JPH05508309A - 変体ｃｄ４４―表面蛋白質、これを暗号化するｄｎａ―配列、この蛋白質に対する抗体並びに診断及び治療におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 変体ＣＤ４４−表面蛋白質、これを暗号化するＤＮＡ−配列、この蛋白質に対す る抗体並びに診断及び治療におけるその使用本発明は、変体ＣＤ４４−表面蛋白 質、この蛋白質の変体決定子に対する抗体、並びにその製法、更に、この変体蛋 白質片に関して暗号化するＤＮＡ−配列、並びにこの蛋白質又はその１部分及び これら蛋白質に対する抗体を腫瘍転移の診断及び治療のために使用することに関 する。

転移する可能性は、悪性腫瘍細胞に特有の生命に危険な特性である。最初の１次 腫瘍細胞は、おそらく、腫瘍進行の過程での一連の変化によりこの特性を獲得す る。この過程の結果として、癌細胞変体は、絶えず、１次腫瘍物質から離れ、細 胞外マトリックスを遥遇し、リンパ系又は血液循環内に入り移動する。しばしば 、相互に付着して、転移性腫瘍細胞は血液又はリンパ系中で移送され、他の位置 でこの脈管系を出て、そのまわりで、２次組織内に入り、娘細胞を形成する（文 献：　Ｈａｒｔ等１９８９年、Ｎ１ｃｏ／　ｓｏｎ　１９８７　参照）。

転移の形成は、腫瘍細胞と細胞内マトリックス又は他の細胞との一連の相互作用 を必要とする。これらのほとんど全ての相互作用は、細胞表面成分例えばマトリ マウスに関するレセプター及び薄層、表面結合した蛋白質分解酵素並びに細胞付 着分子（組織特異性付着及びこれに伴なう転移の組織優先性を限定するようなも のを包含して）、更に、生長因子及び生長因子レセプターを必要とする。

ＢＳｐ７３ラッテ−腫瘍の非転移性及び転移性腫瘍細胞の膜蛋白質は、異なり、 抗体反応により検出されルコとは公知である（　１ｌａｔｚｋｕ等１９８３及び １９８９）。

ところで、転移性ＢＳｐ７３ＡＳＭＬ腫瘍細胞は、部分的に、公知の、リンパ球 付着及び細胞−細胞及び細胞−マトリックス交換作用に関与する糖蛋白質（ヒト におけるこの正常な糖蛋白質の呼称：ＣＤ４４、Ｒｅｒｕｅｓ　−１、マウスで は＋ｐｐｇ−１及びラッチでは：ＨＥＢＦｉｎ）に相当する表面蛋白質を含有す ることが判明した。しかしながら、新規変体ＣＤ４４−表面蛋白質は、これら公 知の配列とは、ヒトＣＤ４４−配列の２２０番と２３７番のアミノ酸（もしくは マウス−配列の２２４番と２３９番のアミノ酸）の間に挿入されている１５４個 のアミノ酸の細胞外範囲（ＥＺＢ）により異なっている。この新規糖蛋白質は、 転移時の細胞／マトリックスもしくは細胞／細胞結合に関して、重要な役割を有 するように思われる。従って、この蛋白質範囲（Ｅ　Ｚ　Ｂ）の製造及び同定は 、本発明の課題の１つである。ＢＳｐ７３ＡＳＭＬから得られた膜蛋白質を用い るマウスの免疫化により、変体ＣＤ４４−表面蛋白質のＥＺＨに対する抗体を形 成する肺臓細胞が得られた。ケーラー（Ｗｏｅｈｌｅｒ）　（１９８１）の方法 により、これを安定した培養液を得るために、ポリエチレングリコールで骨髄腫 細胞と共に融解させた。クローニング及び抗体を生じ、ＢＳｐ７３ＡＳＭＬとは 反応するが、非転移性株形ＢＳｐ７３ＡＳとは反応せず、他の非腫瘍原性ラッテ 細胞とも反応しない培養物の選択により、新規蛋白質骨ＥＺＢに対して特異的な 抗体を取得することができる。更なる実験のために、ＢＳｐ７３ＡＳＭＬ細胞を 免疫蛍光テストで特に強力に着色するモノクローナル抗体（ｍＡｂｌ、ＩＡＳＭ Ｌなる呼称を有する、ｍＡｂ：モノクローナル抗体）を選択した。

ウェスタンプロット試験により、ＢＳｐ７３Ａ、ＳＭＬ細胞からの蛋白質加水分 解生成物中で、１２００００．１５００００．１８００００及び２０００００の 分子量を有する４個の蛋白質バンドがｍＡｂｌ、］、。

ＡＳＭＬで測定できるが、ラッテ線維芽細胞及び非−転移性ラッテ腫瘍細胞から の抽出物は有意な反応を示さない。この大きさのちがいが、当初アミノ酸配列の ちがい又は強さの異なる後の蛋白質変性に依るのかは、なお確定することはでき なかった。いずれの場合にも、この抗体により認識されるエピトープは、全ての ４種の蛋白質中に含有しているが、対照のために使用した非転移性ＢＳｐ７３Ａ Ｓ−細胞又は正常う１．子細胞からの蛋白質中には含有しない。

表面蛋白質のＥＺＨに関して暗号化するｃＤＮＡ配列の単離 バクテリア表現ライブラリィ中のＥＺＢ−暗号化ＣＤＮＡ−配列を発見するため に、モノクローナル抗体ｍＡ、ｂ１．ＩＡＳＭＬを使用した。このライブラリィ をＢ　Ｓ　ｐ　７３　Ａ、　Ｓ　Ｍ　Ｌ細胞及びｐＥＺベクター系からのポリＡ ＋ＲＮＡを用いて構成した（　５ｔａｎｌｅｙ＆　Ｌｕｚｉ。

１．１９８４）。このｃＤＮＡ−配列により暗号化された生成物は、抗体を用い るβ−ガラクトシダーゼ融合蛋白質として発見できた。このように単離された、 モノクローナル抗体１．ＩＡＳＭＬに関してポジチブなｐＥＸ３４なる名称を有 するｃＤＮＡクローンは、１６７ヌクレオチドのｃＤＮＡ配列片を有する。次い で、再びＢＳｐ７３ＡＳＭＬ　ＲＮＡからのベクターｐＳＰ６５中の大きいｃ　 ＤＮＡライブラリィを詳細に調べるために、このｃＤＮＡ片を利用した。これで 単離されたクローンの１つ２Ｍ６６は、いわゆるプライマー延長（ｐｒｆｍｅｒ 　−Ｖｅｒｌａｅｒ＋ｇｅｒｕｎｇ　ニスターターオリゴヌクレオチド）及びポ リメラーゼ一連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、全長ｃＤＮＡ−クローンｐＭｅｔａ −１を単離するために役立った。完全な長さの証明は、プライマー延長（３２０ ７ヌクレオチド）を用いて得られた。ＢＳｐ７３ＡＳＭＬ−腫瘍からのＲＮＡと のコリニアリティ（Ｋｏｌｉｎｅａｒｉｔａｅｔ）が、ＲＮアーゼ及びＳ１保護 分析により記録された。

バクテリア中での表現及び抗体による認識を用いるｅＤＮＡの単離は、この抗体 が表面蛋白質のＥＺＢ中の１次的アミノ酸配列を認識することを証明する。

ＥＺＢ−暗号化メツセンジャーＲＮＡは、ＢＳり７ａＡＳＭＬ中で表現されるが 、ＢＳｐ７３ＡＳ−細胞中には表現されない。

バイブリド形成により特異的メツセンジャーＲＮＡ５を検出するために、ｅＤＮ Ａクローンから３種の異なる配列試料を得た。試料Ａは、ＥＺＢに関して暗号化 するｃＤＮＡ−範囲をカバーしている（位置：９４１〜１．．１０８　）　、試 料Ｂは、ｐＭｅｔａ−１から、位置１４０３−１５７２の間の配列を表わし、試 料Ｃは、初めから位置７９４までの配列を有する（第１図）。ＢＳｐ７３腫瘍細 胞系のポリＡ＋ＲＮＡを、電気泳動により分離し、ＲＮＡトランスファージ〜イ ブリド形成を用いて分析した。転移しない４種の細胞系は、試料Ａに対して相同 であるＲＮＡを含有せず、転移性腫瘍細胞ＢＳｐ７３ＡＳＭＬからのＲＮＡ　ｓ は、強力に反応する。試料Ａは、このＲＮＡ−調製物中で、２．２〜３．３　ｋ 　ｂの種々のＲＮＡ−寸法の非相同混合物及び４．９　ｋ　ｂ１７）大きいＲＮ Ａ一種を認識する。転移性腫瘍細胞変体中のモノクローナル抗体１．１ＡＳＭＬ により認識された特異的膜蛋白質の排他的表現は、明らかに、相応するＥＺＢ− 暗号化性メツセンジャーＲＮＡＢの排他的表現により、証明される。明らかに、 ３，２ｋｂの完全ｃＤＮＡ−クローンｐＭｅｔａ−１は、このＲＮＡ一種の全配 列を表出できない。ＲＮＡ−寸法の非相同混合物からの１種のみが表出できる。

試料Ｂ及びＣは、ＢＳｐ７３ＡＳＭＬ　ＲＮＡの分離の際に試料Ａと同じバイブ リド形成型を示し、いずれにせよ、そのかぎりにおいて、この非相同では、即ち 、このＲＮＡ−配列が、全ての３種の試料Ａ１Ｂ及びＢに対して相補的である配 列を有することが確認できる。試料Ａとは反対に、試料Ｂ及び試料Ｃは非転移性 細胞系中のメツセンジャーＲＮＡ一種をも認識する。ＲＮＡの大きさは、ＢＳｐ ７３ＡＳＭＬ中のそれとは明らかに異なり、即ち、１．５．２．０．２．９及び ４．３　ｋ　ｂの大きさを有する４種の明らかに異なるメツセンジャーＲＮＡ一 種が検出される。ＢＳｐ７３ＡＳＭＬからのＲＮＡ５の非相同混合物中でこれら ＲＮＡ−配列が隠されているとしても、これらは、ＢＳｐ７ａＡＳＭＬ中には同 じ量で存在しないことは確実である。決定的なことは、試料Ａに対する相補性を 有するＲＮＡ配列が明らかに、非転移性細胞内には完全に不在であることである 。従って、試料Ａ、Ｂ及びＣの配列が、転移性腫瘍中の同じＲＮＡ５に、しかも 、試料−Ａ−配列がＢ−Ｃ−ポジチブＲＮＡ　ｓ中にスプライシング挿入され、 この二者択−的スブライシングが転移性細胞系中でのみ起こるように含有してい ると、慎重に結論することができる。

ＲＮＡとｃＤＮＡとの間のコリニアリティを立証し、ＢＳｐ７３ＡＳとＢＳｐ７ ３ＡＳＭＬ細胞との間のＲＮＡ５のちがいを分析するために、Ｓｌ−ヌクレアー ゼ及びＲＮアーゼを保護分析を行なった。保護されたＤＮＡ−又はＲＮＡ−フラ グメントは、全長より小さくてよい。それというのも、５′−末端は、腫瘍細胞 からのＲＮＡ５とバイブリド形成することのできないベクター配列を有するから である。まず、３′位上の移行；即ち、試料Ａに対する相同を有する配列から試 料Ｂに対するそれへの移行を考慮した。双方の技術は、広い範囲にわたりこの試 料とコリニア−であるＢＳｐ７３ＡＳ細胞中の特有のＲＮＡ一種を示している。

更に、その５′は、ＢＳｐ７３ＡＳＭＬからのＲＮＡ配列に相当するｃＤＮＡ− もしくはＲＮＡ−試料をこのＢＳｐ７３ＡＳ−細胞からのＲＮＡとは異なる。Ｂ Ｓｐ７３ＡＳＭＬのＲＮＡ５は、特に、試料の大きいフラグメントを保護する配 列を含有する。この大きいフラグメントは、蛋白質分析に供されたＤＮＡ−もし くはＲＮＡ−片の全長に相応する。より小さいフラグメントも検出可能である。

、ＲＮＡ−トランスファーバイブリド形成は、種々の大きさのＲＮＡの非相同混 合物をカバーしているので、これらの小さい保護されたフラグメントが、ｃＤＮ Ａから特定位置即ち、予め証明された遺伝子拡散点と提供試料の５′末一端との 間の位置で拡散するＲＮＡ一種を示すことができる。これらＲＮＡ一種は、ＢＳ ｐ７３ＡＳ−細胞中では同様に検出できない。

ところで、５′位上の遺伝子拡散の点、即ち、試料Ｃとバイブリド形成する配列 から、試料Ａ即ちＥＢＺ−暗号化配列とバイブリド形成するものへの移行を考察 する。この分析は、５′切断点に関する相応する結果を与える。ＢＳｐ１３ＡＳ 細胞からのＲＮＡ　ｓは、提供試料を小範囲にわたってのみ保護することができ る。

ＢＳｐ７３ＡＳＭＬ細からのメツセンジャーＲＮＡ　ｓは、より長いフラグメン トを保護する。即ち、これらは、提供試料の全長にわたりコリニア−である。従 って、このｃＤＮＡクローンｐＭｅｔａ−１は、転移性腫瘍細胞ＢＳｐ７３ＡＳ ＭＬ内に現われる配列を描くと結論することができる。３′及び５′範囲は、Ｂ Ｓｐ７３ＡＳ細胞からのＲＮＡ５中にも認められる。前記技術を用いて記載され つる定義された移行を有するこのＥＺＢ−暗号化配列は、ここでは、ＲＮＡ−形 成のための二者択一的スプライスメカニズムが存在することを示している。ＥＺ Ｂ−配列への移行の５′及び３′切断点が第１図で矢印で示されている。

モノクローナル抗体１．　ＩＡｓＭＬは、糖蛋白質ＣＤＤ４４の１変体形を同定 する。

表面蛋白質に関する構造情報を得るために、全てのクローン化されたｃＤＮＡ分 子の配列決定をした。全長−クローンｐＭｅｔａ−１のヌクレオチド−配列及び これから誘導されたアミノ酸配列を第２図に示す。

全長−ｃＤＮＡ−クローンは、３２０７ヌクレオチドに渡って伸びている。３′ 末端は、１個のポリＡ端を有し、２個の付加的ポリアデニル化信号は、２２８８ 及び１７４３の位置に存在する。最初のＡＴＧコドンは、コンセンス−開始配列 に続き、１５０９ヌクレオチド（５０３アミノ酸に相当）の読み取り枠を開示す る。腹位置の蛋白質に関して推測するように、最初の２１アミノ酸は疎水性であ り、信号ペプチドである。この配列のどの部も、従来は、データベース内に見つ けることはできない。しかしながら、リンパ球−ホーミング−レセプターＣＤ４ ４　（もしくはＰｇｐ−１）に関して最近公開されたデータに対する配列相同を 発見した（　Ｉｄｚｅｒｄａ等１９３９　；　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ等１９８９　 ；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ等１９８９　；　Ｎｏｔｔｅｎｂｕｒｇ等１９８９　 ：Ｚｈｏｕ等１９８９）。この相同は、厳密に、非−翻訳領域を包含するｃＤＮ Ａの５′及び３′部に限られており、これは、既に前述されたＢ　Ｓ　ｐ　７３ 　Ａ、　Ｓ−及びＢＳｐ７３ＡＳＭＬ　ＲＮＡ−配列の間の拡散の点の所で終わ っている。拡散点の間の全範囲（第２図中、色の付いている所）即ち、転移−特 異性ＥＺＢ−暗号化配列の全範囲は、Ｐｇｐｌ−又はＣＤ４４−配列内には抽出 されていない。転移−特異性糖蛋白質は、明らかに、ＣＤ４４糖蛋白質の変体を 抽出している。即ち、これは、１５６アミノ酸の付加的なエキストラドメイン及 びこれに伴なう４１０アミノ酸の拡張された細胞外領域（２１アミノ酸信号ペプ チドを除いて）を、不変ＣＤ４４糖蛋白質の２７０アミノ酸（同様に信号ペプチ ドを除く）に対向して有する。しかしながら、非−転移性ＢＳｐ７３ＡＳ−細胞 内には、このＣＤ４４−ファミリーの不変の形が検出される。このＢＳｐ７３Ａ Ｓ−ＲＮＡｓのｃＤＮＡ−配列は、同様にクローニングされており、エキストラ ドメイン以外の転移−特異性クローンとの同一性が証明されている。

変体ＣＤ４４の表現は、転移ポテンシャルと相互に関連している。

変体ＣＤ４４糖蛋白質の表現が例外なくＢＳｐ７３ＡＳＭＬ細胞内で行なわれ、 それが、この細胞の転移ポテンシャルと又は一般的な転移ポテンシャルと関連し ているか否かを検査するために、他の一連の同質遺伝子ラッテ腫瘍細胞即ち乳癌 系の腫瘍細胞系１３７６２ＮＦ（Ｎｅｒｉ等１９８２）を研究した。ここで、親 腫瘍細胞系から誘導された細胞系即ちＭＴＰａ、ＭＴＣ１ＭＴＦ７及びＭＴＡ− 細胞（第１群）とリンパ節又は肺転移部に由来する細胞系、即ちＭＴＬＹ、ＭＴ Ｌｎ２、ＭＴＩ−ｎ３（第２群）とを比較する。第１群−細胞は、実質的に、正 常なＣＤ４４型（試料Ｂとバイブリド形成する際に、ＢＳｐ７３ＡＳ細胞からの ＲＮＡ５のそれに似ている）を表現する。これに反し、試料Ａでは、拡散ＲＮＡ バンド（これは約２．５　ｋ　ｂの大きさを有する）の少量が検出される。他方 、第２群−細胞は、まった（異なるＲＮＡ型を示す。双方の試料Ａ及びＢは、大 きいＲＮＡ種とバイブリド形成する。

その大きさは、ＢＳｐ７ａＡＳＭＬ中で検出されうるものと似ている。この類似 性は、ＲＮＡ５ｅ及びＳ１保護分析によっても記録されうる。これらのデータに 基づき、ＲＮＡのスプライシング型内の変化及び変体ＣＤ４４の表現は、転移の 生成と相互に関連しており、この転移性乳癌細胞中で獲得された型は、非常に、 既に転移性ＢＳｐ７３ＡＳＭＬ細胞系に関して知ったものに一致すると結論する 。高分子量で、この抗体により認識される蛋白質は、ＢＳｐ７３ＡＳＭＬ抽出物 中で検出された蛋白質の双方の高分子量の種に一致する。この乳癌腫瘍系内で、 同様に、ＲＮＡ一種及び高分子量蛋白質の転移特異性表現も認められる。１群即 ちいわゆる親細胞系内にも、主として試料Ａ即ちＥＢＺ−暗号化配列とバイブリ ド形成するＲＮＡ　ｓが認められ、かつ、抗体により１ｏｏｏｏｏダルトソの蛋 白質の僅かな着色も認めることができるということは、１群−細胞も僅かな転移 可能性を有し、実際に転移性を示さない当初の腫瘍細胞系ＢＳｐ７３ＡＳとはま ったく反対であることに帰因する。

モノクローナル抗体１．ＩＡＳＭＬは、ラッチ内での転移形成を抑制する。

同質遺伝子ラッチにおける腫瘍細胞系ＢＳｐ７３ＡＳ　Ｍ　１．の転移形成の一 連の実験で、細胞を皮下注射し、種々の時間に、腫瘍施与の前及び後に、２〜３ 日の間隔で、モノクローナル抗体１．１ＡＳＭＬを腹腔的注射した。この免疫学 的プロトコルの分野でも、注射抗体に対するラッチの免疫応答が起こったように 確認された。即ち、抗−マウス−免疫グロブリン抗体並びに抗イディオタイプ− 抗体も生じる。この一連の実験の結果は、腫瘍の生長及び転移は、１．１ＡＳＭ Ｌの注射により著るしく遅延されることを示している。この遅延は、その反応速 変論で、この抗体が転移の初期段階と干渉すると結論することができる。この実 験は、転移性細胞の表面の抗体により認識された蛋白質構造が、転移過程に役割 を有し、治療及び診断計画で実現可能にすることを示している。

ラッテｃＤＮＡのＥＢＺ暗号化配列部に対する相同ヒト配列の単離。

培養液中のヒト腫瘍細胞にとって、もちろん、直ちに、ラッチ系に相応して、そ れらがなお転移特性を保持しているか否かを検出する可能性はない。免疫拡散し たマウスを用いる実験は、ヒトにおける転移ポテンシャルに関して非常に限られ た言及のみを可能とする。従って、従来、世界中で培養液中に取られていた比較 的多くの腫瘍細胞系を、これらがラッチ転移に関して証明することができた配列 を表現するか否かを試験すべきであった。このような腫瘍を見つけることは成功 している。これは、ヒトの大細胞肺癌に由来し、番号：　ＬＣＬＣ９７を有する 。この腫瘍細胞系中には、ラッチの転移性腫瘍細胞系中で検出可能であるＲＮＡ ５にまったく一致する挙動をする３種の特定のＲＮＡ一種（大きさ：　５．５． ３．４及び２．８　ｋ　ｂ）が検出できる。これらは、即ち試料Ａとも試料Ｂ及 びＣともバイブリド形成し、即ち、これらヒトＲＮＡ種も、広い範囲にわたり、 ｃＤＮＡｐＭｅ　ｔ　ａ−１に対して同じである（８５％）。

モノクローナル抗体１．１ＡＳＭＬは、この腫瘍細胞と反応せず、即ちこの抗体 により認識された坪量白質は抗原決定因子の範囲内で、ヒト腫瘍細胞の表面上に 発現する蛋白質とは異なる。非反応性に関して、この抗体の高い特異性に基づく 、最小の偏りに達する。

ヒト腫瘍細胞ＬＣＬＣ９７は、ｃＤＮＡ−ライブラリィを構成するために役立っ た。ラッテ−及びヒト配列の間の高い一致性に基づき、試料Ａに対して相同性を 示すｃＤＮＡクローンを単離することができた。ヒトｃＤＮＡを配列決定した。

第３図（ａｌｂ）に、１次配列及びそれから誘導されたアミノ酸配列を示す。ラ ッテ−及びヒト−配列の間に大きい範囲にわたり充分な同一性が存在することが 判る。このヒト配列並びにそれから誘導されたアミノ酸配列も、同様に、本発明 の目的である。

次のクローン化されたＢＳｐ細胞系を、この試験に使用した：　ＢＳｐ７３ＡＳ ＭＬ−１及びｌ０ＡＳ−７かつ培養液中に夏ａｔｚｋｕ等による記載（１９８３ ）のように保持した；更に、Ｎｅｒｉ等による記ｌｌｌ１（１９８２）の乳癌細 胞系ＢＳｐ７３ＡＳＭｌｌ蛋白質に対するモノクローナル抗体を、Ｂａ１ｂｃマ ウスの免疫化により製造した。免疫化されたマウスの膵臓細胞の単離の後に、こ れを不滅化のために、Ｋｏｅｈｌｅｒのモノクローナル抗体の製法によりＡｇ８ 骨髄腫細胞と融合させた。得られたハイブリドーマ細胞を、ＢＳｐ７３ＡＳＭＬ に対する特異抗体を産生ずるが、ＢＳｐ７３Ａｓ及び正常ラッチ繊維芽細胞に対 しては産生じないものを見つけるために、スクリーニング法を実施した。その正 確な処置法は、同様に、ｌ１ａｔｚｋｕ等の文献（１９８９）に記載されている 。

相応する特異性を有するモノクローナル抗体（ｍＡＫ）産生性のハイブリドーマ 細胞を、組織培養液中で膨張させ、この媒体中に放出されたｍＡＫを硫酸アンモ ニウム沈殿及びカラムクロマトグラフィ（蛋白質Ａ−セファロース及びＭｏｎｏ Ｑ　）により著るしく濃度増加させ、この形で実験に使用した。その１つがｍＡ Ｋ　１．１ＡＳＭＬである。

免疫蛍光 種々の腫瘍細胞上の変体ＣＤ４４分子の抽出のために、腫瘍細胞を培養液中に入 れ、次いで燐酸塩緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）”？？洗浄シ、１．１ＡＳＭＬと共！ ：：４０℃で３０分間インキュベートした。この結合の検出ための２次抗体とし て、ローダミン結合ウサギ抗−マウスＩｇＧを使用し、蛍光顕微鏡中で抽出した 。

ｃＤＮＡ表現ライブラリィの構成及びイムノスクリーニング ＢＳｐ７３ＡＳＭＬ細胞からのポリＡ＋ＲＮＡを、オリゴ（ｄ、　Ｔ　）及び種 々の組成のへキサヌクレオチドでプライム化しくｇｅｐｒｉｍｔ）　、Ａ　Ｍ　 Ｖからの逆トランスクリプターゼを用いて、ｃＤＮＡの第１鎖を合成した。Ｅ、 コリーＤＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮアーゼＨ及びＥ、コリーリガーゼを用いてこ のｃＤＮＡの第２の鎖を製造し、引続き２本舗ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラー ゼを用いてその末端でベクタディングした（ｂｅｇ−ｒａｄｉｎｇｔ）。３種の 読取ラスター中でｃＤＮＡの融合を可能にするベクターｐ　Ｅ　Ｘ　１．２及び ３　（５ｔａｎｌｅｙ及びＬｕｚｉｏｓ　１９８４　）を、Ｓｍａｌ制限エンド ヌクレアーゼを用いて切断し、ｃＤＮＡとリゲートさせた（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ ）。温度敏感なリプレッサーを産生ずるコンピテントＥ、コリーＤＨ５（ｐＣＩ 　８５７）バクテリアを、ｐＥＸ−ｃＤＮＡコントラストを用いてトランスフェ クトさせ、ナイロンフィルター上で培養した。温度敏感なリプレッサーＲＣＩ８ ５７に関する遺伝子は、ｐＥＸプラスミドと適合性のプラスミドｐｃｒ８５７上 に存在する。２８℃で、融合蛋白質の合成を制御するＩＰ、プロモータは遮断さ れている。４２℃まで昇温することにより、このＣＩリプレッサーは失活され、 β−ガラクトシダグー／ＡＳＭＬ融合蛋白質の合成は、実質的に進行される。こ の熱誘導されたバクテリアコロニイを、引続き、フィルター上で、クロロホルム 蒸気を用いて変性し、次いで、これを、乾燥乳粉末３％、リソチーム及びＤＮア ーゼを含有するＰＢＳ中でインキュベートする。ナイロンフィルターに固定され たバクテリア融合蛋白質を、次いで、ｍＡＫｌ、ＩＡＳＭＬと共にインキュベー トし、非特異的に結合したｍＡＫの洗浄除去の後に、結合の検出のために、２次 抗体１２５Ｊとしてマークされたウサギ抗−マウスＩｇＧを使用する。オートラ ジオグラフィにより、オリジナルのバクテリアフィルターからの陽性クローンを 単離し、更に分析した。１．１ＡＳＭＬと特異的に反応する融合蛋白質を合成し たクローンはｐＥＸ３４であった。このバクテリアクローン中に含有されるｐＥ Ｘプラスミドは、１６７ヌクレオチドＣＤＮＡを有し、これは特に、エピトープ （もしくは抗原決定因子）を暗号化し、その特異性ｍＡＫ１．１ＡＳＭＬを有す る。

次いで、全長ｃＤＮＡｍＭｅ　ｔ　ａ−１７７）単離を、標準法で行なった。

ｍＡＫｌ、１ＡＳＭＬを用いるラッテの免疫化ＢＳｐ７３１！１瘍細胞に対する 純系であるＢＯＸラッチに、皮下もしくは腹腔内に、ｍＡＫｌ、ＩＡＳＭＬ（Ｋ ｅｙｈｏｌｅ　Ｌｔｍｐｅｔ　Ｈａｅｓｏｃｙａｎｉｎｅに結合した）を、完全 フロインドアジュバントと共に注射した。第１の注射は、ＢＳｐＡＳＭＬ細胞の 注射（足皮下脂肪組織中に）の前に１０．７及び３日に行ない、次いで、その後 ３．７．１１．１４、及び２１日に行なった。２８日後に、ラッチを殺し、種々 のリンパ節を標本化し、秤量し、肉眼で見える肺転移を計数した。

変体ＣＤ４４表面蛋白質の表現と転移ポテンシャルとの間の関係 変体ＣＤ４４糖蛋白質の表現が、単に検査ＢＳｐ７３ＡＳＭＬｍ胞系の特性のみ であるか、又はその表現が転移ポテンシャルと関連するのか否がを確認するため に、１３７６２ＮＦ−乳癌から生じる他の１運のラッチ腫瘍細胞（Ｎｅｒｉ等１ ９８２）を検査した。更に、１次−腫瘍から生じる細胞系（ＭＴＰａ、ＭＴＣ， ＭＴＦ７及びＭＴＡ　（第１群））とリンパ節−及び肺−転移から生じる細胞系 （ＭＴＬｙＳＭＴＬｎ２、ＭＴＬｎ３　（第２群））とを比較した。ＣＤ４４か ら誘導されたＲＮＡの型を第４図に示す。ここで、試料Ａ１Ｂ及びＤは、前記の 第１図に記載の試料に相当する。

第１群の細胞は、全て、試料Ｂを有する正常なＣＤ４４−型を示す。これに反し て、第２群の細胞は、それとは異なる型を示す。そのＲＮＡは、第１群のＲＮＡ より大きく、ＢＳｐ７３ＡＳＭＬのＲＮＡに相当する。より小さいＲＮＡ５は、 試料りとのバイブリド形成の際に消失する。残りの型は、双方のラッチ腫瘍系の 間での類似性を示している。

試料Ａを用いても、第２群のＲＮＡ−型は、ＢＳｐ７３ＡＳＭＬのそれに相当す る。試料Ａは、ＢＳｐ７３ＡＳからのＲＮＡとはバイブリド形成しないが、第１ 群の細胞では、約２．５　ｋ　ｂの小さい拡散ＲＮＡ−バンドを生じる。ＲＮア ーゼ及びＳ１ヌクレア一ゼ保護分析は、同様に、構造的類似性を示す。これらの 結果から、変体ＣＤ４４ＲＮＡｓの切断型及び表現における変化は、転移の形成 を伴って現われるように見えるｐ　Ｍ　ｅ　ｔ　ａ　−１の過剰表現による非転 移性ＢＳｐ７３ＡＳ−細胞上への転移ポテンシャルの移動変体ＣＤ４４種の表現 とラッチ腫瘍の２系列中の転移ポテンシャルとの関係は、転移過程のこの糖蛋白 質の原因的役割を証明している。このことを検査するために、ｐ−Ｍｅｔａ−１ をＢＳｐ７３ＡＳ−細胞中に移行させ、これによって細胞の挙動が変るか否かを 検査した。ｐＭｅｔａ−Ｌの完全暗号化領域（第２図）を、５Ｖ４０−プロモー タの下に導入し、この構成体（第５図の線図）を、ＰＳＶ２ｎｅｏと共にＢＳｐ ７３ＡＳ−細胞中に導入した。個々の６４１８−抵抗性及びｐＭｅｔａ−１表現 性コロニーが得られた。この２つのコロニーのＲＮＡ−型を第５図に示す。変体 ＣＤ４４特異性試料Ａのバイブリド形成は、約２．２　ｋ　ｂの支配的トランス クリプトを示し、これは、ＢＳｐ７３ＡＳＭＬ−細胞中で書き換えられる。最小 頻発ＲＮＡの大きさに相当する（第５図）。しかしながら、このトランスフェク トされた細胞は、ＢＳｐ７３ＡＳＭＬと同様に、約１０倍も多いこのＲＮＡを含 有する。

このトランスフェクトされた細胞（ＢＳｐ７３ＡＳ−ｐｓＶＭｅｔａｌ−１４） の１つ中で、他の大きさが観察され、これは、プラスミド−組込みの場所に関連 しつる。ｐ　Ｓ　Ｖ　２　ｎｅｏシミュレーション移行うローン（再現されず） 及びＢＳｐ７３ＡＳ−受容体細胞は、試料Ａに対し相補的であるＲＮＡを含有し ない。内在性正常ＣＤ４４−転写（ｐＳＶＭｅ　ｔ　ａ−１のエキストラドメイ ンなし）をトランスフェクト内に発現させるために、フィルターを線状化し、試 料りと再バイブリド形成させた。翻訳されなかった３′配列のこの部分は、表現 クローン中に含有されていない（第５図参照）。試料りは、双方のトランスフェ クトのＲＮＡ内に２．９と４．９　ｋ　ｂの２個の主トランスクリプトを、コン トロールＢＳｐ７ａＡＳ中にも模写されなかったＢＳｐ７３ＡＳ　ｐｓＶｎｅｏ 中に検出する。

種々の相応するバイブリド化の大体の計量は、このトランスフェクトが、変種Ｃ Ｄ４４ＲＮＡｓの約５倍で発現することを示しており、これは、内在性遺伝子ｌ ・ランスクリプトと同様に、表現プラスミドにより転写されている。

過剰表現されたｃＤＮＡは、蛋白質中に翻訳される。第５図に示されている双方 のトランスフェクトは、同じに見える大きさのｍＡｂｌ、ＩＡＳＭＬ−免疫化可 能な蛋白質、即ち１５０ＫＤａの主生成物及び１０Ｑ　Ｋ、　Ｄ　ａでの弱いバ ンドを合成する。ｃ　ＤＮＡ−配列は、５０３アミノ酸のみの１次蛋白質生成物 を暗号化する（約６００００ダルトンに相当）ので、全ての可視バンド変性され た形を抽出するはずである。１５０ＫＤ−バンドは、変体ＣＤ４４の変性された 形の１個（これは転移性細胞ＢＳｐ７３ＡＳＭＬ中で表現される）と共に進む。

ＢＳｐ７３ＡＳ又はシミュレーション転写された１３ｓｐ７３Ａｓ　ｐＳＶｎｅ ｏ細胞は、この蛋白質を有しない。ＢＳｐ７３ＡＳＭＬ−細胞中におけるように 、トランスフェクトにより表現された細胞のエピトープは細胞表面で露呈されて いる。

ＢＳｐ７３ＡＳ−細胞に転移ポテンシャルを与えるために、変性ＣＤ４４の表現 が充分であることを立証するために、トランスフェクトをシンゲンＢＤＸ−ラッ テ（天然の転移−プロトコル）中に注入した。早期表現体中には、注入の場所か ら転移性の腫瘍細胞ＢＳｐ７３ＡＳＭＬが急速に拡がり、注入後約１０日には完 全に分散されていた（Ｍａｔｚｋｕ、　１９８４　）。従って、全ての局所的腫 瘍は、１０日後に、切断により除いた。ＢＳｐ７３ＡＳＭＬ−細胞の全キャリア 及び過剰表現されたトランスフェクトの注入された全ての動物は、肺転移を発現 した（第１表）。転移形成の経過は、比較的急速であり、注入後、５〜８週内で あった。

ＢＳｐ７３ＡＳ−細胞又はシミュレーショントランスフェクトを獲得した動物は 、この時間の後に、完全に健康であり（切断による以外）、５ケ月後にも転移を 確認できなかった。

強力な転移形成の意想外の類似性にもかかわらず、い（つかの重要な差異がある 。ＢＳり７３ＡＳＭＬ−細胞は、全ての動物中で、リンパ節に達し、そ径部内及 び大動脈の付近で、種々の結節の実質的増大をもたらす（第１表）。トランスフ ェクト（ＢＳｐ７３ＡＳ−ｐＳＶＭｅｔａｌ−１４）は、全ての動物が複数肺転 移を起こす（第１表）が、３〜８動物中でのリンパ節増加をもたらす。他のトラ ンスフェクト（ＢＳｐ７３ＡＳ−ｐｓＶＭｅｔａｌ−１５）を用いてハ、リンパ 節増大は確認できなかった。従って、このトランスフェクトは、リンパ節内で必 須の生長相なしで肺内でコロニーを形成することができると見える。

第１表による表現は、ＢＳｐ７３ＡＳ−トランスフェクトとＢＳｐ７３ＡＳＭＬ との間のもう１つのちがいを示している。個々の肺転移は、肉眼で見え、ＢＳｐ 　７３　Ａ　Ｓ　Ｍ　Ｌ　ｌ、：よるそれは小さく、多いが、ＢＳｐ７３ＡＳＭ Ｌを有する多くの系では、１１〜２ｏ動物で、１肺当りトランスフェクトよりも ５〜２０個多い結節を生じる。

生じた転移が注入されたトランスフェクトにより誘起されたことを確認し、転移 ポテンシャルを伝達する自然の突然変異のありそうもない可能性を排除するため に、全肺抽出物中及び再培養された転移獲取細胞の抽出物中のエピトープ陽性蛋 白質を測定した。集めた肺抽出物中並びにＢＳｐＡＳ−ｐＳＶＭｅ　ｔ　ａ　ｌ −１５−トランスフェクトを得た動物の特異的肺結節の抽出物中に、１５０ＫＤ ａの糖蛋白質が検出可能である。Ｇ４１８−抵抗−菌株は、試験管内生長の際に 、同じに見える分子量の蛋白質を発現する。

診断及び治療 １、　存在するヒｈｐＭａｔｅ−１配列とのその場でのバイブリド形成によるヒ ト腫瘍物質の分析。この実験は、予め、ヒトＥＺＢを認識するＡＫを提供する予 倹実験と考えられている。

２、　ヒトＥＺＢに対する抗体の製造 バクテリア表現バクター中のヒトｐＭｅ　ｔ　ａ　１配列のクローニング、従っ てβ−ガラクトシダーゼ又はトリプトファンとの融合で、Ｅ−プロダクツが生じ る。融合蛋白質もしくはＥＺＢからの合成蛋白質（担体分子上に結合）を用いる ウサギの免疫化。多価もしくは１価特異性の抗体の単離。

使用可雌性ニ ー臨床的腫瘍物質の免疫学的経過検査（診断）−ＥＬ　Ｉ　ＳＡ−テストを用い る患者の血清中の可溶性ＥＺＢの検出（診断）。

一抗体を用いてトキシンを腫瘍／転移範囲内に入れるための、トキシン結合転抗 体の形成（治療）。

−２個の規定された抗体結合位置を有する抗体の形成。この２重特異性により、 転移範囲内で細胞毒反応を開始させる（例えば抗ＣＤ２−又はＣＤ３−結合）試 みがなされる（治療）。

３、　完全なｈＭｅ　ｔ　ａ−１，ｃＤＮＡ配列を有する表現ベクターを用いる ヒト又はラッチ細胞のトランスフェクションによるｈＭｅｔａ−１１白賞の産生 もしくはＬ　ＣＬ　Ｃ９７−細胞からの精製。

使用可能性ニ ー腫瘍細胞の組織結合位置をブロックするための蛋白質又はその１部分の注入。

一結合位置の特牲付けの後に、移動性腫瘍細胞をブロックする結合蛋白質の多量 を注入することに依る治療のための使用も考えられる。

文献リスト： Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｌ、＾、、Ｚｈｏｕ、Ｄ、Ｆ、Ｆｌ、、ＰｉｃｋｅｒＳＬ 。

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、Ｗａｖｎｅｒ、　Ｅ、　Ａ、　、Ｇａ１ｌａｔｉｎ、　１．夏、及びＳｔ、　 Ｊｏｈｎ。

Ｔ、（１９ｇ９）　”ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ　ａ　ｅＤＮＡ　ａｌｏｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａ　Ｉｙｍｐｈｏｃｙｔ ｅａｄｎｅｓｉａｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆａｒ　ｈｉｇｈ　ｅｎｄｏｔｈｅＨ ｕ＋ｗ　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、Ｕ、Ｓ、＾、８６：４６５９−４６６３゜ Ｋａｅｈｉｅｒ、　Ｇ、（１９８１）　Ｉｎ：　Ｌ　Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ及びＢ 。

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２８５゜　Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

１１ａｔｚｋｕ、　Ｓ、Ｊｏｍｆｔｏｙｓｋｉ、Ｍｉｌｄｅｎｂｅｒｇｅｒ及び Ｚｏｅｌｌｅｒ、Ｍ、（１９８３）　’Ｃｈａｒａｃｔｅｒｆｚａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　Ｂｓｐ７３、ａ　５ｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｒａｔｔｕｍｏｒ　ａｎｄ　ｉ ｔｓ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　５ｅｌｅｃｔｅｄｖａｒｆａｎｌ　ｓｈＯｖｉｎｇ　ｄ ｉＨｅｒｅｎｔ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｚｉｎｇ　ｃａｐａｃｉ−ｔｆｅｓ、”　 ｒｎｖ、１ｌｅｔ、３　：１０９−１２３゜１１ａｔｚｋｕ、　Ｓ、　、Ｗｅｎ ｚｅＬ＾、　、Ｌｉｕ、　Ｓ、及びＺｏｅｉｌｅｒ。

１、（１９８９）　。”Ａｎｔｆｇｅｎｉｃ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔ −ｙｅｅｎ＋＊ｅｔａｓｔａｔｉｃ　ａｎｄ　ｎｏｒ＋ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ　 ＢＳｐ７３　ｒａｔ　ｔｕｍｏｒｖａｒｉａｎｔｓ　ｅｈａｒａｃｔｅｒｔｚｅ ｄ　ｂｙ　＋ｇｏｒ＋ｏｃｌｏｎａｉ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ。

″　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４９　：　１２９４−１２９９゜Ｎｅｒｉ％Ａ、、 　Ｗｅｌｃｈ、　Ｄ、、Ｋａｗａｇｕｃｈｉ、、Ｔ　及びＮ１ｃｏｌｓｏｎ、Ｇ 、Ｌ、（１９８２）　”Ｄｅｖｅｌｏｐ＋５ｅｎｔ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｆｅｓ　ｏｆ　ｍａｌｌｇｎａｔ　ｃｅｌｌ　５ｕｂｌｉｎｅｓ 　ａｎｄ　ｃｌｏｎｅｓｏｆ　５ｐｏｒ＋ｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｍｅｔａｓｔａ ｓｉｚｉｎｇ　ｒａｔ　ｍａｍｍａｒｙ　ａｄｅ−ｎｏｃａｒｅｉｒ＋ｏａａ、 ＝　Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、（３３：　５　Ｇ７−５　１　７ ゜ Ｎ１ｃｏｌｓｏｎ、Ｇ、Ｌ、（１９８７）　Ｔｕｔｏｒ　ｃｅｌｌ　ｔｎｓｔａ ｈｉｌ−ｉｔｙ、ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎＳ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｒｅｓ ｓｉｏｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　＋ｍｅｔ−ａｓｔａｔｉｅ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ：　 ｆｒｏ＋ｍ　ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ｔｏ　ｏｎｃｏｆｅｔａｌｅｚｐｒｅｓｓｉｏ ｎ、”　Ｃａｎｅｅｒ　ｒｅｓ、４７　：１４７３−１４８７゜ Ｎｏｔｔｅｎｂｕｒｇ、　Ｃ，、Ｒｅｅｓ、　Ｇ、及びＳｔ、　ＪｏｈｎＳＴ、 （１９８９）　’ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ＣＤ　４４　ｃ　Ｄ 　Ｎ　Ａ：５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｆｅａｔｕｒｅｓ　ａｒｅ　ｄｉｓｔｉｎｃ ｔ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅｐｒｉｇ＋ａｔｅ　ｃ　ＤＮＡ、”　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ。

Ａ、８６　：　８５２１−８５２５゜ Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ、１．　、＾ｍ１ｏｔ、Ｌ　、Ｐｅ５ａｎｄｏ、Ｊ、Ｉ ｌ、及び５ｅｅｄ、　Ｂ、（１９８９）　”＾　ＩＢｐｈｏｃｙｔｅ　ｍｏｌｅ ｃｕｌｅｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ　ｉｎ　ｌｙｍｐｎ　ロｏｄｅ　ｈｏｓｉｎｇ　 ｉｓ　ａ　ｍｅｍｂｅｒｏｆ　ｔｈｅ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　１ｆｎｋ　ｐｒｏ ｔｅｉｎ　ｆａｍｉｌｙ、”　Ｃｅ１１５６　：１０５７−１０６２゜ ５ｔａｎｌｅｙ　Ｋ、　Ｋ、及びＬｕｚｉｏ、　Ｊ、　Ｐ、（１９８４）、”Ｃ ｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｅｗ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｈｉｇｈ　 ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏ ｒｓ：　１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆｃＤ　Ｎ　Ａ　ｃｌｏｎｅｓ　ｃ ｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　１ｉｖｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ、”ＥＭＢＯ Ｊ、３：１４２９−１４３４゜Ｗｅｎｚｅｌ、＾、（１９８５）　’Ｃｈａｒａ ｋｔｅｒｉｓｉｅｒｕｎｇ　ｖａｎＤｉｆｆｅｒｅｎｚｉｅｒｕｎｇｓａｎｔｉ ｇｅｎｅｎ　ａｕｆ　ｄｅｗ　ＲａｔｔｅｎｔｕｓｏｒＢｓｐ７３ｍｉｔ　Ｈｉ ｌｆｅ　ｍｏｎｏｋＬｏｎａｌｅｒ　Ａｎｔｉｋｏｅｒｐｅｒ、”カールスルー エ大学博士論文 Ｚｈｏｕ、　Ｄ、　Ｆ、　Ｈ，、Ｄｆｎｇ、　Ｊ、　Ｆ、　Ｐｉｃｋｅｒ、　Ｌ 、　Ｆ、、Ｂａ−ｒｇａｔｚｅ、　Ｒ，Ｆ、　、Ｂｕｔｃｈｅｒ、　Ｅ、　Ｃ， 及びＧｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、Ｖ。

（１９８９）　”１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎｏｆ　Ｐｇｐ−１−Ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｈｏａｏｌｏｇ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　ｈｕｍａｎＨ−ＣＡ　Ｍ　（Ｈｅｒｍｅｓ）　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｈ ｏｓｉｎｇ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、”Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４３　：　３３９ ０−３３９５゜第　１　表 その変体ＣＤ４４ｃＤＮＡがｐＭｅｔａ−１を表現するＢＳｐ７３ＡＳ−細胞の 転移性拡大＊＊＊腫瘍クローン　局所的　転移性オードブシー発　生　における 分布 ”ＬＮ　ｉｎｇ　”ＬＮ　ｐａｒ肺 ＢＳｐ７３ＡＳＩＩＬ　Ｏ／　８　ｇ／　８　８／　８　８／　８φ１．５−２ ．５”　φ２．５−５．０　粟粒性ＢＳｐ７３ＡＳ−０／　８　３／　８　３／ 　８　８／　８ｐｓＹＩＩｅｔａｌ−１４φ０．３−１．２　φ１．０−４．５ 　多重φ０．３−５．０ ＢＳｐ７３ＡＳ−０／　８　０／　８　０／　８　８／　８ｐｓＶＭｅｔａｌ− １５５−２０ φ０．３−１０．０ ＢＳｐ７３ＡＳ　１／　８　０／　８　０／　８　０／　８ＢＳｐ７３ＡＳ−０ ／　８　０／　８　０／　８　０／　８ｐｓＶｎｅ。

＊＊　平均直径（舅＠） ＊＊＊　この表は、所定細胞の注射後６０日の段階を示す。

＊ＬＮ＝リンパ節 ｍ　Ｅ　’Ｅ　：ｊ　：：　Ｅ　ａ　：ｖ　Ｅ　至■　巨■　呑■　舌８！　匡 ；層　手＝コ要　約　書 本発明は、変体ＣＤ４４表面蛋白質に関する。この蛋白質の変体決定子に対する 抗体及びその製法及びこの変体蛋白質片を暗号化するＣ−ＤＮＡ配列及びこの蛋 白質又はその１部分及びこれに対する抗体の腫瘍転移の診断及び治療への使用。

国　際　ｖ４　登　権　舌

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．表面蛋白質転移性腫瘍細胞に関して暗号化するＤＮＡ−フラグメントにおい て、このＤＮＡ−フラグメントは、 ａ）ヌクレオチド−配列 【配列があります】及び【配列があります】ｂ）ａ）に記載のヌクレオチド−配 列とハイブリド形成し、転移性腫瘍細胞の表面糖蛋白質に関して暗号化するヌク レオチド−配列 ｃ）ａ）及びｂ）に記載のＤＮＡ−配列に対して変性されており、かつ／又は対 立変体であるヌクレオチド−配列 から選択されていることを特徴とする、ＤＮＡ−フラグメント。
2. ２．反応成分に対して少なくとも８５％の相同を有するヌクレオチド配列とハイ ブリド形成する、請求の範囲１に記載のＤＮＡ−フラグメント。
3. ３．ベクトリエルヌクレオチド配列及び請求の範囲１に記載のＤＮＡ−フラグメ ントより成る、組換えＤＮＡ−分子。
4. ４．表現ベクタ−である、請求の範囲３に記載の組換えＤＮＡ−分子。
5. ５．請求の範囲１又は２に記載のＤＮＡ−フラグメント又は請求の範囲３又は４ に記載の組換えＤＮＡ−分子を含有する、形質転換宿主細胞。
6. ６．請求の範囲１及び２に記載のＤＮＡ−フラグメントにより暗号化される、ポ リペプチド。
7. ７．請求の範囲３又は４に記載の組換えＤＮＡ−分子により製造可能な、ポリペ プチド。
8. ８．アミノ酸配列 ……ｒ−蛋白質…… 【配列があります】及びｈ−蛋白質【配列があります】及びこれらの対立変体及 びグリコシル化生成物を包含する、請求の範囲６及び７に記載のポリペプチド。
9. ９．請求の範囲６から８に記載のポリペプチドのエピトープと反応する、多価− 及び１価の抗体。
10. １０．請求の範囲１又は２に記載のＤＮＡ−フラグメント、その相補性ストラン ド、その誘導体及びその１部分を、転移性腫瘍細胞の表面糖蛋白質に関して暗号 化するヌクレオチド配列又はその１部分の同定、製造又は単離のために使用する こと。
11. １１．請求の範囲９に記載の抗体を、請求の範囲７から９のいずれかに記載のポ リペプチドの同定、製造又は単離のために使用すること。
12. １２．請求の範囲９に記載の抗体少なくとも１種を含有する転移性腫瘍及び／又 は転移の診断剤。
13. １３．抗体は、酵素と結合しており、色素及び／又はラジオアイソトープで標識 されている、請求の範囲１２に記載の薬剤。
14. １４．抗体は、少なくとも２個の抗体結合位置を有するハイブリド抗体である、 請求の範囲１２及び１３に記載の薬剤。
15. １５．請求の範囲１に記載のＤＮＡ又は請求の範囲６に記載の蛋白質の使用下に 製造された、請求の範囲６に記載の蛋白質に対する抗体。
16. １６．請求の範囲１５及び６に記載の抗体、蛋白質又はその１部分を腫瘍治療で 使用される医薬品の製造のために使用すること。
17. １７．細胞毒作用剤と結合されている請求の範囲１５に記載の抗体を、腫瘍治療 用の薬剤の製造のために使用すること。
18. １８．抗体は、少なくとも２個の抗原結合位置を有するハイブリド抗体である、 請求の範囲１５から１７のいずれかに記載の薬剤。