KR101958113B1 - (-)-α-비사볼올 생산 미생물 및 상기 미생물을 이용한 (-)-α-비사볼올 생산 방법 - Google Patents

(-)-α-비사볼올 생산 미생물 및 상기 미생물을 이용한 (-)-α-비사볼올 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101958113B1
KR101958113B1 KR1020170128169A KR20170128169A KR101958113B1 KR 101958113 B1 KR101958113 B1 KR 101958113B1 KR 1020170128169 A KR1020170128169 A KR 1020170128169A KR 20170128169 A KR20170128169 A KR 20170128169A KR 101958113 B1 KR101958113 B1 KR 101958113B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bisabolol
medium
gene
strain
mrbbs
Prior art date
Application number
KR1020170128169A
Other languages
English (en)
Inventor
이승구
김선창
이대희
한귀환
김성근
성봉현
염수진
김하성
Original Assignee
한국생명공학연구원
재단법인 지능형 바이오 시스템 설계 및 합성 연구단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원, 재단법인 지능형 바이오 시스템 설계 및 합성 연구단 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020170128169A priority Critical patent/KR101958113B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101958113B1 publication Critical patent/KR101958113B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/0101—(2E,6E)-Farnesyl diphosphate synthase (2.5.1.10), i.e. geranyltranstransferase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 (-)-α-비사볼올 생산 미생물 및 상기 미생물을 이용한 (-)-α-비사볼올 생산 방법에 관한 것으로, 상기 (-)-α-비사볼올 생산 미생물을 이용하면 (-)-α-비사볼올을 대량으로 생산할 수 있으며, 생산된 (-)-α-비사볼올을 용이하게 회수할 수 있다.

Description

(-)-α-비사볼올 생산 미생물 및 상기 미생물을 이용한 (-)-α-비사볼올 생산 방법{(-)-α-Bisabolol Producing Microorganism And Method of Producing (-)-α-Bisabolol Using Thereof}
본 발명은 (-)-α-비사볼올 생산 미생물 및 상기 미생물을 이용한 (-)-α-비사볼올 생산 방법에 관한 것이다.
테르페노이드(Terpenoid)는 이소프레노이드(isoprenoid)라는 이름으로도 알려져 있으며, 자연적으로 생성되는 물질 중에서 가장 다양한 종류를 가지는 물질 중의 하나이다. 동물에서는 세포막 성분 및 호흡기의 전자 전달계(respiratory electron transport chain) 구성요소로 이용되고, 미생물 및 식물에서는 2차 대사산물로 발견된다. 이러한 테르페노이드는 파클리탁셀 (paclitaxel) 및 아르테미시닌(artemisinin)과 같은 약물이나 멘톨(menthol), 파출리(patchoulol)와 같은 향료로 이용된다.
모노테르펜(monoterpene), 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 및 디테르펜 (diterpene)을 포함하는 테르페노이드는 테르펜 합성효소(terpene synthases, TPS)에 의하여 IPP(isopentenyl diphosphate) 및 이의 이성질체인 DMAPP(dimethyl allyldiphosphate)로부터 합성되며, IPP 및 DMAPP는 하기 두 대사경로에서 합성된다: 메발로네이트 대사경로(mevalonate(MVA) pathway), 및 2-C-methyl-d-erythritol 4-phosphate(MEP) 대사경로. 일반적으로, 대장균 (Escherichia coli)을 포함하는 그람-음성 세균(Gram-negative bacteria)은 MEP 대사경로를 이용하고, 진핵생물(eukaryote), 고세균(archaea), 인간 및 그람-양성 구균(Gram-positive cocci)은 MVA 대사경로를 이용한다. 프레닐트랜스퍼라제(Prenyltransferases)는 IPP와 DMAPP를 조립하여 GPP(geranyl diphosphate, C10), FPP(farnesyl diphosphate, C15), 및 GGPP(geranyl geranyl diphosphate, C20)를 포함하는 테르페노이드 전구체, 즉 프레닐 이인산(prenyl diphosphate)을 합성한다. 이러한 프레닐 이인산 분자는 테르펜 합성효소에 의하여 다양한 종류의 테르페노이드로 전환된다.
(-)-α-비사볼올((-)-α-bisabolol)은 브라질 칸데이아 나무(Brazilian candeia tree; Eremanthus erythropappus) 및 독일 카모마일(German chamomile; Matricaria recutita)과 같은 약용 허브(medicinal herbs)에서 발견되는 불포화 세스퀴테르펜 알코올(unsaturated sesquiterpene alcohol)이다. (-)-α-비사볼올은 항균, 소독 및 항염 활성이 있으며, 피부 진정(skin soothing) 및 보습에도 효능이 있다.
현재 천연 (-)-α-비사볼올은 브라질 칸데이아 나무에서 추출된 칸데이아 정유(candeia essential oil)를 증기-증류(steam-distillation)하여 제조하고 있으나, 환경 오염 및 생물보전 문제를 발생시키는 단점이 있다. 또한, (-)-α-비사볼올을 화학적으로 합성할 수 있으나, 화학 합성은 원치 않은 부분입체이성질체(diastereomer)인 (+)-α-비사볼올 및 (±)-epi-α-비사볼올이 같이 합성되고, 부산물이 생성되어 정제 과정이 추가로 필요한 단점이 있다.
최근 단일 테르페노이드 산물로서 (-)-α-비사볼올만을 선택적으로 합성할 수 있는 효소가 독일 카모마일에서 발견되었다. 이 합성효소를 효모 (Saccharomyces cerevisiae)에 도입하여 4일 동안 배양한 결과, 8 ㎎/L의 (-)-α-비사볼올이 생산되는 것을 확인하였으나 산업적 규모로 생산하기에는 생산성이 낮은 문제가 있었다.
1. 대한민국 등록특허 제10-1735697호 1. 대한민국 공개특허 제10-2012-0088062호
본 발명의 일 목적은 (-)-α-비사볼올((-)-α-bisabolol) 합성효소 유전자 및 메발로네이트 대사경로(mevalonate pathway) 유전자가 도입되어 (-)-α-비사볼올 생산능이 개선된 에스케리치아(Escherichia) 속 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및 배양 결과물로부터 (-)-α-비사볼올을 분리하는 단계를 포함하는 (-)-α-비사볼올 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 (-)-α-비사볼올 합성효소 유전자 및 메발로네이트 대사경로(mevalonate pathway; 이하, MVA 대사경로로 기재함) 유전자가 도입되어 (-)-α-비사볼올 생산능이 개선된 에스케리치아(Escherichia) 속 균주를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, '(-)-α-비사볼올'은 세스퀴테르펜 알코올(sesquiterpene alcohol)의 한 종류로 레보메놀(levomenol)로도 알려져 있다. 항염증, 피부 보습 및 진정 효능이 있어 화장품의 성분으로 이용되어 왔으며, 최근 멜라닌의 생합성을 억제하여 미백 효과가 있는 것으로 밝혀졌다. 광학이성질체(enantiomer)로 (+)-α-비사볼올이 있으나 자연계에서는 드물게 발견되고, β-비사볼올은 알코올 작용기(-OH)의 위치가 (-)-α-비사볼올과 상이하다. 지금까지 알려진 비사볼올 합성 방법은 라세믹 혼합물(recemic mixture)인 (±)-α-비사볼올의 형태로 합성하기 때문에 (-)-α-비사볼올을 분리 및 정제하는 과정이 추가로 필요한 단점이 있었다.
본 명세서에서 사용된 용어, '(-)-α-비사볼올 생산능이 개선된 에스케리치아 속 균주'는 (-)-α-비사볼올을 생산 및 분비할 수 있는 균주로서 모균주 또는 야생형 균주보다 대량으로 또는 고농도로 배지에 (-)-α-비사볼올을 축적시킬 수 있는 균주를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 에스케리치아 속 균주는 대장균(Escherichia coli; 이하, E. coli로 기재함)일 수 있다. 상기 대장균은 E. coli DH5α, MG1655 및 BL21(DE3)로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, DH5α인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 에스케리치아 속 균주는 내부 2-C-methyl-d-erythritol 4-phosphate 대사경로(이하, MEP 대사경로로 기재함)를 가지고 있으나, (-)-α-비사볼올 합성효소 유전자 및 MVA 대사경로 유전자로 형질전환되어 (-)-α-비사볼올을 고효율로 생산할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, '형질전환(transformation)'은 폴리뉴클레오티드를 숙주로 도입하여 폴리뉴클레오티드가 게놈 외 인자로서 또는 게놈에 삽입되어 원하는 유전자를 복제 가능하도록 유도하는 방법을 의미한다. 예를 들어 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
형질전환 과정에 있어서 상기 벡터 등을 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 (-)-α-비사볼올 합성효소 유전자는 MrBBS (Matricaria recutita (-)-α-bisabolol synthase) 유전자일 수 있으며, FPP(farnesyl diphosphate)로부터 (-)-α-비사볼올만을 선택적으로 합성할 수 있는α-비사볼올 합성효소를 암호화한다. 또한, 상기 MrBBS 유전자는 E. coli 코돈에 최적화된 서열로 도입될 수 있다. 코돈 최적화(codon optimization)란 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 E. coli에 도입할 때, 목적 단백질이 잘 발현될 수 있도록 E. coli가 선호하는 코돈으로 바꾸는 작업을 의미한다. 코돈 최적화 과정을 거치면 염기서열이 바뀌어 유전자 서열은 변형되지만 아미노산 서열은 바뀌지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 MVA 대사경로 유전자는 글리세롤과 같은 탄소원으로부터 (-)-α-비사볼올을 합성하는 대사 과정에 관여하는 유전자를 의미한다. MVA 대사경로 유전자는 mvaK1 (mevalonate kinase, 메발로네이트 키나제; GenBank accession number: AF290099), mvaD (mevalonate 5-diphosphate decarboxylase, 메발로네이트 5-인산 디카르복실라제; GenBank accession number: AF290099), mvaK2 (phosphomevalonate kinase, 포스포메발로네이트 키나제; GenBank accession number: AF290099) 및 idi (isopentenyl diphosphate isomerase, 이소펜테닐 이인산 이소머라제; GenBank accession number: AF119715)를 포함할 수 있다. 또한, mvaE (acetoacetyl-CoA thiolase, 아세틸-CoA 티올라제; GenBank accession number: AF290092) 및 mvaS (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase; GenBank accession number: AF290092)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 MVA 대사경로 유전자들은 IPP(isopentenyl diphosphate) 및 DMAPP(dimethyl allyldiphosphate)의 공급을 증가시키는 역할을 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 (-)-α-비사볼올 생산 균주는 FPP(farnesyl diphosphate) 합성효소 유전자가 추가로 도입된 것일 수 있으며, FPP 합성효소 유전자는 ispA(farnesyl diphosphate synthase, 파르네실 이인산 합성효소; GenBank accession number: AAC73524)일 수 있다. 상기 FPP 합성효소는 IPP 및 DMAPP로부터 FPP를 합성하여 (-)-α-비사볼올 전구체를 공급하는 역할을 할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 (-)-α-비사볼올 생산능이 개선된 에스케리치아 속 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및 배양 결과물로부터 (-)-α-비사볼올을 분리하는 단계를 포함하는 (-)-α-비사볼올 생산 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, '배양(culture)'은 미생물을 적절히 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 미생물을 배양하는 방법은 당업계에 알려져 있는 적당한 배지와 배양조건에 따라 수행할 수 있으며, 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예로는, 회분식 배양(batch culture), 연속 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함될 수 있으며, 배양 배지에는 당 분야에 알려진 LB 배지, TB 배지, M9 배지 및 2xYT 배지가 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, '배지(media)'는 본 발명의 (-)-α-비사볼올 생산 균주의 배양에 사용되는 것으로 상기 균주가 (-)-α-비사볼올을 생산할 수 있도록 탄소원, 질소원 및 무기염류를 포함하는 배지를 의미한다. 탄소원으로는 전분, 포도당, 자당, 갈락토스, 과당, 글리세롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어 글리세롤이 바람직하다. 질소원으로는 황산암모늄, 질산암모늄, 질산나트륨, 글루탐산, 카사미노산, 효모추출물, 펩톤, 트립톤, 대두박 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 미네랄은 염화나트륨, 인산제이칼륨, 황산 마그네슘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 (-)-α-비사볼올 생산 방법에서 균주를 배지에서 배양하는 단계는 탄소원으로서 글리세롤을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 0.1 내지 3.5%(w/v)의 글리세롤을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. 또한, 상기 균주를 배양하는 단계는 MVA 대사경로의 중간 산물, 예를 들면 메발로네이트(이하, MVA로 기재함)를 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. (-)-α-비사볼올 생산 균주가 하부 MVA 대사경로만을 이용하도록 형질전환된 경우 0.1 내지 15 mM 농도의 MVA가 부가된 배지에서 배양이 이루어질 수 있다. 또한, 상기 배양 배지는 균주의 생장에 적절하도록 pH가 조절될 수 있으며, pH 4 내지 10인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 균주를 배지에서 배양하는 단계는 배양 배지 위에 n-도데카인(n-dodecane) 또는 식물성 오일(vegetable oils)을 오버레이(overlay)하여 배양하는 것일 수 있다. 따라서 배양이 종료된 후 상기 n-도데카인층(n-dodecane phase) 또는 식물성 오일층을 회수하여 (-)-α-비사볼올을 손실없이 수득할 수 있다. 상기 식물성 오일은 대두 오일, 카놀라 오일, 옥수수 오일 및 해바라기 오일로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 (-)-α-비사볼올 생산 균주를 이용하면 (-)-α-비사볼올을 대량으로 생산할 수 있으며, 생산된 (-)-α-비사볼올을 용이하게 회수할 수 있다.
도 1은 (-)-α-비사볼올 합성 과정에 관여하는 내재 MEP 대사경로(endogenous 2-C-methyl-d-erythritol 4-phosphate pathway) 유전자 및 외래 MVA 대사경로(exogenous mevalonate pathway) 유전자를 보여주는 도이다.
도 2는 pTSN-MrBBS, pSSN12Didi, pSNA-MrBBS 및 pSNA-MrBBS-IspA 플라스미드의 구조를 개략적으로 보여주는 도이다.
도 3A는 다른 농도의 (-)-α-비사볼올을 포함하는 LB 배지에서 E. coli DH5α, MG1655 및 BL21(DE3)를 배양한 후 시간에 따른 생장 정도를 보여주는 도이다.
도 3B는 다른 농도의 (-)-α-비사볼올을 포함하는 LB 고체 배지에서 E. coli DH5α, MG1655 및 BL21(DE3)를 배양한 후 CFU(colony-forming unit)를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 4는 pTSN-MrBBS 플라스미드로 형질전환된 DH5α를 배양한 후, n-도데카인층(n-dodecane phase)을 분리하여 가스 크로마토그래피(gas chromatography,GC)로 분석한 결과를 보여주는 것이다.
도 5A는 GC-질량분석기(GC-mass spectrometry)로 (-)-α-비사볼올을 분석한 결과를 보여주는 도이다.
도 5B는 pTSN-MrBBS 플라스미드로 형질전환된 DH5α를 배양한 후, n-도데카인층에서 분리한 25.6분대의 피크(peak)를 GC-질량분석기로 분석한 결과를 보여주는 도이다.
도 6A는 pSSN12Didi 플라스미드와 pTSN-MrBBS 플라스미드로 형질전환된 DH5α를 다른 농도의 메발로네이트를 첨가한 배지에서 배양한 후 (-)-α-비사볼올의 생산량을 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 6B는 pSSN12Didi 플라스미드와 pTSN-MrBBS 플라스미드로 형질전환된 DH5α를 다른 농도의 메발로네이트를 첨가한 배지에서 배양한 후 세포 생장 정도를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 7A는 M9, LB, 2xYT 배지 및 서로 다른 농도의 글리세롤을 첨가한 TB 배지에서 pSNA-MrBBS 플라스미드로 형질전환된 DH5α를 배양한 후 (-)-α-비사볼올의 생산량을 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 7B는 pSNA-MrBBS 플라스미드로 형질전환된 DH5α를 배양한 후 첨가한 IPTG의 농도에 따른 (-)-α-비사볼올의 생산량을 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 8A는 서로 다른 pH의 TB 배지에서 pSNA-MrBBS 플라스미드로 형질전환된 DH5α를 배양하여 (-)-α-비사볼올의 생산량을 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 8B는 E. coli 균주 종류에 따른 (-)-α-비사볼올의 생산량을 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 9A는 ispA 유전자의 과발현 여부에 따른 (-)-α-비사볼올의 생산량을 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 9B는 pSNA-MrBBS-IspA 플라스미드로 형질전환된 DH5α를 배양하여 IPTG 첨가 유무에 따른 (-)-α-비사볼올의 생산량을 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 10A는 pSNA-MrBBS-IspA 플라스미드로 형질전환된 DH5α를 30℃에서 배양하면서 (-)-α-비사볼올의 생산량, 배지 성분 및 세포 생장 정도를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 10B는 pSNA-MrBBS-IspA 플라스미드로 형질전환된 DH5α를 25℃에서 배양하면서 (-)-α-비사볼올의 생산량, 배지 성분 및 세포 생장 정도를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 11은 pSNA-MrBBS-IspA 플라스미드로 형질전환된 DH5α를 이용하여 25℃에서 유가식 발효를 진행하면서 (-)-α-비사볼올의 생산량, 배지 성분 및 세포 생장 정도를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험방법
1. E. coli 균주, 배지 및 배양 조건
플라스미드 클로닝(cloning) 및 (-)-α-비사볼올 생산에 사용한 E. coli 균주는 DH5α, MG1655 및 BL21(DE3)이다. MG1655 및 BL21(DE3)는 숙주(host)에 따른 (-)-α-비사볼올의 생산성 및 독성을 비교하기 위한 용도로 이용하였다. 상기 E. coli 균주는 LB 배지(Luria Bertani medium; 트립톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 및 NaCl 5 g/L)에서 배양하였다.
(-)-α-비사볼올 생산(30℃ 및 200 rpm 조건)에 이용한 배지는 하기와 같다: TB 배지 (terrific broth medium; 카제인 효소 소화물 12 g/L, 효모 추출물 24 g/L, K2HPO4 9.4 g/L, 및 KH2PO4 2.2 g/L); 2xYT 배지 (트립톤 16 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 및 NaCl 5 g/L); 및 M9 최소 배지(M9 minimal medium; Na2HPO4 6.78 g/L, KH2PO4 3 g/L, NaCl 0.5 g/L, NH4Cl 1 g/L, MgSO4 0.241 g/L, CaCl2 0.0111 g/L, 및 티아민(thiamine) 0.1 g/L). M9 최소 배지는 4 g/L의 글루코스를 첨가하여 사용하였으며, 각각의 배지에는 용도에 맞게 암피실린(ampicillin; 100 ㎍/㎖) 또는 클로람페니콜(chloramphenicol; 34 ㎍/㎖)을 첨가하였다. 또한, (-)-α-비사볼올 생산을 유도하기 위하여 배양 중 IPTG(isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하였다.
n-도데카인(n-dodecane)은 휘발성 성분의 손실을 방지하기 위하여 배지에 오버레이(overlay)하였고, (-)-α-비사볼올의 농도가 높을 경우 E. coli 생장에 유해하기 때문에 생산된 (-)-α-비사볼올의 용해 및 추출에도 이용하였다. MVA는 메발로노락톤(mevalonolactone; Sigma Aldrich, 미국)으로부터 당업계에 알려진 방법(J Biol Chem. 1992; 267:23113-23121)으로 준비하였다.
E. coli의 생장 정도는 분광광도계(spectrophotometer; Ultrospec 8000, GE Healthcare, 스웨덴)로 600 ㎚(OD600)에서 흡광도를 측정하여 모니터링하였다. 또한, (-)-α-비사볼올이 E. coli의 생장에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다양한 농도의 (-)-α-비사볼올을 첨가한 LB 액체 배지에서 E. coli를 배양하였다. E . coli 배양 중 정체기(stationary phase)에 배양액의 일부를 수거하여 LB 고체 배지에 분주하고, 30℃에서 밤새 배양한 후 CFU(colony-forming unit)를 확인하였다.
2. 플라스미드 제작( Plasmid construction)
2-1. pTSN - MrBBS 플라스미드
게놈 DNA 분리, 제한효소 절단, 형질전환 및 다른 분자 생물학적 실험 방법은 당업계에 알려진 통상의 방법에 따라 수행하였다. 모든 제한효소 및 T4 DNA ligase는 New England Biolabs (Ipswich, USA)에서 구입하였다. PCR (polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄 반응)은 high fidelity KOD-Plus-Neo polymerase(Toyobo, Osaka, Japan)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 플라스미드 분리 및 젤 분리 키트(gel extraction kits)는 Promega (Madison, USA) 제품을 이용하였고, 올리고뉴클레오티드는 Bioneer(Daejeon, Korea)에 주문하여 합성하였다. (-)-α-비사볼올 합성효소((-)-α-bisabolol synthase)를 암호화하는 MrBBS 유전자(GenBank accession number: KJ020282)는 E. coli 코돈에 적합하도록 최적화시킨 후 Bioneer에서 합성하여 GenBank database에 등록(accession number: KU680479)하였다. 합성된 MrBBS 유전자 서열은 Bis-IF 및 Bis-IR 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, pTrc99A (GE Healthcare) 벡터를 Bis-VF 및 Bis-VR 프라이머로 증폭하여 플라스미드 백본(plasmid backbone)을 제작하였다. 상기 증폭된 MrBBS 유전자 서열과 플라스미드 백본을 Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs)로 연결시켜 pTSN-MrBBS 플라스미드를 제작하였다.
플라스미드 제작에 이용한 상기 MrBBS 유전자는 독일 카모마일(German chamomile)에서 분리된 것으로 (-)-α-비사볼올만을 단독으로 생산한다. 단일 주요 산물로 (-)-α-비사볼올을 생산하는 TPS(terpene synthase)가 연구된 바 있으나, 상기 TPS는 일반적으로 상이한 구조를 갖는 바람직하지 않은 이성질체(isomer) 또는 알려지지 않은 입체화학(stereochemistry)의 α-비사볼올을 생산하는 단점이 있었다.
2-2. pSNA - MrBBS 플라스미드
MVA 대사경로의 모든 유전자를 포함하는 pSNA 플라스미드(Biotechnol Prog. 2007;23:599-605)를 XbaI으로 절단하여 MVA 대사경로 유전자 단편을 제조하였다. 이후 XbaI으로 절단한 pTSN-MrBBS 플라스미드와 상기 MVA 대사경로 유전자 단편을 T4 DNA ligase로 연결(ligation)하여 전체 폴리시스트로닉(entire polycistronic) MVA 대사경로 유전자를 pTSN-MrBBS 플라스미드에 삽입시켰다. 전체 MVA 대사경로 유전자가 도입된 플라스미드를 pSNA-MrBBS로 명명하였다.
2-3. pSNA - MrBBS - IspA 플라스미드
(-)-α-비사볼올은 프레닐 이인산 전구체(prenyl diphosphate precursor)인 FPP의 탈피로인산화(depyrophosphorylation)에 의하여 만들어진다. 따라서, FPP 합성효소를 이용하여 IPP 및 DMAPP로부터 FPP를 합성하는 것은 (-)-α-비사볼올의 생산성을 향상시키는 데 있어 중요한 역할을 한다. 또한, FPP와 같은 프레닐 이인산(prenyl diphosphate)의 농도가 높을 경우 E. coli의 생장에 유해하기 때문에 FPP는 TPS에 의하여 후속 대사산물(downstream products)로 효율적으로 전환될 필요가 있다.
따라서 테르페노이드 생합성 중간체인 FPP와 (-)-α-비사볼올의 합성을 증가시키기 위하여 FPP 합성효소(farnesyl diphosphate synthase)를 과발현(Overexpression)시켰다. 먼저, E. coli MG1655의 게놈 DNA로부터 FPP 합성효소를 암호화하는 ispA 유전자(GenBank accession number: AAC73524)를 IspAI-F 및 IspAI-R 프라이머로 증폭하였다. PCR 과정에서 발생하는 교정 오류(proofreading error)를 방지하기 위하여 증폭된 ispA 유전자를 먼저 pTSN-MrBBS 플라스미드의 XbaI 제한효소 사이트에 삽입시켰다(pTSN-MrBBS-IspA 플라스미드). 이후 pTSN-MrBBS-IspA 플라스미드와 pSNA 플라스미드를 XbaI으로 절단하고, 연결하여 pSNA-MrBBS-IspA 플라스미드를 제작하였다. MVA 대사경로 유전자의 방향성은 생어 서열분석(Sanger sequencing)으로 확인하였다.
도 1은 글리세롤로부터 (-)-α-비사볼올을 합성하는 과정에 관여하는 내재 MEP 대사경로 유전자 및 외래 MVA 대사경로 유전자를 보여주는 것이다.
도 2는 pTSN-MrBBS, pSSN12Didi, pSNA-MrBBS 및 pSNA-MrBBS-IspA 플라스미드의 구조를 개략적으로 보여주는 것이다.
실험에 사용한 E. coli 균주와 플라스미드의 특징, 및 프라이머 서열을 하기 표 1에 기재하였다.
Figure 112017096375990-pat00001
3. 회분식 발효 및 유가식 발효(Batch fermentation and fed-batch fermentation)
상기 2.에서 제작한 플라스미드로 형질전환된 E. coli를 TB 배지 100 ㎖에서 30℃ 및 180 rpm 조건으로 전배양(pre-culture)하였다. 1 L 발효조(fermenter)에 400 ㎖ TB 배지와 10 g/L의 글리세롤을 첨가하고, 상기 전배양액을 1% (v/v) 농도로 접종하여 회분식 발효(batch fermentation)를 수행하였다. 발효 과정은 온도 30℃ 및 교반 속도 200 rpm의 조건에서 1 vvm (volume of air/volume of medium/min)의 유속으로 공기를 통하게 하여(air-aerated) 진행하였다. 배지에 1 M HCl과 25% NH4OH 용액을 첨가하여 pH 7.0으로 조정하고, 발효 과정 동안 배양액으로부터 지속적으로 (-)-α-비사볼올을 분리하기 위하여 n-도데카인 80 ㎖(배지 부피의 20%(v/v))을 배지에 오버레이하였다.
유가식 발효(fed-batch fermentation)는 회분식 공정(batch operation)으로 시작하였으며, OD600이 3.0에 도달하였을 때 유가 모드(fed-batch mode)로 전환하여 24시간 동안 발효시켰다. 유가식 발효 시작 시에 TB 배지에 10 g/L 글리세롤, 0.1% (v/v) 미량 원소 용액(trace element solution; 27 g/L FeCl36H2O, 2 g/L ZnCl24H2O, 2 g/L CoCl26H2O, 2 g/L Na2MoO42H2O, 1 g/L CaCl22H2O, 1.3 g/L CuCl26H2O, 및 0.5 g/L H3BO3) 및 1% (v/v) 비타민 용액(Sigma Aldrich, Cat. No. M6895)을 첨가하였다. 이후 글리세롤을 0.01 L/h 수준으로 공급하였고, 10% (v/v) 카놀라 오일을 TB 배지 30 L에 오버레이하였다.
4. n - 도데카인과 식물성 오일을 이용한 (-)-α- 비사볼올의 분리
4종의 식물성 오일을 이용하여 (-)-α-비사볼올을 분리하였다: 카놀라 오일(canola oil), 해바라기 오일(sunflower oil), 옥수수 오일(corn oil) 및 대두 오일(soy-bean oil). 멸균된 TB 배지 10 ㎖에 총 0.1 g의 (-)-α-비사볼올을 첨가하고, 상기 식물성 오일을 각각 1 ㎖씩 오버레이하였다. 배지와 오일의 혼합물을 가볍게 교반한 후, 물-기반 TB 배지와 오일층이 분리되도록 25℃에서 1시간 동안 방치하였다. 이후 수상층(aqueous layer)은 제거하고, 유기층(organic layer)은 새로운 튜브로 옮겨 가스 크로마토그래피(gas chromatography, GC)로 분석하였다. 각 식물성 오일과 n-도데카인의 (-)-α-비사볼올 회수율(recovery yield)을 비교하였다.
n-도데카인의 (-)-α-비사볼올 회수 효율(recovery efficiency)을 하기와 같이 확인하였다. E . coli DH5α에 pSNA-MrBBS-IspA 플라스미드를 형질전환시키고, 20%(v/v) n-도데카인을 첨가한 TB 배지를 이용하여 30℃ 및 180 rpm 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛(pellet), 상등액(supernatant) 및 유기층으로 분획하고, 유기층은 바로 GC로 분석하였다. 분리한 상등액은 20%(v/v) n-도데카인과 혼합하여 30분 동안 방치하고, 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 유기층을 분리한 후 GC로 분석하였다. 세포 펠렛은 먼저 초음파로 세포를 분쇄한 뒤 세포 용해물(lysate)을 이용하여 상기와 동일한 방법으로 (-)-α-비사볼올 함량을 분석하였다.
5. (-)-α- 비사볼올의 동정 및 정량
배양액(culture broth)을 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 n-도데카인층(n-dodecane phase)을 회수하고, GC 및 GC-질량분석기(GC-mass spectrometry, GC-MS)로 (-)-α-비사볼올을 분석하였다. (-)-α-비사볼올은 HP-5MS 컬럼(30 m x 0.250 ㎜ x 0.25 ㎛, Agilent, Santa Clara, USA)을 이용하여 GC-MS (5977A MSD)로 동정하였다. 유속은 1 ㎖/min으로 유지하고, 오븐 온도는 초기 2분 동안 60℃로 유지하다가 5℃/min의 속도로 300℃까지 상승시킨 후 300℃에서 10분 동안 유지하였다. 표준물질은 (-)-α-비사볼올(Cat. No. 2308926-1, Sigma Aldrich)을 이용하였고, GC-MS 소프트웨어인 Mass Hunter(Agilent, Santa Clara, USA)로 확인하였다. (-)-α-비사볼올 정량(quantification)은 불꽃이온화검출기 (flame ionization detector, FID) 및 HP-5 컬럼(30 m x 0.320 ㎜ x 0.25 ㎛)이 장착된 GC를 이용하여 유속 1 ㎖/min 조건에서 수행하였다. 오븐은 초기 2분 동안 60℃로 유지하다가 5℃/min의 속도로 200℃까지 상승시켜 2분 동안 유지한 후, 5℃/min의 속도로 300℃까지 상승시켜 5분 동안 유지하였다. 헬륨(helium)은 5.58 psi의 인렛 압력(inlet pressure)을 가지는 운반 가스(carrier gas)로 이용되었다. 형질전환된 E. coli에서 생산된 (-)-α-비사볼올의 농도는 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.
Figure 112017096375990-pat00002
6. 글리세롤 소비량 및 부산물 생성 정도 분석
배양액을 원심분리하여 상등액을 회수한 후 글리세롤 소비량 및 부산물 생성 정도를 정량하였다. 구체적으로 454 ㎚의 시차굴절 검출기(refractive index detector) 및 Aminex HPX87H 컬럼(1300 ㎜ x 7.8 ㎜; Bio-Rad, Hercules, USA)을 장착한 HPLC(high performance liquid chromatography; Shimadzu, Kyoto, Japan)로 글리세롤, 아세테이트 및 MVA의 농도를 분석하였다. 이동상은 황산(sulfuric acid, 0.4 mM)을 이용하고, 50℃에서 0.3 ㎖/min의 유속으로 분석하였다.
실험결과
1. (-)-α- 비사볼올 생산 균주
(-)-α-비사볼올은 항균 효과를 나타내므로 3종류의 E. coli 균주를 (-)-α-비사볼올을 포함하는 LB 배지에서 배양하여 (-)-α-비사볼올 생산에 적합한 균주를 확인하였다.
확인 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이 배지에 (-)-α-비사볼올을 첨가한 경우 세포 생장이 저해되는 것을 알 수 있었다. 배양 3시간 후(mid-log phase), BL21(DE3)는 1 및 5 g/L의 (-)-α-비사볼올을 첨가한 배지에서 생장이 현저하게 감소하였다. MG1655는 1 또는 5 g/L의 (-)-α-비사볼올 농도에 영향을 받지 않았으며, DH5α의 경우 5 g/L의 (-)-α-비사볼올 농도에서 생장이 약간 감소하였으나 1 g/L 농도에서는 생장에 영향이 없었다.
또한, 각 균주의 배양액을 초기 정체기(early stationary phase)에 수거하여 CFU를 측정하였다. 측정 결과, 도 3B에 나타난 것과 같이 (-)-α-비사볼올을 첨가한 경우 BL21(DE3)는 콜로니를 전혀 형성하지 않은 반면, DH5α는 (-)-α-비사볼올에 가장 강한 내성을 나타내었다. 상기 실험 결과를 고려하여 E. coli DH5α를 (-)-α-비사볼올 생산 균주로 선택하여 추후 실험에 이용하였다.
2. MrBBS 유전자를 발현하는 E. coli DH5α에서 (-)-α- 비사볼올 생산
pTSN-MrBBS 플라스미드로 형질전환된 DH5α를 20%(v/v) n-도데카인이 오버레이된 LB 배지에서 48시간 동안 배양하여 2상 배양(two-phase cultures)을 수행하였다.
배양 결과, 도 4에 나타난 것과 같이 n-도데카인층 샘플에서 25.6분에 피크가 나타나는 것을 알 수 있었으며, n-도데카인에 용해시킨 표준 (-)-α-비사볼올을 분석한 결과 상기 피크가 (-)-α-비사볼올인 것을 확인할 수 있었다. 반면 pTrc99A 플라스미드로 형질전환된 DH5α(대조군)의 배양액에서는 25.6분대의 피크를 관찰할 수 없었다. 또한, 도 5A 및 5B에 나타난 것과 같이 표준 (-)-α-비사볼올의 피크와 25.6분에 나타난 피크의 질량 분석 결과가 동일한 것을 확인할 수 있었다. 상기 실험 결과를 통하여 pTSN-MrBBS 플라스미드를 도입한 DH5α에서 3 ㎎/L의 (-)-α-비사볼올이 생산된 것을 확인할 수 있었다.
3. MrBBS 유전자 및 MVA 대사경로 유전자를 발현하는 E. coli DH5α에서 (-)-α-비사볼올 생산
미생물에서 테르페노이드(terpenoids) 생산은 중요한 대사과정 중간체가 TPS 기질[예를 들어, GPP(geranyl diphosphate), FPP(farnesyl diphosphate) 또는 GGPP(geranyl geranyl diphosphate)]로 공급(flux)되는 것에 의해 주로 제한된다. 따라서, TPS 기질 공급을 증가시키기 위하여, MVA에서 IPP와 DMAPP로 이어지는 하부 MVA 대사경로를 암호화하는 pSSN12Didi 플라스미드를 pTSN-MrBBS 플라스미드와 공동으로 DH5α에 형질전환시켰다. E . coli에서 MVA는 외부 기질(exogenous substrate)이므로, 첨가된 MVA는 하부 MVA 대사경로에 의하여 IPP 및 DMAPP로만 전환될 수 있다.
LB 배지에 0 내지 10 mM의 MVA를 각각 첨가하여 30℃에서 48시간 동안 배양한 결과, 도 6A에 나타난 것과 같이 MVA 농도에 비례하여 (-)-α-비사볼올 생산이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 도 6B에 나타난 것과 같이 DH5α의 생장은 MVA 농도에 영향을 받지 않지 않았다. 10 mM의 MVA를 첨가한 경우 10.5 ㎎/L의 (-)-α-비사볼올이 생산되어 MVA를 첨가하지 않은 경우(3 ㎎/L)보다 (-)-α-비사볼올 생산성이 약 3.5배 증가한 것을 확인할 수 있었다. 상기 실험 결과를 통하여, E. coli에 하부 MVA 대사경로 유전자를 도입하고, MVA를 첨가하여 배양하면 (-)-α-비사볼올 생산성이 향상되는 것을 알 수 있다.
그러나 MVA는 경제적이지 않기 때문에, 글리세롤과 같은 가격이 저렴한 기질을 이용하기 위하여 pSNA-MrBBS 플라스미드를 제작하였다. pSNA-MrBBS 플라스미드는 MrBBS 유전자와 완전한 MVA 대사경로 유전자를 포함하며, MVA가 없어도 IPP 및 DMAPP를 생산할 수 있다.
pSNA-MrBBS 플라스미드를 도입한 DH5α를 LB 배지에서 배양한 결과, 도 7A에 나타난 것과 같이 글리세롤로부터 총 12.8 ㎎/L의 (-)-α-비사볼올이 생산되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 MrBBS 유전자와 하부 MVA 대사경로 유전자를 도입하고, 10 mM의 MVA를 첨가하여 배양한 경우(도 5A, 10.5 ㎎/L)보다 높은 수준이었다. 상기 결과를 통하여 E. coli에 완전한 MVA 대사경로 유전자를 도입하면 (-)-α-비사볼올 생산성이 현저하게 증가한다는 것을 알 수 있다.
4. MrBBS 유전자 및 MVA 대사경로 전체 유전자를 발현하는 E. coli DH5α에 서 (-)-α-비사볼올 생산을 위한 최적 조건
FPP(farnesyl diphosphate)의 전구체인 IPP와 DMAPP는 tRNA 프레닐화(prenylation), 호흡을 위한 퀴논(quinone)과 돌리콜(dolichol)의 합성, 및 세포벽 생합성에 이용되는 E. coli의 필수 대사산물이다. 따라서, 세포 내부의 필수 대사과정(endogenous essential metabolism)과 (-)-α-비사볼올 생산 사이에서 IPP와 DMAPP의 대사 균형을 유지하는 것은 (-)-α-비사볼올 생산성 향상 및 생장 저해를 완화시키는 것에 중요한 역할을 한다. 따라서 배양 배지 및 글리세롤의 이용가능성(availability)에 따라 (-)-α-비사볼올 생산성이 저해되는지 확인하였다.
서로 다른 배지에 0 내지 3.5%(w/v)의 글리세롤을 첨가하고, pSNA-MrBBS 플라스미드로 형질전환시킨 DH5α를 배양하였다. 배양 결과, 도 7A에 나타난 것과 같이 여분의 탄소원을 첨가하지 않은 경우 TB 배지에서 배양하였을 때 가장 많은 (-)-α-비사볼올이 생산되었다(24.2 ㎎/L). 또한, TB 배지에 1% 글리세롤을 공급한 경우 34.8 ㎎/L의 (-)-α-비사볼올이 생산되어 글리세롤을 첨가하지 않은 경우(24.2 ㎎/L)보다 (-)-α-비사볼올 생산량이 약 1.4배 증가하였다. 그러나 3%(w/v) 글리세롤을 첨가한 경우 (-)-α-비사볼올 생산량이 더 이상 증가하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 최적의 IPTG 농도를 확인하기 위하여 pSNA-MrBBS 플라스미드로 형질전환시킨 DH5α를 TB 배지(+10 g/L 글리세롤)에서 배양하였다. OD600이 0.5가 되었을 때 0 내지 0.1 mM 범위의 IPTG를 배지에 첨가하여 추가로 배양하였다. 배양 결과, 도 7B에 나타난 것과 같이 IPTG를 첨가하지 않아 MrBBS 유전자와 MVA 대사경로 유전자가 불완전하게 발현(leaky expression)된 경우 가장 많은 (-)-α-비사볼올이 생산되는 것을 확인할 수 있었다(38.9 ㎎/L). IPTG를 첨가한 경우, DH5α의 생장은 IPTG 농도와 관계없이 유사하였으나 (-)-α-비사볼올 생산은 현저하게 감소하였다.
또한, 배양 배지의 초기 pH가 (-)-α-비사볼올 생산에 미치는 영향을 확인한 결과 도 8A에 나타난 바와 같이 최적 pH는 7인 것을 확인할 수 있었다(38.2 ㎎/L).
상기 실험 결과를 통하여 확인한 배양 최적 조건에서 (-)-α-비사볼올 생산에 이상적인 E. coli 균주를 확인하기 위하여 E. coli DH5α, MG1655 및 BL21(DE3) 각각에 pSNA-MrBBS 플라스미드를 형질전환시킨 후 배양하였다. 배양은 pH 7.0의 TB 배지에 10 g/L 글리세롤을 첨가하고, 20%(v/v) n-도데카인을 오버레이하여 IPTG의 첨가 없이 수행하였다. 배양 결과, 도 8B에 나타난 바와 같이 DH5α가 가장 많은 양의 (-)-α-비사볼올을 생산하여(38.4 ㎎/L), BL21(DE3)과 비교하여 13배 높은 생산성을 나타내었다.
5. FPP 합성효소 유전자의 과발현이 (-)-α- 비사볼올 생산에 미치는 영향
pSNA-MrBBS-IspA 플라스미드를 DH5α에 형질전환시킨 후 1% (w/v) 글리세롤을 포함하는 TB 배지를 이용하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이때 IPTG는 첨가하지 않고, n-도데카인을 오버레이하여 2상 배양을 진행하였다. 배양 결과, 도 9A에 나타난 것과 같이 ispA 유전자의 과발현에 의하여 79.7 ㎎/L의 (-)-α-비사볼올이 생산되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 pSNA-MrBBS 플라스미드만을 형질전환시킨 경우(39.7 ㎎/L)와 비교하여 2배 정도 증가한 수치이다.
또한, 도 9B에 나타난 바와 같이 IPTG 첨가(0.05 mM)에 의하여 (-)-α-비사볼올의 생산량이 87.8 ㎎/L에서 40.0 ㎎/L로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 세포 생장 정도는 유의한 차이가 발생하지 않았다.
(-)-α-비사볼올의 생산량을 시간별로 모니터링하기 위하여, pSNA-MrBBS-IspA 플라스미드로 형질전환된 DH5α를 이용하여 30℃에서 93시간 동안 회분식 발효를 수행하였다. 발효 결과, 도 10A에 나타난 것과 같이 IPTG의 첨가 없이 (-)-α-비사볼올은 214 ㎎/L가 생산되었으며, 세포는 OD600에서 11.5까지 생장하였다. 배지의 성분을 확인한 결과, MVA 및 아세테이트가 주요 부산물임에도 불구하고, 글리세롤이 소진된 48시간 이후 아세테이트가 소비되었다.
또한, 배양 온도에 따른 (-)-α-비사볼올의 생산량을 확인하였다. 미생물의 생장 온도가 낮으면 전사 속도(transcription rate)가 느려져 이종 효소(heterologous enzyme)의 용해도(solubility)가 증가하고, E. coli에서 단백질 접힘(protein folding)이 잘 일어나기 때문이다. 또한, 대사과정에 관여하는 효소의 용해도가 향상되면 대사산물의 수율 또한 증가한다. 따라서, 동일한 조건으로 25℃에서 회분식 발효를 수행하였다.
발효 결과, 도 10B에 나타난 바와 같이 342 ㎎/L의 (-)-α-비사볼올이 생산되어 30℃에서 발효시킨 경우와 비교하여 생산성이 약 1.6배 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이때, 세포 생장은 25% 감소하였다.
6. (-)-α- 비사볼올의 분리 및 유가식 발효
플라스크 배양 및 회분식 발효에서 생산된 (-)-α-비사볼올은 배지에 오버레이한 n-도데카인을 이용하여 배지로부터 용이하게 분리할 수 있다. 그러나 n-도데카인은 경제적으로 저렴하지 않기 때문에 (-)-α-비사볼올 분리에 식물성 오일이 이용될 수 있는지 확인하였다.
실험 결과, 하기 표 2에 나타난 것과 같이 이용한 모든 식물성 오일이 96.6 내지 98.8%의 추출 수율(extraction yield)을 나타내어 n-도데카인(99.5%)과 유사한 추출 수율을 보이는 것을 확인하였다. 식물성 오일 중에서 카놀라 오일(98.8%)이 가장 우수한 추출 수율을 보였으며, 따라서 유가식 발효 과정에서 (-)-α-비사볼올 추출에 이용하였다.
추출 용액 추출 수율 (%)
대두 오일 (Soybean oil) 98.5
카놀라 오일 (Canola oil) 98.8
옥수수 오일 (Corn oil) 98.5
해바라기 오일 (Sunflower oil) 96.7
n-도데카인 99.5
또한, 산업 규모의 생산과 유사한 조건에서 (-)-α-비사볼올을 생산하기 위하여 50 L 발효조에서 유가식 발효를 수행하였다. 10 g/L의 글리세롤이 첨가된 TB 배지 30 L를 이용하여 pSNA-MrBBS-IspA 플라스미드로 형질전환된 DH5α를 25℃에서 배양하였다. 글리세롤이 완전히 소모되면 3 g/L의 글리세롤을 추가로 공급하고, 추출 용액으로 10% (v/v) 카놀라 오일을 이용하였다.
배양 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 배양 90시간 후 (-)-α-비사볼올의 생산량이 3.3 g/L인 것을 확인하여 25℃에서 수행한 회분 발효보다 거의 8.4배 높은 수준인 것을 알 수 있었다. 또한, 발효가 진행되는 동안 (-)-α-비사볼올은 지속적으로 생산되어 발효 종료시 9.1 g/L까지 축적되었다. 이는 MrBBS 유전자를 과발현시킨 S. cerevisiae(Saccharomyces cerevisiae)를 4일 동안 배양하여 8 ㎎/L의 (-)-α-비사볼올을 생산한 이전 연구 결과와 비교하여 약 1,137배 증가한 수치이다. 최종 발효 결과, (-)-α-비사볼올의 생산 및 생산성은 각각 0.18 g/g DCW (dry cell weight, 건조 균체량) 및 1.24 g/L/day인 것을 확인할 수 있었다.
본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE&BIOTECHNOLOGY INTELLIGENT SYNTHETIC BIOLOGY CENTER <120> Bisabolol Producing Microorganism And Method of Producing Bisabolol Using Thereof <130> PN170133 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 1 aggttaaacc atgagcacac tgagcgtcag 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 2 cgactctaga ttagactatc atcggatgta 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 3 gatagtctaa tctagagtcg acctgcaggc 30 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 4 gtgtgctcat ggtttaacct cctgtgtgaa attgttatc 39 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 5 ggtaccccat atggactttc cgcagcaact 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 6 tgcctctaga ttatttatta cgctggatga 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 7 taataaataa tctagaggca tcaaataaaa 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 8 gaaagtccat atggggtacc tttctcctct 30 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 9 acatccgatg atagtctaat attcattaaa gaggagaaag 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotides <400> 10 tgcatgcctg caggtcgact ctagattatt tattacgctg 40

Claims (14)

  1. (-)-α-비사볼올((-)-α-bisabolol) 합성효소 유전자 및 메발로네이트 대사경로(mevalonate pathway) 유전자가 도입되어 (-)-α-비사볼올 생산능이 개선된 에스케리치아(Escherichia) 속 균주에 있어서,
    상기 균주는 대장균(Escherichia coli) DH5α이고,
    상기 (-)-α-비사볼올 합성효소 유전자는, 대장균 코돈에 적합하도록 최적화시킨 MrBBS 유전자(Matricaria recutita (-)-α-bisabolol synthase)(GenBank accession number: KU680479)를 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 프라이머로 증폭하여 수득된 DNA 단편을 포함하는 재조합 발현벡터에 의해 상기 균주에 도입되고,
    상기 메발로네이트 대사경로 유전자는 mvaK1(mevalonate kinase), mvaD(mevalonate 5-diphosphate decarboxylase), mvaK2(phosphomevalonate kinase), idi(isopentenyl diphosphate isomerase), mvaE(acetoacetyl-CoA thiolase) 및 mvaS(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase)이고,
    상기 균주는 FPP(farnesyl diphosphate) 합성효소 유전자를 포함하고,
    상기 FPP 합성효소 유전자는 ispA(farnesyl diphosphate synthase)이고,
    상기 균주는 글리세롤이 첨가된 pH 7.0의 TB 배지에서 배양되는 것인
    (-)-α-비사볼올 생산능이 개선된 에스케리치아(Escherichia) 속 균주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항의 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양 결과물로부터 (-)-α-비사볼올을 분리하는 단계를 포함하는 (-)-α-비사볼올 생산 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 배지는 TB 배지(terrific broth)인 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 배지는 글리세롤을 추가로 포함하는 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 배지는 pH 7.0인 것인 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 배지 위에 n-도데카인(n-dodecane) 또는 식물성 오일을 오버레이(overlay)하여 배양하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 식물성 오일은 대두 오일, 카놀라 오일, 옥수수 오일 및 해바라기 오일로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
KR1020170128169A 2017-09-29 2017-09-29 (-)-α-비사볼올 생산 미생물 및 상기 미생물을 이용한 (-)-α-비사볼올 생산 방법 KR101958113B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170128169A KR101958113B1 (ko) 2017-09-29 2017-09-29 (-)-α-비사볼올 생산 미생물 및 상기 미생물을 이용한 (-)-α-비사볼올 생산 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170128169A KR101958113B1 (ko) 2017-09-29 2017-09-29 (-)-α-비사볼올 생산 미생물 및 상기 미생물을 이용한 (-)-α-비사볼올 생산 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101958113B1 true KR101958113B1 (ko) 2019-03-14

Family

ID=65759549

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170128169A KR101958113B1 (ko) 2017-09-29 2017-09-29 (-)-α-비사볼올 생산 미생물 및 상기 미생물을 이용한 (-)-α-비사볼올 생산 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101958113B1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210068662A (ko) * 2019-12-02 2021-06-10 한국생명공학연구원 신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소 및 이를 이용한 (-)-알파 비사볼올 생산 방법
WO2022008619A1 (en) 2020-07-07 2022-01-13 Givaudan Sa A method of reducing skin irritation, comprising the application to the skin of an alpha-bisabolol prepared by a biotechnological process
WO2023242403A1 (en) * 2022-06-16 2023-12-21 Danmarks Tekniske Universitet Microbial cells and methods for production of hernandulcin

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120088062A (ko) 2010-11-19 2012-08-08 경상대학교산학협력단 파네솔 생산성이 향상된 에세리키아 속 미생물 및 그를 이용하여 파네솔을 생산하는 방법
KR101735697B1 (ko) 2013-10-07 2017-05-24 서울대학교산학협력단 이종 시스템에서 (-)-α-비사보롤을 생산하는 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120088062A (ko) 2010-11-19 2012-08-08 경상대학교산학협력단 파네솔 생산성이 향상된 에세리키아 속 미생물 및 그를 이용하여 파네솔을 생산하는 방법
KR101735697B1 (ko) 2013-10-07 2017-05-24 서울대학교산학협력단 이종 시스템에서 (-)-α-비사보롤을 생산하는 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
한국생물공학회 학술대회 초록집. P0439. 페이지 458 (2015.10.)* *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210068662A (ko) * 2019-12-02 2021-06-10 한국생명공학연구원 신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소 및 이를 이용한 (-)-알파 비사볼올 생산 방법
KR102343992B1 (ko) * 2019-12-02 2021-12-28 한국생명공학연구원 신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소 및 이를 이용한 (-)-알파 비사볼올 생산 방법
WO2022008619A1 (en) 2020-07-07 2022-01-13 Givaudan Sa A method of reducing skin irritation, comprising the application to the skin of an alpha-bisabolol prepared by a biotechnological process
WO2023242403A1 (en) * 2022-06-16 2023-12-21 Danmarks Tekniske Universitet Microbial cells and methods for production of hernandulcin

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10392635B2 (en) Production of tetrahydrocannabinolic acid in yeast
Frohwitter et al. Production of the sesquiterpene (+)-valencene by metabolically engineered Corynebacterium glutamicum
Han et al. Fermentative production and direct extraction of (−)-α-bisabolol in metabolically engineered Escherichia coli
Alonso-Gutierrez et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for limonene and perillyl alcohol production
Tashiro et al. Bacterial production of pinene by a laboratory-evolved pinene-synthase
CN110869496A (zh) 用于大麻素家族的戊烯化聚酮的重组生产系统
US11299717B2 (en) Production of citronellal and citronellol in recombinant hosts
KR101958113B1 (ko) (-)-α-비사볼올 생산 미생물 및 상기 미생물을 이용한 (-)-α-비사볼올 생산 방법
Khalid et al. Development of a terpenoid-production platform in Streptomyces reveromyceticus SN-593
US20200017889A1 (en) Production of Cannabigerolic Acid in Yeast
CN114502734A (zh) 微生物产生植物大麻素和植物大麻素前体的方法和细胞
CN110546268A (zh) 类胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素的生产
Luo et al. Characterization of a sesquiterpene cyclase from the glandular trichomes of Leucosceptrum canum for sole production of cedrol in Escherichia coli and Nicotiana benthamiana
ul Hassan et al. Engineered Saccharomyces cerevisiae for the de novo synthesis of the aroma compound longifolene
US20210102224A1 (en) Terpene synthase producing patchoulol and elemol, and preferably also pogostol
US20220220515A1 (en) Advanced Production of Cannabinoids in Yeast
US20220162188A1 (en) Isoprenoids and methods of making thereof
Kim et al. Production of (−)-α-bisabolol in metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae
Lai et al. Reconstruction of the archaeal isoprenoid ether lipid biosynthesis pathway in Escherichia coli through digeranylgeranylglyceryl phosphate
KR101578652B1 (ko) 스틸벤 화합물을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 스틸벤 화합물의 생산 방법
KR101285312B1 (ko) α-파르네센 생산성이 향상된 에세리키아 속 미생물 및 그를 이용하여 α-파르네센을 생산하는 방법
US20240093253A1 (en) Sustainable production of cannabinoids from simple precursor feedstocks using saccharomyces cerevisiae
US20160289702A1 (en) Biosynthetic Mint
Navale Improved production of epi-cedrol and santalene by fusion protein expression: Stability study and cyclization mechanism of epi-cedrol biosynthesis
WO2022016118A2 (en) Prenyltransferase enzymes

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant