KR0184691B1

KR0184691B1 - 다양한 씨디44 표면단백질, 이 단백질을 코딩하는 디엔에이 서열, 이 단백질에 대한 항체와 진단과 치료의 용도

Info

Publication number: KR0184691B1
Application number: KR1019920702741A
Authority: KR
Inventors: 피터 헤르리치; 헬무트 폰타; 우르슐라 군테르트; 쉬그프레드 마투주쿠; 아키임 웬젤
Original assignee: 페터 가트로브; 케른포르쉐젠트룸 칼스루히 게엠베하; 토마스 게링; 유니버시타트 칼슈; 하랄트 하우젠; 도이취스 크레브스포르쉐젠트룸; 레인하트 구른발트
Priority date: 1990-05-07
Filing date: 1991-03-30
Publication date: 1999-04-01
Also published as: IE911526A1; DE4014510A1; DE59101889D1; IL134982A0; NO20001668D0; ZA913389B; IE62096B1; PT97574A; CA2082382A1; CA2082382C; EP0531300A1; IL134982A; AU646858B2; US5506119A; BR1100650A; YU79491A; NO20001668L; NO310661B1; NO317154B1; HU218905B

Abstract

본 발명은 다양한 DC44 표면 단백질에 관계한다. 이 단백질의 다양한 결정부위에 대한 항체와 이들의 생산과정과 이 단백질을 코드하는 cDNA 서열과 이단백질에 대한 용도와 종양 전이의 진단과 치료를 위한 단백질에 관계한 항체에 관계한다.

Description

변이주 CD44 표면단백질, 이 단백질을 코딩하는 DNA 서열, 이 단백질에 대한 항체와 진단과 치료의 용도.

제1도는 쥐-pMeta-1 표면 단백질의 제한요소 절단 부위와 항체 결합 부위를 나타낸다.

제2도는 CD44 단백질의 pMeta-1 DNA의 총서열이다.

제3a도는 cDNA와 세포의 부분의 단백질 서열이다 제3b도는 쥐(rMeta-1), 사람(hCD44)과 쥐(mCD44)의 세포의 부분에서의 표면 단백질의 서열이다.

제4도는 CD44에서 유도된 RNA 패턴이다.

제5도는 pMeta-1의 코팅 부위이다.

[구체예]

세포와 항체

연구를 목적으로 다음의 Bsp 세포주를 이용하는데; Matzku et al., (1983)에서 상술한 것과 같이 Bsp73 14 ASML-1과 10AS-7를 배양물에 유지시키고 : Neri et al., (1982)에서 상술한 것과 같이 포유류 종양 세포주를 유지시키고 : Balb C 쥐에 항원을 투여하여 BSp73ASML 막단백질에 대한 단클론 항체를 생산한다. 면역처리된 쥐의 지라세포를 분리한 후, Kohler(1981)의 단클론 항체 생산 방법에 따라 불사화(immortalization)를 위해 Ag8 골수종 세포와 융합시켰다. 수득된 하이브리도마 세포는 BSp73ASML에 대해 특이항체를 만드나 BSp73AS와 정상적인 쥐 섬유아세포에 대해서는 특이항체를 만들지 않는 것을 찾기 위해 스크린 과정을 한다. 정확한 과정은 Matzku et al(1989)에 설명되어 있다.

특이성을 가지는 단클론 항체(mAb)를 생산하는 하이브리도마 세포는 조직 배양물에서 연장시키고, mAb는 암모니움 설페이트 침전에 의해 농후된 배지로 방출되고 이 항체는 연구에 이용된다. 그중 하나가 mAb1.1.ASML이다.

면역형광법

상이한 종양세포에서 변이주 CD44 분자를 나타내기 위해, 배양물에서 수득하여, 인산-완충염 용액(PBS)으로 세척하고, 40℃에서 30분간 1.1ASML로 배양시켰다. 결합을 감지하기 위한 제2항체로 로다민 결합된 토끼-항-쥐 IgG를 사용하여 형광 현미경으로 관찰한다.

cDNA 발현 벡터 작성과 면역-스크리닝

BSp73ASML 세포의 Poly A+ RNA는 올리고 dT와 상이한 성분물의 헥사뉴클레오티드로 프라임시키고 cDNA 제1가닥의 AMV에서 역전사하여 합성한다. cDNA의 제2가닥은 대장균 (E. coli) DNA 중합효소 I, RNaseH와 대장균 (E. coli) 리게이즈(ligase)를 사용하여 만든 후, T4 DNA가 단부에 있는 2중가닥 cDNA는 선형화한다. 3개의 다른 리딩 프레임을 가지는 cDNA를 융합시킬 수 있는 가능한 벡터 pEX1, pEX2, pEX3(Stanley and Luzio, 1984)를 SmaI 제한효소로 절단시키고, cDNA(T4 DNA 리게이즈)로 결찰시킨다. 온도-민감성 억제자를 만드는 컴피턴스(competent) 대장균 (E. coli) DH5(pCI857)에 pEX-cDNA를 전이감염시키고, 나일론 필터에서 배양시킨다. 온도 민감성 억제자 RCI857 pCI857에 있는데 이 플라스미드는 pEX 플라스미와 양립할 수 있다. 28℃에서, 융합단백질의 합성을 조절하는 IP^R프로모터는 비활성화된다. 온도를 42℃로 상승시킴에 따라 CI 억제자는 비활성화되고, β 갈락토시다제/ASML 융합 단백질의 합성은 활성화된다. 열에 의해 유도된 박테리아 콜로니는 필터에서 클로로포름 기체로 변성시키고, 3% 건유분말, 라이소자임과 DNase를 포함하는 PBS 에서 배양시킨다. 나일론 필터에 고정된 박테리아성 융합단백질은 mAb1.1ASML와 함께 배양시켜, 비-특이적으로 결합된 mAb를 세척해낸 후, 제2항체 125J-라벨된 토끼 항-쥐 IgG의 결합을 감지하는데 사용된다. 방사능 사진을 찍은 후, 고유 박테리아 필터에서 양성클론을 분리하여 분석한다. 1.1ASML과 특이적으로 반응하는 융합 단백질을 합성하는 클론은 pEX34이다. 박테리아 클론에 포함된 pEX는 167개 뉴클레오티드로 구성된 cDNA를 가지는데, 이는 mAb1.1ASML에 의해 특이적인 에피토프를 인코드한다. 표준 기술 방법에 따라 전체길이 cDNA mMeta-1를 분리한다.

쥐에 mAbl.lASML를 면역주사한다.

Bsp73 종양세포와 동질 유전자를 가지는 BDX 쥐에 컴플리트 퓨루운트 어쥬번트(complete Freund adjuvant)와 함께 mAb1.1ASML(Keyhole limpet 헤모시아닌이 결합된)를 피하 또는 복강내로 주입하였다. BSpASML 세포 주입전 3,7,10일과 주입후 3,7,11,14,21일에 실시하였다. 28일후 쥐를 죽이고 다양한 임파절을 취하여 무게를 달고 육안으로 폐 전이를 헤아린다.

변이주 CD44 표면 단백질의 발현과 전이 가능성 사이의 상관 관계

변이주 CD44 당단백질의 발현이 단순히 BSp73ASML 세포주의 특성으로 인한 것인지 또는 전이가능성과 연관이 있는지를 확실히 하기 위해 13762 NF 포유류 육종(Neri et al., 1982)에서 유도된 쥐 종양 세포를 조사하였다. 더욱이, 일차 종양(MTPa, MTC, MTF7 과 MTA(제1그룹))에서 유도된 세포주를 임파절과 폐 전이(MTLy, MTLn2, MTLn3(제2그룹))에서 유도된 세포주와 비교하였다. CD44에서 유도한 RNA 패턴은 도면 4에 나타내었고, 이 때, 샘플 A, B, D는 본 출원서 페이지 5, 6과 도 1에 상술된 샘플에 상응한다. 제1그룹의 모든 세포는 샘플 B의 정상적인 CD44 패턴을 나타내었다. 그러나, 제2그룹의 세포는 상이한 패턴을 나타내었다. RNA는 제1그룹의 RNA보다 크고, BSp73ASML의 RNA와 상응한다. 작은 RNA는 샘플 D와 하이브리드하는 경우에 소실된다. 다른 패턴은 두 가지 쥐 종양 시스템 사이에 유사성을 나타낸다.

샘플 A와 같이, 제2그룹의 RNA 패턴은 BSp73ASML의 RNA 패턴에 상응한다. 샘플 A는 BSp73AS의 RNA와는 하이브리드하지 않고 제1그룹의 세포 경우에는 약 2.5kb의 작은 확산 RNA 밴드가 나타난다. RNase와 SI 보호분석에 다르면 구조상 유사성이 나타난다. 이러한 결과로부터 절단형 패턴과 변이주 CD44 RNA의 발현에서 교환으로 전이형성이 되는 것을 알 수 있다.

pMeta-1 과발현에 의해 비-전이성 BSp73AS 세포에 전이 가능성이 전달된다.

쥐 종양에서 변이주 CD44 종과 전이가능성의 관계에서 전이과정에서 당단백질이 원인을 제공하는 역할을 하는 것으로 보인다. 이 점을 연구하기 위해, pMeta-1을 BSp73AS 세포로 전이하고, 세포의 거동(behaviour)이 변하는 지를 조사한다. SV40 프로모터 아래에 pMeta-1의 완전한 코딩부분(도면 2)을 삽입하고 이것을(도면 5) PSV2neo이 있는 BSp73AS 세포에 도입시켰다. G418-저항성 콜로니와 pMeta-1-발현 콜로니를 각각 얻었다. 이들 콜로니의 RNA의 패턴은 도면 5에 나타내었다. 변이주 CD44-특이적 샘플 A의 하이브리드 반응에서 BSp73ASML 세포에서 전사된 가장 최소 tRNA 크기에 상응하는 약 2.2kb의 우성 전사체가 나타난다(제5도). 그러나, 감염된 세포는 BSp73ASML의 RNA 양에 약 10배를 가지고 있다.

형질감염된 세포 중 하나에서 크기(BSp73AS-pSVMeta-1-14)가 다른 것이 보이는데, 플라스미드 삽입위치에 따라 달라짐을 볼 수 있다. pSVneo 시뮬레이션은 클론을 옮기고 BSp73AS 수용 세포는 샘플 A에 상보적인 RNA를 포함하지 않는다. 전이체에서 내생(endogenic) 정상 CD44 전사체(pSVMeta-1의 엑스트라 도메인이 없는)를 발견하기 위해, 필터를 벗기고, 샘플 D와 다시 하이브리드시킨다. 전사 안되는 3' 서열은 발현 클론에 포함하고 있지 않다(제5도). 샘플 D에서 두개의 감염(도면 5, 오른쪽 컬럼) 즉 기준 BSp73AS와 BSp73ASpSVneo에서 2.9kb와 4.9kb 전사체를 볼 수 있다.

하이브리드반응의 정량분석에 따르면, 전이체는 변이주 CD44 RNA 양에 약 5배로 정도로 발현시키는데, 이는 내생 유전자 전사체로써 발현 플라스미드에 의해 전사된다.

과다발현된 cDNA는 단백질로 옮겨진다. 도면 5에서 설명한 것과 같이, 두 개의 감염체는 의견상 동일한 크기의 즉, 주 생성물인 150kDa과 옅은 밴드인 100kDa를 가지는 mAbl-면역-착색단백질을 합성한다. cDNA 서열은 약 503개 아미노산(약 60,000 달톤에 상응하는) 1차 단백질을 코드하기 때문에, 실제 보이는 모든 밴드는 변형된 형태를 나타낸다. 150kDa 밴드는 전이성 세포 BSp73ASML에서 발현되는 변형된 변이주 CD44 중 하나와 함께 이동하게 된다. BSp73AS 또는 모의 전이된 BSp 73ASpSVneo는 이 단백질을 소유하지 않는다. BSp73ASML 세포에서는 감염체에 의해 발현되는 세포의 에피토프는 세로표면에 자유롭게 배치되어 있다.

변이주 CD44의 발현으로 BSp73AS 세포에 전이 가능성을 부여할 수 있는 가를 설명하기 위해, 감염체를 동질유전성 BDX 쥐(자발적 전이 프로토콜)에 주입하였다. 초반 실험에서, 전이성 종양 세포 BSp73ASML은 주입부분으로부터 신속히 번지고, 주입 후 10일쯤 완전히 퍼졌다(Matzku, 1984). 그러므로 모든 국부 종양은 10일경에 절단에 의해 제거되었다. 과발현되는 감염체를 주사한 모든 동물과 BSp73ASML 세포의 캐리어에서 폐 전이를 형성되었다(표 1). 전이 형성 과정은 주입 후에 5-8주 내에 비교적 신속하게 진전된다. 이 시간 이후, BSp73AS 세포 또는 의태성 감염체를 제공받은 동물은 완전히 건강을 회복하고(절단의 경우와는 별도로) 5달이 지나도 전이는 없었다.

강한 전이형성에 놀라운 유사성에도 불구하고, 몇 가지 흥미로운 차이점이 있다. 모든 동물에서 BSp73ASML 세포는 임파절에 도달하고 서혜부와 대동맥 부분에 각종 선의 대량 확대를 유도한다(표 1). 모든 동물에 폐 전이가 진행중일지라도 8마리 동물 중 3마리에서 감염체(BSp73AS-pSVneta-1-14)로 인해 임파절이 확대된다(표 1). 다른 감염체(BSp73AS-pSVMeta-1-15)에서는 임파선 확장이 없었다. 그러므로, 감염체는 임파절의 성장 단계없이 폐에서 콜로니를 형성시킬 수 있는 것으로 보인다.

표 1에 따른 실험에서는 BSp73AS 감염체와 BSp73ASML 사이에 또 다른 차이점을 지적한다. 각각의 폐 전이는 눈으로 확인할 수 있는데 비해 BSp73ASML의 전이는 작고, 수가 많으나, BSp73ASML 시리즈에서는(Reber et al., 1990) 20마리 동물 중 11마리에서 감염체보다 폐당 2-20 더 큰 임파절을 발육시켰다.

감염체의 주사에 의해 전이가 형성되는지를 확인하고, 자발적인 돌연변이의 가능성을 배제하기 위하여, 총 폐 추출물에서 에피토프 양성 단백질과 재배양된 전이-생성 세포 추출물에서의 에피토프 양성 단백질을 측정하였다. 150kDa 당단백질은 전체 폐 추출물에서 감지할 수 있고 BSp73AS-pSVmeta-1-15 전이체를 수용한 동물의 특정 폐 결절 추출물에서도 감지할 수 있다. 시험관 내에서 성장시킨 경우에, G418-저항성 균주는 동일한 분자량을 가지는 단백질을 발현한다.

진단과 치료

1. 사람 pMeta-1 서열과 하이브리드시킴으로써 사람 종양 물질 분석. 이러한 실험들은 사람의 ECR을 인식하는 항체를 이용하기 전에 예비실험이 된다.

2. 사람 ECR에 대한 항체 생산, 박테리아성 발현 벡터에 사람 pMeta-1 서열을 클로닝시켜 β- 갈락토시다제 또는 트립토판 E-생성물과 융합된다. 이러한 융합단백질 또는 ECR 에서 합성한 펩티드(수용체 분자와 결합됨)를 토끼에 면역주사한다. 다클론성 또는 단일 클론성 항체분리.

가능한 용도;

- 임상에서 종양물질의 면역 조직학적 연구(진단)

- ELISA 테스트로 환자의 혈청에서 가용성 ECR 감지(진단)

- 종양/전이 부분에 독성을 제공하기 위해 항체 결합된 독성의 결합체 제조(치료)

- 두 개의 항원이 결합 할 수 있는 항체 제조. 이중(double)특이성으로 전이 부분에 세포독성 반응을 유도한다(항-DC3 결합)

(치료)

3. 완전한 hMeta-1 cDNA 서열을 가지는 발현 벡터를 사람 또는 쥐 세포에 형질전염시켜, hMeta-1 단백질의 생산 또는 LCLC97 세포에서 정제.

가능한 용도;

- 종양세포의 조직결합부위를 차단하기 위한 단백질 주입.

- 결합위치의 특징화후에, 이동하는 종양세포를 차단할 수 있는 대량의 결합단백질의 주입시킴에 따라 이용할 수 있는 치료학적 용도.

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** 평균 직경 *** 주어진 세포 주입후 60일간의 단계

^*LN = 임파선

본 발명은 변이주(variant) CD44 표면 단백질, 이들 단백질의 다양한 결정부위에 대한 항체와 이들을 만드는 과정, 변이주 단백질을 코드하는 DNA 서열, 종양 전이의 진단과 치료용 단백질로 사용하는 용도 및 단백질에 대한 항체에 관계한다.

악성 종양 세포가 실제 생명에 위협을 주는 이유는 전이되는 능력 때문이다. 최초 종양 세포는 종양 진행 과정에서 연속적으로 변화하면서 전이되는 성질을 가지게 된다. 이러한 과정으로 인하여 암 세포 변이체는 원시 종양 물질에서 연속적으로 떨어지고 임파계 또는 혈관계로 이동하거나 세포외(extracellular) 매질로 침투한다. 종종 다른 세포에 흡착되어 혈관계 또는 임파계로 이동된 전이하는 종양 세포는 혈관계를 떠나 제2조직에 침투하거나 자손 종양(daughter tumor) 세포를 형성하게 된다(Survey of Hartet al., 1989 : Nicolson, 1987). 전이형성은 세포간(intercellular) 매질 및 다른 세포와 종양 세포와의 상호작용에 의한 것이다. 상호작용은 매질의 수용체 박편수용체 표면 결합된 단백질 분해성 효소와 같은 세포 표면 성분물과, 기관 특이적 흡착을 일으키는 세포 흡착 분자와 전이의 적합한 기관과 성장 인자와 성장 인자 수용체 등이 요구된다.

막 단백질은 BSp73 쥐 종양의 전이성 종양 세포와 비-전이성 종양세포로 분화되는데(Matzku et al., 1983, 1989) 이는 항체 반응에 의해 설명된다.

전이성 BSp73ASML 종양 세포는 임파 세포 흡착과 세포-세포와 세포-매트릭스간 교환작용에서 공지된 당단백질에 대응하는 표면 단백질을 포함하고 있다(사람의 일반적인 당단백질 : CD44, hermes-1, 쥐의 경우 : Ppg-1 와 쥐 : HEBFln). 사람 CD44 서열의 220번째와 237번째 아미노산 사이에(쥐의 경우 224번째와 239번째 아미노산)있는 154개 아미노산의 세포외 부분(ECR)에 의한 공지된 서열의 것과는 신규의 변이주(variant) CD44 표면 단백질이 다르다. 이와 같은 신규의 당단백질은 전이의 경우에 세포/매질 또는 세포/세포결합에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 신규한 당단백질은 전이의 경우에 세포/매트릭스 또는 세포/세포 결합에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 그러므로, 이 단백질 부위(CER)의 생산과 특성을 조사하는 것이 본 발명 작업의 하나가 된다. BSp73ASML에서 수득된 막단백질을 쥐에 항원으로 투여하면 지라세포는 변이주 CD44 표면단백질의 ECR에 대한 항체를 형성할 수 있다. Kohler의 방법에 따라(1981), 영구 배양을 위해 골수종 세포에 폴리에틸렌 글리콜을 융합시켰다. BSp73ASML과는 반응하고, 비-전이성 모세포와는 반응하지 않고, 또한 다른 비-종양성 쥐 세포와도 반응하지 않는 항체를 생산하는 배양물을 클로닝하고 선별하여 ECR에 신규 단백질에 대한 특이적 항체를 얻을 수 있다. 추가 연구를 위해, 면역 형광테스트에서 BSp73ASML 세포를 강하게 염색시키는 단클론 항체를 얻었고 이 항체는 mABl.lASML로 명명한다(mAb : 단클론 항체를 말함).

BSp73ASML의 단백질 가수 분해 물질을 이용한 웨스턴 블랏 테스트에서, mAbl.l.ASML의 분자량이 120,000; 150,000; 180,000과 200,000인 4개의 밴드를 얻을 수 있었으나, 쥐의 섬유아세포와 비-전이성 쥐 종양 세포 추출물에서는 반응이 나타나지 않았다. 이와 같이 단백질 크기에서 차이가 있는 원인이 고유 아미노산 서열이 상이해서인지 또는 단백질 변형에서 차이가 생기는 것인지는 아직 확인할 수 없다. 어떤 경우에는, 4가지 단백질 모두에 항체에 의해 인지되는 에피토프가 포함되나, 비-전이성 BSp73AS 세포 또는 정상적인 쥐 세포에서 기준으로 사용되는 단백질에는 포함되어 있지 않다.

표면 단백질의 ECR을 코드하는 cDNA 서열의 분리

단클론 항체 mAb1.1ASML를 이용하여 박테리아 발현 벡터에서 ECR-코딩 cDNA 서열을 찾는다. BSp73ASML과 pEX 벡터시스템(Stanley Luzio, 1984)에서 Poly A + RAN를 사용하여 발현 벡터를 만든다. 항체를 이용하여 cDNA 서열에 의해 코드된 생성물은 β-갈락토시다제 퓨젼 단백질로 확인되었다. pEX34와 단클론 항체 1.1ASML에 의해 분리된 cDNA 양성 클론은 167개 뉴클레오티드를 가진 cDNA 서열이다. 이 cDNA를 이용하여 BSp73ASML RNA로 pSP65 벡터에서 거대 cDNA 라이브러리를 통해 모형화하는데 사용된다. 분리된 클론 중 pM66을 사용하여 프라이머 연장(시작 올리고타이드)과 중합 효소 사슬 반응(PCR)으로 전체길이의 cDNA 클론 pMeta-1을 분리한다. 총 길이는 일차 3207개 뉴클레오티드에서 얻을 수 있다. BSp73ASML 종양에서 RNA와 공직선성(colinearity; Cistron 핵산배열이 특정 폴리펩티드의 아미노산 배열과 상응함)은 RNase와 Sl 보호분석에 의해 증명할 수 있다.

박테리아 발현에 의한 cDNA 분리와 항체에 의한 인지로 항체가 ECR 표면 단백질의 일차 아미노산 서열을 인식한다.

ECR-코딩 mRNA는 BSp73AS 세포에서는 발현이 안되고, BSp73ASML에서 발현된다.

하이브리드 반응에 의한 특이 mRNAs를 설명하기 위해, cDNA 클론에서 세 가지 상이한 서열 샘플을 만들었다. 시료 A는 ECR을 코드하는 (위치: 941-1108) cDNA 부위가 된다. 시료 B는 1403-1572 사이의 서열이 되고, 시료 C는 pMeta-L의 시작 부위에서 794까지의 서열이 된다(도면 1). BSp73 종양 세포주의 Roly A + RNA는 전기영동으로 분리하여, RNA 전이 하이브리드 반응에 의해 분석하였다. 전이하지 않는 4개의 세포주에는 샘플 A와 유사한 RNA는 갖고 있지 않는데 비해, 전이성 종양세포주의 RNA는 BSp73ASML과 강력하게 반응하였다. RNA 준비물에서, 샘플 A는 2.2 내지 3.3kb 크기의 이질성 RNA 복합물과 4.9kb의 거대 RNA를 인지한다. 전이성 종양세포 변이주에서 단클론항체 1.1ASML에 의해 인지되는 특이 막단백질의 발현은 ECR-코딩 mRNAs의 발현에 기초한다. 3.2kb의 완전한 cDNA 클론 pMeta-1은 RNA 모든 서열을 가지지는 않는다. 상이한 크기의 RNA 혼합물 중에서 한 종을 가질 뿐이다. 샘플 B와 C에는 이들 RNA 종들이 샘플 A, B, C 모두에 상보적인 서열을 가진다는 이질성(heterogeneity)을 확인한 어떠한 경우에도 BSp73ASML RNA를 분리한 샘플 A와 동일한 하이브리드 패턴을 가진다. 샘플 A와 대비하여 샘플 B와 C는 비-전이성 세포주에 mPNA를 인지한다. RNA 크기는 BSp73ASML에서의 RNA와는 상당히 다르고 즉, 크기가 1.5, 2.0, 2.9와 4.3kb의 mRNA 종을 확인할 수 있다. 이들 RNA종이 BSp73ASML의 이질성 RNA 혼합물에 포함될 수는 있으나 BSp73ASML에는 같은 양으로 존재하지 않는 것은 확실하다. 샘플 A에 상보적인 RNA 서열은 비-전이 세포에 분명히 존재하지 않는다. 그러므로, 샘플 A 서열이 B-C-양성 RNA로 절단되고, 또다른 절단과정은 전이세포주에서만 발생하는 방식으로 전이종양에 있는 동일한 RNA를 샘플 A, B, C 서열에 포함되어 있다.

RNA와 cDNA 사이의 공직선성을 설명하기 위해, 그리고 BSp73AS와 BS p73ASML 세포 사이의 RNA 상이성을 분석하기 위해, S1 뉴클레아제와 RNase 보호 분석을 하였다. 보호된 DNA 또는 RNA는 총길이에 비해 작았는데 그 이유는 이들은 종양세포의 RNAs와 하이브리드 하지 않는 5'-말단 벡터 서열을 포함하고 있기 때문이다. 우선 3'쪽으로의 전이를 생각해 볼 수 있는데; 3'쪽으로 샘플 A와 유사한 서열이 샘플 B 쪽으로 전이된다고 볼 수 있다. 이와 같은 기술에 의해 넓은 범위에서 샘플과 공직선성이 있는 한 개의 RNA종이 BSp73AS에 있음을 알 수 있다. 또한 5' 단부는 BS p73ASML의 RNA 서열에 상응하는 cDNA 또는 RNA로 분화한다. 특히, BSp73 ASML의 RNAs 샘플의 거대 단편을 보호하는 서열을 가지고 있다. 가장 큰 단편은 보호분석에 의해 제공될 DNA 또는 RNA 전체 길이에 상응하게 된다. 더 작은 단편도 감지할 수 있다. RNA 전이 하이브리드는 상이한 크기의 RNA 이질성 혼합물을 커브하고 있지 않기 때문에, 이것은 샘플의 5' 단부와 이미 보호된 상이점(divergence point) 사이의 위치에서 cDNA로부터 분지되는 더 작은 RNA 보호 단편임을 나타낼 수 있다. RNA 종은 BSp73AS 세포에서 감지할 수 없다.

5' 단부의 분기점을 고려할 때, 샘플 C와 하이브리드하는 서열이 샘플 A와 하이브리드하는 서열로 전이되어 ECR 코딩 서열이 된다. 이와 같은 분석은 5'를 절단한 결과에 상응하는 것이다. BSp73AS에서의 RNA는 작은 범위에 한하여 샘플을 보호할 수 있다. BSp73ASML에서의 mRNA는 더 긴 부분을 보호할 수 있다. 즉 제공된 시료의 전체와 공직선성이 있는 것이다. cDNA 클론은 전이 종양 세포 BSp73ASML에서 독특한 pMeta-1 서열을 나타낸다. 3'와 5' 부위도 BSp73AS의 RNA에서 찾아볼 수 있다. 상기 전술한 기술에 따라 특정 전이가 있는 ECR-코딩 서열의 유전자 지도를 만들 수 있는데, 이로써 RNA를 만드는 데에는 선택성 접합(splicing) 메카니즘이 있음을 나타내는 것이다. ECR 서열에서 5'와 3' 전이 절단 부분은 제1도에 화살표로 표시되어 있다.

단클론항체 1.1ASML를 이용하여 다단백질 CD44 변이주를 확인한다.

표면 단백질의 구조적 정보를 얻기 위해, 모든 클론된 cDNA 분자를 서열화하였다. 전체길이의 클론 pMeta-1의 뉴클레오티드 서열과 여기에서 유도된 아미노산 서열은 제2도에 나타내었다. 전체 길이의 cDNA 클론은 3207개 뉴클레오티드이다. 3' 단부에는 Poly A 단부, 2288과 1743 위치에 2개의 추가 폴리아데닐 반응 신호가 있다. 표준 개시 서열과, 503개 아미노산에 상응하는 1509개 뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임에 이어져 첫 번째 ATG 코돈이 있다. 막단백질을 추측할 경우 처음 21개 아미노산은 소수성이며 시그날 펩티드가 된다. 이 서열은 지금까지 데이타 베이스에서 발견되지 않은 것들이다. 그러나, 임파세포를 표적으로 하는 수용체 CD44에 대한 최근 공지된 데이타에서 유사한 서열을 발견하였다(Idzerda et al., 1989; Goldstein et al., 1989; Stamenkovic et al., 1989; Nottenburg et al., 1989; Zhou et al., 1989). 유사 부위는 비-해독 부분을 포함하는 cDNA의 5'와 3' 단부에 한정되어 있고, BSp73AS와 BSp73ASML RNA 서열 사이의 기점에서 끝이 난다. 발산점(도면 2의 화살표 부분) 사이의 총 크기, 즉 전이-특이적 ECR-코딩 서열의 크기는 Pgp1 또는 CD44 서열에서 나타내지 않는다. 전이-특이적 당단백질은 CD44 당단백질 변이주를 나타낸다. 즉, 불변 CD44 당단백질의 270개 아미노산(시그날 펩티드는 아님)과 비교할 때 확장된 세포외(extracellular) 부분의 410개 아미노산과 추가 세포외 도메인 156개 아미노산을 가진다. 그러나 비-전이 BSp73AS 세포에서, 이들 CD44의 변하지 않은 형태가 감지되었다. RNA의 cDNA는 BSp73AS RNA의 cDNA를 클론시켜, 세포외 도메인과 전이-특이 클론이 동일함을 설명한다.

변이주 CD44의 발현은 전이 능력과 상관관계가 있다.

변이주 CD44 당단백질의 발현이 BSp73ASML 세포에서 예외없이 발생하는지, 그리고 이들 세포의 전이능력과 관계가 있는지 또한 일반적인 전이능력과 관계 있는지를 검사하기 위해, 포유류 육종 시스템 13762NF의 종양세포와 같은 동질유전성 쥐 종양세포를 연구했다(Neri et al., 1982). 모종양(parental tumour) 세포에서 유도된 세포주 즉 MTPa, MTC, MTF7, MTA 세포(제1그룹)와 임파절 또는 폐 전이에서 유도된 세포주 즉, MTLy, MTLn2, MTLn3(제2그룹)의 세포를 비교하였다. 제1그룹 세포는 샘플 B와 하이브리드할 때, BSp73AS 세포의 RNA와 유사한 정상적인 CD44 패턴을 기본적으로 발현한다. 한편, 샘플 A와 하이브리드될 경우, 약 크기가 2.5kb인 소량의 확산된 RNA 밴드를 감지할 수 있다. 한편, 제2그룹 세포는 완전하게 다른 RNA 패턴을 나타낸다. 샘플 A와 B는 더 큰 RNA와 하이브리드한다. 이 크기는 BSp73ASML에서 감지되는 것과 유사하다. RNase와 S1 보호분석에 의해 유사성을 증명한다. 이들 자료를 기초로 하여, RNA의 접합(splicing) 패턴의 변화와 변이주 CD44 발현은 전이 형성과 관계가 있고, 전이 포유류 육종세포에서 수득한 패턴은 전이성 BSp73ASML 세포주에 공지된 것과 상응한다는 결론을 얻었다. 항체가 인지하는 고분자량 단백질은 BSp73ASML 추출물에서 감지되는 두 개의 고분자 단백질에 상응한다. 포유류 종양종에서, RNA 종의 전이 특이적 발현과 고분자 단백질의 전이 특이적 발현을 발견하였다. 모세포주인 제1그룹에서 RNA는 샘플 A인 ECR-코딩서열과 하이브리드됨을 발견할 수 있고, 약하게 착색된 항체와 100,000 달톤의 단백질이 볼 수 있는데, 전이성을 나타내지 않는 세포주 BSp73AS와 대조적으로 제1그룹도 소량의 전이 활성을 가짐을 알 수 있다.

만클론항체 1.1ASML는 쥐에서 전이 형성을 저해한다.

동질 유전자형 쥐에서 종양세포주 BSp73ASML의 전이형성의 실험에서, 세포를 피하로 주입하고, 종양 주입 전후 2 내지 3일 간격으로 각각 다른 시간대에 복강으로 단클론 항체 1.1ASML을 주입한다. 면역학적 프로토콜을 이용하여 주입된 항체에 대해 쥐의 면역반응이 어떻게 일어나는지를 살펴본다. 그 결과 항-쥐(mouse) 이뮤노글로블린과 항-특정항원결정기(idiotype) 항체가 생성된다. 이러한 일련의 실험결과로 1.1ASML 주입으로 인해 종양의 성장과 전이가 상당히 지체됨을 볼 수 있다. 운동학상 이와 같은 지체로 인하여 항체가 전이형성과정을 방해한다는 결론을 얻었다. 이 실험에서, 항체에 의해 인지되는 전이세포 표면의 단백질 구조가 전이형성과정에서 중요한 역할을 하며, 치료학적으로 그리고 진단학적 계획에도 중요하다.

쥐 cDNA의 ECR-코팅서열에 대한 유사한 사람의 서열 분리

쥐 시스템에 상응하여 사람 종양세포 배양을 하여 전이성질을 여전히 보유하는지를 감지하는 과정에서 자연적 가능성은 없음을 알 수 있다. 면역-결핍 쥐 실험으로 사람의 경우에 전이 능력에 대해 매우 한정적인 예측을 할 수 있다. 따라서, 상당히 오랜전서부터 세계 도처에서 수득한 많은 종양세포주로 쥐의 전이에서 볼 수 있었던 서열의 발현이 있는지를 검사하였다. 그러한 종양세포주를 찾는 일은 가능한 것이다. 사람은 거대-세포 폐 종양에서 기원한 것으로 LCLC97를 가지고 이 종양 세포주에서 쥐의 전이 종양세포주에서 감지할 수 있는 RNAs에 상응하는 세 종의 RNA(크기: 5.5:3.4:2.8kb)를 감지할 수 있다. 이들은 샘플 A와 하이브리드 할 뿐 아니라 샘플 B와 C와도 하이브리드 한다. 즉, 이와 같은 사람 RNA 종은 cDNA pMata-1(85%)와 상당 범위에서 동일하였다.

그러나, 단클론 항체 1.1ASML은 종양세포와 반응하지 않고 항원 결정부위에서 항원에 의해 인식되는 단백질 부분은 사람 종양 세포 표면에 존재하는 단백질과도는 상이하다. 비-반응성의 경우 항체의 고친화성에서 최소의 변수에 충족한다. 사람 종양세포 LCLC97은 cDNA 라이브러리를 만드는데 사용된다, 쥐와 사람 서열간에 상당히 일치한다는 점을 기초로 하여, 샘플 A와 유사성을 보이는 것으로 cDNA 클론을 분리할 수 잇다. 사람 cDNA를 서열화하였다. 제3(a, b)도에서는 1차 서열과 여기에서 유도한 아미노산 서열을 나타내었다. 상당부분에서 쥐와 사람 서열에 동일성이 보인다. 사람 서열과 여기에서 유도된 아미노산 서열은 본 특허 명세서의 목적이 된다.

Claims

전이성(metastasing) 종양세포의 표면 단백질을 인코드하는 DNA 단편에 있어서, DNA 단편은

뉴클레오티드 서열

에서 선택되는 것을 특징으로 하는 전이 종양세포의 표면 단백질을 코드하는 DNA 단편.
제1항에 따르는 DNA 단편과 벡터 뉴클레오티드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
제2항에 있어서, 벡터 뉴클레오티드 서열이 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 분자.
제1항에 따르는 DNA 단편 또는 제2항 또는 제3항 중 어느 한 항에 따르는 재조합 DNA 분자를 소유하는 것을 특징으로 하는 형질 전환된 숙주 세포.
제1항에 따르는 DNA 단편에 의해 코드되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제1항에 따르는 DNA 단편을 포함하는 제2항에 따르는 재조합 DNA 분자에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제5항 또는 6항에 있어서, 아미노산 서열의 구성이

... r-단백질

과 h-단백질

인 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
제7항에 따르는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드에 대한 특이적인 단클론성 및 다클론성 항체.
제1항에 있어서, 전이 종양세포의 표면 당단백질을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 확인, 생산 또는 분리하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 DNA 단편.
제8항에 있어서, 제5항 내지 제7항에 따르는 폴리펩티드의 확인, 생산 또는 분리에 사용되는 것을 특징으로 하는 항체.
제1항에 따르는 DNA 단편 또는 제5항에 따르는 폴리펩티드를 이용하여 생성되는 것을 특징으로 하는 항체.