JPH10257882A - モノクローナル抗体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本来の性質を有するタンパク質としての免疫原
の直接的な確保が困難な場合においても、高い確率で所
望するモノクローナル抗体を製造する手段を確立するこ
と。 【解決手段】抗原決定基をコードする塩基配列を含む遺
伝子で動物を免疫した、その遺伝子免疫動物の免疫細胞
に由来するハイブリドーマと、そのハイブリドーマを抗
体産生細胞として用いるモノクローナル抗体の製造方法
を提供すること。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する利用分野】本発明は、モノクローナル抗
体の製造方法及びその製造方法において用いるハイブリ
ドーマに関する技術分野に属する発明である。より具体
的には、免疫原として直接遺伝子を用いるモノクローナ
ル抗体の製造方法及びその製造方法において用いるハイ
ブリドーマに関する発明である。

【０００２】

【従来の技術】モノクローナル抗体は、ミサイル療法等
の治療手段、エンザイムイムノアッセイ法やラジオイム
ノアッセイ法等の特異的な抗原抗体反応を利用した検出
手段、アフィニティクロマトグラフィー等の物質の精製
手段等において、今や欠くことのできないものとなって
いる。このモノクローナル抗体を製造する場合には、そ
の抗原決定基を有する抗原を用いて動物を免疫して、そ
の免疫動物の脾臓細胞等の免疫細胞とミエローマ細胞に
代表される旺盛な増殖能力を有する腫瘍細胞由来の細胞
とのハイブリドーマを形成させ、これらのハイブリドー
マから所望するモノクローナル抗体を産生するクローン
を選択して、このクローンをモノクローナル抗体の産生
細胞とすることが一般に行われている。そして近年は、
生体由来のタンパク質を精製することなく、未知のある
いは既知の遺伝子をクローニングし、この遺伝子に由来
する組換えタンパク質を免疫原として、モノクローナル
抗体を作成するアプローチが盛んに行われている。

【０００３】しかしながら、このアプローチを行っても
本来の性質を有する抗原を確保することが非常に困難な
ために、目的とするモノクローナル抗体が得られない場
合がある。例えば、その抗原が極微量しか入手できな
い場合や、抗原の構成アミノ酸に疎水性アミノ酸が多
く含まれているために，その抗原が不溶性である場合、
組換えタンパク質の構造が本来の抗原の構造と異なる
場合、抗原が宿主細胞にとって有毒なタンパク質であ
るために，所望する抗原を産生すべき組換え宿主細胞が
死滅する場合等は、抗原を確保することが非常に困難で
あり、所望するモノクローナル抗体を得るための作業は
困難を極める。

【０００４】

【発明が解決すべき課題】そこで、本発明が解決すべき
課題は、上記のように本来の性質を有するタンパク質と
しての免疫原の直接的な確保が困難な場合においても、
高い確率で所望するモノクローナル抗体を製造するため
の手段を確立することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、この課題の
解決に向けて鋭意検討を行った結果、所望する抗原決定
基をコードする遺伝子で直接動物を免疫して、その遺伝
子免疫動物の免疫細胞を用いることによって、その抗原
決定基を特異的に認識するモノクローナル抗体を製造す
ることができることを見出し、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は抗原決定基をコードす
る塩基配列を含む遺伝子で動物を免疫した、その遺伝子
免疫動物の免疫細胞に由来するハイブリドーマと、その
ハイブリドーマを抗体産生細胞として用いるモノクロー
ナル抗体の製造方法を提供するものである。

【０００７】なお、本発明において遺伝子とは、その抗
原決定基をコードする核酸の塩基配列そのものに限られ
るものではなく、その抗原決定基をコードする核酸の塩
基配列を含んでいる限り、その形態は限定されるもので
はない。例えば、その抗原決定基をコードする塩基配列
の上流に適切なプロモーター等を導入した、免疫動物の
細胞内で発現可能な形態の発現プラスミド等も、本発明
における遺伝子の範疇に含まれる。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。 Ａ．抗原決定基をコードする塩基配列を含む遺伝子で動
物を免疫した、その遺伝子免疫動物の免疫細胞に由来す
るハイブリドーマ（以下、本発明ハイブリドーマとい
う）の製造：

【０００９】本発明において、動物を免疫する抗原決定
基は特に限定されるものではなく、所望する物質の所望
する抗原決定基を広く選択することができる。例えば、
所望する物質そのものが、現段階では非常に微量にしか
入手できない物質、例えば精製方法が確立されていない
タンパク質，非常に変性しやすいタンパク質，組み換え
体を作製することが困難なタンパク質，組み換え体が本
来のタンパク質と異なる構造をとってしまうタンパク
質，生産させると組換え発現宿主に有毒なタンパク質等
を選択することが特に有用である。

【００１０】宿主内において発現した後、本来は細胞質
内に止まる性質のタンパク質をコードする遺伝子で動物
を免疫する場合、その遺伝子産物が少なくとも細胞外に
露出する形態をとるように遺伝子に改変を加えること
が、動物におけるその遺伝子産物に対する免疫反応を惹
起させる上で好ましい。

【００１１】例えば、抗原となるタンパク質のＮ末端側
と分泌型のシグナルペプチドとが融合して発現するよう
に遺伝子を設計することができる。また、同時にＣ末端
側に、ＧＰＩ(Glycosyl Phosphatidyl Inositol)アンカ
ー用のシグナル配列を付加したり、細胞膜貫通領域とし
て疎水性の高いアミノ酸配列を挿入して発現させること
により、その遺伝子産物が細胞膜上に止まるように遺伝
子を改変することもできる。

【００１２】このようにして、免疫した遺伝子から発現
したタンパク質が、少なくとも細胞外に露出するように
すれば、所望のタンパク質に対する免疫効果を向上させ
ることができる。

【００１３】抗原決定基をコードする塩基配列を含む遺
伝子の入手法は、その遺伝子が免疫動物の細胞中で発現
することが可能である限り、特に限定されるものではな
く、例えばその抗原決定基を含むタンパク質（ポリペプ
チドを含む。以下、同様である。）そのものをコードす
る遺伝子を製造して、これを適切な遺伝子発現ベクター
に組み込んで入手することができる。

【００１４】ここで、抗原決定基そのものをコードする
遺伝子の入手法は通常公知の方法を採ることができる。
例えば、抗原決定基を含むタンパク質そのものをコード
する遺伝子が既知で、かつ低分子量である場合には、ホ
スファイト−トリエステル法（Ikehara,M.,etal.,Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,5956(1984) ）等の通常公知
の方法を用いて所望する遺伝子を化学合成することも可
能であり、これらの化学合成法を応用したＤＮＡシンセ
サイザーを用いてその遺伝子を合成することも可能であ
る。

【００１５】また、抗原決定基を含むタンパク質そのも
のをコードする遺伝子は既知であるが、比較的高分子量
である場合には、例えばその遺伝子を含む遺伝子を入手
して、その遺伝子から所望する抗原決定基を含むタンパ
ク質そのものをコードする遺伝子を、ＰＣＲ法等の遺伝
子増幅法を用いて増幅して入手する方法や、その遺伝子
を含む遺伝子の遺伝子ライブラリーを作成して、この遺
伝子ライブラリー中から所望する遺伝子を有するクロー
ンを選択して増殖させて入手する方法等を用いることが
できる。

【００１６】さらに、その塩基配列が未知の場合には、
モノクローナル抗体の抗原となる物質の性質に応じた方
法で、一旦その塩基配列を決定した上で、上記のいずれ
かの方法を用いて、所望する抗原決定基を含むタンパク
質そのものをコードする遺伝子を入手することができ
る。

【００１７】塩基配列の決定は、通常公知の方法を用い
て行うことができる。例えば、その遺伝子を含む遺伝子
の遺伝子ライブラリーを作成して、この遺伝子ライブラ
リー中からプラークハイブリダイゼーション法等の公知
のクローン選択法を用いて、所望する遺伝子を含むクロ
ーンを選別して、その遺伝子の塩基配列を決定すること
ができる。この塩基配列決定法としては、例えばマキサ
ム−ギルバート法（Maxam,A.M.,and Gilbert,W.,Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.,74,560(1977)），ゲノミック・シ
ークエンス法（Church,G.M. and Gilbert,W.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.,81,1991(1984)），マルチプレック
ス法（Church,G.M. and Kieffer-Higgins,S.,Science,2
40,185(1988)），サイクルシークエンス法（Murray,V.,
Nucleic Acids Res.,17,8889(1989)），ジデオキシ法
（Sanger,F.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,54
63(1977)）等の方法を用いて、所望する遺伝子の塩基配
列を決定することができる。

【００１８】また、これらの原理を応用した塩基配列自
動解析装置を用いて、この塩基配列を決定することも勿
論可能である。なお、上記のごとく塩基配列を決定した
遺伝子断片そのものをプローブとして、遺伝子ライブラ
リーから所望する遺伝子を有するクローンを選別して、
所望する遺伝子の全長を入手する手法を用いることも可
能である。

【００１９】本発明で用いる、抗原決定基をコードする
塩基配列を含む遺伝子は、上記のように宿主細胞で少な
くとも発現可能な形態を採ることが必要である。この
「発現可能な形態」の代表的なものとして、遺伝子発現
ベクターに上記の抗原決定基を含むタンパク質そのもの
をコードする遺伝子を導入した形態を挙げることができ
る。

【００２０】ここにいう遺伝子発現ベクターとしては、
遺伝子免疫をする対象が主に哺乳動物、例えばマウス，
ラット，ハムスター，モルモット，ウサギ，イヌ，ネ
コ，ヒツジ，ヤギ，ウマ等に限定されているから、これ
らの哺乳動物の細胞を宿主とした場合に発現可能なベク
ターを挙げることができる。

【００２１】このような遺伝子発現ベクターとしては、
例えば抗原決定基を含むタンパク質そのものをコードす
る遺伝子の上流域にプロモーター，エンハンサー，及び
下流域に転写終了配列等を保有するものを用いるのが好
適である。これらの遺伝子発現ベクターは、個別的に設
計して、構築したものを用いることができる。

【００２２】また、既存の遺伝子発現ベクターのうち、
導入細胞が哺乳動物細胞である遺伝子発現ベクターを用
いることも可能である。例えば、ｐ９１０２３，ｐＣＤ
Ｍ８，ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６，ｐＢＣＭＧＳＮｅｏ，
ｐＳＶ２ｄｈｆｒ，ｐＳＶｄｈｆｒ，ｐＡｃ３７３，ｐ
ＡｃＹＭ１，ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐＲＥＰ４，ｐｃＤＮＡ
Ｉ等を例示することができる。

【００２３】これらの遺伝子発現ベクターのうち、Cyto
megalo virus(CMV) プロモーター,Rous sarcoma virus
(RSV) プロモーター, Simian virus 40(SV40) プロモー
ター, SV2 プロモーター, SRa プロモーター等、哺乳動
物細胞において強力な活性を有するプロモーターを有す
るベクターは、本発明で用いる遺伝子発現ベクターとし
て好ましい。

【００２４】このようにして構築される抗原決定基をコ
ードする塩基配列を含む遺伝子による免疫動物の免疫法
は、通常公知の免疫法を用いることができる。すなわ
ち、マウス，ラット，ハムスター，モルモット，ウサ
ギ，イヌ，ネコ，ヒツジ，ヤギ，ウマ等の免疫動物に、
この遺伝子を静脈内，皮内，皮下，筋肉内，腹腔内注射
等の手段で投与し、これを数回繰り返すことで、免疫動
物は、所望する抗原決定基で免疫される。つまり、抗原
決定基をコードする塩基配列を含む遺伝子が宿主動物の
細胞中に取り込まれ、その細胞中でこの遺伝子が発現し
て、抗原として選択された抗原決定基を有する遺伝子産
物で宿主細胞が免疫される。

【００２５】より具体的には、上記遺伝子を生理食塩水
やＰＢＳ等に溶解し、免疫の対象となる動物に、上記手
段でこの遺伝子溶解物を投与して免疫して、モノクロー
ナル抗体製造のための免疫細胞、例えば免疫後の脾臓細
胞を得ることができる。なお、免疫動物は、細胞融合に
用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択することが
望ましい。

【００２６】このようにして遺伝子を宿主動物内に投与
することにより、その遺伝子産物により免疫された動物
から、通常公知の方法で所望する本発明ハイブリドーマ
を製造することができる。

【００２７】すなわち、遺伝子免疫した動物の免疫細胞
と動物の骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作出し、これ
により所望する抗原決定基を認識する抗体を産生するク
ローンを選択し、このクローンを培養することにより製
造することができる。

【００２８】この遺伝子免疫細胞と細胞融合する他方の
親細胞としての骨髄腫細胞としては、既に公知のもの、
例えばＳＰ２／０−Ａｇ１４，Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ
４−１，ＭＰＣ11−４５，６．ＴＧ１．７（以上、マウ
ス由来）；２１０．ＲＣＹ．Ａｇ１．２．３（ラット由
来）；ＳＫＯ−００７，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２
（以上、ヒト由来）等を用いることができる。

【００２９】上記遺伝子免疫細胞とこの骨髄腫細胞との
細胞融合は、通常公知の方法、例えばケーラーとミルシ
ュタインの方法（Kohler,G. and Milstein,C.,Nature,2
56,495(1975)）等に準じて行うことができる。

【００３０】より具体的には、この細胞融合は、通常公
知の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ），センダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下におい
て、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド
等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で
行い、ハイブリドーマを調製する。

【００３１】所望のハイブリドーマの分離は、通常の選
別用培地、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテ
リン及びチミジン）培地で培養することにより行うこと
ができる。すなわち、この選別用培地において目的とす
るハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時間
をかけて培養することによりハイブリドーマの分離を行
うことができる。このようにして得られるハイブリドー
マは、通常の限界希釈法により目的とするモノクローナ
ル抗体の検索及び単一クローン化に供することができ
る。

【００３２】目的とするモノクローナル抗体産生株の検
索は、本発明が好適に適用されるべき、抗原となるタン
パク質が入手困難である場合等を勘案すると、そのタン
パク質を直接用いることなしに行うことができる手段を
選択することが好ましい。例えば、抗原となる遺伝子を
特異的に発現している細胞や強制発現させた細胞を用い
ることによって、間接蛍光抗体法，フローサイトメトリ
ー，免疫ブロット法等の手法により抗原となるタンパク
質を直接用いることなしに行うことができる。

【００３３】なお、抗原となるタンパク質を入手するこ
とが可能である場合には、例えばＥＬＩＳＡ法，プラー
ク法，スポット法，凝集反応法，オクタロニー法，ＲＩ
Ａ法等の一般的な検索法を選択することができる。

【００３４】このようにして得られる本発明モノクロー
ナル抗体を産生する本発明ハイブリドーマは、通常の培
地で継代培養することが可能であり、さらに液体窒素中
で長時間保存することもできる。

【００３５】この本発明ハイブリドーマからの所望の本
発明モノクローナル抗体の採取は、この本発明ハイブリ
ドーマを常法に従って培養して、その培養上清として得
る方法や、本発明ハイブリドーマをこのハイブリドーマ
に適合性が認められる動物に投与して増殖させ、その腹
水として得る方法等を用いることができる。

【００３６】また、このようにして得られるモノクロー
ナル抗体は、更に塩析，ゲル濾過法，アフィニティクロ
マトグラフィー等の通常の手段により精製することがで
きる。このようにして得られる本発明モノクローナル抗
体は、免疫した遺伝子がコードする抗原決定基を抗原と
するモノクローナル抗体である。

【００３７】本発明により、目的の抗原が十分量確保で
きない場合でも、その遺伝子（一部でも可能）さえ確保
することができれば、その遺伝子がコードするタンパク
質に含まれる抗原決定基に対するモノクローナル抗体を
得ることができる。このモノクローナル抗体は、その抗
原の精製手段，検出手段等において非常に重要な役割を
果たし得る。

【００３８】

【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、この実施例により本発明の技術的範囲が限定
されるべきものではない。この実施例において、本発明
の適用例としたＴ４８は、ヘルパーＴ細胞亜集団のうち
１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）にのみ特異的に発現する
タンパク質で、アトピー性疾患の発症，エイズの劇症化
等に深く関わるヘルパーＴ細胞群におけるバランスの変
化を迅速かつ簡便に特定する手段として用いることがで
き得るタンパク質であり、極めて有用な免疫関連タンパ
ク質である。

【００３９】しかしながら、現在のところこのＴ４８
を、純粋な形態で大量に入手することは、困難であり、
そのモノクローナル抗体の製造に際しても、Ｔ４８を直
接抗原として製造することは困難を伴っている。そこ
で、本発明をこのＴ４８に適用して、Ｔ４８に対するモ
ノクローナル抗体を、その遺伝子を入手することにより
製造する実施例を以下に記載する。まず、この実施例の
記載に先立ち、Ｔ４８の遺伝子を入手する工程を、参考
例として述べる。

【００４０】〔参考例〕 Ｔ４８遺伝子の製造等 （１）Ｔ４８遺伝子のクローニング サブトラクション法によりＴｈ１に特異的に発現してい
るＴ４８遺伝子断片を単離し、この遺伝子の全長につい
てのクローニングを行った。所望のｃＤＮＡの全長をク
ローニングするために、Ｔｈ１ｍＲＮＡの発現が高い細
胞からλファージｃＤＮＡライブラリーを調製した。

【００４１】すなわち、上記２Ｐ１５細胞より全ＲＮＡ
を抽出し、オリゴ（ｄＴ）ラテックス（日本ロシュ製）
を用いて、ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡを常法により精製し
た。次に、市販のｃＤＮＡクローニングキット（ライフ
テクノロジー社製）を用いて、２本鎖ｃＤＮＡを合成
し、λｇｔ２２ＡファージのＳａｌ I／Ｎｏｔ I サイ
トにクローニングした。これに引続き、市販のキット
（ストラタジーン社製）を用いて、インビトロで上記λ
ファージにおけるパッケージングを完了した。このパッ
ケージング産物を大腸菌Ｙ１０９０ｒ^- 株に感染させ、
約２×１０⁵ 個の組換えλファージを得た。次に、上記
のサブトラクション法で得た新規のｃＤＮＡ断片をラン
ダムプライミング法を用いた市販の³²Ｐ標識用キット
（宝酒造製）を用いて標識し、これを放射性プローブと
して、プラークハイブリダイゼーション法によりλファ
ージライブラリーのスクリーニングを行った。

【００４２】その結果、１３の陽性クローンを見出し、
これらの陽性ｃＤＮＡクローンのうち、最も長いインサ
ートＤＮＡを持つクローン３つをプラスミドｐBluescri
pt SK(-)（ストラタジーン社製）のＥｃｏＲＶ／Ｎｏｔ
I サイトにサブクローニングした。

【００４３】蛍光ターミネーターを用いたジデオキシタ
ーミネーション法による塩基配列解析の結果、上記３つ
の陽性クローンのｃＤＮＡの互いに重複する部分の塩基
配列は完全に一致しており、同一の遺伝子に由来するク
ローンであることが確認された。

【００４４】これらの３つの陽性クローンのうち、最も
長いｃＤＮＡを有するクローンＴ４８−４をクローンＴ
４８と称し、以下に用いた。

【００４５】（２）Ｔ４８遺伝子の構造 クローンＴ４８に取り込まれたｃＤＮＡは１１５３bpの
鎖長であり、ノーザンブロッティングで測定されたｍＲ
ＮＡの長さ（１．４kbp ）にほぼ近いものであった。そ
して、その３’端に、ｐｏｌｙ（Ａ）付加シグナル及び
逆転写反応で用いたオリゴｄＴの相補配列と思われる１
５個のＡ（アデニン）を有していた。

【００４６】また、最も長いオープンリーディングフレ
ームは、５’端より７９番目のＡＴＧより始まり、７４
８番目のＴＧＡで終わり、２２３アミノ酸残基よりなる
タンパク質をコードしていると予測された。その開始コ
ドン付近の塩基配列（ＴＣＧＣＣＡＴＧＡ）は、Ｋｏｚ
ａｋのコンセンサス配列（ＣＣＡ（Ｇ）ＣＣＡＴＧＧ）
とほぼ相同であった。

【００４７】以上の点より、クローンＴ４８は、ｍＲＮ
Ａの３’端から始まり、コーディング領域全長を経て
５’側の非翻訳領域の一部に達するほぼ全長を含んでい
ると判断された。このクローンＴ４８の有するｃＤＮＡ
配列を有する遺伝子を、以下Ｔｈ１遺伝子とし、その塩
基配列を配列番号１に示す このようにして、塩基配列が決定されたＴｈ１遺伝子を
用いて、Ｔｈ１に対するモノクローナル抗体を製造し
た。その工程を実施例として以下に示す。

【００４８】〔実施例１〕 Ｔｈ１遺伝子ベクターの調
製及び同遺伝子による免疫 Ｔｈ１遺伝子の全長（配列番号１）を含むプラスミドＤ
ＮＡ（pBluescript SK(-))で形質転換した大腸菌（Ｅ.c
oli K12-JM109 株）〔この形質転換体は、Ｔ４８ｃＤＮ
Ａとして、工業技術院生命工学研究所に寄託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５６１８で寄託されている〕を増殖させて集
菌し、これからプラスミドＤＮＡを抽出して、制限酵素
ＨｉｎｄIII 及びＮｏｔＩを用いて消化し、アガロース
電気泳動でベクターＤＮＡを分離させて、インサートＤ
ＮＡ（Ｔ４８）を調製した。このようにして得たＴｈ１
遺伝子（開始コドン上流７８bpからpolyＡテイルまで）
を、ｐＲｃ／ＣＭＶプラスミド（Invitrogen社製）のサ
イトメガロウイルスプロモーターの下流にあるＨｉｎｄ
III サイトとＮｏｔI サイトとの間に挿入して、所望す
るＴｈ１遺伝子の全長を組み込んだプラスミドＤＮＡ
（ｐＲｃ／ＣＭＶ−Ｔ４８）を得た。

【００４９】このｐＲｃ／ＣＭＶ−Ｔ４８の生理食塩水
溶液を、８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀）の両足大腿筋
及び尾皮内に各２０μg を（１匹１回当り６０μg ）、
３週おきに３回免疫した。特異抗体の上昇を、免疫血清
を用いて間接蛍光抗体法及びウエスタンブロッティング
法で確認後、さらに上記と同様の手順で２回追加免疫を
行った。

【００５０】〔実施例２〕 ハイブリドーマの調製 最終免疫の２週間後、免疫マウスの脾臓細胞を１×１０
⁸ 個及びミエローマ細胞を３×１０⁷ 個をＲＰＭＩ１６
４０培地中で混合した。次に、この混合物に遠心を施し
て得られた細胞の混合沈澱を、ＲＰＭＩ１６４０培地で
洗浄して上清を完全に除去した後、残った細胞沈澱物
に、３７℃に保温した５０％ポリエチレングリコール
（平均分子量１５００）ＰＢＳ溶液を４５秒かけて攪拌
しながら加えて、この残った細胞沈澱物を懸濁した。細
胞を均一に懸濁しながらＲＰＭＩ１６４０培地を３０ml
加えた後、系に遠心分離を施して細胞を再び沈澱させ
た。

【００５１】このようにして得られた細胞をＨＡＴ培地
に懸濁し、９６ウエルプレートに１ウエル当たり１×１
０⁵ 個／５０μl の濃度でまき、３７℃，５％ＣＯ₂ の
条件下でインキュベーターを用いて培養した。なお、培
養開始後５日，７日及び９日目にウエル当り５０μl の
ＨＡＴ培地を追加して栄養補給を行い、細胞を観察し
た。培養開始後１０〜１４日目には、ほとんどのウエル
に細胞増殖が見られるようになるので、それぞれの培養
上清を一定量採集して１次スクリーニングを行った。す
なわち、スライドに固定したＴ４８ｃＤＮＡを強制発現
させたＣＯＳ７細胞〔ｐｃＤＬ−ＳＲα／ＣＯＳ７、調
製法：１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭで１
８時間培養したＣＯＳ７細胞に，リポフェクチン試薬
（ライフテクノロジー社製）とＴ４８ｃＤＮＡを組み込
んだｐｃＤＬ−ＳＲαプラスミドＤＮＡを含んだＯｐｔ
ｉ−ＭＥＭＩ培地（ライフテクノロジー社製）を重層
し，ＣＯ₂ インキュベーター内で３７℃で６時間培養し
た。次いで，培地を除いた後，１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ
を加え、３７℃で４２時間培養した。〕と、室温で３０
分反応させた。この反応系を洗浄して、ＦＩＴＣ標識ヤ
ギ抗マウスＩｇＧと遮光状態で室温下、３０分間反応さ
せた。再び反応系を洗浄後、これにカバーグラスをのせ
て蛍光顕微鏡で観察した。

【００５２】なお、ここで用いたスライドは、Ｔｈ１遺
伝子を強制発現させたＣＯＳ７細胞（上記）を５×１０
⁵ 個/ mlの割合で１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに懸濁し、こ
の懸濁物を１２穴スポットスライドグラスに４０μl/穴
で分注後、ＣＯ₂ インキュベーター内で３７℃で３時間
培養し、細胞をスライドグラス上に付着させた。次い
で、スライドをＰＢＳで軽くリンスした後、氷冷した２
％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液で室温で１０分間処
理して細胞を固定した。次いで、ＰＢＳでリンス後、
０．１％ＮＰ−４０／ＰＢＳ溶液で、室温下、５分間処
理して細胞膜を可溶化したものである。

【００５３】〔実施例３〕 モノクローナル抗体の調製 上記実施例２において、Ｔ４８ｃＤＮＡを組み込んだ細
胞のみに反応したウエルについて、限界希釈法による単
クローンの選択及び２次スクリーニングを行った。すな
わち、単クローンの選択については、ウエル中の細胞数
を測定し、細胞が１ウエル当り０．２個になるように細
胞を懸濁した培地を９６ウエルプレートに分注して培養
した後、再度培養上清を用いて上記スクリーニングを行
った。なお、この操作は３回行った。

【００５４】また、２次スクリーニングは以下のように
行った。 免疫ブロットによる方法 Ｔｈ１遺伝子を強制発現させたＣＯＳ７細胞（前記）
を、０．５％の界面活性剤であるＮＰ−４０を含むバッ
ファーで溶解し、この溶解物に遠心分離を施して、核を
除いた上清をサンプルとした。次に、このサンプルを還
元及び非還元条件下で、ＳＤＳポリアクリルアミド電気
泳動で分離した。

【００５５】電気泳動を行ったゲルからニトロセルロー
ス膜へ、この電気泳動により生じたバンドをブロットし
た後、ブロッキングバッファー（１％スキムミルク，５
％ＦＢＳ及び０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳ）に浸
し、４℃で一晩静置した後、さらにハイブリドーマの培
養上清に浸し、室温で１時間反応させた。膜をウオッシ
ュバッファー（０．１％ツイーン２０含有ＰＢＳ）に浸
して１５分間振盪して洗浄した。３回洗浄した後、希釈
した標識二次抗体（ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス
ＩｇＧ）と室温で１時間反応させた。ウオッシュバッフ
ァーで３回洗浄後、膜をケミルミネッセンス法により化
学発光させ、オートラジオグラフィー用フィルムに当て
てバンドを検出した。

【００５６】フローサイトメーターによる方法（この
方法は、抗原となるタンパク質が細胞膜上に発現してい
る場合に適用可能である） Ｔｈ１遺伝子を強制発現させたＣＯＳ７細胞（前記）
を、１０％ＦＢＳ，ＲＰＭＩ１６４０培地で適当に希釈
したハイブリドーマ上清に浮遊させ、氷上で３０分反応
させた。細胞をウオッシュバッファー（０．１％ＢＳ
Ａ，０．０５％ＮａＮ₃ 含有ＰＢＳ）で２回洗浄後、細
胞を希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体溶液
中で、氷上において３０分間反応させた。細胞をウオッ
シュバッファーで２回洗浄後、ＰＢＳに懸濁し、フロー
サイトメーターにより蛍光を検出した。

【００５７】上記方法により選別し得たＴｈ１遺伝子産
物特異的モノクローナル抗体産生ハイブリドーマについ
て、単クローン細胞を大量に培養し、抗体を精製するこ
とによって所望するＴ４８タンパク質に対して特異的な
モノクローナル抗体が得られた。

【００５８】また、このハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃ
マウスの腹腔内に投与し、腹腔内で細胞が増殖して抗体
を含む腹水が貯留した後、採集し、抗体を精製した。こ
の結果、Ｔ４８タンパク質に対して特異的なモノクロー
ナル抗体を産生するクローンＴＤＡ−３及びＴＦＧ−７
を得ることができた。これらのうち、クローンＴＤＡ−
３が産生するモノクローナル抗体を用いてＴｈ１遺伝子
を強制発現させたＣＯＳ７細胞の免疫ブロットの結果を
第１図に示す（この第１図において、Ｔ４８産物とは、
ＣＯＳ７細胞においてＴｈ１遺伝子を強制発現させた結
果生じた翻訳転写産物を表す。）。また、同細胞のフロ
ーサイトメーターによる解析結果を第２図に示す。

【００５９】この本発明に関わるＴ４８モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマは、Mouse Hybridoma Ｔ
ＤＡ−３及びMouse Hybridoma ＴＦＧ−７として、通商
産業省工業技術院生命工学研究所に寄託されている（寄
託番号は、Mouse HybridomaＴＤＡ−３がＦＥＲＭ Ｐ
−１６０３３，同ＴＦＧ−７がＦＥＲＭ Ｐ−１６０３
４，である）。

【００６０】これらの実施例等により、特定の物質をコ
ードする遺伝子さえ入手できれば、その物質中に含まれ
る抗原決定基に対するモノクローナル抗体が容易に入手
可能であることが明らかになった。

【００６１】

【発明の効果】本発明により、免疫原として直接遺伝子
を用いるモノクローナル抗体の製造方法及びその製造方
法において用いるハイブリドーマが提供される。

【００６２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１１５３ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：不明 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 ヒトＴｈ１遺伝子（Ｔ４８） 配列 CCCTTTAAAG GGTGACTCGT CCCACTTGTG TTCTCTCTCC TGGTGCAGAG TTGCAAGCAA 60 GTTTATCAGA GTATCGCCAT GAAGTTCGTC CCCTGCCTCC TGCTGGTGAC CTTGTCCTGC 120 CTGGGGACTT TGGGTCAGGC CCCGAGGCAA AAGCAAGGAA GCACTGGGGA GGAATTCCAT 180 TTCCAGACTG GAGGGAGAGA TTCCTGCACT ATGCGTCCCA GCAGCTTGGG GCAAGGTGCT 240 GGAGAAGTCT GGCTTCGCGT CGACTGCCGC AACACAGACC AGACCTACTG GTGTGAGTAC 300 AGGGGGCAGC CCAGCATGTG CCAGGCTTTT GCTGCTGACC CCAAACCTTA CTGGAATCAA 360 GCCCTGCAGG AGCTGAGGCG CCTTCACCAT GCGTGCCAGG GGGCCCCGGT GCTTAGGCCA 420 TCCGTGTGCA GGGAGGCTGG ACCCCAGGCC CATATGCAGC AGGTGACTTC CAGCCTCAAG 480 GGCAGCCCAG AGCCCAACCA GCAGCCTGAG GCTGGGACGC CATCTCTGAG GCCCAAGGCC 540 ACAGTGAAAC TCACAGAAGC AACACAGCTG GGAAAGGACT CGATGGAAGA GCTGGGAAAA 600 GCCAAACCCA CCACCCGACC CACAGCCAAA CCTACCCAGC CTGGACCCAG GCCCGGAGGG 660 AATGAGGAAG CAAAGAAGAA GGCCTGGGAA CATTGTTGGA AACCCTTCCA GGCCCTGTGC 720 GCCTTTCTCA TCAGCTTCTT CCGAGGGTGA CAGGTGAAAG ACCCCTACAG ATCTGACCTC 780 TCCCTGACAG ACAACCATCT CTTTTTATAT TATGCCGCTT TCAATCCAAC GTTCTCACAC 840 TGGAAGAAGA GAGTTTCTAA TCAGATGCAA CGGCCCAAAT TCTTGATCTG CAGCTTCTCT 900 GAAGTTTGGA AAAGAAACCT TCCTTTCTGG AGTTTGCAGA GTTCAGCAAT ATGATAGGGA 960 ACAGGTGCTG ATGGGCCCAA GAGTGACAAG CATACACAAC TACTTATTAT CTGTAGAAGT 1020 TTTGCTTTGT TGATCTGAGC CTTCTATGAA AGTTTAAATA TGTAACGCAT TCATGAATTT 1080 CCAGTGTTCA GTAAATAGCA GCTATGTGTG TGCAAAATAA AAGAATGATT TCAGAAATAA 1140 AAAAAAAAAA AAA 1153

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｔｈ１遺伝子を強制発現させたＣＯＳ７細胞の
免疫ブロッティングの結果を示す図面である。

【図２】Ｔｈ１遺伝子を強制発現させたＣＯＳ７細胞の
フローサイトメーターによる蛍光の検出の結果を示す図
面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗原決定基をコードする塩基配列を含む遺
   伝子で動物を免疫した、その遺伝子免疫動物の免疫細胞
   に由来するハイブリドーマ。
2. 【請求項２】請求項１記載のハイブリドーマを抗体産生
   細胞として用いるモノクローナル抗体の製造方法。