JP2000513935A

JP2000513935A - Ａａｔｔプロモーターエレメントおよび転写因子

Info

Publication number: JP2000513935A
Application number: JP10503545A
Authority: JP
Inventors: ラム，クリストファー，ジェイ．; ドエルナー，ピーター; レイブル，ゴエッツ
Original assignee: ザソークインスティチュートフォーバイオロジカルスタディーズ
Priority date: 1996-06-27
Filing date: 1997-06-27
Publication date: 2000-10-24
Also published as: US20020146824A1; EP0975664A4; EP0975664A1; KR20000022313A; US6472211B1; US6191258B1; US5834236A; AU3507797A; WO1997049727A1; AU719624B2; CA2261029A1

Abstract

(57)【要約】異種プロモーター構築物におけるシスエレメントの活性を、プロモーターの固有な特異性を変更することなく増大させる新規な転写エンハンサーエレメント(AATT)_nが提供される。(AATT)反復エレメントに特異的に結合する転写因子ＰＡＢＦおよびその使用方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 AATTプロモーターエレメントおよび転写因子発明の分野本発明は遺伝子の発現に関する。さらに特定すると、機能しうる形でそこに連結された遺伝子の転写速度を増大させる新規なエンハンサーエレメント、特に植物におけるエンハンサーエレメントに関する。発明の背景遺伝子は、誘導的に、細胞型に特異的に、または構成的に調節される。遺伝子発現の調節に関与する異なる種類の構造エレメントが存在する。遺伝子に近接して、または遺伝子内に位置するシス作用性エレメントは、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質すなわちトランス作用性因子を結合するように働く。タンパク質とＤＮＡとの結合は、遺伝子転写の開始、維持またはダウンレギュレーションに関与する。遺伝子を制御するシス作用性エレメントには、プロモーター、エンハンサーおよびサイレンサーが含まれる。プロモーターは転写開始部位の隣に位置し、方向依存性の様式で機能する。他方、プロモーターの活性を調節するエンハンサーおよびサイレンサーはそれらの方向および転写開始部位からの距離に関して柔軟性でありうる。植物において特異的に調節される遺伝子の一例として、フェニルアラニンのケイ皮酸（フェニルプロパン骨格に基づく多様な天然産物の前駆体）への脱アミノ反応を触媒するフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）が挙げられる。維管束発生の間に、ＰＡＬは構造ポリマーであるリグニンの沈着と関連して、分化しつつある木部細胞において選択的に発現される。セルロースに次いで最も豊富なバイオポリマーであるリグニンは、植物組織（木部）における管を形成する細胞の主要な細胞壁構成要素である。木部は、植物の根から茎への水および無機溶質の移動に関与する。ＰＡＬ遺伝子は分化しつつある木部において対応して高いレベルで発現される。遺伝子発現の速度を人為的に調節する能力は、新しい特徴を有する植物を作製する手段を提供する。内因性遺伝子発現レベルの増大を含めて、遺伝子発現レベルの増大が望ましい状況は数多く存在する。そのような状況には、例えば、農業または商業上の目的のための植物産物（タンパク質）の産生が含まれる。発明の概要本発明は、非特異的エンハンサーとして機能する新規な反復エレメントを提供する。すなわち、本発明のエンハンサーエレメントは、このエンハンサーエレメントに結合しているプロモーターの固有な特異性に影響を与えない。それどころか、このエンハンサーエレメントはプロモーターの活性を高め、それによってプロモーターに結合している遺伝子の所望レベルの発現をもたらす。この新規な反復エレメントに結合する新規な転写因子であるパリンドロームエレメント結合因子(palindromic element binding factor：ＰＡＢＦ)もまた提供される。第１の実施態様において、本発明は少なくとも配列(AATT)_n（ここでｎは≧２で、好ましくは約２から約20である）からなる単離されたヌクレオチド配列を含むエンハンサーエレメントを提供する。配列(AATT)_nは、シス作用性の、非特異的なエンハンサー活性を有する。１つの面において、本発明は、機能しうる形で遺伝子に結合している異種プロモーターに(AATT)_n反復エレメントを機能しうる形で連結し、それによって該遺伝子の増大した発現を可能とする、細胞における遺伝子の発現を増大させる方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、SDS-PAGEで測定したとき約67kDの分子量を有し、(AATT)_n反復エレメント（ここでｎ≧２）に結合し、そして、Ｈ１ヒストンドメイン、グルタミンが豊富なドメイン、および高速移動群（HMG）I/Yドメインを有することによって特徴づけられる、実質的に精製されたパリンドロームエレメント結合因子（ＰＡＢＦ）ポリペプチドを提供する。ＰＡＢＦは転写因子として作用し、本発明の(AATT)反復エレメントに結合する。図面の簡単な説明図１、パネルＡは、図１Ｂに示す構築物を含むそれぞれ独立した形質転換体由来の成熟した、、着色した花冠（花弁）組織（パネルａ〜ｄ）、未着色の花冠組織（パネルｆ）、および第５節間より上の葉柄（パネルｅ）の抽出物におけるＧＵＳ活性（各トランスジェニック系統について２植物体の平均）の棒グラフを示す。影をつけて囲った部分は、それぞれ独立したトランスジェニック系統において測定したＧＵＳ活性の平均値を表す。パネルａの文字およびパネルｄの数字は、トランスジェニック系統を示し、パネルｅおよびｆのＧＵＳデータはそれらから誘導された。図１、パネルＢは、プロモーターGUS-融合構築物を示す（一定の縮尺によって描いたものではない）。PAL2プロモーターの153bp RsaI断片または(AATT)₁₃配列を有する合成パリンドローム配列(PAs)を-326 CHS15/GUS遺伝子融合体の前にクローン化した（それぞれ構築物-326 Rsaおよび-326 PAs）；または-72 CHS15/GU S遺伝子融合体の前にクローン化した（それぞれ構築物-72 Rsaおよび-72 PAs）。CHS15プロモーターを斜線を引いた四角で示す。PAL2プロモーター内のRsaI断片の位置（PAL2、点々を付してある）、およびPAL2△PA構築物におけるPA欠失の位置（破線）を示してある。矢印は転写開始部位を示す；GUSはレポーター遺伝子を示す。図２、パネルＡは、標識化RsaI断片を添加する前に表示の温度で10分間インキュベートしたマメ（タンパク質20mg)の粗製核抽出物(NE)を用いた電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を示す。結合反応は０℃または25℃で30分間実施した。図２、パネルＢは、結合反応の前に80℃で10分間インキュベートしたタバコの茎から調製した核抽出物(20mg)を用いた電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を示す。この結合反応には、コンカテマー化した(concatemerized)オリゴヌクレオチドの五量体（すなわち(AATT)₅）をプローブとして用いた。4%非変性ポリアクリルアミドゲルおよび高イオン強度Tris-グリシン緩衝液を用いた電気泳動(10 V/cm)によって未結合ＤＮＡからタンパク質-ＤＮＡ複合体を分離した。Ｐ：遊離のプローブ、C1およびC2:複合体。図３は、マメ核抽出物を用いたRsaI断片のDNアーゼＩフットプリント分析を示す。末端標識RsaI断片をマメ核抽出物の存在下（＋）または不在下（−）でインキュベートし、、次に0.25および１単位／mlのDNアーゼＩでそれぞれ消化した。消化産物を、6%変性ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動、および同一ＤＮＡ断片のマクサム・ギルバートＡおよびＧ配列決定反応（レーンＡ／Ｇ）によって分析した。DNアーゼＩによる消化から保護された領域を示し、また対応する配列（配列番号９）を左側に示す。番号は転写開始部位に対するヌクレオチドの位置を示す。図４は、多量体化PAプローブを用いてつり上げた、λ900に対して溶原性の培養物由来のタンパク質抽出物のサウスウエスタンブロット分析を示す。パネルＡは、SDS-PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜にブロットし、再生させた溶原性ファージのタンパク質抽出物である。膜を６枚の帯片に切り、図示したプローブとハイブリダイズさせた。Ｍ：kDa単位の見かけ分子量を有するマーカータンパク質の位置。PA_n:コンカテマー化PAプローブ;PA:単量体PAプローブ;１〜４：PAL2プロモーターの異なる領域を表すＰＣＲ産物。パネルＢは、PAL2プロモーター内のＰＣＲ産物１〜４の相対的位置を示す。師部(phloem)エレメントAT-、P F-、およびPA-モチーフの位置を示す。番号は転写開始部位に基づく位置を示す。矢印は130kDaの、ファージにコードされた融合タンパク質を示す。図５ａおよび５ｂは、ＰＡＢＦｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号２および３）。一文字表記で示す推定されるアミノ酸配列は、第61位にあるオープンリーディングフレームの最初のメチオニンから始まり、N-546の次に位置する終止コドンで終わる。矢印は、最初に単離された、端を切断されたｃＤＮＡクローンの5'および3'末端を示す。AT- フック(hook)モチーフに下線を付してある。図６は疎水性プロットである。上のパネルは、負の数値が親水性領域を表す疎水性プロットを示す。数字は、ＰＡＢＦ配列内におけるアミノ酸の位置を示す。下のパネルは、ＰＡＢＦの構成を図式的に示す。黒い四角は、HMG I/Yドメインに見いだされるAT-フックモチーフを示す。図７Ａは、ＰＡＢＦのドメインと、植物ヒストンＨ１遺伝子およびHMG I/Y ＤＮＡ結合モチーフ（AT-フック）（配列番号10〜16）との配列相同性の比較を示す。アミノ酸の同類置換を＋で示す。図７Ｂは、哺乳動物HMG I/Yタンパク質の反復dA-dT-ＤＮＡ結合モジュール（ａ〜ｃ）（配列番号17〜24）を示す。類似した反復配列がＰＡＢＦ（ａ〜ｇ）に見いだされた。共通AT-フックモチーフと異なるアミノ酸のみを示してある。不変のコアモチーフであるRGRPを太字で印刷してある。括弧内の数字は、各タンパク質内のアミノ酸の位置を示す。好ましい実施態様の説明本発明は、新規なエンハンサーエレメントおよびこのエンハンサーエレメントに結合する新規なパリンドロームエレメント結合因子（ＰＡＢＦ）を提供する。本発明のエンハンサーエレメントおよび結合因子は、特に植物において遺伝子発現を増大させる方法を提供する。PAL2 エンハンサーエレメント本発明のエンハンサーエレメントは、複数の離れた反復ユニット(AATT)を含む。このエンハンサーは、少なくとも発現の増大に必要とされる数の反復エレメントを有し、通常はその数は天然のエンハンサーに存在する反復ユニットの数の約２倍以下である。本明細書に記述する(AATT)反復は不完全であってよい。すなわち、全反復配列中にはある程度の変動をもって、特異的コア配列(AATT)を有してよい。本発明のエンハンサーエレメントは、全てAATT反復から成ってもよいし、不完全な反復から成ってもよいし、またはAATT反復と不完全な反復の組合せから成ってもよい。本発明のエンハンサーエレメントは、上記4bp配列の少なくとも２反復、好ましくは少なくとも約４反復、最も好ましくは少なくとも８反復を有し、そして好ましくは上記4bp配列の約20の反復しか有さない。従って、エンハンサーエレメントは少なくとも８塩基対(bp)、好ましくは約16から約32bp、そして最も好ましくは約80bp以下を有する。本発明のエンハンサーエレメントは、それが由来する種またはそれが天然に機能する種と同じまたは異なる種に用いることができる。天然のエンハンサーは、天然の環境下では一般にプロモーターの上流約600bp以内に位置するＤＮＡ配列を含む。本発明のエンハンサーエレメントはシスに作用し、そして増強すべきプロモーター内の転写開始ドメインの約5000bp、好ましくは約2000bp以内、最も好ましくはそれに隣接するか1000bp以内に位置する。例えば、ｍＲＮＡの最初のヌクレオチドを＋１とすると、エンハンサーを含む配列は好ましくは約-50から約- 1000bp、通常は約-50から-900bp、そしてより具体的には約-50から約-800 bp上流に位置する。エンハンサーエレメントは、それが増強するプロモーターに対して上流または下流に位置することができる。または、エンハンサーエレメントは転写ユニット中のイントロン内に位置してもよい。本発明のエンハンサーエレメントは、天然においてこのエンハンサーの制御下に見いだされるプロモーター（同種）および天然においてはこのエンハンサー領域と関連していないプロモーター（異種）を含む種々のプロモーターと共に使用することができる。植物における転写の増大は、高レベルの内因性遺伝子の発現および高レベルの外因性遺伝子の発現を得るのに有用である。本明細書に用いる「内因性」という用語は、野生型宿主に通常見いだされる遺伝子を言い、他方、「外因性」という用語は野生型宿主に通常見いだされない遺伝子を言う。本発明のエンハンサーエレメントは、転写開始ドメインを含むプロモーターに機能しうる形で連結される。「転写開始ドメイン」という用語は、少なくともＲＮＡポリメラーゼ結合部位およびｍＲＮＡ開始部位を有するプロモーターを言う。そしてプロモーターは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む場合にはタンパク質をコードする、典型的には5'および3'非翻訳配列を含む内因性または外因性の遺伝子に機能しうる形で連結している。そのようなオープンリーディングフレーム、またはＲＮＡをコードする配列は、タンパク質産物をコードする天然のオープンリーディングフレーム；ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ配列；合成ＤＮＡ；天然遺伝子のエキソンに由来する、タンパク質をコードする配列（例えば、エキソン連結によって生じるオープンリーディングフレーム）；および／または上記の組合せを含む。適切な転写終止配列およびポリアデニル化配列もまた含まれる。本発明によってその発現レベルを増大させることができる目的の遺伝子は、例えば、一次ＲＮＡ産物をコードする天然の遺伝子（植物、動物、細菌、ウイルス、真菌）に由来する配列；特定のＲＮＡまたはタンパク質産物をコードする合成ＤＮＡ配列；例えば、部位特異的突然変異誘発等の突然変異誘発によって改変されたＤＮＡ配列；（融合タンパク質を産生するための）上記の任意のもののキメラ；および相補的ＲＮＡ分子（アンチセンス）をコードするＤＮＡ配列、並びに上記のものの組合せおよび／またはフラグメントを含む。本発明を用いて増大したレベルで産生させることができるタンパク質の例は、以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、栄養的に重要なタンパク質；増殖促進因子；植物における早期開花のためのタンパク質；特定の環境条件下で植物に保護を与えるタンパク質、例えば、金属または他の毒性物質（除草剤または殺虫剤等）に対する耐性を付与するタンパク質；極端な温度に対する耐性を付与するストレス関連タンパク質；真菌、細菌、ウイルス、昆虫および線虫に対する耐性を付与するタンパク質；特定の商業的価値のあるタンパク質、例えば、EPSPシンターゼ等の代謝経路に関与する酵素である。本明細書に記述するエンハンサーエレメントは天然の供給源（例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ））から単離することができる。または、標準的ＤＮＡ合成技法（例えば、Current Protocols in Molecular Biology， Unit 2.11，Ausubelら(編)，John Wiley，1995参照）によって合成するこができる。１つの実施態様において、本発明は細胞における遺伝子発現を増大させる方法を提供する。この方法は、目的の遺伝子に機能しうる形で連結したプロモーターに上記の(AATT)_n反復エレメントを機能しうる形で連結し、そして該遺伝子の発現を増大させることを含んでなる。プロモーターは構成的なものでも、誘導性のものでもよい。本明細書に用いる「増大した」または「増大させる」という用語は、本発明のエンハンサーエレメントを含むプロモーターと連結していない対応する野生型遺伝子の発現に較べて上昇した遺伝子発現を言う。本明細書に用いる「機能しうる形で連結された」または「機能しうる形で連結している」という用語は、本発明のエンハンサーエレメントとプロモーター配列との間の、およびプロモーター配列と該プロモーターによって調節される構造遺伝子との間の機能的な連結を意味する。機能しうる形で連結されたエンハンサーおよびプロモーターは構造遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を制御する。本発明に用いた構造遺伝子の発現は、多数のプロモーターによって誘導することが可能である。本明細書では目的の構造遺伝子の内因性プロモーターを該遺伝子の転写調節のために用いることが可能であるが、好ましくはプロモーターは外来の調節配列である。植物発現ベクターに対して適切なウイルスプロモーターは、CaMVの35S ＲＮＡおよび19S ＲＮＡプロモーター(Brissonら，Nature 310:511 ，1984;Odellら，Nature 313:810，1985);ゴマノハグサ(figwort)モザイクウイルス(FMV)由来の全長転写プロモーター(Gowdaら，J．Cell Biochem.，13D:301， 1989)およびTMV由来のコートタンパク質プロモーター(Takamatsuら，EMBO J．6: 307，1987)を含む。あるいはまた、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット(ssRUBISCO)由来の光誘導性プロモーター(Coruzziら，EMBO J.，3: 1671，1984;Broglieら，Science 224:838，1984);マンノピン(mannnopine)シンターゼプロモーター(Veltenら，EMBO J.，3:2723，1984);ノパリンシンターゼ(N OS)およびオクトピンシンターゼ(OCS)プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaclens)の腫瘍誘導性プラスミドに担持されている）、または、例えばダイズhsp17.5-Eまたはhsp17.3-B（Gurleyら，Mol．C ell．Biol.，6:559，1986;Severinら，Plant Mol．Biol.，15:827，1990）等の熱ショックプロモーター、等の植物プロモーターを用いることができる。本発明に有用なプロモーターは、構成的および誘導性の天然プロモーターの両方、ならびに作製されたプロモーターを含む。CaMVプロモーターは構成的プロモーターの例である。最も有用であるためには、誘導性プロモーターは１）誘導物質の不在下では低い発現をもたらし、２）誘導物質の存在下では高い発現をもたらし、３）植物の正常な生理を妨げない誘導機構を用い、そして４）他の遺伝子の発現に全く影響を及ぼさないものでなければならない。植物において有用な誘導性プロモーターの例は、化学的手段によって誘導されるものを含む。例えば、銅イオンによって活性化される酵母メタロチオネインプロモーター(Mettら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:4567，1993);置換されたベンゼンスルホンアミド(例えば除草剤の毒性緩和剤 )によって活性化されるIn2-1およびIn2-2調節配列(Hersheyら，Plant Mol．Biol .，17:679，1991);およびグルココルチコイドによって誘導されるGRE調節配列(S chenaら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:10421，1991)などである。当業者には他の構成的および誘導性プロモーターが公知であろう。選択される特定のプロモーターは、十分な発現を引き起こして有効量の構造遺伝子産物の産生をもたらすことが可能でなければならない。本発明の構築物に用いるプロモーターは、所望であれば、その制御特性を変更するために改変することができる。環境的に調節されるプロモーター、例えば光および乾燥によって調節されるプロモーターを本発明に用いることができる。ホルモン的に調節されるプロモーターもまた用いることができる。組織特異的プロモーターもまた本発明に用いることができる。組織特異的プロモーターの例は、苗条分裂組織に発現されるプロモーターである(Atanassovaら，Plant J.，2:291，1992)。果実特異的および種子特異的プロモーター、または cdc2aプロモーターおよびcyc07プロモーターを含む、トランスジェニック植物において有用な他の組織特異的プロモーターが当業者には公知であろう。（例えば、Itoら，Plant Mol．Biol.，24:863，1994;Martinezら，Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 89:7360，1992;Medfordら，Plant Cell 3:359，1991;Teradaら，Plant J ournal，3:241，1993;Wissenbachら，Plant Journal，4:411，1993を参照されたい。）先に述べたように、本発明に使用するプロモーターに機能しうる形で連結されたエンハンサーエレメントはプロモーターの特異性を変更しない。すなわち、本発明のエンハンサーエレメントはこのエンハンサーエレメントに連結したプロモーターの固有の特異性に影響を与えない。場合により、機能しうる形でプロモーターに連結したエンハンサーエレメントおよび構造遺伝子を含む構築物に選択マーカーを結合することができる。本明細書に用いる「マーカー」という用語は、該マーカーを含む植物または植物細胞の選択またはスクリーニングを可能とする特性または表現型をコードする遺伝子を言う。好ましくはマーカー遺伝子は、適切な抗生物質を用いて非形質転換細胞の中から形質転換植物細胞を選択することを可能とする抗生物質耐性遺伝子である。適切な選択マーカーの例は、アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン-B-ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびアミノグリコシド3 '-Ｏ-ホスホトランスフェラーゼII（カナマイシン、ネオマイシンおよびG418耐性）を含む。当業者には他の適切なマーカーが公知であろう。例えば、uidA遺伝子、GUS、ルシフェラーゼまたはGFP遺伝子等の他のスクリーニング可能なマーカーもまた用いることができる。本発明による植物の形質転換は、植物分子生物学の分野の当業者に公知の種々の方法のうち本質的に任意のものを用いて実施することができる。（例えば、参考としてここに組み入れるMethods of Enzymology，Vol．153，198:7，Wuおよび Grossman編，Academic Pressを参照されたい。）本明細書に用いる「形質転換」という用語は、外因性または内因性の核酸配列の導入によって宿主植物の表現型を変更することを言う。本発明に従って形質転換プロセスを開始するためには、まず適切なベクターを構築し、それを植物細胞に適切に導入する必要がある。ここで用いるベクターの構築の詳細は、植物遺伝子工学の分野の当業者には公知である。例えば、Ｔｉプラスミド、根誘導性プラスミド（Ｒｉ）および植物ウイルスベクターを用いて本発明に使用するエンハンサー-プロモーター構築物を植物細胞中に導入することができる。このような技法の総論については、例えば参考としてここに組み入れるWeissbachおよびWeissb ach,1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Secti on VIII，pp.421-463;並びにGriersonおよびCorey，1988，Plant Molecular Bio logy，第２版，Blackie，London，第7-9章、およびHorschら，Science 227:1229 ，1985を参照されたい。当業者は本発明の核酸配列を比較的完全な状態で導入するための適切なベクターを選択することができるであろう。従って、導入されたＤＮＡ配列を担持する植物をもたらすベクターであればどれでも十分であるに違いない。裸のＤＮＡ断片(naked piece of DNA)でさえも、効率は低いが、本発明の特性を付与することができるだろうと予想される。ベクターの選択、またはベクターを用いるべきかどうかは、典型的には選択された形質転換法によって左右される。例えば、Ｔｉプラスミドを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いて異種核酸配列を植物細胞中に導入することができる。形質転換ビヒクルとしてアグロバクテリウム・ツメファシエンス培養物を用いる場合は、形質転換された組織の正常な、非発癌性分化が可能となるように、ベクター担持体としてアグロバクテリウムの非発癌性株を用いることが最も有利である。また、アグロバクテリウムがバイナリー(binary)Ｔｉプラスミド系を有することが好ましい。このようなバイナリー系は、１）伝達ＤＮＡ（Ｔ-ＤＮＡ）の植物への導入に必須のビルレンス(virulence)領域を有する第１のＴｉプラスミド、および２）キメラプラスミドからなる。キメラプラスミドは、導入されるべき核酸配列に接している、野生型ＴｉプラスミドのＴ-ＤＮＡ領域の少なくとも１つのボーダー領域を有する。バイナリーＴｉプラスミド系は植物細胞を形質転換するのに効果的であることが示された(De Framond，Biotechnology，1:262，1983;Hoekemaら，Natur e，303:179，1983)。このようなバイナリー系は、アグロバクテリウムのＴｉプラスミドへの核酸配列の組み込みを必要としないので好ましい。アグロバクテリウムを使用する方法は、1)アグロバクテリウムと培養され単離されたプロトプラストの同時培養;2)アグロバクテリウムを用いた植物細胞または組織の形質転換；または3)アグロバクテリウムを用いた種子、頂部または分裂組織の形質転換を含むが、これらだけに限定されない。さらに、遺伝子導入はBechtoldら(C.R．Acad．Sci．Paris，316:1194，1993) が記述するようにアグロバクテリウムによるin situ形質転換によって達成することが可能である。この方法は、アグロバクテリウム菌体懸濁物の真空浸透に基づいている。植物細胞に核酸を導入する好ましい方法は、外植片、分裂組織または種子等の植物細胞を上記のように形質転換アグロバクテリウム・ツメファシエンスに感染させることである。当分野で公知の適切な条件下で、形質転換植物細胞を増殖させ、苗条および根を形成させ、さらに植物体を発生させる。または、機械的または化学的手段を用いて、本明細書に記述するエンハンサー構築物を植物細胞と接触させることによって細胞中に導入することができる。例えば、マイクロピペットを用いた直接マイクロインジェクションによって核酸を機械的に植物細胞中に導入することができる。さらに、植物細胞に取り込まれる遺伝子物質と沈降複合体を形成するポリエチレングリコールを用いて、核酸を植物細胞中に導入することができる。核酸はエレクトロポレーションによっても植物細胞中に導入することができる (Frommら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:5824，1985。これは参考としてここに組み入れている)。この技法では、関連する核酸配列を含むベクターまたは核酸の存在下で植物プロトプラストを電気穿孔する。高い電界強度の電気的衝撃は植物の膜を可逆的に透過性とし、核酸の導入を可能とする。電気穿孔された植物プロトプラストは細胞壁を再形成し、分裂し、そして植物カルスを形成する。導入した遺伝子を有する形質転換植物細胞の選択は、本明細書に記述する表現型マーカーを用いて実施することができる。核酸を植物細胞中に導入する別の方法は、導入すべき核酸を小ビーズまたは粒子のマトリックス内に、またはそれらの表面に有する小さい粒子を用いた高速衝撃による打ち込みである(Kleinら，Nature，327:70，1987)。典型的には新しい核酸配列の１回のみの導入が必要とされるが、この方法は特に多重導入を提供する。カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）もまた異種核酸を植物細胞中に導入するためのベクターとして使用できる（米国特許第4,407,956号）。CaMVのウイルスＤＮＡゲノムを親細菌プラスミドに挿入し、細菌中で増殖させることができる組換えＤＮＡ分子を作製する。クローン化した後、組換えプラスミドを再度クローン化し、所望の核酸配列の導入によってさらに改変することができる。次に、組換えプラスミドの改変されたウイルス性部分を親細菌プラスミドから切り出し、これを植物細胞または植物に接種する。以下の実施例においては、タバコ植物体を大体においてRogersら(Methods Enz ymol．118:627，1986)の方法によって形質転換する。すなわち、表面を滅菌したタバコの葉からタバコリーフディスクを採取し、ムラシゲ-スクーグ(Murashige- Skoog)(MS)培地で培養し、傷ついた表面における部分的細胞形成を促進する。次に、エンハンサー、プロモーターおよび目的の遺伝子の所望の組合せを有するプラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌体の培養物中にリーフディスクを浸漬する。次に、これらのディスクを、形質転換細胞のみが増殖してカルスを形成するカナマイシン含有MS培地で培養する。次に、苗条が成長し、そして発根培地で成長させることによってカルスから小植物体が再生される。パリンドロームエレメント結合因子（PABF）本発明はまた、還元SDS-PAGEによる測定で約67kDaの分子量を有し、(AATT)_n（配列中、nは2以上（前記で詳細に説明したとおり））反復エレメントに結合し、 N末端からC末端方向にH1ヒストン様ドメイン、グルタミンに富むドメインおよび HMG I/Y様ドメインを有することにより特徴づけられる実質的に純粋なパリンドロームエレメント結合因子（PABF）を提供する。本発明で用いる「実質的に純粋」なる用語は、PABFが、天然では結合している他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の物質を実質的に含まないことを意味する。当業者であれば、タンパク質の精製ための標準的な技術を用いてPABFを精製することが可能である。実質的に純粋なポリペプチドは、非還元または還元ポリアクリルアミドゲル上で単一の主要バンドを与える。また、PABFポリペプチドの純度は、アミノ末端アミノ酸の配列分析により判定することができる。PABFポリペプチドは、PABFの活性が完全に維持されている限りポリペプチドの機能的断片を含む（すなわち、該断片は転写因子として機能し、(AATT)_n反復エレメントに対する結合能を保有している）。そのようなポリペプチドには、抗体産生を誘導しうる免疫学的に反応性のペプチドが含まれる。本発明の好ましいPABFは、植物細胞に由来するものである。本発明は、PABFポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、PABFをコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む。PABF活性を有するポリペプチドをコードする限り（すなわち、コードされるペプチドが、転写因子として作用し、(AATT)_n反復エレメントに対する結合能を保有する限り）、PABFの全部または一部をコードするすべてのポリヌクレオチドが本発明に含まれると理解される。そのようなポリヌクレオチドには、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチドおよび意図的に操作されたポリヌクレオチドが含まれる。例えば、PABFポリヌクレオチドを、部位特異的突然変異誘発に付すことができる。また、PABFのポリヌクレオチド配列には、アンチセンス配列も含まれる。本発明のポリヌクレオチドには、遺伝暗号の結果として縮重している配列が含まれる。20個の天然アミノ酸が存在し、それらのほとんどは2個以上のコドンにより特定される。したがって、すべての縮重ヌクレオチド配列が、本発明に含まれる。特に本発明で開示するのは、タバコPABFをコードするＤＮＡ配列である。該配列は、約546アミノ酸長のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含有する。好ましくは、本発明の植物PABFヌクレオチド配列は、配列番号2に記載の配列であり、該アミノ酸配列は、好ましくは、配列番号3（図5）である。 PABFをコードするポリヌクレオチドは、配列番号2、および配列番号2に相補的な核酸配列（図5）を含む。相補的配列には、アンチセンス核酸を含めることが可能である。該配列がＲＮＡである場合には、配列番号2のデオキシヌクレオチドA、G、CおよびTを、それぞれ、リボヌクレオチドA、G、CおよびUで置換する。また、本発明には、配列番号3のタンパク質をコードするＤＮＡに生理的条件下で選択的にハイブリダイズが可能となるのに十分な長さである少なくとも15塩基長の前記核酸配列の断片が含まれる。特に、「選択的にハイブリダイズ（する）」なる用語は、ある断片が、PABFタンパク質をコードするＤＮＡに中等度〜高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意味する（Sambrook， FritschおよびManiatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual（第2版）を参照されたい）。後記実施例に記載のPABF核酸配列は、最初のATGが翻訳開始部位として使用されると仮定すると546アミノ酸の1個の長いオープンリーディングフレームを含有する。これは、67kDaの見掛け算出相対分子量（M_r）を有するタンパク質を生じる。SDSポリアクリルアミドゲル上で分画されたタバコ核抽出物を用いたサザンウエスタンブロット分析から、PABFポリペプチドが(AATT)_nエンハンサーエレメントに結合することが確認された（実施例3）。疎水性予測分析（KyteおよびDoolittle，J．Mol．Bio.，157:105，1982）は、 PABFが高度に疎水性であることを示しており、PABFが3個の異なるドメインを含有することを示唆している。N末端のアミノ酸38〜127は、ヌクレオソーム間のリンカーＤＮＡに結合して高次構造の形成を引き起こす塩基性染色体タンパク質であるヒストンH1の中央球状ドメインに高度の相同性を示す。アミノ酸153〜231の PABFの中央部分は、グルタミンに富むドメインよりなる。78個のアミノ酸のうちの39個（50％）がグルタミン残基であり、これらは均一に分布していた。C末端ドメインのアミノ酸274〜484は、哺乳動物HMG I/Yタンパク質に対して高度の類似性を示した。HMG I/Yタンパク質は、ATに富む配列に優先的に結合する小さな塩基性非ヒストン染色体タンパク質である（Bustinら，前掲）。結合は、HMG I/Y遺伝子内で3回反復している11アミノ酸のペプチドであるATフックモチーフにより媒介される。PABF内には、6個のATフックモチーフが存在する。さらに、7アミノ酸で分離された第7ATフックモチーフの1個のN末端および1個のC末端半分が見出される。PABFドメインの、最初に単離されたC末端部分は、3個のATフックモチーフを含有し、このことは、このモチーフがPABFのＤＮＡ結合活性を与えること強く示唆している。 PABFの一次アミノ酸配列の小さな修飾は、本明細書に記載のPABFポリペプチドと実質的に同等の活性を有するタンパク質を与えうる。そのようなタンパク質は、「配列番号3のアミノ酸を実質的に有する」なる用語で定義されるタンパク質を含む。そのような修飾は、部位特異的突然変異誘発による意図的なものであっても、あるいは自発的なものであってもよい。これらの修飾により産生されるポリペプチドのすべては、PABFの生物活性を保有している限り、本発明に含まれる。さらに、1以上のアミノ酸の欠失は、得られる分子の構造を、その生物活性を有意に改変することなく修飾しうる。これは、潜在的により広範な用途を有する、より小さな活性分子の開発につながりうる。例えば、PABFの生物活性に要求されないアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸を除去することが可能である。本発明のPABFポリペプチドは、開示されている配列（配列番号3、図5）、およびその保存変異体を含む。本発明で用いる「保存的変異」なる用語は、あるアミノ酸残基が、別の生物学的に類似した残基で置換されることを意味する。保存的変異には、例えば、疎水性残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）同士の置換、あるいは極性残基同士の置換（例えば、リシンからアルギニンへの置換、アスパラギン酸からグルタミン酸への置換またはアスパラギンからグルタミンへの置換など）が含まれる。「保存的変異」なる用語はまた、非置換の親アミノ酸の代わりに、置換されたアミノ酸を使用することを含む（ただし、これは、該置換ポリペプチドに対して産生される抗体が、該非置換ポリペプチドとも免疫反応性である場合に限られる）。本発明の核酸配列は、いくつかの方法により得ることができる。例えば、該ＤＮＡを、当該技術分野でよく知られているハイブリダイゼーション技術を用いて単離することができる。これらには、1）相同ヌクレオチド配列を検出するための、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーとプローブとのハイブリダイゼーション、2）対象となるＤＮＡ配列に対してアニーリングしうるプライマーを使用する、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ上でのポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）、および3）共通の構造的特徴を有するクローン化ＤＮＡ断片を検出するための、発現ライブラリーの抗体スクリーニングが含まれるが、それらに限定されるものではない。好ましくは、本発明のPABFポリヌクレオチドは、植物に由来する。核酸ハイブリダイゼーションに基づくスクリーニング法を用いると、適当なプローブが入手可能である限り、任意の生物に由来する任意の遺伝子配列の単離が可能となる。対象となるタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは、化学的に合成することが可能である。このためには、アミノ酸配列の、短いオリゴペプチド伸長が既知であることが必要である。該タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、遺伝暗号から推定することができるが、遺伝暗号の縮重を考慮しなければならない。該配列が縮重している場合には、混合付加反応を行なうことが可能である。これは、変性二本鎖ＤＮＡの不均一混合物を含む。そのようなスクリーニングのためには、ハイブリダイゼーションを、好ましくは、一本鎖ＤＮＡ上または変性二本鎖ＤＮＡ上で行なう。対象となるポリペブチドに関するｍＲＮＡ配列の存在量が極端に少ない起源に由来するｃＤＮＡクローンの検出においては、ハイブリダイゼーションが特に有用である。すなわち、非特異的結合を避けるように定められたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いることにより、例えば、ある特異的ｃＤＮＡクローンを、該標的ＤＮＡとその完全な相補体である該混合物中の単一プローブとのハイブリダイゼーションによりオートラジオグラフィーで可視化することが可能になる（Wallaceら，Nucl．Acid Res.，9-879，1981;Maniatisら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y．1989）。また、PABFをコードする特異的ＤＮＡ配列の生成は、1）ゲノムＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離、2）対象となるポリペプチドの必要なコドンを得るための、ＤＮＡ配列の化学的製造、3）真核供与細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列のin vitro合成、および対象となるＤＮＡ配列とアニーリングしうるプライマーを使用するゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのPCRにより達成することができる。最後者の場合には、最終的には、ｃＤＮＡと一般に称される、ｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補体が形成される。ＤＮＡ配列の合成は、しばしば、所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列がわかっている場合にうってつけの方法である。対象となるｃＤＮＡ配列を単離するための標準的な方法としては、高い遺伝子発現レベルを有する供与細胞内に豊富に存在するｍＲＮＡの逆転写に由来する、プラスミドまたはファージを保持するｃＤＮＡライブラリーの形成がある。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組合せて使用する場合には、希有発現産物でさえもクローニングすることが可能である。該ポリペプチドのアミノ酸配列の有意部分がわかっている場合には、標的ｃＤＮＡ内に存在すると推定される配列を複製する標識された一本または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡプローブ配列の生成を、一本鎖形態に変性しているｃＤＮＡのクローン化コピー上で行なうＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法において利用することができる（Jayら，Nucl．Acid Res.，11:2325，1983）。 PABFに特異的な抗体を使用して、少なくとも１つのエピトープを有するPABFペプチドに関してラムダgt11などのｃＤＮＡ発現ライブラリーを間接的にスクリーニングすることができる。そのような抗体はポリクローナル的またはモノクローナル的のいずれで誘導することも可能であり、PABF ｃＤＮＡの存在の指標となる発現産物を検出するために使用することができる。 PABFをコードするＤＮＡ配列は、適当な宿主細胞内へのＤＮＡ導入によりin v itroで発現させることができる。「宿主細胞」とは、ベクターの増殖とそのＤＮＡの発現が行われる細胞である。この用語は、対象宿主細胞の任意の後代（子孫）も含む。複製中に突然変異が生じる可能性があるため、すべての後代がそれらの親細胞と同一であるわけではないと理解される。しかしながら、「宿主細胞」なる用語を使用する場合には、そのような後代を含めることとする。安定な導入（これは、外来ＤＮＡが宿主内で連続的に維持されることを意味する）の方法は、当該技術分野で公知である。再生された植物（例えば、花、種子、葉、枝、果実など）から得られる部分は、これらの部分が、本発明に従い形質転換されている細胞を含む限り、特許請求する発明の範囲内に含まれる。これらの部分が本発明の導入核酸配列を含む限り、再生された植物の後代および変異体および突然変異体もまた、本発明の範囲内に含まれる。本発明においては、PABFポリヌクレオチド配列を組換え発現ベクター内に挿入することができる。「組換え発現ベクター」なる用語は、PABF遺伝子配列の挿入または組込みにより操作されている当該技術分野で公知のプラスミド、ウイルスまたは他の担体を意味する。そのような発現ベクターは、宿主の挿入遺伝子配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含有する。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、および形質転換細胞の表現型選択を可能にする特異的遺伝子を含有する。 PABFをコードするポリヌクレオチド配列は、植物、原核生物または真核生物内で発現させることができる。宿主には、微生物、酵母、昆虫および哺乳動物に加えて、植物細胞を含めることができる。真核またはウイルス配列を有するＤＮＡ配列を原核生物内で発現させる方法は、当該技術分野でよく知られている。宿主内での発現および複製の能力を有する生物学的に機能するウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターが、当該技術分野で公知である。そのようなベクターを使用して、本発明のＤＮＡ配列を組み込ませる。組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者によく知られている慣用の方法で行なうことができる。本発明により提供される組換え的に発現されたポリペプチドまたはその断片の単離および精製は、分取クロマトグラフィー、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いる免疫学的分離などの慣用の手段により行なうことができる。また、本発明のPABFポリペプチドを使用して、PABFポリペプチドのエピトープに対して免疫反応性であるか又は結合する抗体を製造することができる。種々のエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体から実質的になる抗体、および種々のモノクローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体は、該タンパク質の断片を含有する抗原から、当該技術分野でよく知られている方法により製造する（Kohlerら，Nature，256:495，1975；Current Protocols i n Molecular Biology，Ausubelら編，1989）。本発明で用いる「抗体」なる用語は、無傷の分子に加えて、エピトープ決定基に結合しうるその断片（例えば、Fab、F(ab')₂およびFv）を含む。これらの抗体断片は、その抗原または受容体に選択的に結合する何らかの能力を保有しており、以下のとおりに定義される。（1）Fab：抗体分子の一価の抗原結合性断片を含有する該断片は、全抗体を酵素パパインで消化して無傷の軽鎖と1本の重鎖の一部とを得ることにより製造することができる；（2）Fab'₂：抗体分子の該断片は、全抗体をペプシンで処理した後に還元して無傷の軽鎖と重鎖の一部とを産生させることにより得ることができ、抗体1分子当たり2個のFab'断片が得られる；（3）F(ab')₂：これは、全抗体を酵素ペプシンで消化することにより（その後の還元は行なわない）得ることができる抗体断片であり、2個のジスルフィド結合で連結された2個のFab'断片の二量体である；（4）Fv：これは、2本の鎖として発現された軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含有する遺伝的に操作された断片と定義される；（5）一本鎖抗体（「SCA」）：これは、遺伝的に融合された一本鎖分子として適当なポリペプチドリンカーで連結された軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含有する遺伝的に操作された分子と定義される。これらの断片の製造法は、当該技術分野で公知である（例えば、Harlowおよび Lane，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)を参照されたい；これを参考として本明細書に組み入れる。）。本発明のPABFポリペプチドに結合する抗体は、無傷ポリペプチド、または対象となる小さなペプチドを含有する断片のいずれかを免疫化抗原として使用して製造することができる。例えば、PABFのN末端またはC末端ドメインに特異的に結合する抗体を製造するのが望ましいかもしれない。免疫化に使用するポリペプチドまたはペプチドは、翻訳されたｃＤＮＡまたは化学合成に由来するものであってもよく、所望により担体タンパク質に結合させることができる。該ペプチドに化学的に結合させる一般的に使用されるそのような担体には、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（BSA）および破傷風トキソイドが含まれる。ついで該結合ペプチドを使用して、動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）を免疫する。また、エピトープを模擬するモノクローナル抗体を産生させるために、抗イディオタイプ技術を用いることも可能である。本明細書に記載されている遺伝子発現の増強方法は、発現させる遺伝子に機能しうる形で連結している異種プロモーターと(AATT)_n反復エレメントとを機能しうる形で連結し、場合により、遺伝子発現をさらに増強するために該反復エレメントをPABFポリペプチドと接触させることを含む。前記のとおり、PABFは、(AATT)_n反復エレメントに結合し（後記の実施例に示すとおり）、さらに(AATT)_nエンハンサーエレメントの活性を「増強」するＤＮＡ結合性タンパク質である。さらに増強するために、(AATT)_n反復エレメントと機能しうる形で連結されたプロモーター領域とPABFコードポリヌクレオチドとを機能しうる形で連結することが望ましいであろう。ある特定の理論に拘束されるものではないが、プロモーターと本発明の(AATT)_n反復エレメントとの両方に機能しうる形で連結したPABFの発現の増強により正のフィードバックループが形成され、それによりPABFは、(AATT)_n反復エレメントに結合しそれ自体の発現の連続的な増強を刺激することにより、それ自体の発現を誘導すると考えられる。前記の開示は、本発明の一般的な記載である。以下の特定の実施例を参考にすることにより、より完全な理解が得られるが、記載されているこれらの実施例は例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。実施例以下の実施例では、非特異的エンハンサーとして機能するPAL2プロモーターの上流領域内の(AATT)反復PAシス-エレメントの同定について記載する。このモチーフが異種プロモーターに機能しうる形で連結している場合に、特異的転写パターンの一般的な増強が認められた。そのC末端ドメイン内に存在するATフックＤＮＡ結合モジュールを介してこのエレメントに結合する新規因子をクローニングした。この因子は、非特異的エンハンサーとしてのコグネイト・シス-エレメントの活性と符合する機能特性を有する集合体である新規な三部分（tripartite）ドメイン構造を有する。実施例１材料および方法プラスミドの構築および植物の形質転換 PAL2プロモーター（Cramerら，Plant Mol．Blol.，12:367，1989）の153bpのR saI断片を、−326および−72 CHS15プロモーター／GUS遺伝子融合体の上流のフィルインされたHindIII部位内にクローニングした（Stermerら，Mol．Plant-Mic rob．Int.，3:381，1990）。同様に、(AATT)₃オリゴヌクレオチドを合成し、キナーゼで処理し、連結し、フィルイン反応後にpGEM7のSmaI部位内にクローニングした。1つのプラスミド（pPAs）は、合成パリンドローム（PA）エレメントに関してPAsと称される配列(AATT)₁₃の挿入断片を含有していた。この断片を使用して、−326および−72 CHS15プロモーター／GUS遺伝子融合体の上流にPAsモチーフをサブクローニングした。トランスジェニックタバコ植物を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）LB4404を使用する葉ディスク形質転換により作製し（Rogersら，Methods Enzymol.，118:627，1986 ）、200μｇ/mlカナマイシンを含有するMS培地（MurashigeおよびSkoog，Physio l．Plant，15:473，1962）上、25℃にて明期16時間／暗期８時間のサイクルで成長させた。蛍光GUSアッセイ対応するグルクロニドからの4-メチルウンベリフェロン（MU）の生成をFluoro /Colorimeter（American Instrument Company）で測定することにより（Jeffers onら，EMBO J.，6:3901，1987）、組織抽出物中のGUS活性を測定した。タンパク質濃度を、Bradford（Bradford，M.M.，Anal．Biochem.，72:248，1976）に従い測定した。一般的な分子生物学的技術タバコＤＮＡを葉から単離し（MurrayおよびThompson，Nucl．Acids Res.，8: 4321，1980）、全ＲＮＡを各種のタバコ組織から調製した（Chirgwinら，Bioche mistry，18:5294，1979）。サザンおよびノーザンブロットのために、核酸をNyt ranメンブレン（SchleicherおよびおよびGilbert，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:1991，1984）、メンブレンを 2×SSC、1％SDS中、室温で２回、0.2×SSC、1％SDS中、60℃で1回、そしてより低ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションのために1×SSC、1％SDS中、60 ℃で洗浄した。λ900 ｃＤＮＡ断片のランダムプライミング（FeinbergおよびVo gelstein，Anal．Biochem.，132:6，1983）により、プローブを調製した。Milli pore（Bedford，MA）ＤＮＡ合成装置で、オリゴヌクレオチドを合成した。プローブとして使用した種々のオリゴヌクレオチドの配列(5'-3'）を以下に示す：一連のネステイドデレーション（段階的欠失）を生成させた後、PABFをコードするｃＤＮＡを両方の鎖上で配列決定した（Sangerら，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，74:54563，1977）。Wisconsin大学遺伝子コンピューターグループの配列決定用ソフトウエアパッケージング（Devereuxら，Nucl．Acids Res.，12:387， 1984）を用いて配列データを分析し、Blastネットワーク・サービス（Altshulら，J．Mol．Biol.，215:403，1990）で相同性検索を行なった。電気泳動移動度シフト分析（EMSA）結合反応を、2×10⁴cpmの³²P標識プローブ、培養したマメ細胞（品種Canadian Wonder）およびタバコの茎のそれぞれの核抽出物（Staigerら，Proc．Natl．Ac ad Sci．USA，86:6939，1989）20μｇ、60μｇのポリ［dI-dC］を結合緩衝液（2 0mM Hepes，pH7.9/20%グリセロール/0.2MKCl/0.4mM EDTA/0.5mM PMSF/2mM MgCl₂ /1mM DTT）中に含有する20ml中で行なった（Ausubelら，Current Protocols in Molecular Biology， John Wiley & Sons，NY，1992）。PAモチーフ（AATTAATTAATCAATTAATTAATTAATTG ATTGATT）（配列番号１）を有する相補的オリゴヌクレオチドをキナーゼで処理し、アニーリングし、連結して、コンカテマー化PAエレメントを得た（Vinsonら，Genes Dev.，2:801，1988）。ゲル精製した五量体をプローブとして使用した。クレノウポリメラーゼを用いたフィルイン反応により、制限断片を標識した。 DNアーゼIフットプリント分析 Ausubelら（Ausubelら，前掲）に従い、DNアーゼIフットプリンティングを行なった。簡単に説明すると、pGEM7中にサブクローニングした153bpのRsal PAL2 プロモーター断片（−410〜−255）の非コード鎖を、該ベクターのマルチクローニング部位内に存在するBamHI部位の陥凹3'末端のフィルインにより標識した。D NアーゼI（0.25u/mlおよび1u/ml）による25℃で1分間の消化の前に、該標識化断片を10μｇのマメ核抽出物と共に50mlの反応中、それぞれ0℃で10分間および25 ℃で20分間インキュベートした。化学分解法（Maxamら，Methods Enzymol，65:4 99，1980）による配列決定のために、該標識化断片のアリコートを使用した。サウスウエスタン分析−タバコ茎ＲＮＡから調製したλgt11ライブラリを、二重鎖PAオリゴヌクレオチドをコンカテマー化することによって作製したPAエレメントの多重コピーを含有するプローブでスクリーニングした。組換えファージの増殖およびイソプロピルβ−チオガラクトシド誘導後、タンパク質をニトロセルロース膜上に移した（Schleicher （Vinsonら、上記；Singhら、Bio Techniques,7:252,1989）。5％脱脂乾燥ミルクを補充した結合緩衝液（BB，20 mM Hepes，pH 7.9/3 mM MgCl₂/40mM ＫCl/１m M DTT）中で30分、膜をブロッキングした後、0.25％ミルク、10⁶cpm/mlプローブおよび５μｇ/ml変性鮭精子ＤＮＡを含むBB中、室温で３時間、フィルターをハイブリダイズした。オートラジオグラフィーの前に、フィルターをBBで10分間、３回洗浄した。大腸菌Y1089中でPABF組換え溶原菌を産生させた。溶原性抽出物（Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Lab.Press,第２版）を 10％SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースに移した。再生および5％ミルクを含むBBでの4℃で９時間のブロッキング後、膜を細片に切り分け、各種のプローブと4℃で10時間ハイブリダイズさせた。コンカテマー化オリゴヌクレオチドプローブをさらなるゲル精製せずに使用した。PCR断片を標識するために、非標識dCTPに代えてα-³⁵Ｓ dCTPを使用した。実施例２普遍的エンハンサーとしてのPAエレメントートランスジェニックタバコ中のPA L2プロモーターの5'欠失の分析によって、主要な量的エレメントは転写開始部位に対して-480および-289位置の間に存在することが明らかになった（Leyvaら、P lant Cell,4:263,1992）。図１、パネルＢはプロモーターGUS融合構築物を示している（定比率で描いてはいない）。PAL2プロモーターの153bp RsaI断片または (AATT)₁₃配列を有するPAsを-326CHS15/GUS遺伝子融合物（それぞれ-326Rsaおよび-326PAs構築物）または-72CHS15/GUS遺伝子融合物（それぞれ-72Rsaおよび-72 PAs構築物）の前端にクローン化した。CHS15プロモーターを斜線部分で表す。PA L2プロモーター内のRsaI断片の位置（PAL2、ドット部分）およびPAL2ΔPA構築物内のPA欠失位置（破線）を示す。矢印はリポーター遺伝子の転写開始部位を示す。この領域内に２つの注目すべき配列モチーフが存在する：ジヌクレオチドATの 19タンデム反復（AT−エレメント：-467〜-429）および配列AATTの不完全10回反復であるパリンドロームエレメント（PA：-340〜-300）。PAシスエレメント（-3 40〜-300）の機能を、豆カルコンシンターゼCHS15プロモーターの上流にこの配列を置いた場合の影響の分析、および全長豆PAL2プロモーターからこのエレメントを欠失させることによって評価した。豆PAL2プロモーターの-410〜-255の153b p RsaI断片、または完全(AATT)₁₃配列で構成される合成PAエレメント（PAs）の両方を-326CHS15/GUSおよび-72CHS15/GUSプロモーター遺伝子融合物の上流に挿入した（図１、パネルＢ）。転写開始部位に対して-326まで5'側を欠失したCHS15プロモーターは花弁の着色表皮細胞中で発現するが、花弁の非着色領域または導管組織中では発現しない。CHS15プロモーターをさらに-72まで5'側を欠失さると、 CHSの発現のために必須のG-ボックス9(-74〜-68)の破壊によって、トランスジェニックタバコおよび懸濁培養した大豆細胞（Dronら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8 5:6738,1988）中でのGUSの発現が阻害される。図１、パネルＢに要約したCHS15/GUSおよびPAL2/GUS遺伝子融合構築物で形質転換したT₂植物からの花弁の着色部分におけるGUS活性を測定した。それぞれ5種の独立した-326トランスジェニック系および７種の独立した-326 PAs系の複製植物を抽出性GUS活性についてアッセイした。図１Ａは図１、パネルＢに図示する構築物を含有する独立した形質転換物からの成熟着色花冠（花弁）組織（パネルａ〜ｄ）、非着色花冠組織（パネルｆ）および第５節間の上の葉柄（パネルｅ）の抽出物中のGUS活性（各トランスジェニック系について２つの植物の平均）に関する棒グラフを示す。影をつけた部分は独立したトランスジェニック系中で測定したGUS活性の平均値を表す。パネルａの文字およびパネルｄの数字はパネルｅおよびｆのGUSデータを導いたトランスジェニック系を示す。 -326植物の着色花弁組織中のGUS活性はおよそ100pmol 4-メチルウンベルリフェロンmgタンパク質／minである。-326PAs植物中にPAsエレメントを存在させると、着色組織中で抽出性GUS活性が特異的に10倍に増大した。-326 Rsa構築物で形質転換した５種の独立したトランスジェニック系は-326植物に比較して、着色組織中でGUS活性が８倍に増大することが示された。（図１Ａ、パネルｂ）。野性型-326CHS15プロモーターが活性でないその他の組織中では増大したGUS活性は見られなかった。花弁の非着色部分および葉柄中では、両構築物（-326PAs， -326Rsa）についてGUS活性はバックグラウンド値を超えず（図１Ａ、パネルｅおよびｆ）、観察された効果が厳密に量的なものであることが示唆された。 -72最小CHS15プロモーター構築物での結果は異なっていた。７つの独立した-7 2Rsa系の分析の結果、花弁中ではGUS活性を示さなくなったこのプロモーターが1 53bp RsaI断片の導入によってなお活性化することができることが明らかになった（図１Ａ、パネルｃ）。しかし、PAsエレメントのみ（９独立系）では-72まで欠失したCHS15プロモーターの上流に置かれたとき、GUSの発現を刺激することはできなかった（図１Ａ、パネルｃの-72PAs参照）。これによって、PAsエレメントは非特異的エンハンサー活性を有しているが、これ自身ではプロモーターを活性化することができないことが示された。153bp RsaI PAL2断片は(AATT)ｎエレメントの他に特異的シスエレメントを含有することが推定され、PAL2プロモーターに関する以前の分析（Leyvaら、上記）と一致している。 PAエレメントに関するエンハンサー機能もまた、このエレメントをPAL2プロモーターから特異的に欠失させた実験（PAL2ΔPA）によって示された。こうして、 PAL2ΔPA/GUS遺伝子融合物を含有するトランスジェニック植物の花弁および葉柄中のGUS活性は、野性型PAL2プロモーターの制御下にあるGUSとの遺伝子融合物を含有する同等の植物よりも実質的に低かった（図１Ａ、パネルｄおよびｅ）。核抽出物はPAエレメントに対する熱安定性ＤＮＡ結合活性を含有する−PAL2プロモーターの-480〜-289領域に結合する核因子を電気泳動移動度分析（EMSA）によって同定した。図２、パネルＡは、標識RsaI断片を添加する前に、指示温度で 10分間インキュベートした豆の粗核抽出物（NE）（タンパク質20mg）での電気泳動移動度分析（EMSA）を示す。結合反応を0℃または25℃のいずれかで30分間実施した。室温でEMSA結合反応を実施したとき、２つの複合体、C1およびC2が観察された。主要な複合体、C2はプローブの約90％と結合する。ATに富む配列と優先的に結合する小さい染色体タンパク質の１クラス（Bustinら、Bioche m．Biophys．Acta，1049:231,1990）である、高移動度グループのタンパク質（H MG）がこれらの複合体に関与するかどうかを試験するため、この結合因子の熱安定性を試験した。両複合体は熱安定性であった。70℃で10分のインキュベート後、C2における当初の結合活性の約40％が残存したが、80℃でのインキュベート後は消失した。対照的に、複合体C1は80℃まで安定で、高温での方が優先的に形成された。トランスジェニックタバコ中での豆PAL2プロモーターの発現パターンは豆中のものに非常に類似しており、調節機構の保存を示唆している（Liangら、Proc.Na tl.Acad.Sci.USA,86:9284,1986b）。タバコ抽出物中に同様のＤＮＡ結合活性が存在するかどうかを試験するため、プローブとしてPA結合部位を使用してEMSAを実施した。タバコ茎から調製した核抽出物中に同様の熱安定性ＤＮＡ結合活性（ C2、図２ｂ）が検出された。80℃で10分間のインキュベート後、結合のごくわずかの減少が観察された。その上、タバコ抽出物の熱処理の後、さらに小さい複合体（C1）が出現した。図２、パネルＢは、タバコ茎から調製し、プローブとしてコンカテマー化した PAオリゴヌクレオチドの５量体を使用する結合反応の前に、80℃で10分インキュベートした核抽出物（20mg）の電気泳動移動度シフト分析（EMSA）を示す。高イオン強度のTris−グリシン緩衝液を使用する4％非変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動（10V/cm）によって、非結合ＤＮＡからタンパク質−ＤＮＡ複合体を分離した。Ｐ：遊離プローブ、C1およびC2：複合体。この領域の大部分をカバーする153bp RsaI制限断片（-410〜-255）についての特異性を示す、豆核抽出物中に存在するＤＮＡ結合活性を同定した（図２Ａ）。豆核抽出物の存在下（＋）または不在下（−）で末端標識したRsaI断片をインキュベートし、続いてそれぞれDNアーゼI 0.25および１単位／mlで消化した。消化生成物を、同一のＤＮＡ断片のMaxam-Gilbert A及びGシークエンシング反応物（レーンA/G）とともに6％変性ポリアクリルアミドゲル上で分析した。図の右側にDNアーゼI消化から保護された領域を示し、対応する配列を記載する。数字はPAL2プロモーターの転写開始部位ａに対するヌクレオチドの位置を示す。153bp RsaI断片に結合するトランス因子のDNアーゼIフットプリント分析の結果、(AATT)反復PAエレメントに正確にマッピングする単一の保護部位（-343〜300）が明らかになった(図３)。実施例３ PA特異的ＤＮＡ結合タンパク質をコードするタバコｃＤＮＡ−PAエレメントと相互作用するタンパク質を同定するため、タバコ（Nicotianatabacum）茎ＲＮＡから調製したλgt11発現ライブラリを、PAプローブを使用して、ＤＮＡ結合タンパク質についてスクリーニングした。１×10⁶プラークのスクリーニング後、PA プローブに結合したＤＮＡ結合タンパク質(PAPF)を発現する単一の組換えファージ（λ900）を単離した。 PABFの結合がPAプローブに対して特異的であるか、または普遍的なＤＮＡ結合活性を有するのかを決定するため、ＤＮＡ−タンパク質フィルター結合アッセイを実施した。IPTGでの誘導後、λ900プラークからのタンパク質をニトロセルロースに移し、これを９個に切断して、別種のプローブとハイブリダイズさせた。スクリーニングに使用したPAはPABFに強く結合した。トランスジェニック植物の機能研究のために使用したPAsの結合はPAの結合と識別できなかった。ATの19回反復からなるATに富む領域（AT）は、PAL2の-480〜-289領域内のPAエレメントの上流に存在する。PAに類似しているにもかかわらず、ATプローブとの結合は観察されなかった。その外に、PFと命名した10AT塩基対(AATTTAATTT)の妨害されていないストレッチがPAL2プロモーターのATとPAモチーフとの間に位置しているが、このエレメントも同様にPABFに結合しなかった。その上に、特にAT塩基対に富んではいないプローブを試験した：PAL2プロモーターのACに富むエレメントおよび各種の変異体（mAC-1，-2，-3）、G-ボックス（Giulianoら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA， 85:7089,1988）ならびにH-ボックス（Loakeら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，8 9:9230，1992）モチーフ。これらのモチーフはいずれもPABFに結合しなかった。図４は、マルチマー化PAプローブでプローブしたλ900に対して溶原性の培養物からのタンパク質抽出物のサウスウエスタンブロット分析を示す。図４、パネルＡはSDS-PAGE上で分離し、ニトロセルロース上にブロットし、そして再生した溶原性ファージのタンパク質抽出物である。膜を６枚に切断し、指示したプローブとハイブリダイズさせた。M：kDaで示す実際の分子量を有するマーカータンパク質の位置；PAｎ：コンカテマー化PAプローブ；PA：モノマーPAプローブ；1〜4 ：PAL2プロモーターの各種領域を表すPCR-断片。図４ＢはPAL2プロモーター内の PCR断片1〜4の相対位置を示す。篩部エレメント、AT-，PF-，およびPA-モチーフの位置を指示している。数字は転写開始部位に対する位置を表す。矢印は130kDa のファージにコードされた融合タンパク質を表す。マルチマー化PAプローブ（PA_n）でプローブしたλ900に対して溶原性の培養物からのタンパク質抽出物のサウスウエスタンブロット分析で、約130kDaの融合タンパク質が検出された（図４、パネルＡ）。PAｎへの結合に比較して、モノマー PAエレメントは弱く結合するのみで、大部分のプローブは約33kDaの細菌タンパク質に結合した（図４、パネルＡ、レーンPA）。しかし、PAL2プロモーターとの関係では、PABFは単一のPAエレメントを認識する。このため、完全プロモーター構築物（PAL2）またはPAエレメント（PAL2ΔPA）若しくはATストレッチ（PAL2Δ AT）のいずれかが欠失した構築物（図４、パネルＢ）を使用するPCRによって、2 00bpのPAL2プロモーター領域-480〜-280の断片を作製した。この領域の外側からの断片を対照として含ませた。完全PAエレメントを有する断片のみがＤＮＡ結合タンパク質に結合した（図４、パネルＡ、レーン１および２）。このように、PA BFはマルチマー化PAプローブに結合したばかりでなく、PAL2プロモーター内にはめこまれたPAエレメントにも強く結合した。 PABFの転写物サイズおよび発現パターン−PABF転写物のサイズをノーザンブロット分析によって決定したところ、約2.2kbであった。タバコの根、茎、葉および花組織から調製した総ＲＮＡのPABFmRNAレベルについての分析によって、構成的に発現することが知られているβ-ATPアーゼ遺伝子（Boutry and Chua,EMBO J .,4:2159,1985）に比較して、すべての組織でPABFの強い発現が明らかになった。茎および葉の組織において他の組織よりもわずかに多い定常状態のPABFｍＲＮＡレベルが検出された。 PABFは三部構造(tripartite structure)のHMG I/Y様タンパク質である−ノーザンブロットデータではポリ（A）尾部を有する850bpｃＤＮＡ断片を含有するλ 900は全長ｃＤＮＡクローンではないことが示された。全長ｃＤＮＡを単離するため、この3'断片を使用してλgt11花芽ライブラリをスクリーニングした。4×1 0⁵プラークをスクリーニングし、単離した最大のクローン（λ2200）は2153bp断片を含有しており、これを両鎖について配列決定した（図５）。 λ900の配列はポリ（A）尾部を欠如している以外はλ2200の3'配列（図５、ヌクレオチド 1182−1993）と同一である。λ2200は546アミノ酸の長いオープンリーディングフレームを１つ含有しており、翻訳開始部位として１番目のATGが使用されると推定される。これから計算上の相対分子量（Mr）が67kDaのタンパク質が生じる。図５はPABFｃＤＮＡのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号２および３）。１文字のコードで示す推定アミノ酸配列はオープンリーディングフレームの61位の最初のメチオニンで始まり、N-546に続く停止コドンで終了する。矢印は当初単離された切断されたｃＤＮＡクローンの 5'および3'末端を示す。ATフックモチーフに下線を付けている。SDSポリアクリルアミドゲルで分画したタバコ核抽出物でのサウスウエスタン分析によって、HM Gタンパク質およびヒストンと推定される約18kDaの小さなタンパク質の他に、PA BFを含む、40kDaから80kDaの範囲内のその他のHMG様タンパク質がPAプローブに結合することができることが確認された。図６は疎水性プロットである。上部パネルは疎水性プロットを示し、マイナス値は親水性部分を表す。数字はPABF配列内のアミノ酸位置に相当する。下部のパネルにPABFの構成を図式によって示す。黒色部分はHMG I/Yドメイン中に見られるATフックモチーフを示す。疎水性予測（Kyte and Doolittle，J．Mol．Bio.， 157:105,1982）では、PABFが高度に親水性であることが示され、またPABFが３つの区別されるドメインを含有しているらしいことが示唆された（図６、上部パネル）。この構造的構成はPABFの推定アミノ酸配列に対する類似性に関するデータベース検索によって確認された（図６）。N-末端のアミノ酸38〜127は、ヌクレオソーム間のリンカーＤＮＡに結合して、さらに高次構造の形成を導く塩基性染色体タンパク質である、ヒストンH1の中央の球状ドメインに対して高度の類似性を示した（図７Ａ）。アミノ酸153と231との間のPABFの中央部はグルタミンに富むドメインで構成されていた。78アミノ酸の中で39（50％）がグルタミン残基であり、これらが均一に分布していた。C-末端ドメインのアミノ酸274〜484は哺乳類HMG I/Yタンパク質への高度の類似性を示した。HMG I/Yタンパク質は塩基性でヒストンを含まない小さな染色体タンパク質で、ATに富む配列と優先的に結合する（Bustinら、上記）。結合は11アミノ酸のペプチドモチーフからなるATフックによって仲介され、HMG I/Y中ではこれが３回反復している。このATフックモチーフに類似した６つの短い配列がPABF中に存在した（図６および７Ｂ）。その上、７アミノ酸で隔てられた、このＤＮＡ結合単位の１個のN-末端および１個のC- 末端の半分が見出だされた。当初単離されたPABFのC-末端部分はこれらの結合単位を３個含有しており、このモチーフがＤＮＡ結合活性に対応することを強く示唆している。 PABFのゲノム構成−タバコゲノム中のPABF遺伝子の構成を決定するため、低ソトリンジェントの条件下でサザンブロットを実施した。５個の制限エンドヌクレアーゼによって、等強度の２または３個のハイブリダイズ断片が観察され、PABFはおそらく２つと考えられる遺伝子群の小さな遺伝子ファミリーの１員であることが示された。N.tabacumの複二倍体的性質から、これらのシグナルは２つのタバコ原種N.sylvestrisおよびN.tomentosiformisのPAB F遺伝子に対応するのかも知れない。花ライブラリの再スクリーニング後に単離したｃＤＮＡのおよそ半分がPABFｃＤＮＡに比較して異なる制限パターンを示した。配列分析によって、この第２の遺伝子はPABFに94％同一であり、ATフックモチーフが特によく保存されていることが示された。要約非特異的エンハンサーとしてのPA機能−上記の実施例は合成PAエレメント（PA s）が豆PAL2プロモーター内の量的シスエレメントの機能を有していることを示している。こうして、豆CHS15プロモーターの上流に置かれたとき、このエレメントは相同性プロモーターによって誘導される発現の空間的および時間的パターンを変更することなく、トランスジェニックタバコ中で発現を約10倍刺激した。植物遺伝子中でいくつかのATに富むエレメントがカリフラワーモザイクウイルス (CaMv)35S-90プロモーターからの方向に無関係な様式の転写を強化することがわかっている。しかし、これらの場合、上流エレメントはそのプロモーターの発現パターンを改変する（Bustosら、Plant Cell,1:839,1989；Jordanoら、Plant Ce ll,1:855,1989）。２つの別の研究も組織特異的発現においてATに富む領域を関連づけている（Jofukuら、Nature,328:734,1987；Jensenら、EMBO J.,7:1265,19 88）。対照的に、PAL2PAエレメントでは発現パターンの改変は見られなかった。このように、PAエレメントの導入はCHS15プロモーターの発現パターンに影響せず、PAsエレメントが普遍的エンハンサーとして作用することを証明している。 PABFはPAモチーフに特異的に結合する−豆核タンパク質はPAエレメントを誘導する 153bp RsaI断片と非常に熱に安定な複合体を形成した。DNアーゼIフットプリント分析によって、豆核タンパク質のための結合部位としてのPAエレメントが同定された。高度の熱安定性およびATに富む配列への優先的な結合は、機能的に確定された塩基性の小さな非ヒストン染色体タンパク質であるHMGタンパク質の特性である（Bustinら、上記）。いくつかの場合、ATに富む上流配列に特異的な植物ＤＮＡ結合活性がHMGタンパク質として同定されている（Czarneckaら、上記；Jacobsenら、Plant Cell,2:85,1990；P edersenら、Plant Mol.Bio.,16:95,1991）。上記のデータは異なる電気泳動移動度を有する２つの熱安定性複合体、C1およびC2を示し、ATに富む配列に対して異なる親和性を有する別個のHMGタンパク質の存在を示唆している。類似の結合パターンがCzarneckaら（Czarneckaら、上記）によっても観察され、SDS-PAGEによる分画において、低移動度複合体は46〜69kDaポリペプチドに分けられ、一方高移動度複合体はそれぞれ32および23kDaの２つのタンパク質に分かれた（Czarnec kaら、上記）。 PABFの機能−ヒストンH1とPABF中のHMG I/Y染色体タンパク質ドメインとにはさまれたグルタミンに富む区域の新規な組合せは、転写の協奏的、非特異的刺激を提供するようである。こうして、同種(AATT)反復シスエレメントへのPABFの結合は、ヒストンH1によって仲介される基礎抑制を減少させ、そしてプロモーターに対する転写因子の普遍的な接近を助長するためのヌクレオソーム構造の局部的再編成によるばかりでなく、転写開始複合体の形成を強化するためのグルタミンに富む区域の配置によって、転写を増加させるようである。各成分は作用において非特異的であると予想され、このキメラタンパク質の組み合わされた、おそらく相乗的な寄与が、同種(AATT)反復シスエレメントの、特異的シスエレメントの存在に依存し、最小プロモーターについては不活性な非特異的エンハンサーとしての性質と協調する。こうして、PAL2プロモーター中でのPABFとPAエレメントの相互作用は、単離したとき弱い木部特異的発現を与えるにすぎない下流の導管特異的シスエレメントによって特定される選択的発現を強化する機構を提供する。さらに、PABFは、プロモーター強度を非特異的に量的に調節するための、転写活性化ドメインが染色体タンパク質ドメインと各種の組合せで並列している、転写因子の新規なクラスの始原型であるようである。本発明を現在のところ好ましい態様を参照して記載したが、本発明の精神からはずれることなく各種の改変がなされ得ると理解されるべきである。したがって、本発明は以下の請求の範囲のみによって限定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ドエルナー，ピーターアメリカ合衆国 92109 カリフォルニア州，サンディエゴ，ホーンブレンド 1410 (72)発明者レイブル，ゴエッツオーストリア国エー―1030 ビエンナ, ドクターボール―ガッセ７

Claims

【特許請求の範囲】 1. 少なくとも配列(AATT)_n（ここでｎ≧２）からなる単離されたヌクレオチド配列。 2. ｎが約２から約20である、請求項１に記載のヌクレオチド配列。 3. (AATT)_nが、シスに作用する非特異的なエンハンサーエレメント活性を有する、請求項１に記載のヌクレオチド配列。 4. 配列が(AATT)₁₃である、請求項１に記載のヌクレオチド配列。 5. 実質的に精製されたパリンドロームエレメント結合因子（ＰＡＢＦ）ポリペプチド。 6. ＰＡＢＦがａ）SDS-PAGEで測定したとき約67kDの分子量を有し；ｂ）(AATT)_n反復エレメント（ここでｎ≧２）に結合し；そしてｃ）Ｈ１ヒストンドメイン、グルタミンが豊富なドメイン、およびHMG I/Yドメインを有する、ことによって特徴づけられる、請求項５に記載のポリペプチド。 7. タンパク質のアミノ酸配列が配列番号３（図５）に示すアミノ酸配列と実質的に同一である、請求項５に記載のポリペプチド。 8. アミノ酸配列が配列番号３（図５）に示すアミノ酸配列と実質的に同一である、請求項５に記載のポリペプチド。 9. 請求項５に記載のＰＡＢＦポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。 10．配列番号２（図５）に示すヌクレオチド配列、もしくは同一のアミノ酸配列をコードするがアミノ酸のいくつかについて異なったコドンを有するその変異型、またはそのスプライシング変異型(splice variant)ヌクレオチド配列を有する、請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチド。 11．請求項９に記載の核酸配列を含む組換え発現ベクター。 12．請求項11に記載のベクターを含む宿主細胞。 13．請求項５に記載のタンパク質または該タンパク質の抗原性断片に結合する抗体。 14．細胞における遺伝子の増大した発現を提供する方法であって、機能しうる形で該遺伝子に結合している異種プロモーターに(AATT)_n反復エレメントを機能しうる形で連結することを含んでなる、前記方法。 15．プロモーターが構成的プロモーターである、請求項14に記載の方法。 16．プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項14に記載の方法。 17．細胞が植物細胞である、請求項14に記載の方法。 18．請求項５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同時発現させることをさらに含む、請求項14に記載の方法。 19．機能しうる形で(AATT)_nに連結されたＰＡＢＦをさらに含む、請求項14に記載の方法。