KR101971678B1 - 신규한 세스퀴테르펜 신타아제 및 이를 이용한 세스퀴테르펜 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 세스퀴테르펜 신타아제 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

신규한 세스퀴테르펜 신타아제 및 이를 이용한 세스퀴테르펜 생산방법 {Novel sesquiterpene synthase and a method for producing sesquiterpene using the same}

본 발명은 신규한 세스퀴테르펜 신타아제 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 고무나무 (Parthenium argentatum)에서 유래될 수 있는 분리된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질, 변이된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질, 상기 세스퀴테르펜 신타아제 단백질을 코딩하는 분리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 상기 핵산 혹은 발현 벡터를 포함하는 재조합 미생물, 및 상기 미생물을 배양하여 (-)-α-비사보롤, β-히마찰렌, 또는 알로아로마덴드렌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

비사보롤 (bisabolol)은 테르펜 (terpene)에 속하는 화합물 중 탄소수가 15인 세스퀴테르펜 알콜 (sesquiterpene alcohol)의 한 종류로 레보메놀(levomenol)로도 불리며, 분자식이 C₁₅H₂₆O 이다.

그 중 (-)-α-비사보롤은 묽은 프로랄 (floral) 향기를 가지고 있어, 여러 가지 방향 (芳香)에 사용되었으며, 피부를 치유하는 성분과 항자극, 항염증, 및 항균 작용이 알려져 있어 화장품의 원료로 사용되어 왔다(Bhatia et al. (2008) Food and chemical toxicology S72-6). 또한, 비사보롤은 피부 자극을 완화하여 피부를 진정시키며, 피부 보습 효과를 갖는다. 또한, 피부 멜라닌 생성을 억제하는 미백 활성이 있어, 피부톤을 개선시키는 화이트닝 화장품에 주로 사용되며, 허브 차, 감기약 등에 사용된다. 최근 (-)-α-비사보롤이 백혈병 모델에서 아폽토시스 (apoptosis)의 유도 활성이 있음이 밝혀졌다.

자연에 존재하는 (-)-α-비사보롤은 카모밀 (국화과, Matricaria recutita) 꽃으로부터 증류하여 얻은 카모밀 오일 (chamomile oil)에서 처음 발견되었으며, 90년대 이후 실질적인 상업적 원료는 브라질에서 자생하는 칸데이아(candeia) 나무 (Eremanthus erythropappus 또는 Vanillosmopsis erythropappa로 알려짐)이다. 다만, 매년 약 80톤의 생산량이 수출되고 있어, 상기 수목의 확보가 용이하지 않다는 문제 때문에 미생물을 이용한 대량 생산 방법이 필요한 상황이다.

한편 히마찰렌 (himachalene)은 세스퀴테르페노이드 (sesquiterpenoid)에 속하는 물질로, 분자식 C₁₅H₂₄, 분자량 204.35이며, 이성질체로서 베타-히마찰렌 및 알파-히마찰렌이 존재한다. 히마찰렌으로 유도된 히마찰렌 유도체의 미생물 억제 활성이 있음이 밝혀진 바 있다 (EXCLI journal, 2014, Vol.13, pp.1216-25). 알로아로마덴드렌은(allo-aromadendrene) 세스퀴테르펜의 한 종류이며, 분자식 C₁₅H₂₄, 분자량 204.35를 갖는다. 알로아로마덴드렌은 정유 (Essential oil)의 구성 성분으로 연구되고 있으나, 아직 약리활성이 구체적으로 밝혀진 바는 없다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 미생물을 통한 상기 물질의 대량 생산 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 본 발명에 따른 신규한 세스퀴테르펜 신타아제가 β-히마찰렌 (β-himachalene), (-)-α-비사보롤 ((-)-α-bisabolol), 및 알로아로마덴드렌 (allo-aromadendrene) 생산에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 고무나무 (Parthenium argentatum)에서 유래될 수 있는 분리된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 변이된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 분리된 핵산을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 혹은 이를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세스퀴테르펜 신타아제 단백질을 포함하거나, 이를 코딩하는 핵산 혹은 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터가 도입된, 세스퀴테르펜을 생산할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 세스퀴테르펜을 생산할 수 있는 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 이의 배양물로부터 세스퀴테르펜을 회수하는 단계를 포함하는, 세스퀴테르펜을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다. 한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 신규한 세스퀴테르펜 신타아제 단백질을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 고무나무 (Parthenium argentatum)에서 유래될 수 있는, 분리된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질을 제공한다.

본 발명의 용어 "고무나무 (Parthenium argentatum)"는 구아율 (guayule)로도 불리는 식물로서, 본 발명에서는 상기 고무나무에서 신규한 세스퀴테르펜 신타아제 2 종을 규명하였다.

본 발명의 용어 "분리된"은 자연적으로 존재하는 환경, 예컨대 생물체의 세포 내 등에서 실질적으로 분리 또는 정제된 것을 의미한다. 분리된 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 단백질 및 화학적으로 합성된 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "세스퀴테르펜"은 식물 정유에 함유되는 테르펜 중 탄소 15원자로 구성되는 사슬식 또는 고리식의 탄화수소 및 그 유도체를 말한다. 상기 테르펜은 가연성의 불포화 탄화수소로, 일반식 (C₅H₈)_n (n≥2)을 갖는 탄수화물 및 이들의 유도체의 총칭이며, 향료의 원료나 의약품 등으로 사용된다. 본 발명의 용어 "세스퀴테르펜 신타아제 단백질"은 상기 세스퀴테르펜을 합성하는 효소를 의미한다.

상기 고무나무에서 유래될 수 있는 세스퀴테르펜 신타아제 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 단백질, 보다 더 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 모두 포함한다.

또한, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 단백질, 보다 더 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 모두 포함한다.

상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가지는 단백질, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 단백질, 및 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 구성되는 단백질은 해당 서열번호의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성 혹은 서열 상동성을 가지는 단백질을 모두 포함하는 개념이다. 예를 들어, 이러한 서열 동일성 혹은 서열 상동성을 가지며, 해당 서열번호의 아미노산 서열을 가지는 단백질과 상응하는 효능을 나타내는 단백질이라면, 일부 아미노산 서열이 결실, 변형, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 발명의 범주에 모두 포함되는 것은 당업자에게 자명하다.

또한, 특정 서열번호의 아미노산 서열로 구성된다는 표현은 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞 뒤의 무의미한 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 구성된 단백질의 활성을 가지는 경우라면 본 발명의 범주에 속함은 당업자에게 자명하다.

상기에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 DNA 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 DNA 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수 (score), 동일성 (identity) 및 유사도 (similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 (Southern blot hybridization) 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법 (예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다. 상기에서 용어 “엄격한 조건”이란 핵산 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 고무나무 유래의 세스퀴테르펜 신타아제 3 (서열번호 1, TPS3로도 명명) 및 세스퀴테르펜 신타아제 4 (서열번호 2, TPS4로도 명명)를 새롭게 규명하였으며 (실시예 1), 본 발명의 일 실험예에서는 NCBI의 Non-redundant protein sequences 데이터베이스에 대해 BLASTp 프로그램을 이용해 검색하여 상기 단백질이 신규한 단백질임을 규명하였다 (실험예 1).

본 발명에서 사용된 용어, 세스퀴테르펜의 예로는 β-히마찰렌 (β-himachalene), (-)-α-비사보롤 ((-)-α-bisabolol), 또는 알로아로마덴드렌 (allo-aromadendrene)를 들 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질은 β-히마찰렌 혹은 (-)-α-비사보롤 합성능을 가질 수 있고, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 단백질은 알로아로마덴드렌 합성능을 가지는 효소일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 구체적으로 본 발명은 상기 고무나무에서 유래될 수 있는 세스퀴테르펜 신타아제 단백질이 변이된, 단백질을 제공한다.

상기 고무나무에서 유래될 수 있는 세스퀴테르펜 신타아제 단백질에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 목적상 구체적으로 상기 변이된 세스퀴테르펜 신타아제 변이체는 세스퀴테르펜 신타아제가 변이에 의해서 그 활성이 야생형과 비교하여 효율적으로 증가되거나, 변화된 단백질이다. 본 발명에서 변이는 일반적으로 효소를 개량하기 위한 방법으로 당업계의 알려진 공지된 방법들이 제한없이 사용될 수 있으며, 이에는 합리적 설계 (rational design)와 유도 진화 (directed evolution) 등의 전략이 있다. 예를 들어, 합리적 설계 전략에는 특정 위치의 아미노산을 위치-지정 돌연변이도입 (site-directed mutagenesis)하는 방법 등이 있고, 유도 진화 전략에는 무작위적 변이 (random mutagenesis)를 일으키는 방법 등이 있다. 또한, 자연적인 돌연변이에 의해 외부의 조작 없이, 402 번째 및/또는 429 번째 아미노산이 돌연변이된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것이 아니다.

구체적으로, 상기 변이된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질은 분리된 것이거나/것이며, 재조합 단백질일 수 있거나/있으며, 비자연적으로 발생된 것일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "치환"은 아미노산 하나의 서열이 다른 아미노산 서열로의 대체 또는 변화를 말한다. 예를 들면, 본 발명에 기술된 치환을 사용함으로써, 세스퀴테르펜 신타아제의 특정 위치의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하거나 치환할 수 있다. 아미노산의 치환에 있어, 당업계의 알려진 공지된 방법들이 제한 없이 사용될 수 있다.

상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 이의 N-말단으로부터 402번 아스파라진 (asparagine) 잔기가 아스파라진 이외의 잔기로 치환된 단백질일 수 있다. 보다 더 구체적으로 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 이의 N-말단으로부터 402번 아스파라진 잔기가 류신 (leucine)으로 치환된, 변이된 세스퀴테르펜 신타아제일 수 있다. 상기 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있으며, 더 구체적으로 서열번호 5의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 단백질일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

보다 더 구체적으로, 상기 변이된 세스퀴테르펜 신타아제는 402번 아미노산 잔기의 변이 외에 독립적으로 혹은 추가적으로 429번 트레오닌 (threonine) 잔기가 트레오닌 이외의 잔기로 치환된 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 글리신 (glycine)으로 치환된 것일 수 있다.

상기 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있으며, 더 구체적으로 서열번호 6의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 단백질일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 구체적으로 기술된 변이된 세스퀴테르펜 신타아제는 변이되지 않은 세스퀴테르펜 신타아제에 비하여 우수한 (-)-α-비사보롤 생산능을 가지는 단백질일 수 있으며, 이러한 생산능을 가지는 이상 상기 서열들과 80% 이상, 구체적으로는 85% 이상, 보다 더 구체적으로는 90% 이상, 보다 더 구체적으로는 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 혹은 99% 이상의 서열 동일성 혹은 서열 상동성을 가지는 단백질을 제한 없이 포함할 수 있다.

한편, 상동성 혹은 특정 아미노산 서열로 구성되는 단백질이라는 표현에 대한 설명은 앞서 기술된 내용이 모두 적용된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 세스퀴테르펜 신타아제 단백질을 코딩하는, 분리된 핵산을 제공한다.

상기 세스퀴테르펜 신타아제 단백질에 대해서는 앞서 기술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "핵산"은 DNA 그리고 RNA 분자를 포함하는 의미를 가지며, 천연 핵산뿐만 아니라 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다. 본 발명에서 상기 핵산은 세포로부터 분리된 핵산 또는 인위적으로 합성된, 비자연적으로 발생된 핵산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 상기 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산은 각각 서열번호 3 및 4의 핵산 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 다양한 조합의 핵산 서열이 가능함이 당업자에게 자명하다. 또한, 서열번호 3 혹은 4의 핵산 서열과 80% 이상, 구체적으로는 85% 이상, 보다 더 구체적으로는 90% 이상, 보다 더 구체적으로는 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 혹은 99% 이상의 서열 동일성 혹은 서열 상동성을 나타내는 핵산 서열로서, 실질적으로 해당 서열이 코딩하는 단백질의 활성과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖는 핵산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 핵산 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는, 발현 벡터를 제공한다.

상기 핵산에 대해서는 앞서 기술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 DNA 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위 (replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함한다. 용어 "벡터"는 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. 용어 "벡터"는 또한 트랜스포존, 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 핵산을 포함하는 발현 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균 유래 플라스미드 (pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 및 pTNS), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)-유래 플라스미드 (pUB110 및 pTP5), 효모-유래 플라스미드 (YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 아그로박테리움 매개 형질전환에 사용할 수 있는 Ti-플라스미드를 포함한다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지 (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus) 또는 백시니아 바이러스 (vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스 (baculovirus)와 같은 곤충 바이러스, 이중 가닥 식물 바이러스 (예, CaMV), 단일가닥 바이러스 또는 게미니 바이러스로부터 유래된 바이러스 벡터가 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 핵산을 벡터로 삽입하기 위해, 정제된 DNA를 적당한 제한효소로 절단하여 적당한 벡터 DNA의 제한 부위 또는 클로닝 부위에 삽입하는 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 세스퀴테르펜 신타아제를 코딩하는 핵산은 벡터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본 발명의 벡터는 프로모터 및 본 발명의 핵산 외에 인핸서 (enhancer)와 같은 시스 요소 (cis element), 스플라이싱 시그널 (splicing signal), 폴리 A 추가 시그널 (poly A addition signal), 선택 마커 (selection marker), 라이보좀 결합 서열 (ribosome binding sequence, SD sequence) 등을 추가로 포함할 수 있다. 선택 마커의 예로, 클로람페니콜 저항 핵산, 암피실린 저항 핵산, 디하이드로폴레이트 환원효소 (dihydrofolate reductase), 네오마이신 저항 핵산 등이 사용될 수 있으나, 상기 예들에 의해 작동 가능하도록 연결되는 추가적 구성요소가 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 발현 벡터는 세스퀴테르펜의 전구 물질인 IPP (isopentenyl diphosphate)와 DMAPP (dimethylallyl diphosphate)의 생산을 가져오는, 하나 이상의 효소를 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 유전자는 MvaE (bifunctional acetoacetyl-CoA thiolase and HMG-CoA reductase), MvaS (HMG-CoA synthase), MvaK1 (mevalonate kinase), MvaK2 (phosphomevalonate kinase), MvaD (diphosphomevalonate decarboxylase), Idi (IPP isomerase) 또는 IspA (FPP synthase)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "IPP", "DMAPP"은 메발론산 경로의 중간물질로, 유기체 내의 테르펜 또는 테르페노이드 생합성 경로에서 전구체로 사용되며 각각 이성질체 관계이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 세스퀴테르펜 신타아제 단백질, 이를 코딩하는 핵산 혹은 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 재조합 미생물을 제공한다.

상기 세스퀴테르펜 신타아제 단백질, 상기 핵산, 및 상기 발현벡터에 대해서는 앞서 기술한 바와 같다.

상기 재조합 미생물은 구체적으로, 세스퀴테르펜을 생산할 수 있는 재조합 미생물일 수 있다.

상기 세스퀴테르펜을 생산할 수 있는 재조합 미생물은 β-히마찰렌 (β-himachalene), (-)-α-비사보롤 ((-)-α-bisabolol), 및 알로아로마덴드렌 (allo-aromadendrene)으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된, 세스퀴테르펜을 생산할 수 있는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 재조합 미생물은, 세스퀴테르펜 생산을 위하여 세스퀴테르펜의 전구 물질인 IPP (isopentenyl diphosphate)와 DMAPP (dimethylallyl diphosphate)의 생산능을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 미생물은 메발론산 합성 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자를 발현하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "미생물"은 야생형 미생물이나, 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 약화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물을 모두 포함하는 개념이다.

상기 미생물은 구체적으로 에스케리치아 속 (genus Escherichia)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 미생물은 에스케리치아 콜리 (Escherichia coli), 에스케리치아 에르마니 (E. hermannii), 에스케리치아 알베티 (E. albertii), 에스케리치아 블라태 (E. blattae), 에스케리치아 퍼거소니 (E. fergusonii), 에스케리치아 불르네리스 (E. vulneris) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 미생물은 구체적으로 슈도모나스 속 (genus Pseudomonas)일 수 있으며, 구체적으로 슈도모나스 퓨티다 (Pseudomonas putida)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "재조합 미생물"은 상기 미생물이 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 미생물을 지칭하는 것이다. 재조합 미생물은 상기 미생물의 야생형에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 발현할 수 있다. 또한 재조합 미생물은 야생형 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서 형질전환은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.

본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 본 발명의 세스퀴테르펜 신타아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 형질전환 시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 세스퀴테르펜을 생산할 수 있는 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 이의 배양물로부터 세스퀴테르펜을 회수하는 단계를 포함하는, 세스퀴테르펜을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 세스퀴테르펜을 생산할 수 있는 재조합 미생물에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 세스퀴테르펜 생산능을 가지는 미생물을 이용한 세스퀴테르펜 생산 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 회분식 공정, 유가식 또는 반복 유가식 공정 (fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "배양물"은 미생물과 그 미생물을 배양한 배양기 내에 존재하는 모든 물질을 포함한다. 일반적으로 미생물 자체와 미생물이 배지에 배출한 각종 효소, 대사물질 등을 함유하는 물질을 의미한다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별로 또는 혼합물로 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산 암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 인원으로서는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 25℃ 내지 37℃, 구체적으로는 25℃ 내지 30℃ 이다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량에 도달할 때까지 계속 할 수 있으며, 구체적으로는 24 내지 100 시간일 수 있으며, 원하는 세스퀴테르펜의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속할 수 있다. 상기 세스퀴테르펜은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

본 발명의 용어, "회수"는 특정 물질을 혼합물에서 분리해내는 과정을 의미한다. 미생물 또는 배지로부터 세스퀴테르펜을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 증류, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 분리된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질은 미생물에서 β-히마찰렌 (β-himachalene), (-)-α-비사보롤 ((-)-α-bisabolol), 또는 알로아로마덴드렌 (allo-aromadendrene) 생산능을 가지므로, 재조합 미생물을 통한 상기 물질의 대량생산에 널리 사용될 수 있다.

도 1은 기체 크로마토그래피를 통한 TPS3 효소의 생산물질 동정에 관한 것이다.
도 2는 기체 크로마토그래피-질량분석법을 통한 TPS3 효소의 생산물질에 포함된 β-히마찰렌 동정에 관한 것이다.
도 3은 기체 크로마토그래피-질량분석법을 통한 TPS3 효소의 생산물질에 포함된 (-)-α-비사보롤 동정에 관한 것이다.
도 4는 기체 크로마토그래피를 통한 TPS4 효소의 생산물질 동정에 관한 것이다.
도 5는 기체 크로마토그래피-질량분석법을 통한 TPS4 효소의 생산물질에 포함된 알로아로마덴드렌 동정에 관한 것이다.
도 6은 TPS3 효소의 아미노산 변이 도입을 통한 (-)-α-비사보롤 합성에 관한 것이다.
도 7은 ispA와 메발론산 경로를 동시 발현하는 단일 플라스미드를 함유한 TPS3 효소의 β-히마찰렌 생산에 관한 것이다.
도 8은 ispA와 메발론산 경로를 동시 발현하는 단일 플라스미드를 함유한 TPS4 생산의 알로아로마덴드렌 생산에 관한 것이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 예에 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 테르펜 합성효소 3 (Terpene synthase 3, TPS3), 테르펜 합성효소 4 (TPS4) 유전자 합성

구축되어 있던 고무나무 (Parthenium argentatum)의 cDNA library를 무작위로 시퀀싱하여 라이브러리 제작에 사용된 벡터 서열은 제거하고 고무나무의 DNA 서열만을 취하여 조합(assembly)한 후 BlastX를 통해 NCBI의 non-redundant database를 대상으로 비교 분석한 결과 2개의 테르펜 합성효소 유사체(homologue)를 발견하였다. 바이오니아 회사에 의뢰하여, 테르펜 합성효소 3 (서열번호 1)을 코딩하는 유전자와 테르펜 합성효소 4 (서열번호 2)를 코딩하는 유전자를 대장균 코돈에 최적화 하여 테르펜 합성효소를 코딩하는 DNA (서열번호 3, 4)를 합성하였다.

실시예 2: 테르펜 합성효소 3 발현 플라스미드인 pTSN-TPS3의 클로닝

테르펜 합성효소 3을 대장균에서 발현하기 위하여 pTSN-TPS3을 다음과 같이 제작하였다. 대장균 코돈에 최적화된 테르펜 합성효소 3 (서열번호 3)을 서열번호 7와 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 KOD-Plus-NEO 중합효소 (TOYOBO, Japan)로 중합효소 연쇄반응 (Polymerase chain reaction, 이하 PCR)을 하였다. 또한, pTSN 플라스미드를 주형으로 서열번호 9과 서열번호 10의 프라이머를 이용하여 KOD-Plus-NEO 중합효소로 PCR 하였다. 두 개의 증폭된 단편을 깁슨 어셈블리 (Gibson Assembly)(NEB, USA) 방법으로 연결하여 클로닝 하였다. 테르펜 합성효소 3 서열은 생어 시퀀싱 (Sanger sequencing) 방법으로 확인하였다.

실시예 3: 테르펜 합성효소 4 발현 플라스미드인 pTSN-TPS4의 클로닝

테르펜 합성효소 4를 대장균에서 발현하기 위하여 pTSN-TPS4를 다음과 같이 제작하였다. 대장균 코돈에 최적화된 테르펜 합성효소 4 (서열번호 4)를 서열번호 7와 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 KOD-Plus-NEO 중합효소로 PCR 하였다. 또한, pTSN 플라스미드를 주형으로 서열번호 11와 서열번호 12의 프라이머를 이용하여 KOD-Plus-NEO 중합효소로 PCR 하였다. 두 개의 증폭된 단편을 깁슨 어셈블리 방법으로 연결하여 클로닝하였다. 테르펜 합성효소 4 서열은 생어 시퀀싱 방법으로 확인하였다.

실시예 4: 대장균에서 메발론산 경로 (mevalonate pathway)를 이용하여 테르펜 합성효소 3 생산물 분석

테르펜 합성효소 3의 생산물을 동정하기 위하여 pTSN-TPS3을 대장균 DH5α (Enzynomics, korea)에 형질전환 하였다. 이때 테르펜 (terpene)의 전구체인 IPP (isopentenyl diphosphate)과 DMAPP (dimethyl allyl diphosphate)를 과량 공급하기 위하여 메발론산 경로를 발현하는 pSEVA241-MVA2(pBBR1) 플라스미드를 동시에 형질전환 하였다. 형질전환된 대장균을 항생제를 포함하는 LB (10 g/L 트립톤 (tryptone), 5 g/L 효모추출물 (yeast extract), 및 5 g/L NaCl, 암피실린 (ampicillin) 100 μg/ml, 카나마이신 (kanamycin) 25 μg/ml) 플레이트에서 선별한 후 단일 콜로니를 항생제를 포함하는 LB (10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모추출물, 및 5 g/L NaCl, 암피실린 100 μg/ml, 카나마이신 25 μg/ml) 배지에 접종하여 30℃, 200 rpm으로 하룻밤 동안 (overnight) 배양하였다. 배양액 1%를 항생제와 이소프로필-β-티오갈락토피라노시드(IPTG)와 글리세롤이 포함된 TB (12 g/L 효소 카제인 소화 (Enzymatic casein digest), 24 g/L 효모추출물, 9.4 g/L K₂HPO₄, 및 2.2 g/L KH₂PO₄, 3.5% (w/v) 글리세롤, 0.025 mM IPTG, 암피실린 100 μg/ml, 카나마이신 25 μg/ml)에 접종하였다. 이때 생성된 테르펜을 추출하기 위하여 n-도데칸 (n-dodecane) (Sigma, USA)을 배양 부피의 20% 첨가한 후 30℃, 200 rpm으로 2~3일 동안 배양하였다. 배양액을 13,000 rpm을 3분 동안 원심분리 하여 n-도데칸 층을 분리한 후 기체 크로마토그래피 (gas chromatography, GC) 및 기체 크로마토그래피-질량분석법 (GC-mass spectrometry, 이하 GC-MS)으로 생산물을 분석하였다.

실시예 5: 대장균에서 메발론산 경로를 이용하여 테르펜 합성효소 4 생산물 분석

테르펜 합성효소 4의 생산물을 동정하기 위하여 pTSN-TPS4를 대장균 DH5α에 형질전환 하였다. 이때 테르펜의 전구체인 DMAPP, IPP를 공급하기 위하여 메발론산 경로를 발현하는 pSEVA241-MVA2(pBBR1) 플라스미드를 동시에 형질전환 하였다. 형질전환된 대장균을 항생제를 포함하는 LB (10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모추출물, 및 5 g/L NaCl, 암피실린 100 μg/ml, 카나마이신 25 μg/ml) 플레이트에서 선별한 후 단일 콜로니를 항생제를 포함하는 LB (10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모추출물, 및 5 g/L NaCl, 암피실린 100 μg/ml, 카나마이신 25 μg/ml) 배지에 접종하여 30℃, 200 rpm으로 하룻밤 동안 배양하였다. 배양액 1%를 항생제와 이소프로필-β-티오갈락토피라노시드 (IPTG)와 글리세롤이 포함된 TB (12 g/L 효소 카제인 소화, 24 g/L 효모추출물, 9.4 g/L K₂HPO₄, 및 2.2 g/L KH₂PO₄, 3.5% (w/v) 글리세롤, 0.025 mM IPTG, 암피실린 100 μg/ml, 카나마이신 25 μg/ml)에 접종하였다. 이때 생성된 테르펜을 추출하기 위하여 n-도데칸을 배양 부피의 20% 첨가한 후 30℃, 200 rpm으로 2일 동안 배양하였다. 배양액을 13,000 rpm을 3분 동안 원심분리 하여 n-도데칸 층을 분리한 후 GC 및 GC-MS로 생산물을 분석하였다.

실시예 6: GC 및 GC-MS를 이용한 테르펜 분석

n-도데칸에 함유된 테르펜은 GC 및 GC-MS (Agilent 7890A, USA)를 이용하여 분석하였다. GC는 HP-5 컬럼 (30m X 0.320mm X 0.25 μm)을 사용하였고 오븐의 초기온도를 60℃, 2분 동안 유지한 후 5℃/분 속도로 200℃까지 증가시키고 2분간 유지하였다. 그 후 50℃/분으로 300℃까지 증가시키고 5분간 유지하였다. GC-MS는 HP-5MS 컬럼 (30m X 0.250mm X 0.25μm)을 사용하였고 오븐의 초기온도를 60℃, 2분 동안 유지한 후 5℃/분 속도로 300℃까지 증가시키고 10분간 유지하였다.

실시예 7: 테르펜 합성효소 3 (N402L) 발현 플라스미드인 pTSN-TPS3L 클로닝

테르펜 합성효소 3의 402번 아미노산인 아스파라진 (asparagine)을 류신 (leucine)으로 변환한 pTSN-TPS3L을 다음과 같이 제작하였다. pTSN-TPS3 플라스미드를 주형으로 서열번호 9과 서열번호 13의 프라이머를 이용하여 KOD-Plus-NEO 중합효소로 PCR 하였다. 또한, pTSN-TPS3 플라스미드를 주형으로 서열번호 7와 서열번호 14의 프라이머를 이용하여 KOD-Plus-NEO 중합효소로 PCR 하였다. 두 개의 증폭된 단편을 깁슨 어셈블리 방법으로 연결하여 클로닝 하였다. 변이된 테르펜 합성효소 3 (N402L) 서열은 생어 시퀀싱 방법으로 확인하였다.

실시예 8: 테르펜 합성효소 3 (N402L, T429G) 발현 플라스미드인 pTSN-TPS3LG 클로닝

테르펜 합성효소 3의 402번 아미노산인 아스파라진을 류신으로, 429 아미노산인 트레오닌 (threonine)을 글리신 (glycine)으로 변환한 pTSN-TPS3LG를 다음과 같이 제작하였다. pTSN-TPS3L 플라스미드를 주형으로 서열번호 9와 서열번호 15의 프라이머를 이용하여 KOD-Plus-NEO 중합효소로 PCR 하였다. 또한, pTSN-TPS3L 플라스미드를 주형으로 서열번호 7과 서열번호 16의 프라이머를 이용하여 KOD-Plus-NEO 중합효소로 PCR 하였다. 두 개의 증폭된 단편을 깁슨 어셈블리 방법으로 연결하여 클로닝 하였다. 변이된 테르펜 합성효소 3 (N402L, T429G) 서열은 생어 시퀀싱 방법으로 확인하였다.

실시예 9: 메발론산 경로 및 ispA 를 포함한 TPS3, TPS4를 발현하는 단일 플라스미드 클로닝

pTSN-TPS3 혹은 pTSN-TPS4를 XbaI으로 절단 한 후 ispA와 메발론산 경로를 발현하는 DNA를 삽입하여 pTSN-TPS3-IspA-MVA 및 pTSN-TPS4-IspA-MVA를 각각 제작하였다.

실시예 10: 대장균에서 β-히마찰렌 (β-himachalene) 생산

β-히마찰렌을 대량생산하기 위하여 TPS3, IspA, 메발론산 경로를 발현하는 단일 플라스미드인 pTSN-TPS3-IspA-MVA를 제작하였다. pTSN-TPS3-IspA-MVA이 형질전환된 대장균을 항생제를 포함하는 LB (10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모추출물, 및 5 g/L NaCl, 암피실린 100 μg/ml) 플레이트에서 선별한 후 단일 콜로니를 항생제를 포함하는 LB (10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모추출물, 및 5 g/L NaCl, 암피실린 100 μg/ml) 배지에 접종하여 30℃, 200 rpm으로 하룻밤 동안 배양하였다. 배양액 1%를 항생제와 글리세롤이 포함된 TB (12 g/L 효소 카제인 소화, 24 g/L 효모추출물, 9.4 g/L K₂HPO₄, 및 2.2 g/L KH₂PO₄, 3.5% (w/v) 글리세롤, 암피실린 100 μg/ml)에 접종하였고 n-도데칸을 배양 부피의 20% 첨가한 후 30℃, 200 rpm으로 2일 동안 배양하였다. 배양액을 13,000 rpm을 3분 동안 원심분리 하여 n-도데칸 층을 분리한 후 기체 크로마토그래피 (GC)로 생산물을 분석하였다.

실시예 11: 대장균에서 알로아로마덴드렌 (allo-aromadendrene) 생산

알로아로마덴드렌을 대량생산하기 위하여 TPS4, IspA, 메발론산 경로를 발현하는 단일 플라스미드인 pTSN-TPS4-IspA-MVA를 제작하였다. pTSN-TPS4-IspA-MVA이 형질전환된 대장균을 항생제를 포함하는 LB (10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모추출물, 및 5 g/L NaCl, 암피실린 100 μg/ml) 플레이트에서 선별한 후 단일 콜로니를 항생제를 포함하는 LB (10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모추출물, 및 5 g/L NaCl, 암피실린 100 μg/ml) 배지에 접종하여 30℃, 200 rpm으로 하룻밤 동안 배양하였다. 배양액 1%를 항생제와 글리세롤이 포함된 TB (12 g/L 효소 카제인 소화, 24 g/L 효모추출물, 9.4 g/L K₂HPO₄, 및 2.2 g/L KH₂PO₄, 3.5% (w/v) 글리세롤, 암피실린 100 μg/ml)에 접종하였고 n-도데칸을 배양 부피의 20% 첨가한 후 30℃, 200 rpm으로 2일 동안 배양하였다. 배양액을 13,000 rpm을 3분 동안 원심분리 하여 n-도데칸 층을 분리한 후 기체 크로마토그래피 (GC)로 생산물을 분석하였다.

실험예 1: TPS3 단백질 분석

서열번호 1의 TPS3 단백질 길이는 575개 아미노산으로 이루어져 있다. 이 단백질의 기능을 예측하고자 NCBI의 Non-redundant protein sequences (nr) 데이터베이스에 대해 BLASTp 프로그램을 이용하여 가장 근접한 단백질을 검색하였다. 검색결과 해바라기 (Helianthus annuus) 유래의 β-파르네센 합성효소 유사 단백질 (β-farnesene synthase-like) [GeneBank: XP_022017387.1] 과 가장 높은 상동성인 85% 상동성을 나타냈다.

실험예 2: TPS4 단백질 분석

서열번호 2의 TPS4 단백질 길이는 546개 아미노산으로 이루어져 있다. 이 단백질의 기능을 예측하고자 NCBI의 Non-redundant protein sequences (nr) 데이터베이스에 대해 BLASTp 프로그램을 이용하여 가장 근접한 단백질을 검색하였다. 검색결과 해바라기 (Helianthus annuus) 유래의 β-카리오필렌 합성효소 유사 단백질 (β-caryophyllene synthase-like) [GeneBank: XP_021995087.1] 과 가장 높은 상동성인 86% 상동성을 나타냈다. 상기 TPS3 및 TPS4의 분석 결과를 정리하면 하기와 같다 (표 1).

테르펜 합성효소	아미노산	NCBI' blast를 이용한 최적 대응 (상동성)
TPS3	575 아미노산 (전체 길이)	(E)-베타-파르네센 합성효소 (85%)
TPS4	546 아미노산 (전체 길이)	베타-카리오필렌 합성효소 (86%)

실험예 3: TPS3 효소의 생산물질 동정

TPS3 효소의 기능을 대장균에서 단백질을 발현하여 밝히고자 하였다. 대장균에서의 발현을 용이하게 하기 위해서 TPS3 DNA 서열을 대장균 코돈에 맞게 최적화하였다. 또한, 세스퀴테르펜의 전구물질인 IPP와 DMAPP를 공급하기 위하여 메발론산 경로를 발현하는 플라스미드인 pSEVA241-MVA2(pBBR1)를 pTSN-TPS3와 동시에 형질전환 하였다. 탄소원인 글리세롤로부터 세스퀴테르펜을 효과적으로 생산하기 위하여 0.025 mM IPTG가 함유된 TB 배지를 사용하였고 세스퀴테르펜을 추출하기 위하여 n-도데칸을 배양액의 20% 부피를 오버레이하여 30℃, 200 rpm으로 2일 동안 배양하였다. 배양 후 n-도데칸 층을 GC로 분석한 결과 음성대조군인 공벡터가 형질전환된 대장균에 존재하지 않는 신규 피크가 20분에 나타났고 (도 1), 이 피크는 GC-MS를 통해 β-히마찰렌 [Cas number: 1461-03-6]으로 동정되었다 (도 2). 또한, 소량의 (-)-α-비사보롤 ((-)-α-bisabolol) 피크도 GC-MS에서 검출 되었다 (도 3).

실험예 4: TPS4 효소의 생산물질 동정

TPS4 효소의 기능을 대장균에서 단백질을 발현하여 밝히고자 하였다. 대장균에서의 발현을 용이하게 하기 위해서 TPS4 DNA 서열을 대장균 코돈에 맞게 최적화하였다. 또한, 세스퀴테르펜의 전구물질인 IPP와 DMAPP를 공급하기 위하여 메발론산 경로를 발현하는 플라스미드인 pSEVA241-MVA2(pBBR1)를 pTSN-TPS4와 동시에 형질전환 하였다. 탄소원인 글리세롤로부터 세스퀴테르펜을 효과적으로 생산하기 위하여 0.025 mM IPTG가 함유된 TB 배지를 사용하였고 세스퀴테르펜을 추출하기 위하여 n-도데칸을 배양액의 20% 부피를 오버레이하여 30℃, 200 rpm으로 3일 동안 배양하였다. 배양 후 n-도데칸 층을 GC로 분석한 결과 음성대조군인 공벡터가 형질전환된 대장균에 존재하지 않는 신규 피크가 21.3분에 나타났고 (도 4), 이 피크는 GC-MS를 통해 알로아로마덴드렌 [Cas number: 25246-27-9]으로 동정되었다 (도 5).

실험예 5: TPS3 효소의 변이 도입을 통한 (-)-α-비사보롤 합성

TPS3가 약한 활성으로 (-)-α-비사보롤을 합성하는 특성을 이용하여 TPS3에 돌연변이를 도입하여 주 생산물인 β-히마찰렌 대신에 (-)-α-비사보롤을 생산하고자 하였다. 이를 위해 TPS3의 402번 아스파라진 잔기를 류신으로 치환한 TPS3 (N402L) 혹은 TPS3의 402번 아스파라진 잔기를 류신으로 치환하고 429번 트레오닌 잔기를 글리신으로 치환한 TPS3 (N402L, T429G)을 제작하였다. 각각의 발현 플라스미드를 pSEVA241-MVA2(pBBR1) 과 동시에 형질전환하고 글리세롤, 0.025 mM IPTG가 함유된 TB 배지에 n-도데칸을 20% 오버레이하여 30℃, 200 rpm으로 2일 동안 배양하였다. 배양 후 n-도데칸 층을 GC로 분석한 결과 TPS3 (N402L)의 경우 β-히마찰렌의 생산이 34% 감소하고 (-)-α-비사보롤 피크가 증가하였다 (도 6). TPS3 (N402L, T429G)의 경우 β-히마찰렌의 생산이 80% 감소하고 (-)-α-비사보롤 이 전체 생산물의 80% 이상 합성되었다.

실험예 6: IspA와 메발론산 경로를 동시 발현하는 단일 플라스미드를 통한 TPS3 생산

β-히마찰렌을 대장균에서 과량 생산하기 위하여 pTSN-TPS3 플라스미드에 IspA와 메발론산 경로를 발현하는 pTSN-TPS3-IspA-MVA를 제작하였다. 또한, 항생제 사용 및 IPTG 사용을 줄이고자 모든 유전자를 높은 복제개수 (high copy number)의 단일 플라스미드에 도입하였다. 제작한 플라스미드를 형질전환 하고 글리세롤이 함유된 TB 배지에 n-도데칸을 20% 오버레이하여 30℃, 200 rpm으로 2일 동안 배양하였다. 배양 후 n-도데칸 층을 GC로 분석한 결과 pTSN-TPS3 플라스미드에 비해 pTSN-TPS3-IspA-MVA 플라스미드가 형질전환된 대장균이 35배 더 많은 β-히마찰렌을 생산하였다 (도 7).

실험예 7: IspA와 메발론산 경로를 동시 발현하는 단일 플라스미드를 통한 TPS4 생산

알로아로마덴드렌을 대장균에서 과량 생산하기 위하여 pTSN-TPS4 플라스미드에 IspA와 메발론산 경로를 발현하는 pTSN-TPS4-IspA-MVA를 제작하였다. 또한, 항생제 사용 및 IPTG 사용을 줄이고자 모든 유전자를 높은 복제개수의 단일 플라스미드에 도입하였다. 제작한 플라스미드를 형질전환 하고 글리세롤이 함유된 TB 배지에 n-도데칸을 20% 오버레이하여 30℃, 200 rpm으로 2일 동안 배양하였다. 배양 후 n-도데칸 층을 GC로 분석한 결과 pTSN-TPS4 플라스미드에 비해 pTSN-TPS4-IspA-MVA 플라스미드가 형질전환된 대장균이 21배 더 많은 알로아로마덴드렌을 생산하였다 (도 8).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실험 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Novel sesquiterpene synthase and a method for producing sesquiterpene using the same <130> KPA160505-KR <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 575 <212> PRT <213> Parthenium argentatum <400> 1 Met Ser Thr Phe Leu Val Ser Ser Ala Ser Phe Ser Ser Ser Ile Leu 1 5 10 15 Pro Ser Ala Val Asp Asp Asn Cys Gly Thr Lys Gln Asn Val Ile Arg 20 25 30 Asn Thr Thr Asn Phe Asn Ala Ser Ile Trp Gly Asp Gln Phe Leu Thr 35 40 45 Pro Asp Glu Pro Glu Asp Leu Ala Met Glu Lys Gln Ala Val Glu Glu 50 55 60 Leu Lys Glu Glu Val Arg Lys Glu Leu Met Ile Lys Ala Ser Ser Asn 65 70 75 80 Glu Pro Leu Gln His Met Lys Met Ile Asp Leu Ile Asp Val Val Gln 85 90 95 Arg Leu Gly Ile Ala Tyr His Phe Glu Asp Glu Ile Glu Glu Ala Leu 100 105 110 Gln His Ile Tyr Val Thr Tyr Gly Glu Lys Trp Ile Gly His Asn Asn 115 120 125 Leu Gln Asn Ile Ala Leu Trp Phe Arg Leu Leu Arg Gln Gln Gly Phe 130 135 140 Asn Leu Ser Ser Glu Ile Phe Lys Asn His Met Asp Glu Glu Gly Arg 145 150 155 160 Phe Lys Glu Ser Phe Cys Ala Asp Ala Gln Gly Leu Leu Ala Leu Tyr 165 170 175 Glu Ala Ser Tyr Met Lys Val Glu Gly Glu Lys Val Leu Asp Asp Ala 180 185 190 Leu Glu Phe Thr Lys Thr His Leu Val Ile Ile Ala Lys Asp Pro Ser 195 200 205 Cys Asp Ser Leu Leu Arg Thr Gln Ile Gln Gln Ala Leu Lys Gln Pro 210 215 220 Leu Arg Lys Arg Leu Pro Arg Leu Glu Ala Val Arg Tyr Ile Pro Ile 225 230 235 240 Tyr Gln Gln Glu Pro Ser His Asn Glu Val Leu Leu Lys Leu Ala Lys 245 250 255 Ser Asp Phe Asn Val Leu Gln Ser Met His Lys Lys Glu Leu Ser Gln 260 265 270 Ile Cys Lys Trp Trp Lys Asp Leu Asp Met Gln Asn Lys Leu Pro Tyr 275 280 285 Val Arg Asp Arg Leu Ile Glu Gly Tyr Phe Trp Ile Leu Gly Val Tyr 290 295 300 Phe Glu Pro Gln His Ser Arg Thr Arg Met Phe Leu Met Lys Thr Ser 305 310 315 320 Met Trp Leu Ile Val Leu Asp Asp Thr Phe Asp Asn Tyr Gly Thr Tyr 325 330 335 Glu Glu Leu Lys Ile Phe Thr Glu Ala Val Glu Arg Trp Ser Met Ser 340 345 350 Cys Leu Asp Thr Leu Pro Glu Tyr Met Lys Leu Ile Tyr Gln Glu Leu 355 360 365 Leu Asn His His Gln Glu Met Glu Glu Leu Ile Glu Lys Glu Gly Lys 370 375 380 Ala Tyr Gln Ile Gln Tyr Val Lys Glu Met Ala Lys Glu Val Ile Arg 385 390 395 400 Asn Asn Leu Val Glu Ala Arg Trp Leu Lys Glu Gly Tyr Met Pro Thr 405 410 415 Leu Glu Glu Tyr Met Ser Val Ser Val Lys Thr Cys Thr Tyr Gly Leu 420 425 430 Met Ile Ala Arg Ser Tyr Val Gly Arg Ala Asp His Met Val Thr Glu 435 440 445 Asp Thr Phe Lys Trp Val Thr Thr Tyr Pro Pro Ile Val Lys Ala Ala 450 455 460 Cys Phe Ile Leu Arg Leu Met Asp Asp Ile Thr Thr His Lys Glu Glu 465 470 475 480 Gln Glu Arg Gly His Val Ala Ser Ser Ile Glu Cys Tyr Gln Asn Glu 485 490 495 Thr Gly Ala Ser Glu Glu Glu Ala Cys Lys Phe Ile Leu Lys Lys Ile 500 505 510 Glu Asp Ala Trp Lys Val Ile Asn Arg Asp Ser Leu Arg Pro Thr Glu 515 520 525 Ile Pro Phe Pro Leu Leu Met Ser Thr Ile Asn Phe Ala Arg Ala Cys 530 535 540 Asp Val Ile Tyr Lys Val Asn Asp Gly Tyr Thr His Ala Glu Glu Glu 545 550 555 560 Met Ile Ser His Ile Lys Ser Ile Leu Val His Pro Ala Ala Ile 565 570 575 <210> 2 <211> 546 <212> PRT <213> Parthenium argentatum <400> 2 Met Ser Phe Gln Gln Glu Val Ile Arg Pro Leu Arg Asp Tyr Gln Pro 1 5 10 15 Ser Ile Trp Gly Asp Lys Phe Leu Ile Tyr Asn Lys Gln Pro Lys Gln 20 25 30 Asp Glu Ala Lys Gln Ile Val Tyr Asp Leu Lys Glu Gln Val Arg Lys 35 40 45 Asn Ile Glu Ala Ala Leu Asn Ser Pro Lys Glu His Thr Arg Leu Leu 50 55 60 Lys Gln Ile Asp Thr Ile Gln Arg Leu Gly Ile Ser Tyr Tyr Phe Glu 65 70 75 80 Glu Glu Ile Asp Lys Ala Leu Lys His Val Tyr Asp Ala Tyr Gly Asp 85 90 95 Asn Trp Asn Gly Gly Ser Pro Ser Leu Trp Phe Arg Leu Leu Arg Gln 100 105 110 His Gly Phe Tyr Val Ser Cys Asp Val Phe Asn Asn Tyr Lys Asp Glu 115 120 125 Gln Gly Ala Phe Lys Arg Ser Leu Thr Ser Asp Val Glu Glu Leu Leu 130 135 140 Glu Leu Tyr Glu Ala Thr Tyr Met Arg Val Gln Gly Glu Val Val Leu 145 150 155 160 Asp Glu Ala Leu Ser Phe Thr Lys Thr Arg Leu Asn Glu Ile Ala Lys 165 170 175 Asp Pro Ile Arg Ser Asn Ser Thr Leu Ser Ala His Ile Gln Glu Ala 180 185 190 Leu Glu Gln Pro Ile Arg Lys Arg Leu Pro Arg Leu Glu Ala Leu Arg 195 200 205 Tyr Ile Gln Phe Tyr Gln Gln Gln Pro Ser His Asp Asp Thr Leu Leu 210 215 220 Lys Leu Ala Lys Phe Gly Phe Asn Leu Val Gln Ser Leu Tyr Lys Lys 225 230 235 240 Glu Leu Ser Gln Leu Ser Glu Trp Trp Asn Gly Met Asp Val Pro Asn 245 250 255 Asn Leu Pro Tyr Ala Arg Asp Arg Leu Val Glu Ser Tyr Phe Trp Ala 260 265 270 Leu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Lys Tyr Ser Leu Ala Arg Ile Phe Leu 275 280 285 Ala Lys Val Ile Ala Met Ala Thr Val Ile Asp Asp Thr Tyr Asp Ala 290 295 300 Tyr Gly Ile Tyr Glu Glu Leu Glu Ile Phe Thr Glu Ala Val Met Arg 305 310 315 320 Trp Ser Asp Thr Cys Leu Asp Met Leu Pro Gly Tyr Met Lys Leu Ile 325 330 335 Tyr Gln Thr Leu Leu Asp Met Tyr Lys Glu Met Glu Glu Ile Leu Glu 340 345 350 Lys Glu Gly Lys Ile Asp Leu Phe Asn Cys Ala Lys Glu Phe Met Lys 355 360 365 Thr Phe Ile Arg Gly Tyr Met Met Glu Ala Lys Trp Leu Asn Glu Gly 370 375 380 Tyr Ile Pro Thr Thr Glu Glu His Ala Ser Val Ala Tyr Val Thr Gly 385 390 395 400 Gly Gly Ser Ile Leu Ile Thr Ser Cys Tyr Leu Gly Met Ala Asn Ile 405 410 415 Val Thr Asp Lys Ser Ile Lys Trp Ala Leu Thr Glu Pro Pro Leu Phe 420 425 430 Lys Ala Ser Ser Lys Ile Gly Arg Leu Leu Asn Asp Ile Ala Gly His 435 440 445 Lys Glu Glu Gln Glu Arg Lys His Phe Pro Ser Ala Ile Glu Ser Tyr 450 455 460 Lys Lys Glu Tyr Asp Val Thr Glu Glu His Ala Tyr Asp Leu Leu His 465 470 475 480 Glu Gln Ile Glu Asp Val Trp Lys Asp Val Asn Arg Glu Ser Leu Val 485 490 495 Cys Lys Asp Val Pro Met Pro Leu Ile Met Val Thr Val Asn Leu Ile 500 505 510 Arg Thr Leu Glu Val Leu Tyr Lys Asp Thr Asp Asn Phe Thr His Ala 515 520 525 Gly Glu Glu Phe Lys Asn His Ile Lys Ser Leu Leu Val His Ala Ile 530 535 540 Ser Ile 545 <210> 3 <211> 1725 <212> DNA <213> Parthenium argentatum <400> 3 atgagcacct tcctggttag cagcgcaagc ttcagcagct cgattctccc gtcagcagtc 60 gatgataatt gtggtaccaa acagaatgtc atacgtaaca caaccaattt caatgcaagc 120 atttggggcg accagtttct cactcccgat gaaccggaag atctggctat ggaaaaacaa 180 gcggttgagg agctgaaaga ggaagttcgt aaggaactga tgattaaagc gagcagtaac 240 gaaccgctgc agcacatgaa aatgattgac ctgatcgacg ttgttcagcg tctgggcatc 300 gcatatcatt tcgaagacga aattgaggag gcactacagc acatttacgt tacctacggt 360 gagaagtgga ttggtcataa caatctgcag aacattgctc tgtggttccg actgctgcgt 420 cagcagggtt tcaacctgag cagcgaaatt tttaaaaacc acatggatga agaaggccgt 480 tttaaagaga gcttttgcgc cgatgcacag ggcctgctgg ccctctatga agccagctac 540 atgaaagttg agggcgaaaa agtcctggat gacgcgctgg aatttactaa aacccatctg 600 gttataatag cgaaggatcc gagctgtgat agcctgctgc gtacccagat acagcaagcg 660 ctgaaacagc cgctgcgtaa gcgcctgccg cgtctggaag ctgttcgtta cattccgatc 720 tatcaacagg aaccctcgca taacgaagtt ctgctgaaac tggcaaagag cgattttaat 780 gtgctgcaga gcatgcataa aaaagaactg agccaaattt gcaaatggtg gaaagatctg 840 gatatgcaaa ataagctgcc gtatgttcgc gatcgtctga tcgaagggta cttttggatt 900 ctgggagttt attttgaacc gcagcacagc cgcaccagga tgttcctgat gaaaactagc 960 atgtggctga ttgttctgga tgataccttt gacaactatg gtacctatga ggaactgaaa 1020 atttttaccg aggcggtgga acgctggagc atgagctgcc tggatacact gcctgaatac 1080 atgaaactga tttatcaaga gctgctgaat caccatcaag agatggagga gctgattgag 1140 aaggagggta aggcatatca aatccagtat gtaaaagaaa tggcaaaaga agttattcgt 1200 aacaatctcg tcgaagcccg ttggcttaag gagggttaca tgccgacact ggaggaatac 1260 atgagcgtta gcgttaaaac gtgtacctat ggactgatga tcgcccgtag ctatgtgggg 1320 cgtgccgatc acatggttac cgaagacacc ttcaaatggg ttaccaccta tccgcccatt 1380 gtgaaagccg cttgttttat tctgcggctg atggacgata ttaccaccca taaagaggag 1440 caagaacgcg gacatgttgc cagcagcatt gaatgctatc agaacgagac cggggcgagc 1500 gaagaagaag cttgtaagtt tatcctgaaa aagattgaag acgcgtggaa agttatcaat 1560 cgtgacagct tgcgcccgac cgaaatcccg tttccgctgc tgatgagcac cataaatttt 1620 gcgagggcct gcgacgttat ttataaagtg aatgatggtt atacgcatgc tgaagaagaa 1680 atgatttccc atatcaagag catcctggtt catccggcgg caatc 1725 <210> 4 <211> 1638 <212> DNA <213> Parthenium argentatum <400> 4 atgagctttc agcaggaagt tatccgtccg ctgcgagatt atcagccgtc catctggggc 60 gataaatttc tgatctataa taaacaaccg aaacaggatg aggcaaaaca gattgtttac 120 gacctgaaag agcaggttcg taaaaacatt gaagctgccc ttaatagccc gaaagaacat 180 acccgtcttc tgaagcagat tgacaccatt caacgtctcg gtatcagcta ttatttcgag 240 gaggaaatcg ataaagcgct gaaacacgtg tatgacgcgt atggggataa ctggaatgga 300 gggagcccga gcctgtggtt tcgtctgctt cgtcagcatg gcttttacgt ctcttgtgat 360 gtcttcaaca actataaaga tgaacaggga gcatttaaac gttccctgac cagcgatgta 420 gaagaactac tggaactgta cgaagcaacc tatatgcggg tgcagggtga agttgtgctg 480 gatgaagcgc tgagctttac caaaacccgt ctgaatgaaa ttgccaaaga ccctattcga 540 agcaacagca ccctgtccgc ccacattcaa gaggcgctgg agcagccgat tcgtaagcgc 600 ctgccgcgtc tggaagcact gagatatatt cagttttatc agcagcagcc tagccatgat 660 gataccctgc tgaaactggc aaaatttggt ttcaacctgg tgcagagcct gtacaagaaa 720 gagctgtcgc aactgagcga gtggtggaat ggtatggatg ttcctaataa tctgccgtat 780 gccagggatc gcctggttga aagctatttc tgggccctgg gtgtatatag cgaaccgaag 840 tacagcctgg cacgcatttt cctggccaag gttatcgcaa tggcgaccgt tattgacgat 900 acctatgacg cctacggtat atatgaagaa ctggaaattt tcactgaagc cgttatgcgt 960 tggagcgata cctgcctgga catgctgcca ggatatatga aactgattta tcaaaccctg 1020 ctggatatgt ataaagaaat ggaagagatc ctggaaaagg aagggaaaat tgatctgttt 1080 aattgcgcaa aagaatttat gaaaaccttt attcgtggct acatgatgga ggctaagtgg 1140 ctgaatgaag gctacattcc gacgaccgag gagcatgcga gcgtggccta tgtgaccggc 1200 gggggcagca tcctgattac ctcgtgctac ctgggaatgg caaatattgt aacagataaa 1260 agcataaaat gggcgctgac cgaaccgcct ctgttcaaag catccagcaa aattggccgt 1320 ctactcaacg atattgcggg tcacaaggaa gagcaggaac gtaaacactt cccaagcgca 1380 attgaaagct acaagaagga gtatgacgta accgaggagc acgcttacga cctgctgcat 1440 gagcaaattg aggatgtgtg gaaagacgta aatcgtgaga gtctggtctg taaagacgtc 1500 cccatgccgc tgattatggt cactgtgaat ctgattcgga ccctggaagt tctgtacaaa 1560 gataccgaca attttactca tgctggtgaa gaatttaaaa accatattaa gagcctgctg 1620 gttcatgcga ttagcatt 1638 <210> 5 <211> 575 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TPS3 N402L <400> 5 Met Ser Thr Phe Leu Val Ser Ser Ala Ser Phe Ser Ser Ser Ile Leu 1 5 10 15 Pro Ser Ala Val Asp Asp Asn Cys Gly Thr Lys Gln Asn Val Ile Arg 20 25 30 Asn Thr Thr Asn Phe Asn Ala Ser Ile Trp Gly Asp Gln Phe Leu Thr 35 40 45 Pro Asp Glu Pro Glu Asp Leu Ala Met Glu Lys Gln Ala Val Glu Glu 50 55 60 Leu Lys Glu Glu Val Arg Lys Glu Leu Met Ile Lys Ala Ser Ser Asn 65 70 75 80 Glu Pro Leu Gln His Met Lys Met Ile Asp Leu Ile Asp Val Val Gln 85 90 95 Arg Leu Gly Ile Ala Tyr His Phe Glu Asp Glu Ile Glu Glu Ala Leu 100 105 110 Gln His Ile Tyr Val Thr Tyr Gly Glu Lys Trp Ile Gly His Asn Asn 115 120 125 Leu Gln Asn Ile Ala Leu Trp Phe Arg Leu Leu Arg Gln Gln Gly Phe 130 135 140 Asn Leu Ser Ser Glu Ile Phe Lys Asn His Met Asp Glu Glu Gly Arg 145 150 155 160 Phe Lys Glu Ser Phe Cys Ala Asp Ala Gln Gly Leu Leu Ala Leu Tyr 165 170 175 Glu Ala Ser Tyr Met Lys Val Glu Gly Glu Lys Val Leu Asp Asp Ala 180 185 190 Leu Glu Phe Thr Lys Thr His Leu Val Ile Ile Ala Lys Asp Pro Ser 195 200 205 Cys Asp Ser Leu Leu Arg Thr Gln Ile Gln Gln Ala Leu Lys Gln Pro 210 215 220 Leu Arg Lys Arg Leu Pro Arg Leu Glu Ala Val Arg Tyr Ile Pro Ile 225 230 235 240 Tyr Gln Gln Glu Pro Ser His Asn Glu Val Leu Leu Lys Leu Ala Lys 245 250 255 Ser Asp Phe Asn Val Leu Gln Ser Met His Lys Lys Glu Leu Ser Gln 260 265 270 Ile Cys Lys Trp Trp Lys Asp Leu Asp Met Gln Asn Lys Leu Pro Tyr 275 280 285 Val Arg Asp Arg Leu Ile Glu Gly Tyr Phe Trp Ile Leu Gly Val Tyr 290 295 300 Phe Glu Pro Gln His Ser Arg Thr Arg Met Phe Leu Met Lys Thr Ser 305 310 315 320 Met Trp Leu Ile Val Leu Asp Asp Thr Phe Asp Asn Tyr Gly Thr Tyr 325 330 335 Glu Glu Leu Lys Ile Phe Thr Glu Ala Val Glu Arg Trp Ser Met Ser 340 345 350 Cys Leu Asp Thr Leu Pro Glu Tyr Met Lys Leu Ile Tyr Gln Glu Leu 355 360 365 Leu Asn His His Gln Glu Met Glu Glu Leu Ile Glu Lys Glu Gly Lys 370 375 380 Ala Tyr Gln Ile Gln Tyr Val Lys Glu Met Ala Lys Glu Val Ile Arg 385 390 395 400 Asn Leu Leu Val Glu Ala Arg Trp Leu Lys Glu Gly Tyr Met Pro Thr 405 410 415 Leu Glu Glu Tyr Met Ser Val Ser Val Lys Thr Cys Thr Tyr Gly Leu 420 425 430 Met Ile Ala Arg Ser Tyr Val Gly Arg Ala Asp His Met Val Thr Glu 435 440 445 Asp Thr Phe Lys Trp Val Thr Thr Tyr Pro Pro Ile Val Lys Ala Ala 450 455 460 Cys Phe Ile Leu Arg Leu Met Asp Asp Ile Thr Thr His Lys Glu Glu 465 470 475 480 Gln Glu Arg Gly His Val Ala Ser Ser Ile Glu Cys Tyr Gln Asn Glu 485 490 495 Thr Gly Ala Ser Glu Glu Glu Ala Cys Lys Phe Ile Leu Lys Lys Ile 500 505 510 Glu Asp Ala Trp Lys Val Ile Asn Arg Asp Ser Leu Arg Pro Thr Glu 515 520 525 Ile Pro Phe Pro Leu Leu Met Ser Thr Ile Asn Phe Ala Arg Ala Cys 530 535 540 Asp Val Ile Tyr Lys Val Asn Asp Gly Tyr Thr His Ala Glu Glu Glu 545 550 555 560 Met Ile Ser His Ile Lys Ser Ile Leu Val His Pro Ala Ala Ile 565 570 575 <210> 6 <211> 575 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TPS3 N402L, T429G <400> 6 Met Ser Thr Phe Leu Val Ser Ser Ala Ser Phe Ser Ser Ser Ile Leu 1 5 10 15 Pro Ser Ala Val Asp Asp Asn Cys Gly Thr Lys Gln Asn Val Ile Arg 20 25 30 Asn Thr Thr Asn Phe Asn Ala Ser Ile Trp Gly Asp Gln Phe Leu Thr 35 40 45 Pro Asp Glu Pro Glu Asp Leu Ala Met Glu Lys Gln Ala Val Glu Glu 50 55 60 Leu Lys Glu Glu Val Arg Lys Glu Leu Met Ile Lys Ala Ser Ser Asn 65 70 75 80 Glu Pro Leu Gln His Met Lys Met Ile Asp Leu Ile Asp Val Val Gln 85 90 95 Arg Leu Gly Ile Ala Tyr His Phe Glu Asp Glu Ile Glu Glu Ala Leu 100 105 110 Gln His Ile Tyr Val Thr Tyr Gly Glu Lys Trp Ile Gly His Asn Asn 115 120 125 Leu Gln Asn Ile Ala Leu Trp Phe Arg Leu Leu Arg Gln Gln Gly Phe 130 135 140 Asn Leu Ser Ser Glu Ile Phe Lys Asn His Met Asp Glu Glu Gly Arg 145 150 155 160 Phe Lys Glu Ser Phe Cys Ala Asp Ala Gln Gly Leu Leu Ala Leu Tyr 165 170 175 Glu Ala Ser Tyr Met Lys Val Glu Gly Glu Lys Val Leu Asp Asp Ala 180 185 190 Leu Glu Phe Thr Lys Thr His Leu Val Ile Ile Ala Lys Asp Pro Ser 195 200 205 Cys Asp Ser Leu Leu Arg Thr Gln Ile Gln Gln Ala Leu Lys Gln Pro 210 215 220 Leu Arg Lys Arg Leu Pro Arg Leu Glu Ala Val Arg Tyr Ile Pro Ile 225 230 235 240 Tyr Gln Gln Glu Pro Ser His Asn Glu Val Leu Leu Lys Leu Ala Lys 245 250 255 Ser Asp Phe Asn Val Leu Gln Ser Met His Lys Lys Glu Leu Ser Gln 260 265 270 Ile Cys Lys Trp Trp Lys Asp Leu Asp Met Gln Asn Lys Leu Pro Tyr 275 280 285 Val Arg Asp Arg Leu Ile Glu Gly Tyr Phe Trp Ile Leu Gly Val Tyr 290 295 300 Phe Glu Pro Gln His Ser Arg Thr Arg Met Phe Leu Met Lys Thr Ser 305 310 315 320 Met Trp Leu Ile Val Leu Asp Asp Thr Phe Asp Asn Tyr Gly Thr Tyr 325 330 335 Glu Glu Leu Lys Ile Phe Thr Glu Ala Val Glu Arg Trp Ser Met Ser 340 345 350 Cys Leu Asp Thr Leu Pro Glu Tyr Met Lys Leu Ile Tyr Gln Glu Leu 355 360 365 Leu Asn His His Gln Glu Met Glu Glu Leu Ile Glu Lys Glu Gly Lys 370 375 380 Ala Tyr Gln Ile Gln Tyr Val Lys Glu Met Ala Lys Glu Val Ile Arg 385 390 395 400 Asn Leu Leu Val Glu Ala Arg Trp Leu Lys Glu Gly Tyr Met Pro Thr 405 410 415 Leu Glu Glu Tyr Met Ser Val Ser Val Lys Thr Cys Gly Tyr Gly Leu 420 425 430 Met Ile Ala Arg Ser Tyr Val Gly Arg Ala Asp His Met Val Thr Glu 435 440 445 Asp Thr Phe Lys Trp Val Thr Thr Tyr Pro Pro Ile Val Lys Ala Ala 450 455 460 Cys Phe Ile Leu Arg Leu Met Asp Asp Ile Thr Thr His Lys Glu Glu 465 470 475 480 Gln Glu Arg Gly His Val Ala Ser Ser Ile Glu Cys Tyr Gln Asn Glu 485 490 495 Thr Gly Ala Ser Glu Glu Glu Ala Cys Lys Phe Ile Leu Lys Lys Ile 500 505 510 Glu Asp Ala Trp Lys Val Ile Asn Arg Asp Ser Leu Arg Pro Thr Glu 515 520 525 Ile Pro Phe Pro Leu Leu Met Ser Thr Ile Asn Phe Ala Arg Ala Cys 530 535 540 Asp Val Ile Tyr Lys Val Asn Asp Gly Tyr Thr His Ala Glu Glu Glu 545 550 555 560 Met Ile Ser His Ile Lys Ser Ile Leu Val His Pro Ala Ala Ile 565 570 575 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aggttaaacc atgagcacct tcctggttag 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cgactctaga ttagattgcc gccggatgaa 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aggtgctcat ggtttaacct cctgtgtgaa 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggcaatctaa tctagagtcg acctgcaggc 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tagcatttaa tctagagtcg acctgcaggc 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gaaagctcat ggtttaacct cctgtgtgaa 30 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tattcgtaac ctgctcgtcg aagcccgttg gct 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cttcgacgag caggttacga ataacttctt ttg 33 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 taaaacgtgt ggttatggac tgatgatcgc ccg 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tcagtccata accacacgtt ttaacgctaa cgc 33

Claims (19)

1. 고무나무 (Parthenium argentatum)에서 유래될 수 있는, 분리된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질로서, 상기 단백질은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가지는 것인, 분리된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 세스퀴테르펜은 β-히마찰렌 (β-himachalene), (-)-α-비사보롤 ((-)-α-bisabolol), 및 알로아로마덴드렌 (allo-aromadendrene)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 분리된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질은 β-히마찰렌 혹은 α-비사보롤 합성능을 가지고, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 단백질은 알로아로마덴드렌 합성능을 가지는 단백질인, 분리된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질.
   
5. 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 이의 N-말단으로부터 402번 아스파라진 잔기가 류신으로 치환된, 변이된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 변이된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질은 429번 트레오닌 잔기가 글리신으로 치환된, 변이된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질.
   
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 변이된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질은 (-)-α-비사보롤 합성능을 가지는, 변이된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질.
   
8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 가지는, 변이된 세스퀴테르펜 신타아제 단백질.
   
9. 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 세스퀴테르펜 신타아제 단백질을 코딩하는, 분리된 핵산.
   
10. 제9항의 핵산을 포함하는, 발현 벡터.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 발현 벡터는 세스퀴테르펜의 전구 물질인 IPP (isopentenyl diphosphate)와 DMAPP (dimethyl allyl diphosphate)의 생산을 가져오는, 하나 이상의 효소를 코딩하는 유전자를 더 포함하는, 발현 벡터.
    
12. 제9항의 핵산 혹은 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 재조합 미생물.
    
13. 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 세스퀴테르펜 신타아제 단백질을 포함하거나, 상기 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 혹은 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터가 도입된, 세스퀴테르펜을 생산할 수 있는 재조합 미생물.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리치아 속 (genus Escherichia)인, 세스퀴테르펜을 생산할 수 있는 재조합 미생물.
    
15. 제13항에 있어서, 상기 세스퀴테르펜은 β-히마찰렌 (β-himachalene), (-)-α-비사보롤 ((-)-α-bisabolol), 및 알로아로마덴드렌 (allo-aromadendrene)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 세스퀴테르펜을 생산할 수 있는 재조합 미생물.
    
16. 제13항에 있어서, 상기 미생물은 세스퀴테르펜의 전구 물질인 IPP (isopentenyl diphosphate)와 DMAPP (dimethyl allyl diphosphate)의 생산능을 가지는, 세스퀴테르펜을 생산할 수 있는 재조합 미생물.
    
17. 제16항에 있어서, 상기 미생물은 메발론산 합성 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자를 발현하는, 세스퀴테르펜을 생산할 수 있는 재조합 미생물.
    
18. 제13항의 세스퀴테르펜을 생산할 수 있는 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 이의 배양물로부터 세스퀴테르펜을 회수하는 단계를 포함하는, 세스퀴테르펜을 생산하는 방법.
    
19. 제18항에 있어서, 상기 세스퀴테르펜은 β-히마찰렌 (β-himachalene), (-)-α-비사보롤 ((-)-α-bisabolol), 및 알로아로마덴드렌 (allo-aromadendrene)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 세스퀴테르펜을 생산하는 방법.

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