JP7105783B2 - 組換え宿主におけるシトロネラール及びシトロネロールの生産 - Google Patents

組換え宿主におけるシトロネラール及びシトロネロールの生産 Download PDF

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Description

相互参照
本出願は、２０１６年１０月１１日に出願された米国仮出願第６２／４０６，９０６号の優先権の利益を主張するものであり、同文献の開示は参照によりその全体が本明細書に援用される。
本開示は、組換え宿主におけるシトロネラール及びシトロネロールの生産に関する。特に、本開示は、組換え宿主におけるシトロネラール、シトロネロール及びシトロネル酸前駆体の合成に関する。
関連技術
シトロネラールは、一般にシトロネラ油に関連するレモンの香りを提供するモノテルペノイドである。レモンの香りの香気を提供することに加えて、シトロネラールは、蚊を含むがこれらに限定されない昆虫を追い払うこと、及び抗真菌特性を有することが示されている。シトロネラールはまた、関連するキラル化合物の不斉合成用の出発材料としても有用である。
シトロネラールは、主として植物の二次代謝によって形成される。シトロネラールは、Ｃｏｒｙｍｂｉａ ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ、Ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎ ｎａｒｄｕｓ、及びＣｙｍｂｏｐｏｇｏｎ ｗｉｎｔｅｒｉａｎｕｓなどの植物の油から抽出することができる。シトロネラールは、最も一般には、水蒸気蒸留または溶剤抽出によって、そのＲ－及びＳ－鏡像異性体の非ラセミ混合物として単離される。
シトロネラールは、シトロネロールへと還元的に生物変換され得る。シトロネロール合成は通常、ゲラニオール（トランス）またはネロール（シス）の水素化によって行われる。シトロネラールと同様に、シトロネロールは香料工業において一般に使用され、昆虫忌避剤として作用し、またいくつかの天然テルペノイドの合成における中間体として使用され得る。
例えば香料工業及び製薬工業における、シトロネラール及びシトロネロール両方の堅調な生産から、現在の工業ニーズを満たすために土地、設備、及びバイオマス発電の点でかなりの農業資源が必要とされている。しかしながら、効率が高く、再生可能なこれらの化合物の代替的資源の特定は、困難なままである。その上、より高い純度のシトロネラール及びシトロネロール化合物が必要とされる一方で、これらを追加の処理工程なしに植物源から得ることは困難である。したがって、規模拡大できる量の高純度シトロネラール及びシトロネロールを得るための代替的な手法を開発する必要性が依然としてある。
本発明が先行技術を上回るある特定の利点及び発展を提供するのは、上記の背景に照らしたものである。特に、本明細書に記載されるように、シトロネラール及びシトロネロールを作製するための細菌または酵母といった組換え微生物の使用が開示される。
本明細書に開示される本発明は具体的な利点または機能性に限定されないが、本発明は、シトロネラールまたはシトロネル酸を生産可能な組換え宿主細胞であって、
（ａ）ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｂ）ゲラニオールシンターゼ（ＧＥＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｃ）ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（ＧｅＤＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｄ）エノエートレダクターゼ（ＥＮＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、を含み、
該遺伝子のうちの少なくとも１つが組換え遺伝子である、該組換え宿主細胞を提供する。
本発明はまた、シトロネラール、シトロネロール、またはシトロネル酸を生産可能な組換え宿主細胞であって、
（ａ）ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｂ）ゲラニオールシンターゼ（ＧＥＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｃ）ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（ＧｅＤＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｄ）エノエートレダクターゼ（ＥＮＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｅ）アルデヒドレダクターゼ（ＡＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、を含み、
該遺伝子のうちの少なくとも１つが組換え遺伝子である、該組換え宿主細胞も提供する。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、
（ａ）該ＥＮＲポリペプチドが、ゲラニアール及び／またはネラールからのシトロネラールの形成を触媒し、
（ｂ）該ＡＲポリペプチドが、ネラールからのネロール及び／またはシトロネラールからのシトロネロールの形成を触媒する。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該ＧＥＳポリペプチドは、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）からのゲラニオールの形成を触媒し、該ＧＰＰは、該ＧＰＰＳポリペプチドがメバロン酸経路及び／またはメチルエリトリトール４－リン酸（ＭＥＰ）経路からイソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）を変換することによって生産される。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、メバロン酸経路は、内在性経路または組換え経路である。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、
（ａ）該ＧＰＰＳポリペプチドが、配列番号１７、５９～６２、または８７～８８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｂ）該ＧＥＳポリペプチドが、配列番号１８または６３～６６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｃ）該ＧｅＤＨポリペプチドが、配列番号１～６、１９、２０、または２４～３２のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｄ）該ＥＮＲポリペプチドが、配列番号７～９、２１、２２、３３、３４、３７、４４～４８、５４、５５、または６７のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｅ）該ＡＲポリペプチドが、配列番号３１～３２、６８、または８３～８６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
本発明はまた、シトロネラール、シトロネロール、またはシトロネル酸を生産可能な組換え宿主細胞であって、
（ａ）ネリル二リン酸シンターゼ（ＮＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｂ）ネロールシンターゼ（ＮＥＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｃ）ネロールデヒドロゲナーゼ（ＮｅＤＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｄ）エノエートレダクターゼ（ＥＮＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、を含み、
該遺伝子のうちの少なくとも１つが組換え遺伝子である、該組換え宿主細胞も提供する。
本発明はまた、シトロネラール、シトロネロール、またはシトロネル酸を生産可能な組換え宿主細胞であって、
（ａ）ネリル二リン酸シンターゼ（ＮＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｂ）ネロールシンターゼ（ＮＥＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｃ）ネロールデヒドロゲナーゼ（ＮｅＤＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｄ）エノエートレダクターゼ（ＥＮＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｅ）アルデヒドレダクターゼ（ＡＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、を含み、
該遺伝子のうちの少なくとも１つが組換え遺伝子である、該組換え宿主細胞も提供する。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、
（ａ）該ＥＮＲポリペプチドが、ゲラニアール及び／またはネラールからのシトロネラールの形成を触媒し、
（ｂ）該ＡＲポリペプチドが、ゲラニアールからのゲラニオール及び／またはシトロネラールからのシトロネロールの形成を触媒する。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、
（ａ）該ＮＰＰＳポリペプチドが、配列番号５３または７４～７５のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｂ）該ＮＥＳポリペプチドが、配列番号５６～５８または７７～７９のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｃ）該ＮｅＤＨポリペプチドが、配列番号１～６、１９、２０、または２４～３２のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｄ）該ＥＮＲポリペプチドが、配列番号７～９、２１、２２、３３、３４、３７、４４～４８、５４～５５、または６７のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｅ）該ＡＲポリペプチドが、配列番号３１、３２、または８３～８６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｆ）該ＡＤＨポリペプチドが、配列番号６８に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
本発明はまた、シトロネラール及び／またはシトロネロールを生産可能な組換え宿主細胞であって、
（ａ）ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子またはネリル二リン酸シンターゼ（ＮＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｂ）ゲラニオールシンターゼ（ＧＥＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子またはネリルシンターゼ（ＮＥＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、を含み、
該組換え宿主細胞が、イリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）ポリペプチドをコードする遺伝子またはエノエートレダクターゼ（ＥＮＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含み、該遺伝子のうちの少なくとも１つが組換え遺伝子である、該組換え宿主細胞も提供する。
本発明はまた、シトロネラール、シトロネロール、またはシトロネル酸を生産可能な組換え宿主細胞であって、
（ａ）ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子またはネリル二リン酸シンターゼ（ＮＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｂ）ゲラニオールシンターゼ（ＧＥＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子またはネリルシンターゼ（ＮＥＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、を含み、
該組換え宿主細胞が、イリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）ポリペプチドをコードする遺伝子及びシトロネラール／シトロネロールデヒドロゲナーゼ（ＣｉＤＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含み、該遺伝子のうちの少なくとも１つが組換え遺伝子である、該組換え宿主細胞も提供する。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、
（ａ）該ＧＰＰＳポリペプチドが、配列番号１７、５９～６２、８７、または８８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｂ）該ＮＰＰＳポリペプチドが、配列番号５３、７４、または７５のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｃ）該ＧＥＳポリペプチドが、配列番号１８または６３～６６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｄ）該ＮＥＳポリペプチドが、配列番号５６～５８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｅ）該ＩＳＹポリペプチドが、配列番号５４または５５のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｆ）該ＥＮＲポリペプチドが、配列番号７～９、２１、２２、３３、３４、３７、４４～４８、５４、５５、または６７のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｇ）該ＣｉＤＨポリペプチドが、配列番号４９～５２のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該シトロネラールは、ｄ－シトロネラール、ｌ－シトロネラール、またはそれらの組み合わせである。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該シトロネロールは、ｄ－シトロネロール、ｌ－シトロネロール、またはそれらの組み合わせである。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該組換え宿主細胞は、植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞を含む。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該組換え宿主細胞は細菌細胞である。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞である。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該組換え宿主細胞は、ＡＤＨ６、ＲＦＸ１、ＧＲＥ２、ＡＲＩ１、ＧＣＹ１、及びＡＹＲ１のうちの１つ以上の欠失をさらに含む酵母細胞である。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該酵母は、
（ａ）ＡＤＨ６、ＲＦＸ１、ＧＲＥ２、ＡＲＩ１、ＧＣＹ１、及びＡＹＲ１の欠失、または
（ｂ）ＡＤＨ６、ＲＦＸ１、ＧＲＥ２、及びＡＲＩ１の欠失を含む。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該組換え宿主細胞は、異種ＮＡＤＨオキシダーゼポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む酵母細胞である。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該異種ＮＡＤＨオキシダーゼポリペプチドは、配列番号６９に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該異種ＮＡＤＨオキシダーゼポリペプチドは、配列番号６９に記載されるアミノ酸配列を有する。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該組換え宿主細胞は、カルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む酵母細胞である。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該ＣＡＲポリペプチドは、配列番号７０に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該ＣＡＲポリペプチドは、配列番号７０に記載されるアミノ酸配列を有する。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該組換え酵母細胞は、ホスホパネイン（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｅｉｎｅ）トランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）ポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該ＰＰＴａｓｅポリペプチドは、配列番号７１に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該ＰＰＴａｓｅポリペプチドは、配列番号７１に記載されるアミノ酸配列を有する。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。
本明細書に開示される組換え宿主細胞の一態様では、該Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、野生型よりも低いファルネシルピロリン酸シンターゼ活性をもたらすように転写的に下方調節または変異されているファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＥＲＧ２０）遺伝子を含有する。
本発明はまた、シトロネラール、シトロネロール、またはシトロネル酸の生産方法であって、本明細書に開示される組換え宿主細胞を細胞培養液中、該遺伝子が発現される条件下で増殖させることを含み、該シトロネラール、シトロネロール、またはシトロネル酸が該組換え宿主細胞によって生産される、該方法も提供する。
本明細書に開示される方法の一態様では、該組換え宿主細胞は、該ＧＰＰＳポリペプチドをコードする遺伝子もしくは該ＮＰＰＳポリペプチドをコードする遺伝子、該ＧＥＳポリペプチドをコードする遺伝子もしくは該ＮＥＳポリペプチドをコードする遺伝子、該ＧｅＤＨポリペプチドをコードする遺伝子もしくは該ＮｅＤＨポリペプチドをコードする遺伝子、該ＩＳＹポリペプチドをコードする遺伝子、該ＣｉＤＨポリペプチドをコードする遺伝子、及び／または該ＥＮＲポリペプチドをコードする遺伝子を含む、１つ以上のプラスミドで形質転換され、該遺伝子のうちの少なくとも１つが組換え遺伝子である。
本明細書に開示される方法の一態様では、該組換え宿主細胞は、該ＧＰＰＳポリペプチドをコードする遺伝子もしくは該ＮＰＰＳポリペプチドをコードする遺伝子、該ＧＥＳポリペプチドをコードする遺伝子もしくは該ＮＥＳポリペプチドをコードする遺伝子、該ＧｅＤＨポリペプチドをコードする遺伝子もしくは該ＮｅＤＨポリペプチドをコードする遺伝子、該ＩＳＹポリペプチドをコードする遺伝子、該ＣｉＤＨポリペプチドをコードする遺伝子、及び／または該ＥＮＲポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換され、該遺伝子のうちの少なくとも１つが組換え遺伝子である。
本明細書に開示される方法の一態様では、該組換え遺伝子のうちの少なくとも１つは、該宿主細胞ゲノム内に組み込まれる。
本発明はまた、シトロネラールまたはシトロネロールの生産方法であって、シトロネラールまたはシトロネロール前駆体を細胞培養液中、
（ａ）ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）ポリペプチド、
（ｂ）ゲラニオールシンターゼ（ＧＥＳ）ポリペプチド、
（ｃ）ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（ＧｅＤＨ）ポリペプチド、
（ｄ）ネリル二リン酸シンターゼ（ＮＰＰＳ）ポリペプチド、
（ｅ）ネロールシンターゼ（ＮＥＳ）ポリペプチド、
（ｆ）ネロールデヒドロゲナーゼ（ＮｅＤＨ）ポリペプチド、
（ｇ）イリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）ポリペプチド、
（ｈ）シトロネラール／シトロネロールデヒドロゲナーゼ（ＣｉＤＨ）ポリペプチド、
（ｉ）エノエートレダクターゼ（ＥＮＲ）ポリペプチド、
（ｊ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）ポリペプチド、及び／または
（ｋ）アルデヒドレダクターゼ（ＡＲ）ポリペプチド、のうちの１つ以上であって、
該ポリペプチドのうちの少なくとも１つが組換えポリペプチドである、該１つ以上を使用して全細胞生物変換することと、それによって該シトロネラールまたは該シトロネロールを生産させることと、を含む、該方法も提供する。
本明細書に開示される方法の一態様では、
（ａ）該ＥＮＲポリペプチドがゲラニアールをシトロネラールに還元し、
（ｂ）該ＡＤＨ及びＡＲポリペプチドがシトロネラールをシトロネロールに還元する。
本明細書に開示される方法の一態様では、
（ａ）該ＧＰＰＳポリペプチドが、配列番号１７、５９～６２、８７、または８８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｂ）該ＧＥＳポリペプチドが、配列番号１８または６３～６６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｃ）該ＧｅＤＨポリペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、１９、２０、または２４～３２のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｄ）該ＮＰＰＳポリペプチドが、配列番号５３、７４、または７５のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｅ）該ＮＥＳポリペプチドが、配列番号５６～５８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｆ）該ＮｅＤＨポリペプチドが、配列番号１～６、１９、２０、または２４～３２のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｇ）該ＩＳＹポリペプチドが、配列番号５４または５５のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｈ）該ＣｉＤＨポリペプチドが、配列番号４９～５２のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｉ）該ＥＮＲポリペプチドが、配列番号７～９、２１、２２、３３、３４、３７、４４～４８、５４、５５、または６７のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｊ）該ＡＤＨポリペプチドが、配列番号６８に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
（ｋ）該ＡＲポリペプチドが、配列番号３１、３２、または８３～８６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
本発明はまた、シトロネラールまたはシトロネロールの生産方法であって、
（ａ）アセチル－ＣｏＡをイソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換可能な遺伝子を含む、メバロン酸経路を有する組換え宿主細胞であって、該組換え宿主細胞が細菌、真菌、藻類、または酵母細胞である、該組換え宿主細胞を用意することと、
（ｂ）（ｉ）ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｉｉ）ゲラニオールシンターゼ（ＧＥＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｉｉｉ）ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（ＧｅＤＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｉｖ）エノエートレダクターゼ（ＥＮＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子、及び／または
（ｖ）アルデヒドレダクターゼ（ＡＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子を含む、シトロネラールプラスミドを用意することと、
（ｃ）該組換え宿主細胞を該シトロネラールプラスミドで形質転換することと、
（ｄ）該シトロネラールプラスミドで形質転換された該組換え宿主細胞を培養液中で培養することと、を含み、
該シトロネラールまたは該シトロネロールが該組換え宿主細胞によって生産される、該方法も提供する。
本明細書に開示される方法の一態様では、該メバロン酸経路は、宿主細胞に対して内在性または外来性であり、１つ以上のオペロンまたは協調的遺伝子調節（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）エレメントに細分される。
本明細書に開示される方法の一態様では、該１つ以上のオペロンまたは協調的遺伝子調節エレメントのうちの第１のオペロンは、
（ａ）プロモーターと、
（ｂ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（Ｅｃ＿ａｔｏＢ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｃ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ（Ｌｃ＿ＭｖａＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｄ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ（Ｌｃ＿ＭｖａＡ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、を含む。
本明細書に開示される方法の一態様では、該１つ以上のオペロンまたは協調的遺伝子調節エレメントのうちの第２のオペロンは、
（ａ）プロモーターと、
（ｂ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅメバロン酸キナーゼ（Ｓｃ＿ｅｒｇ１２）ポリペプチドまたはＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉメバロン酸キナーゼ（Ｍｍ＿ＭＫ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｃ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅホスホメバロン酸キナーゼ（Ｓｃ＿ｅｒｇ８）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｄ）Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅジホスホメバロン酸（Ｄｉｐｈｏｓｐｏｍｅｖａｌｏｎａｔｅ）デカルボキシラーゼ（Ｓｃ＿ｅｒｇ１９）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｅ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（Ｅｃ＿ｉｄｉ）ポリペプチドまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅイソペンチル二リン酸イソメラーゼ（Ｓｐ＿ｉｄｉ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、を含む。
本明細書に開示される方法の一態様では、該シトロネラールプラスミドは、
（ａ）少なくとも１つのプロモーターと、
（ｂ）ゲラニル二リン酸シンターゼポリペプチドをコードする遺伝子と、
（ｃ）ゲラニオールシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子と、を含み、
また、
（ｄ）Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ＿黄色酵素（Ｋｌ＿ＫＹＥ１）ポリペプチド、エンレダクターゼ（Ｐｓ＿ＯＹＥ２．６）ポリペプチド、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ ＥＮＲ（Ｚｍ＿ＯＹＥ）ポリペプチド、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＮＲ（Ｓｃ＿ＯＹＥ２）ポリペプチド、もしくはＳｃ＿ＯＹＥ３ポリペプチドをコードする遺伝子である遺伝子によってコードされる、ＥＮＲポリペプチド、または
（ｅ）Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｃｄ＿ＧｅＤＨ）ポリペプチド、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ菌種ＲＤ６．２ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｒｓ＿ＧｅＤＨ）ポリペプチド、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ ｍａｃｒｏｇｏｌｔａｂｉｄａゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｓｍ＿ＧｅＤＨ）ポリペプチド、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ａｃ＿ＧｅＤＨ）ポリペプチド、もしくはＴｈａｕｅｒａ ｔｅｒｐｅｎｉｃａ ５８Ｅｕゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｔｔ＿ＧｅＤＨ）ポリペプチドをさらに含む。
本明細書に開示される方法の一態様では、ゲラニル二リン酸シンターゼをコードする該遺伝子は、Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓゲラニル二リン酸シンターゼ（Ａｇ＿ＧＰＰＳ２）またはＰｉｃｅａ ｇｌａｕｃａゲラニル二リン酸シンターゼ（Ｐｇ＿ＧＰＰＳ）であり、ゲラニオールシンターゼをコードする該遺伝子は、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓエラニオール（ｅｒａｎｉｏｌ）シンターゼ（Ｃｒ＿ＧＥＳ）、Ｏｃｉｍｕｍ ｂａｓｉｌｉｃｕｍゲラニオールシンターゼ（Ｏｂ＿ＧＥＳ）、Ｐｈｙｌａ ｄｕｌｃｉｓゲラニオールシンターゼ（Ｐｄ＿ＧＥＳ）、またはＶａｌｅｒｉａｎａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓゲラニオールシンターゼ（ＶＯ＿ＧＥＳ）遺伝子である。
本明細書に開示される方法の一態様では、該培養培地は、ネロール及び／またはゲラニオールをさらに含む。
本明細書に開示される方法の一態様では、該宿主細胞は、酸化細菌に接触させられる。
本明細書に開示される方法の一態様では、該酸化細菌は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属由来である。
本明細書に開示される方法の一態様では、該酸化細菌は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ、またはＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓである。
一態様では、本明細書に開示される方法は、該生産されたシトロネラール、該シトロネロール、もしくは該シトロネル酸単独またはそれらの組み合わせを単離することをさらに含む。
本明細書に開示される方法の一態様では、単離工程は、
（ａ）該生産されたシトロネラール、該シトロネロール、もしくは該シトロネル酸単独または該それらの組み合わせを含む該細胞培養液を用意することと、
（ｂ）該細胞培養液の液相を該細胞培養液の固相から分離させて、該生産されたシトロネラール、該シトロネロール、もしくは該シトロネル酸単独または該それらの組み合わせを含む上清を得ることと、
（ｃ）１つ以上の充填済みイオン交換または逆相クロマトグラフィーカラム中に１つ以上の吸着性樹脂を用意することと、
（ｄ）工程（ｂ）の該上清を該１つ以上の充填済みイオン交換または逆相クロマトグラフィーカラム中の該１つ以上の吸着性樹脂に接触させて、該生産されたシトロネラール、該シトロネロール、もしくは該シトロネル酸単独または該それらの組み合わせの少なくとも一部分を得、それによって該生産されたシトロネラール、該シトロネロール、もしくは該シトロネル酸単独または該それらの組み合わせを単離することと、を含む。
本明細書に開示される方法の一態様では、単離工程は、
（ａ）該生産されたシトロネラール、該シトロネロール、もしくは該シトロネル酸単独または該それらの組み合わせを含む該細胞培養液を用意することと、
（ｂ）該細胞培養液の液相を該細胞培養液の固相から分離させて、該生産されたシトロネラール、該シトロネロール、もしくは該シトロネル酸単独または該それらの組み合わせを含む上清を得ることと、
（ｃ）該生産されたシトロネラール、該シトロネロール、もしくは該シトロネル酸単独または該それらの組み合わせのうちの１つ以上を結晶化させるかまたは抽出し、それによって該生産されたシトロネラール、該シトロネロール、もしくは該シトロネル酸単独または該それらの組み合わせを単離することと、を含む。
一態様では、本明細書に開示される方法は、該シトロネラール、該シトロネロール、該シトロネル酸、またはその組成物を回収することをさらに含む。
本明細書に開示される方法の一態様では、該回収された組成物は、光学的に純粋なシトロネラールまたはシトロネロールの組成物で富化される。
本明細書に開示される方法の一態様では、該組換え宿主細胞は、細菌細胞である。
本明細書に開示される方法の一態様では、該細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞である。
本明細書に開示される方法の一態様では、該組換え宿主細胞は、酵母細胞である。
本明細書に開示される方法の一態様では、該酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
本発明はまた、ゲラニアール、シトロネラール、シトロネロール、シトロネル酸、またはそれらの組み合わせの製造におけるＧｅＤＨポリペプチドの使用も提供する。
本発明はまた、ネラール、シトロネラール、シトロネロール、もしくはシトロネル酸またはそれらの組み合わせの製造におけるＮｅＤＨポリペプチドの使用も提供する。
本発明はまた、ゲラニアール、ネラール、シトロネラール、シトロネロール、もしくはシトロネル酸またはそれらの組み合わせの製造のためのＧｅＤＨポリペプチド及び／またはＮｅＤＨポリペプチドの使用も提供する。
本発明はまた、シトロネラール、シトロネル酸またはそれらの組み合わせの製造におけるＣｉＤＨポリペプチドの使用も提供する。
本発明はまた、ゲラニアール、シトロネラール、シトロネロール、もしくはシトロネル酸またはそれらの組み合わせの生体外または全細胞生物変換製造におけるＧｅＤＨポリペプチドの使用も提供する。
本発明はまた、ネラール、シトロネラール、シトロネロール、もしくはシトロネル酸またはそれらの組み合わせの生体外または全細胞生物変換製造におけるＮｅＤＨポリペプチドの使用も提供する。
本発明はまた、ゲラニアール、ネラール、シトロネラール、シトロネロール、もしくはシトロネル酸またはそれらの組み合わせの生体外または全細胞生物変換製造におけるＧｅＤＨポリペプチド及びＮｅＤＨポリペプチドの使用も提供する。
本発明はまた、シトロネラール、シトロネル酸、またはそれらの組み合わせの生体外または全細胞生物変換製造におけるＣｉＤＨポリペプチドの使用も提供する。
本明細書に開示される使用の一態様では、該ＧｅＤＨポリペプチドは、配列番号１～６、１９、２０、または２４～３２のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも４５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
本明細書に開示される使用の一態様では、該ＮｅＤＨポリペプチドは、配列番号１～６、１９、２０、または２４～３２のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
本明細書に開示される使用の一態様では、該ＣｉＤＨポリペプチドは、配列番号４９～５２のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性配列同一性を有するポリペプチドを含む。
本発明はまた、シトロネロール、シトロネラール、シトロネル酸、またはそれらの組み合わせの製造におけるＥＮＲポリペプチドの使用も提供する。
本発明はまた、シトロネロール、シトロネラール、シトロネル酸、またはそれらの組み合わせの生体外または全細胞生物変換製造におけるＥＮＲポリペプチドの使用も提供する。
本明細書に開示される使用の一態様では、ＥＮＲポリペプチドは、配列番号７～９、２１、２２、３３、３４、３７、４４～４８、５４、５５、または６７のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
本発明はまた、シトロネロール、シトロネラール、シトロネル酸またはそれらの組み合わせの製造におけるＩＳＹポリペプチドの使用も提供する。
本発明はまた、シトロネロール、シトロネラール、シトロネル酸、またはそれらの組み合わせの生体外または全細胞生物変換製造におけるＩＳＹポリペプチドの使用も提供する。
本明細書に開示される使用の一態様では、ＩＳＹポリペプチドは、配列番号５４または５５のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
本発明はまた、ゲラニオール、ネロール、シトロネロール、シトロネル酸またはそれらの組み合わせの製造におけるＡＲポリペプチドの使用も提供する。
本発明はまた、ゲラニオール、ネロール、シトロネロール、シトロネル酸またはそれらの組み合わせの生体外または全細胞生物変換製造におけるＡＲポリペプチドの使用も提供する。
本明細書に開示される使用の一態様では、ＡＲポリペプチドは、配列番号３１、３２、または８３～８６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
本発明のこれら及び他の特徴及び利点は、添付の特許請求の範囲と併せて、以下の詳細な説明からより完全に理解されよう。特許請求の範囲は、その中での列挙によって定義されるものであり、本明細書に記載される特徴及び利点の具体的な考察によって定義されるものではないことに留意されたい。
本発明の実施形態の以下の詳細な説明は、以下の図面と併せて閲読するとき最もよく理解され得る。これらの図面において、同様の構造は同様の数字により示される。
シトロネラール生合成経路の概略図を示す。各反応において該当する場合、酵素が示される。 示される酵素及び産物を伴う代替的なシトロネラール／シトロネロール経路を示す。 示される酵素及び産物を伴うなおも別の代替的なシトロネラール／シトロネロール経路を示す。 酵母におけるプラスミドベースのシトロネラール／シトロネロール経路生産を示す。Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ＿ゲラニル二リン酸シンターゼ（Ａｇ＿ＧＰＰＳ２）、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ＿ゲラニオールシンターゼ（Ｃｒ＿ＧＥＳ）、Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓ＿ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｃｄ＿ＧｅＤＨ）、及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ＿黄色酵素（Ｋｌ＿ＫＹＥ１）を共発現させることによる、酵母において生体内でシトロネラール／シトロネロール経路を開始させる異種遺伝子の発現。 シトロネラール／シトロネロール経路のための代替的な出発基質であり得る、酵母におけるプラスミドベースのネロール生産を示す。Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ＿ゲラニル二リン酸シンターゼ（Ａｇ＿ＧＰＰＳ２）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ＿ネロールシンターゼ（Ｇｍ＿ＮＥＳ）、またはＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ＿ネリル二リン酸シンターゼ（Ｓｌ＿ＮＤＰＳ１）及びＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ＿ネロールシンターゼ（Ｇｍ＿ＮＥＳ）を共発現させることによる、酵母において生体内でシトロネラール／シトロネロール経路を開始させる異種遺伝子の発現。 ゲラニオールからシトロネロールへの、次いでシトロネロールからシトロネラールへの変換を介した、酵母におけるプラスミドベースのシトロネラール／シトロネロール経路生産を示す。Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ＿ゲラニル二リン酸シンターゼ（Ａｇ＿ＧＰＰＳ２）、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ＿ゲラニオールシンターゼ（Ｃｒ＿ＧＥＳ）、またはＡｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ、及びＯｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ＿イリドイドシンターゼ（Ｏｅ＿ＩＳＹ）、またはＡｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｏｅ＿ＩＳＹ、及びＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ菌種ＤＦＣｌ－１＿シトロネラール／シトロネロールデヒドロゲナーゼ（Ｂｓ＿ＣｉＤＨ）を共発現させることによる、酵母において生体内でシトロネラール／シトロネロール経路を開始させる異種遺伝子の発現。 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへのシトロネラール／シトロネロール経路遺伝子の全染色体組込み、すなわち、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中のＡｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ＿ゲラニル二リン酸シンターゼ（Ａｇ＿ＧＰＰＳ２）、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ＿ゲラニオールシンターゼ（Ｃｒ＿ＧＥＳ）、Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓ＿ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｃｄ＿ＧｅＤＨ）、及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ＿黄色酵素（Ｋｌ＿ＫＹＥ１）を示す。 組み込まれた経路を有する酵母において生産されたシトロネラール／シトロネロールのキラルＧＣを示す。 酵母における内在性ＥＮＲまたは過剰発現Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ＿ＥＮＲ（Ｓｃ＿ＯＹＥ２）を有するシトロネラール／シトロネロール経路生産を示す。 内在性ＥＮＲ活性を有する酵母において生産されたシトロネラール／シトロネロールのキラルＧＣを示す。 過剰発現Ｓｃ＿ＯＹＥ２活性を有する酵母において生産されたシトロネラール／シトロネロールのキラルＧＣを示す。 酵母におけるシトロネラール／シトロネロール経路で活性なＧｅＤＨを示す。酵母における生体内での、各ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（ＧｅＤＨ）である、Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓ＿ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｃｄ＿ＧｅＤＨ）、Ｔｈａｕｅｒａ ｔｅｒｐｅｎｉｃａ ５８Ｅｕ＿ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｔｔ＿ＧｅＤＨ）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ菌種ＲＤ６．２＿ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｒｓ＿ＧｅＤＨ）、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ ｍａｃｒｏｇｏｌｔａｂｉｄａ＿ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｓｍ＿ＧｅＤＨ）、及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ＿ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ａｃ＿ＧｅＤＨ）、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ＿ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｐｐ＿ＧｅＤＨ）の、Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ＿ゲラニル二リン酸シンターゼ（Ａｇ＿ＧＰＰＳ２）、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ＿ゲラニオールシンターゼ（Ｃｒ＿ＧＥＳ）及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ＿黄色酵素（Ｋｌ＿ＫＹＥ１）との発現。 対照条件下及びＫｌ＿ＫＹＥ１またはＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ＿ＥＮＲ（Ｚｍ＿ＯＹＥ）のいずれかが過剰発現されたときの、酵母におけるプラスミドベースのシトロネラール／シトロネロール生産を示す。 過剰発現Ｋｌ＿ＫＹＥ１活性を有する酵母において生産されたシトロネラール／シトロネロールのキラルＧＣを示す。 過剰発現Ｚｍ＿ＯＹＥ活性を有する酵母において生産されたシトロネラール／シトロネロールのキラルＧＣを示す。 シトラールのＫ＿ＫＹＥ１（上）またはＺｍ＿ＯＹＥ（下）による生体外変換を示す。 ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（ＧｅＤＨ）である、Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓ＿ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｃｄ＿ＧｅＤＨ）、Ｔｈａｕｅｒａ ｔｅｒｐｅｎｉｃａ ５８Ｅｕ＿ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｔｔ＿ＧｅＤＨ）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ菌種ＲＤ６．２＿ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｒｓ＿ＧｅＤＨ）、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ ｍａｃｒｏｇｏｌｔａｂｉｄａ＿ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｓｍ＿ＧｅＤＨ）、及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ＿ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ａｃ＿ＧｅＤＨ）を含有する酵母細胞溶解物におけるゲラニオール変換を示す。上記で列挙したＧｅＤＨの各々を含有する酵母細胞溶解物におけるシトロネラール、ゲラニオール及びシトロネロールシグナルを１分、１５分及び９０分時点で測定した。 主にＲｓ＿ＧｅＤＨがゲラニオールからゲラニアールへの変換を触媒することを示す。 Ｅ．ｃｏｌｉにおけるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリピロリン酸（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＤＭＡＰＰ）生産のためのメバロン酸プラスミド（ｐＭｅｖプラスミド）の設計の概略図を示す。 Ｅ．ｃｏｌｉにおけるシトロネラール／シトロネロール生産のためのシトロネラールプラスミド（ｐＣｉｔｒｏプラスミド）の設計の概略図を示す。 Ｃｄ＿ＧｅＤＨまたはＲｓ＿ＧｅＤＨを使用したＥ．ｃｏｌｉにおけるｐＭＥＶ及びｐＣｉｔｒｏ（Ｋｌ－ＫＹＥ１）プラスミド上でのシトロネラール／シトロネロール経路生産を示す。 Ｃｄ＿ＧｅＤＨ及びＫｌ＿ＫＹＥ１活性を有するＥ．ｃｏｌｉにおいて生産されたシトロネラール／シトロネロールのキラルＧＣを示す。 Ｒｓ＿ＧｅＤＨ及びＫｌ＿ＫＹＥ１活性を有するＥ．ｃｏｌｉにおいて生産されたシトロネラール／シトロネロールのキラルＧＣを示す。 Ｃｄ＿ＧｅＤＨ及びＺｍ＿ＯＹＥを発現するＥ．ｃｏｌｉにおけるｐＭＥｖ及びｐＣｉｔｒｏプラスミド上でのシトロネラール／シトロネロール経路生産を示す。 Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＺｍ＿ＯＹＥ及びＣｄ＿ＧｅＤＨが過剰発現されている経路によって生産されたシトロネラール／シトロネロールのキラルＧＣを示す。 シトロネラール／シトロネロール経路発現カセットが組み込まれた酵母における、アルデヒドレダクターゼ（ＡＲ）活性に関与する酵母の内在性遺伝子ＡＤＨ６、ＲＦＸ１、ＧＲＥ２、ＡＲＩ１、ＧＣＹ１、及びＡＹＲ１の欠失が、酵母におけるシトロネラール蓄積の増加につながることを示す。 シトロネラール／シトロネロール経路発現カセットが組み込まれた酵母における異種ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子の発現が、酵母におけるシトロネラールの化学純度の増加につながることを示す。 シトロネラール／シトロネロール経路発現カセットが組み込まれた酵母における、異種ホスホパンテテイントランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）と共にした異種カルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）遺伝子の発現が、酵母におけるシトロネラールの化学純度の増加につながることを示す。 酵母において、ネロールが、Ｎｅ／ＧｅＤＨ及びエン－レダクターゼ活性を有する異種遺伝子によってシトロネラール及びシトロネロールに変換されて、ｄ－及びｌ－シトロネラール、ならびにｄ－及びｌ－シトロネロールを生産し得ることを示す。 酵母において、ゲラニオールが、イリドイドシンターゼ活性を有する異種遺伝子によってシトロネラール及びシトロネロールに変換されて、ｄ－及びｌ－シトロネラール、ならびにｄ－及びｌ－シトロネロールを生産し得ることを示す。 酵母において、ネロールが、イリドイドシンターゼを有する異種遺伝子によってシトロネラール及びシトロネロールに変換されて、ｄ－及びｌ－シトロネラール、ならびにｄ－及びｌ－シトロネロールを生産し得ることを示す。 シトロネロールからシトロネラール及びシトロネル酸への生物変換による結果を示す。酸化細菌Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓは、１４４時間後にシトロネロールをシトロネラール及びシトロネル酸へと変換した。 シトロネロールからシトロネラールへの生物変換による結果を示す。酸化細菌Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓは、１４４時間後にシトロネロールをシトロネラールへと変換した。 シトロネラールからシトロネル酸への生物変換による結果を示す。酸化細菌Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓは、１４４時間後に１００％のシトロネラールをシトロネル酸へと変換した。 シトロネロールからシトロネル酸への生物変換による結果を示す。酸化細菌Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓまたはＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉは、１４４時間後に１００％のシトロネロールをシトロネル酸へと変換した。
当業者であれば、図中の要素が簡略化及び明確性を考慮して例示されており、必ずしも一定の縮尺では描かれていないことを理解するであろう。例えば、図中の要素のうちのいくつかの寸法は、本発明の実施形態（複数可）の理解を改善する一助となるように、他の要素に対して誇張され得る。
本明細書で引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照によりあらゆる目的で本明細書に明示的に援用される。
本発明を詳細に説明する前に、いくつかの用語を定義する。本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、１つの「核酸」への言及は、１つ以上の核酸を意味する。
本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、所与の値の±１０％を指す。
「好ましくは」、「一般に」、及び「典型的に」のような用語は、本明細書において、特許請求される本発明の範囲を限定するようにも、またはある特定の特徴が特許請求される本発明の構造もしくは機能にとって必要不可欠、必須、もしくはさらに重要であることを黙示するようにも利用されるものではないことに留意されたい。むしろ、これらの用語は、本発明の特定の実施形態で利用できることもできないこともある、代替的なまたは追加の特徴を強調することを単に意図している。
本発明を説明し、定義する目的で、「実質的に」という用語は、本明細書において、任意の定量的比較、値、測定値、または他の表現に起因し得る本来的な程度の不確実性を表すように利用されることに留意されたい。「実質的に」という用語はまた、本明細書において、論争中の発明の主題の基本的機能の変化をもたらすことなく、ある定量的表現が述べられた指示対象から異なり得る程度を表すようにも利用される。
当業者に周知の方法を使用して、本発明による遺伝子発現構築物及び組換え細胞を構築することができる。これらの方法には、生体外組換えＤＮＡ技術、合成技術、生体内組換え技術、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術が含まれる。例えば、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、及びＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に記載される技術を参照されたい。
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」という用語は、当業者には理解されるように、文脈に応じて１本鎖または２本鎖いずれかの実施形態における、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせを含む核酸を指すように交換可能に使用され得る。
本明細書で使用されるとき、「微生物」、「微生物宿主」、「微生物宿主細胞」、「組換え宿主」、及び「組換え宿主細胞」という用語は、交換可能に使用され得る。本明細書で使用されるとき、「組換え宿主」という用語は、少なくとも１つのＤＮＡ配列によってゲノムが増強された宿主を指すことを意図する。かかるＤＮＡ配列には、天然には存在しない遺伝子、通常はＲＮＡに転写またはタンパク質に翻訳（「発現」）されないＤＮＡ配列、及び宿主に導入することが所望される他の遺伝子もしくはＤＮＡ配列が含まれるが、これらに限定されない。典型的には、本明細書に記載の組換え宿主のゲノムは、１つ以上の組換え遺伝子の安定的導入により増強されることが理解されよう。全般的に、導入されたＤＮＡは、ＤＮＡのレシピエントである宿主に元々は常在していないが、例えば、ある遺伝子の産物の生産を増大させるためまたは遺伝子の発現パターンを変化させるために、所与の宿主からのＤＮＡセグメントを単離し、その後そのＤＮＡの１つ以上の追加のコピーを同じ宿主に導入することが本開示の範囲内である。いくつかの事例では、導入されたＤＮＡは、例えば、相同組換えまたは部位特異的突然変異誘発によって、内在性遺伝子またはＤＮＡ配列を修飾またはさらには置き換える。好適な組換え宿主には、微生物が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「組換え遺伝子」または「組換えＤＮＡ配列」という用語は、宿主において野生型でない遺伝子またはＤＮＡ配列を指す。組換え遺伝子及び組換えＤＮＡ配列は、別の種からレシピエント宿主に導入され得るか、または組換え宿主を形成するための突然変異誘発及び／または組換え方法による遺伝子改変を通して宿主にすでに存在するＤＮＡ配列が増強、修飾または変異されたものとなるように、野生型遺伝子もしくはＤＮＡ配列から誘導され得る。組換え遺伝子または組換えＤＮＡ配列の例としては、宿主に導入された外来性遺伝子、遺伝子産物の変化した活性または機能性を呈するバリアントをもたらすように修飾または変異された内在性遺伝子、キメラ遺伝子（例えば、タンパク質のドメインスワッピングによって作り出される）、コドン最適化遺伝子、プロモーター、オペレーター、抑制因子またはターミネーターなどの様々な転写調節因子に関連付けられるまたはその制御下にある内在性または異種遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。宿主に導入される組換え遺伝子は、形質転換されつつある宿主に通常存在するＤＮＡ配列と同一であり得、組換え宿主が含む内在性遺伝子が野生型宿主細胞よりも高いコピー数で存在するように、ＤＮＡの１つ以上の追加のコピーを提供して、それによってそのＤＮＡの遺伝子産物の過剰発現または修飾された発現を可能にするために導入されることが理解されよう。いくつかの実施形態では、組換え遺伝子は、宿主細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列番号１～９）またはＥ．ｃｏｌｉ（配列番号１０～２２）における発現のために合成及び／またはコドン最適化される。
本明細書で使用されるとき、「改変された生合成経路」という用語は、本明細書に記載される、組換え宿主における少なくとも１つの組換え遺伝子または組換えＤＮＡ配列を含む生合成経路を指す。いくつかの態様では、生合成経路の１つ以上の工程は、修飾されていない（野生型）宿主においては天然に生じない。いくつかの実施形態では、遺伝子の異種バージョンが、その遺伝子の内在性バージョンを含む宿主に導入される。
本明細書で使用されるとき、「内在性」遺伝子という用語は、特定の生物、組織、または細胞に源を発し、その内部で生産または合成される遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、内在性遺伝子は酵母遺伝子である。いくつかの実施形態では、遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ２８８Ｃを含むがこれらに限定されないＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに内在性である。
いくつかの実施形態では、内在性酵母遺伝子は、組換え宿主において過剰発現される。本明細書で使用されるとき、「過剰発現」という用語は、ある生物における、野生型生物における遺伝子発現レベルよりも高いレベルでの遺伝子の発現を指すように使用される。例えば、Ｐｒｅｌｉｃｈ，２０１２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９０：８４１－５４を参照されたい。
いくつかの実施形態では、内在性酵母遺伝子、例えばＡＤＨは、欠失されるか、または転写的に下方調節される。例えば、Ｇｉａｅｖｅｒ＆Ｎｉｓｌｏｗ，２０１４，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９７（２）：４５１－６５を参照されたい。本明細書で使用されるとき、「欠失」、「欠失される」、「ノックアウト」、及び「ノックアウトされる」という用語は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含むがこれらに限定されないある生物においてもはや発現されないように操作された、内在性遺伝子を指すように交換可能に使用され得る。
本明細書で使用されるとき、「異種」遺伝子という用語は、組換え宿主以外の種に由来する遺伝子を説明する。いくつかの実施形態では、組換え宿主はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、異種遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の生物に由来する。例えば、遺伝子コード配列は、異種配列を発現する組換え宿主とは異なる原核微生物、真核微生物、植物、動物、昆虫、または真菌由来であり得る。いくつかの実施形態では、コード配列は、宿主に天然の配列である。
「選択可能マーカー」は、宿主細胞の栄養要求性を補足する、抗生物質耐性を提供する、または色変化をもたらす任意の数の遺伝子のうちの１つであり得る。次いで、遺伝子置換ベクターの線状化ＤＮＡ断片が、当業者に周知の方法を使用して細胞に導入される（下記参照）。線状断片のゲノムへの組込み及び遺伝子の破壊が、選択マーカーに基づいて決定され得、例えば、ＰＣＲまたはサザンブロット解析によって検証され得る。選択におけるその使用に続いて、選択可能マーカーは、例えば、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ系（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３６：１５３－１７３及びＵ．Ｓ．２００６／００１４２６４を参照されたい）によって、宿主細胞のゲノムから除去され得る。代替的に、遺伝子置換ベクターは、破壊対象の遺伝子のある部分を組み込むような方式で構築され得、ここにおいて、この部分は、いずれの内在性遺伝子プロモーター配列も欠けており何もコードしないか、または遺伝子のコード配列の不活性断片である。
本明細書で使用されるとき、「バリアント」及び「変異体」という用語は、特定のタンパク質の野生型配列と比較して、１つ以上のアミノ酸が修飾されたタンパク質配列を説明するように使用される。
本明細書で使用されるとき、「不活性断片」という用語は、遺伝子の完全長コード配列からもたらされるタンパク質の活性の、例えば、約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または０％）を有するタンパク質をコードする遺伝子の断片である。遺伝子のかかる部分は、既知のプロモーター配列が何ら遺伝子配列に作動可能に連結されないが、停止コドン及び転写終結配列が遺伝子配列のその部分に作動可能に連結されるような方式で、ベクターに挿入される。このベクターはその後、遺伝子配列のその部分において線状化され、細胞の中へ形質転換させ得る。単一の相同組換えを用いて、この線状化ベクターは次いで、遺伝子の内在性対応物に組み込まれてその不活性化をもたらす。
本明細書で使用されるとき、「メバロン酸経路」、「イソプレノイド経路」及び「ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ経路」という用語は、交換可能に使用され得、イソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）及び／またはジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）を合成する代謝経路を指す。ＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰは典型的に、イソプレノイドの生産の際に細胞によって利用される。メバロン酸経路のための主要な基質は、アセチル補酵素Ａ（アセチル－ＣｏＡ）であり、これは、例えば解糖による、炭素源（限定されないがグルコース、アセテート、エタノールなど）の分解、またはβ酸化を通した脂肪酸の分解の際に、細胞によって生み出される。ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰは、ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）に接触させられると、一緒にゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を産出する、５炭素中間体である。代替的に、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをネリル二リン酸シンターゼ（ＮＰＰＳ）に接触させて、ネリル二リン酸（ＮＰＰ）を産出することができる。
本明細書で使用されるとき、「ゲラニル二リン酸シンターゼ」（ＧＰＰＳ）という用語は、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰからのゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）の生産を触媒可能である酵素、ポリペプチドまたはその断片を指す。錯誤回避のために、ファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子もまた、天然にまたは突然変異の結果としてのいずれかで、ＧＰＰＳ活性を持つことができる。非限定的な例として、ＦＰＰＳの遺伝子ＥＲＧ２０及びｉｓｐＡは、ＧＰＰＳ活性を有する酵素を生産するように変異され得る。錯誤回避のために、本明細書で使用される「ゲラニル二リン酸シンターゼ」（ＧＰＰＳ）という用語は、故に、ＧＰＰＳ活性を持つポリペプチドまたは酵素をコードする、かかる変異したあるいは組換えＥＲＧ２０及びｉｓｐＡ遺伝子を包含する。
本明細書で使用されるとき、「接触」という用語は、２つの対象物間の任意の物理的相互作用を指すように使用される。例えば、「接触」という用語は、酵素と基質との間の相互作用を指し得る。別の例では、「接触」という用語は、液体（例えば、上清）と吸着性樹脂との間の相互作用を指し得る。
本明細書で使用されるとき、「イソペンテニルピロリン酸」、「ＩＰＰ」、「イソペンテニル二リン酸」及び「ＩＤＰ」という用語は、交換可能に使用され得る。ＩＰＰという用語は、メバロン酸経路の産物を指す。
本明細書で使用されるとき、「ジメチルアリルピロリン酸」、「ジメチルアリル二リン酸」、「ＤＭＡＰＰ」及び「ＤＭＡＤＰ」という用語は、交換可能に使用され得る。ＤＭＡＰＰという用語は、ＩＰＰの異性体を指す。ＤＭＡＰＰは、酵素イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼによってＩＰＰから異性化される。
本明細書で使用されるとき、「アルデヒドレダクターゼ」、「ＡＲ」及び「アルドースレダクターゼ」という用語は、交換可能に使用され得る。アルデヒドレダクターゼは、アルデヒド及びカルボニルの還元を触媒するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性オキシドレダクターゼを指す。
本明細書で使用されるとき、「シトロネラール／シトロネロール経路」という用語は、シトロネラール、シトロネロール、及び／またはシトロネル酸の発現のための生合成改変経路を指す。いくつかの態様では、シトロネラール／シトロネロール経路は、ＧＰＰまたはＮＰＰからゲラニオールへの反応を触媒するゲラニオールシンターゼ（ＧＥＳ）によって開始させることができる。
いくつかの態様では、ゲラニオールシンターゼが、ＧＰＰからゲラニオールへの変換を触媒し、いくつかの態様では、ゲラニオールシンターゼが、ＧＰＰからゲラニオールへの変換を触媒する。ゲラニオールは次いで、ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（ＧｅＤＨ）によって酸化されて、ゲラニアールを生産する。シトロネラール／シトロネロール経路の第３の工程は、エノエートレダクターゼ（ＥＮＲ）を介したゲラニアールからシトロネラールへの還元である（図１ａを参照されたい）。
代替的に、シトロネラール／シトロネロール経路は、ＮＰＰまたはＧＰＰからネロールへの変換を触媒するネロールシンターゼ（ＮＥＳ）によって開始させることができる。いくつかの態様では、ネロールシンターゼは、ＧＰＰからネロールへの変換を触媒し、いくつかの態様では、ネロールシンターゼは、ＧＰＰからネロールへの変換を触媒する。ネロールは次いで、ネラールデヒドロゲナーゼ（ＮｅＤＨ）によって酸化されて、ネラールを生産する。ネラールは次いで、エノエートレダクターゼ（ＥＮＲ）活性によってｌ－シトロネラールに変換される（図１ｂを参照されたい）。
本明細書で使用されるとき、「ゲラニオールデヒドロゲナーゼ」（ＧｅＤＨ）及び「ネロールデヒドロゲナーゼ」（ＮｅＤＨ）という用語は、ゲラニオールからゲラニアール、及びネロールからネラールをそれぞれ合成する能力を有する酵素、ポリペプチド及びその断片を指す。いくつかの実施形態では、同じポリペプチドが、一方または両方の活性を呈することができる。例えば、Ｒｓ＿ＧｅＤＨの遺伝子産物は、ＧｅＤＨ活性及びＮｅＤＨ活性の両方を呈するポリペプチドである。
本明細書で使用されるとき、「シトロネロール前駆体」、「シトロネロール前駆体」、「シトロネル酸前駆体」及び「シトロネラール／シトロネロール中間体」という用語は、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰなどのメバロン酸経路における中間体、ならびにＧＰＰ、ゲラニオール、ゲラニアール及び／またはシトロネラールなどのシトロネラール／シトロネロール経路における中間体を指す。
一実施形態では、ネラールからゲラニアールへの異性化は、ケト－エノール互変異性化を介して起こり得る。本明細書で使用されるとき、「ケト－エノール互変異性化」という用語は、ケト型からエノール型への変換を指す。
このプロセスの第４の工程は、宿主細胞におけるアルコールデヒドロゲナーゼ／アルデヒドレダクターゼ活性によってシトロネラールをシトロネロールに還元する。デヒドロゲナーゼは、Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｃｄ＿ＧｅＤＨ）、Ｔｈａｕｅｒａ ｔｅｒｐｅｎｉｃａ ５８Ｅｕゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｔｔ＿ＧｅＤＨ）、Ｓｐｉｎｇｏｐｙｘｉｓ ｍａｃｒｏｇｏｌｔａｂｉｄａゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｓｍ＿ＧｅＤＨ）、及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ａｃ＿ＧｅＤＨ）、または列挙されていない他のゲラニオールデヒドロゲナーゼから選択され得る。アルデヒドレダクターゼ（ＡＲ）活性は、内在性または外来性アルデヒドレダクターゼ酵素活性の結果であり得る。加えて、ネラールをネロールに、ゲラニアールをゲラニオールに、またはシトロネラールをシトロネロールに変換するアルデヒドレダクターゼは、同じであることも異なることもあり得る（図１ａ及び１ｂを参照されたい）。
代替的に、シトロネラール／シトロネロール経路は、それぞれＮＥＳまたはＧＥＳ活性によって、ＮＰＰまたはＧＰＰからネロールまたはゲラニオールへの変換を介してシトロネロールを生産し得る。この実施形態では、エノエートレダクターゼ（ＥＮＲ）またはイリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）活性が、ネロールまたはゲラニオールをそれぞれｌ－またはｄ－シトロネロールに変換する。ｄ－またはｌ－シトロネロールは次いで、シトロネラール／シトロネロールデヒドロゲナーゼ（ＣｉＤＨ）によって酸化されて、それぞれｄ－またはｌ－シトロネラールを産出する（図１ｃを参照されたい）。
本明細書で使用されるとき、「シンターゼ」という用語は、典型的に２つ以上の分子の連結を伴う合成プロセスを触媒する酵素を指す（例えば、アセチル－ＣｏＡがアセトアセチル－ＣｏＡと縮合して３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡを形成する反応は、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼによって触媒される。
本明細書で使用されるとき、「キナーゼ」という用語は、高エネルギーのリン酸供与分子から、メバロン酸キナーゼ（ＭＫ）及びホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）などの特定の基質へのリン酸基の移動を触媒する酵素を指す。
本明細書で使用されるとき、「鏡像異性体」、「鏡像異性体」、「光学異性体」、「立体異性体」または「光学異性体」という用語は、互いの鏡像であるキラル分子（単数または複数）を指す。これらの分子は互いに重ね合わせることができず、当業者には接頭語の使用により区別される。次のような等価の３つの主要な命名系が存在する：純粋な異性体が平面偏光を時計回りまたは反時計回りに回転させる能力に基づく、＋／－光学活性系（＋及び－）；ラテン語への直接翻訳に基づく（ｄｅｘｔｅｒが右、ｌａｅｖｕｓが左を表す）、ｄ／ｌ系、別名、右旋性系及び左旋性系。故に、「ｌ」は「－」と等価であり、「ｄ」は「＋」と等価である。これら２つの系は、本明細書で交換可能に使用される。錯誤回避のために、ラテン語に基づく関連するＲ／Ｓ系（ｒｅｃｔｕｓが適切（ｐｒｏｐｅｒ）、ｓｉｎｉｓｔｅｒが一直線（ｓｔｒａｉｇｈｔ）を表す）は、分子において１つよりも多くの立体中心が存在し得る場合における具体的な立体中心の絶対配置を特徴付けるために使用されるが、それはまた、分子が単一の立体中心を含む場合、分子全体を特徴付けるためにも使用され得る。本明細書で使用されるとき、「ｄ－鏡像異性体」という用語は、極性の高い方の基がフィッシャー投影式の右側に位置付けられる、キラル炭素を有する分子を指す（Ｄ－鏡像異性体（ｅｎａｔｉｏｍｅｒｓ）は平面偏光を時計回り（＋）に回転させる）。本明細書で使用されるとき、「ｌ－鏡像異性体」という用語は、極性の高い方の基がフィッシャー投影式の左側に位置付けられる、キラル炭素を有する分子を指す（Ｌ－鏡像異性体（ｅｎａｔｉｏｍｅｒｓ）は平面偏光を反時計回り（－）に回転させる）。
本明細書で使用されるとき、「光学純度」及び「鏡像異性体過剰率」という用語は、交換可能に使用され得る。光学純度は、キラル物質に使用される純度の尺度を指す。例えば、光学純度が１００％である場合、一方の鏡像異性体（ｄ－またはｌ－のいずれか）のみが生産されたことになる。加えて、経路が９０％のｄ－シトロネラール及び１０％のｌ－シトロネラールを生産する場合、ｄ－シトロネラールの光学純度は、９０％－１０％＝鏡像異性体過剰率（ｅｅ）８０％である。
本明細書で使用されるとき、「イソメラーゼ」という用語は、分子を一方の異性体から別の異性体へと変換する酵素を指す。イソメラーゼは、結合が切断及び形成される分子内転位を促進し得るか、またはそれらは、立体構造変化を触媒し得、これにはイソペンテニル二リン酸イソメラーゼなどがある。
本明細書で使用されるとき、「レダクターゼ」という用語は、還元剤として作用する酵素を指す。レダクターゼには、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ及びエノエートレダクターゼ（ＥＮＲ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用されるとき、「エノエートレダクターゼ」及び「エン（ｅｎｅ）レダクターゼ」という用語は、交換可能に使用され、酵母の旧黄色酵素（ＯＹＥ）クラスのフラボタンパク質も含む。錯誤回避のために、イリドイドシンターゼ（限定されないが、Ｏｅ＿ＩＳＹ及びＣｒ＿ＩＳＹなど）は、エノエートレダクターゼ活性を持つことができ、故に、かかる酵素は、本明細書で使用される「エノエートレダクターゼ」という用語に包含される。
本明細書で使用されるとき、「誘導体」という用語は、何らかの化学的または物理的プロセスによって同様の化合物から誘導された分子または化合物を指す。
本明細書で使用されるとき、「ネロール」という用語は、甘く爽やかなバラの臭気を有するモノテルペンを指す。モノテルペンは、元々はネロリ油から単離されるが、レモングラス及びホップの精油にも存在する。ネロールは、ゲラニオールのシス－トランス異性体である。
本明細書で使用されるとき、「シトロネロール」または「ジヒドロゲラニオール」という用語は、ゲラニオール（トランス）の水素化によって生産され得る、天然の非環式モノテルペノイドを指す。
本明細書で使用されるとき、「ネラール」及び「ゲラニアール」という用語は、シトラールの構成成分である液体アルデヒドを指す。シトラールは、レモンマートル、Ｌｉｔｓｅａ ｃｉｔｒａｔａ、Ｌｉｔｓｅａ ｃｕｂｅｂａ、レモングラス、レモンティーツリーなどの植物からの天然由来の精油である。シトラール、別名３，７－ジメチル－２，６－ジエナールまたはレモナールは、それぞれの異性体テルペノイドのブレンドであり、このうち、Ｅ－異性体（シトラールＡ）が強力な柑橘類レモン臭を提供するゲラニアールであり、Ｚ－異性体（シトラールＢ）がより甘いがやや弱いレモン臭を提供するネラールである。シトラールは、抗菌剤、香気剤、香料成分、香味剤として、レモンの増強のため、及びビタミンＡの合成において商業的に使用される。
本明細書で使用されるとき、「ゲラニオール」という用語は、バラ油、ゼラニウム（ｇｅｒｍａｎｉｏｕｍ）油、パルマローザ油、レモン油及びシトロネラ油に天然に存在する、バラ様の香りを有するモノテルペノイド（ｍｏｎｏｔｅｒｐｏｅｎｏｉｄ）アルコールを指す。ゲラニオールは、芳香剤において商業的に使用される香気成分であり、典型的にモモ、ラズベリー、グレープフルーツ、赤リンゴ、プラム、ライム、オレンジ、レモン、スイカ、パイナップル、及びブルーベリーなどの風味を有する。
本明細書で使用されるとき、「シトロネラール」、「ロジナール」または「３，７－ジメチルオクタ－６－エン－１－アール」という用語は、モノテルペノイドを指す。モノテルペノイドは、シトロネラ油の主成分であり、その特有のレモンの香りを提供する。シトロネラールは、ｌまたはｄ鏡像異性体として存在し得る。
本明細書で使用されるとき、「デヒドロゲナーゼ」という用語は、１つ以上の水素分子を基質から除去して電子受容体に与える還元反応によって基質を酸化する酵素を指し、これにはゲラニオールデヒドロゲナーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼなどがある。
本明細書で使用されるとき、「メバロン酸プラスミド」及び「ｐＭｅｖ」という用語は、交換可能に使用され得る。メバロン酸プラスミドという用語は、Ｅ．ｃｏｌｉの中へ形質転換させるプラスミドを指し、これによりアセチル－ＣｏＡ及び／またはマロニル－ＣｏＡからのＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの生産がもたらされ得る。メバロン酸プラスミドに含まれる遺伝子は、内在性または外来性であり得る。最初の３つの遺伝子：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（Ｅｃ＿ａｔｏＢ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ（Ｓａ＿ｍｖａＳ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（Ｓａ＿ｍｖａＡ）は、１つのプロモーターの制御下にあり、最後の４つの遺伝子：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ メバロン酸キナーゼ（Ｓｃ＿ｅｒｇ１２）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅホスホメバロン酸キナーゼ（Ｓｃ＿ｅｒｇ８）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅジホスホメバロン酸（Ｄｉｐｈｏｓｐｏｍｅｖａｌｏｎａｔｅ）デカルボキシラーゼ（Ｓｃ＿ｅｒｇ１９）、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（Ｅｃ＿ｉｄｉ）は、もう１つのプロモーターの制御下にある。各オペロンは、転写ターミネーターによって終結する。これら７つの遺伝子は、ｐ１５ベースの複製プラスミド骨格及びカナマイシン選択マーカー上に位置付けられる。Ｅｃ＿ＩＤＩを除く全ての遺伝子が異種であり、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧＥＮＥＡＲＴ（商標）ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉコドン最適化バリアントとして合成されたものである。Ｅｃ＿ａｔｏＢは、Ｅ．ｃｏｌｉ野生型宿主の内在性遺伝子をＥ．ｃｏｌｉのためにコドン最適化することによって生産された組換え遺伝子であった（野生型遺伝子は、それがＥ．ｃｏｌｉにおける発現に好ましいコドンを広く使用していなかったため修飾された）。
本明細書で使用されるとき、「シトロネラールプラスミド」、「ｐＣｉｔｒｏプラスミド」及び「ｐＣｉｔｒｏ」という用語は、交換可能に使用され得る。シトロネラールプラスミドという用語は、宿主細胞の中への形質転換に続いて、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰからのシトロネラールの生産をもたらし得るプラスミドを指す。シトロネラールプラスミドにおける遺伝子は、内在性または外来性であり得る。本明細書に開示される非限定的な一例では、異種遺伝子Ａｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｋｌ＿ＫＹＥ１（代替的にはＰｓ＿ＯＹＥ２．６）及びＣｄ＿ＧｅＤＨ（代替的にはＲｓ＿ＧｅＤＨ）によってコードされる４つの酵素：ゲラニル二リン酸シンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、エンレダクターゼ及びゲラニオールデヒドロゲナーゼを２つのオペロン上に細分した。最初の３つの遺伝子は、あるプロモーターの制御下にあり、ある転写ターミネーターによって終結する。最後の遺伝子は、別のプロモーター及びターミネーターの制御下にある。これら４つの遺伝子は、ｐＢＲ３２２ベースの複製プラスミド骨格及びアンピシリン選択マーカー上に位置付けられるが、任意の好適なプラスミド（好ましくは高コピー数プラスミド）及び選択マーカーを使用することができる。全ての遺伝子は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧＥＮＥＡＲＴ（商標）ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成されたものである。この事例における宿主細胞の種はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉであるように選定したため、この例における遺伝子は、コドン最適化バリアントであった（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのためにコドン最適化したＲｓ＿ＧｅＤＨを除く）。
本明細書で使用されるとき、「オペロン（単数）」及び「オペロン（複数）」ならびに「協調的遺伝子調節エレメント」という用語は、機能的に等価であり、交換可能に使用され、単一のプロモーターの制御下にある１つよりも多くの遺伝子を含有するＤＮＡの機能単位を含む遺伝子調節系を指す。協調的遺伝子調節の手段として高度に普及しているものの、オペロンは遍在していない。例えば、酵母において（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）協調的遺伝子調節は、共通のプロモーター要素を使用してそれぞれ反対のＤＮＡ鎖遺伝子を連結することによって、または１つよりも多くの機能的ドメインを単一のペプチドへと鎖状につないで、キメラタンパク質を提供することによって、頻繁に達成される。単一のプロモーターを使用して１つよりも多くの機能的活性を制御する上記の系の全てが、様々な種の野生型宿主細胞において観察され、組換えＤＮＡ技術を使用した協調的発現下での多酵素経路の改変について着想を与えてきた。
本明細書で使用されるとき、「プラスミド（単数）」または「プラスミド（複数）」という用語は、細胞の染色体ＤＮＡとは明確に異なる、小さな環状の２本鎖ＤＮＡ分子を指す。プラスミドは広範な長さを有し、いくつかの遺伝的利点を提示する。プラスミドは、「ベクター」の１つの形態であり、外部からの（外来性）ＤＮＡを宿主細胞内に導入し、維持するのに特に有用である。特定の用途のためのプラスミドの選定は典型的に、１つの宿主細胞あたり選定したコピー数のプラスミドで１つ以上の宿主細胞種の中に維持される能力によって決定付けられる。
本明細書で使用されるとき、「アセチルトランスフェラーゼ」及び「トランスアセチラーゼ」という用語は、交換可能に使用され得る。「アセチルトランスフェラーゼ」（アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼなど）は、アセチル基をアセチル－ＣｏＡからレシピエント化合物に移動させる、ある種のトランスフェラーゼを指し、例えば、リジンアミノ酸などがある。
かかる酵素の具体的な実施形態についての代表的なＵｎｉＰｒｏｔ番号には、以下が含まれる：Ｈ１ＺＶ３８（配列番号１）、ＡＯＡＯＥ４Ｂ３Ｎ６（配列番号２）、Ａ０Ａ０Ｐ０ＤＱＧ４（配列番号３）、Ｑ５９０９６（配列番号４）、Ｃ９Ｅ０Ｇ２（配列番号５）、Ｄ５ＭＰＦ３（配列番号６）、Ｐ４０９５２（配列番号７）、Ａ３ＬＴ８２（配列番号８）、Ｑ９ＦＥＷ９（配列番号６７）、Ｑ０３５５８（配列番号３３）、Ｇ１ＦＣＧ０（配列番号３４）、Ｑ８８ＮＦ７（配列番号３７）、Ｑ５ＮＬＡ１（配列番号９）、Ｑ６Ｉ７Ｂ７（配列番号４４）、Ｇ６ＸＬ４３（配列番号４５）、Ａ０Ａ０Ｄ６ＭＰＹ３（配列番号４６）、Ｆ８ＥＵＡ７（配列番号４７）、Ｂ７Ｌ５Ｋ３（配列番号４８、Ｑ１ＷＦ６８（配列番号４９）、Ｑ１ＷＦ６３（配列番号５０）、Ｊ１ＩＰ１９（配列番号５１）、Ｕ１Ｈ７Ｓ９（配列番号５２）、Ｃ１Ｋ５Ｍ２（配列番号５３）、Ａ０Ａ０Ｕ３Ｊ２９４（配列番号５４）、Ｋ７ＷＤＬ７（配列番号５５）、Ｒ４ＨＥＫ６（配列番号５６）、Ｔ２ＤＰ９０（配列番号５７）、Ｊ７ＪＹＵ１（配列番号５８）、Ｐ７６４６１（配列番号１０）、Ｑ９ＦＤ８７（配列番号１１）、Ｑ９ＦＤ８６（配列番号１２）、Ｐ０７２７７（配列番号１３）、Ｐ２４５２１（配列番号１４）、Ｐ３２３７７（配列番号１５）、Ｑ４６８２２（配列番号１６）、Ｐ４０９５２（配列番号７）、Ａ３ＬＴ８２（配列番号２２）、Ａ０Ａ０Ｍ２Ｈ８Ａ０（配列番号３０）、Ｐ２７２５０（配列番号３１）、Ｐ７５６９１（配列番号３２）、Ｂ２ＮＩ９４（配列番号２４）、Ｄ２ＷＫＤ９（配列番号２５）、Ｑ２ＫＮＬ５（配列番号２６）、Ａ０Ａ０Ｅ４Ｂ３Ｎ６（配列番号２７）、Ｃ９Ｅ０Ｇ２（配列番号２８）、Ａ０Ａ０Ｘ８Ｒ１Ｍ５（配列番号２９）、Ｊ９ＰＺＲ５（配列番号１８）、Ｑ６ＵＳＫ１（配列番号６３）、Ｅ９ＪＧＴ２（配列番号６４）、Ｃ０ＫＷＶ４（配列番号６５）、Ｖ９ＺＡＤ７（配列番号６６）、Ｑ０４８９４（配列番号６８）。
一実施形態では、本発明は、シトロネラール、シトロネロール、シトロネル酸、またはシトロネラール前駆体のうちの１つ以上の生体内及び生体外生産を企図する。さらなる実施形態では、本発明は、シトロネラール、シトロネロール、シトロネル酸、またはシトロネラール前駆体のうちの１つ以上の生産のための、生体内及び生体外工程の組み合わせを企図する。特定の一実施形態では、本発明は、シトロネラール、シトロネロール、シトロネル酸、またはシトロネラール前駆体のうちの１つ以上を生産可能な、改変された生合成経路を含有する組換え宿主を提供し、該改変された生合成経路は、１つ以上の発現された機能的異種酵素を含む。
例えば、いくつかの態様では、本発明は、生体内でシトロネロール前駆体を生産可能な組換え微生物（酵母または細菌など）細胞を提供する。特に、本明細書で提供される組換え酵母または細菌細胞は、ゲラニオールをゲラニアールに、及びシトロネラールをシトロネロールに変換可能な１つ以上のデヒドロゲナーゼ及び／または他のタンパク質を発現することができる。デヒドロゲナーゼの源には、これらの酵素を天然に発現するＲｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ及びＢａｃｉｌｌｕｓのいくつかの種を含む細菌が含まれるが、これらに限定されない。他の特定の実施形態では、本明細書で使用されるデヒドロゲナーゼは、酵母、真菌、植物、及び／または動物に由来し得る。
別の実施形態では、本発明は、ゲラニアールをシトロネラールに変換可能な１つ以上のレダクターゼ及び／または他のタンパク質を発現することができる、組換え微生物（酵母または細菌など）細胞を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ネラールをシトロネラールに変換可能な１つ以上のレダクターゼ及び／または他のタンパク質を発現することができる、組換え微生物（酵母または細菌など）細胞を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをＧＰＰに、またはＧＰＰをゲラニオールに変換可能な１つ以上のシンターゼ及び／または他のタンパク質を発現することができる、組換え微生物（酵母または細菌など）細胞を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをＮＰＰに、またはＮＰＰをネロールに変換可能な１つ以上のシンターゼ及び／または他のタンパク質を発現することができる、組換え微生物（酵母または細菌など）細胞を提供する。
別の実施形態では、シトロネロール前駆体を生産可能な組換え微生物（酵母または細菌など）細胞は、天然ファルネシルピロリン酸シンターゼプロモーターをより弱いプロモーターで置き換えて、天然ファルネシルピロリン酸シンターゼの転写の下方調節をもたらすことを介してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰレベルを増加させることによって、シトロネロール前駆体生産を増加させるようにさらに修飾され得る。非限定的な例として、酵母ＥＲＧ２０遺伝子は、ＧＰＰ及びＩＰＰからのファルネシル二リン酸の形成を触媒するように作用する酵母ファルネシルピロリン酸シンターゼをコードするため、ＥＲＧ２０プロモーターをＫＥＸ２プロモーターで置き換えて、ＥＲＧ２０の転写の下方調節をもたらすことによって、酵母におけるＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを増加させることが可能である。
別の実施形態では、亢進したＩＰＰ及びＤＭＡＰＰレベルを有する組換え微生物（酵母または細菌など）細胞は、シトロネラール及び／またはシトロネロールを産出することが必要な遺伝子に対する経路発現カセットの導入及び／または組込みによく適している。例えば、Ａｇ＿ＧＰＰＳ２は、ＴＥＦ１プロモーターの制御下にあり得、Ｃｒ＿ＧＥＳは、ＰＧＫ１プロモーターの制御下にあり得、Ｒｓ＿ＧｅＤＨは、ＰＧＫ１プロモーターの制御下にあり得、Ｋｌ＿ＫＹＥ１は、ＴＰＩ１プロモーターの制御下にあり得る。いくつかの態様では、発現カセットは、宿主ゲノムの領域に相同の隣接領域を含有し得、このため、相同組換えによる宿主細胞ゲノム（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）への標的化された組み込みが可能となる（例えば、ＷＯ２０１４／０２７１１８を参照されたく、同文献は参照によりその全体が援用される）。
別の実施形態では、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰレベルの亢進は、Ｅ．ｃｏｌｉに対して最適化された１つ以上のメバロン酸経路遺伝子を有する、メバロン酸経路に必要とされる遺伝子をまとめて含む１つ以上のオペロンを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞において達成することができる。ある特定の実施形態では、メバロン酸経路を含む７つの遺伝子は、１つ以上のプラスミド上に存在し得る及び／または宿主のゲノムＤＮＡに組み込まれ得る。例えば、一実施形態では、メバロン酸経路は、Ｅ．ｃｏｌｉに導入され、維持され得、次のような単一のプラスミド上の２つのオペロンに細分される：Ｅｃ＿ａｔｏＢ、Ｓａ＿ｍｖａＳ、及びＳａ＿ｍｖａＡが１つのプロモーターによって駆動され得、Ｓｃ＿ｅｒｇ１２、Ｓｃ＿ｅｒｇ８、Ｓｃ＿ｅｒｇ１９及びＥｃ＿ｉｄｉがもう１つのプロモーターによって駆動され得る。この事例では、Ｅｃ＿ａｔｏＢを除く全てのメバロン酸経路遺伝子が、Ｅ．ｃｏｌｉに対して最適化された異種遺伝子である。特定の宿主種における異種発現のための遺伝子の最適化には典型的に、好ましいコドン使用頻度パターンの理解を利用する。
別の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるシトロネラール、シトロネロール及び／またはシトロネル酸の組換えタンパク質発現は、Ｅ．ｃｏｌｉ最適化遺伝子を含むシトロネラールプラスミドを介して生じ得る。例えば、Ａｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｋｌ－ＫＹＥ１及びＣｄ＿ＧｅＤＨの転写は、１つ以上のプロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターである。構成的プロモーターは、その制御下にあるコード配列または遺伝子の継続的転写を可能にする、転写因子によって調節されないプロモーターを指す。構成的プロモーターの例としては、それらのオペレーターＰＧａｐＡ、ＰＧａｄＥを伴わないＰＴ７、ＰＴｒｃ、ＰＴａｃ及びＰＬａｃが挙げられるが、これらに限定されない）。他の実施形態では、プロモーターは、調節下にある遺伝子の化学的または物理的転写調節を可能にする誘導性プロモーターである。正に調節される誘導性プロモーターは、生物要因または非生物要因の存在下でその制御下にあるコード配列または遺伝子の転写亢進を可能にするプロモーターを指す。さらなる実施形態では、より高い転写率への遺伝子の誘導は、転写抑制因子分子を不活性化する因子の付加によって誘導され得る。なおもさらなる実施形態では、活性化因子及び抑制因子が、多調節（ｍｕｌｔｉ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）誘導性プロモーターにおいて機能し得る。誘導性プロモーターの例としては、ａｌｃＡが挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるシトロネラール、シトロネロール及び／またはシトロネル酸の組換えタンパク質発現は、１つ以上のＥ．ｃｏｌｉ最適化遺伝子を含むシトロネラールプラスミドを介して生じ得る。Ａｇ＿ｔＧＰＰｓ、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｐｓ＿ＯＹＥ２．６及びＲｓ＿ＧｅＤＨの転写は、ｔｒｃ－プロモーターなどの１つ以上のプロモーターによって駆動され得る。一例では、Ａｇ＿ｔＧＰＰｓ、Ｃｒ＿ＧＥＳ及びＰｓ＿ＯＹＥ２．６遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉに対して最適化される。
例えば、本発明は、生体内でシトロネラール、シトロネロールまたはシトロネル酸のうちの１つ以上を生産可能な組換え微生物（酵母または細菌など）細胞を提供する。特に、本明細書で提供される組換え酵母または細菌細胞は、ゲラニオールをシトロネラール、シトロネロール及び／またはシトロネル酸に変換可能な、１つ以上のデヒドロゲナーゼ、レダクターゼ及び／または他のタンパク質を発現することができる。
別の実施形態では、本明細書に開示される組換え微生物（酵母または細菌など）細胞は、ゲラニオールからゲラニアール、及び／またはシトロネラールからシトロネロールの形成を触媒可能な、１つ以上のゲラニオールデヒドロゲナーゼを発現することができる。
さらなる実施形態では、本明細書に開示される組換え微生物（酵母または細菌など）細胞は、ゲラニアールをシトロネラールに還元可能な、１つ以上のエンレダクターゼを発現することができる。
本明細書で使用されるとき、「検出可能量」、「検出可能濃度」、「測定可能量」、及び「測定可能濃度」という用語は、測定対象の具体的な産物（例えば、ゲラニオール、ゲラニアール、シトロネラール、シトロネロール、シトロネル酸、あるいはシトロネラール／シトロネロール中間体及び／またはシトロネラール／シトロネロール前駆体）のレベルを指す。産物は、ＡＵＣ、μＭ／ＯＤ６００、ｍｇ／Ｌ、μＭ、またはｍＭで測定され得る。ゲラニオール、ゲラニアール、シトロネラール、シトロネロール、シトロネル酸、シトロネラール／シトロネロール中間体及び／またはシトロネラール／シトロネロール前駆体生産（すなわち、総計、上清、有機相、及び／または細胞内ゲラニオール、ゲラニアール、及び／またはシトロネラールレベル）は、当業者に一般に利用可能な技術、例えば、限定されないが、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、紫外可視分光法／分光測光法（ＵＶ－Ｖｉｓ）、質量分析法（ＭＳ）、及びＮＭＲによって、検出及び／または分析され得る。
本明細書で使用されるとき、「検出不能濃度」という用語は、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＵＶ－Ｖｉｓ、ＭＳ、またはＮＭＲなどの技術によって測定及び／または分析するには低すぎる化合物のレベルを指す。いくつかの実施形態では、「検出不能濃度」（＜１ｐｐｍ）の化合物は不在である。
本明細書で使用されるとき、「または」及び「及び／または」という用語は、組み合わせたまたは互いに排他的な複数の成分を説明するように利用される。例えば、「ｘ、ｙ、及び／またはｚ」は、「ｘ」単独、「ｙ」単独、「ｚ」単独、「ｘ、ｙ、及びｚ」、「（ｘ及びｙ）またはｚ」、「ｘまたは（ｙ及びｚ）」、または「ｘまたはｙまたはｚ」を指し得る。いくつかの実施形態では、「及び／または」は、組換え細胞が含む外来性核酸を指すように使用され、ここにおいて組換え細胞は、ある群から選択される１つ以上の外来性核酸を含む。ある特定の実施形態では、「及び／または」は、ゲラニオール、ゲラニアール、シトロネラール及び／またはシトロネロールの生産を指すように使用され、ここにおいて１つ以上のゲラニオール、ゲラニアール、シトロネラール及び／またはシトロネロールが生産される。なおも別の実施形態では、「及び／または」は、ゲラニオール、ゲラニアール、シトロネラール、シトロネロール及び／またはシトロネル酸の生産を指すように使用され、ここにおいて１つ以上のゲラニオール、ゲラニアール、シトロネラール、シトロネロール及び／またはシトロネル酸が、次の工程：組換え微生物を培養する工程、組換え微生物において１つ以上のゲラニオール、ゲラニアール、シトロネラール、シトロネロール及び／またはシトロネル酸を生産させる工程、及び／または１つ以上のゲラニオール、ゲラニアール、シトロネラールシトロネロール及び／またはシトロネル酸を単離する工程のうちの１つ以上を通して生産される。
機能的ホモログ
本明細書に記載のポリペプチドの機能的ホモログもまた、組換え宿主においてシトロネロール、シトロネラール、シトロネル酸及び／またはその前駆体を産生させる際の使用に好適である。
機能的ホモログは、参照ポリペプチドに対して配列類似性を有し、参照ポリペプチドの生化学的または生理的機能（複数可）のうちの１つ以上を実行するポリペプチドを指す。機能的ホモログ及び参照ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドであり得、配列類似性は、収斂進化または分岐進化事象に起因し得る。したがって、機能的ホモログは、文献においてホモログ、またはオルソログ、またはパラログと表記されることがある。天然に存在する機能的ホモログのバリアント、例えば、野生型コード配列の変異体によってコードされるポリペプチドが、それ自体機能的ホモログであり得る。機能的ホモログはまた、ポリペプチドのコード配列の部位特異的突然変異誘発を介して、または天然に存在する様々なポリペプチドのコード配列からのドメインを組み合わせること（「ドメインスワッピング」）によって、作り出すことができる。本明細書に記載の機能的ポリペプチドをコードする遺伝子を修飾するための技術が知られており、これにはとりわけ、指向性進化技術、部位特異的突然変異誘発技術及びランダム突然変異誘発技術が含まれる。これらの技術は、ポリペプチドの比活性を増加させる、基質特異性を変化させる、発現レベルを変化させる、細胞内位置を変化させる、またはポリペプチド－ポリペプチド相互作用を所望の様態で修飾するために有用であり得る。かかる修飾ポリペプチドは、機能的ホモログとみなされる。「機能的ホモログ」という用語は、機能的に相同のポリペプチドをコードする核酸に適用されることがある。
機能的ホモログは、ヌクレオチド及びポリペプチド配列アライメントの解析によって同定され得る。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベースのクエリを行って、シトロネロール及びシトロネロール前駆体生合成ポリペプチドのホモログを同定することができる。配列解析は、ホモログのデータベース検索のために本明細書に開示される任意の配列を参照配列として使用した、非冗長データベースのＢＬＡＳＴ、双方向ＢＬＡＳＴ、またはＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ解析を伴い得る。アミノ酸配列は、いくつかの事例では、ヌクレオチド配列から推定され得る。データベースにおいて４０％を超える配列同一性を有するポリペプチドが、シトロネロール及びシトロネロール前駆体生合成ポリペプチドとしての好適性を決定するためのさらなる評価の候補となる。アミノ酸配列類似性は、１つの疎水性残基を別の疎水性残基と置換する、または１つの極性残基を別の極性残基と置換するなどの、保存的アミノ酸置換を可能にする。所望であれば、さらなる評価対象の候補の数を絞り込むために、かかる候補の手動検査が実行され得る。手動検査は、シトロネロール及びシトロネロール前駆体生合成ポリペプチドに存在するドメイン、例えば、保存された機能的ドメインを有すると思われる候補を選択することによって行うことができる。いくつかの実施形態では、核酸及びポリペプチドは、ＢＬＡＳＴ解析を使用するのではなく、トランスクリプトームデータから発現レベルに基づいて同定される。
保存された領域は、シトロネロール及びシトロネロール前駆体生合成ポリペプチドの一次アミノ酸配列内で、反復配列である、何らかの二次構造（例えば、ヘリックス及びベータシート）を形成する、正荷電もしくは負荷電ドメインを確立する、またはタンパク質モチーフもしくはドメインを表す領域の位置を特定することによって、同定され得る。例えば、ワールド・ワイド・ウェブ上のｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ／及びｐｆａｍ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／にて、多様なタンパク質モチーフ及びドメインについてのコンセンサス配列を記載するＰｆａｍウェブサイトを参照されたい。Ｐｆａｍデータベースで含まれる情報については、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２６：３２０－３２２（１９９８）、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２８：４０５－４２０（１９９７）、及びＢａｔｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２７：２６０－２６２（１９９９）に記載される。保存された領域はまた、密接に関連する種由来の同じまたは関連するポリペプチドの配列をアライメントすることによっても決定することができる。密接に関連する種は、同じ科由来であることが好ましい。いくつかの実施形態では、かかるホモログを同定するために、２つの異なる種由来の配列のアライメントで十分である。
典型的には、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を呈するポリペプチドが、保存された領域を同定するのに有用である。関連するポリペプチドの保存された領域は、少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）を呈する。いくつかの実施形態では、保存された領域は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を呈する。
例えば、組換え宿主においてシトロネロール及び／またはシトロネロール前駆体を生産させるために好適なポリペプチドには、Ａｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｋｌ＿ＫＹＥ１、Ｃｄ＿ＧｅＤＨ、Ｔｔ＿ＧｅＤＨ、Ｒｓ＿ＧｅＤＨ、Ｓｍ＿ＧｅＤＨ、Ａｃ＿ＧｅＤＨ、Ｐｐ＿ＧｅＤＨ、Ｐｓ＿ＯＹＥ２．６、Ｚｍ＿ＯＹＥ、Ｅｃ＿ａｔｏＢ、Ｓａ＿ｍｖａＳ、Ｓａ＿ｍｖａＡ、Ｓｃ＿ｅｒｇ１２、Ｓｃ＿ｅｒｇ８、Ｓｃ＿ｅｒｇ１９、Ｌｃ＿ＭＶＡ、Ｅｆ＿ＭＶＡ、Ｓｐ＿ＩＤＩ、ＳｃＩＤＩ及びＥｃ＿ｉｄｉの機能的ホモログが含まれる。
基質特異性の修飾方法が当業者に知られており、これには、限定なしに、部位特異的／合理的突然変異誘発手法、ランダム指向性進化手法及び組み合わせが含まれ、このうちランダム突然変異誘発／飽和技術は、酵素の活性部位の近くで行われる。例えば、Ｌａｂｒｏｕ ＮＥ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．１１（１）：９１－１００を参照されたい。
候補配列は典型的に、参照配列の長さの８０％～２００％、例えば、参照配列の長さの８２、８５、８７、８９、９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００％である長さを有する。機能的ホモログポリペプチドは典型的に、参照配列の長さの９５％～１０５％、例えば、参照配列の長さの９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、もしくは１２０％、またはそれらの間の任意の範囲である長さを有する。任意の候補核酸またはポリペプチドについての参照核酸またはポリペプチドに対する同一性パーセント（％）は、次のように決定することができる。参照配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列またはアミノ酸配列）が、コンピュータプログラム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ（第１．８３版、デフォルトパラメータ）、またはＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム）を使用して１つ以上の候補配列にアライメントされる。こうしたコンピュータプログラムは、核酸またはポリペプチド配列の全長にわたってそれらのアライメントが実行されることを可能にする（大域アライメント）。Ｃｈｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１３）：３４９７－５００。
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａが参照と１つ以上の候補配列との間の最良の一致度を算出し、それらをアライメントすることにより、同一性、類似性及び差異が決定され得る。１つ以上の残基のギャップを参照配列、候補配列、または両方に挿入して、配列アライメントが最大化され得る。核酸配列の迅速な対アライメントのためには、次のデフォルトパラメータが使用される：ワードサイズ：２；ウィンドウサイズ：４；スコアリング方法：百分率；上位対角線の数（ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔｏｐ ｄｉａｇｏｎａｌｓ）：４；及びギャップペナルティ：５。核酸配列の多重アライメントには、次のパラメータが使用される：ギャップ開始（ｏｐｅｎｉｎｇ）ペナルティ：１０．０；ギャップ伸長ペナルティ：５．０；及びウェイトトランジション（ｗｅｉｇｈｔ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ）：有り。タンパク質配列の迅速な対アライメントのためには、次のパラメータが使用される：ワードサイズ：１；ウィンドウサイズ：５；スコアリング方法：百分率；上位対角線の数：５；ギャップペナルティ：３。タンパク質配列の多重アライメントには、次のパラメータが使用される：ウェイトマトリックス：ｂｌｏｓｕｍ；ギャップ開始ペナルティ：１０．０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５；親水性ギャップ：オン；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ；残基特異的ギャップペナルティ：オン。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ出力は、配列間の関係を反映する配列アライメントである。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａは、例えば、ワールド・ワイド・ウェブ上のｔｈｅ Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓｅａｒｃｈ Ｌａｕｎｃｈｅｒサイト（ｓｅａｒｃｈｌａｕｎｃｈｅｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｍｕｌｔｉ－ａｌｉｇｎ／ｍｕｌｔｉ－ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌ）で、及びワールド・ワイド・ウェブ上のｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅサイト、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／で、実行することができる。
候補核酸またはアミノ酸配列の参照配列に対する同一性パーセントを決定するには、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して配列をアライメントし、アライメントにおける同一一致の数を参照配列の長さで割り、結果に１００を掛ける。同一性％の値は小数第１位に丸められ得ることに留意されたい。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、及び７８．１４は７８．１に丸められ、一方で７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、及び７８．１９は７８．２に丸められる。
候補アミノ酸配列の参照配列に対する同一性パーセントを決定するには、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用して配列をアライメントし、アライメントにおける同一一致の数を参照配列の長さで割り、結果に１００を掛ける。同一性％の値は小数第１位に丸められ得ることに留意されたい。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、及び７８．１４は７８．１に丸められ、一方で７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、及び７８．１９は７８．２に丸められる。
ゲラニオールデヒドロゲナーゼ、ゲラニオールデヒドロゲナーゼ様タンパク質、エノエート（エン）レダクターゼ、エンレダクターゼ様タンパク質、アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ及びアセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ様タンパク質、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ及びＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ様タンパク質、メバロン酸キナーゼ及びメバロン酸キナーゼ様タンパク質、ホスホメバロン酸キナーゼ及びリン光体（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）メバロン酸キナーゼ様タンパク質、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ様タンパク質、ゲラニル二リン酸シンターゼ及びゲラニル二リン酸シンターゼ様タンパク質、ゲラニオールシンターゼ及びゲラニオールシンターゼ様タンパク質は、酵素によって実行される酵素活性に関与しない追加のアミノ酸を含み得ることが理解されよう。
機能的デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、シンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、キナーゼ、デカルボキシラーゼ及びイソメラーゼタンパク質は、酵素によって実行される酵素活性に関与しない追加のアミノ酸を含み得ることが理解されよう。「キメラ」、「融合ポリペプチド」、「融合タンパク質」、「融合酵素」、「融合構築物」、「キメラタンパク質」、「キメラポリペプチド」、「キメラ構築物」、及び「キメラ酵素」という用語は、異なるタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子を接合することにより改変されたタンパク質を指すように、本明細書で交換可能に使用され得る。
いくつかの実施形態では、ゲラニオールデヒドロゲナーゼ、エンレダクターゼ、ゲラニアール二リン酸シンターゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、アセチル－ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼまたはイソペンテニル二リン酸イソメラーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、コードされたポリペプチドのその後の操作（例えば、精製または検出を促進するため）、溶解性、分泌、または局在化を促進するために設計された「タグ」をコードするタグ配列を含み得る。タグ配列は、コードされたタグがポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかに位置付けられるように、ポリペプチドをコードする核酸配列に挿入され得る。コードされたタグの非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン－タグ（ＨＩＳタグ）、ジスルフィドオキシドレダクターゼ（ＤｓｂＡ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｎ利用物質（Ｎ－ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）（ＮｕｓＡ）、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、及びＦｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）が挙げられる。タグの他の例としては、葉緑体トランジットペプチド、ミトコンドリアトランジットペプチド、澱粉体ペプチド、シグナルペプチド、または分泌タグが挙げられる。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ドメインスワッピングによって変化したタンパク質である。本明細書で使用されるとき、「ドメインスワッピング」という用語は、第１のタンパク質のドメインを第２のタンパク質のドメインで置き換えるプロセスを説明するように使用される。いくつかの実施形態では、第１のタンパク質のドメイン及び第２のタンパク質のドメインは、機能的に同一または機能的に同様である。いくつかの実施形態では、第２のタンパク質のドメインの構造及び／または配列は、第１のタンパク質のドメインの構造及び／または配列とは異なる。
シトロネロール及びシトロネロール前駆体生合成核酸
本明細書に記載のポリペプチドをコードする組換え遺伝子は、ポリペプチドを発現するのに好適な１つ以上の調節領域にセンス配向で作動可能に連結された、そのポリペプチドのコード配列を含む。多くの微生物は多シストロン性ｍＲＮＡから複数の遺伝子産物を発現することができるため、所望であれば、それらの微生物について単一の調節領域の制御下で複数のポリペプチドが発現され得る。コード配列及び調節領域は、調節領域が配列の転写または翻訳を調節するのに有効であるように調節領域及びコード配列が配置されているとき、作動可能に連結されているとみなされる。典型的には、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、単シストロン性遺伝子について調節領域から１～約５０ヌクレオチド下流に配置される。
多くの場合、本明細書に記載のポリペプチドのコード配列は、組換え宿主以外の種において同定され、すなわち、異種核酸である。故に、組換え宿主が微生物である場合、コード配列は、他の原核もしくは真核微生物由来、植物由来または動物由来であり得る。しかしながら、場合によっては、コード配列は、宿主に天然の配列であり、その生物に再導入されることになる。天然配列は、外来性核酸に連結された非天然配列、例えば、組換え核酸構築物において天然配列に隣接する非天然調節配列の存在によって、その天然に存在する配列から区別され得ることが多い。さらに、安定に形質転換された外来性核酸は典型的に、天然配列が見出される位置以外の位置で組み込まれる。「調節領域」は、転写または翻訳開始及び速度、ならびに転写または翻訳産物の安定性及び／または移動度に影響を及ぼすヌクレオチド配列を有する核酸を指す。調節領域は、限定なしに、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導エレメント、タンパク質結合配列、５´及び３´非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントロン、及びそれらの組み合わせを含む。調節領域は典型的に、少なくともコア（基本）プロモーターを含む。調節領域はまた、エンハンサー配列、上流エレメントまたは上流活性化領域（ＵＡＲ）などの、少なくとも１つの制御エレメントも含み得る。調節領域は、調節領域が配列の転写または翻訳を制御するのに有効であるように調節領域及びコード配列を配置することによって、コード配列に作動可能に連結される。例えば、コード配列及びプロモーター配列を作動可能に連結するために、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は典型的に、プロモーターから１～約５０ヌクレオチド下流に配置される。しかしながら、調節領域は、最大で翻訳開始部位から約５，０００ヌクレオチド上流、または転写開始部位から約２，０００ヌクレオチド上流に配置することができる。
組み込み対象の調節領域の選定は、効率、選択能力、誘導能、所望の発現レベル、及びある特定の培養段階中の優先的発現を含むがこれらに限定されない、いくつかの因子に左右される。調節領域を適切に選択し、コード配列に対して適切に配置することによってコード配列の発現を調節することは、当業者には日常的な事柄である。１つよりも多くの調節領域、例えば、イントロン、エンハンサー、上流活性化領域、転写ターミネーター、及び誘導性要素が存在し得ることが理解されよう。
１つ以上の遺伝子を、組換え核酸構築物内で、シトロネラール／シトロネロール生産の個別的な態様に有用な「モジュール」として組み合わせることができる。複数の遺伝子をモジュール、特に多シストロン性モジュールとして組み合わせることにより、多様な種におけるモジュールの使用が容易となる。例えば、好適な調節領域の挿入後にモジュールが多様な種に導入され得るように、シトロネラール／シトロネロール生合成遺伝子クラスター、またはメバロン酸経路遺伝子クラスターを多シストロン性モジュールとして組み合わせることができる。別の例として、各シトロネラール／シトロネロールコード配列が別個の調節領域に作動可能に連結されるように、シトロネラール／シトロネロール遺伝子クラスターを組み合わせて、シトロネラール／シトロネロールモジュールを形成することができる。かかるモジュールは、単シストロン性発現が必要であるか、または望ましい種において使用することができる。シトロネラール／シトロネロール生産に有用な遺伝子に加えて、組換え構築物はまた典型的に、複製起点、及び適切な種において構築物を維持するための１つ以上の選択可能マーカーも含有する。
遺伝コードの縮重のため、いくつかの核酸が特定のポリペプチドをコードし得ることが理解されよう。すなわち、多くのアミノ酸に関して、そのアミノ酸のコドンとしての役目を果たす１つよりも多くのヌクレオチド三つ組が存在する。故に、所与のポリペプチドのコード配列におけるコドンは、特定の宿主における最適な発現が得られるように、その宿主（例えば、微生物）に適切なコドンバイアス表を使用して修飾され得る。単離核酸として、これらの修飾配列は精製分子として存在することができ、組換え核酸構築物のためのモジュールを構築する際に使用するためにベクターまたはウイルスに組み込むことができる。
場合によっては、代謝中間体をシトロネロールまたはシトロネロール前駆体生合成に流用するために、内在性ポリペプチドの１つ以上の機能を阻害することが望ましい。例えば、ＧＰＰを生産するのに必要なＩＰＰ及びＤＭＡＰＰ生産をさらに増加させるために、ファルネシルピロリン酸シンターゼを下方調節することによって、酵母株におけるファルネシルピロリン酸の合成を下方調節することが望ましくあり得る。そのような場合、ポリペプチドまたは遺伝子産物を過剰発現する核酸を、当該株の中へ形質転換させる組換え構築物に組み込むことができる。代替的に、突然変異誘発を用いて、機能を増加または増大させることが所望される遺伝子において変異体を生み出すことができる。
一実施形態では、本発明の組換え宿主細胞、方法及び／または使用のうちのいずれか１つにおいて使用するためのＧＰＰＳポリペプチドは、配列番号１７、または５９～６２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは、それとの少なくとも５０％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも７５％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明の組換え宿主細胞、方法及び／または使用のうちのいずれか１つにおいて使用するためのＧＥＳポリペプチドは、配列番号１８、または６３～６６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは、それとの少なくとも４０％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも７５％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明の組換え宿主細胞、方法及び／または使用のうちのいずれか１つにおいて使用するためのＧｅＤＨポリペプチドは、配列番号１～６、１９、２０、または２４～３２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するか、あるいは、それとの少なくとも４５％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも７５％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明の組換え宿主細胞、方法及び／または使用のうちのいずれか１つにおいて使用するためのＥＮＲポリペプチドは、配列番号７～９、２１、２２、３３、３４、３７、４４～４８、または６７のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは、それとの少なくとも５０％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも７５％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明の組換え宿主細胞、方法及び／または使用のうちのいずれか１つにおいて使用するためのＡＲポリペプチドは、配列番号３１、３２、または８３～８６のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは、それとの少なくとも８５％の同一性、好ましくはそれとの９０％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明の組換え宿主細胞、方法及び／または使用のうちのいずれか１つにおいて使用するためのＮＰＰＳポリペプチドは、配列番号５３、７４、または７５のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは、それとの少なくとも４５％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも７５％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明の組換え宿主細胞、方法及び／または使用のうちのいずれか１つにおいて使用するためのＮＥＳポリペプチドは、配列番号５６～５８または７７～７９のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは、それとの少なくとも４５％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも７５％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明の組換え宿主細胞、方法及び／または使用のうちのいずれか１つにおいて使用するためのＮｅＤＨポリペプチドは、配列番号１～６、１９、２０、または２４～３２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは、それとの少なくとも５０％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも７５％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明の組換え宿主細胞、方法及び／または使用のうちのいずれか１つにおいて使用するためのＡＤＨポリペプチドは、配列番号６８に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは、それとの少なくとも４５％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも７５％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明の組換え宿主細胞、方法及び／または使用のうちのいずれか１つにおいて使用するためのＩＳＹポリペプチドは、配列番号５４または５５のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは、それとの少なくとも５０％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも７５％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、本発明の組換え宿主細胞、方法及び／または使用のうちのいずれか１つにおいて使用するためのＣｉＤＨポリペプチドは、配列番号４９～５２のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは、それとの少なくとも８０％の同一性、好ましくはそれとの少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
宿主微生物
真菌、細菌、酵母、哺乳類、昆虫、及び植物を含む、組換え宿主を使用して、シトロネラール、シトロネロール、シトロネル酸及び／またはそれらの前駆体の生産のためのポリペプチドを発現させることができる。
いくつかの原核生物及び真核生物、例えば、グラム陰性菌（Ｅ．ｃｏｌｉなど）、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）、及び真菌が、本明細書に記載の組換え微生物を構築する際の使用に特に好適である。シトロネラール及びシトロネロール前駆体生産株として使用するのに選択した種及び株がまず分析されて、どの生産遺伝子が当該株に内在性であり、どの遺伝子が存在しないかが決定される。当該株に内在性対応物が存在しない遺伝子が、１つ以上の組換え構築物に有利に組み立てられ、これが次いで欠損した機能（複数可）を埋め合わせるために当該株の中へ形質転換される。
典型的には、組換え微生物は、発酵槽中、ある温度（複数可）で一定期間増殖され、この温度及び一定期間は、シトロネラール、シトロネロール、シトロネル酸、及び／またはそれらの前駆体の生産を促進するものである。本発明により提供される、構築され、遺伝子改変された微生物は、とりわけ、ケモスタット、バッチ、流加培養、ドロー・アンド・フィル（ｄｒａｗ ａｎｄ ｆｉｌｌ）などの半連続発酵、連続灌流発酵、及び連続灌流発酵細胞培養を含む、従来の発酵プロセスを使用して培養することができる。本方法で使用される特定の微生物に応じて、イソペンテニル生合成遺伝子ならびにテルペンシンターゼ及びシクラーゼ遺伝子などの他の組換え遺伝子もまた存在し、発現させることが可能である。基質及び中間体、例えば、イソペンテニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸、ゲラニル二リン酸、ゲラニアール、ゲラニオール、シトロネラール、シトロネロール、及び／またはシトロネル酸のレベルは、公開される方法に従って試料を培養培地から抽出して分析することによって決定することができる。
本方法で有用な炭素源には、組換え宿主細胞によって代謝されてシトロネラール／シトロネロールの増殖及び／または生産を促進し得る、任意の分子が含まれ得る。好適な炭素源の例としては、スクロース（例えば、糖蜜に見出される）、フルクトース、キシロース、エタノール、アセテート、グリセロール、グルコース、セルロース、デンプン、セロビオースまたは他のグルコースを含むポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、酵母を宿主として用いる実施形態では、スクロース、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、及びグルコースなどの炭素源が好ましくあり得る。炭素源は、適切な宿主細胞種の培養分野の当業者に一般に使用される任意の供給計画（ｆｅｅｄｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅｎ）に従って、宿主生物に提供され得る。
組換え微生物が培養液中で一定期間増殖させられた後（この培養条件及び一定期間によりシトロネラール、シトロネロール、シトロネル酸、及び／または１つ以上のシトロネラール／シトロネロール前駆体の生産が促進される）、生産された産物が次いで、当該技術分野で既知の種々の技術を使用して培養基、発生ガス（ｏｆｆ－ｇａｓ）及び／または組換え微生物から回収され得る。例えば、シトロネラール、シトロネロール、シトロネル酸、及びそれらの前駆体は、宿主細胞から拡散し、及び／または宿主トランスポーターによって宿主細胞から輸送される。いくつかの実施形態では、透過処理剤を添加して、供給材料が宿主の中に入り産物が出ていくのを補助することができる。いくつかの実施形態では、シトロネラール、シトロネロール、シトロネル酸（ｃｉｔｒｏｎｅｌｉｃ ａｃｉｄ）、及びそれらの前駆体は、培養基に直接添加される溶媒相（ミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ）がこの非限定的例である）によって外側に捕捉され得るか、またはそれらは、発酵槽に接続された発生ガス捕捉系における収集容器中で溶媒相（ここでも再びＩＰＭがこの非限定的例である）に捕捉され得る。
発生ガス捕捉系の非限定的な例は、発生ガスを発酵槽中の発酵培地の上部のヘッドスペースから冷却装置（Ｄｉｍｒｏｔｈ冷却器など）へと導き、この冷却装置で発生ガスの温度を水蒸気及びシトロネラール（ｃｉｔｏｎｅｌｌａｌ）またはシトロネロールガスの凝縮点未満に冷却することを含む。凝縮された水、シトロネロール及び／またはシトロネラールは、溶媒相（ＩＰＭなど）を含有する収集容器中へ排出及び／またはポンプ送液され、溶媒相がシトロネラール及び／またはシトロネロールを捕捉する。凝縮された水蒸気は、収集容器中に第２の相（水相）として存在し、収集容器中のシトロネロール及び／またはシトロネロール含量を増加させるように周期的または継続的に排出され得る。いくつかの実施形態では、収集容器のガス状のヘッドスペースは、第２の冷却装置（Ｄｉｍｒｏｔｈ冷却器など）に結合され、この第２の冷却装置が、第１の冷却装置における凝縮を逃れたあらゆるシトロネラール及び／またはシトロネロールガス及び水蒸気を冷却し、溶媒相及び水相を含有する第２の収集容器中に凝縮物を収集する。シトロネラール及び／またはシトロネロールは次いで、溶媒の蒸発、または沈殿（例えば、温度またはｐＨ調整による）によって、溶媒相から富化、精製、または単離され得る。
別の実施形態では、培養微生物の粗溶解物を遠心分離して上清を得ることができ、これを次いでクロマトグラフィーカラム（例えば、Ｃ－１８カラム）にかけ、水で洗浄して親水性化合物を除去し、次いで好適な溶媒（この非限定的な例はメタノールである）で目的の化合物（複数可）の溶出を行うことができる。化合物（複数可）は次いで、分取ＨＰＬＣによってさらに精製することができる（これについての関連性のある技術は、例えば、ＷＯ２００９／１４０３９４に教示される）。
本明細書で考察される種々の遺伝子及びモジュールは、単一の宿主よりむしろ２つ以上の組換え宿主または宿主細胞に存在し得ることが理解されよう。複数の組換え宿主が使用される場合、それらを混合培養液中で増殖させて、シトロネラール、シトロネロール、及び／またはシトロネル酸を蓄積させることができる。
代替的に、２つ以上の宿主をそれぞれ別個の培養基中で増殖させることができ、第１の培養基の産物、例えば、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを第２の培養基中に導入して、ＧＰＰなどの後続の中間体へと、または、例えば、シトロネラール、シトロネロールもしくはシトロネル酸のうちの１つ以上などの最終産物へと変換させることができる。例えば、組換え微生物（本明細書で教示される組換え酵母またはＥ．ｃｏｌｉなど）によって生産されたシトロネロールを、酸化細菌（例えば、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ菌種、例えば、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ、またはＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）に接触させて、シトロネロールからシトロネラール及び／またはシトロネル酸への生物変換を可能にすることができる。次いで、第２のまたは最終宿主によって生産された産物が回収される。いくつかの実施形態では、培養基以外の栄養源を使用し、発酵槽以外の系を利用して組換え宿主を増殖させ得ることもまた理解されよう。
本明細書で使用されるとき、「生物変換」または「生体内変化」という用語は、ある特定の微生物などの生物学的プロセスまたは薬剤による、使用可能な産物への有機材料の変換を指す。いくつかの実施形態では、シトロネラール、シトロネロール、またはシトロネル酸は、酸化細菌を使用した生物変換によって生産され得る。生物変換が生じるためには、酸化細菌がその前駆体、及び／または中間体を、シトロネラール／シトロネロール経路に関与する１つ以上の酵素を発現する組換え宿主細胞によって生産されるシトロネロール、シトロネラール、またはシトロネル酸に修飾する。生体内での修飾に続いて、シトロネロール、シトロネラール、またはシトロネル酸は、細胞内にとどまり、及び／または培養基中に分泌される。例えば、ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、ゲラニオールシンターゼ（ＧＥＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（ＧｅＤＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、エノエートレダクターゼ（ＥＮＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、アルデヒドレダクターゼ（ＡＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子とを含み、シトロネロール、シトロネラール、またはシトロネル酸のうちの１つ以上を生産可能な、作動的に改変された生合成経路を含む組換え宿主細胞が、酸化細菌に接触させられて、シトロネロールをシトロネラール及び／またはシトロネル酸に変換する。ある特定の実施形態では、生物変換は、効率的な自己持続性の生物変換系が規模拡大費用を著しく低下させ得ることから、利点とみなされる。
代表的な原核及び真核種が下記により詳述される。しかしながら、他の種が好適であってもよいことが理解されよう。例えば、好適な種は、Ａｂｉｅｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ、Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ、Ｔｈａｕｅｒａ、またはＺｙｍｏｍｏｎａｓなどの属のものであり得る。かかる属由来の代表的な種には、Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ菌種ＲＤ６．２、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ ｍａｃｒｏｇｏｌｔａｂｉｄａ、Ｔｈａｕｅｒａ ｔｅｒｐｅｎｉｃａ ５８Ｅｕ、及びＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ亜種ｍｏｂｉｌｉｓが含まれる。
いくつかの実施形態では、微生物は、細菌などの原核生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓであり得る。
他の実施形態では、微生物は、Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅなどの真菌、例えば、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり得る。
ある特定の実施形態では、微生物は、藻類細胞、例えば、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ菌種、Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ、またはＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ａｌｍｅｒｉｅｎｓｉｓ種であり得る。
いくつかの実施形態では、微生物は、ラン藻細胞、例えば、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ菌種、Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ、またはＳｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ａｌｍｅｒｉｅｎｓｉｓであり得る。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ菌種
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓは、合成生物学においてよく研究され、広く使用されるシャーシ生物であり、組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに関して入手可能な変異体、プラスミドのライブラリ、詳細な代謝コンピュータモデル及び他の情報が存在し、産物収量を増大させるための種々のモジュールの合理的設計を可能にしている。組換え微生物を作製するための方法が知られている。
Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ
Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓは、海面高度から標高１，８００ｍまでで生じる、北米の太平洋北西及び北カリフォルニア原産のモミである。それは、カスケード山脈のアメリカオオモミ／アメリカトガサワラ生態地域における主要な構成要素である。この樹木は典型的に、高さ４０～７０ｍまで成長する。カスケード山脈の西部で見られる、より丈の高い沿岸部アメリカオオモミ、及びカスケード地域の東部で見られる、より丈の低い内陸部アメリカオオモミの２つの変種が存在する。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ菌種
Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｎｉｇｅｒ及びＡ．ｓｏｊａｅなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種は、食品生産において広く使用される微生物であり、これらもまた組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａ．ｆｌａｖｕｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、及びＡ．ｔｅｒｒｅｕｓのゲノムに関してヌクレオチド配列が入手可能であり、流束を増大させ産物収量を増加させるための内在性経路の合理的設計及び修飾を可能にしている。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓに関して代謝モデル、ならびにトランスクリプトーム研究及びプロテオーム研究が開発されてきた。Ａ．ｎｉｇｅｒは、クエン酸及びグルコン酸などのいくつかの食品成分の工業生産のために培養され、したがって、Ａ．ｎｉｇｅｒなどの種は全般的に、シトロネロール及びシトロネロール前駆体の生産に好適である。
Ｅ．ｃｏｌｉ
合成生物学において広く使用される別のプラットフォーム生物であるＥ．ｃｏｌｉもまた、組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓと同様、Ｅ．ｃｏｌｉに関して入手可能な変異体、プラスミドのライブラリ、詳細な代謝コンピュータモデル及び他の情報が存在し、産物収量を増大させるための種々のモジュールの合理的設計を可能にしている。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓに関して上述したのと同様の方法を使用して、組換えＥ．ｃｏｌｉ微生物を作製することができる。
Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓ
Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓは、モノテルペンの酸化を脱窒と結び付けることができるベータプロテオバクテリアである。
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓは、非運動性のグラム陰性ｃｏｃｃｏｂａｃｉｌｌｕｓである。それは好気条件下で増殖し、カタラーゼ陽性及びオキシダーゼ陰性である。
Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、及びＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ菌種
Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、及びＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ菌種は、それらが培養で大量のイソプレノイドを生産することが知られていることから有用であり得る。故に、大量のシトロネロールの生産のためのテルペン前駆体は、内在性遺伝子によってすでに生産されている。故に、シトロネロール生合成ポリペプチドに対する組換え遺伝子を含むモジュールが、メバロン酸またはＭＥＰ経路遺伝子を導入することを必要とせずに、かかる属由来の種に導入され得る。
Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ（Ｂｌａｓｔｏｂｏｔｒｙｓ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）
Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓは、珍しい生化学的性質をもつ二形性酵母である（それは４２℃の温度まではパン酵母のような出芽酵母として増殖し、この閾値を超えるとそれは糸状の形態で増殖する）。それは広範な基質で増殖することができ、硝酸同化能をもつ。それは、天然プラスチックを生産する株の作出または環境試料中のエストロゲンに対するバイオセンサーの開発に成功裏に適用されてきた。
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、二形性酵母（Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓを参照されたい）であり、Ｈｅｍｉａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ科に属する。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの全ゲノムが知られている。Ｙａｒｒｏｗｉａ種は好気性であり、非病原性とみなされる。Ｙａｒｒｏｗｉａは、疎水性基質（例えば、アルカン、脂肪酸、油）の使用が効率的であり、糖で増殖することができる。それは工業用途への可能性が高く、油性の微生物である。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｐｔｉｃａは、その細胞の乾燥重量のおよそ４０％まで脂質含量を蓄積することができ、脂質蓄積及び再動員に関するモデル生物である。例えば、Ｎｉｃａｕｄ，２０１２，Ｙｅａｓｔ ２９（１０）：４０９－１８、Ｂｅｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ９１（６）：６９２－６、Ｂａｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８４（５）：８４７－６５を参照されたい．
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ菌種
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａは、単細胞の有色酵母である。油性の赤色酵母であるＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓは、粗グリセロールから脂質及びカロテノイドを生産することが示されている（Ｓａｅｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６（１）：２１０－８）。Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ株は、バイオマス及び脂質の改善された生産性のための効率的な流加発酵系であることが示されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４１：３１２－７）。
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓは、油性の酵母であり、脂質生産経路の改変に有用である（例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎ．３：１１１２、Ａｇｅｉｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９０（４）：１２１９－２７を参照されたい）。
Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ
Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉは、メチロトローフ酵母（それはメタノールで増殖することができる）である。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどの他のメチロトローフ種と同様、それは異種タンパク質の生産のための優れたプラットフォームを提供する。数グラム範囲の分泌外部タンパク質の収量が報告されている。１つの計算法であるＩＰＲＯにより、最近、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉキシロースレダクターゼの補因子特異性をＮＡＤＰＨからＮＡＤＨに実験的に切り替える突然変異が予測された。例えば、Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．８２４：３２９－５８、Ｋｈｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１８（１０）：２１２５－３８を参照されたい。
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）
Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａは、メチロトローフ酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉを参照されたい）である。それはさらに、広範な他の基質でも増殖することができる。それは熱耐性であり、硝酸同化能をもつ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓもまた参照されたい）。それは、Ｂ型肝炎ワクチン、インスリン及びＣ型肝炎の治療のためのインターフェロンアルファ－２ａの生産に、さらには様々な技術的酵素（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ）に適用されてきた。例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｖｉｒｏｌ Ｓｉｎ．２９（６）：４０３－９を参照されたい。
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓは、ケフィアの生産に通常適用される酵母である。それは数種類の糖、最も重要な点としては、乳及び乳清に存在するラクトースで増殖することができる。それは、とりわけ、チーズの生産のためのキモシン（子牛の胃内に通常存在する酵素）の生産に成功裏に適用されてきた。４０，０００Ｌ規模の発酵槽中で生産が行われる。例えば、ｖａｎ Ｏｏｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．６（３）：３８１－９２を参照されたい。
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、メチロトローフ酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ及びＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａを参照されたい）である。それは、外部タンパク質の生産のための効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォーム要素はキットとして入手可能であり、タンパク質の生産のために学界において世界中で使用されている。複合型ヒトＮ－グリカン（酵母グリカンは同様であるが、ヒトで見出されるものと同一ではない）を生産することができる株が改変されてきた。例えば、Ｐｉｉｒａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（６）：５３２－７を参照されたい。
Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ菌種
Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｍｏｓｓｅｓは、懸濁培養で増殖させるとき、酵母または他の真菌培養と同様の特性を有する。この属は、他の種類の細胞では生産が困難であり得る、植物二次代謝産物の生産に使用され得る。
Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ
Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓは、バシクルモンＡｐｏｃｙｎａｃｅａｅ科の顕花植物の種である。それはマダガスカル原産及び特有であるが、他の地域でも観葉植物、ならびに、がんを治療するために使用される薬物ビンクリスチン及びビンブラスチンの源である薬用植物として生育される。
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ菌種
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍに密接に関連する、好気性非芽胞形成性非運動性のグラム陽性細菌の属である。いくつかの種は病原性の特性を有することが示されているが、多くは良性であり、土壌、水、及び真核細胞を含む、広範な環境で生存することが見出されている。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓは、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓの一員であるグラム陽性ｃｏｃｃａｌ細菌であり、鼻内、呼吸器内、及び皮膚上で頻繁に見出される。それはカタラーゼ及び硝酸還元に対して陽性であることが多い。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは常に病原性であるわけではないが、膿瘍などの皮膚感染症、副鼻腔炎などの呼吸器感染症、及び食中毒の一般的な原因である。
Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ
Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓは、グラム陰性通性嫌気性非芽胞形成性で極鞭毛をもつ桿菌である。それは、いくつかの態様では酵母に勝る、顕著なバイオエタノール生産能を有する。それは元々、アフリカのパームワイン、メキシコのプルケなどのアルコール飲料から、ならびにまた、欧州諸国におけるリンゴ酒及びビールの混入物質（リンゴ酒病（ｃｉｄｅｒ ｓｉｃｋｎｅｓｓ）及びビール腐敗）として単離された。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａは、桿状のグラム陰性腐生土壌細菌である。それは、トルエンなどの有機溶媒を分解する能力を含む、非常に多様な代謝作用を示す。この能力は、バイオレメディエーション、すなわち微生物を使用した油の生分解に利用されてきた。
Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ菌種
Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ菌種は、桿状または楕円形のグラム陰性細菌である。それらは小さなゲノムサイズ及び限定された代謝能力を有する傾向にある。これらの能力には、酸化発酵プロセスを通して炭水化物及びアルコールを部分的に酸化することが含まれる。それらは偏性好気性であり、最終電子受容体として酸素を用いる完全に呼吸型の代謝を有する。Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ株は糖富化環境を好む。例としては、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ、及びＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉが含まれるが、これらに限定されない。
シトロネラール／シトロネロール組成物
シトロネロール、シトロネラール、及びシトロネル酸に対する現在の工業ニーズを満たすために土地、設備、及びバイオマス発電の点でかなりの農業資源が必要とされている。したがって、規模拡大できる量の高純度シトロネロール、シトロネラール、及びシトロネル酸を得る能力を有することが望ましい。本明細書に記載の組換え宿主は、シトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸が選択的に富化された組成物を生産し得る。本明細書で使用されるとき、「富化」という用語は、Ｃｏｒｙｍｂｉａ ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ、Ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎ ｎａｒｄｕｓ、及びＣｙｍｂｏｐｏｇｏｎ ｗｉｎｔｅｒｉａｎｕｓなどの植物の油からのシトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸（抽出物）と比較して、特定のシトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸の割合が増加した、シトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸組成物を説明するように使用される。故に、本明細書に記載の組換え宿主は、所与の産物に所望されるプロファイルを満たすように適合されていると共に、各シトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸の割合がバッチ間で一貫している、組成物の生産を促進し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換え宿主は、望まれないシトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸前駆体及び／または中間体、あるいは植物抽出物中に見出される副産物を生産しないか、その生産量が低減される。故に、本明細書に記載の組換え宿主によって生産されるシトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸を含む組成物は、植物に由来する組成物とは区別可能である。いくつかの実施形態では、シトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸組成物は、生体外、生体内で、または生物変換によって生産され得る。
蓄積される個々の所望の産物（例えば、シトロネロール、シトロネラール、またはシトロネル酸）の量は、約１～約７，０００ｍｇ／Ｌ、例えば、約１～約１０ｍｇ／Ｌ、約３～約１０ｍｇ／Ｌ、約５～約２０ｍｇ／Ｌ、約１０～約５０ｍｇ／Ｌ、約１０～約１００ｍｇ／Ｌ、約２５～約５００ｍｇ／Ｌ、約１００～約１，５００ｍｇ／Ｌ、または約２００～約１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約少なくとも１，４００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，６００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１，８００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２，８００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約７，０００ｍｇ／Ｌであり得る。いくつかの態様では、シトロネロール、シトロネラール、またはシトロネル酸の量は、７，０００ｍｇ／Ｌを超え得る。蓄積されるシトロネロール、シトロネラール、及びシトロネル酸の組み合わせの量は、約１ｍｇ／Ｌ～約７，０００ｍｇ／Ｌ、例えば、約２００～約１，５００、少なくとも約２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約６，０００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約７，０００ｍｇ／Ｌであり得る。いくつかの態様では、シトロネロール、シトロネラール、及びシトロネル酸の組み合わせの量は、７，０００ｍｇ／Ｌを超え得る。一般に、培養時間が長いほど、もたらされる産物の量は多くなる。故に、組換え宿主微生物は、１日間～７日間、１日間～５日間、３日間～５日間、約３日間、約４日間、または約５日間培養され得る。
本明細書で考察される種々の遺伝子及びモジュールは、単一の微生物よりむしろ２つ以上の組換え微生物に存在し得ることが理解されよう。複数の組換え微生物が使用される場合、それらを混合培養液中で増殖させて、シトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸を生産することができる。例えば、第１の微生物は、シトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸前駆体の生産のための１つ以上の生合成遺伝子を含み得、一方で第２の微生物は、シトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸生合成遺伝子を含む。次いで、第２のまたは最終微生物によって生産された産物が回収される。いくつかの実施形態では、培養基以外の栄養源を使用し、発酵槽以外の系を利用して組換え微生物を増殖させることもまた理解されよう。
代替的に、２つ以上の微生物をそれぞれ別個の培養基中で増殖させることができ、第１の培養基の産物、例えば、ＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰ、またはゲラニオールもしくはネロールを第２の培養基中に導入して、後続の中間体へと、または、シトロネラールなどの最終産物へと変換させることができる。次いで、第２のまたは最終微生物によって生産された産物が回収される。いくつかの実施形態では、培養基以外の栄養源を使用し、発酵槽以外の系を利用して組換え微生物を増殖させることもまた理解されよう。
本明細書に開示される方法によって得られたシトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸ならびに組成物を使用して、昆虫忌避剤などの、香料工業において一般に使用される任意の数の製品を作製することができ、またそれらをいくつかの天然テルペノイドの合成における中間体として使用することもできる。例えば、実質的に純粋なシトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸を、蝋燭、ローション、芳香剤、防臭剤、練歯磨、チューインガム及び油などの製品に組み込むことができる。実質的に純粋なシトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸もまた組み込むことができる。代替的に、各々が特定のシトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸を生産する組換え微生物を別個に培養し、シトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸を各微生物から実質的に純粋な形態で回収し、次いで化合物を組み合わせて、各化合物を所望の割合で含む混合物を得ることによって、シトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸の混合物を作製することができる。本明細書に記載の組換え微生物は、現在のシトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸産物と比較して、より精密で一貫した混合物が得られることを可能にする。
本明細書に記載の組換え微生物によって生産された組成物は、いくつかの製品に組み込むことができる。例えば、組換え微生物によって生産されたシトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸組成物は、シトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸ならびに製品の種類に応じて、乾燥重量に基づき、シトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸約２０ｍｇ／産物ｋｇから、シトロネロール、シトロネラール、及び／またはシトロネル酸約１８００ｍｇ／産物ｋｇの範囲の量で製品に組み込むことができる。例えば、シトロネロール組成物は、シトロネロール９０～９９重量％及び検出不能量の植物由来混入物質を有し得、乾燥重量に基づき２５～１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００～５００ｍｇ／ｋｇ、２５～１００ｍｇ／ｋｇ、２５０～１０００ｍｇ／ｋｇ、５０～５００ｍｇ／ｋｇまたは５００～１０００ｍｇ／ｋｇで製品に組み込むことができる。
シトロネラール組成物は、シトロネラール３重量％超を有するシトロネラール組成物であり得、製品中のシトロネラールの量が乾燥重量に基づき２５～１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００～５００ｍｇ／ｋｇ、２５～１００ｍｇ／ｋｇ、２５０～１０００ｍｇ／ｋｇ、５０～５００ｍｇ／ｋｇまたは５００～１０００ｍｇ／ｋｇであるように、製品に組み込むことができる。典型的には、シトロネラール組成物は、検出不能量の植物由来混入物質を有する。
シトロネル酸組成物は、シトロネル酸３重量％超を有するシトロネル酸組成物であり得、製品中のシトロネル酸の量が乾燥重量に基づき２５～１６００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００～５００ｍｇ／ｋｇ、２５～１００ｍｇ／ｋｇ、２５０～１０００ｍｇ／ｋｇ、５０～５００ｍｇ／ｋｇまたは５００～１０００ｍｇ／ｋｇであるように、製品に組み込むことができる。典型的には、シトロネル酸組成物は、検出不能量の植物由来混入物質を有する。
本発明は、以下の実施例にさらに記載される。これらの実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
以下に続く実施例は、本発明の具体的な実施形態、及びその種々の使用を例示説明するものである。それらは説明目的でのみ記載されており、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１．生体内試料中のモノテルペンの分析
ミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ）を４０００ｇで５分間の遠心分離によって二相培養物から回収した。２０μｌのＩＰＭをヘキサン中で２０倍希釈した後、定量した。２μｌの希釈した試料を、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＣ２ ＰＤＡ ｅＬａｍｂｄａ検出器に連結したＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＣ２系（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＵＳＡ）に注入した。化合物の分離をＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＣ２ ＨＳＳ Ｃ１８ ＳＢカラム（１．８μｍ、３．０ｍｍ×１００ｍｍ）で達成し、４０℃で維持した。移動相Ａ及びＢはそれぞれＣＯ２及びアセトニトリルであった。２．０ｍｌ／分の流量を用いた。勾配プロファイルは次の通りであった：１％Ｂで０．２分間一定、１．８分間かけて１％Ｂ～１０％Ｂの直線勾配、１０％Ｂで１分間洗浄及び初期条件に戻る。Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｂａｃｋ－Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ（ＡＢＰＲ）の圧力をＷａｔｅｒ Ａｃｑｕｉｔｙ ＣＯ２コンバージェンスマネージャで２０００ｐｓｉに維持した。
シトロネラール、ゲラニアール、シトロネロール及びゲラニオールをはじめとするモノテルペンを、それらのＵＶ２１０ｎｍ吸光度を記録することによって分析した。検出されたモノテルペン化合物を、既知標準物質（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）（０．６２５ｍｇ／ｌ～３２０ｍｇ／ｌの範囲、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）による直線の検量線を使用して、Ｗａｔｅｒｓ ＴａｒｇｅｔＬｙｎｘソフトウェアを使用して定量した。
実施例２．生体外試料中のモノテルペンの分析
１００μｌ生体外アッセイ試料を３００μｌメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）またはヘキサンでの液液抽出によって抽出した。ＭＴＢＥまたはヘキサンを１２０００ｘｇでの迅速な遠心分離によって回収し、注入バイアルに入れてから分析した。
１μｌ試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ水素炎イオン化検出器を装着したＡｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ａ ＧＣ系（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＵＳＡ）に注入した。化合物の分離をＲｅｓｔｅｋ Ｒｔｘ（登録商標）－Ｗａｘカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ）で達成した。炉内温度は、最初は５０℃で０．６分間保ち、２０℃／分で１８０℃に高め、次いで（ｔｈｅｍ）６０℃／分で１８０℃から２５０℃にプログラムし、最後に２５０℃で０．６分間保った。水素をキャリアガスとして２ｍｌ／分の一定流量で使用した。インジェクタ及び検出器はそれぞれ２５０℃及び２６０℃に保った。
シトロネラール、ゲラニアール、シトロネロール及びゲラニオールをはじめとするモノテルペンを、既知標準物質（０．０７８ｍｇ／ｌ～４０ｍｇ／ｌの範囲、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）による直線の検量線を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓｈｕｎｔｅｒ定量分析ソフトウェアを使用して定量した。
実施例３．株改変
シトロネラール／シトロネロール経路中間体及びシトロネロールを生産可能な組換え酵母株を、前駆体株（例えば、ＷＯ２０１４０２７１１８を参照されたく、同文献は参照によりその全体が援用される）を使用して、Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ ＧＰＰＳポリペプチド（配列番号１７）をコードする組換え遺伝子、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ ＧＥＳポリペプチド（配列番号１８）をコードする組換え遺伝子、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＥＮＲポリペプチド（配列番号２１）、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＥＮＲポリペプチド（配列番号８）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ ＥＮＲポリペプチド（配列番号９）をコードする組換え遺伝子、組換えＣａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓＧｅＤＨポリペプチド（配列番号１、配列番号１９）をコードする組換え遺伝子、Ｔｈａｕｒｅｒａ ｔｅｒｐｅｎｉｃａ ５８Ｅｕ ＧｅＤＨポリペプチド（配列番号５）をコードする組換え遺伝子、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ菌種ＲＤ６．２ ＧｅＤＨポリペプチド（配列番号２）をコードする組換え遺伝子、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ ｍａｃｒｏｇｏｌｔａｂｉｄａ ＧｅＤＨポリペプチド（配列番号３）をコードする組換え遺伝子、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ＧｅＤＨポリペプチド（配列番号４）をコードする組換え遺伝子、及び／またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＧｅＤＨポリペプチド（配列番号６）をコードする組換え遺伝子の１つ以上のコピーを組み込むことによって、改変した。
実施例４．ゲラニオールを介した酵母及び細菌におけるシトロネラール／シトロネロール経路生産
ｄ－またはｌ－シトロネラール及びｄ－またはｌ－シトロネロールの生産のための、酵母及び細菌における代表的な異種または内在性経路が図１ａに示される。メバロン酸経路または２Ｃ－メチル－Ｄ－エリトリトール－４－リン酸（ＭＥＰ）経路は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリピロリン酸（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＤＭＡＰＰ）の生産をもたらすことができる。次いで、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）によって縮合して、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）を生産することができ、これをシトロネラール／シトロネロール経路のための出発基質とすることができる。次いで、ゲラニオールシンターゼ（ＧＥＳ）によってＧＰＰをゲラニオールへと変換することができる。次いで、ゲラニオールをゲラニオールデヒドロゲナーゼ（ＧｅＤＨ）によって酸化させて、ゲラニアールを生産することができる。次いで、エンレダクターゼ（ＥＮＲ、エノエートレダクターゼとも称される）を使用して、ゲラニアールをｄ－シトロネラールへと還元することができる。次いで、ゲラニオールの酸化からのＧｅＤＨの逆活性に加えて、宿主細胞におけるアルデヒドレダクターゼ（ＡＲ）活性によってシトロネラールをシトロネロールに還元することができる。ＥＮＲ及びその基質の特異性がｄ－またはｌ－シトロネラールの生産を決定し得る（図１ａを参照されたい）。
シトロネラール／シトロネロール経路の追加の態様は、ゲラニアールからネラールへの異性化であり得る。この工程は、ケト－エノール互変異性化に起因して化学的に生じ得る。次いで、ゲラニオールの酸化からのＧｅＤＨの逆活性に加えて、宿主細胞におけるＡＲ活性によってネラールをネロールに変換することができる。
実施例５．ネロールを介した酵母及び細菌におけるシトロネラール／シトロネロール経路生産
ｄ－またはｌ－シトロネラール及びｄ－またはｌ－シトロネロールの生産のための酵母及び細菌における代表的な異種または内在性経路が図１ｂに示される。メバロン酸経路またはＭＥＰ経路は、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの生産をもたらすことができる。次いで、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをネリル二リン酸シンターゼ（ＮＰＰＳ）によって変換して、ネリル二リン酸（ＮＰＰ）を生産することができ、これをシトロネラール／シトロネロール経路のための出発基質とすることができる。次いで、ネリルシンターゼ（ＮＥＳ）によってＮＰＰをネロールへと変換することができる。次いで、ネロールをネラールデヒドロゲナーゼ（ＮｅＤＨ）によって酸化させて、ネラールを生産することができる。次いで、ＥＮＲがネラールをｌ－シトロネラールへと還元し得る。次いで、ネロールの酸化からのＮｅＤＨの逆活性に加えて、宿主細胞におけるＡＲ活性によってシトロネラールをシトロネロールに還元することができる。ＥＮＲ及びその基質の特異性がｄ－またはｌ－シトロネラールの生産を決定し得る（図１ｂを参照されたい）。
実施例６．ネロールまたはゲラニオールからシトロネロールへの直接変換を介した、酵母及び細菌におけるシトロネラール／シトロネロール経路生産
ｄ－またはｌ－シトロネラール及びｄ－またはｌ－シトロネロールの生産のための酵母及び細菌における代表的な異種または内在性経路が図１ｃに示される。メバロン酸経路またはＭＥＰ経路は、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの生産をもたらすことができる。次いで、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをＧＰＰＳまたはＮＰＰＳによって縮合して、それぞれＧＰＰまたはＮＰＰを生産することができる。ＧＰＰまたはＮＰＰをそれぞれゲラニオールまたはネロールに変換することができる。次いで、エノエートレダクターゼ（ＥＮＲ）またはイリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）によって、ゲラニオールまたはネロールをそれぞれｄ－シトロネロールまたはｌ－シトロネロールに変換することができる。次いで、シトロネロールデヒドロゲナーゼ（ＣｉＤＨ）によって、ｄ－またはｌ－シトロネロールをそれぞれｄ－またはｌ－シトロネラールに酸化させることができる。
実施例７．酵母におけるシトロネラール／シトロネロール経路生産
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるプラスミドに基づくシトロネラール／シトロネロール経路を確立する異種遺伝子の生体内発現を、ＥＲＧ２０の転写を下方調節して、Ａｇ＿ＧＰＰＳ２の過剰発現によりゲラニル二リン酸の生産を増加させることによって引き起こされた、亢進したイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリピロリン酸（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＤＭＡＰＰ）レベルを有する酵母株を使用して試験した（例えば、ＷＯ２０１４０２７１１８を参照されたく、同文献は参照によりその全体が援用される）。
酵母株を、Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓゲラニル二リン酸シンターゼ（Ａｇ＿ＧＰＰＳ２）、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓゲラニアールシンターゼ（Ｃｒ＿ＧＥＳ）、及び／またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ黄色酵素（Ｋｌ＿ＫＹＥ１）及びＣａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓゲラニアールデヒドロゲナーゼ（Ｃｄ＿ＧｅＤＨ）の共発現を含む、自律複製配列（ＡＲＳ）及び酵母セントロメア（ＣＥＮ）を含有するプラスミド（ＡＲＳ－ＣＥＮプラスミド）で形質転換させた。ＡＲＳ－ＣＥＮプラスミドは、構成的プロモーターの制御下にあった。２％グルコースを含む合成完全（ＳＣ）培地を培養に使用した。培養の間、培養物に１０％ｖ／ｖミリスチン酸イソプロピル二次相を補充して、当該経路の活性化によって生産される目的分子の抽出及び捕捉の一助とした。培養物を１２０時間増殖させた。
上記に列挙した全ての遺伝子は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧＥＮＥＡＲＴ（商標）ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコドン最適化バリアントとして合成されたものであった。ＩＰＭ試料をＵＰＣｓ－ＵＶによって分析した。
Ａｇ＿ＧＰＰＳ２＋Ｃｒ＿ＧＥＳの共発現では、この経路の第１の中間体である約４００ｍｇ／Ｌのゲラニオールの生産がもたらされた。Ａｇ＿ＧＰＰＳ２＋Ｃｒ＿ＧＥＳ＋Ｋｌ＿ＫＹＥ１の共発現では、約３００ｍｇ／Ｌのゲラニオール生産ならびに微量のゲラニアール（約１０ｍｇ／Ｌ）及びシトロネロール（約２５ｍｇ／Ｌ）の蓄積がもたらされた。Ａｇ＿ＧＰＰＳ２＋Ｃｒ＿ＧＥＳ＋Ｃｄ＿ＧｅＤＨの発現では、様々な量のゲラニオール（約３０ｍｇ／Ｌ）、ゲラニアール（約１５０ｍｇ／Ｌ）、シトロネロール（約１００ｍｇ／Ｌ）、ネラール（約７５ｍｇ／Ｌ）、ならびに５ｍｇ／Ｌ未満のシトロネラール及びネロール蓄積がもたらされた。これらの結果により、ゲラニオールが、Ｃｄ＿ＧｅＤＨによってゲラニアールに変換され、次いで、内在性エンレダクターゼ活性（Ｓｃ＿ＯＹＥ２）によってシトロネラールに過渡的にさらに変換されることが実証される。ゲラニアールの一部は、ケト－エノール互変異性化によってネラールに相互変換され、ネラールの一部は、ＡＲ活性によってネロールに還元される。シトロネラールの生産に続いて、アルコールデヒドロゲナーゼ／アルデヒドレダクターゼ活性によりシトロネロールを産出する。Ａｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｃｄ＿ＧｅＤＨ及びＫｌ＿ＫＹＥ１の発現では、（シトロネラールを介した）シトロネロールの生産と共に全シトロネラール／シトロネロール経路の確立がもたらされた。プラスミドに基づくＫｌ＿ＫＹＥ１及びＣｄ＿ＧｅＤＨ遺伝子の発現により、シトロネラール／シトロネロール経路の中間体及び／または最終産物の生産におけるそれらの役割が示唆される。経路工程の段階的追加によって、この経路の優勢的な方向が明らかとなった。ＧＰＰ－＞ゲラニオール／ネロール－＞ゲラニアール／ネラール－＞シトロネラール－＞シトロネロール（図１及び２を参照されたい）。
実施例８．シトロネラール／シトロネロール経路のための基質としてのネロールの生産
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるプラスミドに基づくシトロネラール／シトロネロール経路の活性化を介したネロールの生産を確立する異種遺伝子の生体内発現を、ＥＲＧ２０の転写の下方調節によって引き起こされた、亢進したイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリピロリン酸（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＤＭＡＰＰ）レベルを有する酵母株を使用して試験した。
酵母株を、Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ＿ゲラニル二リン酸シンターゼ（Ａｇ＿ＧＰＰＳ２）及びＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ＿ネロールシンターゼ（Ｇｍ＿ＮＥＳ、配列番号５６）またはＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ＿ネリル二リン酸シンターゼ（Ｓｌ＿ＮＤＰＳ１、配列番号５３）及びＧｍ＿ＮＥＳの共発現を含む、自律複製配列（ＡＲＳ）及び酵母セントロメア（ＣＥＮ）を含有するプラスミド（ＡＲＳ－ＣＥＮプラスミド）で形質転換させた。ＡＲＳ－ＣＥＮプラスミドは、構成的プロモーターの制御下にあった。２％グルコースを含む合成完全（ＳＣ）培地を培養に使用した。培養の間、培養物に１０％ｖ／ｖミリスチン酸イソプロピル二次相を補充して、当該経路の活性化によって生産される目的分子の抽出及び捕捉の一助とした。培養物を１２０時間増殖させた。
上記に列挙した全ての遺伝子は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧＥＮＥＡＲＴ（商標）ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコドン最適化バリアントとして合成されたものであった。ＩＰＭ試料をＵＰＣｓ－ＵＶによって分析した。Ａｇ＿ＧＰＰＳ２及びＧｍ＿ＮＥＳの発現では、ゲラニオールのみ（約３０ｍｇ／Ｌ）の生産がもたらされた一方で、ＳＩ＿ＮＤＰＳ１及びＧｍ＿ＮＥＳの発現では、約５ｍｇ／Ｌのネロール及びゲラニオールが産出された（図３を参照されたい）。この実施例におけるネロールの生産は、ＳＩ＿ＮＤＰＳ１によるＮＰＰの生産、及びＧｍ＿ＮＥＳの発現によってＮＰＰがネロールに変換されることを指示する。
実施例９．ゲラニオールからシトロネロールへの変換を介したシトロネラールの生産
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるプラスミドに基づくシトロネラール／シトロネロール経路を確立する異種遺伝子の生体内発現を、ＥＲＧ２０の転写の下方調節によって引き起こされた、亢進したイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリピロリン酸（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＤＭＡＰＰ）レベルを有する酵母株を使用して試験した。
酵母株を、Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓゲラニル二リン酸シンターゼ（Ａｇ＿ＧＰＰＳ２）及びＣａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓゲラニアールシンターゼ（Ｃｒ＿ＧＥＳ）の共発現、Ａｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ、及びＯｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ イリドイドシンターゼ（Ｏｅ＿ＩＳＹ）の共発現、またはＡｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｏｅ＿ＩＳＹ、及びＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ菌種ＤＦＣｌ－１＿シトロネロール／シトロネラールデヒドロゲナーゼ（Ｂｓ＿ＣｉＤＨ）の共発現を含む、自律複製配列（ＡＲＳ）及び酵母セントロメア（ＣＥＮ）を含有するプラスミド（ＡＲＳ－ＣＥＮプラスミド）で形質転換させた。ＡＲＳ－ＣＥＮプラスミドは、構成的プロモーターの制御下にあった。２％グルコースを含む合成完全（ＳＣ）培地を培養に使用した。培養の間、培養物に１０％ｖ／ｖミリスチン酸イソプロピル二次相を補充して、当該経路の活性化によって生産される目的分子の抽出及び捕捉の一助とした。培養物を１２０時間増殖させた。
上記に列挙した全ての遺伝子は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧＥＮＥＡＲＴ（商標）ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコドン最適化バリアントとして合成されたものであった。ＩＰＭ試料をＵＰＣｓ－ＵＶによって分析した。
Ａｇ＿ＧＰＰＳ２及びＣｒ＿ＧＥＳの発現では、約２３０ｍｇ／Ｌのゲラニオールの生産がもたらされた。Ａｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ及びＯｅ＿ＩＳＹの発現では、約２００ｍｇ／Ｌのゲラニオール、約５０ｍｇ／Ｌのシトロネロール及び１０ｍｇ／Ｌ未満のシトロネラールの生産がもたらされた。Ａｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｏｅ＿ＩＳＹ、及びＢｓ＿ＣｉＤＨの発現では、３７５ｍｇ／Ｌのゲラニオール、１００ｍｇ／Ｌのシトロネロール、５０ｍｇ／Ｌ未満のシトロネラール、及び未満２０ｍｇ／Ｌのゲラニアールが産出された。結果は、Ｏｅ＿ＩＳＹがゲラニオールをシトロネロールに直接変換すること、及びゲラニオールを有する酵母株におけるＢｓ＿ＣｉＤＨの共発現が少量のシトロネラールの蓄積をもたらすことを指示する（図４を参照されたい）。
実施例１０．Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに組み込まれたシトロネラール／シトロネロール経路
シトロネラール／シトロネロール経路遺伝子Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓゲラニル二リン酸シンターゼ（Ａｇ＿ｔＧＰＰＳ）Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓゲラニアールシンターゼ（Ｃｒ＿ＧＥＳ）Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ黄色酵素（Ｋｌ＿ＫＹＥ１）、及びＣａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓゲラニアールデヒドロゲナーゼ（Ｃｄ＿ＧｅＤＨ）の全染色体組込みを有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母株を開発し、試験して、どのシトロネラール／シトロネロール経路中間体及び／または最終産物が生産されるかを特定した。
ＥＲＧ２０の転写の下方調節によって引き起こされた、亢進したイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）レベルを有する酵母株を、経路発現カセットの組込みに使用した（例えば、ＷＯ２０１４０２７１１８を参照されたく、同文献は参照によりその全体が援用される）。Ａｇ＿ＧＰＰＳ２の前にＴＥＦ１プロモーター、Ｃｒ＿ＧＥＳ及びＣｄ＿ＧｅＤＨの前にＰＧＫ１プロモーター、ならびにＫｌ＿ＫＹＥ１の前にＴＰＩ１プロモーター。隣接領域を含有する発現カセットを相同組換えによって酵母ゲノムに組み込んだ。組込み構築物は、発現カセット及び選択マーカー（プロモーター－ＯＲＦ－ターミネーター－選択マーカー）からなり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムにおける具体的な遺伝子間配列に相同である隣接配列が、上流及び下流（約３～４００ヌクレオチド）にある。相同配列は、組込み構築物の標的を当該ゲノムにおけるこれらの配列に定め、構築物は相同組換えによって組み込まれる。組み込まれた発現カセット及び選択マーカーを有する酵母クローンは、選択マーカーを用いて選択することができる。
２％グルコースを含む酵母抽出物ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）培地を培養に使用した。培養の間、培養物に１０％ｖ／ｖミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ）二次相を補充して、当該経路の活性化によって生産される分子の抽出及び捕捉の一助とした。培養物を１２０時間増殖させた。全ての遺伝子は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧＥＮＥＡＲＴ（商標）ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコドン最適化バリアントとして合成されたものであった。ＩＰＭ試料をＵＰＣ２－ＵＶによって分析した。ＩＰＭ試料をキラルＧＣによって分析して、シトロネラール及びシトロネロールの光学純度（鏡像異性体過剰率、ｅｅ％）を測定した。
組み込まれた経路の発現で、唯一の主要産物としてシトロネロール（約１７５ｍｇ／Ｌ）の生産がもたらされた。具体的には、組み込まれた経路で、約１００ｅｅ％のｄ－シトロネロールが産出された（図５を参照されたい）。
実施例１１．異なるＧｅＤＨ遺伝子を有する酵母におけるシトロネラール／シトロネロール経路生産
酵母におけるシトロネラール／シトロネロール経路の活性ゲラニオールデヒドロゲナーゼには、Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｃｄ＿ＧｅＤＨ）、Ｔｈａｕｅｒａ ｔｅｒｐｅｎｉｃａ ５８Ｅｕゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｔｔ＿ＧｅＤＨ）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ菌種ＲＤ６．２＿ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｒｓ＿ＧｅＤＨ）、Ｓｐｉｎｇｏｐｙｘｉｓ ｍａｃｒｏｇｏｌｔａｂｉｄａゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｓｍ＿ＧｅＤＨ）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ａｃ＿ＧｅＤＨ）、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｐｐ＿ＧｅＤＨ）が含まれる。
シトロネラール／シトロネロール経路を開始させるために、ＥＲＧ２０の転写の下方調節によって引き起こされた、亢進したＩＰＰ及びＤＭＡＰＰレベルを有する酵母株を使用して、亢進したＧＰＰレベルを産出した。酵母株を、Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓゲラニル二リン酸シンターゼ（Ａｇ＿ＧＰＰＳ２）、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓゲラニアールシンターゼ（Ｃｒ＿ＧＥＳ）、及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ黄色酵素（Ｋｌ＿ＫＹＥ１）、ならびに次のもの：Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｃｄ＿ＧｅＤＨ、配列番号１）、Ｔｈａｕｅｒａ ｔｅｒｐｅｎｉｃａ ５８Ｅｕゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｔｔ＿ＧｅＤＨ、配列番号５）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ菌種ＲＤ６．２＿ゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｒｓ＿ＧｅＤＨ、配列番号２）、Ｓｐｉｎｇｏｐｙｘｉｓ ｍａｃｒｏｇｏｌｔａｂｉｄａゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｓｍ＿ＧｅＤＨ、配列番号３）、及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ａｃ＿ＧｅＤＨ、配列番号４）、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａゲラニオールデヒドロゲナーゼ（Ｐｐ＿ＧｅＤＨ、配列番号６）から選択されるゲラニオールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む、ＡＲＳ－ＣＥＮプラスミドで形質転換させた。異種遺伝子は、次のような構成的プロモーターの制御下にある：Ａｇ＿ＧＰＰＳ２の前にＴＥＦ１プロモーター、Ｃｒ＿ＧＥＳの前にＰＧＫ１プロモーター、Ｋｌ＿ＫＹＥ１の前にＴＰＩ１プロモーター及び異なるＧｅＤＨの各々の前にＰＧＫ１プロモーター。２％グルコースを含む合成完全（ＳＣ）培地を培養に使用した。培養の間、培養物に１０％ｖ／ｖミリスチン酸イソプロピル二次相を補充して、当該経路から生じる目的分子の抽出及び捕捉の一助とした。培養物を１２０時間増殖させた。全ての遺伝子は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧＥＮＥＡＲＴ（商標）ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコドン最適化バリアントとして合成されたものであった。ＩＰＭ試料をＵＰＣｓ－ＵＶによって分析した。
この実験で試験したＣｄ＿ＧｅＤＨ、Ｔｔ＿ＧｅＤＨ、Ｒｓ＿ＧｅＤＨ、Ｓｍ＿ＧｅＤＨ、Ｐｐ＿ＧｅＤＨ、及びＡｃ＿ＧｅＤＨ酵素の種々の組み合わせは、種々の量のシトロネロールを産出した（図６を参照されたい）。シトロネラールを含む経路中間体は、試験したＣｄ＿ＧｅＤＨ、Ｔｔ＿ＧｅＤＨ、Ｒｓ＿ＧｅＤＨ、Ｓｍ＿ＧｅＤＨ、Ｐｐ＿ＧｅＤＨ、及びＡｃ＿ＧｅＤＨ酵素の全ての組み合わせによってシトロネロールに変換され、ゲラニオールまたはゲラニアールの生産はごく少量のみであった。Ａｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｋｌ＿ＫＹＥ１、及びＲｓ＿ＧｅＤＨ及びＡｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｋｌ＿ＫＹＥ１、及びＡｃ＿ＧｅＤＨの共発現では、最も高い量のシトロネロール（約２００ｍｇ／Ｌ）が産出された。Ａｃ＿ＧｅＤＨ発現をＰｐ＿ＧｅＤＨと置き換えた場合、約１０ｍｇ／Ｌのシトロネラールが生産され、約１５０ｍｇ／Ｌのシトロネロールが生産された（図７を参照されたい）。
実施例１２．酵母における内在性ＥＮＲ及び過剰発現Ｓｃ＿ＯＹＥ２によって生産された光学純度
内在性ＥＮＲまたはＳｃ＿ＯＹＥ２（プラスミドベース）を過剰発現した酵母において、シトロネラール／シトロネロール経路生産を実行した。酵母株を、Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓゲラニル二リン酸シンターゼ（Ａｇ＿ＧＰＰＳ２）、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓゲラニアールシンターゼ（Ｃｒ＿ＧＥＳ）、及びＣａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓゲラニアールデヒドロゲナーゼ（Ｃｄ＿ＧｅＤＨ）（対照）またはＡｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｃｄ＿ＧｅＤＨ、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＮＲ（Ｓｃ＿ＯＹＥ２、配列番号３３）の共発現を含む、自律複製配列（ＡＲＳ）及び酵母セントロメア（ＣＥＮ）を含有するプラスミド（ＡＲＳ－ＣＥＮプラスミド）で形質転換させた。ＡＲＳ－ＣＥＮプラスミドは、構成的プロモーターの制御下にあった。２％グルコースを含む合成完全（ＳＣ）培地を培養に使用した。培養の間、培養物に１０％ｖ／ｖミリスチン酸イソプロピル二次相を補充して、当該経路の活性化によって生産される目的分子の抽出及び捕捉の一助とした。培養物を１２０時間増殖させた。
上記に列挙した全ての遺伝子は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧＥＮＥＡＲＴ ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコドン最適化バリアントとして合成されたものであった。ＩＰＭ試料をＵＰＣｓ－ＵＶによって分析した。ＩＰＭ試料をキラルＧＣによって分析して、シトロネラール及びシトロネロールの光学純度を測定した。
Ａｇ＿ｔＧＧＰＳ、Ｃｒ＿ＧＥＳ及びＣｄ＿ＧｅＤＨの発現では、約１０ｍｇ／Ｌのゲラニオール、５ｍｇ／Ｌ未満のネロール、約３０ｍｇ／Ｌのゲラニアール、約１０ｍｇ／Ｌのネラール、約４５ｍｇ／Ｌのシトロネロール、及び５ｍｇ／Ｌ未満のシトロネラールが産出された。内在性ＥＮＲ活性では、９６．４％ｅｅのｄ－シトロネロールの生産がもたらされた。Ｓｃ＿ＯＹＥ２の過剰発現では、約１０ｍｇ／Ｌのゲラニオール、５ｍｇ／Ｌ未満のネロール、約２５ｍｇ／Ｌのゲラニアール、約１０ｍｇ／Ｌのネラール、約５０ｍｇ／Ｌのシトロネロール、及び５ｍｇ／Ｌ未満のシトロネラールが生産された。９７．０％のｅｅでｄ－シトロネロールが生産された（図６を参照されたい）。
実施例１３．ＧｅＤＨ酵素を含有する酵母細胞溶解物におけるゲラニオール変換
多様なＧｅＤＨ遺伝子を酵母培養物中で発現させ、これを酵母細胞溶解物の調製に使用した。これらの溶解物をゲラニオールによる供給実験に使用して、生産されたシトロネラール／シトロネロール経路産物の量を観察した。
Ｃｄ＿ＧｅＤＨ、Ｔｔ＿ＧｅＤＨ、Ｒｓ＿ＧｅＤＨ、Ｓｍ＿ＧｅＤＨ、Ｐｐ＿ＧｅＤＨ、またはＡｃ＿ＧｅＤＨを発現する酵母培養物からの酵母細胞溶解物（ＹＣＬ）を採取し、同様のタンパク質濃度に希釈した。採取に続いて、ゲラニオール及びＮＡＤ＋を基質として溶解物に供給することによって生体外反応を開始させて、シトロネラール／シトロネロール経路を確立した。ＧｅＤＨの発現の結果ではない背景活性を測定するために、空ベクターを含有するだけの細胞からＹＣＬを採取した（「空」を参照されたい）。３０℃でのインキュベーションから１分、１５分、及び９０分後、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）での抽出によって生体外反応を停止し、ゲラニアール、シトロネラール及びシトロネロールのレベルをガスクロマトグラフィー－水素炎イオン化検出器（ＧＣ－ＦＩＤ）によって分析した。全ての遺伝子は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧＥＮＥＡＲＴ（商標）ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコドン最適化バリアントとして合成されたものであった。
ＧｅＤＨを発現する細胞から採取した全てのＹＣＬは、空ベクターを発現する細胞から採取したＹＣＬよりも高いゲラニアール、シトロネラール、及びシトロネロールのシグナルを示した（「Ｘ＿ＧｅＤＨ」対「空」を比較されたい）（図５を参照されたい）。全てのＧｅＤＨ酵素がゲラニオールをゲラニアールに変換することに成功し、次いでゲラニアールが内在性活性によってシトロネラール及びシトロネロールにさらに変換された。９０分時点で、Ｒｓ＿ＧｅＤＨを発現する細胞から採取したＹＣＬにおいて、他の試料と比較したとき最も高いシトロネラール（約２．５ｍｇ／Ｌ）及び最も低いシトロネロール（約３ｍｇ／Ｌ）シグナルが検出された（図１０を参照されたい）。
実施例１４．酵母におけるＫｌ＿ＫＹＥ１及びＺｍ＿ＯＹＥによって生産された光学純度
ＥＮＲであるＫｌ＿ＫＹＥ１（配列番号７）及びＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ＿ＥＮＲ（Ｚｍ＿ＯＹＥ、配列番号９）の過剰発現を、高純度のシトロネロールにおいて生産した酵母において実行した。酵母株を、Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓゲラニル二リン酸シンターゼ（Ａｇ＿ＧＰＰＳ２）、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓゲラニアールシンターゼ（Ｃｒ＿ＧＥＳ）、及びＣａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓゲラニアールデヒドロゲナーゼ（Ｃｄ＿ＧｅＤＨ）（対照）またはＡｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｃｄ＿ＧｅＤＨ、及び、Ｃｄ＿ＧｅＤＨ、及びＺｍ＿ＯＹＥの共発現を含む、自律複製配列（ＡＲＳ）及び酵母セントロメア（ＣＥＮ）を含有するプラスミド（ＡＲＳ－ＣＥＮプラスミド）で形質転換させた。ＡＲＳ－ＣＥＮプラスミドは、構成的プロモーターの制御下にあった。２％グルコースを含む合成完全（ＳＣ）培地を培養に使用した。培養の間、培養物に１０％ｖ／ｖミリスチン酸イソプロピル二次相を補充して、当該経路の活性化によって生産される目的分子の抽出及び捕捉の一助とした。培養物を１２０時間増殖させた。
上記に列挙した全ての遺伝子は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧＥＮＥＡＲＴ（商標）ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコドン最適化バリアントとして合成されたものであった。ＩＰＭ試料をＵＰＣｓ－ＵＶによって分析した。ＩＰＭ試料をキラルＧＣによって分析して、シトロネラール及びシトロネロールの光学純度を測定した。
酵母におけるプラスミドベースのシトロネラール／シトロネラール生産経路での対照遺伝子の発現では、５ｍｇ／Ｌ未満のネロール、約２０ｍｇ／Ｌのゲラニアール、約１０ｍｇ／Ｌのネラール、及び約１００ｍｇ／Ｌのシトロネロールが産出された。Ｋｌ＿ＫＹＥ１の過剰発現では、約５ｍｇ／Ｌのネラール及び約２００ｍｇ／Ｌのｄ－シトロネロール（９７．６％ｅｅ）がもたらされた。Ｚｍ＿ＯＹＥの過剰発現でもまた、約５ｍｇ／Ｌのネラール及び約２００ｍｇ／Ｌのｌ－シトロネロール（９７％ｅｅ）が生産された（図８を参照されたい）。
実施例１５．Ｒｓ＿ＧｅＤＨは酵母溶解物においてゲラニオールからゲラニアールへの変換を触媒する
図１０に記載されるＧｅＤＨを試験して、酵母細胞溶解物においてそれらがシトロネラールからシトロネロールへの変換を触媒する傾向を調査した。Ｃｄ＿ＧｅＤＨまたはＲｓ＿ＧｅＤＨを発現する酵母培養物からの酵母細胞溶解物（ＹＣＬ）を採取し、同様のタンパク質濃度に希釈した。次いで、シトロネラール及びＮＡＤ＋を基質として溶解物に供給することによって生体外反応を開始させた。背景活性を測定するために、異種ＧｅＤＨを発現しないが空ベクターを含有するだけの細胞からＹＣＬを採取した（図６の「空」を参照されたい）。ＧｅＤＨとのインキュベーションから１０分、６０分、１８０分、及び４８０分後、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）での抽出によって生体外反応を停止した。ＭＴＢＥ試料をガスクロマトグラフィー－水素炎イオン化検出器（ＧＣ－ＦＩＤ）によって分析した。
シトロネラールからシトロネロールへの変換が全ての生体外反応で検出された（図６を参照されたい）。シトロネラールからシトロネロールへの最も高い変換レベルが、Ｃｄ＿ＧｅＤＨを発現する細胞から採取したＹＣＬで検出され、このことはシトロネラール／シトロネラール経路の最終産物の産出におけるその役割の可能性を指示する。空ベクターまたはＲｓ＿ＧｅＤＨを発現する細胞から採取したＹＣＬでは、同じシトロネラールからシトロネロールへの変換が示され（図６における「空」対「Ｒｓ＿ＧｅＤＨ」のシトロネロールを比較されたい）、このことはＲｓ＿ＧｅＤＨがシトロネラールをシトロネロールに変換しないことを指示する（図１１を参照されたい）。
実施例１６．ＥＮＲ活性によるｄ－シトロネラール及びｌ－シトロネラールの基質媒介性変換
２つの異なるＥＮＲであるＫｌ＿ＫＹＥ１（配列番号２１）及びＺｍ＿ＯＹＥ（配列番号９）の基質特異性の生体外試験により、シトロネラール／シトロネロール経路産物が産出された（図９を参照されたい）。Ｋｌ＿ＫＹＥ１及びＺｍ＿ＯＹＥをＥ．ｃｏｌｉから過剰発現させ、ＧＳＴ融合物として精製した。次いで、タンパク質をシトラール（ネラール：ゲラニアール約５０：５０）と共に３０℃、生体外で、ＮＡＤＰＨ再生系（２０ｍＭトリス／ＨＣＬ［ｐＨ７．５］、０．２ｍｇ／ｍＬ ＧＳＴ－融合物、１ｍＭ ＮＡＤＰ＋、２０ｍＭ Ｇ６Ｐ及び１０μｇ／ｍＬ ＧＤＨ及び５ｍＭシトラール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含めて、指示される時間枠（０、２、または２０時間）にわたってインキュベートした。反応物をヘキサンで抽出し、ＵＰＣ２－ＵＶで分析して反応産物を検出した。
Ｋｌ＿ＫＹＥ１単独とのシトラール（５０％ゲラニアール：５０％ネラール）の生体外インキュベーションでは、約５０％のゲラニアール及び約５０％のネラールが産出された一方で、Ｋｌ＿ＫＹＥ１過剰発現との２０時間のシトラールインキュベーションでは、約３０％のゲラニアール、約５０％のネラール、及び約２０％のシトロネラールが産出された。主として、ゲラニアール成分は、Ｋｌ＿ＫＹＥが発現される場合にシトロネラールに変換される。対照条件下では（Ｋｌ＿ＫＹＥ１を含まない）、シトラールインキュベーションなしで、約５０％のゲラニアール、及び約５０％のネラールが生産され、シトラールインキュベーションの２０時間後、約４５％のゲラニアールが生産され、約５５％のネラールが生産された。Ｋｌ＿ＫＹＥを含まない対照反応では大部分が変化なしであった。
Ｚｍ＿ＯＹＥ単独とのシトラール（５０％ゲラニアール：５０％ネラール）の生体外インキュベーションでは、約５０％のゲラニアール、約４０％のネラール、及び約１０％のシトロネラールが産出された一方で、２時間のインキュベーションでは、約４５％のゲラニアール、約１０％のネラール、及び約４５％のシトロネラールが産出された。主として、ネラール成分は、シトロネラールに変換される。対照条件下では（Ｚｍ＿ＯＹＥを含まない）、シトラールインキュベーションなし、及び２時間のシトラールインキュベーション後で、約５０％のゲラニアール、約４５％のネラール、及び約５％のシトロネラールが産出された。Ｚｍ＿ＯＹＥを含まない対照反応では大部分が変化なしであった。
実施例１７．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＩＰＰ＋ＤＭＡＰＰ生産のためのｐＭｅｖプラスミドの設計
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの発現のためのメバロン酸プラスミドを構築した。７つの遺伝子（Ｅｃ＿ａｔｏＢ（配列番号１０）、Ｓａ＿ｍｖａＳ（配列番号１１）、Ｓａ＿ｍｖａＡ（配列番号１２）、Ｓｃ＿Ｅｒｇ１２（配列番号１３）、Ｓｃ＿ｅｒｇ８（配列番号１４）、Ｓｃ＿ｅｒｇ１９（配列番号１５）、及びＥｃ＿ｉｄｉ（配列番号１６））を２つのオペロン上に細分した。最初の３つの遺伝子を１つのプロモーター下に置き、最後の４つの遺伝子をもう１つのプロモーター下に置いた。各オペロンは転写ターミネーターを含有するように改変した。これら７つの遺伝子は、ＬａｃＩタンパク質及びカナマイシン選択マーカーをコードするｐ１５ベースの複製プラスミド骨格に位置付けられる。Ｅｃ＿ｉｄｉを除く全ての遺伝子が異種であり、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧＥＮＥＡＲＴ（商標）ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉコドン最適化バリアントとして合成されたものであった（図１２を参照されたい）。Ｅｃ＿ａｔｏＢは、Ｅ．ｃｏｌｉ野生型宿主の内在性遺伝子をＥ．ｃｏｌｉのためにコドン最適化することによって生産された組換え遺伝子であり（野生型遺伝子は、それがＥ．ｃｏｌｉにおける発現に好ましいコドンを広く使用していなかったため修飾された）、Ｅ．ｃｏｌｉのためのコドン最適化バリアントを提供するようにＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧＥＮＥＡＲＴ（商標）ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成されたものであった。
実施例１８．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるシトロネラール／シトロネロール生産のためのｐＣｉｔｒｏプラスミドの設計
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＩＰＰ及びＤＭＡＰＰからのシトロネラール生産のための遺伝子を含むプラスミドを構築した。Ａｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｋｌ＿ＫＹＥ１、及びＣｄ＿ＧｅＤＨ（代替的には本明細書全体を通して開示される別のＧＰＰＳ、ＧＥＳ、ＧｅＤＨ、またはＥＮＲ遺伝子）によってコードされる４つのタンパク質（ゲラニル二リン酸シンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、エンレダクターゼ及びゲラニオールデヒドロゲナーゼ）を２つのオペロン上に細分した。最初の３つの遺伝子は１つのプロモーターの制御下にあり、最後の遺伝子は、もう１つのプロモーターの制御下にあった。これら４つの遺伝子は、アンピシリン選択マーカーをコードするｐＢＲ３２２ベースの複製プラスミド骨格上に位置付けた。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのためにコドン最適化されたＲｓ＿ＧｅＤＨを除いて、全ての遺伝子は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧＥＮＥＡＲＴ（商標）ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、Ｅ．ｃｏｌｉコドン最適化バリアントとして合成されたものであった（図１３を参照されたい）。
実施例１９．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドに基づくシトロネラール／シトロネロール経路の確立
図１２及び１３からのプラスミド構築物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてシトロネラール／シトロネロール経路を確立した。Ｒｓ＿ＧｅＤＨと比較してのＣｄ＿ＧｅＤＨの活性によるシトロネラール／シトロネラール経路の開始を試験するために比較研究を行った。
プラスミドｐＭｅｖは、アセチル－ＣｏＡからＩＰＰ及びＤＭＡＰＰへの変換に関与する７つのタンパク質（Ｅｃ＿ａｔｏＢ、Ｓａ＿ｍｖａＳ、Ｓａ＿ｍｖａＡ、Ｓｃ＿Ｍｋ、Ｓｃ＿ｅｒｇ８、Ｓｃ＿ｅｒｇ１９、及びＥｃ＿ｉｄｉ）をコードし、プラスミドｐＣｉｔｒｏは、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをシトロネラール／シトロネロール経路産物に変換する４つのタンパク質（Ａｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｋｌ＿ＫＹＥ１及びＲｓ＿ＧｅＤＨまたはＣｄ＿ＧｅＤＨ）をコードするものであった。培養物を、１％グルコースを含有するＬＢ培地中で４０時間増殖させた。培養物に１０％ＩＰＭ二次相を補充して、当該経路の中間体の抽出及び捕捉の一助とした。ＩＰＭ試料をＵｌｔｒａＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＵＰＣ２－ＵＶ）（３連）によって３連で分析した。ＩＰＭ試料をキラルＧＣによって分析して、シトロネラール及びシトロネロールの光学純度（鏡像異性体過剰率、ｅｅ％）を測定した。
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐＭｅｖ及びｐＣｉｔｒｏ（Ｃｄ＿ＧｅＤＨ）またはｐＣｉｔｒｏ（Ｒｓ＿ＧｅＤＨ）のいずれかの共発現では、シトロネラール／シトロネロール中間体及びシトロネロールの生産がもたらされた。約２５ｍｇ／Ｌのゲラニアール、約５ｍｇ／Ｌのネロール、約３５０ｍｇ／Ｌのｄ－シトロネロール（９４％ｅｅ）、及び約４０ｍｇ／Ｌのｄ－シトロネラール（９３．４％ｅｅ）がｐＭＥＶ及びｐＣｉｔｒｏ（Ｃｄ＿ＧｅＤＨ＋Ｋｌ＿ＫＹＥ１）の共発現で生産された。Ｃｄ＿ＧｅＤＨをＲｓ＿ＧｅＤＨと置き換えた場合、約７５ｍｇ／Ｌのゲラニオール、約２５ｍｇ／Ｌのゲラニアール、約５ｍｇ／Ｌのネロール、約４０ｍｇ／Ｌのｄ－シトロネロール（９５％ｅｅ）、及び約３００ｍｇ／Ｌのｄ－シトロネラール（９４．２％ｅｅ）（図１４を参照されたい）。
実施例２０．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドに基づくＺｍ＿ＯＹＥによるシトロネラール／シトロネロール経路
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドに基づくＺｍ＿ＯＹＥの過剰発現によるシトロネラール／シトロネロール経路生産の決定。
プラスミドｐＭｅｖは、アセチル－ＣｏＡをＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに変換する７つの遺伝子（Ｅｃ＿ａｔｏＢ、Ｓａ＿ｍｖａＳ、Ｓａ＿ｍｖａＡ、Ｓｃ＿ＭＫ、Ｓｃ＿ｅｒｇ８、Ｓｃ＿ｅｒｇ１９、及びＥｃ＿ｉｄｉ）をコードし、プラスミドｐＣｉｔｒｏは、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをシトロネラール／シトロネロールに変換する４つの遺伝子、Ａｇ＿ＧＰＰＳ２、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｚｍ＿ＯＹＥ）及びＣｄ＿ＧｅＤＨをコードする。培養物を、１％グルコースを含有するＬＢ培地中で４０時間増殖させ、１０％ＩＰＭ二次相を補充して、当該経路の中間体及び最終産物の抽出及び捕捉の一助とした。全ての経路産物をＵＰＣ２－ＵＶによって３連で分析した。ＩＰＭ試料をキラルＧＣによって分析して、シトロネラール及びシトロネロールの光学純度（鏡像異性体過剰率（ｅｅ％））を測定した。プラスミドｐＭｅｖ及びｐＣｉｔｒｏ（Ｃｄ＿ＧｅＤＨ＋Ｚｍ＿ＯＹＥ）の共発現により、約１７５ｍｇ／Ｌのｌ－シトロネロール（９９．６％ｅｅ）及び約１５０ｍｇ／Ｌのｌ－シトロネラール（９９．４％ｅｅ）の生産がもたらされた（図１５を参照されたい）。
実施例２１．シトロネラール／シトロネロール経路が組み込まれた酵母におけるシトロネラール蓄積を改善するための内在性酵母遺伝子の欠失
シトロネラールをシトロネロールに変換する酵母株において、この酵母における当該経路によって生産されるシトロネラール及びシトロネロールの量を制御するために、アルデヒドレダクターゼ（ＡＲ）活性に直接的または間接的に関与する内在性酵母遺伝子を欠失させた。この手法により、酵母において生産されるシトロネラールの化学純度の増加をもたらすことができる。
亢進したＩＰＰ及びＤＭＡＰＰレベルを有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母株（ＥＲＧ２０の転写の下方調節によって引き起こされた）を、構成的プロモーターの制御下でのシトロネラール／シトロネロール経路発現カセットＡｇ＿ＧＰＰＳ、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｃｄ＿ＧｅＤＨ、Ｋｌ＿ＫＹＥ１の組込みに使用した（全ての遺伝子はＧＥＮＥＡＲＴ（商標）を使用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化されたものであり、発現カセットを相同組換えによって酵母ゲノムに組み込んだ）。次の酵母遺伝子：ＡＤＨ６、ＲＦＸ１、ＧＲＥ２、ＡＲＩ１、ＧＣＹ１及びＡＹＲ１の組み合わせの欠失により、シトロネラール蓄積の増加をもたらした。酵母株を、２％グルコースを含む合成完全（ＳＣ）培地中で９６時間増殖させ、培養の間、１０％ｖ／ｖミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ）二次相を補充して、目的のシトロネラール／シトロネロール経路分子の抽出及び捕捉を促進した。ＩＰＭ試料をＵＰＣ２－ＵＶ及びキラルＧＣによって分析した（図１６ａを参照されたい）。
図１６ａに示されるように、ＡＤＨ６、ＲＦＸ１、ＧＲＥ２、及びＡＲＩ１の欠失では、ＡＤＨ６及びＲＦＸ１のみの欠失によるわずか１０ｍｇ／Ｌと比較して、約９０ｍｇ／Ｌのシトロネラールの蓄積がもたらされた（シトロネラール蓄積の約９倍の改善を反映する）。ＡＤＨ６、ＲＦＸ１、ＧＲＥ２、ＡＲＩ１、ＧＣＹ１及びＡＹＲ１の欠失では、ＡＤＨ６及びＲＦＸ１のみの欠失によるわずか１０ｍｇ／Ｌと比較して、約１００ｍｇ／Ｌのシトロネラールの蓄積がもたらされた（シトロネラール蓄積の約１０倍の改善を反映する）。
実施例２２．ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子の発現による酵母におけるシトロネラールの化学純度の改善
シトロネラール／シトロネロール経路を含む酵母株における異種ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子の発現は、シトロネロール形成を低減する。ＮＡＤＨオキシダーゼは、ＮＡＤＨをＮＡＤ＋に変換し、こうして酵母株におけるＮＡＤＨレベルを低下させる。ＮＡＤＨレベルがより低いと、アルデヒドレダクターゼ（ＡＲ）の酵素活性の低減につながり、ひいては酵母におけるシトロネラールからシトロネロールへの変換がより少なくなる。この手法により、シトロネロール蓄積を低減することによって酵母において生産されるシトロネラールの化学純度を増加させることができる。
亢進したＩＰＰ及びＤＭＡＰＰレベルを有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母株（ＥＲＧ２０の転写の下方調節によって引き起こされた）を、構成的プロモーターの制御下でのシトロネラール／シトロネロール経路発現カセットＡｇ＿ＧＰＰＳ、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｒｓ＿ＧｅＤＨ、Ｋｌ＿ＫＹＥ１の組込みに使用した（全ての遺伝子はＧＥＮＥＡＲＴ（商標）を使用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化されたものであり、発現カセットを相同組換えによって酵母ゲノムに組み込んだ）。Ｓｐ＿ＮＡＤＨｏｘｉ（配列番号６９）の発現により、シトロネロールの蓄積の低減及びシトロネラールの化学純度の増加がもたらされた。酵母株を、２％グルコースを含む合成完全（ＳＣ）培地中で９６時間増殖させ、培養の間、１０％ｖ／ｖミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ）二次相を補充して、目的のシトロネラール／シトロネロール経路分子の抽出及び捕捉を促進した。ＩＰＭ試料をＵＰＣ２－ＵＶ及びキラルＧＣによって分析した（図１７を参照されたい）。この実施例では、酵母におけるシトロネラールからシトロネロールへの変換を低減する異種ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子を同定し、シトロネラール／シトロネロール経路を含む酵母株における異種ＮＡＤＨオキシダーゼ遺伝子の発現がシトロネロール蓄積を低減し、シトロネラール／シトロネロール経路によって生産されるシトロネラールの化学純度を増加させ得ることを実証する。
図１７に示されるように、ＡＤＨ６、ＲＦＸ１、ＧＲＥ２、及びＡＲＩ１の欠失を含む酵母における異種ＮＡＤＨオキシダーゼの構成的発現では、ＡＤＨ６、ＲＦＸ１、ＧＲＥ２、及びＡＲＩ１の欠失のみを含み、約１００ｍｇ／Ｌのシトロネラール、及び約１５０ｍｇ／Ｌのシトロネロールとそれに加えて約５０ｍｇ／Ｌのシトロネル酸（シトロネラール対シトロネロール＋シトロネル酸の約０．５：１の比）を蓄積した酵母と比較して、約７０ｍｇ／Ｌのシトロネラール及び３０ｍｇ／Ｌのシトロネロール（シトロネラール対シトロネロールの約２．３：１の比）の蓄積がもたらされた。故に、ＡＤＨ６、ＲＦＸ１、ＧＲＥ２、及びＡＲＩ１の欠失を有する酵母における異種ＮＡＤＨオキシダーゼの構成的発現により、シトロネラールの化学純度の約４．５倍の改善がもたらされた。
実施例２３．ホスホパンテテイントランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）遺伝子と共にしたカルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）遺伝子の発現による酵母におけるシトロネラールの化学純度の改善
シトロネラール／シトロネロール経路を含む酵母株における、異種ホスホパンテテイントランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）遺伝子と共にした異種カルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）遺伝子の発現は、シトロネル酸蓄積を低減する。シトロネラール／シトロネロール経路を有する酵母における、ホスホパンテテイントランスフェラーゼ遺伝子と共にしたカルボン酸遺伝子の発現は、カルボン酸形成を阻止し得る。ＣＡＲ遺伝子及びＰＰＴａｓｅ遺伝子の発現は、酵母においてアルデヒドレダクターゼ（ＡＲ）活性を支持する遺伝子を欠失させた際にシトロネラールが蓄積するときに、シトロネラールがシトロネル酸に変換されるのを阻止する。故に、この手法を酵母におけるシトロネラールの化学純度を増加させる手段として使用することができる。
亢進したＩＰＰ及びＤＭＡＰＰレベルを有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母株（ＥＲＧ２０の転写の下方調節によって引き起こされた）を、構成的プロモーターの制御下でのシトロネラール／シトロネロール経路発現カセットＡｇ＿ＧＰＰＳ、Ｃｒ＿ＧＥＳ、Ｒｓ＿ＧｅＤＨ、Ｋｌ＿ＫＹＥ１の組込みに使用した（全ての遺伝子はＧＥＮＥＡＲＴ（商標）を使用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化されたものであり、発現カセットを相同組換えによって酵母ゲノムに組み込んだ）。Ｍｍ＿ＣＡＲ（配列番号７０）及びＢｓ＿ＳＦＰ（配列番号７１）の発現により、シトロネロールの蓄積の低減及びシトロネラールの化学純度の増加がもたらされた。酵母株を、２％グルコースを含む合成完全（ＳＣ）培地中で９６時間増殖させ、培養の間、１０％ｖ／ｖミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ）二次相を補充して、目的のシトロネラール／シトロネロール経路分子の抽出及び捕捉を促進した。ＩＰＭ試料をＵＰＣ２－ＵＶ及びキラルＧＣによって分析した（図１８を参照されたい）。この実施例では、酵母におけるシトロネル酸形成を阻止する異種ＣＡＲ遺伝子を同定し、シトロネラール／シトロネロール経路を含む酵母株におけるＰＰＴａｓｅ遺伝子と共にした異種ＣＡＲ遺伝子の発現がシトロネル酸を阻止し、酵母におけるシトロネラール／シトロネロール経路によって生産されるシトロネラールの化学純度を増加させ得ることを実証する。
図１８に示されるように、ＡＤＨ６、ＲＦＸ１、ＧＲＥ２、ＡＲＩ１、ＧＣＹ１及びＡＹＲ１の欠失を含む酵母株における、異種ホスホパンテテイントランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）遺伝子と共にした異種カルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）遺伝子の発現は、生産されるシトロネラールの化学純度を約１．８倍増加させ得る（対照におけるシトロネラール対シトロネロール約１．８：１の比と比較してシトロネラール対シトロネロールの約１：１の比）。
実施例２４．酵母における代替的な経路を介したシトロネラール／シトロネロール経路生産
プラスミドに基づくシトロネラール／シトロネロール経路を確立する異種遺伝子の生体内発現を、ＥＲＧ２０の転写の下方調節によって引き起こされた、亢進したイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリピロリン酸（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＤＭＡＰＰ）レベルを有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を使用して酵母において試験した。酵母株を、構成的プロモーターを使用して、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ菌種ゲラニアールデヒドロゲナーゼ（Ｒｓ＿ＧｅＤＨ、配列番号２）またはＣａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ ｄｅｆｒａｇｒａｎｓ＿ゲラニアールデヒドロゲナーゼ（Ｃｄ＿ＧｅＤＨ、配列番号１）及び／またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ＿黄色酵素（Ｋｌ＿ＫＹＥ１、配列番号７）を発現するプラスミドでさらに形質転換させて、シトロネラール／シトロネロール経路を確立した。上記に列挙した全ての遺伝子は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧＥＮＥＡＲＴ（商標）ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコドン最適化バリアントとして合成されたものであった。２％グルコースを含み、ＩＰＭ中２５０ｍｇ／Ｌのネロールを補充した合成完全（ＳＣ）培地を培養に使用した。培養の間、培養物に１０％ｖ／ｖミリスチン酸イソプロピル二次相もまた補充して、該経路の活性化によって生産される目的分子の抽出及び捕捉の一助とした。培養物を９６時間増殖させ、ＩＰＭ試料をＵＰＣｓ－ＵＶによって分析した。
Ｎｅ／ＧｅＤＨ活性及びエンレダクターゼ活性を有する異種遺伝子を発現する酵母にネロールを供給することにより、ネラール、ｄ－及びｌ－シトロネラールならびにｄ－及びｌ－シトロネロールの生産がもたらされる。ゲラニオールデヒドロゲナーゼＣｄ＿ＧｅＤＨ（またはＲｓ＿ＧｅＤＨまたはその他）を含有する株において、ネロールは、ネラールに、次いでシトロネラールを介してシトロネロールに変換される（ＡＤＨ背景活性によってシトロネロールに変換されることになる）。ゲラニオールデヒドロゲナーゼ及びエンレダクターゼＫｌ＿ＫＹＥの両方を含有する株においては、全てのネロールが、シトロネラールを介してシトロネロールに変換される（ＡＤＨ背景活性によってシトロネロールに変換されることになる）。この手法は、ネロールが、Ｎｅ／ＧｅＤＨ及びエン－レダクターゼ活性を有する異種遺伝子によってシトロネラール及びシトロネロールに変換され得ることを示し、この手法を上記の実施例７に記載される主要経路の代替手段として使用して、ｄ－及びｌ－シトロネラール、ｄ－及びｌ－シトロネロールを生産することができる（図１９を参照されたい）。図１９に示されるように、約１１５ｍｇ／Ｌのシトロネロール及び約２２０ｍｇ／Ｌのシトロネロールが、ネロールを供給した、Ｎｅ／ＧｅＤＨ活性及びエンレダクターゼを有する異種遺伝子を発現する酵母において生産された。
実施例２５．酵母における代替的な経路を介したシトロネラール／シトロネロール経路生産
プラスミドに基づくシトロネラール／シトロネロール経路を確立する異種遺伝子の生体内発現を、ＥＲＧ２０の転写の下方調節によって引き起こされた、亢進したイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリピロリン酸（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌｌｙ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＤＭＡＰＰ）レベルを有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を使用して酵母において試験した。酵母株を、構成的プロモーターの制御下で、イリドイドシンターゼ（Ｏｅ＿ＩＳＹ）（配列番号５４）及び／またはエンレダクターゼ（Ｋｌ＿ＫＹＥ１、配列番号７）を発現するプラスミドで形質転換させた。上記に列挙した全ての遺伝子は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧＥＮＥＡＲＴ（商標）ＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコドン最適化バリアントとして合成されたものであった。２％グルコースを含み、ＩＰＭ中２００ｍｇ／Ｌのゲラニオールまたは２５０ｍｇ／Ｌのネロールを補充した合成完全（ＳＣ－Ｈｉｓ）培地を培養に使用した。培養の間、培養物に１０％ｖ／ｖミリスチン酸イソプロピル二次相もまた補充して、該経路の活性化によって生産される目的分子の抽出及び捕捉の一助とした。培養物を９６時間増殖させ、ＩＰＭ試料をＵＰＣｓ－ＵＶによって分析した。
エンレダクターゼ活性（ＥＮＲまたはイリドイドシンターゼＩＳＹ）を有する異種遺伝子を発現する酵母にゲラニオールまたはネロールを供給することにより、それぞれｄ－及びｌ－シトロネロールへの直接変換がもたらされる。Ｏｅ＿ＩＳＹを含有する株において、ゲラニオール及びネロールはシトロネロールに変換される。この手法は、ゲラニオール及びネロールが異種イリドイドシンターゼ遺伝子によってシトロネロールに変換され得ることを示す。この手法を上記の実施例７に記載される主要経路の代替手段として使用して、ｄ－及びｌ－シトロネラール、ならびにｄ－及びｌ－シトロネロールを生産することができる（図２０ａ及び図２０ｂを参照されたい）。図２０ａに示されるように、約９０ｍｇ／Ｌのシトロネロールが、ゲラニオールを供給した、イリドイドシンターゼ活性を有する異種遺伝子を発現する酵母において生産された（対照における約１０ｍｇ／Ｌと比較して、約９倍の改善を表す）。図２０ｂに示されるように、約６０ｍｇ／Ｌのシトロネロールが、ネロールを供給した、イリドイドシンターゼ活性を有する異種遺伝子を発現する酵母において生産された（対照における検出不能量のシトロネロールと比較して、少なくとも約６０倍の改善を表す）。
実施例２６．酸化細菌によるシトロネロールからシトロネラールへの生物変換
組換え微生物（「ＮＣＣＢ由来の株」）によって生産されるシトロネロールを酸化細菌Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓまたはＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓに接触させて、シトロネロールからシトロネラールへの生物変換を行った。酸化細菌を、２．５％グリセロール、０．５％酵母抽出、及び０．３％ペプトンを含むグリセロール培地中で培養した。培養物を採取し、５０ｍＭアセテートまたはリン酸緩衝液（ｐＨ５または６．５）に再懸濁させ、０．５ｇ／Ｌシトロネロールを含有する１０％ｖ／ｖミリスチン酸イソプロピル二次相を補充して、基質及び産物シトロネラールまたはシトロネル酸の毒性を減少させた（場合によっては、２．５％グリセロールを生物変換試料に添加した）。生物変換を２４～１４４時間行った。ＩＰＭ試料をＵＰＣｓ－ＵＶによって分析して、産物を検出した。
この実施例は、酸化細菌Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ及びＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓの酸化活性が、組換え微生物によって生産されるシトロネロールをシトロネラールまたはシトロネル酸へと変換することを特定し、シトロネロールからシトロネラールへの生物変換の手法を実証する。酸化細菌Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓは、１４４時間後に約１００ｍｇ／Ｌのシトロネラール、及び約２００ｍｇ／Ｌのシトロネル酸を生産した（図２１ａを参照されたい）。酸化細菌Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓは、１４４時間後に約５０ｍｇ／Ｌのシトロネラール、及び約３００ｍｇ／Ｌのシトロネル酸を生産した（図２１ｂを参照されたい）。
実施例２７．酸化細菌によるシトロネラールからシトロネル酸への生物変換
組換え微生物（「ＮＣＣＢ由来の株」）によって生産されるシトロネラールを酸化細菌Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓに接触させて、シトロネラールからシトロネル酸への生物変換を行った。酸化細菌を、２．５％グリセロール、０．５％酵母抽出、及び０．３％ペプトンを含むグリセロール培地中で培養した。培養物を採取し、５０ｍＭアセテート（ｐＨ５）に再懸濁させ、０．５ｇ／Ｌシトロネラールを含有する１０％ｖ／ｖミリスチン酸イソプロピル二次相を補充して、基質及び産物の毒性を減少させた。生物変換を１４４時間行った。ＩＰＭ試料をＵＰＣｓ－ＵＶによって分析して、産物を検出した。
この実施例は、酸化細菌Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓの酸化活性が、組換え微生物によって生産されるシトロネラールをシトロネル酸へと変換することを特定し、シトロネラールからシトロネル酸への生物変換の手法を実証する。酸化細菌Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓは、１４４時間後に１００％のシトロネラールをシトロネル酸へと変換した（図２２を参照されたい）。
実施例２８．酸化細菌によるシトロネロールからシトロネル酸への生物変換
組換え微生物（「ＮＣＣＢ由来の株」）によって生産されるシトロネロールを酸化細菌Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓまたはＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉに接触させて、シトロネロールからシトロネル酸への生物変換を行った。酸化細菌を、２．５％グリセロール、０．５％酵母抽出、及び０．３％ペプトンを含むグリセロール培地中で培養した。培養物を採取し、５０ｍＭアセテート（ｐＨ５）に再懸濁させ、０．５ｇ／Ｌシトロネロールを含有する１０％ｖ／ｖミリスチン酸イソプロピル二次相を補充して、基質及び産物の毒性を減少させた。生物変換を１４４時間行った。ＩＰＭ試料をＵＰＣｓ－ＵＶによって分析して、産物を検出した。
この実施例は、酸化細菌Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓまたはＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉの酸化活性が、組換え微生物によって生産されるシトロネロールをシトロネル酸へと変換することを特定し、シトロネロールからシトロネル酸への生物変換の手法を実証する。酸化細菌Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓまたはＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉは、１４４時間後に１００％のシトロネロールをシトロネル酸へと変換した（図２３を参照されたい）。
表１．配列表の手引き
Figure 0007105783000001
Figure 0007105783000002
Figure 0007105783000003
Figure 0007105783000004
Figure 0007105783000005
Figure 0007105783000006
Figure 0007105783000007
 表２．本明細書に開示される配列
Figure 0007105783000008
Figure 0007105783000009
Figure 0007105783000010
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Figure 0007105783000014
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Claims (23)

  1. シトロネラール及び／またはシトロネロールを生産可能な組換え宿主細胞であって、
    （ａ）ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子またはネリル二リン酸シンターゼ（ＮＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
    （ｂ）ゲラニオールシンターゼ（ＧＥＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子またはネリルシンターゼ（ＮＥＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、を含み、
    前記組換え宿主細胞が、イリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）ポリペプチドをコードする遺伝子またはエノエートレダクターゼ（ＥＮＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含み、前記イリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）ポリペプチドをコードする遺伝子または前記エノエートレダクターゼ（ＥＮＲ）ポリペプチドをコードする遺伝子のうちの少なくとも１つが組換え遺伝子であり、
    前記組換え宿主細胞が、細菌細胞または酵母細胞であり、
    前記酵母が、
    （ａ）ＡＤＨ６、ＲＦＸ１、ＧＲＥ２、ＡＲＩ１、ＧＣＹ１、及びＡＹＲ１の欠失、または
    （ｂ）ＡＤＨ６、ＲＦＸ１、ＧＲＥ２、及びＡＲＩ１の欠失を含む、
    前記組換え宿主細胞。
  2. シトロネラール、シトロネロール、またはシトロネル酸を生産可能な組換え宿主細胞であって、
    （ａ）ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子またはネリル二リン酸シンターゼ（ＮＰＰＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、
    （ｂ）ゲラニオールシンターゼ（ＧＥＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子またはネリルシンターゼ（ＮＥＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子と、を含み、
    前記組換え宿主細胞が、イリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）ポリペプチドをコードする遺伝子及びシトロネラール／シトロネロールデヒドロゲナーゼ（ＣｉＤＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含み、前記イリドイドシンターゼ（ＩＳＹ）ポリペプチドをコードする遺伝子及び前記シトロネラール／シトロネロールデヒドロゲナーゼ（ＣｉＤＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子のうちの少なくとも１つが組換え遺伝子であり、前記組換え宿主細胞が細菌細胞または酵母細胞であり、
    前記酵母が、ＡＤＨ６、ＲＦＸ１、ＧＲＥ２、ＡＲＩ１、ＧＣＹ１、及びＡＹＲ１のうちの１つ以上の欠失をさらに含む、
    前記組換え宿主細胞。
  3. （ａ）前記ＧＰＰＳポリペプチドが、配列番号１７、５９～６２、８７、または８８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
    （ｂ）前記ＮＰＰＳポリペプチドが、配列番号５３、７４、または７５のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
    （ｃ）前記ＧＥＳポリペプチドが、配列番号１８または６３～６６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
    （ｄ）前記ＮＥＳポリペプチドが、配列番号５６～５８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
    （ｅ）前記ＩＳＹポリペプチドが、配列番号５４または５５のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
    （ｆ）前記ＥＮＲポリペプチドが、配列番号７～９、２１、２２、３３、３４、３７、４４～４８、５４、５５、または６７のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
    請求項１に記載の組換え宿主細胞。
  4. （ａ）前記ＧＰＰＳポリペプチドが、配列番号１７、５９～６２、８７、または８８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
    （ｂ）前記ＮＰＰＳポリペプチドが、配列番号５３、７４、または７５のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
    （ｃ）前記ＧＥＳポリペプチドが、配列番号１８または６３～６６のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
    （ｄ）前記ＮＥＳポリペプチドが、配列番号５６～５８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
    （ｅ）前記ＩＳＹポリペプチドが、配列番号５４または５５のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み、
    （ｆ）前記ＣｉＤＨポリペプチドが、配列番号４９～５２のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載の組換え宿主細胞。
  5. 前記シトロネラールが、ｄ－シトロネラール、ｌ－シトロネラール、またはそれらの組み合わせである、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  6. 前記シトロネロールが、ｄ－シトロネロール、ｌ－シトロネロール、またはそれらの組み合わせである、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  7. 前記細菌細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細胞、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ細胞、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  8. 前記酵母が、
    （ａ）ＡＤＨ６、ＲＦＸ１、ＧＲＥ２、ＡＲＩ１、ＧＣＹ１、及びＡＹＲ１の欠失、または
    （ｂ）ＡＤＨ６、ＲＦＸ１、ＧＲＥ２、及びＡＲＩ１の欠失を含む、請求項２または４に記載の組換え宿主細胞。
  9. 前記組換え宿主細胞が、異種ＮＡＤＨオキシダーゼポリペプチドをコードする遺伝子をさらに含む酵母細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  10. 前記異種ＮＡＤＨオキシダーゼポリペプチドが、配列番号６９に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項９に記載の組換え宿主細胞。
  11. 前記異種ＮＡＤＨオキシダーゼポリペプチドが、配列番号６９に記載されるアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の組換え宿主細胞。
  12. 前記組換え宿主細胞が、カルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードする異種遺伝子をさらに含む酵母細胞である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  13. 前記ＣＡＲポリペプチドが、配列番号７０に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１２に記載の組換え宿主細胞。
  14. 前記ＣＡＲポリペプチドが、配列番号７０に記載されるアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の組換え宿主細胞。
  15. 前記組換え酵母細胞が、ホスホパネイン（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｅｉｎｅ）トランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）ポリペプチドをコードする異種遺伝子をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  16. 前記ＰＰＴａｓｅポリペプチドが、配列番号７１に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１５に記載の組換え宿主細胞。
  17. 前記ＰＰＴａｓｅポリペプチドが、配列番号７１に記載されるアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の組換え宿主細胞。
  18. 前記酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  19. 前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞が、野生型よりも低いファルネシルピロリン酸シンターゼ活性をもたらすように転写的に下方調節または変異されているファルネシルピロリン酸シンターゼ（ＥＲＧ２０）遺伝子を含有する、請求項１８に記載の組換え宿主細胞。
  20. シトロネラール、またはシトロネロールの生産方法であって、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を細胞培養液中、前記遺伝子が発現される条件下で増殖させることを含み、前記シトロネラール、またはシトロネロールが前記組換え宿主細胞によって生産される、前記方法。
  21. 前記組換え宿主細胞が、前記ＧＰＰＳポリペプチドをコードする遺伝子もしくは前記ＮＰＰＳポリペプチドをコードする遺伝子、前記ＧＥＳポリペプチドをコードする遺伝子もしくは前記ＮＥＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＧｅＤＨ（ゲラニオールデヒドロゲナーゼ）ポリペプチドをコードする遺伝子もしくはＮｅＤＨ（ネロールデヒドロゲナーゼ）ポリペプチドをコードする遺伝子、前記ＩＳＹポリペプチドをコードする遺伝子、及び／または前記ＣｉＤＨポリペプチドをコードする遺伝子をコードする遺伝子を含む、１つ以上のプラスミドで形質転換され、前記遺伝子のうちの少なくとも１つが組換え遺伝子である、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記組換え宿主細胞が、前記ＧＰＰＳポリペプチドをコードする遺伝子もしくは前記ＮＰＰＳポリペプチドをコードする遺伝子、前記ＧＥＳポリペプチドをコードする遺伝子もしくは前記ＮＥＳポリペプチドをコードする遺伝子、ＧｅＤＨ（ゲラニオールデヒドロゲナーゼ）ポリペプチドをコードする遺伝子もしくはＮｅＤＨ（ネロールデヒドロゲナーゼ）ポリペプチドをコードする遺伝子、前記ＩＳＹポリペプチドをコードする遺伝子、及び／または前記ＣｉＤＨポリペプチドをコードする遺伝子をコードする遺伝子で形質転換され、前記遺伝子のうちの少なくとも１つが組換え遺伝子である、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記組換え遺伝子のうちの少なくとも１つが前記宿主細胞ゲノム内に組み込まれる、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
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