KR20210068662A

KR20210068662A - 신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소 및 이를 이용한 (-)-알파 비사볼올 생산 방법

Info

Publication number: KR20210068662A
Application number: KR1020190157935A
Authority: KR
Inventors: 이대희; 이승구; 김성근; 김수정; 우승균
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2019-12-02
Filing date: 2019-12-02
Publication date: 2021-06-10
Also published as: KR102343992B1

Abstract

본 발명은 신규 (-)-알파-비사볼올(bisabolol) 합성효소 및 이를 이용한 (-)-알파-비사볼올 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 상기 효소를 포함하는 비사볼올 합성용 조성물; 상기 효소를 처리하는 단계를 포함하는 비사볼올 제조방법; 및 상기 효소를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 비사볼올 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소 및 이를 이용한 (-)-알파 비사볼올 생산방법은, 기존 합성효소에 비해 (-)-알파 비사볼올 합성량이 증가되는 효과가 있다.

Description

신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소 및 이를 이용한 (-)-알파 비사볼올 생산 방법 {Novel (-)-alpha-bisabolol synthase and a method for producing (-)-alpha-bisabolol using the same}

본 발명은 신규 (-)-알파-비사볼올(bisabolol) 합성효소 및 이를 이용한 (-)-알파-비사볼올 생산 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 상기 효소를 포함하는 비사볼올 합성용 조성물; 상기 효소를 처리하는 단계를 포함하는 비사볼올 제조방법; 및 상기 효소를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 비사볼올 제조방법에 관한 것이다.

아티초크(Cynara cardunculus var. scolymus)는 국화과에 속하는 엉겅퀴처럼 생긴 다년생 화초이며 거인의 엉겅퀴라 할만큼 엉겅퀴를 담은 거대한 꽃이 특징인 허브이다. 고대 그리스나 로마시대부터 재배하여 식용으로 이용했다고 전해진다. 지중해 연안이 원산지이며, 바닷가 근처에서 자란다. 줄기는 높이가 1.5~2m이고 잎은 어긋나고 깃 모양으로 깊이 갈라진다. 잎 표면은 녹색이고 뒷면은 솜 같은 흰색 털이 빽빽이 있다. 꽃은 여름에 자줏빛으로 피고 두상화(꽃대 끝에 꽂자루가 없는 작은 꽃이 많이 모여 피어 머리모양을 이룬 꽃)를 이루며 달린다.

(-)-알파-비사볼올((-)-α-bisabolol)은 브라질 칸데이아 나무(Brazilian candeia tree; Eremanthus erythropappus) 및 독일 카모마일(German chamomile; Matricaria recutita)과 같은 약용 허브(medicinal herbs)에서 발견되는 불포화 세스퀴테르펜 알코올(unsaturated sesquiterpene alcohol)이다. (-)-알파-비사볼올은 항균, 소독 및 항염 활성이 있으며, 피부 진정(skin soothing) 및 보습에도 효능이 있다.

현재 천연 (-)-알파-비사볼올은 브라질 칸데이아 나무에서 추출된 칸데이아 정유(candeia essential oil)를 증기증류(steam-distillation)하여 제조하고 있으나, 환경오염 및 생물보전 문제를 발생시키는 단점이 있다.

또한, (-)-알파-비사볼올을 화학적으로 합성할 수 있으나, 화학 합성은 원치 않은 부분입체이성질체(diastereomer)인 (+)-알파-비사볼올 및 (±)-epi-알파-비사볼올이 같이 합성되고, 부산물이 생성되어 정제 과정이 추가로 필요한 단점이 있다.

최근, 단일 테르페노이드 산물로서 (-)-알파-비사볼올만을 선택적으로 합성할 수 있는 효소가 독일 카모마일에서 발견되었다. 이 합성효소를 효모(Saccharomyces cerevisiae)에 도입하여 4일 동안 배양한 결과, 8 ㎎/L의 (-)-알파-비사볼올이 생산되는 것을 확인하였으나 산업적 규모로 생산하기에는 생산성이 낮은 문제가 있었다(한국등록특허: 10-1735697).

상기와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 아티초크로부터 (-)-알파-비사볼올을 합성하는 신규한 효소를 발굴하고, 신규한 효소를 이용한 비사볼올 생산방법이 기존의 효소를 이용한 방법보다 비사볼올 생성량이 뛰어난 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소를 포함하는 (-)-알파-비사볼올 합성용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소를 처리하는 단계를 포함하는 (-)-알파-비사볼올 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 (-)-알파-비사볼올 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소를 포함하는 비사볼올 합성용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 “효소”는 서열번호 1의 아미노산을 포함하고 비사볼올을 합성하는 활성을 갖는 CcBOS(Cynara cardunculus var. scolymus bisabolol synthase)일 수 있다. 상기 효소는 아티초크로부터 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 효소는 서열번호 1을 포함하거나, 또는 상기 아미노산 서열과 70% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 비사볼올을 합성하는 활성을 나타낼 수 있는 한, 특정 서열이나 유래에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 아미노산 서열과 동일한 활성을 갖는 서열은 제한없이 포함될 수 있으며, 70% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 아미노산 서열번호 1의 서열 및 상기 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

즉, 본 발명에서 “특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질”이라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 효소와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 상기 아미노산 서열 앞뒤에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본 발명의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.

본 발명의 용어, “상동성(homology)” 또는 “동일성(identity)”은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.

용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성(homologous)을 갖거나 또는 동일한(identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스(또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본 출원에서 사용된 것으로서, 용어 “상동성” 또는 “동일성”은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.

또한, 본 발명의 상기 효소는 서열번호 1의 아미노산 중 402번 위치에 류신을 포함하는 다른 효소에 비해 비사볼올의 생산능이 강화된 것일 수 있다.

본 발명의 용어, “비사볼올”은 “(-)-알파-비사볼올”일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 용어, “(-)-알파-비사볼올”은 세스퀴테르펜 알코올(sesquiterpene alcohol)의 한 종류로 레보메놀(levomenol)로도 알려져 있다. 항염증, 피부 보습 및 진정 효능이 있어 화장품의 성분으로 이용되어 왔으며, 최근 멜라닌의 생합성을 억제하여 미백 효과가 있는 것으로 밝혀졌다. 광학이성질체(enantiomer)로 (+)-알파-비사볼올이 있으나 자연계에서는 드물게 발견되고, β-비사볼올은 알코올 작용기(-OH)의 위치가 (-)-알파-비사볼올과 상이하다.

본 발명의 용어, “조성물”은 상기 효소 또는 상기 효소를 발현하는 숙주 세포를 포함하는 것 일 수 있다.

상기 용어, “숙주세포”는 상기 효소를 코딩하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터가 형질전환된 균주세포일 수 있다. 상기 형질전환용 균주로는 대장균(Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 피키아 패스토리스(Pichia pastoris) 또는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소를 발현하는 숙주 세포는 (-)-알파-비사볼올을 생산 및 분비할 수 있는 균주로서 모균주 또는 야생형 균주보다 대량으로 또는 고농도로 배지에 (-)-알파-비사볼올을 축적시킬 수 있는 균주를 의미하고, (-)-알파-비사볼올 생산능이 개선된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 균주는 에스케리치아 속 균주일 수 있으며, 구체적으로, 대장균(Escherichia coli; 이하, E. coli로 기재함)일 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 대장균은 E. coli DH5α, MG1655 및 BL21(DE3)로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 본 발명의 일 실시예에 따르면 DH5α인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 (-)-알파-비사볼올의 합성효소 유전자는 아티초크에서 유래한 CcBOS 유전자로 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 용어 아티초크는, 국화과에 속하는 엉겅퀴처럼 생긴 다년생 화초이며 거인의 엉겅퀴라 할만큼 엉겅퀴를 담은 거대한 꽃이 특징인 허브를 의미한다.

또한, 상기 CcBOS 유전자는 E.coli 코돈에 최적화된 서열로 도입될 수 있다. 코돈 최적화(codon optimization)란 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 E. coli에 도입할 때, 목적 단백질이 잘 발현될 수 있도록 E. coli가 선호하는 코돈으로 바꾸는 작업을 의미한다. 코돈 최적화 과정을 거치면 염기서열이 바뀌어 유전자 서열은 변형되지만 아미노산 서열은 바뀌지 않는다.

상기 용어, “핵산”은 DNA 또는 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함할 수 있다(참조문헌: Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 효소를 코딩하는 핵산은 단위체인 뉴클레오티드가 공유결합에 의해 연결된 DNA 또는 RNA 서열일 수 있고, 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열의 DNA화 전환 시(아미노산을 61개 코돈(codon)으로 변형)에 가능한 모든 가지 수 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열일 수 있고, 보다 구체적으로, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 번역될 수 있는 뉴클레오티드와 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%의 상동성, 유사성 또는 동일성을 가지면서, 번역되어 목적하는 효소 활성을 나타낼 수 있는 핵산을 포함할 수 있다. 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 활성이 동일한 단백질, 번역(translation) 후 아미노산 서열이 동일한, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성, 유사성, 또는 동일성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명의 범위에 포함될 수 있음은 자명하다.

또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 본 발명의 효소를 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.

상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성(homology) 또는 동일성(identity)이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 85% 이상, 구체적으로는, 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 보다 구체적으로는, 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1 X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는, 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

상기 용어, “벡터”는 “재조합 벡터”일 수 있으며, 이는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 제조된 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

상기 용어, “작동 가능하게 연결된(operably linked)”은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어, 프로모터와 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동 적 연결은 당해 기술 분야에서 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등과 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있으며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

상기 용어, “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로, 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.

본 발명에서 상기 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 (-)-알파-비사볼올의 생산능이 강화된 대장균을 형질전환시키는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 상기 재조합 벡터가 대장균에 도입되어 발현될 수 있도록 처리하는 방법이라면 당해 기술 분야에서 사용될 수 있는 모든 형질전환 방법을 포함한다.

보다 구체적으로, 형질전환 방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 환원물질인 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기 천공법(electroporation), 전기 충격 유전자 전달법, 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는, 신규 비사볼올 합성효소인 CcBOS를 플라스미드에 클로닝하고, 대장균에 형질전환하여, 기존 비사볼올 합성효소 EeBOS(Eremanthus erythropappus (DC) McLeisch bisabolol synthase)를 도입한 대장균과 비교하여 약 63배 높은 비사볼올 생산능을 확인하였고, 또한, 세포 성장도 CcBOS를 도입한 숙주 세포가 다른 효소가 형질전환된 숙주세포보다 우수한 것을 확인하였으며, 장기간 배양해도 비사볼올 생산량이 높게 유지되는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (-)-α-비사볼올 생산 균주는 MmMvaK1(Methanosarcina mazei MvaK1)을 포함하는 MVA(mevalonate; 메발로네이트) 대사경로를 발현하는 유전자가 재조합 벡터에 추가로 도입된 것 일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 MVA 대사경로 유전자는 글리세롤과 같은 탄소원으로부터 (-)-α-비사볼올을 합성하는 대사 과정에 관여하는 유전자를 의미한다. MVA 대사경로 유전자는 mvaK1(mevalonate kinase, 메발로네이트 키나제; GenBank accession number: AF290099), mvaD(mevalonate 5-diphosphate decarboxylase, 메발로네이트 5-인산 디카르복실라제; GenBank accession number: AF290099), mvaK2(phosphomevalonate kinase, 포스포메발로네이트 키나제; GenBank accession number: AF290099) 및 idi(isopentenyl diphosphate isomerase, 이소펜테닐 이인산 이소머라제; GenBank accession number: AF119715)를 포함할 수 있다. 또한, mvaE(acetoacetyl-CoA thiolase, 아세토아세틸-CoA 티올라제; GenBank accession number: AF290092) 및 mvaS(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase; GenBank accession number: AF290092)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 MVA 대사경로 유전자들은 IPP(isopentenyl diphosphate) 및 DMAPP(dimethyl allyldiphosphate)의 공급을 증가시키는 역할을 할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (-)-α-비사볼올 생산 균주는 FPP(farnesyl diphosphate) 합성효소 유전자가 추가로 도입된 것일 수 있으며, FPP 합성효소 유전자는 ispA(farnesyl diphosphate synthase, 파르네실 이인산 합성효소; GenBank accession number: AAC73524)일 수 있다. 상기 FPP 합성효소는 IPP 및 DMAPP로부터 FPP를 합성하여 (-)-α-비사볼올 전구체를 공급하는 역할을 할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 일 실시양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소를 처리하는 단계를 포함하는 (-)-알파-비사볼올 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 용어, “효소” 및 “(-)-알파-비사볼올”은 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 “효소를 처리하는 단계”는, 기질과 본 발명의 효소를 반응시키는 단계이고, 기질은 FPP 또는 Mg²⁺ 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 일 실시예에 따르면, 상기 효소에 기질 FPP를 30μM~70μM 처리하는 것일 수 있으며, Mg²⁺를 2~8mM 처리하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 효소는 pH 5 내지 pH 9에서 최적의 반응 활성을 갖는 것일 수 있으며, 온도 10℃ 내지 50℃에서 최적의 반응 활성을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 일 실시양태는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 유전자를 합성하는 단계; 상기 합성된 효소 유전자를 재조합 벡터에 삽입하는 단계; 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환 하는 단계; 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 배양된 숙주로부터 비사볼올을 추출하는 단계; 및 추출된 비사볼올을 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 용어, “효소”, “(-)-알파-비사볼올”, “벡터”, “숙주세포”, “형질전환”은 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 용어, “배양(culture)”은 미생물을 적절히 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 미생물을 배양하는 방법은 당업계에 알려져 있는 적당한 배지와 배양조건에 따라 수행할 수 있으며, 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예로는, 회분식 배양(batch culture), 연속 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함될 수 있으며, 배양 배지에는 당 분야에 알려진 LB 배지, TB 배지, M9 배지 및 2xYT 배지가 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서 바람직한 배양은 유가식 배양일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 용어, “배지(media)”는 본 발명의 (-)-알파-비사볼올 생산 균주의 배양에 사용되는 것으로 상기 균주가 (-)-알파-비사볼올을 생산할 수 있도록 탄소원, 질소원 및 무기염류를 포함하는 배지를 의미하고, 이외에도 (-)-알파-비사볼올의 생산에 필요하거나 생산성을 향상시킬 수 있는 물질은 제한없이 본 발명의 배지에 포함될 수 있다.

탄소원으로는 전분, 포도당, 자당, 갈락토스, 과당, 글리세롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어 글리세롤이 바람직하다. 질소원으로는 황산암모늄, 질산암모늄, 질산나트륨, 글루탐산, 카사미노산, 효모추출물, 펩톤, 트립톤, 대두박 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 미네랄은 염화나트륨, 인산제이칼륨, 황산마그네슘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 제조방법은 (-)-알파-비사볼올 생산능이 개선된 대장균 속 균주를 배지에 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 (-)-알파-비사볼올 생산 방법에서 균주를 배지에서 배양하는 단계는 탄소원으로서 글리세롤을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 0.1 내지 3.5%(w/v)의 글리세롤을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. 또한, 상기 균주를 배양하는 단계는 MVA 대사경로의 중간 산물, 예를 들면 MVA를 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. (-)-알파-비사볼올 생산 균주의 낮은 MVA 대사경로를 강화하도록 형질전환된 경우 0.1 내지 15 mM 농도의 MVA가 부가된 배지에서 배양이 이루어질 수 있다. 또한, 상기 배양 배지는 균주의 생장에 적절하도록 pH가 조절될 수 있으며, pH 4 내지 10인 것이 바람직하며, 구체적으로 pH 5 내지 9일 수 있다. 또한, 상기 배양 배지는 균주의 생장에 적절하도록 온도가 조절될 수 있으며, 온도 10℃ 내지 50℃인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 균주를 배지에 배양하는 단계는, 유가식 배양단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 유가식 배양 단계는 n-도데카인(n-dodecane) 또는 식물성 오일(vegetable oils)을 오버레이(overlay)하여 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 균주를 배양하는 단계 이후 배양된 균주로부터 비사볼올을 추출하는 단계; 상기 추출된 비사볼올을 선택적으로 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 추출하는 단계 및 정제하는 단계는, 배양 배지 위에 오버레이한 n-도데카인(n-dodecane) 또는 식물성 오일층을 회수하고, 이로부터 (-)-알파-비사볼올을 손실없이 획득하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 식물성 오일은 대두 오일, 카놀라 오일, 옥수수 오일 및 해바라기 오일로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 일 실시 양태는, 상기 조성물을 포함하는 (-)-알파-비사볼올 합성용 키트를 제공한다.

본 발명의 용어, “키트”는 상기 (-)-알파-비사볼올을 합성할 수 있는 조성물이 포함된 키트를 의미하며, 본 발명의 키트를 이용하면 (-)-알파-비사볼올을 합성할 수 있다. 본 발명의 (-)-알파-비사볼올 합성용 키트에는 상기 조성물뿐만 아니라, 합성에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 효소를 위한 기질, 적당한 완충용액 등을 포함할 수 있다. 상기 기질은 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96웰 플레이트, 폴리스테린 수지로 합성된 96웰 플레이트 및 유리로된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 일 실시 양태는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소의 (-)-알파-비사볼올 합성 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소 및 이를 이용한 (-)-알파 비사볼올 생산방법은, 기존 합성효소에 비해 (-)-알파 비사볼올 생산량이 증가되는 효과가 있다.

도 1은 MVA 대사경로, FPP 합성효소 및 (-)-알파-비사볼올 합성효소를 발현하기 위한 플라스미드 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2는 각각의 (-)-알파-비사볼올 합성효소를 포함하는 형질전환체의 (-)-알파-비사볼올 생산 농도를 나타내는 그래프이다.
도 3은 각각의 (-)-알파-비사볼올 합성효소를 포함하는 형질전환체의 세포 생장을 나타내는 그래프이다.
도 4는 각각의 (-)-알파-비사볼올 합성효소별 SDS-페이지 분석 사진이다.
도 5은 각각의 (-)-알파-비사볼올 합성효소별 상대적 활성을 나타내는 그래프이다.
도 6a는 각각의 메탈이온이 CcBOS 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 6b는 마그네슘 이온의 농도가 CcBOS 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 6c는 각각의 온도가 CcBOS 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 6d는 각각의 pH가 CcBOS에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 7은 신규 CcBOS 효소를 포함하는 형질전환체(B)와 기존의 MrBOS 효소를 포함하는 형질전환체(A)의 유가식 배양 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 pTSN-Bisa-Cc-Mm 플라스미드 및 FPP 합성효소, CcBOS 및 낮은 MVA 대사경로를 발현하는 유전자가 도입된 pSSN12Didi-CcBOS-IspA-Mm 플라스미드 구조를 나타내는 모식도이다.
도 9는 pTSN-Bisa-Cc-Mm 플라스미드와 pSSN12Didi-CcBOS-IspA-Mm 플라스미드가 도입된 형질전환체의 유가식 배양 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명에서 생산한 (-)-알파-비사볼올(Peak 2)과 (-)-알파-비사볼올 스탠다드(Peak 1)를 GC-MS로 비교 분석한 결과이다.
도 11은 본 발명에서 생산한 (-)-알파-비사볼올과 (-)-알파-비사볼올 스탠다드를 NMR로 비교 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명에서 생산한 (-)-알파-비사볼올의 1H NMR과 13C NMR 화학적 이동(chemical shift) 수치를 나타낸 결과이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소의 형질전환

신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소를 발굴하고 E.coli에 형질전환하여 (-)-알파-비사볼올 합성량을 비교하였다.

보다 구체적으로, 아티초크(C. cardunculus var. scolymus)로부터 신규 효소를 발굴한 뒤 코돈 최적화(codon-optimized)를 통해 뉴클레오티드 시퀀스를 준비하였으며, 비교를 위해 Matricaria recutita, Artemisia annua, 및 E. erythropappus (DC) McLeisch로부터 유래한 시퀀스(각각 MrBOS, AaBOS, 및 EeBOS)를 준비하였다. 준비된 효소의 유전자는 마크로젠(한국)에서 합성하였다. 이후, (-)-알파-비사볼올 기질인 FPP를 과량 공급하기 위하여 도 1에 나타난 구조를 가지는 플라스미드인 pTSN-Bisa-Mm(Catalysts 2019; 9(5): 432)에 각각의 합성된 유전자를 각각 삽입한 뒤, E.coli DH5α에 형질전환하였다.

실시예 2: (-)-알파-비사볼올 생산

실시예 2-1: (-)-알파-비사볼올 생산량 및 세포 생장 평가

실시예 1에서 준비한 각기 다른 (-)-알파-비사볼올 합성효소를 지닌 형질전환체에서의 (-)-알파-비사볼올 생성량을 비교하였다.

보다 구체적으로, 각 형질전환체들을 10g/L 글리세롤 및 20% (v/v) n-dodecane이 포함된 TB(terrific broth; 12g/L 효소 카제인 소화 (Enzymatic casein digest), 24g/L 효모추출물, 9.4g/L K₂HPO₄,및 2.2g/L KH₂PO₄, 100μg/mL 암피실린) 배지에서 30℃, 200rpm으로 72시간 배양하였다. 이때 생성된 (-)-알파-비사볼올을 측정하기 위하여 배양액을 13,000rpm 조건으로 3분 동안 원심분리 하여 n-dodecane층을 분리한 후 기체 크로마토그래피 (gas chromatography, GC)로 (-)-알파-비사볼올을 나타내는 21.7분에 생성되는 peak의 면적을 (-)-알파-비사볼올 스탠다드(Sigma Aldrich, 미국)의 표준곡선과 비교하여 분석하였다. GC는 HP-5 컬럼 (30m X 0.320mm X 0.25μm)을 사용하였고 오븐의 초기온도를 60℃, 2분 동안 유지한 후 5℃/분 속도로 200℃까지 증가시키고 2분간 유지하였다. 그 후 50℃/분으로 300℃까지 증가시키고 5분간 유지하였다.

그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, 아티초크로부터 유래한 본 발명의 신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소가 포함된 CcBOS에서 다른 (-)-알파-비사볼올 합성효소를 사용할 때 보다 (-)-알파-비사볼올 생성량이 더 증가한 것을 확인하였다.

또한, 각각의 형질전환체들의 세포 생장도 비교하였다.

보다 구체적으로, 각 형질전환체들을 10g/L 글리세롤 및 20% (v/v) n-dodecane이 포함된 TB 배지에서 30℃, 200rpm으로 72시간 배양하고, 배양액의 600nM 흡광도(OD₆₀₀)를 분광광도계(spectrophotometer)로 측정하였다.

그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소가 포함된 CcBOS에서 다른 (-)-알파-비사볼올 합성효소를 사용할 때 보다 세포 생장률이 더 증가한 것을 확인하였다.

이를 통해, 신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소가 포함된 CcBOS가 다른 (-)-알파-비사볼올 합성효소보다 (-)-알파-비사볼올을 합성하는데 있어서 보다 뛰어남을 확인하였다.

실시예 2-2: SDS 페이지를 통한 (-)-알파-비사볼올 생산효소 발현 평가

실시예 1에서 합성한 각기 다른 (-)-알파-비사볼올 합성효소 유전자를 pET28a(+) 플라스미드에 삽입한 뒤, E.coli BL21(DE3)에 형질전환하여 (-)-알파-비사볼올 합성효소의 발현양을 측정하였다.

보다 구체적으로, 각 형질전화체들을 LB(10g/L 트립톤 (tryptone), 5g/L 효모추출물 (yeast extract), 및 10g/L NaCl, 25μg/mL 카나마이신) 배지에서 30℃, 200rpm으로 1시간 30분 동안 배양한 후 0.1mM IPTG를 첨가하여 20℃, 150rpm에서 20시간 동안 배양하였다. 그리고 상기 배양액을 4℃, 3,000rpm에서 20분간 원심분리하여 세포를 회수한 뒤 1X lysis buffer에 재부유하였다. 상기 재부유된 세포를 초음파파쇄기(sonicator)로 파쇄한 후 4℃, 16,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 회수하였고 추가로 0.45μm 필터로 여과하였다. 그 후 Profinia^TM 단백질 정제 시스템(Bio-Rad, 미국)을 이용하여 각각의 (-)-알파-비사볼올 합성효소를 정제하였다. 각 단계 중 전세포 파쇄액, 수용성 분액, 정제 단백질을 SDS 페이지로 분석하였다.

Lane 1에는 250, 150, 100, 75, 50, 37 및 25kDa을 의미하는 마커 단백질을 넣고, Lane 2, 5, 8 및 11 에는 상기 형질전환체들의 전세포파쇄액을 넣었으며, Lane 3, 6, 9 및 12에는 상기 형질전환체들의 수용성 분액을 넣었고, Lane 4, 7, 10 및 13에는 정제 단백질을 0.2mg/mL 넣었다.

그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소 CcBOS의 수용성 분액인 lane 9에서 (-)-알파-비사볼올 합성효소에 해당하는 밴드가 선명히 나타나는 것을 확인하였다.

이를 통해, 4개의 (-)-알파-비사볼올 합성효소들 중에서 CcBOS가 E.coli에서 수용성으로 가장 잘 발현되는 것을 확인하였다.

실시예 2-3: 신규 (-)-알파-비사볼올 생산효소의 (-)-알파-비사볼올 합성 활성능 평가

실시예 2-2에서 정제한 각기 다른 (-)-알파-비사볼올 합성효소의 (-)-알파-비사볼올 합성 활성능을 비교하였다.

보다 구체적으로, 각 정제 효소 0.01mg/mL을 기질 50μM FPP, 1mM MgCl₂, 2.5 mU phophatase가 포함된 50mM HEPES 버퍼 (pH 7.5) 50μL에서 30℃, 5분간 반응시켰다. 이후 10μL의 malachite green development solution을 첨가하여 효소 반응을 정지시켰다. 이후 상온에서 20분간 발색반응을 유도한 후, 623nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 각 정제 효소 반응으로 생성된 monophosphate의 양을 산출하여 각 효소의 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, 신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소 CcBOS에서 (-)-알파-비사볼올 합성 활성능이 가장 높은 것을 확인하였다.

이를 통해, 신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소 CcBOS가 다른 (-)-알파-비사볼올 합성효소에 보다 활발히 (-)-알파-비사볼올을 생산하는 것을 확인하였다.

실시예 3: CcBOS 효소 특성 분석

실시예 1 내지 2에서 신규 (-)-알파-비사볼올 합성효소인 CcBOS가 다른 효소에 비해 활성이 우수한 것을 확인하여, 이의 특성을 분석하였다.

먼저, 메탈 이온들에 따른 CcBOS의 활성에 대해서 비교하였다. 구체적으로, 메탈 이온 1mM이 각각 첨가되고, 50μM FPP와 2.5 mU phophatase이 포함된 50mM HEPES 버퍼 (pH 7.5)에서 30℃, 5분간 정제된 CcBOS (0.01 mg/mL)를 반응시켰다. 반응 산물은 실시예 2-3과 동일하게 623nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 메탈 이온의 종류별 CcBOS의 활성을 평가하였다.

또한, Mg²⁺ 의 농도에 따른 CcBOS의 활성에 대해서 비교하였다. 구체적으로, 각각 다른 농도의 MgCl2가 첨가되고, 50μM FPP와 2.5 mU phophatase이 포함된 50mM HEPES 버퍼 (pH 7.5)에서 30℃, 5분간 CcBOS를 반응시켰다. 반응 산물은 실시예 2-3과 동일하게 623nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 Mg²⁺의 농도별 CcBOS의 활성을 평가하였다.

또한, 온도에 따른 CcBOS의 활성에 대해서 비교하였다. 구체적으로, 50μM FPP, 2.5 mU phophatase, 5mM MgCl₂가 포함된 50mM HEPES 버퍼 (pH 7.5)에서 다양한 온도 조건으로 5분간 CcBOS를 반응시켰다. 반응 산물은 실시예 2-3과 동일하게 623nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 온도별 CcBOS의 활성을 평가하였다.

또한, pH에 따른 CcBOS의 활성에 대해서 비교하였다. 구체적으로, 50μM FPP, 2.5 mU phophatase, 5mM 농도의 MgCl₂가 포함된 50 mM MOPS 버퍼(흰색 원), 50 mM EPPS 버퍼(검은 원) 및 50 mM CHES 버퍼(회색 원)에 pH를 6.5 ~ 10.0으로 구분하여, 30℃, 5분간 CcBOS를 반응시켰다. 반응 산물은 실시예 2-3과 동일하게 623nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 pH별 CcBOS의 활성을 평가하였다.

그 결과, 도 6a에서 볼 수 있듯이, Mg²⁺ 이온이 CcBOS의 활성에 가장 큰 영향을 미치는 것을 확인하였다.

도 6b에서 볼 수 있듯이, Mg²⁺ 이온이 2.5mM 이상 첨가되었을 때, CcBOS의 활성이 활발한 것을 확인하였다.

도 6c에서 볼 수 있듯이, 35℃의 온도에서 CcBOS의 활성이 가장 활발한 것을 확인하였다.

도 6d에서 볼 수 있듯이, pH 7.0에서 CcBOS의 활성이 가장 활발한 것을 확인하였다.

실시예 4: CcBOS 발현 형질전환체의 유가식 배양을 통한 (-)-알파-비사볼올 생산

pTSN-Bisa-Cc-Mm을 포함하는 형질전환체를 유가식 배양을 하여 특성을 분석하였다.

보다 구체적으로, 상기 형질전환체를 0.025mM IPTG 및 20%(v/v) n-dodecane이 포함된 TB 배지에서, 30℃, pH 7.0 조건으로 2상 배양(two-phase culture)을 수행하였다. 글리세롤은 배양기에 지속적으로 첨가하여 주었으며, 교반 속도는 500rpm, 용존산소량은 1vvm으로 유지해주었다.

또한, 비교를 위해서 pTSN-Bisa-Mr-Mm 플라스미드를 포함하는 형질전환체를 상기와 같은 방법으로 배양하여 비교하였다.

그 결과, 도 7에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 CcBOS를 발현하는 현질전환체가 MrBOS를 발현하는 형질전환체보다 (-)-알파-비사볼올 생산량이 더 많았으며, 장기간 배양에서도 지속적으로 (-)-알파-비사볼올을 생산하는 것을 확인하였다. 또한, 세포의 생장 역시 뛰어난 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 CcBOS 발현 형질전환체가 (-)-알파-비사볼올의 생산능 및 세포 생장에서도 기존의 효소를 이용한 형질전환체보다 뛰어남을 확인하였다.

실시예 5: pTSN-Bisa-Cc-Mm 및 pSSN12Didi-CcBOS-IspA-Mm 플라스미드가 도입된 형질전환체의 유가식 배양을 통한 (-)-알파-비사볼올 생산

낮은 MVA 대사경로를 암호화하는 pSSN12Didi 플라스미드에 본 발명의 CcBOS 합성효소와 FPP 합성효소를 추가로 세포 내에서 발현하기 위해 도 8의 pSSN12Didi-CcBOS-IspA-Mm 플라스미드를 제작한 후 pTSN-Bisa-Cc-Mm 플라스미드와 함께 E.coli DH5α에 형질전환하였다. 이후, 상기 형질전환체는 실시예 4와 동일한 방법으로 유가식 배양을 실시하였다.

그 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이, 상기 pSSN12Didi-CcBOS-IspA-Mm 플라스미드를 추가로 도입한 형질전환체에서 (-)-알파-비사볼올의 생산능이 월등히 증가한 것을 확인하였다.

이를 통해, pTSN-Bisa-Cc-Mm 및 pSSN12Didi-CcBOS-IspA-Mm 플라스미드의 동시 도입이 (-)-알파-비사볼올의 생산능을 향상시키는 것을 확인하였다.

실시예 6: 신규 효소에 의해 합성된 (-)-알파-비사볼올 GC-MS 및 NMR 분석

실시예　6-1: GC-MS 분석

상기 pTSN-Bisa-Cc-Mm 및 pSSN12Didi-CcBOS-IspA-Mm가 포함된 형질전환체로부터 생산된 (-)-알파-비사볼올 성분을 분석하였다.

보다 구체적으로, 실시예 5에서 유가배양식 발효를 통해 획득한 n-dodecane 추출물을 회수하여 GC-MS 분석을 실시하였다.

그 결과, 도 10에서 볼 수 있듯이, (-)-알파-비사볼올 스탠다드와 상기 추출물에서 획득한 (-)-알파-비사볼올의 피크가 일치하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 신규 효소 및 (-)-알파-비사볼올 생산방법이 기존의 (-)-알파-비사볼올과 동일한 (-)-알파-비사볼올을 생산할 수 있음을 확인하였다.

실시예 6-2: NMR 분석

상기 pTSN-Bisa-Cc-Mm 및 pSSNDidi-CcBOS-IspA-Mm가 포함된 형질전환체로부터 생산된 (-)-알파-비사볼올의 NMR 성분 분석을 실시하였다.

그 결과, 도 11과 도 12에서 볼 수 있듯이, (-)-알파-비사볼올 스탠다드와 상기 추출물에서 획득한 (-)-알파-비사볼올의 NMR 결과가 일치하는 것을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Novel (-)-alpha-bisabolol synthase and a method for producing (-)-alpha-bisabolol using the same <130> KPA190494-KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 569 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombination protein <400> 1 Met Ser Asn Phe Leu Val Ser Thr Cys Ser Ser Pro Leu Ala Leu Asp 1 5 10 15 Glu Asn Asn Ser Thr Lys Gln Asp His Val Ile Arg Asn Thr Val Thr 20 25 30 Phe His Ser Ser Ile Trp Gly Asp Gln Phe Leu Thr Tyr Asp Glu Lys 35 40 45 Asp Asp Leu Val Ala Glu Lys Gln Leu Ala Glu Glu Leu Ile Glu Glu 50 55 60 Thr Arg Lys Glu Leu Ile Ile Thr Thr Ser Ser His Glu Pro Ile Gln 65 70 75 80 His Met Lys Leu Ile Gln Leu Ile Asp Ala Val Gln Arg Leu Gly Val 85 90 95 Ala Tyr His Phe Glu Lys Glu Ile Glu Asp Ala Leu Gln His Val Tyr 100 105 110 Arg Thr Tyr Gly His Gln Gly Ile His Asn Asn Asn Asp Leu Gln Ser 115 120 125 Ile Ser Leu Trp Phe Arg Ile Leu Arg Gln Gln Gly Phe Asn Val Ser 130 135 140 Ser Glu Ile Phe Lys Asn His Met Asp Glu Lys Gly Asn Leu Phe Ser 145 150 155 160 Asn Asp Val Gln Ser Met Leu Ala Leu Tyr Glu Ala Ser Tyr Met Arg 165 170 175 Val Glu Gly Glu Lys Val Leu Asp Asp Ala Leu Glu Phe Thr Lys Thr 180 185 190 His Leu Ala Ile Ile Ala Lys Asp Pro Ser Cys Asp Ser Ser Leu Arg 195 200 205 Thr Gln Ile Gln Asp Ala Leu Arg Gln Pro Leu Arg Lys Arg Leu Pro 210 215 220 Arg Leu Glu Ala Val Arg Tyr Ile Pro Ile Tyr Gln Gln Gln Ser Ser 225 230 235 240 His Asn Gln Ile Leu Leu Lys Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn Met Leu 245 250 255 Gln Thr Met His Lys Lys Glu Leu Ser Glu Ile Cys Lys Trp Trp Lys 260 265 270 Asp Leu Asp Met Gln Asn Lys Leu Pro Phe Val Arg Asp Arg Leu Ile 275 280 285 Glu Gly Tyr Phe Trp Ile Leu Gly Ile Tyr Phe Glu Pro His His Ser 290 295 300 Arg Ser Arg Met Phe Leu Ile Lys Ser Cys Met Trp Leu Val Val Ile 305 310 315 320 Asp Asp Thr Phe Asp Asn Tyr Gly Thr Tyr Glu Glu Leu Glu Ile Phe 325 330 335 Thr Glu Ala Val Glu Arg Trp Ser Ile Asn Cys Leu Asp Met Leu Pro 340 345 350 Glu Tyr Met Lys Leu Ile Tyr Lys Glu Leu Val Ile Val His Gln Glu 355 360 365 Met Glu Glu Thr Leu Glu Lys Glu Gly Lys Ala Tyr His Ile His His 370 375 380 Val Lys Glu Leu Ala Lys Glu Cys Thr Arg Ser Leu Leu Val Glu Ala 385 390 395 400 Lys Trp Leu Lys Glu Gly Tyr Met Pro Thr Leu Asp Glu Tyr Ile Ser 405 410 415 Asn Ser Leu Ile Thr Cys Ala Tyr Ala Val Met Ile Ala Arg Ser Tyr 420 425 430 Val Gly Gly Asp Asp Lys Leu Val Asn Glu Asp Ser Phe Lys Trp Val 435 440 445 Ala Thr His Pro Pro Leu Val Lys Ala Ser Cys Leu Ile Leu Arg Leu 450 455 460 Met Asp Asp Ile Ala Thr His Lys Glu Glu Gln Glu Arg Gly His Val 465 470 475 480 Ala Ser Ser Ile Glu Cys Tyr Ile Lys Glu Thr Gly Ala Thr Glu Glu 485 490 495 Glu Ala Arg Glu His Phe Ser Lys Gln Val Glu Asp Ala Trp Lys Val 500 505 510 Val Asn Arg Glu Ser Leu Arg Pro Thr Ala Val Ala Phe Pro Leu Val 515 520 525 Met Pro Ala Ile Asn Leu Ala Arg Met Cys Asp Ala Leu Tyr Lys Gly 530 535 540 Asn His Asp Gly Tyr Asn His Ala Gly Lys Glu Val Ile Gln Tyr Ile 545 550 555 560 Lys Ser Leu Leu Val His Pro Leu Ile 565 <210> 2 <211> 1710 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombination protein <400> 2 atgagtaact ttttagtgtc tacctgctca agcccgcttg ccttggacga gaacaattcg 60 acaaaacaag atcacgtgat tcgtaacacc gttacgtttc acagctccat ttggggcgac 120 caattcctga catacgacga aaaagatgat ttggtggcgg aaaagcagtt ggcggaggaa 180 ctgattgaag aaacccgtaa ggaattaatc atcacaacgt caagtcatga accgatccaa 240 cacatgaaac ttatccagtt aattgatgca gtgcagcgcc ttggtgtcgc atatcacttt 300 gagaaagaga tcgaggacgc tttgcaacac gtgtaccgca cttatggtca ccagggtatt 360 cataacaata atgatttgca aagtattagc ttatggtttc gtattttgcg ccaacagggc 420 tttaatgtat caagtgagat cttcaaaaat cacatggacg agaagggtaa ccttttttcc 480 aacgatgtcc agagcatgtt agctttatac gaagcgtcct atatgcgtgt cgagggcgag 540 aaggtactgg atgatgcgct cgagttcaca aaaacccatt tagctatcat tgccaaagat 600 ccgtcctgcg atagttcttt acgtacacaa atccaagacg cactgcgcca gcctttacgt 660 aaacgtcttc cacgtttaga ggcagttcgc tacattccga tctaccaaca acaaagttcg 720 cacaatcaaa ttctgttgaa attggccaag ttggacttca acatgctgca aactatgcat 780 aagaaggaat tgtcagaaat ctgtaagtgg tggaaagacc tggacatgca gaataagctg 840 ccctttgttc gtgaccgttt aatcgaggga tacttttgga ttttaggtat ttatttcgag 900 ccccatcaca gccgcagccg tatgttttta attaaatcct gtatgtggtt agtcgtaatc 960 gacgacacct ttgataatta tggaacttac gaagaactgg agattttcac cgaagcagtc 1020 gagcgctggt cgatcaattg cctggacatg ctgcccgaat atatgaaatt aatctataaa 1080 gagctggtta tcgtgcacca agaaatggag gagacccttg aaaaggaagg taaggcatat 1140 cacattcacc atgtcaagga acttgcaaag gaatgcaccc gcagcttgct ggttgaagca 1200 aagtggttga aagaggggta catgccaact ttggatgaat acatctcgaa cagcttaatc 1260 acatgcgcct acgcagttat gatcgcccgt agctatgtag gcggtgacga caagttggtc 1320 aatgaagata gctttaagtg ggttgccaca catccgccgt tagtcaaggc cagctgtctg 1380 attctgcgct tgatggacga catcgccacg cacaaggaag agcaggagcg tggtcatgtc 1440 gcgtcatcaa tcgagtgtta cattaaagag accggagcga cggaagaaga ggcacgtgag 1500 cattttagca agcaggtcga ggatgcctgg aaagtggtca atcgcgagtc tcttcgccca 1560 actgccgtcg catttccgtt ggtgatgcca gcaatcaatc ttgcacgtat gtgcgatgcg 1620 ctgtacaagg gtaaccatga cggttataat cacgcgggaa aagaggtaat ccagtacatt 1680 aagtctcttc ttgttcatcc gcttatttaa 1710

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소를 포함하는, 비사볼올 합성용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소를 발현하는 미생물을 포함하는, 비사볼올 합성용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 전체 MVA 대사경로의 유전자 및 FPP 합성효소로 이루어진 군에서 하나 이상을 추가로 발현하는 것인, 비사볼올 합성용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 미생물은 CcBOS 유전자, 낮은 MVA 대사경로의 유전자 및 FPP 합성효소로 이루어진 군에서 어느 하나 이상을 추가로 도입하여 더 발현하는 것인, 비사볼올 합성용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비사볼올은 (-)-알파-비사볼올인, 비사볼올 합성용 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소를 처리하는 단계를 포함하는, 비사볼올 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 효소는 pH 5 내지 pH 9에서 최적 활성이 이루어지는 것인, 비사볼올 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 효소는 온도 10℃ 내지 50℃에서 최적 활성이 이루어지는 것인, 비사볼올 제조방법.
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 비사볼올 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 숙주세포는 전체 MVA 대사경로의 유전자 및 FPP 합성효소로 이루어진 군에서 하나 이상이 추가로 도입된 것인, 비사볼올 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 숙주세포는 CcBOS 유전자, 낮은 MVA 대사경로 유전자 및 FPP 합성효소로 이루어진 군에서 어느 하나 이상이 추가로 도입된 것인, 비사볼올 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 숙주 세포를 배양하는 단계는 유가식 배양 단계를 포함하는 것인, 비사볼올 제조방법.
제10항에 있어서, 유가식 배양 단계는 배지에 n-dodecane을 포함하는 것인, 비사볼올 제조방법.
제10항에 있어서, 유가식 배양 단계는 온도 10℃ 내지 50℃에서 이루어지는 것인, 비사볼올 제조방법.
제10항에 있어서, 유가식 배양 단계는 pH 5.0 내지 pH 9.0에서 이루어지는 것인, 비사볼올 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 숙주 세포를 배양하는 단계 이후 배양된 숙주 세포로부터 비사볼올을 추출하는 단계를 포함하는, 비사볼올 제조방법.
제16항에 있어서, 상기 추출하는 단계 이후 비사볼올을 선택적으로 정제하는 단계를 포함하는, 비사볼올 제조방법.
제17항에 있어서, 상기 비사볼올을 선택적으로 정제하는 단계는 n-dodecane으로부터 획득하는 것인, 비사볼올 제조방법.
제6항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비사볼올은 (-)-알파-비사볼올인, 비사볼올 제조방법.