JPH01165376A - Ａｐａｓｅ−１↑１の精製および線虫耐性遺伝子の回収 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は酵素タンパクを精製すること、および精製され
たタンパクを遺伝子回収に使用することに関する。特に
２本発明は、トマトの酸性ホスファターゼ−１（Ａｐａ
ｓｅ−１１）を精製すること、および精製されたタンパ
クから誘導された配列を利用し。

線虫耐性をコードする隣接遺伝子を得ることに関する。

（従来の技術） トマトの線虫耐性遺伝子（Ｍｉ）は、第６染色体上の酸
性ホスファターゼ−１（Ａｐａｓｅ−１１）をコードす
る遺伝子に近接して連結されていることが知られている
（Ｒｉｃｋ、　Ｃ，Ｍ、、遺伝子地図（１９８８）　３
　：４７４．コールドスプリングハーバ−プレス）。Ａ
ｐａｓｅ−１１は栽培トマトに見られる変異型であり、
おそらく線虫助月±１■ｅ　１ｎｃｏ　ｎ１ｔａに対す
る耐性をコードする遺伝子が野性種に」肛■亘皿りから
移入された際に導入されたのであろう（Ｒｉｃｋ、　Ｃ
，Ｍ、ら、　Ｔｏｍａｔ。

Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｏ　ｅｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ　ｏ
ｒｔｓ（１９７４）２４：２５）　；そして実際、　Ａ
ｐａｓｅ−１１は線虫耐性種を作り出す際の選択マーカ
ーとして使用される（Ｍｅｄｉｎａ−Ｆｉｌｈｏ。

Ｈ，Ｐ、、　Ｐｈ、Ｄ、論文（１９８０）カリフォルニ
ア大学デービス校）。

数多くの植物にとって、根瘤線虫に対する耐性は極めて
重要である。このような植物には、広葉作物（例えば、
タバコ、ワタ、トマト、ウリおよび他の野菜）、飼料作
物および観賞植物が含まれる。線虫が感染すると、根糸
は浅く、根瘤を有するようになり、細根の発達および植
物の成長が妨げられる。最近の線虫対策としては、抗線
虫薬による土壌の処理や作付は管理などの方法があるが
。

費用が掛り、また場合によっては環境に望ましくない結
果を与える。しかし、　Ｍｉ遺伝子により直接植物に耐
性を与えて、線虫を制御する方法は、環境上安全であり
、長期に実施しても安価である。

旧遺伝子は単一の遺伝子座として定義され、トマトゲノ
ムの第６染色体上に位置するが、この遺伝子の産物につ
いては現在のところ不明である。

しかし、　Ｍｉ遺伝子を移入すると根瘤線虫に対する耐
性が付与され、該遺伝子が酸性ホスファターゼをコード
する遺伝子領域に近接していることは理解されている。

一般に、酸性ホスファターゼには種々の型が存在し、低
いｐＨでリン酸モノエステルを加水分解する能力によっ
て特徴付けられる。数多くのこれら酸性ホスファターゼ
が研究されている。＾ｐａｓｅ−１１に関する従来の研
究によると、　Ａｐａｓｅ−１１は単一遺伝子座Ａｐｓ
ｌとして受は継がれ、　Ｍｉ遺伝子座に近接している（
Ｆｏｒｂｅｓ、　Ｊ、Ｆ、ら、　Ｔｏｍａｔｏ　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ並並肛旦り虹庖匹旦５　（１９７６）薮；７
−８）。

（発明の要旨） 本発明は精製されたＡｐａｓｅ−１１を提供する。これ
により、適当なオリゴヌクレオチドプローブのアミノ酸
配列決定、およびその構築、そしてＡｐａｓｅ−１１に
特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
の生産が可能となる。得られたプローブおよび抗体は、
　Ａｐａｓｅ−１１をコードする遺伝子の回収に有用で
ある。Ａｐａｓｅ−１１をコードする遺伝子またはその
一部は、染色体ウオーキング技術またはジャンピング技
術を用いて、線虫耐性をコードする旧遺伝子を得るため
に利用し得る。

従って、ある局面では２本発明はトマトのＡｐａｓｅ−
１１を精製する方法、およびこの精製による産物を目的
としている。

酸性ホスファターゼ−１タンパク（Ａｐａｓｅ−１１）
を精製する本発明の方法は、以下の工程を包含する：ａ
））マド細胞の粗抽出物を５５〜８５％飽和の硫酸アン
モニウムで沈殿させること、ｂ）この沈殿物を脱塩する
こと；ｃ）該ｂ）工程の脱塩された調製物をアニオン交
換クロマトグラフィーに供し。

Ａｐａｓｅ〜１′を含有する画分を収集すること；ｄ）
該画分を脱塩すること；ｅ）該ｄ）工程の脱塩された調
製物をヒドロキシアパタイトによるクロマトグラフィー
に供し、　Ａｐａｓｅ−１１を含有する画分を収集する
こと；ｆ）該ｅ）工程で得られた画分を脱塩すること；
およびｇ）該ｆ）工程の脱塩された調製物をアフィニテ
ィークロマトグラフィーに供し、　Ａｐａｓｅ−１１画
分を回収すること。

トマトのＡｐａｓｅ−１１を精製する本発明の方法は。

以下の方法を包含する：ａ）培養されたトマト細胞を約
ｐＨ８の緩衝液で抽出すること、ｂ）５５〜８５％の硫
酸アンモニウムを用いて、この抽出物からＡｐａｓｅ−
１１タンパクを沈殿させること；ｃ）この沈殿物を再溶
解し、脱塩すること；ｄ）脱塩された溶液をＤＥＡＲセ
ルロースによるクロマトグラフィーに供し、トリス−Ｈ
Ｃｌ　ｐＨ７，４から５００ｍＭ　ＨＣＩまでの濃度勾
配を用いて、　Ａｐａｓｅ−１１画分を溶出させること
；ｅ）該ｄ）工程のＡｐａｓｅ−１１含有画分を脱塩す
ること；ｆ）該Ａｐａｓｅ−１１含有画分をヒドロキシ
アパタイトによるカラムクロマトグラフィーに供し。

４００ｍＭリン酸塩までの直線濃度勾配を用いて、溶出
させること；ｇ）該ｆ）工程のＡｐａｓｅ−１１含有画
分を脱塩すること；およびｈ）該ｇ）工程の脱塩された
Ａｐａｓｅ−１１画分をＣｏｎＡセファロースによるク
ロマトグラフィーに供し、４０ｍＭトリス、　２００ｍ
Ｍ　ＮａＣ１゜ｐＨ７，４を用いて、　Ａｐａｓｅ−１
１画分を溶出させること。

別の局面では９本発明は精製されたタンパクを抗Ａｐａ
ｓｅ−１１抗体の調製に利用すること、およびこのよう
にして調製された抗体を目的としている。

さらに別の局面では２本発明は、精製された酵素のアミ
ノ酸配列に基づいて構築されたオリゴマープローブに関
する。

（発明の構成） ここで用いられているように、酸性ホスファターゼ−１
（またはＡｐａｓｅ−１、Ａｐａｓｅ−１１）は、第６
染色体上で旧領域に直接隣接したＡｐｓｌ遺伝子座によ
りコードされるタンパクを意味する。Ｍｉ領領域存在は
耐性トマト品種の線虫耐性をもたらす。

Ａｐａｓｅ−１１酵素の性質は、ここに述べる精製方法
を用いて得られたタンパクの研究により明らかになって
いる。節単に言えば、非変性ＰＡＧＥによると。

＾ｐａｓｅ−１１の分子量は約５１ｋｄであり、二量体
であると考えられている。５Ｏ５−ＰＡＧＥによると、
精製物質の見掛けの分子量は３１ｋｄである。このタン
パクは次のようなアミノ酸組成を有する糖タンパ、りで
あると考えられる：　Ｌｙｓ、　４．７ｍｏｌｅ％；　
Ｈｉｓ＋　３．１ｍｏｌｅ％；　Ａｒｇ、　３．８ｍｏ
ｌｅ％；　Ｃｙｓ、　０．９ｍｏｌｅ％；　Ａｓｘ、　
１２．１ｍｏｌｅ％；Ｔｈｒ＋　５．４ｉｏ１ｅ％；　
Ｓｅｒ＋　１０．６ｍｏｌｅ％；　Ｇｌｘ。

１２．０ｍｏｌｅ％；　Ｐｒｏ、　４．０ｍｏｌｅ％１
ＧＩＬ　９．６ｍｏｌｅ％；Ａｌａ、　６．６ｍｏｌｅ
％；　ＶａＬ　６．３ｍｏｌｅ％；　Ｍｅｔ＋　１．１
ｍｏｌｅ％；　ｌｉｅ、　４．３ｍｏｌｅ％；　Ｌｅｕ
＋　７．９ｍｏｌｅ％１Ｔｙｒ＋　３．７ｍｏｌｅ％；
　Ｐｈｅ、　４．０ｍｏｌｅ％。

酵素の基質特異性は、クエン酸緩衝液（ｐＨ４，６）中
、３０°Ｃにて各種基質５酵から放出されるリン酸エス
テル量により測定された。基質特異性はｐ　−ニトロフ
ェニルホスフェートに対するホスファターゼ活性の百分
率として以下に示す： （以下余白） 基−−亘　　　　　　　　　　　　　蝕旦と旦α−ナフ
チルホスフ１−トロ β−ナフチルホスフェート　　　　　　　７８グルコー
ス−１−ホスフェート　　　　　０グルコース−６−ホ
スフェート　　　　　１２リボース−５−ホスフェート
　　　　　　５４フルクトース−６−ホスフェート　　
　　５８３−ホスホグリセリン酸　　　　　　　５３グ
リセルアルデヒド−３−ホスフェート５７ローホスホグ
ルクロン酸　　　　　　　５７α−グリセロホスフェー
ト　　　　　　３４β−グリセロホスフェート　　　　
　　１０ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
０ＡＤＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　２＾Ｍ
Ｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　４遺伝子配列
には恣意的または偶発的な変異の起こり得る可能性があ
り、それによって上述の酵素活性およびアミノ酸組成が
ある程度変化し得ることを理解すべきである。従って、
ここに述べられた特性は基準となるパラメーターであり
、絶対的な必要条件ではない０例えば、　　Ａｐａｓｅ
−１１のようなＡｐａｓｅ−１１遺伝子の対立遺伝子が
様々な品種に存在することは広く知られている。対立遺
伝子の酵素変異型も特にこの定義に包含される。上述の
方法で精製することができ、Ｍｉ領領域近接した指定遺
伝子座に存在する遺伝子によってコードされるのであれ
ば、このようなタンパクはこの定義に含まれる。

精製されたタンパクは、一般に認められている手段で、
抗血清またはモノクローナル抗体を調製するのに利用す
ることができる。抗血清の調製には、ラットやマウスな
どの適当な哺乳類被験体の抗体価をモニターする。この
抗体価のモニターは。

標準ＥＬＩＳＡまたは放射免疫分析法において精製され
たタンパクを抗原として使用した免疫分析法で行う。モ
ノクローナル調製物が望まれる場合には。

免疫動物から調製した抗体産生細胞を、典型的には骨髄
腫細胞系に融合させて永久増殖化し、所望の抗体を生産
する場合と同様の方法で、この永久増殖性細胞をスクリ
ーニングする。

このようにして得られた抗体は、　Ａｐａｓｅ−１タン
パクの分析法に有用である。また、適切に構築されたｃ
ＤＮＡライブラリーを、　Ａｐａｓｅ−１をコードする
遺伝子の存在についてスクリーニングするのにも有用で
ある。この方法では、　ｃＤＮＡライブラリーは。

＾ｐａｓｅ−１遺伝子を有するトマト品種から単離した
ｎ＋ＲＮＡから構築される（Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，Ａ、ら
、　Ｐｒｏｃ　ＮａｔｌＡｃａｄ　５ｃｉＵＳＡ　（１
９８３）８０：１１９４４１９８）　、このライブラリ
ーで細菌を形質転換した場合１組換えＱｐａｓｅ−１は
該遺伝子を有する細胞によって産生される。この産生は
、抗体調製物による標準的な免疫分析技術を用いて、培
養物をＡｐａｓｅ−１タンパクの存在について分析する
ことによりモニターし得る。

精製されたタンパクはＮ末端の配列を決定するための基
質としても有用である。適当に構築されたｃＤＮＡライ
ブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングす
るための他の方法に使用するオリゴマープローブを設計
するのに充分なアミノ酸配列が得られる。アミノ酸配列
を決定する技術は今や当該技術分野においては標準的な
方法であり。

このような技術に関する概要は１例えばＡ１１ｅｎ、Ｇ
。

の文献に見い出される（Ａ１１ｅｎ、Ｇ、、　　ｒタン
パクおよびペプチドの配列決定」、生化学および分子生
物学における実験技術（１９８１）、　Ｗｏｒｋ、Ｔ、
Ｓ、ら繁。

エルセビアーサイエンスバブリッシャーズＢＶ　。

アムステルダム、ヨーク、オックスフォード）。

いったん充分な配列が決定されると、遺伝子コードに基
づいてプローブが設計される。プローブとして用いるた
めには、約６個のアミノ酸配列（１７〜１Ｂ−ｍａｒ　
）を有するオリゴマーが、所望の配列を得るのに有用で
ある。特定のアミノ酸に対するコドンには縮退が存在す
るため、厳密な条件下で所望の配列を回収するのに必要
な数の適合ヌクレオチドを得るためには、このような長
さの配列が必要である。また、厳密な条件は偽陽性の結
果を除外するのに必要である。縮退による配列の曖昧さ
のいくらかは、オリゴマーにおける縮退したヌクレオチ
ドの代わりにイノシンを用いることにより巧妙に処理し
得る（Ｍａｒｔｉｎ、　Ｆ、Ｈ，ら、　Ｎｕｃｌ　Ａｃ
１ｄｓＲｅｓ（１９８５）　１３：８９２７−８９３８
）。

ハイブリダイゼーションの条件を記述する際。

厳密な条件とは、非常に高い相同性を有する配列の間で
のみ塩基対合が可能であるような条件を意味する。条件
の厳密性は、当該技術において一般的に理解されている
ように、主としてホルムアミドおよび塩の濃度、そして
洗浄時間および温度により制御される（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、　Ｔ、ら２分子クローニング（１９８２）　、コー
ルドスプリングハーバ−プレス）。

オリゴマープローブは２種々のプロトコルで調製された
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用される。

典型的な調製においては９例えばＨａｌｌ＋Ｔ、Ｃ，ら
の方法（Ｈａｌｌ、Ｔ、Ｃ，ら、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ
　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ堕Ａ　（１９７８）■：３１９６）
を用いて、インビトロで培養されたトマト細胞あるいは
Ａｐａｓｅ−１を発現するトマトの他の組繊からｍＲＮ
＾を単離する。１ｍＲＮＡのテンプレートから、　０ｋ
ａｙａ＋ｎａ／Ｂｅｒｇベクター系（Ｏｋａｙａｎ＋ａ
。

Ｈｏら、　Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８３）
　３　：２８０−２８９）、あるいはＡｌｅｘａｎｄｅ
ｒ　Ｄ、Ａ、らの変法（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、　Ｄ、Ａ
、ら。

Ｇｅｎｅ（１９８４）３１ニア９−８９）を用いて、　
ｃＤＮＡライブラリーを構築する。ライブラリーはλｇ
ｔｌｌまたは他のファージベクター（前出）にも調製し
得る。単離されたコロニーはハイブリダイゼーションに
よりスクリーニングし、そしてさらにＤＮＡ配列を決定
して、このＤＮＡが以前に決定したＡｐａｓｅ−１の必
要とされるコード配列に対応することを確認することに
より特徴付ける。

単離されたＡｐａｓｅ−１ｃＤＮＡは、標準的な組換え
方法を用いて、　Ａｐａｓｅ−１酵素の生産に使用し得
る。

あるいは１本発明の方法によれば、単離されたＡｐａｓ
ｅ−１ｃＤＮＡを用いて、トマトの染色体に由来するゲ
ノムライブラリーからＡｐｓ−１遺伝子座を含むゲノム
口Ｎ＾を回収することができる。Ａｐｓ−１遺伝子座に
相当するゲノムＤＮＡを得るためには、少な（とも約２
０個のヌクレオチドを有するｃＤＮＡが必要である。も
ちろん、　ｃＤＮＡ配列が長いほど、所望の配列の回収
は容易になる。従って、２０個のヌクレオチド配列に対
しては、５０個のヌクレオチド配列が好ましく、ＳＯＯ
個のヌクレオチド配列であればより好ましい。完全長の
クローンが最も望ましい。

Ａｐｓ−１遺伝子座に「相当する」とは、　Ａｐａｓｅ
−１を産生ずる情報を担う遺伝子領域にある配列を意味
する。

ゲノムライブラリーは、トマトのＤＮ八を制限酵素で部
分消化し、得られた断片をコスミドまたはλクローニン
グベクターに挿入することにより調製される（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ、　Ｔ、ら２分子クローニング（１９Ｂ２）　
、　コールドスプリングハーバ−プレス）。

コスミドベクターは約５０ｋｂのＤＮＡ、　　λベクタ
ーは約２４ｋｂのＤＮＡを収容し得る。これらのベクタ
ーはＥ、　ｃｏｌｉ中で増幅され、充分な量のＤＮＡが
得られる。少なくともＡｐｓ−１遺伝子座の一部分に相
当するゲノムクローンがあれば、染色体ウオーキングに
使用する末端断片を得ることができる。Ａｐｓ−１遺伝
子座に相当すると考えられる断片は、適切な制限酵素で
切断し、適当な末端断片を得る。この末端断片を用いて
２重複するゲノムクローンを単離する。次に、このクロ
ーンの末端断片を用いて。

さらに重複するクローンを単離する。次々に重複クロー
ンを単離することにより１元の開始位置から徐々に離れ
、所望のＭｉ遺伝子に近接するクローンが得られるよう
になる。これらの技術は当該分野に公知であり１例えば
釦ｔｔｈ、　Ｃ，Ｌ、ら、　Ｍｅｔｈｏｄｓハ１ｕ剥−
（印刷中）により概説されている。ウオーキング法の基
礎については、　５ｔｅｉｎａ＋ｅｔｚ、　Ｍ、らＮａ
ｔｕｒｅ（１９８２）３００　：３５−４２に記載され
ている。

ごく最近、長い間隔を橋渡しできる「ジャンピング」法
が開示された。これらの技術は、　Ｐｏｕｓｔｋａ＋Ａ
、ら（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ（１９８６）　２　：
１７４−１７９；　Ｎａｔｕｒｅ　（１９Ｂ？）　　３
２５：３５３−３５６）やＣｏ１１ｉｎｓ、　Ｆ、Ｓ、
　　ら（匝Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１
９８４）８１：６８１２−６８１６）などが用いた方法
である。このアプローチでは、探索するゲノムＤＮＡラ
イブラリーは、非常に長く、約数百ｋｂという大きな分
子量を有するＤＮＡから構成され、低融点アガロースの
ブロックに包埋された細胞を溶解した後１選択的制限酵
素で穏やかに消化して調製される０次いで、この長鎖の
ＤＮＡは、制限部位を利用して、マーカーの存在下で環
状にされる。このマーカーは環状にされたプラスミドに
組み込まれる。次いで、この環状ＤＮＡは別の制限酵素
で切断し９元の長鎖ＤＮＡの両末端部以外の中間部分を
欠失させる。新しく得られた比較的短い断片は、連結マ
ーカー配列の各末端に高分子ｌＤＮＡ断片の両端を含み
、ジャンピングライブラリーを形成する。このジャンピ
ングライブラリーから次の所望の重複した断片を回収し
ていくことができる。この方法を行うためには２両端を
含む断片を。

Ａｐａｓｅ−１１タンパクをコードすると考えられる元
のゲノムＤＮＡで探索し、陽性のクローンを用いて続く
両端マーカーライブラリーを探索する。このようにして
、非常に広い範囲のゲノムも、短い手順で分析すること
ができる。このことは、細菌のゲノムＤＮＡや他のより
簡潔に構築されたゲノムＤＮＡに比較して極めて長い哺
乳類の染色体ＤＮＡを分析する際に必要である。

旧遺伝子座が得られたかどうかの確証は１重複する各ゲ
ノムクローンを単離し、　Ｍｉ線虫耐性の有無について
試験して得られる。この耐性を確認するためには、これ
らクローンの断片をＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＴｉベ
クター系を通じて植物に移入する（Ｓｉｍｐｓｏｎ。

Ｒ，Ｂ、ら、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ（１９８
６）　６　：４０３−４１５）　、形質転換された植物
の根は、　）ＩｕｅｔｔｅＬ　Ｒ−Ｎ、ら（月旦１胚懸
旦旦、ｇ（１９８５）　、　ｐｐ、　１１５以下、マサ
チューセッツ大学試験農場）のインビトロ分析法を用い
て。

Ｍ、　１ｎｃｏ　ｎ１ｔａに対スる耐性についてスクリ
ーニングする。

Ｍｉゲノムを使用することにより、このＤＮＡを用いて
線虫感受性植物を線虫耐性に形質転換することができる
。このことについては、ゲノム自体およびこのゲノムか
ら設計されたＤＮＡの両者が有用である。

（以下余白） （実施例） Ａｐａｓｅ−１１の存在を、セルロースアセテート膜電
気泳動を用いて評価した。試験する上清をセルロースア
セテート膜上に載置し、ザトリウス（Ｓａｔｏｒｉｕｓ
　）の電気泳動装置を用いて、　０．３Ｍホウ酸緩衝液
（ｐＨ７，８）にて２００ボルトで１５分間電気泳動を
行った。

次いで、１ｍｇ／ｄのブラックに塩、　０．７５ｍＭ　
ＭｇＣｈ。

５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐ）１４．６）　、　　これ
に２５Ｈｔｌ／ｍｆｌの１％β−ナフチルホスフェート
（アセトン：水が１：１の溶液に前もって溶解）を加え
た溶液を用い、　３０″Ｃにてバンドが染まるまで染色
した。分析用媒質は１２．５■／−の希アガーを用いて
固化した。この固化はＶａｌｌｅｊｏｓ、Ｃ，Ｅ、＋“
植物遺伝学および品種改良′″Ｐａｒｔ＾（１９８３）
エルセピア−、アムステルダム、　ｐ、４９８を改変し
た方法に従って行った。染色は、試料の純度に応じて１
５〜４５分間行った。

Ａｐａｓｅ活性は、　Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ＋Ｈ，ｔｌ、
　”酵素分析法”（１９６３）アカデミツクプレス、　
ＮＹ、　ｐｐ７８３−７８４の方法に従って、　５０ａ
＋Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，６）中におけるｐ−ニト
ロフェニルホスフェートからのニトロフェノールの放出
を用いて測定した。３０″Ｃにおいて１分間あたりにｌ
ｕＭニトロフェノールを放出するような酵素活性を、１
単位（ｕｎｉ　ｔ）として定義した。タンパク濃度はＢ
ｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ。

Ｍ、Ｍ、、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９７６）
７２：　２４８−２５４）により測定した。

トマト（Ｌ　ｃｏ　ｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔ
ｕｍ旧１１．ｃｖ　ＶＥＮＴ）の細胞懸濁培養物を、シ
ｇ糖を含有する完全培地（ＤｕＰｏｎｔ、Ｆ、Ｍ、ら、
　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ　ｓ　ｏｌ（１９８５）７７：６４
−６８）の３００ｄとともに１２フラスコに維持し、２
７°Ｃにて光を与えずに連続的に振盪した。タンパク抽
出を行う２日前に、リン酸塩を含有しない追加の培地３
００ｍを添加した。

精製についての全ての工程は１０°Ｃ以下で行った。

２ｋｇの細胞を培地から濾過し、　　１．６ｆの緩衝液
Ａ（０，ＩＭ　　）リス−〇ＣＩ、　ｐＨ８，０，５ｍ
Ｍジチオエリトリトール、　　５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　
２０％ポリビニルポリピロリドン）と共に、ワーリング
プレンダー（Ｗａｒｉｎｇｂｌｅｎｄｅｒ　）でホモジ
ナイズし、　６．４００ｇで１０分間遠心分離した。そ
のペレットを０．５２の緩衝液Ａと共にワーリングブレ
ンダーで再ホモジナイズし。

遠心分離した。

集めた上清から５５〜８５％飽和の（Ｎｌ（４）　ＺＳ
Ｏ４による沈澱物を調製した。これは、固形（ＮＨ４）
　ｔｓＯａを添加して３０分間撹拌することにより行っ
た。この沈澱を１１．７５０ｇで３０分間遠心分離する
ことにより回収し、３００戚の緩衝液Ｂ（５０ＩＩＩＭ
）リス−ＨＣｌ。

ｐＨ７，４）に再溶解させ、そして７１の緩衝液Ｂに対
して１晩、該緩衝液を１回交換して透析を行った。

脱塩した溶液を、緩衝液Ｂで平衡化した３×４８１のＤ
ＨＡＩＩ！−セルロースカラムにかけ、７１ｄの画分を
集めた。このカラムを２５０ｄの緩衝液Ｂで洗浄し９次
いで５０〜５００ｍＭの直線濃度勾配を有するトリス−
ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）　３００ｍで展開し、続いて５
００＋ｗＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）で洗浄した
。第１図Ａに示されるように、　Ａｐａｓｅ−１１は強
く結合し、０．５Ｍトリスで溶出された。これは画分１
３９〜１４７に相当した。

Ａｐａｓｅ−１１を含有する画分（１４０ｍ）は、第１
図Ｂに示されるように、実施例１のセルロースアセテー
ト膜電気泳動により測定した。この画分は、　Ａｐａｓ
ｅ−２も含有していた。これらの画分を、緩衝液Ｃ（１
０１リン酸塩、　ｐＨ７，６）に対して１晩透析した。

Ａｐａｓｅ−１１を含有する脱塩した画分を、緩衝液Ｃ
で平衡化した３Ｘ１Ｂｃｍのハイドロオキシアパタイト
カラムにかけた。　Ａｐａｓｅ−１１は、　１０〜４０
０ｎ＋Ｈの直線濃度勾配を有するリン酸塩（大ｉｔ調製
の場合は。

この工程はバッチ溶出で置き換えた）により溶出された
。　Ａｐａｓｅ−１１を含有する画分（９０ｄ）は、緩
衝液Ｄ（２５ＩＩＩＭトリスーＨＣｌ、　５０ｍＭ　Ｎ
ａＣ１，ｐＨ７，４）に対して１晩透析した。

この脱塩した画分を、緩衝液りで平衡化した１×１２Ｃ
ＩｌのＣｏｎＡセファロースカラムにかけた。八ｐａｓ
ｅ−１１は通過した（非吸着の）画分に主に存在した。

純粋なＡｐａｓｅ−１１を得るには、第２図に示すよう
に。

この材料をさらにＣｏｎＡセファロースカラムに２回通
すことが必要であった。第２図Ａに示すように。

通過画分を集めた後の最初のＣｏｎＡセファロースカラ
ムへの再通過においては、緩衝液Ｅ（４０ｍＭ）リス−
ＨＣｌ、　２００ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ７，４）に引き
続いて１％α−メチルグルコシドを加えた緩衝液Ｅでカ
ラムを洗浄した。緩衝液Ｅで溶出された画分ｉはほとん
どのＡｐａｓｅ−１を含有していた；１％グルコシドを
加えた緩衝液Ｅで溶出された画分ｉｉはＡｐａｓｅ−２
と少量のＡｐａｓｅ−１とを含有していた。

画分ｉに含有されるＡｐａｓｅ−１は、５ｍＭ）リス−
ＨＣｌに対して透析し、凍結乾燥し、４−の水に再溶解
し、そして再びＣｏｎＡカラムにかけた。第２図Ｂに示
すように、緩衝液Ｅ　（ｐＨ８，５）で溶出されたＡｐ
ａｓｅ−１（画分ｉｉｉ　）は均質であった。

第２図Ｂに示されるピークから、精製されたＡｐａｓｅ
−１１タンパクが回収され、そしてゲルクロマトグラフ
ィーにより均質であることが確かめられた。第３図はこ
れらの結果を示す。第３図Ａは５ＤＳＰＡＧＥを示し、
レーン１は分子量の標準物質、そしてレーン２は回収し
た画分ｍである。第３図ＢはＡｐａｓｅ活性についての
染色を行った非変性ＰＡＧＥを示す；　レーン１は画分
■、そしてレーン２はＡｐａｓｅ４とＡｐａｓｅ−２と
の混合物である。どちらのタイプのＰＡＧＥも９画分用
は／１ｐａｓｅ−１に対応する単一バンドであることを
示している。

次いで、精製されたタンパクは、抗体の生産。

および適当なオリゴマーのプローブの設計のためのアミ
ノ酸配列決定に用いられる。

（発明の要約） トマトのホスファターゼ−１イソ酵素（Ａｐａｓｅ−１
１　）が均質になるまで精製され、そしてアミノ酸配列
が決定されている。該酵素は抗Ａｐａｓｅ−１抗体を調
製するのに用いられる。

４　　゛　　の　　　なＵ 第１図はＤＥＡＲセルロースに対する＾ｐａｓｅ−１１
を含む抽出物の溶出曲線を表す図である。

第２図はＣｏｎＡセファロースに対する＾ｐａｓｅ−１
１含有画分の溶出曲線を表す図である。

第３図は精製されたＡｐａｓｅ−１１のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動の結果を表す図である。

狐、赫、４．。

、　　′ の へ ＦＩＧ、　３ ２、発明の名称 Ａｐａｓｅ−１１の精製および線虫耐性遺伝子の回収３
、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４５６８ダ
ブリン、トリニティ　コート　６５６０名称　プラント
　セル　リサーチ インスティチュート ４、代理人 住所　〒５３０大阪府大阪市北区西天満６、補正の対象 願書の特許出願人の代表者の欄、委任状（訳文添付）、
法人証明書（訳文添付）および図面（全図） ７、補正の内容 願書、委任状、法人証明書については別紙のとおり

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酸性ホスファターゼー１タンパク（Ａｐａｓｅ−１
   ＾１）を精製する方法であって、該方法は以下の工程を
   包含する： ａ）トマト細胞の粗抽出物を５５〜８５％飽和の硫酸ア
   ンモニウムで沈殿させること； ｂ）この沈殿物を脱塩すること： ｃ）該ｂ）工程の脱塩された調製物をアニオン交換クロ
   マトグラフィーに供し、Ａｐａｓｅ−１＾１を含有する
   画分を収集すること； ｄ）該画分を脱塩すること； ｅ）該ｄ）工程の脱塩された調製物をヒドロキシアパタ
   イトによるクロマトグラフィーに供し、Ａｐａｓｅ−１
   ＾１を含有する画分を収集すること； ｆ）該ｅ）工程で得られた画分を脱塩すること；および ｇ）該ｆ）工程の脱塩された調製物をアフィニティーク
   ロマトグラフィーに供し、Ａｐａｓｅ−１＾１画分を回
   収すること。 ２、前記アニオン交換クロマトグラフィーにＤＥＡＥセ
   ルロースを用いる特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記アフィニティークロマトグラフィーにＣｏｎＡ
   セファロースを用いる特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。 ４、トマトのＡｐａｓｅ−１＾１を精製する方法であっ
   て、該方法は以下の方法を包含する： ａ）培養されたトマト細胞を約ｐＨ８の緩衝液で抽出す
   ること； ｂ）５５〜８５％の硫酸アンモニウムを用いて、この抽
   出物からＡｐａｓｅ−１＾１タンパクを沈殿させること
   ； ｃ）この沈殿物を再溶解し、脱塩すること； ｄ）脱塩された溶液をＤＥＡＥセルロースによるクロマ
   トグラフィーに供し、トリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．４から
   ５００ｍＭ　ＨＣｌまでの濃度勾配を用いて、Ａｐａｓ
   ｅ−１＾１画分を溶出させること； ｅ）該ｄ）工程のＡｐａｓｅ−１＾１含有画分を脱塩す
   ること； ｆ）該Ａｐａｓｅ−１＾１含有画分をヒドロキシアパタ
   イトによるカラムクロマトグラフィーに供し、４００−
   Ｍリン酸塩までの直線濃度勾配を用いて、溶出させるこ
   と： ｇ）該ｆ）工程のＡｐａｓｅ−１＾１含有画分を脱塩す
   ること；および ｈ）該ｇ）工程の脱塩されたＡｐａｓｅ−１＾１画分を
   ＣｏｎＡセファロースによるクロマトグラフィーに供し
   、４０−Ｍトリス、２００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４
   を用いて、Ａｐａｓｅ−１＾１画分を溶出させること。 ５、特許請求の範囲第１項に記載の方法によって鋼製さ
   れた精製Ａｐａｓｅ−ｌ＾１。 ６、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見掛けの分子量が３１ｋｄ
   であり、次のアミノ酸組成を有する精製されたＡｐａｓ
   ｅ−ｌ＾１タンパク：Ｌｙｓ、４．７ｍｏｌｅ％；Ｈｉ
   ｓ、３．１ｍｏｌｅ％；Ａｒｇ、３．８ｍｏｌｅ％；Ｃ
   ｙｓ、０．９ｍｏｌｅ％；Ａｓｘ、１２．１ｍｏｌｅ％
   ；Ｔｈｒ、５．４ｍｏｌｅ％；Ｓｅｒ、１０．６ｍｏｌ
   ｅ％；Ｇｌｘ、１２．０ｍｏｌｅ％；Ｐｒｏ、４．０ｍ
   ｏｌｅ％；Ｇｌｙ、９．６ｍｏ１ｅ％；Ａｌａ、６．６
   ｍｏｌｅ％；Ｖａｌ、６．３ｍｏｌｅ％；Ｍｅｔ、１．
   １ｍｏｌｅ％；Ｉｌｅ、４．３ｍｏｌｅ％；Ｌｅｕ、７
   ．９ｍｏｌｅ％；Ｔｙｒ、３．７ｍｏｌｅ％；Ｐｈｅ、
   ４．０ｍｏｌｅ％。 ７、特許請求の範囲第５項に記載のタンパクと特異的に
   反応する抗体調製物。 ８、特許請求の範囲第６項に記載のタンパクと特異的に
   反応する抗体調製物。