JP3133062B2 - 変体ｃｄ４４―表面蛋白質、これを暗号化するｄｎａ―配列、この蛋白質に対する抗体並びに診断及び治療におけるその使用 - Google Patents

変体ｃｄ４４―表面蛋白質、これを暗号化するｄｎａ―配列、この蛋白質に対する抗体並びに診断及び治療におけるその使用

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、変体CD44−表面蛋白質、この蛋白質の変体
決定子に対する抗体、並びにその製法、更に、この変体
蛋白質片に関して暗号化するDNA−配列、並びにこの蛋
白質又はその１部分及びこれら蛋白質に対する抗体を腫
瘍転移の診断及び治療のために使用することに関する。
転移する可能性は、悪性腫瘍細胞に特有の生命に危険
な特性である。最初の１次腫瘍細胞は、おそらく、腫瘍
進行の過程での一連の変化によりこの特性を獲得する。
この過程の結果として、癌細胞変体は、絶えず、１次腫
瘍物質から離れ、細胞外マトリックスを通過し、リンパ
系又は血液循環内に入り移動する。しばしば、相互に付
着して、転移性腫瘍細胞は血液又はリンパ系中で移送さ
れ、他の位置でこの脈管系を出て、そのまわりで、２次
組織内に入り、娘細胞を形成する（文献:Hart等1989
年、Nico/son1987参照）。転移の形成は、腫瘍細胞と細
胞内マトリックス又は他の細胞との一連の相互作用を必
要とする。これらのほとんど全ての相互作用は、細胞表
面成分例えばマトリックスに関するレセプター及び薄
層、表面結合した蛋白質分解酵素並びに細胞付着分子
（組織特異性付着及びこれに伴なう転移の組織優先性を
限定するようなものを包含して）、更に、生長因子及び
生長因子レセプターを必要とする。
BSp73ラッテ−腫瘍の非転移性及び転移性腫瘍細胞の
膜蛋白質は、異なり、抗体反応により検出されることは
公知である（Matzku等1983及び1989）。
ところで、転移性BSp73ASML腫瘍細胞は、部分的に、
公知の、リンパ球付着及び細胞−細胞及び細胞−マトリ
ックス交換作用に関与する糖蛋白質（ヒトにおけるこの
正常な糖蛋白質の呼称:CD44、Hermes−１、マウスでは:
ppg−１及びラッテでは:HEBFIn）に相当する表面蛋白質
を含有することが判明した。しかしながら、新規変体CD
44−表面蛋白質は、これら公知の配列とは、ヒトCD44−
配列の220番と237番のアミノ酸（もしくはマウス−配列
の224番と239番のアミノ酸）の間に挿入されている154
個のアミノ酸の細胞外範囲（EZB）により異なってい
る。この新規糖蛋白質は、転移時の細胞／マトリックス
もしくは細胞／細胞結合に関して、重要な役割を有する
ように思われる。従って、この蛋白質範囲（EZB）の製
造及び同定は、本発明の課題の１つである。BSp73ASML
から得られた膜蛋白質を用いるマウスの免疫化により、
変体CD44−表面蛋白質のEZBに対する抗体を形成する脾
臓細胞が得られた。ケーラー（Koehler）（1981）の方
法により、これを安定した培養液を得るために、ポリエ
チレングリコールで骨髄腫細胞と共に融解させた。クロ
ーニング及び抗体を生じ、BSp73ASMLとは反応するが、
非転移性株形BSp73ASとは反応せず、他の非腫瘍原性ラ
ッテ細胞とも反応しない培養物の選択により、新規蛋白
質分EZBに対して特異的な抗体を取得することができ
る。更なる実験のために、BSp73ASML細胞を免疫蛍光テ
ストで特に強力に着色するモノクローナル抗体（mAb1、
1ASMLなる呼称を有する、mAb:モノクローナル抗体）を
選択した。
ウエスタンブロット試験により、BSp73ASML細胞から
の蛋白質加水分解生成物中で、120000、150000、180000
及び200000の分子量を有する４個の蛋白質バンドがmAb
1.1.ASMLで測定できるが、ラッテ線維芽細胞及び非−転
移性ラッテ腫瘍細胞からの抽出物は有意な反応を示さな
い。この大きさのちがいが、当初アミノ酸配列のちがい
又は強さの異なる後の淡白質変性に依るのかは、なお確
定することはできなかった。いずれの場合にも、この抗
体により認識されるエピトープは、全ての４種の蛋白質
中に含有しているが、対照のために使用した非転移性BS
p73AS−細胞又は正常ラッテ細胞からの蛋白質中には含
有しない。
表面蛋白質のEZBに関して暗号化するcDNA配列の単離 バクテリア表現ライブラリィ中のEZB−暗号化cDNA−
配列を発見するために、モノクローナル抗体mAb1.1ASML
を使用した。このライブラリィをBSp73ASML細胞及びpEZ
ベクター系からのポリＡ＋RNAを用いて構成した（Stanl
ey ＆ Luzio、1984）。このcDNA−配列により暗号化さ
れた生成物は、抗体を用いるβ−ガラクトシダーゼ融合
蛋白質として発見できた。このように単離された、モノ
クローナル抗体1.1ASMLに関してポジチブなpEX34なる名
称を有するcDNAクローンは、167ヌクレオチドのcNA配列
片を有する。次いで、再びBSp73ASML RNAからのベクタ
ーpSP65中の大きいcDNAライブラリィを詳細に調べるた
めに、このcDNA片を利用した。これで単離されたクロー
ンの１つpM66は、いわゆるプライマー延長（primer−Ve
rlaengerung:スターターオリゴヌクレオチド）及びポリ
メラーゼ−連鎖反応（PCR）を用いて、全長cDNA−クロ
ーンpMeta−１を単離するために役立った。完全な長さ
の証明は、プライマー延長（3207ヌクレオチド）を用い
て得られた。BSp73ASML−腫瘍からのRNAとのコリニアリ
ティ（Kolinearitaet）が、RNアーゼ及びS1保護分析に
より記録された。
バクテリア中での表現及び抗体による認識を用いるcD
NAの単離は、この抗体が表面蛋白質のEZB中の１次的ア
ミノ酸配列を認識することを証明する。
EZB−暗号化メッセンジャーRNAは、BSp73ASML中で表
現されるが、BSp73AS−細胞中には表現されない。
ハイブリド形成により特異的メッセーンジャーRNAsを
検出するために、cDNAクローンから３種の異なる配列試
料を得た。試料Ａは、EZBに関して暗号化するcDNA−範
囲をカバーしている（位置:941〜1108）。試料Ｂは、pM
eta−１から、位置1403−1572の間の配列を表わし、試
料Ｃは、初めから位置794までの配列を有する（第１
図）。BSp73腫瘍細胞系のポリＡ＋RNAを、電気泳動によ
り分離し、RNAトランスファーハイブリド形成を用いて
分析した。転移しない４種の細胞系は、試料Ａに対して
相同であるRNAを含有せず、転移性腫瘍細胞BSp73ASMLか
らのRNAsは、強力に反応する。試料Ａは、このRNA−調
製物中で、2.2〜3.3kbの種々のRNA−寸法の非相同混合
物及び4.9kbの大きいRNA−種を認識する。転移性腫瘍細
胞変体中のモノクローナル抗体1.1ASMLにより認識され
た特異的膜蛋白質の排他的表現は、明らかに、相応する
EZB−暗号化性メッセンジャーRNAsの排他的表現によ
り、証明される。明らかに、3.2kbの完全cDNA−クロー
ンpMeta−１は、このRNA−種の全配列を表出できない。
RNA−寸法の非相同混合物からの１種のみが表出でき
る。試料Ｂ及びＣは、BSp73ASML RNAの分離の際に試料
Ａと同じハイブリド形成型を示し、いずれにせよ、その
かぎりにおいて、この非相同では、即ち、このRNA−配
列が、全ての３種の試料Ａ、Ｂ及びＢに対して相補的で
ある配列を有することが確認できる。試料Ａとは反対
に、試料Ｂ及び試料Ｃは非転移性細胞系中のメッセンジ
ャーRNA−種をも認識する。RNAの大きさは、BSp73ASML
中のそれとは明らかに異なり、即ち、1.5、2.0、2.9及
び4.3kbの大きさを有する４種の明らかに異なるメッセ
ンジャーRNA−種が検出される。BSp73ASMLからのRNAsの
非相同混合物中でこれらRNA−配列が隠されているとし
ても、これらは、BSp73ASML中には同じ量で存在しない
ことは確実である。決定的なことは、試料Ａに対する相
補性を有するRNA配列が明らかに、非転移性細胞内には
完全に不在であることである。従って、試料Ａ、Ｂ及び
Ｃの配列が、転移性腫瘍中の同じRNAsに、しかも、試料
−Ａ−配列がＢ−Ｃ−ポジチブRNAs中にスプライシング
挿入され、この二者択一的スプライシングが転移性細胞
系中でのみ起こるように含有していると、慎重に結論す
ることができる。
RNAとcDNAとの間のコリニアリティを立証し、BSp73AS
とBSp73ASML細胞との間のRNAsのちがいを分析するため
に、S1−ヌクレアーゼ及びRNアーゼを保護分析を行なっ
た。保護されたDNA−又はRNA−フラグメントは、全長よ
り小さくてよい。それというのも、５′−末端は、腫瘍
細胞からのRNAsとハイブリド形成することのできないベ
クター配列を有するからである。まず、３′位上の移
行：即ち、試料Ａに対する相同を有する配列から試料Ｂ
に対するそれへの移行を考慮した。双方の技術は、広い
範囲にわたりこの試料とコリニアーであるBSp73AS細胞
中の特有のRNA−種を示している。更に、その５′は、B
Sp73ASMLからのRNA配列に相当するcDNA−もしくはRNA−
試料をこのBSp73AS−細胞からのRNAとは異なる。BSp73A
SMLのRNAsは、特に、試料の大きいフラグメントを保護
する配列を含有する。この大きいフラグメントは、蛋白
質分析に供されたDNA−もしくはRNA−片の全長に相応す
る。より小さいフラグメントも検出可能である。RNA−
トランスファーハイブリド形成は、種々の大きさのRNA
の非相同混合物をカバーしているので、これらの小さい
保護されたフラグメントが、cDNAから特定位置即ち、予
め証明された遺伝子拡散点と提供試料の５′末端との間
の位置で拡散するRNA−種を示すことができる。これらR
NA−種は、BSp73AS−細胞中では同様に検出できない。
ところで、５′位上の遺伝子拡散の点、即ち、試料Ｃ
とハイブリド形成する配列から、試料Ａ即ちEBZ−暗号
化配列とハイブリド形成するものへの移行を考察する。
この分析は、５′切断点に関する相応する結果を与え
る。BSp73AS細胞からのRNAsは、提供試料を小範囲にわ
たってのみ保護することができる。BSp73ASML細からの
メッセンジャーRNAsは、より長いフラグメントを保護す
る。即ち、これらは、提供試料の全長にわたりコリニア
ーである。従って、このcDNAクローンpMeta−１は、転
移性腫瘍細胞BSp73ASML内に現われる配列を描くと結論
することができる。３′及び５′範囲は、BSp73AS細胞
からのRNAs中にも認められる。前記技術を用いて記載さ
れうる定義された移行を有するこのEZB−暗号化配列
は、ここでは、RNA−形成のための二者択一的スプライ
スメカニズムが存在することを示している。EZB−配列
への移行の５′及び３′切断点が第１図で矢印で示され
ている。
モノクローナル抗体1.1ASMLは、糖蛋白質CDD44の１変
体形を同定する。
表面蛋白質に関する構造情報を得るために、全てのク
ローン化されたcDNA分子の配列決定をした。全長−クロ
ーンpMeta−１のヌクレオチド−配列及びこれから誘導
されたアミノ酸配列を第２図に示す。全長−cDNA−クロ
ーンは、3207ヌクレオチドに渡って伸びている。３′末
端は、１個のポリＡ端を有し、２個の付加的ポリアデニ
ル化信号は、2288及び1743の位置に存在する。最初のAT
Gコドンは、コンセンス−開始配列に続き、1509ヌクレ
オチド（503アミノ酸に相当）の読み取り枠を開示す
る。膜位置の蛋白質に関して推測するように、最初の21
アミノ酸は疎水性であり、信号ペプチドである。この配
列のどの部も、従来は、データベース内に見つけること
はできない。しかしながら、リンパ球−ホーミング−レ
セプターCD44（もしくはPgp−１）に関して最近公開さ
れたデータに対する配列相同を発見した（Idzerda等198
9;Goldstein等1989;Stamenkovic等1989;Nottenburg等19
89;Zhou等1989）。この相同は、厳密に、非−翻訳領域
を包含するcDNAの５′及び３′部に限られており、これ
は、既に前述されたBSp73AS−及びBSp73ASML RNA−配
列の間の拡散の点の所で終わっている。拡散点の間の全
範囲（第２図中、色の付いている所）即ち、転移−特異
性EZB−暗号化配列の全範囲は、Pgp1−又はCD44−配列
内には抽出されていない。転移−特異性糖蛋白質は、明
らかに、CD44糖蛋白質の変体を抽出している。即ち、こ
れは、156アミノ酸の付加的なエキストラドメイン及び
これに伴なう410アミノ酸の拡張された細胞外領域（21
アミノ酸信号ペプチドを除いて）を、不変CD44糖蛋白質
の270アミノ酸（同様に信号ペプチドを除く）に対向し
て有する。しかしながら、非−転移性BSp73AS−細胞内
には、このCD44−ファミリーの不変の形が検出される。
このBSp73AS−RNAsのcDNA−配列は、同様にクローニン
グされており、エキストラドメイン以外の転移−特異性
クローンとの同一性が証明されている。
変体CD44の表現は、転移ポテンシャルと相互に関連し
ている。
変体CD44糖蛋白質の表現が例外なくBSp73ASML細胞内
で行なわれ、それが、この細胞の転移ポテンシャルと又
は一般的な転移ポテンシャルとの関連しているか否かを
検査するために、他の一連の同質遺伝子ラッテ腫瘍細胞
即ち乳癌系の腫瘍細胞系13762NF（Neri等1982）を研究
した。ここで、親腫瘍細胞系から誘導された細胞系即ち
MTPa、MTC、MTF7及びMTA−細胞（第１群）とリンパ節又
は肺転移部に由来する細胞系、即ちMTLY、MTLn2、MTLn3
（第２群）とを比較する。第１群−細胞は、実質的に、
正常なCD44型（試料Ｂとハイブリド形成する際に、BSp7
3AS細胞からのRNAsのそれに似ている）を表現する。こ
れに反し、試料Ａでは、拡散RNAバンド（これは約2.5kb
の大きさを有する）の少量が検出される。他方、第２群
−細胞は、まったく異なるRNA型を示す。双方の試料Ａ
及びＢは、大きいRNA種とハイブリド形成する。その大
きさは、BSp73ASML中で検出されうるものと似ている。
この類似性は、RNAse及びS1保護分析によっても記録さ
れうる。これらのデータに基づき、RNAのスプライシン
グ型内の変化及び変体CD44の表現は、転移の生成と相互
に関連しており、この転移性乳癌細胞中で獲得された型
は、非常に、既に転移性BSp73ASML細胞系に関して知っ
たものに一致すると結論する。高分子量で、この抗体に
より認識される蛋白質は、BSp73ASML抽出物中で検出さ
れた蛋白質の双方の高分子量の種に一致する。この乳癌
腫瘍系内で、同様に、RNA−種及び高分子量蛋白質の転
移特異性表現も認められる。１群即ちいわゆる親細胞系
内にも、主として試料Ａ即ちEBZ−暗号化配列とハイブ
リド形成するRNAsが認められ、かつ、抗体により100000
ダルトンの蛋白質の僅かな着色も認めることができると
いうことは、１群−細胞も僅かな転移可能性を有し、実
際に転移性を示さない当初の腫瘍細胞系BSp73ASとはま
ったく反対であることに帰因する。
モノクローナル抗体1.1ASMLは、ラッテ内での転移形
成を抑制する。
同質遺伝子ラッテにおける腫瘍細胞系BSp73ASMLの転
移形成の一連の実験で、細胞を皮下注射し、種々の時間
に、腫瘍施与の前及び後に、２〜３日の間隔で、モノク
ローナル抗体1.1ASMLを腹腔内注射した。この免疫学的
プロトコルの分野でも、注射抗体に対するラッテの免疫
応答が起こったように確認された。即ち、抗−マウス−
免疫グロブリン抗体並びに抗インディオタイプ−抗体も
生じる。この一連の実験の結果は、腫瘍の生長及び転移
は、1.1ASMLの注射により著るしく遅延されることを示
している。この遅延は、その反応速度論で、この抗体が
転移の初期段階と干渉すると結論することができる。こ
の実験は、転移性細胞の表面の抗体により認識された蛋
白質構造が、転移過程に役割を有し、治療及び診断計画
で実現可能にすることを示している。
ラッテcDNAのEBZ暗号化配列部に対する相同ヒト配列
の単離。
培養液中のヒト腫瘍細胞にとって、もちろん、直ち
に、ラッテ系に相応して、それらがなお転移特性を保持
しているか否かを検出する可能性はない。免疫拡散した
マウスを用いる実験は、ヒトにおける転移ポテンシャル
に関して非常に限られた言及のみを可能とする。従っ
て、従来、世界中で培養液中に取られていた比較的多く
の腫瘍細胞系を、これらがラッテ転移に関して証明する
ことができた配列を表現するか否かを試験すべきであっ
た。このような腫瘍を見つけることは成功している。こ
れは、ヒトの大細胞肺癌に由来し、番号:LCLC97を有す
る。この腫瘍細胞系中には、ラッテの転移性腫瘍細胞系
中で検出可能であるRNAsにまったく一致する挙動をする
３種の特定のRNA−種（大きさ:5.5、3.4及び2.8kb）が
検定できる。これらは、即ち試料Ａとも試料Ｂ及びＣと
もハイブリド形成し、即ち、これらヒトRNA種も、広い
範囲にわたり、cDNApMeta−１に対して同じである（85
％）。
モノクローナル抗体1.1ASMLは、この腫瘍細胞と反応
せず、即ちこの抗体により認識された片蛋白質は抗原決
定因子の範囲内で、ヒト腫瘍細胞の表面上に発現する蛋
白質とは異なる。非反応性に関して、この抗体の高い特
異性に基づく、最小の偏りに達する。ヒト腫瘍細胞LCLC
97は、cDNA−ライブラリィを構成するために役立った。
ラッテ−及びヒト配列の間の高い一致性に基づき、試料
Ａに対して相同性を示すcDNAクローンを単離することが
できた。ヒトcDNAを配列決定した。第３図（ａ、ｂ）
に、１次配列及びそれから誘導されたアミノ酸配列を示
す。ラッテ−及びヒト−配列の間に大きい範囲にわたり
充分な同一性が存在することが判る。このヒト配列並び
にそれから誘導されたアミノ酸配列も、同様に、本発明
の目的である。
実施例： 細胞及び抗体： 次のクローン化されたBSp細胞系を、この試験に使用
した:BSp73ASML−１及び10AS−７かつ培養液中にMatzku
等による記載（1983）のように保持した；更に、Neri等
による記載（1982）の乳癌細胞系BSp73ASML膜蛋白質に
対するモノクローナル抗体を、Balbcマウスの免疫化に
より製造した。免疫化されたマウスの脾臓細胞の単離の
後に、これを不滅化のために、Koehlerのモノクローナ
ル抗体の製法によりAg8骨髄腫細胞と融合させた。得ら
れたハイブリドーマ細胞を、BSp73ASMLに対する特異抗
体を産生するが、BSp73AS及び正常ラッテ繊維芽細胞に
対しては産生しないものを見つけるために、スクリーニ
ング法を実施した。その正確な処置法は、同様に、Matz
ku等の文献（1989）に記載されている。
相応する特異性を有するモノクローナル抗体（mAK）
産生性のハイブリドーマ細胞を、組織培養液中で膨張さ
せ、この媒体中に放出されたmAKを硫酸アンモニウム沈
殿及びカラムクロマトグラフィ（蛋白質Ａ−セファロー
ス及びMonoQ）により著るしく濃度増加させ、この形で
実験に使用した。その１つがmAK1.1ASMLである。
免疫蛍光 種々の腫瘍細胞上の変体CD44分子の抽出のために、腫
瘍細胞を培養液中に入れ、次いで燐酸塩緩衝食塩溶液
（PBS）で洗浄し、1.1ASMLと共に40℃で30分間インキュ
ベートした。この結合の検出のための２次抗体として、
ローダミン結合ウサギ抗−マウスIgGを使用し、蛍光顕
微鏡中で抽出した。
cDNA表現ライブラリィの構成及びイムノスクリーニング BSp73ASML細胞からのポリＡ＋RNAを、オリゴ（dT）及
び種々の組成のヘキサヌクレオチドでプライム化し（ge
primt）、AMVからの逆トランスクリプターゼを用いて、
cDNAの第１鎖を合成した。E.コリ−DNAポリメラーゼ
Ｉ、RNアーゼＨ及びE.コリーリガーゼを用いてこのcDNA
の第２の鎖を製造し、引続き２本鎖cDNAをT4DNAポリメ
ラーゼを用いてその末端でベグラディングした（beg−r
adingt）。３種の読取ラスター中でcDNAの融合を可能に
するベクターpEX1、２及び３（Stanley及びLuzio、198
4）、Sma I制限エンドヌクレアーゼを用いて切断し、cD
NAとリゲートさせた（T4DNAリガーゼ）。温度敏感なリ
プレッサーを産生するコンピテントE.コリ−DH5（pCI85
7）バクテリアを、pEX−cDNAコントラストを用いてトラ
ンスフェクトさせ、ナイロンフィルター上で培養した。
温度敏感なリプレッサーRCI857に関する遺伝子は、pEX
プラスミドと適合性のプラスミドpCI857上に存在する。
28℃で、融合蛋白質の合成を制御するIPRプロモータは
遮断されている。42℃まで昇温することにより、このCI
リプレッサーは失活され、β−ガラクトシダーゼ/ASML
融合蛋白質の合成は、実質的に進行される。この熱誘導
されたバクテリアコロニィを、引続き、フィルター上
で、クロロホルム蒸気を用いて変性し、次いで、これ
を、乾燥乳粉末３％、リソチーム及びDNアーゼを含有す
るPBSでインキュベートする。ナイロンフィルターに固
定されたバクテリア融合蛋白質を、次いで、mAK1.1ASML
と共にインキュベートし、非特異的に結合したmAKの洗
浄除去の後に、結合の検出のために、２次抗体125Jとし
てマークされたウサギ抗−マウスIgGを使用する。オー
トラジオグラフィにより、オリジナルのバクテリアフィ
ルターからの陽性クローンを単離し、更に分析した。1.
1ASMLと特異的に反応する融合蛋白質を合成したクロー
ンはpEX34であった。このバクテリアクローン中に含有
されるpEXプラスミドは、167ヌクレオチドcDNAを有し、
これは特に、エピトープ（もしくは抗原決定因子）を暗
号化し、その特異性mAK1.1ASMLを有する。
次いで、全長cDNAmMeta−１の単離を、標準法で行な
った。
mAK1.1ASMLを用いるラッテの免疫化 BSp73腫瘍細胞に対する純系であるBDXラッテに、皮下
もしくは腹腔内に、mAK1.1ASML（Keyhole Limpet Hae
mocyanineに結合した）を、完全フロインドアジュバン
トと共に注射した。第１の注射は、BSpASML細胞の注射
（足皮下脂肪組織中に）の前に10、７及び３日に行な
い、次いで、その後３、７、11、14、及び21日に行なっ
た。28日後に、ラッテを殺し、種々のリンパ節を標本化
し、秤量し、肉眼で見える肺転移を計数した。
変体CD44表面蛋白質の表現と転移ポテンシャルとの間の
関係 変体CD44糖蛋白質の表現が、単に検査BSp73ASML細胞
系の特性のみであるか、又はその表現が転移ポテンシャ
ルと関係するのか否かを確認するために、13762NF−乳
癌から生じる他の１連のラッテ腫瘍細胞（Neri等1982）
を検査した。更に、１次−腫瘍から生じる細胞系（MTP
a、MTC、MTF7及びMTA（第１群））とリンパ節−及び肺
−転移から生じる細胞系（MTLy、MTLn2、MTLn3（第２
群））とを比較した。CD44から誘導されたRNAの型を第
４図に示す。ここで、試料Ａ、Ｂ及びＤは、前記の第１
図に記載の試料に相当する。第１群の細胞は、全て、試
料Ｂを有する正常なCD44−型を示す。これに反して、第
２群の細胞は、それとは異なる型を示す。そのRNAは、
第１群のRNAより大きく、BSp73ASMLのRNAに相当する。
より小さいRNAsは、試料Ｄとのハイブリド形成の際に消
失する。残りの型は、双方のラッテ腫瘍系の間での類似
性を示している。
試料Ａを用いても、第２群のRNA−型は、BSp73ASMLの
それに相当する。試料Ａは、BSp73ASからのRNAとはハイ
ブリド形成しないが、第１群の細胞では、約2.5kbの小
さい拡散RNA−バンドを生じる。RNアーゼ及びS1ヌクレ
アーゼ保護分析は、同様に、構造的類似性を示す。これ
らの結果から、変体CD44RNAsの切断型及び表現における
変化は、転移の形成を伴って現われるように見える。
pMeta−１の過剰表現による非転移性BSp73AS−細胞上へ
の転移ポテンシャルの移動 変体CD44種の表現とラッチ腫瘍の２系列中の転移ポテ
ンシャルとの関係は、転移過程のこの糖蛋白質の原因的
役割を証明している。このことを検査するために、ｐ−
Meta−１をBSp73AS−細胞中に移行させ、これによって
細胞の挙動が変るか否かを検査した。pMeta−１の完全
暗号化領域（第２図）を、SV40−プロモータの下に導入
し、この構成体（第５図の線図）を、PSV2neoと共にBSp
73AS−細胞中に導入した。個々のG418−抵抗性及びpMet
a−１表現性コロニーが得られた。この２つのコロニー
のRNA−型を第５図に示す。変体CD44と特異性試料Ａの
ハイブリド形成は、約2.2kbの支配的トランスクリプト
を示し、これは、BSp73ASML−細胞中で書き換えられ
る。最小頻発RNAの大きさに相当する（第５図）。しか
しながら、このトランスフェクトされた細胞は、BSp73A
SMLと同様に、約10倍も多いこのRNAを含有する。
このトランスフェクトされた細胞（BSp73AS−pSVMeta
1−14）の１つ中で、他の大きさが観察され、これは、
プラスミド−組込みの場所に関連しうる。pSV2neoシミ
ュレーション移行クローン（再現されず）及びBSp73AS
−受容体細胞は、試料Ａに対し相補的であるRNAを含有
しない。内在性正常CD44−転写（pSVMeta−１のエキス
トラドメインなし）をトランスフェクト内に発現させる
ために、フィルターを線状化し、試料Ｄと再ハイブリド
形成させた。翻訳されなかった３′配列のこの部分は、
表現クローン中に含有されていない（第５図参照）。試
料Ｄは、双方のトランスフェクトのRNA内に2.9と4.9kb
の２個の主トランスクリプトを、コントロールBSp73AS
中にも模写されなかったBSp73AS pSVneo中に検出す
る。
種々の相応するハイブリド化の大体の計量は、このト
ランスフェクトが、変種CD44RNAsの約５倍で発現するこ
とを示しており、これは、内在性遺伝子トランスクリプ
トと同様に、表現プラスミドにより転写されている。
過剰表現されたcDNAは、蛋白質中に翻訳される。第５
図に示されている双方のトランスフェクトは、同じに見
える大きさのmAb1.1ASML−免疫化可能な蛋白質、即ち15
0KDaの主生成物及び100KDaでの弱いバンドを合成する。
cDNA−配列は、503アミノ酸のみの１次蛋白質生成物を
暗号化する（約60000ダルトンに相当）ので、全ての可
視バンド変性された形を抽出するはずである。150KD−
バンドは、変体CD44の変性された形の１個（これは転移
性細胞BSp73ASML中で表現される）と共に進む。BSp73AS
又はシミュレーション転写されたBSp73AS pSVneo細胞
は、この蛋白質を有しない。BSp73ASML−細胞中におけ
るように、トランスフェクトにより表現された細胞のエ
ピトープは細胞表面で露呈されている。
BSp73AS−細胞に転移ポテンシャルを与えるために、
変性CD44の表現が充分であることを立証するために、ト
ランスフェクトをシンゲンBDX−ラッテ（天然の転移−
プロトコル）中に注入した。早期表現体中には、注入の
場所から転移性の腫瘍細胞BSp73ASMLが急速に拡がり、
注入後約10日には完全に分散されていた（Matzku、198
4）。従って、全ての局所的腫瘍は、10日後に、切断に
より除いた。BSp73ASML−細胞の全キャリア及び過剰表
現されたトランスフェクトの注入された全ての動物は、
肺転移を発現した（第１表）。転移形成の経過は、比較
的急速であり、注入後、５〜８週内であった。BSp73AS
−細胞又はシミュレーショントランスフェクトを獲得し
た動物は、この時間の後に、完全に健康であり（切断に
よる以外）、５ケ月後にも転移を確認できなかった。
強力な転移形成の意想外の類似性にもかかわらず、い
くつかの重要な差異がある。BSp73ASML−細胞は、全て
の動物中で、リンパ節に達し、そ径部内及び大動脈の付
近で、種々の結節の実質的増大をもたらす（第１表）。
トランスフェクト（BSp73AS−pSVMetal−14）は、全て
の動物が複数肺転移を起こす（第１表）が、３〜８動物
中でのリンパ節増加をもたらす。他のトランスフェクト
（BSp73AS−pSVMetal−15）を用いては、リンパ節増大
は確認できなかった。従って、このトランスフェクト
は、リンパ節内で必須の生長相なしで肺内でコロニーを
形成することができると見える。
第１表による表現は、BSp73AS−トランスフェクトとB
Sp73ASMLとの間のもう１つのちがいを示している。個々
の肺転移は、肉眼で見え、BSp73ASMLによるそれは小さ
く、多いが、BSp73ASMLを有する多くの系では、11〜20
動物で、１肺当りトランスフェクトよりも５〜20個多い
結節を生じる。
生じた転移が注入されたトランスフェクトにより誘起
されたことを確認し、転移ポテンシャルを伝達する自然
の突然変異のありそうもない可能性を排除するために、
全肺抽出物中及び再培養された転移獲取細胞の抽出物中
のエピトープ陽性蛋白質を測定した。集めた肺抽出物中
並びにBSpAS−pSVMetal−15−トランスフェクトを得た
動物の特異的肺結節の抽出物中に、150KDaの糖蛋白質が
検出可能である。G418−抵抗−菌株は、試験管内生長の
際に、同じに見える分子量の蛋白質を発現する。
診断及び治療 1. 存在するヒトpMate−１配列とその場でのハイブリ
ド形成によるヒト腫瘍物質の分析。この実験は、予め、
ヒトEZBを認識するAKを提供する予備実験と考えられて
いる。
2. ヒトEZBに対する抗体の製造 バクテリア発現ベクター中のヒトpMetal配列のクロー
ニング、従ってβ−ガラクトシダーゼ又はトリプトファ
ンとの融合で、Ｅ−プロダクツが生じる。融合蛋白質も
しくはEZBからの合成蛋白質（担体分子上に結合）を用
いるウサギの免疫化。多価もしくは１価特異性の抗体の
単離。
使用可能性： −臨床的腫瘍物質の免疫学的経過検査（診断） −ELISA−テストを用いる患者の血清中の可溶性EZBの
検出（診断）。
−抗体を用いてトキシンを腫瘍／転移範囲内に入れる
ための、トキシン結合抗体の形成（治療）。
−２個の規定された抗体結合位置を有する抗体の形
成。この２重特異性により、転移範囲内で細胞毒反応を
開始させる（例えば抗CD2−又はCD3−結合）試みがなさ
れる（治療）。
3.完全なhMeta−1cDNA配列を有する発現ベクターを用い
るヒト又はラッテ細胞のトランスフェクションによるhM
eta−１蛋白質の産生もしくはLCLC97−細胞からの精
製。
使用可能性： −腫瘍細胞の組織結合位置をブロックするための蛋白
質又はその１部分の注入。
−結合位置の特性付けの後に、移動性腫瘍細胞をブロ
ックする結合蛋白質の多量を注入することに依る治療の
ための使用も考えられる。
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/574 Ｂ 33/574 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (73)特許権者 999999999 ドイチェス クレープスフォルシュング スツェントルム ドイツ連邦共和国 Ｄ―6900 ハイデル ベルク１ イム ノイエンハイマー フ ェルト 280 (72)発明者 ヘルリッヒ，ペーター ドイツ連邦共和国 Ｄ―7500 カールス ルーエ 41 フォーゲルザング ８ (72)発明者 ポンタ，ヘルムート ドイツ連邦共和国 Ｄ―7515 リンケン ハイム ブランケンロッハーシュトラー セ 12 (72)発明者 ギュンテルト，ウルズラ ドイツ連邦共和国 Ｄ―7500 カールス ルーエ１ ゲルヴィッヒシュトラーセ 40 (72)発明者 マツク，ジークフリート ドイツ連邦共和国 Ｄ―6901 ヴィーゼ ンバッハ シラーシュトラーセ ９ (72)発明者 ヴェンツェル，アヒム ドイツ連邦共和国 Ｄ―6900 ハイデル ベルク ハントシューズハイマー ラン トシュトラーセ 86 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/12 C07K 14/47 C07K 16/30 C12N 5/10 C12P 21/02 C12P 21/08 G01N 33/53 G01N 33/574 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】表面蛋白質転移性腫瘍細胞の一部分に関し
    て暗号化するDNA−フラグメントにおいて、このDNA−フ
    ラグメントは、 ａ） ヌクレオチド−配列 ｂ）ａ）に記載のDNA−配列に対して縮重されており、
    かつ／又は対立変体であるヌクレオチド−配列 から選択されていることを特徴とする、DNA−フラグメ
    ント。
  2. 【請求項２】請求項1a）に記載のヌクレオチド配列の一
    つと少なくとも85％相同であり、請求項1a）に記載のヌ
    クレオチド配列の一つとハイブリド形成し、転移性腫瘍
    細胞の完全表面蛋白質に関して暗号化するヌクレオチド
    配列を含有する、請求項１に記載のDNA−フラグメン
    ト。
  3. 【請求項３】ベクターヌクレオチド配列及び請求の範囲
    １又は２に記載のDNA−フラグメントより成る、組換えD
    NA−分子。
  4. 【請求項４】発現ベクターである、請求の範囲３に記載
    の組換えDNA−分子。
  5. 【請求項５】請求の範囲１又は２に記載のDNA−フラグ
    メント又は請求の範囲３又は４に記載の組換えDNA−分
    子を含有する、形質転換された宿主細胞。
  6. 【請求項６】請求の範囲１又は２に記載のDNA−フラグ
    メントにより暗号化される、ポリペプチド。
  7. 【請求項７】請求の範囲１に記載のDAN−フラグメント
    を包含する請求の範囲３又は４に記載の組換えDNA−分
    子により製造可能な、ポリペプチド。
  8. 【請求項８】アミノ酸配列 及びこれらの対立変体及びグリコシル化生成物を包含す
    る、請求の範囲６及び７に記載のポリペプチド。
  9. 【請求項９】請求の範囲６から８のいずれかに記載のポ
    リペプチドのエピトープと反応する、多価−及び１価の
    抗体。
  10. 【請求項１０】請求項１又は２に記載のDNA−フラグメ
    ント、その相補性フラグメントを、転移性腫瘍細胞の表
    面糖蛋白質の一部分をコードするヌクレオチド配列又は
    その部分の同定、製造又は単離のために使用する方法。
  11. 【請求項１１】請求の範囲９に記載の抗体を、請求の範
    囲６から８のいずれかに記載のポリペプチドの同定、製
    造又は単離のために使用する方法。
  12. 【請求項１２】請求の範囲９に記載の抗体少なくとも１
    種を含有する、転移性腫瘍及び／又は転移の診断剤。
  13. 【請求項１３】抗体は、酵素と結合しており、色素及び
    ／又はラジオアイソトープで標識されている、請求の範
    囲12に記載の薬剤。
  14. 【請求項１４】請求の範囲１に記載のDNA又は請求の範
    囲６に記載の蛋白質の使用下に製造された、請求の範囲
    ６に記載の蛋白質に対する抗体。
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