WO2000071727A1 - Nouveau gene codant la synthese de l'acide abscisique - Google Patents

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plant
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Hirohiko Hirochika
Koji Sakamoto
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National Institute Of Agrobiological Sciences
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    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8291—Hormone-influenced development
    • C12N15/8293—Abscisic acid [ABA]

Definitions

  • the present invention relates to a novel gene. More specifically, abscisic acid in plants
  • the present invention relates to a novel gene encoding a protein having a function of controlling synthesis.
  • Transposons are mutagenic genes known to be ubiquitous in the genomes of animals, yeast, bacteria and plants. Transposons are classified into two classes according to their transposition mechanism. Transposons belonging to class II translocate in the form of DNA without replication. As a transposon belonging to class II, corn (Zea 11135) 8 (: no 05, Spm / d Spm and Mu elements (Fedoroff. 1989, Cell 56, I81-191; F) edoroff et al.] 983, Cell 35, 235-242: Schiefelbein et al., 1985, Proc. Nat]. Ac ad. Sci.
  • Transposons belonging to class I also called retrotransposons, replicate and translocate via RNA intermediates.
  • Class I transposons were initially identified and characterized in Drosophila and yeast, but recent studies have shown that they are ubiquitous in plant genomes and represent a significant portion of them. (Bennetzen, 1996, Tr ends Microbiol o., 4, 347-353; Voytas, 1996, Science, 274, 737-738). The majority of retrotransposons appear to be immobile, built-in units. Recent studies have shown that some of these are activated under stress conditions such as wounding, pathogen attack and cell culture (Grandbastien, 1998, Trend sin PIantS cience, 3, 18 1 -187; Wess 1 er, 1996; Curr. Biol.
  • Tos 17 is a class I element in the most studied plants. Tos 17 was cloned by the RT-PCR method using degenerate primers based on the conserved amino acid sequence of the reverse transcriptase domain between the Ty1-copia group retroelements (Hirochika et al. 1992, M o 1. Gen. Ge net., 233, 209—2 16). Tosl 7 is a 4.3 kb long, two identical 138 bp LTR (long terminal repeat) and PBS (primer binding site) complementary to the 3 'end of the starting methionine tRNA. (Hirochika et al., 1991, supra).
  • the Tos17 transcript is strongly activated by tissue culture and increases its copy number with culture time.
  • the initial copy number of Tos17 is 2, but in the regenerated plants after tissue culture, it has increased to 5 to 30 copies (Hirochika et al.). , 1996, supra).
  • Tos17 translocates in a random manner in the chromosome and causes stable mutations, and therefore in rice Providing a powerful tool for gene isolation (Hirochika et al., 1997, Plant Mo). Biol. 35, 231-240; 1999, Mo lecu 1 ar B ioloyof Ric (K. Shimamo to ed.), Springer—Verlag, 43-48; g).
  • Abscisic acid is an important plant hormone. Plants are known to exhibit various physiological actions such as promoting organ detachment, inducing dormancy, promoting senescence, inhibiting growth, and closing stomata (McCarty, DR Annu. Rev. P lant P hysio 1. P lant Mo 1. B iol. 46, 71-93 (19995), G iraudat. J. Cu rr. Op in.Cel 1 B iol. 7: 2 3 2-240 (1995); Ad dicott, FT (ed.), Ab scidic Acid, Praeger Scientific, New York (1993)).
  • Abscisic acid is a type of apocartoid. Apocartoids are compounds that result from the oxidative cleavage of carotenoids and are widely found in nature. Abscisic acid is produced by oxidative cleavage of epoxy carotenoids. It has been proposed that oxidative cleavage is the primary and rate-limiting reaction in the biosynthesis of abscisic acid.
  • the VP14 gene is a gene encoding abscisic acid synthase, and its product, 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, is a 9-cis-epoxy mono-rotinoid (eg, 9 ' one cis one violaxanthin and 9 cis - neoxanthine) by cutting, and generates C 25 apo aldehydes and xanthoxin.
  • Xanthoxin is a precursor of abscisic acid in higher plants. Abscisic acid is also induced to be expressed by desiccation (Zeevaart, J. AD and Cleinman RA Annu. Rev. Plan MoI-Biol. 39 439 (1988)).
  • the VP14 gene is the rate-limiting enzyme for abscisic acid synthesis because mutations in the VP14 gene are involved in increasing or decreasing abscisic acid synthesis (Scheart z. SH et al. 276 1872—1874 1 997) And has only been identified from corn. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a novel plant gene provided using Tos17.
  • the present inventors have conducted extensive systematic analysis of the phenotype of the plant having the newly transferred Tos 17 copy and the sequence adjacent to the Tos 17 target site in rice. As a result, a rice mutant causing ear germination mutation was obtained, and a novel gene that regulates abscisic acid synthesis in plants was elucidated as a target site of Tos17, thereby completing the present invention.
  • the present invention relates to an oligonucleotide encoding a plant gene capable of controlling abscisic acid synthesis, which encodes an amino acid sequence from M at position [.] To I at position 164 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the present invention relates to an oligonucleotide or an oligonucleotide including an oligonucleotide encoding an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence.
  • the oligonucleotide is derived from rice.
  • this oligonucleotide is represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the oligonucleotide encodes a protein that is capable of regulating the expression of a VP14-like gene.
  • the present invention also relates to a vector comprising the above-mentioned oligonucleotide operably linked to a control sequence.
  • the present invention also relates to a vector that is pBI101-Hm-VS1.
  • the present invention also relates to a plant comprising the above oligonucleotide, and to a plant transformed with the above vector.
  • the present invention relates to a method for controlling abscisic acid synthesis in a plant, comprising the step of introducing the above-mentioned oligonucleotide into a plant.
  • FIG. 1 is a photograph showing the phenotype of the sprouting mutant. The photograph on the left is a sprouting mutant
  • Figure 2 shows the results of panicle sprouting mutation and Tos 17 linkage analysis.
  • the mutation in the figure is from a panicle-expressing mutant, and WT is a sample from a normal individual.
  • Lanes 1 to 10 show ear sprouting mutation, and lanes 11 to 19 show normal type.
  • the arrow indicates the homogenized band of the Tos17 band. In the individual showing ear germination, the To s 17 band was homogenized.
  • FIG. 3 shows the sequence of the product obtained by TAIL-PCR near the insertion site of Tos17 (SEQ ID NO: 3).
  • FIG. 4 shows a sequence of about 6.0 kb near the Tos17 insertion site.
  • the sequence was obtained by screening in Example 3 (SEQ ID NO: 4).
  • FIG. 5 is a diagram showing the nucleotide sequence (SEQ ID NO: L) of the oligonucleotide of the present invention and the corresponding amino acid sequence. Based on the sequence near the Tos17 insertion site obtained by TAIL-PCR, the nucleotide sequence and amino acid sequence of the cDNA determined by RACE and the primer extension method were determined.
  • nucleotides 383 to 877 encode an ORF (SEQ ID NO: 2) consisting of 164 amino acids.
  • Bold letters in the figure indicate nuclear localization signals (bold letters), and underlines indicate glycine-rich amino acid sequences.
  • the downward arrow indicates the position of Tos 17 inserted in the mutant strain AO150 (position 274).
  • FIG. 6 is a schematic diagram of the T-DNA plasmid used in the complementation test.
  • a 2390 bp fragment containing the ToF7 inserted ORF and excised with BglII was inserted into the BamHI site of PBI101-Hm.
  • FIG. 7 shows a part of the sequence of the rice VP14-like gene (SEQ ID NO: 5). Using this sequence as a probe, the expression of the VP14 gene was analyzed.
  • FIG. 8 is a diagram showing the expression of the VP14-like gene in the vs1 mutant. VP14-like rice gene expression was analyzed by Northern blot. WT is a sample obtained from a normal line, and V s1 is a sample obtained from a sprouting mutant. In the low humidity shown in the figure, one is the result of growing at normal humidity, and ten is the result of growing at low humidity. The arrow indicates the band position of the RNA that was lost in the ear sprouting mutant vs. 1.
  • FIG. 1 shows a part of the sequence of the rice VP14-like gene (SEQ ID NO: 5). Using this sequence as a probe, the expression of the VP14 gene was analyzed.
  • FIG. 8 is a diagram showing the expression of the VP14-like gene in the v
  • FIG. 9 is a diagram showing analysis of VS1 gene expression by the primer extension method. Primer extension was performed using RNA prepared from rice grown under high humidity (control) or low humidity (low humidity) conditions. No induction by drying is seen. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention provides a plant novel gene provided using Tos17, a vector containing the same, a plant transformed with the novel gene, and a plant comprising a step of transforming the novel gene into a plant. To provide an improved method.
  • an oligonucleotide encoding a plant gene capable of controlling abscisic acid synthesis is provided.
  • the term “can control abscisic acid synthesis” refers to suppressing or promoting a gene involved in abscisic acid biosynthesis in a plant.
  • the term "plant” includes monocots, dicots.
  • Oligonucleotides encoding plant genes capable of controlling abscisic acid synthesis of the present invention are typically those encoding the amino acid sequence from M at position 1 to I at position 164 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • Oligonucleotides encoding a plant gene capable of controlling abscisic acid synthesis of the present invention may have a sequence from M at position 1 to I at position 164 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, as long as they can control abscisic acid synthesis in a plant. At least 80% sequence identity to the amino acid sequence, preferably at least 85% sequence identity, more preferably at least 90% Oligonucleotides having even more preferably at least 95% sequence identity, most preferably at least 99% sequence identity.
  • sequence identity means that the two compared oligonucleotide sequences are identical, and the percentage sequence identity between the two compared oligonucleotide sequences is After optimally aligning the two oligonucleotide sequences, the same nucleobase (e.g., T, G, U, or I) occurs in both sequences to obtain the number of matched positions and the number of matched positions. The number of positions determined is divided by the total number of comparison oligonucleotides, and the result is multiplied by 100 to calculate.
  • nucleobase e.g., T, G, U, or I
  • Sequence identity can be calculated, for example, using the following sequence analysis tools: Unix-based GCG Wisconsin Package (Pror Am Manu 1 for the Wisconsin Package, Versions, 1994) September, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Mad is on.Wisc on sin, USA 537 ⁇ 1; R ice, P. (1996) Progr am Manu 1 for EGCG Packag e. Peter R ice, The S anger Configuration, Hinxton Hall, Cambridge, CB 101 RQ, England) and the Ex PAS yWor 1 d Wid Wet> Molecular Biology Server (Ge neva Un iversity Ho spunand Un iversity of Geneva, Geneva, Switzerland) and Mac Vector 6.0 (Teijin System Technology).
  • the modification of the peptide includes addition, deletion, substitution, or modification of an amino acid.
  • Amino acid addition refers to the addition of one or more amino acids to the original peptide chain.
  • Amino acid deletion refers to the deletion of one or more amino acids from the original peptide:
  • Amino acid substitution refers to replacing the original peptide with one or more amino acids.
  • Amino acid or peptide modifications include single or multiple amidation, carboxylation, sulphation, halogenation, alkylation, Examples include, but are not limited to, glycosylation, phosphorylation, hydroxylation, and acylation (eg, acetyl group, aliphatic group).
  • the amino acid to be substituted or added may be a natural amino acid or a non-natural amino acid. Preferably, it is a natural amino acid.
  • the peptides of the invention and variants thereof also include ammonium salts (including alkyl or arylammonium salts), sulfates, hydrogensulfates, phosphates, phosphorus Hydrogen oxyphosphate, dihydrogen phosphate, thiosulfate, carbonate, bicarbonate, benzoate, sulfonate, thiosulfonate, mesylate (methyl sulfonate), ethyl sulfonate, and benzene sulfone It can take the form of a salt of the peptide, such as an acid salt.
  • Certain amino acids can be substituted for other amino acids in a protein structure having a structure such as, for example, a cationic region or a binding site for a substrate molecule, without appreciable loss or loss of interaction binding capacity. It is the interaction capacity and properties of a protein that define the biological functional activity of a protein. Thus, certain amino acid sequence substitutions can be made in the protein sequence, and its DNA coding sequence, and still obtain a protein having the original properties. Thus, various changes can be made in the disclosed peptide sequence or the corresponding DNA sequence encoding this peptide without any apparent loss or elimination of their biological utility or activity. Is contemplated by the inventors.
  • the hydrophobicity index of the amino acid may be considered.
  • the importance of hydrophobic amino acid indexes in conferring interactive biological functions on proteins is generally considered in the art (Kyte. Jf and Doolittle, RF J. Mo ⁇ . Biol. 1 5 7 (1): 105-1 32, 19 8 2). It is recognized that the hydrophobic properties of amino acids contribute to the secondary structure of the protein produced. This in turn defines the interaction of the protein with other molecules (eg, cell membrane molecules, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, etc.). Each amino acid is assigned a hydrophobic index based on its hydrophobic and charge properties.
  • hydrophilic indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0): lysine (10.3.0); Aspartic acid (103.0 ⁇ 1): Glutamic acid (+ 3.0 ⁇ 1); Serine (+0.3): Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0) : Threonine (10.4); proline (10.5 ⁇ 1); alanine (10.5); histidine (10.5); cystine (1) .0); methionine (1-1.3).
  • Another amino acid has a similar hydrophilicity index and can still acquire bioisosteres, especially immunologically equivalent proteins.
  • “conservative substitution” refers to a substitution in an amino acid substitution in which the original amino acid and the amino acid to be substituted have similar hydrophilic or hydrophobic indices.
  • the conservative substitution is preferably an amino acid substitution whose hydrophilicity index and / or hydrophobicity index is within 2 or less, more preferably an amino acid substitution whose hydrophilicity index or and / or hydrophobicity index is within ⁇ 1. Amino acids whose sex index or Z and hydrophobicity index are within 0.5 Conversion is even more preferred.
  • amino acid substitutions are made based on the above indices.
  • Exemplary substitutions that take into account the various above properties are well known to those of skill in the art and include, for example, arginine and lysine; glutamic and aspartic acids: serine and threonine; glutamine and asparagine; and valine, leucine, and isoleucine. , And the like, but are not limited to these.
  • Nucleotide modifications can also be obtained using degenerate sequences of the genetic code. Such degenerate sequences are well known to those skilled in the art. It will be apparent to those skilled in the art that the amino acids encoded by the degenerate sequence are identical.
  • control sequences refers to DNA sequences having a functional promoter and any associated transcription elements (eg, enhancers, CCAAT boxes, TATA boxes, SPI sites, etc.).
  • operably linked means that the oligonucleotide is capable of operating in a host cell with various regulatory elements, such as promoters, enhancers, etc., that regulate its expression such that the gene can be expressed. Connected in a state. It is well known to those skilled in the art that the types and types of control sequences may vary depending on the host cell. For example, the CaMV 35S promoter, the nopaline synthase promoter and the like are well known to those skilled in the art. A method known to those skilled in the art can be used for introducing a gene into a plant. For example, a method via an agrobacterium and a method for direct introduction into cells are well known.
  • a method via Nag e1 (Micribio 1. Lett., 67, 325 (1990)) can be used as a method via an agglomerate.
  • this method first, for example, an expression vector is transformed into an agrobacterium by electo-poration, and then the transformed agropa and the transformed agrobacterium are transformed into P1nt Molecular Biology Manua 1 (S. B. Ge] vineta 1.), which is introduced into plant cells according to the method described in Academic Press Res.
  • P1nt Molecular Biology Manua 1 S. B. Ge] vineta 1.
  • an electoral poration method and a gene gun method are known as a method for directly introducing a gene into a cell.
  • Cells into which the gene has been introduced can be selected first for drug resistance such as hygromycin resistance, and then regenerated into plants by a conventional method.
  • the oligonucleotide of the present invention is typically obtained according to the method described herein, but can also be obtained by chemical synthesis based on the sequence disclosed in the present invention.
  • the oligonucleotides of the invention can be synthesized using an Applied BioSystems oligonucleotide synthesizer according to the specifications provided by the manufacturer.
  • the obtained calli were cultured for 5 months in N6 liquid medium (Otsuki, (1990), supra) supplemented with 2,4-D, and then regenerated medium (Otsuki, (1990), supra) And regenerated rice (1st generation (R1) plant) was obtained.
  • the second generation of the 500 regenerated rice lines obtained was deployed in the field. After one week of germination of the phenotype of each plant in the R2 population, the seeds germinated and were fully ripe. After detailed observation of each line, ear germination was observed in one line. This strain was named VS1. In order to more clearly show the sprouting traits, the spikelets where sprouting was observed were kept at 25 ° C under 100% humidity. As shown in Fig.
  • Linkage analysis was performed using the population from which the sprouting mutant was isolated. Linkage analysis was performed according to a general method well known in the art. Specifically, individuals showing panicle germination mutation and normal Individuals are visually distinguished from each other, and the DNA from each is CTAB method (Murray, GC and Thompson, WF. Uc 1. Acids Res. 8: 432 1 -432 5 (1980)) Extracted. The obtained DNA was digested with a restriction enzyme, subjected to 0.7% agarose electrophoresis, and then adsorbed to a nylon membrane (Sch 1 eicher & Schnel).
  • a 230 bp Bg1II fragment containing the full-length open reading frame of the gene obtained in Example 4 was inserted into a pBI101-Hm vector (Nagoya University Professor Kenzo Nakamura, Faculty of Agriculture, Furuya University) (Fig. 6).
  • the resulting vector was designated as pBI 10 1.—Hm—VS1.
  • the Agrobacterium um efaciens EHA strain was obtained by electroporation under the selection of 5 OmgZ1 kanamycin and hygromycin (obtained from Dr. Kenzo Nakamura, Faculty of Agriculture, Nagoya University). Was transformed.
  • the obtained agrobacterium strain was cryopreserved until use.
  • Seeds of the sprouting mutant were sterilized with 1% sodium hypochlorite and washed five times with sterile distilled water. The seeds are mixed with 3% sucrose, 0.3 g Degraded product, 2.8 g of proline and 2.Omg of 2,4-D were added, and N6 medium solidified with 510 gel gum (Chu et al., 1995, Sci. S inica, 18, 659-668). The medium pH was adjusted to pH 5.8 before autoclaving. Seeds were grown at 28 ° C for 3 weeks in the dark to obtain micro calli about 2 mm in size. This was transferred to a callus induction medium, cultured in the light for 4 days, and used for infection with agrobacterium.
  • cryopreserved agrobacterium was adjusted to pH 7.2 containing 5 OmgZ1 kanamachiin and 5 OmgZ1 hygromycin, and solidified with 15 gZl agar in an AB medium (Chi1 ton). Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3672-36 76). C The cells were cultured at different locations for 3 days. Agrobacterium cells were collected, and a liquid AAM medium containing 20 wg of acetosiliringone (Hiei et al., 1994, Plant J., 6, 271-282) (Hiei, 1994) Pl ants, 6: 27 1-282).
  • the obtained suspension was co-incubated with the above-mentioned induced callus at a site for 227 days to infect agrobacterium.
  • the obtained callus was washed five times with a liquid callus induction medium containing 50 Omg / 1 calpenicillin, and dried on sterilized Whatman No. 1 filter paper.
  • This callus was cultured in a virulent induction medium containing 5 OmgZ1 hygromycin for 3 weeks to select hygromycin-resistant callus, and 30 g of sucrose, 30 g of sorbitol, 1 g of casein hydrolyzate.
  • the VP14 gene is considered to be the rate-limiting gene for abscisic acid synthesis, but this gene has been isolated only from maize to date. Therefore, in order to isolate the VP4 gene from rice, the conserved sequences of VP14 of maize and VP14-like gene isolated from Arabidopsis were combined with the gene analysis software Mac Vector 6.0 (Teijin The conserved sequences were identified by comparison using system technology 1). 4′-side primers and 3′-side primers corresponding to the two conserved sequences were prepared. Using these two primers, rice VP 14 was amplified.
  • Example 6 Northern blot analysis was performed using the rice VP] .4-like gene isolated in Example 6 as a probe. MRNA from normal lines grown under high and low humidity and VS1 mutant rice was isolated using ISOGEN (Nippon Gene). Released. This mRNA was separated on an agarose gel with I%) and adsorbed on a nylon membrane (Scheicher & Schnel 1). A Southern blot was then performed using a VP14 probe labeled with 32 P—dCTP (Sambrook et al., Supra). X-ray films were obtained from Kodak. Figure 5 shows the results. As shown, under high humidity (1 in Fig. 8), the normal strain (WT)
  • VS1 is considered to be a gene that down-regulates VP] .4 or VP14-like genes.
  • RNA from IS-treated leaves or untreated leaves was analyzed using the primer extension method.
  • the primer used in the primer extension method was TTCGAGTTTTTGTGTTAGGG (SEQ ID NO: 6) corresponding to the VS1 gene, and the 5 'end was treated with 32 P- ⁇ -ATP using polynucleotide kinase (T ⁇ Y ⁇ B ⁇ ). Marked. RNA from IS-treated leaves or untreated leaves
  • a novel oligonucleotide capable of controlling abscisic acid synthesis which can be used for plant breeding, is provided.
  • a plant provided with useful traits such as drought resistance and germination of hard-to-ear is provided.

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Description

明細書 アブシジン酸合成を制御する新規遺伝子 技術分野
本発明は、 新規遺伝子に関する。 より詳細には、 植物においてアブシジン酸
( a b s c i s i c a c i d) 合成を制御する機能を有するタンパク質をコー ドする新規遺伝子に関する。 背景技術
トランスポゾンは、 動物、 酵母、 細菌および植物のゲノムに遍在することが知 られる変異誘発遺伝子である。 トランスポゾンは、 その転移（ t r a n s p o s i t i o n)機構により 2つのクラスに分類されている。 クラス I Iに属するト ランスポゾンは、 複製することなく DN Aの形態で転移する。 クラス I Iに属す るトランスポゾンとして、 トウモロコシ（Z e a 1113 5)の八（：ノ05 、 S p m/d S pmおよび Mu要素（F e d o r o f f . 1 989, Ce l l 56、 I 8 1— 1 91 ; F e d o r o f f ら、 ] 983、 C e l l 35, 235 - 24 2 : S c h i e f e l b e i nら、 1 985、 P r o c . Na t 】 . Ac a d. S c i . USA 82、 4783— 4787)、 An t i r r h i n um ma j u s (キンギヨソゥ） の T am要素 （B o n a sら、 ：1 984、 EMBO J、 3、 101 5- 1 019) が知られている。 クラス I Iに属するトランスポゾン は、 トランスポゾン ·夕ツギングを利用する遺伝子単離に広く利用されている。 この技術は、 トランスポゾンがゲノム上で転移して、 ある遣伝子中に挿入される と遺伝子の生理学的および形態学的変異が起こり、 遺伝子が制御する表現型が変 化することを利用する。 この変化を検出することにより影響を受けた遺伝子を単 離する （B a nc r o f tら、 1 993、 Th e P l an t C e 1 5. 6 31— 638 : Co l a s a n t iら、 1998、 Ce l l、 93、 593 - 6 03 : Gr ayら、 1997、 Ce l l , 89、 25— 3 ] ; Ke d d i eら， 1998. Th e P l n t Ce l l , 10、 877 -887 ； W i t h a mら、 1994、 Ce l し 78、 1 101— 1 1 1 5) 。
クラス Iに属するトランスポゾンは、 レトロトランスポゾンとも呼ばれ、 複製 し、 そして RNA中間体を介して転移する。 クラス I トランスポゾンは、 最初、 ショウジヨウバエおよび酵母で同定され、 そして特徴付けられたが、 最近の研究 により植物ゲノム中に遍在し、 そのかなりの部分を占めていることが明らかにさ れてレ る （B e n n e t z e n、 1 996, Tr e n d s M i c r o b i o l o. 、 4、 347-353 ； Voy t a s, 1996、 S c i e n c e, 274、 737 - 738) 。 レトロトランスポゾンの大部分は、 非移動性の組み込みュニ ットであるようである。 最近の研究は、 これらのいくつかが、 創傷、 病原体の攻 撃および細胞培養などのストレス条件下で活性化されることを示している （G r a n d b a s t i e n, 1 998、 Tr e nd s i n P I an t S c i e n c e、 3、 18 1 - 187 ; W e s s 1 e r , 1996 ； Cu r r. B i o l .
6、 959— 961 : We s s l e rら、 1995、 Cu r r. O p i n . G e n e t. De v e に 5、 814— 82 1) 。 例えば、 タバコでは T n t 1 Αお よび T t o 1 (P ou t e a uら、 1 994、 P l n t J . 、 5、 535— 542 ; Ta k e d aら、 1988、 P l an t Mo 1. B i o l . 、 36、 365— 376) 、 およびィネでは T o s 17 (Η i. r ο c h i k aら、 199 6, P r o c. Na t 1. Ac a d. S c i . US A> 93、 7783- 778 8) について、 ストレス条件下における活性化が報告されている。
イネのレトロトランスポゾン To s 17は、 最も良く研究されている植物中の クラス I要素である。 To s 17は、 Ty 1— c o p i a群レトロ要素の間の逆 転写酵素ドメインの保存アミノ酸配列を基に作製された縮重プライマーを用いた RT— PC R法によりクローン化された （H i r o c h i k aら、 1992、 M o 1. Ge n. Ge n e t . 、 2 3 3、 2 0 9— 2 1 6) 。 To s l 7は、 4. 3 k bの長さの、 2つの同じ 1 3 8 b pの LTR (長鎖末端反復） および開始メ チォニン t RNAの 3'末端に相補的な P B S (プライマー結合部位） を持つ (H i r o c h i k aら、 1 9 9 6、 上述） 。 T o s 1 7転写は、 組織培養によ り強く活性化され、 そして培養時間とともにそのコピー数を増加する。 ゲノム研 究のモデルであるジャポニカ品種日本晴では、 To s 1 7の当初のコピー数は 2 であるが、 組織培養後、 再生した植物では、 5〜3 0コピーに増加している （H i r o c h i k aら、 1 9 9 6、 上述） 。 酵母およびショウジヨウバエで特徵付 けられたクラス I I トランスポゾンとは異なり、 To s 1 7は、 染色体中をラン ダムな様式で転移し、 そして安定な変異を引き起こし、 そしてそれ故、 イネにお ける遣伝子単離の強力なツールを提供する （H i r o c h i k aら、 1 9 9 7、 P l a n t Mo 】 . B i o l . 3 5、 2 3 1 - 240 ; 1 9 9 9, Mo l e c u 1 a r B i o l o y o f R i c (K. S h i mamo t o編） 、 S p r i n g e r—V e r l a g、 4 3〜4 8;g) 。
アブシジン酸は、 重要な植物ホルモンである。 植物において、 器官脱離の促進、 休眠誘導、 老化促進、 生長阻害、 気孔の閉鎖などの多様な生理作用を示すことが 知られている （Mc C a r t y, D. R. A n n u. R e v. P l a n t P h y s i o 1. P l a n t Mo 1. B i o l . 4 6、 7 1 - 9 3 ( 1 9 9 5) 、 G i r a u d a t . J . Cu r r . Op i n. C e l 1 B i o l . 7 : 2 3 2 - 240 ( 1 9 9 5) ； Ad d i c o t t , F. T. (編） 、 Ab s c i d i c Ac i d, P r a e g e r S c i e n t i f i c , New Yo r k ( 1 9 8 3) ) 。 また、 アブシジン酸合成量の低下は、 植物 （例えば、 トウモロコ シ） の穂発芽およびしおれの原因になると推測されている （Mc C a r t y, D. R. An n u. Re v. P l a n t P h y s i o l . P l a n t Mo 1. B i o 1 . 4 6、 7 1 - 9 3 ( 1 9 9 5 ) ； ； Ad d i c o t t、 F. T. 同 上） ） 。 従って、 アブシジン酸合成を制御することによって、 穂発芽の抑制およ び乾燥耐性の付与などの植物発現型の調節および付与が可能になると予測された。 アブシジン酸は、 アポカルテノイドの一種である。 アポカルテノイドは、 カロ テノィドの酸化的切断によって生じる化合物で、 自然界に広範に存在している。 アブシジン酸は、 エポキシカロテノイドの酸化的切断によって生成する。 アブシ ジン酸の生合成において、 酸化的切断が第一に関与する反応であり、 そして律速 反応であると提唱されている。
アブシジン酸生合成に関連する遺伝子は、 これまでに植物から 2種単離されて いる。 そのうち、 1種はタバコから （Ma r v i n E. ら、 EMB〇 J - 1 5 : 233 1 - 2342, 1996) , およびもう 1種はトウモロコシからされ た VP 14であり （Ta n B— Cら、 P r o c. Na t l . Ac ad. S c に USA, 94 12235— 12240 1997 ; S c h e a r t z, S. H. ら、 S c i e n c e 276 1 872— 1 874) 、 共にトランスポゾンを利 用して単離された。 アブシジン酸生合成には、 これらの他にも数多くの遺伝子が 関与していると考えられており、 アブシジン酸生合成酵素のさらなる研究が期待 されている。
VP 14遺伝子は、 アブシジン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、 その産 物である 9—シス一エポキシカロテノィドジォキシゲナーゼは、 9一シス—ェポ キシ一力ロテノイド （例えば、 9' 一シス一ビオラキサンチンおよび 9 シス —ネオキサンチン） を切断して、 C25アポアルデヒドおよびキサントキシンを 生成する。 キサントキシンは、 高等植物においてアブシジン酸の前駆体である。 アブシジン酸はまた、 乾燥によって発現が誘導される （Z e e v a a r t, J . A. D. および C r e e lma n R. A. A n n u. Re v. P l an t M o 1 - B i o l . 39 439 (1988) ) 。 さらに、 VP 14遺伝子の変異 がアブシジン酸合成の増減に関与することからも、 VP 14遺伝子がアブシジン 酸合成の律速酵素であることが提唱されている （S c h e a r t z. S. H. ら、 S c i en c e 276 1872— 1874 1 997 ) V P 14はこれま でに、 トウモロコシからしか同定されていない。 発明の開示
本発明は、 T o s 1 7を用いて提供される植物新規遺伝子を提供する。
本願発明者らは、 イネにおいて、 新たに転移した T o s 1 7コピーをもつ植物 の表現型および T o s 1 7標的部位の隣接配列の系統的な分析を鋭意重ねた結果、 T o s 1 7挿入により、 穂発芽変異を起こすイネ変異体を得、 T o s 1 7の標的 部位として、 植物においてアブシジン酸合成を制御する新規遺伝子を解明し、 本 発明を完成するに至った。
本発明は、 アブシジン酸合成を制御し得る植物遺伝子をコードするオリゴヌク レオチドであって、 配列表の配列番号 2の].位の Mから 1 6 4位の Iまでのアミ ノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド、 または該アミノ酸配列において 1も しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードす るオリゴヌクレオチドを含む、 ォリゴヌクレオチドに関する。
好ましくは、 このオリゴヌクレオチドは、 イネに由来する。
好ましくは、 このオリゴヌクレオチドは、 配列表の配列番号 1で示される。 好ましくは、 このオリゴヌクレオチドは、 V P 1 4様遺伝子の発現を調節し得 る遺伝子をタンパク質をコードする。
1つの局面で、 本発明はまた、 制御配列に作動可能に連結された上記オリゴヌ クレオチドを含むベクターに関する。
好ましくは、 本発明はまた、 p B I 1 0 1— Hm— V S 1であるベクターに関 する。
他の局面で、 本発明はまた、 上記オリゴヌクレオチドを含む植物に関し、 上記 のベクターで形質転換された植物に関する。
さらに、 本発明は、 植物におけるアブシジン酸合成の制御方法に関し、 上記の オリゴヌクレオチドを植物に導入する工程を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 穂発芽変異体の表現型を示す写真である。 左の写真は、 穂発芽変異体
(ヘテロ） 系統を示し、 右の写真は、 正常系統を示す。
図 2は， 穂発芽変異および To s 1 7連鎖解析を示す図である。 図中の変異は 穂発現変異株由来， WTは正常個体由来のサンプルを示す。 レーン 1〜 10は、 穂発芽変異、 レーン 1 1〜19は、 正常型を示す。 矢印は、 To s 1 7のバンド のホモ化したパンドを示す。 穂発芽を示す個体では、 To s 1 7のバンドがホモ 化していた。
図 3は、 To s 17の挿入部位近傍の TA I L— PC Rによって得られた産物 の配列である （配列番号 3) 。
図 4は、 To s 17挿入部位の近傍約 6. 0 k bの配列である。 配列は実施例 3においてスクリーニングによって得た （配列番号 4) 。
図 5は， 本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列 （配列番号: L) およ び対応するアミノ酸配列を示す図である。 TA I L— P CRで得た To s 1 7挿 入部位の近傍の配列を基に、 RACE、 プライマ一伸長法により決定した cDNAの 塩基配列およびアミノ酸の配列を決定した。 図中、 ヌクレオチド 383〜877 位は、 164アミノ酸からなる ORF (配列番号 2) をコードする。 図中の太字 は、 核局在シグナル （太字） を示し、 そして下線はグリシンリッチなアミノ酸の 配列を示す。 下向き矢印は、 突然変異株系統 AO 1 50で挿入された To s 17 の位置を示す （274位） 。
図 6は、 相補性試験に用いた T一 DNAプラスミドの模式図である。 To s i 7が挿入された ORFを含み、 Bg〗 I Iで切り出される 2390 b pの断片を P B I 101—Hmの B amH I部位に挿入した。
図 7は、 イネの VP 14様遺伝子の配列の一部である （配列番号 5) 。 この配 列をプローブとして用いて VP 14遺伝子の発現解析を行った。 図 8は、 v s 1変異株中の V P 1 4様遣伝子の発現を示す図である。 V P 1 4 様のイネ遺伝子発現をノーザンブロッ卜によって分析した。 WTとは正常系統か ら得たサンプル、 および V s 1とは穂発芽変異体から得たサンプルである。 図中 の低湿度において、 一とは通常の湿度で、 十とは低湿度で、 それぞれ生育した結 果である。 矢印は、 穂発芽変異体 v s 1で消失した R N Aのバンド位置を示す。 図 9は、 プライマー伸長法による V S 1遺伝子発現の分析を示す図である。 高 湿度 （コントロール） または低湿度 （低湿度） の条件で生育したイネから調製し た R N Aを用いて、 プライマ一伸長を行った。 乾燥による誘導は、 見られない。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 T o s 1 7を用いて提供される植物新規遺伝子、 これを含むベクタ ―、 当該新規遺伝子で形質転換された植物、 および当該新規遺伝子を植物に形質 転換する工程を包含する、 植物の改良方法を提供する。
本発明によれば、 アブシジン酸合成を制御し得る植物遺伝子をコードするオリ ゴヌクレオチドが提供される。 本願明細書で用いる用語 「アブシジン酸合成を制 御し得る」 は、 植物において、 アブシジン酸生合成に関与する遺伝子を、 抑制ま たは促進することをいう。 用語 「植物」 は、 単子葉植物、 双子葉植物を包含する。 本発明のアブシジン酸合成を制御し得る植物遺伝子をコードするオリゴヌクレ ォチドは， 代表的には、 配列表の配列番号 2の 1位の Mから 1 6 4位の Iまでの アミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド、 または該アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコ一 ドするオリゴヌクレオチドを含む、 オリゴヌクレオチドである。
本発明のアブシジン酸合成を制御し得る植物遺伝子をコードするオリゴヌクレ ォチドは、 植物においてアブシジン酸合成を制御し得る限り、 配列表の配列番号 2の 1位の Mから 1 6 4位の Iまでのアミノ酸配列と、 少なくとも 80%の配列同 一性、 好ましくは少なくとも 85 %の配列同一性、 より好ましくは少なくとも 90 % の配列同一性、 さらにより好ましくは少なくとも 95%の配列同一性、 最も好まし くは少なくとも 99%の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを包含する。 用語 「配列の同一性」 は、 対比される 2つのオリゴヌクレオチド配列が同一であるこ とを意味し、 対比される 2つのオリゴヌクレオチド配列間の配列同一性の割合 (%)は、 対比される 2つのオリゴヌクレオチド配列を最適に整列させた後、 同一 の核酸塩基（例えば、 T、 G、 U、 または I)が両方の配列で生じて適合した位 置の数を得て適合位置数とし、 適合した位置の数を比較オリゴヌクレオチド総数 で除し、 そして、 この結果に 100を乗じて計算される。 配列同一性は、 例えば， 以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る ： Un i xベースの GCG W i s c o n s i n P a c k a g e (P r o r am Ma nu 1 f o r t h e Wi s c on s i n P a c k a g e, Ve r s i o n s, 1 994年 9月、 G e n e t i c s Compu t e r Gr o u , 575 S c i e n c e D r i v e Mad i s on. Wi s c on s i n, USA 537】 1 ; R i c e、 P. ( 1996) P r o g r am Manu 1 f o r EGCG P a c k a g e. P e t e r R i c e, Th e S an g e r Ce n t r e、 H i n x t o n H a l l , Camb r i d g e, C B 1 0 1 RQ、 En g l a n d) および t h e Ex PAS y Wo r 1 d Wi d e We t>分子生物学用サーバ一 （Ge n e v a Un i v e r s i t y Ho s p i t a l a n d Un i v e r s i t y o f Ge n e v a, Ge n e v a, Sw i t z e r l a nd) および M a c V e c t o r 6. 0 (帝人システムテクノロジー） 。
本明細書中において， ペプチドの改変には、 アミノ酸の付加、 欠失、 置換、 ま たは修飾が挙げられる。 アミノ酸の付加は、 もとのぺプチド鎖に 1つ以上のアミ ノ酸を付加することをいう。 アミノ酸の欠失は、 もとのペプチドから： 1つ以上の アミノ酸を欠失させることをいう。 アミノ酸の置換は、 もとのペプチドを 1っ以 上のアミノ酸で置換することをいう。 アミノ酸またはペプチドの修飾には、 一重 または多重の、 アミド化、 カルボキシル化， 硫酸化、 ハロゲン化、 アルキル化、 グリコシル化、 リン酸化、 水酸化、 ァシル化 （例えば、 ァセチル基， 脂肪基） な どが挙げられるが、 これらに限定されない。 置換、 または付加されるアミノ酸は、 天然のアミノ酸であってもよく、 非天然のアミノ酸であってもよい。 天然のアミ ノ酸であることが好ましい。 本発明のさらなる実施態様において、 本発明のぺプ チドおよびその改変体はまた、 アンモニゥム塩 （アルキルまたはァリ一ルアンモ 二ゥム塩を含む） 、 硫酸塩、 硫酸水素塩、 リン酸塩、 リン酸水素塩、 リン酸二水 素塩、 チォ硫酸塩、 炭酸塩、 重炭酸塩、 安息香酸塩、 スルホン酸塩、 チォスルホ ン酸塩、 メシレート （メチルスルホン酸） 塩， ェチルスルホン酸塩、 およびベン ゼンスルホン酸塩のようなペプチドの塩の形態を取り得る。
(生物学的機能の等価な改変）
以下、 ペプチドの生物学的機能の等価な置換について概説する。 ペプチドの生 物学的機能の等価な置換は、 本発明のペプチドおよびそれらをコードする D N A セグメントの構造において行われ得、 そして依然として所望の特徴を有する蛋白 質またはペプチドをコードする機能的分子を得る。 以下、 等価体またはさらに改 良された第 2の生成分子を生成するための蛋白質のアミノ酸の変化について議論 する。 アミノ酸置換を実施する方法は、 化学合成、 または遺伝子工学を利用する 技術においてアミノ酸をコードする D N A配列のコドンを変化させることを含む がこれらに限定されない。
あるアミノ酸は、 相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、 例えば、 カチオン性領域または基質分子の結合部位のような構造を有する蛋白質構造にお いて他のアミノ酸に置換され得る。 ある蛋白質の生物学的機能活性を規定するの は、 蛋白質の相互作用能力および性質である。 従って、 特定のアミノ酸配列置換 が蛋白質配列、 およびその D N Aコード配列において行われ得、 それでもなお、 もとの性質を有する蛋白質が得られ得る。 従って、 それらの生物学的有用性また は活性の明らかな低下または消失なしに、 種々の変化が、 開示されたペプチド配 列またはこのペプチドをコードする対応する D N A配列において行われ得ること が本発明者らにより意図される。
このような変化を作製する際に、 アミノ酸の疎水性インデックスが考慮され得 る。 蛋白質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸イン デックスの重要性は、 一般に当該分野で考慮される （Ky t e . Jf および D o o l i t t l e, R. F. J . Mo } . B i o l . 1 5 7 ( 1 ) ： 1 0 5 - 1 3 2, 1 9 8 2) 。 アミノ酸の疎水的性質は、 生成した蛋白質の二次構造に寄与す ることが認められる。 これは次いでその蛋白質と他の分子 （例えば、 細胞膜分子、 酵素、 基質、 レセプター、 DNA, 抗体、 抗原など） との相互作用を規定する。 各アミノ酸は、 それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性ィンデックスを 割り当てられる。 それらは：イソロイシン （+4. 5) ；バリン （十 4. 2) ； ロイシン （十 3. 8) ： フエ二ルァラニン （+ 2. 8) ： システィン Zシスチン (+ 2. 5) ；メチォニン （+ 1. 9) ： ァラニン （+ 1. 8) ； グリシン （一 0. 4) ； スレオニン （一0. 7) ；セリン （一0. 8) ： トリブトファン （一 0. 9) ；チロシン （一 ] . 3) ： プロリン （一】 . 6) ； ヒスチジン （一 3. 2) ； グルタミン酸 （— 3. 5) ； グルタミン （— 3. 5) ； ァスパラギン酸
(- 3. 5) ： ァスパラギン （一3. 5) ： リジン （一 3. 9) ：およびアルギ ニン （一 4. 5) ) (Ky t e . Jおよび D o o 1 1 t t 1 e , R. F. 1 9 8 2) である。
あるアミノ酸を， 同様の疎水性ィンデックスまたは値を有する他のアミノ酸に より置換して、 そして依然として同様の生物学的活性を有する蛋白質 （例えば、 依然として生物学的機能的に等価な蛋白質） を生じさせ得ることが当該分野で周 知である。 このような変化を作製することにおいて、 疎水性インデックスが ± 2 以内であるアミノ酸置換が好ましく、 士 1以内であるアミノ酸置換がより好まし く、 および ± 0. 5以内のアミノ酸置換がさらにより好ましい。 親水性に基づく このようなアミノ酸の置換が効果的に行われ得ることが当該分野において理解さ れる。 米国特許第 4, 5 54、 1 0 ： L号は、 その隣接した親水性により支配され るような蛋白質の最も局所的な平均親水性が、 蛋白質の生物学的特性に関連する ことを記載する。 米国特許第 4、 5 54、 】 0 1号に記載されるように、 以下の 親水性インデックスがアミノ酸残基に割り当てられている ： アルギニン （+ 3. 0) ： リジン （十 3. 0) ； ァスパラギン酸 （十 3. 0 ± 1 ) ： グルタミン酸 (+ 3. 0± 1) ；セリン （+ 0. 3) ： ァスパラギン （+ 0. 2) ； グルタミ ン （+ 0. 2) ； グリシン （0) ：スレオニン （一 0. 4) ； プロリン （一 0. 5 ± 1〉 ；ァラニン （一0. 5) ； ヒスチジン （一 0. 5) ； システィン （一 ] . 0) ； メチォニン （一 1. 3) ； バリン （一 1. 5) ： ロイシン （一 ：し 8) ； イソロイシン （一 1. 8) ； チロシン （— 2. 3) ： フエ二ルァラニン （一 2. 5) ； トリブトファン （一 3. 4) 。 アミノ酸が同様の親水性インデックスを有 しかつ依然として生物学的等価体 （特に免疫学的に等価な蛋白質） を獲得し得る 別のものに置換され得ることが理解される。 このような変化において、 親水性ィ ンデックスが ± 2以内であるアミノ酸置換が好ましく、 土 1以内であるアミノ酸 置換がより好ましく、 および ±0. 5以内のアミノ酸置換がさらにより好ましい。 本発明において、 「保存的置換」 とは、 アミノ酸置換において、 元のアミノ酸 と置換されるアミノ酸との親水性ィンデックスまたは および疎水性ィンデック スが類似している置換をいう。 保存的置換は、 好ましくは、 親水性インデックス または/および疎水性インデックスが土 2以内であるアミノ酸置換であり、 親水 性インデックスまたは および疎水性ィンデックスが ± 1以内であるアミノ酸置 換がより好ましく、 親水性インデックスまたは Zおよび疎水性インデックスが士 0. 5以内であるアミノ酸置換がさらにより好ましい。
上記に概要されるように、 アミノ酸置換は上記のインデックスに基づいて行わ れる。 種々の以上の特性を考慮する例示的な置換には、 当業者に周知であり、 例 えば、 アルギニンおよびリジン； グルタミン酸およびァスパラギン酸：セリンお よびスレオニン； グルタミンおよびァスパラギン；ならびにバリン、 ロイシン、 およびイソロイシン、 などが挙げられるがこれらに限^されない。 ヌクレオチドの改変は、 さらに， 遺伝コードの縮重配列を利用しても得られ得 る。 このような縮重配列は当業者には周知である。 縮重配列でコードされるアミ ノ酸が同一であることは当業者には明らかである。
本願明細書で用いる用語 「制御配列」 は、 機能的プロモーターおよび、 任意の 関連する転写要素（例えば、 ェンハンサー、 CCAATボックス、 TATAポッ クス、 SP I部位など）を有する DN A配列をいう。
本願明細書で用いる用語 「作動可能に連結」 は、 遺伝子が発現し得るように、 オリゴヌクレオチドが、 その発現を調節するプロモーター、 ェンハンサ一等の 種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。 制御配列のタイプおよび種類が、 宿主細胞に応じて変わり得ることは、 当業者 に周知の事項である。 例えば、 C aMV 35 Sプロモーター、 ノパリンシンター ゼプロモーターなどが当業者に周知である。 植物体への遺伝子の導入には、 当業 者に公知の方法が用いられ得る。 例えば、 ァグロパクテリゥムを介する方法と直 接細胞に導入する方法とが周知である。 ァグロパクテリゥムを介する方法は、 例 えば、 N a g e 1 らの方法（M i c r i b i o 1. Le t t . 、 67、 325 (1 990))が用いられ得る。 この方法は、 まず、 例えば発現ベクターをエレクト口 ポレ一シヨンによってァグロパクテリゥムに形質転換し、 ついで、 形質転換され たァグロパ、クテリゥムを P 1 n t Mo l e c u l a r B i o l o gy Ma n u a 1 ( S . B. G e ] v i n e t a 1. 、 Ac ad em i c P r e s s Pu l i s h e r s)に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。 遺伝子 を直接細胞に導入する方法としては、 エレクト口ポレーシヨン法、 遺伝子銃法が 知られている。
遺伝子が導入された細胞は、 まずハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性で選択さ れ、 ついで、 常法により、 植物体に再生され得る。
本明細書中、 以下で使用される名称、 および以下で記載される実験室手順は、 当該分野で周知で一般的に用いられる手順を使用する。 標準的な技術は、 組換え 法、 ポリヌクレオチド合成、 ならびに微生物培養および形質転換（例えば、 エレ クトロポレーシヨン）について使用される。 この技術および手順は、 一般的に， 当該分野、 およびこの書類を通じて提供される種々の一般的な参考文献（一般的 に Iま、 S amb r o o kら、 Mo l e c u l a r C l o n i n g : A L a b o r a t o r y ianu a l、 第 2版 （1989) Co l d Sp r i n g H a r o r L a b o r a t o r y P r e s s, Co l d S p r i n g H a r bo r、 N. Y. を参照。 これらは、 本明細書中で参考として援用される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、 代表的には、 本明細書に記載の方法に従って 得られるが、 本発明に開示された配列を基に、 化学合成によっても得られ得る。 例えば、 本発明のオリゴヌクレオチドは、 A p p I i e d B i o Sy s t em sのオリゴヌクレオチド合成機を用いて製造業者によって提供される仕様書に従 つて合成され得る。
P C R増幅の方法は、 当該分野で周知である（PCR Te c hn o l ogy : P r i n c i l e s a n d App l i c a t i o n s f o r DNA Am 1 i f i c a t i o n. HA E r 1 i c h編、 F r e ema n P r e s s . N e wY〇 r k、 NY(1 992) ； PCR P r o t o c o l s : A Gu i d e t o Me t h o d s a n d App l i c a t i on s. I n n i s .
Ge l f l a n d、 S n i s k y . および Wh i t e編、 Ac a d em i c P r e s s、 S a n D i e go、 CA(1 990) ; Ma t t i 】 a (1991) Nu c l e i c Ac i d s Re s. 1 9 ： 4967 ； E c k e r t , K. A. および Ku n k e T. A. (199 DPCR Me t h o d s a n d A p p i i c a t i on s 1 : 1 7 ; PCR, Mc Ph e r s on, Qu i r k e s、 および丁 a y l o r、 I RL P r e s s、 Ox f o r d, これらは、 本明 細書中で参考として援用する。 実施例 以下、 本願発明を実施例を挙げて説明する。 以下の実施例は、 本発明の例示す るものであって、 本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
また、 以下の実施例で用いられた化学薬品、 キットは、 具体的に指示がある場 合を除いて、 岩井化学から入手した。
(実施例 1 ) 培養による T o s 1 7の活性化および得られた変異体の特徴付け ジャポニカ種の品種日本晴の完熟種子を出発材料に用い、 先に記載のように
(H r o c h i k aら、 1 996、 前出） カルス開始培養および細胞懸濁培養を 行った。 To s 1 7の活性化は、 大槻 （ 1 990) の方法（イネ ·プロトプラス ト培養系、 農林水産技術情報協会）に従って行った。 要約すれば、 イネの完熟種 子を 2. 4—ジクロロフエノキシ酢酸 （2, 4— D) を添加した MS培地 （大槻、 ( 1 990) 、 前出） で培養し （25 、 1ヶ月間） 、 カルス誘導を行った。 得 られたカルスを、 2, 4— Dを添加した N 6液体培地 （大槻、 （ 1 990) 、 前 出） で 5ヶ月間培養したのち、 再分化培地 （大槻、 （ 1990) 、 前出） に移し 再分化イネ （第 1世代 （R 1) 植物） を得た。 得られた再分化イネ 500系統の 第二世代を、 圃場にに展開した。 R 2集団の各植物の表現型を発芽 1週間後、 種 子が実り、 完熟した後に、 各系統を詳細に観察した結果、 1系統で穂発芽が観察 された。 この株を VS 1と命名した。 穂発芽の形質をさらに明確に示すために、 穂発芽の観察された穂を湿度 100 %の条件下、 25°Cで保温した。 図 1に示さ れるように， VS 1株において穂についた種子の約 4分の 1で発芽することが観 察された。 一方、 正常系統では、 同じ条件下で全く発芽は観察されない。 以上の 結果は、 VS 1株は穂発芽変異を有することを示している。 また、 】つの穂にお いて穂発芽する種子としない種子が 1 ： 3の割合で観察された。 このことは、 穂 発が変異が劣性変異であることを示している。 (実施例 2) 穂発芽変異体の解析
以上のように、 遣伝解析から穂発芽変異は劣性変異であることが示された。 さ らに、 穂発芽した個体を生育させたところ， 水分欠乏の植物が示すようなしおれ が観察された。 穂発芽変異およびしおれ現象はアブシジン酸含量の低下を示唆し ている （Mc C a r t y, D. R. An n u. Re v. P l a n t P hy s i o 1. P l a n t Mo 1. B i o l . 46 7 1 - 93 (1 995) ) 。
次に、 正常系統および変異系統におけるアブシジン酸含量を測定した。 測定は, 高湿度条件 （すなわち、 密封試験管内） 、 および低湿度条件 （すなわち、 試験管 の蓋をはずし 6時間後） で行った。 アブシジン酸含量の測定は、 アブシジン酸ィ ムノアッセィ検出キット （S i gma) で行った。 結果を表].に示す。 この測定 において、 各系統の幼苗におけるアブシジン酸含量を測定した。 コントロール系 統では、 乾燥によってアブシジン酸量が増加したが， 同条件下での穂発芽変異体 においては、 アブシジン酸量は増加しなかった。 以上の結果から， 今回単離され た穂発芽変異体は、 アブシジン酸合成に異常を有する変異体であると結論づけた。 表 1 アブシジン酸含量 （ n m o 1 Z g新鮮重量）
Figure imgf000016_0001
(実施例 3 ) 穂発芽変異体の原因遺伝子の単離および構造解析
穂発芽変異体の原因遺伝子を同定単離するために、 穂発芽変異体が分離する集 団を用いて、 To s 1 7遣伝子との連鎖解析を行った。 連鎖解析は、 当該分野で 周知の一般的な方法に従って行った。 具体的には、 穂発芽変異を示す個体と正常 個体とを肉眼で識別し、 それぞれから DNAを CTAB法 （Mu r r a y, G. C . および T h omp s o n, W. F. . u c 1. Ac i d s Re s. 8 ： 432 1 -432 5 ( 1 980) ) により抽出した。 得られた DNAを制限酵素 で切断し、 0. 7 %ァガロース電気泳動後、 ナイロンメンブレン （S c h 1 e i c h e r &S c h n e l ] ) に吸着させた。 To s ] 7を、 X b a Iおよび B a mH I制限酵素処理によって得られる DNA断片を32 P— d CTPで標識し、 サザンプロットを行った。 結果を図 2に示す。 レーン : 1〜 1 0は、 穂発芽変異を 示す個体からの DNAを、 レーン ]. 1〜 1 9は正常個体からの DNAを解析した 結果を示す。 矢印で表す To s 1 7のバンドが穂発が個体では必ず見られる。 一 部正常個体にも見られるが、 バンドの濃さは弱い （各レーンに載せられた DNA 量は必ずしも均一ではない。 この問題を回避するために、 矢印のすぐ下のバンド との相対的な濃さで判断した） 。 この結果， 穂発芽変異では矢印で示す To s I 7のバンドがホモ化しているが、 正常個体ではへテロの状態か、 または全く存在 しないことを示している。 このことは、 矢印で示す矢印 To s 1 7のバンドが穂 発芽変異と完全連鎖していることを示している。 さらに、 60個体の分離集団を 用いて同様な分析を行うことにより， 上記の結果を確証した。 これらの結果は、 図 2の矢印で示される To s 1 7が穂発芽変異を誘発したことを示唆する。
ここで、 変異体から、 上記の方法を用いて処理した変異体 DNAをァガロース 電気泳動後、 図 2の矢印のサイズの周辺の領域にあたる部分を切り出し、 DNA を抽出した。 DNAの抽出には、 Q I A q u i c k Ge l E t r a c t i o n K i t (Q i a g e n) を用いた。 この DNAを铸型として、 TA I L— P CR (L i u, Y. — G. および i f f i e r , R. F. Ge n om i c s 25、 674 - 68 1 ( 1 995) ) により、 To s l 7に隣接する配列、 すなわち穂発芽変異の原因遺伝子の一部をクローン化した。 TA I L一 P CRは、 M i y a oら、 P l a n t B i o t e c h n o l o g y ]. 5 : 253 - 2 5 6 ( 1 9 9 8) の方法に従って行った。 得られた配列を図 3に示す （配列番号 3) 。 この配列をプローブとして用いて、 イネのゲノムライブラリー （農業生物 資源研究所高野誠氏より入手した） をスクリーニングした。 スクリーニングは、
S amb r o o kら、 前出のように行った。 スクリーニングにより得られたクロ ーンの To s 1 7挿入部分の近傍の約 6 k b pの配列を決定した。 配列を図 4に 示す （配列番号 4) 。 この遺伝子の塩基配列を下に、 RACEプライマ一伸長
(F r o hma n, M. A. ら、 P r o c . N a t 1 . A c a d. S c i . US A 8 5 : 8 9 9 8— 9 0 0 2 ( 1 9 8 8) ) を行い、 To s 1 7挿入部位にコ ードされる c DMAの塩基配列を決 ¾した （図 5、 配列番号].) 。 この c DNA は、 全長 8 94 b p (図 5、 配列番号 1 ) からなり、 1 64アミノ酸からなる〇 RF (図 5、 ヌクレオチド 3 8 3〜8 7 7位。 配列番号 2 ) をコードする。 この ORFには、 グリシンリッチモチーフ （図 5、 下線部） 、 および核局在シグナル
(図 5、 太字） が存在する。 To s 1 7の挿入部位を、 矢印で示す （図 5) 。
(実施例 4 ) 遺伝子導入による相補性試験
1. 相補性ベクターの構築および Ag r o b a c t e r i um t ume f a c i e n sによる穂発芽変異体の形質転換
実施例 4で得られた遺伝子の完全長のオープンリーディングフレームを含む 2 3 9 0 b pの B g 1 I I断片を、 p B I 1 0 1—Hmベクターに組み込んだ （名 古屋大学農学部中村研三先生より入手した） （図 6) 。 得られたベクターを p B I 1 0 1.— Hm— V S 1と称した。 この組換えべクタ一を用いて、 エレクトロポ 一レーシヨンにより、 5 OmgZ 1のカナマイシンおよびハイグロマイシンの選 択下で A g r o b a c t e r i u m t um e f a c i e n s EH A株 （名古 屋大学農学部中村研三先生より入手した） を形質転換した。 得られたァグロパク テリゥム株は、 使用するまで凍結保存した。
穂発芽変異体の種子を、 1 %の次亜塩素酸ナトリウムで殺菌し、 そして殺菌蒸 留水で 5回洗浄した。 この種子を、 3 %スクロース、 0. 3 gZ lカゼイン加水 分解物、 2. 8 gノ】のプロリン、 2. Omg 】の 2, 4— Dを添加し、 5· 0 1のゲルガムで固化させた N 6培地 （C h uら、 1 97 5、 S c i . S i n i c a、 1 8、 659— 668 ) 上に置いた。 なお、 培地 p Hはオートクレー ブ前に PH5. 8に調整した。 種子は、 28°Cで 3週間暗所で生育させ、 約 2m mの大きさの微小カルスを得た。 これを、 カルス誘導培地に移し、 4日間明所で 培養し、 ァグロパクテリゥム感染に用いた。
凍結保存した上記のァグロパクテリゥムを、 5 OmgZ 1のカナマシイン、 5 OmgZ 1のハイグロマイシンを含み、 pH7. 2に調整し、 1 5 gZ lの寒天 で固化した AB培地 （C h i 1 t o nら、 1. 9 74、 P r o c . Na t l . Ac a d. S c i . USA, 7 1、 3672— 36 76) で 22。C 3日間喑所で培養 した。 ァグロバクテリウム菌体を集め、 20 w gのァセトシリリンゴン （H i e i ら、 1 994、 P l a n t J . 、 6, 2 7 1 - 282) を含む液体 A AM培 地（H i e i、 1 994 P l an t s, 6 ： 27 1 - 282)に懸濁した。 得ら れた懸濁液を、 上記の誘導カルスと、 2 2 7日間喑所で同時インキュベーショ ンしァグロバクテリゥムを感染させた。 得られたカルスを 50 Omg/ 1のカル ペニシリンを含む液体カルス誘導培地で 5回洗浄し、 殺菌した Wh a t ma n No. 1濾紙上で乾燥させた。 このカルスを、 5 OmgZ 1ハイグロマイシンを 含む力ルス誘導培地で 3週間培養してハイグロマイシン耐性カルスを選択し、 3 O gZ lのスクロース、 30 gノ 1のソルビトール、 2 gZ〗のカゼイン加水分 解物、 2 g/ lのキネチン， 50 OmgZ 1のカルペニシリン、 5 OmgZ 1 の ハイグロマイシンおよび 5 1のゲルガムを含む pH 5. 8の MS基礎培地 （M u r a s h i g eおよび S k o o g. 1 962, Ph y s i o l . P l a n t. 、 1 5、 473 -497) を含む再生培地に移した。
形質転換体は、 オーキシンまたは N A Aを添加することなくハイグロマイシン を含む再生培地で容易に再生し、 土壌に移した。 形質転換体は， 穂発が変異体の 示すしおれ現象を示さず、 正常に生育した。 この結果から、 実施例 4で単離され た遺伝子の変異が穂変異の原因となっていると結論された。 よって、 この遺伝子 を VS 1遺伝子と命名した。
(実施例 5 ) VP 14様遺伝子のィネからの単離
上記に記載したように、 VP 14遺伝子は、 アブシジン酸合成の律速と考えら れている遺伝子であるが、 この遣伝子は現在までに卜ゥモロコシからしか単離さ れていない。 従って、 VP 4遺伝子をイネから単離するために、 トウモロコシ の VP 14と A r a b i d ο p s i sから単離された VP 14様遺伝子の保存配 列を、 遺伝子解析ソフト M a c V e c t o r 6. 0 (帝人システムテクノロジ 一） を用いて比較し、 保存配列を同定した。 この保存配列 2ケ所に対応する 4' 側プライマ一および 3' 側プライマーを調製した。 この 2つのプライマ一を使用 してイネの VP 14の増幅を行った。 用いた鎵型は、 乾燥処理 （葉を切り離し、 室温に 3時間放置） をしたイネの葉より RN Aを抽出し、 逆転写酵素 （TaKa R a) 処理により c DNA化したサンプルを用いた。 この PCRにより、 約 6. 0の産物が得られた。 この産物の部分配列を決定し、 トウモロコシの VP 14と 高い相同性 （85%) を示すことを確認した。 部分配列を図 7 (配列番号 5) に 示す。 以後、 この産物をプローブとして、 イネの VP 14様遺伝子の発現解析に 用いた。 正常のイネから抽出した DNAをサンプルに用いてサザンブロット分析 を行った場合、 5本のバンドが得られ、 イネには VP 14様遺伝子が少なくとも 5つ存在することが示唆された。
(実施例 6 ) V S 1遺伝子の機能解析
次に、 VS 1遺伝子が VP 14様遺伝子の発現を調節し得るかについて研究し た。 まず、 実施例 6で単離したイネの VP ].4様遺伝子をプローブとして用いて, ノーザンプロット分析を行った。 高湿度下および低湿度下で生育した正常系統お よび VS 1変異型イネから mRNAを、 I SOGEN (日本ジーン） を用いて単 離した。 この mRNAをァガロースゲル に I %) で分離し、 そしてナイロンメン ブレン （S c h i e i c h e r &S c h n e l 1 ) に吸着した。 次いで、 32 P — dCTPで標識した VP 14プローブを用いてサザンブロットを行った （S a mb r o o kら、 前出） 。 X線フィルムは Ko d a kから得た。 結果を図 5に示 す。 示されるように、 高湿度下では （図 8では一） 、 正常系統 （WT) 、 変異株
(V s 1) ともに、 VP 14の発現は見い出されなかった。 一方、 低湿度 （+ ) では、 正常系統 （WT) にサイズの異なる 2種類のバンド （2. O k bおよび 2. 5 k b) 力検出されたが、 v s 1変異株 （v s 1) では、 1つのバンドが消失し ていた。 従って、 VS 1は， VP ].4または VP 14様の遺伝子をダウンレギュ レートする遗伝子であると考えられる。
次に、 プライマー伸長を用いて、 プライマ一伸長法を使用して VS 1遺伝子の 発現を分析した。 プライマ一伸長法に用いたプライマーは、 VS 1遺伝子に対応 する TTCGAGTTTTTGTGTTAGGG (配列番号 6 ) で、 5 ' 末端を ポリヌクレオチドキナーゼ （T〇Y〇B〇） を用いて、 32P— τ— ATPで標 識した。 乾燥誘導処理をした葉、 または無処理の葉より RN Aを I S OGEN
(日本ジーン） を用いて調製した。 この RN Aを鍀型に配列決 ¾ゲル （S amb r o o kら、 前出） にのせ、 電気泳動後、 X線フィルム （Kod a k) に露光し た。 実験の詳細は、 H i r o c h i k a (EMBO J. 12. 2521 - 25 28, 1993) に従った。 結果を図 9に示す。 示されるように、 VS 1は、 乾 燥条件下でも高湿度下でも同程度に発現していることが明らかになつた。 上記の実施例は， 本発明の種々の局面、 および本発明の特定のオリゴヌクレオ ドがどのように作製され， および利用されるのかを例示して記載している。 本発 明の範囲を制限するものではない。 産業上の利用可能性 2734
植物育種に利用可能なアブシジン酸合成を制御し得る新規オリゴヌクレオチド が提供される。 当該オリゴヌクレオチドを植物に導入し、 アブシジン酸合成を制 御することにより、 乾燥耐性、 難穂発芽性のような有用な形質が付与された植物 が提供される。

Claims

請求の範囲
'酸合成を制御し得る植物遣伝子をコードするオリゴヌクレオチ ドであって、 配列表の配列番号 2の 1位の Mから ] 64位の Iまでのアミノ酸配 列をコードするオリゴヌクレオチド， または該アミノ酸配列において] もしくは 数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードするオリ ゴヌクレオチドを含む、 オリゴヌクレオチド。
2. イネ由来の、 請求項 1に記載のオリゴヌクレオチド。
3. 配列表の配列番号 1で示される、 請求項 1に記載のオリゴヌクレオチド。
4. VP 14様遺伝子の発現を調節し得る遺伝子をタンパク質をコードするォ リゴヌクレオチド。
5. 制御配列に作動可能に連結された請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のォ リゴヌクレオチドを含む、 ベクター。
6. pB I 101 -Hm-VS lである請求項 5に記載のベクター。
7. 請求項 5または 6に記載のベクターで形質転換された、 植物。
8. 植物におけるアブシジン酸合成の制御方法であって、 請求項】〜 5のいず れか 1項に記載のオリゴヌクレオチドを植物に導入する工程を包含する、 方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bao, C. T. et al., "Genetic control of abscisic acid biosynthesis in maize", Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997), Vol. 94, No. 22, pages 12235-12240. *
Burbidge, A. et al., "Characterization of the ABA-deficient tomato mutant notabilis and its relationship with maize Vp14", Plant Journal (Feb. 1999), Vol. 17, No. 4, pages 427-431. *
Elena M. et al., "Molecular identification of zeaxanthin epoxidase of Nicotiana plumbaginifolia, a gene involved in abscisic acid biosynthesis and corresponding to the ABA locus of Arabidosis thaliana", The EMBO Journal (1996), Vol. 15, No. 10, pages 2331-2342. *
Hirochika, H. et al., "Retrotransposons of rice: their regulation and use for genome analysis", Plant Molecular Biology (1997), Vol. 35, No. 1/2, pages 231-240. *

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