KR100443489B1 - 압시식산 합성을 제어하는 신규 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 압시식산 (abscisic acid) 합성을 제어할 수 있는 식물 유전자를 코딩하는 올리고뉴클레오티드로서, 서열 목록의 서열 번호 2의 1 (M) 내지 164 (I) 위치의 아미노산 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오티드, 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 코딩하는 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드; 이러한 올리고뉴클레오티드의 산물; 및 이러한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 식물에 관한 것이다.

Description

압시식산 합성을 제어하는 신규 유전자{Novel gene regulating the synthesis of abscisic acid}

트랜스포존은, 동물, 효모, 세균 및 식물의 게놈에 편재하는 돌연변이 유발 유전자이다. 트랜스포존은 그의 이동 (transposition) 메카니즘에 따라 두 부류로 분류된다. 클래스 II 트랜스포존은 복제 없이 DNA 의 형태로 이동한다. 공지된 클래스 II 트랜스포존의 예는 옥수수 (제아 마이스 (Zea mays))의 Ac/Ds, Spm/dSpm 및 Mu 요소 (Fedoroff, 1989, Cell 56, 181-191; Fedoroff 등, 1983, Cell 35, 235-242; Schiefelbein 등, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4783-4787), 및 금어초 (Antirrhinum, 안티리눔 마주스 (Antirrhinum majus))의 Tam 요소 (Bonas 등, 1984, EMBO J, 3, 1015-1019)를 포함한다. 클래스 II 트랜스포존은 트랜스포존 태깅에 의한 유전자 단리에 광범위하게 사용된다. 이러한 기술은 트랜스포존의특성을 이용한 것이다. 즉, 트랜스포존은 게놈 내에서 이동하여 특정 유전자로 삽입되고, 그 결과, 유전자가 기능적으로 변경되어 유전자에 의해 제어되는 표현형이 변화된다. 영향을 받은 유전자는 이러한 표현형 변화를 검출함으로써 단리될 수 있다 (Bancroft 등, 1993, The Plant Cell, 5, 631-638; Colasanti 등, 1998, Cell, 93, 593-603; Gray 등, 1997, Cell, 89, 25-31; Keddie 등, 1998, The Plant Cell, 10, 877-887; Whitham 등, 1994, Cell, 78, 1101-1115).

클래스 I의 트랜스포존은 레트로트랜스포존으로도 불린다. 레트로트랜스포존은 RNA 중간체를 통한 복제성 이동을 한다. 클래스 I 트랜스포존은 초파리 및 효모에서 최초로 동정 및 특성화되었다. 최근의 연구에 의하면 레트로트랜스포존이 식물 게놈에 있어서 편재하며 우세하다는 것이 밝혀졌다 (Bennetzen, 1996, Trends Microbiolo., 4, 347-353; Voytas, 1996, Science, 274, 737-738). 대부분의 레트로트랜스포존은 통합성의 비이동성 유닛인 것으로 나타났다. 최근에, 이러한 유형의 레트로트랜스포존 중 몇몇이 창상, 병원체 공격, 및 세포 배양과 같은 스트레스 조건 하에서 활성화된다는 것이 보고되었다 (Grandbastien, 1998, Trends in Plant Science, 3, 181-187; Wessler, 1996, Curr. Biol. 6, 959-961; Wessler 등, 1995, Curr. Opin. Genet. Devel. 5, 814-821). 예를 들어, 스트레스 조건 하에서의 상기와 같은 활성화는 담배의 레트로트랜스포존인 Tnt1A 및 Tto1 (Pouteau 등, 1994, Plant J., 5, 535-542; Takeda 등, 1988, Plant Mol. Biol., 36, 365-376), 및 벼의 레트로트랜스포존인 Tos17 (Hirochika 등, 1996, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 93, 7783-7788)에서 발견되었다.

벼 레트로트랜스포존 Tos17은 광범위하게 연구된 식물에 있어서의 클래스 I 요소이다. Tos17은, Ty1-copia 군 레트로-요소의 역전사효소 도메인의 보존 아미노산 서열을 기초로 제조된 축중 (degenerate) 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 클로닝하였다 (Hirochika 등, 1992, Mol. Gen. Genet., 233, 209-216). Tos17은 4.3 kb의 길이를 가지며, 2개의 동일한 138 bp의 LTR (장쇄 말단 반복 (long terminal repeat)) 및 개시 메티오닌 tRNA의 3' 말단에 상보적인 PBS (프라이머-결합 부위 (primer binding site))을 가진다 (Hirochika 등 (1996)의 상기 문헌). Tos17의 전사는 조직 배양에 의해 강력하게 활성화되며, Tos17의 카피수 (copy number)는 배양 시간이 증가할수록 증가한다. 게놈 연구 모델로서 사용되는 자포니카 (japonica) 변종의 니폰베어(Nipponbare)에 있어서 Tos17의 초기 카피수는 2 이다. 조직 배양으로부터 재생된 식물에 있어서 상기 카피수는 5 내지 30으로 증가한다 (Hirochika 등 (1996)의 상기 문헌). 효모 및 초파리에서 발견되는 클래스 II 트랜스포존과는 달리, Tos17은 염색체에서 랜덤하게 이동하여 안정한 방식으로 돌연변이를 유발한다. 따라서, Tos17은 벼에서의 유전자 단리에 유용한 도구를 제공한다 (Hirochika 등, 1997, Plant Mol. Biol. 35, 231-240; 1999, Molecular Biology of Rice, K. Shimamoto 편집, Springer-Verlag, 43-48).

압시식산은 중요한 식물 호르몬이다. 식물에 있어서 상기 호르몬은 기관 이탈의 촉진, 휴면 유도, 노화 촉진, 생장 저해, 기공의 폐쇄 등과 같은 여러 생리학적 작용을 가지는 것으로 알려져 있다 (McCarty, D.R., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46, 71-93 (1995), Giraudat, J. Curr. Opin. Cell Biol. 7: 232-240 (1995); Addicott, F.T. (편집), "Abscisic Acid", Praeger Scientific, 미국 뉴욕 (1983)). 또한, 압시식산의 합성 저하는 식물 (예를 들어 옥수수)의 조숙한 발아 및 시들음 (wilting)의 원인이 되는 것으로 추측되고 있다 (McCarty, D.R. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46, 71-93 (1995); Addicott, F.T. (상기 문헌)). 따라서, 압시식산 합성을 제어할 수 있다면, 조숙한 발아의 억제 및 건조내성과 같은 식물 발현의 조절 또는 부여가 가능해질 것으로 예상된다.

압시식산은 아포카르테노이드의 일종이다. 아포카르테노이드는 카르테노이드의 산화적 절단에 의해 생성되는 화합물로서, 자연계에 광범위하게 존재한다. 압시식산은 에폭시카로테노이드의 산화적 절단에 의해 생성된다. 산화적 절단은 압시식산 생합성에 연루된 첫번째 반응이며, 상기 반응에 있어서 속도 결정 단계인 것으로 제안되어 왔다.

지금까지, 압시식산 생합성에 관련하는 2종의 유전자가 식물로부터 단리되었다. 2종의 유전자 중 하나는 담배로부터 단리된 VP14이며 (Marvin, E. 등, EMBO J., 15: 2331-2342, 1996), 다른 하나는 옥수수로부터 단리된 VP14인데 (Tan, B-C등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12235-12240, 1997; Scheartz, S.H. 등, Science 276, 1872-1874), 이들 둘 모두는 트랜스포존을 이용하여 단리되었다. 압시식산 생합성에 연루된 여러 다른 유전자가 존재할 것으로 생각된다. 압시식산 생합성 효소에 대한 추가의 연구가 요구된다.

VP14 유전자는 압시식산 신테타제를 코딩하는 유전자이다. 9-시스-에폭시카로테노이드 디옥시게나제인 상기 유전자의 생성물은 9-시스-에폭시카로테노이드 (예를 들어 9'-시스-비올락산틴 및 9'-시스-네옥산틴)을 절단하여 C₂₅아포알데히드 및 잔톡신을 생성한다. 잔톡신은 고등 식물에 있어서 압시식산의 전구체이다. 압시식산의 발현은 건조에 의해 유도된다 (Zeevaart, J.A.D. 및 Creelman, R.A., Annu. Rev. Plant Mol. Biol. 39, 439 (1988)). 또한, VP14 유전자의 돌연변이에 의해 압시식산 합성이 감소된다. 따라서, VP14 유전자는 압시식산 합성의 속도 결정 효소라는 것이 제안되어 왔다 (Scheartz, S.H. 등, Science 276, 1872-1874, 1997). 지금까지 VP14는 단지 옥수수에서만 동정되었다.

발명의 개시

본 발명은 Tos17을 사용하여 제공되는 신규 식물 유전자를 제공한다.

본 발명자들은 새롭게 이동된 Tos17 카피 및 Tos17 표적 부위의 인접 서열을가지는 식물의 표현형을 예의연구하여 계통적으로 분석하였다. 그 결과, 본 발명자들은 Tos17 삽입으로 인하여 조숙 발아 돌연변이를 가지는 벼 돌연변이체를 수득하여 Tos17 표적 부위를 조사함으로써 압시식산 합성을 제어하는 신규한 유전자를 알아내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 압시식산 합성을 제어할 수 있는 식물 유전자를 코딩하는 올리고뉴클레오티드로서, 서열 목록의 서열 번호 2의 1 (M) 내지 164 (I) 위치의 아미노산을 코딩하는 올리고뉴클레오티드, 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 또는 부가된 제2 아미노산 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 올리고뉴클레오티드는 벼로부터 유래된다.

바람직하게는, 본 올리고뉴클레오티드는 서열 목록의 서열 번호 1로 나타내어진다.

바람직하게는, 본 올리고뉴클레오티드는 VP14-유사 (VP14-like) 유전자의 발현을 조절할 수 있는 유전자를 코딩한다.

본 발명은, 한 측면에 따르면, 제어 서열에 작동가능하게 연결된 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 발명은 pBI101-Hm-VS1 벡터에 관한 것이다.

본 발명은, 한 측면에 따르면, 상기 벡터를 사용하여 형질전환시킨 식물에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드를 식물 내로 도입하는 단계를 포함하는, 식물에 있어서 압시식산 합성을 제어하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 신규 유전자에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 식물에 있어서 압시식산 (abscisic acid) 합성을 제어하는 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 신규 유전자에 관한 것이다.

도 1은 조숙 발아 돌연변이체의 표현형을 나타내는 사진이다. 사진의 좌측 표현형은 조숙 발아 돌연변이체 (헤테로) 주를 나타내고, 사진의 우측 표현형은 정상 주를 나타낸다.

도 2는 조숙 발아 돌연변이체와 Tos17 사이의 연관성 분석을 나타내는 다이아그램이다. 도면에 있어서, 돌연변이는 조숙하게 발아하는 개체로부터 유래되는 샘플을 나타내며, WT는 정상 식물로부터 유래되는 샘플을 나타낸다. 레인 1 내지 10은 조숙 발아 돌연변이체를 나타내며, 레인 11 내지 19는 정상 주를 나타낸다.화살표는 Tos17의 호모 밴드를 나타낸다. 조숙 발아 돌연변이체에 있어서, Tos17 밴드는 호모화(homozygous)되어 있다.

도 3은 Tos17 삽입 부위 근처의 서열의 TAIL-PCR 생성물의 서열을 나타낸다.

도 4는 Tos17 삽입 부위 근처의 약 6.0 kb의 서열을 나타낸다. 상기 서열 (서열 번호 4) 은 실시예 3에서 스크리닝에 의해 수득하였다.

도 5는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 1) 및 상응하는 아미노산 서열을 나타내는 다이아그램이다. TAIL-PCR을 사용하여 수득되는 Tos17 삽입 부위 근처의 서열을 기초로 RACE 및 프라이머 신장 방법을 사용하여 수득한 cDNA의 염기 서열 및 아미노산 서열을 결정하였다. 도면에 있어서, 383 내지 877 위치의 뉴클레오티드의 서열은 164개의 아미노산으로 구성된 ORF (서열 번호 2)를 코딩한다. 도면에 있어서, 굵은체 문자는 핵 위치화 시그널 (굵은체 문자)를 나타내며, 밑줄은 글리신-풍부 아미노산 서열을 나타낸다. 하향 화살표는 돌연변이주 A0150에 있어서의 Tos17 삽입 부위 (274 위치)를 나타낸다.

도 6은 상보성 시험에 사용되는 T-DNA 플라스미드를 나타내는 모식도이다. Tos17이 삽입된 ORF를 포함하며 BglII 절단에 의해 수득되는 2390 bp의 프래그먼트가 pBI101-Hm의 BamHI 부위에 삽입되어 있다.

도 7은 벼 VP14-유사 유전자의 서열의 일부를 나타낸다 (서열 번호 5). 상기 서열을 프로브로 사용하여 VP14 유전자의 발현을 분석하였다.

도 8은 vsl 돌연변이 계통에 있어서의 VP14-유사 유전자의 발현을 나타내는 다이아그램이다. 벼 VP14-유사 유전자의 발현을 노턴 블로팅으로 분석하였다. WT는 정상 주로부터의 샘플을 나타내며, vs1은 조숙 발아 돌연변이체로부터의 샘플을 나타낸다. 도면에 나타낸 "저습도"에 있어서, - 는 통상의 습도에서의 생장을 나타내며, + 는 저습도에서의 생장을 나타낸다. 화살표는 조숙 발아 돌연변이체 vs1에서 소실되는 RNA 밴드 위치를 나타낸다.

도 9는 프라이머 신장 방법을 사용한 VS1 유전자의 발현 분석을 나타내는 다이아그램이다. 고습도 (대조) 또는 저습도 (저습도)에서 생장시킨 벼로부터 제조한 RNA를 사용하여 프라이머 신장을 수행하였다. 건조로 인한 유도는 관찰되지 않았다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

본 발명은 Tos17을 사용하여 제공되는 신규 식물 유전자, 신규 유전자를 포함하는 벡터, 신규 유전자를 사용하여 형질전환한 식물, 및 신규 유전자를 사용하여 식물을 형질전환시키는 단계를 포함하는 식물의 개량 방법을 제공한다.

본 발명은 압시식산 합성을 제어할 수 있는 식물 유전자를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본원 명세서에서 사용되는 "압시식산 합성을 제어할 수 있다"라는 용어는, 식물에 있어서 압시식산 생합성에 연루된 유전자를 억제 또는 증강시키는 것을 나타낸다. "식물"이라는 용어는 단자엽식물 및 쌍자엽식물 모두를 포함한다.

압시식산 합성을 제어할 수 있는 식물 유전자를 코딩하는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 대표예는 서열 목록의 서열 번호 2의 1 (M) 내지 164 (I) 위치의 아미노산 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오티드, 및 상기 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 또는 부가된 아미노산을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

압시식산 합성을 제어할 수 있는 식물 유전자를 코딩하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 올리고뉴클레오티드가 식물에 있어서 압시식산 합성을 제어할 수 있기만 하다면, 서열 목록의 서열 번호 2의 1 (M) 내지 164 (I) 위치의 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 85% 이상의 서열 동일성, 더 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. "서열 동일성"이라는 용어는 관심있는 2개의 올리고뉴클레오티드가 동일 서열을 가진다는 것을 나타낸다. 관심있는 2개의 올리고뉴클레오티드 서열들 사이의 서열 동일성의 수준 (%)는 하기와 같이 계산한다: 2개의 올리고뉴클레오티드 서열을 최적으로 정렬하고; 상기 서열들 사이에서 동일한 뉴클레오티드 염기 (예를 들어 A, T, C, G, U, 또는 I)를 가지는 서열 위치를 카운팅하여 매칭 위치의 총수를 매칭 위치 수로 하고; 매칭 위치 수를 2개의 올리고뉴클레오티드의 총 염기수로 나누어 그 결과에 100을 곱한다. 서열 동일성은 예를 들어 하기 서열 분석 도구를 사용하여 계산될 수 있다: Unix-based GCG Wisconsin Package (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, 1994년 9월, Genetics Computer Group, 미국 53711 위스콘신주 사이언스 드라이브 매디슨 575 소재); Rice, P., (1996) Program Manual for EGCG Package, Peter Rice, The Sanger Centre, 영국 씨비10 1알큐 캠브리지 힝스톤 홀 소재); the ExPASy World Wide Web Server for Molecular Biology (Geneva University Hospital and University of Geneva, 스위스 제네바 소재); 및 MacVector 6.0 (Teijin System Technology).

본원 명세서에 있어서, 펩티드 변이는 아미노산 부가, 결실, 치환, 또는 변경을 포함한다. 아미노산 부가는 하나 이상의 아미노산이 오리지널 펩티드 사슬에 부가된 것을 나타낸다. 아미노산 결실은 하나 이상의 아미노산이 오리지널 펩티드로부터 결실된 것을 나타낸다. 아미노산 치환은 오리지널 펩티드에 있어서 하나 이상의 아미노산이 치환된 것을 나타낸다. 아미노산 또는 펩티드 변경은 단일 또는 다수의 아미드화, 카르복실화, 술페이트화, 할로겐화, 알킬화, 글리코실화, 포스포릴화, 수산화, 아실화 (예를 들어 아세틸기 또는 지방족기) 등을 포함하지만, 그에 한정되는 것은 아니다. 치환 또는 부가되는 아미노산은 천연 아미노산, 또는 이와는 달리 비천연 아미노산일 수 있다. 천연 아미노산이 바람직하다. 본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 펩티드 또는 그의 변이체는 암모늄염 (알킬- 또는 아릴-암모늄염), 술페이트, 황산수소, 포스페이트, 인산수소, 인산이수소, 티오술페이트, 카르보네이트, 비카르보네이트, 벤조에이트, 술포네이트, 티오술포네이트, 메실레이트 (메틸술포네이트), 에틸술포네이트, 및 벤젠술포네이트와 같은 펩티드의 염의 형태일 수 있다.

(등가의 생물학적 기능을 가지는 변이체)

이하, 생물학적-기능적으로 등가인 펩티드 치환에 대하여 간략하게 기술한다. 생물학적-기능적으로 등가인 치환을 본 발명의 펩티드 또는 그를 코딩하는 DNA 절편에서 수행할 경우, 원하는 특성을 여전히 가지는 단백질, 또는 펩티드를 코딩하는 기능성 분자가 수득된다. 이하, 등가체 또는 개량된 제2 생성 분자를 생성하기 위한 단백질의 아미노산의 변화를 논의한다. 아미노산 치환은, 화학 합성법, 또는 유전 공학 기술에 있어서 DNA 서열 중 아미노산 코딩 코돈을 변화시키는 것에 의해 수행될 수 있지만, 본 발명은 상기에 한정되는 것은 아니다.

특정 아미노산은, 상호작용 결합 능력의 명백한 저하 또는 제거 없이, 예를 들어 양이온성 영역 또는 기질 분자의 결합 부위를 가지는 단백질 구조에 있어서다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 특정 단백질의 생물학적 기능성 활성은 그의 상호작용 능력을 규정한다. 따라서, 심지어 특정 아미노산 서열의 치환을 단백질 서열 및 그 서열을 코딩하는 DNA에서 수행한다 해도, 여전히 오리지널 특성을 가지는 단백질을 수득할 수 있다. 따라서, 생물학적 유용성 또는 활성의 명백한 저하 또는 제거 없이, 본 발명에서 개시된 펩티드 서열 또는 그를 코딩하는 DNA 서열에서 다양한 변경이 수행될 수 있음이 본 발명자들에 의해 의도된다.

이러한 변이를 생성할 경우, 아미노산의 소수성 지수가 고려될 수 있다. 상호작용적인 생물학적 기능을 단백질에 부여하려고 할 경우 단백질의 소수성 아미노산 지수의 중요성이 당 업계에서 고려된다 (Kyte, J and Doolittle, R.F., J. Mol. Biol. 157 (1): 105-132, 1982). 아미노산의 소수적 성질은, 생성되는 단백질의 2차 구조에 기여하는 것으로 인정된다. 2차 구조는 단백질과 다른 분자 (예를 들어 원형질막 분자, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 및 항원) 사이의 상호작용을 규정한다. 소수성 지수는 아미노산의 소수성 및 전하에 기초하여 각각의 아미노산에 할당되어 있다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루탐산 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르트산 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 리신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5) ((Kyte, J and Doolittle, R.F., 1982).

특정 아미노산을, 유사한 소수성 지수 또는 값을 가지는 다른 아미노산으로 치환하는 경우에도, 단백질은 여전히 유사한 생물학적 활성을 가질 수 있다는 것 (예를 들어 단백질은 등가의 생물학적 기능을 가짐)이 당 업계에 잘 알려져 있다. 이러한 변이에 있어서, ±2의 소수성 지수 이내에서의 아미노산 치환이 바람직하며, ±1의 소수성 지수 이내에서의 아미노산 치환이 더 바람직하며, ±0.5의 소수성 지수 이내에서의 아미노산 치환이 훨씬 더 바람직하다. 친수성에 기초하여 아미노산 치환이 효과적으로 수행된다는 것이 당 업계에 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에는 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 단백질의 가장 국소적인 평균 친수성이 단백질의 생물학적 특성에 관련된다는 것이 기술되어 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 기재되어 있는 바와 같이, 하기 친수성 지수가 아미노산 잔기에 할당되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르트산 (+3.0±1); 글루탐산 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 아미노산을, 유사한 친수성 지수를 가지는 다른 아미노산으로 치환하여 단백질이 생물학적으로 등가 (특히, 면역학적으로 등가)의 단백질로 남아있도록 할 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 변이에 있어서, ±2의 친수성 지수 이내에서의 아미노산 치환이 바람직하며, ±1의 친수성 지수 이내에서의 아미노산 치환이 더 바람직하며, ±0.5의 친수성 지수 이내에서의 아미노산 치환이 훨씬 더 바람직하다.

본원 명세서에 있어서, "보존적 치환"은 오리지널 아미노산의 친수성 지수 및/또는 소수성 지수가 치환 아미노산의 친수성 및/또는 소수성 지수와 유사한 아미노산 치환을 나타낸다. 보존적 치환은, ±2의 친수성 지수 및/또는 소수성 지수 이내에서의 아미노산 치환이 바람직하며, ±1의 친수성 지수 및/또는 소수성 지수 이내에서의 아미노산 치환이 더 바람직하며, ±0.5의 친수성 지수 및/또는 소수성 지수 이내에서의 아미노산 치환이 훨씬 더 바람직하다.

상기에 간략하게 기술한 바와 같이, 아미노산 치환은 상기 지수에 기초하여 수행된다. 상기 여러 특성에 기초한 예시적 치환의 예는, 당 업계의 숙련자에게 잘 알려져 있는 아르기닌 및 리신; 글루탐산 및 아스파르트산; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신, 및 이소류신을 포함하지만, 본 발명은 그에 한정되는 것은 아니다.

뉴클레오티드 서열은 유전코드의 축중 서열을 이용하여 변화시킬 수 있다. 이러한 축중 서열은 당 업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 축중 서열이 동일한 아미노산을 코딩한다는 것은 당 업계의 숙련자에게는 명백하다.

본원 명세서에 사용되는 "제어 서열"은, 기능성 프로모터 및 임의의 기타 관련 전사 요소 (예를 들어 인핸서, CCAAT 박스, TATA 박스, 및 SPI 부위)와 같은DNA 서열을 나타낸다.

본원 명세서에 사용되는 "작동가능하게 연결된다"라는 용어는 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되는 유전자가 숙주 세포에서 발현될 수 있게 하는 방식으로 프로모터 및 인핸서와 같은 유전자 발현을 조절하는 조절성 요소에 올리고뉴클레오티드가 연결되어 있다는 것을 나타낸다.

제어 서열의 유형 및 종류는 숙주 세포에 따라 달라진다는 것이 당 업계의 숙련자에게는 잘 알려져 있다. 당 업계의 숙련자에게 잘 알려진 제어 서열의 예는 CaMV35S 프로모터 및 노팔린 신타제 프로모터를 포함한다. 유전자는 공지된 방법을 사용하여 식물체 내로 도입될 수 있다. 상기와 같은 공지된 방법의 예는 아그로박테리움 (Agrobacterium)에 의해 매개되는 방법, 또는 유전자를 세포 내로 직접 도입하는 방법을 포함한다. 아그로박테리움에 의해 매개되는 방법의 예로는 Nagel 등의 방법이 있다 (Microbiol. Lett., 67, 325(1990)). 상기 방법에 있어서, 예를 들어 발현 벡터를 전기천공법을 사용하여 아그로박테리움 내로 먼저 도입하고, 이어서 형질전환 아그로박테리움을 문헌 [Plant Molecular Biology Manual, S.B. Gelvin 등, Academic Press Publishers]에 기재된 방법에 따라 식물 세포 내로 도입한다. 유전자를 세포 내로 직접 도입하는 공지된 방법의 예는 전기천공법 및 유전자 총 (gene gun) 방법을 포함한다.

유전자-도입 세포는 약제 내성, 예를 들어 하이그로마이신 내성에 의해 선발하고, 그 후, 통상 사용되는 방법을 사용하여 식물체로 재생시킨다.

일반적으로, 본원 명세서에서 사용되는 명칭 및 실험실 프로토콜은 당 업계에 공지되어 있다. 재조합 기술, 폴리뉴클레오티드 합성, 및 미생물 배양 및 형질전환법 (예를 들어 전기천공법)은 표준 기술 이내에서 사용된다. 상기 기술 및 프로토콜은 당 업계의 여러 일반적인 출판물 및 본 명세서에 기술되어 있다 (일반적으로, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 미국 뉴욕). 상기 출판물은 본 명세서에서 참고로 채용되어 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 대표적으로는 본원 명세서에 기술된 방법에 의해 수득된다. 이와는 달리, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 본원 명세서에 개시된 서열을 기초로 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 올리고뉴클레오티드 합성기 (Applied BioSystems사제)를 사용하여 제조자에 의해 제공되는 세목서에 따라 합성될 수 있다.

PCR 증폭 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다 (PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, HA Erlich 편집, Freeman Press, New York, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis,Gelfland, Snisky, 및 White 편집, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila 등 (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4967; Eckert, K.A. 및 Kunkel, T.A. (1991) PCR Methods and Applications 1: 17; PCR, McPherson, Quirkes, 및 Taylor, IRL Press, Oxford). 상기 출판물은 본원 명세서에 참고로 채용되어 있다.

이하, 본 발명을 실시예로 기술한다. 본 발명은 하기 실시예에 의해 예시되지만, 실시예에 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예에서 사용하는 화학약품 및 키트는 달리 명시되지 않는 한, Iwai Chemicals Company로부터 입수가능하다.

(실시예 1) 배양에 의한 Tos17의 활성화 및 생성 돌연변이체의 특성화

자포니카 변종인 니폰베어의 완전 성숙 종자를 출발 재료로 사용하여, 상기한 바와 같이 (Hirochika 등 (1996), 상기 문헌), 캘러스 (callus) 개시 배양 및 세포 현탁 배양을 수행하였다. Tos17을 Otsuki 방법 (1990) (Rice-protoplast culture, Agriculture, Forestry and Fisheries Technical Information Society)에 따라 활성화하였다. 요약하면, 완전 성숙 벼 종자를 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)를 포함하는 MS 배지에서 배양하여 (25℃, 1개월) (Otsuki (1990), 상기 문헌) 캘러스를 유도하였다. 생성된 캘러스를 2,4-D를 포함하는 N6 액체 배지(Otsuki (1990), 상기 문헌)에서 5개월 동안 배양하고, 이어서 재생 배지 (Otsuki (1990) 상기 문헌)로 옮겨 재생 벼 (제1 세대 (R1) 식물)을 수득하였다. 생성된 재생 벼 500 주의 제2 세대를 야외에 전개 (disseminate)하였다. R2 집단이 발아하였으며, 발아 1주일 후, 종자를 생성하였다. 성숙 후, 각 주를 상세하게 관찰한 결과, 하나의 주에서 조숙 발아가 발견되었다. 상기 계통을 VS1으로 명명하였다. 조숙 발아 특성을 확인하기 위하여, 조숙 발아를 확인한 패니클 (panicle)를 100%의 습도 및 25℃의 온도에서 인큐베이션하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이 VS1 계통에 있어서, 패니클 상의 종자의 약 1/4이 발아한다는 것이 밝혀졌다. 정상 주에 있어서는, 동일 조건 하에서 발아가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 VS1 계통이 조숙 발아 돌연변이를 가진다는 것을 나타낸다. 하나의 패니클 상에서, 조숙 발아하는 종자의 수 대 조숙 발아를 하지 않는 종자의 수 의 비는 1:3이었다. 이는, 조숙 발아에 있어서의 돌연변이가 열성 돌연변이라는 것을 나타낸다.

(실시예 2) 조숙 발아 돌연변이체의 분석

상기한 바와 같이, 유전자 분석에 의하면, 조숙 발아에 있어서의 돌연변이가 열성 돌연변이라는 것이 나타났다. 조숙 발아한 개개의 식물을 추가로 생장시켰는데, 수분이 결핍된 식물에서 관찰되는 시들음이 관찰되었다. 조숙 발아 돌연변이 및 시들음 현상은 압시식산 함량의 저하를 암시하는 것이다 (McCarty, D. R. , Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46, 71-93 (1995)).

그 후, 정상주 및 돌연변이주의 압시식산 함량을 측정하였다. 측정은 고습도 조건 (즉, 밀봉 시험관 내), 이어서 저습도 조건 (즉, 시험관의 마개를 제거한지 6시간 후) 하에서 수행하였다. 압시식산 합량의 측정은 압시식산 면역분석 검출 키트 (Sigma제)를 사용하여 수행하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다. 이러한 측정에 있어서, 각 주의 어린 묘목의 압시식산 함량을 측정하였다. 대조주의 압시식산 함량은 건조로 인하여 증가한 반면, 조숙 발아 돌연변이체의 압시식산 함량은 동일한 조건 하에서 증가하지 않았다. 그 결과, 본 실시예의 단리된 조숙 발아 돌연변이체는 압시식산 합성에 있어서 이상을 가지는 것으로 결론지었다.

압시식산 함량 (nmol/g 신선중량)

생장 조건	정상 개체	돌연변이체	압시식산 함량의 비(정상/돌연변이체)
고습도(밀봉 시험관)	77.5	18.3	4.2
저습도(시험관의 마개를 제거한 지 6시간 후)	5025	28.5	176

(실시예 3) 조숙 발아 돌연변이체의 원인 유전자의 단리 및 구조 분석

조숙 발아 돌연변이체의 원인 유전자를 동정 단리하기 위하여, 조숙 발아 돌연변이체가 분리하는 집단을 사용하여 Tos17 유전자와의 연관성 분석을 수행하였다. 연관성 분석은 당 업계에 잘 알려진 일반적인 방법에 따라 수행하였다. 구체적으로는, 조숙 발아 돌연변이체 및 정상 개체를 육안으로 서로 식별하고, 각각의 집단으로부터 CTAB 방법 (Murray, G. C. 및 Thompson, W.F., Nucl. Acids Res.8: 4321-4325 (1980))에 따라 DNA를 추출하였다. 생성된 DNA를 제한 효소로 절단하고, 이어서 0.7% 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 그 후, DNA를 나일론 막 (Schleicher & Schnell제)에 흡착시켰다. Tos17 을 제한 효소 XbaI 및 BamHI으로 절단하고, 생성된 DNA 프래그먼트를³²P-dCTP로 라벨링하고, 이어서 서턴 블로팅하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 레인 1 내지 10은 조숙 발아 돌연변이체로부터 수득한 DNA를 나타내며, 레인 11 내지 19는 정상 개체로부터 수득한 DNA를 나타낸다. 화살표로 나타낸 Tos17 밴드가 모든 조숙 발아 돌연변이체에서 관찰되었다. Tos17 밴드가 정상 개체의 일부에서 관찰되었지만, 밴드의 진하기가 약하였다 (레인 상에 로딩한 DNA의 양은 균일하지 않다. 상기 문제점을 회피하기 위하여, 밴드의 진하기를 화살표 바로 아래의 밴드 진하기와 비교하였다). 그 결과, 화살표로 나타낸 Tos17 밴드는 조숙 발아 돌연변이체에서는 호모화되어 있지만, 정상 개체에서는 헤테로화되어 있었다. 이는, 화살표로 나타낸 Tos17 밴드 및 조숙 발아 돌연변이가 완전 연관되어 있음을 나타낸다. 60 개체로 구성된 분리 집단에 대하여 유사한 분석을 행하여 상기 결과를 확인하였다. 이러한 결과는, 도 2에 있어서 화살표로 나타낸 Tos17이 조숙 발아 돌연변이를 유발한다는 것을 나타낸다.

상기 방법으로 처리한 돌연변이 DNA의 아가로스 전기영동 후, 도 2에서 화살표로 나타낸 크기 근처의 영역에 해당하는 겔의 일부를 잘라내고, 이어서 DNA를 추출하였다. DNA 추출은 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen제)를 사용하여 수행하였다. 상기 DNA를 주형으로 사용하여 TAIL-PCR (Liu, Y. -G 및 Whiffier, R. F., Genomice 25, 674-681 (1995))를 수행하여 Tos17에 인접하는 서열, 즉, 조숙 발아 돌연변이의 원인 유전자의 일부를 클로닝하였다. TAIL-PCR은 Miyao 등의 문헌 [Plant Biotechnology 15: 253-256 (1998)]에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 생성된 서열을 도 3에 나타내었다 (서열 번호 3). 상기 서열을 프로브로 사용하여 벼 게놈 라이브러리 (Makoto Takano of the National Institute of Agrobiological Resources로부터 입수)의 스크리닝을 수행하였다. 스크리닝은 Sambrook 등의 상기 문헌에 따라 수행하였다. 상기 스크리닝에 의해 생성된 클론의 Tos17 삽입 부위 근처의 약 6 kbp의 서열을 결정하였다. 서열을 도 4에 나타내었다 (서열 번호 4). 상기 유전자의 염기 서열을 기초로, RACE 프라이머 신장 (Frohman, M.A. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002 (1988))을 수행하여, Tos17 삽입 부위에서 코딩되는 cDNA의 염기 서열을 결정하였다 (도 5, 서열 번호 1). 상기 cDNA는 전체 길이가 894 bp이며 (도 5, 서열 번호 1), 164개의 아미노산으로 구성된 ORF를 코딩한다 (도 5, 383 내지 877 위치의 뉴클레오티드; 서열 번호 2). 상기 ORF는 글리신-풍부 모티프 (도 5에서 밑줄), 및 핵 위치화 시그널 (도 5에서 굵은체 문자)을 포함한다. Tos17 삽입 부위는 화살표로 나타내어져 있다 (도 5).

(실시예 4) 유전자 도입에 의한 상보성 시험

1. 상보성 벡터의 구축 및 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 조숙 발아 돌연변이체의 형질전환

실시예 3에 있어서, 유전자의 전체 길이 개봉 판독 프레임을 포함하는 2390 bp의 BglII 프래그먼트를 pBI101-Hm 벡터 (Kenzo Nakamura of the School of Agricultural Sciences of Nagoya University로부터 입수) 내로 통합시켰다 (도 6). 생성된 벡터를 pBI101-Hm-VS1으로 명명하였다. 상기 재조합 벡터를 사용하여 50 mg/ℓ의 카나마이신 및 하이그로마이신을 포함하는 선별 배지 중에서 전기천공법으로 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA 계통을 형질전환시켰다 (Kenzo Nakamura of the School of Agricultural Sciences of Nagoya University로부터 입수). 생성된 아그로박테리움 계통을 미래의 사용시까지 동결보존하였다.

조숙 발아 돌연변이체의 종자를 1% 차아염소산나트륨으로 살균하고, 살균 증류수로 5회 세정하였다. 상기 종자를, 3% 수크로스, 0.3 g/ℓ의 카제인 가수분해물, 2.8 g/ℓ의 프롤린, 및 2.0 mg/ℓ의 2,4-D를 포함하며, 5.0 g/ℓ의 겔 검으로 고정화한 N6 배지 (Chu 등, 1975, Sci. Sinica, 18, 659-668) 상에 두었다. 배지의 pH는 오토클레이브 전에 pH 5.8로 조정하였다. 종자를 28℃에서 3주 동안 암소에서 생육시켜 약 2 mm 크기의 작은 캘러스를 수득하였다. 작은 캘러스를 캘러스 유도 배지로 옮겨 4일 동안 명소에서 배양하였다. 생성된 캘러스를 아그로박테리움 감염에 이용하였다.

상기 동결보존한 아그로박테리움을, 50 mg/ℓ의 카나마이신 및 50 mg/ℓ의 하이그로마이신을 포함하며, pH를 7.2로 조정하고, 15 g/ℓ의 아가로 고화시킨 AB배지 (Chilton 등, 1974, Proo. Natl. Acad, Sci. USA, 71, 3672-3676)에서 3일 동안 22℃에서 암소에서 배양하였다. 아그로박테리움 균주를 수집하고, 20 μg의 아세토시린곤 (Hiei, 1994, Plants, 6, 271-282)을 포함하는 액체 AAM 배지 (Hiei 등, 1994, Plant J., 6, 271-282)에 현탁시켰다. 생성된 현탁물을 상기의 유도 캘러스와 함께 7일 동안 22℃에서 암소에서 공동-인큐베이션하여 캘러스를 아그로박테리움으로 감염시켰다. 생성된 캘러스를 500 mg/ℓ의 카르베니실린을 포함하는 캘러스 유도 액체 배지로 5회 세정하고, 이어서 살균 와트만 (Whatman) No. 1 필터 페이퍼 상에서 건조시켰다. 50 mg/ℓ의 하이그로마이신을 포함하는 캘러스 유도 배지 상에서 캘러스를 3주 동안 배양하여 하이그로마이신-내성 캘러스를 선발하고, 이어서 30 g/ℓ의 수크로스, 30 g/ℓ의 소르비톨, 2 g/ℓ의 카제인 가수분해물, 2 g/ℓ의 카이네틴, 500 mg/ℓ의 카르베니실린, 50 mg/ℓ의 하이그로마이신 및 5/ℓ의 겔 검을 포함하는 pH 5.8의 MS 기초 배지 (Murashige 및 Skoog, 1962, Physiol. Plant., 15, 473-497)를 포함하는 재생 배지로 옮겼다.

형질전환체는 옥신 또는 NAA 없이 하이그로마이신을 포함하는 재생 배지에서 용이하게 재생하여, 토양으로 옮겼다. 형질전환체는 조숙 발아 돌연변이체에서 관찰되는 시들음 현상을 나타내지 않고 정상적으로 생장하였다. 이러한 결과로부터, 실시예 3에서 단리한 유전자의 돌연변이가 조숙 발아 돌연변이의 원인이 된다는 결론을 내렸다. 상기 유전자를 VS1 유전자로 명명하였다.

(실시예 5) 벼로부터의 VP14-유사 유전자의 단리

상기한 바와 같이, VP14 유전자는 압시식산 합성에 있어서의 속도 결정 단계를 제어하는 것으로 생각된다. 지금까지, 상기 유전자는 단지 옥수수로부터 단리되었다. 따라서, 벼로부터 VP14 유전자를 단리하기 위하여, 옥수수로부터 단리한 VP14 유전자 및 아라비돕시스 (Arabidopsis)로부터 단리한 VP14-유사 유전자의 보존 서열을, 유전자 분석 소프트웨어 MacVector 6.0 (Teijin system technology)를 사용하여 서로 비교하여 보존 서열을 동정하였다. 보존 서열의 두 부분에 해당하는 5'-말단 프라이머 및 3'-말단 프라이머를 제조하였다. 상기 2개의 프라이머를 사용하여, 벼 VP14 유전자를 증폭시켰다. 상기 증폭에 사용하는 주형은 하기와 같이 제조하였다: 벼 잎을 건조시키고 (잎을 절단하여 실온에 3시간 동안 방치함); 상기 잎으로부터 RNA를 추출하고; RNA를 역전사효소 (TaKaRa제)로 처리하여 cDNA 샘플을 수득하였다. 상기 PCR에 의해 약 3.0 kbp의 생성물을 수득하였다. 상기 생성물의 부분 서열 결정에 의하면, 벼 VP14와 옥수수 VP14 사이의 동일성이 크다는 것이 나타났다 (85%). 부분 서열을 도 7에 나타내었다 (서열 번호 5). 그 후, 상기 생성물을 프로브로 사용하여 벼 VP14-유사 유전자의 발현 분석을 수행하였다. 정상 벼로부터 추출한 DNA를 샘플로 사용하여 서턴 블로팅 분석을 수행하였다. 5개의 밴드가 수득되었는데, 이는 5개 이상의 VP14-유사 유전자가 벼에 존재한다는 것을 나타낸다.

(실시예 6) VS1 유전자의 기능 분석

그 후, VS1 유전자가 VP14-유사 유전자의 발현을 조절할 수 있는지의 여부를 연구하였다. 실시예 6에 있어서, 먼저 벼 VP14-유사 유전자를 단리하고, 이를 프로브로 사용하여 노턴 블로팅 분석을 수행하였다. ISOGEN (Nippon gene제)을 사용하여, 고습도 및 저습도에서 생장시킨 VS1-돌연변이 벼 및 정상 주의 벼로부터 mRNA를 단리하였다. 상기 mRNA를 아가로스 겔 (1%)를 사용하여 단리하고, 나일론 막 (Schleicher & Schnell) 상에 흡착시켰다. 그 후,³²P-dCTP 라벨링 VP14 프로브를 사용하여 mRNA를 노턴 블로팅하였다 (Sambrook 등의 상기 문헌). X-선 필름을 Kodak사로부터 입수하였다. 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 알 수 있듯이, 고습도의 경우 (도 8에서 - 로 나타냄), 정상 주 (WT) 및 돌연변이체 (vs1) 모두에서 VP14의 발현이 발견되지 않았다. 저습도 (+)의 경우, 상이한 크기 (2.0 kb 및 2.5 kb)를 가지는 2개의 밴드가 정상 주(WT)에서 검출되었으나, vs1 돌연변이체 (vs1)에서는 밴드가 소실되었다. 따라서, VS1은 VP14 또는 VP14-유사 유전자의 하향 조절 (down regulation)을 야기하는 유전자인 것으로 생각된다.

그 후, VS1 유전자의 발현을 프라이머 신장 방법으로 분석하였다. 프라이머 신장 방법에 사용한 프라이머는 VS1 유전자에 상응하는 TTCGAGTTTTTGTGTTAGGG (서열 번호 6)인데, 그의 5' 말단은 폴리뉴클레오티드키나제 (TOYOBO제)를 사용하여³²P-γ-ATP로 라벨링하였다. ISOGEN (Nippon gene제)를 사용하여, 건조 유도 처리를 한 잎, 또는 무처리 잎으로부터 RNA를 제조하였다. 상기 RNA를 주형으로 사용하여 서열결정 겔 상에 상기 RNA를 두고 (Sambrook 등의 상기 문헌), 이어서 전기영동하여 X-선 필름 (Kodak제)에 노출시켰다. 실험의 세부 사항은 Hirochika 등의 문헌 [EMBO J., 12, 2521-2528, 1993]에 따랐다. 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9로부터 알 수 있듯이, VS1은 저습도 및 고습도에서 유사하게 발현됨이 명백하다.

상기 실시예는 본 발명의 여러 측면, 및 본 발명의 특정 올리고뉴클레오티드를 어떻게 제조 및 이용하는지를 예시 기술하지만, 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다.

본 발명에 따르면 식물 육종에 이용가능한 압시식산 합성을 제어할 수 있는 신규 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 올리고뉴클레오티드를 식물에 도입하여 압시식산 합성을 제어할 경우, 건조 내성 및 조숙 발아 억제와 같은 유용한 형질을 가지는 식물이 제공된다.

본 발명은 출원전 발명자들의 불가피한 사정에 의해 공지되었는바 이에 대한 신규성 상실의 예외 규정의 적용을 요구합니다. 본 발명은 제21회 일본 분자생물학회 연회 프로그램 및 강연 요지집에 일부 개시되어 있고, 동 학회는 1998년 12월 16일부터 1998년 12월 19일까지 파시피코 요코하마에서 개최되었으며 이러한 프로그램과 강연 요지의 간행은 1998년 11월 25일자로 발간되었습니다. 동 간행은제21회 일본 분자생물학회 편집위원회와 동경대학 의과학연구소에서 간행하였으며 그 연락처는 재단법인 학회센터 간사이 오피스이고, 그 주소는 일본국 도요나가시 신센리 히가시마치 1-4-2의 센리라이프사이언스센터빌딩 14층이며 전화번호는 (06)873-2301이며 팩시밀리번호는 (06)873-2300입니다.

<110> National Institute of Agrobiological Sciences Bio-oriented Technology Research Advancement Institution <120> A novel gene regulating the synthesis of abscisic acid <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 894 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (383)..(874) <400> 1 aagattcttg atacagggaa gaaatctgta ccttagagga tggaaagcaa gggattgtgt 60 ttttgagctt aaccatgacc aacatgagaa cttcactctg gacccaaagt gcatcagact 120 caaaactggt ttgaactata acaagcttgt tttcgggggt gttgagaata ctcccactgg 180 tctatggcct gttagaaaag catttgacaa cttctggagg catgctggtg gtgaaaacat 240 aaatatatca gaagatgttg caatatttgc tgtgattata tctgaggcag caagattacg 300 cccggtgcat gactacatca aagattcttt cctttctgag aatccgggtt taagcaaatt 360 ggggaaacat ccctccaacc cc atg tat gtg aag aag tac aag aaa 406 Met Tyr Val Lys Lys Tyr Lys Lys 1 5 att tct gct cac ata atg gaa aat gtt gac ctc atg aaa cag ggc cta 454 Ile Ser Ala His Ile Met Glu Asn Val Asp Leu Met Lys Gln Gly Leu 10 15 20 gag cca aaa cca ttc aag cat gag aaa ctt gtc ata gat 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gccactccat cgtggagctc ccggacggaa 420 gcgcttgatg tcgccgcgac gaggctgctc gtcacctgtc aatgcacatg gggcacacca 480 tcgccgagag gctctgcaag acgcagagag ccgccggcgc cggcgaaaga ggcagacgag 540 gggcggaggg ccgcgctgct gcaggcggtt tgcggtcgtg ggcggtggca tgtcggcggc 600 gtcgggctcc gcgtgcgggt gtttgctccg ggaccatagt gcgtcgggcg gcgtcgtcgt 660 ctcgccgcgg actggtgatg agcagatgca acagctggag gtcggccggc gtagagccgc 720 cgccgccggt ggcagctcct ccctcgccgg ccgctgcccg cgcccgcaac gcccatctgt 780 tctctgcagc cgccgtggag aggggaggag agaggaagag agatggtgag gggaggggaa 840 gaagtggctg acatgtggga cccacgtggg tcccacgctg agtcatctgc catatcagac 900 aaaaccggag tcaaaaccgt tcagggatac tagtttattc tggttttata agttgaggga 960 cgcattgtat ctggttttgt ggttcaagga cgattcaaca agttgaggga cctccggtgt 1020 actttttccc taaagttatt atgtcacatt tgagtacgga cggcccacta atctcgcgat 1080 gcccgaaaac gaagcccaga gacccaactc ccccattctc aagcatattg catcgacaag 1140 cgcagcggca ttcttccgag ccccctcttc gccatttcgc ctgctccgtg atcgccgtcg 1200 cgcaccattt cgccgccctg ccccgcccca gcaacgattg cgtgcgggat ctcaaaccct 1260 agggttccct cggcgctgac gggagcaacc tctcgccgcc gacgccgcta tcgcccggca 1320 gattcgttga cgatggggcg ctcacggccc tcgcctccgc ctcctcacgc gagcgaggta 1380 atcgtctccc cctttaaccg ttcgttgttg tttgtgttca gccgtggagc ggagatgacg 1440 cggtatcgaa taccaattgg cttagatgcg attttggaaa cagaacttac gtcattccgc 1500 ggcagaattt tactttatcc tttactttat ccacagcgga ttcatgatac agagttagcg 1560 ataatatgtt gattgtgcat tattagagat ttttgtttcc gatttatgtg cagcgctagt 1620 aagattccct gagcatgtgc aacttatgat ccacctgccg aactgatttt gtcttgctaa 1680 ttagtgcata aatttcctag gtaggacaac ctattgaatt cgtttcagtc gttcctatta 1740 attgtattat ggtgattgtt tttttttttt gaaacctaga tcttgctggt tttatattaa 1800 gagagggaaa tgccatacaa aattatggtg attggtttac ttggatatga tttccaataa 1860 ctgtgccctg gtcaatatgg atatttggta cggcagtatt gtcagagaat gatagaaaac 1920 actattgaca gagtattaga ctgtatattg gatccaaaaa tgtgagaaca gaatatggtt 1980 cagcagtcca tagttttgct gctgttgctt ataatcttgc aaggttatca gccagattgt 2040 tacagttaac ttgcaaggct atatatcagc cacattgtta ctctgaactt ggaagtttaa 2100 tatgcctgga atctttcaca ggattgggag tttggatata ccctaatgaa ctacaactga 2160 ccattaagca gcactgcctg ttgaaaagtt gctagtttac tcatttaact tccatatatg 2220 aatgtacaca cctgtaattt tgtttagcag atcaggaata gggggctcac ctcaaagcat 2280 gtgaccacaa tttgccttga tggaactgac aaggaagcgt tagcaagcta tcttagtggc 2340 attgaagagg taattaattg gtcatatgaa gatggaatta aggtggatat ctcagatatt 2400 tgtggacagt gccatgaggt attcactaca agagctggag gctcaatgga agtggaattc 2460 gtgtacatgg gtcggtctat aagattcttg atacagggaa gaaatctgta ccttagagga 2520 tggaaagcaa gggattgtgt ttttgagctt aaccatgacc aacatgagaa cttcactctg 2580 gacccaaagt gcatcagact caaaactggt ttgaactata acaagcttgt tttcgggggt 2640 gttgagaata ctcccactgg tctatggcct gttagaaaag catttgacaa cttctggagg 2700 catgctggtg gtgaaaacat aaatatatca gaagatgttg caatatttgc tgtgattata 2760 tctgaggcag caagattacg cccggtgcat gactacatca aagattcttt cctttctgag 2820 aatccgggtt taagcaaatt ggggaaacat ccctccaacc ccatgtatgt gaagaagtac 2880 aagaaaattt ctgctcacat aatggaaaat gttgacctca 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aagaatagtt tagcttatac 4620 tattatgttt ccacaggttc tgttcctttc tcagtttttt ttatgcacac ttgctttttt 4680 tgaacaggga aattgaactg cttatggaga acccacagcg caacttccct ctaaccaact 4740 tctgtcttga cccctcaaag gtatgcttgt tttttacaat atgtaattat aaactcaata 4800 cttttttttt tgaaaccgaa gctaggctaa gctggagtta tattaaggag aatagaaaag 4860 tatttacaat atcaccaaag aaggtgaagg agaaagaaac aagggaaact agggaagaaa 4920 acataaaaga aacacacact aaatgaaacc taagcggata ttctcgcgat gttttttgct 4980 ccacacatgc tccatatttt gatttcgtct tgtattttga tgagtagttg cgacatggtt 5040 ttctcttgat tttggaacac cctcctgttt cgttcacacc atatttccta tgccaccaac 5100 aagtggattg acttgagtgc tttagccttg tttttccctc cttgaaatgt actcaatact 5160 tgctaacatg tatattgtta atgaactaat gataatgttt tggaccagta aggagatgaa 5220 gcttagcttt cgttgtatat ttacttgttc ttaggttgat tttgcttaag atctctgtct 5280 cttgtgctat atgggtttgt gagagatgtc agcgagttgc atgatcaaat agaattagtg 5340 tatgacacag tgcgaacagt tccatttggt ctactgattt tgcttgagaa aagtgcttgt 5400 gaaaacagca atttcttgac tgtccctgtc tgtaaacaac 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gtcgaagtcg tagcggccga cggtctcgag gtcgccgtcg 240 gcggtgacgc gcacctggta ggggaggtcg tcctccgaca tggcgaggag cctgccgttg 300 aagtagatga ggccggcgtt ggcgacgccg gtgccgtgtg acgggtcgag gaggccgagg 360 cggcgcgcgc gtagaacaga gcaaggcgcg cgatgcccgg agtggccatg gagctcacct 420 atcgccttag gaaaactgga agggcgaatt ctgagatatc catncactgg cggccgtcaa 480 catnatctaa ag 492 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: primer for primer extension analysis <400> 6 ttcgagtttt tgtgttaggg 20

Claims (8)

1. 압시식산 (abscisic acid) 합성을 제어할 수 있는 식물 유전자를 지니는 올리고뉴클레오티드에 있어서, 서열 번호 2의 1 (M) 내지 164 (I) 위치의 아미노산 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오티드
2. 제1항에 있어서, 벼로부터 유래되는 올리고뉴클레오티드
3. 제1항에 있어서, 서열 목록의 서열 번호 1로 나타내어지는 올리고뉴클레오티드
4. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 압시식산 합성을 조절하는 VP14-유사 (Viviparous14-like) 유전자의 발현을 제어할 수 있는 유전자임을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드
5. 제 1항에 따른 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드와 프로모터, 인핸서 등의 유전자 발현을 조절하는 조절 서열이 작동가능하게 연결되어 있는 벡터
6. 삭제
7. 제5항에 따른 벡터를 사용하여 형질전환한 식물세포
8. 식물에 있어서의 압시식산 합성의 제어 방법으로서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드를 식물 내로 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법