KR20000022313A - 에이에이티티 프로모터 요소 및 전사 인자 - Google Patents

에이에이티티 프로모터 요소 및 전사 인자 Download PDF

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KR20000022313A
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크리스토퍼 제이 램
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더 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈
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Abstract

본 발명은 그 고유 특이성은 변화시키지 않으면서 이종성 프로모터 구성체에서 시스 요소의 활성을 증가시키는 신규의 전자 인핸서 요소인 (AATT)n를 제공한다. 또한 본 발명은 (AATT)n반복 요소에 특이적으로 결합하는 전사 인자인 PABF 및 그 사용 방법을 제공한다.

Description

에이에이티티 프로모터 요소 및 전사 인자
유전자는 유도성이거나 세포형 특이적이거나 또는 구성성인 방법으로 조절된다. 유전자 발현의 조절에 관여하는 구조 요소에는 다양한 유형들이 있다. 유전자의 근처에 또는 유전자 내부에 위치한 시스 작용성 요소는 서열 특이적 DNA 결합 단백질, 즉 트란스 작용성 인자에 결합하는 작용을 한다. DNA에의 단백질의 결합이 유전자 전사의 개시, 유지 또는 하류 조절을 담당한다.
유전자를 제어하는 시스 작용성 요소로는 프로모터, 인핸서 및 사일런서(silencer)가 있다. 프로모터는 전사 개시부 다음에 위치하고, 방향 의존적인 방식으로 기능하는 반면에, 인핸서 및 사일런서 요소는 프로모터의 활성을 조절하는 것으로서, 그 방향 및 전사 개시부로부터의 거리와 관련하여 가변성이 있을 수 있다.
식물에서 특이적으로 조절되는 유전자의 예로는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL)가 있는데, 이것은 페닐알라닌을 신남산으로 아미노기를 제거하는 반응을 촉매하며, 여기서, 신남산은 페닐프로판 골격에 기초한 다양한 천연 생성물의 전구체이다. 관다발의 발달중에, PAL은 구조 중합체 리그닌의 축적과 관련된 분화성의 목질부(xylem) 세포에서 선택적으로 발현된다. 셀룰로스 다음으로 가장 풍부한 생물 중합체인 리그닌은 식물 조직(목질부)에서 도관을 형성하는 세포의 주요 구조 세포벽 성분이다. 목질부는 식물의 뿌리로부터 식물 슈트(shoot)로의 물 및 무기 용질의 이동을 담당한다. PAL 유전자는 상응하여 분화성 목질부에서 고레벨로 발현된다.
유전자 발현율을 인공적으로 조절하는 능력은 새로운 특성을 가진 식물을 생산하는 수단을 제공한다. 증가된 내재성 유전자 발현을 포함하여 유전자 발현의 증가된 레벨이 바람직할 수 있는 다수의 상황이 존재한다. 그러한 상황의 예로는 농업용 또는 상업용 식물 단백질 생성물의 생산이 있다.
본 발명은 일반적으로는 유전자의 발현에 관한 것이고, 구체적으로는 특히 식물에서 인핸서 요소에 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사율을 증가시키는 신규의 인핸서(enhancer) 요소에 관한 것이다.
도 1A는 도 1B에 도시한 구성체를 함유하는 독립 형질전환체로부터의 색소가 있는 성숙 화관(꽃잎) 조직 (패널 a-d), 색소가 없는 화관 조직(패널 f) 및 제5 절간위의 옆병(패널 e)의 추출물의 GUS 활성(각 돌연변이주에 대해 2개 식물의 평균)에 대한 막대 그래프를 도시한 것이다. 흐리게 표시한 상자는 독립 돌연변이주에서 측정한 GUS 활성의 평균치를 나타낸다. 패널 a의 문자 및 패널 d의 숫자는 패널 e 및 f의 GUS 데이터가 유도된 돌연변이주를 나타낸다.
도 1B는 프로모터 GUS-융합 구성체를 예시한 것이다(축적은 고려하지 않음). (AATT)13서열을 가진 합성 팔린드롬형 서열(PAs) 또는 PAL2 프로모터의 153 bp의 RsaI 단편을 -326 CHS15/GUS 유전자 융합체(각각 구성체 -326 Rsa 및 -326 PAs) 또는 72 CHS15/GUS 유전자 융합체(각각 구성체 -72 Rsa 및 -72 PA)의 앞에 클로닝하였다. CHS15 프로모터는 빗금친 상자로 나타냈다. PAL2ΔPA 구성체내 PA 결실의 위치(파단선) 뿐만 아니라 PAL2 프로모터(PAL2, 점으로 표시함)내 RsaI 단편의 위치가 나타나 있다. 화살표는 전사 개시부를 표시하며, GUS는 리포터 유전자를 나타낸다.
도 2A는 표지된 RsaI 단편을 첨가하기 전에 지시된 온도에서 10분 동안 항온처리한 콩(20 ㎎의 단백질)의 미정제 핵 추출물(NE)을 사용한 전기영동 이동성 변화 분석법(EMSA)의 결과를 나타낸 것이다. 결합 반응은 0℃ 또는 25℃에서 30분 동안 수행하였다.
도 2B는 쇄상체(concatemer) 올리고뉴클레오티드의 5량체(즉, (AATT)5)를 프로브로 사용한 결합 반응 전에 80℃에서 10분 동안 항온처리한 담배 스템으로부터 얻은 핵 추출물(20 ㎎)을 사용한 전기영동 이동성 변화 분석법(EMSA)의 결과를 나타낸 것이다. 단백질-DNA 복합체는 고이온강도의 트리스-글리신 완충액으로 4% 비변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동(10V/㎝)하여 비결합 DNA로부터 분리하였다. P: 유리 프로브, Cl 및 C2: 복합체.
도 3은 콩의 핵 추출물을 사용한 RsaI 단편의 DNaseI 푸트프린트 분석 결과를 도시한 것이다. 말단을 표지한 RsaI 단편은 콩의 핵 추출물의 존재(+) 또는 부재(-)하에 항온처리하고, 이어서 각각 0.25 U/㎖ DNaseI 및 1 U/㎖ DNaseI으로 처리하였다. 분해 생성물은 동일한 DNA 단편의 맥삼-길버트 A 및 G 서열분석 반응(A/G 레인)으로 함께 6%의 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 분석하였다. DNaseI 처리로부터 보호된 영역이 나타나 있고, 상응하는 서열은 우측(서열번호 9)에 나타냈다. 숫자 매김은 전사 개시부에 대해 상대적인 뉴클레오티드 위치를 나타낸 것이다.
도 4는 다량체 PA 프로브로 처리한 λ900에 대해 용원성인 배양물로부터의 단백질 추출물의 사우스웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한 것이다. 패널 A는 SDS-PAGE상에서 분리하고, 니트로셀룰로스상에 블로팅하여 재생시킨 용원성 파지의 단백질 추출물이다. 막은 6개의 스트립으로 절단하고, 나타낸 프로브로 하이브리드화하였다. M: kDa로 나타낸 외관 분자 질량을 가진 마커 단백질의 위치; PAn: 쇄상체 PA 프로브; PA: 단량체 PA 프로브; 1-4: PAL2 프로모터의 상이한 영역을 나타내는 PCR 생성물. 패널 B는 PAL2 프로모터내의 PCR 생성물의 상대적인 위치를 나타낸다. 사부(phloem) 요소인 AT, PF 및 PA-모티프의 위치가 나타나 있다. 숫자는 전사 개시부에 상대적인 위치를 의미한다. 화살표는 파지가 암호화하는 130 kDa의 융합 단백질을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 PABF cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 추론된 아미노산 서열을 나타낸 것이다(각각 서열번호 2 및 서열번호 3). 1-문자 암호로 나타낸 추론된 아미노산은 위치 61에서 개방형 해독틀의 첫 번째 메티오닌에서 개시하여 N-546 다음의 정지 코돈에서 종결된다. 화살표는 최초에 분리된 절단된 cDNA 클론의 5' 및 3'-말단을 나타낸다. AT-후크 모티프에는 밑줄을 그었다.
도 6은 소수성에 관한 플롯이다. 위의 패널은 친수성 영역을 나타내는 음의값과 함께 소수성의 플롯을 나타낸다. 숫자는 PABF 서열내의 아미노산의 위치를 의미한다. 아래의 패널은 PABF의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다. 흑색의 상자는 HMG I/Y 도메인에서 발견되는 AT-후크 모티프를 나타낸다.
도 7A는 식물 히스톤 H1 유전자 및 HMG I/Y DNA-결합 모티프(AT 후크)를 가진 PABF의 도메인들의 서열 상동성을 비교한 것이다(서열번호 10 내지 서열번호 16). 보존적 아미노산 치환은 + 표시로 나타냈다.
도 7B는 포유동물의 HMG I/Y 단백질(a-c)의 반복되는 dA·dT-DNA 결합 모듈을 나타낸다(서열번호 17 내지 서열번호 24). 유사한 반복 서열이 PABF(a-g)에서 확인되었다. 일치 AT-후크 모티프와 상이한 아미노산만을 나타냈다. 불변의 코어 모티프 RGRP는 대문자로 나타냈다. 괄호안의 숫자는 각각의 단백질내 아미노산 위치를 나타낸다.
본 발명은 비특이적 인핸서로서 기능하는 신규의 반복 요소를 제공한다. 달리 말하면, 본 발명은 인핸서 요소와 결합된 프로모터의 고유 특이성에 영향을 끼치지 않는다. 대신에, 인핸서 요소는 프로모터의 활성을 증가시켜 프로모터와 결합된 유전자의 발현의 목적하는 레벨을 산출한다. 신규의 반복 요소에 결합하는 팔린드롬형 요소 결합 인자(PABF)인 신규의 전사 인자 역시 제공된다.
제1의 양태로, 본 발명은 최소한 서열 (AATT)n으로 구성되는 분리된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인핸서 요소를 제공하는데, 상기 서열에서 n은 2 이상이고, 바람직하게는 약 2 내지 약 20이다. 서열 (AATT)n은 시스 작용성이고 비특이적인 인핸서 활성을 가진다. 한 가지 관점에서, 본 발명은 임의의 세포에서 임의의 유전자의 발현을 증가시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 그 유전자와 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터에 (AATT)n반복 요소를 작동 가능하게 연결시켜 상기 유전자의 발현을 증가시키는 단계를 포함한다.
제2의 양태로, 본 발명은 실질적으로 정제된 팔린드롬형 요소 결합 인자(PABF) 폴리펩티드를 제공하는데, 이것은 SDS-PAGE로 측정한 분자량이 약 67 kDa이고, (AATT)n반복 요소(n은 2 이상임)에 결합하며, 히스톤 도메인, 글루타민 풍부 도메인 및 고이동성 군(HMP) I/Y 도메인을 가지는 것이 특징이다. PABF는 전사 인자로서 작용하며, 본 발명의 (AATT) 반복 요소에 결합한다.
바람직한 양태에 관한 설명
본 발명은 신규의 인핸서 요소 및 이 인핸서 요소에 결합하는 신규의 팔린드롬형 요소 결합 인자(PABF)를 제공한다. 본 발명의 인핸서 요소 및 결합 인자는 특히 식물에서의 유전자 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.
PAL2 인핸서 요소
본 발명의 인핸서 요소는 다수의 분리된 반복 단위(AATT)를 포함한다. 인핸서는 인핸서 발현에 요구되는 반복된 요소의 개수를 최소로 가지며, 보통 천연 인핸서에 존재하는 반복 단위수의 약 2배 이하의 개수를 가진다.
본원에 기술하는 (AATT) 반복 구조는 불완전할 수 있다. 즉, 이 구조는 전체 반복 서열의 일정 정도의 가변성과 함께 특이적 코어 서열(AATT)를 가진다. 본 발명의 인핸서 요소는 전적으로 AATT 반복 구조, 불완전 반복 구조 또는 AATT 반복 구조 및 불완전 반복 구조의 조합으로 구성될 수 있다.
본 발명의 인핸서 요소는 4 bp 서열의 반복 구조가 2개 이상, 바람직하게는 약 4개 이상, 가장 바람직하게는 약 8개 이상이고, 바람직하게는 약 20개 이하이다. 그러므로, 인핸서 요소는 약 8개 이상의 염기쌍(bp), 바람직하게는 약 16 bp 내지 약 32 bp, 가장 바람직하게는 약 80 bp 이하의 염기쌍을 함유한다.
본 발명의 인핸서 요소는 그것이 유래하거나 또는 천연적으로 기능하는 동일종 또는 상이한 종에서 사용될 수 있다. 천연 인핸서는 그 천연 환경에서 일반적으로 프로모터의 약 600 bp로부터 상류 및 그 내부에 존재하는 DNA 서열을 포함한다. 본 발명의 인핸서 요소는 시스 작용성이고, 바람직하게는 증폭시킬 프로모터내 전사 개시 도메인의 약 5000 bp내에 위치하고, 바람직하게는 약 2000 bp, 가장 바람직하게는 약 1000 bp에 인접하거나 그 내부에 위치한다. 예를 들면, mRNA의 개시 뉴클레오티드를 +1로 지정하면, 인핸서를 포함하는 서열은 약 -50 bp 내지 약 -1000 bp 상류에 위치하는 것이 바람직하고, 통상적으로는 약 -50 bp 내지 약 -900 bp, 더 구체적으로는 약 -50 bp 내지 약 -800 bp의 상류에 위치한다. 인핸서 요소는 그것이 증폭시키는 프로모터와 관련하여 상류 또는 하류에 위치할 수 있다. 한편, 인핸서 요소는 전사 단위의 인트론내에 위치할 수도 있다.
본 발명의 인핸서 요소는 인핸서 영역(이종성)과 천연적으로 결합되지 않은 프로모터 뿐만 아니라 인핸서(상동성)의 제어하에서 천연적으로 발견되는 프로모터를 포함하여 다양한 프로모터와 함께 이용할 수 있다.
식물에서의 전사의 증폭은 외래성 유전자 발현의 고레벨 뿐만 아니라 내재성 유전자 발현의 고레벨을 얻는 데에 유용하다. 본원에서 사용되는 "내재성"이란 용어는 야생형 숙주에서 통상 발견되는 유전자를 의미하는 반면에, "외래성"이란 용어는 야생형 숙주에서 통상 발견되지 않는 유전자를 의미한다.
본 발명의 인핸서 요소는 전사 개시 도메인을 포함하는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. "전사 개시 도메인"이란 적어도 RNA 폴리머라제 결합 부위 및 mRNA 개시 부위를 가진 프로모터를 의미한다. 프로모터는 다시 개방형 해독틀(ORF)를 포함할 때 단백질을 암호화하고, 통상 5' 및 3' 비해독 서열을 포함하기도 하는 내재성 또는 외래성 유전자에 작동 가능하게 연결된다. 그러한 개방형 해독틀 또는 RNA 암호화 서열로는 단백질 생성물을 암호화하는 천연의 개방형 해독틀, mRNA에서 유래한 cDNA 서열, 합성 DNA, 천연 유전자의 엑손에서 유래한 단백질 암호화 서열(예; 엑손 결찰에 의해 생성되는 개방형 해독틀), 및/또는 이들의 조합이 있다. 적합한 전사 종결 서열 및 폴리아데닐화 서열 역시 포함된다.
당해 유전자, 즉 그것의 발현 레벨이 본 발명에 따라 증가될 수 있는 유전자의 예로는 1차 RNA 생성물을 암호화하는 천연 유전자의 서열(식물, 동물, 박테리아, 비루스, 진균류), 특이 RNA 또는 단백질 생성물을 암호화하는 합성 DNA 서열, 부위 특이적 돌연변이 유발과 같은 돌연변이 유발에 의해 변형된 DNA 서열, 이들 서열중 임의의 것들의 키메라(융합 단백질을 생산하는 키메라) 및 상보적인 RNA 분자(안티센스)를 암호화하는 DNA 서열과 이들의 조합 및/또는 단편이 있다.
본 발명을 이용하여 증가된 레벨로 생성될 수 있는 단백질의 예로는 영양학적으로 중요한 단백질, 성장 촉진 인자, 식물에서의 조기 개화용 단백질, 특정 환경 조건하에서 식물을 보호할 수 있는 단백질(예; 금속이나, 제초제 또는 살충제와 같은 기타 독성 물질에 내성을 부여하는 단백질), 온도 극한에 대한 내성을 부여하는 스트레스 관련 단백질, 진균류, 박테리아, 비루스, 곤충 및 선충류에 대한 내성을 부여하는 단백질, 특이적인 상업적 가치를 지닌 단백질(예; EPSP 신타제와 같이 대사 경로에 관여하는 효소)이 있으나, 이들에 국한되지 않는다.
본원에 기술하는 인핸서 요소는 천연의 출처로부터 분리하거나(예; 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL)) 또는 표준 DNA 합성 기술에 의해 합성할 수 있다(문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Unit2.11, Ausubel 등 편집, 존 와일리 앤드 선즈, 1995] 참조).
일 양태로, 본 발명은 임의의 세포에서 임의의 유전자의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 전술한 (AATT)n반복 요소를 당해 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터에 작동 가능하게 연결시키는 단계 및 이 유전자의 발현을 증가시키는 단계를 포함한다. 프로모터는 구성성이거나 유도성일 수 있다. 본원에서 사용된 "증가된" 또는 "증가"란 용어는 본 발명의 인핸서 요소를 포함하는 프로모터와 결합되지 않은 상응하는 야생형 유전자의 발현과 비교하여 증가되는 유전자 발현을 의미한다.
"작동 가능하게 결합된" 및 "작동 가능하게 연결된"이란 용어는 본 발명의 인핸서 요소와 프로모터 서열 사이 및 또한 프로모터 서열과 이 프로모터가 조절하는 구조 유전자 사이의 기능적 연결을 의미한다. 작동 가능하게 연결된 인핸서 및 프로모터는 구조 유전자가 암호화하는 폴리펩티드의 발현을 제어한다.
본 발명에 이용되는 구조 유전자의 발현은 다수의 프로모터에 의해 작동될 수 있다. 당해 구조 유전자의 내재성 프로모터가 그 유전자의 전사 조절에 이용될 수 있지만, 프로모터는 외래의 조절 서열이 바람직하다. 식물 발현 벡터의 경우, 적합한 비루스 프로모터로는 CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터(Brisson 등, Nature, 310:511, 1984; Odell 등, Nature, 313:810, 1985), 피그워트 모자이크 비루스(FMV)에서 유래한 전체 길이의 전사 프로모터(Gowda 등, J. Cell Biochem., 13D:301, 1989) 및 TMV에서 유래한 코트 단백질 프로모터(Takamatsu 등, EMBO J. 6:307, 1987)가 있다. 한편, 리뷸로스 비스-포스페이트 카르복실라제의 소형 소단위(ssRUBISCO)에서 유래한 광유도성 프로모터(Coruzzi 등, EMBO J., 3:1671, 1984; Brogile 등, Science, 224:838, 1984), 만노핀 신타제 프로모터(Velten 등, EMBO J., 3:2723, 1984), 노팔린 신타제(NOS) 및 옥토핀 신타제(OCS) 프로모터(아그로박테리움 튜메파시엔스의 종양 유도성 플라스미드) 또는 열충격 프로모터(예; 콩 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B)(Gurley 등, Mol. Cell. Biol., 6:559, 1986; Severin 등, Plant Mol. Biol., 15:827, 1990)와 같은 식물 프로모터를 사용할 수 있다.
본 발명에 유용한 프로모터로는 공학적으로 만든 프로모터 뿐만 아니라, 구성성 및 유도성의 천연 프로모터가 있다. CaMV 프로모터가 구성성 프로모터의 예이다. 가장 유용한 유도성 프로모터는 1) 유도물질의 부재하에서는 낮은 발현을 제공하고, 2) 유도물질의 존재하에서는 높은 발현을 제공하며, 3) 식물의 정상적인 생리작용을 방해하지 않는 유도 체계를 이용하고, 4) 기타 유전자의 발현에는 영향을 끼치지 않아야 한다. 식물에 유용한 유도성 프로모터의 예로는 화학적 수단에 의해 유도되는 것들, 예를 들면, 구리 이온에 의해 활성화된 효모의 메탈로티오네인 프로모터(Mett 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 미국, 90:4567, 1993); 치환된 벤젠설폰아미드에 의해 활성화된 In2-1 및 In2-2 조절유전자 서열(예; 제초제 안정화물질(Hershey 등, Plant Mol. Biol., 17:679, 1991)); 및 글루코코르티코이드에 의해 유도되는 GRE 조절 서열(Schena 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 미국, 88:10421, 1991)이 있다. 기타 구성성 및 유도성 프로모터는 당업자에게는 널리 공지되어 있다.
선택된 구체적인 프로모터는 구조 유전자 생성물의 유효량의 생산을 초래하는 충분한 발현을 일으킬 수 있어야 한다. 본 발명의 구성체에 사용된 프로모터는 필요하다면, 그 제어 특성에 영향을 끼치도록 변형시킬 수 있다.
환경적으로 조절되는 프로모터, 예를 들면, 광 및 건조 상태에 의해 조절되는 프로모터를 본 발명에 이용할 수 있다. 호르몬에 의해 조절되는 프로모터를 이용할 수도 있다.
조직 특이적 프로모터를 본 발명에 이용할 수도 있다. 조직 특이적인 프로모터의 예로는 슈트 분열조직에서 발현되는 프로모터가 있다(Atanassova 등, Plant J., 2:291, 1992). 열매 특이적 프로모터 및 종자 특이적 프로모터, 또는 cdc2a 프로모터 및 cyc07 프로모터와 같은 돌연변이 식물에 유용한 기타 조직 특이적 프로모터는 당업자에게는 널리 공지되어 있다(문헌[Ito 등, Plant Mol. Biol., 24:863, 1994; Martinez 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 89:7360, 1992; Medford 등, Plant Cell, 3:359, 1991; Terada 등, Plant Journal, 3:241, 1993; Wissenbach 등, Plant Journal, 4:411, 1993] 참조).
전술한 바와 같이, 본 발명에 이용되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 인핸서 요소는 프로모터의 특이성을 변화시키지 않을 것이다. 달리 말하면, 본 발명의 인핸서 요소는 인핸서 요소와 결합된 프로모터의 고유 특이성에 영향을 끼치지 않는다.
선별 마커를 프로모터에 작동 가능하게 연결된 구조 유전자와 인핸서 요소를 포함하는 구성체와 결합시킬 수도 있다. 본원에서 사용된 "마커"란 용어는 마커를 함유하는 식물 또는 식물 세포의 선별 또는 검색을 가능하게 하는 형질 또는 표현형을 암호화하는 유전자를 의미한다. 마커 유전자는 항생물질 내성 유전자인 것이 바람직하므로, 적합한 항생물질을 사용하여, 형질전환되지 않은 세포로부터 형질전환된 식물 세포를 선별할 수 있다. 적합한 선별 마커의 예로는 아데노신 디아미나제, 디히드로폴레이트 리덕타제, 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제, 티미딘 키나제, 크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 및 아미노-글리코사이드 3'-O-포스포트랜스퍼라제 II(카나마이신, 네오마이신 및 G418 내성)가 있다. 기타 적합한 마커는 당업자에게는 공지되어 있다. 예를 들면, uidA 유전자, GUS, 루시퍼라제 또는 GFP 유전자와 같은 검색가능한 마커를 사용할 수도 있다.
본 발명에 따른 식물의 형질전환은 식물 분자 생물학 분야의 당업자에게는 공지된 다양한 방법에 의해 수행할 수 있다(본원에 참고로 인용한 문헌[Methods of Enzymology, Vol. 153, 1987, Wu and Grossman 편집, 아카데믹 프레스] 참조). 본원에 사용된 "형질전환"이란 용어는 외래성 또는 내재성 핵산 서열의 도입에 의해 숙주 식물의 유전자형을 변형시키는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 형질전환 방법을 개시하기 위해서는, 먼저 적합한 벡터를 구성하고, 그 벡터를 식물 세포내로 적절히 도입시킬 필요가 있다. 여기서 이용되는 벡터의 구성 방법에 관한 상세한 사항은 식물 유전 공학 분야의 당업자에게는 공지되어 있다.
예를 들면, 본 발명에 이용되는 인핸서-프로모터 구성체는 Ti 플라스미드, 뿌리 유도성(Ri) 플라스미드 및 식물 비루스 벡터를 사용하여 식물 세포내로 도입시킬 수 있다. 그러한 기술에 대한 검토를 위해서는 본원에 참고로 인용한 문헌[Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, 아카데믹 프레스, 뉴욕, 섹션 VIII, 421-463면; 및 Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology, 2판, Blackie, 런던, Ch. 7-9 및 Horsch 등, Science, 227:1229, 1985] 참조.
당업자는 본 발명의 핵산 서열을 비교적 천연의 상태로 도입시키기 위한 적합한 벡터를 선별할 수 있다. 따라서, 도입된 DNA 서열을 보유하는 식물을 생산하는 어떠한 벡터라도 충분하다. DNA의 나출편 조차도 저효율이지만 본 발명의 성질을 부여할 수 있을 것으로 예상된다. 벡터의 선별 또는 벡터의 사용 여부는 통상 선택된 형질전환 방법에 의해 결정된다.
예를 들면, 이종 핵산 서열은 Ti 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 이용하여 식물 세포내로 도입시킬 수 있다. 형질전환 매개체로서 에이. 튜메파시엔스 배양물을 사용할 때, 형질전환된 조직의 정상적인 비종양원성 분화가 가능하도록 벡터 캐리어로서 아그로박테리움의 비종양원성 균주를 사용하는 것이 가장 유리하다. 아그로박테리움이 이중의 Ti 플라스미드 시스템을 보유하는 것이 또한 바람직하다. 그러한 이중 시스템은 1) 식물내로 접합전달(transfer) DNA(T-DNA)의 도입에 필수적인 독성 영역을 가진 제1 Ti 플라스미드 및 2) 키메라 플라스미드를 포함한다. 키메라 플라스미드는 접합전달될 핵산에 인접한 야생형 Ti 플라스미드의 T-DNA 영역의 하나 이상의 경계 영역을 포함한다. 이중 Ti 플라스미드 시스템은 식물 세포의 형질전환에 효과적인 것으로 알려져 있다(De Framond, Biotechnology, 1:262, 1983; Hoekema 등, Nature, 303:179, 1983). 그러한 이중 시스템은 아그로박테리움에서 Ti 플라스미드내로 통합시킬 필요가 없기 때문에 바람직하다.
아그로박테리움의 사용을 포함하는 방법으로는 1) 아그로박테리움과 배양된 분리된 원형질체의 동시 배양법, 2) 아그로박테리움을 사용한 식물 세포 또는 조직의 형질전환 또는 3) 아그로박테리움을 사용한 종자, 첨부 또는 분열조직의 형질전환이 있으나, 이에 국한되지 않는다.
또한, 유전자 접합전달은 문헌[Bechtold 등, C.R. Acad. Sci. Paris, 316:1194, 1993]에 기재된 바와 같이, 아그로박테리움에 의한 동일계 형질전환에 의해 수행할 수 있다. 이 방법은 아그로박테리움 세포의 현탁액의 진공 침투에 기초한다.
핵산을 식물 세포내로 도입시키는 바람직한 방법은 외식편, 분열 조직 또는 종자와 같은 그러한 식물 세포를 전술한 바와 같이 형질전환된 아그로박테리움 튜메파시엔스로 감염시키는 것이다. 당해 분야에 공지된 적합한 조건하에, 형질전환된 식물 세포를 증식시켜 슈트, 뿌리를 형성하고 식물체로 더욱 발육시킨다.
한편, 본원에 기술하는 인핸서 구성체는 기계적 또는 화학적 수단을 사용하여 식물 세포와 접촉시킴으로써 식물 세포내로 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 핵산은 마이크로피펫을 이용하여 식물 세포내로 직접 미세주입에 의해 기계적으로 접합전달할 수 있다. 더욱이, 핵산은 세포가 흡수하는 유전물질과 침전 복합체를 형성하는 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 식물 세포내로 접합전달할 수 있다.
핵산은 또한 전기사출법(electroporation)에 의해 식물 세포내로 도입시킬 수도 있다(Fromm 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 미국, 82:5824, 1985, 본원에 참고로 인용함). 이 기술에서는, 식물 원형질체를 관련 핵산 서열을 포함하는 핵산 또는 벡터의 존재하에 전기영동시킨다. 전기장의 세기가 높은 전기 충격은 식물막을 가역적으로 투과하여 핵산을 도입시킬 수 있다. 전기사출된 식물 원형질체는 세포벽을 재형성하고, 분열하여 식물 칼루스를 형성한다. 형질전환된 유전자를 사용하여 형질전환된 식물 세포를 선별하는 것은 본원에 기술한 표현형 마커를 사용하여 수행할 수 있다.
식물 세포내로 핵산을 도입시키는 또 다른 방법은 소형 비드 또는 입자의 매트릭스내에 또는 그 표면상에 포함된 도입시킬 핵산과 함께 소형 입자에 의한 고속 사출 침투법(ballistic penestration)이다(Klein 등, Nature, 327:70, 1987). 통상적으로는 단 한 번의 새로운 핵산 서열의 도입이 필요하지만, 이 방법은 특히 다수의 도입을 제공한다.
이종 핵산을 식물 세포내로 도입시키는 벡터로서 카울리플라워 모자이크 비루스(CaMV)를 사용할 수도 있다(미국 특허 제4,407,956호). CaMV 비루스 DNA 게놈은 박테리아에서 증폭시킬 수 있는 재조합 DNA 분자를 생성시키는 모 박테리아 플라스미드내로 삽입시킨다. 클로닝후, 재조합 플라스미드를 재클로닝하고, 목적하는 핵산 서열의 도입에 의해 추가로 변형시킬 수 있다. 재조합 플라스미드의 변형된 비루스 부분을 모박테리아 플라스미드로부터 절제하여 식물 세포 또는 식물의 접종에 사용한다.
후술하는 실시예에서는, 담배 식물을 문헌[Rogers 등, Methods Enzymol. 118:627, 1986]의 방법에 의해 일반적으로 형질전환시킨다. 간단히 언급하면, 담배엽 디스크를 표면 멸균된 담배엽으로부터 취하고, 무라시게-스쿡(MS) 배지에서 배양하여 상처 표면에서 부분적 세포 형성을 촉진한다. 그 다음, 엽 디스크를 인핸서, 프로모터 및 당해 유전자의 목적하는 조합을 가진 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 튜메파시엔스 세포의 배양물에 침지시킨다. 그 후, 디스크를 형질전환된 세포만이 칼루스로 성장될 카나마이신 함유 MS 배지상에서 배양한다. 슈트가 성장하고, 발근 배지에서 성장시킴에 의해 묘목이 칼루스로부터 재생된다.
팔린드롬형 요소 결합 인자(PABF)
본 발명은 또한 실질적으로 순수한 팔린드롬형 요소 결합 인자(PABF)를 제공하는데, 이것은 환원성 SDS-PAGE로 측정한 분자량이 약 67 kDa이고, (AATT)n반복 요소(상기에 상세히 설명한 바와 같이, n은 2 이상임)에 결합하며, N 말단으로부터 C 말단 방향으로 히스톤형 도메인, 글루타민 풍부 도메인 및 HMP I/Y형 도메인을 가지는 것이 특징이다.
본원에 사용된 "실질적으로 순수한"이란 용어는 천연적으로 결합되어 있는 기타 단백질, 지질, 탄수화물 또는 기타 물질이 실질적으로 부재하는 PABF를 의미한다. 당업자는 단백질 정제의 표준 기술을 사용하여 PABF를 정제할 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 비환원성 또는 환원성 폴리아크릴아미드 겔상에서 단일의 주밴드를 생성할 것이다. PABF 폴리펩티드의 순도는 아미노 말단 아미노산 서열 분석에 의해 측정할 수도 있다. PABF 폴리펩티드는 PABF의 활성이 천연 상태로 존재하는 한, 폴리펩티드의 기능적 단편을 포함한다(즉, 단편들이 전사 인자로서 기능하고 (AATT)n반복 요소에 결합하는 능력을 보유한다). 그러한 폴리펩티드로는 항체 생산을 유도할 수 있는 면역학적으로 반응성이 있는 펩티드가 있다. 본 발명의 바람직한 PABF는 식물 세포로부터 유래한다.
본 발명은 PABF 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이들 폴리뉴클레오티드로는 PABF를 암호화하는 DNA, cDNA 및 RNA가 있다. PABF의 일부 또는 전부를 암호화하는 모든 폴리뉴클레오티드는 역시 이들이 PABF 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하는 한, 즉 암호화된 펩티드가 전사 인자로서 작용하고 (AATT)n반복 요소에 결합하는 능력을 보유하는 한, 본원에 포함된다는 것을 이해하여야 한다. 그러한 폴리뉴클레오티드로는 천연 존재형, 합성 및 의도적으로 조작한 폴리뉴클레오티드가 있다. 예를 들면, PABF 폴리뉴클레오티드는 부위 지향적인 돌연변이 유발 처리를 할 수 있다. PABF에 대한 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 안티센스 서열을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드로는 유전자 암호의 결과로서 축퇴성인 서열들이 있다. 자연계에는 20종의 아미노산이 있는데, 대부분은 하나 이상의 코돈에 의해 지정된다. 그러므로, 모든 축퇴성 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 포함된다.
본원에 구체적으로 개시하는 것은 담배 PABF를 암호화하는 DNA 서열이다. 이 서열은 길이가 약 546개 아미노산인 폴리펩티드를 암호화하는 개방형 해독틀을 포함한다. 본 발명의 식물 PABF 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2에 제시된 서열이 바람직하고, 아미노산 서열은 서열번호 3(도 5)에 제시한 것이 바람직하다.
PABF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로는 서열번호 2 뿐만 아니라, 서열번호 2에 상보적인 핵산 서열(도 5)도 있다. 상보적인 서열은 안티센스 핵산을 포함할 수 있다. 서열이 RNA이면, 서열번호 2의 데옥시뉴클레오티드 A, G, C 및 T는 리보뉴클레오티드 A, G, C 및 U로 각각 대체된다. 본 발명에는 또한 단편이 생리적 조건하에서 서열번호 3의 단백질을 암호화하는 DNA에 선택적으로 하이브리드화하기에 충분한 길이인 15개 이상의 염기로 이루어진 상기 핵산 서열의 단편도 포함된다. 구체적으로, "선택적으로 하이브리드화함"이란 단편이 보통의 조건 내지 고엄중성의 조건하에 PABF 단백질을 암호화하는 DNA에 하이브리드화한다는 것을 의미한다(문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2판)] 참조).
하기 실시예들에서 기술하는 PABF 핵산 서열은 첫 번째 ATG를 해독 개시부로 사용하는 것을 고려하면, 546개의 아미노산의 긴 개방형 해독틀 하나를 포함한다. 이것은 외관상 계산되는 상대 분자 질량(Mr)이 67 kDa인 단백질을 생성시킨다. SDS 폴리아크릴아미드 겔상에서 분류한 담배 핵 추출물을 사용한 사우스웨스턴 블롯 분석으로부터 PABF 폴리펩티드가 (AATT)n인핸서 요소에 결합하는 것을 확인하였다(실시예 3).
소수성 예측 분석(Kyte and Doolittle, J. Mol. Bio., 157:105, 1982)에서는 PABF가 고도로 친수성인 것으로 나타났고, PABF는 3개의 특징적인 도메인을 포함하는 것으로 시사되었다. N-말단내 아미노산 38 내지 127은 뉴클레오좀들 사이에 링커 DNA를 결합시켜 보다 고차원의 구조를 형성하는 염기성 염색체 단백질인 히스톤 H1의 중앙의 구형 도메인에 고도의 상동성을 나타낸다. 아미노산 153과 231 사이의 PABF의 중앙부는 글루타민 풍부 도메인으로 구성된다. 78개 아미노산중 39개(50%)가 글루타민 잔기였고, 이들은 균일하게 분포하였다. C-말단 도메인인 아미노산 274 내지 484는 포유동물의 HMG I/Y 단백질과 고도의 유사성을 나타냈다. HMG I/Y 단백질은 AT-풍부 서열에 우선적으로 결합하는 소형의 염기성의 비히스톤계 염색체 단백질이다(Bustin 등, 상기 참조). 결합은 11개 아미노산의 펩티드인 AT-후크(hook) 모티프에 의해 매개되는데, 이 모티프는 HMG I/Y 유전자에 3회 반복되어 있다. 6개의 AT-후크 모티프가 PABF에 존재한다. 또한, 7개 아미노산에 의해 분리된 7번째 AT 후크 모티프의 하나의 N-말단의 절반과 하나의 C-말단의 절반이 확인되었다. PABF의 최초에 분리된 C-말단부는 3개의 AT-후크 모티프를 포함하는데, 이는 이 모티프가 PABF의 DNA 결합 활성을 담당한다는 것을 강력히 시사하는 것이다.
PABF 1차 아미노산 서열의 사소한 변형은 본원에 기술한 PABF 폴리펩티드와 비교하여 실질적으로 등가의 활성을 가지는 단백질을 생성시킬 수 있다. 그러한 단백질로는 "실질적으로 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는" 이란 용어에 의해 정의되는 것들이 있다. 그러한 변형으로는 부위 지향적 돌연변이 유발에 의하는 것과 같이, 의도적인 것이거나 자발적일 수 있다. 상기 변형에 의해 생산되는 폴리펩티드는 PABF의 생물학적 활성이 잔존하는 한 모두 본원에 포함된다. 또한, 하나 이상의 아미노산의 결실은 그 생물학적 활성을 크게 변화시키지 않고 생성 분자의 구조의 변형을 초래할 수 있다. 이것은 잠재적으로 용도가 광범위한 보다 작은 활성 분자의 개발을 유도할 수 있다. 예를 들면, PABF의 생물학적 활성에 요구되지 않는 아미노 말단 또는 카르복시 말단 아미노산을 제거할 수 있다.
본 발명의 PABF 폴리펩티드는 개시된 서열(서열번호 3; 도 5) 및 그 보존적 변형체를 포함한다. 본원에 사용되는 "보존적 변형체"란 용어는 임의의 아미노산 잔기를 또 하나의 생물학적으로 유사한 잔기로 대체한 것을 의미한다. 보존적 변형의 예로는 이소루이신, 발린, 루이신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기를 다른 소수성 잔기로 치환하는 것, 리신을 아르기닌으로, 아스파라긴산을 글루탐산으로 또는 아스파라긴을 글루타민으로 등과 같이, 하나의 극성 잔기를 다른 극성 잔기로의 치환하는 것이 있다. "보존적 변형"이란 또한 치환된 폴리펩티드에 대해 형성된 항체 역시 비치환된 폴리펩티드와 면역반응하는 것을 조건으로 비치환된 모아미노산 대신에 치환된 아미노산을 사용하는 것을 포함한다.
본 발명의 핵산 서열은 여러 가지 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들면, DNA는 당해 분야에 널리 공지된 하이브리드화 기술을 사용하여 분리할 수 있다. 그 예로는 1) 상동성 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 프로브와 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리의 하이브리드화, 2) 당해 DNA 서열에 어닐링될 수 있는 프라이머를 사용하여 게놈 DNA 또는 cDNA상에서 수행하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 3) 공통의 구조적 특징을 가진 클로닝된 DNA 단편을 검출하기 위한 발현 라이브러리의 항체 검색법이 있다.
본 발명의 PABF 폴리뉴클레오티드는 식물에서 유래하는 것이 바람직하다. 핵산 하이브리드화에 의존하는 검색 절차는 적합한 프로브를 이용할 수 있다면, 어떠한 유기체로부터 어떠한 유전자 서열도 분리할 수 있다. 당해 단백질을 암호화하는 서열의 일부에 상응하는 올리고뉴클레오티드 프로브는 화학적으로 합성할 수 있다. 이것은 아미노산 서열의 짧은 올리고펩티드 연장체를 알아야 할 필요가 있다. 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 유전자 암호로부터 추론할 수 있으나, 암호의 축퇴성을 고려하여야 한다. 서열이 축퇴성인 경우 혼합 부가 반응을 수행할 수 있다. 이것은 변성된 2본쇄 DNA의 이질성 혼합물을 포함한다. 그러한 검색의 경우, 하이브리드화는 1본쇄 DNA 또는 2본쇄 DNA상에서 수행하는 것이 바람직하다. 하이브리드화는 당해 폴리펩티드와 관련되는 극히 적은 양의 mRNA 서열이 존재하는 출처에서 유래한 cDNA 클론의 검출에 특히 유용하다. 달리 말하면, 비특이적 결합을 피하기 위한 엄중 하이브리드화 조건을 사용함으로써, 예를 들면, 표적 DNA가 그 완전한 상보체인 혼합물의 그 단일 프로브에 혼성화함에 의한 특이적 cDNA 클론의 자동방사성 사진에 의해 가시화할 수 있다(Wallace 등, Nucl. Acad. Res., 9:879, 1981; Maniatis 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 하버, 뉴욕, 1989).
PABF를 암호화하는 특이 DNA 서열의 개발은 1) 게놈 DNA로부터 2본쇄 DNA 서열의 분리, 2) 당해 폴리펩티드에 필수 코돈을 제공하기 위한 DNA 서열의 화학적 제조, 3) 진핵 공여 세포로부터 분리된 mRNA의 역전사에 의한 2본쇄 DNA 서열의 시험관내 합성, 및 당해 DNA 서열에 어닐링될 수 있는 프라이머를 사용하는 게놈 DNA 또는 cDNA의 PCR에 의해 이루어질 수도 있다. 후자의 경우에, 결국 일반적으로 cDNA로 지칭되는 mRNA의 2본쇄 DNA 상보체가 형성된다.
DNA 서열의 합성은 목적 폴리펩티드 생성물의 아미노산 잔기의 전체 서열을 알고 있을 때 자주 선택되는 방법이다. 당해 cDNA 서열을 분리하기 위한 표준 절차에는 고레벨의 유전자 발현을 가지는 공여 세포에 풍부한 mRNA의 역전사에서 유래한 플라스미드 보유 또는 파지 보유 cDNA 라이브러리의 형성법이 있다. 폴리머라제 연쇄 반응과 함께 사용할 경우에, 드문 발현 생성물이 클로닝될 수도 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열의 상당 부분이 알려져 있는 경우에, 표적 cDNA에 임시적으로 존재하는 서열을 증폭시키는 표지된 1본쇄 또는 2본쇄의 DNA 또는 RNA 프로브 서열의 생산법을, 1본쇄형으로 변성된 cDNA의 클로닝된 사본상에서 수행되는 DNA/DNA 하이브리드화 절차에 이용할 수 있다(Jay 등, Nucl. Acad Res., 11:2325, 1983).
람다 gt11과 같은 cDNA 발현 라이브러리는 PABF에 특이적인 항체를 사용하여 하나 이상의 에피토프를 가진 PABF 펩티드에 대해 간접적으로 검색할 수 있다. 그러한 항체는 다클론으로 또는 단일클론으로 유도될 수 있고, PABF cDNA의 존재의 표시인 발현 생성물의 검출에 사용할 수 있다.
PABF를 암호화하는 DNA 서열은 적합한 숙주 세포내로 DNA 접합전달에 의해 시험관내에서 발현시킬 수 있다. "숙주 세포"는 벡터가 증폭되고 그 DNA가 발현될 수 있는 세포이다. 이 용어는 또한 당해 숙주 세포의 임의의 자손을 포함한다. 복제중에 일어나는 돌연변이가 존재할 수 있기 때문에, 모든 자손이 모세포와 동일할 수는 없음을 이해할 수 있다. 그러나, 그러한 자손은 "숙주 세포"란 용어를 사용할 경우에 포함된다. 외래 DNA가 숙주에서 연속적으로 유지된다는 것을 의미하는 안정한 접합전달 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
꽃, 종자, 엽, 가지, 열매 등과 같은 재생 식물에서 얻은 식물의 부분은 이들이 본 발명에 따라 형질전환된 세포를 포함하는 것을 조건으로 본 발명의 범위에 포함된다. 재생 식물의 자손 및 변형체 및 돌연변이체는 또한 이들 부분이 본 발명의 도입된 핵산 서열을 포함하는 것을 조건으로 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서, PABF 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 발현 벡터내로 삽입될 수 있다. "재조합 발현 벡터"란 용어는 플라스미드, 비루스를 의미하거나 또는 PABF 유전자 서열의 삽입 또는 혼입에 의해 조작된 당해 분야에 공지된 기타 매개체를 의미한다. 그러한 발현 벡터는 숙주의 삽입된 유전자 서열의 효율적인 전사를 촉진하는 프로모터 서열을 포함한다. 발현 벡터는 통상 복제 기점, 프로모터, 뿐만 아니라 형질전환된 세포의 표현형에 의한 선별을 가능하게 하는 특이 유전자를 포함한다.
PABF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 식물, 원핵세포 또는 진핵세포에서 발현시킬 수 있다. 숙주로는 식물 세포 뿐만 아니라, 미생물, 효모, 곤충 및 포유동물 유기체가 있을 수 있다. 원핵세포에서 진핵세포 또는 비루스 서열을 가진 DNA 서열을 발현시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 숙주에서 발현 및 복제될 수 있는 생물학적으로 기능성인 비루스 및 플라스미드 DNA 벡터는 당해 분야에 공지되어 있다. 그러한 벡터를 사용하여 본 발명의 DNA 서열을 혼입시킨다.
재조합 DNA를 사용한 숙주 세포의 형질전환은 당업자에게는 널리 공지된 통상의 기술에 의해 수행할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 재조합에 의해 발현된 폴리펩티드 또는 그 단편의 분리 및 정제는 단일클론 항체 또는 다클론 항체가 관여하는 면역학적 분리법 및 제조용 크로마토그래피를 비롯한 통상의 수단에 의해 수행할 수 있다.
본 발명의 PABF 폴리펩티드를 사용하여 PABF 폴리펩티드의 에피토프에 결합하거나 면역반응성인 항체를 제조할 수 있다. 상이한 에피토프 특이성을 가진 수집된 단일클론 항체, 뿐만 아니라 별개의 단일클론 항체 제제를 주성분으로 하여 구성되는 항체가 제공된다. 단일클론 항체는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 단백질의 단편을 포함하는 항원으로부터 제조된다(Kohler 등, Nature, 256:495, 1975; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 등 편집, 1989).
본 발명에 사용된 "항체"란 용어는 천연의 분자 뿐만 아니라, 에피토프 결정인자에 결합할 수 있는 그 단편, 예를 들면, Fab, F(ab')2및 Fv를 포함한다. 이러한 항체 단편은 그 항원 또는 수용체와 선택적으로 결합하는 약간의 능력을 보유하는 것으로서, 다음과 같이 정의된다:
(1) 항체 분자의 1가의 항원 결합 단편을 포함하는 Fab 단편은 전체 항체를 효소 파파인으로 처리하여 천연의 경쇄와 하나의 중쇄의 일부를 생성시킴으로써 제조할 수 있다.
(2) 항체 분자의 Fab' 단편은 전체 항체를 펩신으로 처리하고, 환원시킴으로써 천연의 경쇄와 중쇄의 일부를 생성시킴으로써 얻을 수 있고, 항체 분자당 두 개의 Fab' 단편이 얻어진다.
(3) (Fab')2항체 단편은 전체 항체를 효소 펩신으로 처리하고 후속의 환원 처리를 하지 않고 얻을 수 있으며, (Fab')2는 두 개의 이황화물 결합에 의해 함께 결합된 두 개의 Fab' 단편의 이량체이다.
(4) Fv는 두 개의 쇄로 발현되는 경쇄 가변부와 중쇄 가변부를 포함하는 유전자 조작된 단편으로 정의된다.
(5) 단쇄 항체("SCA")는 유전자 융합된 단쇄 분자로서 적합한 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 경쇄 가변부와 중쇄 가변부를 포함하는 유전자 조작된 분자로 정의된다.
상기 단편들의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(본원에 참고로 인용한 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 하버 래보러토리, 뉴욕(1998)] 참조).
본 발명의 PABF 폴리펩티드에 결합하는 항체는 면역화 항원으로서 당해 소형 펩티드를 포함하는 천연 폴리펩티드 또는 단편을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, PABF의 N-말단 또는 C-말단 도메인에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 면역화에 사용된 폴리펩티드 또는 펩티드는 필요에 따라 캐리어 단백질에 접합될 수 있는 것으로서 해독된 cDNA에서 유도되거나 화학합성법에 의해 유도될 수 있다. 펩티드에 화학적으로 결합되는 그러한 통상 사용되는 캐리어로는 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌(KLH), 티로글로뷸린, 소혈청 알부민(BSA) 및 파상풍 톡소이드가 있다. 결합된 펩티드를 사용하여 동물(예; 마우스, 래트 또는 토끼)을 면역화시킨다
에피토프와 유사한 단일클론 항체의 제조에는 항-이디오타입 기술을 사용할 수도 있다.
본원에 기술하는 유전자 발현의 증가 방법은 (AATT)n반복 요소를 발현될 유전자와 작동 가능하게 연결된 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결시키는 단계, 및 선택적으로 반복 요소를 PABF 폴리펩티드와 접촉시켜 유전자 발현을 추가로 증가시키는 단계를 포함한다. 전술한 바와 같이, PABF는 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, (AATT)n반복 요소에 결합하고, (AATT)n인핸서 요소의 활성을 추가로 "상승시키는(boost)" DNA 결합 단백질이다. 추가의 상승을 위해서는, (AATT)n반복 요소에 작동 가능하게 연결된 프로모터 영역에 PABF를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 작동 가능하게 연결시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정의 이론을 고수하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 (AATT)n반복 요소와 프로모터에 작동 가능하게 연결된 PABF의 증가된 발현은 양성 피드백 루프를 이루어, PABF가 (AATT)n반복 요소에의 결합에 의해 그리고 그 자체의 발현의 연속적인 증가의 자극에 의해 스스로의 발현을 유도하는 것으로 생각된다.
상기 개시사항은 본 발명을 일반적으로 설명한 것이다. 하기의 구체적인 실시예를 참조하면 보다 완전한 이해를 얻을 수 있으며, 다만 이들 실시예는 예시 목적으로만 제시되는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
하기의 실시예들은 비특이적 인핸서로 기능하는 PAL2 프로모터의 상류 영역내에 (AATT)-반복 요소 PA 시스-요소의 동정 방법을 설명한다. 이러한 모티프가 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결될 때 특이적 전사 패턴의 일반적인 증가가 관찰되었다. 그 C-말단 도메인에 존재하는 AT-후크 DNA 결합 분자를 통해 상기 요소에 결합하는 신규의 인자가 클로닝되었다. 이 인자는 신규의 3부분 도메인 구조를 가지는데, 이 구조의 응집 작용성은 비특이적 인핸서로서의 동족 시스-요소의 활성과 일치하는 것이다.
실시예 1
재료 및 방법
플라스미드 구성 및 식물 형질전환-PAL2 프로모터의 153 bp의 RsaI 단편(Cramer 등, Plant Mol. Biol., 12:367, 1989)를 -326 및 -72 CHS15 프로모터/GUS 유전자 융합체(Stermer 등, Mol. Plant-Microb. Int., 3:381, 1990)의 상류의 채워진 HindIII 부위내로 클로닝하였다. 유사하게, (AATT)3올리고뉴클레오티드를 합성하고, 키나제 처리하고, 결찰하고, 충전 반응후에 pGEM 7의 SmaI 부위내로 클로닝하였다. 한 가지 플라스미드(pPAs)는 서열 (AATT)13의 삽입체를 포함하였는데, 이것은 합성 팔린드롬형(PA) 요소에 대해 PAs로 명명되었다. 이 단편을 사용하여 -326 및 -72 CHS 15 프로모터/GUS 유전자 융합체의 상류의 PAs를 서브클로닝하였다. 아그로박테리움 튜메파시엔스 LB4404(Rogers 등, Methods Enzymol., 118:627, 1986)를 사용하여 엽 디스크 형질전환에 의해 돌연변이 담배 식물을 생성시키고, 25℃에서 16h 광/8h 암 주기하에서 200 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유한 MS 배지(Murashige and Skoog, Physiol. Plant, 15:473, 1962)에서 증식시켰다.
형광측정계에 의한 GUS 분석-조직 추출물내 GUS 활성은 형광측정계/비색계(어메리칸 인스트루먼트 컴파니)를 사용하여 상응하는 글루쿠로니드(Jefferson 등, EMBO J., 6:3901, 1987)로부터 4-메틸움벨리페론(MU)의 생산을 측정함으로써 조직 추출물내 GUS 활성을 측정하였다. 단백질 농도는 브래드포드의 방법(Bradford, M.M., Anal. Biochem., 72:248, 1976)에 따라 측정하였다.
일반 분자 생물학적 기술-담배 DNA는 엽으로부터 분리하였고(Murray and Thompson, Nucl. Acids Res., 8:4321, 1980), 전체 RNA는 다양한 담배 조직으로부터 제조하였다(Chirgwin 등, Biochemistry, 18:5294, 1979). 서던 및 노던 블롯의 경우, 핵산을 니트란 막상으로 옮겼다(Schleicher and Schull). 하이브리드화는 60℃에서 수행하였고(Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 81:1991, 1984), 막은 실온에서 2x SSC, 1% SDS에서 2회, 60℃에서 0.2x SSC, 1% SDS에서 1회, 그리고, 보다 낮은 엄중 하이브리드화의 경우, 60℃에서 1x SSC, 1% SDS에서 세척하였다. 프로브는 λ900 cDNA 단편의 무작위적 프라이밍(Feinberg and Vogelstein, Anal. Biochem., 132:6, 1983)에 의해 제조하였다. 올리고뉴클레오티드는 밀리포어(매사추세츠주 베드포드) DNA 합성기상에서 합성하였다.
프로브로 사용된 상이한 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다(5'-3'):
PA: (AATTAATTAATCAATTAATTAATTAATTGATTGATT)(서열번호 1);
PF: (CATAAGGATTAGGAATTTAATTTCGTAG(서열번호 4));
AT: (TATATATATATATATATATATATATATATACCACGT(서열번호 5));
AC: (CTTGTCATTATTTCTCCACCAACCCCCTTCACTTCCC(서열번호 6));
G-상자: (TGCAGGTGTTGCACGTGATACTCACCTACCCTGCA(서열번호 7));
H-상자: (CGACTCACCTACCTGACATGCTACGCAGCG(서열번호 8)).
PABF를 암호화하는 cDNA는 일련의 정착된 결실의 생성후에 양쪽 가닥상에서 서열분석되었다(Sanger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 74:54563, 1977). 위스콘신 대락교 유전학 컴퓨터 그룹 서열 분석 소프트웨어 패키지(Devereux 등, Nucl. Acids Res., 12:387, 1984)를 사용하여 서열 데이터를 분석하고, 블라스트 네트워크 서비스를 사용하여 상동성 연구를 수행하였다(Altshul 등, J. Mol. Biol., 215:403, 1990).
전기영동에 의한 이동성 변화 분석(EMSA)-다음과 같은 결합 완충액에서 각각 6 ㎍의 폴리[dI-dC]의 배양된 콩 세포(캐나다 원더 재배종) 및 담배 스템으로부터 2 x 104cpm의32P 표지된 프로브인 20 ㎍의 핵 추출물(Staiger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 86:6930, 1989)을 함유하는 20 ㎖에서 결합 반응을 수행하였다: 20 mM Hepes, pH7.9/20% 글리세롤/0.2 M KCl/0.4 mM EDTA/0.5 mM PMSF/2 mM MgCl2/1 mM DTT(Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, 존 와일리 앤즈 선즈, 뉴욕, 1992). 다음과 같은 PA 모티프를 가진 상보성 올리고뉴클레오티드를 키나제 처리하고, 어닐링하고 결찰하여 쇄상체 PA 요소를 생성시켰다(Vinson 등, Genes Dev,, 2:801, 1988):
(AATTAATTAATCAATTAATTAATTAATTGATTGATT)(서열번호 1).
프로브로서 겔 정제된 5량체를 사용하였다. 클리나우 폴리머라제를 사용한 충전 반응에 의해 제한 단편을 표지하였다.
DNase I 푸트프린트 분석-DNase I 푸트프린트 분석법은 Ausubel 등의 방법(Ausubel 등, 상기 참조)에 따라 수행하였다. 간단히 언급하면, pGEM7내로 서브클로닝된 153 bp의 RsaI PAL2 프로모터 단편(-410 내지 -255)의 비암호 가닥을 벡터의 다수 클로닝 부위에 존재하는 BamHI 부위의 오목한 3'- 단부에서 충전함으로써 표지시켰다. 표지된 단편은 25℃에서 1분 동안 각각 0.25 u/㎖ 및 1 u/㎖로 DNase I 처리하기 전에 50 ㎖의 반응물내 10 ㎍의 콩 핵 추출물과 함께 0℃에서 10분 및 25℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 표지된 단편의 분취물을 화학적 분해 방법에 의한 서열분석에 사용하였다(Maxam 등, Methods Enzymol., 65:499, 1980).
사우스웨스턴 분석-2본쇄 PA 올리고뉴클레오티드를 쇄상체화하여 생성된 PA 요소의 다수 사본을 포함하는 프로브로 담배 스템 RNA에서 얻은 λgt11 라이브러리를 검색하였다. 재조합 파지의 성장 및 이소프로필 β-티오갈락토사이드 유도후, 단백질을 니트로셀룰로스 막상에 옮겼다(Schleicher and Schull). 막에 결합된 단백질을 변성시키고 재생시켰다(Vinson 등, 상기 참조; Singh 등, Bio Techniques, 7:252, 1989). 5% 무지방 건유로 보충된 결합 완충액(BB, 20 mM Hepes, pH7.9/3 mM MgCl2/40 mM KCl/1 mM DTT)에서 30분 동안 막을 차단시킨 후에, 필터를 BB에서 0.25%의 우유, 106cpm/㎖의 프로브 및 실온에서 3시간 동안 변성시킨 5 ㎍/㎖의 연어 정자 DNA와 하이브리드화하였다. 자동방사성 사진 분석전에 필터를 BB로 10분 동안 3회 세척하였다.
PABF 재조합 용원(lysogen)을 에스케리키아 콜리 Y1089에서 생성시켰다. 용원성 추출물(Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 랩 프레스, 제2판)을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 분리하고 니트로셀룰로스에 옮겼다. 4℃에서 9 시간 동안 5% 우유를 함유한 BB로 재생 및 차단시킨 후, 막을 절단하여 스트립을 만들고, 상이한 프로브와 4℃에서 10 시간 동안 하이브리드화하였다. 쇄상체의 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가의 겔 정제 과정 없이 사용하였다. PCR 단편을 표지하기 위해, α-35S dCTP를 비표지된 dCTP 대신에 사용하였다.
실시예 2
일반 인핸서로서의 PA 요소-돌연변이된 담배에서의 PAL2 프로모터의 5' 결실의 분석으로부터, 주요량의 요소는 전사 개시부에 상대적인 위치 -480과 -289 사이에 존재하는 것으로 나타났다(Leyva 등, Plant Cell, 4:263, 1992). 도 1B는 프로모터 GUS-융합 구성체(축척은 고려하지 않음)를 도시한 것이다. (AATT)13서열을 가진 PAL2 프로모터 또는 PAs의 153 bp의 RsaI 단편은 -326 CHS15/GUS 유전자 융합체(각각 구성체 -326 Rsa 및 -326 PAs) 또는 -72 CHS15/GUS 유전자 융합체(각각 구성체 -72 Rsa 및 -72 PAs)의 전방에 클로닝하였다. CHS15 프로모터는 빗금친 상자로 나타냈다. PAL2 프로모터(PAL2, 점으로 표시함)내 RsaI 단편의 위치 뿐만 아니라, PAL2ΔPA 구성체내 PA 결실의 위치(파단선)가 나타나 있다. 화살표는 리포터 유전자의 전사 개시부를 나타낸다.
두 개의 현저한 서열 모티프가 다음 영역내에 존재한다: 디뉴클레오티드 AT의 19개 직렬 반복 구조(AT-요소: -467 내지 -429) 및 서열 AATT의 불완전한 10배 반복 구조인 팔린드롬형 요소(PA: -340 내지 -300). PA 시스-요소(-340 내지 -300)의 기능은 콩 칼콘 신타제 CHS15 프로모터의 상류에 상기 서열을 위치시키고, 전체 길이의 콩 PAL2 프로모터로부터 그 요소를 결실시키는 효과를 분석하여 평가하였다. 완전 (AATT)13서열로 구성되는 합성 PA 요소(PAs) 또는 -410 내지 -255의 콩의 PAL2 프로모터의 153 bp의 RsaI 단편을 326 CHS15/GUS 및 -72 CHS15/GUS 프로모터 유전자 융합체(도 1, 패널 B)의 상류에 삽입시켰다. 전사 개시부에 상대적으로 -326까지 5' 결실된 CHS15 프로모터는 꽃잎의 색소가 있는 표피 세포에서 발현되지만, 꽃잎의 무색소 영역 또는 관다발 조직에서는 발현되지 않는다. CHS15 프로모터의 -72까지의 추가의 5' 결실은 돌연변이된 담배 및 현탁 배양된 대두콩 세포(Dron 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 85:6738, 1988)에서 CHS 발현에 필수적인 G-상자 9(-74 내지 -68)의 파괴에 의해 GUS 발현을 제거한다.
GUS 활성은 도 1의 패널 B에 요약된 CHS15/GUS 및 PAL2/GUS 유전자 융합 구성체를 사용하여 형질전환시킨 T2식물에서 얻은 꽃잎의 색소가 있는 부분에서 측정하였다. 5개의 독립적인 -326 돌연변이주 및 7개의 독립적인 -326 PAs 세포주의 각각의 복제 식물을 추출가능한 GUS 활성에 대해 분석하였다. 도 1A는 도 1B에 도시한 구성체를 함유하는 독립 형질전환체로부터의 색소가 있는 성숙 화관(꽃잎) 조직 (패널 a-d), 색소가 없는 화관 조직(패널 f) 및 제5 절간위의 옆병(패널 e)의 추출물의 GUS 활성(각 돌연변이주에 대해 2개 식물의 평균)에 대한 막대 그래프를 도시한 것이다. 흐리게 표시한 상자는 독립 돌연변이주에서 측정한 GUS 활성의 평균치를 나타낸다. 패널 a의 문자 및 패널 d의 숫자는 패널 e 및 f의 GUS 데이터가 유도된 돌연변이주를 나타낸다.
-326 식물의 색소가 있는 꽃잎 조직의 GUS 활성은 약 100 pmol의 4-메틸움벨리페론 단백질 ㎎/ 분이다. -326 PAs 식물에서 PAs 요소의 존재는 색소가 있는 조직에서 특히 추출가능한 GUS 활성의 10배까지의 증가를 가져왔다. -326 Rsa 구성체를 사용하여 형질전환시킨 5개의 독립 돌연변이주는 -326 식물에 비교하여 색소가 있는 조직의 GUS 활성이 8배까지 증가하는 것으로 나타났다(도 1A, 패널 b). 증가된 GUS 활성은 야생형 -326 CHS15 프로모터가 활성이 없는 기타 조직에서는 나타나지 않았다. 두 구성체(-326 PAs, -326 Rsa)에 대한 GUS 활성은 꽃잎의 무색소 부분 또는 엽병에서의 배경 레벨을 넘지 않았는데, 이는 관찰된 효과가 엄격히 정량적임을 시사한다.
-72 최소 CHS15 프로모터 구성체를 사용한 결과는 상이하였다. 7개의 독립적인 -72 Rsa 주의 분석으로부터, 꽃잎에서 GUS 활성을 더 이상 나타내지 않은 이 프로모터는 153 bp의 RsaI 단편의 도입에 의해 여전히 활성화될 수 있는 것으로 나타났다(도 1A, 패널 c). 그러나, PAs 요소만(9개의 독립 세포주)이 -72까지 결실된 CHS15 프로모터의 상류에 위치될 때 GUS 발현을 자극할 수 없었다(도 1A, 패널 c의 -72 PAs 참조). 이것은 PAs 요소가 비특이적 인핸서 활성을 가지지만, 스스로 프로모터를 활성화할 수는 없음을 나타내는 것이다. 153 bp의 RsaI 단편은 아마도 (AATT)n요소 외에도 특이적 시스-요소를 포함하였는데, 이것은 PAL2 프로모터에 관한 전술한 분석(Leyva 등, 상기 참조)과 일치하는 것이다.
PA 요소에 대한 인핸서의 기능은 또한 이 요소가 PAL2 프로모터(PAL2ΔPA)로부터 특이적으로 결실되는 실험에 의해 나타났다. 따라서, PAL2ΔPA/GUS 유전자 융합체를 함유하는 돌연변이된 식물의 꽃잎 및 엽병의 GUS 활성은 야생형 PAL2 프로모터의 제어하에서의 GUS를 가진 유전자 융합체를 포함하는 동등한 식물에서보다 상당히 더 낮았다(도 1A, 패널 d 및 e).
PA 요소에 대한 열 안정성 DNA 결합 활성을 포함하는 핵 추출물-PAL2 프로모터의 -480 내지 -289 영역에 결합하는 핵 인자는 전기영동에 의한 이동성 변화 분석(EMSA)에 의해 동정되었다. 도 2의 패널 A는 표지된 RsaI 단편을 첨가하기 전에 지시된 온도에서 10분 동안 항온처리한 콩의 미정제 핵 추출물(NE)를 사용한 전기영동에 의한 이동성 변화 분석(EMSA)을 도시한 것이다. 결합 반응은 0℃ 또는 25℃에서 30분 동안 수행하였다.
EMSA 결합 반응을 실온에서 수행하였을 때, 두 개의 복합체 C1 및 C2가 관찰되었다. 주복합체 C2는 프로브의 약 90%에 결합한다. 고이동성 군 단백질 (HMG), 즉 AT-풍부 서열에 우선적으로 결합하는 소형 염색체 단백질 부류(Bustin 등, Biochem. Biophys. Acta, 1049:231, 1990)가 상기 복합체에 포함되는지 여부를 시험하기 위해, 결합 인자의 열적 안정성을 검사하였는데, 두 복합체는 열 안정성이었다. C2의 본래 결합 활성의 약 40%는 70℃에서 10분 항온처리후에 잔존하였으나, 80℃에서 항온처리후에는 상실되었다. 대조적으로, 복합체 C1은 80℃까지 안정하였으며, 보다 고온에서 우선적으로 형성되었다.
돌연변이된 담배에서 콩 PAL2 프로모터의 발현 패턴은 콩에서의 그것과 매우 유사하였는데, 이것은 조절 메카니즘이 보존된다는 것을 시사한다(Liang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 86:9284, 1986b). 유사한 DNA-결합 활성이 담배 추출물에서 존재하는 지 여부를 시험하기 위해, 프로브로서 PA 결합 부위를 사용하여 EMSA를 수행하였다. 유사한 열안정성 DNA 결합 활성(C2, 도 2b)은 담배 스템에서 얻은 핵 추출물에서 검출되었다. 80℃에서 10분 동안 항온처리후에 결합 활성의 소량의 감소만이 관찰되었다. 또한, 담배 추출물의 열처리후에 보다 작은 복합체(C1)가 나타났다.
도 2B는 쇄상체(concatemer) PA 올리고뉴클레오티드의 5량체를 프로브로 사용한 결합 반응 전에 80℃에서 10분 동안 항온처리한 담배 스템으로부터 얻은 핵 추출물(20 ㎎)을 사용한 전기영동 이동성 변화 분석법(EMSA)의 결과를 나타낸 것이다. 단백질-DNA 복합체는 고이온강도의 트리스-글리신 완충액으로 4% 비변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동(10V/㎝)하여 비결합 DNA로부터 분리하였다. P: 유리 프로브, Cl 및 C2: 복합체.
콩의 핵 추출물에 존재하는 DNA 결합 활성이 동정되었는데, 이것은 이 영역의 대부분을 차지하는 153 bp의 RsaI 제한 단편(-410 내지 -255)에 대한 특이성을 나타냈다(도 2A).
말단을 표지한 RsaI 단편은 콩의 핵 추출물의 존재(+) 또는 부재(-)하에 항온처리하고, 이어서 각각 0.25 U/㎖ DNaseI 및 1 U/㎖ DNaseI으로 처리하였다. 분해 생성물은 동일한 DNA 단편의 맥삼-길버트 A 및 G 서열분석 반응(A/G 레인)으로 함께 6%의 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서 분석하였다. DNaseI 처리로부터 보호된 영역이 나타나 있고, 상응하는 서열은 우측에 나타냈다. 숫자 매김은 PAL2 프로모터의 전사 개시부에 대해 상대적인 뉴클레오티드 위치를 나타낸 것이다. 153 bp의 RsaI 단편에의 트란스 인자의 DNase I 푸트프린트 분석으로부터, (AATT)-반복 PA 요소에 정확히 지도화되는 단일의 보호된 부위(-343 내지 -300)가 나타났다(도 3).
실시예 3
PA 특이적 DNA 결합 단백질을 암호화하는 담배 cDNA-PA 요소와 상호작용하는 단백질을 동정하기 위하여, 담배(니코티아나 타바컴) 스템 RNA에서 얻은 λgt11 발현 라이브러리를 PA 프로브를 가진 DNA 결합 단백질에 대해 검색하였다. PA 프로브를 결합한 DNA 결합 단백질(PABF)를 발현시키는 단일의 재조합 파지(λ900)가 1 x 106개 플라크의 검색후에 분리되었다.
PABF의 결합이 PA 프로브에 특이적인지 또는 일반적인 DNA 결합 활성을 가지는지 여부를 측정하기 위해, DNA-단백질 필터 결합 분석을 실시하였다. IPTG를 사용한 유도후에, λ900 플라크에서 얻은 단백질을 니트로셀룰로스로 옮기고, 9개의 분절로 절단하고 상이한 프로브와 하이브리드화시켰다. 검색에 사용된 PA는 PABF에 의해 강하게 결합하였다. 돌연변이된 식물에서의 기능 연구에 사용된 PAs의 결합은 PA 결합과는 구별할 수 없었다. AT의 19배 반복 구조로 구성되는 AT-풍부 영역(AT)은 -480 내지 -289 영역내 PAL2의 PA 요소의 상류에 존재한다. PA와의 유사성에도 불구하고, AT 프로브를 사용한 경우에는 결합이 관찰되지 않았다. PF로 명명된 10개의 AT 염기쌍(AATTTAATTT)의 추가의 비간섭 연장체가 PAL2 프로모터의 AT 모티프와 PA 모티프 사이에 위치하지만, 이 요소 역시 PABF에 결합되지는 않았다. 또한 본원 발명자들은 AT 염기쌍이 특별히 풍부하지는 않은 다음과 같은 프로브를 시험하였다: PAL2 프로모터의 AC-풍부 요소 뿐만 아니라, 다양한 돌연변이체(mAC-1, -2, -3), G-상자(Giuliano 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 85:7089, 1988) 및 H-상자(Loake 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 89:9230, 1992) 모티프. 이들 모티프는 어느 것도 PABF에 결합하지 않았다.
도 4는 다량체 PA 프로브로 처리한 λ900에 대해 용원성인 배양물로부터의 단백질 추출물의 사우스웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한 것이다. 도 4의 패널 A는 SDS-PAGE상에서 분리하고, 니트로셀룰로스상에 블로팅하여 재생시킨 용원성 파지의 단백질 추출물이다. 막은 6개의 스트립으로 절단하고, 나타낸 프로브로 하이브리드화하였다. M: kDa로 나타낸 실제 분자 질량을 가진 마커 단백질의 위치; PAn: 쇄상체 PA 프로브; PA: 단량체 PA 프로브; 1-4: PAL2 프로모터의 상이한 영역을 나타내는 PCR 생성물. 도 4B는 PAL2 프로모터내의 PCR 단편 1-4의 상대적인 위치를 나타낸다. 사부(phloem) 요소인 AT-, PF- 및 PA-모티프의 위치가 나타나 있다. 숫자는 전사 개시부에 상대적인 위치를 의미한다. 화살표는 파지가 암호화하는 130 kDa의 융합 단백질을 나타낸다.
다량체 PA 프로브(PAn)로 처리한 λ900에 대해 용원성인 배양물에서 얻은 단백질 추출물의 사우스웨스턴 블록 분석은 약 130 kDa의 융합 단백질을 검출하였다(도 4, 패널 A). PAn에의 결합과 비교하여, 단량체 PA 요소는 단지 약하게만 결합하였고, 프로브의 대부분은 약 33 kDa의 박테리아 단백질에 의해 결합되었다(도 4, 패널 A, 레인 PA). 그러나, PAL2 프로모터의 경우에, PABF는 단일의 PA 요소를 인지한다. 따라서, 200 bp의 PAL2 프로모터 영역 -480 내지 -280의 단편은 전체 프로모터 구성체(PAL2) 또는 AT-풍부 연장체(PAL2ΔAT)에서 PA 요소(PAL2ΔPA)가 결실된 구성체를 사용하여 PCR로 생성시켰다(도 4, 패널 B). 이 영역 외부의 단편은 대조군으로서 포함시켰다. 천연 PA 요소를 가진 단편만이 DNA 결합 단백질에 결합되었다(도 4, 패널 A, 레인 1 및 2). 따라서, PABF는 다량체 PA 프로브에 결합될 뿐만 아니라, PAL2 프로모터내에 매립된 PA 요소에도 강하게 결합된다.
PABF의 전사체 크기 및 발현 패턴-PABF의 전사체의 크기는 노던 블롯 분석에 의해 측정하여 약 2.2 kb였다. PABF mRNA 레벨에 대해 담배의 뿌리, 스템, 엽 및 꽃에서 얻은 전체 RNA의 분석에서, 구성성으로 발현되는 것으로 공지된(Boutry and Chua, EMBO J., 4:2159, 1985) β-ATPase 유전자와 비교하여 모든 조직에서 PABF의 강력한 발현이 나타났다. 약간 더 높은 정상 상태의 PABF mRNA 레벨은 다른 조직에서보다 스템 및 엽 조직에서 검출되었다.
PABF는 3부분 구조를 가진 HMG I/Y형 단백질-노던 블롯 데이터는 폴리(A) 미부를 가진 850 bp cDNA 단편을 포함한 λ900이 전체 길이의 cDNA 클론이 아님을 나타냈다. 전체 길이의 cDNA를 분리하기 위해서, 이 3' 단편을 사용하여 λgt11 꽃봉오리 라이브러리를 검색하였다. 4x105개 플라크를 검색하였고, 분리된 최대 클론(λ2200)은 양 가닥상에서 서열분석된 2153 bp의 단편을 포함하였다(도 5).
λ900의 서열은 폴리(A) 미부가 없는 것을 제외하고는, λ2200의 3' 서열(도 5, 뉴클레오티드 1182-1993)과 동일하였다. 첫번째 ATG가 해독 개시부로 사용되는 을 고려하면, λ2200은 546개의 아미노산의 긴 개방형 해독틀을 하나 포함한다. 이것은 계산되는 상대 분자 질량(Mr)이 67 kDa인 단백질을 생성시킨다. 도 5는 PABF cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 추론된 아미노산 서열을 나타낸 것이다(각각 서열번호 2 및 서열번호 3). 1-문자 암호로 나타낸 추론된 아미노산은 위치 61에서 개방형 해독틀의 첫 번째 메티오닌에서 개시하여 N-546 다음의 정지 코돈에서 종결된다. 화살표는 최초에 분리된 절단된 cDNA 클론의 5' 및 3'-말단을 나타낸다. AT-후크 모티프는 밑줄이 그어져 있다. SDS 폴리아크릴아미드 겔상에서 분류한 담배 핵 추출물을 사용한 사우스웨스턴 블롯 분석으로부터, 아마도 HMG 단백질 및 히스톤인 약 18 kDa의 소형 단백질 외에도, PABF를 포함하여 40 kDa 내지 80 kDa 범위의 기타 HMG형 단백질이 PA 프로브에 결합할 수 있음을 확인하였다.
도 6은 소수성에 관한 플롯이다. 위의 패널은 친수성 영역을 나타내는 음의값과 함께 소수성의 플롯을 나타낸다. 숫자는 PABF 서열내의 아미노산의 위치를 의미한다. 아래의 패널은 PABF의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다. 흑색의 상자는 HMG I/Y 도메인에서 발견되는 AT-후크 모티프를 나타낸다. 소수성 예측(Kyte and Doolittle, J. Mol. Bio., 157:105, 1982)에서는 PABF가 고도로 친수성인 것으로 나타났고, PABF는 3개의 특징적인 도메인을 포함하는 것으로 시사되었다(도 6, 위 패널). 이러한 구조 기구는 PABF의 추론된 아미노산 서열과의 유사성에 대한 데이터 베이스 연구에 의해 확인되었다(도 6). N-말단내 아미노산 38 내지 127은 뉴클레오좀들 사이에 링커 DNA를 결합시켜 보다 고차원의 구조를 형성하는 염기성 염색체 단백질인 히스톤 H1의 중앙의 구형 도메인에 고도의 상동성을 나타낸다(도 7A). 아미노산 153과 231 사이의 PABF의 중앙부는 글루타민 풍부 도메인으로 구성된다. 78개 아미노산중 39개(50%)가 글루타민 잔기였고, 이들은 균일하게 분포하였다. C-말단 도메인인 아미노산 274 내지 484는 포유동물의 HMG I/Y 단백질과 고도의 유사성을 나타냈다. HMG I/Y 단백질은 AT-풍부 서열에 우선적으로 결합하는 소형의 염기성의 비히스톤계 염색체 단백질이다(Bustin 등, 상기 참조). 결합은 11개 아미노산의 펩티드 모티프인 AT-후크에 의해 매개되는데, 이 모티프는 HMG I/Y에 3회 반복되어 있다. 이 AT-후크 모티프와 유사한 6개의 짧은 서열이 PABF에 존재한다(도 6 및 7B). 또한, 7개 아미노산에 의해 분리된 이 DNA 결합 모듈의 하나의 N-말단의 절반과 하나의 C-말단의 절반이 확인되었다. PABF의 최초에 분리된 C-말단부는 이들 결합 모듈중 3개를 포함하는데, 이는 이 모티프가 그 DNA 결합 활성을 담당한다는 것을 강력히 시사하는 것이다.
PABF의 게놈 기구-담배 게놈내 PABF 유전자의 기구를 측정하기 위해, 낮은 엄중 조건하에 서던 블롯을 수행하였다. 5개의 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 동일한 강도의 2개 또는 3개의 하이브리드화 단편을 관찰하였는데, 이는 PABF가 대부분 아마도 2개의 유전자의 소형 유전자군의 일원임을 나타내는 것이다. 엔. 타바컴의 복이배체성으로 인해, 이러한 신호는 두 개의 조상 담배종인 엔. 실베스트리스(N. sylvestris) 및 엔. 토멘토시포미스(N. tomentosiformis)의 PABF 유전자에 상응할 수 있다. 꽃 라이브러리의 재검색후 분리된 cDNA의 약 절반은 PABF cDNA에 비교하여 상이한 제한 패턴을 나타냈다. 서열 분석으로부터, 제2 유전자가 PABF와 약 94% 동일하며, AT-후크 모티프가 특히 잘 보존되는 것으로 나타났다.
요약
PA는 비특이적 인핸서로서 기능함-상기 실시예들은 합성 PA 요소(PAs)가 콩의 PAL2 프로모터내 정량적인 시스-요소의 기능을 가진다는 것을 보여준다. 따라서, 콩의 CHS15 프로모터의 상류에 위치할 때, 상기 요소는 상동성 프로모터에 의해 유도되는 발현의 공간적 또는 일시적 패턴을 변화시키지 않고 돌연변이된 담배에서 발현을 약 10배 촉진하였다. 식물 유전자의 여러 가지 AT-풍부 요소는 방향과 무관한 방법으로 카울리플라워 모자이크 비루스(CaMV) 35S-90 프로모터로부터 전사를 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나, 이들 경우에 상류 요소는 프로모터의 발현 패턴을 변형시킨다(Bustos 등, Plant Cell, 1:839, 1989; Jordano 등, Plant Cell, 1:855, 1989). 두가지 다른 연구는 또한 조직 특이적 발현에서 AT-풍부 영역을 관련시켰다(Jofuku 등, Nature, 328:734, 1987; Jensen 등, EMBO J., 7:1265, 1988). 대조적으로, 발현 패턴의 변형은 PAL2PA 요소의 경우는 나타나지 않았다. 따라서, PA 요소의 도입은 CHS15 프로모터의 발현 패턴에 영향을 끼치지 않는데, 이것은 PAs 요소가 일반 인핸서로 작용한다는 것은 입증하는 것이다.
PABF는 PA 모티프에 특이적으로 결합함-콩의 핵 단백질은 PA 요소를 유도하는 153 bp RsaI 단편을 가진 매우 열안정성인 복합체를 형성하였다. DNase I 푸트프린트 분석법은 콩의 핵 단백질에 대한 결합 부위로서 PA 요소를 동정하였다. 고도의 열 안정성 및 AT-풍부 서열의 우선적인 결합은 작용이 규명된 소형의 염기성의 비히스톤 염색체 단백질인 HMG 단백질의 특징이다(Bustin 등, 상기 참조). 일부의 경우, AT-풍부 상류 서열에 대해 특이적인 식물 DNA 결합 활성은 HMG 단백질로 동정되었다(Czarnecka 등, 상기 참조; Jacobsen 등, Plant Cell, 2:85, 1990; Pedersen 등, Plant Mol. Biol., 16:95, 1991). 상기 데이터는 상이한 전기영동 이동성을 가진 두 개의 열 안정성 복합체 C1 및 C2를 나타내고 있는데, 이는 AT-풍부 서열에 대해 상이한 친화성을 가진 별개의 HMG 단백질의 존재를 시사하는 것이다. 유사한 결합 패턴이 또한 짜르네카 등(Czarnecka 등, 상기 참조)에 의해 관찰되었고, SDS-PAGE에 의한 분류시에 저이동성의 복합체가 46 kDa 내지 69 kDa의 폴리펩티드로 분리된 반면에, 고이동성의 복합체는 각각 32 kDa 및 23 kDa의 단백질로 분리되었다(Czarnecka 등, 상기 참조).
PABF의 기능-PABF내 히스톤 H1과 HMG I/Y 염색체 단백질 도메인 사이에 낀 글루타민-풍부 영역의 신규의 조합은 전사의 조화된 비특이적 자극을 제공한다. 따라서, PABF가 동족(AATT) 반복구조 시스-요소에 결합하는 것은 뉴클레오좀 구조를 국부적으로 재조직화하여 히스톤 H1 매개의 기초 억제를 완화시키고, 전사 인자의 프로모터로의 일반적인 접근을 촉진함에 의해서 뿐만 아니라, 글루타민 풍부 영역을 전사 개시 복합체 형성을 증가시키도록 배치함에 의해서 전사를 증가시킬 수 있다. 각각의 성분은 작용에 있어 비특이적인 것으로 예상되고, 이 키메라 단백질의 합쳐진, 가능하게는 상승적 기능성은 특이적 시스-요소의 존재에 의존하고 최소 프로모터의 경우에 불활성인 비특이적 인핸서로서의 동족(AATT)-반복 시스-요소의 성질과 일치한다. 따라서, PAL2 프로모터내 PA 요소와 PABF의 상호작용은 분리시에 약한 목질부 특이적 발현만을 제공하는 하류 관다발 특이적 시스-요소에 의해 지정되는 선택적인 발현을 증가시키는 메카니즘을 제공한다. 더욱이, PABF는 전사 활성화 도메인이 프로모터 강도의 비특이적인 정량적 조절을 위해 염색체 단백질 도메인과 다양한 조합으로 병치되는 신규 부류의 전사 인자의 원형일 수 있다.
제시된 바람직한 양태를 참조하여 본 발명을 설명하였지만, 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않고 다양한 수정예를 만들 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 본 발명은 첨부하는 특허 청구의 범위에 의해서만 한정된다.
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(1) 일반 정보:
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신규의 전사 인핸서 요소 및 전사 인자와 그 사용 방법
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(xi) 서열: 서열번호 22:

Claims (19)

  1. 최소한 서열(AATT)n(여기서, n은 2 이상임)로 구성되는 분리된 뉴클레오티드 서열.
  2. 제1항에 있어서, n이 약 2 내지 약 20인 분리된 뉴클레오티드 서열.
  3. 제1항에 있어서, (AATT)n이 시스 작용성의 비특이적 인핸서 요소 활성을 가지는 것인 분리된 뉴클레오티드 서열.
  4. 제1항에 있어서, 서열이 (AATT)13인 분리된 뉴클레오티드 서열.
  5. 실질적으로 정제된 팔린드롬형 요소 결합 인자(PABF) 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, PABF가 a) SDS-PAGE로 측정하여 약 67 kDa의 분자량을 가지고, b) (AATT)n반복 요소(여기서, n은 2 이상임)에 결합하며, 3) H1 히스톤 도메인, 글루탐산 풍부 도메인 및 HMG I/Y 도메인을 가지는 것인 실질적으로 정제된 팔린드롬형 요소 결합 인자 폴리펩티드.
  7. 제5항에 있어서, 상기 단백질의 아미노산 서열이 서열번호 3(도 5)에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 것인 실질적으로 정제된 팔린드롬형 요소 결합 인자 폴리펩티드.
  8. 제5항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 서열번호 3(도 5)에 제시된 아미노산 서열과 동일한 것인 실질적으로 정제된 팔린드롬형 요소 결합 인자 폴리펩티드.
  9. 제5항의 PABF 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항에 있어서, 서열번호 2(도 5)에 제시된 뉴클레오티드 서열, 또는 동일한 아미노산 서열을 암호화하지만 일부 아미노산에 대해서는 상이한 코돈을 이용하는 그 변형체 서열, 또는 이들의 스플라이스(splice) 변형체 뉴클레오티드 서열을 가지는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  11. 제9항에 따른 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  12. 제11항에 따른 벡터를 함유하는 숙주 세포.
  13. 제5항에 따른 단백질 또는 그 항원성 단편에 결합하는 항체.
  14. 세포에서 유전자의 증가된 발현을 제공하는 방법으로서, (AATT)n반복 요소를 상기 유전자와 작동 가능하게 연결되어 있는 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결시키는 단계를 포함하는, 세포에서 유전자의 증가된 발현을 제공하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 프로모터가 구성성(constitutive) 프로모터인, 세포에서 유전자의 증가된 발현을 제공하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 프로모터가 유도성(inducible) 프로모터인, 세포에서 유전자의 증가된 발현을 제공하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 세포가 식물 세포인, 세포에서 유전자의 증가된 발현을 제공하는 방법.
  18. 제14항에 있어서, 제5항의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 동시 발현시키는 단계를 추가로 포함하는, 세포에서 유전자의 증가된 발현을 제공하는 방법.
  19. 제14항에 있어서, (AATT)n에 작동 가능하게 연결된 PABF를 추가로 포함하는, 세포에서 유전자의 증가된 발현을 제공하는 방법.
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