NO309770B1 - DNA-fragment som koder for en del av et overflateproteins metastasedannende tumorceller; ekspresjonsvektor; transformert vertscelle; polypeptid for anvendelse i et in vitro system; antistoff; samt anvendelse av antistoffet - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et DNA-fragment som koder for en del av et overflateproteins metastase- dannende tumorceller.

Dessuten vedrører oppfinnelsen en ekspresjonsvektor; en transformert vertscelle; et polypeptid for anvendelse i et in vitro system; et antistoff; samt anvenelse av antistoffet .

Evnen til å danne metastaser utgjør ondartede tumor-cellers egentlige livstruende egenskap. De opprinnelige primærtumorceller erverver sannsynligvis denne egenskap gjennom en hel serie forandringer i løpet av tumor-utviklingen. Som resultat av disse prosesser løsner kreftcellevariantene stadig fra den primære tumormasse, gjennomtrenger den ekstracellulære matrise og vandrer inn i lymfesystemet eller blodsirkulasjonen. De metastasedannende tumorceller blir, ofte klebet til hverandre, transportert i blod- eller lymfesystemet, forlater karsystemet på andre steder for der å trenge inn i sekundærvev og danne dattertumorer (oversikter av Hart et al., 1989 og Nicolson, 1987). Dannelsen av metastaser krever en hel rekke interaksjoner mellom tumorceller og intercellulær matrise eller andre celler. Nesten alle disse interaksjoner behøver celleoverflatekomponenter, f.eks. reseptorene for matrise og plater, overflatebundne proteolytiske enzymer, samt celleadhesjonsmolekyler inklusivt slike som betinger metastasedannelsens organspesifikke adhesjon og derved organpreferanse, foruten vekstfaktorer og vekstfaktorreseptorer.

Det er kjent at membranproteinene til ikke-metastasedannende og metastasedannende tumorceller fra BSp73A rottetumorer er forskjellige fra hverandre, påvist ved hjelp av antistoffreaksjon (Matzku et al., 1983 og 1989) .

Det kjennetegnende ved oppfinnelsen fremgår av karakteristikken i de selvstendige krav 1, 4, 5, 6, 7, 9 og 11.

Det har vist seg at de metastasedannende BSp73ASML tumorceller inneholder et overflateprotein som delvis tilsvarer et kjent glykoprotein som deltar i lymfocytt - adhesjonen og celle-celle- og-celle-matriseveksel-virkningen (betegnelser på det normale glykoprotein hos mennesket:CD44, Hermes-1, hos mus:Ppg-l og hos rotte:HEBFln). Fra disse kjente sekvenser avviker imidlertid det variante CD44-overflateprotein ifølge oppfinnelsen ved et ekstracellulært område (EZB) med 154 aminosyrer, som er innskjøvet mellom den 220. og 227. aminosyre i den humane CD44-sekvens (henholdsvis mellom 224. og 239. aminosyre i sekvensen hos mus). Dette nye glykoprotein synes å spille en viktig rolle for henholdsvis celle/ matrise- og celle/cellebindingen ved metastasedannelsen. Fremstilling og karakterisering av dette proteinområde (EZB) er derfor et av formålene med den foreliggende oppfinnelse. Ved immunisering av mus med membranproteiner som er utvunnet av BSp73ASML ble det frembrakt miltceller som danner antistoffer mot det variante CD44-overflateproteins EZB . Ved Kohler's metode fra 1981 ble disse ved hjelp av polyetylenglykol smeltet sammen med ryggmargceller for å oppnå bestandige kulturer. Ved hjelp av kloning og utvelgelse av de kulturer som produserer antistoffer som reagerer med BSp73ASML, men ikke med den ikke-metastasedannende stammeform BSp73AS og heller med andre ikke-onkogene rotteceller, er det mulig å utvinne antistoffer som er spesifikke mot den nye proteindel EZB. For den videre undersøkelse ble det valgt et monoklonalt antistoff, som farger BSp73ASML-cellene særlig intens i immunfluorescenstesten og som fikk betegnelsen mAbl.1ASML (mAb=monoklonalt antistoff).

I "Westernblot"-prøven er det i et proteinhydrolysat av BSp73ASML-celler mulig å bestemme 4 proteinbånd med molekylvekter på 120.000, 150.000, 180.000 og 200.000 med mAbl.l. ASML, mens ekstrakter av rottefibroblastceller og ikke-metastasedannende rottetumorceller ikke gir noen markert reaksjon. Det kunne ennå ikke bestemmes om disse størrelsesforskjeller skyldes en forskjellig, opprinnelig aminosyresekvens eller en forskjellig sterk, senere proteinmodifikasjon. I alle fall foreligger epitopen som er gjenkjent av antistoffet i alle fire proteinarter, men ikke i kontroilproteinene fra de ikke-metastasedannende BSp73AS-celler eller fra normale rotteceller.

Isolering av cDNA- sekvenser som koder for

overflateproteinets EZB.

Det monoklonale antistoff mAbl.1ASML ble anvendt i et bakterielt ekspresjonsbibliotek for å påvise de cDNA-sekvenser som koder for EZB. Biblioteket ble konstruert ved hjelp av PolyA+ RNA fra BSp73ASML-celler og pEX-vektorsystemet (Stanley & Luzio, 1984). Produktene som kodes av cDNA-sekvensene påvises ved hjelp av antistoffene å være jS-galaktosidasefusjonsproteiner. En således isolert cDNA-klon som har betegnelsen pEX34 og som er positiv for det monoklonale antistoff 1.1ASML bærer et cDNA-sekvensstykke på 167 nukleotider. Dette cDNA-stykke ble nå anvendt til å oppnå et større cDNA-bibliotek i vektoren pSP65, igjen fra BSp73ASML RNA. En klon, pM66, som er isolert med denne tjente til ved hjelp av såkalt "primer"-forlengelse (starter-oligonukleotid) og polymerasekjede-reaksjonen (PCR) å isolere den fulle lengde cDNA-klon pMeta-1. Bevis for den fulle lengde ble oppnådd ved hjelp av primerforlengelsen (3207 nukleotider). Kolineariteten med en RNA fra Bsp73ASML-tumoren ble dokumentert ved hjelp av RNase og Sl-proteksjonsanalyse.

Isoleringen av de forskjellige cDNA-er ved hjelp av ekspresjonen i bakterier og påvisningen ved hjelp av antistoffene beviser at antistoffet gjenkjenner primær aminosyresekvens i overflateproteinets EZB.

Budbærer- RNA som koder for EZB uttrykkes i BSp73ASML- , men ikke i BSp73AS- celler.

3 forskjellige sekvensprober ble frembrakt fra cDNA-klonene for å påvise spesifikke budbærer-RNA-er ved hjelp av hybridisering. Probe A dekker det cDNA-område som koder for nevnte EZB (posisjonene: 941-1108). Probe B representerer sekvensene mellom posisjonene 1403-1572, og probe C bærer sekvensene fra begynnelsen til posisjonen 794 fra pMeta-1 (fig. 1). Poly A+ RNA fra BSp73-tumorcellelinjene ble separert elektroforetisk og analysert ved hjelp av RNA-transferhybridisering. Fire av cellelinjene, som ikke danner metastaser, inneholder intet RNA som er homolog til probe A, mens RNA fra de metastasedannende tumorceller Bsp73ASML reagerer sterkt. Probe A gjenkjenner i dette RNA-preparat en heterogen blanding av forskjellige RNA-størrelser på mellom 2,2 og 3,3 kb og en større RNA-art på 4,9 kb. Den utelukkende ekspresjon av de spesifikke membranproteiner, som gjenkjennes av det monoklonale antistoff 1.1ASML i den metastasedannende tumor-cellevariant skyldes åpenbart den utelukkende ekspresjon av de tilsvarende budbærer-RNA som koder for nevnte EZB. Åpenbart kan den fullstendige cDNA-klon pMeta-1 med 3,2 kb ikke representere alle sekvenser av denne RNA-art. Den kan bare fremstille én art av den heterogene blanding av RNA-størrelse. Probene B og C gir samme hybridiseringsmønster som probe A ved oppdelingen av BSp73ASML RNA, i hvertfall så langt man kan fastslå med heterogeniteten, dvs. at disse RNA-arter bærer sekvenser som er komplementær til alle tre prober A, B og C. I motsetning til probe A gjenkjenner probene B og C også budbærer-RNA-arter i de ikke-metastasedannende cellelinjer. Størrelsene på RNA avviker imidlertid tydelig fra størrelsene i BSp73ASML. Det påvises nemlig fire klart forskjellige budbærer-RNA-arter, med størrelsene 1,5, 2,0, 2,9 og 4,3 kb. Selv om disse RNA-arter vil kunne være gjemt i den heterogene blanding av RNA-ene fra BSp73ASML er det imidlertid sikkert at de ikke foreligger i samme mengde i BSp73ASML. Det avgjørende er at RNA-sekvensene med komplementaritet til probe A åpenbart er fullstendig fraværende i de ikke-metastasedannende celler. Det kan derfor forsiktig trekkes den slutning at sekvensene i probene A, B og C foreligger i de samme RNA-er i den metastasedannende tumor, og det på en måte som om sekvensene i probe A var innspleiset i de B-C-positive RNA-er og som om denne alternative spleising bare forekom i den metastasedannende cellelinje.

For å bevise kolineariteten mellom RNA og cDNA og for å analysere forskjellen mellom RNA i BSp73AS- og BSp73ASML-cellene ble det gjennomført Sl-nuklease- og RNase-proteksjonsanalyser. De beskyttede DNA- eller RNA-fragmenter kan bære være mindre enn den totale lengde, som følge av at 5'-endene inneholder vektorsekvenser som ikke kan hybridisere med RNA-ene fra tumorcellene. Først betraktes overgangen på 3'-siden: Overgangen av sekvenser med homologi til probe A etter slike frekvenser med homologi til probe B. Begge metoder viser én eneste RNA-art i BSp73AS-celler som er kolineare med probene i et bredt område. Mer 5' fra dette avviker henholdsvis cDNA-og RNA-proben, som jo tilsvarer RNA-sekvenser fra BSp73ASML, fra RNA fra BSp73AS-cellene. RNA-ene fra BSp73ASML inneholder fremfor alt sekvenser som beskytter større fragmenter av probene. De største fragmenter tilsvarer hele lengden av henholdsvis DNA- og RNA-stykkene som tilbys til proteksjonsanalysen. Også mindre fragmenter kan påvises. Idet RNA-transferhybridiseringene har iakttatt en heterogen blanding av RNA med forskjellige størrelser er det mulig at disse mindre, beskyttede fragmenter oppviser RNA-arter som avviker fra ,cDNA-ene på annen måte, dvs. på steder mellom det tidligere påviste divergenspunkt og til de tilbudte probers 5'-ender. Disse RNA-arter kan heller ikke påvises i BSp73AS-cellene.

Nå betraktes divergenspunktet på 5'-siden, altså overgangen fra sekvenser som danner hybrider med probe C med de som danner hybrider med probe A, altså sekvensen som koder for nevnte EBZ. Analysen gir tilsvarende resultater for 5'-bruddpunktet. RNA-er fra BSp73AS-celler kan bare beskytte de tilbudte prober i et mindre område. Budbærer-RNA-er fra BSp73ASML-celler beskytter lengre fragmenter. De er nemlig kolineare i hele lengden av den tilbudte prøve. Man kan altså trekke den slutning at cDNA-klonen representerer pMeta-1-sekvenser som blir utpreget i de metastasedannende tumorceller BSp73ASML. 3'- og 5'-områdene finnes også i RNA-ene fra BSp73AS-celler. Sekvensene som koder for nevnte EZB og som har de definerte overganger, som ved hjelp av de ovenfor beskrevne metoder kan kartlegges, viser at det her må foreligge en alternativ spleisemekanisme for RNA-dannelsen. 5'- og 3'-bruddpunktene i overgangene til EZB-sekvensene er markert i fig. 1 ved hjelp av piler.

Det monoklonale antistoff 1. 1ASML identifiserer en variantform av qlykoproteinet CD44.

For å oppnå strukturelle informasjoner om overflate-proteinet er alle klonete cDNA-molekyler blitt sekvensert. Nukleosidsekvensene til totallengdeklonen pMeta-1 og de derav avledete aminosyresekvenser er vist i fig. 2. Totallengde-cDNA-klonen spenner over 3.207 nukleotider. 3'-terminusen bærer en polyA-ende, mens to ytterligere polyadenyleringssignaler ligger i posisjonene 22 8 8 og 1743. Det første ATG-kodon følger etter en konsens-initieringssekvens og åpner en leseramme på 1.509 nukleotider, noe som tilsvarer 503 aminosyrer. Slik man vil anta for et membranstadig protein er de første 21 aminosyrer hydrofobe og utgjør et signalpeptid. Ingen del av disse sekvenser er hittil funnet i databasene. I forbindelse med den foreliggende oppfinnelse fant man imidlertid sekvenshomologi til nylig publiserte data over lymfocytt-Homing-reseptoren CD44 (respektivt Pgp-l)

(Idzerda et al., 1989; Goldstein et al., 1989; Stamenkovic et al., 1989, Nottenburg et al., 1989 og Zhou et al., 1989) . Homologene er strengt begrenset til 5'- og 3'-delene av cDNA med tillegg av ikke-translaterte områder, og de ender i de ovennevnte divergenspunkter mellom BSp73AS- og BSp73ASML RNA-sekvensene. Den totale strekning mellom divergenspunktene (i fig. 2 vist ved hjelp av fargemarkering), dvs. hele utstrekningen av den metastasespesifikke sekvens som koder for nevnte EZB, er ikke representert i Pgpl- eller CD44-sekvensene. Det metastasespesifikke glykoprotein representerer åpenbart en variant av CD44-glykoproteinene. Det bærer nemlig et ytterligere, ekstracellulært område med 156 aminosyrer og følgelig et

mangfoldiggjort, ekstracellulært område med 410 aminosyrer (med fradrag av 21 aminosyrers signalpeptid), sammenlignet med 270 aminosyrer (likeledes med fradrag av signalpeptid) i det uforandrete CD44-glykoprotein. I de ikke-metastasedannende BSp73AS-celler påvises imidlertid de

uforandrete former av denne CD44-familie. cDNA-sekvenser i disse BSp73AS-RNA-er er også blitt klonet, og identiteten med de metastasespesifikke kloner utenfor ekstraområdet er blitt påvist.

Det variante CD44 sin ekspresjon er korrelert med det metastatiske potensiale.

For å kontrollere om ekspresjonen av de variante CD44 glykoproteiner utelukkende foregår i BSp73ASML-cellene og om de står i sammenheng med disse cellers metastatiske potensiale eller det metastatiske potensiale generelt, ble en annen serie isogeniske rottetumorcellelinjer, nemlig tumorcellelinjene fra Mammokarsinom-systemet 13762 NF (Neri et al., 1982), undersøkt. Derved ble cellelinjer som var avledet fra modertumoren, nemlig cellene MTPa, MTC, MTF7 og MTA (gruppe 1) sammenlignet med cellelinjer som ble dannet av lymfeknuter eller lungemetastaser, nemlig MTLy, MTLn2 og MTLn3 (gruppe 2). Cellene i gruppe 1 uttrykker stort sett det normale CD44-mønster, lignende mønsteret til RNA-ene fra BSp73AS-cellene når probe B hybridiseres. Med probe A påvises det derimot en mindre mengde av et diffust RNA-bånd som har omtrent størrelsen 2,5 kb. Cellene i gruppe 2 oppviser på den annen side et helt annet RNA-mønster. Begge prober A og B hybridiserer med større RNA-arter. Størrelsene ligner de som påvises i BSp73ASML. Likheten dokumenteres også ved hjelp av RNAse- og Sl-beskyttelsesanalyser. På grunn av disse data trakk man den slutning at en forandring av spleisemønsteret til RNA og ekspresjonen av variant CD44 korrelerer med dannelsen av metastaser, og at det oppnådde mønster i disse metastasedannende mammokarsinomceller tilsvarer meget godt de man ovenfor har gjort seg kjent med for den metastasedannende BSp73ASML-cellelinje. De høymolekylære proteiner, som gjenkjennes ved hjelp av antistoffene, tilsvarer de to høymolekylære arter av proteiner som er påvist i BSp73ASML-ekstraktene. I denne mammotumorserie påvises det også en metastasespesifikk ekspresjon av RNA-arter og av høymolekylære proteiner. At det i gruppe 1, altså i de såkalte morcellelinjer, overhodet ble funnet RNA-er, som hybridiserer med probe A, altså med sekvensen som koder for nevnte EBZ, og at det også kan ses en svak farging av et protein av 100.000 Da med antistoffet, tilbakeføres til at cellene i gruppe 1 også har en liten evne til å danne metastaser, helt i motsetning til den opprinnelige tumorcellelinje BSp73AS, som overhodet ikke viser noen metastasedannelse.

Det monoklonale antistoff 1. 1ASML hemmer metastasedannelse i rotter.

I en forsøksserie for metastasedannelse av tumor-cellelinj en BSp73ASML i isogeniske rotter ble celler injisert subkutant, og på forskjellige tidspunkter ble det monoklonale antistoff 1.1ASML innsprøytet intraperitonealt i avstander på fra 2 til 3 dager før og etter tumor-administreringen. Innenfor rammen av denne immunologiske protokoll ble det også bestemt hvordan rottens immunitetsreaksjon overfor det injiserte antistoff hadde foregått. Det dannes nemlig antimus-immunglobulin-antistoffer og antiidiotype-antistoffer. Resultatet av denne forsøksserie er at tumorens vekst og metastasedannelse forsinkes sterkt ved injeksjon av 1.1ASML. Denne forsinkelse tillater i sin kinetikk den slutning at antistoffet innvirker på en primær prosess av metastasedannelsen. Forsøket viser at den av antistoffet erkjente proteinstruktur på overflaten av de metastasedannende celler spiller en rolle i metastasedannelsesprosessen og at terapeutiske og diagnostiske planer er realistiske.

Isolering av den homologe, humane sekvens til den sekvensdel i cDNA fra rotte som koder for nevnte EBZ.

For humane tumorceller i kultur foreligger selvfølgelig ikke uten videre muligheten til å påvise, på tilsvarende måte som i rottesystemene, om de bibeholder metastasedannende egenskaper. Forsøk med mus med mangelfull immunitet tillater bare meget begrenset utsagn om metastasepotensialet hos mennesker. Derfor måtte det testes forholdsvis mange tumorcellelinjer som på langt tilbakeliggende tidspunkter var anbrakt i kultur ett eller annet sted i verden og som kunne påvises for rottemeta-stasene. Det har lykkes å finne en slik tumorcellelinje. Den stammer fra en storcellet lungekarsinom fra menneske og har nummeret LCLC97. I denne tumorcellelinje kan det påvises tre definerte RNA-arter (størrelse: 5,5, 3,4 og 2,8 kb), som forholder seg nøyaktig tilsvarende til RNA-ene som kan påvises i de metastasedannende tumorcellelinjer hos rottene. De hybridiserer nemlig både med probe A og med probene B og C, dvs. at også disse humane RNA-arter i store områder er identisk med cDNA pMeta-1 (85%) .

Det monoklonale antistoff 1.1ASML reagerte riktignok ikke med denne tumorcelle, dvs. at proteinstykket som ble gjenkjent av antistoffet må i området for antigendeterminanten være forskjellig fra de proteiner som befinner seg på overflaten av den humane tumorcelle. Por ikke-reaktiviteten er allerede de minste avvikelser som følge av antistoffenes høye spesifisitet tilstrekkelig. Den humane tumorcelle LCLC97 tjente nå til å konstruere et cDNA-bibliotek. På grunn av den høye overensstemmelse mellom sekvensene hos henholdsvis rotte og menneske kunne det isoleres en cDNA-klon som viste homologi med probe A. Den humane cDNA ble sekvensert. Fig. 3 (a,b) viser primærsekvensen og aminosyresekvensen som var avledet av denne. Det fremgår at i store områder foreligger det langt på vei identitet mellom sekvens hos henholdsvis rotte og menneske. Denne humane sekvens og aminosyresekvensen som er avledet av denne er også gjenstand for den foreliggende oppfinnelse.

Ut førelseseksempler:

Celler og antistoffer.

Følgende klonete Bsp-cellelinjer ble anvendt for undersøkelsen: BSp73 14ASML-1 og 10AS-7 og oppbevart i kultur slik som beskrevet av Matzku et al., 1982. Dessuten ble de av Neri et al., 1982, beskrevne mammokarsinomcellelinjer monoklonale antistoffer mot BSp73 ASML membranproteiner fremstilt ved immunisering av Balbc-mus. Etter isolering av miltcellene fra en immunisert mus ble disse fusjonert med Ag8 ryggmargceller for udødeliggjøring ved fremgangsmåten til fremstilling av monoklonale antistoffer ifølge Kohler (1981). De derved oppnådde hybridomceller ble underkastet en screening for å finne slike antistoffer som er spesifikke mot BSp73ASML, men ikke mot BSp73AS og normale rottefibroblastceller. Den nøyaktige fremgangsmåte er beskrevet i et diplomarbeid av Wenzel i 1986 og av Matzku et al. i 1989.

Hybridomceller som produserer monoklonale antistoffer (mAk) og som har tilsvarende spesifisitet ble mangfoldiggjort i vevskulturen, og det monoklonale antistoff som ble oppnådd i mediet ble ved ammoniumsulfatutfelling og kolonnekromatografi (protein A-sepharose og MonoQ) sterkt anriket og i denne form anvendt til undersøkelsene. Ett av dem er mAkl.lASML.

Immunfluorescens:

For fremstilling av det variante CD44 molekyl på forskjellige tumorceller ble disse opptatt i kultur, deretter vasket med fosfatbufret koksaltløsning (PBS) og inkubert med 1.1ASML i 10 minutter ved 40°C. Som sekundært antistoff for påvisning av bindingen ble det anvendt et rhodaminkoplet kanin anti-mus immunglobulin og vist i fluorescensmikroskop.

Oppbygning av cDNA- ekspresionsbiblioteker og immunscreening.

PolyA+ RNA fra BSp73ASML-celler ble primet med oligo- (dT) og heksanukleotider av forskjellig sammensetning og syntetisert med revers transkriptase fra AMV fra den første kjede i cDNA. Den andre kjede i cDNA ble fremstilt med E.coli DNA polymerasel, RNaseH og E.coli ligase, og deretter ble den dobbeltkjedete cDNA sine ender gjort like lange ved hjelp av T4DNA polymerase. Vektorene pEXl, 2 og 3 (Stanley og Luzio, 1984), som muliggjør fusjoneringen av cDNA-ene i tre forskjellige leserastre ble kuttet opp med Smal-restriksjonsendonuklease og ligert til cDNA (T4 DNA ligase). Kompetente E.coli DH5 (pCI857) bakterier som produserer en temperaturømfintlig repressor transformeres med pEX-cDNA-produktene og dyrkes på nylonfiltre. Genet for den temperaturømfintlige repressor RCI857 ligger på plasmidet pCI857, som er forenelig med pEX-plasmidene. Ved 2 8°C er lPR-promoteren, som styrer syntesen av fusjonsproteinene, utkoplet. Ved temperatur-økning til 42°C inaktiveres CI-repressoren, og syntesen av /S-galaktosidase/ASML-fusjonsproteiner settes massivt i gang. De varmeinduserte bakteriekolonier denatureres deretter med kloroformdamp på filtrene, og disse inkuberes deretter i PBS som inneholder 3% tørrmelkpulver, lysozym og DNase. De bakterielle fusjonsproteiner som er fiksert på nylonfilteret inkuberes nå med mAkl.1ASML og blir etter utvasking av ikke-spesifikt bundet mAk anvendt til å påvise bindingen som sekundært antistoff 125J markert kanin anti-mus IgG. Etter autoradiografi ble positive kloner isolert fra det opprinnelige bakteriefilter og analysert vidtgående. En klon som syntetiserte fusjons-proteinet, som reagerte spesifikt med 1.1ASML, var pEX34. pEX-plasmidet som finnes i bakterieklonen inneholder 167 nukleotide cDNA-er, som blant annet koder for epitopen (respektivt antigendeterminanten) hvis spesifisitet mAK.l.lASML bærer.

Isoleringen av de totale lengder cDNA mMeta-1 foregikk deretter ved standardmetoder.

Immunisering av rotter med mAkl. 1ASML.

BDX-rotter, som er syngeniske med BSp73-tumorcellene, ble injisert subkutant respektivt intraperitonealt med mAkl.1ASML (koplet til Keyhole Limpet Haemocyanin) sammen med komplett Freunds adjuvans. Den første injeksjon ble foretatt 10, 7 og 3 dager før injeksjonen av BSpASML-cellene (inn i fotfettpolsteret), de følgende deretter 3, 7, 11, 14 og 21 dager senere. Etter 2 8 dager avlives rottene, de forskjellige lymfeknuter prepareres og veies, og makroskopisk synlige lungemetastaser telles.

Sammenheng mellom ekspresjonen av variante CD44 overflate-proteiner og metastatisk potensiale.

For å fastslå om ekspresjonen av variante CD44 glukoproteiner utelukkende er en egenskap hos den undersøkte BSp73ASML-cellelinje, eller om ekspresjonen kan bringes i sammenheng med det metastatiske potensiale, ble en annen serie rottetumorcellelinjer, som er avledet fra 13762NF-mammokarsinom (Neri et al., 1982) undersøkt. Dessuten ble cellelinjer, som er avledet av primærtumorer (MTPa, MTC, MTF7 og MTA (gruppe 1)) sammenlignet med cellelinjer som er avledet fra lymfeknute- og lungemetastaser (MTLy, MTLn2, MTLn3 (gruppe 2)). Mønsteret til RNA avledet fra CD44 er gjengitt i fig. 4, hvorved probe A, B og D tilsvarer probene som er beskrevet på side 4 og i fig. 1. Celler i gruppe 1 oppviser alle et normalt CD44-mønster med probe B. Celler i gruppe 2 oppviser derimot et mønster som avviker fra dette. RNA er større enn RNA i gruppe 1 og tilsvarer RNA fra BSp73ASLM. Mindre RNA-er går tapt ved hybridiseringen med probe D. Det øvrige mønster viser likhet mellom de to rottetumorsystemer.

Også med probe A tilsvarer RNA-mønsteret i gruppe 2 mønsteret til BSp73ASML. Mens probe A ikke hybridiserer med RNA fra BSp73AS opptrer det et lite, diffust RNA-bånd på ca. 2,5 kb hos celler fra gruppe 1. RNase- og Sl-nukleaseproteksjonsanalyse viser også den strukturelle likhet. Av disse resultater synes det å opptre en skifting i spaltningsmønsteret og ekspresjonen til variante CD44 RNA-er med dannelsen av metastaser.

Overføring av det metastatiske potensiale til ikke-metastasedannende BSp73AS- celler ved overekspresion av pMeta- 1.

Sammenhengen mellom ekspresjonen av variante CD44-arter med det metastatiske potensiale i to serier av rottetumorer indikerer en kausal rolle for disse glykoproteiner i den metastasedannende prosess. For å undersøke denne rolle ble p-Meta-1 overført i BSp73AS-celler og undersøkt om de derved forandret cellenes beteende. Det fullstendige, kodende område av pMeta-1

(fig. 2) ble innført nedenfor SV4 0-promotoren, og denne formasjon (diagram i fig. 5) ble sammen med PSV2neo innført i BSp73AS-celler. Enkelte G418-resistente og pMeta-1-uttrykkende kolonier ble oppnådd. Disse to koloniers RNA-mønster er gjengitt i fig. 5. Hybridiseringen av den variante CD44 spesifikke probe A oppviser en dominant transkript på ca. 2,2 kb, noe som i størrelse tilsvarer den minste, hyppige RNA som

transkriberes i BSp73ASML-cellene (fig. 5). De transkriberte celler inneholder imidlertid ca. 10 ganger så mye av denne RNA som BSp73ASML.

Andre størrelsesordner iakttas i en av de transkriberte celler (BSp73AS-pSVMetal-14), noe som kan være avhengig av stedet for plasmidintegrasjonen. En pSV2neo-simuleringsoverføringsklon (ikke gjengitt) og BSp73AS-mottakercellene inneholder ingen RNA som er komplementær til probe A. For å påvise de endogene, normale CD44-transkripsjoner (uten ekstraområdet til pSVMeta-1) i transfektene ble filteret strippet og re-hybridisert med probe D. Denne del av den ikke-translaterte 3'-sekvens finnes ikke i ekspresjonsklonen (se fig. 5). Probe D oppviser to hovedtranskripter på 2,9 og 4,9 kb i de to transfekters RNA-er (fig. 5, høyre spalte) både i kontrollen BSp73AS og i den ikke avbildete BSp73ASpSVneo.

Omtrentlige kvantifiseringer av de forskjellige, overensstemmende hybridiseringer viser at transfektene uttrykker ca. 5 ganger så mye av de variante CD44 RNA-er, som transkriberes ved hjelp av ekspresjonsplasmidet, slik som de endogene gentranskripter.

De overuttrykte cDNA-er translateres til et protein. De to transfekter som er vist i fig. 5, syntetiserer mAbl.lASML-immunfargbare proteiner av samme tilsynelatende størrelse, nemlig et hovedprodukt på 150 kDa og svakere bånd ved 100 kDa. På grunn av at cDNA-sekvensen koder for et primært proteinprodukt med bare 503 aminosyrer (tilsvarer 60.000 Da), må alle synlige bånd fremvise modifiserte former. Båndet på 150 kDa løper sammen med én av de modifiserte former av variant CD44, som uttrykkes i den metastasedannende celle BSp73ASML. BSp73AS lier simultanoverførte BSp73ASpSVneo-celler har ikke dette protein. Som i BSp73ASML-cellene ligger epitopen til cellene som uttrykkes av transfekten fritt på celle-overflaten .

For å bevise at ekspresjonen av variant CD44 er tilstrekkelig til å bibringe BSp73AS-celler et metastatisk potensiale ble transfekter injisert i syngeniske BDX-rotter (spontan metastaseprotokoll). I tidligere forsøk bredte det seg fra injeksjonsstedet hurtig ut metastatiske tumorceller BSp73ASML og var ca. 10 dager etter injeksjonen fullstendig fordelt (Matzku, 1984). Alle lokale tumorer ble derfor fjernet den 10. dag ved hjelp av amputasjoner. Alle bærere av BSp73ASML-celler og alle dyr som var injisert med én av de overuttrykte transfekter utviklet lungemetastaser (tabell 1). Forløpet for metastasedannelsen var forholdsvis hurtig, i løpet av 5-8 uker etter injeksjonen. Dyr som hadde fått BSp73AS-cellene eller simultantransfekter var etter dette tidspunkt helt friske (bortsett fra som følge av amputasjonen), og også etter 5 måneder kunne det ikke påvises noen metastaser.

Til tross for en overraskende likhet i den sterke metastasedannelse foreligger det enkelte interessante forskjeller. BSp73ASML-celler når i alle dyr frem til lymfeknutene og fører til en massiv forstørrelse av forskjellige knuter i området for inguinalranden og ved siden av aorta (tabell 1). En transfekt (BSp73AS-pSVMetal-14) forårsaker lymfeknuteforstørrelser i 3 av 8 dyr, selv om alle dyr utvikler multiple lungemetastaser (tabell 1) . Med den andre transfekt (BSp73AS-pSVMetal-15) kan det ikke fastslås noen lymfeknuteforstørrelse. Transfektene synes derfor å være i stand til å danne kolonier i lungen uten en obligatorisk vekstfase i lymfeknutene.

Forsøket ifølge tabell 1 tyder dessuten på en annen forskjell mellom BSp73AS-transfektene og BSp73ASML. De individuelle lungemetastaser er synlige makroskopisk, mens de fra BSp73ASML er små og tallrike. Imidlertid utvikler i en større serie med BSp73ASML (Reber et al., 1990) 11 av 20 dyr fra 5 til 20 knuter per lunge, enn transfektene.

For å fastslå at de dannete metastaser forårsakes av den injiserte transfekt og for å utelukke den usannsynlige mulighet for en spontan mutasjon, som overfører et metastatisk potensiale, ble de epitop-positive proteiner bestemt i de totale lungeekstrakter og i ekstrakter fra rekultiverte, metastasefrembringende celler. I den totale lungeekstrakt og i ekstraktene til en spesifikk lungeknute fra et dyr som hadde mottatt BSpAS-pSVMetal-15-transfekter, kan 150 kDa glykoproteinet påvises. Den G418-resistente stamme uttrykker ved vekst in vitro et protein med den samme tilsynelatende molekylvekt.

Diagnostikk og terapi.

1. Analyse av humant tumormateriale ved hjelp av hybridiseringer in situ med de foreliggende, humane pMeta-1 sekvenser. Disse forsøk er tenkt som innledende forsøk før det foreligger et antistoff som gjenkjenner den humane

EZB.

2. Fremstilling av antistoffer mot den humane EZB. Kloning av de humane pMetal-sekvenser i bakterielle ekspresjonsvektorer, slik at det oppstår fusjoner med j3-galaktosidase eller tryptofan E-produkt. Immunisering av kaniner med disse fusjonsproteiner respektivt med syntetiserte peptider fra nevnte EZB (koplet på bærer-molekyler). Isolering av de polyvalente respektivt monospesifikke antistoffer.

Anvendelsesmuligheter:

Immunhistologiske undersøkelser av klinisk tumormateriale (diagnostikk).

Påvisning av løselig EZB i serum fra pasienter ved hjelp av ELISA-tester (diagnostikk) .

Konstruksjon av toksinkoplede antistoffer for ved hjelp av antistoffet å bringe toksinet inn i tumor/ metastaseområdet (terapi).

Konstruksjon av antistoffer med to definerte antigen-bindingssteder.

Ved hjelp av denne dobbeltspesifisitet skal det forsøkes å utløse cytotoksiske reaksjoner i metastaseområdet (f.eks. Anti-CD2- eller -CD3-kopling) (terapi). 3. Produksjon av hMeta-1 protein ved hjelp av trans-formasjon av humane celler eller rotteceller med en ekspresjonsvektor som bærer den fullstendige hMeta-1 cDNA-sekvens, respektivt rensing av LCLC97-celler.

Anvendelsesmuligheter:

Injeksjon av proteinet eller deler derav for å blokkere tumorcellenes vev-bindingsseter.

Etter karakterisering av bindingssetene kunne også anvendelse i terapi være tenkelig, som kunne bestå i injisering av store mengder bindingsprotein som ville blokkere de vandrende tumorceller.

Litteraturliste:

L.A. Goldstein, D.F.H. Zhou, L.J. Picker, C.N. Minty, R.F. Bargatze, J.F. Ding og E.C. Butcher, A human lymphocyte homing receptor, the hermes antigen, is related to cartilage proteoglycan core and link proteins. Cell, Vol 56, 1989, p. 1063-1072. I.R. Hart, N.T. Goode og R.E. Wilson, Molecular aspects of the metastatic cascade., Biochim. Biophys. Acta, Vol 989, 1989, p. 65-84.

R.L. Idzerda, W.G. Carter, C. Nottenburg, E.A. Wayner, W.M. Gallatin og T. St. John, Isolation and DNA sequence of a cDNA clone encoding a lymphocyte adhesion receptor for high endothelium., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., Vol 86, 1989, p. 4659-4663.

G. Kohler, i: I. Lefkovits og B. Pernis (eds). Immunological Methods, Vol 2, 1981, p. 285. N.Y. Academic Press.

S. Matzku, Komitowski, Mildenberger og M. Zoller, Characterization of Bsp 73, a spontaneous rat tumor and its in vivo selected variants showing differenct metastasizing capacities. Inv. Met., Vol 3, 1983, p. 109-123 .

S. Matzku, A. Wenzel, S. Liu og M. Zoller, Antigenic differences between metastatic and nonmetastatic BSp73 rat tumor variants characterized by monoclonal antibodies. Cancer Res., Vol 49, 1989, p. 1294-1299.

A. Neri, D. Welch, T. Kawaguchi og G.L. Nicolson, Development and biologic properties of malignant cell sublines and clones of spontaneously metastasizing rat mammary adenocarcinoma. J. Nati. Cancer Inst., Vol 68, 1982, p. 507-517.

G.L. Nicolson, Tumor cell instability, diversification, and progression to the metastatic phenotype: from oncogene to oncofetal expression. Cancer Res., Vol 47, 1987, p. 1473-1487. C. Nottenburg, G. Rees og T. St. John, Isolation of mouse CD44 cDNA: structural features are distinct from the primate cDNA. Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., Vol 86, 1989, p. 8521-8525. I. Stamenkovic, M. Amiot, J.M. Pesando og B. Seed, A lymphocyte molecule implicated in lymph node homing is a member of the cartilage link protein family. Cell, Vol 56, 1989, p. 1057-1062.

K.K. Stanley og J.P. Luzio, Construction of a new family of high efficiency bacterial expression vectors: identification of cDNA clones coding for human liver proteins. EMBO J., Vol 3, 1984, p. 1429-1434.

A. Wenzel, Charakterisierung von Differenzierungs-antigenen auf dem Rattentumor Bsp 73 mit Hilfe monoklonaler Antikorper. Diplomarbeid, universitetet i Karlsruhe.

D. F.H. Zhou, J.F. Ding, L.F. Picker, R.F. Bargatze, E.C. Butcher og D.V. Goeddel, Molecular cloning and expression of Pgp-1 - The mouse homolog of the human H-CAM (Hermes) lymphocyte homing receptor., J. Immunol., Vol 143, 1989, p. 3390-3395.

Claims (13)

1. DNA-fragment som koder for en del av et overflateproteins metastasedannende tumorceller, karakterisert ved at DNA-fragmentet er valgt blant a) nukleotid-sekvensene og og b) nukoleotid-sekvenser som er degenerert i forhold til de under a) angitt DNA-sekvenser og/eller utgjør allele varia-sj oner.

2. DNA-fragment i samsvar med krav 1, karakterisert ved at det inneholder nukleotid-sekvenser som hybridiserer med én av de i krav 1 under a) angitt nukleotid-sekvenser og koder for et fullstendig overflateglykoproteins metastasedannende tumorceller.

3. DNA-fragment i samsvar med krav 2, karakterisert ved at det hybridiserer med én av de i krav 1 angitte nukleotid-sekvenser, som oppviser minst 85% homologi med reaksjonspartneren.

4. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den inneholder og kan uttrykke et DNA-fragment ifølge et av kravene 1, 2 og 3.

5. Transformert vertscelle, karakterisert ved at den inneholder en ekspresjonsvektor ifølge krav 4.

6. Polypeptid for anvendelse i et in vitro system, karakterisert ved at et DNA-fragment ifølge krav 1 koder for det.

7. Polypeptid for anvendelse i et in vitro system, karakterisert ved at det kan fremstilles ved hjelp av en ekspresjonsvektor ifølge krav 4 som inneholder et DNA-fragment ifølge krav 1.

8. Polypeptid i samsvar med krav 6 eller 7, karakterisert ved at det inneholder aminosyre-sekvensene ...r-protein og h-protein og allele variasjoner og glykosileringsprodukter derav.

9. Antistoff, karakterisert ved at det reagerer med epitopen av et polypeptid med aminosyresekvensen ifølge krav 6-8.

10. Antistoff mot et protein ifølge krav 6, karakterisert ved at det er fremstilt under anvendelse av et DNA-fragment ifølge krav 1 eller et protein ifølge krav 6 .

11. Anvendelse av et antistoff ifølge krav 9 til identifi-sering, fremstilling eller isolering av et polypeptid ifølge et av kravene 6-8.

12. Anvendelse av antistoffet ifølge krav 9 til fremstilling av et middel til diagnostisering av metastasedannende tumorer og/eller metastaser.

13. Anvendelse i samsvar med krav 12 hvor antistoffet er koplet til et enzym eller er merket med et fargestoff og/eller med en radioisotop.