JPH0823972A - グルカゴン分解酵素及びそれをコードする遺伝子並びに該グルカゴン分解酵素に対する抗体 - Google Patents
グルカゴン分解酵素及びそれをコードする遺伝子並びに該グルカゴン分解酵素に対する抗体Info
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- JPH0823972A JPH0823972A JP6187936A JP18793694A JPH0823972A JP H0823972 A JPH0823972 A JP H0823972A JP 6187936 A JP6187936 A JP 6187936A JP 18793694 A JP18793694 A JP 18793694A JP H0823972 A JPH0823972 A JP H0823972A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 下記の酵素学的性質を有するグルカゴン分解
酵素及びそれをコードする遺伝子並びに該グルカゴン分
解酵素に対する抗体。 （１）作用： グルカゴン、バソアクティブ・インテス
ティナル・ペプタイドおよびセクレチンを基質とし、こ
れを加水分解する。 （２）等電点： ｐＩ ６.８ （３）阻害剤： １ｍＭのアンチパインによって阻害さ
れ、１ｍＭのロイペプチンおよび０.１ｍＭのペプスタ
チンによって阻害されない。 （４）分子量： ８３ｋＤａ（ＳＤＳ電気泳動動法によ
る） 【効果】 本発明のグルカゴン分解酵素は、グルカゴン
やＶＩＰ（バソアクティブ・インテスティナル・ペプタ
イド）を分解する作用を有し、過剰なグルカゴンやＶＩ
Ｐの存在により発症する種々の疾病の治療、予防に有効
であると期待される。
酵素及びそれをコードする遺伝子並びに該グルカゴン分
解酵素に対する抗体。 （１）作用： グルカゴン、バソアクティブ・インテス
ティナル・ペプタイドおよびセクレチンを基質とし、こ
れを加水分解する。 （２）等電点： ｐＩ ６.８ （３）阻害剤： １ｍＭのアンチパインによって阻害さ
れ、１ｍＭのロイペプチンおよび０.１ｍＭのペプスタ
チンによって阻害されない。 （４）分子量： ８３ｋＤａ（ＳＤＳ電気泳動動法によ
る） 【効果】 本発明のグルカゴン分解酵素は、グルカゴン
やＶＩＰ（バソアクティブ・インテスティナル・ペプタ
イド）を分解する作用を有し、過剰なグルカゴンやＶＩ
Ｐの存在により発症する種々の疾病の治療、予防に有効
であると期待される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なグルカゴン分解
酵素、それをコードする遺伝子、該グルカゴン分解酵素
の製造方法及び該グルカゴン分解酵素に対する抗体に関
する。
酵素、それをコードする遺伝子、該グルカゴン分解酵素
の製造方法及び該グルカゴン分解酵素に対する抗体に関
する。
【０００２】
【従来の技術】グルカゴンは膵臓から分泌されるホルモ
ンで、２９個のアミノ酸から構成されており、インスリ
ンに拮抗して血糖量を増加させる。 グルカゴノーマ症
候群においては、グルカゴン産生腫瘍のほかに、天疱瘡
様皮膚炎、口内炎、体重減少、貧血、低アミノ酸血症、
耐糖能異常を伴い、血中のグルカゴン量が高まる。
ンで、２９個のアミノ酸から構成されており、インスリ
ンに拮抗して血糖量を増加させる。 グルカゴノーマ症
候群においては、グルカゴン産生腫瘍のほかに、天疱瘡
様皮膚炎、口内炎、体重減少、貧血、低アミノ酸血症、
耐糖能異常を伴い、血中のグルカゴン量が高まる。
【０００３】一方、バソアクティブ・インテスティナル
・ペプタイド（Vasoactive Intestinal Peptide；以
下、「ＶＩＰ」と略す ）は、多様な生理活性を持つ神
経伝達物質で、２８個のアミノ酸で構成されたペプチド
である。臨床的には、ＶＩＰはＷＤＨＡ症候群（膵腺腫
を伴う消化器症状）の原因物質である。グルカゴノーマ
症候群やＷＤＨＡ症候群の予防／治療方法として、グル
カゴンやＶＩＰを分解する酵素の活用が考えられるが、
従来、グルカゴンやＶＩＰを分解する酵素は知られてい
なかった。
・ペプタイド（Vasoactive Intestinal Peptide；以
下、「ＶＩＰ」と略す ）は、多様な生理活性を持つ神
経伝達物質で、２８個のアミノ酸で構成されたペプチド
である。臨床的には、ＶＩＰはＷＤＨＡ症候群（膵腺腫
を伴う消化器症状）の原因物質である。グルカゴノーマ
症候群やＷＤＨＡ症候群の予防／治療方法として、グル
カゴンやＶＩＰを分解する酵素の活用が考えられるが、
従来、グルカゴンやＶＩＰを分解する酵素は知られてい
なかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、前記疾患の予
防／治療のためには、まず、グルカゴンやＶＩＰを分解
する酵素を見出し、これを分離、精製することや、更に
この酵素の遺伝子を解明する必要があった。また、該酵
素の生理的役割や生体内分布については乏しい知見しか
ないので、それらを明らかにする上でも該酵素の純品を
得て、その酵素に対する純粋な抗体を取得する必要もあ
った。
防／治療のためには、まず、グルカゴンやＶＩＰを分解
する酵素を見出し、これを分離、精製することや、更に
この酵素の遺伝子を解明する必要があった。また、該酵
素の生理的役割や生体内分布については乏しい知見しか
ないので、それらを明らかにする上でも該酵素の純品を
得て、その酵素に対する純粋な抗体を取得する必要もあ
った。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、無タンパ
ク培養系での有用物質の生産を研究する過程において、
グルカゴン分解酵素の存在を見いだした。そして、各種
の分離、精製手段を利用し、125Ｉ−標識グルカゴンを
用いるアッセイ法で酵素活性を追跡しつつ純度を高めて
いった結果、純品としてグルカゴン分解酵素を得た。ま
た、このグルカゴン分解酵素のペプチド配列から、公知
方法に従って当該酵素をコードする遺伝子を見いだし、
該遺伝子を含んでなる発現ベクターを作成し、該発現ベ
クターにより形質転換された宿主を得た。
ク培養系での有用物質の生産を研究する過程において、
グルカゴン分解酵素の存在を見いだした。そして、各種
の分離、精製手段を利用し、125Ｉ−標識グルカゴンを
用いるアッセイ法で酵素活性を追跡しつつ純度を高めて
いった結果、純品としてグルカゴン分解酵素を得た。ま
た、このグルカゴン分解酵素のペプチド配列から、公知
方法に従って当該酵素をコードする遺伝子を見いだし、
該遺伝子を含んでなる発現ベクターを作成し、該発現ベ
クターにより形質転換された宿主を得た。
【０００６】更に、グルカゴン分解酵素の製造方法とし
て、ヒト膵臓癌組織由来の腫瘍細胞を培養し、その培養
物中から該酵素を採取する方法およびグルカゴン分解酵
素発現ベクターにより形質転換された形質転換体を培養
又は飼育し、該形質転換体から該酵素を採取する方法も
確立した。更にまた、前記疾患の治療や診断の目的に利
用しうるグルカゴン分解酵素に対する抗体を得た。
て、ヒト膵臓癌組織由来の腫瘍細胞を培養し、その培養
物中から該酵素を採取する方法およびグルカゴン分解酵
素発現ベクターにより形質転換された形質転換体を培養
又は飼育し、該形質転換体から該酵素を採取する方法も
確立した。更にまた、前記疾患の治療や診断の目的に利
用しうるグルカゴン分解酵素に対する抗体を得た。
【０００７】本発明は、これらの知見に基づき完成され
たものであり、新規なグルカゴン分解酵素、それをコー
ドする遺伝子系、該酵素の製造方法及び該酵素に対する
抗体を提供するものである。
たものであり、新規なグルカゴン分解酵素、それをコー
ドする遺伝子系、該酵素の製造方法及び該酵素に対する
抗体を提供するものである。
【０００８】本発明のグルカゴン分解酵素（以下、「Ｇ
ＤＥ」と略す）は、例えばヒト膵臓癌腫瘍細胞の培養上
清から、グルカゴン分解活性を有する画分を、種々の精
製手段を組合せ、分離、精製すれば良い。
ＤＥ」と略す）は、例えばヒト膵臓癌腫瘍細胞の培養上
清から、グルカゴン分解活性を有する画分を、種々の精
製手段を組合せ、分離、精製すれば良い。
【０００９】より具体的には、例えば、「ＨＰＣ−Ｙ
Ｏ」と名付けられたヒト膵臓癌腫瘍細胞由来の株化細胞
を継代培養し、その培養上清をグルカゴン分解活性を指
標に、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を組み合わせ
単一ピークを与えるまで精製することにより得ることが
できる。 グルカゴン分解活性は、標識グルカゴン、例
えば125Ｉ標識グルカゴン等を用いることにより、測定
することができる。
Ｏ」と名付けられたヒト膵臓癌腫瘍細胞由来の株化細胞
を継代培養し、その培養上清をグルカゴン分解活性を指
標に、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を組み合わせ
単一ピークを与えるまで精製することにより得ることが
できる。 グルカゴン分解活性は、標識グルカゴン、例
えば125Ｉ標識グルカゴン等を用いることにより、測定
することができる。
【００１０】このようにして得られた本発明のＧＤＥ
は、次のような酵素学的性質を有していた。 （１）作用：グルカゴン、バソアクティブ・インテステ
ィナル・ペプタイド（Vasoactive Intestinal Peptid
e）およびセクレチンを基質とし、それぞれ下記の矢印
に示すペプチド結合を加水分解する。
は、次のような酵素学的性質を有していた。 （１）作用：グルカゴン、バソアクティブ・インテステ
ィナル・ペプタイド（Vasoactive Intestinal Peptid
e）およびセクレチンを基質とし、それぞれ下記の矢印
に示すペプチド結合を加水分解する。
【化２】 （２）基質特異性：グルカゴン、バソアクティブ・イン
テスティナル・ペプタイド及びセクレチンを加水分解す
る。 （３）等電点：ｐＩ ６.８ （４）阻害剤：酵素反応は１ｍＭのアンチパインによっ
て阻害されるが、１ｍＭのロイペプチンによっても、
０.１ｍＭのペプスタチンによっても阻害されない。 （５）分子量：８３ｋＤａ（ＳＤＳ電気泳動動法によ
る） （６）以下のペプチドフラグメントを有する： （i） ＳＮＳＴＳＹＶＫ （ii） ＹＹＡＳＴＳＹＤＤＴＹＫ （iii）ＮＬＴＥＥＹＤＶＳＤＧＥＩＥＬＬＹＥＫ （iv） ＬＹＷＦＬＤＥＡＫ （v） ＥＬＲＥＶＥＴＹＹＤＬＬＦＥＫ
テスティナル・ペプタイド及びセクレチンを加水分解す
る。 （３）等電点：ｐＩ ６.８ （４）阻害剤：酵素反応は１ｍＭのアンチパインによっ
て阻害されるが、１ｍＭのロイペプチンによっても、
０.１ｍＭのペプスタチンによっても阻害されない。 （５）分子量：８３ｋＤａ（ＳＤＳ電気泳動動法によ
る） （６）以下のペプチドフラグメントを有する： （i） ＳＮＳＴＳＹＶＫ （ii） ＹＹＡＳＴＳＹＤＤＴＹＫ （iii）ＮＬＴＥＥＹＤＶＳＤＧＥＩＥＬＬＹＥＫ （iv） ＬＹＷＦＬＤＥＡＫ （v） ＥＬＲＥＶＥＴＹＹＤＬＬＦＥＫ
【００１１】本発明のＧＤＥは、例えば実施例に示すご
とくして単離精製されるが、一旦単離精製され、その性
質が解明された後は、それらの性質を指標にして蛋白質
の単離精製に用いられる任意の常法を用いて本発明のＧ
ＤＥを単離精製できることは明らかである。
とくして単離精製されるが、一旦単離精製され、その性
質が解明された後は、それらの性質を指標にして蛋白質
の単離精製に用いられる任意の常法を用いて本発明のＧ
ＤＥを単離精製できることは明らかである。
【００１２】次に、遺伝子操作の手法により、本発明の
ＧＤＥ発現ベクターにより形質転換された形質転換体を
培養又は飼育し、該形質転換体から該酵素を採取する方
法について説明する。
ＧＤＥ発現ベクターにより形質転換された形質転換体を
培養又は飼育し、該形質転換体から該酵素を採取する方
法について説明する。
【００１３】ＧＤＥのｃＤＮＡのクローニングは、株化
細胞「ＨＰＣ−ＹＯ」から常法に従ってｍＲＮＡを調製
し、ｃＤＮＡライブラリーを作製後、抗ヒトＧＤＥ抗体
を用いた抗体スクリーニングにより目的のｃＤＮＡを
得、次いでその塩基配列を決定することにより行われ
る。
細胞「ＨＰＣ−ＹＯ」から常法に従ってｍＲＮＡを調製
し、ｃＤＮＡライブラリーを作製後、抗ヒトＧＤＥ抗体
を用いた抗体スクリーニングにより目的のｃＤＮＡを
得、次いでその塩基配列を決定することにより行われ
る。
【００１４】上記手順により決定された、本発明ＧＤＥ
の塩基配列は、後記配列表の配列２に示すとおりであ
る。また、上記ＧＤＥは、決定された塩基配列から、後
記配列表の配列１に示すアミノ酸配列またはこれと相同
性を有するアミノ酸配列を有するものと推定されてい
る。 なお、本明細書において相同性を有するアミノ酸
配列とは、あるアミノ酸配列に対し、１又は複数のアミ
ノ酸が付加、除去及び／又は置換されているが、その作
用においては原アミノ酸配列とほぼ同等な作用を有する
アミノ酸配列を意味する。
の塩基配列は、後記配列表の配列２に示すとおりであ
る。また、上記ＧＤＥは、決定された塩基配列から、後
記配列表の配列１に示すアミノ酸配列またはこれと相同
性を有するアミノ酸配列を有するものと推定されてい
る。 なお、本明細書において相同性を有するアミノ酸
配列とは、あるアミノ酸配列に対し、１又は複数のアミ
ノ酸が付加、除去及び／又は置換されているが、その作
用においては原アミノ酸配列とほぼ同等な作用を有する
アミノ酸配列を意味する。
【００１５】以上のようにＧＤＥのアミノ酸配列が決定
されると、前記の方法に限られず、他の方法によっても
本発明のＧＤＥをコードする遺伝子（以下、「ＧＤＥ遺
伝子」という）を得ることができる。 すなわち、天然
ＧＤＥのアミノ酸配列をコードする１つのヌクレオチド
配列が決定されれば、本ＧＤＥ遺伝子は前記ストラテジ
ーとは異なるストラテジーによりｃＤＮＡとしてクロー
ニングすることができ、さらには、それを産生する細胞
のゲノムからクローニングすることもできる。
されると、前記の方法に限られず、他の方法によっても
本発明のＧＤＥをコードする遺伝子（以下、「ＧＤＥ遺
伝子」という）を得ることができる。 すなわち、天然
ＧＤＥのアミノ酸配列をコードする１つのヌクレオチド
配列が決定されれば、本ＧＤＥ遺伝子は前記ストラテジ
ーとは異なるストラテジーによりｃＤＮＡとしてクロー
ニングすることができ、さらには、それを産生する細胞
のゲノムからクローニングすることもできる。
【００１６】ゲノムからクローニングする場合、プロー
ブヌクレオチドとして下記のいずれかのペプチドのヌク
レオチド配列に基づいて設計されたゲノムＤＮＡを使用
することができる。
ブヌクレオチドとして下記のいずれかのペプチドのヌク
レオチド配列に基づいて設計されたゲノムＤＮＡを使用
することができる。
【００１７】
【００１８】ゲノムから目的とするＤＮＡをクローニン
グするための一般的方法は、当業界において良く知られ
ている（例えば、Current Protocols In Molecular Bio
logy,John Wiley & Sons社第５章及び第６章）。
グするための一般的方法は、当業界において良く知られ
ている（例えば、Current Protocols In Molecular Bio
logy,John Wiley & Sons社第５章及び第６章）。
【００１９】本発明のＧＤＥ遺伝子はまた、化学合成に
よっても調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、
当業界において自動ＤＮＡ合成機、例えばアプライド・
バイオシステムズ社の３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機など
を採用することにより容易に行うことができる。
よっても調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、
当業界において自動ＤＮＡ合成機、例えばアプライド・
バイオシステムズ社の３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機など
を採用することにより容易に行うことができる。
【００２０】次に、上記のようにして得られたＧＤＥ遺
伝子としてプラスミドに導入し、常用の遺伝子組換え法
により哺乳動物細胞等の宿主を形質転換してＧＤＥを発
現させる。 ＧＤＥの発現は、抗ヒトＧＤＥ抗体を用い
たウェスタン・ブロッティング法により確認することが
できる。 プラスミドへの導入、形質転換株の確立、当
該株の培養等は、常用の遺伝子組換え法に従って行うこ
とができる。
伝子としてプラスミドに導入し、常用の遺伝子組換え法
により哺乳動物細胞等の宿主を形質転換してＧＤＥを発
現させる。 ＧＤＥの発現は、抗ヒトＧＤＥ抗体を用い
たウェスタン・ブロッティング法により確認することが
できる。 プラスミドへの導入、形質転換株の確立、当
該株の培養等は、常用の遺伝子組換え法に従って行うこ
とができる。
【００２１】発現系は当業者に既知のものから適宜選択
して用いれば良いが、シグナル配列の付加・改良や宿主
の選択によって分泌効率および発現量の向上をはかるこ
ともできる。 宿主細胞としては、特に限定されない
が、細菌類、酵母及び他の真菌類、ヒトおよび他の動物
の培養細胞、植物の培養細胞等が挙げられる。 即ち、
本発明のポリヌクレオチドを遺伝子として適当な発現ベ
クターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞に導
入し、該宿主細胞を培養し、そして得られた培養物（細
胞または培地）から目的とするＧＤＥ蛋白質を採取す
る。
して用いれば良いが、シグナル配列の付加・改良や宿主
の選択によって分泌効率および発現量の向上をはかるこ
ともできる。 宿主細胞としては、特に限定されない
が、細菌類、酵母及び他の真菌類、ヒトおよび他の動物
の培養細胞、植物の培養細胞等が挙げられる。 即ち、
本発明のポリヌクレオチドを遺伝子として適当な発現ベ
クターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞に導
入し、該宿主細胞を培養し、そして得られた培養物（細
胞または培地）から目的とするＧＤＥ蛋白質を採取す
る。
【００２２】宿主としては、原核生物または真核生物を
用いることができる。 原核生物としては細菌、特に大
腸菌（Escherichia coli）、バチルス（Bacillus）属細
菌、例えばバチルス・ズブチリス（B.subtilis）等を用
いることができる。 真核生物としては酵母、例えばサ
ッカロミセス（Saccharomyces ）属酵母、例えばサッカ
ロミセス・セレビシエ（S. Serevisiae ）等の真核微生
物、昆虫細胞、例えばヨガ細胞（Spodoptera Frugiperd
a ）、カイコ細胞（Bombyx mori）、動物細胞、例えば
ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞、特にサル細胞、例え
ば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７等を使用することができる。
用いることができる。 原核生物としては細菌、特に大
腸菌（Escherichia coli）、バチルス（Bacillus）属細
菌、例えばバチルス・ズブチリス（B.subtilis）等を用
いることができる。 真核生物としては酵母、例えばサ
ッカロミセス（Saccharomyces ）属酵母、例えばサッカ
ロミセス・セレビシエ（S. Serevisiae ）等の真核微生
物、昆虫細胞、例えばヨガ細胞（Spodoptera Frugiperd
a ）、カイコ細胞（Bombyx mori）、動物細胞、例えば
ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞、特にサル細胞、例え
ば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７等を使用することができる。
【００２３】発現ベクターとしては、プラスミド、ファ
ージ、ファージミド、ウィルス［バキュロ（昆虫）、ワ
クチニア（動物細胞）］等が使用できる。 発現ベクタ
ー中のプロモーターは、宿主細菌に依存して選択され、
例えば細菌用プロモーターとしてｌａｃプロモーター、
ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター等が使用さ
れ、酵母用プロモーターとして例えばａｄｈ １プロモ
ーター、ｐｇｋプロモーター等が使用される。 また、
昆虫用プロモーターとしては、バキュロウィルスポリヘ
ドリンプロモーター等、動物細胞としては、Ｓｉｍｉａ
ｎ Ｖｉｒｕｓ４０（ＳＶ４０）の初期または、後期プ
ロモーター等が挙げられる。また、エンハンサーを使用
する場合、例えばＳＶ４０のエンハンサー等を遺伝子の
上流または下流に挿入する。
ージ、ファージミド、ウィルス［バキュロ（昆虫）、ワ
クチニア（動物細胞）］等が使用できる。 発現ベクタ
ー中のプロモーターは、宿主細菌に依存して選択され、
例えば細菌用プロモーターとしてｌａｃプロモーター、
ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター等が使用さ
れ、酵母用プロモーターとして例えばａｄｈ １プロモ
ーター、ｐｇｋプロモーター等が使用される。 また、
昆虫用プロモーターとしては、バキュロウィルスポリヘ
ドリンプロモーター等、動物細胞としては、Ｓｉｍｉａ
ｎ Ｖｉｒｕｓ４０（ＳＶ４０）の初期または、後期プ
ロモーター等が挙げられる。また、エンハンサーを使用
する場合、例えばＳＶ４０のエンハンサー等を遺伝子の
上流または下流に挿入する。
【００２４】発現ベクターによる宿主の形質転換は、当
業界において良く知られている常法により行うことがで
き、これらの方法は例えば、カレント・プロトコルズ・
イン・モレキュラ・バイオジィ（ Current Protocols i
n Molecular Biology, JohnWiley & Sons 社）に記載さ
れている。
業界において良く知られている常法により行うことがで
き、これらの方法は例えば、カレント・プロトコルズ・
イン・モレキュラ・バイオジィ（ Current Protocols i
n Molecular Biology, JohnWiley & Sons 社）に記載さ
れている。
【００２５】形質転換体の培養も常法に従って行うこと
ができる。培養物からＧＤＥ蛋白質の精製は蛋白質を単
離・精製するための常法に従って、例えば限外ろ過、各
種カラムクロマトグラフィー、例えばセファロースを用
いるクロマトグラフィー等により行うことができる。
ができる。培養物からＧＤＥ蛋白質の精製は蛋白質を単
離・精製するための常法に従って、例えば限外ろ過、各
種カラムクロマトグラフィー、例えばセファロースを用
いるクロマトグラフィー等により行うことができる。
【００２６】かくして、ＧＤＥ蛋白質を有利に得ること
ができる。 得られたＧＤＥ蛋白質は生化学的、または
化学的な修飾、例えばＮ末端のアシル化等されたもので
あっても良い。
ができる。 得られたＧＤＥ蛋白質は生化学的、または
化学的な修飾、例えばＮ末端のアシル化等されたもので
あっても良い。
【００２７】本発明の、ＧＤＥに対する抗体も、常法に
したがって得ることができる。 すなわち、まず上記の
ＧＤＥで家兎等の動物に感作し、その血清を分離し、必
要に応じてこの血清から免疫グロブリン画分を精製する
ことにより得られる。 この場合、該物質の感作性を高
めるために、該物質を牛血清アルブミン（ＢＳＡ）また
はメチルＢＳＡ等の担体蛋白質と結合させたものを免疫
原として用いても良い。
したがって得ることができる。 すなわち、まず上記の
ＧＤＥで家兎等の動物に感作し、その血清を分離し、必
要に応じてこの血清から免疫グロブリン画分を精製する
ことにより得られる。 この場合、該物質の感作性を高
めるために、該物質を牛血清アルブミン（ＢＳＡ）また
はメチルＢＳＡ等の担体蛋白質と結合させたものを免疫
原として用いても良い。
【００２８】動物に感作する場合、抗体産生を高めるた
めに、フロインドの完全アジュバント（ＦＣＡ）または
フロインドの不完全アジュバント（ＦＩＣＡ）と共に感
作することもできる。 動物に感作する回数は２回以上
が望ましく、試験採血により血清の抗体価をチェックし
ながら感作回数を決定すれば良い。 免疫動物は必要に
応じて屠殺して全血を用いても良いが、適宜追加感作す
ることにより一定の抗体価を保ち、必要に応じて少量を
採血して用事使用することもできる。 さらに、該物質
をマウスに感作し、感作マウスの脾臓細胞とミエローマ
細胞からハイブリドーマを作成し、常法に従ってモノク
ローナル抗体を得ることも可能である。
めに、フロインドの完全アジュバント（ＦＣＡ）または
フロインドの不完全アジュバント（ＦＩＣＡ）と共に感
作することもできる。 動物に感作する回数は２回以上
が望ましく、試験採血により血清の抗体価をチェックし
ながら感作回数を決定すれば良い。 免疫動物は必要に
応じて屠殺して全血を用いても良いが、適宜追加感作す
ることにより一定の抗体価を保ち、必要に応じて少量を
採血して用事使用することもできる。 さらに、該物質
をマウスに感作し、感作マウスの脾臓細胞とミエローマ
細胞からハイブリドーマを作成し、常法に従ってモノク
ローナル抗体を得ることも可能である。
【００２９】
【発明の効果】本発明のＧＤＥは、従来知られていない
グルカゴンおよびＶＩＰを分解する作用を有するもので
ある。 従って、過剰なグルカゴンやＶＩＰの存在によ
り発症する種々の疾病の治療、予防に有効であると期待
される。また、本発明のＧＤＥは、グルカゴンを神経伝
達物質とする中枢神経系や腸管などに分布する末梢神経
節に存在することから、諸神経疾患の診断に有用性が期
待される。更に本発明のＧＤＥは、様々な腫瘍培養細胞
の培養上清に検出されることから悪性疾患の血清学的診
断に応用できるものと期待される。
グルカゴンおよびＶＩＰを分解する作用を有するもので
ある。 従って、過剰なグルカゴンやＶＩＰの存在によ
り発症する種々の疾病の治療、予防に有効であると期待
される。また、本発明のＧＤＥは、グルカゴンを神経伝
達物質とする中枢神経系や腸管などに分布する末梢神経
節に存在することから、諸神経疾患の診断に有用性が期
待される。更に本発明のＧＤＥは、様々な腫瘍培養細胞
の培養上清に検出されることから悪性疾患の血清学的診
断に応用できるものと期待される。
【００３０】
【実施例】以下の実施例によって本発明を詳細に説明す
るが、この実施例によって本発明が限定されるものでは
ない。
るが、この実施例によって本発明が限定されるものでは
ない。
【００３１】実 施 例 １. ＧＤＥ産生細胞株ＨＰＣ−ＹＯの樹立：膵臓癌患者の癌
組織をステンレスメッシュを用いて分散させ、１０％牛
胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地を用
い、炭酸ガスインキュベーターで培養することにより樹
立した。 この細胞株を漸次血清濃度を低下させた環境
に順化させ、最終的に蛋白質を含まないＨａｍ'ｓ Ｆ１
２培地のみで増殖するようにした（Nozomi Yamaguchi e
t. al. Cancer Res 50: 7008-7012,1990）。 この細胞
株については、平成６年７月１４日付で工業技術院生命
工学工業技術研究所にＦＥＲＭ−１４４２９号として寄
託した（なお、本寄託において寄託者の付した識別のた
めの表示は、ＳＢＭ３３４である）。
組織をステンレスメッシュを用いて分散させ、１０％牛
胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地を用
い、炭酸ガスインキュベーターで培養することにより樹
立した。 この細胞株を漸次血清濃度を低下させた環境
に順化させ、最終的に蛋白質を含まないＨａｍ'ｓ Ｆ１
２培地のみで増殖するようにした（Nozomi Yamaguchi e
t. al. Cancer Res 50: 7008-7012,1990）。 この細胞
株については、平成６年７月１４日付で工業技術院生命
工学工業技術研究所にＦＥＲＭ−１４４２９号として寄
託した（なお、本寄託において寄託者の付した識別のた
めの表示は、ＳＢＭ３３４である）。
【００３２】実 施 例 ２. ＨＰＣ−ＹＯ株の継代培養および大量培養：継代培養は
以下のごとく行った。 プラスチック培養フラスコ（１
５０ｃｍ2、コーニング社製）を用い、８〜１０Ｍ 亜セ
レン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンＧカリ
ウムおよび１００μｇ／ｍｌ 硫酸カナマイシンを含む
Ｈａｍ'ｓ Ｆ１２培地５０ｍｌ中で培養し、４日毎に培
養液を交換した。培養継代時には、０.２５％ トリプシ
ン（ＧＩＢＣＯ社製）、０.０１％ ＥＤＴＡを含むＰＢ
Ｓ（−）を加え、細胞が剥離するまで３７℃で保った。
剥離した細胞は１,５００ｒｐｍで５分間遠心し回収し
た。 細胞は再び上記の培地に懸濁し、新しいフラスコ
５本に継代した。翌日培養液を更新し、以後５日毎に培
地交換を行った。 また一部は１,７００ｃｍ2 のプラス
チック製ローラーボトル（コーニング社）に移し、０.
５回転／分の速度で回転培養を行った。 培地交換は５
日毎に行った。
以下のごとく行った。 プラスチック培養フラスコ（１
５０ｃｍ2、コーニング社製）を用い、８〜１０Ｍ 亜セ
レン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンＧカリ
ウムおよび１００μｇ／ｍｌ 硫酸カナマイシンを含む
Ｈａｍ'ｓ Ｆ１２培地５０ｍｌ中で培養し、４日毎に培
養液を交換した。培養継代時には、０.２５％ トリプシ
ン（ＧＩＢＣＯ社製）、０.０１％ ＥＤＴＡを含むＰＢ
Ｓ（−）を加え、細胞が剥離するまで３７℃で保った。
剥離した細胞は１,５００ｒｐｍで５分間遠心し回収し
た。 細胞は再び上記の培地に懸濁し、新しいフラスコ
５本に継代した。翌日培養液を更新し、以後５日毎に培
地交換を行った。 また一部は１,７００ｃｍ2 のプラス
チック製ローラーボトル（コーニング社）に移し、０.
５回転／分の速度で回転培養を行った。 培地交換は５
日毎に行った。
【００３３】実 施 例 ３. ＨＰＣ−ＹＯ株からのＧＤＥの精製： ［ 酵素活性の測定方法 ］２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７.４）に０.５％の牛アルブミンおよび０.０２
％のＮａＮ3 を加えたアッセイバッファーで、２０,０
００ｃｐｍに調整した125Ｉ−標識グルカゴン［１０番
目のチロシンが125Ｉで置換されている。アマーシャム
社（Amersham Inc.、米国）より購入］に培養上清ある
いは各種カラムで分離した分画を加え、室温２０分反応
させたのち、２０％ＴＣＡを等量加えて反応を止めた。
ついで３,０００ｒｐｍ−２０分遠心後上清を捨て、ガ
ンマカウンターで沈査の放射活性を測定し、放射活性が
培養上清やその分画の代わりに加えたＰＢＳの値よりも
低いものを分解酵素活性陽性とした。
（ｐＨ７.４）に０.５％の牛アルブミンおよび０.０２
％のＮａＮ3 を加えたアッセイバッファーで、２０,０
００ｃｐｍに調整した125Ｉ−標識グルカゴン［１０番
目のチロシンが125Ｉで置換されている。アマーシャム
社（Amersham Inc.、米国）より購入］に培養上清ある
いは各種カラムで分離した分画を加え、室温２０分反応
させたのち、２０％ＴＣＡを等量加えて反応を止めた。
ついで３,０００ｒｐｍ−２０分遠心後上清を捨て、ガ
ンマカウンターで沈査の放射活性を測定し、放射活性が
培養上清やその分画の代わりに加えたＰＢＳの値よりも
低いものを分解酵素活性陽性とした。
【００３４】［ ＧＤＥの精製 ］実施例２で述べた方法
に従って得たＨＰＣ−ＹＯ細胞の培養上清を限外濾過膜
ＰＴＧＣ（日本ミリポア社）で約２００倍に濃縮し、脱
イオン水で十分透析した後凍結乾燥した。 この凍結乾
燥品を出発材料として以下の精製に用いた。
に従って得たＨＰＣ−ＹＯ細胞の培養上清を限外濾過膜
ＰＴＧＣ（日本ミリポア社）で約２００倍に濃縮し、脱
イオン水で十分透析した後凍結乾燥した。 この凍結乾
燥品を出発材料として以下の精製に用いた。
【００３５】（ステップ１） Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ ゲ
ル濾過：上記凍結乾燥品を０.１ＭのＮａＣｌを含む１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）に溶解し、同じ
緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲル濾過カラ
ム（２６×７０ｃｍ）に添加し、溶出した。 溶出画分
について先に述べた方法にしたがって活性を測定した結
果、分子量約９０ｋＤａの近辺に活性が認められた。
ル濾過：上記凍結乾燥品を０.１ＭのＮａＣｌを含む１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）に溶解し、同じ
緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ゲル濾過カラ
ム（２６×７０ｃｍ）に添加し、溶出した。 溶出画分
について先に述べた方法にしたがって活性を測定した結
果、分子量約９０ｋＤａの近辺に活性が認められた。
【００３６】（ステップ２） Ｍｏｎｏ Ｑ 陰イオン交
換クロマトグラフィー：ステップ１で得た活性画分を１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）緩衝液で平衡
化したＭｏｎｏ Ｑカラム（１０×１０ｃｍ）に添加
し、同緩衝液中のＮａＣｌ濃度を０.４Ｍから０.８Ｍま
で直線的に上げ、吸着蛋白を溶出した。先に述べた方法
で活性を測定した結果、０.５Ｍ ＮａＣｌ画分に活性を
認めた。
換クロマトグラフィー：ステップ１で得た活性画分を１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）緩衝液で平衡
化したＭｏｎｏ Ｑカラム（１０×１０ｃｍ）に添加
し、同緩衝液中のＮａＣｌ濃度を０.４Ｍから０.８Ｍま
で直線的に上げ、吸着蛋白を溶出した。先に述べた方法
で活性を測定した結果、０.５Ｍ ＮａＣｌ画分に活性を
認めた。
【００３７】（ステップ３） ヒドロキシルアパタイ
ト：ステップ２で得た活性画分を１０ｍＭ リン酸緩衝
液（ｐＨ６.８）で平衡化しておいたヒドロキシルアパ
タイトカラム（８×１０ｃｍ、ペンタックス社）に添加
した。 吸着蛋白はリン酸の直線的濃度勾配（１０ｍＭ
〜４００ｍＭ）により溶出した。 画分について活性を
測定した結果、約２００ｍＭリン酸画分に活性を検出し
た。 上記３ステップの結果を図１の（Ａ）〜（Ｃ）に
示す。
ト：ステップ２で得た活性画分を１０ｍＭ リン酸緩衝
液（ｐＨ６.８）で平衡化しておいたヒドロキシルアパ
タイトカラム（８×１０ｃｍ、ペンタックス社）に添加
した。 吸着蛋白はリン酸の直線的濃度勾配（１０ｍＭ
〜４００ｍＭ）により溶出した。 画分について活性を
測定した結果、約２００ｍＭリン酸画分に活性を検出し
た。 上記３ステップの結果を図１の（Ａ）〜（Ｃ）に
示す。
【００３８】実 施 例 ４. ＧＤＥの性状： （ａ）分子量の測定 実施例３に従って精製したＧＤＥの分子量をドデシル硫
酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）により測定した。ゲル濃度は１２％を用
いた。 ５％の２−メルカプトエタノールおよび２％ Ｓ
ＤＳを含む試料用緩衝液（ｐＨ６.８）に溶解し、３分
間煮沸した。 泳動は２５ｍＡで１時間３０分行ない、
固定後銀染色試薬（第一化学社製）で蛋白質を染色し
た。 分子量マーカーは第一化学社製を用いた。 ホスホ
リラーゼ Ｂ（９７.４ｋｄ）、牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ、６６.３ｋｄ）、アルドラーゼ（４２.４ｋｄ）カル
ボニックアンヒドラーゼ (３０.０ｋｄ）、トリプシン
インヒビター (２０.１ｋｄ）、リゾチーム（１４.４ｋ
ｄ）。 この結果を図２に示す。図から明らかな通り、
本発明のＧＤＥは分子量約８３,０００に単一のバンド
を示した。
酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）により測定した。ゲル濃度は１２％を用
いた。 ５％の２−メルカプトエタノールおよび２％ Ｓ
ＤＳを含む試料用緩衝液（ｐＨ６.８）に溶解し、３分
間煮沸した。 泳動は２５ｍＡで１時間３０分行ない、
固定後銀染色試薬（第一化学社製）で蛋白質を染色し
た。 分子量マーカーは第一化学社製を用いた。 ホスホ
リラーゼ Ｂ（９７.４ｋｄ）、牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ、６６.３ｋｄ）、アルドラーゼ（４２.４ｋｄ）カル
ボニックアンヒドラーゼ (３０.０ｋｄ）、トリプシン
インヒビター (２０.１ｋｄ）、リゾチーム（１４.４ｋ
ｄ）。 この結果を図２に示す。図から明らかな通り、
本発明のＧＤＥは分子量約８３,０００に単一のバンド
を示した。
【００３９】（ｂ）精製酵素の酵素阻害性剤感受性の測
定 実施例３に従って精製したＧＤＥに対する種々の阻害剤
の影響を調べたところ、表１に示す結果になった。
定 実施例３に従って精製したＧＤＥに対する種々の阻害剤
の影響を調べたところ、表１に示す結果になった。
【００４０】実 施 例 ５. 本発明ＧＤＥのＮ−末端近傍のアミノ酸配列と内部配
列：実施例３で得た精製ＧＤＥを気相式プロテインシー
ケンサー４７３Ａ（アプライド・バイオシステムズ社
製）を用いてエドマン分解を行ない、得られたＰＴＨ−
アミノ酸を同定したが、Ｎ−末端がブロックされてお
り、有用な結果を得ることが出来なかった。 そこでこ
の精製品を常法に従い、４−ビニルピリジンを加えて還
元Ｓ−ピリジルエチル化し、これを０.１Ｍ炭酸水素ナ
トリウム（ｐＨ８.５）に溶解し、リシルエンドペプチ
ダーゼ（和光純薬工業社製）を０.１μｇ加え、３７℃
で２０時間反応させた。 反応後これに１０％ＴＦＡを
加え、ｐＨを２付近に調整した後、逆相ＨＰＬＣにてＣ
１８カラム（Ｖｙｄａｃ社製）でペプチド断片を分離精
製し、上述のプロテインシーケンサーを用いてアミノ酸
内部配列を解析した。 その結果５箇所の部分アミノ酸
配列（後記配列表中、配列番号３〜７）が明らかになっ
た。
列：実施例３で得た精製ＧＤＥを気相式プロテインシー
ケンサー４７３Ａ（アプライド・バイオシステムズ社
製）を用いてエドマン分解を行ない、得られたＰＴＨ−
アミノ酸を同定したが、Ｎ−末端がブロックされてお
り、有用な結果を得ることが出来なかった。 そこでこ
の精製品を常法に従い、４−ビニルピリジンを加えて還
元Ｓ−ピリジルエチル化し、これを０.１Ｍ炭酸水素ナ
トリウム（ｐＨ８.５）に溶解し、リシルエンドペプチ
ダーゼ（和光純薬工業社製）を０.１μｇ加え、３７℃
で２０時間反応させた。 反応後これに１０％ＴＦＡを
加え、ｐＨを２付近に調整した後、逆相ＨＰＬＣにてＣ
１８カラム（Ｖｙｄａｃ社製）でペプチド断片を分離精
製し、上述のプロテインシーケンサーを用いてアミノ酸
内部配列を解析した。 その結果５箇所の部分アミノ酸
配列（後記配列表中、配列番号３〜７）が明らかになっ
た。
【００４１】実 施 例 ６. 本発明のＧＤＥに対する特異ポリクロナール抗体および
部分アミノ酸配列に体するポリクローナル抗体の作製方
法：単一に精製したＧＤＥをリシルエンドペプチダーゼ
にて消化し、ＨＰＬＣで分離したペプチド断片のアミノ
酸配列をペプチド合成機を用いて合成した。 精製した
ＧＤＥと合成ペプチド（ｐｅｐ.２１とｐｅｐ.３８）と
を二価性架橋試薬ＭＢＳを用いて常法通りに牛血清アル
ブミンと結合させ、フロイントアジュバントとミセルを
作製し、家兎に免疫した。 約４週後抗血清を得た。 抗
血清を固定化牛血清アルブミンカラム、ついでプロテイ
ンＡカラムに添加して、精製抗体（ＧＤＥ抗体、抗ｐｅ
ｐ.２１抗体および抗ｐｅｐ.３８抗体）を得た。
部分アミノ酸配列に体するポリクローナル抗体の作製方
法：単一に精製したＧＤＥをリシルエンドペプチダーゼ
にて消化し、ＨＰＬＣで分離したペプチド断片のアミノ
酸配列をペプチド合成機を用いて合成した。 精製した
ＧＤＥと合成ペプチド（ｐｅｐ.２１とｐｅｐ.３８）と
を二価性架橋試薬ＭＢＳを用いて常法通りに牛血清アル
ブミンと結合させ、フロイントアジュバントとミセルを
作製し、家兎に免疫した。 約４週後抗血清を得た。 抗
血清を固定化牛血清アルブミンカラム、ついでプロテイ
ンＡカラムに添加して、精製抗体（ＧＤＥ抗体、抗ｐｅ
ｐ.２１抗体および抗ｐｅｐ.３８抗体）を得た。
【００４２】実 施 例 ７. ヒトＧＤＥ遺伝子のクローニング： （１） ＨＰＣ−ＹＯ ｍＲＮＡの調製 ＨＰＣ−ＹＯ ｍＲＮＡの調製は、ピッカトラップ シス
テム１０００（東洋インキ製造）を用いて行った。ＨＰ
Ｃ−ＹＯ約２×１０8 細胞のペレットに１ｍｌの抽出用
緩衝液［４Ｍ グアニジンチオシアネート、２５ｍＭ ク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７.１）］を加え、ホモジナイ
ズし、あらかじめ用意しておいた８ｍｌの希釈用緩衝液
（６×ＳＳＣ溶液、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７.４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.２５％ＳＤＳ）と１７
４μｌの２−メルカプトエタノールとの混合液を加え撹
拌した。
テム１０００（東洋インキ製造）を用いて行った。ＨＰ
Ｃ−ＹＯ約２×１０8 細胞のペレットに１ｍｌの抽出用
緩衝液［４Ｍ グアニジンチオシアネート、２５ｍＭ ク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７.１）］を加え、ホモジナイ
ズし、あらかじめ用意しておいた８ｍｌの希釈用緩衝液
（６×ＳＳＣ溶液、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７.４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.２５％ＳＤＳ）と１７
４μｌの２−メルカプトエタノールとの混合液を加え撹
拌した。
【００４３】１０ｍｌのビオチン化オリゴｄＴプローブ
を加え、７０℃で５分間加熱後、ライセートを１１,０
００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心し上清を回収した。
この上清をＳＡ−ＰＭＰｓ（ストレプトアビジン−パラ
マグネティック パーティクル）溶液に加え、撹拌後、
室温で２分間放置し磁気スタンドにてＳＡ−ＰＭＰｓ沈
殿物を回収した。 この沈殿物に１ｍｌの０.５×ＳＳＣ
溶液を加え、撹拌後、遠心チューブに移し磁気スタンド
にてＳＡ−ＰＭＰｓを回収した。 この操作を更に２回
繰り返し上清はできる限り除いた。 次に、この沈殿物
に５００μｌのヌクレアーゼ−フリー蒸留水を加え、撹
拌後、磁気スタンドにてＳＡ−ＰＭＰｓを集め上清を回
収した。
を加え、７０℃で５分間加熱後、ライセートを１１,０
００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心し上清を回収した。
この上清をＳＡ−ＰＭＰｓ（ストレプトアビジン−パラ
マグネティック パーティクル）溶液に加え、撹拌後、
室温で２分間放置し磁気スタンドにてＳＡ−ＰＭＰｓ沈
殿物を回収した。 この沈殿物に１ｍｌの０.５×ＳＳＣ
溶液を加え、撹拌後、遠心チューブに移し磁気スタンド
にてＳＡ−ＰＭＰｓを回収した。 この操作を更に２回
繰り返し上清はできる限り除いた。 次に、この沈殿物
に５００μｌのヌクレアーゼ−フリー蒸留水を加え、撹
拌後、磁気スタンドにてＳＡ−ＰＭＰｓを集め上清を回
収した。
【００４４】この溶液に５０μｌの３Ｍ 酢酸ナトリウ
ム、５００μｌのイソプロパノールを加え、−２０℃で
１時間放置後、１５,０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠
心し、その沈殿物を５００μｌの７０％エタノールで洗
った。 遠心沈殿物を軽く風乾後、３０μｌのＲＮａｓ
ｅ−フリー蒸留水にて溶解し、約１５μｇのｐｏｌｙＡ
+ＲＮＡを得た。
ム、５００μｌのイソプロパノールを加え、−２０℃で
１時間放置後、１５,０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠
心し、その沈殿物を５００μｌの７０％エタノールで洗
った。 遠心沈殿物を軽く風乾後、３０μｌのＲＮａｓ
ｅ−フリー蒸留水にて溶解し、約１５μｇのｐｏｌｙＡ
+ＲＮＡを得た。
【００４５】（２） ｃＤＮＡライブラリーの調製 ｃＤＮＡライブラリーの調製は、タイム・セーバー Ｄ
ＮＡ 合成キット（Timesaver DNA Synthesis Kit；ファ
ルマシア社）を用いて行った。
ＮＡ 合成キット（Timesaver DNA Synthesis Kit；ファ
ルマシア社）を用いて行った。
【００４６】＜工程１＞ cＤＮＡの合成： ＨＰＣ−ＹＯｍＲＮＡ１０μｌ（約５μｇ）にＤＥＰＣ
（ジエチルピロカーボネート）で処理した蒸留水を１０
μｌ加え６５℃で１０分間熱した後、氷中につけた。フ
ァースト・ストランド・リアクション・ミクスチュア
（First strand reaction mix）にＤＴＴ溶液１μｌ、
ＮｏｔＩ−オリゴ ｄＴ１８プライマー １μｌ、先の熱
変性ｍＲＮＡ ２０μｌを加え、３７℃で１時間反応さ
せた。
（ジエチルピロカーボネート）で処理した蒸留水を１０
μｌ加え６５℃で１０分間熱した後、氷中につけた。フ
ァースト・ストランド・リアクション・ミクスチュア
（First strand reaction mix）にＤＴＴ溶液１μｌ、
ＮｏｔＩ−オリゴ ｄＴ１８プライマー １μｌ、先の熱
変性ｍＲＮＡ ２０μｌを加え、３７℃で１時間反応さ
せた。
【００４７】次に、この反応液にセカンド・ストランド
・リアクション・ミクスチュア（Second strand reacti
on mix）を加え、１２℃で３０分間、続いて２２℃で１
時間反応後、６５℃で１０分間熱処理した。この溶液に
１００μｌのフェノール／クロロホルム（１：１）を加
え、撹拌後、１２,０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清
をセファクリルＳ−４００スピンカラムにのせ１,５０
０ｒｐｍで２分間遠心し溶出液を回収した。
・リアクション・ミクスチュア（Second strand reacti
on mix）を加え、１２℃で３０分間、続いて２２℃で１
時間反応後、６５℃で１０分間熱処理した。この溶液に
１００μｌのフェノール／クロロホルム（１：１）を加
え、撹拌後、１２,０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清
をセファクリルＳ−４００スピンカラムにのせ１,５０
０ｒｐｍで２分間遠心し溶出液を回収した。
【００４８】＜工程２＞ ＥｃｏＲＩアダプターの付加 工程１の溶出液にＥｃｏＲＩアダプター溶液５μｌ、ポ
リエチレングリコール溶液３０μｌ、１／５希釈ＡＴＰ
溶液 １μｌ、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ１μｌを加え、１６℃
にて１時間反応後、６５℃で１０分間の熱処理にてリガ
ーゼを失活させた。 この溶液に１.５μｌ ポリヌクレ
オチドキナーゼ溶液を加え、３７℃で３０分間反応後、
６５℃で１０分間の熱処理にてキナーゼを失活させた。
リエチレングリコール溶液３０μｌ、１／５希釈ＡＴＰ
溶液 １μｌ、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ１μｌを加え、１６℃
にて１時間反応後、６５℃で１０分間の熱処理にてリガ
ーゼを失活させた。 この溶液に１.５μｌ ポリヌクレ
オチドキナーゼ溶液を加え、３７℃で３０分間反応後、
６５℃で１０分間の熱処理にてキナーゼを失活させた。
【００４９】＜工程３＞ 制限酵素ＮｏｔＩによる切断 工程２の反応液にＮｏｔＩ（８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を２
μｌ加え、３７℃で１時間反応後、フェノール／クロロ
ホルム（１：１）抽出を行い、上清をセファクリルＳ−
４００スピンカラムで分離し溶出液を回収した。
μｌ加え、３７℃で１時間反応後、フェノール／クロロ
ホルム（１：１）抽出を行い、上清をセファクリルＳ−
４００スピンカラムで分離し溶出液を回収した。
【００５０】＜工程４＞ 酢酸カリウムによるｃＤＮＡ
のサイズ分画 濃度勾配作製装置の補給槽に５％酢酸カリウム、２ｍＭ
のＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液を２.４
ｍｌ、混合槽に２０％酢酸カリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、
１ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液を２.４ｍｌそれぞれ
入れ、５ｍｌ遠心チューブ（ベックマン社製 １３×５
１ｍｍ）に酢酸カリウムのグラジエント溶液を調製し
た。
のサイズ分画 濃度勾配作製装置の補給槽に５％酢酸カリウム、２ｍＭ
のＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液を２.４
ｍｌ、混合槽に２０％酢酸カリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、
１ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液を２.４ｍｌそれぞれ
入れ、５ｍｌ遠心チューブ（ベックマン社製 １３×５
１ｍｍ）に酢酸カリウムのグラジエント溶液を調製し
た。
【００５１】このグラジエントチューブに工程３で得た
ｃＤＮＡ８０μｌとλＤＮＡのＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄII
I二重消化物（８０μｇ／２８６μｌ）２０μｌとの混
合物を重層し、ＳＷ５５Ｔｉローターを用いて２５℃で
５５,０００ｒｐｍにて３時間遠心した。 遠心後、ペリ
スタポンプにて１１分画に分け、各々をエタノール沈殿
後、ＤＮＡを軽く乾燥させライゲーション溶液［６６ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、０.１ｍＭ スペル
ミジン、６.６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭＤＴＴ、１５
０ｍＭ ＮａＣｌ］１０μｌに溶解した。 そのうち２μ
ｌを用いて２％アガロースゲル電気泳動後、２Ｋｂより
大きなバンドの現れる画分（３画分）を集めた。
ｃＤＮＡ８０μｌとλＤＮＡのＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄII
I二重消化物（８０μｇ／２８６μｌ）２０μｌとの混
合物を重層し、ＳＷ５５Ｔｉローターを用いて２５℃で
５５,０００ｒｐｍにて３時間遠心した。 遠心後、ペリ
スタポンプにて１１分画に分け、各々をエタノール沈殿
後、ＤＮＡを軽く乾燥させライゲーション溶液［６６ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、０.１ｍＭ スペル
ミジン、６.６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭＤＴＴ、１５
０ｍＭ ＮａＣｌ］１０μｌに溶解した。 そのうち２μ
ｌを用いて２％アガロースゲル電気泳動後、２Ｋｂより
大きなバンドの現れる画分（３画分）を集めた。
【００５２】＜工程５＞ λベクターとのライゲーショ
ン サイズ分画したｃＤＮＡ溶液１０μｌ、５μｌ、２.５
μｌに、λＥｘＣｅｌｌベクター２μｇを各々加え、各
々の総量が１９μｌになるようライゲーション溶液で調
製した後、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７.０）１μｌ、
エタノール５０μｌを加え、−７０℃で２０分間放置
後、１５,０００ｒｐｍで１０分間遠心し沈殿物を回収
した。 この沈殿物にライゲーション溶液 ８μｌ、１／
２０希釈ＡＴＰ溶液 １μｌ、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ １μ
ｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。
ン サイズ分画したｃＤＮＡ溶液１０μｌ、５μｌ、２.５
μｌに、λＥｘＣｅｌｌベクター２μｇを各々加え、各
々の総量が１９μｌになるようライゲーション溶液で調
製した後、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７.０）１μｌ、
エタノール５０μｌを加え、−７０℃で２０分間放置
後、１５,０００ｒｐｍで１０分間遠心し沈殿物を回収
した。 この沈殿物にライゲーション溶液 ８μｌ、１／
２０希釈ＡＴＰ溶液 １μｌ、Ｔ4ＤＮＡリガーゼ １μ
ｌを加え、１６℃で３０分間反応させた。
【００５３】＜工程６＞ インビトロ・パッケージング
反応 インビトロ・パッケージング反応は、ギガ パック II
ゴールド（Giga pack II gold；ストラタジーン社）を
用いて行った。フリーズ／ソー エクストラクト（Freez
e/thaw extract）にライゲーション溶液を５μｌ加えて
すぐにソニック エクストラクト（Sonic extract）を１
５μｌ加え、ゆっくりと撹拌し氷中につけた。 その
後、２２℃で２時間インビトロ・パッケージング反応を
行った後、ＳＭ緩衝液［１２５ｍＭ ＮａＣｌ、０.２
５ｍＭ ＭｇＳＯ4、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７.５）、０.０１％ ゲラチン］５００μｌ、クロロホ
ルム ２０μｌを加えて１,５００ｒｐｍで５分間室温に
て遠心し上清を回収した。
反応 インビトロ・パッケージング反応は、ギガ パック II
ゴールド（Giga pack II gold；ストラタジーン社）を
用いて行った。フリーズ／ソー エクストラクト（Freez
e/thaw extract）にライゲーション溶液を５μｌ加えて
すぐにソニック エクストラクト（Sonic extract）を１
５μｌ加え、ゆっくりと撹拌し氷中につけた。 その
後、２２℃で２時間インビトロ・パッケージング反応を
行った後、ＳＭ緩衝液［１２５ｍＭ ＮａＣｌ、０.２
５ｍＭ ＭｇＳＯ4、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７.５）、０.０１％ ゲラチン］５００μｌ、クロロホ
ルム ２０μｌを加えて１,５００ｒｐｍで５分間室温に
て遠心し上清を回収した。
【００５４】＜工程７＞ ファージ力価の測定 大腸菌Ｙ１０９０ｒ- ［△（ｌａｃＵ１６９）、ｐｒｏ
Ａ+ △（ｌｏｎ）、ａｒａＤ１３９、ｓｔｒＡ、ｓｕｐ
Ｆ、ｈｓｄＲ、ｔｒｐＣ２２：：Ｔｎ１０（ｔｅｔ
r ）、［ｐＭＣ９ａｍｐr ｔｅｔr ］、ｍｃｒＢ］２０
０μｌの一夜培養液に、工程６で得たファージ懸濁液の
１μｌと１０μｌとを、それぞれ３７℃で２０分間吸着
させた後、３ｍｌのＬＢ Ｔｏｐ アガー（０.７％）を
加え、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレ
ートにまいて３７℃で一夜培養し、ファージ力価を測定
した。
Ａ+ △（ｌｏｎ）、ａｒａＤ１３９、ｓｔｒＡ、ｓｕｐ
Ｆ、ｈｓｄＲ、ｔｒｐＣ２２：：Ｔｎ１０（ｔｅｔ
r ）、［ｐＭＣ９ａｍｐr ｔｅｔr ］、ｍｃｒＢ］２０
０μｌの一夜培養液に、工程６で得たファージ懸濁液の
１μｌと１０μｌとを、それぞれ３７℃で２０分間吸着
させた後、３ｍｌのＬＢ Ｔｏｐ アガー（０.７％）を
加え、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレ
ートにまいて３７℃で一夜培養し、ファージ力価を測定
した。
【００５５】（３）ヒトＧＤＥ遺伝子の抗体スクリーニ
ング 約１２万クローンのＨＰＣ−ＹＯ cＤＮＡライブラリー
を抗ｐｅｐ.３８抗体を用いて抗体スクリーニングを行
った。 その結果、約２００万個のプラークから計６１
個の陽性クローンを得た。次に、Ｍ１３ フォワードプ
ライマー（５'−ＧＴＴ ＴＴＣ ＣＣＡＧ ＴＣ ＡＣＧ
ＡＣ−３'）とＭ１３ リバースプライマー（５'−ＣＡ
Ｇ ＧＡＡ ＡＣＡＧＣＴ ＡＴＧ ＡＣ−３'）でＰＣＲ
を行い、挿入ＤＮＡ断片を増幅させた。
ング 約１２万クローンのＨＰＣ−ＹＯ cＤＮＡライブラリー
を抗ｐｅｐ.３８抗体を用いて抗体スクリーニングを行
った。 その結果、約２００万個のプラークから計６１
個の陽性クローンを得た。次に、Ｍ１３ フォワードプ
ライマー（５'−ＧＴＴ ＴＴＣ ＣＣＡＧ ＴＣ ＡＣＧ
ＡＣ−３'）とＭ１３ リバースプライマー（５'−ＣＡ
Ｇ ＧＡＡ ＡＣＡＧＣＴ ＡＴＧ ＡＣ−３'）でＰＣＲ
を行い、挿入ＤＮＡ断片を増幅させた。
【００５６】ｐｅｐ.３８のアミノ酸配列、ＹＤＤＴＹ
Ｋに相当するＤＮＡ配列の混合プローブ［５'−ＴＡ
（Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＡＣ（Ｃ／Ａ
／Ｔ／Ｇ）ＴＡ（Ｃ／Ｔ）ＡＡ−３'］を用いてサザン
ハイブリダイゼーションを行った結果、６１個のうち７
個の陽性クローンを得た。 更に、挿入ＤＮＡ断片の大
きさを調べ、最長のクローンλＧＤＥ＃４−２（約２.
８Ｋｂ）を選び以下の解析を行った。
Ｋに相当するＤＮＡ配列の混合プローブ［５'−ＴＡ
（Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＡＣ（Ｃ／Ａ
／Ｔ／Ｇ）ＴＡ（Ｃ／Ｔ）ＡＡ−３'］を用いてサザン
ハイブリダイゼーションを行った結果、６１個のうち７
個の陽性クローンを得た。 更に、挿入ＤＮＡ断片の大
きさを調べ、最長のクローンλＧＤＥ＃４−２（約２.
８Ｋｂ）を選び以下の解析を行った。
【００５７】（４）ヒトＧＤＥ遺伝子の塩基配列の決定 λＧＤＥ＃４−２クローンを用いてヒトＧＤＥ遺伝子の
一次構造決定を行った。 その結果を図３〜６に示し
た。
一次構造決定を行った。 その結果を図３〜６に示し
た。
【００５８】（５）塩基配列の特徴 λＧＤＥ＃４−２の挿入部分であるｃＤＮＡの全長は
２,７５８ｂｐで、９９ｂｐの５'非翻訳領域、２,５９
２ｂｐのＧＤＥ翻訳領域、６７ｂｐの３'非翻訳領域か
ら成り、このクローンはポリＡ領域を欠失していた。
ＧＤＥ翻訳領域にはＧＤＥ蛋白質の精製の部で明らかに
なっていた部分アミノ酸配列５種の全てが含まれてお
り、アミノ酸８６４残基、その推定分子量は９６.８ｋ
Ｄａであった。 図７にそのハイドロパシー・プロフィ
ール（Hydropathy profile）を示した。 また、シグナ
ル配列の領域以外にはＣｙｓ残基が１個も含まれていな
い。 また、Ｇｅｎｂａｎｋ（ｖｅｒｓｉｏｎ ８２.
０）及びＥＭＢＬ（ｖｅｒｓｉｏｎ３８.０）データベ
ース検索の結果から新規な蛋白質であることがわかっ
た。
２,７５８ｂｐで、９９ｂｐの５'非翻訳領域、２,５９
２ｂｐのＧＤＥ翻訳領域、６７ｂｐの３'非翻訳領域か
ら成り、このクローンはポリＡ領域を欠失していた。
ＧＤＥ翻訳領域にはＧＤＥ蛋白質の精製の部で明らかに
なっていた部分アミノ酸配列５種の全てが含まれてお
り、アミノ酸８６４残基、その推定分子量は９６.８ｋ
Ｄａであった。 図７にそのハイドロパシー・プロフィ
ール（Hydropathy profile）を示した。 また、シグナ
ル配列の領域以外にはＣｙｓ残基が１個も含まれていな
い。 また、Ｇｅｎｂａｎｋ（ｖｅｒｓｉｏｎ ８２.
０）及びＥＭＢＬ（ｖｅｒｓｉｏｎ３８.０）データベ
ース検索の結果から新規な蛋白質であることがわかっ
た。
【００５９】実 施 例 ８. 発現プラスミドの構築：λＧＤＥ＃４−２をテンプレー
トに翻訳領域をはさむように設計したＭｌｕＩ制限酵素
部位を付加したプライマーＧＤＥ１１２（５'−ＡＣＴ
ＧＡＣ ＧＣＧＴＧＴ ＡＧＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＡＡＧ Ａ
ＧＡ ＧＡＡ ＴＧ−３'）とＳａｌＩ制限酵素部位を付
加したプライマーＧＤＥ１１３（５'−ＡＣＧ ＣＧＴ
ＣＧＡ ＣＴＧ ＴＴＴ ＴＴＴ ＡＴＴ ＡＴＴ ＣＡＣ
ＣＧＴ ＡＡＴ Ａ−３'）にてＰＣＲを行い、その産物
をＭｌｕＩとＳａｌＩで消化後、約２.６ＫｂのＤＮＡ
断片を単離・精製した。
トに翻訳領域をはさむように設計したＭｌｕＩ制限酵素
部位を付加したプライマーＧＤＥ１１２（５'−ＡＣＴ
ＧＡＣ ＧＣＧＴＧＴ ＡＧＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＡＡＧ Ａ
ＧＡ ＧＡＡ ＴＧ−３'）とＳａｌＩ制限酵素部位を付
加したプライマーＧＤＥ１１３（５'−ＡＣＧ ＣＧＴ
ＣＧＡ ＣＴＧ ＴＴＴ ＴＴＴ ＡＴＴ ＡＴＴ ＣＡＣ
ＣＧＴ ＡＡＴ Ａ−３'）にてＰＣＲを行い、その産物
をＭｌｕＩとＳａｌＩで消化後、約２.６ＫｂのＤＮＡ
断片を単離・精製した。
【００６０】同様に、ＳＶ４０プロモーターをもつｐＫ
ＣＲベクター由来ｐＫＤＥＭＳＳベクターをＭｌｕＩと
ＳａｌＩにて消化し、ベクターＤＮＡ断片（約６.４Ｋ
ｂ）をアガロースゲル電気泳動にて単離・精製した。
次に、常法に従いヒトＧＤＥ翻訳領域を含むＤＮＡ断片
とｐＫＤＥＭＳＳベクターＤＮＡ 断片をライゲート
し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させて出てきたコロニ
ーをＰＣＲ法により解析して目的とする組換え型ヒトＧ
ＤＥ発現プラスミドｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２
（図８）を得た。
ＣＲベクター由来ｐＫＤＥＭＳＳベクターをＭｌｕＩと
ＳａｌＩにて消化し、ベクターＤＮＡ断片（約６.４Ｋ
ｂ）をアガロースゲル電気泳動にて単離・精製した。
次に、常法に従いヒトＧＤＥ翻訳領域を含むＤＮＡ断片
とｐＫＤＥＭＳＳベクターＤＮＡ 断片をライゲート
し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させて出てきたコロニ
ーをＰＣＲ法により解析して目的とする組換え型ヒトＧ
ＤＥ発現プラスミドｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２
（図８）を得た。
【００６１】実 施 例 ９. ヒトＧＤＥ組換え体の発現と解析： （１）ＣＯＳ７細胞を用いた組換え型ヒトＧＤＥ遺伝子
の発現 ヒトＧＤＥ組換え体ｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２の
２μｇと、リポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）
２μｌを使用し、３.５ｃｍ ｄｉｓｈで培養したＣＯＳ
７細胞（約３×１０5 細胞）を形質転換した。 Ｈａｍ'
ｓ Ｆ−１２培地 ５ｍｌを用い、３７℃、５％ＣＯ2 中
で７２時間培養後、その培養上清を回収し、セントリコ
ン１０（アミコン）により約３５０μｌに濃縮した。
の発現 ヒトＧＤＥ組換え体ｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２の
２μｇと、リポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）
２μｌを使用し、３.５ｃｍ ｄｉｓｈで培養したＣＯＳ
７細胞（約３×１０5 細胞）を形質転換した。 Ｈａｍ'
ｓ Ｆ−１２培地 ５ｍｌを用い、３７℃、５％ＣＯ2 中
で７２時間培養後、その培養上清を回収し、セントリコ
ン１０（アミコン）により約３５０μｌに濃縮した。
【００６２】次に、実施例６で作成した３種類の抗血清
を用いてＨＰＣ−ＹＯ細胞の培養上清、ＧＤＥ精製品、
ヒトＧＤＥ遺伝子を導入したＣＯＳ７細胞の培養上清を
それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、ウェスタン・ブロ
ット解析をした。 いずれの抗血清も全く同じ反応を示
した（図９）。
を用いてＨＰＣ−ＹＯ細胞の培養上清、ＧＤＥ精製品、
ヒトＧＤＥ遺伝子を導入したＣＯＳ７細胞の培養上清を
それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ない、ウェスタン・ブロ
ット解析をした。 いずれの抗血清も全く同じ反応を示
した（図９）。
【００６３】（２）ＣＯＳ１細胞を用いた組換え型ヒト
ＧＤＥ蛋白質の活性 ヒトＧＤＥ組換え体ｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２の
１μｇ、２μｇ、３μｇ及びそのベクターであるｐＫＤ
ＥＭＳＳ ２μｇをリポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ−
ＢＲＬ）各々２５μｌずつ使用し、３.５ｃｍ ｄｉｓｈ
で培養したＣＯＳ１細胞（約３×１０5 細胞）を形質転
換した。１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−
ＢＲＬ）培地２ｍｌで３７℃、５％ＣＯ2 中７２時間培
養後、その培養上清を回収した。
ＧＤＥ蛋白質の活性 ヒトＧＤＥ組換え体ｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２の
１μｇ、２μｇ、３μｇ及びそのベクターであるｐＫＤ
ＥＭＳＳ ２μｇをリポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ−
ＢＲＬ）各々２５μｌずつ使用し、３.５ｃｍ ｄｉｓｈ
で培養したＣＯＳ１細胞（約３×１０5 細胞）を形質転
換した。１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−
ＢＲＬ）培地２ｍｌで３７℃、５％ＣＯ2 中７２時間培
養後、その培養上清を回収した。
【００６４】次に、５μｇのグルカゴンに上記培養上清
を５μｌずつ加え３７℃で１時間反応後、キャピラリー
電気泳動にて２０ｋＶ、２０分間泳動させた。 その結
果、１μｇ、２μｇのｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２
で形質転換した上清ではｐＫＤＥＭＳＳベクターのみの
培養上清と同様にグルカゴンの分解が認められなかった
が、３μｇのｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２で形質転
換した培養上清では図１０に示すようにグルカゴンの分
解が認められ、ヒトＧＤＥ蛋白質が活性を持って発現し
ていることが確認された。
を５μｌずつ加え３７℃で１時間反応後、キャピラリー
電気泳動にて２０ｋＶ、２０分間泳動させた。 その結
果、１μｇ、２μｇのｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２
で形質転換した上清ではｐＫＤＥＭＳＳベクターのみの
培養上清と同様にグルカゴンの分解が認められなかった
が、３μｇのｐＫＤＥＭＳＳ／ＧＤＥ＃４−２で形質転
換した培養上清では図１０に示すようにグルカゴンの分
解が認められ、ヒトＧＤＥ蛋白質が活性を持って発現し
ていることが確認された。
【００６５】
配列番号： １ 配列の長さ： ８６４ 配列の型： アミノ酸 アミノ酸配列の種類： ペプチド ペプチド起源： ヒト膵臓癌腫瘍細胞由来の株化細胞Ｈ
ＰＣ−ＹＯ 配列：ＭＫＫＩＴＴＬＩＶＡＶＦＬＬＬＦＶＶＡＣＴＰ
ＮＮＳＤＧＫＬＴＶＴＦＤＴＫＧＧＳＰＶＥＰＩＫＶＤ
ＫＮＧＬＩＥＡＰＡＤＰＮＫＥＧＦＶＦＲＹＷＹＴＴＮ
ＥＮＶＡＦＳＦＤＴＰＩＴＳＮＩＴＬＮＡＳＷＤＤＥＡ
ＮＰＴＤＩＡＴＩＴＡＭＩＮＥＤＩＤＡＶＧＥＱＬＹＫ
ＴＹＹＤＬＳＬＬＳＫＧＰＩＮＮＳＶＩＳＷＳＳＡＮＫ
ＹＶＳＮＴＧＩＩＬＰＬＬＤＧＥＳＥＤＴＴＬＩＴＧＫ
ＦＶＬＮＧＶＴＩＮＨＥＦＤＶＤＬＹＱＮＫＤＶＥＬＥ
ＤＲＲＴＶＰＦＫＮＬＴＥＥＹＤＶＳＤＧＥＩＥＬＬＹ
ＥＫＧＧＳＶＰＹＶＲＶＥＤＦＭＫＬＬＴＧＦＩＤＰＡ
ＬＤＩＴＹＥＴＮＤＴＳＬＹＩＱＹＤＹＹＤＥＤＥＤＫ
ＴＹＤＬＮＶＴＩＤＴＶＴＮＴＬＶＡＰＤＡＧＦＹＷＧ
ＹＶＹＳＴＡＴＮＦＧＲＨＩＴＹＤＲＥＮＰＨＡＨＹＴ
ＥＧＶＤＶＶＹＤＬＳＫＹＮＭＤＩＶＬＦＥＧＤＶＶＬ
ＰＹＹＭＡＮＱＬＦＡＧＳＳＹＹＮＶＹＹＮＹＤＧＬＦ
ＧＶＹＳＬＰＳＥＧＥＤＡＹＥＴＩＲＴＳＴＫＮＮＴＡ
ＬＰＴＤＬＴＩＨＴＦＮＦＬＡＦＳＭＤＹＦＹＧＬＫＥ
ＬＲＥＶＥＴＹＹＤＬＬＦＥＫＲＤＳＦＬＴＲＮＡＬＲ
ＬＤＬＳＩＨＥＦＬＴＦＶＶＤＥＰＨＴＳＹＧＹＰＧＹ
ＦＮＲＡＴＹＴＧＰＳＶＴＳＬＮＤＦＧＤＲＦＫＫＷＹ
ＬＤＧＭＶＡＴＤＡＱＩＧＫＫＷＧＥＡＡＳＧＷＮＡＳ
ＧＲＤＲＫＬＹＷＦＬＤＥＡＫＴＳＡＶＬＳＬＤＧＦＳ
ＴＡＤＩＩＥＤＴＡＹＮＮＱＴＶＬＤＩＬＫＶＥＳＨＩ
ＦＰＡＭＮＧＧＳＫＹＦＹＹＮＱＳＮＨＤＮＮＶＶＥＩ
ＬＩＫＧＬＴＲＴＤＬＱＴＹＮＡＳＬＶＳＬＧＦＴＡＳ
ＡＮＮＬＴＦＴＫＥＶＤＧＬＫＹＹＡＳＴＳＹＤＤＴＹ
ＫＳＬＩＶＧＬＳＶＦＤＭＴＫＳＶＶＰＥＦＶＮＳＳＮ
ＳＬＩＫＳＤＳＡＶＦＭＥＦＹＭＤＩＩＬＳＱＴＮＮＬ
ＫＮＭＩＬＤＩＴＷＮＴＧＧＮＶＧＡＬＹＲＶＩＧＦＩ
ＴＱＮＳＦＡＶＳＳＩＳＡＤＴＫＳＮＳＴＳＹＶＫＩＥ
ＧＶＰＴＹＤＨＬＮＷＧＬＬＴＴＰＴＳＦＳＡＡＮＳＬ
ＴＴＩＦＫＥＮＮＬＧＰＩＩＧＬＴＳＧＧＧＴＳＳＩＴ
ＰＩＬＬＰＮＧＴＡＦＴＴＳＳＮＮＭＳＡＹＲＴＧＴＧ
ＴＥＡＤＰＹＶＹＨＰＮＥＦＧＩＥＰＴＨＰＩＰＩＧＮ
ＩＹＮＥＴＶＬＬＤＩＬＴＴＹＹＧＥ
ＰＣ−ＹＯ 配列：ＭＫＫＩＴＴＬＩＶＡＶＦＬＬＬＦＶＶＡＣＴＰ
ＮＮＳＤＧＫＬＴＶＴＦＤＴＫＧＧＳＰＶＥＰＩＫＶＤ
ＫＮＧＬＩＥＡＰＡＤＰＮＫＥＧＦＶＦＲＹＷＹＴＴＮ
ＥＮＶＡＦＳＦＤＴＰＩＴＳＮＩＴＬＮＡＳＷＤＤＥＡ
ＮＰＴＤＩＡＴＩＴＡＭＩＮＥＤＩＤＡＶＧＥＱＬＹＫ
ＴＹＹＤＬＳＬＬＳＫＧＰＩＮＮＳＶＩＳＷＳＳＡＮＫ
ＹＶＳＮＴＧＩＩＬＰＬＬＤＧＥＳＥＤＴＴＬＩＴＧＫ
ＦＶＬＮＧＶＴＩＮＨＥＦＤＶＤＬＹＱＮＫＤＶＥＬＥ
ＤＲＲＴＶＰＦＫＮＬＴＥＥＹＤＶＳＤＧＥＩＥＬＬＹ
ＥＫＧＧＳＶＰＹＶＲＶＥＤＦＭＫＬＬＴＧＦＩＤＰＡ
ＬＤＩＴＹＥＴＮＤＴＳＬＹＩＱＹＤＹＹＤＥＤＥＤＫ
ＴＹＤＬＮＶＴＩＤＴＶＴＮＴＬＶＡＰＤＡＧＦＹＷＧ
ＹＶＹＳＴＡＴＮＦＧＲＨＩＴＹＤＲＥＮＰＨＡＨＹＴ
ＥＧＶＤＶＶＹＤＬＳＫＹＮＭＤＩＶＬＦＥＧＤＶＶＬ
ＰＹＹＭＡＮＱＬＦＡＧＳＳＹＹＮＶＹＹＮＹＤＧＬＦ
ＧＶＹＳＬＰＳＥＧＥＤＡＹＥＴＩＲＴＳＴＫＮＮＴＡ
ＬＰＴＤＬＴＩＨＴＦＮＦＬＡＦＳＭＤＹＦＹＧＬＫＥ
ＬＲＥＶＥＴＹＹＤＬＬＦＥＫＲＤＳＦＬＴＲＮＡＬＲ
ＬＤＬＳＩＨＥＦＬＴＦＶＶＤＥＰＨＴＳＹＧＹＰＧＹ
ＦＮＲＡＴＹＴＧＰＳＶＴＳＬＮＤＦＧＤＲＦＫＫＷＹ
ＬＤＧＭＶＡＴＤＡＱＩＧＫＫＷＧＥＡＡＳＧＷＮＡＳ
ＧＲＤＲＫＬＹＷＦＬＤＥＡＫＴＳＡＶＬＳＬＤＧＦＳ
ＴＡＤＩＩＥＤＴＡＹＮＮＱＴＶＬＤＩＬＫＶＥＳＨＩ
ＦＰＡＭＮＧＧＳＫＹＦＹＹＮＱＳＮＨＤＮＮＶＶＥＩ
ＬＩＫＧＬＴＲＴＤＬＱＴＹＮＡＳＬＶＳＬＧＦＴＡＳ
ＡＮＮＬＴＦＴＫＥＶＤＧＬＫＹＹＡＳＴＳＹＤＤＴＹ
ＫＳＬＩＶＧＬＳＶＦＤＭＴＫＳＶＶＰＥＦＶＮＳＳＮ
ＳＬＩＫＳＤＳＡＶＦＭＥＦＹＭＤＩＩＬＳＱＴＮＮＬ
ＫＮＭＩＬＤＩＴＷＮＴＧＧＮＶＧＡＬＹＲＶＩＧＦＩ
ＴＱＮＳＦＡＶＳＳＩＳＡＤＴＫＳＮＳＴＳＹＶＫＩＥ
ＧＶＰＴＹＤＨＬＮＷＧＬＬＴＴＰＴＳＦＳＡＡＮＳＬ
ＴＴＩＦＫＥＮＮＬＧＰＩＩＧＬＴＳＧＧＧＴＳＳＩＴ
ＰＩＬＬＰＮＧＴＡＦＴＴＳＳＮＮＭＳＡＹＲＴＧＴＧ
ＴＥＡＤＰＹＶＹＨＰＮＥＦＧＩＥＰＴＨＰＩＰＩＧＮ
ＩＹＮＥＴＶＬＬＤＩＬＴＴＹＹＧＥ
【００６６】配列番号： ２ 配列の長さ： ２７５８ 配列の型： 核酸 核酸配列の種類： ｃＤＮＡ ｃＤＮＡ起源： ヒト膵臓癌腫瘍細胞由来の株化細胞Ｈ
ＰＣ−ＹＯ 配列： CAACATTTGT CGTTTTTTTG AAATATTATT GCTGACTAAA TAAATCAATT ATAGTAAACT 60 CTTTCCATAC CATAAATTGG GTAGAGAGGA AAAGAGAGAA TGAAAAAAAT AACTACACTC 120 ATAGTTGCTG TCTTTTTATT GTTATTTGTT GTAGCCTGCA CACCGAATAA CTCAGATGGA 180 AAGTTAACAG TAACTTTTGA TACAAAGGGT GGTTCACCTG TTGAACCAAT CAAAGTGGAT 240 AAGAATGGTT TAATTGAAGC ACCAGCTGAT CCAAATAAAG AGGGATTTGT ATTTAGATAC 300 TGGTACACAA CAAATGAAAA TGTTGCATTT TCATTTGACA CACCAATTAC GTCTAATATC 360 ACTTTAAATG CATCTTGGGA TGATGAAGCA AATCCAACTG ATATTGCTAC AATCACTGCC 420 ATGATTAATG AAGATATAGA TGCAGTAGGT GAACAATTAT ACAAAACATA TTATGACTTA 480 AGTTTACTTA GTAAGGGGCC AATTAATAAT TCAGTGATTT CATGGTCATC AGCAAACAAA 540 TATGTTTCAA ATACAGGTAT TATCTTACCG TTATTAGACG GTGAGTCAGA AGATACAACA 600 TTGATTACAG GTAAGTTTGT TTTAAACGGC GTGACAATTA ATCATGAGTT TGATGTAGAC 660 TTATATCAAA ATAAAGATGT TGAATTAGAA GATAGACGTA CAGTGCCGTT TAAAAATCTA 720 ACAGAAGAAT ATGATGTTTC AGATGGTGAG ATTGAACTTC TATATGAAAA AGGTGGTAGT 780 GTGCCTTATG TTCGTGTTGA AGATTTCATG AAGTTATTAA CTGGATTTAT TGATCCAGCA 840 CTTGATATTA CATATGAAAC AAATGACACA TCACTTTATA TTCAATATGA TTATTATGAT 900 GAAGATGAAG ATAAAACGTA TGACCTTAAT GTCACAATTG ATACTGTAAC CAATACATTG 960 GTAGCACCAG ACGCTGGTTT TTATTGGGGC TATGTGTATT CAACAGCAAC AAACTTTGGA 1020 CGCCATATTA CTTATGATAG AGAAAATCCA CACGCTCATT ATACAGAAGG CGTAGATGTT 1080 GTTTATGATT TAAGTAAATA TAATATGGAT ATTGTCTTAT TTGAAGGGGA TGTTGTTTTA 1140 CCATATTATA TGGCAAATCA ACTCTTTGCA GGATCTAGTT ATTATAATGT GTACTACAAC 1200 TATGATGGAT TATTTGGTGT ATACTCACTT CCAAGTGAAG GTGAAGATGC ATACGAAACC 1260 ATTAGAACAT CAACTAAAAA TAATACAGCA TTGCCAACAG ATCTTACAAT CCATACATTT 1320 AACTTCTTAG CATTTTCTAT GGATTATTTC TATGGTCTAA AAGAGCTACG TGAAGTTGAA 1380 ACTTATTATG ATCTATTATT TGAAAAACGC GATTCATTCT TAACAAGAAA TGCATTAAGA 1440 CTTGACTTAT CTATTCATGA ATTCTTAACG TTTGTGGTGG ATGAGCCGCA TACTTCCTAT 1500 GGTTATCCAG GATATTTTAA CCGTGCAACT TATACCGGAC CTTCTGTTAC AAGTTTAAAT 1560 GACTTTGGCG ATCGATTTAA GAAATGGTAT TTAGATGGTA TGGTAGCAAC CGATGCTCAA 1620 ATAGGTAAAA AATGGGGCGA GGCAGCAAGT GGATGGAATG CATCAGGTAG AGATAGAAAA 1680 CTTTACTGGT TCTTAGATGA AGCTAAAACA TCTGCAGTAT TATCTTTAGA TGGTTTTTCT 1740 ACTGCAGATA TTATTGAAGA TACAGCTTAT AATAATCAAA CTGTATTAGA TATCTTGAAA 1800 GTGGAAAGTC ATATATTCCC TGCAATGAAC GGTGGAAGTA AGTATTTCTA CTATAACCAA 1860 TCAAATCACG ATAATAATGT AGTGGAAATA CTAATTAAAG GATTAACTAG AACAGATTTA 1920 CAAACTTATA ATGCTTCACT TGTTAGTTTA GGGTTTACAG CATCAGCTAA TAACCTAACA 1980 TTTACTAAAG AAGTAGATGG TTTAAAATAT TATGCTTCAA CTTCTTATGA TGATACCTAT 2040 AAGTCACTCA TCGTTGGATT ATCCGTGTTT GACATGACAA AATCAGTTGT TCCTGAGTTT 2100 GTTAATAGTT CAAATTCACT AATTAAATCT GATAGTGCAG TATTTATGGA GTTTTACATG 2160 GATATCATCT TAAGTCAAAC AAATAACTTA AAAAACATGA TTTTAGATAT CACTTGGAAT 2220 ACAGGTGGTA ACGTAGGTGC ACTATATAGA GTTATAGGCT TTATCACACA AAATAGTTTT 2280 GCAGTATCAA GTATCAGTGC AGATACGAAG TCTAACTCAA CTTCATATGT AAAAATTGAA 2340 GGTGTTCCAA CATATGATCA CTTAAACTGG GGACTACTAA CAACACCAAC ATCCTTTTCA 2400 GCGGCTAACA GTTTAACTAC TATCTTTAAA GAAAACAATT TAGGTCCAAT TATTGGATTA 2460 ACATCCGGTG GTGGTACATC AAGTATTACA CCAATTCTAT TACCTAATGG TACAGCATTT 2520 ACAACCTCAT CTAATAATAT GAGTGCGTAT AGAACTGGTA CTGGTACAGA GGCAGATCCG 2580 TATGTTTATC ATCCAAATGA ATTTGGTATT GAACCAACAC ATCCAATTCC AATTGGAAAC 2640 ATCTATAATG AAACTGTATT ATTAGATATA TTAACCACAT ATTACGGTGA ATAATAAAAA 2700 ACAGGGCATA CCTTAATCGG TACGCCCTGA CTCCTTATAT ATTTTATATA GCTAGATG 2760
ＰＣ−ＹＯ 配列： CAACATTTGT CGTTTTTTTG AAATATTATT GCTGACTAAA TAAATCAATT ATAGTAAACT 60 CTTTCCATAC CATAAATTGG GTAGAGAGGA AAAGAGAGAA TGAAAAAAAT AACTACACTC 120 ATAGTTGCTG TCTTTTTATT GTTATTTGTT GTAGCCTGCA CACCGAATAA CTCAGATGGA 180 AAGTTAACAG TAACTTTTGA TACAAAGGGT GGTTCACCTG TTGAACCAAT CAAAGTGGAT 240 AAGAATGGTT TAATTGAAGC ACCAGCTGAT CCAAATAAAG AGGGATTTGT ATTTAGATAC 300 TGGTACACAA CAAATGAAAA TGTTGCATTT TCATTTGACA CACCAATTAC GTCTAATATC 360 ACTTTAAATG CATCTTGGGA TGATGAAGCA AATCCAACTG ATATTGCTAC AATCACTGCC 420 ATGATTAATG AAGATATAGA TGCAGTAGGT GAACAATTAT ACAAAACATA TTATGACTTA 480 AGTTTACTTA GTAAGGGGCC AATTAATAAT TCAGTGATTT CATGGTCATC AGCAAACAAA 540 TATGTTTCAA ATACAGGTAT TATCTTACCG TTATTAGACG GTGAGTCAGA AGATACAACA 600 TTGATTACAG GTAAGTTTGT TTTAAACGGC GTGACAATTA ATCATGAGTT TGATGTAGAC 660 TTATATCAAA ATAAAGATGT TGAATTAGAA GATAGACGTA CAGTGCCGTT TAAAAATCTA 720 ACAGAAGAAT ATGATGTTTC AGATGGTGAG ATTGAACTTC TATATGAAAA AGGTGGTAGT 780 GTGCCTTATG TTCGTGTTGA AGATTTCATG AAGTTATTAA CTGGATTTAT TGATCCAGCA 840 CTTGATATTA CATATGAAAC AAATGACACA TCACTTTATA TTCAATATGA TTATTATGAT 900 GAAGATGAAG ATAAAACGTA TGACCTTAAT GTCACAATTG ATACTGTAAC CAATACATTG 960 GTAGCACCAG ACGCTGGTTT TTATTGGGGC TATGTGTATT CAACAGCAAC AAACTTTGGA 1020 CGCCATATTA CTTATGATAG AGAAAATCCA CACGCTCATT ATACAGAAGG CGTAGATGTT 1080 GTTTATGATT TAAGTAAATA TAATATGGAT ATTGTCTTAT TTGAAGGGGA TGTTGTTTTA 1140 CCATATTATA TGGCAAATCA ACTCTTTGCA GGATCTAGTT ATTATAATGT GTACTACAAC 1200 TATGATGGAT TATTTGGTGT ATACTCACTT CCAAGTGAAG GTGAAGATGC ATACGAAACC 1260 ATTAGAACAT CAACTAAAAA TAATACAGCA TTGCCAACAG ATCTTACAAT CCATACATTT 1320 AACTTCTTAG CATTTTCTAT GGATTATTTC TATGGTCTAA AAGAGCTACG TGAAGTTGAA 1380 ACTTATTATG ATCTATTATT TGAAAAACGC GATTCATTCT TAACAAGAAA TGCATTAAGA 1440 CTTGACTTAT CTATTCATGA ATTCTTAACG TTTGTGGTGG ATGAGCCGCA TACTTCCTAT 1500 GGTTATCCAG GATATTTTAA CCGTGCAACT TATACCGGAC CTTCTGTTAC AAGTTTAAAT 1560 GACTTTGGCG ATCGATTTAA GAAATGGTAT TTAGATGGTA TGGTAGCAAC CGATGCTCAA 1620 ATAGGTAAAA AATGGGGCGA GGCAGCAAGT GGATGGAATG CATCAGGTAG AGATAGAAAA 1680 CTTTACTGGT TCTTAGATGA AGCTAAAACA TCTGCAGTAT TATCTTTAGA TGGTTTTTCT 1740 ACTGCAGATA TTATTGAAGA TACAGCTTAT AATAATCAAA CTGTATTAGA TATCTTGAAA 1800 GTGGAAAGTC ATATATTCCC TGCAATGAAC GGTGGAAGTA AGTATTTCTA CTATAACCAA 1860 TCAAATCACG ATAATAATGT AGTGGAAATA CTAATTAAAG GATTAACTAG AACAGATTTA 1920 CAAACTTATA ATGCTTCACT TGTTAGTTTA GGGTTTACAG CATCAGCTAA TAACCTAACA 1980 TTTACTAAAG AAGTAGATGG TTTAAAATAT TATGCTTCAA CTTCTTATGA TGATACCTAT 2040 AAGTCACTCA TCGTTGGATT ATCCGTGTTT GACATGACAA AATCAGTTGT TCCTGAGTTT 2100 GTTAATAGTT CAAATTCACT AATTAAATCT GATAGTGCAG TATTTATGGA GTTTTACATG 2160 GATATCATCT TAAGTCAAAC AAATAACTTA AAAAACATGA TTTTAGATAT CACTTGGAAT 2220 ACAGGTGGTA ACGTAGGTGC ACTATATAGA GTTATAGGCT TTATCACACA AAATAGTTTT 2280 GCAGTATCAA GTATCAGTGC AGATACGAAG TCTAACTCAA CTTCATATGT AAAAATTGAA 2340 GGTGTTCCAA CATATGATCA CTTAAACTGG GGACTACTAA CAACACCAAC ATCCTTTTCA 2400 GCGGCTAACA GTTTAACTAC TATCTTTAAA GAAAACAATT TAGGTCCAAT TATTGGATTA 2460 ACATCCGGTG GTGGTACATC AAGTATTACA CCAATTCTAT TACCTAATGG TACAGCATTT 2520 ACAACCTCAT CTAATAATAT GAGTGCGTAT AGAACTGGTA CTGGTACAGA GGCAGATCCG 2580 TATGTTTATC ATCCAAATGA ATTTGGTATT GAACCAACAC ATCCAATTCC AATTGGAAAC 2640 ATCTATAATG AAACTGTATT ATTAGATATA TTAACCACAT ATTACGGTGA ATAATAAAAA 2700 ACAGGGCATA CCTTAATCGG TACGCCCTGA CTCCTTATAT ATTTTATATA GCTAGATG 2760
【００６７】配列番号： ３ 配列の長さ： ８ 配列の型： アミノ酸 アミノ酸配列の種類： ペプチド ペプチド起源： ヒト膵臓癌腫瘍細胞由来の株化細胞Ｈ
ＰＣ−ＹＯ
ＰＣ−ＹＯ
【００６８】配列番号： ４ 配列の長さ： １２ 配列の型： アミノ酸 アミノ酸配列の種類： ペプチド ペプチド起源： ヒト膵臓癌腫瘍細胞由来の株化細胞Ｈ
ＰＣ−ＹＯ
ＰＣ−ＹＯ
【００６９】配列番号： ５ 配列の長さ： １９ 配列の型： アミノ酸 アミノ酸配列の種類： ペプチド ペプチド起源： ヒト膵臓癌腫瘍細胞由来の株化細胞Ｈ
ＰＣ−ＹＯ
ＰＣ−ＹＯ
【００７０】配列番号： ６ 配列の長さ： ９ 配列の型： アミノ酸 アミノ酸配列の種類： ペプチド ペプチド起源： ヒト膵臓癌腫瘍細胞由来の株化細胞Ｈ
ＰＣ−ＹＯ
ＰＣ−ＹＯ
【００７１】配列番号： ７ 配列の長さ： １５ 配列の型： アミノ酸 アミノ酸配列の種類： ペプチド ペプチド起源： ヒト膵臓癌腫瘍細胞由来の株化細胞Ｈ
ＰＣ−ＹＯ
ＰＣ−ＹＯ
【図１】 ＧＤＥの精製ステップごとの溶離パターンを
示す図面。 図中、（Ａ）はゲル濾過、（Ｂ）は陰イオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、（Ｃ）はヒドロキシ
ルアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果を示す。
示す図面。 図中、（Ａ）はゲル濾過、（Ｂ）は陰イオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、（Ｃ）はヒドロキシ
ルアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果を示す。
【図２】 ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により、ＧＤＥの分子量を測定した結果
を示す写真。
ドゲル電気泳動により、ＧＤＥの分子量を測定した結果
を示す写真。
【図３】〜
【図６】 ＧＤＥ遺伝子の一次構造を示す図面。
【図７】 ＧＤＥのハイドロパシー・プロフィールを示
す図面。
す図面。
【図８】 組換え型ヒトＧＤＥ発現プラスミドの構成を
示す図面。
示す図面。
【図９】 抗ＧＤＥ抗体を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ウ
ェスタン・ブロット解析した結果を電気泳動で示す写
真。 写真中、１はＨＰＣ−ＹＯ細胞の培養上清、２は
ＧＤＥ精製品、３はヒトＧＤＥ遺伝子を導入したＣＯＳ
７細胞の培養上清、４はＣＯＳ７の無蛋白培養物の上清
濃縮物、Ｍはマーカーを示す。
ェスタン・ブロット解析した結果を電気泳動で示す写
真。 写真中、１はＨＰＣ−ＹＯ細胞の培養上清、２は
ＧＤＥ精製品、３はヒトＧＤＥ遺伝子を導入したＣＯＳ
７細胞の培養上清、４はＣＯＳ７の無蛋白培養物の上清
濃縮物、Ｍはマーカーを示す。
【図１０】 ＧＤＥで形質転換した培養上清がグルカゴ
ン分解活性を有することを示す図面。 以 上
ン分解活性を有することを示す図面。 以 上
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 山口 希 京都府京都市北区鞍馬口通り寺町西入ル新 御霊口町285−79 (72)発明者 小山 邦彦 京都府京都市左京区高野蓼原町１の３ ル ネ下鴨東519 (72)発明者 今西 二郎 京都府京都市左京区鹿ケ谷法然院西町38の ２
Claims (9)
- 【請求項１】 下記の酵素学的性質を有するグルカゴン
分解酵素。 （１）作用：グルカゴン、バソアクティブ・インテステ
ィナル・ペプタイド（Vasoactive Intestinal Peptid
e）およびセクレチンを基質とし、それぞれ下記の矢印
に示すペプチド結合を加水分解する。 【化１】 （２）基質特異性：グルカゴン、バソアクティブ・イン
テスティナル・ペプタイド及びセクレチンを加水分解す
る。 （３）等電点：ｐＩ ６.８ （４）阻害剤：酵素反応は１ｍＭのアンチパインによっ
て阻害されるが、１ｍＭのロイペプチンによっても、
０.１ｍＭのペプスタチンによっても阻害されない。 （５）分子量：８３ｋＤａ（ＳＤＳ電気泳動動法によ
る） （６）以下のペプチドフラグメントを有する： （i） ＳＮＳＴＳＹＶＫ （ii） ＹＹＡＳＴＳＹＤＤＴＹＫ （iii）ＮＬＴＥＥＹＤＶＳＤＧＥＩＥＬＬＹＥＫ （iv） ＬＹＷＦＬＤＥＡＫ （v） ＥＬＲＥＶＥＴＹＹＤＬＬＦＥＫ - 【請求項２】 少なくとも次の式、 ＭＫＫＩＴＴＬＩＶＡＶＦＬＬＬＦＶＶＡＣＴＰＮＮＳ
ＤＧＫＬＴＶＴＦＤＴＫＧＧＳＰＶＥＰＩＫＶＤＫＮＧ
ＬＩＥＡＰＡＤＰＮＫＥＧＦＶＦＲＹＷＹＴＴＮＥＮＶ
ＡＦＳＦＤＴＰＩＴＳＮＩＴＬＮＡＳＷＤＤＥＡＮＰＴ
ＤＩＡＴＩＴＡＭＩＮＥＤＩＤＡＶＧＥＱＬＹＫＴＹＹ
ＤＬＳＬＬＳＫＧＰＩＮＮＳＶＩＳＷＳＳＡＮＫＹＶＳ
ＮＴＧＩＩＬＰＬＬＤＧＥＳＥＤＴＴＬＩＴＧＫＦＶＬ
ＮＧＶＴＩＮＨＥＦＤＶＤＬＹＱＮＫＤＶＥＬＥＤＲＲ
ＴＶＰＦＫＮＬＴＥＥＹＤＶＳＤＧＥＩＥＬＬＹＥＫＧ
ＧＳＶＰＹＶＲＶＥＤＦＭＫＬＬＴＧＦＩＤＰＡＬＤＩ
ＴＹＥＴＮＤＴＳＬＹＩＱＹＤＹＹＤＥＤＥＤＫＴＹＤ
ＬＮＶＴＩＤＴＶＴＮＴＬＶＡＰＤＡＧＦＹＷＧＹＶＹ
ＳＴＡＴＮＦＧＲＨＩＴＹＤＲＥＮＰＨＡＨＹＴＥＧＶ
ＤＶＶＹＤＬＳＫＹＮＭＤＩＶＬＦＥＧＤＶＶＬＰＹＹ
ＭＡＮＱＬＦＡＧＳＳＹＹＮＶＹＹＮＹＤＧＬＦＧＶＹ
ＳＬＰＳＥＧＥＤＡＹＥＴＩＲＴＳＴＫＮＮＴＡＬＰＴ
ＤＬＴＩＨＴＦＮＦＬＡＦＳＭＤＹＦＹＧＬＫＥＬＲＥ
ＶＥＴＹＹＤＬＬＦＥＫＲＤＳＦＬＴＲＮＡＬＲＬＤＬ
ＳＩＨＥＦＬＴＦＶＶＤＥＰＨＴＳＹＧＹＰＧＹＦＮＲ
ＡＴＹＴＧＰＳＶＴＳＬＮＤＦＧＤＲＦＫＫＷＹＬＤＧ
ＭＶＡＴＤＡＱＩＧＫＫＷＧＥＡＡＳＧＷＮＡＳＧＲＤ
ＲＫＬＹＷＦＬＤＥＡＫＴＳＡＶＬＳＬＤＧＦＳＴＡＤ
ＩＩＥＤＴＡＹＮＮＱＴＶＬＤＩＬＫＶＥＳＨＩＦＰＡ
ＭＮＧＧＳＫＹＦＹＹＮＱＳＮＨＤＮＮＶＶＥＩＬＩＫ
ＧＬＴＲＴＤＬＱＴＹＮＡＳＬＶＳＬＧＦＴＡＳＡＮＮ
ＬＴＦＴＫＥＶＤＧＬＫＹＹＡＳＴＳＹＤＤＴＹＫＳＬ
ＩＶＧＬＳＶＦＤＭＴＫＳＶＶＰＥＦＶＮＳＳＮＳＬＩ
ＫＳＤＳＡＶＦＭＥＦＹＭＤＩＩＬＳＱＴＮＮＬＫＮＭ
ＩＬＤＩＴＷＮＴＧＧＮＶＧＡＬＹＲＶＩＧＦＩＴＱＮ
ＳＦＡＶＳＳＩＳＡＤＴＫＳＮＳＴＳＹＶＫＩＥＧＶＰ
ＴＹＤＨＬＮＷＧＬＬＴＴＰＴＳＦＳＡＡＮＳＬＴＴＩ
ＦＫＥＮＮＬＧＰＩＩＧＬＴＳＧＧＧＴＳＳＩＴＰＩＬ
ＬＰＮＧＴＡＦＴＴＳＳＮＮＭＳＡＹＲＴＧＴＧＴＥＡ
ＤＰＹＶＹＨＰＮＥＦＧＩＥＰＴＨＰＩＰＩＧＮＩＹＮ
ＥＴＶＬＬＤＩＬＴＴＹＹＧＥ で表されるアミノ酸配列またはこれと相同性を有するア
ミノ酸配列を含んでなるグルカゴン分解酵素。 - 【請求項３】 請求項第１項又は第２項に記載のグルカ
ゴン分解酵素をコードするＤＮＡ。 - 【請求項４】 次の式、 CAACATTTGT CGTTTTTTTG AAATATTATT GCTGACTAAA TAAATCAATT ATAGTAAACT 60 CTTTCCATAC CATAAATTGG GTAGAGAGGA AAAGAGAGAA TGAAAAAAAT AACTACACTC 120 ATAGTTGCTG TCTTTTTATT GTTATTTGTT GTAGCCTGCA CACCGAATAA CTCAGATGGA 180 AAGTTAACAG TAACTTTTGA TACAAAGGGT GGTTCACCTG TTGAACCAAT CAAAGTGGAT 240 AAGAATGGTT TAATTGAAGC ACCAGCTGAT CCAAATAAAG AGGGATTTGT ATTTAGATAC 300 TGGTACACAA CAAATGAAAA TGTTGCATTT TCATTTGACA CACCAATTAC GTCTAATATC 360 ACTTTAAATG CATCTTGGGA TGATGAAGCA AATCCAACTG ATATTGCTAC AATCACTGCC 420 ATGATTAATG AAGATATAGA TGCAGTAGGT GAACAATTAT ACAAAACATA TTATGACTTA 480 AGTTTACTTA GTAAGGGGCC AATTAATAAT TCAGTGATTT CATGGTCATC AGCAAACAAA 540 TATGTTTCAA ATACAGGTAT TATCTTACCG TTATTAGACG GTGAGTCAGA AGATACAACA 600 TTGATTACAG GTAAGTTTGT TTTAAACGGC GTGACAATTA ATCATGAGTT TGATGTAGAC 660 TTATATCAAA ATAAAGATGT TGAATTAGAA GATAGACGTA CAGTGCCGTT TAAAAATCTA 720 ACAGAAGAAT ATGATGTTTC AGATGGTGAG ATTGAACTTC TATATGAAAA AGGTGGTAGT 780 GTGCCTTATG TTCGTGTTGA AGATTTCATG AAGTTATTAA CTGGATTTAT TGATCCAGCA 840 CTTGATATTA CATATGAAAC AAATGACACA TCACTTTATA TTCAATATGA TTATTATGAT 900 GAAGATGAAG ATAAAACGTA TGACCTTAAT GTCACAATTG ATACTGTAAC CAATACATTG 960 GTAGCACCAG ACGCTGGTTT TTATTGGGGC TATGTGTATT CAACAGCAAC AAACTTTGGA 1020 CGCCATATTA CTTATGATAG AGAAAATCCA CACGCTCATT ATACAGAAGG CGTAGATGTT 1080 GTTTATGATT TAAGTAAATA TAATATGGAT ATTGTCTTAT TTGAAGGGGA TGTTGTTTTA 1140 CCATATTATA TGGCAAATCA ACTCTTTGCA GGATCTAGTT ATTATAATGT GTACTACAAC 1200 TATGATGGAT TATTTGGTGT ATACTCACTT CCAAGTGAAG GTGAAGATGC ATACGAAACC 1260 ATTAGAACAT CAACTAAAAA TAATACAGCA TTGCCAACAG ATCTTACAAT CCATACATTT 1320 AACTTCTTAG CATTTTCTAT GGATTATTTC TATGGTCTAA AAGAGCTACG TGAAGTTGAA 1380 ACTTATTATG ATCTATTATT TGAAAAACGC GATTCATTCT TAACAAGAAA TGCATTAAGA 1440 CTTGACTTAT CTATTCATGA ATTCTTAACG TTTGTGGTGG ATGAGCCGCA TACTTCCTAT 1500 GGTTATCCAG GATATTTTAA CCGTGCAACT TATACCGGAC CTTCTGTTAC AAGTTTAAAT 1560 GACTTTGGCG ATCGATTTAA GAAATGGTAT TTAGATGGTA TGGTAGCAAC CGATGCTCAA 1620 ATAGGTAAAA AATGGGGCGA GGCAGCAAGT GGATGGAATG CATCAGGTAG AGATAGAAAA 1680 CTTTACTGGT TCTTAGATGA AGCTAAAACA TCTGCAGTAT TATCTTTAGA TGGTTTTTCT 1740 ACTGCAGATA TTATTGAAGA TACAGCTTAT AATAATCAAA CTGTATTAGA TATCTTGAAA 1800 GTGGAAAGTC ATATATTCCC TGCAATGAAC GGTGGAAGTA AGTATTTCTA CTATAACCAA 1860 TCAAATCACG ATAATAATGT AGTGGAAATA CTAATTAAAG GATTAACTAG AACAGATTTA 1920 CAAACTTATA ATGCTTCACT TGTTAGTTTA GGGTTTACAG CATCAGCTAA TAACCTAACA 1980 TTTACTAAAG AAGTAGATGG TTTAAAATAT TATGCTTCAA CTTCTTATGA TGATACCTAT 2040 AAGTCACTCA TCGTTGGATT ATCCGTGTTT GACATGACAA AATCAGTTGT TCCTGAGTTT 2100 GTTAATAGTT CAAATTCACT AATTAAATCT GATAGTGCAG TATTTATGGA GTTTTACATG 2160 GATATCATCT TAAGTCAAAC AAATAACTTA AAAAACATGA TTTTAGATAT CACTTGGAAT 2220 ACAGGTGGTA ACGTAGGTGC ACTATATAGA GTTATAGGCT TTATCACACA AAATAGTTTT 2280 GCAGTATCAA GTATCAGTGC AGATACGAAG TCTAACTCAA CTTCATATGT AAAAATTGAA 2340 GGTGTTCCAA CATATGATCA CTTAAACTGG GGACTACTAA CAACACCAAC ATCCTTTTCA 2400 GCGGCTAACA GTTTAACTAC TATCTTTAAA GAAAACAATT TAGGTCCAAT TATTGGATTA 2460 ACATCCGGTG GTGGTACATC AAGTATTACA CCAATTCTAT TACCTAATGG TACAGCATTT 2520 ACAACCTCAT CTAATAATAT GAGTGCGTAT AGAACTGGTA CTGGTACAGA GGCAGATCCG 2580 TATGTTTATC ATCCAAATGA ATTTGGTATT GAACCAACAC ATCCAATTCC AATTGGAAAC 2640 ATCTATAATG AAACTGTATT ATTAGATATA TTAACCACAT ATTACGGTGA ATAATAAAAA 2700 ACAGGGCATA CCTTAATCGG TACGCCCTGA CTCCTTATAT ATTTTATATA GCTAGATG 2760 で示される塩基配列を有する請求項３に記載のＤＮＡ。
- 【請求項５】 請求項第３項又は第４項に記載のＤＮＡ
を含んでなる発現ベクター。 - 【請求項６】 請求項第５項に記載の発現ベクターによ
り形質転換された宿主。 - 【請求項７】 請求項第１項又は第２項に記載のグルカ
ゴン分解酵素の製造方法において、ヒト膵臓癌組織由来
の腫瘍細胞を培養し、該培養物から該酵素を採取するこ
とを特徴とする方法。 - 【請求項８】 請求項第１項又は第２項に記載のグルカ
ゴン分解酵素の製造方法において、該酵素をコードする
ＤＮＡを含んでなる発現ベクターにより形質転換された
宿主を培養又は飼育し、前記宿主から酵素を採取するこ
とを特徴とする方法。 - 【請求項９】 請求項第１項又は第２項に記載のグルカ
ゴン分解酵素に対する抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18793694A JP3803978B2 (ja) | 1994-07-19 | 1994-07-19 | グルカゴン分解酵素及びそれをコードする遺伝子並びに該グルカゴン分解酵素に対する抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18793694A JP3803978B2 (ja) | 1994-07-19 | 1994-07-19 | グルカゴン分解酵素及びそれをコードする遺伝子並びに該グルカゴン分解酵素に対する抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0823972A true JPH0823972A (ja) | 1996-01-30 |
| JP3803978B2 JP3803978B2 (ja) | 2006-08-02 |
Family
ID=16214778
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18793694A Expired - Fee Related JP3803978B2 (ja) | 1994-07-19 | 1994-07-19 | グルカゴン分解酵素及びそれをコードする遺伝子並びに該グルカゴン分解酵素に対する抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3803978B2 (ja) |
-
1994
- 1994-07-19 JP JP18793694A patent/JP3803978B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JP3803978B2 (ja) | 2006-08-02 |
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