KR101285312B1 - α-파르네센 생산성이 향상된 에세리키아 속 미생물 및 그를 이용하여 α-파르네센을 생산하는 방법 - Google Patents

α-파르네센 생산성이 향상된 에세리키아 속 미생물 및 그를 이용하여 α-파르네센을 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에세리키아속 미생물에 코돈-최적화된 α-파르네센 신타제로 형질전환된 에세리키아속 미생물 및 그를 이용한 α-파르네센 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 미생물을 이용하면 α-파르네센을 높은 효율로 생산할 수 있다.

Description

α-파르네센 생산성이 향상된 에세리키아 속 미생물 및 그를 이용하여 α-파르네센을 생산하는 방법{A microorganism of Escherichia genus having enhanced productivity of α-farnesene and method of producing α-farnesene using the same}
본 발명은 α-파르네센 생산성이 향상된 에세리키아 속 미생물 및 이를 이용하여 α-파르네센을 생산하는 방법에 관한 것이다.
이소프레노이드는 살아있는 유기체에서 중요한 역할을 하는 물질로서 세포의 유동성, 전자 이동 및 기타 대사 작용을 유지하는데 사용된다. 이소프레이드는 40000개 이상의 생산물들로 이루어진 다양한 군을 포함하는데 다수의 천연 이소프레노이드 및 합성 이소프레노이드는 약품, 화장품, 향수, 색소 및 발색제, 살진균제, 방부제, 기능성 식품 및 정밀 화학 중간 물질로서 사용된다.
천연의 상태에서, 이소프레노이드는 이의 전구체인 이소펜테닐 디포스페이트(IPP)와 이성체인 디메틸알릴 피로포스페이트(DMAPP)의 연속적인 축합 반응에 의해 합성된다. 상기 전구체에 대한 경로로서는 2가지가 알려져 있다. 식물을 제외한 진핵 생물은 일반적으로, 아세틸 조효소 A(아세틸-CoA)를 IPP로 전환시키기 위해 메발로네이트-의존 경로(MVA)를 이용하는데, 이 때, 상기 IPP는 추후 DMAPP로 이성체와 된다. 일부 예외도 있지만, 원핵생물은 통상적으로 IPP 및 DMAPP를 생산하기 위해 메발로네이트-독립 경로 또는 데옥시자일룰로스-5-포스페이트 경로(MEP)만을 이용한다. 식물은 MVA 경로와 MEP 경로 둘 다를 이용한다.
통상적으로, 이소프레노이드는 천연 공급원 예를 들어 식물, 미생물 및 동물로부터 추출하여 제조되어 왔다. 그러나, 추출에는 다수의 심각한 한계점이 있기 때문에, 그로 인한 수율은 보통 매우 낮다. 첫째, 대부분의 이소프레노이드는 천연의 환경 하에서는 소량만이 축적된다. 둘째, 공급 유기체는 일반적으로 원하는 이소프레노이드를 상업적으로 유용한 양만큼 생산하는데 필요한 대규모 배양 공정에 적합하지 않다. 셋째, 이소프레노이드 추출을 위해서는 임의의 독성 용매가 필요하고, 이 용매의 취급과 처리 과정에 특별히 주의해야 하므로, 이소프레노이드를 상업적으로 생산해 내는데 어려움이 따른다.
특히 식물로부터 추출되는 이소프레노이드의 클래스인 세스퀴테르펜은 중요한 의학적, 산업적 특성을 갖는다(Berger, 2009; Dhingra et al., 2000; Muntendam et al., 2009). α-파르네센(farnesene) (3,7,11-트리메틸도데카-1,3E,6E,10-테트라엔)은 사과 껍질에서 처음 발견된 가장 간단한 아시클릭 세스퀴테르펜의 하나로서, 식물 방어에 있어 역할을 하고 있다 (Huelin and Murray, 1966; Pare and Tumlinson, 1999). 파르네센은 파르네산(farnesane)으로의 수소화 반응으로 인해 최근 생물연료 전구체로서 개발되고 있으나 (Renneger and McPhee, 2008), 파르네센을 포함한 세스퀴테르펜은 천연적으로 아주 작은 양만큼만 생산된다. 따라서, 대사 공학(metabolic engineering)은 대장균 및 효모로부터 이러한 희박하고 가치있는 화합물을 생산을 위한 대안적이고 매력적인 경로가 될 수 있을 것이다.
파르네센 형성은 파네실 피로포스페이트 (FPP)의 디피로포스포릴레이션을 촉매하는 파르네센 신타제(FS)에 의해 최종적으로 수행된다. 그러나 사과, 말루스 엑스 도메스티카(Malus x domestica) 로부터 분리된 것을 포함하는 단지 소수의 파르네센 신타제만이 현재까지 규명되었다. 또한 대장균으로부터의 파르네센 생산은 대부분의 경우에 있어 대장균에서의 파르네센 신타제의 낮은 단백질 발현으로 인해 제한된다.
MVA 및 MEP 대사 경로가 밝혀짐으로써 이소프레노이드를 생합성 방법에 의해 생산할 수 있게 되었다. 그러나, 다수의 상업적 분야에서 요망되는 다량의 이소프레노이드 생성물이 생산되었음에도 불구하고, 현재의 기술로써 생산할 수 있는 이소프레노이드보다 더욱 많은 양의 이소프레노이드를 생산하는 발현 시스템과 발효법의 필요성이 대두되고 있다.
본 발명의 목적은 α-파르네센을 높은 효율로 생산할 수 있는 에세리키아 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 α-파르네센을 높은 효율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태는 에세리키아속 미생물에 코돈-최적화(codon-optimized)된 말루스 엑스 도메스티카(Malus x domestica) 유래의 α-파르네센 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 에세리키아속 미생물을 제공한다.
상기 "코돈-최적화(codon-optimized)"는 표적 핵산 서열로 형질전환시키는 숙주 세포 내에서 표적 핵산 서열을 더욱 높은 수준으로 발현시키기 위해 표적 핵산 서열을 선택된 숙주 세포의 코돈 선호도를 반영하도록 변형시키는 것을 의미한다. 예를 들어 본 발명의 α-파르네센 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은 에세리키아속 미생물의 코돈 선호도에 맞게 변형시킬 수 있다. "코돈 선호도"란 유기체에 따라 각 아미노산을 코딩하는데 자주 사용하는 핵산 서열을 의미한다. 다수의 유기체에 대한 코돈 선호도 표를 입수할 수 있는데, 이 표는 본 발명의 서열을 디자인하는데 참고 기준으로서 사용할 수 있다(Gouy and Gautier (1982) Nucleic Acids Res 10(22) 7055-7074; Eyre-Walker (1996) Mol. Biol Evol 13(6) 864-872 참조). 소정의 숙주 미생물의 코돈 중 가장 많이 사용되는 코돈을 사용하면, 일반적으로 번역 가능성이 증가하게 되므로 원하는 서열의 발현 수준도 증가할 수 있다.
상기 "에세리키아속 미생물"은 바람직하게는 에세리키아 콜라이 (Eschrichia coli), 더 구체적으로는 E. coli DH5α가 될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 대장균 유래의 FPP 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 에세리키아속 미생물에 코돈-최적화된 말루스 엑스 도메스티카(Malus x domestica) 유래의 α-파르네센 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 융합 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 에세리키아속 미생물을 제공한다.
상기 "대장균 유래의 FPP 신타제"는 에세리키아 콜리 유래의 파네실 피로포스페이트((E,E)-farnesyl pyrophosphate) 합성효소를 의미하고 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 IspA 유전자의 프로모터와 전사 종결 부분을 제외한 실질적으로 FPP 신타제 단백질을 코딩하는 부분을 의미한다.
상기 "융합 폴리뉴클레오티드"는 2 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 핵산 서열을 당업자에게 잘 알려진 분자생물학적 방법으로 연결시킨 폴리뉴클레오티드 핵산 서열을 의미한다. 융합 폴리뉴클레오티드는 근접한 시간대에 근접한 장소에서 융합된 폴리뉴클레오티드들이 코딩하는 단백질들이 같이 발현될 수 있게 한다. 따라서 융합된 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질들이 서로 상호작용할 수 있다. 인공 및 천연 융합 효소는 근접한 연속적인 반응을 강제하거나 경로의 순차적인 효소들이 서로 작용하게 하여 중간체가 자유 발산되지 않고 대사체로 직접적으로 전환되게 하여 기질 채널링(substrate channeling) 현상을 나타낸다. 단백질 융합은 동일한 중간체를 이용하는 다른 효소와의 경쟁을 제거함으로써 대사적 중간체 전달의 효과적이고, 배타적이고 보호된 수단으로 표적 대사체 경로를 제공할 수 있다.
본 발명은 FPP 신타제와 α-파르네센 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드들을 융합시킴으로써 생성된 FPP가 근접한 거리에 생성된 α-파르네센 신타제에 의해 사용될 수 있어 α-파르네센의 생산성을 향상시킬 수 있다. FPP는 파르네센의 전구체로서 사용될 뿐만 아니라 퀴논 및 지질 담체와 같은 세포 구성요소의 생합성에서 사용되므로, FPP는 생성된 후 세포 구성 요소의 생합성에 사용되거나 α-파르네센 신타제에 의해 사용될 수 있다. 하지만 본 발명과 같이 FPP 신타제와 α-파르네센 신타제를 근접하게 발현되도록 함으로써 생성된 FPP가 세포 구성 요소의 생합성에 이용되기보다 근접하게 발현된 α-파르네센 신타제에 의해 보다 더 쉽게 이용되어 α-파르네센의 생산성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 융합 폴리뉴클레오티드는 상기 대장균 유래의 FPP 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 상기 에세리키아속 미생물에 코돈-최적화된 말루스 엑스 도메스티카(Malus x domestica) 유래의 α-파르네센 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 하나 이상의 임의의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 링커(linker)가 더 결합된 것인 에세리키아속 미생물을 제공한다.
상기 "하나 이상의 임의의 아미노산"은 상기 융합되는 두개 단백질 각각의 기능이 융합된 단백질의 형태에서도 유지되는 채로 발현될 수 있도록 하는 것이면 어떠한 것이라도 포함할 수 있다.. 예를 들면, 상기 하나 이상의 임의의 아미노산은 GGGGSGGGGS, (Gly4-Ser)3, (Gly2-Ser)2, 및 Gly4-Ser-Gly5-Ser로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. FPP 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 α-파르네센 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 하나 이상의 임의의 아미노산으로 이루어진 링커가 결합됨으로 인하여 FPP 신타제와 α-파르네센 신타제의 발현이 용이하게 될 수 있다. 링커 펩타이드 없는 직접적인 단백질 융합은 융합 파트너 간에 입체적 장애를 유발하여 각자의 구조적 배열 및 효소 활성에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 에세리키아속 미생물은 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제 및 히드록시메틸글루타릴 (HMG)-CoA 리덕타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 엔테로코커스 패칼리스 유래의 HMG-CoA 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 메발로네이트 키나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 포스포메발로네이트 키나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 대장균 유래의 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 더 형질전환될 수 있다.
본래 에세리키아속 미생물은 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 및 디메틸알릴 디포스페이트(DMAPP)를 생산하기 위해 내부 메틸 메틸-에리트리톨 포스페이트(MEP) 경로를 이용하나 IPP 및 DMAPP 생산량을 증가시키기 위해 메발로네이트(MVA) 경로를 이용하도록 형질전환시킬 수 있다. 상기 엔테로코커스 패칼리스 유래의 유전자들과 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 유전자들은 MVA 경로를 진행하는데 필요한 효소들의 유전자들이다. 도 1에 α-파르네센을 생산하기 위한 MEP 경로와 MVA 경로를 간단하게 도식화하였다. 상기 에세리키아속 미생물이 MVA 경로를 사용하도록 형질전환되면 IPP 및 DMAPP 생산량이 증가하고 이에 따라 파네실 피로포스페이트(FPP) 생산량도 증가하여 α-파르네센 생산을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 대장균 유래의 FPP 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 에세리키아속 미생물에 코돈-최적화(codon-optimized)된 말루스 엑스 도메스티카(Malus x domestica) 유래의 α-파르네센 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 융합 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 융합 폴리뉴클레오티드는 FPP 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 α-파르네센 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 하나 이상의 임의의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 링커가 더 결합된 융합 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 링커가 더 결합된 융합 폴리뉴클레오티드는 서열번호 36의 염기 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 에세리키아속 미생물에 코돈-최적화된 말루스 엑스 도메스티카(Malus x domestica) 유래의 α-파르네센 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기 서열, 상기 대장균 유래의 FPP 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 아미노산 서열, 상기 하나 이상의 임의의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 링커는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제 및 히드록시메틸글루타릴 (HMG)-CoA 리덕타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4, 상기 엔테로코커스 패칼리스 유래의 HMG-CoA 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5, 상기 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 메발로네이트 키나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6, 상기 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 포스포메발로네이트 키나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7, 상기 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8, 및 상기 대장균 유래의 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 상기 미생물을 배양하는 단계; 및 배양물로부터 α-파르네센을 분리하는 단계를 포함하는 미생물로부터 α-파르네센을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법에서 상기 미생물을 배양하는 것은 배지 위에 데칸 상(decane phase)을 위치시켜 배양하는 것일 수 있다. 따라서 휘발성이 있는 α-파르네센을 손실 없이 수득할 수 있고, 데칸에 용해되어 있는 α-파르네센을 수득함으로써 수확 및 정제 방법을 모두 단순화하여 생산 비용을 줄일 수 있다.
본 발명의 에세리키아 속 미생물로부터 α-파르네센을 생산하는 방법은 본 발명의 미생물을 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법에 있어서, 배양은 합성, 반합성, 또는 복합 배양 배지에서 배양할 수 있다. 배양 배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, MRS (Man-Rogosa-Sharp) 액체 배지 및 우유가 첨가된 액체 배지를 사용할 수 있다. 탄소원으로는 전분, 포도당, 자당, 갈락토스, 과당, 글리세롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 글리세롤을 사용할 수 있다. 질소원으로는 황산암모늄, 질산암모늄, 질산나트륨, 글루탐산, 카사미노산, 효모추출물, 펩톤, 트립톤, 대두박 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 미네랄은 염화나트륨, 인산제이칼륨, 황산마그네슘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있다. 미생물 배양 배지 내 상기 탄소원, 질소원 및 미네랄 각각은 리터당 10 내지 100 g, 5 내지 40 g 및 0.5 내지 4 g을 이용할 수 있다.
상기 배양 배지에 첨가되는 비타민은 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 비타민은 상기에서 언급한 탄소원, 질소원, 미네랄과 등과 동시에 배지에 첨가하거나, 멸균하여 준비된 배지에 첨가할 수 있다.
배양은 통상의 대장균 배양 조건으로 수행할 수 있으며, 예를 들어 약 15-45?에서 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양 배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 냉동건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
상기 배양의 일 예에 있어서, 탄소원으로서 글리세롤을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 0.1 % (v/v) 내지 5 % (v/v)의 글리세롤을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. 또한 배양의 일 예에 있어, MVA 경로의 중간 산물, 예를 들면 메발로네이트를 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. 미생물이 하부 MVA 경로만을 이용하도록 형질전환된 경우, 예를 들면 0.1mM 내지 15mM의 메발로네이트가 부가된 배지에서 배양이 이루어질 수 있다. 또한 배양의 일 예에 있어, 상기 배양은 IPTG 유도와 함께 이루어질 수 있다. 예를 들면, 0.01mM 내지 1mM의 IPTG 유도하에 배양이 이루어질 수 있다. 배지는 2YT 배지 (1L 당 16 g 트립톤, 5 g 소듐 클로라이드, 및 10 g 효모 추출물)일 수 있고 항생제를 필요로 하는 만큼 첨가할 수 있으며 예를 들면, 앰피실린 100 ㎍/mL, 클로람페니콜 50 ㎍/mL, 및 카나마이신 50 ㎍/mL을 첨가할 수 있다. 또한 배양의 일 예에 있어서, 항생제, 글리세롤, 및/또는 메발로네이트가 첨가된 2YT 배지 위에 데칸 상이 위치할 수 있다.
본 발명의 미생물에 대하여는 상기한 바와 같다.
본 발명의 방법은 또한, 배양물로부터 α-파르네센을 분리하는 단계를 포함한다. 상기 α-파르네센을 분리하는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 구체적으로, 2-상 배양으로부터 데칸상을 수집하고 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리시켜 세포 파편을 제거하고, 가스 크로마토 그래피 (GC) 및 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS)을 수행하여 분리될 수 있다.
본 발명의 에세리키아 속 미생물을 이용하면 α-파르네센을 높은 효율로 생산할 수 있다.
본 발명의 α-파르네센을 생산하는 방법에 의하면, α-파르네센을 높은 효율로 생산할 수 있다.
도 1a는 α-파르네센 합성 경로에 대한 간략한 다이어그램을 나타낸다. IPP 및 DMAPP는 MEP 경로 또는 MVA 경로에 의해 합성된다. MEP 경로는 글리세르알데하이드 3-포스페이트 및 피루베이트의 축합에 의해 시작된다. MVA 경로는 출발 물질로서 아세틸-CoA를 사용한다. FPP는 1 개의 DMAPP 및 2 개의 IPP의 축합을 통해 IspA에 의해 합성된다. α-파르네센 신타제는 전구체 FPP로부터 α-파르네센 형성시키는 촉매 작용을 한다. 보통 화살표 및 점선 화살표는 각각 단일 및 다중 효소 반응을 나타낸다.
도 1b는 본 발명에서 사용된 합성 플라스미드의 유전자 요약도를 나타낸다. 오각형 및 직사각형은 각각 프로모터 및 유전자를 나타낸다. 채워진 직사각형은 ispA 및 aFS 사이의 융합 연결을 나타낸다. RBS는 둥근 직사각형으로 나타낸다. 도 1a 및 도 1b에 사용된 약어의 의미는 다음과 같고 이 약어들은 본 명세서의 다른 부분에서도 동일한 의미로 사용된다. G-3-P는 글리세르알데히드 3-포스페이트이고; DXP는 1-데옥시-D-자일룰로즈-5-포스페이트(xylulose-5-phosphate)이고; MEP는 메틸-에리트리톨 포스페이트이고; DMAPP는 디메틸알릴 피로포스페이트이고; IPP는 이소펜테닐 피로포스페이트이고; FPP는 (E,E)-파르네실 피로포스페이트이고; FOH는 파르네솔이다. DXS는 DXP 신타제이고, IDI는 IPP 이소머라제이고; IspA는 FPP 신타제이고; (?)는 대장균 내부 비특이적 포스파타제를 나타내고; 및 FS는 α-파르네센 신타제이다. aFS는 인공적으로 코돈-최적화된 α-파르네센 신타제 유전자를 나타낸다.
도 2는 α-파르네센 생산 및 세포 성장에 있어서 α-파르네센 신타제 유전자의 코돈 최적화 효과를 나타낸다. 도 2a에서 pTwFS 또는 pTaFs를 갖는 재조합 대장균의 α-파르네센 생산량이 나타난다. 흰색 막대는 24시간, 검은색 막대는 48시간 배양 후 얻은 α-파르네센 생산량을 나타낸다. 도 2b는 빈 벡터 pTrc99A, pTwFS 또는 pTaFS를 갖는 재조합 대장균의 세포 성장을 각각 정사각형, 원 또는 삼각형으로 나타낸다. 배양은 29도, 1.0% (v/v) 글리세롤을 포함하는 2YT 배지에서 IPTG 없이 또는 0.1 mM IPTG 하에서 24시간 동안 수행되었다.
도 3은 IPP 및 DMAPP 합성의 증가가 α-파르네센 생산 및 세포 성장에 미치는 영향을 나타낸다. 대장균 aFS-CT, 대장균 aFS-dxs, 대장균 aFS-idi 및 대장균 aFS-SN을 29도에서, 1% (v/v)글리세롤를 포함하는 2YT 배지에서, 0.1 mM IPTG 유도 없이 또는 유도 하에서 배양시켰다. 대장균 aFS-SN의 배지에는 5mM 메발로네이트를 보충하였고, 흰색 막대는 24시간, 검은색 막대는 48시간 배양시킨 후 결과를 나타낸다.
도 4는 α-파르네센 생산 및 세포 성장에 있어 IspA 발현 증진의 효과를 나타낸다. 대장균 ispAaFS-CT 및 대장균 ispAaFS-SN를 29도에서, 1% (v/v) 글리세롤을 포함하는 2YT 배지에서 IPTG 유도 없이 또는 0.1mM IPTG 유도 하에서 배양시켰다. 대장균 ispAaFS-SN의 배양액에는 5mM 메발로네이트를 보충하였고 흰색 막대는 24시간, 검은색 막대는 48시간 배양시킨 후 결과를 나타낸다.
도 5는 α-파르네센 생산 및 세포 성장에 있어 IspA 및 α-파르네센 신타제 융합이 미치는 영향을 나타낸다. 대장균 ispANaFS-SN 및 ispALaFS-SN을 29℃에서, 1.0% (v/v) 글리세롤 및 5mM 메발로네이트를 포함하는 2YT 배지에서 IPTG 유도 없이 또는 0.1 mM IPTG 유도하에서 배양시켰다. 흰색 막대는 24시간, 검은색 막대는 48시간 배양시킨 후 결과를 나타낸다.
도 6은 첨가한 메발로네이트 양에 따른 대장균 ispALaFS-SN의 α-파르네센 생산 및 세포 성장을 나타낸다. 배양은 29℃, 0.1 mM IPTG 유도 하에서, 1.0% (v/v) 글리세롤 및 0 내지 15 mM 메발로네이트를 포함한 2YT 배지에서 수행되었다. 흰색 막대는 24시간, 검은색 막대는 48시간 배양시킨 후 결과를 나타낸다.
도 7은 글리세롤 농도에 따른 대장균 ispALaFS-NA의 α-파르네센 생산 및 세포 성장을 나타낸다. 배양은 29℃, 0.1 mM IPTG 유도 하에서, 0 내지 4.0% (v/v) 글리세롤을 포함하는 2YT 배지에서 수행되었다. 흰색 막대는 24시간, 검은색 막대는 48시간 배양시킨 후 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 이하의 실시예에서 다음의 실험 재료 및 방법을 사용하였다.
(1) 배지 및 배양 조건
E. coli DH5α (F-,Φ80dlacZ△M15, △(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rK - mK +), phoA, supE44, λ-,thi-1)를 2YT 배지 (1 L 당 16 g 트립톤, 10 g 효모 추출물, 및 5 g 소듐 클로라이드)에서 플라스미드 제조를 위해서는 37℃에서, α-파르네센 생산을 위해서는 29℃에서 배양시켰다. 37℃에서 밤새 배양시킨 종자 배양액(seed culture)을 1% (v/v) 글리세롤을 포함하는 2YT 배지에서 OD600, 0.1이 될 때까지 접종하였고, 다른 특별한 언급이 없으면 α-파르네센 생산을 위해 29℃에서 배양시켰다. pSSN12Didi 플라스미드를 포함하는 대장균의 배양액에 메발로놀락톤으로부터 제조된 메발로네이트를 다른 언급이 없으면 5 mM의 농도로 보충하였다. 항생제 앰피실린 (100 ㎍/mL) 및 클로람페니콜 (50 ㎍/mL), 및 0.1 mM의 IPTG가 필요한 경우 첨가되었다. α-파르네센의 휘발성때문에, 배양 동안 생산되는 α-파르네센의 회수를 위해 초기에 5mL의 배양액 위에 1mL의 데칸을 덮었다. 세포 성장은 600 nm (OD600)에서 광학적 밀도를 측정하는 것에 의해 측정되었고 모든 실험은 삼중으로 수행되었다.
(2) 플라스미드의 제조
제한 효소 절단 및 형질 전환을 포함하는 기본적인 분자 생물학 기술을 문헌(Sambrook and Russell, 2001)에 기술된 대로 수행하였다. 제조자의 지시에 따라 Pfu DNA 폴리머라제(SolGent, Daejeon, Korea)를 사용하여 PCR에 의해 DNA 단편을 증폭시켰다. 본 발명에서 사용되는 플라스미드 및 프라이머는 표 1에 나열된다.
이름 특성 참조
플라스미드
pSTV28 Plac 발현 벡터, pACYC184 origin, lacZ, Cmr Takara Co., Ltd.
pSdxs E. coli 유래 dxs를 포함하는 pSTV28 벡터
pSidi E. coli 유래 idi를 포함하는 pSTV28 벡터
pSSN12Didi E. coli 유래의 idi, S. pneumonia 유래 mvaK1, mvaK2 및 mvaD를 포함하는 pSTV28 벡터
pSNA E. faecalis 유래 mvaE 및 mvaS, S. pneumoniae유래 mvaK1, mvaK2, 및 mvaD 및 E. coli 유래 idi 를 포함하는 pSTV28 벡터
pET-30a /MdAFS1 wFS 를 포함하는 pET-30a 벡터 (Green et al., 2007)
pTrc99A Ptrc 발현 벡터, pBR322 유래, lacIq, Ampr (Amann et al., 1988)
pTwFS wFS를 포함하는 pTrc99A 벡터
pUC57aFS aFS를 포함하는 pUC57 벡터
pTaFS aFS를 포함하는 pTrc99A 벡터
pTispAaFS aFS 및 E. coli 유래 ispA 를 포함하는 pTrc99A 벡터
pTispANaFS aFS 및 ispA 사이에 링커가 없는 aFS 및 ispA의 융합 유전자를 포함하는 pTrc99A 벡터
pTispALaFS aFS 및 ispA 사이에 (GGGGS)2 링커를 포함하는 aFS 및 ispA의 융합 유전자를 포함하는 pTrc99A 벡터
프라이머
aFS-F1 GGGATCC ATGGAATTTCGTGTCCACCTG 서열번호 28
aFS-F2 GGGATCCAGGAGGTAATAATAATGGAATTTCGTGTCCACCTG 서열번호 29
aFS-R CCCAAGC TT AGTTGACCAGCGGCTGAAACAG 서열번호 30
ispA-F GCGAATTC ATGGACTTTCCGCAGCAAC 서열번호 31
ispA-R1 GGGATCC TTATTTATTACGCTGGATGTAG 서열번호 32
ispA-R2 GCGGATCCTTTATTACGCTGGATGTAGTC 서열번호 33
ispA-R3 GCGGATCCGCCGCCACCCGAGCCACCGCCACCTTTATTACGCTGGATGTAGTC 서열번호 34
참고: 시작 코돈과 종결 코돈은 두꺼운 글씨체로 표시하고 제한효소 사이트는 밑줄을 그어 표시하였다.
효소명 유전자 유전자 서열 (Genebank 허가번호)
엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제 및 히드록시메틸글루타릴 (HMG)-CoA 리덕타제 mvaE 서열번호 12 (AF290092)
엔테로코커스 패칼리스 유래의 HMG-CoA 신타제 mvaS 서열번호 13 (AF290092)
스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 메발로네이트 키나제 mvaK1 서열번호 14(AF290099)
스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 포스포메발로네이트 키나제 mvaK2
서열번호 15(AF290099)
스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제 mvaD 서열번호 16 (AF290099)
대장균 유래의 이소펜테닐 디포스페이트(IPP) 이소머라제 idi 서열번호 17 (U00096)
유전자 프라이머서열 제한효소
mvaE F 서열번호 20 Sac I
R 서열번호 21 Sma I
mvaS F 서열번호 22 Sma I
R 서열번호 23 BamH I
mvaK1, mvaK2, mvaD F 서열번호 24 Kpn I
R 서열번호 25 Xba I
idi F 서열번호 26 Sma I
R 서열번호 27 Sph I
1) pSdxs, pSidi, pSSN12Didi 및 pSNA의 제조
① pSdxs, pSidi의 제조
대장균 유래 dxs 유전자의 DNA 주형 및 프라이머(서열번호 37, 38)를 이용하여 증폭시킨 PCR 산물을 EcoRI과 BamHI 제한효소를 이용하여 pSTV28 벡터에 삽입하여 pSdxs를 제조하였다. 대장균 유래 idi 유전자의 DNA 주형 및 프라이머(서열번호 39, 40)를 이용하여 증폭시킨 PCR 산물을 BamHI과 SalI 제한효소를 이용하여 pSTV28 벡터에 삽입하여 pSidi를 제조하였다.
② pSSN12Didi의 제조
먼저, 스트렙토코커스 뉴모니애의 염색체 DNA 주형 및 서열번호 24 및 25의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 mvaK1, mvaD 및 mvaK2 오페론을 증폭하였으며(mvaK1, mvaK2, mvaD는 하나의 오페론으로 염색체상에 존재해서 각각의 유전자를 PCR 클로닝하지 않고 오페론을 통째로 한번에 PCR 클로닝을 하였다. 증폭된 유전자 단편을 KpnI 및 XbaI으로 처리한 후 동일 효소로 절단된 pBAD24 벡터(Guzman, L. M. 등, J. Bacteriol., 177, 4121-4130, 1995)에 삽입하여 플라스미드 pDSN12D를 제조하였다. 또한, idi 유전자 단편을 대장균 염색체 DNA 주형 및 서열번호 26 및 27의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 증폭한 후, 이를 SmaI과 SphI으로 처리하여 동일 효소로 절단된 플라스미드 pDSN12D에 삽입하여 플라스미드 pDSN12Didi를 제조하였다. 그 후, 플라스미드 pDSN12Didi를 BamHI과 SalI으로 절단하여 상기 4개의 유전자가 포함된 유전자 단편을 얻은 후 이를 동일 효소로 처리된 pSTV28 벡터(Takara Korea, 한국) (서열번호 25)에 삽입하여 플라스미드 pSSN12Didi를 제작하였다.
③ pSNA의 제조
표 2의 유전자들을 표 3에 열거된 프라이머들을 사용하여, 해당 유전자를 포함하고 있는 균주의 염색체 DNA를 주형으로 한, PCR을 통하여 증폭하였다. 증폭된 산물을 표 3에 열거된 제한 효소를 이용하여 pSTV28 벡터 (Takara Korea, 한국) (서열번호 18)에 도입하여, 벡터 pSNA를 제조하였다. 벡터 pSNA는 아세틸-CoA로부터 IPP를 생산할 수 있는 메발로네이트 경로의 효소를 코딩하는 유전자를 모두 포함하고 있다.
2) pTwFS, pTaFS, pTispAaFS, pTispAN, pTispAL, pTispANaFS 및 pTispALaFS 의 제조
Green 박사(Horticultural and Food Research Institute, Auckland, New Zealand)가 pET-30a/MdAFS1 플라스미드를 기증하였고 (Green et al., 2007), 이를 EcoRI 및 XhoI로 절단하여 사과 α-파르네센 신타제 유전자의 야생형(wFS: 서열번호 35, GenBank accession number : AY563622.1)을 얻었다. 생성된 단편을 pTrc99A(Amann et al., 1988)의 EcoRI-SalI 부위에 삽입하여 pTwFS를 생산하였다. pUC57-aFS의 플라스미드는 GenScript Corp(NJ, US)의 최적 대장균 코돈 사용에 따라 합성된 인공 α-파르네센 신타제 유전자 (aFS)를 포함한다. aFS 유전자는 프라이머 aFS-F2 및 aFS-R를 사용하여 PCR에 의해 pUC57-aFS로부터 증폭되었다. 생성된 PCR 생산물을 BamHI 및 HindIII로 절단하고 pTrc99A의 상응하는 제한 효소 부위에 삽입하여 pTaFS를 생성하였다. pTispAaFS 플라스미드의 제조를 위해, 대장균 게놈 DNA로부터 프라이머 ispA-F 및 ispA-R1를 사용하여 PCR에 의해 증폭된 ispA 유전자를 EcoRI 및 BamHI으로 절단된 pTaFS 플라스미드에 삽입하였다. ispA 및 aFS를 융합하기 위해, ispA 유전자를 ispA-F 및 ispA-R2 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켜 정지 코돈을 제거하고 EcoRI 및 BamHI의 절단 효소 사이트를 도입하여 ispAN으로 이름지었다. 동일하게 ispA-F 및 ispA-R3 프라이머로 PCR 생산물 ispAL을 생성시켰고, 이는 ispAN과 비교할 때 유연한 (GGGGS)2 링커(서열번호 11)를 BamHI 사이트 전에 포함한다. 이 두 개의 PCR 생산물을 pTrc99A 벡터의 EcoRI-BamHI 사이트에 클로닝시켜 각각 pTispAN 및 pTispAL를 생성시켰다. aFS-F1 및 aFS-R 프라이머로 증폭시킨 aFS 유전자를 BamHI 및 HindIII로 절단하여 pTispAN 및 pTispAL에 삽입하고 각각 pTispANaFS 및 pTispALaFS를 생성시켰다. α-파르네센 신타제 유전자를 포함하는 개략적인 플라스미드 구조가 도 1b에 나타난다. 본 발명에 사용된 PCR 프라이머는 표 1에 나열된다.
(3) α-파르네센의 식별 및 정량
2-상 배양으로부터 데칸상을 수집하고 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리시켜 세포 파편을 제거하고, 가스 크로마토 그래피 (GC) 및 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS)을 수행하였다. α-파르네센 및 FOH의 생산은 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector (FID))를 구비한 Agilent Technologies 7890A Gas Chromatograph를 사용하여 정량하였다. 샘플을 1:10의 분리(split) 비율에서 주입하였다. 1 ㎕ 샘플로부터 각 분석물이 19091J HP-5 컬럼 (길이, 30 m; 내부 지름, 0.32 mm; 필름 두께, 250 ㎛)상에서 분리되었다. 오븐 온도는 처음에 1분 동안 80℃로 유지되었고 10℃/분의 속도로 250℃까지 증가되어 1분 동안 유지되었다. 39 psi를 입구 압력으로 하여 질소를 담체 가스로서 사용하였다. 검출기 온도를 260℃에서 유지하였다. GC-MS 분석을 Double-Focusing Mass Spectrometer GC Mate II (JEOL, Tokyo, Japan) 상에서 수행하였다.
(4) 메발로네이트 및 글리세롤의 정량
메발로네이트 농도는 GC 분석에 의해 결정되었다. 배양 여과액은 3 M HCl를 사용하여 pH 2로 조정하고 45℃에서 1 시간 동안 배양시키고, 무수 Na2SO4로 포화시키고, 최종적으로 에틸 아세테이트로 추출하였다. 생성된 샘플들을 메발로네이트 정량을 위해 Agilent Technologies 7890A Gas Chromatograph에 의해 분석하였다. GC의 분석 온도는 1분 동안 180℃의 초기 온도로 통제되고 2.5℃/분의 기울기에서 200℃까지 증가시키고 2분 동안 유지시켰다. 검출기 온도는 260℃에서 유지되었다. 글리세롤 농도는 굴절률 검출기 및 Kromasil KR100-5NH2 column (250 mm×4.6 mm, Eka Chemicals, Bohus, Sweden)을 갖는 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) (Shimadzu, Kyoto, Japan)에 의해 측정하였다. 배양액을 원심분리한 후 얻은 상층액을 잔여 글리세롤의 정량을 위해 주입하였다. 이동 상은 1.5 mL/분의 유속인 물 중의 75% 아세토니트릴이었다.
실시예 1: 대장균으로부터 생산된 α- 파르네센의 식별
사과 α-파르네센 신타제가 인 비트로 분석에서 FPP로부터 α-파르네센을 생산할 수 있다고 보고되었다. 대장균으로부터 α-파르네센을 생산하기 위해, 사과 α-파르네센 신타제 유전자의 야생형(wFS)을 pTrc99A 벡터 내에 클로닝시켜 pTwFS을 생성하고 pTwFS을 포함하는 재조합 대장균(대장균 wFS)을 29℃, 1mL 데칸이 덮어 씌워진 5mL의 2YT 배지에서 24시간 동안 배양시켰다. 데칸 층을 수집하여 GC 및 GC-MS에 의해 분석하였다. GC 크로마토그램에서 7.96분의 보유 시간(retention time)에서의 큰 피크가 대장균 wFS의 배양액에서만 관찰되었다(도 1c). 상기 피크는 그 후 GC-MS에 의해 식별되었다(도 1d). 이 피크의 질량 스펙트럼은 EI 질량 스펙트럼 라이브러리 및 발행된 문헌(Pechous and Whitaker, 2004)에 있는 α-파르네센 프로파일과 일치했다. 따라서, α-파르네센 형성은 대장균 내에서 사과 α-파르네센 신타제가 기능적으로 발현되었다는 것을 나타낸다.
실시예 2: 대장균 내에서 높은 수준의 발현을 위한 α- 파르네센 신타제의 코돈 최적화
코돈 사용 바이어스(bias)는 생물마다 다양해서, 이종 유래 발현의 장벽이 된다 (Gustafsson et al., 2004; Kane, 1995). wFS 유전자의 개개의 유전자 코돈의 빈도는 대장균의 것과 상당히 상이한 것으로 밝혀졌다 (http://www.kazusa.or.jp/codon/). wFS 유전자의 코돈 바이어스 분석 (http://pro.genomics.purdue.edu/emboss/)은 53.9의 Nc (Effective number of condon) 및 0.58의 CAI (Codon adaptation index)를 나타낸다. 높은 Nc 및 낮은 CAI 값은 대장균 내에서 사과 α-파르네센의 낮은 발현의 가능성을 나타낸다. 따라서, 인공 α-파르네센 신타제(aFS) 유전자를 대장균 코돈 사용에 따라 디자인하고 wFS 유전자의 378 코돈(전체 유전자 코돈의 65.5%)을 변형하여 코돈-최적화된 aFS 유전자의 NC 및 CAI 값이 각각 39.7 및 0.84이 나왔다.
aFS 유전자를 pTrc99A 벡터에 클로닝하여 pTaFS를 생성하였다. pTaFS를 포함한 대장균(대장균 aFS)을 대장균 wFS의 배양과 같은 조건으로 배양시켰다. SDS-PAGE 분석에서, α-파르네센 신타제의 눈에 보이는 밴드(Mw, 66 kDa)가 0.1 mM IPTG 유도된 대장균 aFS의 배양액에서만 관찰되었다. 이는 α-파르네센 신타제의 발현이 코돈-최적화에 의해 향상되었다는 것을 나타낸다. 또한, α-파르네센이 대장균 wFS와 비교할 때 대장균 aFS에서 더 높게 관찰되었지만, 두 균주 사이에 세포 성장의 차이는 관찰할 수 없었다 (도 2a). 0.1 mM IPTG 유도에 의해 두 균주 모두에서 극심한 세포 성장의 감소를 관찰하였다 (도 2b).
비록 그들의 산출은 비-유도된 배양액보다 0.1 mM IPTG 유도된 배양액에서 상대적으로 더 낮지만, 그들의 성장 차이를 생각할 때, 두 균주의 세포 특이적 α-파르네센 산출은 0.1 mM IPTG 의 유도와 함께 급격하게 증가하였다. α-파르네센 생산의 증가는 α-파르네센 신타제의 높은 발현으로 야기된 것으로 결론지을 수 있었다.
0.1 mM IPTG 유도 하에서 대장균 wFS 및 대장균 aFS의 세포 성장 억제는 단백질 과발현 또는 희박한 코돈 고갈로 인한 것이 아닐 것이다. α-파르네센 신타제의 발현 수준이 대사적 부담을 야기할 만큼 높지 않고 희박한 코돈은 코돈-최적화된 aFS 유전자에 존재하지 않기 때문이다. 성장 억제를 유발하는 이유는 세포 성장을 위한 필수 대사물 (IPP, DMAPP 및 FPP)의 부족으로 인한 것일 수 있다. α-파르네센 신타제의 증가된 발현은 α-파르네센 형성을 위한 그들의 소비를 더 심하게 하기 때문이다. 그러므로 대장균 aFS의 세포 성장 및 α-파르네센 생산에 있어 IPP, DMAPP 및 FPP 합성의 증가의 효과를 조사해볼 필요가 있었다.
실시예 3: α- 파르네센 생산을 위한 IPP 및 DMAPP 공급의 향상
대장균 내부 MEP 경로의 향상을 위해, 이 경로와 관련된 dxs 및 idi 유전자를 pSTV28에 클로닝하여 pSdxs 및 pSidi를 생성하고 pTaFS와 함께 같이 형질전환시켜 각각 대장균 aFS-dxs 및 대장균 aFS-idi를 얻었다. 또한 pSTV28 빈 벡터를 공동 형질전환시켜 대장균 aFS-CT를 대조군으로 얻었다 (도 3). 유도되지 않은 배양액에서 대장균 aFS-CT, 대장균 aFS-dxs 및 대장균 aFS-idi 사이에서 α-파르네센 생산 및 세포 성장에 있어 큰 차이는 없었다. 그러나, 0.1mM IPTG 유도된 배양액에서, 대장균 aFS-CT에 비해 대장균 aFS-idi로부터 7배 증가된 α-파르네센 생산을 얻었다. 또한 IPTG 유도에 의해 대장균 aFS에서 관찰되었던 세포 성장 억제는 대장균 aFS-dxs 및 대장균 aFS-idi의 배양에서 발견할 수 없었으나, 대장균 aFS-CT의 배양에서는 발견되었다. 이는 α-파르네센 생산을 위한 빌딩 블록의 소비로 인해 대장균 성장을 위한 IPP 및 DMAPP가 제한되었다는 것을 나타낸다. DXS 및 IDI와 같은 MEP 경로의 속도-결정 효소들의 과발현, 특히 IDI의 과발현은 성장 억제를 완화시키고 α-파르네센 생산을 향상시켰다. α-파르네센 합성을 위한 하나의 분자는 두 개의 IPP 및 하나의 DMAPP를 필요로 하나, MEP 경로는 IPP 및 DMAPP를 5:1의 비율로 생산한다. IPP 및 DMAPP의 소비와 형성 사이의 불균형은 IPP 및 DMAPP의 IDI 촉매 아이소머화의 과발현에 의해 제거할 수 있고, 이는 대장균 aFS-idi에서 α-파르네센 생산의 상당한 증가를 가져왔다.
α-파르네센 생산에 있어 MVA 경로의 효과를 메발로네이트의 보충에 의해 MVA 하부 경로를 포함하는 pSSN12Didi 플라스미드로 조사하였다. pTaFS 및 pSSN12Didi를 갖는 재조합 대장균 (대장균 aFS-SN)을 상기 기술된 동일한 배양 조건에서 5mM 메발로네이트를 추가하고 배양시켰다 (도 3). IPTG 유도 없이 대장균 aFS-SN에서 α-파르네센 생산의 두드러진 증가를 관찰하였다. 48시간 후, 비-유도 및 0.1 mM IPTG 유도된 배양에서 각각, 17.4 mg/L 및 17.8 mg/L의 α-파르네센 생산을 얻었다. 그러나, IPTG 유도된 배양의 세포 성장은 비-유도된 것에 비해 현저하게 낮았다. 48시간에서 IPTG 유도된 배양으로부터의 6.5mg/L/OD600의 세포 특이적 수득은 비-유도된 배양의 2.1mg/L/OD600 보다 3.2배 더 높았다. 또한 IPTG 유도된 배양에서 α-파르네센 생산의 2배의 현저한 증가는 24시간 후 세포 성장의 정체 상태에서도 유지되었다. 이러한 결과는 도입된 경로에 의한 IPP 및 DMAPP 합성의 증가가 α-파르네센 생산의 증가에 기여한다는 것을 의미한다. 세포 내 IPP 및 DMAPP의 축적에 의해 세포 성장이 억제된다고 보고된다 (Martin et al., 2003). IPTG 유도된 배양에서 대장균 aFS-SN의 성장 억제는 대장균 aFS-CT에서 관찰되는 IPP 및 DMAPP의 부족에 의한 것이기 보다는 IPP 및 DMAPP의 높은 수준으로 인한 것일 것이다. FPP 신타제 (IspA, ispA에 의해 인코드됨)은 두 개의 IPP 및 하나의 DMAPP의 압축에 의해 대장균에서 FPP 합성을 촉매한다 (Fujisaki et al., 1990). ispA 유전자의 단일 염색체 카피는 재조합 대장균에서 α-파르네센 생산을 위한 FPP의 많은 양을 합성하기에 충분하지 않을 것이다. 따라서, FPP 신타제의 증대는 IPP 및 DMAPP의 세포 내 축적을 방지하고 α-파르네센 생산을 위한 FPP 합성을 촉진시킬 것이다.
실시예 4: α- 파르네센 생산에 있어 IspA 과발현의 효과
ispA 유전자를 pTaFS 플라스미드에 클로닝시켜 pTispAaFS를 얻었다 (도 1b). pTispAaFS 및 pSSN12Didi를 포함하는 재조합 대장균 ispAaFS-SN 을 상기 기술된 것과 같이 5mM 메발로네이트를 포함하는 2YT 배지에서 배양시켰다. 또한 pTispAaFS를 pSTV28 빈 벡터와 함께 형질전환시켜 대조균 균주로 대장균 ispAaFS-CT를 얻었다. IPTG 유도된 48시간 배양에서 대장균 ispAaFS-SN의 α-파르네센 생산은 57.6 mg/L (도 4)로, 도 3에서 얻은 대장균 aFS-SN의 생산보다 3.2배 높았다. IspA의 과발현은 pSSN12Didi 플라스미드를 포함하는 균주에서 α-파르네센 생산을 효과적으로 촉진시켰으나, 대장균 ispAaFS-CT에서는 대장균 aFS-CT(도 3)와 동등한 α-파르네센 생산만을 관찰할 수 있었다. 이는 FPP 합성을 위한 IPP 및 DMAPP의 충분한 공급이 없다면, IspA 과발현에 의한 것만으로는 α-파르네센 합성이 증가될 수 없다는 것을 나타낸다. 또한 대장균 ispAaFS-SN는 IPTG 유도된 및 비-유도된 배양에서 부산물로서 FOH를 생산하였다. FOH 생산은 24시간 배양으로부터 현저하게 증가한 반면, 동일한 시간에 α-파르네센 생산의 증가는 한계점에 다다른다.
실시예 5: α- 파르네센 및 FOH 생산에 있어 IspA 및 α- 파르네센 신타제의 융합 단백질의 효과
α-파르네센 신타제의 FPP 이용가능성을 증가시키기 위해, IspA 및 α-파르네센 신타제를 인프레임(in-frame) 단백질 융합에 의해 공동 위치시켰고, 이는 α-파르네센 근처에 FPP 농도를 증가시킬것으로 예상되었다. α-파르네센 신타제로 FPP의 전달에 있어 단백질 융합은 α-파르네센 합성을 위해 세포질 내 대량의 액체 중에서 중간체를 자유 분산시키는 것보다 우수한 동역학적 특성을 나타낼 것이다. 기질 채널링(substrate channeling)이라고 하는 효소 촉매된 반응에 있어 기질 및 중간체의 채널링은 피루베이트 디카르복실라제와 같은 천연 효소 복합체에서 관찰된다. 기질 채널링은 통상적인 중간체의 경쟁하는 대사적 경로로의 불필요한 흐름을 감소시킬 수 있다. 기질 채널링은 또한 단백질 융합에 의해 수행될 수 있다. 따라서, ispANaFS 및 ispALaFS의 두 개의 융합 유전자를 각각 ispA 및 aFS 유전자의 직접적인 융합 또는 그들 사이에 (GGGGS)2 링커를 삽입하여 생성시켰다. ispANaFS 및 ispALaFS를 pTrc99A 벡터로 클로닝시켜 pTispANaFS 및 pTispALaFS (도 1b)를 생성시키고, pSSN12Didi와 함께 각각 공동 형질전환시켜 각각 대장균 ispANaFS-SN 및 대장균 ispALaFS-SN를 생성시켰다. 이 두 개의 균주는 상기 기재된 것과 같이 5mM 메발로네이트를 포함하는 2YT 배지에서 배양시켰다 (도 5). 대장균 ispANaFS-SN 및 대장균 ispALaFS-SN으로부터의 α-파르네센 생산은 비-유도된 배양에 비교하여 0.1 mM IPTG 유도된 배양에서 훨씬 높게 나타났다. 대장균 ispALaFS-SN의 배양에서, 단백질 융합을 갖지 않는 대장균 ispAaFS-SN(도 4)보다 세포 성장은 거의 증가되지 않은 반면 급격한 α-파르네센 생산의 증가를 관찰할 수 있었다. 대장균 ispALaFS-SN는 48시간 동안 IPTG 유도된 배양에서 86.8 mg/L의 α-파르네센을 생산하였다. 흥미롭게도 배양액 중에 FOH 부생성물 형성은 관찰되지 않았다. 이는 IspALaFS의 융합 단백질이 효과적으로 IPP 및 DMAPP를 α-파르네센 합성으로 이끌었다는 것을 나타낸다. 대장균 ispANaFS-SN의 배양에서, α-파르네센 생산 및 세포 성장은 대장균 ispAaFS-SN의 것과 유사하였고, 24시간까지 FOH의 형성이 없었음에도 불구하고 동등한 양의 FOH가 48 시간에서 여전히 수득되었다. IspANaFS 융합 단백질은 α-파르네센 생산에 있어 긍정적인 효과를 나타내는데 실패하였다. 링커 펩타이드 없는 직접적인 단백질 융합은 융합 파트너 간에 입체적 장애를 유발하여 각자의 구조적 배열 및 효소 활성에 영향을 미칠 수 있다. (GGGGS)2 링커를 사용하는 효소 융합 전략은 FPP 흐름을 FOH가 아닌 α-파르네센의 형성으로 돌릴 수 있다. IPTG 유도된 배양 조건에서 대장균 ispALaFS-SN으로부터의 더 높은 α-파르네센 생산하였고 pTispALaFS 및 0.1 mM IPTG 유도가 추가적인 연구를 위해 적용되었다.
실시예 6: α- 파르네센 생산에 있어 메발로네이트 농도의 효과
대장균 ispALaFS-SN의 α-파르네센 생산에 있어 메발로네이트 농도의 효과를 조사하기 위해 0 내지 15 mM의 다양한 농도의 메발로네이트를 첨가하였다 (도 6). 세포 성장 및 α-파르네센 생산이 첨가 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 15mM 메발로네이트를 첨가한 48시간에서 153.6 mg/L의 가장 높은 α-파르네센 생산량을 얻었고 5 mM 메발로네이트를 첨가하였을 때 얻은 86.8 mg/L의 α-파르네센 생산과 비교할 때 1.8배 증가한 것이다. 메발로네이트를 첨가하지 않은 배양에서 단지 9.8 mg/L의 α-파르네센이 얻어졌고 세포 성장 또한 메발로네이트를 첨가한 배양에 비해 훨씬 낮았다. α-파르네센 합성과 세포 성장이 내부 MEP 경로에 의해서만 제한적인 양으로 보충되는 IPP 및 DMAPP를 사용하는데 경쟁하였기 때문이다. 남은 메발로네이트 분석은 많은 양의 메발로네이트가 모든 메발로네이트 첨가된 배양에 남아있고 15 mM 메발로네이트 첨가 배양에서 48시간 동안 처음 첨가된 메발로네이트의 28%만이 소비되었다는 것을 보여준다. 메발로네이트 소비 및 α-파르네센 생산은 24 시간에서 설명할 수 없이 낮은 α-파르네센 생산이 관찰되는 15 mM 메발로네이트 첨가 배양을 제외하고, 배양의 처음 24시간 동안 거의 진행된다. 비록 α-파르네센 생산 및 세포 성장이 메발로네이트를 높은 농도로 첨가하는 것에 의해 증진되지만, 메발로네이트는 비싼 물질이고 많은 양의 잔존 메발로네이트가 낭비되기 때문에 이는 α-파르네센 생산을 위한 경제적인 방법이 아니다. 배양 배지에 있어 높은 메발로네이트 농도의 이익은 메발로네이트의 농도 구배에 의해 결정되는 확산 수송에 의한 메발로네이트의 세포적 흡수의 증가 때문인 것으로 보인다. 그러므로, α-파르네센의 대량 생산을 위해 기질로서 메발로네이트를 요구하는 하부 경로(pSSN12Didi) 대신 내부적으로 풍부한 대사 산물인 아세틸-CoA로부터 시작하는 전체 MVA 경로를 사용하는 것이 필요하다.
실시예 7: 전체 MVA 경로를 사용하는 α- 파르네센 생산
pTispALaFS 플라스미드를 pSNA와 함께 같이 형질전환시켜 대장균 ispALaFS-NA를 형성시켜, 0.1 mM IPTG 및 다양한 농도의 글리세롤 (0 - 4%, (v/v))을 포함하는 2YT 배지에서 배양시켰다. 그의 풍부함, 낮은 가격 및 높은 정도의 적합성(reduction) 때문에 탄소 및 에너지 소스로서 글리세롤을 선택하였다 (Murarka et al., 2008; Yazdani and Gonzalez, 2007). 또한 글리세롤은 바이오디젤 생산 과정에서 부산물로서 생산되어 새로운 용도가 탐색되고 있다 (da Silva et al., 2009; Fukuda et al., 2001). 결론적으로 α-파르네센의 생산은 대장균 ispALaFS-NA의 배양에 글리세롤의 추가에 의해 급격하게 증가하였다. 2.0% (v/v)까지는 글리세롤 농도에 따라 증가하였고 3.0% (v/v)의 글리세롤 첨가에서 증가의 한계점에 도달하였다 (도 7). 380.0 mg/L의 가장 높은 α-파르네센 생산이 3.0% (v/v) 글리세롤이 첨가된 48시간 배양에서 얻어졌다. 따라서, 메발로네이트의 첨가를 요구하는 하부 MVA 경로를 갖는 대장균보다 효울적으로 전체 MVA 경로를 포함하는 재조합 대장균은 값싼 탄소 소스로부터 α-파르네센을 생산할 수 있었다. 대장균 ispALaFS-NA로부터의 α-파르네센 생산은 글리세롤의 존재 하에서 24시간 후 현저하게 증가하였고, 2.0% (v/v) 글리세롤이 첨가된 배양에서 24시간에 비해 48시간에서 10배 증가가 관찰되었다. 24시간 후의 이러한 급격한 증가는 메발로네이트 중간체의 생산에서도 관찰되었다. 24시간에서 2.5 mM 미만의 메발로네이트가 글리세롤 농도에 따른 큰 차이 없이 모든 배양액에서 관찰된 반면, 2.0% (v/v)보다 많은 글리세롤이 첨가된 배양에서 상당한 양의 메발로네이트가 48시간에 축적되었다. 23.8 mM의 가장 높은 메발로네이트 축적은 4.0% (v/v) 글리세롤 첨가된 배양에서 관찰되었다. 2.0% (v/v)보다 많은 글리세롤의 첨가는 α-파르네센 생산에 있어 증가를 나타내지 않았지만 글리세롤 농도가 증가함에 따라 메발로네이트 축적은 증가하였다. 2.0% (v/v) 글리세롤 첨가된 배양에서 생산된 메발로네이트 양은 MVA 하부 경로에 포화된 농도로써 대장균 ispALaFS-NA의 α-파르네센 생산에 충분하였다. 배양액에서 메발로네이트의 높은 축적은 MVA 상부 경로(아세틸-CoA로부터 메발로네이트까지)에 비해 MVA 하부 경로의 낮은 효율을 의미한다. 그러므로, 메발로네이트의 과생산으로부터 기인하는 대사물의 낭비를 최소화하기 위해 균형잡힌 MVA 경로를 개발하는 것이 필요하다(예, 낮은 효율의 효소를 더 좋은 효율의 효소로 대체함으로써 속도를 제한하는 단계를 제거하는 것).
모든 글리세롤 첨가된 배양에서 24시간 후 세포 성장에 있어 현저한 차이는 없었으나, 48시간 후에는 글리세롤 첨가의 증가에 따라 성장도 증가하였다. 글리세롤 첨가 없는 배양에서, α-파르네센 생산 및 세포 성장은 탄소 및 에너지원의 제한으로 인해 극심하게 제한되었다. 잔여 글리세롤은 1.0% (v/v) 미만으로 글리세롤이 첨가된 배양에서 24시간 후 제한되었고, 0.5% (v/v) 글리세롤 첨가된 배양에서 48시간에는 고갈되었다. 그러나, 2.0% (v/v)보다 많은 글리세롤이 첨가된 배양에서는 글리세롤이 제한되지 않았다. 세포 성장 및 메발로네이트와 α-파르네센의 생산 모두 24시간 후의 배양에서도 현저하게 증가하였다. 특히, α-파르네센 및 메발로네이트의 생산은 세포 성장에 비해 24 시간 후 두드러지게 증가하였다. 전반적인 세포 대사의 중요한 대사물인 아세틸-CoA은 지수 증식기(logarithmic phase)에 주로 세포 성장을 위해 사용되고 세포가 활발하게 자라지 않은 때인 24시간 후에는 메발로네이트 경로를 위해 사용 가능하게 되는 것으로 보인다. 표 4는 대사 공학된 대장균의 단계적 α-파르네센 생산의 증가를 나타낸다.
균주 배양 조건 α-파르네센 생산
(mg/L)		 증가 정도(배)
대장균 wFS 2YT medium, 29℃, 1.0% (v/v) glycerol 1.2 1
대장균 aFS 2YT medium, 29℃, 1.0% (v/v) glycerol 1.6 1.3
대장균 aFS-dxs 2YT medium, 29℃, 1.0% (v/v) glycerol, 0.1mM IPTG 1.9 1.6
대장균 aFS-idi 2YT medium, 29℃, 1.0% (v/v) glycerol, 0.1mM IPTG 6.2 5.2
대장균 aFS-SN 2YT medium, 29℃, 1.0% (v/v) glycerol, 0.1mM IPTG, 5mM mevalonate 17.8 14.8
대장균ispAaFS-SN 2YT medium, 29℃, 1.0% (v/v) glycerol, 0.1mM IPTG, 5mM mevalonate 57.6 48.0
대장균ispANaFS-SN 2YT medium, 29℃, 1.0% (v/v) glycerol, 0.1mM IPTG, 5mM mevalonate 62.2 51.8
대장균ispALaFS-SN 2YT medium, 29℃, 1.0% (v/v) glycerol, 0.1mM IPTG, 5mM mevalonate 86.8 72.3
2YT medium, 29℃, 1.0% (v/v) glycerol, 0.1mM IPTG, 15mM mevalonate 153.6 128.0
대장균ispALaFS-NA 2YT medium, 29℃, 3.0% (v/v) glycerol, 0.1mM IPTG 380.0 316.7
참고
Amann, E., et al., 1988. Gene. 69, 301-15.
Berger, R. G., 2009. Biotechnol Lett. 31, 1651-9.
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Yazdani, S. S., Gonzalez, R., 2007. Curr Opin Biotechnol. 18, 213-9.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

  1. 에세리키아속 미생물에 코돈-최적화(codon-optimized)된 말루스 엑스 도메스티카(Malus x domestica) 유래의 α-파르네센 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 에세리키아속 미생물로서, 상기 미생물은 대장균인 것인 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 대장균 유래의 FPP 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 에세리키아속 미생물에 코돈-최적화된 말루스 엑스 도메스티카 유래의 α-파르네센 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 융합 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 에세리키아속 미생물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 융합 폴리뉴클레오티드는 상기 대장균 유래의 FPP 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 상기 에세리키아속 미생물에 코돈-최적화된 말루스 엑스 도메스티카 유래의 α-파르네센 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 하나 이상의 임의의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 링커(linker)가 더 결합된 것인 에세리키아속 미생물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에세리키아속 미생물은 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제 및 히드록시메틸글루타릴 (HMG)-CoA 리덕타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 엔테로코커스 패칼리스 유래의 HMG-CoA 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 메발로네이트 키나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 포스포메발로네이트 키나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 대장균 유래의 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 더 형질전환된 것인 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 에세리키아속 미생물에 코돈-최적화된 α-파르네센 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것인 미생물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 대장균 유래의 FPP 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 아미노산 서열, 및 상기 에세리키아속 미생물에 코돈-최적화된 말루스 엑스 도메스티카 유래의 α-파르네센 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것인 미생물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 대장균 유래의 FPP 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 아미노산 서열, 상기 에세리키아속 미생물에 코돈-최적화된 말루스 엑스 도메스티카 유래의 α-파르네센 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기 서열, 및 상기 하나 이상의 임의의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 링커는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것인 미생물.
  8. 제4항에 있어서, 상기 엔테로코커스 패칼리스 유래의 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제 및 히드록시메틸글루타릴 (HMG)-CoA 리덕타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4, 상기 엔테로코커스 패칼리스 유래의 HMG-CoA 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5, 상기 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 메발로네이트 키나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6, 상기 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 포스포메발로네이트 키나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7, 상기 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8, 및 상기 대장균 유래의 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 것인 미생물.
  9. 삭제
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하는 단계; 및
    배양물로부터 α-파르네센을 분리하는 단계를 포함하는 미생물로부터 α-파르네센을 생산하는 방법.
  11. 대장균 유래의 FPP 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 에세리키아속 미생물에 코돈-최적화된 말루스 엑스 도메스티카 유래의 α-파르네센 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 융합 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 36의 염기 서열을 갖는 것인 융합 폴리뉴클레오티드.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2066778A2 (en) * 2006-09-26 2009-06-10 The Regents of the University of California Production of isoprenoids and isoprenoid precursors
US7736882B2 (en) 2001-12-06 2010-06-15 The Regents Of The University Of California Host cells for production of isoprenoid compounds

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