KR100436924B1

KR100436924B1 - 베타 시크리테아제의 제조 방법

Info

Publication number: KR100436924B1
Application number: KR10-2000-0058300A
Authority: KR
Inventors: 묵인희; 장창환
Original assignee: (주) 디지탈바이오텍
Priority date: 2000-06-28
Filing date: 2000-10-04
Publication date: 2004-06-23
Also published as: KR20020002188A

Abstract

본 발명은 재조합된 베타 시크리테아제 유전자를 도입하여 형질전환 또는 형질감염시킨 숙주로부터 베타 시크리테아제를 대량으로 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 베타 시크리테아제 cDNA를 선택적으로 증폭시켜서 베타 시크리테아제 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계; 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 생성된 베타 시크리테아제를 분리 정제하는 단계;를 포함하는 베타 시크리테아제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명을 통하여 알츠하이머병 연구에 필수적인 역할을 하는 베타 시크리테아제를 대량으로 제조할 수 있다.

Description

베타 시크리테아제의 제조 방법{Process for production of beta-secretase}

본 발명은 베타 시크리테아제의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 베타 시크리테아제 정상 유전자 또는 돌연변이 유전자 발현 카세트를 벡터에 도입하여 발현 벡터를 제조하고 이를 숙주 세포에 도입하여 형질전환 또는 형질감염시킨 숙주 세포로부터 베타 시크리테아제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

베타 시크리테아제는 알츠하이머병 환자의 뇌에서 발견되어지는 베타 아밀로이드의 형성에 관여하는 단백질 분해 효소로서, 염기 서열은 사이언스지(1999년 10월)에 발표가 되었으며, 본 명세서에서 서열 목록 1로 표시된다. 이는 시그날 시퀀스(1-24), 프로 도메인(24-60), 캐탈리틱 도메인(60-453), 트랜스멤브레인 도메인(453-481) 및 사이토졸 도메인(481-501)으로 구성되어 있다.

노인성 치매의 60% 이상을 차지하는 알츠하이머병은 뇌에 노인반점(senile plaque)을 가지는 것을 특징으로 하는데 이 노인반점의 주요 성분이 베타 아밀로이드이다. 이 베타 아밀로이드는 아밀로이드 전구 대사 단백질(Amyloid Precursor Protein: APP)에서부터 베타 시크리테아제와 감마 시크리테아제라는 단백질 분해 효소의 작용에 의하여 형성되게 된다. 만일 베타 시크리테아제가 활성화되지 않는다면 베타 아밀로이드의 형성은 불가능하게 되는 것이므로 베타 아밀로이드 생성에 베타시크리테아제의 역할은 필수적이다. 따라서, 베타 시크리테아제는 치매 치료의 기초 연구에 중요하게 사용되어지는 만큼 그 대량 생산이 요구되고 있다. 그러나, 1999년 10월 베타시크리테아제의 염기서열이 발표된 이래 단백질 분해의 활성을 갖는 베타시크리테아제를 대량으로 제조하는 방법은 아직까지 알려진 것이 없었다.

본 발명은 단백질 분해의 활성을 갖는 베타 시크리테아제를 대량 생산하기 위하여 베타 시크리테아제 정상 유전자 또는 돌연변이 유전자 발현 카세트와 상기 발현 카세트를 벡터에 도입시킨 발현 벡터를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터들을 숙주 세포에 도입하여 형질전환시킨 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 하며, 상기 숙주 세포는 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유류일 수 있다.

또한 본 발명의 궁극적인 목적은 치매 치료의 기초 연구에 중요하게 이용되는 베타 시크리테아제를 다량으로 제조하는 방법을 제공하는 것으로서, 상기 제조 방법은 베타 시크리테아제 cDNA를 선택적으로 증폭시켜서 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환 또는형질감염시키는 단계; 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 생성된 베타 시크리테아제를 분리 정제하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

도 1은 박테리아 발현 벡터 pET22b와 베타 시크리테아제(22-501)(BASE22501)의 접합 모식도 및 클로닝 확인 결과이다.

도 2는 박테리아에서의 베타 시크리테아제 발현 결과이다.

도 3은 pREP41MH 및 pREP42MH 벡터의 모식도이다.

도 4는 효모에서 발현된 베타 시크리테아제의 정제 과정의 플로우 챠트이다.

도 5는 곤충세포에서 발현된 베타 시크리테아제 유전자의 클로닝 및 스크리닝 과정에 대한 플로우 챠트이다.

도 6은 발현 벡터를 곤충세포에 코트랜스펙션하는 과정의 모식도이다.

도 7은 포유류 발현 벡터 pcDNA3.1와 베타 시크리테아제(22-501)의 접합 모양 및 클로닝 확인 결과를 나타낸 도면이다.

도 8은 형질감염된 HEK 293 세포와 APP의 스크리닝 결과를 나타낸 도면이다.

도 9는 재조합된 베타 시크리테아제의 활성도를 나타낸 도면이다.

도 10은 베타 시크리테아제의 활성 부위 중 25번째 아미노산 Asp를 Asn으로 돌연변이화시키는 방법을 나타낸 도면이다.

도 11은 박테리아 발현 벡터 pET19b와 돌연변이된 베타 시크리테아제MBACE46419(D215N)의 접합 모식도 및 클로닝 확인 결과를 나타낸 도면이다.

도 12는 pET19b-MBACE46419/BL21(ED3) 발현 결과를 나타낸 도면이다.

도 13은 재조합된 돌연변이 베타 시크리테아제 MBACE의 활성도를 나타낸 도면으로서 1 ∼ 3은 pH 4.5에서, 1-1 ∼ 3-1은 pH 8.0에서의 활성도를 나타낸다.

도 14는 MBACE46419의 NIi-NTA 친화도를 나타낸 도면이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 베타 시크리테아제의 정상 유전자 또는 돌연변이 유전자를 이용하여 숙주 세포에서 대량 발현할 수 있는 발현 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여 형질전환시킨 형질전환체를 제공하며,

베타 시크리테아제 cDNA를 선택적으로 증폭시켜서 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계; 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 생성된 베타 시크리테아제를 분리 정제하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타 시크리테아제의 제조 방법을 제공한다.

특히, 상기 베타 시크리테아제 돌연변이 유전자는 수용성 단백질 형태로 발현을 유도하기 위한 것으로서, 베타 시크리테아제 활성 부위 중 215번째 아미노산 D(Asp)를 N(Asn)으로 돌연변이시킨 것이다. 이때, 상기 돌연변이 유전자 발현 벡터로 균주를 발현시키면 발현양이 상당히 증가할 뿐만 아니라 수용성 단백질 형태로 발현하게 되어 매우 유용하다.

이하에서 본 발명 베타 시크리테아제의 제조 방법을 상세히 설명하고자 한다.

1. 베타 시크리테아제 cDNA의 증폭

HEK293 세포를 배양하여 이 세포로부터 RNA를 추출하여 역전사 효소를 사용하여 전체 cDNA 라이브러리를 만든다. 이어서, 인간 베타 시크리테아제에 특이적인 프라이머를 제조하여, 전체 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고 pfu DNA 중합효소를 이용하여 공지의 PCR(Polymerase chain Reaction) 방법으로 베타 시크리테아제 cDNA를 증폭한다. 이때 프라이머는 전사 해독 프레임(Open reading frame :ORF) 부분만을 위한 프라이머와 전장(full length) 프라이머의 두 종류로서, 각각 정방향과 역방향 프라이머를 모두 제작한다.

A. 전사 해독 프레임용 프라이머

정방향 프라이머 : 서열 목록 2

역방향 프라이머 : 서열 목록 3

B. 전장 프라이머

정방향 프라이머 : 서열 목록 4

역방향 프라이머 : 서열 목록 5

2. 베타 시크리테아제의 cDNA의 선택적인 증폭

그 다음 여러가지의 다른 길이의 베타 시크리테아제를 발현하기 위해서, 각 부위에 맞는 특이적 프라이머를 적절히 제작하여, 상기에서 합성한 베타 시크리테아제 cDNA를 주형으로 하여 여러가지 다른 길이의 베타 시크리테아제 유전자를 선택적으로 증폭한다. 이와 같이 베타 시크리테아제 유전자의 선택적인 증폭을 하는 이유는 활성을 가지면서 발현율을 극대화하기 위해서이며, 이와 같은 선택적 증폭은 베타 시크리테아제의 염기 서열 중 캐탈리틱 도메인(60-453)을 가지는 부분을 중심으로 여러가지 다른 길이로 할 수 있으며, 이를 위한 프라이머로는 다음과 같다.

정방향 프라이머

F46 : 서열 목록 6 (NdeI site)

F22 : 서열 목록 7 (BamHI site)

역방향 프라이머

R419 : 서열 목록 8 (BamHI site)

R453 : 서열 목록 9 (XhoI site)

R501 : 서열 목록 10 (XhoI site)

상기에서 F는 정방향, R은 역방향을 뜻하며, 수치는 염기서열의 번호를 의미하며, 예를 들어 F46은 46번째 염기 서열부터 정방향으로 합성하는 것을 의미한다.

이들 프라이머들은 이후에 벡터로의 삽입과정에서 벡터에 멀티클로닝 사이트가 있는 특이적 제한 효소 사이트를 포함하여 벡터로의 삽입과정을 용이하게 수행할 수 있도록 한다.

3. 벡터로의 삽입

사용하는 벡터는 이후의 형질전환 또는 형질감염될 숙주 세포에 도입하기가적절한 벡터를 사용하며, 예를 들어 숙주가 박테리아인 경우에는 pET 박테리아 발현 벡터인 pET22b, pET21a, pET19b, pET3a 등을 사용할 수 있고, 숙주가 효모 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)인 경우에는 pREP41/42MH 벡터를 사용할 수 있고, 숙주가 곤충(바쿨로바이러스 시스템)인 경우에는 비융합 발현 벡터로 pVL1393을 융합 발현 벡터의 경우에는 pAcUW31을 사용할 수 있으며, 숙주가 포유류인 경우에는 pcDNA 벡터를 사용할 수 있다.

4. 재조합 DNA의 숙주로의 도입 및 클로닝

각각의 특이적인 벡터에 원하는 길이의 베타 시크리테아제 DNA가 도입된 재조합 DNA를 숙주 세포에 형질전환 또는 형질감염시킨다. 본 발명에서 사용될 수 있는 숙주로는 박테리아, 효모, 곤충 및 포유류 세포가 바람직하다.

이중, 박테리아, 예를 들어 대장균은 원핵 세포에서 베타 시크리테아제의 대량 생산을 위한 방법으로 사용된다.

효모는 진핵 세포에서 대량생산을 위한 재조합 단백질을 얻기 위한 방법 중의 하나로서, 효모는 출아형 효모인 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)이며 다른 하나는 분열형 효모인 스키조사카로마이세스 폼베로 나눌 수 있다. 효모는 다루기 쉽고 포유류 세포보다 성장이 빨라 짧은 시간 내에 다량의 단백질을 발현시킬 수 있으며, 진핵세포에 있는 많은 유전자들과 프로세싱 과정이 비슷하다는 장점을 가지고 있다.

바쿨로바이러스 발현 시스템은 진핵 발현 시스템이므로 단백질 개질, 프로세싱 및 전송 시스템을 사용할 수 있으며 헬퍼-종속적인 바이러스를 사용함으로써 쉽게 재조합 단백질을 많이 얻을 수 있다. 그리고 바이러스 게놈이 커서 크기가 큰 외래 DNA를 집어넣을 수 있다. 바쿨로바이러스 발현 시스템은 감염 세포에서 매우 높은 수준으로 발현되며 재조합 바이러스는 어떠한 헬퍼 기능도 필요하지 않다. 특정 플라크 모폴로지(plaque morphology)를 통해 간단하고 쉽게 재조합 단백질을 스크리닝 할 수 있는 장점을 가지고 있다.

숙주로 사용될 수 있는 포유류 세포로는 예를 들어 사람의 신경 세포주인 SY5Y 세포와 신장세포주인 HEK293 세포 등이 있다.

5. 베타 시크리테아제의 발현 및 분리, 정제

베타 시크리테아제의 이후의 발현 및 분리, 정제 단계는 형질감염체 또는 형질전환체의 특징에 따라 당업계에서 일반적으로 사용되는 적절한 방법으로 수행한다.

구체적인 방법은 하기 실시예에 기재되어 있으며, 본 실시예는 단지 예시적인 목적을 가지며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

베타 시크리테아제 정상 유전자를 이용한 베타 시크리테아제 제조 방법

실시예 1 : 베타 시크리테아제 cDNA의 증폭

HEK293 세포(Human embryonic kidney cell)을 배양하여 이 세포로부터 RNA를추출하여 역전사 효소를 사용하여 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 이어서, 공지된 베타 시크리테아제의 염기서열 정보로부터 다음과 같은 인간 베타 시크리테아제 특이적인 프라이머를 제작하였다.

전사 해독 프레임용 프라이머와 전체 길이를 위한 프라이머는 상기에 기재된 서열 목록 2 내지 5와 같다.

반응 튜브에 상기 프라이머 2 pmol을 넣은 다음, 주형으로 상기 cDNA 라이브러리 100 ng을 넣고, pfu DNA 중합효소를 가한 다음 PCR을 실시하여, 약 2³⁰염기쌍의 베타 시크리테아제 cDNA를 증폭하였다. 이때 PCR 반응 조건은 다음과 같다 : 94℃에서 5분간 예비변성, 94℃에서 1분간 변성, 68℃에서 3분간 어니얼링, 중합 29회, 68℃에서 5분간 최종 중합반응.

실시예 2 : 대장균에서의 대량 생산

발현시킬 베타 시크리테아제는 캐탈리틱 도메인(60-453)을 포함하는 부분을 중심으로 다음과 같은 6가지의 다른 길이의 단백질로서, 각각에 사용한 벡터 및 베타 시크리테아제 유전자는 다음과 같다. 이때, 단백질의 발현을 확인하고, 분리 및 정제를 용이하게 하기 위하여 i)∼iv)의 경우는 C-말단에 히스티딘 표지를 붙였으며, v)∼vi)의 경우는 N-말단에 히스티딘 표지를 붙였다.

ⅰ) pET22b + 베타 시크리테아제(22-501)

ⅱ) pET22b + 베타 시크리테아제(22-453)

ⅲ) pET21a + 베타 시크리테아제(1-460)

ⅳ) pET21a + 베타 시크리테아제(46-419)

ⅴ) pET19b + 베타 시크리테아제(46-419)

ⅵ) pET3a + 베타 시크리테아제(46-419)

단계 1 : 베타 시크리테아제 DNA의 선택적인 증폭 및 벡터로의 삽입

실시예 1에서 합성한 베타 시크리테아제 cDNA를 주형으로 하고 아래와 같은 각 부위에 맞는 특이적 프라이머를 제작하여 선택적으로 증폭한 후, 위 i)∼vi)과 같이 각각의 벡터에 삽입하였다. 각 프라이머에는 벡터로의 삽입을 용이하게 하기 위해 벡터의 멀티클로닝 사이트에 대한 특이적 제한 효소 사이트를 만들어 넣었다. 사용된 프라이머는 서열 목록 6 내지 10의 F46, F22, R419, R453, R501로서 상기 일반적인 제조 방법에 기재된 것과 동일하다.

이 중에서 (ⅰ)의 pET22b + 베타 시크리테아제(22-501)의 삽입 결과는 도 1에 나타나 있으며, 표에서 BASE22501은 베타 시크리테아제(22-501) 유전자를 의미한다.

단계 2 : 대장균에로의 형질 감염 및 베타 시크리테아제의 발현

이와 같이 클로닝한 베타 시크리테아제 유전자를 포함한 발현 벡터를 대장균 균주 BL21 DE3에 형질전환시킨 후, 앰피실린(50 ug/ml)이 포함된 LB(1% 트립톤, 0.5% 이스트 추출물, 1% NaCl) 배지에서 배양하여 형질전환이 이루어진 숙주 세포를 선별하였다. 단일 콜로니를 앰피실린(50 ug/ml)이 들어있는 LB 배지에 접종을 하여 37℃, 250 rpm의 조건으로 예비배양 한 후에 같은 성분의 LB 배지에 1%가 되도록 접종한 후 37℃에서 배양하였다. OD₆₀₀값이 0.5∼0.8에 이르면 IPTG를 1 mM이 되게 넣어주고 배양온도를 26℃로 낮추어서 5시간정도 배양 후 균체를 원심분리기(10분에 5000g)를 이용하여 분리하였다. 이때 IPTG를 넣기 전과 후로 나누어서 시간별(0, 2, 4, 6, 8 시간 및 밤새)로 균체를 채취하여 SDS-PAGE 분석을 통해서 베타 시크리테아제가 과다발현되는 시점을 결정하도록 하였다.

분리되어진 균체는 리소자임(0.2 mg/ml)으로 처리한 후 상온에서 1 시간동안 반응시키고 2분간 초음파처리하였다. 파쇄된 균체는 4℃, 12,000g에서 1 시간 동안 원심분리함으로써 균체의 잔재 및 불용성 단백질을 제거한 상징액을 회수하였다. 다음으로 분리한 상징액에 50% 슬러리의 Ni-NTA 아가로스를 첨가하고 4℃에서 2시간동안 계속적으로 교반시키면서 반응시켰다. 세척 완충액(50 mM NaH₂PO₄, pH8.0/ 300 mM NaCl/ 20 mM 이미다졸)을 첨가하고 3번 세척한 후에 용출 완충액(50 mM NaH₂PO₄, pH8.0/ 300 mM NaCl/ 250 mM 이미다졸)을 Ni-NTA 아가로스와 동량으로 첨가하고 잘 현탁시킨 다음 4℃에서 1 시간동안 반응시킨 후, 원심분리하여 융합된 베타 시크리테아제를 용출하였다. 용출 유,무는 12% SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 또한 불용성 단백질은 같은 성분의 세척 완충액, 용출 완충액에 8 M UREA를 첨가하여 동일한 방법으로 수행하였다.

이와 같이, 각 시간대별로 발현을 유도해 본 결과, 상기 i) 및 iii)의 경우IPTG 1mM 처리시 4시간부터 그 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 2). 도 2에서 BASE22501, BASE1460은 각각 베타 시크리테아제(22-501) 유전자, 베타 시크리테아제(1-460) 유전자를 의미한다.

pET22b-BASE22501로 형질전환된 E.coli는 2000년 7월 10일 생명공학연구소에 기탁하였으며, 수탁번호는 KCTC 18031P이다.

실시예 3 : 효모에서의 대량 생산

분열형 효모인 스키조사카로마이세스 폼베 발현 벡터에 단백질 분리에 용이한 6개의 히스티딘 표지가 되어 있는 벡터를 선택하였다. 상기 폼베 발현 벡터는 nmtl (No massage in Thyamine) 프로모터를 사용하였다. 이 프로모터를 사용하고 6개의 히스티딘을 가질 수 있는 pREP41/42MH 벡터를 사용하였다(도 3). 일단 베타 시크리테아제 유전자를 pREP41/42MH 벡터에 삽입시킨 후 리튬 아세테이트법을 사용하여JY741(h ade6-M210 ura4-D18 leul-32)에 형질감염시켰다. 형질감염은 다음과 같이 수행하였다.JY741을 YES(3% 글루코오스, 0.5% 이스트 추출물, 아미노산 보체 (0.0075% 아데닌, 0.025% 류신 0.0075% 우라실 및 0.0075% 히스티딘)) 배지에서 30%로 밤새 예비배양한 후, 세포가 5 x 10⁶에서 2 x 10⁷세포/ml 정도의 농도에 도달하면 3000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 세포를 수거한 후 20 ml DW로 세척하고 0.1M 리튬 아세테이트(pH 4.9) 20 ml를 첨가하고 잘 섞어 최종 농도가 1 x 10⁹세포/ml가 되게 하였다. 10 ㎕씩 튜브에 분할하여 담은 후 60분 동안 상온에 놓아두었다. 각각의 튜브에 pREP41/42MH DNA를 첨가하고 가볍게 볼텍싱한 다음 상온에 60분간 놓아두었다. 각각의 튜브에 50% PEG를 290 ㎕ 첨가하고 가볍게 볼텍싱한 후 50분간 상온에 놓아두었다. 43℃에서 15분간 열충격을 가한 후 10분간 상온에 놓아두었다. 각각의 튜브를 12,000 rpm에서 15초 동안 원심분리하여 세포를 수거한 후, DW로 3번에 걸쳐 세척하였다. EMM/ade + ura 배지에 세포를 푼 후 플레이트에 스프레딩하고 30℃에서 약 4일간 배양하였다. 이렇게 완성된 효모 세포를 다량 배양하여 단백질을 얻고, SDS-PAGE와 임뮤노 블로팅을 통해 확인하였다.

단백질 정제는 도 4와 같은 방법으로 진행하였다.

실시예 4 : AcMNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)을 사용한 대량 생산

바쿨로바이러스 발현 시스템에서는, 비융합 발현 벡터로는 pVL1393을 사용하였으며, 융합 발현 벡터로는 pAcUW31을 사용하였다.

PCR을 통해 2가지의 베타 시크리테아제 유전자의 증폭 과정을 거쳤는데, 하나는 염기서열 22-419의 길이를 가졌고(BASE22-419), 다른 하나는 염기서열 46-419의 길이를 가졌다(BASE46-419). 이를 위한 각각의 프라이머는 F46, F22, R419로서 실시예 2에 기재된 것과 동일하다.

각각의 프라이머에는 단백질의 분리(Ni-NTA 영역)를 용이하게 하기 위해 6개의 히스티딘 표지를 C-말단에 붙였다.

각각의 클론으로부터 BASE22-419가 44kDa, BASE46-419가 41kDa의 단백질을발현하였다.

재조합 바쿨로 바이러스의 클로닝과 스크리닝은 도 5와 같은 순서로 진행하였다. 도 5의 순서 중, 코트렌스펙션 과정 동안 도 6에 나타난 바와 같이 재조합 바이러스의 비율을 높이고 플라크 분석법을 통해 쉽게 재조합 산물을 얻기 위해 선형 와일드 타입 바이러스형 DNA를 사용하였다.

2 x 10⁶ Sf9 셀을 완전배지/10% FBS에서 60 nm 디쉬에 풀었다. 각각의 플레이트에 대해서 40㎕의 DW에 5㎕의 선형 AcMNPV DNA와 5㎕의 100 ng/㎕ 플라스미드 DNA를 첨가하였다. 그 후 DNA 용액에 50㎕의 리포펙틴을 첨가하고 잘 섞은 후 15분간 실온에서 놓아둔다. 15분간 배양하는 동안 플레이트의 배지는 FBS가 없는 완전 배지 1.5ml로 교체하였다. 리포펙틴-DNA 복합체를 각각의 플레이트에 천천히 흔들어 첨가하고 5시간 동안 27℃에서 배양하였다. 이후 15ml의 완전 배지/10% FBS를 각각의 플레이트에 넣은 후 27℃ 습도 상태에서 65시간 배양하였다. 트랜스펙션 상층액을 각각의 플레이트에 대해 15ml 원심분리 튜브에 담았다. 4℃, 1000 x g에서 원심분리 한 후, 새로운 튜브에 각각의 바이러스형 상층액을 옮기고 4℃에서 보관하였다. 확인 과정을 통해 목적 단백질의 발현이 확인되면 대량 배양 용기를 사용하여 대량 배양하였다.

실시예 5 : 포유류 세포에서의 대량 생산

상기 실시예 1에서 제조한 베타 시크리테아제 유전자를 포유류 발현 벡터인pcDNA3.1의 멀티 클로닝 사이트 중 EcoRI과 XhoI 사이트에 집어 넣었다(도 7). 도 7에서 A는 베타 시크리테아제 유전자 cDNA의 PCR 결과이고, B는 cDNA를 pcDNA3.1에 도입한 결과이고, C는 발현 벡터의 모식도이다.

이후, 리포좀을 매개체로 하여 사람의 신경세포주인 SY5Y 세포와 신장세포주인 HEK293 세포를 형질감염 시킨 후 발현 정도를 확인하였다. 이와 같이 베타 시크리테아제를 과다 발현하는 세포를 만든 후 이것이 APP의 반응과정에 어떻게 관여하는지를 확인하기 위해, 베타 시크리테아제에 의하여 잘려진 APP 단편을 특이적으로 검출하는 항체를 사용하여 확인하였다(도 8).

형질전환된 HEK293 세포는 2000년 7월 4일 서울대학교 의과대학 암연구소내 한국 세포주 연구 재단(KCLRF)에 기탁하였으며, 수탁번호는 KCLRF-BP-00031이다.

실시예 6 : 대량 생산된 베타 시크리테아제의 활성도 검증

각각의 실시예에서 대량 생산된 베타시크리테아제의 활성도를 확인하기 위하여 산성 조건(pH 4.5)와 염기성 조건(pH 8.0)으로 하여 각각 APP 기질과 함께 반응시킨 뒤 절단된 단편인 sAPPβ를 웨스턴 블롯한 후, 특이적 항체를 이용하여 조사하였다. 그 결과 pH 4.5에서 베타 시크리테아제의 활성이 pH 8.0에서보다 높게 나타났다(도 9). 도 9에서 1-1, 10-1번은 pH 8.0 조건에서 측정한 것이고, 나머지 1~10은 pH 4.5 조건에서 측정한 것이다.

이와 같이 베타 시크리테아제의 활성도 측정을 pH 4.5와 8.0에서 측정한 이유는 다음과 같다. 즉, 베타 시크리테아제는 효소이므로 단백질을 분해하는 활성이없다면 대량생산하는 아무런 의의가 없을 것이다. 그러므로 그 활성을 검증하는 작업은 필수적인 것이다. 생체내의 각 소 기관들은 각각 특유의 pH를 나타내고 있으며, 베타 시크리테아제가 존재할 것으로 추정되는 소포체와 골지체는 pH가 산성을 띠는 4.5 정도를 유지하고 있으며 대부분 중성을 띠고 있다고 알려져 있다. 활성정도를 살펴볼 때 pH를 4.5부터 8까지 설정한 이유는 세포내에 존재 할 수 있는 극단의 pH를 설정해본 것으로서, 예상했던 대로 베타시크리테아제 활성이 소포체와 골지체의 pH에서 더 높은 것으로 나타났다.

베타 시크리테아제 돌연변이 유전자를 이용한 베타 시크리테아제 제조 방법

실시예 7 : 베타 시크리테아제 cDNA 클로닝

베타 시크리테아제 cDNA의 합성 및 시스템에서의 발현을 위한 클로닝은 실시예 1에 기재된 베타 시크리테아제 정상 유전자를 이용하는 방법과 동일하다.

실시예 8 : 베타 시크리테아제의 돌연변이화

베타 시크리테아제의 활성 부위 중 215번째 아미노산 D(Asp)를 N(Asn)으로 돌연변이를 실시하여 D215N이라 명명하고 포유류에서 발현하는 벡터인 pCDNA3.1c에 클로닝하였으며 시퀀싱을 통해서 이를 확인하였으며, G을 A로 치환하였음을 알 수 있다(도 10 참조).

실시예 9 : 박테리아에서의 대량 생산

pET 박테리아 발현 벡터를 사용하여 돌연변이 시킨 베타 시크리테아제 (D215N)의 박테리아에서의 발현을 유도하였다.

전술한 바와 같이, 베타 시크리테아제는 시그널 시퀀스(1-24), 프로도메인(24-60), 캐탈리틱 도메인(60-453), 트랜스멤브레인 도메인(453-481) 그리고 사이토졸 도메인(481-501)으로 구성되어 있으며, 본 실험에서는 박테리아에서의 발현시 발현된 단백질의 수용성(Solubility)를 높이기위해 캐탈리틱 도메인을 가지는 부분을 중심으로 프로도메인의 46번부터 캐탈리틱 도메인의 419까지 길이로 발현 지역을 최소화하여 박테리아에서의 발현을 유도하였다. 발현 벡터로는 pET19b를 사용하였으며, 여기에는 N-말단 히스티딘 tag이 되어있어 발현확인 및 분리 정제를 쉽게 할 수 있게 하였다.

실시예 10 : PCR

위에서 합성한 돌연변이(D215N) 베타 시크리테아제 cDNA를 주형으로 하고 각 부위에 맞는 프라이머를 제작하여 벡터에 클로닝을 시켰다. 이때 클로닝을 용이하게 하기 위하여 벡터에 다중클로닝 부위가 있는 특이적 제한효소 부위를 프라이머에 만들어서 넣었다.이때 프라이머의 서열은 정방향 프라이머로는 F46 을 사용하고 역방향 프라이머로는 R419를 사용하였으며, 이는 상기 실시예 2의 단계 1에 기재된 것과 동일하다.

실시예 11 : 발현벡터의 구성 및 발현

이와 같이 클로닝한 돌연변이 베타시크리테아제 D215N을 포함한 발현벡터를E.coliBL21(DE3) 균주에 CaCl₂방법을 이용하여 형질전환시킨후, IPTG를 사용하여 원하는 돌연변이 베타시크리테아제의 발현을 유도하였다. 각 시간대별로 발현양을 확인해본 결과 IPTG 1 mM 처리후 4시간후가 발현양이 가장 많았으며 또한 수용성 단백질의 형태로 발현되는 것을 확인하였다(도 11 참조).

pET19b-MBASE46419로 형질전환된 E.coli는 2000년 8월 17일 생명공학연구소에 기탁하였으며, 수탁번호는 KCTC 18040P이다.

실시예 12 : 재조합 돌연변이 베타시크리테아제의 활성도 검증

대량 생산된 베타시크리테아제의 활성도를 확인하기 위하여 pH를 산성 조건 (pH 4.5)과 염기성 조건(pH 8.0)으로 하여 각각 APP 기재와 함께 반응시킨 뒤 그 절단된 단편인 sAPPβ를 웨스턴 블럿을 한 뒤 특이적 항체를 이용하여 조사하였다. 그 결과 pH 4.5에서 베타시크리테아제의 활성이 pH 8.0에서보다 높게 나타났다(도 12 참조).

실시예 13 : 분리 정제

발현벡터에 들어있는 돌연변이 베타시크리테아제는 단백질 발현을 위하여 숙주 세포인 BL21(DE3)에 형질전환 시킨 후 앰피실린(50 ug.ml)이 포함된 LB(1%trypton, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) 배지에서 배양하여 형질전환이 이루어진 숙주 세포를 선별하였다. 단일 콜로니를 앰피실린(50 ug/ml)이 들어있는 LB 배지에 접종을 하여 37℃, 250rpm의 조건으로 예비배양한 후 같은 성분의 LB 배지에 1%가 되도록 접종한 후 37℃에서 배양하였다. OD₆₀₀값이 0.5∼0.8에 이르면 유도물질인 IPTG를 1 mM이 되게 넣어주고 배양온도를 26℃로 낮추어서 5시간정도 배양 후 균체를 원심분리기(5000g at 10 min)를 이용하여 분리하였다. 분리되어진 균체는 리소자임(0.2 mg/ml)로 처리 후 상온에서 1 시간 반응 후 2분간 초음파처리하였다. 파쇄된 균체는 4℃, 12,000g에서 1 시간을 원심분리함으로써 균체의 잔재 및 불용성 단백질을 제거한 상징액을 회수하였다. 다음으로 분리한 상징액에 50% 슬러리의 Ni-NTA 아가로스를 첨가하고 4℃에서 2시간동안 지속적으로 섞어주면서 반응 시켰다. 세척용 완충액(50 mM NaH₂PO₄, pH8.0/ 1 M NaCl/ 20 mM Imidazole/ 0.1% Triton X-100)를 첨가하고 3번 세척한 후에 용출 완충액(50 mM NaH₂PO₄, pH8.0/ 1 M NaCl/ 250 mM Imidazole/ 0.1% Ttiton X-100)을 Ni-NTA 아가로스와 동량으로 첨가하고 잘 현탁시킨 다음 4℃에서 1 시간동안 반응시킨 후, 원심분리하여 융합된 베타 시크로테아제를 용출시켰다. 용출 유무는 12% SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 또한 불용성 단백질은 동일한 성분의 세척용 완충액, 용출용 완충액에 8 M UREA를 첨가하여 동일한 방법으로 수행하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 생산 방법에 따르면 베타 시크리테아제를 효율적으로 대량 생산할 수 있으며, 이와 같이 대량생산된 베타 시크리테아제는 알츠하이머 병의 치료에 있어 베타 시크리테아제의 기능을 응용하는 연구분야에 유용하게 이용될 수 있다. 특히, 본 발명 베타 시크리테아제 재조합 돌연변이 유전자(D215N) 발현 벡터로 균주를 형질전환시키면, 발현양을 상당히 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 수용성 단백질 형태로 발현시킬 수 있어 치매 치료 연구에 매우 유용하다. 이와 같이 대량생산된 베타 시크리테아제를 이용하여 특이적인 항체를 제조하여 치매 치료 약제의 제조에 효과적으로 이용할 수 있다.

<110> Hyun-Wan Lee;DIGITAL BIOTECH <120> Method for production of beta-secretase <130> 1 <160> 10 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 2526 <212> DNA <213> Human <400> 1 ccacgcgtcc gcagcccgcc cgggagctgc gagccgcgag ctggattatg gtggcctgag 60 cagccaacgc agccgcagga gcccggagcc cttgcccctg cccgcgccgc cgcccgccgg 120 ggggaccagg gaagccgcca ccggcccgcc atgcccgccc ctcccagccc cgccgggagc 180 ccgcgcccgc tgcccaggct ggccgccgcc gtgccgatgt agcgggctcc ggatcccagc 240 ctctcccctg ctcccgtgct ctgcggatct cccctgaccg ctctccacag cccggacccg 300 ggggctggcc cagggccctg caggccctgg cgtcctgatg cccccaagct ccctctcctg 360 agaagccacc agcaccaccc agacttgggg gcaggcgcca gggacggacg tgggccagtg 420 cgagcccaga gggcccgaag gccggggccc accatggccc aagccctgcc ctggctcctg 480 ctgtggatgg gcgcgggagt gctgcctgcc cacggcaccc agcacggcat ccggctgccc 540 ctgcgcagcg gcctgggggg cgcccccctg gggctgcggc tgccccggga gaccgacgaa 600 gagcccgagg agcccggccg gaggggcagc tttgtggaga tggtggacaa cctgaggggc 660 aagtcggggc agggctacta cgtggagatg accgtgggca gccccccgca gacgctcaac 720 atcctggtgg atacaggcag cagtaacttt gcagtgggtg ctgcccccca ccccttcctg 780 catcgctact accagaggca gctgtccagc acataccggg acctccggaa gggtgtgtat 840 gtgccctaca cccagggcaa gtgggaaggg gagctgggca ccgacctggt aagcatcccc 900 catggcccca acgtcactgt gcgtgccaac attgctgcca tcactgaatc agacaagttc 960 ttcatcaacg gctccaactg ggaaggcatc ctggggctgg cctatgctga gattgccagg 1020 cctgacgact ccctggagcc tttctttgac tctctggtaa agcagaccca cgttcccaac 1080 ctcttctccc tgcagctttg tggtgctggc ttccccctca accagtctga agtgctggcc 1140 tctgtcggag ggagcatgat cattggaggt atcgaccact cgctgtacac aggcagtctc 1200 tggtatacac ccatccggcg ggagtggtat tatgaggtga tcattgtgcg ggtggagatc 1260 aatggacagg atctgaaaat ggactgcaag gagtacaact atgacaagag cattgtggac 1320 agtggcacca ccaaccttcg tttgcccaag aaagtgtttg aagctgcagt caaatccatc 1380 aaggcagcct cctccacgga gaagttccct gatggtttct ggctaggaga gcagctggtg 1440 tgctggcaag caggcaccac cccttggaac attttcccag tcatctcact ctacctaatg 1500 ggtgaggtta ccaaccagtc cttccgcatc accatccttc cgcagcaata cctgcggcca 1560 gtggaagatg tggccacgtc ccaagacgac tgttacaagt ttgccatctc acagtcatcc 1620 acgggcactg ttatgggagc tgttatcatg gagggcttct acgttgtctt tgatcgggcc 1680 cgaaaacgaa ttggctttgc tgtcagcgct tgccatgtgc acgatgagtt caggacggca 1740 gcggtggaag gcccttttgt caccttggac atggaagact gtggctacaa cattccacag 1800 acagatgagt caaccctcat gaccatagcc tatgtcatgg ctgccatctg cgccctcttc 1860 atgctgccac tctgcctcat ggtgtgtcag tggcgctgcc tccgctgcct gcgccagcag 1920 catgatgact ttgctgatga catctccctg ctgaagtgag gaggcccatg ggcagaagat 1980 agagattccc ctggaccaca cctccgtggt tcactttggt cacaagtagg agacacagat 2040 ggcacctgtg gccagagcac ctcaggaccc tccccaccca ccaaatgcct ctgccttgat 2100 ggagaaggaa aaggctggca aggtgggttc cagggactgt acctgtagga aacagaaaag 2160 agaagaaaga agcactctgc tggcgggaat actcttggtc acctcaaatt taagtcggga 2220 aattctgctg cttgaaactt cagccctgaa cctttgtcca ccattccttt aaattctcca 2280 acccaaagta ttcttctttt cttagtttca gaagtactgg catcacacgc aggttacctt 2340 ggcgtgtgtc cctgtggtac cctggcagag aagagaccaa gcttgtttcc ctgctggcca 2400 aagtcagtag gagaggatgc acagtttgct atttgcttta gagacaggga ctgtataaac 2460 aagcctaaca ttggtgcaaa gattgcctct tgaattaaaa aaaaaaacta gaaaaaaaaa 2520 aaaaaa 2526 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 gccgaattca agctccctct cctgagaagc c 31 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer <400> 3 ggcctcgagc ttcagcaggg agatgtcatc a 31 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 4 ggcgaattcg tgccgatgta gcgggctccg 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer <400> 5 ggcctcgagc tggaacccac cttgccagcc 30 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward priemr <400> 6 tttcatatgg agaccgacga agagcccga 29 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 caggarccaa cccagcacgg aatc 24 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 tttggatcca gcgctgacag caaagcc 27 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 9 cacgagctca ctgagtagac agac 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 10 cacgagctca gtgaagtcgt ccct 24

Claims

삭제
서열번호 1로 나타낸 염기서열의 서열번호 60-419를 갖는 유전자를 pET22b, pET21a, pET19b, pET3a, pREP41/42MH, pVL1393, pAcUW31 및 pcDNA 벡터로 구성된 군에서 선택되는 벡터에 삽입하되, 베타 시크리테아제의 활성 부위 중 215번째 아미노산 D(Asp)를 N(Asn)으로 돌연변이시킨 유전자(D215N)를 포함하는 것임을 특징으로 하는 베타 시크리테아제 돌연변이 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
삭제
삭제
제2항의 재조합 발현 벡터를 대장균, 효모, 곤충 및 포유류로 구성된 군에서 선택된 1종의 숙주세포에 도입하여 형질전환됨을 특징으로 하는 형질전환체.
삭제
제5항에 있어서, 대장균 BL21(DE3)/pET22b-BACE22501(수탁번호 : KCTC 18031P, 2000. 7. 10.).
제5항에 있어서, 대장균 BL21(DE3)/pET19b-MBACE46419(수탁번호 : KCTC 18040P, 2000. 8. 17.).
제5항에 있어서, 포유류 HEK293 CELL/pcDNA3-BACE(수탁번호 : KCLRF-BP-00031, 2000. 7. 4.).
베타 시크리테아제 cDNA를 선택적으로 증폭시켜서 베타 시크리테아제 돌연변이 유전자(D215N)를 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;

상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계; 및

상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하고, 생성된 베타 시크리테아제를 분리 정제하는 단계;

로 이루어진 베타 시크리테아제의 제조 방법.
삭제