏｌｉのＩｓｐＤとＩｓｐＦとの非天然融合体のためのリンカー、及びそれがＭＥＰ経路流束に及ぼす作用を示す。（ａ）は、Ｄｘｓ、ＩｓｐＤＦキメラ及びＩｄｉが過剰発現している株であり、（ｂ）は、Ｄｘｓ、ＩｓｐＤＦキメラ、ＩｓｐＥ及びＩｄｉが過剰発現している株である。誘導のために用いたＩＰＴＧ濃度は、各構築物について左から右に、０μＭ、２５μＭ及び５０μＭである。第１のＹ軸はテルペン力価であり、第２のＹ軸は正規化テルペン力価である。 ＭＥＰ経路流束に関して、Ｅ．ｃｏｌｉのＩｓｐＤとＩｓｐＦとの非天然融合体のためのリンカーを示す。誘導のために用いたＩＰＴＧ濃度は、各構築物について左から右に、０μＭ、２５μＭ及び５０μＭである。第１のＹ軸はテルペン力価であり、第２のＹ軸は正規化テルペン力価である。 ＩｓｐＤＦ１のドメイン分離がＭＥＰ経路流束に及ぼす作用を示す。誘導のために用いたＩＰＴＧ濃度は、各構築物について左から右に、０μＭ、２５μＭ及び５０μＭである。第１のＹ軸はテルペン力価であり、第２のＹ軸は正規化テルペン力価である。 ＩｓｐＥの非天然融合体、及びそれがＭＥＰ経路流束に及ぼす作用を示す。誘導のために用いたＩＰＴＧ濃度は、各構築物について左から右に、０μＭ、２５μＭ及び５０μＭである。第１のＹ軸はテルペン力価であり、第２のＹ軸は正規化テルペン力価である。 異なる対照構築物と比較したときの、表示されたｉｓｐＤＥ過剰発現株におけるリコペン生成を示した比較プロットを示す。力価（左）及び正規化した力価（右）の値を示す。空欄の場所は「－」で表されている。
原核生物宿主細胞内への芳香族酸の輸送を増進するための宿主細胞遺伝子操作方策を本明細書に記載する。そうして、芳香族酸は、１つ以上の下流酵素段階の基質として細胞内に提供されて所望の目的代謝産物を生成し得る。例えば、芳香族酸は、異種芳香族プレニル転移酵素の基質であり得る。芳香族プレニル転移酵素は、芳香族酸をプレニル化してプレニル化生成物を生成し得る。プレニル供与体は、外来プレニル供与体または異種プレニル供与体であり得る。特定の実施形態では、プレニル供与体はゲラニルジホスフェートである。いくつかの実施形態では、プレニル供与体はネリルピロホスフェートである。いくつかの実施形態では、プレニル供与体は有機ピロホスフェートである。いくつかの実施形態では、プレニル供与体は、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａに天然に存在する有機ピロホスフェートである。いくつかの実施形態では、プレニル供与体は、Ｅ．ｃｏｌｉに天然に存在する有機ピロホスフェートである。いくつかの実施形態では、プレニル供与体は、イソペンチルジホスフェート（ＩＰＰ）、ジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニルジホスフェート（ＧＰＰ）、ファルネシルジホスフェート（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニルジホスフェート（ＧＧＰＰ）、及びＧＰＰネリルジホスフェートの異性体のようなそれらの異性体からなる群から選択される有機ピロホスフェートである。
場合によっては、ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸を含む異種発現カセットによって、一部もしくは全てのプレニル供与体が生成される、または増加した量のプレニル供与体が提供される。場合によっては、非メバロン酸経路の構成要素をコードする核酸を含む異種発現カセットによって、一部もしくは全てのプレニル供与体が生成される、または増加した量のプレニル供与体が提供される。場合によっては、二機能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸を含む異種発現カセットによって、一部もしくは全てのプレニル供与体が生成される、または増加した量のプレニル供与体が提供される。場合によっては、二機能性ｉｓｐＤＥ酵素をコードする核酸を含む異種発現カセットによって、一部もしくは全てのプレニル供与体が生成される、または増加した量のプレニル供与体が提供される。
異種輸送体の基質が、宿主細胞に発現する異種芳香族プレニル転移酵素の基質である実施形態において、基質は、典型的にはプレニル受容体である。例えば、プレニル受容体はオリベトレートまたはＤＶＡであり得る。したがって、いくつかの実施形態では、プレニル化オリベトレート生成物を生産するための方法及び組成物が本明細書に記載される。さらに、またはあるいは、プレニル化ジバリン酸生成物を生産するための方法及び組成物が本明細書に記載される。プレニル供与体がゲラニルピロホスフェートでありプレニル受容体がオリベトレートである実施形態では、プレニル化生成物はカンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）であり得る。プレニル供与体がネリルピロホスフェートでありプレニル受容体がオリベトレートである実施形態では、プレニル化生成物はカンナビネロレート（ＣＢＮＲＡ）であり得る。いくつかの実施形態では、プレニル受容体はジバリン酸（ＤＶＡ）である。したがって、いくつかの実施形態では、プレニル化ジバリン酸生成物を生産するための方法及び組成物が本明細書に記載される。プレニル供与体がゲラニルピロホスフェートでありプレニル受容体がＤＶＡである実施形態において、プレニル化生成物はカンナビゲロバリン酸酸（ＣＢＧＶＡ）であり得る。いくつかの実施形態では、プレニル供与体はネリルピロホスフェートであり、プレニル受容体はオリベトレートであり、プレニル化生成物はＣＢＮＲＡであり、芳香族プレニル転移酵素はＮｐｈＢまたはその機能性断片である。
プレニル化オリベトレートなどのプレニル化芳香族生成物（例えばプレニル化芳香族酸）、その下流の酵素的生成物またはその脱炭酸体は、宿主細胞、その溶解物、またはその使用済み培養培地から目的代謝産物として単離され得る。場合によっては、単離された目的代謝産物、その塩、その溶媒和物、その誘導体及び／またはその脱炭酸体は、医薬組成物の薬物有効成分として使用され得る。
かくして、プレニル化芳香族生成物が、プレニル化されたオリベトレート、オリベトール、ＤＶＡまたはジバリノールである実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物は、宿主細胞におけるカンナビノイドの生産に用いられ得る。例えば、宿主細胞は、異種カンナビノイド合成酵素、例えばＣＢＤＡ合成酵素を共発現させ得る。同様に、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、宿主細胞におけるカンナビノイド前駆体の生産に用いられ得、当該前駆体は１つ以上の試験管内反応の反応物質として単離及び使用されて目的生成物、例えばカンナビノイドまたはその誘導体を生成する。
これらの試験管内反応は、目的生成物、例えばカンナビノイドまたはその誘導体を生成する合成化学スキームを含み得る。これらの試験管内反応は、さらに、またはあるいは、１つ以上の酵素触媒試験管内反応を含み得る。例えば、宿主細胞から単離された、または宿主細胞溶解物中に含まれた、カンナビノイド合成酵素に、カンナビノイド前駆体を接触させてもよい。また別の代替形態を挙げると、カンナビノイド前駆体は単離され得、カンナビノイド合成酵素が異種発現する異なった原核生物宿主または真核生物宿主を使用した第２の微生物合成工程への投入材料として使用され得る。
異種輸送体、機能性であり異種輸送体の基質をプレニル化できる芳香族プレニル転移酵素、及び１つ以上の付加的な経路構成要素を共発現させるための方法及び組成物も、本明細書に記載される。本明細書に記載されるように、１つ以上の付加的な経路構成要素は、カンナビノイド合成酵素（例えば、ＴＨＣＡＳ及び／またはＣＢＤＡＳ）、及び１つ以上のヘルパー経路構成要素を含み得、それによって、（例えば原核生物）宿主細胞システムにおいて、検出可能な量のカンナビノイドを生成し得る。別の例示的なヘルパー経路構成要素は、メバロン酸非依存性（ＭＥＰ）経路構成要素、例えば二機能性ｉｓｐＤＦ酵素である。別の例示的なヘルパー経路構成要素は、メバロン酸非依存性（ＭＥＰ）経路構成要素、例えば二機能性ｉｓｐＤＥ酵素である。別の例示的なヘルパー経路構成要素はＧＰＰ合成酵素である。１つ以上のヘルパー経路の１つ以上の成分の発現を用いて目的カンナビノイドを生成することができる。異種輸送体、芳香族プレニル転移酵素、カンナビノイド合成酵素（複数可）、１つ以上のヘルパー経路構成要素（複数可）の１つ以上、及びそれらの組合せをコードする核酸の発現は、１つ以上の異種プロモーターによって制御され得る。
いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素はＴＨＣＡＳである。いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素はＣＢＤＡＳである。いくつかの実施形態では、原核生物宿主細胞は、ＴＨＣＡＳに機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット、及びＣＢＤＡＳに機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。
定義
「ＴＨＣＡＳ」または「テトラヒドロカンナビノール酸合成酵素」は、カンナビゲロール酸からテトラヒドロカンナビノール酸への変換を触媒する酵素を指す。
「ＣＢＤＡＳ」または「カンナビジオール酸合成酵素」は、カンナビゲロール酸からカンナビジオール酸への変換を触媒する酵素を指す。
「ＣＢＧＡＳ」または「カンナビゲロール酸合成酵素」は、オリベトレート及びＧＰＰからカンナビゲロール酸への変換を触媒する酵素を指す。
以下の略語を本明細書中で使用する：「Ｇ３Ｐ」はグリセルアルデヒド３－ホスフェートを意味し、「ＤＯＸＰ」は１－デオキシ－Ｄ－キシルロース５－ホスフェートを意味し、「ＭＥＰ」は２－Ｃ－メチルエリスリトール４－ホスフェートを意味し、「ＣＤＰ－ＭＥ」は４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチルエリスリトールを意味し、「ＣＤＰ－ＭＥＰ」は４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール２－ホスフェートを意味し、「ＭＥＣＰＰ」は２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール２，４－シクロジホスフェートを意味し、「ＨＭＢＰＰ」は（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブタ－２－エニルピロホスフェートを意味し、「ＩＰＰ」はイソペンテニルジホスフェートを意味し、「ＤＭＡＰＰ」はジメチルアリルジホスフェートを意味し、「ＧＰＰ」はゲラニルピロホスフェートを意味する。
「ＤＸＰ経路」及び「ＭＥＰ経路」は、メバロン酸非依存性経路としても知られる非メバロン酸経路を指す。ＭＥＰ経路の遺伝子は、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ及びｉｄｉである。
「ｄｘｓ」は、ＤＯＸＰ合成酵素を指し、「ｉｓｐＣ」はＤＯＸＰ還元酵素を指し、「ｉｓｐＤ」は２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール４－ホスフェートシチジリル転移酵素を指し、「ｉｓｐＥ」は４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼを指し、「ｉｓｐＦ」は２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール２，４－シクロジホスフェート合成酵素を指し、「ｉｓｐＧ」はＨＭＢ－ＰＰ合成酵素を指し、「ｉｓｐＨ」はＨＭＢ－ＰＰ還元酵素を指し、「ｉｄｉ」はイソペンテニル／ジメチルアリルジホスフェート異性化酵素を指し、「ｉｓｐＡ」は、「ＧＰＰ合成酵素」としても知られるファルネシルジホスフェート合成酵素を指すが、これは、ＤＭＡＰＰ＋ＩＰＰをＧＰＰに、及びＧＰＰ＋ＩＰＰをファルネシルピロホスフェートに変換することができる。
「ｉｓｐＤＦ」という用語は、２つの異なる活性部位を有しｉｓｐＤ活性（ＥＣ２．７．７．６０）及びｉｓｐＦ活性（ＥＣ４．６．１．１２）を呈する二機能性一本鎖酵素を指す。典型的には、ｉｓｐＤＦは、天然に存在する二機能性酵素、または１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入もしくは置換などの１つ以上の改変を有する天然に存在する二機能性酵素の誘導体である。
「ＯＡ」はオリベトレートを指し、「ＣＢＧＡ」はカンナビゲロール酸を指し、「ＣＢＮＲＡ」はカンナビネロール酸を指し、「ＣＢＮＡ」はカンナビノール酸を指し、「カンナビノール」または「ＣＢＮ」は６，６，９－トリメチル－３－ペンチルベンゾ［ｃ］クロメン－１－オールを指し、「ＣＢＧＶＡ」はカンナビゲロバリン酸を指し、「ＴＨＣＡ」は、Δ９異性体を含めたテトラヒドロカンナビノール酸を指し、「ＣＢＤＶ」はカンナビジバリンを指し、「ＣＢＣ」はカンナビクロメンを指し、「ＣＢＣＡ」はカンナビクロメン酸を指し、「ＣＢＣＶ」はカンナビクロメバリンを指し、「ＣＢＧはカンナビゲロールを指し、「ＣＢＧＶ」はカンナビゲロバリンを指し、「ＣＢＥ」はカンナビエルソインを指し、「ＣＢＬ」はカンナビシクロールを指し、「ＣＢＶ」はカンナビバリンを指し、「ＣＢＴ」はカンナビトリオールを指し、「ＴＨＣＶ」はテトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）を指し、「ＴＨＣ」はテトラヒドロカンナビノールを指し、「Δ９－ＴＨＣ」はΔ９－テトラヒドロカンナビノールを指し、「ＣＢＤＡ」はカンナビジオール酸を指す。
本明細書中で使用する場合、「カンナビジオール」、「ＣＢＤ」または「カンナビジオール」という用語は、以下の化合物のうちの１つ以上を指し、他の特定の立体異性体または複数の立体異性体が指定されていない限り化合物「Δ２－カンナビジオール」を含む。これらの化合物は：（１）Δ５－カンナビジオール（２－（６－イソプロペニル－３－メチル－５－シクロヘキセン－１－イル）－５－ペンチル－１，３－ベンゼンジオール）、（２）Δ４－カンナビジオール（２－（６－イソプロペニル－３－メチル－４－シクロヘキセン－１－イル）－５－ペンチル－１，３－ベンゼンジオール）、（３）Δ３－カンナビジオール（２－（６－イソプロペニル－３－メチル－３－シクロヘキセン－１－イル）－５－ペンチル－１，３－ベンゼンジオール）、（４）Δ３，７－カンナビジオール（２－（６－イソプロペニル－３－メチレンシクロヘキサ－１－イル）－５－ペンチル－１，３－ベンゼンジオール）、（５）Δ２－カンナビジオール（２－（６－イソプロペニル－３－メチル－２－シクロヘキセン－１－イル）－５－ペンチル－１，３－ベンゼンジオール）、（６）Δ１－カンナビジオール（２－（６－イソプロペニル－３－メチル－１－シクロヘキセン－１－イル）－５－ペンチル－１，３－ベンゼンジオール）、及び（７）Δ６－カンナビジオール（２－（６－イソプロペニル－３－メチル－６－シクロヘキセン－１－イル）－５－ペンチル－１，３－ベンゼンジオール）である。
これらの化合物は、以下に示す１つ以上の不斉中心及び２つ以上の立体異性体を有する：（１）Δ５－カンナビジオールは２つの不斉中心及び４つの立体異性体を有し、（２）Δ４－カンナビジオールは３つの不斉中心及び８つの立体異性体を有し、（３）Δ３－カンナビジオールは２つの不斉中心及び４つの立体異性体を有し、（４）Δ３，７－カンナビジオールは２つの不斉中心及び４つの異性体を有し、（５）Δ２－カンナビジオールは２つの不斉中心及び４つの立体異性体を有し、（６）Δ１－カンナビジオールは２つの不斉中心及び４つの立体異性体を有し、（７）Δ６－カンナビジオールは１つの不斉中心及び２つの立体異性体を有する。好ましい実施形態では、カンナビジオールは具体的にはΔ２－カンナビジオールである。具体的に示していない限り、「カンナビジオール」、「ＣＢＤ」もしくは「カンナビジオール」に対する、または上に言及した具体的なカンナビジオール化合物（１）～（７）のうちのいずれかに対する言及は、参照により含まれるあらゆる化合物のあらゆる可能な立体異性体を含む。一実施形態では、「Δ２－カンナビジオール」は、異種システムにおいて一部または全てが生成されたΔ２－カンナビジオール立体異性体の混合物であり得る。
「イソプレノイド」または「テルペノイド」は、１つ以上の炭素数５のイソプレン構成単位を含む任意の化合物を指し、これには直鎖及び環式テルペノイドが含まれる。本明細書中で使用する場合、「テルペン」という用語は、テルペノイド及びイソプレノイドと交換可能である。テルペンが例えば炭素鎖の酸化または転位によって化学修飾される場合、得られる化合物は総じてテルペノイドと呼称され、イソプレノイドとも呼ばれる。
テルペノイドは、炭素数５及び炭素数１０の群を基準として用いて、存在する炭素原子の数に従って命名され得る。例えば、ヘミテルペノイド（Ｃ５）は１個のイソプレン単位（半分のテルペノイド）を有し、モノテルペノイド（Ｃ１０）は２個のイソプレン単位（１個のテルペノイド）を有し、セスキテルペノイド（Ｃ１５）は３個のイソプレン単位（１．５個のテルペノイド）を有し、ジテルペノイド（Ｃ２０）は４個のイソプレン単位（または２個のテルペノイド）を有する。典型的には、モノテルペノイドはＣ１０テルペノイド前駆体ゲラニルピロホスフェート（ＧＰＰ）から天然に産生する。同様に、「環式モノテルペン」は、環式または芳香族の（つまり環構造を含む）テルペノイドを指す。それは２個のイソプレン構成単位、典型的にはＧＰＰから作られている。直鎖モノテルペンとしては、ゲラニオール、リナロール、オシメン及びミルセンが挙げられるが、これらに限定されない。環式モノテルペン（単環式、二環式及び三環式）としては、リモネン、ピネン、カレン、テルピネオール、テルピノレン、フェランドレン、ツジェン、トリシクレン、ボルネオール、サビネン及びカンフェンが挙げられるが、これらに限定されない。
「テルペノイド合成酵素」は、１つのテルペノイドまたはテルペノイド前駆体から別のテルペノイドまたはテルペノイド前駆体への変換を触媒することができる酵素を指す。例えば、ＧＰＰ合成酵素は、例えばテルペノイド前駆体ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰからのＧＰＰの形成を触媒する酵素である。同様に、ＦＰＰ合成酵素は、例えばＧＰＰ及びＩＰＰからのＦＰＰの生成を触媒する酵素である。テルペン合成酵素は、プレニルジホスフェート（例えばＧＰＰ）からイソプレノイドまたはイソプレノイド前駆体への変換を触媒する酵素である。当該用語は直鎖及び環式テルペン合成酵素を両方とも含む。
「環式テルペノイド合成酵素」は、テルペノイドまたはテルペノイド前駆体を改変して環構造をもたらす反応を触媒することができる酵素を指す。例えば、環式モノテルペノイド合成酵素は、直鎖モノテルペンを基質として使用して環式または芳香族の（環を含有する）モノテルペノイド化合物を生成することができる酵素を指す。一例は、環式モノテルペンであるサビネンを直鎖モノテルペン前駆体ＧＰＰから形成するのを触媒できるものであるサビネン合成酵素であろう。本明細書中で使用する場合、「テルペン合成酵素」という用語はテルペノイド合成酵素と交換可能である。
プレニル転移酵素またはイソプレニル転移酵素は、プレニルまたはイソプレニル合成酵素とも呼ばれるが、テルペノイドまたはイソプレノイド化合物のピロホスフェート前駆体の生成を触媒することができる酵素である。例示的なプレニル転移酵素またはイソプレニル転移酵素はｉｓｐＡであるが、これは、好適な基質の存在下でゲラニルジホスフェート（ＧＰＰ）またはファルネシルジホスフェート（ＦＰＰ）の形成を触媒することができるものである。
芳香族プレニル転移酵素は、芳香族基質へのプレニル基の転移を触媒することができる酵素である。例示的な芳香族プレニル転移酵素はＣＢＧＡＳである。別の例示的な芳香族プレニル転移酵素はＮｐｈＢである。また別の例示的な芳香族プレニル転移酵素はＣｓＰＴ４である。
「カンナビノイド合成酵素」は、以下の活性のうちの１つ以上を触媒する酵素を指す：ＣＢＧＡからＴＨＣＡ、ＣＢＤＡまたはＣＢＣＡへの環化、ＣＢＧＶＡからＴＨＣＶＡ、ＣＢＣＶＡ、ＣＢＤＶＡへの環化、ＣＢＧＡを形成するオリベトレートのプレニル化、及びそれらの組合せ。例示的なカンナビノイド合成酵素としては、Ｃａｎｎａｂｉｓ属の植物に天然に存在することが見出されるもの、例えば、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａのＴＨＣＡ合成酵素、ＣＢＤＡ合成酵素及びＣＢＣＡ合成酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
例示的なイソプレノイド、テルペノイド、カンナビノイド及びＭＥＰ経路ポリペプチド及び核酸としては、ＫＥＧＧデータベースに記載されているものが挙げられる。ＫＥＧＧデータベースは、幾多の例示的なイソプレノイド、テルペノイド、カンナビノイド、ならびにＭＥＰ経路ポリペプチド及び核酸のアミノ酸及び核酸配列を含有している（例えば、「ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／ｐａｔｈｗａｙ／ｍａｐ／ｍａｐ００１００．ｈｔｍｌ」にあるワールドワイドウェブ、及びその中の配列を参照されたく、これをもって参照によりその各々の全体を、特にイソプレノイド、テルペノイド、カンナビノイド、ならびにＭＥＰ経路ポリペプチド及び核酸のアミノ酸及び核酸配列に関して援用する）。
本明細書中で使用する場合、「異種」という用語は、天然には一緒にみられない任意の２つの成分を指す。例えば、機能可能に連結されたプロモーターに対して異種である遺伝子をコードする核酸は、その天然状態（例えば遺伝子改変されていない細胞の中）において特定ゲノム中でそれと機能可能に連結されたプロモーターによる制御がなされない発現を有している核酸である。本明細書中で提供される場合、天然に存在しないプロモーターに機能可能に連結された全ての遺伝子は「異種」とみなされる。同様に、宿主細胞に対して「異種」である遺伝子は、特定の生物の遺伝子改変されていない細胞にはみられないか、または異なるゲノムもしくは非ゲノム（例えばプラスミド）位置にみられるか、または遺伝子改変されていない細胞の中で異なるプロモーターに機能可能に連結された、遺伝子である。加えて、宿主細胞に対して「異種」であるプロモーターは、特定の生物の遺伝子改変されていない細胞にはみられないか、または異なるゲノムもしくは非ゲノム（例えばプラスミド）位置にみられるかまたは遺伝子改変されていない細胞の中で異なる核酸に機能可能に連結されたプロモーターである。
本明細書中で使用する場合、「発現カセット」は、少なくとも１つの目的遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列であって、プロモーターが少なくとも１つの機能可能に連結された遺伝子に対して異種であるか、プロモーターが、それが存在する宿主細胞に対して異種であるか、もしくは少なくとも１つの機能可能に連結された遺伝子が宿主細胞に対して異種であるか、またはそれらの組合せである、当該ポリヌクレオチド配列を指す。２つ以上のタンパク質をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含有する発現カセットについて記載した実施形態において、異なる発現カセットの中に２つ以上のタンパク質が入っている代替実施形態も企図していることは、理解される。同様に、別個の発現カセットをまとめ合わせてもよいことは理解される。典型的な実施形態では、１つ以上の、または全ての発現カセットは、１つ以上のポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む。例示的な実施形態では、異種輸送体をコードする核酸はコドン最適化されている。
「塩」は、本発明の方法に使用される化合物の酸性または塩基性塩を指す。薬学的に許容される塩の実例は、鉱酸（塩酸、臭化水素酸、リン酸など）塩、有機酸（酢酸、プロピオン酸、グルタミン酸、クエン酸など）塩、第四級アンモニウム（ヨウ化メチル、ヨウ化エチルなど）塩である。薬学的に許容される塩が無害であることは理解される。好適な薬学的に許容される塩に関するさらなる情報は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５の中に見出すことができ、参照によりこれを本明細書に援用する。
本明細書中で使用する場合、「溶媒和物」という用語は、溶媒和によって形成された化合物（溶媒分子と溶質の分子またはイオンとの組合せ）、または溶質イオンもしくは分子すなわち本発明の化合物と１つ以上の溶媒分子とからなる凝集物を意味する。水が溶媒である場合、対応する溶媒和物は「水和物」である。水和物の例としては、半水和物、一水和物、二水和物、三水和物、六水和物及び他の含水種が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、溶媒和物形態の中に化合物の薬学的に許容される塩及び／またはプロドラッグも存在する場合があることを理解するはずである。溶媒和物は、典型的には、化合物の調製の一部であるか本発明の無水化合物による自然な水分吸収によるかのどちらかである水和によって形成される。総じて、あらゆる物理的形態を本発明の範囲の中に含めることを意図する。
したがって、本発明に係る方法において作られた、または本発明に係る組成物の中に含まれた治療活性薬剤、例えば、限定されないがカンナビノイドまたはテルペノイドが、十分に酸性である、十分に塩基性である、または十分に酸性であるのみならず十分に塩基性でもある官能基をもっている場合、これらの基または複数の基はそれゆえに複数の無機または有機塩基及び無機及び有機酸のいずれかと反応して薬学的に許容される塩を形成し得る。例示的な薬学的に許容される塩としては、薬理活性化合物と鉱酸もしくは有機酸または無機塩基との反応によって調製された塩、例えば、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン－１，４－二酸塩、ヘキシン－１，６－二酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、β－ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタン－スルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン－１－スルホン酸塩、ナフタレン－２－スルホン酸塩、及びマンデル酸塩を含む塩が挙げられる。薬理活性化合物が１つ以上の塩基性官能基を有する場合、当技術分野で利用できる任意の好適な方法、例えば、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などによるかまたは有機酸、例えば、酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、ピラノシジル酸、例えばグルクロン酸もしくはガラクツロン酸、アルファヒドロキシ酸、例えばクエン酸もしくは酒石酸、アミノ酸、例えばアスパラギン酸もしくはグルタミン酸、芳香族酸、例えば安息香酸もしくはケイ皮酸、スルホン酸、例えばｐ－トルエンスルホン酸もしくはエタンスルホン酸などによる遊離塩基の処理によって、所望の薬学的に許容される塩が調製され得る。薬理活性化合物が１つ以上の酸性官能基を有する場合、当技術分野で利用できる任意の好適な方法、例えば、無機または有機塩基、例えば、アミン（第一級、第二級または第三級）、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物などによる遊離酸の処理によって、所望の薬学的に許容される塩が調製され得る。好適な塩の実例としては、アミノ酸、例えばグリシン及びアルギニン、アンモニア、第一級、第二級及び第三級アミン、及び環式アミン、例えば、ピペリジン、モルホリン及びピペラジンに由来する有機塩、ならびにナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウム及びリチウムに由来する無機塩が挙げられる。
本明細書中で使用される「組成物」は、指定された量で指定の成分を含む生成物、及び指定された量での指定の成分の配合によって得られた任意の生成物を包含することを意図する。「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤または賦形剤が製剤の他の成分との適合性を有しそのレシピエントに対して有害でないものでなければならないことを意味する。
「薬学的に許容される賦形剤」は、対象への活性薬剤の投与及び対象による吸収に役立つ物質を指す。本発明において有用となる医薬品賦形剤としては、結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング剤、甘味剤、着香剤及び着色剤が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、他の医薬品賦形剤が本発明において有用となることを認識するであろう。
場合によっては、本発明に係る方法または本発明に係る組成物に使用される化合物に保護基を含ませることがあり得る。そのような保護基の使用は、後の水和、または生体内で起こる可能性があり化合物を分解する可能性がある他の反応を防止するために行われる。保護され得る基としては、アルコール、アミン、カルボニル、カルボン酸、ホスフェート及び末端アルキンが挙げられる。アルコールを保護するのに有用な保護基としては、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、β－メトキシエトキシエチルエーテル、ジメトキシトリチル、メトキシメチルエーテル、メトキシトリチル、ｐ－メトキシベンジルエーテル、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラン、トリチル、シリルエーテル、メチルエーテル及びエトキシエチルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。アミンを保護するのに有用な保護基としては、カルボベンジルオキシ、ｐ－メトキシベンジルカルボニル、ｔ－ブチルオキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、カルバメート、ｐ－メトキシベンジル、３，４－ジメトキシベンジル、ｐ－メトキシフェニル、トシル、クロロギ酸トリクロロエチル、及びスルホンアミドが挙げられる。カルボニルを保護するのに有用な保護基としては、アセタール、ケタール、アシラール及びジチアンが挙げられる。カルボン酸を保護するのに有用な保護基としては、メチルエステル、ベンジルエステル、ｔ－ブチルエステル、２，６－二置換フェノールのエステル、シリルエステル、オルトエステル及びオキサゾリンが挙げられる。ホスフェート基を保護するのに有用な保護基としては、２－シアノエチル、及びメチルが挙げられる。末端アルキンを保護するのに有用な保護基としては、プロパルギルアルコール、及びシリル基が挙げられる。他の保護基は当技術分野において既知である。
本明細書中で使用する場合、「プロドラッグ」という用語は、投与後に生体内でいくつかの化学的または生理学的プロセスによって生物活性化合物を遊離させる前駆体化合物を指す（例えば、プロドラッグは、生理的ｐＨに達した時に、または酵素作用によって、生物活性化合物に変換される）。プロドラッグ自体は、所望の生物活性を欠いているか有しているかのどちらかであり得る。このため、「プロドラッグ」という用語は、薬学的に許容される生物活性化合物の前駆体を指す。ある場合には、プロドラッグは、プロドラッグの由来となった親化合物よりも改善された物理的及び／または送達特性を有する。プロドラッグは、哺乳動物生物において溶解性、組織適合性または遅い遊離の利点を提供することが多い（Ｈ．Ｂｕｎｄｇａｒｄ，Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８８），ｐｐ．７－９，２１－２４）。プロドラッグに関する記述は、Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏ－Ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，”ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｖｏｌ．１４、及びＥ．Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，ｅｄ．，Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ＆Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８７）の中で提供されている。プロドラッグの例示的な利点には、その物理的特性、例えば長期保存における強化された薬物安定性が含まれ得るが、これらに限定されない。
「プロドラッグ」という用語はまた、プロドラッグを対象に投与したときに生体内で活性化合物を遊離させる任意の共有結合した担体を含むことも意味する。本明細書に記載の治療活性化合物のプロドラッグは、カンナビノイド、テルペノイド、及び本発明に係る方法に使用されるか本発明に係る組成物の中に含まれる他の治療活性化合物を含めた治療活性化合物に存在している１つ以上の官能基を、修飾部が慣例的な操作あるいは生体内で切断されて親治療活性化合物が生成するような方法で修飾することによって、調製され得る。プロドラッグには、ヒドロキシ、アミノまたはメルカプト基と、活性化合物のプロドラッグを対象に投与したときに切断されてそれぞれ遊離ヒドロキシ、遊離アミノまたは遊離メルカプト基を形成する任意の基とが共有結合している化合物が含まれる。プロドラッグの例としては、アルコールのフマル酸もしくは安息香酸誘導体、または反応に使用できるアミン官能基を有する治療活性薬剤のアセトアミド、ホルムアミドもしくはベンズアミド誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、治療活性薬剤、または治療活性薬剤の薬学的に許容される形態がカルボン酸官能基を含有する場合、プロドラッグは、Ｃ１－８アルキル、Ｃ２－１２アルカノイルオキシメチル、４～９個の炭素原子を有する１－（アルカノイルオキシ）エチル、５～１０個の炭素原子を有する１－メチル－１－（アルカノイルオキシ）エチル、３～６個の炭素原子を有するアルコキシカルボニルオキシメチル、４～７個の炭素原子を有する１－（アルコキシカルボニルオキシ）エチル、５～８個の炭素原子を有する１－メチル－１－（アルコキシカルボニルオキシ）エチル、３～９個の炭素原子を有するＮ－（アルコキシカルボニル）アミノメチル、４～１０個の炭素原子を有する１－（Ｎ－（アルコキシカルボニル）アミノ）エチル、３－フタリジル、４－クロトノラクトニル、ガンマ－ブチロラクトン－４－イル、ジ－Ｎ，Ｎ（Ｃ１－Ｃ２）アルキルアミノ（Ｃ２－Ｃ３）アルキル（例えば（３－ジメチルアミノエチル）、カルバモイル－（Ｃ１－Ｃ２）アルキル、Ｎ，Ｎ－ジ（Ｃ１－Ｃ２）アルキルカルバモイル－（Ｃ１－Ｃ２）アルキル、及びピペリジノ－、ピロリジノ－、またはモルホリノ（Ｃ２－Ｃ３）アルキルなどの基によってカルボン酸基の水素原子を置き換えることによって形成されたエステルを含み得る。
同様に、開示される化合物または当該化合物の薬学的に許容される形態がアルコール官能基を含有する場合、プロドラッグは、（Ｃ１－Ｃ６）アルカノイルオキシメチル、１－（（Ｃ１－Ｃ６））アルカノイルオキシ）エチル、１－メチル－１－（（Ｃ１－Ｃ６）アルカノイルオキシ）エチル（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシカルボニルオキシメチル、Ｎ（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシカルボニルアミノメチル、スクシノイル、（Ｃ１－Ｃ６）アルカノイル、α－アミノ（Ｃ１－Ｃ４）アルカノイル、アリールアシル、及びα－アミノアシル、または天然に存在するＬ－アミノ酸から各α－アミノアシル基が独立して選択されるα－アミノアシル－α－アミノアシル、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ１－Ｃ６）アルキル）２またはグリコシル（炭水化物のヘミアセタール形態のヒドロキシ基の除去によって得られるラジカル）などの基によってアルコール基の水素原子を置き換えることによって形成され得る。
開示される化合物または当該化合物の薬学的に許容される形態がアミン官能基を組み込んでいる場合、プロドラッグは、Ｒ及びＲ’を各々独立して（Ｃ１－Ｃ１０）アルキル、（Ｃ３－Ｃ７）シクロアルキル、ベンジルとした、またはＲ－カルボニルを天然α－アミノアシルもしくは天然α－アミノアシル－天然α－アミノアシルとした、Ｒ－カルボニル、ＲＯ－カルボニル、ＮＲＲ’－カルボニル、Ｙ１をＨ、（Ｃ１－Ｃ６）アルキルまたはベンジルとしたＣ（ＯＨ）Ｃ（Ｏ）ＯＹ１、Ｙ２を（Ｃ１－Ｃ４）アルキルとしＹ３を（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、カルボキシ（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、アミノ（Ｃ１－Ｃ４）アルキル、またはモノ－Ｎもしくはジ－Ｎ，Ｎ（Ｃ１－Ｃ６）アルキルアミノアルキルとしたＣ（ＯＹ２）Ｙ３、Ｙ４をＨまたはメチルとしＹ５をモノ－Ｎもしくはジ－Ｎ，Ｎ（Ｃ１－Ｃ６）アルキルアミノ、モルホリノ、ピペリジン－１－イルまたはピロリジン－１－イルとしたＣ（Ｙ４）Ｙ５などの基によってアミン基中の水素原子を置き換えることによって形成され得る。
プロドラッグ系統の使用については、Ｔ．Ｊａｒｖｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ” ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｓ．Ｃ．Ｇａｄ，ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，２００５），ｃｈ．１７，ｐｐ．７３３－７９６に記載されている。プロドラッグ構築及び使用のための他の代替物は当技術分野において既知である。本発明に係る方法または医薬組成物がカンナビノイド、テルペノイドまたは他の治療活性薬剤のプロドラッグを使用するかまたは含む場合、化合物のプロドラッグ及び活性代謝産物は、当技術分野で知られている慣例的な技術を用いて同定され得る。例えば、Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４０，２０１１－２０１６（１９９７）、Ｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８６（７），７６５－７６７、Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．，３４，２２０－２３０（１９９５）、Ｂｏｄｏｒ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，１３，２２４－３３１（１９８４）、Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、Ｌａｒｓｅｎ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ－Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９１）、Ｄｅａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，７４８，２８１－２９３（２０００）、Ｓｐｒａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＆Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，１０，６０１－６０５（１９９２）、及びＰｒｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｘｅｎｏｂｉｏｌ．，３，１０３－１１２（１９９２）を参照されたい。
ＯＭＰスーパーファミリーポリン、例えばＯｒｐＤファミリーポリン、例えばｐｐ３６５６、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーター、芳香族プレニル転移酵素、カンナビノイド合成酵素及び／または非メバロン酸経路構成要素などのポリペプチドを開示または特許請求する本明細書の中で使用する場合、列挙されたポリペプチドの相同分子種を代替的に企図していることは理解されよう。
カンナビノイド
カンナビノイドは、皮膚を含めたヒトの身体の全体にわたって細胞内のカンナビノイド受容体を活性化させることが知られている化学物質群である。フィトカンナビノイドは、アサ属植物に由来するカンナビノイドである。それらは、植物から単離さることもあるし、または合成的に生産されることもある。エンドカンナビノイドは、ヒトの身体にみられる内因性カンナビノイドである。古典的フィトカンナビノイドは、ベンゾピラン部分を保有するＡＢＣ三環式テルペノイド化合物である。
カンナビノイドは、細胞の表面に存在するカンナビノイド受容体と相互作用することによってその作用を働かせる。今日までに、ＣＢ１受容体とＣＢ２受容体との２種類のカンナビノイド受容体が同定されている。これらの２つの受容体は、約４８％のアミノ酸配列同一性を共有しており、異なる組織に分布しており、また、異なるシグナル伝達機序を有してもいる。それらはまた、作動薬及び拮抗薬に対する感受性が異なってもいる。
かくして、カンナビノイドの生体内での生産のための遺伝子、プロモーター、ヘルパー経路構成要素及び発現カセットをスクリーニングするため、同定するため、作るため及び使用するための試験管内及び生体内での方法を本明細書に記載する。
典型的には、本明細書に記載の方法及び組成物は、宿主細胞における１つ以上のカンナビノイドの生産もしくは増進された生産、または宿主細胞における１つ以上のカンナビノイド前駆体の生産のために用いられ得る。場合によっては、カンナビノイドまたはその前駆体は、精製され得、（例えば、プロドラッグ、溶媒和物もしくは塩を形成するために、または目的カンナビノイドを前駆体から形成するために）誘導体化され得、及び／または医薬組成物に製剤化され得る。
本発明の方法に従って及び／または組成物を使用して生産され得るカンナビノイドは、限定されないが、フィトカンナビノイドを含む。場合によっては、カンナビノイドには、カンナビノール、カンナビジオール、Δ９－テトラヒドロカンナビノール（Δ９－ＴＨＣ）、合成カンナビノイドＨＵ－２１０（６ａＲ，１０ａＲ）－９－（ヒドロキシメチル）－６，６－ジメチル－３－（２－メチルオクタン－２－イル）－６Ｈ，６ａＨ，７Ｈ，１０Ｈ，１０ａＨ－ベンゾ［ｃ］イソクロメン－１－オール）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、カンナビクロメバリン（ＣＢＣＶ）、カンナビゲロール（ＣＢＧ）、カンナビゲロバリン（ＣＢＧＶ）、カンナビエルソイン（ＣＢＥ）、カンナビシクロール（ＣＢＬ）、カンナビバリン（ＣＢＶ）及びカンナビトリオール（ＣＢＴ）が含まれるが、これらに限定されない。さらに他のカンナビノイドとしては、テトラヒドロカンナビバリン（ＴＨＣＶ）及びカンナビゲロールモノメチルエーテル（ＣＢＧＭ）が挙げられる。さらなるカンナビノイドとしては、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）、Δ９－テトラヒドロカンナビノール酸（ＴＨＣＡ）及びカンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）が挙げられ、これらのさらなるカンナビノイドは、それらの構造におけるカルボン酸基の存在を特徴とする。
さらに他のカンナビノイドとしては、ナビロン、リモナバント、ＪＷＨ－０１８（ナフタレン－１－イル－（１－ペンチルインドール－３－イル）メタノン）、ＪＷＨ－０７３ナフタレン－１－イル－（１－ブチルインドール－３－イル）メタノン、ＣＰ－５５９４０（２－［（１Ｒ，２Ｒ，５Ｒ）－５－ヒドロキシ－２－（３－ヒドロキシプロピル）シクロヘキシル］－５－（２－メチルオクタン－２－イル）フェノール）、ジメチルヘプチルピラン、ＨＵ－３３１（３－ヒドロキシ－２－［（１Ｒ）－６－イソプロペニル－３－メチル－シクロヘキサ－２－エン－１－イル］－５－ペンチル－１，４－ベンゾキノン）、ＳＲ１４４５２８（５－（４－クロロ－３－メチルフェニル）－１－［（４－メチルフェニル）メチル］－Ｎ－［（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）－１，３，３－トリメチルビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル］－１Ｈ－ピラゾール－３－カルボキサミド）、ＷＩＮ５５，２１２－２（（１１Ｒ）－２－メチル－１１－［（モルホリン－４－イル）メチル］－３－（ナフタレン－１－カルボニル）－９－オキサ－１－アザトリシクロ［６．３．１．０４，１２］ドデカ－２，４（１２），５，７－テトラエン）、ＪＷＨ－１３３（（６ａＲ，１０ａＲ）－３－（１，１－ジメチルブチル）－６ａ，７，１０，１０ａ－テトラヒドロ－６，６，９－トリメチル－６Ｈ－ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン）、レボナトラドール、及びＡＭ－２２０１（１－［（５－フルオロペンチル）－１Ｈ－インドール－３－イル］－（ナフタレン－１－イル）メタノン）が挙げられる。他のカンナビノイドとしては、Δ８－テトラヒドロカンナビノール（Δ８－ＴＨＣ）、１１－ヒドロキシ－Δ９－テトラヒドロカンナビノール、Δ１１－テトラヒドロカンナビノール、及び１１－ヒドロキシ－テトラカンナビノールが挙げられる。
別の代替形態において、これらのカンナビノイドの類縁体または誘導体は、カンナビノイド前駆体の生成、及び例えば合成的手段によるさらなる誘導体化によって得られ得る。合成カンナビノイドとしては、Ａｔｔａｌａ ｅｔ ａｌ．による米国特許第９，３９４，２６７号、Ｈｅｒｋｅｎｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．による米国特許第９，３７６，３６７号、Ｇｉｊｓｅｎ ｅｔ ａｌ．による米国特許第９，２８４，３０３号、Ｔｒａｖｉｓによる米国特許第９，１７３，８６７号、Ｆｕｌｐ ｅｔ ａｌ．による米国特許第９，１３３，１２８号、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．による米国特許第８，７７８，９５０号、Ａｄａｍ－Ｗｏｒｒａｌｌ ｅｔ ａｌ．による米国特許第７，７００，６３４号、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．による米国特許第７，５０４，５２２号、Ｂａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．による米国特許第７，２９４，６４５号、Ｋｒｕｓｅ ｅｔ ａｌ．による米国特許第７，１０９，２１６号、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．による米国特許第６，８２５，２０９号、及びＭｉｔｔｅｎｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．による米国特許第６，２８４，７８８号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
別の代替形態において、カンナビノイドは、エンドカンナビノイドまたはその誘導体もしくは類縁体であり得る。エンドカンナビノイドとしては、アナンダミド、２－アラキドノイルグリセロール、２－アラキドニルグリセリルエーテル、Ｎ－アラキドノイルドパミン、及びビロダミンが挙げられるが、これらに限定されない。エンドカンナビノイドの複数の類縁体も、７，１０，１３，１６－ドコサテトラエノイルエタノールアミド、オレアミド、ステアロイルエタノールアミド、及びホモ－γ－リノレノイルエタノールアミンを含めて知られている。
本発明に係る方法及び組成物で生産されたカンナビノイドは、ＣＢ２カンナビノイド受容体に対して選択的であるか、２つのカンナビノイド受容体に対して非選択的でありＣＢ１カンナビノイド受容体またはＣＢ２カンナビノイド受容体のどちらでも結合するかのどちらかであり得る。場合によっては、本発明に係る方法及び組成物で生産されたカンナビノイドは、ＣＢ２カンナビノイド受容体に対して選択的である。場合によっては、カンナビノイド、またはカンナビノイドの混合物の中のカンナビノイドの１つは、ＣＢ２の拮抗薬（例えば選択的または非選択的拮抗薬）である。場合によっては、本発明に係る方法及び組成物で生産されたカンナビノイドは、ＣＢ２カンナビノイド受容体に対して選択的である。場合によっては、カンナビノイド、またはカンナビノイドの混合物の中のカンナビノイドの１つは、ＣＢ１の拮抗薬（例えば選択的または非選択的拮抗薬）である。
発現カセット
１つ以上の目的遺伝子を宿主細胞に発現させるのに適した発現カセットを本明細書に記載する。本明細書に記載の発現カセットは、プラスミドの構成要素であり得るか、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれ得る。単一のプラスミドは、１つ以上の本明細書に記載の発現カセットを含有し得る。２つ以上の発現カセットについて記載している本明細書中で使用する場合、代替的に２つ以上の発現カセットのうちの少なくとも２つをまとめ合わせて発現カセットの数を減らしてもよいことは理解される。同様に、複数の目的遺伝子を、単一のプロモーターに機能可能に連結されたものとして記載しており、したがって単一の発現カセットの構成要素として記載している場合、単一の発現カセットを、単一の記載された発現カセットの重複するまたは重複しないサブセットを含有する２つ以上の発現カセットに細分してもよいことは理解される。
本明細書に記載の発現カセットは、当技術分野で知られている好適なプロモーターを含有し得る。場合によっては、プロモーターは恒常的プロモーターである。他の例では、プロモーターは誘導性プロモーターである。原核生物宿主での、またはそれに使用するための好ましい実施形態において、プロモーターは、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔｒｃプロモーター、Ｌａｃプロモーター、Ｔａｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、ｔｉｐプロモーター、λＰＬプロモーター、λＰＲプロモーター、λＰＲＰＬプロモーター、アラビノースプロモーター（ａｒａＢＡＤ）などである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｐｔ．２００７，ｐ．５７１１－１５に記載のプロモーターからなる群から選択され、これをもって参照によりその全体を、特に本明細書に記載の目的対象の核酸の発現、目的遺伝子、宿主細胞及びそれらの組合せのためのプロモーター、プラスミドを含めた発現カセットに関して援用する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｚａｓｌａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６ Ａｕｇ；３（８）：６２３－８に記載のＥ．ｃｏｌｉプロモーターからなる群から選択され、これをもって参照によりその全体を、特に本明細書に記載の関心対象の核酸の発現、目的遺伝子、宿主細胞及びそれらの組合せのためのプロモーター、プラスミドを含めた発現カセットに関して援用する。様々な宿主細胞における１つ以上の目的遺伝子の発現を促すのに有用なプロモーターは多数あり、当業者によく知られている（例えば、ＷＯ２００４／０３３６４６、Ｕ．Ｓ．８，５０７，２３５、Ｕ．Ｓ．８，７１５，９６２、及びＷＯ２０１１／０１７７９８、ならびにその中で引用されている参考文献を参照されたく、これをもって参照によりそれらの各々の全体を、特に本明細書に記載の関心対象の核酸の発現、目的遺伝子、宿主細胞及びそれらの組合せのためのプロモーター、プラスミドを含めた発現カセットに関して援用する）。
本明細書に記載の方法及び組成物は、機能性異種輸送体、例えば、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーター（例えばｐｃａＫ）、またはＯＭＰスーパーファミリーポリン、例えばＯｐｒＤファミリーのポリン（例えばｐｐ３６５６）の発現のために用いられ得る。本明細書に記載の方法及び組成物はさらに、機能性芳香族プレニル転移酵素の発現のために用いられ得る。場合によっては、本明細書に記載の方法及び組成物はさらに、例えば非メバロン酸経路を介して例えば二機能性ｉｓｐＤＦ酵素及び／または二機能性ｉｓｐＤＥ酵素の発現によってプレニル供与体の生成量を増加させるために用いられ得る。本明細書に記載の方法及び組成物はさらに、機能性カンナビノイド合成酵素、例えばＴＨＣＡＳ及び／またはＣＢＤＡＳの発現のために用いられ得る。
典型的には、機能性ＴＨＣＡＳ及び／またはＣＢＤＡＳは、１つ以上のヘルパー経路構成要素、及び／または１つ以上のヘルパー経路の１つ以上の構成要素の共発現によってもたらされる。
異種輸送体は、宿主における発現のために改変され得る。例えば、１つ以上の膜貫通またはシグナルペプチドドメインを、切断してもよいし、または宿主細胞における発現に適合した膜貫通もしくはシグナルペプチドドメインの代わりに使用してもよい。さらに、またはあるいは、１つ以上のグリコシル化部位を（例えば主要アミノ酸配列の突然変異によって）欠失させてもよい。同様に、天然の宿主においてその天然タンパク質の分子内ジスルフィド結合にみられる１つ以上または全てのシステインを例えばセリンに突然変異させてもよい。同様に、天然の宿主においてその天然タンパク質の分子間ジスルフィド結合にみられる１つ以上または全てのシステインを例えばセリンに突然変異させてもよい。
本明細書に記載の方法及び組成物は、異種輸送体の、及び場合によっては芳香族プレニル転移酵素の、発現と組み合わせて、好適な（例えば原核生物）宿主細胞におけるＧＰＰ合成酵素の発現のために用いられ得る。例えば、宿主細胞は、ＧＰＰ合成酵素をコードする異種核酸に機能可能に連結されたプロモーターを有する発現カセットを含み得る。
本明細書に記載の方法及び組成物は、異種輸送体の、及び場合によっては芳香族プレニル転移酵素の、発現と組み合わせて、好適な（例えば原核生物）宿主細胞におけるＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子の発現のために用いられ得る。いくつかの実施形態では、遺伝子コピー数の増幅、及び／または内因性遺伝子（またはそのコピー）を強い恒常的もしくは誘導性異種プロモーターに機能可能に連結することによる、宿主細胞の１つ以上の内因性構成要素の過剰発現によって、ＭＥＰ経路流束が増大する。したがって、一実施形態では、ＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットが提供される。Ｅ．ｃｏｌｉにおいては、内因性ＭＥＰ経路遺伝子は、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ及びｉｄｉである。
場合によっては、発現カセットのプロモーターは、ＭＥＰ経路の２つ以上の遺伝子をコードする核酸に機能可能に連結される。場合によっては、発現カセットのプロモーターは、ＭＥＰ経路の３つ以上の遺伝子をコードする核酸に機能可能に連結される。場合によっては、発現カセットのプロモーターは、ＭＥＰ経路の４つ、５つ、６つもしくは全ての内因性遺伝子、またはそのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくは全ての相同分子種をコードする核酸に機能可能に連結される。場合によっては、発現カセット内に提供されるＭＥＰ経路の遺伝子は、原核生物遺伝子である。場合によっては、発現カセット内に提供されるＭＥＰ経路の遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子である。場合によっては、発現カセット内に提供されるＭＥＰ経路の遺伝子の１つ以上は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉに対して異種である遺伝子である。場合によっては、ＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子は第１発現カセット内に提供され、ＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子は第２発現カセット内に提供される。好ましい実施形態では、ｄｘｓに機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットが提供される。
場合によっては、ＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子をコードし、さらにＧＰＰ合成酵素、カンナビノイド合成酵素もしくはイソプレン合成酵素またはその機能性断片をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットが提供される。場合によっては、ＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子をコードし、さらにＴＨＣＡ合成酵素またはその機能性断片をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットが提供される。場合によっては、ＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子をコードし、さらにＣＢＧＡ合成酵素またはその機能性断片をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットが提供される。場合によっては、ＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子をコードし、さらにＣＢＤＡ合成酵素またはその機能性断片をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットが提供される。場合によっては、ＭＥＰ経路の１つ以上の遺伝子をコードし、さらにＮｐｈＢまたはその機能性断片をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットが提供される。
いくつかの実施形態では、二機能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含有する発現カセットが提供される。ｉｓｐＤＦ遺伝子は、宿主細胞における天然ｉｓｐＤ及び／またはｉｓｐＦの過剰発現に加えて、またはその代替として使用され得る。場合によっては、核酸は、以下のアミノ酸配列（配列番号５）を有するｉｓｐＤＦタンパク質をコードする：
ＭＩＡＬＱＲＳＬＳＭＨＶＴＡＩＩＡＡＡＧＥＧＲＲＬＧＡＰＬＰＫＱＬＬＤＩＧＧＲＳＩＬＥＲＳＶＭＡＦＡＲＨＥＲＩＤＤＶＩＶＶＬＰＰＡＬＡＡＡＰＰＤＷＩＡＡＳＧＲＶＰＡＶＨＶＶＳＧＧＥＲＲＱＤＳＶＡＮＡＦＤＲＶＰＡＱＳＤＶＶＬＶＨＤＡＡＲＰＦＶＴＡＥＬＩＳＲＡＩＤＧＡＭＱＨＧＡＡＩＶＡＶＰＶＲＤＴＶＫＲＶＤＰＤＧＥＨＰＶＩＴＧＴＩＰＲＤＴＩＹＬＡＱＴＰＱＡＦＲＲＤＶＬＧＡＡＶＡＬＧＲＳＧＶＳＡＴＤＥＡＭＬＡＥＱＡＧＨＲＶＨＶＶＥＧＤＰＡＮＶＫＩＴＴＳＡＤＬＤＱＡＲＱＲＬＲＳＡＶＡＡＲＩＧＴＧＹＤＬＨＲＬＩＥＧＲＰＬＩＩＧＧＶＡＶＰＣＤＫＧＡＬＧＨＳＤＡＤＶＡＣＨＡＶＩＤＡＬＬＧＡＡＧＡＧＮＶＧＱＨＹＰＤＴＤＰＲＷＫＧＡＳＳＩＧＬＬＲＤＡＬＲＬＶＱＥＲＧＦＴＶＥＮＶＤＶＣＶＶＬＥＲＰＫＩＡＰＦＩＰＥＩＲＡＲＩＡＧＡＬＧＩＤＰＥＲＶＳＶＫＧＫＴＮＥＧＶＤＡＶＧＲＧＥＡＩＡＡＨＡＶＡＬＬＳＥＳ。
他の実施形態では、ｉｓｐＤＦ核酸は、配列番号５と同一であるかまたはそれに関して少なくとも３２％、４０％、４５％、５０％、５２％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の同一性を有するｉｓｐＤＦタンパク質をコードする。
場合によっては、二機能性ｉｓｐＤＦは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰ１０２０、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰ１０２０、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ Ｊ９９ ｊｈｐ０４０４、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰＡＧ１ ＨＰＡＧ１＿０４２７、Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ ＨＨ１５８２、Ｈ．ａｃｉｎｏｎｙｃｈｉｓ Ｓｈｅｅｂａ株Ｈａｃ＿１１２４、Ｗ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ １７４０ ＷＳ１９４０、Ｓ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ １２５１ Ｓｕｄｅｎ＿１４８７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ亜種ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８ Ｃｊ１６０７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＲＭ１２２１ ＣＪＥ１７７９、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ亜種ｊｅｊｕｎｉ ８１－１７６ ＣＪＪ８１１７６＿１５９４、及びＣ．ｆｅｔｕｓ亜種ｆｅｔｕｓ ８２－４０ ＣＦＦ８２４０＿０４０９の少なくとも３００連続アミノ酸との同一性が７５％以下である主要アミノ酸配列を有する。場合によっては、二機能性ｉｓｐＤＦは、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰ１０２０、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰ１０２０、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ Ｊ９９ ｊｈｐ０４０４、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ ＨＰＡＧ１ ＨＰＡＧ１＿０４２７、Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ ＨＨ１５８２、Ｈ．ａｃｉｎｏｎｙｃｈｉｓ Ｓｈｅｅｂａ株Ｈａｃ＿１１２４、Ｗ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ １７４０ ＷＳ１９４０、Ｓ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＤＳＭ １２５１ Ｓｕｄｅｎ＿１４８７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ亜種ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８ Ｃｊ１６０７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＲＭ１２２１ ＣＪＥ１７７９、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ亜種ｊｅｊｕｎｉ ８１－１７６ ＣＪＪ８１１７６＿１５９４、またはＣ．ｆｅｔｕｓ亜種ｆｅｔｕｓ ８２－４０ ＣＦＦ８２４０＿０４０９ではない。
例示的なｉｓｐＤＦ二機能性酵素は本明細書に記載されている。二機能性ｉｓｐＤＦ酵素のさらなる例としては、下表に示されるものが挙げられるが、これらに限定されない：
Figure 2022523992000002
Figure 2022523992000003
Figure 2022523992000004
例示的なｉｓｐＤＦ酵素には、さらには、本明細書に示されるｉｓｐＤＦ酵素配列（例えば、ＩｓｐＤＦ１、ＩｓｐＤＦ２またはＩｓｐＤＦ３）との少なくとも８０％の同一性（または８５％、または９０％、または９５％、または９９％、または１００％の同一性）を有するｉｓｐＤＦ酵素が含まれる。さらなる例示的なｉｓｐＤＦ酵素としては、上記表中に示されるｉｓｐＦドメイン配列と少なくとも８０％同一である（または８５％、または９０％、または９５％、または９９％、または１００％同一である）ｉｓｐＦドメインを有するｉｓｐＤＦ酵素が挙げられる。さらなる例示的なｉｓｐＤＦ酵素としては、上記表中に示されるｉｓｐＤドメイン配列と少なくとも８０％同一である（または８５％、または９０％、または９５％、または９９％、または１００％同一である）ｉｓｐＤドメインを有するｉｓｐＤＦ酵素が挙げられる。
二機能性ｉｓｐＤＦは、プラスミド中の核酸にコードされ得る。あるいは、二機能性ｉｓｐＤＦは、異種宿主細胞のゲノムに組み込まれた核酸にコードされ得る。場合によっては、異種プロモーターが、二機能性ｉｓｐＤＦをコードする核酸に機能可能に連結される。さらに、またはあるいは、宿主細胞は、二機能性ｉｓｐＤＦをコードする核酸に対して異種であり得る。二機能性ｉｓｐＤＦ酵素、及び例えば宿主細胞（例えば原核細胞宿主細胞）におけるカンナビノイド生産におけるその使用方法は例えばＰＣＴ／ＣＡ２０１８／０５１０７４に記載されており、その内容全体をあらゆる目的のために援用する。
二機能性ｉｓｐＤＦをコードする核酸は、ＭＥＰ経路発現カセット、例えばＭＥＰ経路遺伝子をコードする核酸を含有する上記発現カセットのいずれか１つの中にあり得る。場合によっては、二機能性ｉｓｐＤＦをコードする核酸は、カンナビノイド合成酵素をコードする核酸を含有する発現カセットの中にあり得る。場合によっては、二機能性ｉｓｐＤＦをコードする核酸は、ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸を含有する発現カセットの中にあり得る。場合によっては、二機能性ｉｓｐＤＦをコードする核酸は、イソプレン合成酵素をコードする核酸を含有する発現カセットの中にあり得る。
いくつかの実施形態では、二機能性ｉｓｐＤＥ酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含有する発現カセットが提供される。ｉｓｐＤＥ遺伝子は、宿主細胞における天然ｉｓｐＤ及び／またはｉｓｐＦ及び／または異種ｉｓｐＤＦの過剰発現に加えて、またはその代替として使用され得る。場合によっては、核酸は、リンカーを介して天然ｉｓｐＥアミノ酸配列またはその機能性断片と融合した天然ｉｓｐＤアミノ酸配列またはその機能性断片を有するｉｓｐＤＦタンパク質をコードする。
例示的なｉｓｐＤＥ二機能性酵素は本明細書に記載される。二機能性ｉｓｐＤＥ酵素のさらなる例としては、下表に示されるもの（リンカー配列は太字下線部である）が挙げられるが、これらに限定されない：
Figure 2022523992000005
例示的なｉｓｐＤＥ酵素には、さらには、本明細書に示されるｉｓｐＤＥ酵素配列（例えば配列番号１０）との少なくとも８０％の同一性（または８５％、または９０％、または９５％、または９９％、または１００％の同一性）を有するｉｓｐＤＥ酵素が含まれる。さらなる例示的なｉｓｐＤＥ酵素としては、上記表中に示されるｉｓｐＥドメイン配列と少なくとも８０％同一である（または８５％、または９０％、または９５％、または９９％、または１００％同一である）ｉｓｐＥドメインを有するｉｓｐＤＥ酵素が挙げられる。さらなる例示的なｉｓｐＤＥ酵素としては、上記表中に示される（例えばリンカー配列を除く）ｉｓｐＤドメイン配列と少なくとも８０％同一である（または８５％、または９０％、または９５％、または９９％、または１００％同一である）ｉｓｐＤドメインを有するｉｓｐＤＥ酵素が挙げられる。さらなる例示的なｉｓｐＤＥ酵素としては、リンカー配列を含む上記表中に示されるｉｓｐＤドメイン配列と少なくとも８０％同一である（または８５％、または９０％、または９５％、または９９％、または１００％同一である）ｉｓｐＤドメインを有するｉｓｐＤＥ酵素が挙げられる。
二機能性ｉｓｐＤＥは、プラスミド中の核酸にコードされ得る。あるいは、二機能性ｉｓｐＤＥは、異種宿主細胞のゲノムに組み込まれた核酸にコードされ得る。場合によっては、異種プロモーターが、二機能性ｉｓｐＤＥをコードする核酸に機能可能に連結される。さらに、またはあるいは、宿主細胞は、二機能性ｉｓｐＤＥをコードする核酸に対して異種であり得る。
いくつかの実施形態では、ｉｓｐＥＦ二機能性酵素、またはそのようなｉｓｐＥＦ二機能性酵素をコードする核酸が提供される。例示的なｉｓｐＥＦ二機能性酵素としては、下表に示されるもの、及び下表に記載のｉｓｐＥＦ酵素配列との８０％の同一性（または８５％、または９０％、または９５％、または９９％、または１００％の同一性）を有するｉｓｐＥＦ二機能性酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
Figure 2022523992000006
さらなる例示的なｉｓｐＥＦ酵素としては、上記表中に示されるｉｓｐＦドメイン配列と少なくとも８０％同一である（または８５％、または９０％、または９５％、または９９％、または１００％同一である）ｉｓｐＦドメインを有するｉｓｐＥＦ酵素が挙げられる。さらなる例示的なｉｓｐＥＦ酵素としては、上記表中に示されるｉｓｐＥドメイン配列と少なくとも８０％同一である（または８５％、または９０％、または９５％、または９９％、または１００％同一である）ｉｓｐＥドメインを有するｉｓｐＥＦ酵素が挙げられる。
二機能性ｉｓｐＥＦは、プラスミド中の核酸にコードされ得る。あるいは、二機能性ｉｓｐＥＦは、異種宿主細胞のゲノムに組み込まれた核酸にコードされ得る。場合によっては、異種プロモーターが、二機能性ｉｓｐＤＦをコードする核酸に機能可能に連結される。さらに、またはあるいは、宿主細胞は、二機能性ｉｓｐＥＦをコードする核酸に対して異種であり得る。
場合によっては、核酸は、Ｅ．ｃｏｌｉ天然ｉｓｐＤアミノ酸配列の機能性断片と少なくとも３２％、４０％、４５％、５０％、５２％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一である、または同一であるｉｓｐＤアミノ酸配列を有するｉｓｐＤＥタンパク質をコードする。場合によっては、核酸は、Ｅ．ｃｏｌｉ天然ｉｓｐＥアミノ酸配列の機能性断片と少なくとも３２％、４０％、４５％、５０％、５２％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一である、または同一であるｉｓｐＥアミノ酸配列を有するｉｓｐＤＥタンパク質をコードする、またはさらにコードする。
場合によっては、ｉｓｐＤＥタンパク質をコードする核酸は、ｉｓｐＥドメインとｉｓｐＤドメインとの間の柔軟なペプチドリンカーをコードする。場合によっては、柔軟なリンカーは長さが６～１５アミノ酸である。場合によっては、柔軟なリンカーは長さが７～１２アミノ酸である。場合によっては、柔軟なリンカーは、ＧＯＲアルゴリズム、バージョンＩＶによって予測したとき、少なくとも６５％または少なくとも７０％のランダムコイル形成を含む。
二機能性ｉｓｐＤＥは、プラスミド中の核酸にコードされ得る。あるいは、二機能性ｉｓｐＤＥは、異種宿主細胞のゲノムに組み込まれた核酸にコードされ得る。場合によっては、異種プロモーターが、二機能性ｉｓｐＤＥをコードする核酸に機能可能に連結される。さらに、またはあるいは、宿主細胞は、二機能性ｉｓｐＤＥをコードする核酸に対して異種であり得る。
本明細書に記載のｉｓｐＤＥ二機能性酵素は、イソプレンを生成するのに有用であり得る。本明細書に記載のｉｓｐＤＥ二機能性酵素は、１つ以上のテルペノイド、例えば、ヘミテルペノイド、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、インドールジテルペン、トリテルペノイド、環式テルペノイド及び直鎖テルペノイドを生成するのに有用であり得る。例示的なテルペノイド生成物としては、リコペン、ゲラニオール、リナロール、オシメン及びミルセン、タキソール、リモネン、ピネン、カレン、テルピネオール、テルピノレン、フェランドレン、ツジェン、トリシクレン、ボルネオール、サビネン、またはカンフェンが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載のｉｓｐＤＥ二機能性酵素は、タキソール及び／またはタキソール誘導体を生成するのに有用であり得る。本明細書に記載のｉｓｐＤＥ二機能性酵素は、ステロイド、Ｎ－グリカン、カロテノイド、ユビキノン、ゼアチン及び／またはポリプレノールを生成するのに有用であり得る。
いくつかの実施形態では、二機能性ＭＥＰ経路酵素は、柔軟なリンカーペプチドをｉｓｐＤドメインまたはその機能性断片とｉｓｐＥドメインまたはその機能性断片との間に含む。いくつかの実施形態では、柔軟なリンカーは、ＳＬＧＧＧＧＳＡＡＡの配列を含む。場合によっては、リンカー配列は、ＧＯＲアルゴリズム、バージョンＩＶ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９９６ Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｅｄ．，ｖｏｌ ２６６，５４０－５５３）によって決定したとき、６５％より高いランダムコイル形成を有する。場合によっては、ｉｓｐＤＥタンパク質をコードする核酸は、ｉｓｐＥドメインとｉｓｐＤドメインとの間の柔軟なペプチドリンカーをコードする。場合によっては、柔軟なリンカーは長さが６～１５アミノ酸である。場合によっては、柔軟なリンカーは長さが７～１２アミノ酸である。場合によっては、柔軟なリンカーは、ＧＯＲアルゴリズム、バージョンＩＶによって予測したとき、少なくとも６５％または少なくとも７０％のランダムコイル形成を含む。
一態様において、本明細書に記載の二機能性ｉｓｐＤＥ酵素の１つ以上は、例えば宿主細胞内の、発現カセット内の核酸にコードされ得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の二機能性ｉｓｐＤＥ酵素は宿主細胞に異種発現する。場合によっては、１つ以上の二機能性ｉｓｐＤＥ酵素は、同じまたは異なる発現カセット内のＭＥＰ経路の１つ以上の構成要素と共発現する。ＭＥＰ経路構成要素としては、例えば、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ及びｉｄｉが挙げられる。いくつかの実施形態では、二機能性ｉｓｐＤＥ酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットは、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ及びｉｄｉからなる群から選択される１つ以上のＭＥＰ経路酵素をさらに含む。一実施形態では、二機能性ｉｓｐＤＥ酵素に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットは、ｄｘｓ、ｉｓｐＦ及びｉｄｉをさらに含む。一実施形態では、二機能性ｉｓｐＤＥ経路酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットは、国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１８／０５１０７４号に記載されているような二機能性ｉｓｐＤＦ酵素をさらに含み、参照によりその開示内容は本明細書に明示的に援用される。
場合によっては、１つ以上の二機能性ｉｓｐＤＥ酵素は、同じまたは異なる発現カセット内の１つ以上の芳香族プレニル転移酵素と共発現する。場合によっては、１つ以上の二機能性ｉｓｐＤＥ酵素は、同じまたは異なる発現カセット内の１つ以上のカンナビノイド合成酵素と共発現する。いくつかの実施形態では、本発明は、カンナビノイド合成酵素（例えば、ＣＢＤＡＳまたはＴＨＣＡＳ、好ましくはＣＢＤＡＳ）及び二機能性ｉｓｐＤＥ酵素の宿主細胞における異種発現のための発現カセットまたは発現カセットのシステムを提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上の二機能性ｉｓｐＤＥ酵素、及び限定はしないがイソプレン合成酵素またはリコペン合成酵素を含めた１つ以上のテルペノイド合成酵素の、宿主細胞における異種発現のための発現カセットまたは発現カセットのシステムを提供する。いくつかの実施形態では、発現カセットまたは発現カセットのシステムは、リコペン合成経路の１つ以上の構成要素（例えば、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＩ及び／またはｃｒｔＢ）、ジテルペン合成酵素、セスキテルペン合成酵素またはモノテルペン合成酵素をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットまたは発現カセットのシステムは、カレン合成酵素、ミルセン合成酵素またはリモネン合成酵素をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現カセットまたは発現カセットのシステムは、任意選択的に、リコペン合成経路の構成要素（例えば、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＩ及び／またはｃｒｔＢ）、イソプレン合成酵素、ＧＰＰ合成酵素（例えば、ｉｓｐＡ、または植物由来ＧＰＰ合成酵素）、モノテルペン合成酵素及び／またはカンナビノイド合成酵素を含む。
場合によっては、１つ以上の二機能性ｉｓｐＤＥ酵素は、同じまたは異なる発現カセット内の１つ以上の芳香族プレニル転移酵素及び１つ以上のカンナビノイド合成酵素（例えばＣＢＤＡＳ及び／またはＴＨＣＡＳ）と共発現する。いくつかの実施形態では、カンナビノイド合成酵素は、ＣａｎｎａｂｉｓのＣＢＧＡ合成酵素からなる群から選択される。
二機能性ｉｓｐＤＥをコードする核酸は、ＭＥＰ経路遺伝子をコードする核酸を含有する上記発現カセットのいずれか１つなどのＭＥＰ経路発現カセットの中にあり得る。場合によっては、二機能性ｉｓｐＤＥをコードする核酸は、カンナビノイド合成酵素をコードする核酸を含有する発現カセットの中にあり得る。場合によっては、二機能性ｉｓｐＤＥをコードする核酸は、ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸を含有する発現カセットの中にあり得る。場合によっては、二機能性ｉｓｐＤＥをコードする核酸は、イソプレン合成酵素をコードする核酸を含有する発現カセットの中にあり得る。
本明細書に記載の方法及び組成物は、好適な（例えば原核生物）宿主細胞においてＭＥＰ経路で産生された前駆体からのＧＰＰの生産ために使用され得、ＧＰＰは芳香族プレニル転移酵素のプレニル供与体基質であり、芳香族酸は芳香族プレニル転移酵素のプレニル受容体である。かくして、いくつかの実施形態では、ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットが提供される。ＧＰＰ合成酵素は、ＭＥＰ経路の遺伝子をコードする核酸も含有する発現カセットの中にあり得る。さらに、またはあるいは、ＧＰＰ合成酵素は、カンナビノイド合成酵素をコードする核酸も含有する発現カセットの中にあり得る。場合によっては、ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸に機能可能に連結された発現カセットのプロモーターは、カンナビノイド合成酵素にも機能可能に連結されている。さらに、またはあるいは、ＧＰＰ合成酵素は、イソプレン合成酵素をコードする核酸も含有する発現カセットの中にあり得る。
宿主細胞
上記発現カセットのいずれか及びその組合せは、好適な宿主細胞の中に導入され得、目的代謝産物、例えばカンナビノイドまたはプレニル化芳香族酸の生産のために使用され得る。好適な宿主細胞としては、原核生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐａｎｔｅｏａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属の原核生物が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい原核生物宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｐａｎｔｅｏａ ｃｉｔｒｅａ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、宿主細胞は真核生物宿主細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発現カセットは、１つ以上の目的遺伝子（例えば、ＭＦＳ芳香族酸アンチポーター（例えばｐｃａＫ）、ＯＭＰスーパーファミリーポリン、ＯｐｒＤファミリーポリン（例えばｐｐ３６５６）、芳香族プレニル転移酵素、ＭＥＰ経路遺伝子、カンナビノイド合成酵素遺伝子、ｉｓｐＡ、ｉｓｐＳ、ｉｓｐＤＦ、またはＧＰＰ合成酵素）をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーター（例えば異種プロモーター）を含み、１つ以上の目的遺伝子をコードする核酸は、発現カセットを含む宿主細胞にコドン最適化されている。
場合によっては、宿主細胞は、ＭＥＰ経路の１つ以上の生成物、例えばＤＭＡＰＰ及び／またはＩＰＰを含む。例えば、本明細書に記載のＭＥＰ経路発現カセットを含有する宿主細胞は、ＭＥＰ経路発現カセットを含有しない宿主細胞と比較して、増加した量のＭＥＰ経路生成物、例えばＤＭＡＰＰ及び／またはＩＰＰを含み得る。
場合によっては、宿主細胞は、ＭＥＰ経路の下流の１つ以上の生成物を含み得る。例えば、ＧＰＰ合成酵素発現カセットを含む宿主細胞は、ＧＰＰ合成酵素発現カセットがない宿主細胞と比較して、増加した量のＧＰＰを含み得る。別の例を挙げると、イソプレン合成酵素発現カセットを含む宿主細胞は、イソプレン合成酵素発現カセットがない宿主細胞と比較して、増加した量のイソプレンを含み得る。
さらに別の例を挙げると、カンナビノイド合成酵素発現カセットを含む宿主細胞は、異種輸送体またはその機能性断片をコードする異種核酸を含有する発現カセットがない宿主細胞と比較して、増加した量のカンナビノイドを含み得る。場合によっては、カンナビノイドはＣＢＧＡである。場合によっては、カンナビノイドはＣＢＣＡである。場合によっては、カンナビノイドはＣＢＤＡである。場合によっては、カンナビノイドはＴＨＣＡである。場合によっては、カンナビノイドはＣＢＮＡであるかまたはＣＢＮである。場合によっては、カンナビノイドはＣＢＤである。場合によっては、カンナビノイドはＴＨＣである。場合によっては、カンナビノイドはＣＢＣである。場合によっては、カンナビノイドはＴＨＣＶである。場合によっては、カンナビノイドはＣＢＤＶである。場合によっては、カンナビノイドはＣＢＣＶである。
同様に、発現カセットからの発現を誘導するのに適した条件の下で宿主細胞を培養した場合、宿主細胞は、非誘導性条件と比較して、増大した量の、宿主細胞内の発現カセットにコードされる１つ以上の酵素の生成物を含み得る。例えば、誘導されたときに宿主細胞は、誘導物質の非存在下で培養された同じ宿主細胞と比較して、増大した細胞内量の、異種輸送体の芳香族酸基質、または増加した細胞内蓄積速度の芳香族酸基質を含み得る。別の例を挙げると、誘導されたときに宿主細胞は、誘導物質の非存在下で培養された同じ宿主細胞と比較して、増大した量の、または増加した生成速度の、芳香族プレニル転移酵素の生成物を含み得る。別の例を挙げると、誘導されたときに宿主細胞は、誘導物質の非存在下で（例えば、ＩＰＴＧ、アラビノースなどの非存在下で）培養された同じ宿主細胞と比較して、増加したＤＭＡＰＰ及び／またはＩＰＰを呈し得る。別の例を挙げると、誘導されたときに宿主細胞は、誘導物質の非存在下で（例えば、ＩＰＴＧ、アラビノースなどの非存在下で）培養された同じ宿主細胞と比較して、増加したＧＰＰを呈し得る。別の例を挙げると、誘導されたときに宿主細胞は、誘導物質の非存在下で（例えば、ＩＰＴＧ、アラビノースなどの非存在下で）培養された同じ宿主細胞と比較して、増加したイソプレンを呈し得る。別の例を挙げると、誘導されたときに宿主細胞は、誘導物質の非存在下で（例えば、ＩＰＴＧ、アラビノースなどの非存在下で）培養された同じ宿主細胞と比較して、増加したカンナビノイドを呈し得る。
いくつかの実施形態では、宿主細胞はオリベトレート（ＯＡ）を含む。ＯＡは、ＯＡを含有する培地の中で宿主細胞を培養することによって宿主細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞はジバリン酸（ＤＶＡ）を含む。ＤＶＡは、ＤＶＡを含有する培地の中で宿主細胞を培養することによって宿主細胞に導入され得る。典型的な実施形態では、ＯＡ及び／またはＤＶＡは、異種輸送体の基質である。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＰ経路を通る流束を減少させる内在性酵素をコードする１つ以上の遺伝子の発現を欠失または減少させるように、遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＰ経路を通る流束を減少させる内因性酵素の量または活性を欠失または減少させるように、遺伝子改変されている。例えば、ピルベート、及びグリセルアルデヒド－３ホスフェート（Ｇ３Ｐ）は、ＭＥＰ経路ｄｘｓの最初の酵素の基質である。ピルベート及びＧ３Ｐを消費する内在経路は、ピルベート及びＧ３Ｐの量を増加させるように改変され得、かくして、ＭＥＰ経路を通る流束が増大し得る。場合によっては、ａｃｋＡ－ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｌｄｈＡ、ｄｌｄ、ａｄｈＥ、ｐｐｓ及びａｔｏＤＡからなる群から選択される１つ以上の宿主細胞内在性遺伝子または遺伝子産物を改変してピルベートまたはＧ３Ｐレベルを上昇させる。
培養方法
本発明は、さらには、誘導条件下、好適な培地の中で本発明に係る宿主細胞を培養して目的代謝生成物の産生をもたらすプロセスを提供する。目的代謝生成物は、カンナビノイド、テルペノイド、またはその前駆体であり得る。方法は、使用済み培地中及び／または宿主細胞内の代謝産物を濃縮することを含み得る。
生産された微生物は、所望の有機化学化合物を生産する目的のために、連続的に－例えばＷＯ０５／０２１７７２に記載されているように－あるいは回分式プロセス（バッチ培養）または流加もしくは反復流加プロセスで非連続的に培養され得る。既知の培養方法についての一般的性質の概要は、Ｃｈｍｉｅｌによる教本（ＢｉｏｐｒｏｚｅＢｔｅｃｈｎｉｋ．１：Ｅｉｎｆｉｉｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ（Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１））またはＳｔｏｒｈａｓによる教本（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ（Ｖｉｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４））から入手することができる。
使用される培養培地または発酵培地は、好適な様式で各々の株の要求を満たしていなければならない。様々な微生物のための培養培地については、“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）において説明がなされている。培養培地という用語と、発酵培地という用語は、交換可能である。
炭素源として、糖及び炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、廃糖蜜、甜菜またはサトウキビ加工由来のスクロース含有液、澱粉、澱粉加水分解物及びセルロースなど；油及び脂肪、例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油脂など；脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノレン酸など；アルコール、例えば、グリセロール、メタノール及びエタノールなど；ならびに有機酸、例えば酢酸または乳酸などを使用することが可能である。
窒素源として、有機窒素含有化合物、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、黄粉及び尿素；または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムを使用することが可能である。窒素源は、個別に、または混合物として使用され得る。
リン源として、リン酸、リン酸二水素カリウム、またはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩を使用することが可能である。
培養培地は、例えば、金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム及び鉄の塩化物または硫酸塩の形態で、成長に必要とされる塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などをさらに含んでいてもよい。最後に、上記物質に加えてアミノ酸などの必須成長因子、例えばホモセリン及びビタミン、例えば、チアミン、ビオチンまたはパントテン酸を採用してもよい。
上記出発物質は単一回分の形態で培養物に添加してもよいし、または培養中に好適な様式で供給してもよい。
培養物のｐＨは、塩基性化合物、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水；または酸性化合物、例えばリン酸もしくは硫酸を好適な様式で採用することによって制御され得る。ｐＨは大抵６．０～８．５、好ましくは６．５～８の値に調整される。発泡を制御するには消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルなどを採用することが可能である。プラスミドの安定性を維持するには、好適な選択物質、例えば抗生物質などを培地に添加することが可能である。培養は好ましくは好気性条件下で行う。これらの条件を維持するためには、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば空気などを培養物中に導入する。過酸化水素に富む液体を使用することが同様に可能である。培養は、適当と認められる場合には、高圧、例えば０．０３～０．２ＭＰａの高圧で行われる。培養物の温度は、通常、２０～４５℃、好ましくは２５～４０℃、特に好ましくは３０～３７℃である。回分または流加プロセスでは、回収するに足りる量の所望の有機化学化合物が形成されるまで培養を継続することが好ましい。この目的は通常、１０～１６０時間以内（例えば１０～７２時間以内、１０～４８時間以内、１０～２４時間以内、または１０～１６時間以内）に達成される。連続プロセスでは、より長い培養時間が可能である。微生物の活動の結果、発酵培地及び／または上記微生物の細胞の中に有機化学化合物が濃縮（蓄積）される。
好適な培養培地の例は、とりわけ、ＵＳ５，７７０，４０９、ＵＳ５，９９０，３５０、ＵＳ５，２７５，９４０、ＷＯ２００７／０１２０７８、ＵＳ５，８２７，６９８、ＷＯ２００９／０４３８０３、ＵＳ５，７５６，３４５、及びＵＳ７，１３８，２６６の中に見つかり得る。
培養中に濃度を１回以上（複数可）決定するための目的代謝生成物の分析は、クロマトグラフィー、好ましくは逆相クロマトグラフィーの手段で代謝産物を分離することによって起こり得る。
検出は、測光法（吸収、蛍光）で行われ得る。
濃度（単位体積あたりの形成された目的代謝生成物）、収率（消費された単位炭素源あたりの形成された目的代謝生成物）、形成（単位体積及び単位時間あたりの形成された目的代謝生成物）及び固有形成（単位細胞乾燥物もしくは単位乾燥バイオマスあたり及び単位時間あたりの目的代謝生成物、または単位細胞タンパク質あたり及び単位時間あたりの形成された化合物）、あるいは他のプロセスパラメータ、ならびにその組合せからなる群から選択されるパラメータの１つ以上に関して、本発明に係る１つ以上の発現カセットを含有する宿主細胞を使用する培養方法の能力は、本発明に係る発現カセットを含有しない宿主細胞を使用する培養方法を基準として少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％向上し得る。これは、大規模な工業プロセスに関して非常に価値があると考えられる。
そうして、目的代謝生成物を含有する生成物が液体または固体の形態でもたらされ得る、または生成し得る、または回収され得る。
使用済み培地は、宿主細胞がある期間にわたってある温度で培養された培養培地を意味する。培養中に採用される培養培地または培地（複数可）は、所望の目的代謝生成物の生成ならびに典型的には増殖及び生存能力を確実にするあらゆる物質または成分を含む。したがって、培養が完了すると、得られる使用済み培地は、ａ）微生物のバイオマス（細胞塊）であって、当該微生物の細胞の増殖によって生成した当該バイオマス、ｂ）培養中に形成された所望の目的代謝生成物、ｃ）培養中に形成される可能性がある有機副生成物、及びｄ）採用された培養培地の、または出発物質の、培養時に消費されなかった構成物質、例えば、ビオチンなどのビタミン、もしくは硫酸マグネシウムなどの塩などを含む。
有機副生成物は、培養時に採用された微生物によって特定の所望の化合物に加えて産生され場合によっては分泌される物質を含む。使用済み培地は、培養容器または発酵タンクから取り出され得、適当と認められる場合には採取され得、液体または固体形態の目的代謝生成物を含有する生成物を提供するために使用され得る。最も単純な例では、発酵タンクから取り出された、目的代謝生成物を含有する使用済み培地自体が、回収された生成物を構成する。
場合によっては、目的代謝生成物（例えば、テルペノイド、カンナビノイドまたはその前駆体）を回収することは、限定はされないが、ａ）水を部分的に（０％超～８０％未満）～全て（１００％）または実質的に全て（８０％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超または９９％超）除去すること；ｂ）バイオマスを部分的に（０％超～８０％未満）～全て（１００％）または実質的に全て（８０％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超または９９％超）除去することであって、場合によっては後者を除去前に不活性化させること；ｃ）培養中に形成された有機副生成物を部分的に（０％超～８０％未満）～全て（１００％）または実質的に全て（８０％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、９９．３％超または９９．７％超）除去すること；及びｄ）採用された発酵培地の、または出発物質の、培養時に消費されなかった構成物質を使用済み培地から部分的に（０％超）～全て（１００％）または実質的に全て（８０％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、９９．３％超または９９．７％超）除去することからなる群から選択される手段の１つ以上を含み、所望の目的代謝生成物の濃縮または精製を成し遂げる。場合によっては、目的代謝生成物は細胞内で生成し、培養された本発明の宿主細胞の溶解を含めた方法によって回収される。場合によっては、目的代謝生成物を回収する方法は、培養された本発明の宿主細胞の溶解物を提供すること、及び目的代謝生成物を溶解物から単離することを含む。それによって、上記目的代謝生成物の所望の含有量を有する組成物が単離される。培養された宿主細胞を溶解させることは、例えば、宿主細胞を使用済み培地から単離した後に実施され得る。
水を部分的に（０％超～８０％未満）～全て（１００％）または実質的に全て（８０％超～１００％未満）除去すること（手段ａ））を乾燥ともいう。
プロセスの１つの変化形態では、水、バイオマス、有機副生成物、及び採用された発酵培地の未消費構成物質を全てまたは実質的に全て除去することで、所望の目的代謝生成物の純粋な（８０重量％超、９０重量％超）または高純度の（９５重量％超、９７重量％超、または９９重量％超）生成物形態が得られる。手段ａ）のための多くの技術的説明書が当技術分野において入手可能である。
要件に応じて、バイオマスは、例えば、遠心分離、濾過、デカンテーションまたはそれらの組合せなどの分離方法によって使用済み培地から全てまたは部分的に除去され得るか、または全てその中に入ったままにされ得る。適当と認められる場合には、バイオマス、またはバイオマスを含有する使用済み培地を、好適なプロセス工程中に例えば熱処理（加熱）によってまたはアルカリもしくは酸の添加によって不活性化させる。
ある手順においては、バイオマスは、調製された生成物の中にバイオマスが全く残らない（０％）か、または多くても３０％、多くても２０％、多くても１０％、多くても５％、多くても１％もしくは多くても０．１％残るように、全てまたは実質的に全て除去され得る。さらなる手順においては、バイオマスは、調製された生成物の中に全て（１００％）、または７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９９％超もしくは９９．９％超のバイオマスが残るように、除去されないかまたはほんの小さな割合でだけ除去される。したがって、本発明に係るあるプロセスでは、バイオマスは０％超～１００％未満の割合で除去される。最後に、発酵後に得られた発酵ブロスは、最終生成物の取扱特性を改善すべくバイオマスの完全または部分的な除去の前または後に無機酸、例えば、塩酸、硫酸もしくはリン酸など、または有機酸、例えばプロピオン酸などによって酸性ｐＨに調整され得る（例えば、ＧＢ１，４３９，７２８またはＥＰ１３３１２２０を参照されたい）。全てのバイオマスを含有する発酵ブロスを酸性化することは同様に可能である。最後に、重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＣ０３、ＧＢ１，４３９，７２８）または別の塩、例えば亜硫酸のアンモニウム、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を添加することによってブロスの安定化も行われ得る。
バイオマスの除去中に、使用済み培地中に存在する任意の有機または無機固体が部分的にまたは全て除去され得る。使用済み培地中に溶解している有機副生成物、及び溶解している未消費の発酵培地の構成物質（出発物質）は、生成物中に少なくとも部分的に（０％超）、場合によっては少なくとも２５％程度、場合によっては少なくとも５０％程度、及び場合によっては少なくとも７５％程度残り得る。適当と認められる場合には、それらも生成物中に全て（１００％）、または９５％超もしくは９８％超もしくは９９％超の意味で実質的に全て残される。
続いて、既知の方法によって、例えば、回転式蒸発装置、薄膜式蒸発装置、液膜降下式蒸発装置の使用、逆浸透圧法またはナノ濾過によって、水が使用済み培地から除去され得る、または上記使用済み培地が濃厚化もしくは濃縮され得る。その後、この濃縮された使用済み培地は、凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧造粒の方法、または他の例えばＰＣＴ／ＥＰ２００４／００６６５５に記載されている循環流動化床でのようなプロセスによって後処理されて、流動生成物、特に微粉末または好ましくは粗顆粒となり得る。
参考文献
以下の刊行物をこの参照により本明細書に援用する。これらの刊行物は本明細書中では以下に示す番号によって言及される。この刊行物一覧における任意の刊行物の包含は、本明細書中で言及される任意の刊行物が先行技術であると認めるものとみなされるべきではない。
・ＪＡＭＡ．２００６；２９５（７）：７６１－７７５
・Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ，２０１２，３，１－１１
・Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００４ ８８，９０９－９１５．
・Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２，２９８（５５９９），１７９０－３．
・Ｓｏｎａｌ Ｒ．Ａｙａｋａｒ（２０１９），Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｔｅｒｐｅｎｏｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ
実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおける芳香族プレニル転移酵素基質輸送体発現
クローニング：
２つの異なる輸送体ＰｃａＫ及びＰＰ３６５６をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０からＰＣＲによって増幅し、プラスミドにｐＴｒｃプロモーター下にクローニングした。その後、このプラスミドをその発現のためにＢＬ２１ ＤＥ３に形質転換し、ＢＬ２１ ＤＥ３の中に芳香族化合物を輸送するために使用した。
種菌培養物の作製
予め（ＢＬ２１ ＤＥ３細胞、及びプラスミドｐＴｒｃ－ＰｃａＫまたはｐＴｒｃ－ＰＰ３６５６を含有するＢＬ２１ ＤＥ３細胞の）グリセロール原液によって画線しておいた寒天プレートから、単一のコロニーを採取し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含んだＬＢ培地（５ｍｌ）の中で（一晩、プラスミドを含有するＢＬ２１ＤＥ３）［典型的には１６時間］３７℃で成長させた。
接種、誘導及び発現
一晩経た種菌培養物を新鮮な５ｍｌのＬＢ培地にＯＤ６００＝０．１で接種し、３７℃でＯＤ６００が０．６に達するまで成長させた［典型的にはそれは２．５～３時間を要する］。プラスミドを含有するＢＬ２１ ＤＥ３の場合、１００μＭのＩＰＴＧで細胞培養物を誘導した。その後、両方の細胞に０．１ｍＭのオリベトレートを供給し、３０℃及び／または２２℃で６時間、２４時間及び４８時間成長させた。
培養：
その後［典型的には１４～１６時間後］、一晩経た培養物を３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって細胞を採集した。細胞ペレットを使用して溶解させたか、または－８０℃で一晩保って保存した。上清をＨＰＬＣ分析のために－２０℃で保存した（上清１）。
細胞の溶解：
５ｍＬの培養物からのペレット全体を３００μｌの溶解用緩衝液（溶解用緩衝液組成：５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１０％のグリセロール、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １００、１００μｇ／ｍｌのリゾチーム、１ｍＭのＰＭＳＦ、ＤＮアーゼ３Ｕ、２ｍＭのＭｇＣｌ２）に再懸濁させること、及び後にプローブ型超音波処理装置を使用して細胞ペレットを超音波処理することによって、細胞を溶解させた。細胞溶解の間は常に、溶解用緩衝液中に再懸濁された細胞ペレットを氷上に維持し、超音波処理は（氷上で１５秒のパルスと３０秒の休止とのサイクルで）１０サイクル行った。溶解後、１４０００ｒｐｍで２０分間、４℃での遠心分離によって粗製細胞溶解物の上清を採取した。上清をＨＰＬＣ分析のために使用した、または－８０℃で保存した（上清２）。
ＨＰＬＣ分析：
上清１を０．１μｍのフィルターで濾過し、濾液のうち３００μＬをＨＰＬＣ分析のために使用した。上清２を１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上部の透明な上清のうち３００μＬをＨＰＬＣ分析のために使用した。Ｆｌｅｘａｒ ＰＤＡ ｐｌｕｓ多波長検出器及びＣｈｒｏｍｅｒａソフトウェアを備えたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＨＰＬＣでＨＰＬＣ分析を実施した。ＨＰＬＣ分析の条件は以下のとおりである：
・ＨＰＬＣカラム：ＬＵＮＡ ＯＭＥＧＡ ３μｍ Ｐｏｌａｒ Ｃ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ）
・移動相：７５％のＡＣＮ、２５％の水、０．１％のギ酸
・流速：１ｍｌ／分
・検出波長：２３０及び２７０ｎｍ
・オーブン温度：２５℃
・注入体積：１０μＬ
・分析時間：１８分
結果を図５～７に示す。
実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉにおける芳香族プレニル転移酵素基質輸送体発現及びカンナビノイド産生
種菌培養物の作製
以下の実験宿主細胞を試験した：（１）アラビノース誘導性輸送体ｐｃａＫまたはｐｐ３６５６をコードするプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ、ならびに（２））アラビノース誘導性輸送体ｐｃａＫまたはｐｐ３６５６をコードするプラスミド、及び（ｉｓｐＤＦ１酵素、ＧＰＰＳ、及び最適化変異体ＮｐｈＢ（Ｖａｌｌｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．参照）をコードするＢ５プラスミドによって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ。
グリセロール原液からの（１）の種菌培養物を、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含んだ５ｍＬのＬＢに接種し、３０℃で一晩インキュベートする。グリセロール原液からの（２）の種菌培養物を、３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含んだ５ｍＬのＬＢに接種し、３０℃で一晩インキュベートする。
接種、誘導及び発現：
種菌培養物からの（１）の誘導培養物を、０．１ｍＭのＯＡを含んだ総培養体積５ｍＬのＴＢ培地に接種し、ＯＤ６００が０．８になるまで３０℃で培養した。アラビノース及びマグネシウムを添加して５ｍＭのアラビノース及び５ｍＭのＭｇＣｌ２の終濃度とすることによって培養物を誘導した。誘導の間、培養物を３０℃でインキュベートした。誘導開始後２４時間目及び４８時間目の時点で誘導培養物試料を採取した。
種菌培養物からの（２）の誘導培養物を、０．５ｍＭのＯＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含んだ総培養体積５ｍＬのＴＢ培地に接種し、ＯＤ６００が０．８になるまで３０℃で培養した。アラビノースを添加することで５ｍＭのアラビノースの終濃度としＩＰＴＧを添加することで１００μＭの終濃度とすることによって培養物を誘導した。誘導の間、培養物を３０℃でインキュベートした。誘導開始後２４時間目及び４８時間目の時点で誘導培養物試料を採取した。
ＯＡまたはＣＢＧＡの抽出：
培養物をまず３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してペレット及び培養培地上清画分を分離した。ペレットにはＰＢＳによる２回の洗浄も行った。細胞ペレットをＢ－ＰＥＲ完全試薬で製造者のプロトコールに従って溶解させた。手短に述べると、ペレットをＢ－ＰＥＲに再懸濁させ、２５℃で２０分間インキュベートし、１４０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離で不溶物質を降下させた。可溶性物質を細胞溶解物として貯蔵した。細胞溶解物の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって分析した。図４を参照されたい。
ＯＡを細胞溶解物から抽出するために、酢酸エチルを可溶性溶解物画分に１：１の体積比で添加し、激しく混合した。１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって有機及び水性画分を分離した。ｓｐｅｅｄ ｖａｃｕｕｍを使用して有機相を蒸発除去し、分析のためにＨＰＬＣ移動相（７５％のＡＣＮ、２５％の水、０．１％のギ酸）中に再懸濁させた。分析結果を図８に示す。
ＣＢＧＡを細胞溶解物から抽出するために、酢酸エチルを培養培地上清に１：１の体積比で添加し、激しく混合した。１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって有機及び水性画分を分離した。ｓｐｅｅｄ ｖａｃｕｕｍを使用して有機相を蒸発除去し、分析のためにＨＰＬＣ移動相（７５％のＡＣＮ、２５％の水、０．１％のギ酸）中に再懸濁させた。分析結果を図９に示す。
結論：
異種芳香族プレニル転移酵素と、芳香族プレニル転移酵素の基質（例えばオリベトレート）を細胞内に輸送できる輸送体とが発現している宿主細胞は、外来的に適用された芳香族プレニル転移酵素基質（例えばオリベトレート）を含有する培地の中で培養された場合、芳香族プレニル転移酵素の１つ以上の生成物の産生の増加を呈する。図１～４及び図８～９を参照されたい。
実施例３：ｉｓｐＤＥ発現及び分析
導入
Ｅ．ｃｏｌｉのＭＥＰ経路を通る流束が経路遺伝子の妨害によって非常に小さいことがＥ．ｃｏｌｉにおいて致死的であることが、報告された６３，６４。Ｄｘｓ触媒段階の下流側の経路は、ＭＶＡ経路の律速的酵素の異種発現によって補完されることができる６５。Ｄｘｓ欠失は、ビタミンＢ６及びＢ１の生合成におけるその役割ゆえに、ＭＶＡ経路によって補完されることができない３０。これに対し、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰはｔ－ＲＮＡ６６及びキノン６７のプレニル化に必須である。
本明細書中に述べられているように、ＭＥＰは、より高い理論収率で機能し、ＭＶＡ経路よりも熱力学的に有利である２３。実験的に観察されたＭＥＰ経路収率は理論最大値とはかけ離れている。ＭＥＰ経路は、最適化に際してイソプレノイド生合成のための最も堅牢な異種基幹を生み出すために用いられ得る。
ＭＥＰ経路のための前駆体供給の改善
ＧＡＰ及びピルベートは、炭素中心代謝に関与する解糖経路からの代謝産物である。解糖系を通る流束を改善する取組みは、糖取込み速度を向上させる試みが限界であった６８－７０。グルコース輸送体がより活性なものにされたので解糖経路の様々な段階がそれらの代謝制御を失った７１。フルクトース－１，６－ジホスフェートからＤＨＡＰ及びＧＡＰへの変換の熱力学は平衡を基質側へと押す７２。ＤＨＡＰ及びＧＡＰの異性体化はＤＨＡＰの方が有利である。いくつかの成功した取組みは、流束をイソペンテノール産生のためにペントースホスフェート経路及びＥＤ経路へ向かわせることであった７３。ＧＡＰとピルベートとの分配は、流束をＭＥＰ経路へと差し向ける上で役割を有し、ＧＡＰからピルベートへの流束の向け変えは下流におけるリコペン産生に改善をもたらす７４。同研究は、ＧＡＰ及びピルベートを供給することが流束を実質的に変化させないことも報告した。
ＭＥＰ経路最適化
ゲノム配列決定、ゲノムマイニング、プロテオミクス、メタボロミクス及びバイオインフォマティックツールの改良は、より広い用途を見つけるための代謝工学の分野を提供してきた。
よく研究されている方略は、代謝工学のツールによる最適化である。相同ＭＥＰ経路の狭窄部分の異種過剰発現は、末端イソプレノイド生成物の合成を大幅に増強することが証明された。４つの遺伝子－ｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ及びｉｄｉの過剰発現は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタキソール収率を向上させることが示された２４。これに対し、ｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ及びｉｓｐＨの過剰発現は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいてリコペン収率を１５倍向上させた７５。
ＭＥＰ流束は、より活性が高い異種ＭＥＰ経路酵素の発現によって上方制御され得る。これは、単一の酵素、または経路の骨組み全体の取り替えを必要とする。遺伝子導入Ｌａｖａｎｄｕｌａ ｌａｔｉｆｏｌｉａにおいてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＤｘｓを発現させることで５倍高い総テルペノイド収率がもたらされた７６。
ＭＥＰ経路に関与する遺伝子は恒常的プロモーターによって制御される。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて、強力なプロモーターＰｔｕｆによるｄｘｓプロモーターの染色体交換は、６０％向上したＤｘｓ活性、及び倍増したリコペン産生量を実現した４７。
流束の限界の原因は、これらの因子のうちの１つ以上にある：低い活性、低い安定性、低い発現レベル、低い溶解性、フィードバック調節または毒性。これらの酵素を突然変異によって遺伝子レベルで改変する方策が試みられた。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、Ｄｘｓ、Ｄｘｒ及びＩｄｉの指向的共進化は６０％の向上をもたらした７７。
Ｄｘｓ、ＩｓｐＧ、ＩｓｐＨ及びＩＤＩは、低い溶解性、及び過剰発現時の不活性封入体に悩まされる。それらの溶解性の向上は活性の増強につながるであろう。インキュベーション温度を低くすること、シャペロンタンパク質との共発現、及びタンパク質突然変異誘発は、ともすれば不溶性となるタンパク質の溶解性を向上させる。成長培地にベタイン及びソルビトールを補充する別の方策は、Ｄｘｓの溶解性を６０％上昇させた。これはＭＥＰ経路流束の総合的改善にもつながった７８。
融合ＩｓｐＤＦ酵素の出現は、α及びεプロテオバクテリアゲノムにおいてはよくあることであるが、β及びγプロテオバクテリアゲノムにおいてはそうでない７９。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ７９、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ８０、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ８１からＩｓｐＤＦが単離され詳細に研究されている。
二機能性遺伝子はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉから初めて単離されたが７９、その産物（ｃｊＩｓｐＤＦ、４２ｋＤａのポリペプチド）は、ＩｓｐＤ及びＩｓｐＦによって個別に行われる２つの反応をそれぞれ３．９μｍｏｌ．ｍｇ－１．ｍｉｎ－１及び０．８μｍｏｌ．ｍｇ－１．ｍｉｎ－１の速度で行った。ｃｊＩｓｐＤＦは、Ｅ．ｃｏｌｉのＩｓｐＦとの類似性（およそ４８％）がｉｓｐＤ（およそ２５％）よりも高かった。１３Ｃ標識ＭＥＰを採用して試験管内で組換えＥ．ｃｏｌｉからの精製Ｈｉｓタグ付きタンパク質と反応させるとＣＤＰ－ＭＥが生み出され、補因子としてＺｎ＋２イオンを添加すると最高速度（１８．５μｍｏｌ．ｍｇ－１．ｍｉｎ－１）が得られてｐＨ５でのＣＴＰ及びＭＥＰのＫｍ値がそれぞれ３μＭ及び２０μＭであった。ＡＴＰの存在は、ｐＨ８でＣａ＋２を補因子としてＣＤＰ－ＭＥＰのＫｍ値が１９μＭとなる最も高い活性でＭＥｃＰＰの形成をもたらしたときに、ＩｓｐＥを添加するまで反応速度論を変化させなかった。ｃｊＩｓｐＤＦにおいて、ＩｓｐＤ及びＩｓｐＦサブユニットの２つの触媒中心の間の推定最短距離は約３８Åである。ｃｊＩｓｐＤＦは、サイズ排除クロマトグラフィーで分析した場合に三量体、六量体及び十二量体として存在することが報告されたが７９、これに対し、結晶構造は六量体である６２。それはまた、各ドメインにおいて２つの明瞭なドメインがリンカー配列によって繋げられていることも示している。六量体型集合体はＩｓｐＤドメイン二量体の三量体を２つ含有し、ＩｓｐＦドメイン三量体の三量体を２つ含有する。この六量体型複合体では、対応する二量体ＩｓｐＤドメインのＩｓｐＦドメインの１つは会合して三量体を形成している。これは、同じ二機能性ポリペプチドの個々のドメインが会合しないことを意味している。
別のよく研究されているＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ（ｍｌＩｓｐＤＦ）由来の二機能性ＩｓｐＤＦをＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させて、同じくＩｓｐＤ及びＩｓｐＦの両方の触媒活性を呈することが見出された８０。ＩｓｐＤサブユニットは、Ｅ．ｃｏｌｉのＩｓｐＤとの４６％の類似性を有していたが、これに対し、ＩｓｐＦサブユニットはＥ．ｃｏｌｉのＩｓｐＦとの４４％の類似性を有していた。タンパク質試料のサイズ排除クロマトグラフィーによってｍｌＩｓｐＤＦの単量体単位及び二量体型複合体の存在が示された。より高次の分子複合体は観察されなかった。
３組の組合せについて、単量体型Ｅ．ｃｏｌｉ酵素に関する実験が実施され沈降速度法によって分析された：（ａ）ＩｓｐＤとＩｓｐＥ；（ｂ）ＩｓｐＥとＩｓｐＦ；及び（ｃ）ＩｓｐＤとＩｓｐＥとＩｓｐＦ。これらの研究から、３つのＩｓｐＤ二量体と、３つのＩｓｐＥ二量体と、２つのＩｓｐＦ三量体との集合体が明らかになった６２。同研究から、ＩｓｐＤＦからのドメインＩｓｐＤ及びＩｓｐＦがＩｓｐＥと会合して巨大複合体を形成し６２、基質チャネリングを助けることが明らかになった。このことはｃｊＩｓｐＤＦ及びａｔＩｓｐＤＦ８１（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＩｓｐＤＦ）の両方において報告された。ＩｓｐＤ二量体及びＩｓｐＥ二量体の三量体はＩｓｐＦ三量体の二量体と複合体を形成して１８個の触媒中心の集合体を形成する。ａｔＩｓｐＤＦも、より高い分子量比で会合することが検出された。ｃｊＩｓｐＤＦの場合、同多量体の２つの触媒中心の間の距離はＩｓｐＤサブユニットについては３５Åであり、ＩｓｐＦサブユニットについては３０Åであり、これはｃｊＩｓｐＤＦの２つの触媒中心の間の距離よりも短い。
他方、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓから単離されたＩｓｐＤＦ及びＩｓｐＥ（それぞれａｔＩｓｐＤＦ及びａｔＩｓｐＥ）に対して同様の研究８０が行われた。沈降速度実験に基づくと、これらの酵素は、会合することが見出されなかった。試験管内条件においてＡ１５２Ａ点突然変異によるａｔＩｓｐＥの不活性形態を添加することによってさらなる検証確認が行われた。不活性ＩｓｐＥは、ａｔＩｓｐＤＦ及びａｔＩｓｐＥカスケードによるＭＥＰからＭＥｃＰＰへの変換の反応経路を変化させなかった。酵素が会合して基質チャネリングを容易にしたのであれば突然変異ＩｓｐＥは複合体と相互作用して反応の全体速度を減少させたはずである。活性部位が基質をチャネリングしない融合体の他の例。ペプチドグリカン生合成に関与するＥ．ｃｏｌｉ由来のＧｌｍＵ酵素は、経路の連続段階を触媒する二機能性酵素であるが、しかしながら中間体は、第１の活性部位から遊離し、環境中に蓄積して第２の機能性に作用される８２。
生合成経路の非連続段階を触媒する融合酵素の天然の出現は稀である２１。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍのようなグラム陽性細菌は、ＭＶＡ経路に関与しておりＨＭＧ－ＣｏＡ合成酵素に触媒される１つの段階によって隔てられている３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）還元酵素及びアセチルＣｏＡアセチル転移酵素活性を両方とも有する二機能性酵素ＭｖａＥをコードする８３，８４。しかしながら、会合複合体は報告されていない。第２の例は、カロテノイド生合成経路に関与する。真菌－Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓ及びＭｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓにおいて同定された、フィトエン合成酵素及びリコペン環化酵素のための融合体をコードするｃａｒＲＡ遺伝子である８５，８６。フィトエン合成酵素は、２つのＧＰＰ分子の縮合によるフィトエン（ＧＧＰＰ）の合成を触媒するプレニル転移酵素である。フィトエンはその後、ＣａｒＢにコードされる脱水素酵素によってリコペンに変換される。その後、リコペン環化酵素によって触媒される環化によってβ－カロテンが合成される。報告はこれらの融合体の例外の存在を認めているが、それらは原因の正当性を示していないし、これらの融合体の有用性も何ら示していない。
遺伝子レベルでの酵素融合体の出現はよくあることである。脂肪酸合成、ポリケチド合成経路には二機能性酵素が関与するが、それらの全てが経路の連続段階を触媒する。ＩｓｐＤＦ、ＭｖａＥ及びＣｒａＡＲのような融合体の存在理由は不明なままである。とはいえ、何人かの研究者は代謝制御レベルでのそれらの妥当性を主張している。
ＭＥＰ経路の理論最大値と実験的に実現可能な収率との間には隔たりがある。この隔たりを埋めるためにゲノム工学、タンパク質工学及び代謝工学の分野で多くの取組みがなされている。狭窄段階を、より大きな活性及び／または安定性を有する相同な酵素と取り替えることを含む方策は、広く採用されているようには見受けられない。経路に関与することが報告されている二機能性酵素は有望な対象物である。これらの二機能性ＩｓｐＤＦによる生体内ＭＥＰ流束への影響に関する報告はない。精製タンパク質をその試験管内での活性について研究することに努力が向けられてきた。
本研究において本発明者らは、基質チャネリングを増強することを念頭に置いて、ＭＥＰ経路の酵素の融合体を同定するためのメタゲノムスクリーニングを行った。発見された全ての融合体はＩｓｐＤ及びＩｓｐＦのものであった。これらの酵素は、ＭＥＰ経路の非連続段階を触媒することが報告されている。本発明者らは、リンカーの特質、及びＭＥＰ経路流束に対するその影響についての徹底的な研究を行った。二機能性酵素において２つのドメインを結び付けるリンカー配列は、酵素活性を変化させる可能性がある８７，８８。リンカーの柔軟さ及び剛直さは、ドメインの運動の独立性を維持することにおいて役割を果たす。本発明者らは、ＩｓｐＥをＩｓｐＤ及びＩｓｐＦの各々に非自然発生的に融合して天然の融合体を模倣した。そのような堅牢で高収率なＭＥＰ経路基幹株は、かくして、イソプレノイドを生産するため及び新しい化合物を掘り出すために利用され得る。
タンパク質の触媒範囲を広げるか触媒効率を向上させるかのどちらかのために、１つより多くの触媒活性を有する合成融合タンパク質が設計される。単一の融合タンパク質を発現させることはまた、生産コストを大幅に低減してより高い産業適用性につながる８９。化学的触媒作用は、１つより多くの種類の反応を触媒することに適合させた多機能性触媒の方策を広く受け入れてきたし、産業において好評を得てきた９０，９１。
非天然融合体を生み出すための２つの主要な方法がある９２。１つ目は、翻訳時にペプチド結合を生成するであろうヌクレオチド配列によって第１遺伝子の転写終結コドン及び第２遺伝子の転写開始コドンを置き換えることによる、遺伝子レベルでのものである。２つ目は、翻訳後の段階でペプチド結合を形成する会合反応を誘発するタグをタンパク質に導入することである。
２－アミノ－１，２，３－ブタントリオールからのＬ－エリトルロースの変換は、セリンをアミン供与体として新規酵素ω－アミノ基転移酵素によって触媒された。この反応は、基質に送り戻されてグリコアルデヒドからＬ－エリトルロースへの変換のためのトランスケトラーゼ酵素の作用によってアミン供与体としてシステムを再生するヒドロキシピルベートを、副生成物として生成した。アミノ基転移酵素とトランスケトラーゼとの融合は効率的な閉鎖ループシステムを作り出した９３。別の研究は、４つの異種発現酵素を組み合わせてエチルベンゼンから光学的に純粋な（Ｒ）－１－フェニルエタンアミンへの変換のための多重酵素反応カスケードをＥ．ｃｏｌｉにおいて作り出して付加的共因子の使用の必要性をなくした９４。
非天然ＭＥＰ経路酵素融合体に関する報告はない。効率的な変換のために活性部位を共局在化させること、したがって基質をチャネリングすることに役立つ融合体の非存在及び存在は、当技術分野において多く議論されている主題である。しかも、経路の非連続段階を触媒するＩｓｐＤとＩｓｐＦとの融合体が出現し、ＩｓｐＥの融合体は報告されたことがない。
長期土壌生産性（ＬＴＳＰ）研究の一環として、５２°２０’Ｎ、１２１°５５’Ｗの座標に位置するＳｋｕｌｏｗ湖の場所（ＳＢＳ－３ ＷＬ）にて土壌試料が採取された９５。高分子量ゲノムＤＮＡが抽出及び精製されて大きなインサートホスミドライブラリーが作り出された９６－９８。ＮＲホスミドライブラリーは、ＣｏｐｙＣｏｎｔｒｏｌ（商標）Ｆｏｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を製造業者のプロトコールに従って使用して天然の撹乱基準場所のＢｔ土壌横断層から作り出された。ライブラリーからの２０個の３８４プレートについて、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｍｉｔｈ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＧＳＣ），ＵＢＣにてｐＣＣ１－順方向（５’－ＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧ）及びｐＣＣ１－逆方向（５’－ＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣ）プライマーを使用してサンガー末端配列決定が行われ、約７６８０対の末端配列が生成された。ホスミド末端に位置する系統発生学的遺伝子マーカー、及び機能性スクリーニングに基づいて、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでおよそ５３０個のホスミドを選択し、ＧＳＣにてＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ｐｌａｔｆｏｒｍで完全長配列決定された。一まとまりの参照データベース（ＫＥＧＧ ２０１１－０６－１８、ＣＯＧ ２０１３－１２－２７、ＲｅｆＳｅｑ ２０１４－０１－１８、及びＭｅｔａＣｙｃ ２０１１－０７－０３）を備えたＭｅｔａＰａｔｈｗａｙｓ ｐｉｐｅｌｉｎｅ ｖ２．５を用いて、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測及び注釈付けを含めた配列解析を実施した９５。オンラインＨＭＭＥＲツールのバージョン２．１７．３９９を使用してタンパク質ファミリー検索を実施して、ＭｅｔａＰａｔｈｗａｙｓツールによって生成された機能注釈を確認した。ホスミド末端及び全配列決定されたホスミドについて得られたＭｅｔａＰａｔｈｗａｙｓ出力を検索して、二機能性ｉｓｐＤＦをコードする遺伝子の酵素番号（ＥＣ）を見つけ出した。オンラインＢＬＡＳＴＮ検索ツールを使用してＮＣＢＩデータベースに対して同属ヌクレオチド配列の検索を行い、得られたテキストファイルをＭｅｇａｎ ６．１０．０にアップロードして分類の帰属を、ＬＣＡアルゴリズムを使用して行った９５。この解析に基づいてＮＲ００３２＿Ｎ０５、ＮＲ００３２＿Ｏ０７及びＮＲ００３７＿Ｎ０５のホスミド配列をＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａに割り当て、ｉｓｐＤＦに注釈付けを行ってそれぞれｉｓｐＤＦ１、ｉｓｐＤＦ２及びｉｓｐＤＦ３とした。
この試験に使用した全ての株、プラスミド及び遺伝子を表２．１に一覧で示す。それは、ＭＥＰ経路の天然の単量体型酵素及び天然の融合酵素に関する遺伝子骨組みを含んでいる。遺伝子ｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｄｉをＥ．ｃｏｌｉ株Ｋ１２ゲノムからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。二機能性遺伝子ｉｓｐＤＦ１、ｉｓｐＤＦ２及びｉｓｐＤＦ３、ならびにｉｓｐＳはコドン最適化され、Ｇｅｎｅｗｉｚ Ｉｎｃ．によって合成された。ｐＴｒｃ－ｔｒＧＰＰＳ（ＣＯ）－ＬＳはＪａｙ Ｋｅａｓｌｉｎｇから寄贈されたもの（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド５０６０３）１００であり、ここからベクター骨格を増幅してプラスミド変異体を構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αをクローニング宿主として使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を発現宿主として使用した。
Figure 2022523992000007
Figure 2022523992000008
本発明者らは、異なるリンカーを有する融合体を構築した。使用したリンカー及びその配列を表２．２に一覧で示す。リンカーをＰＣＲによって付加し、ギブソン・アセンブリによって生成した。
Figure 2022523992000009
ＣＪ及びＸＬリンカー配列は、各々の融合酵素の配列をＥ．ｃｏｌｉのＩｓｐＤ及びＩｓｐＦとアラインメントすることによって生成された。ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬサーバーを使用して天然及び非天然キメラ融合体のための相同性モデルを組み立てた。非天然融合体を表２．３に一覧で示す。ＩｓｐＤＦ１のＩｓｐＤ及びＩｓｐＦドメインを別個に発現させることも行った。これは、ドメインｉｓｐＤのための遺伝子配列の末端に終止コドン（ＴＡＡ）を加え、リンカーのための遺伝子配列を壊し、ＲＢＳ及び開始コドン（ＡＴＧ）をＩｓｐＦのための遺伝子配列の読み枠の中に入るように加えることによって成し遂げられた。これは、２つのドメインの転写レベルの分離を可能にした。ＩｓｐＤドメインをコードする遺伝子配列をｉｓｐＤ１と表し、対応するタンパク質をＩｓｐＤ１と表す。ＩｓｐＦドメインをコードする遺伝子配列をｉｓｐＦ１と表し、対応するタンパク質をＩｓｐＦ１と表す。
Figure 2022523992000010
非天然融合体をＭＥＰ経路に関与する他の遺伝子と共にクローニングして経路流束に対するその影響を評価した。これらの構築物及び株を表２．４に記す。
Figure 2022523992000011
適切な構成物質（複数可）を含有するＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の中でイソプレン及びリコペンスターター培養物を３０℃で一晩培養した。その後、イソプレンスターター培養物を培地で１５ｍＬに希釈してＯＤ６００を０．２にし、アラビノース及び／またはＩＰＴＧで誘導し、２５ｍＬの密閉ガラス管内で２４時間、３０℃で成長させた。リコペンスターター培養物を培地で５ｍＬに希釈してＯＤ６００を０．２にし、ＩＰＴＧで誘導し、暗所にて培養管内で２４時間、３０℃で成長させた。
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｃｌａｒｕｓ ６８０ガスクロマトグラフ、及びＰｅｒｋｉｎｇ Ｅｌｍｅｒ Ｃｌａｒｕｓ ＳＱ ８Ｔ質量分析計（ＧＣ－ＭＳ）でイソプレン分析を実施した。イソプレンは揮発性モノテルペンであるため、密封された培養物を７０℃で１分間加熱し渦撹拌を５秒間した後に気密シリンジを使用して上部空間を２００μＬ試料採取した。定量のために同様の方法でイソプレンの標準曲線を作成した。ヘリウム（１ｍＬ／分）をキャリアガスとしてＨＰ－５ＭＳキャピラリーカラム（長さ２５ｍ、内径０．２ｍｍ、膜厚０．３３μｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。オーブン温度プログラムは、３５℃で３分間、２５℃／分で２００℃まで、及び１分間保持とした。注入器は６０℃に維持し、２０：１のスプリット比を維持した。ｍ／ｚ６８及びｍ／ｚ６７のイオンに対してＳＩＲモードで質量分析取得を行った。
リコペンは細胞内生成物である。細胞培養物のうち２ｍＬを８０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１ｍＬのアセトンによるペレットからの抽出によってリコペンを抽出した。抽出は弱光条件下で２０分間断続的に渦撹拌をしながら５５℃で実施した。アセトン懸濁液を遠心分離及び濾過した後に分析した。３０℃に維持されたＺｏｒｂａｘ Ｃ－１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を装備したＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｆｌｅｘａｒシステムで試料を分析した。６６％（ｖ／ｖ）のメタノール、３０％（ｖ／ｖ）のテトラヒドロフラン及び４％（ｖ／ｖ）の水からなる移動相と共に試料を１ｍＬ／分の流速で流した。フォトダイオード検出器を使用して波長４７４ｎｍでの吸光度を追跡することによってリコペン検出を行った。
結果
土壌メタゲノム配列をスクリーニングしてＭＥＰ経路酵素のより高い活性及び安定性を有する相同分子種を探した。これは、経路内の２つの酵素－ＩｓｐＤ及びＩｓｐＦの新規融合体の発見につながった。それらをホスミドＮＲ００３２＿Ｎ０５、ＮＲ００３２＿Ｏ０７、及びＮＲ００３７＿Ｎ０５から単離し、対応する遺伝子にそれぞれｉｓｐＤＦ１、ｉｓｐＤＦ２及びｉｓｐＤＦ３と注釈を付けた。翻訳されたポリペプチドにはそれぞれＩｓｐＤＦ１（４１．６ｋＤａ）、ＩｓｐＤＦ２（４２．１ｋＤａ）及びＩｓｐＤＦ３（４０．２ｋＤａ）と注釈を付けた。これらの遺伝子を親和性に基づく分離のためにタグ付けし、誘導物質として０．５ｍＭのＩＰＴＧを使用してＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に発現させた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に所望のバンドがみられたが、ＩｓｐＤＦの発現レベルは低かった。不溶性細胞残屑を変性させて分析し、３つ全ての融合体が封入体を形成したことが分かった。
ＩｓｐＤＦ１、ＩｓｐＤＦ２及びＩｓｐＤＦ３の配列をＥ．ｃｏｌｉのＩｓｐＤ、ＩｓｐＦ及びｃｊＩｓｐＤＦとアラインメントした（表２．５）。発見された酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉの天然一機能性酵素により類似していた。ｃｊＩｓｐＤＦに対してアラインメントしたところ、より大きな違いが認められた７９。５つ全ての（）の間で大部分の残基機能が保存されていたが、相違点が固まって存在していた。２２０～２５０残基のアミノ酸領域は可変性が高く、両方のドメインの連結に関与していた。他の相違する固まりは融合体のＩｓｐＤドメインに認められた。発見された３つのＩｓｐＤＦはどれも新規な配列を有し、報告されたことがない。
Figure 2022523992000012
融合酵素の各ドメインをＥ．ｃｏｌｉのＩｓｐＤ及びＥ．ｃｏｌｉのＩｓｐＦに対してアラインメントした（表２．６）。融合体のＩｓｐＦドメインは、ＩｓｐＤドメインとＥ．ｃｏｌｉのＩｓｐＤとの間の類似性に比べてより高い配列類似性をＥ．ｃｏｌｉのＩｓｐＦと共有していた。この結果は、ｃｊＩｓｐＤＦについて報告されたＥ．ｃｏｌｉ天然酵素との類似性と一致している６２。ｃｊＩｓｐＤＦのＩｓｐＦドメインはＥ．ｃｏｌｉのＩｓｐＤと４８％の配列類似性を共有しているのに対し、ＩｓｐＤドメインはＥ．ｃｏｌｉのＩｓｐＤと２５％の類似性を共有している。
Figure 2022523992000013
融合体のドメインをｃｊＩｓｐＤＦドメインとアラインメントしたところ、類似する傾向が認められた（表２．７）。
Figure 2022523992000014
Ｄｘｓ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＦ及びＩｄｉによって触媒される酵素段階は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＭＥＰ経路の律速段階である２４。同じ骨組みを再構築し（ｐＳＡＳＤＦＩ）、タンパク質発現を分析した。可溶性タンパク質試料をＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルに流し、クーマシー色素で染色した。
イソプレン及びリコペン産生に向かう活性についてＳＡＳＤＦＩを、骨組みと下流経路（それぞれｐＳＡＩｓｐＳ及びｐＡＣ－ＬＹＣ）とを共発現させることによって試験した。ＭＥＰ経路流束改善に及ぼすＩｓｐＤ及びＩｓｐＦの影響に対する説明を提供するために、Ｄｘｓ及びＩｄｉが発現するクローン（ｐＳＡＳＩ）を構築した。
ＳＡＬｙｃ及びＳＡＩｓｏは、対応するテルペノイドを非常に低い収率でもたらした（図１７（ａ）～（ｂ））。これらの株は、ＭＥＰ経路の天然の発現レベルを反映している。誘導はテルペノイド産生に対して実質的な影響を及ぼさなかった。ＳＡＩｓｏに対するＩＰＴＧ誘導は細胞成長に悪影響を与え、このため、より高い正規化収率を示す。より高いＩＰＴＧ誘導レベルはリコペン産生の妨げとなり、成長に悪影響を与えた。Ｄｘｓ及びＩｄｉの過剰発現（ＳＡＬｙｃ－ＳＩ株、及びＳＡＩｓｏ－ＳＩ株）はそれぞれ２２倍及び１２倍多いテルペノイドをもたらした。ＩｓｐＤ及びＩｓｐＦのさらなる発現（ＳＡＬｙｃ－ＳＤＦＩ株、及びＳＡＩｓｏ－ＳＤＦＩ株）はさらにテルペノイド生産量をそれぞれ４７倍及び１５倍増強した。ＳＡＬｙｃ－ＳＩ及びＳＡＬｙｃ－ＳＤＦＩの未誘導培養物はなおもリコペンをＳＡＬｙｃのそれよりも高い収率で産生した。
３つ全ての融合体はイソプレン及びリコペン産生に対して異なった作用を呈した（図１８（ａ）～（ｂ））。ＳＡＬｙｃ－ＳＤＦ１Ｉ及びＳＡＩｓｏ－ＳＤＦ１Ｉが最も性能が優れていた。ＩｓｐＤＦ１株においてリコペン及びイソプレン生産量はそれぞれ２０％及び７５％向上した。ＩｓｐＤＦ２及びＩｓｐＤＦ３変異型では力価が低下した。株のＯＤ６００は同程度の範囲内にあった。ＩｓｐＤＦ１変異体は、触媒処理量も改善されたことを意味してより高い正規化力価を示した。ＳＡＬｙｃ－ＳＤＦ１Ｉを７５μＭ及び１００μＭのＩＰＴＧ誘導濃度で試験したが力価は低下し、最大力価は５０μＭのＩＰＴＧ濃度で得られた。
ＩｓｐＤＦからの単独寄与の影響を評価するために、、ＳＡＩｓｏ－ＤＦ１株、ＳＡＩｓｏ－ＤＦ２株及びＳＡＩｓｏ－ＤＦ３株をイソプレン産生について試験し、ＳＡＬｙｃ－ＤＦ１株、ＳＡＬｙｃ－ＤＦ２株及びＳＡＬｙｃ－ＤＦ３株をリコペン産生について試験した。これら６つ全ての株はそれぞれのテルペノイドをＳＡＩｓｏ及びＳＡＬｙｃと等しいレベルでもたらした（データ示さず）。誘導はテルペノイド力価に対して何ら作用がなかった。
融合体のための相同性モデルを、鋳型としてｃｊＩｓｐＤＦを使用してＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬによって生成した（図１９（ａ）～（ｄ））。４つ全ての融合体は、保存されたサブユニット構造を有している。ＩｓｐＤＦ１及びＩｓｐＤＦ３はｃｊＩｓｐＤＦとのアラインメントが良好であるが、ＩｓｐＤＦ２はより長いリンカーを有する。サブユニットの活性部位は反対側の末端に位置する。推定上のリンカー配列は、ＩｓｐＤＦ２ではＥＡＩＡＲＧＴＧＥＲＡＶＧＥＲＡＡであり、ＩｓｐＤＦ３ではＥＲＬＩＧＡＲＮＴＡＧＡＭである。ＩｓｐＤＦ１はテルペノイド力価を改善したため、それをさらなる試験に使った。
ＩｓｐＥはＩｓｐＤ及びＩｓｐＦと会合することによって流束に影響を与えることが以来報告されている６２。そうして、会合複合体はＭＥＰからＭｅｃＰＰへの代謝産物の効率的な転移及び変換を助ける。本発明者らは、５つの酵素Ｄｘｓ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＦ（またはＩｓｐＤＦ）、ＩｓｐＥ及びＩｄｉが発現している組換えＥ．ｃｏｌｉ株を試験することによってリコペン生産のためにこの現象を調査した。ＳＡＬｙｃ－ＳＤＦＥＩ及びＳＡＬｙｃ－ＳＤＦ１ＥＩはどちらもリコペン力価がそれぞれＳＡＬｙｃ－ＳＤＦＩ及びＳＡＬｙｃ－ＳＤＦ１Ｉよりも低かった（図２０）。ＩｓｐＥ過剰発現時の流束の損失パーセントは一機能性天然酵素クローンよりもＩｓｐＤＦ１クローンにおいてより歴然としていた。この作用はリコペンのより低い速度及びより低い細胞成長速度の和であった。ＩｓｐＥクローンにおいてＯＤ６００は目立って低かった（２０～６０）。ＳＡＬｙｃ－ＳＤＦＥＩ培養物は、より広いエラーバーに映し出されてより高い成長変動性を有していた。
ＳＡＬｙｃ－ＳＤＦ１Ｉの流束の増強におけるリンカーの役割を評価するために、本発明者らは推定上のリンカー配列を３種類のリンカーで置き換えた。１つ目は、ｃｊＩｓｐＤＦから同定されたリンカーである。２つ目は、グリシン及びセリンリンカーでありドメインに柔軟性を付与する「ＦＬ」である。３つ目は、α－ヘリックスを形成し自由運動を制限して立体配座に剛直性を与える「ＲＬ」である。リンカーの作用を、ＩｓｐＥ過剰発現を有する及び有しない株において試験した。非天然リンカーは、リコペンの総合的力価を向上させなかったが（図２１（ａ）～（ｂ））、細胞生存率に影響を及ぼし、培養物のＯＤ６００を低下させた。正規化力価はＳＡＬｙｃ－ＳＤＲＬＦ１Ｉが最も高く、その次に高いのがＳＡＬｙｃ－ＳＤＣＪＦ１Ｉであった。柔軟なリンカーを有するクローンはどちらの組においても最も低いリコペン力価を呈した。
上記節中のリンカーは正規化力価によい影響を与えた。これは、リンカーが細胞成長を犠牲にして流束を改善したことを意味する。そこで、同リンカーをＩｓｐＤＦ１の天然リンカーと一緒に採用してＥ．ｃｏｌｉのＩｓｐＤとＩｓｐＦとを繋げた。図２２（ｂ）中の株の場合、より低い正規化力価はより高いＯＤ６００の結果であった。これは、細胞成長代謝への全体的炭素流束のチャネリングを示唆している。これに対し、図２２（ａ）に示す株の場合、融合体は細胞成長の実質的作用がなくリコペン産物に悪影響を与えた。
株はＣＪ、ＦＬ及びＲＬリンカーに対して混交した応答を呈したので、ＩｓｐＤＦ１の推定上のリンカーを有するＩｓｐＤ及びＩｓｐＦの融合体を構築した。これらの融合体はＭＥＰ流束を減少させ、リコペン生産量をさらに低下させた（図２３）。この作用はＳＡＬｙｃ－ＳＤＸＬＦＩ．ＳＡＬｙｃ－ＳＤＸＬＦＥＩにおいて顕著であった。
ＸＬリンカーによる経路流束に対する悪影響は、ＩｓｐＤＦ１のドメインを分離して研究する必要性を示唆していた（図２４）。個別の酵素としてのドメインの分離はＳＡＬｙｃ－ＳＤ１Ｆ１ＥＩに対してより顕著な作用を有していた。
ＩｓｐＥの非天然融合体、及びそれがＭＥＰ経路流束に及ぼす作用
ＭＥＰ経路の非連続段階を触媒する酵素の誘導体が天然に存在することの理由を評価するために、本発明者らはＩｓｐＥの非天然融合体を構築した。柔軟なリンカーを使用して融合体を構築した。連結方策は天然ＩｓｐＤＦのそれと類似するように保った。ＩｓｐＤのＣ末端をＩｓｐＥのＮ末端に連結することによってＩｓｐＤＥ融合体を構築した。さらに、ＩｓｐＥのＣ末端をＩｓｐＦのＮ末端に連結することによってＩｓｐＥＦ融合体を構築した。図２５は、ＩｓｐＤＥ融合体が、ＳＡＬｙｃ－ＳＤＦＩに比べて２０％の向上しＳＡＬｙｃ－ＳＤＦＥＩに比べて２．３倍向上したリコペン生産量を呈したことを示している。これに対し、ＩｓｐＥＦ融合体はリコペン生産量を大幅に減少させた。
図２６は、これまでに得られた結果をまとめたものである。それは、最も高い力価及び正規化力価の値による異なる構築物の比較グラフである。空欄の場所は「－」で表されている。
考察
リコペン産生骨組みは内因性プロモーターの制御下にあり、ＭＥＰ経路骨組みは、漏出しやすいと報告されているｔｒｃプロモーターの制御下にある１０５－１０７。これらの理由から、誘導がないときのリコペン培養物はリコペンをベース株ＳＡＬｙｃのそれよりも多く産生した。リコペン及びイソプレン発酵の両方でのより高い正規化力価は、それぞれの下流テルペン合成経路を往復するＣ５前駆体代謝産物－ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰが豊富にあることを示している。
融合体、及びリンカーの役割を研究するためには、タキソール収率を上昇させると報告されたＤｘｓ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＦ及びＩｄｉが過剰発現する基底骨組みを構築する必要があった２４。プラスミドｐＳＡＳＤＦＩを含有するこの株は、本研究において比較のための基礎として役立った。ＭＥＰ経路流束の改善のためにＤｘｓ及びＩｄｉの過剰発現のみを強調する報告がいくつかあり１０８，１０９、本研究の結果（図１７）は、ＩｓｐＤ及びＩｓｐＦのさらなる過剰発現がリコペンのための力価を８０％向上させたがイソプレンのそれはほんの３５％にすぎないことを示した。イソプレン培養の間の微好気環境が力価の格差の一因である可能性がある、というのも、それは極めて酸素が制約された環境であるからである。ＳＡＬｙｃ－ＳＤＦＩにおいて得られたリコペン力価は、文献中に報告されている力価と同程度である１１０，１１１。総合して、ｐＳＡＤＦＩ骨組みはｐＳＡＬｙｃ及びｐＳＡＩｓｏ株と比較してリコペン生産量を４７倍、及びイソプレン力価を１５倍向上させ、この方策はＭＥＰ経路の狭窄部分を取り除くのに効果的であることが判明した。
ＤｘｓはＭＥＰ経路のゲートキーパー遺伝子であり、Ｉｄｉは、テルペノイド生合成の下流経路に必要とされるＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ濃度の平衡を維持している最終段階を触媒する。それゆえ、ＩｓｐＤ及びＩｓｐＦならびにＩｓｐＤＦのみが過剰発現している骨組みはテルペノイド力価に影響を及ぼさなかった。ＳＡＩｓｏ－ＤＦ１、ＳＡＩｓｏ－ＤＦ２、ＳＡＩｓｏ－ＤＦ３、ＳＡＬｙｃ－ＤＦ１、ＳＡＬｙｃ－ＤＦ２、及びＳＡＬｙｃ－ＤＦ３によるテルペノイド生産量は、ＭＥＰ経路過剰発現がない株と比較して大して差がなかった（データ示さず）。それゆえ、中間段階の影響を研究するための将来の実験に遺伝子ｄｘｓ及びｉｄｉを含めることを決定した。
ｐＳＡＳＤＦ１ＩオペロンにおけるＩｓｐＤＦ１発現による経路の流束の改善は、触媒ドメインに物理的特徴（例えば柔軟性または触媒部位近接／基質チャネリングなど）を付与する、及び／または天然一機能性酵素よりも高いＩｓｐＤＦ１の安定性及び／または活性を付与するリンカーの役割の結果であり得る。ＩｓｐＤＦ１のＩｓｐＦドメインはＥ．ｃｏｌｉ ＩｓｐＦとの類似性がＩｓｐＤＦ２及びＩｓｐＤＦ３のそれと比較して最も高い。リコペン株におけるＩｓｐＤＦ１過剰発現の影響の強さはイソプレン株とは異なっていた。ＩｓｐＥはＩｓｐＤとＩｓｐＦとの間の段階を触媒するため、触媒カスケードにおけるＩｓｐＥの役割を評価するさらなる調査を行った。ＩｓｐＥに触媒される段階は経路の狭窄部分であるとは報告されておらず、その過剰発現は代謝ストレスを掛け、リコペン力価を低下させた。ＳＡＬｙｃ－ＳＤＦ１ＥＩは、それが発現させる組換えタンパク質がＳＡＬｙｃ－ＳＤＦＥＩでの５つの組換えタンパク質と比べてたった４つであるにもかかわらず、ストレス作用が優勢となった。この結果は、代謝ストレス以外の因子（複数可）の存在を際立たせている。
研究した第１の因子は、リンカーの役割であった。柔軟なリンカーを選択してドメインに可動性を付与し、また、ドメインの運動を制限する長いヘリックスを形成する剛直なリンカーを選択した。ｃｊＩｓｐＤＦからのリンカーも採用した。非天然ＩｓｐＤＦ１融合体については、Ｃ流束は成長から離れてＭＥＰ経路へより大きく逸れており、結果として正規化リコペン力価がより高くなったが総リコペン生産量はより少なくなった。ＳＡＬｙｃ－ＳＤＲＬＦ１Ｉは最も性能が優れる株であり、正規化力価がＳＡＬｙｃ－ＳＤＦ１Ｉよりも２２％高く、正規化力価が基底株ＳＡＬｙｃ－ＳＤＦＩよりも３３％高かった。これは、融合体の立体配座の剛直性が触媒活性の良い影響を有していることを示唆していた。ＩｓｐＤＲＬＦ１の相同性モデリングは結論に至るものではなかった、というのも、鋳型はリンカーの折りたたみを正確に複製することができなかったからである。他方、ＩｓｐＥを過剰発現させた場合（ＳＡＬｙｃ－ＳＤＲＬＦ１ＥＩ株）、生産量は３０％低下し、正規化力価は８０％低下した。しかしながら、ＳＡＬｙｃ－ＳＤＲＬＦ１ＥＩのＯＤ６００は、ＳＡＬｙｃ－ＳＤＲＬＦ１Ｉよりも５０％高かった。ＳＡＬｙｃ－ＳＤＲＬＦ１ＥＩは４つの異種酵素を発現させるため、個々の酵素の有効量は、３つの異種酵素を発現させるＳＡＬｙｃ－ＳＤＲＬＦ１Ｉの場合と比較してより少ない。それゆえ、ＭＥＰ経路流束がより低くなり、全Ｃ流束がバイオマス生成へと逸れた。
この作用をさらに演繹するために、Ｅ．ｃｏｌｉのＩｓｐＤ及びＩｓｐＦの非天然融合体の構築及び比較を行った。これらの例（図２２）において、活性の共局在化はリコペン生産及び正規化力価に悪影響を与えた。しかしながら、これらの例において、Ｉｓｐが過剰発現している株の全体的ＯＤ６００は、ＩｓｐＥが過剰発現していないそれらの対応する変異体に比べて１０～５０％低かった。これは、細胞の健常性及び成長に対するその影響を超えてＩｓｐＥの関与を促した。さらに、推定上のＩｓｐＤＦ１のリンカーは、Ｅ．ｃｏｌｉのＩｓｐＤとＩｓｐＦとを連結するために使用した場合、他の非天然融合体と類似する作用を呈した。
ＲＬ型リンカーを有するキメラ酵素は、これまでのところ、細胞成長を犠牲にしてＭＥＰ経路を通る最大流束を呈した。これはリンカー及びドメイン共局在化の作用を再評価することを促した。酵素の融合体の組織化が反応カスケードの速度を向上させるという広く知れ渡っている理論は、基質拡散限界を低くすること及び基質チャネリングによるものである。しかしながら、近年の証拠は、代謝カスケード上の融合体の動力学が以前に想定していたものよりも複雑であることを示している１１２。初期反応速度を増強するのは単なる酵素間の近接ではなく、むしろ、共局在化が酵素の局所濃度を高めている。これはしたがって、拡散する基質が活性部位の穴と相互作用する機会を増やす１１３。
ＩｓｐＤ１及びＩｓｐＦ１は個々の活性を保持した。ＳＡＬｙｃ－ＳＤ１Ｆ１Ｉ株はリコペン生産量が２５％低かったが、ＯＤ６００も同じ倍率だけ低かった。したがって、全体的流束と正規化力価は同程度であった。ＳＡＬｙｃ－ＳＤ１Ｆ１ＥＩは３０％低いＯＤ６００を有し、リコペン生産量の８２％の増加を呈した。これらの観察結果は両方とも、ＳＡＬｙｃ－ＳＤ１Ｆ１ＥＩではＳＡＬｙｃ－ＳＤＦ１ＥＩよりも正規化リコペン力価が倍率で３倍改善したことを示した。全体的リコペン力価は、より長いオペロンゆえに酵素のコピーのより低い利用可能性のためにＳＡＬｙｃ－ＳＤＦ１Ｉよりも低く留まったが、正規化力価の改善は、ＩｓｐＤＦ１のより高い安定性及び活性の観察結果を強化した。
ＩｓｐＤＦについての多くの発見とは対照的にＩｓｐＥの融合についての文献が何ら存在しないのは注目に値する。経路において非連続段階を触媒する酵素の融合体の役割、及び中間段階酵素の役割は、多く議論されているばかりでなく、むしろ予見しがたいものでもある。本発明者は、ＩｓｐＥの非天然融合体を構築することによってそれを解き明かそうとした。ＩｓｐＤＥ融合体の性能はＩｓｐＥＦ融合体よりも数倍良好であった。事実、ＩｓｐＤＥ融合体は、ＳＡＬｙｃ－ＳＤＦＥＩと比較してリコペン生産量の２．３倍の向上及び正規化力価の２０％の向上を呈した。ＳＡＬｙｃ－ＳＤＦＬＥＦＩのＯＤ６００も倍増した。これに対し、ＩｓｐＥＦ融合体は、ＳＡＬｙｃ－ＳＤＦＥＩと比較してリコペン生産量を少なくとも６５％、正規化力価を８５％低下させた。ＳＡＬｙｃ－ＳＤＦＬＥＦＩ株は、リコペン生産のための最も性能が優れた株であり、ＭＥＰ経路流束ではＳＡＬｙｃ－ＳＤＲＬＦ１Ｉに次いで２番目に優れていた。これは、ＩｓｐＤＦ１の個々のドメインの活性がＥ．ｃｏｌｉの天然ＩｓｐＤ及びＩｓｐＦに比べてより高いという事実による。
* * *
例示的に本明細書に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない要素または複数の要素、限定または複数の限定が何ら存在することなく好適に実施され得る。したがって、例えば、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は広義に非限定的に読み取られるべきである。加えて、本明細書中で採用される用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語及び表現の使用には今後示され記載される何らかの均等物またはその任意の一部を排除する意図はなく、特許請求される本発明の範囲の中で様々な改変形態が可能であることが認識される。
したがって、本発明が好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示されているにもかからわず本明細書に開示される本発明の改変形態及び変化形態が当業者に利用され得ること、ならびにそのような改変形態及び変化形態が本明細書に開示される本発明の範囲に含まれるとみなされることは、理解されるべきである。本発明は、本明細書に広く一般的に記載されている。全般的な開示の範囲に入るより狭い種及びそれに準ずる分類の各々も、これらの発明の一部を形成する。これは、上位概念から任意の主題を除去する仮定または否定的限定を伴う各発明の全般的な記載を、取り除かれた材料がその中に具体的に存在するか否かにかかわらず含む。
加えて、本発明の特徴または態様をマーカッシュ群の用語で記載している場合、当業者であれば、それによって本発明もマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの小群によって記載されることを認識するであろう。上記記載が制約するものではなく例示を意図したものであることも理解されるべきである。上記記載を読めば当業者には多くの実施形態が明らかとなろう。本発明の範囲は、したがって、上記記載を参照して決定されるべきではなく、別記の特許請求の範囲を、そのような特許請求の範囲によって認められる均等物の全範囲と併せて参照して決定されるべきである。特許公報を含めた全ての論文及び参考文献の開示内容を参照により本明細書に援用する。

Claims (48)

  1. 宿主細胞であって、
    ａ．異種輸送体またはその機能性断片をコードする異種核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット
    を含み、前記輸送体が、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）芳香族酸アンチポーター及びＯｐｒＤファミリーポリンからなる群から選択されるものであり、
    ｂ．オリベトレート、ジバリノレート（ＤＶＡ）またはその代謝産物、誘導体もしくは脱炭酸体から選択される芳香族基質
    を含み、前記宿主細胞が、ａ）の前記発現カセットがない対照宿主細胞と比較して前記宿主細胞内への前記芳香族基質の移入を増進することができる、宿主細胞。
  2. 前記細胞が原核生物であり、好ましくは前記原核生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｐａｎｔｅｏａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属の原核生物からなる群から選択される、請求項１に記載の宿主細胞。
  3. 前記細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｐａｎｔｅｏａ ｃｉｔｒｅａ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、またはＬ．ｌａｃｔｉｓである、請求項１に記載の宿主細胞。
  4. 前記細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１に記載の宿主細胞。
  5. 前記輸送体がＭＦＳ芳香族酸アンチポーターｐｃａＫもしくはその機能性断片であるか、または前記輸送体がＯｐｒＤファミリーポリンｐｐ３６５６もしくはその機能性断片である、請求項１～４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  6. 前記輸送体が、配列番号６、７、８または９に示される配列の１００連続アミノ酸と少なくとも５０％もしくは５５％同一である、または同一である、請求項１～５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  7. 前記宿主細胞が、異種芳香族プレニル転移酵素またはその機能性断片をさらに含み、前記芳香族プレニル転移酵素が機能性であり前記芳香族酸基質をプレニル化することができる、請求項１～６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  8. 前記異種芳香族プレニル転移酵素がＣＢＧＡＳもしくはＮｐｈＢ、またはその機能性断片である、請求項７に記載の宿主細胞。
  9. 前記異種芳香族プレニル転移酵素がＣＢＧＡＳの機能性断片である、請求項８に記載の宿主細胞。
  10. ＣＢＧＡＳの前記機能性断片が、配列番号３に示される配列の１００連続アミノ酸と少なくとも５０％もしくは５５％同一である、または同一である、請求項９に記載の宿主細胞。
  11. 前記宿主細胞が、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＤＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ及びｉｄｉからなる群から選択される１つ以上のＭＥＰ経路酵素またはその変異体（例えば、各々の天然原核生物配列と少なくとも９０％、９５％または９９％同一である変異体）をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  12. 前記宿主細胞が、ｉｓｐＤＦをコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  13. 前記宿主細胞が、ｉｓｐＤＥをコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  14. 前記宿主細胞が、ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  15. 前記宿主細胞が、オリベトレート、ＤＶＡ、オリベトールまたはジバリノールを含む培養培地の中に入っており、好ましくは前記宿主細胞が、オリベトレート及び／またはＤＶＡを含む培養培地の中に入っている、請求項１～１４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  16. 前記宿主細胞が、カンナビノイド合成酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットをさらに含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  17. 前記カンナビノイド合成酵素がＣＢＤＡ合成酵素、ＣＢＣＡ合成酵素またはＴＨＣＡ合成酵素であり、好ましくは前記カンナビノイド合成酵素がＣＢＤＡ合成酵素である、請求項１６に記載の宿主細胞。
  18. 原核生物宿主細胞内へのオリベトレートの輸送を増進する方法であって、
    前記輸送体の発現に適した条件の下、前記輸送体の外来芳香族基質を含有する培養培地の中で請求項１～１７のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養すること
    を含む、方法。
  19. オリベトレート及び／またはＤＶＡをプレニル化する方法であって、
    前記輸送体及び前記芳香族プレニル転移酵素の発現に適した条件の下、外来オリベトレート及び／またはＤＶＡを含有する培養培地の中で請求項７～１７のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養し、それによって前記オリベトレート及び／またはＤＶＡをプレニル化すること
    を含む、方法。
  20. 前記芳香族プレニル転移酵素がゲラニルジホスフェート：オリベトレートゲラニル転移酵素であり、前記方法が、カンナビゲロール酸を生成することを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記方法が、前記輸送体が発現しないかまたはより低い量もしくは活性のそれが発現する条件の下で実施される対照方法と比較して、プレニル化されたオリベトレートまたはＤＶＡ生成物の生成量を増加させる、請求項１９～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記方法が、前記培養された細胞を採集し溶解させてそれによって細胞溶解物を生成することを含む、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記方法が、前記プレニル化されたオリベトレートもしくはＤＶＡ生成物またはその代謝産物を前記細胞溶解物から精製することを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記方法が、前記宿主細胞の培養によって生成された使用済み培養培地を採集することを含む、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記方法が、前記プレニル化されたオリベトレートもしくはＤＶＡ生成物またはその代謝産物を前記使用済み培養培地から精製することを含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記方法が、ＣＢＧＡまたはその脱炭酸生成物を前記細胞溶解物または使用済み培養培地から精製することを含む、請求項２３または請求項２５に記載の方法。
  27. 前記方法が、ＣＢＤＡまたはその脱炭酸生成物を前記細胞溶解物または使用済み培養培地から精製することを含む、請求項２１または請求項２５に記載の方法。
  28. 二機能性ｉｓｐＤＥ酵素またはその機能性断片をコードする核酸に機能可能に連結された異種プロモーターを含む、発現カセット。
  29. 二機能性のｉｓｐＤＥ、ｉｓｐＤＦもしくはｉｓｐＥＦ酵素またはその機能性断片をコードする核酸に機能可能に連結された異種プロモーターを含み、好ましくは前記核酸が二機能性ｉｓｐＤＥ酵素またはその機能性断片をコードする、発現カセット。
  30. 前記二機能性ｉｓｐＤＥ酵素が、配列番号１０に示される配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項２８に記載の発現カセット。
  31. 前記発現カセットが、少なくとも１つのさらなるＭＥＰ経路酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む、請求項２８、２９または３０に記載の発現カセット。
  32. 前記少なくとも１つのさらなるＭＥＰ経路酵素が、
    ａ．ｄｘｓ、ｉｓｐＦ及びｉｄｉ、または
    ｂ．ｄｘｓ、ｉｓｐＤＦ及びｉｄｉ
    を含む、請求項３０に記載の発現カセット。
  33. 請求項２８～３２のいずれか１項に記載の発現カセットを含む宿主細胞。
  34. 前記宿主細胞が、テルペノイド合成酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットをさらに含む、請求項３３に記載の宿主細胞。
  35. 前記宿主細胞が、カンナビノイド合成酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットをさらに含む、請求項３３または請求項３４に記載の宿主細胞。
  36. 前記宿主細胞が、芳香族プレニル転移酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットをさらに含む、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  37. 前記宿主細胞が、ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットをさらに含む、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  38. 前記宿主細胞が、
    ｉｓｐＤＥをコードする核酸、
    前記ＧＰＰ合成酵素をコードする核酸、
    前記芳香族プレニル転移酵素をコードする核酸、ならびに
    ＣＢＤＡ合成酵素またはその機能性断片、ＣＢＣＡ合成酵素またはその機能性断片、及びＴＨＣＡ合成酵素またはその機能性断片からなる群から選択されるカンナビノイド合成酵素をコードする核酸
    を含み、好ましくは前記カンナビノイド合成酵素をコードする核酸がＣＢＤＡ合成酵素またはその機能性断片をコードする、請求項３３～３７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  39. 前記宿主細胞がオリベトレート、オリベトール、ジバリノール酸またはジバリノールをさらに含む、請求項３３～３８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  40. オリベトレートまたはジバリノール酸を含む、請求項３９に記載の宿主細胞。
  41. オリベトレートを含む、請求項４０に記載の宿主細胞。
  42. 前記宿主細胞が、少なくとも１つの原核生物シャペロンに機能可能に連結されたプロモーターを含む異種発現カセットをさらに含む、請求項３３～４１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  43. 前記宿主細胞が、
    ａ．ｉｓｐＤＦをコードする異種核酸、及び場合によってはｉｓｐＥをコードする異種核酸、
    ｂ．ｉｓｐＤＥをコードする異種核酸、及び場合によってはｉｓｐＦをコードする異種核酸、または
    ｃ．ｉｓｐＥＦをコードする異種核酸、及び場合によってはｉｓｐＤをコードする異種核酸
    を含む、請求項３３～４２のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  44. 少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは全ての異種発現カセットが前記宿主細胞のゲノムに組み込まれている、請求項３３～４３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  45. 前記発現カセットの少なくとも１つが前記宿主細胞のゲノムに組み込まれていない、請求項３３～請求項４３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  46. テルペノイドを生産する方法であって、前記ｉｓｐＤＥ二機能性酵素の発現に適した条件の下で請求項３３～請求項４５のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
  47. 前記方法が、異種発現した芳香族プレニル転移酵素の、外来的に供給された基質を含む培養培地の中で前記宿主細胞を培養することを含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記外来的に供給された基質が、オリベトレートまたはジバリノール酸、好ましくはオリベトレートを含む、請求項４７に記載の方法。
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JP2022523992A (ja) * 2019-03-06 2022-04-27 インメド ファーマシューティカルズ インコーポレイティド 異種システムにおけるテルペノイドまたはカンナビノイドの生合成のための組成物及び方法
US11891640B1 (en) * 2021-01-20 2024-02-06 National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc Crop protection in algae by exogenous terpene expression
CA3237656A1 (en) * 2021-10-15 2023-04-20 Cellibre, Inc. Optimized biosynthesis pathway for cannabinoid biosynthesis

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7422873B2 (en) * 2006-03-31 2008-09-09 E.I. Du Pont De Nemours And Company Mutant carotenoid ketolase
US9512236B2 (en) * 2006-12-19 2016-12-06 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against GPCRS and polypeptides comprising the same for the treatment of GPCR-related diseases and disorders
US20200385715A1 (en) * 2016-05-11 2020-12-10 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for altering bacteria fitness
CN106148263B (zh) * 2016-07-08 2019-05-10 福建师范大学 类球红细菌菌株及其制备方法和应用
EP3544992A4 (en) * 2016-11-23 2020-07-15 The Regents of The University of California INTERNAL SENSORS FOR G-PROTEIN COUPLED RECEPTOR
US11149291B2 (en) * 2017-07-12 2021-10-19 Biomedican, Inc. Production of cannabinoids in yeast
CA3074748A1 (en) * 2017-09-05 2019-03-14 Inmed Pharmaceuticals Inc. Metabolic engineering of e. coli for the biosynthesis of cannabinoid products
WO2019056123A1 (en) * 2017-09-22 2019-03-28 Inmed Pharmaceuticals Inc. TOPICAL FORMULATIONS OF CANNABINOIDS AND THEIR USE IN THE TREATMENT OF PAIN
US10709763B2 (en) * 2017-12-19 2020-07-14 Gpcr Therapeutics, Inc. GPCR heteromer inhibitors and uses thereof
JP2022523992A (ja) * 2019-03-06 2022-04-27 インメド ファーマシューティカルズ インコーポレイティド 異種システムにおけるテルペノイドまたはカンナビノイドの生合成のための組成物及び方法
WO2022241298A2 (en) * 2021-05-14 2022-11-17 Cellibre, Inc. Engineered cells, enzymes, and methods for producing cannabinoids

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