CN117987450A - 大豆GmESR1基因在调控植物蛋白质含量中的应用 - Google Patents
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了大豆GmESR1基因在调控植物蛋白质含量中的应用。本发明具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物蛋白质含量中的应用。本发明通过将GmESR1蛋白的编码基因导入到受体植物中，得到过表达GmESR1基因的转基因大豆植株，转基因大豆植株中蛋白质含量显著高于野生型大豆植株。本发明所提供的GmESR1蛋白及其编码基因在大豆蛋白质调控研究中具有重要的理论意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及大豆GmESR1基因在调控植物蛋白质含量中的应用。
背景技术
ESR1基因属于AP2/EREBP家族。该反应家族参与各种生物功能，贯穿植物的整个生长发育过程，并且还会响应高盐度、干旱等不利的环境信号。该转录因子家族属于植物特有，并且该转录因子包含不少于144个家族成员。
ESR1属于EREBP亚家族中的转录因子。ERF家族是AP2/ERF家族中最大的分支，成员包含一个或两个具有特定DNA结合基序的AP2/ERF结构域。AP2/ERF域和ESR基因中ESR特定基序之间的区域被认为是增强芽再生的必要区域。ESR1作为转录激活物质发挥作用。同时ESR1基因的ERF结构域(与细胞分裂素的诱导密切相关)与编码乙烯应答系统GCC box(GCCGCC)顺式作用元件专一结合，因此认为ESR1基因该转录区域可能在乙烯信号途径上。
在ESR1被发现之前，科学家已通过遗传学方法获得了许多影响拟南芥芽期的调节因子。如CYCD3、RD3、SRD1和SRD2在芽形成中扮演重要角色，CYCD3控制器官发生能力的获得，SRD3参与调控芽器官发生，SRD1和SRD2参与调控芽再分化。
有研究者通过对拟南芥cDNA文库的功能性筛选获得新的cDNA即ESR1(Enhancerofshoot regeneration1)，并对其功能进行研究。研究结果表明，在存在外源细胞分裂素的情况下，ESR1的过量表达可以极大程度的提高根外植体再生的效率。后续研究发现ESR1不仅在分生组织中心区的表达会影响外周区的器官发育，而且ESR1基因缺失会导致分生组织生长膨大，过量表达又会导致分生组织生长停滞进而不能进行后续分化，这表明ESR1可能通过促进分生组织的生长分化来促进芽再生。
有研究者提出ESR1促进茎尖分生组织结构的形成。同时发现与ESR1同源性较高的ESR2，二者在芽再生中的功能并不完全相同的。除此之外，ESR1和ESR2在茎尖胚胎区域协同调控胚胎后续区域形状结构的形成。形状结构形成后CUC、Shootmeristemless和Wusche基因才能表达。同时发现ESR1和ESR2也通过与BIM1基因相互作用促进拟南芥胚芽形状结构的形成。
ESR1基因也有促进诱导愈伤组织的作用。ESR1由WIND1激活并分级转录，进而调解伤口诱导的愈伤组织形成以及促进随后不定芽再生。在植物受到创伤后，WIND1(Woundinduced dedifferentiation1)通过激活细胞分裂素信号来促进愈伤组织在伤口部位的形成。WIND1过量表达的植物表现出体细胞胚胎发生，也促进了体外组织培养过程中的器官再生。
拟南芥ESR1基因超表达可以让根外植体在不需要细胞分裂素亦或微量细胞分裂素的培养基中能够发现有不定芽的产生，根外植体培养在添加过量的细胞分裂素的培养基条件下，拟南芥ESR1基因超表达的外植体也可以很大水平上提高不定芽的增生率。
由上述研究可见，目前关于ESR1基因的报导多与植物再生方面有关，关于品质方面的研究并未发现报道。大豆作为我国最重要的农作物之一，其品质对以大豆为原料的产业具有重要影响，如能研究ESR1基因对于大豆品质调控的影响，将为大豆品质的提升奠定一定的基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控或改善植物(如大豆)的蛋白质含量。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，所述应用为下述任一种：
D1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物蛋白质含量中的应用；
D2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物蛋白质含量的产品中的应用；
D3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育蛋白质含量改变的植物中的应用；
D4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育蛋白质含量改变的植物的产品中的应用；
D5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在改良高蛋白质含量品种或制备高蛋白质含量品种的产品中的应用；
D6)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的由A1)衍生的或与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质GmESR1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质GmESR1的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质GmESR1且具有蛋白质GmESR1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质GmESR1。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上文中，所述植物育种的目的可包括培育蛋白质含量改变的植物。所述蛋白质含量改变可为提高植物的蛋白质含量，也可为降低植物的蛋白质含量。所述蛋白质含量可为种子中的蛋白质含量、叶片中的蛋白质含量或茎中的蛋白质含量。所述蛋白质含量改变可通过改变所述蛋白质GmESR1的编码基因的表达量实现。
上述应用中，所述蛋白质GmESR1来源于大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)。
本发明还提供了与所述蛋白质GmESR1相关的生物材料的应用，所述应用为下述任一种：
E1)与所述蛋白质GmESR1相关的生物材料在调控植物蛋白质含量中的应用；
E2)与所述蛋白质GmESR1相关的生物材料在制备调控植物蛋白质含量的产品中的应用；
E3)与所述蛋白质GmESR1相关的生物材料在培育蛋白质含量改变的植物中的应用；
E4)与所述蛋白质GmESR1相关的生物材料在制备培育蛋白质含量改变的植物的产品中的应用；
E5)与所述蛋白质GmESR1相关的生物材料在改良高蛋白质含量品种或制备改良高蛋白质含量品种的产品中的应用；
E6)与所述蛋白质GmESR1相关的生物材料在植物育种中的应用；
所述生物材料为下述B1)至B8)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质GmESR1的核酸分子；
B2)抑制或降低或沉默所述蛋白质GmESR1的编码基因表达的核酸分子；
B3)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的表达盒；
B4)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B6)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B3)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B7)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B3)所述表达盒的转基因植物组织；
B8)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B3)所述表达盒的转基因植物器官。
上述应用中，B1)所述核酸分子为如C1)、C2)或C3)所示的所述蛋白质的编码基因：
C1)编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
C2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
C3)与C2)限定的cDNA或DNA分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
SEQ ID No.2所示的DNA分子(调控植物蛋白质含量变化的基因GmESR1)编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质GmESR1(大豆蛋白质含量变化相关蛋白GmESR1)。
SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为蛋白质GmESR1编码基因(CDS)的核苷酸序列。本发明所述的蛋白质GmESR1的基因(GmESR1基因)可以为任意能够编码蛋白质GmESR1的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
B1)所述核酸分子还可包括在SEQ ID No.2所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。
所述核酸分子还包括与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为pGWC载体和/或pEarley Gate101载体。
可用现有的植物表达载体构建含有GmESR1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用GmESR1基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的GmESR1基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得蛋白含量增加的转基因细胞系及转基因植株。携带GmESR1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)等。具体可为大肠杆菌DH5α和/或根癌农杆菌EHA105。
所述重组载体具体可为重组载体pEarley-GmESR1。所述重组载体pEarley-GmESR1是将pEarley载体的attR1位点和attR2位点间的片段替换为attB1-GmESR1-attB2，保持pEarley Gate101的其它核苷酸不变得到的重组表达载体。重组载体pEarley-GmESR1表达SEQ ID No.1所示的蛋白质GmESR1。
本发明还提供了一种培育蛋白质含量增加的植物的方法，所述方法包括提高目的植物中所述蛋白质GmESR1的含量和/或活性，得到蛋白质含量强于所述目的植物的蛋白质含量的植物。
上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质GmESR1的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质GmESR1的编码基因的表达量实现。
上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质GmESR1的编码基因的表达量通过将所述蛋白质GmESR1的编码基因导入所述目的植物实现。
上述方法中，所述蛋白质GmESR1的编码基因可为下述任一种：
H1)编码序列是SEQ ID No.2的DNA分子；
H2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。
具体地，在本发明的一个实施方案中，所述提高目的植物中所述蛋白质IbPRX42的编码基因的表达量通过将SEQ ID No.2所示的DNA分子导入所述目的植物实现。
在本发明的一个实施方案中，所述培育蛋白质含量增加的植物的方法包括如下步骤：
(1)构建包含SEQ ID NO.2所示DNA分子的重组表达载体；
(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入目的植物(如作物或大豆)中；
(3)经筛选和鉴定获得蛋白质含量高于所述目的植物(野生型)的蛋白含量的植物。
所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化，生物射弹(biolistic)方法，电穿孔，in planta技术，等等导入。
本发明中，所述蛋白含量改变的植物理解为不仅包含将所述GmESR1基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述抗逆植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明还提供了一种调控植物蛋白质含量的方法，所述方法包括通过调控所述蛋白质GmESR1的编码基因的表达或调控所述蛋白质GmESR1的活性或含量，来调控植物蛋白质含量。
上述方法中，所述调控所述蛋白质GmESR1的编码基因的表达包括增加目的植物中所述蛋白质GmESR1的编码基因的表达量或降低目的植物中所述蛋白质GmESR1的编码基因的表达量。
具体的，所述增加目的植物中所述蛋白质GmESR1的编码基因的表达量包括将GmESR1过表达载体转化入目的植株，所述降低目的植物中所述蛋白质GmESR1的编码基因的表达量包括将目的植株中的GmESR1基因沉默或敲除。
上述方法中，所述调控所述蛋白质GmESR1的活性或含量包括增加目的植物中所述蛋白质GmESR1的表达量或降低目的植物中所述蛋白质GmESR1表达量。
本文中，所述植物为下述任一种
G1)单子叶植物或双子叶植物；
G2)豆科植物；
G3)大豆属植物；
G4)大豆组植物；
G5)大豆。
所述蛋白质，和/或，所述核酸分子也在本发明的保护范围内。
本文中，所述蛋白质含量可通过凯氏定氮法、燃烧氮法、染料结合法、紫外光度法和近红外谷物分析仪测定法等，具体为通过凯氏定氮法测得的蛋白质含量。
本发明所提供的GmESR1基因编码的蛋白与植物再生相关，将该基因导入大豆中，得到过表达GmESR1基因的转基因大豆植株，转基因大豆植株中蛋白质含量显著高于野生型大豆植株。本发明所提供的GmESR1蛋白及其编码基因在大豆蛋白质调控研究中具有重要的理论意义和应用价值。
附图说明
图1为4个T6代纯合转化子(4-17，4-18，4-21，4-24)和对照DN50中Bar基因PCR扩增检测结果。
图2为转GmESR1基因大豆中GmESR1表达量分析。
图3为Western Blotting杂交检测转GmESR1基因大豆中Bar蛋白的表达情况。
图4为转GmESR1基因大豆蛋白和油分含量分析。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
大豆东农DN50：也称东农50，由东北农业大学于1950年培育的“小粒黄大豆”，该品种茎秆粗壮，抗倒伏能力极强，参考文献《优良大豆新品种“东农50-6431”的简单介绍》
pGWC：pGWC载体由大豆生物学教育部重点实验室大豆遗传改良团队所保存。序列信息如下：
gatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatatagctgcaggacctaaagtctctagacccagctttcttgtacaaagttggcattataagaaagcattgcttatcaatttgttgcaacgaacaggtcactatcagtcaaaataaaatcattatttgccatccagctgcaggccctatagtgagtcgtattaccgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctctcatgagtggacataagcctcgttcggttcgtaagctgtaatgcaagtagcgtaactgccgtcacgcaactggtccagaaccttgaccgaacgcagcggtggtaacggcgcagtggcggttttcatggcttcttgttatgacatgtttttttggggtacagtctatgcctcgggcatccaagcagcaagcgcgttacgccgtgggtcgatgtttgatgttatggagcagcaacgatgttacgcagcagggcagtcgccctaaaacaaagttaaacatcatggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggagttccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcacaatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaatttttttaaggcagttattggtgcgatcctctagctagaaattcgttcaagccgacgccgcttcgccggcgttaactcaagcgattagatgcactaagcacataattgctcacagccaaactatcaggtcaagtcccgcggagttgttcggtaaattgtcacaacgccgcccgccccgttccactgagcgtcagacccggtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgctagcatggatctcggggacgtctaactactaagcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcggaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgtgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccaggcatcaaactaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactcttcctgttagttagttacttaagcgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgcatacgatttaggtgacactatagaagggccccaaataatgattttattttgactgatagtgacctgttcgttgcaacaaattgataagcaatgcttttttataatgccaactttgtacaaaaaagcaggctttgactttaggtccggccggcttactaaaagccagataacagtatgcgtatttgcgcgctgatttttgcggtataagaatatatactgatatgtatacccgaagtatgtcaaaaagaggtgtgcttctagaatgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggcgacggatagt
pEarley Gate101：pEarley Gate101载体来源于上海联迈生物工程有限公司，货号LM-8134。
下述实施例采用SPSS 16.0(SPSS Inc,Chicago,IL,USA)统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异。
实施例1 GmESR1蛋白在调控大豆品质中的应用
1、GmESR1基因全长序列扩增
GmESR1基因来源于大豆，其编码氨基酸序列是SEQ ID No.1所示的蛋白质。SEQ IDNo.1如下：
MRRLNGVAPIIGPDSKGDGGLIANNPKRTSAVNKRALREDGGGGGGGGAMRYRGVRRRPWGRYAAEIRDPQSKERRWLGTFDTAEEAACAYDCAARAMRGLKARTNFVYPTSPQPSSATTEHLFPNFNNNNNFHKHSLFNHHRNRHITGSNTCFDHPHSVDFSAPRNPSSLNMLLFRDLIHSNPSLLSSSSTQNFHDQFYNKSTSTFSSLPVSPSLAPPSYSMNNSCGGSLSVKMNTFPTCGTNFAEKGDDGDGFFSRESSDSGLLEEIVNKFLPRTKPSKCETTFANPQEESLLLPPLVSESTLVSTGQQYYDDDMKKGFPKNEGLGVFYSDQGFPMQQFDTPNGFNSMAMENDQNIINNAENCVIEDVFQYQELLNAFAIRMQNA
GmESR1基因编码序列(CDS)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：
ATGAGGCGTCTCAACGGGGTAGCTCCGATTATCGGACCCGACTCGAAAGGCGACGGTGGACTCATCGCCAATAACCCGAAACGGACCTCGGCCGTGAACAAGAGGGCTTTAAGAGAAGACGGCGGCGGTGGTGGCGGCGGCGGAGCGATGAGGTACCGCGGCGTGAGGCGCAGGCCGTGGGGGCGTTACGCGGCGGAGATAAGGGACCCTCAATCGAAGGAGCGGCGATGGCTGGGAACCTTCGACACGGCGGAGGAAGCCGCTTGCGCCTACGACTGCGCTGCTAGAGCCATGAGGGGTCTCAAAGCTCGCACCAACTTCGTTTACCCAACTTCTCCGCAACCTTCTTCCGCCACCACCGAACACTTGTTCCCTAACTTCAACAACAACAACAACTTTCACAAACACTCACTCTTCAATCACCACCGTAACCGCCACATAACCGGTTCCAACACTTGTTTTGACCACCCTCACTCCGTTGACTTTTCAGCCCCTCGAAACCCTTCTTCTCTCAACATGCTTCTCTTTCGTGACCTTATTCACTCTAACCCTTCTTTGCTTTCTTCTTCTTCCACTCAGAACTTCCACGACCAGTTTTACAACAAGAGTACTTCTACTTTTTCATCGTTACCTGTTTCTCCTTCTCTTGCTCCCCCTAGTTATTCGATGAATAATTCTTGTGGAGGCTCTTTGTCTGTTAAGATGAACACGTTTCCCACTTGTGGAACTAATTTTGCTGAAAAAGGTGATGATGGTGATGGTTTTTTCTCTCGTGAGTCTTCGGATTCGGGGTTGTTGGAGGAGATAGTTAACAAGTTCTTGCCTAGAACGAAGCCTAGTAAATGCGAGACTACTTTTGCAAATCCTCAGGAGGAGTCGCTTCTTCTCCCTCCGCTTGTTTCTGAATCAACGCTTGTTTCCACCGGGCAACAATACTATGATGATGACATGAAAAAAGGGTTTCCAAAGAACGAGGGTCTAGGTGTTTTTTATTCTGATCAAGGTTTTCCCATGCAGCAATTCGACACCCCTAATGGGTTTAATAGCATGGCTATGGAGAATGATCAAAACATTATTAATAATGCAGAGAACTGTGTCATTGAAGATGTTTTTCAGTACCAAGAGCTTCTTAATGCTTTCGCAATCAGAATGCAAAATGCTTAA
2、构建植物表达载体
提取大豆东农50(DN50)的总RNA，用逆转录酶反转录合成cDNA，以该cDNA为模板，利用引物：5’-ATGAGGCGTCTCAACGGGGTAGC-3’和5’-GCAGCATTTTGCATTCTGATTGCG-3’PCR扩增GmESR1基因的CDS，得到PCR产物，将该PCR产物回收后用TA克隆的方式连接到用AhdI酶切后的入门载体pGWC中，得到将GmESR1基因的CDS插入pGWC的attL1和attL2之间的重组载体，命名为pGWC-GmESR1。
再将pGWC-GmESR1通过LR反应与目的载体pEarley Gate101进行同源重组，得到pEarley-GmESR1。pEarley-GmESR1是将pEarley Gate101载体的attR1位点和attR2位点间的片段替换为attB1-GmESR1-attB2，保持pEarley Gate101的其它核苷酸不变得到的重组表达载体。
3、制备重组农杆菌
将pEarley-GmESR1用电击法导入根癌农杆菌LBA4404，得到含有pEarley-GmESR1的重组农杆菌LBA4404/GmESR1。
4、转化
采用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法(Paz MM,Martinez JC,Kalvig AB,Fonger TM,Wang K.Improved cotyledonary node method using an alternativeexplant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybeantransformation.Plant Cell Rep.2006Mar；25(3):206-213)，将重组农杆菌重组农杆菌LBA4404/GmESR1转化大豆东农50(DN50或野生型大豆)。对获得的转化植株用100mg/L的草铵膦除草剂涂抹叶片筛选，得到T0代大豆转化材料4-17、4-18、4-21、4-24。鉴定为阳性转化植株后种植于温室加代，温室条件为25℃，16hr光照/8hr黑暗。T6代纯合转基因株系(转GmESR1基因大豆株系4-17、4-18、4-21、4-24，或简称为T6代转基因株系4-17、4-18、4-21、4-24)用于温室种植、农艺性状调查。
5、GmESR1基因PCR扩增检测
由于GmESR1基因为大豆内源基因，PCR扩增技术无法区别转入基因与内源基因，故通过PCR检测Bar基因是否存在于DN50基因组中，从而鉴定GmESR1基因是否存在于DN50基因组中。利用CTAB法分别提取T6代纯合转基因株系(T6代转基因株系4-17、4-18、4-21、4-24)及对照DN50大豆(CK)叶片基因组DNA，以该基因组DNA为模板，利用表1中的Bar-F和Bar-R为引物通过PCR扩增Bar基因，PCR反应条件为95℃3min；35个循环：95℃30s,56℃15s,72℃15s；72℃5min。
PCR扩增检测结果如图1所示，从左至右依次为Marker(泳道1，图1中标注为M)、阴性对照(泳道2，水，图1中标注为1)、T6代纯合转基因株系4-17(泳道3，图1中标注为2)、T6代纯合转基因株系4-18(泳道4，图1中标注为3)、对照DN50(泳道5，图1中标注为4)、T6代纯合转基因株系4-21(泳道6，图1中标注为5)、T6代纯合转基因株系4-24(泳道7，图1中标注为6)。由图1可知，4个纯合转化子在366bp处均有条带，而CK(泳道5)和水(泳道2)没有条带，即4个T6代纯合转化子(T6代纯合转基因株系4-17，4-18，4-21，4-24)中均有Bar基因，由此可见，GmESR1基因成功转入T6代纯合转基因株系中。
6、GmESR1基因qRT-PCR检测
利用TRIzol试剂(Invitrogen)分别提取T6代转基因株系4-17、4-18、4-21、4-24和野生型大豆DN50根、茎和叶总的RNA。使用II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNAwiper)进行反转录得到cDNA。采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)试剂盒以cDNA为模板，利用表1中的RTGmESR1-F和RTGmESR1-R进行定量PCR扩增GmESR1基因。以Actin4基因作为内参基因，利用表1中的Actin4-F和Actin4-R进行定量PCR扩增Actin4基因。荧光定量反应混合液含有2*ChamQ Universal SYBR qRCR 10μl，上下游引物0.5μM，cDNA模板1μl(相当于100ng的RNA)，加ddH2O至总体积为20μl。采用罗氏荧光定量PCR仪进行实时定量反应，实时定量反应程序：95℃5min；95℃10s，62℃30s，72℃30s，40个循环；溶解曲线，95℃5s，65℃1min，97℃30s；4℃，冷却。对得到的CT值采用2-△△CT方法计算，比较GmESR1基因在T6代转基因株系4-17、4-18、4-21、4-24和野生型大豆DN50中的表达差异。每一个样品进行三次独立的生物学重复，每次进行三次技术重复。所有的引物显示在表1中。
表1 PCR和实时定量PCR引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| Bar-F | 5’-ATATCCGAGCGCCTCGTGCAT-3’ |
| Bar-R | 5’-GGTCTGCACCATCGTCAACCACT-3’ |
| RTGmESR1-F | 5’-CTTCCACTCAGAACTTCCACGAC-3’ |
| RTGmESR1-R | 5’-TAACAGACAAAGAGCCTCCACAA-3’ |
| Actin4-F | 5’-GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT-3’ |
| Actin4-R | 5’-GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA-3’ |
结果如图2所示，T6代转基因株系4-18的根中GmESR1基因表达量显著高于DNA50(*，P<0.05)，T6代转基因株系4-21的根中GmESR1基因表达量极显著高于DNA50(**，P<0.01)。T6代转基因株系4-17的茎中GmESR1基因表达量极显著高于DNA50(**，P<0.01)。T6代转基因株系4-17、4-18、4-21和4-24的叶中GmESR1基因表达量均极显著高于DN50(**，P<0.01)。由此可见，GmESR1基因在苗期根、茎、叶中均有表达，且与对照DN50相比有不同程度的增加。
7、转基因大豆植株western boltting检测
先分别提取T6代转基因株系4-17、4-18、4-21、4-24和野生型大豆DN50新鲜叶片组织蛋白，用液氮研磨大豆新鲜叶片，取50-100μg粉末，加50μL蛋白提取Buffer，剧烈震荡混匀；13000rpm 4℃离心10分钟，取上清至新管；99℃恒温孵育3分钟；取上清点样；按下表配置浓缩胶和分离胶。
表2 Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶制备
点样，调整电压至90V，跑1个小时45分钟，卸胶；对电泳后凝胶进行转膜，用100V电压转膜1小时；转膜完成后，将PVDF膜取出后放于20mL5％脱脂牛奶溶液中，于摇床上封闭处理1小时；取出PVDF膜，加入用5％脱脂牛奶溶液稀释后的一抗(抗Bar蛋白的抗体)，于室温结合1h。用TBST清洗30min，每隔6min清洗一次；将反应后PVDF膜加入稀释后的二抗，于室温结合1h。清洗PVDF膜；将膜吸干后加入AB液避光反应3min后，吸干后，用化学发光成像仪进行成像分析。
由于GmESR1基因为大豆内源基因，Western Blotting实验不能单独检测出外源基因表达的蛋白。故用Bar蛋白的抗体，对T6代转基因株系4-17、4-18、4-21、4-24和野生型大豆DN50进行Western blotting实验，通过分析Bar蛋白是否在转基因大豆中表达蛋白，进而分析GmESR1基因能否在转基因大豆中表达蛋白。
结果如图3所示，从左至右依次为Marker(泳道1，图3中标注为M)、CK(泳道2，野生型大豆DN50，图3中标注为CK)、T6代转基因株系4-17(泳道3，图3中标注为17)、T6代转基因株系4-18(泳道4，图3中标注为18)、T6代转基因株系4-21(泳道5，图3中标注为21)、T6代转基因株系4-24(泳道6，图3中标注为24)。由图3可见，转GmESR1基因大豆植株中，T6代转基因株系4-17、4-18、4-21、4-24这四个株系的外源标记基因Bar基因在T6代转基因株系中获得了蛋白水平的表达，而野生型大豆DN50(受体DN50)植株中没有表达Bar蛋白。综上，说明转GmESR1基因大豆植株(T6代转基因株系4-17、4-18、4-21、4-24)中表达了标记基因编码的蛋白，进而证明外源转入GmESR1基因在转基因株系(T6代转基因株系4-17、4-18、4-21、4-24)中也表达了GmESR1蛋白。
8、蛋白质含量和油分含量测定
将T6代转基因株系4-17、4-18、4-21、4-24和野生型大豆DN50于2020年5月20日在东北农业大学转基因基地进行播种。播种方式为穴播，四种株系随机排列种植，每种株系设置三个重复，每个重复种植3行。行距0.4m，穴距0.2m，每穴定苗2株，每行共24株苗。待植株成熟时，每个重复随机取除边株外的10株，按照通过凯氏定氮法测定蛋白质含量，同时也利用近红外谷物分析仪测定法蛋白质和油分含量。
利用近红外谷物分析仪对各转基因植株和对照DN50的籽粒进行了蛋白质含量检测。具体操作方法和各参数如下：
结果如图4所示，在蛋白质含量上，4个转基因株系(4-17、4-18、4-21、4-24)均比对照DN50显著增高(**，P<0.01)。
凯氏定氮法测定蛋白质含量：取0.3g左右大豆籽粒于消化管中，加入催化剂(高效凯氏定氮催化剂片，北京金元兴科科技有限公司)2片、浓硫酸15mL，在420℃下消化1～1.5h，至消化液澄清为止。用半自动定氮仪(Kjeltec TM 2100，FOSS，Danmark)蒸馏5min，用标准盐酸溶液滴定硼酸吸收液。同时做试剂空白对照。计算大豆粗蛋白含量。
结果显现，过表达GmESR1基因后的转基因植株的蛋白质含量极显著高于对照DN50(P<0.01)。
表3凯氏定氮法所测蛋白质含量
| 品种 | 蛋白质含量(％) | 增加百分比(％) |
| CK | 42.49±0.16 | - |
| 4-17 | 46.42±0.29** | +9.24 |
| 4-18 | 47.83±0.21** | +12.57 |
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
D1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物蛋白质含量中的应用；
D2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物蛋白质含量的产品中的应用；
D3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育蛋白质含量改变的植物中的应用；
D4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育蛋白质含量改变的植物的产品中的应用；
D5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在改良高蛋白质含量品种或制备高蛋白质含量品种的产品中的应用；
D6)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的由A1)衍生的或与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质来源于大豆。
3.与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
E1)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在调控植物蛋白质含量中的应用；
E2)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在制备调控植物蛋白质含量的产品中的应用；
E3)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在培育蛋白质含量改变的植物中的应用；
E4)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在制备培育蛋白质含量改变的植物的产品中的应用；
E5)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在改良高蛋白质含量品种或制备改良高蛋白质含量品种的产品中的应用；
E6)与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用；
所述生物材料为下述B1)至B8)中的任一种：
B1)编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；
B2)抑制或降低或沉默权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
B3)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的表达盒；
B4)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B6)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B3)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B7)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B3)所述表达盒的转基因植物组织；
B8)含有B1)和/或B2)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B3)所述表达盒的转基因植物器官。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，B1)所述核酸分子为如C1)、C2)或C3)所示的所述蛋白质的编码基因：
C1)编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
C2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
C3)与C2)限定的cDNA或DNA分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cDNA分子或DNA分子。
5.一种培育蛋白质含量增加的植物的方法，其特征在于，所述方法包括提高目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性，得到蛋白质含量强于所述目的植物的蛋白质含量的植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量实现。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量通过将权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现。
8.一种调控植物蛋白质含量的方法，其特征在于，所述方法包括通过调控权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达或调控所述权利要求1或2中所述蛋白质的活性或含量，来调控植物蛋白质含量。
9.根据权利要求1-4中任一所述的应用，和/或，权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于，所述植物为下述任一种
G1)单子叶植物或双子叶植物；
G2)豆科植物；
G3)大豆属植物；
G4)大豆组植物；
G5)大豆。
10.权利要求1或2中所述蛋白质，和/或，权利要求3或4中所述核酸分子。
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