KR101062827B1 - Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＥＡ００１ 균주 유래의 신규 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Paenibacillus sp. EA001 균주 유래의 신규 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제(2-deoxyribose 5-phosphate aldolase, DERA)에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 Paenibacillus sp. EA001 균주 유래의 신규 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제, 상기 신규 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 코딩하는 유전자 및 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 이용한 생리활성물질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 천연물에 2개의 탄소유닛을 효소학적 방법으로 첨가할 수 있어, white Biotechnology의 중요성이 강조됨에 따라 기존에 화학적인 방법으로 제조되었던 여러 생리활성물질을 효소학적방법으로 대치할 수 있다.

2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제, 알돌축합반응, Paenibacillus sp.

Description

Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＥＡ００１ 균주 유래의 신규 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제{Novel 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase from Paenibacillus sp. EA001}

본 발명은 Paenibacillus sp. EA001 균주 유래의 신규 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제(2-deoxyribose 5-phosphate aldolase, DERA)에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 Paenibacillus sp. EA001 균주 유래의 신규 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제, 상기 신규 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 코딩하는 유전자 및 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 이용한 생리활성물질의 제조방법에 관한 것이다.

알돌라아제는 알돌축합 반응에 의해 탄소-탄소 결합을 촉매하는 효소로 알려져 있으며 생리활성을 가진 다양한 화합물을 합성하는 과정에 이용될 수 있다. 알돌라아제 중에서 특히, 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제는 다양한 알돌 라아제 중의 하나로써 아세트알데히드 의존적인 알돌라아제이며 탄소-탄소 결합에 있어 가장 유용한 효소로 알려져 있다 (Jennewein et al., Biotechnol. J., 1:537-548, 2006). 일반적으로 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제는 아세트알데히드와 D-글리세르알데히드-3-포스페이트의 알돌반응을 촉매하여 가역적으로 디옥시리보오스 5-포스페이트를 합성하는 과정에 관여한다.

2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제는 다양한 억셉터(acceptor)기질 특히, 프로파날(propanal), 아세톤(acetone), 플루오르아세톤(fluoroacetone) 등을 다양하게 이용할 수 있어 생리활성을 가진 다양한 슈가(sugar)를 합성할 수 있다.

기존의 화학적인 방법에 의한 화합물의 합성은 복잡성, 안정성의 문제나 다양한 화합물을 합성하는데 제한이 있는 반면, 효소적인 화합물의 합성은 상기의 문제점을 보완할 수 있을 뿐만 아니라 두 종류 이상의 효소를 사용하여 기능이 강화된 화합물을 합성할 수 있다. 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 효소와 rabbit muscle로부터 유래된 프럭토스-1,6-디포스페이트 알돌라아제 (fructose- 1,6-diphosphate aldolase)를 사용하면 탄화수소-연관 화합물(carbohydrate-related compounds)을 얻을 수 있고, 키랄 빌딩블럭(chiral building blocks) 또는 탄화수소 미메틱(carbohydrate mimetics)에 유용하게 이용될 수 있다. 특히, 당단백질인 시알산은 인플루엔자바이러스에 의한 혈구응집 작용을 저해하는 것으로 알려져 있는데, 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 효소와 N-아세틸뉴라미닉 액시드 알돌라아제 (N-acetylneuraminic acid aldolase)를 함께 이용하면 시알산 (sialic acid)의 유도체를 합성하는데 시너지 효과를 얻을 수 있다 (Takayama et al. Ann. Rev. Microbiol. 51:285, 1997).

최근에는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 이용하여 항바이러스성 뉴클레오사이드 (antiviral nucleosides), 항암제인 에포틸론 A (epothilone A), 그리고, 고지혈증 치료제인 스타틴 (statins) 계열의 치료제 등을 합성하는 과정에서 각각의 중간체를 제조할 수 있다고 보고되고 있다 (Greenberg et al., PNAS, 101, 5788-5793, 2004; Sukumaran and Hanefeld, Chem. Soc. Rev., 34, 530-542, 2005; Horinouchi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 71, 615-621, 2006). 특히, 아토바스타틴 (atorvastatin), 로수바스타틴 (rosuvastatin)과 같은 고지혈증 치료제는 세계적으로 높은 시장을 점유하고 있고, 점차로 수요가 증가될 것으로 예상된다. 따라서 신규 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제는 스타틴 계열 치료제의 중간체인 락톤 (lactone) 생산에 중요하게 사용될 수 있다. 또한, 신규 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 개선하여 생리활성물질을 합성하는데 중요하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.

최근에는 많은 생리활성물질의 합성에 있어서, 기존의 화학적인 합성법에 존재하는 경제성, 안정성, 환경문제 등의 많은 문제점들을 극복하기 위하여, 효소적인 합성방법을 사용하는 방향이 모색되고 있는 추세이다.

이에, 본 발명자들은 예시한 다양한 생리활성물질을 합성함에 있어 효율이 향상된 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 개발이 필요하다고 판단하고, 활성이 뛰어난, 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 토양에서 분리한 Paenibacillus sp. EA001 균주로부터 2-디옥시리보오 스 5-포스페이트 분해활성과 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 합성활성이 뛰어난 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 분리하고, 상기 효소의 아미노산 서열을 분석하여 신규 효소임을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 생리활성물질의 효소적 합성에 유용한, 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 분해활성과 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 합성활성이 뛰어난 신규 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 유전자로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자가 숙주세포의 염색체상에 삽입되어 있거나, 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 2-디옥 시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, D-디글리세르알데히드-3-포스페이트를 출발물질 또는 중간물질로 사용하는 생리활성물질의 제조방법에 있어서, 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 이용하여 중간산물에 2탄소 유닛을 축합시키는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 천연물에 2개의 탄소유닛을 효소학적 방법으로 첨가할 수 있어, white Biotechnology의 중요성이 강조됨에 따라 기존에 화학적인 방법으로 제조되었던 여러 생리활성물질을 효소학적방법으로 대치할 수 있다.

일 관점에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제에 관한 것이다.

상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제는 다양한 천연화합물에 2개의 탄소유닛을 첨가함으로써 다양한 생리활성물질의 합성에 사용할 수 있는 효소이다. 상기 효소는 화합물을 화학공정에 의해 합성할 때 발생될 수 있는 경제성, 안정성의 문제를 개선하는데 활용될 수 있다. 특히, 환경친화적인 공정의 중요성이 강조됨에 따라 화학공정을 줄이는 과정에 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제는 Paenibacillus sp. EA001 균주 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 Paenibacillus sp. EA001 균주는 토양으로부터 분리하였으며, 분리과정은 다음과 같다.

먼저, 2-디옥시리보오스를 분해하는 능력을 지닌 균주를 우선적으로 선별하였으며, 그 후 2-디옥시리보오스 5-포스페이트를 분해하는 반응에서의 활성 또는 합성하는 반응에서의 활성을 조사하여 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 활성을 지닌 균주를 2차적으로 선별하였다.

선별된 균주의 16S rRNA 염기서열을 결정하고, 그 결과를 GenBank 데이타베이스에서 검색하여, Paenibacillus polymyxa strain ISSDS-792 및 Paenibacillus sp. P119과 98%, Paenibacillus kribbensis과는 99%이상의 높은 상동성을 갖는 것을 확인하고, 상기 균주를 Paenibacillus sp. EA001로 명명하였다.

다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자에 관한 것이다.

본 발명에서는 상기 유전자를 수득하기 위하여, 다양한 균주의 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 아미노산 서열로부터 높게 보존된 부분의 아미노산 서열을 비교하여, 디제네레이트 프라이머 (degenerate primer)를 제작하고, 상기 효소를 암호화하는 유전자의 일부 염기서열을 증폭하였다. 그리고, 이 염기서열외의 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자의 나머지 전체 염기서열을 알아내기 위해 인버스 PCR 프라이머 (inverse PCR primer)를 상기 확인한 일부 염기서열로부터 제작한 후 PCR을 수행하였다.

그 결과, 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자의 염기서열은 663개의 염기로 구성되고, 아미노산 서열은 220개 (24.5 kDa)로 구성되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 아미노산 서열을 BlastP 검색을 한 결과 Geobacillus sp. Y412MC10 (ZP_03039924), Bacillus pumillus ATCC 7061 (ZP_03055147) 및 Bacillus cereus AH187 (ZP_02257186)와 각각 79%, 74% 및 71%의 상동성을 갖는 신규 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제로 확인되었다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 상기 효소의 유전자 염기서열을 밝혀내고, 상기 염기서열로부터 프라이머를 제작하여 유전자를 증폭하고, 발현 벡터인 pET302/NT-his의 EcoRI-BamHI 부위에 재조합하였으며 재조합된 벡터가 도입된 형질전환 미생물을 제작하였다.

2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 과잉 생산을 위해서 재조합된 플라스미드를 대장균 BL21(DE3)에 도입하였고, 얻어진 형질전환체를 100㎍/㎖ 앰피실린 (ampicillin)이 첨가된 LB 액체배지에 진탕배양하여 효소의 과발현을을 유도하였다. 배양액에서 수득한 균체를 초음파로 파쇄한 후, 원심분리하여 상등액을 회수하여 Ni-NTA agarose 담체를 통과시켜 크로마토그래피를 수행하였다. 효소활성 분획을 취하여 정제여부를 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 1).

본 발명은 상기 획득한 효소의 생화학적 특성을 조사하기위해 최적 반응 조건을 조사하였다. 반응 온도는 40℃~60℃에서 높은 활성을 보이며, 최적 반응온도는 50℃에서 상대적인 활성이 최대로 나타나는 것을 확인하였다 (도 2의 A). 최적 pH는 pH6에서 상대적으로 최대 활성을 보였으며, 중성 및 알카리 pH에서 비교적 높은 활성을 보였다 (도 2의 B). 그리고 열에 대한 안정성을 알아보기 위해 각 온도에서 1시간 처리 후 잔존 활성을 확인한 결과 60℃ 이하에서 효소활성이 안정하게 유지되는 것을 알 수 있었다 (도 2의 C).

또 다른 관점에서, 본 발명은 D-디글리세르알데히드-3-포스페이트를 출발물질 또는 중간물질로 사용하는 생리활성물질의 제조방법에 있어서, 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 이용하여 중간산물에 2탄소 유닛을 축합시키는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제는 D-디글리세르알데히드-3-포스페이트에 아세트알데히드를 축합시키는것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 생리활성물질은 항바이러스성 뉴클레오사이드, 에포틸론 A 및 스타틴계 고지혈증 치료제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 "2탄소 유닛"은 acetaldehyde, 2-hydroxyacetaldeyhde, chloroacetaldehyde 등의 아세트알데히드 유도체와 같이 탄소 2개를 가진 작용기를 의미한다.

본 발명에서, 상기 스타틴계 고지혈증 치료제는 아토바스타틴(atovasstatin), 로수바스타틴(rosuvastatin)일 수 있다.

본 발명의 일 양태로서, 아토바스타틴(atovasstatin)의 제조방법에 있어서, 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제는 도너기질인 acetaldehyde와 억셉터 (acceptor)기질인 aldehyde (잔기 : H, Cl, OMe, N₃)와의 알돌축합반응을 통해 다양한 스타틴 (statins)을 합성하기 위한 (3R,5S)-6-chloro-2,4,6-trideoxyhexapyranoside (lactone)을 합성한다. 그 후 화학적인 합성과정을 통해 (4R,6R)-[6-Cyanomethyl-2,2-dimethyl(1,3)dioxan-4-yl]acetic acid methyl ester가 합성되고, 최종적으로 아토바스타틴이 합성된다.

본 발명의 다른 양태로서 로수바스타틴(rosuvastatin)의 제조방법에 있어서, 상기 상기 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제는 도너기질인 아세트알데히드와 억셉터 기질인 알데히드 (잔기 : H, Cl, OMe, N₃)와의 알돌축합반응을 통해 다양한 스타틴 (statins)을 합성하기위해 lactone을 합성한다. 그 후 화학적인 합성과정을 통해 (3R,5S)-3,5,5-Trihydroxyhexanoic acid를 합성하고, 최종적으로 로수바스타틴이 합성된다.

본 발명에서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli DH5α, E. col JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli BL21 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)등이 또한 사용될 수 있다. 상기 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주 가 숙주세포로서 이용될 수 있다.

원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

본 발명에서 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일례로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있으며, pET 계열 벡터(Novagen)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 pET 계열 벡터를 사용하여 클로닝을 수행하면, 발현되는 단백질의 말단에 히스티딘기들이 결합되어 나오므로, 상기 단백질을 효과적으로 정제할 수 있다. 클로닝된 유전자로부터 발현된 단백질을 분리하기 위해서는 당업계에 공지된 일반적인 방법이 이용될 수 있으며, 구체적으로, Ni-NTA His-결합 레진(Novagen)을 사용하는 크로마토그래피 방법을 이용하여 분리할 수 있다.

본 발명에서 "발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다. 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어, Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 프로모터는 대장균에서 본 발명의 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 본 발명에 따른 단백질의 cDNA를 클로닝하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 활성을 갖는 균주의 분리

2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 활성을 갖는 균주를 분리하기 위하여, 내장산 및 강원도 일원에서 토양시료를 채취하였다. 채취된 토양 시료 1g을 생리식염수 9ml에 현탁하고, 10^-4~10^-6배로 희석하여 100㎕를 고체배지 (Max1000 15g/L, Bacto peptone 5g/L, yeast extracts 1g/L, K²HPO₄ 1g/L, NaH₂PO₄·2H₂O 0.6g/L, 0.5g/L MgSO₄·7H₂O, agar 20g/L)에 도말하고 30℃에 2~3일간 배양하였다.

2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 효소의 활성을 갖는 균주를 선별하기 위하여, 액체배지(Max1000 15g/L, Bacto peptone 5g/L, yeast extracts 1g/L, K₂HPO₄ 1g/L, NaH₂PO₄·2H₂O 0.6g/L, 0.5g/L MgSO₄·7H₂O)에 접종하고 30℃에서 3일간 200rpm으로 진탕 배양하여 2-디옥시리보오스를 분해하는 능력을 가진 균주를 1차적으로 선별하였다.

구체적으로 1차 선별은 원심분리하여 얻어진 균체에 2-디옥시리보오스 50mM을 포함하는 0.1M K₂HPO₄ (pH 7.0) 버퍼를 100㎕를 넣고 30℃의 진탕 배양기에서 24시간 반응하였고, 원심분리 후 상등액을 회수하여 박막 크로마토그라피 (Thin layer chromatography)를 통해 2-디옥시리보오스의 분해 능력을 확인하였다.

박막 크로마토그라피는 하기와 같이 진행하였다. 2-디옥시리보오스를 표준 시약으로 사용하고, 상기의 상등액을 크로마토그라피를 위한 판 (TLC aluminium sheets silicagel 60 F254, Merck co.)에 스폿팅하였다. 이것을 n-부탄올, acetic acid 및 증류수를 3:1:1 (v/v/v)의 비율로 혼합한 시약에 1회 전개하였다. 그후, 0.5ml의 p-아니스알데히드(p-anisaldehyde)를 50ml의 아세트산에 녹이고, 황산 1ml을 넣은 정색 시약으로 분사하였고, 열을 가하였다. 생산물은 Rf 값과 발색된 색을 통해 확인 하였다 (US 2004/0038351).

상기와 같은 방법으로 1차로 선별한 균주를 액체배지에서 3일간 진탕배양 후, 배양액을 0.5%(w/v) 2-디옥시리보오스 (2-deoxyribose)를 포함하는 DR 배지 (0.5% 2-디옥시리보오스, 0.2% ammonium chloride, 0.1% KH₂PO₄, 0.1% K₂HPO₄, 0.03% MgSO₄˙8H₂O, 및 0.01% 효모 추출물, pH7.0)로 교체하여, 30℃에 3일간 120rpm으로 진탕배양 후 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 활성을 갖는 균주를 2차적으로 선별하였다. 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 활성을 갖는 균주를 2차적으로 선별하기 위하여, 디옥시리보오스 5-포스페이트 (deoxyribose 5-phosphate, DR5P)를 분해하는 반응과, 합성하는 반응을 수행하였다.

구체적으로는 디옥시리보오스 5-포스페이트 생산을 위해서 반응액은 200㎕로 하고, 100mM 프럭토스 1,6 -디포스페이트 (fructose 1,6-diphosphate, FDP), 200mM 아세트알데히드를 사용하고, 200mM KH₂PO₄ (pH7.0), 15mM MgSO₄7H₂O, 효소추출액을 30℃에서 3시간 동안 125rpm으로 진탕 배양기에서 반응시켰다. 그 후, 생산된 디옥시리보오스 5-포스페이트는 시스테인-설페이트 방법 (Cysteine-sulfate method)로 확인하였다 (Stumpf, P. K., JBC, 169:367, 1947).

디옥시리보오스 5-포스페이트 분해반응은 반응액 100mM Tris-Cl(pH8.8), 1mM DR5P(디옥시리보오스 5-포스페이트), 적절히 희석된 효소 용액 10㎕를 총 100㎕가 되도록하고, 30℃에서 10분 반응시키고, ice stop하였다. 그 후 0.3mM NADH, 10U 알코올 디하이드로게네나아제 (alcohol dehydrogenase, ADH)를 넣고, 흡광도 측정기를 통해 340nm에서 NADH의 감소를 확인함으로써 효소활성을 측정하였다 (Horinouchi et al., Appl. Env. Microbiol., 69:3791, 2003).

상기 방법에 의해 선별한 균주를 16S rRNA 염기서열 결정을 의뢰하고, 그 결과를 GenBank 데이타베이스에서 검색하였다. 그 결과, Paenibacillus polymyxa strain ISSDS-792 및 Paenibacillus sp. P119와는 98% Paenibacillus kribbensis 와는 99%이상의 높은 상동성을 갖는 것을 확인하였고, 이 균주를 Paenibacillus sp. EA001로 명명하였다.

실시예 2: 토양으로부터 분리한 Paenibacillus sp. EA001 균주 유래의 신규 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자 분리

Paenibacillus sp. EA001 균주를 실시예 1에서 사용한 액체배지에 진탕배양하고, 회수된 균체로부터 염색체 DNA를 분리하였다. 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 인코드하는 유전자 (deoC)의 일부 서열을 디제네레이트 PCR (degenerate PCR)을 이용하여 증폭하였다.

올리고뉴클레오타이드 프라이머 (oligonucleotide primer)는 다양한 균주의 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 아미노산 서열을 비교하여 높게 보존된 구역(region)을 선택하여, 하기의 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다.

서열번호 3: 5'-GTNATHGGNTTYCCNYTNGGNGC-3' (forward)

서열번호 4: 5'-RAANCCNGTNWSNGTYTTNACRAA-3' (reverse)

(여기서, R=A + G, Y=C + T, S=G + C, H=A + T + C, N=A + G + C + T )

서열번호 3에서 N은 PCR 효율을 위하여 i(inosine)으로 치환하여 사용하였 다.

PCR 수행을 위한 반응액은 20㎕에 100ng 염색체 DNA, 5uM 각각의 프라이머, 200nM dNTP, 2U Taq polymerase, 1배 Taq DNA 중합효소 (MgCl₂ 포함) 완충액 이 되도록 조성하여 PCR 증폭에 사용하였다. PCR 반응은 95℃에서 3분간 변성 (denaturaion)을 수행한 후, 95℃에서 30초 변성, 48℃에서 1분 어닐링 (annealing), 72℃에서 1분 연장 (extension)을 30회 반복하였다. 마지막으로 72℃에서 10분 연장을 수행하고, 4℃에서 유지시켰다. 확보된 증폭단편은 pGEM-Teasy 플라스미드에 클로닝하여 염기서열의 결정을 의뢰하였고, 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자의 일부 서열임을 확인하였다.

2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자의 전체 서열을 결정하기 위하여, 인버스 PCR (inverse PCR) 방법을 이용하였다. 상기 PCR로부터 확인된 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자 서열로부터 프라이머를 제작하였다.

서열번호 5: 5'-GTGGATATGGTTATTAACATTG-3' (forward)

서열번호 6: 5'-CCTTCGTTTCAAATGCTTTCGT-3' (reverse)

PCR 증폭을 위해 염색체 DNA는 다양한 제한효소를 처리한 후, 제한효소 처리한 염색체 DNA 500ng을 셀프 라이게이션 (self-ligation)에 사용하였다. PCR 수행 을 위한 반응액은 50㎕에 25ng 염색체 DNA, 0.5uM 각각의 프라이머, 200nM dNTP, 2U EF Taq polymerase, 1배 Taq DNA 중합효소 (MgCl2 포함) 완충액 이 되도록 조성하여 PCR 증폭에 사용하였다. PCR 반응은 94℃에서 3분간 변성 (denaturation)을 수행한 후, 94℃에서 30초 변성, 50℃에서 어닐링 30초 (annealing), 72℃에서 2분 연장 (extension)을 35회 반복하였다. 마지막으로 72℃에서 10분 연장을 수행하고, 4℃에서 유지시켰다.

다양한 제한효소로 처리한 염색체 DNA중 EcoRI을 처리하여 셀프 라이게이션한 염색체 DNA로부터 확보된 증폭단편은 pGEM-Teasy 플라스미드에 클로닝하여 염기서열의 결정을 의뢰하였고, 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자의 전체서열을 확인하였다. 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제유전자 서열로부터 번역되는 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타내었다.

실시예 3: 재조합 대장균에서 생산되는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 발현 및 정제

Paenibacillus sp. EA001 균주 유래의 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 대장균 (DH5α)에서 과발현시키기 위하여 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자 (deoC)를 발현 벡터인 pET302/NT-his의 EcoRI-BamHI 부위에 삽입하여 재조합 플라스미드인 pET302EA001D를 제조하였다.

2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자는 상기 확인된 유전자 염기서열로부터 프라이머를 제작하고, Paenibacillus sp. EA001 균주의 염색체 DNA를 이용하여 획득하였다.

서열번호 7: 5'-gagaattcgatgaacatcgcagcattaat-3' (forward)

서열번호 8: 5'-tgggatccttagtaggaagatgtagactgc-3' (reverse)

상기 유전자를 증폭하기 위한 PCR 반응액은 20㎕에 100ng 염색체 DNA, 0.2uM 각각의 프라이머, 200nM dNTP, 2U Taq polymerase, 1배 Taq DNA 중합효소 (MgCl₂ 포함) 완충액 이 되도록 조성하여 PCR 증폭에 사용하였다. PCR 반응은 95℃에서 3분간 변성(denaturaion)을 수행한 후, 95℃에서 30초 변성, 48℃에서 45초 어닐링(annealing), 72℃에서 1분 연장(extension)을 25회 반복하였다. 마지막으로 72℃에서 10분 연장을 수행하고, 4℃에서 유지시켰다.

2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 과잉 생산을 위해서 재조합된 플라스미드를 대장균 BL21(DE3)에 도입하였고, 얻어진 형질전환체를 100㎍/㎖ 앰피실린(ampicillin)이 첨가된 LB 액체배지에서 37℃에서 16시간 동안 200rpm으로 진탕 배양하였다. 그 후 600nm에서 흡광도 값이 0.5가 되었을 때 최종농도 0.2mM 가 되도록 IPTG를 첨가하여 효소의 과발현을 유도하였다. 배양체를 원심분리하여 침전된 균체를 회수하고, 0.85% NaCl로 두 번 세척하였다. 회수된 균체에 1mM PMSF, protease inhibitor cocktail (Roche) 및 10mM imidazoe이 첨가된 100mM Tris-Cl (pH8.0)을 가하여 초음파로 파쇄한 후, 원심분리하여 상등액을 회수하여 효소를 정제하는데 이용하였다. 상기 상등액을 Ni-NTA agarose 담체를 통과 시켜 크로마토그 래피를 수행하였다. 효소의 용출시 250mM imidazole, 300mM NaCl, 20mM Tris-Cl (pH8.0)을 포함하는 용출액으로 효소활성 분획을 취하여 정제여부를 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 1).

정제된 효소는 Amicon Ultra-15 (Millipore, 10K NMWL device)로 농축한 후, 20% 글리세롤 (glycerol)을 포함한 100mM Tris-Cl (pH8.0) 용액에 넣어 4℃에서 12 시간 동안 투석 (dialysis)을 수행하였다.

순수 정제된 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 활성은 100mM Tris-Cl (pH8.8), 1mM DR5P(2-deoxyribose 5-phosphate), 0.3mM NADH 및 적절히 희석된 효소 용액 10㎕를 넣어 총 100㎕가 되도록하고, 30℃에서 10분 반응시키고, ice stop하였다. 상기 반응액을 25℃에서 3분 보관 후, 10U 알코올 디하이드로게네나아제 (alcohol dehydrogenase, ADH)를 넣고, 흡광도 측정기를 통해 340nm에서 NADH의 감소를 확인함으로써 효소활성을 측정하였다 (표 1). 효소의 유닛(U)은 2-deoxyribose 5-phosphate (DR5P)가 분해되어 분당 생산되는 acetaldhyde의 umole 수를 나타낸다.

Paenibacillus sp. EA001 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 정제단계의 활성 및 회수율

	총부피 (ml)	총단백질 (mg)	총 활성 (U)	단위활성 (U/mg)	정제(배)	수율 (%)
배양상층액	2	8.6	399.1	46.3	1	100
Ni-NTA 친화성크로마토그래피	1	4.8	381.2	78.7	1.7	96

실시예 4: 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 생화학적 특성

정제된 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 최적 반응 조건을 알아보기 위해 반응온도, pH의 영향을 조사하였다. 정제된 효소를 사용하여 10~80℃ 범위에서 10℃ 간격으로 상대적인 활성을 측정하였으며, 도 2의 A에 나타난 바와 같이, 50℃에서 최적 반응온도인 것을 알 수 있었다.

효소활성의 최적 pH를 결정하기 위해 100mM citrate buffer (pH 3~6), 100mM sodium phosphate buffer (pH 6~7), Tris-Cl buffer (pH 7~10), glycine/NaOH buffer (pH 10~11)를 사용하였다. 각 pH buffer에서 상대적인 활성을 조사한 결과 pH 6에서 최대 활성을 나타내었으며, 중성 및 알카리 pH에서 비교적 안정한 것으로 확인되었다 (도 2의 B).

열에 대한 안정성을 조사하기 위하여 35~65℃ 범위에서 5℃ 간격으로 잔존 활성을 측정하였다. 도 2의 C에 나타난 바와 같이, 각 지정된 온도에서 1시간 방치 후에 잔존 활성을 확인한 결과 60℃ 이하에서 잔존 활성이 높게 남아있는 것을 알 수 있었다.

실시예 5: 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 키네틱 파라미터 (kinetic parameters)확인

2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 2-디옥시리보오스 5-포스페이트를 기질로하여 kinetic parameter를 결정하기위해 사용하였고, Lineweaver-Burk plot 방법을 사용하여 정하였다. 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 Km 과 Vmax 값은 각각 145.179mM, 0.164 umole/min으로 확인되었다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다

도 1은 재조합 대장균으로부터 정제한 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제를 전기영동 후 쿠마시 염색을 하여 결과를 나타낸 것으로, 레인 m은 분자량 마커이고, 레인 1은 whole cell이며, 레인 2는 whole cell의 과발현을 나타낸 것이고, 레인 3은 세포 추출액이며, 레인 4는 Ni-NTA agarose chromatography 결과이다.

도 2는 Paenibacillus sp. EA001 균주로부터 분리한 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 생화학적 특성을 나타낸 그래프로, A는. 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 최적 온도를 10~80℃에서 10℃ 간격으로 확인한 것이며, B는 최적 pH를 조사한 것이며 (닫힌 사각형 : pH3~6, 열린 사각형 : pH6~7, 닫힌 삼각형 : pH7~10, 열린 삼각형 : pH10~11), C는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 열안정성을 확인한 것이고, 각 온도별로 1시간 처리 후 잔존 활성을 확인한 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel 2-deoxyribose 5-phosphate aldolase from Paenibacillus sp. EA001 <130> P08-B175 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 220 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. <400> 1 Met Asn Ile Ala Ala Leu Ile Asp His Thr Leu Leu Arg Ala Asp Ala 1 5 10 15 Thr Lys Asp Glu Ile Thr Lys Leu Thr Ala Glu Ala Lys Lys Tyr Gln 20 25 30 Phe Ala Ser Val Cys Val Asn Pro Ala Trp Val Ala Tyr Ala Ala Glu 35 40 45 Gln Leu Ala Gly Thr Gly Val Ala Thr Cys Thr Val Ile Gly Phe Pro 50 55 60 Leu Gly Ala Asn Thr Ser Ala Thr Lys Ala Phe Glu Thr Lys Asp Ala 65 70 75 80 Ile Ala Asn Gly Ala Thr Glu Val Asp Met Val Ile Asn Ile Gly Ala 85 90 95 Leu Lys Ala Arg Asp Leu Gln Leu Val Glu Gln Asp Ile Arg Ala Val 100 105 110 Val Glu Ala Ala Ala Gly Thr Leu Val Lys Val Ile Ile Glu Thr Ser 115 120 125 Leu Leu Thr Asp Glu Glu Lys Val Leu Ala Cys Glu Leu Ser Val Lys 130 135 140 Ala Gly Ala Asn Phe Val Lys Thr Ser Thr Gly Phe Ser Thr Gly Gly 145 150 155 160 Ala Thr Val Glu Asp Val Ala Leu Met Arg Lys Thr Val Gly Pro Glu 165 170 175 Ile Gly Val Lys Ala Ser Gly Gly Val Arg Ser Leu Glu Asp Val Gln 180 185 190 Lys Leu Val Glu Ala Gly Ala Ser Arg Ile Gly Ala Ser Ser Gly Val 195 200 205 Lys Ile Ile Glu Gly Glu Gln Ser Thr Ser Ser Tyr 210 215 220 <210> 2 <211> 663 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <400> 2 atgaacatcg cagcattaat cgaccataca ttgttgcgtg cagatgcgac gaaggatgaa 60 attacgaaat tgaccgctga ggcgaagaaa taccagtttg cttccgtatg tgtgaatccg 120 gcgtgggtag catatgcagc agaacagctc gcaggcacgg gcgtagccac ctgcacggtt 180 atcggtttcc cgctgggagc gaacacgtcg gcaacgaaag catttgaaac gaaggatgct 240 attgctaacg gtgcgactga ggtggatatg gttattaaca ttggcgcctt gaaggcacgt 300 gatctacagc tcgttgagca ggatattcgt gcagtcgtgg aagctgctgc cggtacactg 360 gtaaaggtga ttattgaaac cagtctgctg actgacgaag agaaggtgct ggcatgtgag 420 ctatccgtga aagcgggagc gaattttgtg aaaacctcga ctggcttctc tactggcggg 480 gcgactgtgg aagacgtggc tttgatgcgt aaaacggtag gacctgaaat tggggttaaa 540 gcttctggcg gcgtacgcag tctggaagac gtgcaaaagt tggtagaagc aggcgcaagt 600 cggatcggtg caagttccgg tgtgaaaatc atcgagggcg agcagtctac atcttcctac 660 taa 663 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtnathggnt tyccnytngg ngc 23 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 raanccngtn wsngtyttna craa 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gtggatatgg ttattaacat tg 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ccttcgtttc aaatgctttc gt 22 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gagaattcga tgaacatcgc agcattaat 29 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tgggatcctt agtaggaaga tgtagactgc 30

Claims (10)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제.
2. 제1항에 있어서, Paenibacillus sp. EA001 균주 유래인 것을 특징으로 하는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제.
3. 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제 유전자.
4. 제3항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
5. 제3항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
6. 제3항의 유전자가 숙주세포의 염색체상에 삽입되어 있거나, 제5항의 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물.
7. 제6항의 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 2-디옥시리보오스 5-포스페이트 알돌라아제의 제조방법.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제

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