CN104846020B

CN104846020B - 生产香紫苏醇的方法

Info

Publication number: CN104846020B
Application number: CN201510132253.9A
Authority: CN
Inventors: M·沙尔克
Original assignee: Firmenich SA
Current assignee: Firmenich SA
Priority date: 2008-02-15
Filing date: 2009-02-12
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2029-02-12
Also published as: WO2009101126A1; CN104846020A; ATE536412T1; EP2245161B1; CN101939430A; CN101939430B; BRPI0906468A2; WO2009101126A9; EP2245161A1; US8586328B2; US20110041218A1

Abstract

本发明提供了一种生产香紫苏醇的方法，所述方法包括(a)使一条具有LPP合酶活性的特定多肽与GGPP接触，以及(b)使一条具有香紫苏醇合酶活性的多肽与步骤(a)中生产的焦磷酸赖百当烯二醇酯(LPP)接触。具体而言，所述方法可以在体外或体内进行以生产香紫苏醇，这是一种在香料和调味料领域非常有用的化合物。本发明还提供在该方法中使用的多肽的氨基酸序列。源自快乐鼠尾草并编码本发明多肽的核酸，含所述核酸的表达载体，以及经转化以包藏所述核酸的非人宿主生物体或细胞也是本发明的一部分。

Description

生产香紫苏醇的方法

本发明是2009年02月12日申请的发明名称为“生产香紫苏醇的方法”的第200980104742.6号发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明提供了一种生产香紫苏醇的方法，所述方法包括使至少一条多肽与焦磷酸香叶基香叶酯(GGPP)接触。具体而言，所述方法可以在体外或体内进行以生产香紫苏醇，这是一种在香料和调味料领域非常有用的化合物。本发明还提供在本发明方法中使用的多肽的氨基酸序列。编码本发明多肽的核酸以及含所述核酸的表达载体也是本发明的一部分。经转化以在生产香紫苏醇的方法中使用的非人宿主生物体或细胞也是本发明的一个目的。

背景技术

萜见于大多数生物体(微生物、动物和植物)。这些化合物由称为异戊二烯的五碳单元构成，并由其结构中存在的这些单元的数目来划分。因此，单萜、倍半萜和二萜分别为含10、15和20个碳原子的萜。二萜例如可广泛见于植物界，并且已描述了超过2500种的二萜构造(Connolly and Hill,Dictionary of terpenoids,1991,Chapman&Hall,London)。萜分子由于其风味和香味特性以及其化妆、医药和抗微生物效果，一直是数千年来的兴趣所在。由例如蒸汽蒸馏或溶剂提取等各种手段获得的植物提取物被用于萜的来源。萜分子通常原样使用，但在某些情况下利用化学反应来将萜转化为其他高价值分子。

萜的生物合成生产涉及被称为萜合酶的酶。二萜的合成可通过单一一种酶或通过两种或更多种酶来进行。当涉及两种酶时，第一种酶催化二萜焦磷酸酯的合成，随后该酯被第二种酶转化为最终产物。

自然界存在两种类型的环化机理，它们与可分为I类二萜合酶和II类二萜合酶的两种类型的二萜合酶有关(Wendt and Schulz,1998,Structure.6(2):127-33)。对于某些二萜来说，其环化机理自GGPP的焦磷酸酯的酯官能的离子化起始，接着是所得碳阳离子与内部双键的反应。催化这种类型环化的二萜合酶为I类二萜合酶。二萜的生物合成中由II类二萜合酶催化的第二种环化模式由GGPP的端末双键的质子化起始，并在内部重排和质子消除之后，产生环状二萜焦磷酸酯中间体。

编码来自两类中每类二萜合酶的基因和cDNA已被克隆出，并且重组酶也已鉴定出来。编码不同类型二萜合酶的基因的可获性为酶的一级结构提供了信息。某些氨基酸基序在二萜合酶中保留下来，并且要么与依赖质子化的环化相关，要么与依赖离子化的环化相关。DDxxD基序(其中x代表任何氨基酸)见于一些I类二萜合酶。所述基序很可能参与焦磷酸酯部分的连接和离子化。在II类合酶中发现了保守的DxDD基序(其中x代表任何氨基酸)，其中涉及第二天冬氨酸残基作为质子供体。

香紫苏醇是天然产生的二萜分子，其广泛用作用于合成带有龙涎香香调的芳香分子的起始材料。开发这类合成用于提供龙涎香——由抹香鲸的肠分泌的一种蜡状物质——的代用品。龙涎香由于其令人愉快的气味而备受赏识，并且在历史上已被用作加香成分。由于龙涎香高昂的价格以及日益增长的需求，并且特别是由于对鲸类的保护，已经开发了带有龙涎香特征的龙涎香成分和分子的化学合成。在这些分子中，

(瑞士Firmenich SA的注册商标)是最受大多数人赏识的龙涎香的代用品。用于

合成的最广泛使用的起始材料是二萜二醇香紫苏醇。

通常，植物天然提取物的价格和可获性取决于该植物的丰度、油的收率以及地理来源。此外，天然提取物的可获性和品质极大地依赖于导致每年差异化的气候和其他地区条件，使得在某些年份在高品质香料中使用这些成分非常困难，甚至于不可能。因此，提供极少受可获性和品质的波动影响的香紫苏醇来源是有利的。化学合成似乎是制备香紫苏醇的显然选择。但是，考虑到其高度复杂的结构，制备香紫苏醇的经济的合成方法依旧是困难的。由此，能够合成香紫苏醇的生物化学路径将引起极大的兴趣。

在植物和其他生物体中进行的萜的生物合成早已有广泛研究，在此不赘述，但可参考Dewick,Nat.Prod.Rep.,2002,19,181-222，其回顾了萜的生物合成路径的现有技术状况。

一些二萜合酶早已被鉴定出。特别是与本发明的序列具有一定百分比的序列同一性的萜合酶也早已见于序列数据库。尽管如此，已知的二萜合酶与本发明的多肽之间的同一性百分比非常低。

与本发明的LPP合酶最接近的合酶是两种焦磷酸柯巴酯合酶(一种来自番茄(Solanum lycopersicum)(BAA84918)，另一种来自笋瓜(Cucurbita maxima)(AAD04293和AAD04292))——一种来自野甘草(Scoparia dulcis)(BAD91286)的推定的焦磷酸柯巴酯合酶以及一种来自葡萄(Vitis vinifera)的假定蛋白质。这些蛋白质的序列与本发明的LPP合酶仅有41％的同一性，并且没有记载表明这些序列中的任一种能用于香紫苏醇的生产，也未描述它们具有LPP合酶活性。

与本发明的香紫苏醇合酶最接近的合酶为与本发明的多肽具有36％同一性的不确定功能的类萜环化酶(编号NCBI AAS98912)，与本发明的多肽具有32％同一性的黄瓜(Cucumis sativus)的对映体贝壳杉烯合酶(编号BAB 19275)，与本发明的多肽具有32％同一性的来自水稻(Oryza sativa)的对映体咖萨二烯(ent-cassadiene)合酶(编号ABH10734，公布于Xu,Wilderman,Morrone,Xu,Roy,Margis-Pinheiro,Upadhyaya,Coatesand Peters,Functional characterization of the rice kaurene synthase-like genefamily,Phytochemistry,68(3),2007,312-326)以及与本发明所提供的香紫苏醇合酶具有32％同一性的来自水稻(Oryza sativa)的对映体贝壳杉烯合酶(编号AAQ72559，公布于Margis-Pinheiro,Zhou,Zhu,Dennis and Upadhyaya,Isolation and characterizationof a DS-tagged rice(Oryza sativa L.)GA-responsive dwarf mutant defective inan early step of the gibberellins biosynthesis pathway,Plant Cell Rep.,23(12),2005,819-833)。此外，没有记载表明这些序列中的任一种能用于香紫苏醇的生产，特别是没有记载它们能催化由LPP至香紫苏醇的转化。

除序列本身之间的区别外，还需要指出的是，由上述酶合成的产物的结构和性质与香紫苏醇和LPP极为不同。焦磷酸柯巴酯的性质与焦磷酸赖百当烯二醇酯(LPP)极为不同。具体而言，与LPP不同，焦磷酸柯巴酯不能在香紫苏醇的生物合成中作为中间产物使用。对映体贝壳杉烯和对映体咖萨二烯与香紫苏醇也极为不同。对映体贝壳杉烯是一种三环二萜，其不含任何醇官能团，这与香紫苏醇不同，后者为双环二醇。此外，对映体贝壳杉烯为用于调节生长的植物激素的前体，其在香料和调味料领域中没有任何用途，而如上所述，香紫苏醇在这些技术领域中备受关注。

现有技术的一篇文献与香紫苏醇合酶特别相关(Banthorpe,Brown and Morris,Partial purification of farnesyl pyrophosphate:Drimenol cyclase andgeranylgeranyl pyrophosphate:Sclareol cyclase,using cell culture as a sourceof material,Phytochemistry 31,1992,3391-3395)。在该文献中，一种来自粘毛烟草(Nicotiana glutinosa)的部分纯化的蛋白质被鉴定为香紫苏醇合酶，但是对于该蛋白质的氨基酸序列、编码它的核酸的核苷酸序列以及该蛋白质在香紫苏醇的体外或体内生物合成的方法中的用途没有给出任何启示。此外，该文献既没有教导也没有暗示两种蛋白质(I类和II类二萜合酶)参与对由GGPP至香紫苏醇的转化的催化。相反，其教导了一种单一的部分纯化蛋白质负责香紫苏醇的合成。

WO2008/007031公开了一种具有焦磷酸顺式柯巴基-8-醇酯合酶的蛋白质，编码所述蛋白质的核苷酸序列，以及包含所述核酸的载体和转基因非人生物体。然而，这种焦磷酸顺式柯巴基-8-醇酯合酶与本发明的多肽极为不同，这是因为所公开的蛋白质与本发明融合多肽中的本发明方法中使用的LPP合酶仅有44％的氨基酸序列同一性。

本发明的一个目的是提供如上所述以经济的方式制造香紫苏醇的方法。因此，本发明的目的是生产香紫苏醇同时具有很少的浪费，这是一种更加节能并且节约资源的方法，同时降低对化石燃料的依赖。本发明的另一目的是提供一种能合成用作香料和/或芳香成分的香紫苏醇的酶。

现有技术文献均未公开由非环状二萜前体GGPP来生物合成生产香紫苏醇的方法。

使用的缩写

bp 碱基对

kb 千碱基

BSA 牛血清白蛋白

DMAPP 焦磷酸二甲基烯丙酯

DNA 脱氧核糖核酸

cDNA 互补DNA

dT 脱氧胸腺嘧啶

dNTP 脱氧核苷酸三磷酸

DTT 二硫苏糖醇

FPP 焦磷酸法呢酯

GC 气相色谱

GGPP 焦磷酸香叶基香叶酯

idi 焦磷酸异戊烯酯异构酶

IPP 焦磷酸异戊烯酯

IPTG 异丙基-D-硫代半乳糖苷

LB 溶菌肉汤

LPP 焦磷酸赖百当烯二醇酯

MOPSO 3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸

MS 质谱

mvaK1 甲羟戊酸激酶

mvaK2 甲羟戊酸焦磷酸激酶

PCR 聚合酶链式反应

3’-/5’-RACE 3’和5’cDNA末端快速扩增

RMCE 重组酶介导的盒式交换

RT-PCR 逆转录聚合酶链式反应

RNA 核糖核酸

mRNA 信使核糖核酸

RuBisCO 核酮糖-l,5-焦磷酸羧化酶

SDS-PAGE SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SsLPPs 快乐鼠尾草焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶

发明内容

本发明提供一种以经济、可靠并且可再现的方式通过生物合成来生产香紫苏醇的方法。

在本发明中，香紫苏醇、GGPP、LPP以及本申请中引用的其他所有化合物均由图1所示的它们的结构式定义。

对于本申请的目的而言，“二萜合酶”或“具有二萜合酶活性的多肽”指的是能催化由非环状萜前体GGPP起始或由二萜焦磷酸酯如LPP起始的萜分子合成的多肽，或是能催化由非环状二萜前体GGPP起始的二萜焦磷酸酯合成的多肽。

对于“LPP合酶”或“具有LPP合酶活性的多肽”，这里我们指的是能催化由GGPP起始的LPP合成的多肽。

对于“香紫苏醇合酶”或“具有香紫苏醇合酶活性的多肽”，这里我们指的是能催化由LPP起始的香紫苏醇合成的多肽。

对于“能催化由GGPP至香紫苏醇的转化的多肽”，这里我们指的是能催化所述转化的任何多肽，特别是催化两步机理——其中LPP作为中间产物而被合成——的多肽。

多肽催化特定二萜(例如香紫苏醇)和/或特定二萜焦磷酸酯(例如LPP)的合成的能力可通过进行实施例3中详述的酶活性测定而容易地确认。

根据本发明，多肽还表示包括截短的多肽，条件是它们要保持如上任意实施方案中所定义的二萜合酶活性，并且与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的相应片段，或者与SEQ IDNO:3的相应片段有至少所定义百分比的同一性。特别有用的截短的多肽是那些N末端缺失了质体定位信号的多肽。

两条肽序列或核苷酸序列之间的同一性的百分比是当进行这两条序列的比对时，在两条序列中相同的氨基酸或核酸残基的数目的函数。相同的残基定义为在两条序列中在给定比对位置上的同样的残基。这里所用的序列同一性的百分比是由最优比对，通过将两条序列中相同的残基数目除以最短的序列的残基总数再乘以100而计算得到的。最优比对是这样一种比对，其中同一性百分比可能为最高。在一条或两条序列的一个或多个比对位置可引入间隙以获得最优比对。在序列同一性的百分比计算中将这些间隙作为不相同的残基来考虑。

以确定氨基酸或核酸序列同一性为目的的比对可使用计算机程序(例如为万维网上可得的公用计算机程序)以各种方式来实现。优选可使用来自National Center forBiotechnology Information(NCBI)的地址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi的BLAST程序(Tatiana等的FEMS Microbiol Lett.,1999,174:247-250,1999)，其参数设为默认，以获得肽序列或核苷酸序列的最优比对，并计算序列同一性的百分比。

因此，本发明的一个目的是一种生产香紫苏醇的方法，包括：

(a)将GGPP与至少一条具有LPP合酶活性的多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2有至少50％同一性的氨基酸序列；

(b)将步骤(a)中生产的中间产物与至少一条具有香紫苏醇合酶活性的多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO:3有至少50％同一性的氨基酸序列；并且

(c)非强制性选择地将步骤(b)中生产的香紫苏醇分离。

根据一个优选的实施方案，通过将GGPP与所述至少一条具有LPP合酶活性的多肽和所述至少一条具有香紫苏醇合酶活性的多肽一起接触，该生产香紫苏醇的方法的步骤(a)和(b)同时进行。

对于本申请的目的而言，在说步骤(a)和(b)同时进行时，我们指的是，仅有一个动作对于想进行本发明而获得两步骤结果的人来说是必需的，即将GGPP与至少两条多肽接触，或与至少一条下面所描述的融合多肽接触。然而，香紫苏醇的生产仍然以两步机理进行，如图2所示。首先，通过LPP合酶或通过具有LPP合酶序列的融合多肽的一部分，在香紫苏醇合酶的存在下，由GGPP原位合成出LPP。所生产的LPP直接与香紫苏醇合酶直接接触，或与具有香紫苏醇合酶序列的融合多肽的一部分直接接触，该前体一产生，所述酶就催化该前体至香紫苏醇的转化。

根据一个优选的实施方案，生产香紫苏醇的方法的步骤(a)和(b)通过将GGPP与至少一条融合多肽接触而同时进行，所述融合多肽能催化GGPP至香紫苏醇的转化，并包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2有至少50％同一性的氨基酸序列以及与SEQ ID NO:3有至少50％同一性的氨基酸序列。

根据一个优选的实施方案，能催化GGPP至香紫苏醇的转化的融合多肽包含：具有LPP合酶活性和与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2有至少50％同一性的氨基酸序列的多肽的序列，以及具有香紫苏醇合酶活性和与SEQ ID NO:3有至少50％同一性的氨基酸序列的多肽的序列。

该方法既可在体外进行，也可在体内进行，这将在后面详细描述。

待与LPP体外接触的多肽可通过使用标准的蛋白质或酶提取技术，从任何表达它的生物体中提取来获得。如果宿主生物体是将本发明多肽释放到培养基中的单细胞生物体或细胞，该多肽可简单地由培养基收集，例如通过离心，然后非强制性选择地洗涤并在合适的缓冲溶液中再悬浮。如果该生物体或细胞在其细胞内积聚了多肽，则该多肽可通过将该细胞分解或溶解然后从该细胞裂解液中提取多肽来获得。

该具有香紫苏醇合酶活性的多肽或具有LPP合酶活性的多肽——要么为分离形式，要么为与其他蛋白质在一起的形式，例如为在由经培养的细胞或微生物获得的粗蛋白质提取物中的形式——可随后以最优pH悬浮于缓冲溶液中。如果合适，可添加盐、BSA、DTT和其他类型的酶辅助因子，以优化酶活性。合适的条件更详细地描述于随后的实施例中。

随后，将前体GGPP或LPP添加到悬浮液或溶液中，然后在最优温度下，例如15～40℃，优选25～35℃，更优选于30℃培养。培养后，可通过标准分离步骤，例如溶剂提取和蒸馏，非强制性选择地在从溶液中移除多肽之后，将所生产的LPP或香紫苏醇从培养液中分离出来。

根据本发明的另一优选实施方案，该生产香紫苏醇的方法在体内进行。在该情况下，上述方法的步骤(a)和(b)同时进行，并包括在有助于香紫苏醇生产的条件下培养非人宿主生物体或细胞，该非人宿主生物体或细胞能生产GGPP，并且经转化以表达至少一条包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2有至少50％同一性的氨基酸序列并具有LPP合酶活性的多肽以及至少一条包含与SEQ ID NO:3有至少50％同一性的氨基酸序列并具有香紫苏醇合酶活性的多肽。

根据一个更优选的实施方案，该方法还包括：在步骤(a)和(b)之前，用编码包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2有至少50％同一性的氨基酸序列并具有LPP合酶活性的多肽的至少一种核酸以及编码包含与SEQ ID NO:3有至少50％同一性的氨基酸序列并具有香紫苏醇合酶活性的多肽的至少一种核酸来转化能生产GGPP的非人生物体或细胞，从而所述生物体表达所述多肽。

本发明的这些实施方案由于能在体内实施该方法而不用预先分离多肽从而是特别有利的。该反应直接在经转化以表达所述多肽的生物体或细胞内发生。

非人宿主生物体或细胞能用两种核酸同时转化或单独转化。当非人宿主生物体或细胞是用两种核酸同时转化时，这些核酸可接合到单独或不同的载体中。

根据本发明的一个特定实施方案，该编码LPP合酶的至少一种核酸包含与SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体。在一个更优选的实施方案中，所述核酸由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体组成。

根据本发明的一个特定实施方案，该编码香紫苏醇合酶的至少一种核酸包含与SEQ ID NO:6或其补体有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:6或其补体。在一个更优选的实施方案中，所述核酸由SEQ ID NO:6或其补体组成。

在本发明的另一个特定实施方案中，该非人宿主生物体或细胞还可用至少一种编码融合多肽的核酸来转化，所述融合多肽能催化GGPP至香紫苏醇的转化，并包含与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2有至少50％同一性的氨基酸序列以及与SEQ ID NO:3有至少50％同一性的氨基酸序列。

根据一个优选的实施方案，该编码融合多肽的核酸包含与SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5或它们的补体有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体。

根据另一个优选的实施方案，该编码融合多肽的核酸包含与SEQ ID NO:6或其补体有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:6或其补体。

根据一个更优选的实施方案，该编码融合多肽的核酸由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体以及与SEQ ID NO:6或其补体有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列组成。或者，该编码融合多肽的核酸由SEQ ID NO:6或其补体以及与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列组成。或者，该编码融合多肽的核酸由与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列以及与SEQ ID NO:6或其补体有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列组成。在一个最优选的实施方案中，该编码融合多肽的核酸由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体以及SEQ ID NO:6或其补体组成。

根据另一个优选的实施方案，该编码融合多肽的核酸包含与SEQ ID NO:87有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案，该编码融合多肽的核酸包含核苷酸序列SEQ IDNO:87。根据一个最优选的实施方案，该编码融合多肽的核酸由核苷酸序列SEQ ID NO:87组成。

该非人生物体或细胞可有利地用至少一种编码多肽的基因来进一步转化，所述多肽参与GGPP的生成代谢，例如MEP路径的酶，MVA路径的酶和/或异戊二烯转移酶。如本发明任一实施方案所述用LPP合酶和香紫苏醇合酶或用融合多肽来转化能生产GGPP的非人生物体或细胞对于香紫苏醇的生产来说是足够的。然而，用至少一种参与GGPP的生产和/或GGPP的前体(即，焦磷酸异戊二烯酯(IPP)和焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP))的生产的酶来进一步转化会有利地增加可用于香紫苏醇转化的前体的量。

该生物体或细胞意指“表达”多肽，条件是该生物体或细胞经转化以包藏编码所述多肽的核酸，该核酸转录为mRNA，而该多肽见于该宿主生物体或细胞。术语“表达”包括“异源表达”和“过表达”，后者指的是mRNA、多肽和/或酶活性的水平超过在非转化的生物体或细胞中测量的值。转化非人宿主生物体或细胞的合适方法的更详细描述将随后在说明书中专门将该转化的非人宿主生物体或细胞作为本发明的特定目标的部分以及实施例中描述。

特定的生物体或细胞，当其天然生产GGPP时，或当其并不天然生产GGPP但经转化以生产GGPP时，不管是用描述于此的核酸转化之前，还是与所述核酸一起，都意味着“能生产GGPP”。经转化以与天然形成的生物体或细胞相比生产更高的GGPP量的生物体或细胞也包括在“能生产GGPP的生物体或细胞”内。用于转化生物体例如微生物从而使它们生产GGPP的方法是本领域公知的。这种方法例如见于Huang,Roessner,Croteau and Scott,Engineering Escherichia coli for the synthesis of taxadiene,a keyintermediate in the biosynthesis of taxol,Bioorg Med Chem.,9(9),2001,2237-2242。

根据一个优选的实施方案，该生物体天然积聚GGPP，或经转化以积聚该前体。

为了在体内实施本发明，宿主生物体或细胞要在有助于香紫苏醇生产的条件下培养。因此，如果宿主是转基因植物，要提供最优的生长条件，例如最优的光、水和营养条件。如果宿主是单细胞生物体，有助于香紫苏醇生产的条件可包括在宿主的培养基中添加合适的辅因子。此外，应选择培养基以最大限度地合成香紫苏醇。最优的培养条件以更详细的方式描述于随后的实施例中。

适于在体内实施本发明方法的非人宿主生物体可以是任意的非人多细胞或单细胞生物体。在一个优选的实施方案中，用于在体内实施本发明的非人宿主生物体是植物、原核生物或真菌。任何植物、原核生物或真菌都可使用。特别有用的植物为那些天然生产高含量萜的植物。在一个更优选的实施方案中，植物从茄科(Solanaceae)、禾本科(Poaceae)、十字花科(Brassicaceae)、碟形花科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、菊科(Asteraceae)或唇形科(Lamiaceae)中选出。例如，植物从烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica(油菜))、苜蓿属(Medicago(苜蓿))、棉属(Gossypium(棉花))、蒿属(Artemisia)、鼠尾草属(Salvia)和薄荷属(Mentha)中选出。优选地，该植物属于烟草(Nicotiana tabacum)种。

在一个更优选的实施方案中，用于在体内实施本发明方法的非人宿主生物体为微生物。任何微生物都可使用，但根据一个更加优选的实施方案，所述微生物为细菌或真菌，优选所述真菌为酵母。最优选地，所述细菌为大肠杆菌(E.coli)，而所述酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

这些生物体中的大多数并不天然生产GGPP。为了适于实施本发明的方法，这些生物体必须经转化以生产所述前体。如上所述，它们可以在用上述任一实施方案所述的核酸修饰之前或同时如此转化。

也可使用分离的高等真核细胞来取代完整生物体作为宿主以在体内实施本发明的方法。合适的真核细胞可以是任何非人细胞，但优选植物细胞。

根据一个优选的实施方案，该具有LPP合酶活性并在前述任一实施方案中使用的至少一条多肽或者由在前述任一实施方案中使用的核酸编码的至少一条多肽包含与SEQID NO:1或SEQ ID NO:2有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述多肽包含氨基酸序列SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2。在一个更加优选的实施方案中，所述多肽由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2组成。

根据另一个优选的实施方案，该具有香紫苏醇合酶活性并在前述任一实施方案中使用的至少一条多肽或者由在前述任一实施方案中使用的核酸编码的至少一条多肽包含与SEQ ID NO:3有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:3。在一个更加优选的实施方案中，所述多肽由SEQ ID NO:3组成。

根据又一个优选的实施方案，在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前述任一实施方案的核酸编码的融合多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。

根据另一个优选的实施方案，在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前述任一实施方案的核酸编码的融合多肽包含与SEQ ID NO:3有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:3。

根据一个更加优选的实施方案，在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前述任一实施方案的核酸编码的融合多肽由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2以及与SEQ ID NO:3有至少50％、优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列组成。或者，其由SEQ ID NO:3以及与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2有至少50％、优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列组成。或者，该融合多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列以及与SEQ ID NO:3有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列组成。

根据另一个特别优选的实施方案，在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前述任一实施方案的核酸编码的融合多肽包含与SEQ ID NO:88有至少50％、优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案，该融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:88。根据一个更加优选的实施方案，该融合多肽由SEQ ID NO:88组成。

根据本发明的又一个特别的实施方案，具有本发明方法任一实施方案中所需的LPP合酶活性的多肽是这样一种多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:36～39(它们是SEQ ID NO:1的截短形式)中的任一条序列有至少50％同一性的氨基酸序列。最好，所述多肽包含与SEQID NO:36～39中的任一条序列有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述多肽包含SEQ ID NO:36～39中的任一条序列。根据一个更加优选的实施方案，所述多肽由SEQ ID NO:36～39中的任一条序列组成。

根据本发明的另一个特别的实施方案，具有本发明方法任一实施方案中所需的香紫苏醇合酶活性的多肽是这样一种多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:74(它是SEQ ID NO:3的截短形式)有至少50％同一性的氨基酸序列。最好，所述多肽包含与SEQ ID NO:74有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述多肽包含SEQ ID NO:74。根据一个更加优选的实施方案，所述多肽由SEQ ID NO:74组成。

根据另一个特别的实施方案，在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前述任一实施方案的核酸编码的融合多肽包含与SEQ ID NO:36～39中的任一条序列有至少50％、优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列。在一个更加优选的实施方案中，其包含SEQ ID NO:36～39中的任一条序列。

根据另一个特别的实施方案，在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前述任一实施方案的核酸编码的融合多肽包含与SEQ ID NO:74有至少50％、优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列。在一个更加优选的实施方案中，其包含SEQ ID NO:74。

在一个更加优选的实施方案中，在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前述任一实施方案的核酸编码的融合多肽由SEQ ID NO:36～39中的任一条序列以及与SEQID NO:74有至少50％、优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列组成。或者，在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前述任一实施方案的核酸编码的融合多肽由SEQ ID NO:74以及与SEQ ID NO:36～39中的任一条序列有至少50％、优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列组成。或者，该融合多肽由与SEQ ID NO:36～39中的任一条序列有至少50％、优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列以及与SEQ ID NO:77有至少50％、优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列组成。在一个最优选的实施方案中，在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前述任一实施方案的核酸编码的融合多肽由SEQ ID NO:36～39中的任一条序列以及SEQ ID NO:74组成。

根据又一个实施方案，在前述任一实施方案中使用的编码LPP合酶的核酸包含与SEQ ID NO:28～31(它们是SEQ ID NO:4的截短形式)中的任一条序列或其补体有至少50％同一性的核苷酸序列。最好，所述核酸包含与SEQ ID NO:28～31中的任一条序列或其补体有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述核酸包含SEQ ID NO:28～31中的任一条序列或其补体。根据一个更加优选的实施方案，所述核酸由SEQ ID NO:28～31中的任一条序列或其补体组成。

根据本发明的另一个特别的实施方案，在前述任一实施方案中使用的编码香紫苏醇合酶的核酸包含与SEQ ID NO:73(它是SEQ ID NO:6的截短形式)或其补体有至少50％同一性的核苷酸序列。最好，所述核酸包含与SEQ ID NO:73或其补体有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述核酸包含SEQ ID NO:73或其补体。根据一个更加优选的实施方案，所述核酸由SEQID NO:73或其补体组成。

根据另一个特别的实施方案，在前述任一实施方案中使用的编码融合多肽的核酸包含与SEQ ID NO:28～31中的任一条序列或其补体有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。在一个更加优选的实施方案中，其包含SEQ ID NO:28～31中的任一条核苷酸序列或其补体。

根据另一个特别的实施方案，在前述任一实施方案中使用的编码融合多肽的核酸包含与SEQ ID NO:73或其补体有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。在一个更加优选的实施方案中，其包含SEQ ID NO:73的核苷酸序列或其补体。

在一个更加优选的实施方案中，在前述任一实施方案中使用的编码融合多肽的核酸由SEQ ID NO:28～31中的任一条序列或其补体以及与SEQ ID NO:73或其补体有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列组成。或者，在前述任一实施方案中使用的编码融合多肽的核酸由SEQ ID NO:73或其补体以及与SEQ ID NO:28～31中的任一条序列或其补体有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列组成。或者，该编码融合多肽的核酸由与SEQ ID NO:28～31中的任一条序列或其补体有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列以及与SEQ ID NO:73或其补体有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列组成。在一个最优选的实施方案中，在前述任一实施方案中使用的编码融合多肽的核酸由SEQ ID NO:73或其补体以及SEQ IDNO:28～31中的任一条序列或其补体组成。

根据另一个优选的实施方案，在前述任一实施方案中使用的该多肽或该核酸源自快乐鼠尾草(Salvia sclarea)。

实施本发明方法的一个重要工具是融合多肽本身。因此，能催化GGPP至香紫苏醇的转化并包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2有至少50％同一性的氨基酸序列以及与SEQID NO:3有至少50％同一性的氨基酸序列的融合多肽是本发明的另一目的。

根据一个优选的实施方案，该融合多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案，该融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。

根据另一个优选的实施方案，该融合多肽包含与SEQ ID NO:3有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:3。

在一个更加有效的实施方案中，该融合多肽由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2以及与SEQ ID NO:3有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列组成。或者，该融合多肽由SEQ ID NO:3以及与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列组成。在一个最优选的实施方案中，该融合多肽由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2以及SEQ ID NO:3组成。

根据本发明的一个特别的实施方案，该融合多肽包含SEQ ID NO:1的截短形式的序列(例如SEQ ID NO:36～39)和/或SEQ ID NO:3的截短形式的序列(例如SEQ ID NO:74)。

因此，根据本发明的一个特别的实施方案，该融合多肽包含与SEQ ID NO:36～39中的任一条序列有至少50％、优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列。在一个更加优选的实施方案中，其包含SEQ ID NO:36～39中的任一条序列。

根据另一个特别的实施方案，该融合多肽包含与SEQ ID NO:74有至少50％、优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列。在一个更加优选的实施方案中，其包含SEQ ID NO:74。

在一个更加优选的实施方案中，该融合多肽由SEQ ID NO:36～39中的任一条序列以及与SEQ ID NO:74有至少50％、优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列组成。或者，该融合多肽由SEQ ID NO:74以及与SEQID NO:36～39中的任一条序列有至少50％、优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列组成。在一个最优选的实施方案中，该融合多肽由SEQ ID NO:36～39中的任一条序列以及SEQ ID NO:74组成。

根据另一个特别优选的实施方案，本发明的融合多肽包含与SEQ ID NO:88有至少50％、优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案，该融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:88。根据一个更加优选的实施方案，该融合多肽由SEQ ID NO:88组成。

在此使用的多肽指的是包含于此标明的氨基酸序列的多肽或肽片段，以及截短的或变体多肽，条件是它们要保持如上定义的它们的活性，并且它们与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的相应片段有至少所定义百分比的同一性。

变体多肽的例子为天然产生的蛋白质，其由选择性mRNA拼接产生，或者由在此描述的多肽的蛋白酶剪切产生。归因于蛋白水解的变体例如包括：由于从本发明多肽上一个或多个末端氨基酸的蛋白水解移除而产生的在不同类型宿主细胞中表达时N末端或C末端的差异。如此后描述的由本发明的核酸的天然或人工突变获得的核酸所编码的多肽同样包括在本发明之内。

如上所述，本发明的编码融合多肽的核酸是在体内实施该方法时修饰将要使用的非人宿主生物体或细胞的有用工具。

因此，编码上述任一实施方案的融合多肽的核酸也是本发明的一个目的。

根据一个优选的实施方案，该核酸包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案，该核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体。

根据另一个优选的实施方案，该核酸包含与SEQ ID NO:6或其补体有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述融合多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:6或其补体。

在一个更加优选的实施方案中，该核酸由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体以及与SEQ ID NO:6或其补体有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列组成。或者，该核酸由SEQ ID NO:6或其补体以及与SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列组成。或者，该核酸由与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列以及与SEQ ID NO:6或其补体有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列组成。在一个最优选的实施方案中，该核酸由SEQID NO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体以及SEQ ID NO:6或其补体组成。

特别有用的核酸是那些编码包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3的截短形式的融合多肽的核酸。因此，包含SEQ ID NO:4的截短形式(例如SEQ ID NO:28～31)或其补体的核酸和/或包含SEQ ID NO:6的截短形式(例如SEQ ID NO:73)或其补体的核酸是本发明特别有用的实施方案。

因此，根据另一个特别的实施方案，该核酸包含与SEQ ID NO:28～31中的任一条序列或其补体有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。在一个更加优选的实施方案中，其包含SEQ ID NO:28～31中的任一条核苷酸序列或其补体。

根据另一个特别的实施方案，该核酸包含与SEQ ID NO:73或其补体有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。在一个更加优选的实施方案中，其包含SEQ ID NO:73的核苷酸序列或其补体。

在一个更加优选的实施方案中，该核酸由SEQ ID NO:28～31中的任一条序列或其补体以及与SEQ ID NO:73或其补体有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列组成。或者，核酸由SEQ ID NO:73或其补体以及与SEQ ID NO:28～31中的任一条序列或其补体有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列组成。在一个最优选的实施方案中，该核酸由SEQ ID NO:28～31中的任一条序列或其补体以及SEQ ID NO:73或其补体组成。

根据另一个特别优选的实施方案，该核酸包含与SEQ ID NO:87有至少50％，优选至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案，该核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:87。根据一个更加优选的实施方案，该核酸由SEQ ID NO:87组成。

本发明的核酸可定义为包括单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸聚合物(DNA和/或RNA)。术语“核苷酸序列”还应理解为包含单独片段形式或作为大型核酸的一部分的聚核苷酸分子或寡核苷酸分子。本发明的核酸还包含某些分离的核苷酸序列，包括基本上不污染内源材料的那些。本发明的核酸可被截短，条件是它要编码本发明所包含的如上所述的多肽。

包含通过SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体的突变体而得到的序列和/或通过SEQ ID NO:6或其补体的突变体而得到的序列的核酸也包括在本发明之内，条件是它们所包含的序列与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的相应片段或与它们的补体有至少所定义百分比的同一性，并且它们要编码如上所定义的能催化GGPP至香紫苏醇的转化的融合多肽。突变体可以是这些核酸的任意类型的突变体，例如点突变体、缺失突变体、插入突变体和/或阅读框移位突变体。可制备变体核酸以使其核苷酸序列适应特异性表达体系。例如，已知细菌表达体系在氨基酸由优选的密码子编码的情况下更加有效地表达多肽。由于遗传密码的简并性，其中超过一个密码子可编码同一氨基酸，多条DNA序列可编码同一多肽，所有这些DNA序列都包括在本发明之内。

另一个用于转化适于在体内实施本发明方法的宿主微生物或细胞的重要工具是包含本发明任一实施方案的核酸的表达载体。因此，这类载体也是本发明的一个目的。

在此使用的“表达载体”包括任意的直链或环状重组载体，包括但不限于病毒载体、噬菌体和质粒。技术人员能根据表达体系选择合适的载体。在一个实施方案中，表达载体包括本发明的核酸，其可操作地连接至至少一条控制转录、翻译、起始和终止的调控序列，例如转录启动子、操作子或增强子或mRNA核糖体结合位点，并非强制性选择地包括至少一个选择标记。当调控序列功能性地与本发明的核酸关联时，称核苷酸序列为“可操作地连接”。

本发明的表达载体可在如下进一步描述的用于在包藏本发明核酸的宿主微生物和/或细胞中制备遗传转化的宿主微生物和/或细胞的方法中，以及用于生产或制造具有香紫苏醇合酶活性的多肽的方法中使用。

重组非人宿主生物体和细胞——其经转化以包藏至少一种编码具有LPP合酶活性并包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2有至少50％同一性的氨基酸序列的多肽的核酸以及至少一种编码具有香紫苏醇合酶活性并包含与SEQ ID NO:3有至少50％同一性的氨基酸序列的多肽的核酸，从而异源表达或过表达所述多肽——也是实施本发明方法的非常有用的工具。因此，这类非人宿主生物体和细胞是本发明的另一目的。

根据一个优选的实施方案，所述具有LPP合酶活性的多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述多肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。根据一个更加优选的实施方案，所述多肽由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2组成。

根据另一个优选的实施方案，所述具有香紫苏醇合酶活性的多肽包含与SEQ IDNO:3有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述多肽包含SEQ ID NO:3。根据一个更加优选的实施方案，所述多肽由SEQ ID NO:3组成。

根据又一个优选的实施方案，所述编码具有LPP合酶活性的多肽的核酸包含与SEQID NO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述核酸包含SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体。根据一个更加优选的实施方案，所述核酸由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或它们的补体组成。

根据又一个优选的实施方案，所述编码具有香紫苏醇合酶活性的多肽的核酸包含与SEQ ID NO:6或其补体有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述核酸包含SEQ ID NO:6或其补体。根据一个更加优选的实施方案，所述核酸由SEQ ID NO:6或其补体组成。

根据另一个优选的实施方案，所述具有LPP合酶活性的多肽包含与SEQ ID NO:36～39中的任一条序列有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述多肽包含SEQ ID NO:36～39中的任一条序列。根据一个更加优选的实施方案，所述多肽由SEQ ID NO:36～39中的任一条序列组成。

根据另一个优选的实施方案，所述具有香紫苏醇合酶活性的多肽包含与SEQ IDNO:73有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述多肽包含SEQ ID NO:73。根据一个更加优选的实施方案，所述多肽由SEQ ID NO:73组成。

根据又一个优选的实施方案，所述编码具有LPP合酶活性的多肽的核酸包含与SEQID NO:28～31中的任一条序列或其补体有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述核酸包含SEQID NO:28～31中的任一条序列或其补体。根据一个更加优选的实施方案，所述核酸由SEQID NO:28～31中的任一条序列或其补体组成。

根据又一个优选的实施方案，所述编码具有香紫苏醇合酶活性的多肽的核酸包含与SEQ ID NO:73或其补体有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案，所述核酸包含SEQ ID NO:73或其补体。根据一个更加优选的实施方案，所述核酸由SEQ ID NO:73或其补体组成。

根据另一个优选的实施方案，该非人宿主生物体和细胞经转化以包藏至少一种如本发明前述任一实施方案所述的编码融合多肽的核酸，这样其异源表达或过表达所述融合多肽。

本发明的非人宿主生物体可以是任意的非人多细胞或单细胞生物体。在一个优选的实施方案中，该非人宿主生物体是植物、原核生物或真菌。任何植物、原核生物或真菌都适于根据本发明来转化。特别有用的植物为那些天然生产高含量萜的植物。在一个更优选的实施方案中，植物从茄科(Solanaceae)、禾本科(Poaceae)、十字花科(Brassicaceae)、碟形花科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、菊科(Asteraceae)或唇形科(Lamiaceae)中选出。例如，植物从烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica(油菜))、苜蓿属(Medicago(苜蓿))、棉属(Gossypium(棉花))、蒿属(Artemisia)、鼠尾草属(Salvia)和薄荷属(Mentha)中选出。优选地，该植物属于烟草(Nicotiana tabacum)种。

在一个更优选的实施方案中，该非人宿主生物体为微生物。任何微生物都适于本发明，但根据一个更加优选的实施方案，所述微生物为细菌或真菌，优选所述真菌为酵母。最优选地，所述细菌为大肠杆菌(E.coli)，而所述酵母为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

分离的高等真核细胞也可经转化以取代完整生物体。作为高等真核细胞，这里我们指的是除酵母细胞之外的任何非人真核细胞。优选的真核细胞是植物细胞。

术语“经转化”指的是这样一种事实：宿主经过遗传工程以包含前述任一实施方案所需的各核酸的一个、两个或更多个拷贝。优选地，术语“经转化”涉及异源表达由核酸编码的多肽(该多肽使用所述核酸转化)和过表达所述多肽的宿主。因此，在一个实施方案中，本发明提供了经转化的生物体，其中多肽的表达量高于未经如此转化的同一生物体中的表达量。

已知本领域中有多种方法用于创造转基因宿主生物体或细胞，例如植物、真菌、原核生物，或高等真核细胞的细胞培养物。用于与细菌、真菌、酵母、植物和哺乳动物细胞宿主一同使用的合适的克隆和表达载体例如描述于Pouwels等的Cloning Vectors:ALaboratory Manual,1985,Elsevier,New York以及Sambrook等的Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2^ndedition,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press中。用于高等植物和/或植物细胞的克隆和表达载体尤其是技术人员可获得的，见例如Schardl等的Gene 61:1-11,1987。

用于转化宿主微生物或细胞以包藏转基因核酸的方法是技术人员所熟悉的。例如，对于创造转基因植物来说，现行的方法包括：植物原生质体的电穿孔法、脂质体介导的转化方法、农杆菌介导的转化方法、聚乙二醇介导的转化方法、粒子轰击法、植物细胞显微注射法以及使用病毒的转化方法。

在一个实施方案中，经转化的DNA整合到非人宿主生物体和/或细胞的染色体中，从而得到了稳定的重组体系。本领域公知的可用于本发明实践的染色体整合方法包括但不限于重组酶介导的盒式交换(RMCE)、病毒位点特异性染色体插入法、腺病毒法以及核内注射法。

为了实施如上所公开的体外生产香紫苏醇的方法，提供一种制备如本发明任一实施方案所述具有二萜合酶活性的至少一条融合多肽的方法是非常有利的。因此，本发明提供了一种生产能催化GGPP至香紫苏醇的转化的至少一条融合多肽的方法，包括：

(a)培养用本发明的表达载体转化的非人宿主生物体或细胞，从而使其包藏本发明的核酸并表达或过表达由所述核酸编码并能催化GGPP至香紫苏醇的转化的多肽；

(b)将该能催化GGPP至香紫苏醇的转化的多肽从步骤(a)中培养的非人宿主生物体或细胞中分离。

根据一个优选的实施方案，所述方法还包括：在步骤(a)之前，用本发明的至少一种表达载体来转化非人宿主生物体或细胞，从而使其包藏至少一种本发明的核酸并表达或过表达由所述核酸编码的多肽。

非人宿主生物体或细胞的转化和培养可以如上所述的用于体内生产香紫苏醇的方法来进行。步骤(b)可以本领域公知的用于从生物体或细胞中分离特定多肽的任何技术来进行。

在此所指的“多肽变体”意味着这样一种融合多肽，其能催化GGPP至香紫苏醇的转化，并实质上与前述任一实施方案的多肽同源，但由于一个或多个缺失、插入或取代，其氨基酸序列与由本发明的任何核酸序列编码的氨基酸序列不同。

变体可包括保守取代的序列，这意味着某特定氨基酸残基可被具有相似物化特性的残基所取代。保守取代的例子包括：用一个脂肪族残基取代另一个，例如用Ile、Val、Leu或Ala彼此取代；或者用一个极性残基取代另一个，例如Lys和Arg之间，Glu和Asp之间，或Gln和Asn之间的取代。见Zubay,Biochemistry,Addison-Wesley Pub.Co.,(1983)。这类取代的效果可用Altschul,(J.Mol.Biol.219:555-65,1991)中论述的取代打分矩阵如PAM-120、PAM-200和PAM-250来计算。其他的这类保守取代，例如具有相似疏水特性的整个区域的取代，也是公知的。

天然形成的肽变体也包括在本发明之内。这类变体的例子为由选择性mRNA拼接产生的蛋白质或由在此描述的多肽的蛋白酶剪切产生。归因于蛋白水解的变体例如包括：由于从由本发明的序列编码的多肽上一个或多个端末氨基酸的蛋白水解移除而产生的在不同类型宿主细胞中表达时N末端或C末端的差异。

本发明的多肽的变体可用于获得例如所需的提高或降低的酶活性，修饰的区域化学或立体化学，或改变的底物应用或产物分布，对底物的增强的亲和性，对一种或多种所需化合物的生产的改善的特异性，酶促反应的提高的速率，在特定环境(pH、温度、溶剂等)中的更高的活性或稳定性，或者在所需表达体系中提高的表达水平。变体或定位突变可由本领域公知的任何方法产生。天然多肽的变体和衍生物可通过分离不同或相同植物品系或种的天然形成的变体或变体的核苷酸序列而得到，或通过编码本发明的融合多肽的核苷酸序列的人工规划性突变(programming mutation)而得到。对天然氨基酸序列的改变可通过多种常规方法中的任一种来完成。

由附加肽序列在本发明多肽的氨基末端或羧基末端的融合产生的多肽变体可用于增强多肽的表达，有助于蛋白纯化或提高多肽在所需环境或表达体系中的酶活性。这类附加肽序列例如可以是信号肽。因此，本发明还涉及本发明多肽的变体，例如通过与其他寡肽或多肽融合而得到的那些和/或与信号肽连接的那些。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种制备能催化GGPP至香紫苏醇的转化的变体融合多肽的方法，包括步骤：

(a)选择如上所公开的任一实施方案中的核酸；

(b)修饰所选择的核酸以获得至少一种突变核酸；

(c)用该突变核酸序列来转化宿主细胞或单细胞生物体以表达由该突变核酸序列编码的多肽；

(d)对该多肽进行至少一种修饰特性的筛选；并且

(e)非强制性选择地，如果该多肽不具备想要的变体香紫苏醇合酶活性，则重复步骤(a)至(d)直至获得具有所需变体香紫苏醇合酶活性的多肽；

(f)非强制性选择地，如果在步骤(d)中鉴别出具有所需变体香紫苏醇合酶活性的多肽，则分离在步骤(c)中获得的相应突变核酸。

步骤(b)中，例如通过随机诱变、位点特异性诱变或DNA改组会产生大量的突变核酸序列。基因改组的具体步骤见于Stemmer,DNA shuffling by random fragmentationand reassembly:in vitro recombination for molecular evolution.Proc Natl AcadSci U S A.,1994,91(22):10747-1075。简言之，DNA改组指的是已知序列在体外随机重组的过程，涉及至少两种被选定用于重组的核酸。例如，可通过合成含突变序列的寡核苷酸而在特定位点引入突变，所述突变序列侧生有能连接至天然序列的片段的限制位点。在连接之后，所得的重构序列编码具有所需氨基酸插入、取代或缺失的类似物。或者，可采用寡核苷酸定位的位点特异性诱变步骤来提供改变的基因，其中预定的密码子可通过取代、缺失或插入而被改变。

因此，包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5以及SEQ ID NO:6的融合多肽可与编码核酸(例如由除快乐鼠尾草外的其他生物体中分离出的)的其他任何二萜合酶重组。因此，可获得并分离出突变核酸，其可用于根据例如本实施例中公开的标准程序来转化宿主细胞。

在步骤(d)中，对步骤(c)中获得的多肽进行至少一种修饰特性——例如所需的经修饰的酶活性——的筛选。对表达多肽进行筛选的所需酶活性的例子包括由K_M或V_max值量度的提高或降低的酶活性，修饰的区域化学或立体化学以及改变的底物应用或产物分布。酶活性的筛选可通过技术人员熟知的并在本实施例中公开的那些程序进行。

提供步骤(e)用于重复步骤(a)～(d)的过程，优选其可并行操作。因此，通过创造大量的突变核酸，可用不同的变体核酸同时转化多种宿主细胞，从而允许后续的更多数量的多肽的筛选。由此，获得所需变体多肽的机会可任由技术人员而增加。

本申请中提及的出版物均以参照的方式并入于此，以公开并描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。

附图说明

图1：说明书中引用的各种化合物的结构。

图2：由GGPP生物合成香紫苏醇的机理。酶促步骤1和2可由两种不同的蛋白质(LPP合酶和香紫苏醇合酶)催化，或由单一一种双功能酶(融合多肽)催化。

图3：由SsLPPs3(SEQ ID NO:4)和SsLPPs9(SEQ ID NO:5)——两种密切相关的编码cDNA的二萜合酶，出于本发明的目的而被分离出——推断出的氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的比对。相同残基为白色字母，两条序列间的不同残基为黑色字母。

图4：来自表达SsLPPs3和SsLPPs9蛋白质(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)的大肠杆菌细胞的粗可溶蛋白质提取物的SDS-PAGE分析。1泳道和8泳道：分子量标准物；2泳道和7泳道：由用质粒不经插入而转化的细胞所得到的对照蛋白质；3泳道和4泳道：来自用pETDue-SsLPPs3转化的细胞的蛋白质；5泳道和6泳道：来自用pETDuet-SsLPPs9转化的细胞的蛋白质。凝胶用考马斯蓝对总蛋白质染色。

图5：在大肠杆菌中表达的亲和纯化重组鼠尾草二萜合酶SsLPPs3(SEQ ID NO:1)的SDS-PAGE分析。M泳道：分子量标准物；1泳道：来自对照细胞的粗可溶蛋白质提取物；2泳道：来自用pET28-SsLPPs3转化的细胞的粗可溶蛋白质提取物；3泳道：流经部分(flow-through fractions)；4～7泳道：冲洗部分；8～10泳道：使用250mM的L-组氨酸的洗脱部分。凝胶用考马斯蓝对总蛋白质染色。

图6：亲和纯化的SsLPPs3(SEQ ID NO:1)与GGPP一起培养后获得的产物的GC分析。(A)直接溶剂提取；(B)用碱性磷酸酶处理后对同一试样进行溶剂提取。

图7：A全长和截短的SsLPPs3重组二萜合酶(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:36～39)的N末端序列。B在大肠杆菌中表达的全长和截短的SsLPPs3二萜合酶的SDS-PAGE分析。M泳道：分子量标准物；1泳道：来自对照细胞的粗可溶蛋白质提取物；2泳道：来自用pET28-SsLPPs3转化的细胞的粗可溶蛋白质提取物；3泳道：纯化的用组氨酸标记的SsLPPs3；4泳道和5泳道：各自为1μL和0.5μL的来自用pETDuet-SsLPPs3转化的细胞的粗可溶蛋白质提取物；5～9泳道：0.5μL的来自用pETDuet转化的细胞的含有连续四个缺失的粗可溶蛋白质提取物。凝胶用考马斯蓝对总蛋白质染色。

图8：来自II类二萜合酶样片段的氨基酸序列与来自水稻(Oriza sativa)的stemodene合酶(编号AAZ76733)的序列的比对。

图9：用于在大肠杆菌中异源表达的来自1132构造体(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:74)的氨基酸序列的比对。

图10：不同的1132重组蛋白与LPP一起培养后获得的产物的GC分析。来自表达重组SsTps1132(1132-1-3,SEQ ID NO:3)和1132-2-5(SEQ ID NO:74)蛋白质的大肠杆菌的粗蛋白质提取物在最终体积为1mL的50mM MOPSO(pH 7，补充有15mM的MgCl₂)中与LPP一起培养。

图11：用重组1132-2-5蛋白质(SEQ ID NO:74)由LPP产生的产物的GC-MS分析。(A)LPP与来自大肠杆菌、由pET101-1132-2-5转化的粗蛋白质提取物一起培养所得的产物的总离子色谱图。(B)保留时间为14.3时的峰的质谱图。(C)可靠香紫苏醇标准物的质谱图。

图12：1132重组蛋白(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:74)与SsLPPs3重组蛋白(SEQ IDNO:1)一起在GGPP的存在下共培养之后获得的产物的GC分析。

图13：实施例10和实施例11中用于转化大肠杆菌的质粒的结构。

具体实施方式

通过如下的实施例对本发明进行进一步详细描述。

实施例1

通过PCR方法分离编码来自快乐鼠尾草的cDNA的LPP合酶

A.植物材料和RNA提取

从瑞士Bassins的野外收集生长了花蕾(1.5～2cm长，1～2日龄)的快乐鼠尾草，并直接在液氮中冷冻。用来自Invitrogen(Carlsbad,CA)的Concert^TM植物RNA试剂提取总RNA，根据制造商手册，用

2.0mRNA分离试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)通过oligodT-纤维素亲和层析法纯化mRNA。用Marathon^TMcDNA扩增试剂盒(Clontech,MountainView,CA)构建cDNA文库。

B.用于扩增二萜合酶cDNA的聚合酶链式反应

对来自不同植物的I类和II类二萜合酶的氨基酸序列进行比对，并选择保守基序。从这些保守氨基酸基序中推断出简并的寡核苷酸序列。使用基序DxDDTAM(x为任何氨基酸)——其发现于二萜合酶氨基酸序列的中间部分，并假定参与与II类二萜合酶中的GGPP的焦磷酸酯部分的相互作用——来设计正向引物DT3F(5’-(SEQ ID NO:7))。使用发现于某些二萜合酶的另一基序DVW(I/L)GK(T/S)来设计反向引物DT4R(SEQ ID NO:8))。

使用这些引物以所有可能的反向和正向引物的组合来进行PCR。PCR混合物含有0.4μM的各引物、300μM的各dNTP、5μL的10X

DNA聚合酶缓冲液(Qiagen)、2μL的100倍稀释的cDNA、0.5μL的

DNA聚合酶，总体积为50μL。循环条件为：94℃下45秒、50℃下45秒和72℃下2分钟共35个循环，以及72℃下10分钟。在1％的琼脂糖凝胶上评价PCR产物的大小。将相应于预期大小的条带从凝胶上切除，用

凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化，并使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)在

2.1-TOPO载体中克隆。随后，对所插入的cDNA片段进行DNA测序，接着使用BLASTX算法(Altschul等的J.Mol.Biol.215,403-410,1990)将序列与GenBank非冗余蛋白质数据库(NCBI)比较。从所进行的不同PCR中，只有引物DT3F(SEQ ID NO:7)和DT4R(SEQ ID NO:8)的组合获得了具有预期大小并与二萜合酶具有序列同源性的DNA片段。来自本次扩增的所有片段都具有完全相同的序列。将该354bp的序列命名为FN23(SEQ ID NO:9)。

C.通过cDNA末端快速扩增(RACE)进行全长cDNA分离

设计对FN23序列(SEQ ID NO:9)具有特异性的寡核苷酸：FN23-F1’(SEQ ID NO:10)、FN23-F2(SEQ ID NO:11)和FN23-F3(SEQ ID NO:12)。这些引物与用接头序列(SEQ IDNO:13)延长的oligodT引物一起用于RT-PCR。RT-PCR反应混合物的组成如下：10μl的5XQiagen OneStep RT-PCR缓冲液、400μM的各dNTP、400nM的各引物、2μl的Qiagen OneStepRT-PCR酶混合物、1μl的

核糖核酸酶抑制剂(Promega Co.,Madisson,WI)以及1250ng的总RNA，最终体积为50ml。热循环仪条件为：50℃下30分钟(反转录)；95℃下15分钟(DNA聚合酶活化)；94℃下45秒、50℃下45秒和72℃下90秒共35个循环；以及72℃下10分钟。使用RT-PCR产物作为模板与adapterP引物(SEQ ID NO:14)连同相同引物或巢式FN23特异性引物一起进行第二轮PCR。该PCR方法得到了1271bp的cDNA片段(FN30(SEQ ID NO:15))，该片段与FN23片段(SEQ ID NO:9)有192bp完全重叠，并且含有含终止密码子的3’末端和相应cDNA的3’非编码序列。

为了扩增cDNA的5’末端，设计了对FN23(SEQ ID NO:9)有特异性的反义寡核苷酸：FN23-R1(SEQ ID NO:16)、FN23-R2(SEQ ID NO:17)、FN23-R3(SEQ ID NO:18)。根据Marathon^TMcDNA扩增试剂盒方案(Clontech,Mountain View,CA)，使用快乐鼠尾草cDNA文库将这些引物用于5’RACE。热循环条件如下：94℃下1分钟，94℃下30秒和72℃下4分钟共5个循环，94℃下30秒和70℃下4分钟共5个循环，94℃下30秒和68℃下4分钟共20个循环。该5’RACE得到了1449bp的cDNA片段(FN40(SEQ ID NO:19)，该片段与FN23(SEQ ID NO:9)有227bp完全重叠。与已知二萜合酶序列的比较显示出，FN40片段(SEQ ID NO:19)含有翻译起始密码子和87bp的非编码区。三条cDNA片段(FN23、FN30和FN40(SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:19)的拼接得到了2655bp的全长cDNA序列(SaTps1)，其带有编码具有785个残基的蛋白质(SEQ ID NO:21)的2355bp(SEQ ID NO:20)的开放阅读框，所述蛋白质与二萜合酶即与焦磷酸柯巴酯合酶有很强的同源性。参与由质子化引发的环化反应的DxDD基序存在于氨基酸序列(第372位)，而未发现参与由离子化引发的环化反应的DDxD基序。因此，该蛋白质序列具有专门催化依赖于质子化的GGPP的环化反应的II类二萜合酶的典型特征。该蛋白质的异源表达以及酶鉴定详见后面的实施例2～4。

实施例2

快乐鼠尾草LPP合酶在大肠杆菌中的异源表达

使用为在T7启动子的控制下表达而设计的pETDuet-1(Novagen,Madison,WI)以在大肠杆菌细胞中表达。为构建表达质粒，使用为在紧邻起始密码子之前引入NdeI位点并在终止密码子之后引入KpnI位点而设计的正向引物和反向引物SaTps-Nde(SEQ ID NO:22)和SaTps-Kpn(SEQ ID NO:23)，通过PCR从cDNA文库中扩增出SaTps1(SEQ ID NO:20)的开放阅读框。由于该阅读框在该阅读框的1614位置处含有NdeI位点，本次扩增通过重叠延伸PCR(Horton等的Gene 77,61-68,1989)分两步操作，其中使用引物SaTps-Nde(SEQ ID NO:22)和SaTps-Kpn(SEQ ID NO:23)连同引物Satps-mut1f(SEQ ID NO:24)和Satps-mut1r(SEQID NO:25)，它们设计用来移除NdeI位点而不改变氨基酸序列。所得cDNA首先用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)连接到PCR2.1-Topo质粒中，在将NdeI-KpnI片段亚克隆到pETDuet-1载体之前对插入物的序列进行检验。

使用SaTps1特异性引物从cDNA文库扩增所得几条克隆的序列分析显示出在cDNA序列中几个位置处具有一些变异性。鉴定了七个位置，其中可发现两种不同的氨基酸。所发现的一个位置为在某些克隆中出现的丝氨酸残基的插入。这些位置列于下表：

位置(相对于氨基酸序列)	氨基酸
		34	Ile或Thr
40	Phe或Leu
		174	Gln或His
222	Gly或Asp
		538	Gln或His
560	Arg或Leu
		596	Asn或Lys
612	Ser的插入

这些变异性似乎以随机方式出现在十一条不同的测序克隆中，暗示出在快乐鼠尾草基因组中存在至少两种特别紧密相关的二萜合酶的异构体，以及PCR扩增方法导致序列改组。两条克隆——SsLPPs3(SEQ ID NO:4)和SsLPPs9(SEQ ID NO:5)，序列变异性的代表(图3)——被选出用于异源表达和酶鉴定实验。

将质粒pETDuet-SsLPPs3和pETDuet-SsLPPs9转移到Bl21(DE3)大肠杆菌细胞(Novagen,Madison,WI)中。使用经转化细胞的单菌落来接种5ml的LB培养基。在37℃下培养5～6小时后，将培养物转移到20℃的细菌培养箱中，放置1小时达到平衡。随后，通过添加1mM的IPTG诱导蛋白质的表达，并将培养物在20℃下培养过夜。次日，通过离心收集细胞，再次悬浮于0.1体积的50mM MOPSO(pH 7、10％甘油)中，然后超声溶解。提取物通过离心(20,000g下30分钟)变得澄清，将含有可溶蛋白质的上清液用于后续实验。

通过SDS-PAGE分析来自由pETDuet-SsLPPs3和pETDuet-SsLPPs9转化的细胞的粗蛋白质提取物，并将其与用空pETDuet质粒转化的细胞获得的蛋白质提取物比较。明确检测出重组SsLPPs3和SsLPPs9蛋白(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)，并且表观分子量估计为90KDa，该值与分子量计算值83KDa一致(图4)。

实施例3

快乐鼠尾草LPP合酶的纯化和酶活性

为进一步鉴定该重组二萜合酶，我们着手进行SsLPPs3和SsLPPs9酶(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)的纯化。

用NdeI和SacI来消化含有SsLPPs3cDNA和SsLPPs9cDNA(SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5)(实施例2)的PCR2.1-Topo质粒，并且插入物连接到pET28a(+)质粒(Novagen)中。所得表达质粒(pET28-SsLPPs3和pET28-SsLPPs9)包含cDNA，其5’端的修饰(SEQ ID NO:26和SEQID NO:27)是为表达具有N末端六个组氨酸标签的蛋白质而设计的。纯化在自然条件下使用ProBond^TM纯化系统(Invitrogen)根据制造商方案进行，不同之处在于，对于洗脱，使用L-组氨酸来代替咪唑以使酶的抑制程度最小。使用该方法，SsLPPs3和SsLPPs9重组酶可被纯化至明显同质(图5)。

使用200μM的GGPP和1mM的DTT(在MOPSO中，pH 7，10％甘油)将亲和纯化后的酶在30℃下培养12小时。用戊烷提取培养基并用GC或GC-MS分析提取物并未观察到二萜产物。使用碱性磷酸酶(Sigma,6单位/ml)对同一提取物进行处理，接着用戊烷提取并进行GC分析，显示出形成了赖百当烯二醇(图6)，并表明焦磷酸赖百当烯二醇酯(LPP)的酶促形成是使用重组二萜合酶由GGPP得到的唯一产物。

GC分析是在配有火焰离子化检测器并使用内径为0.25mm、长为30m的SPB-1毛细柱(Supelco,Bellefonte,PA)的Agilent 6890系列GC系统进行的。载气为恒定流量为1mL/分钟的氦气。初始炉温为100℃(保持1分钟)，接着以10℃/分钟的梯度升至300℃。

GC-MS分析在连接有5975质量检测器(Agilent Technologies)的6890系列GC系统(Agilent)中进行。柱配备有内径为0.25mm、长为30m的DB-1MS柱(Agilent Technologies)。载气为恒定流量为1mL/分钟的氦气。初始炉温为80℃，接着以10℃/分钟的梯度升至280℃。用2200V的电子倍增电压以70eV记录谱图。通过保留时间的一致性和质谱与可靠标准物的谱图的匹配来确认产物的同一性。

实施例4

快乐鼠尾草LPP合酶的N末端缺失

在植物中，二萜合酶位于质体中。这种区室化是通过识别N末端转运肽信号的传输机制来控制的。因此，二萜合酶通常表达为前体蛋白质，并在质体中通过肽信号的剪切加以处理得到成熟蛋白质。使用ChloroP方法(Emanuelsson等的Protein Science 8,978-984,1999；http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)对SsLPPs3和SsLPPs9(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)的N末端序列进行的分析并未显示出存在转运肽的任何明显证据。因此，进行实验来评价N末端缺失对酶活性的影响。为SsLPPs3制备四条截短的cDNA，导致分别为17、37、53和63个氨基酸(SEQ ID NO:28～31)的缺失。每种构造体通过使用四种不同的正向引物由PCR来制备，每种引物为在所需截短的位置退火而设计，并引入NdeI限制性位点，接着是ATG翻译起始密码子(SsLPPs3_del1,(SEQ ID NO:32)；SsLPPs3_del2,(SEQ ID NO:33)；SsLPPs3_del3,(SEQ ID NO:34),SsLPPs3_del4,(SEQ ID NO:35))。这些引物与引物SaTps-Kpn(SEQ ID NO:23)(实施例2)一起使用，所得到的四条cDNA(SEQ ID NO:28～31)连接到pETDuet-1质粒中。蛋白质(SEQ ID NO:3639)的异源表达如实施例2所述在大肠杆菌中进行。图7示出了SDS-PAGE分析，其比较了由不同的全长和截短的构造体获得的异源蛋白质的生产水平。特别对于最大的两种缺失，明确观察到提高的表达水平。这些结果对于质体定位的萜合酶来说是典型的，并且反映出成熟蛋白质较前体蛋白质提高的溶解性和/或稳定性。

实施例5

快乐鼠尾草花cDNA文库的大规模并行测序

我们采用由Illumina(San Diego,California)开发出的DNA小片段的大规模并行测序技术以获得存在于快乐鼠尾草花中的所有转录物(转录组)的序列信息。这种测序技术采用了基于可逆终止子的测序化学方法和由Solexa以及Illumina(www.illumina.com)开发的簇生成工作站(Cluster Station)和基因组测序仪(Genome Sequencer)设备。

该技术和设备由Fasteris SA(瑞士日内瓦)准备，DNA样品的制备和测序由Fasteris SA完成。使用基因组样品制备试剂盒(Illumina)对1份(1μg)cDNA文库样品进行处理，该cDNA文库是使用Marathon^TMcDNA扩增试剂盒(Clontech,Mountain View,CA)(实施例1)从已生长出花的快乐鼠尾草中产生的。简言之，通过雾化而使DNA片段化，端部经修整以产生平端，将接头连接到DNA片段的末端，然后通过PCR使已用接头修饰的DNA片段扩增。在用凝胶电泳控制文库的质量后，用簇生成工作站和基因组测序仪设备进行DNA簇在流动池(flow cell)中的生成以及测序。使用该技术，获得了190万条具有35个碱基的短序列(read)。

使用Edena软件(Hernandez等的Genome res.15(5),802-809,2008)来拼接毗连序列。首先从每个read中移除最后五个碱基，这是由于在测序程序的最后循环中的低的保真度可能造成错误插入。软件的参数设置成允许以严谨(100％)同一性重叠15个碱基的最短长度。长度至少为50个碱基的contig(毗连序列)得以保留。在这些条件下，可以重新构成2054条具有长度为50～1330个碱基的contig。

为评价拼接的质量，检索contig与SsLPPs3——首次从快乐鼠尾草cDNA文库(SEQID NO:4，实施例2)中分离出的II类二萜合酶——的DNA序列的序列同一性。该检索使用BLASTn方法(Altschul等的J.Mol.Biol.215,403-410,1990)进行。令人惊奇的是，仅发现了三条长度为81、73和52个碱基的contig(contig 1～contig 3，SEQ ID NO:40～42)，并且Eland软件仅用了40个read来生成这些contig。与SsLPPs3参考序列的比对显示出这3条contig仅覆盖了全长序列的8.7％，尽管同一性达99％。

快乐鼠尾草的公共数据库仅报道了极其有限的序列信息。由NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)可获得的仅有的基因序列为来自快乐鼠尾草(NCBI编号Z37450)的核酮糖-1,5-焦磷酸羧化酶(RuBisCO)的大型亚单元的序列。对contig与该快乐鼠尾草RuBisCO DNA序列的DNA同一性的检索(BLASTn检索)得到了两条分别为870和547个碱基的contig(contig 4和contig 5，SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44)。这两条contig与RuBisCO序列的比对显示出98％的覆盖率：在1420个碱基中仅有27个碱基(位于位置858和884之间)不存在于该contig中。除此几乎全部的覆盖率外，参考序列与contig之间的同一性为99.5％，表明仅有7个核苷酸的差异。

随后检索全部read(未拼接数据)与SsLPPs3序列(SEQ ID NO:4)的序列同一性。使用Eland软件(Illumina)进行本次检索使得与参考序列相比最多有2个错配。总共有616个read得以复原。所选择片段与参考序列的比对显示出，SsLPPs3序列在其全长上朝向3’末端以略高的覆盖率(更多read)被覆盖。对RuBisCO序列进行的同样操作显示出对于该序列获得了1650个read。对于RuBisCO来说，其read对参考序列的覆盖率比SsLPPs3的更高。对于SsLPPs3(SEQ ID NO:4)来说，发现了未被覆盖的几段小区域和在read之间序列模糊的区域。这种不完全覆盖妨碍了完整的重新拼接，并且必然是仅产生几条非常小的contig的原因。

实施例6

从测序数据中提取I类二萜合酶样序列

使用Blast算法(Altschul等的J.Mol.Biol.215,403-410,1990)来检索推断出的氨基酸序列与I类二萜合酶序列的同源性。

首先，用2054条contig对蛋白质数据库进行Blastx检索。本次检索仅获得一条显示出与I类二萜合酶具有序列同源性的contig(contig 1610,SEQ ID NO:45)。由该contig推断出的氨基酸序列含有DDxxD基序，其是焦磷酸异戊二烯酯的由离子化引发的环化的特征。

随后，检索列数据(row data)的一部分——其代表大约3x10⁵个read——与I类二萜合酶的同源性。采用tBlastn算法用五条选定的I类二萜合酶氨基酸序列(NCBI编号AAC39443、BAB19275、BAB12441、AAD34295、AAS98912)对这些read进行检索。本次检索选出了462个read，它们随后用CAP程序(Huang,Genomics 14(1),18-25,1992)处理以鉴定出重叠序列。read的一小部分可拼接成最大长度为111个碱基的短contig。这些contig以及剩余的孤立read用于对蛋白质数据库进行Blastx检索以确定它们与I类二萜合酶的同一性。最终，保留了5条DNA片段(SEQ ID NO:46～50)。

这些氨基酸序列(SEQ ID NO:51～55)是从选定片段中推断出的，并与参考二萜合酶序列进行了比对，使它们相对定位。图8示出了这些序列与作为参考的来自水稻(Orizasativa)(Morrone等2006；NCBI编号AAZ76733)的stemodene合酶全长序列的比对。

实施例7

全长I类二萜合酶cDNA的PCR扩增

从对快乐鼠尾草cDNA文库(实施例6)进行测序选出的与二萜合酶相关的DNA序列中推断出一组正向寡核苷酸和反向寡核苷酸。将这些引物与cDNA接头引物一起用于3’/5’RACE类型的PCR扩增。使用如上实施例1所述制备的快乐鼠尾草cDNA文库，根据Marathon^TMcDNA扩增试剂盒程序(Clontech,Mountain View,CA)进行所述扩增。热循环条件如下：94℃下1分钟；94℃下30秒和72℃下4分钟共5个循环；94℃下30秒和70℃下4分钟共5个循环；94℃下30秒和68℃下4分钟共20个循环。

使用Cont250-Fwd引物(SEQ ID NO:56)，得到一条547bp的DNA序列(1130Cont250,SEQ ID NO:66)。序列分析表明，其相应于二萜合酶cDNA的5’末端，并含有348bp的编码区。使用引物Cont147_fw1(SEQ ID NO:57)和Cont147_fw2(SEQ ID NO:58)，得到一条1473bp的序列(1132Cont147,SEQ ID NO:67)，其含有二萜合酶cDNA的3’末端和1293bp的编码区。Cont147_rev1(SEQ ID NO:59)和Cont147_rev2(SEQ ID NO:60)引物用于扩增出一条464bp的DNA片段(1134Cont147,SEQ ID NO:68)。推断出的氨基酸显示出与二萜合酶的同源性，但与其他二萜合酶序列的比对暗示出，仍缺少200～300个密码子以获得5’末端。通过这一系列扩增所获得的所有序列都与先前分离的SsLPPs序列(SsLPPs3和SsLPPs9，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)明显不同。

使用5’RACE方法来鉴别与1132Cont147序列(SEQ ID NO:67)相应的ORF的5’末端。使用引物1132_race 1(SEQ ID NO:62)和1132_race2(SEQ ID NO:63)，获得了一条536bp的序列(1132RACE,SEQ ID NO:69)，其有41个碱基与1132Cont147片段(SEQ ID NO:67)重叠。该RACE产物的N末端与先前获得的1134Cont147序列(SEQ ID NO:68)相同，从而未发现在5’末端的延伸。如先前所观察到的那样，该序列具有与二萜合酶的同源性，但似乎比其他所有公开的二萜合酶序列短至少200个密码子。进行了5’RACE实验，以试图向1132Cont147序列(SEQ ID NO:67)的5’末端延伸序列并鉴别出真正的翻译起始密码子。设计了几组寡核苷酸，但并未获得额外的序列信息。这让我们猜想1134Cont147序列(SEQ ID NO:68)中的ATG密码子之一实际上是相应二萜合酶基因的起始密码子。该推定二萜合酶的核苷酸序列(命名为SsTps1132,SEQ ID NO:6)基于1132Cont147(SEQ ID NO:67)和1132RACE(SEQ ID NO:69)序列重构。使用该第一ATG，SsTps1132(SEQ ID NO:6)的1728bp的ORF编码具有575个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO:3)。该蛋白质含有依赖于离子化的基序(DDFFD)并与公开的二萜合酶具有同源性，但相对较低；最接近的序列为具有37％的同一性、来自烟草(Nicotianatabacum)的萜合酶(NCBI编号AAS98912)。该蛋白质还与实施例1～4中分离自快乐鼠尾草的SsLPPs仅有23％的同一性。SsTps1132与选定的二萜合酶序列进行了比对。这些比对显示出，与其他二萜合酶相比，SsTps1132(SEQ ID NO:3)在其N末端截短了150～240个氨基酸。

采用ChloroP方法(Emanuelsson等的Protein Science 8,978-984,1999；http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)来预测叶绿体转运肽在SsTps1132(SEQ ID NO:3)中的存在。预测出具有51个氨基酸的叶绿体转运肽，从而支持了该蛋白质的叶绿体定位。

对于与SsTps1132(SEQ ID NO:6)DNA序列相同的序列进行的所有read的检索，得到425个read。SsTps1132(220个read/Kb)的表达水平与SsLPPs(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)(260个read/Kb)的表达水平接近。基于在同一新陈代谢路径中酶促催化步骤通常以近似的水平表达的假设，可以推测出SsTps1132与SsLPPs参与到同一新陈代谢路径中。

对由Edena软件(实施例5)生成的contig检索与新推定的I类二萜合酶序列SsTps1132(SEQ ID NO:3)相同的DNA序列。发现了4条contig，先前鉴别出的contig 1610(SEQ ID NO:45)以及事先并未作为二萜合酶的片段被鉴别出来的三条额外的contig(长度为53～96bp，SEQ ID NO:70～72)。用这三条序列进行的Blastx检索并未显示出与已知蛋白质序列的同源性。搜寻这些contig的同源性失败的原因在于这些片段长度短，以及SsTps1132与数据库中存在的二萜合酶的同源性低。

实施例8

快乐鼠尾草I类二萜合酶在大肠杆菌中的异源表达

为了赋予SsTps1132(SEQ ID NO:3)以酶活性，在大肠杆菌中表达该重组蛋白。采用Champion pET101Directional TOPO表达试剂盒将全长cDNA插入到pet101/D-TOPO载体中。

制备两种构造体：一种用于表达全长蛋白质，另一种用于基于叶绿体转运肽的预测来表达截短的蛋白质。使用引物对1132_start_1(SEQ ID No:64)和1132-stop(SEQ IDNO:61)从cDNA文库中扩增出全长SsTps1132(SEQ ID NO:6)开放阅读框。使用引物1132_start2(SEQ ID NO:65)和1132_stop(SEQ ID NO:61)制备用来表达在N末端有50个氨基酸缺失的SsTps1132(SEQ ID NO:3)的构造体。所有用于表达该表达构造体的cDNA的扩增都使用Pfu DNA聚合酶(Promega)进行，其最终体积为50μL，含有5μL的Pfu DNA聚合酶10X缓冲液、200μM的各dNTP、0.4μM的各正向和反向引物、2.9单位的Pfu DNA聚合酶和5μL的100倍稀释的cDNA(如实施例1所述用Marathon^TMcDNA扩增试剂盒(Clontech)制备)。热循环条件如下：95℃下1.5分钟；95℃下45秒、58℃下30秒和72℃下5分钟共30个循环；以及72℃下10分钟。

在连接至pET101载体后，选择几条克隆并测序，以确保在PCR扩增时未引入突变。选择了两种构造体：SsTps1132(SEQ ID NO:6)和1132-2-5(SEQ ID NO:73)。由这些构造体推断出的两条氨基酸序列的比对示于图9。

将质粒pET101-SsTps1132和pET101-1132-2-5转移到Bl21(DE3)大肠杆菌细胞(Novagene,Madison,WI)中。使用经转化细胞的单菌落以接种5ml的LB培养基。在37℃下培养5～6小时后，将培养物转移到20℃的细菌培养箱中，放置1小时达到平衡。随后，通过添加1mM的IPTG来诱导蛋白质的表达，并将培养物在20℃下培养过夜。次日，通过离心收集细胞，再次悬浮于0.1体积的50mM MOPSO(pH 7、10％甘油)中，然后超声溶解。提取物通过离心(20,000g下30分钟)变得澄清，将含有可溶蛋白质的上清液用于后续实验。通过SDS-PAGE分析粗蛋白质提取物，并将其与用空pET101质粒转化的细胞获得的蛋白质提取物比较。看起来肽信号的缺失提高了在大肠杆菌中的异源表达。

实施例9

重组快乐鼠尾草I类二萜合酶在大肠杆菌中的酶活性

将含有重组蛋白质并由实施例8制备的大肠杆菌粗蛋白质提取物用于酶活性的鉴定。像实施例3那样进行酶测定。所有测定都在50mM的MOPSO(pH 7，10％甘油)、1mM的DTT中进行。

首先使用GGPP或LPP——SsLPPs和香紫苏醇生物合成中的推测中间体的产物(实施例1～4)——作为底物评价酶活性。GGPP如Keller和Thompson(J.Chromatogr 645(1),1993,161-167)所述那样合成，而LPP如实施例3所述通过酶法制备。测定在10～100μM的底物、15mM的MgCl₂和0.1～0.5mg的粗蛋白质的存在下进行，总体积为1mL。将管在30℃下培养4～12小时，并用一体积的戊烷提取两次。在氮气流中浓缩后，用GC和GC-MS(使用实施例3中所述的条件)分析提取物，并与对照蛋白质(由空质粒转化的细胞得到)测定获得的提取物比较。使用GGPP作为底物时，任何重组蛋白质均未观察到活性(未给出数据)。使用LPP作为底物时，对于SsTps1132(SEQ ID NO:3)和1132-2-5(SEQ ID NO:74)均观察到活性(图10)。在MgCl₂不存在时，该酶仍有效，并且观察到相同的产物图谱，它们具有大体相同的整体活性。产物鉴别是通过保留时间的一致性(图10)和质谱与可靠标准物谱图匹配(图11)来确定的。在所有测定中，都观察到香紫苏醇的单一峰，而没有另外产物的痕迹。

将II类二萜合酶(SsLPPs3，SEQ ID NO:1；实施例1～4)和I类二萜合酶(1132系列，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:74)共培养，随后进行测定。测定在50mM的MOPSO(pH 7,10％甘油)、1mM的DTT、50μM的GGPP以及1mM的MgCl₂中并在50μL的来自表达不同构造体的大肠杆菌的粗蛋白质提取物的存在下进行。因此，对于在50μL的含有SsLPPs3重组酶(SEQ ID NO:1)的粗蛋白质提取物和50μL的含有SsTps1132(SEQ ID NO:3)或1132-2-5(SEQ ID NO:74)重组蛋白的提取物的存在下的测定用来评估二萜产物的生成。图12示出了在MgCl₂存在下由所述培养产生的提取物的GC图谱。两种1132构造体(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:74)均生产出香紫苏醇，该结果与前述以LPP为底物的测定一致。当从培养环境中省略MgCl₂时未观察到明显差异(未给出数据)。

总之，SsTps1132(SEQ ID NO:6)编码香紫苏醇合酶并催化由LPP至香紫苏醇的转化。

由此我们表明，在快乐鼠尾草中，香紫苏醇由GGPP以两步法用两种不同的酶——LPP合酶和香紫苏醇合酶——合成出来。我们已分离出编码这两种二萜合酶中每一种的cDNA。LPP合酶——其由SsLPPs3and SsLPPs9cDNA编码——催化GGPP至LPP的转化，并含有II类二萜合酶的特性特征。香紫苏醇合酶——其由SsTps1132cDNA编码——催化LPP至香紫苏醇的转化，并与I类二萜合酶相关，尽管存在某些特殊性，即，在N末端有大量的缺失。

实施例10

通过两种二萜合酶的共表达进行的香紫苏醇在大肠杆菌中的体内生产

为评价香紫苏醇在大肠杆菌细胞中的体内生产，制备质粒和经转化的细胞用于两种二萜合酶(LPP合酶和香紫苏醇合酶)的共表达。除这两种二萜合酶外，还共表达了FPP合酶和GGPP合酶以确保细胞中GGPP的充分储备。为进一步增加该路径中的碳流并增加GGPP的水平以及后续所生产的香紫苏醇的水平，在同一细胞中还表达了编码部分甲羟戊酸路径的基因。这些后来使用的基因编码甲羟戊酸激酶(mvaK1)、磷酸甲羟戊酸激酶(mvaK2)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MvaD)焦磷酸异戊烯酯异构酶(idi)，并将甲羟戊酸转化成焦磷酸异戊烯酯(IPP)和焦磷酸二甲基烯丙酯(DMAPP)，这是FPP合酶的两种底物。

使用引物FPPy_NcoI(SEQ ID NO:75)和FPPY-Eco(SEQ ID NO:76)从酿酒酵母(S.cerevisiae)基因组DNA中扩增出酵母FPP合酶基因(编号J05091)。该基因组DNA是使用Qiagen RNA/DNA Maxi试剂盒(Qiagen AG,Basel,Switzerland)从酿酒酵母中分离出来的。PCR使用Pfu DNA聚合酶(Promega AG,Dubendorf,Switzerland)进行，其最终体积为50μL，含有0.4μL的各引物、200μM的dNTP、0.5μL的DNA聚合酶、5μL的酿酒酵母基因组DNA。PCR循环条件如下：95℃下90秒；95℃下45秒、54℃下30秒和72℃下4分钟共28个循环；以及72℃下10分钟。扩增出的DNA作为NdeI-EcorI片段连接到pACYCDuet-1质粒中的第一多克隆位点(MCS1)中，所述质粒提供了质粒pACYCDuet-FPPs，其在T7启动子的控制下包藏了FPPs基因。

使用引物MVA-up 1-start(SEQ ID NO:77)和MVA-up2-stop(SEQ ID NO:78)从肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的基因组DNA(ATCC BAA-334,LGC Standards,Molsheim,France)中扩增出含有编码mvaK1、mvaK2、MvaD和idi的基因的操纵子。PCR使用PfuUltra^TMII融合HS DNA聚合酶(Stratagene)进行，PCR混合物的组成按照制造商手册制备。热循环条件为：95℃下2分钟；95℃下20秒、58℃下20秒和72℃下90秒共30个循环；以及72℃下3分钟。将3.8Kb的片段在琼脂糖凝胶上纯化，然后使用In-Fusion^TMDry-Down PCR克隆试剂盒(clontech)连接到pACYCDuet-FPPs质粒的第二MCS中，所述质粒经NdeI和XhoI消化以提供质粒pACYCDuet-4506(图13A)。对这两条插入物的序列进行完整测序以排除任何突变。

选择来自成团泛菌(Pantoea agglomerans)编码GGPP合酶(编号M90698)的CrtE基因，并通过密码子最优化(DNA2.0,Menlo Park,CA 94025,USA)来合成它。使用引物CrtE_Nco(SEQ ID NO:79)和CrtE_Bam(SEQ ID NO:80)扩增CrtE基因以分别在5’端和3’端引入NcoI和BamHI限制性位点。在与前述相同的条件下使用PfuDNA聚合酶(Promega AG,Dubendorf,Switzerland)进行PCR。将本次扩增的产物连接到位于NcoI和BamHI限制性位点之间的pETDuet质粒的第一MCS中，以提供质粒pETDuet-CrtE。用NdeI和KpnI限制性内切酶消化质粒pETDuet-SsLPPS3-del4(含有缺失了63个密码子的SsLPPS3cDNA(SsLPPS3-del4,SEQ ID NO:31,实施例4))。提取该插入物并将其转移到pETDuet-CrtE质粒的相同位点中，得到了在T7启动子的控制下含有SsLPPS和CrtE基因的质粒pETDuet-CrtE-SsLPPS3-del4(图13B)。

用NcoI和SacI限制性内切酶消化质粒pET101-1132-2-5(含有缺失了50个密码子的SsTps1132cDNA(SsTps1132-2-5,SEQ ID NO:73,实施例8))，并将插入物转移到质粒pRSDuet-1的相同位点中，得到了质粒pRSDuet-1132-2-5(图13中未示出)。

BL21 Star^TM(DE3)大肠杆菌细胞(Invitrogen)可使用3种质粒pACYCDuet-4506(图13A)、pETDuet-CrtE-SsLPPS3-del4(图13B)和pRSDuet-1132-2-5(每种均包藏复制基因和抗性基因的不同来源)来共转化。经转化的细胞在羧苄青霉素(50μg/ml)氯霉素(34μg/ml)卡那霉素(35μg/ml)LB-琼脂糖板上进行选择。使用单菌落来接种补充了相同抗生素的5mL液体LB培养基。将培养物在37℃下培养过夜。次日，用0.2mL过夜培养物来接种补充了相同抗生素的2mL的TB培养基。在37℃下培养6小时后，将培养物冷却至28℃，然后在每一个管中添加1mM的IPTG、2mg/mL的甲羟戊酸(通过将甲羟戊酸内酯(Sigma)以1g/mL的浓度溶解于0.5N的NaOH并将该溶液在37℃下培养30分钟而制备)和0.2ml的癸烷。将培养物在28℃下培养48小时。然后用2体积的乙酸乙酯提取该培养物两次，有机相浓缩至500μL，然后如实施例3所述用GC-MS分析。

该实施例表明，本发明所定义的用LPP合酶和香紫苏醇合酶转化的大肠杆菌细胞能生产香紫苏醇。转化大肠杆菌细胞的其他酶对于香紫苏醇的生产来说不是必需的。事实上，当大肠杆菌细胞仅用LPP合酶和香紫苏醇合酶转化时，也能生产香紫苏醇，但是产量较低。添加转化大肠杆菌细胞的其他酶的目的仅仅是为了提高LPP合酶和香紫苏醇合酶的可用前体的量。

实施例11

通过表达含有LPP合酶和香紫苏醇合酶和融合多肽而进行的香紫苏醇在大肠杆菌体内的生产

采用相同的方法来用融合蛋白生产香紫苏醇，所述融合蛋白在独特的多肽中含有连接在一起的LPP合酶和香紫苏醇合酶。制备一种含新cDNA(SEQ ID NO:87)的质粒，该新cDNA含有位于5’部分的SsLLPS3-del4序列(SEQ ID NO:31)和位于3’部分的1132-2-5序列(SEQ ID NO:73)。在该融合cDNA中，缺失了SsLPPS3-del4cDNA的终止密码子和1132-2-5cDNA的起始密码子。这两条cDNA通过一条15bp的序列(SEQ ID NO:81)连接起来，所述序列编码在两个蛋白质结构域之间构成接头的肽(SEQ ID NO:82)。所编码的融合多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:88中给出。

使用引物Sa3del4-fusion-inf1(SEQ ID NO:83)和Sa3del-fusion-inf2(SEQ IDNO:84)从pETDuet-SsLPPS3-del4质粒中重新扩增出SsLPPS3-del4cDNA(SEQ ID NO:31)。第一条引物设计成在5’端添加一条与pETDuet-1质粒的NdeI区互补的15bp的序列。第二条引物设计成移除终止密码子并且添加编码接头肽的序列。使用引物1132-fusion-inf1(SEQID NO:85)和1132-inf2(SEQ ID NO:86)从质粒pET101-1132-2-5中重新扩增出1132-2-5cDNA(SEQ ID NO:73)。对于SsLPPS-del4来说，这些引物设计成在3’端添加接头序列并添加一条与pETDuet-1质粒的KpnI区互补的15bp的序列。使用Pfu DNA聚合酶(Promega AG,Dubendorf,Switzerland)在与实施例10所述相同的条件下进行PCR。用NdeI和KpnI酶来消化pETDuet-CrtE-SsLPPS3-del4，并从插入物中纯化出线型质粒DNA。使用In-Fusion^TMDry-Down PCR克隆试剂盒(clontech)将这两种PCR产物和该线型质粒结合并连接在一起。通过插入物的测序得到的质粒pETDuet-CrtE-fusion-SsLPPS-1132(图13C)是受控的DNA。

为评价使用这种酶由GGPP起始的香紫苏醇的生产，可使用质粒pACYCDuet-4506(图13A)和pETDuet-CrtE-SsLPPS-1132-fusion(图13C)来共转化BL21 Star^TM(DE3)大肠杆菌细胞(Invitrogen)。经转化的细胞在羧苄青霉素(50μg/ml)氯霉素(34μg/ml)LB-琼脂糖板上进行选择。像实施例10那样进行培养、诱导、补充甲羟戊酸、提取和分析。

该实施例表明，经转化以表达本发明所定义的由LPP合酶结构域和香紫苏醇合酶结构域组成的融合蛋白的大肠杆菌细胞能生产香紫苏醇。转化大肠杆菌细胞的其他酶对于香紫苏醇的生产来说不是必需的。事实上，当大肠杆菌细胞仅用LPP合酶和香紫苏醇合酶转化时，也能生产香紫苏醇，但是产量较低。添加转化大肠杆菌细胞的其他酶的目的仅仅是为了提高LPP合酶和香紫苏醇合酶的可用前体的量。

Claims

1.一种生产香紫苏醇的方法，包括：

(a)将GGPP与至少一条具有LPP合酶活性的多肽接触，该多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:36～39中的任一者有至少98％的同一性，并且该多肽源自快乐鼠尾草；

(b)将步骤(a)中生产的LPP与至少一条具有香紫苏醇合酶活性的多肽接触，该多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:74有至少98％的同一性，并且该多肽源自快乐鼠尾草；并且

(c)非强制性选择地将步骤(b)中生产的香紫苏醇分离。

2.权利要求1的方法，其中通过将GGPP与所述至少一条具有LPP合酶活性的多肽和所述至少一条具有香紫苏醇合酶活性的多肽一起接触来同时进行步骤(a)和步骤(b)。

3.权利要求1的方法，其中步骤(a)和步骤(b)通过将GGPP与至少一条融合多肽接触而同时进行，所述融合多肽能催化GGPP至香紫苏醇的转化，并包含源自快乐鼠尾草的、与SEQID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:36～39中的任一者有至少98％同一性的氨基酸序列以及源自快乐鼠尾草的、与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:74有至少98％同一性的氨基酸序列。

4.权利要求1的方法，其中步骤(a)和步骤(b)同时进行，并包括在有助于香紫苏醇生产的条件下培养非人宿主生物体或细胞，该非人宿主生物体或细胞能生产GGPP，并且经转化以表达前述任一项权利要求所定义的至少一条具有LPP合酶活性的多肽以及前述任一项权利要求所定义的至少一条具有香紫苏醇合酶活性的多肽。

5.权利要求4的方法，还包括：在步骤(a)和步骤(b)之前，用源自快乐鼠尾草的、编码所述具有LPP合酶活性的多肽的至少一种核酸以及源自快乐鼠尾草的、编码所述具有香紫苏醇合酶活性的多肽的至少一种核酸来转化能生产GGPP的非人宿主生物体或细胞，从而所述生物体表达所述多肽。

6.权利要求5的方法，其中该编码具有LPP合酶活性的多肽的核酸的核苷酸序列与SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:28～31中的任一者或它们的补体有至少98％的同一性，并且/或者其中该编码具有香紫苏醇合酶活性的多肽的核酸的核苷酸序列与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:73或其补体有至少98％的同一性。

7.权利要求4或5的方法，其中所述非人宿主生物体或细胞用至少一种源自快乐鼠尾草的、编码融合多肽的核酸转化，从而所述生物体表达所述多肽，所述融合多肽能催化GGPP至香紫苏醇的转化，并包含源自快乐鼠尾草的、与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:36～39中的任一者有至少98％同一性的氨基酸序列以及源自快乐鼠尾草的、与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:74有至少98％同一性的氨基酸序列。

8.权利要求7的方法，其中用于转化非人宿主生物体或细胞的核酸包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:28～31中的任一者或它们的补体有至少98％同一性的核苷酸序列以及与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:73或其补体有至少98％同一性的核苷酸序列。

9.权利要求4～8中任一项的方法，其中所述非人宿主生物体是植物、原核生物或真菌。

10.权利要求4～8中任一项的方法，其中所述非人宿主生物体是微生物。

11.权利要求10的方法，其中所述微生物是细菌或酵母。

12.权利要求11的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(E.coli)，所述酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

13.权利要求4～8中任一项的方法，其中所述非人宿主细胞是植物细胞。

14.一种融合多肽，其能催化GGPP至香紫苏醇的转化，并包含源自快乐鼠尾草的、与SEQID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:36～39中的任一者有至少98％同一性的氨基酸序列以及源自快乐鼠尾草的、与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:74有至少98％同一性的氨基酸序列。

15.一种核酸，其编码权利要求14的融合多肽，并且该核酸源自快乐鼠尾草。

16.权利要求15的核酸，其包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:28～31中的任一者或它们的补体有至少98％同一性的核苷酸序列，并包含与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:73或其补体有至少98％同一性的核苷酸序列。

17.一种表达载体，其包含权利要求16的核酸。

18.权利要求17的表达载体，其形式为病毒载体、噬菌体或质粒。

19.权利要求17或18的表达载体，其包括权利要求15或16的核酸，该核酸可操作地连接至至少一条控制转录、翻译、起始或终止的调控序列。

20.权利要求19的表达载体，其中所述调控序列为转录启动子、操作子或增强子，或mRNA核糖体结合位点。

21.权利要求19或20的表达载体，其还包括至少一个选择标记。

22.一种非人宿主生物体，其经转化以包藏至少一种编码源自快乐鼠尾草的、具有LPP合酶活性并且氨基酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:36～39中的任一者有至少98％同一性的多肽的核酸以及至少一种编码源自快乐鼠尾草的、具有香紫苏醇合酶活性并且氨基酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:74有至少98％同一性的多肽的核酸，从而异源表达或过表达所述多肽，其中所述非人宿主生物体是原核生物或真菌。

23.一种非人宿主生物体，其经转化以包藏至少一种编码源自快乐鼠尾草的、具有LPP合酶活性并且氨基酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:36～39中的任一者有至少98％同一性的多肽的核酸以及至少一种编码源自快乐鼠尾草的、具有香紫苏醇合酶活性并且氨基酸序列与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:74有至少98％同一性的多肽的核酸，从而异源表达或过表达所述多肽，其中所述非人宿主生物体是微生物。

24.权利要求22或23的非人宿主生物体，其经转化以包藏至少一种编码融合多肽的核酸，所述融合多肽能催化GGPP至香紫苏醇的转化，并包含源自快乐鼠尾草的、与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:36～39中的任一者有至少98％同一性并具有LPP合酶活性的多肽的氨基酸序列以及源自快乐鼠尾草的、与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:74有至少98％同一性并具有香紫苏醇合酶活性的多肽的氨基酸序列。

25.权利要求23的非人宿主生物体，其中所述微生物是细菌或酵母。

26.权利要求25的非人宿主生物体，其中所述细菌是大肠杆菌，所述酵母是酿酒酵母。

27.一种生产能催化GGPP至香紫苏醇的转化的至少一条融合多肽的方法，包括：

(a)培养用权利要求17～19中任一项的表达载体转化的非人宿主生物体或细胞，从而使其包藏权利要求15或16的核酸并表达或过表达由所述核酸编码并能催化GGPP至香紫苏醇的转化的多肽；

28.权利要求27的方法，还包括：在步骤(a)之前，用权利要求17～19中任一项的表达载体来转化非人宿主生物体或细胞，从而使其包藏权利要求15或16的核酸并表达或过表达由所述核酸编码的多肽。

29.一种制备能催化GGPP至香紫苏醇的转化的变体融合多肽的方法，包括步骤：

(a)选择权利要求15或16的核酸；

(b)修饰所选择的核酸以获得至少一种突变核酸；

(d)对该多肽进行至少一种修饰特性的筛选；并且

(e)非强制性选择地，如果该多肽不具备想要的变体活性，则重复步骤(a)至(d)直至获得具有所需变体香紫苏醇合酶活性的多肽；

(f)非强制性选择地，如果在步骤(d)中鉴别出具有所需变体活性的多肽，则分离在步骤(c)中获得的相应突变核酸。