JP3803978B2 - グルカゴン分解酵素及びそれをコードする遺伝子並びに該グルカゴン分解酵素に対する抗体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なグルカゴン分解酵素、それをコードする遺伝子、該グルカゴン分解酵素の製造方法及び該グルカゴン分解酵素に対する抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルカゴンは膵臓から分泌されるホルモンで、２９個のアミノ酸から構成されており、インスリンに拮抗して血糖量を増加させる。 グルカゴノーマ症候群においては、グルカゴン産生腫瘍のほかに、天疱瘡様皮膚炎、口内炎、体重減少、貧血、低アミノ酸血症、耐糖能異常を伴い、血中のグルカゴン量が高まる。
【０００３】
一方、バソアクティブ・インテスティナル・ペプタイド（Vasoactive Intestinal Peptide；以下、「ＶＩＰ」と略す ）は、多様な生理活性を持つ神経伝達物質で、２８個のアミノ酸で構成されたペプチドである。臨床的には、ＶＩＰはＷＤＨＡ症候群（膵腺腫を伴う消化器症状）の原因物質である。
グルカゴノーマ症候群やＷＤＨＡ症候群の予防／治療方法として、グルカゴンやＶＩＰを分解する酵素の活用が考えられるが、従来、グルカゴンやＶＩＰを分解する酵素は知られていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、前記疾患の予防／治療のためには、まず、グルカゴンやＶＩＰを分解する酵素を見出し、これを分離、精製することや、更にこの酵素の遺伝子を解明する必要があった。
また、該酵素の生理的役割や生体内分布については乏しい知見しかないので、それらを明らかにする上でも該酵素の純品を得て、その酵素に対する純粋な抗体を取得する必要もあった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、無タンパク培養系での有用物質の生産を研究する過程において、グルカゴン分解酵素の存在を見いだした。
そして、各種の分離、精製手段を利用し、125Ｉ−標識グルカゴンを用いるアッセイ法で酵素活性を追跡しつつ純度を高めていった結果、純品としてグルカゴン分解酵素を得た。
また、このグルカゴン分解酵素のペプチド配列から、公知方法に従って当該酵素をコードする遺伝子を見いだし、該遺伝子を含んでなる発現ベクターを作成し、該発現ベクターにより形質転換された宿主を得た。
【０００６】
更に、グルカゴン分解酵素の製造方法として、ヒト膵臓癌組織由来の腫瘍細胞を培養し、その培養物中から該酵素を採取する方法およびグルカゴン分解酵素発現ベクターにより形質転換された形質転換体を培養又は飼育し、該形質転換体から該酵素を採取する方法も確立した。
更にまた、前記疾患の治療や診断の目的に利用しうるグルカゴン分解酵素に対する抗体を得た。
【０００７】
本発明は、これらの知見に基づき完成されたものであり、新規なグルカゴン分解酵素、それをコードする遺伝子系、該酵素の製造方法及び該酵素に対する抗体を提供するものである。
【０００８】
本発明のグルカゴン分解酵素（以下、「ＧＤＥ」と略す）は、例えばヒト膵臓癌腫瘍細胞の培養上清から、グルカゴン分解活性を有する画分を、種々の精製手段を組合せ、分離、精製すれば良い。
【０００９】
より具体的には、例えば、「ＨＰＣ−ＹＯ」と名付けられたヒト膵臓癌腫瘍細胞由来の株化細胞を継代培養し、その培養上清をグルカゴン分解活性を指標に、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を組み合わせ単一ピークを与えるまで精製することにより得ることができる。 グルカゴン分解活性は、標識グルカゴン、例えば125Ｉ標識グルカゴン等を用いることにより、測定することができる。
【００１０】
このようにして得られた本発明のＧＤＥは、次のような酵素学的性質を有していた。
（１）作用：
グルカゴン、バソアクティブ・インテスティナル・ペプタイド（Vasoactive Intestinal Peptide）およびセクレチンを基質とし、それぞれ下記の矢印に示すペプチド結合を加水分解する。
【化２】
（２）基質特異性：
グルカゴン、バソアクティブ・インテスティナル・ペプタイド及びセクレチンを加水分解する。
（３）等電点：
ｐＩ ６.８
（４）阻害剤：
酵素反応は１ｍＭのアンチパインによって阻害されるが、１ｍＭのロイペプチンによっても、０.１ｍＭのペプスタチンによっても阻害されない。
（５）分子量：
８３ｋＤａ（ＳＤＳ電気泳動動法による）
（６）以下のペプチドフラグメントを有する：
（i） ＳＮＳＴＳＹＶＫ
（ii） ＹＹＡＳＴＳＹＤＤＴＹＫ
（iii）ＮＬＴＥＥＹＤＶＳＤＧＥＩＥＬＬＹＥＫ
（iv） ＬＹＷＦＬＤＥＡＫ
（v） ＥＬＲＥＶＥＴＹＹＤＬＬＦＥＫ
【００１１】
本発明のＧＤＥは、例えば実施例に示すごとくして単離精製されるが、一旦単離精製され、その性質が解明された後は、それらの性質を指標にして蛋白質の単離精製に用いられる任意の常法を用いて本発明のＧＤＥを単離精製できることは明らかである。
【００１２】
次に、遺伝子操作の手法により、本発明のＧＤＥ発現ベクターにより形質転換された形質転換体を培養又は飼育し、該形質転換体から該酵素を採取する方法について説明する。
【００１３】
ＧＤＥのｃＤＮＡのクローニングは、株化細胞「ＨＰＣ−ＹＯ」から常法に従ってｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡライブラリーを作製後、抗ヒトＧＤＥ抗体を用いた抗体スクリーニングにより目的のｃＤＮＡを得、次いでその塩基配列を決定することにより行われる。
【００１４】
上記手順により決定された、本発明ＧＤＥの塩基配列は、後記配列表の配列２に示すとおりである。
また、上記ＧＤＥは、決定された塩基配列から、後記配列表の配列１に示すアミノ酸配列またはこれと相同性を有するアミノ酸配列を有するものと推定されている。 なお、本明細書において相同性を有するアミノ酸配列とは、あるアミノ酸配列に対し、１又は複数のアミノ酸が付加、除去及び／又は置換されているが、その作用においては原アミノ酸配列とほぼ同等な作用を有するアミノ酸配列を意味する。
【００１５】
以上のようにＧＤＥのアミノ酸配列が決定されると、前記の方法に限られず、他の方法によっても本発明のＧＤＥをコードする遺伝子（以下、「ＧＤＥ遺伝子」という）を得ることができる。 すなわち、天然ＧＤＥのアミノ酸配列をコードする１つのヌクレオチド配列が決定されれば、本ＧＤＥ遺伝子は前記ストラテジーとは異なるストラテジーによりｃＤＮＡとしてクローニングすることができ、さらには、それを産生する細胞のゲノムからクローニングすることもできる。
【００１６】
ゲノムからクローニングする場合、プローブヌクレオチドとして下記のいずれかのペプチドのヌクレオチド配列に基づいて設計されたゲノムＤＮＡを使用することができる。
【００１７】
【００１８】
ゲノムから目的とするＤＮＡをクローニングするための一般的方法は、当業界において良く知られている（例えば、Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley & Sons社第５章及び第６章）。
【００１９】
本発明のＧＤＥ遺伝子はまた、化学合成によっても調製することができる。 ＤＮＡの化学合成は、当業界において自動ＤＮＡ合成機、例えばアプライド・バイオシステムズ社の３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機などを採用することにより容易に行うことができる。
【００２０】
次に、上記のようにして得られたＧＤＥ遺伝子としてプラスミドに導入し、常用の遺伝子組換え法により哺乳動物細胞等の宿主を形質転換してＧＤＥを発現させる。 ＧＤＥの発現は、抗ヒトＧＤＥ抗体を用いたウェスタン・ブロッティング法により確認することができる。 プラスミドへの導入、形質転換株の確立、当該株の培養等は、常用の遺伝子組換え法に従って行うことができる。
【００２１】
発現系は当業者に既知のものから適宜選択して用いれば良いが、シグナル配列の付加・改良や宿主の選択によって分泌効率および発現量の向上をはかることもできる。 宿主細胞としては、特に限定されないが、細菌類、酵母及び他の真菌類、ヒトおよび他の動物の培養細胞、植物の培養細胞等が挙げられる。 即ち、本発明のポリヌクレオチドを遺伝子として適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞に導入し、該宿主細胞を培養し、そして得られた培養物（細胞または培地）から目的とするＧＤＥ蛋白質を採取する。
【００２２】
宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。 原核生物としては細菌、特に大腸菌（Escherichia coli）、バチルス（Bacillus）属細菌、例えばバチルス・ズブチリス（B.subtilis）等を用いることができる。 真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces ）属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（S. Serevisiae ）等の真核微生物、昆虫細胞、例えばヨガ細胞（Spodoptera Frugiperda ）、カイコ細胞（Bombyx mori）、動物細胞、例えばヒト細胞、サル細胞、マウス細胞、特にサル細胞、例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７等を使用することができる。
【００２３】
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウィルス［バキュロ（昆虫）、ワクチニア（動物細胞）］等が使用できる。 発現ベクター中のプロモーターは、宿主細菌に依存して選択され、例えば細菌用プロモーターとしてｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとして例えばａｄｈ １プロモーター、ｐｇｋプロモーター等が使用される。 また、昆虫用プロモーターとしては、バキュロウィルスポリヘドリンプロモーター等、動物細胞としては、Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０（ＳＶ４０）の初期または、後期プロモーター等が挙げられる。
また、エンハンサーを使用する場合、例えばＳＶ４０のエンハンサー等を遺伝子の上流または下流に挿入する。
【００２４】
発現ベクターによる宿主の形質転換は、当業界において良く知られている常法により行うことができ、これらの方法は例えば、カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラ・バイオジィ（ Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 社）に記載されている。
【００２５】
形質転換体の培養も常法に従って行うことができる。培養物からＧＤＥ蛋白質の精製は蛋白質を単離・精製するための常法に従って、例えば限外ろ過、各種カラムクロマトグラフィー、例えばセファロースを用いるクロマトグラフィー等により行うことができる。
【００２６】
かくして、ＧＤＥ蛋白質を有利に得ることができる。 得られたＧＤＥ蛋白質は生化学的、または化学的な修飾、例えばＮ末端のアシル化等されたものであっても良い。
【００２７】
本発明の、ＧＤＥに対する抗体も、常法にしたがって得ることができる。 すなわち、まず上記のＧＤＥで家兎等の動物に感作し、その血清を分離し、必要に応じてこの血清から免疫グロブリン画分を精製することにより得られる。 この場合、該物質の感作性を高めるために、該物質を牛血清アルブミン（ＢＳＡ）またはメチルＢＳＡ等の担体蛋白質と結合させたものを免疫原として用いても良い。
【００２８】
動物に感作する場合、抗体産生を高めるために、フロインドの完全アジュバント（ＦＣＡ）またはフロインドの不完全アジュバント（ＦＩＣＡ）と共に感作することもできる。 動物に感作する回数は２回以上が望ましく、試験採血により血清の抗体価をチェックしながら感作回数を決定すれば良い。 免疫動物は必要に応じて屠殺して全血を用いても良いが、適宜追加感作することにより一定の抗体価を保ち、必要に応じて少量を採血して用事使用することもできる。 さらに、該物質をマウスに感作し、感作マウスの脾臓細胞とミエローマ細胞からハイブリドーマを作成し、常法に従ってモノクローナル抗体を得ることも可能である。
【００２９】
【発明の効果】
本発明のＧＤＥは、従来知られていないグルカゴンおよびＶＩＰを分解する作用を有するものである。 従って、過剰なグルカゴンやＶＩＰの存在により発症する種々の疾病の治療、予防に有効であると期待される。
また、本発明のＧＤＥは、グルカゴンを神経伝達物質とする中枢神経系や腸管などに分布する末梢神経節に存在することから、諸神経疾患の診断に有用性が期待される。更に本発明のＧＤＥは、様々な腫瘍培養細胞の培養上清に検出されることから悪性疾患の血清学的診断に応用できるものと期待される。
【００３０】
【実施例】
以下の実施例によって本発明を詳細に説明するが、この実施例によって本発明が限定されるものではない。
【００３１】
実 施 例 １.
ＧＤＥ産生細胞株ＨＰＣ−ＹＯの樹立：
膵臓癌患者の癌組織をステンレスメッシュを用いて分散させ、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地を用い、炭酸ガスインキュベーターで培養することにより樹立した。 この細胞株を漸次血清濃度を低下させた環境に順化させ、最終的に蛋白質を含まないＨａｍ'ｓ Ｆ１２培地のみで増殖するようにした（Nozomi Yamaguchi et. al. Cancer Res 50: 7008-7012,1990）。 この細胞株については、平成６年７月１４日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ−１４４２９号として寄託した（なお、本寄託において寄託者の付した識別のための表示は、ＳＢＭ３３４である）。
【００３２】
実 施 例 ２.
ＨＰＣ−ＹＯ株の継代培養および大量培養：
継代培養は以下のごとく行った。 プラスチック培養フラスコ（１５０ｃｍ2 、コーニング社製）を用い、８〜１０Ｍ 亜セレン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンＧカリウムおよび１００μｇ／ｍｌ 硫酸カナマイシンを含むＨａｍ'ｓ Ｆ１２培地５０ｍｌ中で培養し、４日毎に培養液を交換した。
培養継代時には、０.２５％ トリプシン（ＧＩＢＣＯ社製）、０.０１％ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）を加え、細胞が剥離するまで３７℃で保った。 剥離した細胞は１,５００ｒｐｍで５分間遠心し回収した。 細胞は再び上記の培地に懸濁し、新しいフラスコ５本に継代した。翌日培養液を更新し、以後５日毎に培地交換を行った。 また一部は１,７００ｃｍ2 のプラスチック製ローラーボトル（コーニング社）に移し、０.５回転／分の速度で回転培養を行った。 培地交換は５日毎に行った。
【００３３】
実 施 例 ３.
ＨＰＣ−ＹＯ株からのＧＤＥの精製：
［ 酵素活性の測定方法 ］
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）に０.５％の牛アルブミンおよび０.０２％のＮａＮ3 を加えたアッセイバッファーで、２０,０００ｃｐｍに調整した125Ｉ−標識グルカゴン［１０番目のチロシンが125Ｉで置換されている。アマーシャム社（Amersham Inc.、米国）より購入］に培養上清あるいは各種カラムで分離した分画を加え、室温２０分反応させたのち、２０％ＴＣＡを等量加えて反応を止めた。 ついで３,０００ｒｐｍ−２０分遠心後上清を捨て、ガンマカウンターで沈査の放射活性を測定し、放射活性が培養上清やその分画の代わりに加えたＰＢＳの値よりも低いものを分解酵素活性陽性とした。
【００３４】
［ ＧＤＥの精製 ］
実施例２で述べた方法に従って得たＨＰＣ−ＹＯ細胞の培養上清を限外濾過膜ＰＴＧＣ（日本ミリポア社）で約２００倍に濃縮し、脱イオン水で十分透析した後凍結乾燥した。 この凍結乾燥品を出発材料として以下の精製に用いた。
【００３５】
（ステップ１） Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ゲル濾過：
上記凍結乾燥品を０.１ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）に溶解し、同じ緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲル濾過カラム（２６×７０ｃｍ）に添加し、溶出した。 溶出画分について先に述べた方法にしたがって活性を測定した結果、分子量約９０ｋＤａの近辺に活性が認められた。
【００３６】
（ステップ２） Ｍｏｎｏ Ｑ 陰イオン交換クロマトグラフィー：
ステップ１で得た活性画分を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）緩衝液で平衡化したＭｏｎｏ Ｑカラム（１０×１０ｃｍ）に添加し、同緩衝液中のＮａＣｌ濃度を０.４Ｍから０.８Ｍまで直線的に上げ、吸着蛋白を溶出した。 先に述べた方法で活性を測定した結果、０.５Ｍ ＮａＣｌ画分に活性を認めた。
【００３７】
（ステップ３） ヒドロキシルアパタイト：
ステップ２で得た活性画分を１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６.８）で平衡化しておいたヒドロキシルアパタイトカラム（８×１０ｃｍ、ペンタックス社）に添加した。 吸着蛋白はリン酸の直線的濃度勾配（１０ｍＭ〜４００ｍＭ）により溶出した。 画分について活性を測定した結果、約２００ｍＭリン酸画分に活性を検出した。 上記３ステップの結果を図１の（Ａ）〜（Ｃ）に示す。
【００３８】
実 施 例 ４.
ＧＤＥの性状：
（ａ）分子量の測定
実施例３に従って精製したＧＤＥの分子量をドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した。ゲル濃度は１２％を用いた。 ５％の２−メルカプトエタノールおよび２％ ＳＤＳを含む試料用緩衝液（ｐＨ６.８）に溶解し、３分間煮沸した。 泳動は２５ｍＡで１時間３０分行ない、固定後銀染色試薬（第一化学社製）で蛋白質を染色した。 分子量マーカーは第一化学社製を用いた。 ホスホリラーゼ Ｂ（９７.４ｋｄ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ、６６.３ｋｄ）、アルドラーゼ（４２.４ｋｄ）カルボニックアンヒドラーゼ (３０.０ｋｄ）、トリプシンインヒビター (２０.１ｋｄ）、リゾチーム（１４.４ｋｄ）。 この結果を図２に示す。
図から明らかな通り、本発明のＧＤＥは分子量約８３,０００に単一のバンドを示した。
【００３９】
（ｂ）精製酵素の酵素阻害性剤感受性の測定
実施例３に従って精製したＧＤＥに対する種々の阻害剤の影響を調べたところ、表１に示す結果になった。
【００４０】
実 施 例 ５.
本発明ＧＤＥのＮ−末端近傍のアミノ酸配列と内部配列：
実施例３で得た精製ＧＤＥを気相式プロテインシーケンサー４７３Ａ（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いてエドマン分解を行ない、得られたＰＴＨ−アミノ酸を同定したが、Ｎ−末端がブロックされており、有用な結果を得ることが出来なかった。 そこでこの精製品を常法に従い、４−ビニルピリジンを加えて還元Ｓ−ピリジルエチル化し、これを０.１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８.５）に溶解し、リシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）を０.１μｇ加え、３７℃で２０時間反応させた。 反応後これに１０％ＴＦＡを加え、ｐＨを２付近に調整した後、逆相ＨＰＬＣにてＣ１８カラム（Ｖｙｄａｃ社製）でペプチド断片を分離精製し、上述のプロテインシーケンサーを用いてアミノ酸内部配列を解析した。 その結果５箇所の部分アミノ酸配列（後記配列表中、配列番号３〜７）が明らかになった。
【００４１】
実 施 例 ６.
本発明のＧＤＥに対する特異ポリクロナール抗体および部分アミノ酸配列に体するポリクローナル抗体の作製方法：
単一に精製したＧＤＥをリシルエンドペプチダーゼにて消化し、ＨＰＬＣで分離したペプチド断片のアミノ酸配列をペプチド合成機を用いて合成した。 精製したＧＤＥと合成ペプチド（ｐｅｐ.２１とｐｅｐ.３８）とを二価性架橋試薬ＭＢＳを用いて常法通りに牛血清アルブミンと結合させ、フロイントアジュバントとミセルを作製し、家兎に免疫した。 約４週後抗血清を得た。 抗血清を固定化牛血清アルブミンカラム、ついでプロテインＡカラムに添加して、精製抗体（ＧＤＥ抗体、抗ｐｅｐ.２１抗体および抗ｐｅｐ.３８抗体）を得た。
【００４２】
実 施 例 ７.
ヒトＧＤＥ遺伝子のクローニング：
（１） ＨＰＣ−ＹＯ ｍＲＮＡの調製
ＨＰＣ−ＹＯ ｍＲＮＡの調製は、ピッカトラップ システム１０００（東洋インキ製造）を用いて行った。
ＨＰＣ−ＹＯ約２×１０8 細胞のペレットに１ｍｌの抽出用緩衝液［４Ｍ グアニジンチオシアネート、２５ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７.１）］を加え、ホモジナイズし、あらかじめ用意しておいた８ｍｌの希釈用緩衝液（６×ＳＳＣ溶液、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.２５％ＳＤＳ）と１７４μｌの２−メルカプトエタノールとの混合液を加え撹拌した。
【００４３】
１０ｍｌのビオチン化オリゴｄＴプローブを加え、７０℃で５分間加熱後、ライセートを１１,０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心し上清を回収した。 この上清をＳＡ−ＰＭＰｓ（ストレプトアビジン−パラマグネティック パーティクル）溶液に加え、撹拌後、室温で２分間放置し磁気スタンドにてＳＡ−ＰＭＰｓ沈殿物を回収した。 この沈殿物に１ｍｌの０.５×ＳＳＣ溶液を加え、撹拌後、遠心チューブに移し磁気スタンドにてＳＡ−ＰＭＰｓを回収した。 この操作を更に２回繰り返し上清はできる限り除いた。 次に、この沈殿物に５００μｌのヌクレアーゼ−フリー蒸留水を加え、撹拌後、磁気スタンドにてＳＡ−ＰＭＰｓを集め上清を回収した。
【００４４】
この溶液に５０μｌの３Ｍ 酢酸ナトリウム、５００μｌのイソプロパノールを加え、−２０℃で１時間放置後、１５,０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、その沈殿物を５００μｌの７０％エタノールで洗った。 遠心沈殿物を軽く風乾後、３０μｌのＲＮａｓｅ−フリー蒸留水にて溶解し、約１５μｇのｐｏｌｙ
Ａ +ＲＮＡを得た。
【００４５】
（２） ｃＤＮＡライブラリーの調製
ｃＤＮＡライブラリーの調製は、タイム・セーバー ＤＮＡ 合成キット（Time saver DNA Synthesis Kit；ファルマシア社）を用いて行った。
【００４６】
＜工程１＞ cＤＮＡの合成：
ＨＰＣ−ＹＯｍＲＮＡ１０μｌ（約５μｇ）にＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）で処理した蒸留水を１０μｌ加え６５℃で１０分間熱した後、氷中につけた。
ファースト・ストランド・リアクション・ミクスチュア（First strand reaction mix）にＤＴＴ溶液１μｌ、ＮｏｔＩ−オリゴ ｄＴ１８プライマー １μｌ、先の熱変性ｍＲＮＡ ２０μｌを加え、３７℃で１時間反応させた。
【００４７】
次に、この反応液にセカンド・ストランド・リアクション・ミクスチュア（Second strand reaction mix）を加え、１２℃で３０分間、続いて２２℃で１時間反応後、６５℃で１０分間熱処理した。
この溶液に１００μｌのフェノール／クロロホルム（１：１）を加え、撹拌後、１２,０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清をセファクリルＳ−４００スピンカラムにのせ１,５００ｒｐｍで２分間遠心し溶出液を回収した。
【００４８】
＜工程２＞ ＥｃｏＲＩアダプターの付加
工程１の溶出液にＥｃｏＲＩアダプター溶液５μｌ、ポリエチレングリコール溶液３０μｌ、１／５希釈ＡＴＰ溶液 １μｌ、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ１μｌを加え、１６℃にて１時間反応後、６５℃で１０分間の熱処理にてリガーゼを失活させた。 この溶液に１.５μｌ ポリヌクレオチドキナーゼ溶液を加え、３７℃で３０分間反応後、６５℃で１０分間の熱処理にてキナーゼを失活させた。
【００４９】
＜工程３＞ 制限酵素ＮｏｔＩによる切断
工程２の反応液にＮｏｔＩ（８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を２μｌ加え、３７℃で１時間反応後、フェノール／クロロホルム（１：１）抽出を行い、上清をセファクリルＳ−４００スピンカラムで分離し溶出液を回収した。
【００５０】
＜工程４＞ 酢酸カリウムによるｃＤＮＡのサイズ分画
濃度勾配作製装置の補給槽に５％酢酸カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液を２.４ｍｌ、混合槽に２０％酢酸カリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液を２.４ｍｌそれぞれ入れ、５ｍｌ遠心チューブ（ベックマン社製 １３×５１ｍｍ）に酢酸カリウムのグラジエント溶液を調製した。
【００５１】
このグラジエントチューブに工程３で得たｃＤＮＡ８０μｌとλＤＮＡのＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII二重消化物（８０μｇ／２８６μｌ）２０μｌとの混合物を重層し、ＳＷ５５Ｔｉローターを用いて２５℃で５５,０００ｒｐｍにて３時間遠心した。 遠心後、ペリスタポンプにて１１分画に分け、各々をエタノール沈殿後、ＤＮＡを軽く乾燥させライゲーション溶液［６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、０.１ｍＭ スペルミジン、６.６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ］１０μｌに溶解した。 そのうち２μｌを用いて２％アガロースゲル電気泳動後、２Ｋｂより大きなバンドの現れる画分（３画分）を集めた。
【００５２】
＜工程５＞ λベクターとのライゲーション
サイズ分画したｃＤＮＡ溶液１０μｌ、５μｌ、２.５μｌに、λＥｘＣｅｌｌベクター２μｇを各々加え、各々の総量が１９μｌになるようライゲーション溶液で調製した後、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７.０）１μｌ、エタノール５０μｌを加え、−７０℃で２０分間放置後、１５,０００ｒｐｍで１０分間遠心し沈殿物を回収した。 この沈殿物にライゲーション溶液 ８μｌ、１／２０希釈ＡＴＰ溶液 １μｌ、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ １μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。
【００５３】
＜工程６＞ インビトロ・パッケージング反応
インビトロ・パッケージング反応は、ギガ パック II ゴールド（Giga pack II gold；ストラタジーン社）を用いて行った。
フリーズ／ソー エクストラクト（Freeze/thaw extract）にライゲーション溶液を５μｌ加えてすぐにソニック エクストラクト（Sonic extract）を１５μｌ加え、ゆっくりと撹拌し氷中につけた。 その後、２２℃で２時間インビトロ・パッケージング反応を行った後、ＳＭ緩衝液［１２５ｍＭ ＮａＣｌ、０.２５ｍＭ ＭｇＳＯ4、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、０.０１％ ゲラチン］５００μｌ、クロロホルム ２０μｌを加えて１,５００ｒｐｍで５分間室温にて遠心し上清を回収した。
【００５４】
＜工程７＞ ファージ力価の測定
大腸菌Ｙ１０９０ｒ- ［△（ｌａｃＵ１６９）、ｐｒｏＡ+ △（ｌｏｎ）、ａｒａＤ１３９、ｓｔｒＡ、ｓｕｐＦ、ｈｓｄＲ、ｔｒｐＣ２２：：Ｔｎ１０（ｔｅｔr ）、［ｐＭＣ９ａｍｐr ｔｅｔr ］、ｍｃｒＢ］２００μｌの一夜培養液に、工程６で得たファージ懸濁液の１μｌと１０μｌとを、それぞれ３７℃で２０分間吸着させた後、３ｍｌのＬＢ Ｔｏｐ アガー（０.７％）を加え、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートにまいて３７℃で一夜培養し、ファージ力価を測定した。
【００５５】
（３）ヒトＧＤＥ遺伝子の抗体スクリーニング
約１２万クローンのＨＰＣ−ＹＯ cＤＮＡライブラリーを抗ｐｅｐ.３８抗体を用いて抗体スクリーニングを行った。 その結果、約２００万個のプラークから計６１個の陽性クローンを得た。
次に、Ｍ１３ フォワードプライマー（５'−ＧＴＴ ＴＴＣ ＣＣＡＧ ＴＣ ＡＣＧ ＡＣ−３'）とＭ１３ リバースプライマー（５'−ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＣ−３'）でＰＣＲを行い、挿入ＤＮＡ断片を増幅させた。
【００５６】
ｐｅｐ.３８のアミノ酸配列、ＹＤＤＴＹＫに相当するＤＮＡ配列の混合プローブ［５'−ＴＡ（Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＡＣ（Ｃ／Ａ／Ｔ／Ｇ）ＴＡ（Ｃ／Ｔ）ＡＡ−３'］を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った結果、６１個のうち７個の陽性クローンを得た。 更に、挿入ＤＮＡ断片の大きさを調べ、最長のクローンλＧＤＥ＃４−２（約２.８Ｋｂ）を選び以下の解析を行った。
【００５７】
（４）ヒトＧＤＥ遺伝子の塩基配列の決定
λＧＤＥ＃４−２クローンを用いてヒトＧＤＥ遺伝子の一次構造決定を行った。 その結果を図３〜６に示した。
【００５８】
（５）塩基配列の特徴
λＧＤＥ＃４−２の挿入部分であるｃＤＮＡの全長は２,７５８ｂｐで、９９ｂｐの５'非翻訳領域、２,５９２ｂｐのＧＤＥ翻訳領域、６７ｂｐの３'非翻訳領域から成り、このクローンはポリＡ領域を欠失していた。 ＧＤＥ翻訳領域にはＧＤＥ蛋白質の精製の部で明らかになっていた部分アミノ酸配列５種の全てが含まれており、アミノ酸８６４残基、その推定分子量は９６.８ｋＤａであった。 図７にそのハイドロパシー・プロフィール（Hydropathy profile）を示した。 また、シグナル配列の領域以外にはＣｙｓ残基が１個も含まれていない。 また、Ｇｅｎｂａｎｋ（ｖｅｒｓｉｏｎ ８２.０）及びＥＭＢＬ（ｖｅｒｓｉｏｎ３８.０）データベース検索の結果から新規な蛋白質であることがわかった。
【００５９】
実 施 例 ８.
発現プラスミドの構築：
λＧＤＥ＃４−２をテンプレートに翻訳領域をはさむように設計したＭｌｕＩ制限酵素部位を付加したプライマーＧＤＥ１１２（５'−ＡＣＴ ＧＡＣ ＧＣＧ ＴＧＴ ＡＧＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＡＧＡ ＧＡＡ ＴＧ−３'）とＳａｌＩ制限酵素部位を付加したプライマーＧＤＥ１１３（５'−ＡＣＧ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＴＧ ＴＴＴ ＴＴＴ ＡＴＴ ＡＴＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＡＡＴ Ａ−３'）にてＰＣＲを行い、その産物をＭｌｕＩとＳａｌＩで消化後、約２.６ＫｂのＤＮＡ断片を単離・精製した。
【００６０】
同様に、ＳＶ４０プロモーターをもつｐＫＣＲベクター由来ｐＫＤＥＭＳＳベクターをＭｌｕＩとＳａｌＩにて消化し、ベクターＤＮＡ断片（約６.４Ｋｂ）をアガロースゲル電気泳動にて単離・精製した。 次に、常法に従いヒトＧＤＥ 翻訳領域を含むＤＮＡ断片とｐＫＤＥＭＳＳベクターＤＮＡ 断片をライゲートし、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させて出てきたコロニーをＰＣＲ法により解析して目的とする組換え型ヒトＧＤＥ発現プラスミドｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２（図８）を得た。
【００６１】
実 施 例 ９.
ヒトＧＤＥ組換え体の発現と解析：
（１）ＣＯＳ７細胞を用いた組換え型ヒトＧＤＥ遺伝子の発現
ヒトＧＤＥ組換え体ｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２の２μｇと、リポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）２μｌを使用し、３.５ｃｍ ｄｉｓｈで培養したＣＯＳ７細胞（約３×１０5 細胞）を形質転換した。 Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１２培地 ５ｍｌを用い、３７℃、５％ＣＯ2 中で７２時間培養後、その培養上清を回収し、セントリコン１０（アミコン）により約３５０μｌに濃縮した。
【００６２】
次に、実施例６で作成した３種類の抗血清を用いてＨＰＣ−ＹＯ細胞の培養上清、ＧＤＥ精製品、ヒトＧＤＥ遺伝子を導入したＣＯＳ７細胞の培養上清をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、ウェスタン・ブロット解析をした。 いずれの抗血清も全く同じ反応を示した（図９）。
【００６３】
（２）ＣＯＳ１細胞を用いた組換え型ヒトＧＤＥ蛋白質の活性
ヒトＧＤＥ組換え体ｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２の１μｇ、２μｇ、３μｇ及びそのベクターであるｐＫＤＥＭＳＳ ２μｇをリポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）各々２５μｌずつ使用し、３.５ｃｍ ｄｉｓｈで培養したＣＯＳ１細胞（約３×１０5 細胞）を形質転換した。１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）培地２ｍｌで３７℃、５％ＣＯ2 中７２時間培養後、その培養上清を回収した。
【００６４】
次に、５μｇのグルカゴンに上記培養上清を５μｌずつ加え３７℃で１時間反応後、キャピラリー電気泳動にて２０ｋＶ、２０分間泳動させた。 その結果、１μｇ、２μｇのｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２で形質転換した上清ではｐＫＤＥＭＳＳベクターのみの培養上清と同様にグルカゴンの分解が認められなかったが、３μｇのｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２で形質転換した培養上清では図１０に示すようにグルカゴンの分解が認められ、ヒトＧＤＥ蛋白質が活性を持って発現していることが確認された。
【００６５】
【配列表】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＧＤＥの精製ステップごとの溶離パターンを示す図面。 図中、（Ａ）はゲル濾過、（Ｂ）は陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、（Ｃ）はヒドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果を示す。
【図２】 ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ＧＤＥの分子量を測定した結果を示す写真。
【図３】〜
【図６】 ＧＤＥ遺伝子の一次構造を示す図面。
【図７】 ＧＤＥのハイドロパシー・プロフィールを示す図面。
【図８】 組換え型ヒトＧＤＥ発現プラスミドの構成を示す図面。
【図９】 抗ＧＤＥ抗体を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ウェスタン・ブロット解析した結果を電気泳動で示す写真。 写真中、１はＨＰＣ−ＹＯ細胞の培養上清、２はＧＤＥ精製品、３はヒトＧＤＥ遺伝子を導入したＣＯＳ７細胞の培養上清、４はＣＯＳ７の無蛋白培養物の上清濃縮物、Ｍはマーカーを示す。
【図１０】 ＧＤＥで形質転換した培養上清がグルカゴン分解活性を有することを示す図面。
以 上
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なグルカゴン分解酵素、それをコードする遺伝子、該グルカゴン分解酵素の製造方法及び該グルカゴン分解酵素に対する抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルカゴンは膵臓から分泌されるホルモンで、２９個のアミノ酸から構成されており、インスリンに拮抗して血糖量を増加させる。 グルカゴノーマ症候群においては、グルカゴン産生腫瘍のほかに、天疱瘡様皮膚炎、口内炎、体重減少、貧血、低アミノ酸血症、耐糖能異常を伴い、血中のグルカゴン量が高まる。
【０００３】
一方、バソアクティブ・インテスティナル・ペプタイド（Vasoactive Intestinal Peptide；以下、「ＶＩＰ」と略す ）は、多様な生理活性を持つ神経伝達物質で、２８個のアミノ酸で構成されたペプチドである。臨床的には、ＶＩＰはＷＤＨＡ症候群（膵腺腫を伴う消化器症状）の原因物質である。
グルカゴノーマ症候群やＷＤＨＡ症候群の予防／治療方法として、グルカゴンやＶＩＰを分解する酵素の活用が考えられるが、従来、グルカゴンやＶＩＰを分解する酵素は知られていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、前記疾患の予防／治療のためには、まず、グルカゴンやＶＩＰを分解する酵素を見出し、これを分離、精製することや、更にこの酵素の遺伝子を解明する必要があった。
また、該酵素の生理的役割や生体内分布については乏しい知見しかないので、それらを明らかにする上でも該酵素の純品を得て、その酵素に対する純粋な抗体を取得する必要もあった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、無タンパク培養系での有用物質の生産を研究する過程において、グルカゴン分解酵素の存在を見いだした。
そして、各種の分離、精製手段を利用し、125Ｉ−標識グルカゴンを用いるアッセイ法で酵素活性を追跡しつつ純度を高めていった結果、純品としてグルカゴン分解酵素を得た。
また、このグルカゴン分解酵素のペプチド配列から、公知方法に従って当該酵素をコードする遺伝子を見いだし、該遺伝子を含んでなる発現ベクターを作成し、該発現ベクターにより形質転換された宿主を得た。
【０００６】
更に、グルカゴン分解酵素の製造方法として、ヒト膵臓癌組織由来の腫瘍細胞を培養し、その培養物中から該酵素を採取する方法およびグルカゴン分解酵素発現ベクターにより形質転換された形質転換体を培養又は飼育し、該形質転換体から該酵素を採取する方法も確立した。
更にまた、前記疾患の治療や診断の目的に利用しうるグルカゴン分解酵素に対する抗体を得た。
【０００７】
本発明は、これらの知見に基づき完成されたものであり、新規なグルカゴン分解酵素、それをコードする遺伝子系、該酵素の製造方法及び該酵素に対する抗体を提供するものである。
【０００８】
本発明のグルカゴン分解酵素（以下、「ＧＤＥ」と略す）は、例えばヒト膵臓癌腫瘍細胞の培養上清から、グルカゴン分解活性を有する画分を、種々の精製手段を組合せ、分離、精製すれば良い。
【０００９】
より具体的には、例えば、「ＨＰＣ−ＹＯ」と名付けられたヒト膵臓癌腫瘍細胞由来の株化細胞を継代培養し、その培養上清をグルカゴン分解活性を指標に、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を組み合わせ単一ピークを与えるまで精製することにより得ることができる。 グルカゴン分解活性は、標識グルカゴン、例えば125Ｉ標識グルカゴン等を用いることにより、測定することができる。
【００１０】
このようにして得られた本発明のＧＤＥは、次のような酵素学的性質を有していた。
（１）作用：
グルカゴン、バソアクティブ・インテスティナル・ペプタイド（Vasoactive Intestinal Peptide）およびセクレチンを基質とし、それぞれ下記の矢印に示すペプチド結合を加水分解する。
【化２】
グルカゴン、バソアクティブ・インテスティナル・ペプタイド及びセクレチンを加水分解する。
（３）等電点：
ｐＩ ６.８
（４）阻害剤：
酵素反応は１ｍＭのアンチパインによって阻害されるが、１ｍＭのロイペプチンによっても、０.１ｍＭのペプスタチンによっても阻害されない。
（５）分子量：
８３ｋＤａ（ＳＤＳ電気泳動動法による）
（６）以下のペプチドフラグメントを有する：
（i） ＳＮＳＴＳＹＶＫ
（ii） ＹＹＡＳＴＳＹＤＤＴＹＫ
（iii）ＮＬＴＥＥＹＤＶＳＤＧＥＩＥＬＬＹＥＫ
（iv） ＬＹＷＦＬＤＥＡＫ
（v） ＥＬＲＥＶＥＴＹＹＤＬＬＦＥＫ
【００１１】
本発明のＧＤＥは、例えば実施例に示すごとくして単離精製されるが、一旦単離精製され、その性質が解明された後は、それらの性質を指標にして蛋白質の単離精製に用いられる任意の常法を用いて本発明のＧＤＥを単離精製できることは明らかである。
【００１２】
次に、遺伝子操作の手法により、本発明のＧＤＥ発現ベクターにより形質転換された形質転換体を培養又は飼育し、該形質転換体から該酵素を採取する方法について説明する。
【００１３】
ＧＤＥのｃＤＮＡのクローニングは、株化細胞「ＨＰＣ−ＹＯ」から常法に従ってｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡライブラリーを作製後、抗ヒトＧＤＥ抗体を用いた抗体スクリーニングにより目的のｃＤＮＡを得、次いでその塩基配列を決定することにより行われる。
【００１４】
上記手順により決定された、本発明ＧＤＥの塩基配列は、後記配列表の配列２に示すとおりである。
また、上記ＧＤＥは、決定された塩基配列から、後記配列表の配列１に示すアミノ酸配列またはこれと相同性を有するアミノ酸配列を有するものと推定されている。 なお、本明細書において相同性を有するアミノ酸配列とは、あるアミノ酸配列に対し、１又は複数のアミノ酸が付加、除去及び／又は置換されているが、その作用においては原アミノ酸配列とほぼ同等な作用を有するアミノ酸配列を意味する。
【００１５】
以上のようにＧＤＥのアミノ酸配列が決定されると、前記の方法に限られず、他の方法によっても本発明のＧＤＥをコードする遺伝子（以下、「ＧＤＥ遺伝子」という）を得ることができる。 すなわち、天然ＧＤＥのアミノ酸配列をコードする１つのヌクレオチド配列が決定されれば、本ＧＤＥ遺伝子は前記ストラテジーとは異なるストラテジーによりｃＤＮＡとしてクローニングすることができ、さらには、それを産生する細胞のゲノムからクローニングすることもできる。
【００１６】
ゲノムからクローニングする場合、プローブヌクレオチドとして下記のいずれかのペプチドのヌクレオチド配列に基づいて設計されたゲノムＤＮＡを使用することができる。
【００１７】
ゲノムから目的とするＤＮＡをクローニングするための一般的方法は、当業界において良く知られている（例えば、Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley & Sons社第５章及び第６章）。
【００１９】
本発明のＧＤＥ遺伝子はまた、化学合成によっても調製することができる。 ＤＮＡの化学合成は、当業界において自動ＤＮＡ合成機、例えばアプライド・バイオシステムズ社の３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機などを採用することにより容易に行うことができる。
【００２０】
次に、上記のようにして得られたＧＤＥ遺伝子としてプラスミドに導入し、常用の遺伝子組換え法により哺乳動物細胞等の宿主を形質転換してＧＤＥを発現させる。 ＧＤＥの発現は、抗ヒトＧＤＥ抗体を用いたウェスタン・ブロッティング法により確認することができる。 プラスミドへの導入、形質転換株の確立、当該株の培養等は、常用の遺伝子組換え法に従って行うことができる。
【００２１】
発現系は当業者に既知のものから適宜選択して用いれば良いが、シグナル配列の付加・改良や宿主の選択によって分泌効率および発現量の向上をはかることもできる。 宿主細胞としては、特に限定されないが、細菌類、酵母及び他の真菌類、ヒトおよび他の動物の培養細胞、植物の培養細胞等が挙げられる。 即ち、本発明のポリヌクレオチドを遺伝子として適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞に導入し、該宿主細胞を培養し、そして得られた培養物（細胞または培地）から目的とするＧＤＥ蛋白質を採取する。
【００２２】
宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。 原核生物としては細菌、特に大腸菌（Escherichia coli）、バチルス（Bacillus）属細菌、例えばバチルス・ズブチリス（B.subtilis）等を用いることができる。 真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces ）属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエ（S. Serevisiae ）等の真核微生物、昆虫細胞、例えばヨガ細胞（Spodoptera Frugiperda ）、カイコ細胞（Bombyx mori）、動物細胞、例えばヒト細胞、サル細胞、マウス細胞、特にサル細胞、例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７等を使用することができる。
【００２３】
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウィルス［バキュロ（昆虫）、ワクチニア（動物細胞）］等が使用できる。 発現ベクター中のプロモーターは、宿主細菌に依存して選択され、例えば細菌用プロモーターとしてｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとして例えばａｄｈ １プロモーター、ｐｇｋプロモーター等が使用される。 また、昆虫用プロモーターとしては、バキュロウィルスポリヘドリンプロモーター等、動物細胞としては、Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０（ＳＶ４０）の初期または、後期プロモーター等が挙げられる。
また、エンハンサーを使用する場合、例えばＳＶ４０のエンハンサー等を遺伝子の上流または下流に挿入する。
【００２４】
発現ベクターによる宿主の形質転換は、当業界において良く知られている常法により行うことができ、これらの方法は例えば、カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラ・バイオジィ（ Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 社）に記載されている。
【００２５】
形質転換体の培養も常法に従って行うことができる。培養物からＧＤＥ蛋白質の精製は蛋白質を単離・精製するための常法に従って、例えば限外ろ過、各種カラムクロマトグラフィー、例えばセファロースを用いるクロマトグラフィー等により行うことができる。
【００２６】
かくして、ＧＤＥ蛋白質を有利に得ることができる。 得られたＧＤＥ蛋白質は生化学的、または化学的な修飾、例えばＮ末端のアシル化等されたものであっても良い。
【００２７】
本発明の、ＧＤＥに対する抗体も、常法にしたがって得ることができる。 すなわち、まず上記のＧＤＥで家兎等の動物に感作し、その血清を分離し、必要に応じてこの血清から免疫グロブリン画分を精製することにより得られる。 この場合、該物質の感作性を高めるために、該物質を牛血清アルブミン（ＢＳＡ）またはメチルＢＳＡ等の担体蛋白質と結合させたものを免疫原として用いても良い。
【００２８】
動物に感作する場合、抗体産生を高めるために、フロインドの完全アジュバント（ＦＣＡ）またはフロインドの不完全アジュバント（ＦＩＣＡ）と共に感作することもできる。 動物に感作する回数は２回以上が望ましく、試験採血により血清の抗体価をチェックしながら感作回数を決定すれば良い。 免疫動物は必要に応じて屠殺して全血を用いても良いが、適宜追加感作することにより一定の抗体価を保ち、必要に応じて少量を採血して用事使用することもできる。 さらに、該物質をマウスに感作し、感作マウスの脾臓細胞とミエローマ細胞からハイブリドーマを作成し、常法に従ってモノクローナル抗体を得ることも可能である。
【００２９】
【発明の効果】
本発明のＧＤＥは、従来知られていないグルカゴンおよびＶＩＰを分解する作用を有するものである。 従って、過剰なグルカゴンやＶＩＰの存在により発症する種々の疾病の治療、予防に有効であると期待される。
また、本発明のＧＤＥは、グルカゴンを神経伝達物質とする中枢神経系や腸管などに分布する末梢神経節に存在することから、諸神経疾患の診断に有用性が期待される。更に本発明のＧＤＥは、様々な腫瘍培養細胞の培養上清に検出されることから悪性疾患の血清学的診断に応用できるものと期待される。
【００３０】
【実施例】
以下の実施例によって本発明を詳細に説明するが、この実施例によって本発明が限定されるものではない。
【００３１】
実 施 例 １.
ＧＤＥ産生細胞株ＨＰＣ−ＹＯの樹立：
膵臓癌患者の癌組織をステンレスメッシュを用いて分散させ、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地を用い、炭酸ガスインキュベーターで培養することにより樹立した。 この細胞株を漸次血清濃度を低下させた環境に順化させ、最終的に蛋白質を含まないＨａｍ'ｓ Ｆ１２培地のみで増殖するようにした（Nozomi Yamaguchi et. al. Cancer Res 50: 7008-7012,1990）。 この細胞株については、平成６年７月１４日付で工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ−１４４２９号として寄託した（なお、本寄託において寄託者の付した識別のための表示は、ＳＢＭ３３４である）。
【００３２】
実 施 例 ２.
ＨＰＣ−ＹＯ株の継代培養および大量培養：
継代培養は以下のごとく行った。 プラスチック培養フラスコ（１５０ｃｍ2 、コーニング社製）を用い、８〜１０Ｍ 亜セレン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンＧカリウムおよび１００μｇ／ｍｌ 硫酸カナマイシンを含むＨａｍ'ｓ Ｆ１２培地５０ｍｌ中で培養し、４日毎に培養液を交換した。
培養継代時には、０.２５％ トリプシン（ＧＩＢＣＯ社製）、０.０１％ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（−）を加え、細胞が剥離するまで３７℃で保った。 剥離した細胞は１,５００ｒｐｍで５分間遠心し回収した。 細胞は再び上記の培地に懸濁し、新しいフラスコ５本に継代した。翌日培養液を更新し、以後５日毎に培地交換を行った。 また一部は１,７００ｃｍ2 のプラスチック製ローラーボトル（コーニング社）に移し、０.５回転／分の速度で回転培養を行った。 培地交換は５日毎に行った。
【００３３】
実 施 例 ３.
ＨＰＣ−ＹＯ株からのＧＤＥの精製：
［ 酵素活性の測定方法 ］
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）に０.５％の牛アルブミンおよび０.０２％のＮａＮ3 を加えたアッセイバッファーで、２０,０００ｃｐｍに調整した125Ｉ−標識グルカゴン［１０番目のチロシンが125Ｉで置換されている。アマーシャム社（Amersham Inc.、米国）より購入］に培養上清あるいは各種カラムで分離した分画を加え、室温２０分反応させたのち、２０％ＴＣＡを等量加えて反応を止めた。 ついで３,０００ｒｐｍ−２０分遠心後上清を捨て、ガンマカウンターで沈査の放射活性を測定し、放射活性が培養上清やその分画の代わりに加えたＰＢＳの値よりも低いものを分解酵素活性陽性とした。
【００３４】
［ ＧＤＥの精製 ］
実施例２で述べた方法に従って得たＨＰＣ−ＹＯ細胞の培養上清を限外濾過膜ＰＴＧＣ（日本ミリポア社）で約２００倍に濃縮し、脱イオン水で十分透析した後凍結乾燥した。 この凍結乾燥品を出発材料として以下の精製に用いた。
【００３５】
（ステップ１） Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ゲル濾過：
上記凍結乾燥品を０.１ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）に溶解し、同じ緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲル濾過カラム（２６×７０ｃｍ）に添加し、溶出した。 溶出画分について先に述べた方法にしたがって活性を測定した結果、分子量約９０ｋＤａの近辺に活性が認められた。
【００３６】
（ステップ２） Ｍｏｎｏ Ｑ 陰イオン交換クロマトグラフィー：
ステップ１で得た活性画分を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）緩衝液で平衡化したＭｏｎｏ Ｑカラム（１０×１０ｃｍ）に添加し、同緩衝液中のＮａＣｌ濃度を０.４Ｍから０.８Ｍまで直線的に上げ、吸着蛋白を溶出した。 先に述べた方法で活性を測定した結果、０.５Ｍ ＮａＣｌ画分に活性を認めた。
【００３７】
（ステップ３） ヒドロキシルアパタイト：
ステップ２で得た活性画分を１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６.８）で平衡化しておいたヒドロキシルアパタイトカラム（８×１０ｃｍ、ペンタックス社）に添加した。 吸着蛋白はリン酸の直線的濃度勾配（１０ｍＭ〜４００ｍＭ）により溶出した。 画分について活性を測定した結果、約２００ｍＭリン酸画分に活性を検出した。 上記３ステップの結果を図１の（Ａ）〜（Ｃ）に示す。
【００３８】
実 施 例 ４.
ＧＤＥの性状：
（ａ）分子量の測定
実施例３に従って精製したＧＤＥの分子量をドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定した。ゲル濃度は１２％を用いた。 ５％の２−メルカプトエタノールおよび２％ ＳＤＳを含む試料用緩衝液（ｐＨ６.８）に溶解し、３分間煮沸した。 泳動は２５ｍＡで１時間３０分行ない、固定後銀染色試薬（第一化学社製）で蛋白質を染色した。 分子量マーカーは第一化学社製を用いた。 ホスホリラーゼ Ｂ（９７.４ｋｄ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ、６６.３ｋｄ）、アルドラーゼ（４２.４ｋｄ）カルボニックアンヒドラーゼ (３０.０ｋｄ）、トリプシンインヒビター (２０.１ｋｄ）、リゾチーム（１４.４ｋｄ）。 この結果を図２に示す。
図から明らかな通り、本発明のＧＤＥは分子量約８３,０００に単一のバンドを示した。
【００３９】
（ｂ）精製酵素の酵素阻害性剤感受性の測定
実施例３に従って精製したＧＤＥに対する種々の阻害剤の影響を調べたところ、表１に示す結果になった。
実 施 例 ５.
本発明ＧＤＥのＮ−末端近傍のアミノ酸配列と内部配列：
実施例３で得た精製ＧＤＥを気相式プロテインシーケンサー４７３Ａ（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いてエドマン分解を行ない、得られたＰＴＨ−アミノ酸を同定したが、Ｎ−末端がブロックされており、有用な結果を得ることが出来なかった。 そこでこの精製品を常法に従い、４−ビニルピリジンを加えて還元Ｓ−ピリジルエチル化し、これを０.１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８.５）に溶解し、リシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）を０.１μｇ加え、３７℃で２０時間反応させた。 反応後これに１０％ＴＦＡを加え、ｐＨを２付近に調整した後、逆相ＨＰＬＣにてＣ１８カラム（Ｖｙｄａｃ社製）でペプチド断片を分離精製し、上述のプロテインシーケンサーを用いてアミノ酸内部配列を解析した。 その結果５箇所の部分アミノ酸配列（後記配列表中、配列番号３〜７）が明らかになった。
【００４１】
実 施 例 ６.
本発明のＧＤＥに対する特異ポリクロナール抗体および部分アミノ酸配列に体するポリクローナル抗体の作製方法：
単一に精製したＧＤＥをリシルエンドペプチダーゼにて消化し、ＨＰＬＣで分離したペプチド断片のアミノ酸配列をペプチド合成機を用いて合成した。 精製したＧＤＥと合成ペプチド（ｐｅｐ.２１とｐｅｐ.３８）とを二価性架橋試薬ＭＢＳを用いて常法通りに牛血清アルブミンと結合させ、フロイントアジュバントとミセルを作製し、家兎に免疫した。 約４週後抗血清を得た。 抗血清を固定化牛血清アルブミンカラム、ついでプロテインＡカラムに添加して、精製抗体（ＧＤＥ抗体、抗ｐｅｐ.２１抗体および抗ｐｅｐ.３８抗体）を得た。
【００４２】
実 施 例 ７.
ヒトＧＤＥ遺伝子のクローニング：
（１） ＨＰＣ−ＹＯ ｍＲＮＡの調製
ＨＰＣ−ＹＯ ｍＲＮＡの調製は、ピッカトラップ システム１０００（東洋インキ製造）を用いて行った。
ＨＰＣ−ＹＯ約２×１０8 細胞のペレットに１ｍｌの抽出用緩衝液［４Ｍ グアニジンチオシアネート、２５ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７.１）］を加え、ホモジナイズし、あらかじめ用意しておいた８ｍｌの希釈用緩衝液（６×ＳＳＣ溶液、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.２５％ＳＤＳ）と１７４μｌの２−メルカプトエタノールとの混合液を加え撹拌した。
【００４３】
１０ｍｌのビオチン化オリゴｄＴプローブを加え、７０℃で５分間加熱後、ライセートを１１,０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心し上清を回収した。 この上清をＳＡ−ＰＭＰｓ（ストレプトアビジン−パラマグネティック パーティクル）溶液に加え、撹拌後、室温で２分間放置し磁気スタンドにてＳＡ−ＰＭＰｓ沈殿物を回収した。 この沈殿物に１ｍｌの０.５×ＳＳＣ溶液を加え、撹拌後、遠心チューブに移し磁気スタンドにてＳＡ−ＰＭＰｓを回収した。 この操作を更に２回繰り返し上清はできる限り除いた。 次に、この沈殿物に５００μｌのヌクレアーゼ−フリー蒸留水を加え、撹拌後、磁気スタンドにてＳＡ−ＰＭＰｓを集め上清を回収した。
【００４４】
この溶液に５０μｌの３Ｍ 酢酸ナトリウム、５００μｌのイソプロパノールを加え、−２０℃で１時間放置後、１５,０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、その沈殿物を５００μｌの７０％エタノールで洗った。 遠心沈殿物を軽く風乾後、３０μｌのＲＮａｓｅ−フリー蒸留水にて溶解し、約１５μｇのｐｏｌｙ
Ａ +ＲＮＡを得た。
【００４５】
（２） ｃＤＮＡライブラリーの調製
ｃＤＮＡライブラリーの調製は、タイム・セーバー ＤＮＡ 合成キット（Time saver DNA Synthesis Kit；ファルマシア社）を用いて行った。
【００４６】
＜工程１＞ cＤＮＡの合成：
ＨＰＣ−ＹＯｍＲＮＡ１０μｌ（約５μｇ）にＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）で処理した蒸留水を１０μｌ加え６５℃で１０分間熱した後、氷中につけた。
ファースト・ストランド・リアクション・ミクスチュア（First strand reaction mix）にＤＴＴ溶液１μｌ、ＮｏｔＩ−オリゴ ｄＴ１８プライマー １μｌ、先の熱変性ｍＲＮＡ ２０μｌを加え、３７℃で１時間反応させた。
【００４７】
次に、この反応液にセカンド・ストランド・リアクション・ミクスチュア（Second strand reaction mix）を加え、１２℃で３０分間、続いて２２℃で１時間反応後、６５℃で１０分間熱処理した。
この溶液に１００μｌのフェノール／クロロホルム（１：１）を加え、撹拌後、１２,０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清をセファクリルＳ−４００スピンカラムにのせ１,５００ｒｐｍで２分間遠心し溶出液を回収した。
【００４８】
＜工程２＞ ＥｃｏＲＩアダプターの付加
工程１の溶出液にＥｃｏＲＩアダプター溶液５μｌ、ポリエチレングリコール溶液３０μｌ、１／５希釈ＡＴＰ溶液 １μｌ、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ１μｌを加え、１６℃にて１時間反応後、６５℃で１０分間の熱処理にてリガーゼを失活させた。 この溶液に１.５μｌ ポリヌクレオチドキナーゼ溶液を加え、３７℃で３０分間反応後、６５℃で１０分間の熱処理にてキナーゼを失活させた。
【００４９】
＜工程３＞ 制限酵素ＮｏｔＩによる切断
工程２の反応液にＮｏｔＩ（８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を２μｌ加え、３７℃で１時間反応後、フェノール／クロロホルム（１：１）抽出を行い、上清をセファクリルＳ−４００スピンカラムで分離し溶出液を回収した。
【００５０】
＜工程４＞ 酢酸カリウムによるｃＤＮＡのサイズ分画
濃度勾配作製装置の補給槽に５％酢酸カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液を２.４ｍｌ、混合槽に２０％酢酸カリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液を２.４ｍｌそれぞれ入れ、５ｍｌ遠心チューブ（ベックマン社製 １３×５１ｍｍ）に酢酸カリウムのグラジエント溶液を調製した。
【００５１】
このグラジエントチューブに工程３で得たｃＤＮＡ８０μｌとλＤＮＡのＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII二重消化物（８０μｇ／２８６μｌ）２０μｌとの混合物を重層し、ＳＷ５５Ｔｉローターを用いて２５℃で５５,０００ｒｐｍにて３時間遠心した。 遠心後、ペリスタポンプにて１１分画に分け、各々をエタノール沈殿後、ＤＮＡを軽く乾燥させライゲーション溶液［６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、０.１ｍＭ スペルミジン、６.６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ］１０μｌに溶解した。 そのうち２μｌを用いて２％アガロースゲル電気泳動後、２Ｋｂより大きなバンドの現れる画分（３画分）を集めた。
【００５２】
＜工程５＞ λベクターとのライゲーション
サイズ分画したｃＤＮＡ溶液１０μｌ、５μｌ、２.５μｌに、λＥｘＣｅｌｌベクター２μｇを各々加え、各々の総量が１９μｌになるようライゲーション溶液で調製した後、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７.０）１μｌ、エタノール５０μｌを加え、−７０℃で２０分間放置後、１５,０００ｒｐｍで１０分間遠心し沈殿物を回収した。 この沈殿物にライゲーション溶液 ８μｌ、１／２０希釈ＡＴＰ溶液 １μｌ、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ １μｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。
【００５３】
＜工程６＞ インビトロ・パッケージング反応
インビトロ・パッケージング反応は、ギガ パック II ゴールド（Giga pack II gold；ストラタジーン社）を用いて行った。
フリーズ／ソー エクストラクト（Freeze/thaw extract）にライゲーション溶液を５μｌ加えてすぐにソニック エクストラクト（Sonic extract）を１５μｌ加え、ゆっくりと撹拌し氷中につけた。 その後、２２℃で２時間インビトロ・パッケージング反応を行った後、ＳＭ緩衝液［１２５ｍＭ ＮａＣｌ、０.２５ｍＭ ＭｇＳＯ4、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、０.０１％ ゲラチン］５００μｌ、クロロホルム ２０μｌを加えて１,５００ｒｐｍで５分間室温にて遠心し上清を回収した。
【００５４】
＜工程７＞ ファージ力価の測定
大腸菌Ｙ１０９０ｒ- ［△（ｌａｃＵ１６９）、ｐｒｏＡ+ △（ｌｏｎ）、ａｒａＤ１３９、ｓｔｒＡ、ｓｕｐＦ、ｈｓｄＲ、ｔｒｐＣ２２：：Ｔｎ１０（ｔｅｔr ）、［ｐＭＣ９ａｍｐr ｔｅｔr ］、ｍｃｒＢ］２００μｌの一夜培養液に、工程６で得たファージ懸濁液の１μｌと１０μｌとを、それぞれ３７℃で２０分間吸着させた後、３ｍｌのＬＢ Ｔｏｐ アガー（０.７％）を加え、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートにまいて３７℃で一夜培養し、ファージ力価を測定した。
【００５５】
（３）ヒトＧＤＥ遺伝子の抗体スクリーニング
約１２万クローンのＨＰＣ−ＹＯ cＤＮＡライブラリーを抗ｐｅｐ.３８抗体を用いて抗体スクリーニングを行った。 その結果、約２００万個のプラークから計６１個の陽性クローンを得た。
次に、Ｍ１３ フォワードプライマー（５'−ＧＴＴ ＴＴＣ ＣＣＡＧ ＴＣ ＡＣＧ ＡＣ−３'）とＭ１３ リバースプライマー（５'−ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＣ−３'）でＰＣＲを行い、挿入ＤＮＡ断片を増幅させた。
【００５６】
ｐｅｐ.３８のアミノ酸配列、ＹＤＤＴＹＫに相当するＤＮＡ配列の混合プローブ［５'−ＴＡ（Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＡＣ（Ｃ／Ａ／Ｔ／Ｇ）ＴＡ（Ｃ／Ｔ）ＡＡ−３'］を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った結果、６１個のうち７個の陽性クローンを得た。 更に、挿入ＤＮＡ断片の大きさを調べ、最長のクローンλＧＤＥ＃４−２（約２.８Ｋｂ）を選び以下の解析を行った。
【００５７】
（４）ヒトＧＤＥ遺伝子の塩基配列の決定
λＧＤＥ＃４−２クローンを用いてヒトＧＤＥ遺伝子の一次構造決定を行った。 その結果を図３〜６に示した。
【００５８】
（５）塩基配列の特徴
λＧＤＥ＃４−２の挿入部分であるｃＤＮＡの全長は２,７５８ｂｐで、９９ｂｐの５'非翻訳領域、２,５９２ｂｐのＧＤＥ翻訳領域、６７ｂｐの３'非翻訳領域から成り、このクローンはポリＡ領域を欠失していた。 ＧＤＥ翻訳領域にはＧＤＥ蛋白質の精製の部で明らかになっていた部分アミノ酸配列５種の全てが含まれており、アミノ酸８６４残基、その推定分子量は９６.８ｋＤａであった。 図７にそのハイドロパシー・プロフィール（Hydropathy profile）を示した。 また、シグナル配列の領域以外にはＣｙｓ残基が１個も含まれていない。 また、Ｇｅｎｂａｎｋ（ｖｅｒｓｉｏｎ ８２.０）及びＥＭＢＬ（ｖｅｒｓｉｏｎ３８.０）データベース検索の結果から新規な蛋白質であることがわかった。
【００５９】
実 施 例 ８.
発現プラスミドの構築：
λＧＤＥ＃４−２をテンプレートに翻訳領域をはさむように設計したＭｌｕＩ制限酵素部位を付加したプライマーＧＤＥ１１２（５'−ＡＣＴ ＧＡＣ ＧＣＧ ＴＧＴ ＡＧＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＡＧＡ ＧＡＡ ＴＧ−３'）とＳａｌＩ制限酵素部位を付加したプライマーＧＤＥ１１３（５'−ＡＣＧ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＴＧ ＴＴＴ ＴＴＴ ＡＴＴ ＡＴＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＡＡＴ Ａ−３'）にてＰＣＲを行い、その産物をＭｌｕＩとＳａｌＩで消化後、約２.６ＫｂのＤＮＡ断片を単離・精製した。
【００６０】
同様に、ＳＶ４０プロモーターをもつｐＫＣＲベクター由来ｐＫＤＥＭＳＳベクターをＭｌｕＩとＳａｌＩにて消化し、ベクターＤＮＡ断片（約６.４Ｋｂ）をアガロースゲル電気泳動にて単離・精製した。 次に、常法に従いヒトＧＤＥ 翻訳領域を含むＤＮＡ断片とｐＫＤＥＭＳＳベクターＤＮＡ 断片をライゲートし、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させて出てきたコロニーをＰＣＲ法により解析して目的とする組換え型ヒトＧＤＥ発現プラスミドｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２（図８）を得た。
【００６１】
実 施 例 ９.
ヒトＧＤＥ組換え体の発現と解析：
（１）ＣＯＳ７細胞を用いた組換え型ヒトＧＤＥ遺伝子の発現
ヒトＧＤＥ組換え体ｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２の２μｇと、リポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）２μｌを使用し、３.５ｃｍ ｄｉｓｈで培養したＣＯＳ７細胞（約３×１０5 細胞）を形質転換した。 Ｈａｍ'ｓ Ｆ−１２培地 ５ｍｌを用い、３７℃、５％ＣＯ2 中で７２時間培養後、その培養上清を回収し、セントリコン１０（アミコン）により約３５０μｌに濃縮した。
【００６２】
次に、実施例６で作成した３種類の抗血清を用いてＨＰＣ−ＹＯ細胞の培養上清、ＧＤＥ精製品、ヒトＧＤＥ遺伝子を導入したＣＯＳ７細胞の培養上清をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、ウェスタン・ブロット解析をした。 いずれの抗血清も全く同じ反応を示した（図９）。
【００６３】
（２）ＣＯＳ１細胞を用いた組換え型ヒトＧＤＥ蛋白質の活性
ヒトＧＤＥ組換え体ｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２の１μｇ、２μｇ、３μｇ及びそのベクターであるｐＫＤＥＭＳＳ ２μｇをリポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）各々２５μｌずつ使用し、３.５ｃｍ ｄｉｓｈで培養したＣＯＳ１細胞（約３×１０5 細胞）を形質転換した。１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）培地２ｍｌで３７℃、５％ＣＯ2 中７２時間培養後、その培養上清を回収した。
【００６４】
次に、５μｇのグルカゴンに上記培養上清を５μｌずつ加え３７℃で１時間反応後、キャピラリー電気泳動にて２０ｋＶ、２０分間泳動させた。 その結果、１μｇ、２μｇのｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２で形質転換した上清ではｐＫＤＥＭＳＳベクターのみの培養上清と同様にグルカゴンの分解が認められなかったが、３μｇのｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２で形質転換した培養上清では図１０に示すようにグルカゴンの分解が認められ、ヒトＧＤＥ蛋白質が活性を持って発現していることが確認された。
【００６５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＧＤＥの精製ステップごとの溶離パターンを示す図面。 図中、（Ａ）はゲル濾過、（Ｂ）は陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、（Ｃ）はヒドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果を示す。
【図２】 ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ＧＤＥの分子量を測定した結果を示す写真。
【図３】〜
【図６】 ＧＤＥ遺伝子の一次構造を示す図面。
【図７】 ＧＤＥのハイドロパシー・プロフィールを示す図面。
【図８】 組換え型ヒトＧＤＥ発現プラスミドの構成を示す図面。
【図９】 抗ＧＤＥ抗体を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ウェスタン・ブロット解析した結果を電気泳動で示す写真。 写真中、１はＨＰＣ−ＹＯ細胞の培養上清、２はＧＤＥ精製品、３はヒトＧＤＥ遺伝子を導入したＣＯＳ７細胞の培養上清、４はＣＯＳ７の無蛋白培養物の上清濃縮物、Ｍはマーカーを示す。
【図１０】 ＧＤＥで形質転換した培養上清がグルカゴン分解活性を有することを示す図面。
以 上
Claims (8)
- 下記の酵素学的性質を有するグルカゴン分解酵素。
（１）作用：
グルカゴン、バソアクティブ・インテスティナル・ペプタイド（Vasoactive Intestinal Peptide）およびセクレチンを基質とし、それぞれ下記の矢印に示すペプチド結合を加水分解する。
グルカゴン、バソアクティブ・インテスティナル・ペプタイド及びセクレチンを加水分解する。
（３）等電点：
ｐＩ ６.８
（４）阻害剤：
酵素反応は１ｍＭのアンチパインによって阻害されるが、１ｍＭのロイペプチンによっても、０.１ｍＭのペプスタチンによっても阻害されない。
（５）分子量：
８３ｋＤａ（ＳＤＳ電気泳動動法による）
（６）以下のペプチドフラグメントを有する：
（i） ＳＮＳＴＳＹＶＫ
（ii） ＹＹＡＳＴＳＹＤＤＴＹＫ
（iii）ＮＬＴＥＥＹＤＶＳＤＧＥＩＥＬＬＹＥＫ
（iv） ＬＹＷＦＬＤＥＡＫ
（v） ＥＬＲＥＶＥＴＹＹＤＬＬＦＥＫ - 次の式、
ＭＫＫＩＴＴＬＩＶＡＶＦＬＬＬＦＶＶＡＣＴＰＮＮＳＤＧＫＬＴＶＴＦＤＴＫＧＧＳＰＶＥＰＩＫＶＤＫＮＧＬＩＥＡＰＡＤＰＮＫＥＧＦＶＦＲＹＷＹＴＴＮＥＮＶＡＦＳＦＤＴＰＩＴＳＮＩＴＬＮＡＳＷＤＤＥＡＮＰＴＤＩＡＴＩＴＡＭＩＮＥＤＩＤＡＶＧＥＱＬＹＫＴＹＹＤＬＳＬＬＳＫＧＰＩＮＮＳＶＩＳＷＳＳＡＮＫＹＶＳＮＴＧＩＩＬＰＬＬＤＧＥＳＥＤＴＴＬＩＴＧＫＦＶＬＮＧＶＴＩＮＨＥＦＤＶＤＬＹＱＮＫＤＶＥＬＥＤＲＲＴＶＰＦＫＮＬＴＥＥＹＤＶＳＤＧＥＩＥＬＬＹＥＫＧＧＳＶＰＹＶＲＶＥＤＦＭＫＬＬＴＧＦＩＤＰＡＬＤＩＴＹＥＴＮＤＴＳＬＹＩＱＹＤＹＹＤＥＤＥＤＫＴＹＤＬＮＶＴＩＤＴＶＴＮＴＬＶＡＰＤＡＧＦＹＷＧＹＶＹＳＴＡＴＮＦＧＲＨＩＴＹＤＲＥＮＰＨＡＨＹＴＥＧＶＤＶＶＹＤＬＳＫＹＮＭＤＩＶＬＦＥＧＤＶＶＬＰＹＹＭＡＮＱＬＦＡＧＳＳＹＹＮＶＹＹＮＹＤＧＬＦＧＶＹＳＬＰＳＥＧＥＤＡＹＥＴＩＲＴＳＴＫＮＮＴＡＬＰＴＤＬＴＩＨＴＦＮＦＬＡＦＳＭＤＹＦＹＧＬＫＥＬＲＥＶＥＴＹＹＤＬＬＦＥＫＲＤＳＦＬＴＲＮＡＬＲＬＤＬＳＩＨＥＦＬＴＦＶＶＤＥＰＨＴＳＹＧＹＰＧＹＦＮＲＡＴＹＴＧＰＳＶＴＳＬＮＤＦＧＤＲＦＫＫＷＹＬＤＧＭＶＡＴＤＡＱＩＧＫＫＷＧＥＡＡＳＧＷＮＡＳＧＲＤＲＫＬＹＷＦＬＤＥＡＫＴＳＡＶＬＳＬＤＧＦＳＴＡＤＩＩＥＤＴＡＹＮＮＱＴＶＬＤＩＬＫＶＥＳＨＩＦＰＡＭＮＧＧＳＫＹＦＹＹＮＱＳＮＨＤＮＮＶＶＥＩＬＩＫＧＬＴＲＴＤＬＱＴＹＮＡＳＬＶＳＬＧＦＴＡＳＡＮＮＬＴＦＴＫＥＶＤＧＬＫＹＹＡＳＴＳＹＤＤＴＹＫＳＬＩＶＧＬＳＶＦＤＭＴＫＳＶＶＰＥＦＶＮＳＳＮＳＬＩＫＳＤＳＡＶＦＭＥＦＹＭＤＩＩＬＳＱＴＮＮＬＫＮＭＩＬＤＩＴＷＮＴＧＧＮＶＧＡＬＹＲＶＩＧＦＩＴＱＮＳＦＡＶＳＳＩＳＡＤＴＫＳＮＳＴＳＹＶＫＩＥＧＶＰＴＹＤＨＬＮＷＧＬＬＴＴＰＴＳＦＳＡＡＮＳＬＴＴＩＦＫＥＮＮＬＧＰＩＩＧＬＴＳＧＧＧＴＳＳＩＴＰＩＬＬＰＮＧＴＡＦＴＴＳＳＮＮＭＳＡＹＲＴＧＴＧＴＥＡＤＰＹＶＹＨＰＮＥＦＧＩＥＰＴＨＰＩＰＩＧＮＩＹＮＥＴＶＬＬＤＩＬＴＴＹＹＧＥ
で表されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列に対し、１又は数個のアミノ酸が付加、除去及び／又は置換されているアミノ酸配列を含んでなるグルカゴン分解酵素。 - 請求項第１項又は第２項に記載のグルカゴン分解酵素をコードするＤＮＡ。
- 次の式、
CAACATTTGT CGTTTTTTTG AAATATTATT GCTGACTAAA TAAATCAATT ATAGTAAACT 60
CTTTCCATAC CATAAATTGG GTAGAGAGGA AAAGAGAGAA TGAAAAAAAT AACTACACTC 120
ATAGTTGCTG TCTTTTTATT GTTATTTGTT GTAGCCTGCA CACCGAATAA CTCAGATGGA 180
AAGTTAACAG TAACTTTTGA TACAAAGGGT GGTTCACCTG TTGAACCAAT CAAAGTGGAT 240
AAGAATGGTT TAATTGAAGC ACCAGCTGAT CCAAATAAAG AGGGATTTGT ATTTAGATAC 300
TGGTACACAA CAAATGAAAA TGTTGCATTT TCATTTGACA CACCAATTAC GTCTAATATC 360
ACTTTAAATG CATCTTGGGA TGATGAAGCA AATCCAACTG ATATTGCTAC AATCACTGCC 420
ATGATTAATG AAGATATAGA TGCAGTAGGT GAACAATTAT ACAAAACATA TTATGACTTA 480
AGTTTACTTA GTAAGGGGCC AATTAATAAT TCAGTGATTT CATGGTCATC AGCAAACAAA 540
TATGTTTCAA ATACAGGTAT TATCTTACCG TTATTAGACG GTGAGTCAGA AGATACAACA 600
TTGATTACAG GTAAGTTTGT TTTAAACGGC GTGACAATTA ATCATGAGTT TGATGTAGAC 660
TTATATCAAA ATAAAGATGT TGAATTAGAA GATAGACGTA CAGTGCCGTT TAAAAATCTA 720
ACAGAAGAAT ATGATGTTTC AGATGGTGAG ATTGAACTTC TATATGAAAA AGGTGGTAGT 780
GTGCCTTATG TTCGTGTTGA AGATTTCATG AAGTTATTAA CTGGATTTAT TGATCCAGCA 840
CTTGATATTA CATATGAAAC AAATGACACA TCACTTTATA TTCAATATGA TTATTATGAT 900
GAAGATGAAG ATAAAACGTA TGACCTTAAT GTCACAATTG ATACTGTAAC CAATACATTG 960
GTAGCACCAG ACGCTGGTTT TTATTGGGGC TATGTGTATT CAACAGCAAC AAACTTTGGA 1020
CGCCATATTA CTTATGATAG AGAAAATCCA CACGCTCATT ATACAGAAGG CGTAGATGTT 1080
GTTTATGATT TAAGTAAATA TAATATGGAT ATTGTCTTAT TTGAAGGGGA TGTTGTTTTA 1140
CCATATTATA TGGCAAATCA ACTCTTTGCA GGATCTAGTT ATTATAATGT GTACTACAAC 1200
TATGATGGAT TATTTGGTGT ATACTCACTT CCAAGTGAAG GTGAAGATGC ATACGAAACC 1260
ATTAGAACAT CAACTAAAAA TAATACAGCA TTGCCAACAG ATCTTACAAT CCATACATTT 1320
AACTTCTTAG CATTTTCTAT GGATTATTTC TATGGTCTAA AAGAGCTACG TGAAGTTGAA 1380
ACTTATTATG ATCTATTATT TGAAAAACGC GATTCATTCT TAACAAGAAA TGCATTAAGA 1440
CTTGACTTAT CTATTCATGA ATTCTTAACG TTTGTGGTGG ATGAGCCGCA TACTTCCTAT 1500
GGTTATCCAG GATATTTTAA CCGTGCAACT TATACCGGAC CTTCTGTTAC AAGTTTAAAT 1560
GACTTTGGCG ATCGATTTAA GAAATGGTAT TTAGATGGTA TGGTAGCAAC CGATGCTCAA 1620
ATAGGTAAAA AATGGGGCGA GGCAGCAAGT GGATGGAATG CATCAGGTAG AGATAGAAAA 1680
CTTTACTGGT TCTTAGATGA AGCTAAAACA TCTGCAGTAT TATCTTTAGA TGGTTTTTCT 1740
ACTGCAGATA TTATTGAAGA TACAGCTTAT AATAATCAAA CTGTATTAGA TATCTTGAAA 1800
GTGGAAAGTC ATATATTCCC TGCAATGAAC GGTGGAAGTA AGTATTTCTA CTATAACCAA 1860
TCAAATCACG ATAATAATGT AGTGGAAATA CTAATTAAAG GATTAACTAG AACAGATTTA 1920
CAAACTTATA ATGCTTCACT TGTTAGTTTA GGGTTTACAG CATCAGCTAA TAACCTAACA 1980
TTTACTAAAG AAGTAGATGG TTTAAAATAT TATGCTTCAA CTTCTTATGA TGATACCTAT 2040
AAGTCACTCA TCGTTGGATT ATCCGTGTTT GACATGACAA AATCAGTTGT TCCTGAGTTT 2100
GTTAATAGTT CAAATTCACT AATTAAATCT GATAGTGCAG TATTTATGGA GTTTTACATG 2160
GATATCATCT TAAGTCAAAC AAATAACTTA AAAAACATGA TTTTAGATAT CACTTGGAAT 2220
ACAGGTGGTA ACGTAGGTGC ACTATATAGA GTTATAGGCT TTATCACACA AAATAGTTTT 2280
GCAGTATCAA GTATCAGTGC AGATACGAAG TCTAACTCAA CTTCATATGT AAAAATTGAA 2340
GGTGTTCCAA CATATGATCA CTTAAACTGG GGACTACTAA CAACACCAAC ATCCTTTTCA 2400
GCGGCTAACA GTTTAACTAC TATCTTTAAA GAAAACAATT TAGGTCCAAT TATTGGATTA 2460
ACATCCGGTG GTGGTACATC AAGTATTACA CCAATTCTAT TACCTAATGG TACAGCATTT 2520
ACAACCTCAT CTAATAATAT GAGTGCGTAT AGAACTGGTA CTGGTACAGA GGCAGATCCG 2580
TATGTTTATC ATCCAAATGA ATTTGGTATT GAACCAACAC ATCCAATTCC AATTGGAAAC 2640
ATCTATAATG AAACTGTATT ATTAGATATA TTAACCACAT ATTACGGTGA ATAATAAAAA 2700
ACAGGGCATA CCTTAATCGG TACGCCCTGA CTCCTTATAT ATTTTATATA GCTAGATG 2760
で示される塩基配列を有する請求項３に記載のＤＮＡ。 - 請求項第３項又は第４項に記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
- 請求項第５項に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主。
- 請求項第１項又は第２項に記載のグルカゴン分解酵素の製造方法において、該酵素をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターにより形質転換された宿主を培養又は飼育し、前記宿主から酵素を採取することを特徴とする方法。
- 請求項第１項又は第２項に記載のグルカゴン分解酵素に対する抗体。
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| JPH0823972A (ja) | 1996-01-30 |
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