DE4320624A1

DE4320624A1 - Verfahren zur Diagnose und Analyse von Mammakarzinomen

Info

Publication number: DE4320624A1
Application number: DE4320624A
Authority: DE
Inventors: Helmut Prof Dr Ponta; Karl-Heinz Dipl Biol Heider; Peter Prof Dr Herrlich
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1993-06-22
Filing date: 1993-06-22
Publication date: 1995-02-09

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Analyse und/oder Diagnose von Mammakarzinomen, Mittel für solche Verfahren sowie deren Verwendung.

Hämatogene Ausbreitung von Mammakarzinomen findet sehr früh im Krankheitsverlauf statt und steht im Zusammenhang mit dem späteren Auftreten von Fernmetastasen (Diel et al., 1992). Die molekularen Mechanismen der metastatischen Ausbreitung sind immer noch unbekannt. Die prognostischen Faktoren für die Voraussage des Metastasierungsrisikos be ruhen momentan hauptsächlich auf pathologischen Kriterien, wobei die Hauptfaktoren Tu morstadium, Differenzierung (Gradierung) sowie Lymphknotenmetastasierung sind (Fisher et al., 1990). Allerdings treten in Einzelfällen Diskrepanzen zwischen diesen Faktoren auf, etwa indem trotz fortgeschrittener Tumorgröße oder niedriger Differenzierung (hoher Gra dierung) Lymphknotenmetastasen fehlen. Wenig untersucht ist eine Untergruppe von Pa tienten mit Lymphknoten-negativem Brustkrebs, die später Fernmetastasen entwickeln. Es besteht daher ein Bedarf an Parametern, die eine bessere Voraussage der hämatogenen Tu morausbreitung sowie einer besseren Allgemeinprognose gestatten.

Kürzlich wurde gezeigt, daß ein Oberflächenprotein, variantes CD44, metastatische Eigen schaften in Rattenkarzinom-Zellinien vermitteln kann (Günthert et al., 1991). Das Epitop, das im Zusammenhang mit den metastasierenden Eigenschaften steht, ist Teil einer vergrö ßerten extrazellulären Region, die in der Standardform von CD44 nicht enthalten ist. Ähnli che molekulare Variationen können im menschlichen CD44-Molekül nachgewiesen werden (Jackson et al., 1992). Während die kleinste CD44-Isoform, die Standardform (CD44s), in einer Reihe verschiedener Gewebe, darunter Epithelzellen, ubiquitär exprimiert wird, wer den bestimmte Spleißvarianten von CD44 (CD44v) nur auf einer Untergruppe von Epithel zellen exprimiert. Die CD44-Isoformen werden durch alternatives Spleißen so erzeugt, daß die Sequenzen von 10 Exons (v1-v10) in CD44s komplett ausgeschnitten werden, jedoch bei den größeren Varianten in verschiedenen Kombinationen vorkommen können (Screaton et al., 1992; Heider et al., 1993). Gewebsexpression von variantem CD44 auf hohem Ni veau konnte in kolorektalen Karzinomen und aggressiven Non-Hodgkin-Lymphomen ge zeigt werden (Heider et al., 1993; Koopman et al., 1993).

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Diagnose und/oder Analyse von Mam makarzinomen zur Verfügung, das eine verbesserte Prognose, insbesondere des Metastasie rungsrisikos sowie der Gesamtüberlebenszeit, möglich macht. Das Verfahren beruht auf dem Nachweis der Expression varianter Exons des CD44-Gens oder von Epitopen, die durch solche Exons kodiert werden (im folgenden als "variante Epitope" oder nur "Epitope" bezeichnet). Bevorzugt sind dabei Verfahren, die auf dem Nachweis des varianten Exons v6 (Heider et al., 1993) bzw. auf dem Nachweis des Epitops, das durch das variante Exon v6 kodiert wird, beruhen. Besonders bevorzugt sind dabei Verfahren, die auf dem Nachweis der Nukleinsäuresequenz

oder der Aminosäuresequenz

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besonders bevorzugt der Aminosäuresequenz

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oder degenerierten oder allelen Varianten oder Fragmenten dieser Sequenzen beruhen.

Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus Mittel zur Verfügung, um das erfindungs gemäße Verfahren auszuführen. Diese Mittel betreffen insbesondere Antikörper gegen vari ante Epitope, deren Verwendung sowie die Verwendung bestimmter Peptide zu deren Her stellung. Bevorzugt werden dabei Antikörper, die gegen Epitope gerichtet sind, die durch das variante Exon v6 kodiert werden, insbesondere solche Antikörper, die ein Epitop er kennen, das in der Aminosäuresequenz

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besonders bevorzugt in der Aminosäuresequenz

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oder allelen Varianten oder Fragmenten dieser Sequenzen enthalten ist.

Die Nuklein- und Aminosäuresequenz des varianten Teils des CD44-Gens ist bekannt (Hofmann et al., 1991; Screaton et al., 1992)). Die Existenz degenerierter oder alleler Va rianten ist für die Ausführung der Erfindung nicht von Bedeutung; solche Varianten sind daher ausdrücklich mit eingeschlossen. Die Sequenz des Exons v6 ist besonders bevorzugt. Als Mittel, um die Erfindung auszuführen, können Antikörper dienen, insbesondere solche, die gegen Epitope der Aminosäuresequenz gerichtet sind, die durch Exon v6 kodiert wer den. Besonders bevorzugt sind monoklonale Antikörper. Für das erfindungsgemäße Verfah ren können jedoch auch polyklonale Antikörper, Fab- oder F(ab′)₂-Fragmente von Antikör pern, rekombinant hergestellte single-chain-Antikörper (scFv), chimäre bzw. humanisierte Antikörper oder äquivalente Moleküle dienen, die durch Exon v6 kodierte Epitope spezi fisch binden. Die Herstellung von Antikörpern gegen bekannte Aminosäuresequenzen kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen (Catty, 1989). Beispielsweise kann ein Peptid dieser Sequenz synthetisch hergestellt und als Antigen in einem Immunisierungsprotokoll eingesetzt werden. Ein anderer Weg ist die Herstellung eines Fusionsproteins, das die ge wünschte Aminosäuresequenz enthält, indem eine Nukleinsäure (die synthetisch oder z. B. durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus einer geeigneten Probe hergestellt werden kann), die für diese Sequenz kodiert, in einen Expressionsvektor integriert und als Fusions protein in einem Wirtsorganismus exprimiert wird. Das gegebenenfalls gereinigte Fusions protein kann dann als Antigen in einem Immunisierungsprotokoll eingesetzt und Insert spezifische Antikörper oder, im Falle monoklonaler Antikörper, Hybridome, die insert spezifische Antikörper exprimieren, mit geeigneten Verfahren selektiert werden. Solche Verfahren sind Stand der Technik. Heider et al. (1993) beschreiben die Herstellung von Antikörpern gegen die varianten Epitope v3-v10, v3, v6-v7. Koopman et al. (1993) be schreiben die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen variante CD44-Epitope. Ebenfalls als Mittel zur Ausführung können Nukleinsäuren dienen, die mit varianten Exons, insbesondere v6, hybridisieren, insbesondere solche mit einer Homologie von mehr als 80% zur entsprechenden Exonsequenz. Die Herstellung solcher Nukleinsäuren kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen.

Die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnose und/oder Analyse von Mammakarzinomen kann zweckmäßig durch Untersuchungen von aus dem Körper ent nommenen Proben, beispielsweise aus Biopsien, erfolgen. Vorteilhaft können dabei die er findungsgemäßen Mittel verwendet werden beispielsweise können Gewebsschnitte im munhistochemisch mit den erfindungsgemäßen Antikörpern mit an sich bekannten Metho den untersucht werden. Aus Gewebeproben gewonnene Extrakte können ferner mit anderen immunologischen Methoden unter Verwendung der besagten Antikörper untersucht wer den, beispielsweise in Western Blots, Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA), Ra dioimmunoassays oder verwandten Immunoassays. Der Nachweis der Expression varianter Exons kann auch auf Nukleinsäureebene erfolgen, beispielsweise durch Hybridisierung von aus Gewebeproben gewonnener RNA (Northern Blot) oder revers transkribierter und PCR- amplifizierter RNA mit geeigneten Proben, oder durch Hybridisierung von Nukleinsäuren in Gewebsschnitten mit geeigneten Proben (in-situ-Hybridisierung). Die Untersuchungen kön nen qualitativ, semiquantitativ oder quantitativ, vorzugsweise semiquantitativ oder quanti tativ, erfolgen. Durch Nachweis und/oder Quantifizierung der Expression varianter CD44- Epitope erhobene Daten können so in die Diagnose und Prognose einfließen. Vorteilhaft kann dabei die Kombination mit anderen prognostischen Parametern sein, etwa mit Gradie rung oder Hormonrezeptorstatus.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich gut für die Diagnose, Prognose und Analyse von Mammakarzinomen. Dies ergaben insbesondere immunhistochemische Untersuchungen an Gewebsschnitten.

In diesen Untersuchungen wurden 82 schockgefrorene Proben von menschlichem Brust krebs auf CD44-Oberflächenexpression untersucht (Gewebe von 66 primären Brusttumoren und von 16 histologisch abgesicherten Metastasen in axillären Lymphknoten). Davon waren fast 100% positiv für eine der CD44-Isoformen, während normales Mammaepithel sowie benigne Hypertrophien CD44 nicht exprimierten. 82% dieser Tumoren trugen das v6-Epi top. Ein typisches Färbungsmuster eines Tumorschnittes zeigt Fig. 8.

Alle Lymphknotenmetastasen (16 Fälle) waren v6-positiv, was nahelegt, daß v6-Expression mit fortgeschrittenem Tumorstadium korreliert.

Die semiquantitative Auswertung der immunologischen Reaktionen ergab überraschend ei nen engen Zusammenhang zwischen v6-Expression und Prognose. Die Expression anderer untersuchter Epitope, z. B. v3, ergab keine so enge Korrelation. Eine Auswertung der Ex pression von Spleißvarianten wurde bei einer Gesamtzahl von 60 primären Brusttumoren durchgeführt (Beispiel 2).

Die univariate Überlebensanalyse (Tabelle 1) zeigte, daß hohe Expression des varianten Epitops v6 (Antikörper VFF7) ein signifikanter prognostischer Parameter für eine schlechte Gesamtüberlebenszeit (OAS, p = 0.02, Tabelle und Fig. 5) ist. Der prognostische Wert ist besser als der des Lymphknotenstatus (p = 0.05) und der der 5-Phasen-Fraktion (p = 0.03) und vergleichbar mit dem der histologischen Gradierung. Zusätzlich wurde der Zu sammenhang zwischen Lymphknotenbeteiligung bzw. v6-Expression und OAS mit einer multivariaten Cox-Regressionsanalyse untersucht (Tabelle 2). Das Risikoverhältnis war in Patienten mit einer kleinen Zahl von Lymphknotenmetastasen geringer im Vergleich zu sol chen mit vielen positiven Knoten. Die Expression des v6-Epitops korrelierte ebenfalls mit einem erhöhten Risikoverhältnis. Die Bestimmung des v6-Epitops ist bei der Voraussage der OAS dem Lymphknotenstatus überlegen.

Das v3-Epitop zeigt ebenfalls einen Zusammenhang mit einer schlechten OAS, jedoch le diglich im Grenzbereich der Signifikanz (p = 0.08, Tabelle 1 und Fig. 4). Der Unterschied zur v6-Expression läßt sich mit dem Vorliegen einer gemischten Population erklären, in der unterschiedliche Spleißvarianten nebeneinander existieren. Obwohl die Präsenz von v3- und v6-Sequenzen korreliert ist (p = 0.001), ist v6 die bessere Determinante der Tumorprogres sion. Hohe v6-Expression korreliert signifikant mit positivem Lymphknotenstatus (p= 0.05) und hohem S-Phasenanteil (p = 0.008) sowie histologischer Gradierung (p = 0.06).

Die Kombination von v6-Oberflächenexpression und histologischer Gradierung verbessert die prognostische Signifikanz. Alle Patienten, deren Primärtumoren einen niedrigen v6-Ge halt hatten und die gut differenziert waren, überlebten die Krankheit (Fig. 7). Mehr als 50% der Patienten, die v6-positive Primärtumorzellen des Grades 3 hatten, starben innerhalb von 65 Monaten. War jeweils einer der beiden Faktoren ungünstig, war die Überlebensrate in termediär (p = 0.004). Die Kombination von v3-Epitop und histologischer Gradierung war nicht besser als die Gradierung allein (p = 0.02). Adjuvante zytotoxische Therapie war ef fektiver, wenn der Tumor Exon v6 nicht exprimierte (p = 0.07), als wenn er es tat.

Die Untersuchung demonstriert klar den überraschenden prognostischen Wert des erfin dungsgemäßen Verfahrens, insbesondere auf Grundlage der Expression des varianten Exons v6, für das Mammakarzinom.

Tabelle 1

Univariate Analyse zum Vergleich von Gesamtüberlebenszeit (OAS) in Rela tion zu üblichen prognostischen Faktoren und der Expression der Spleißvarianten v3 und v6 in 59 Brustkrebs-Patienten unter Verwendung von Petos logarithmischem Reihentest.

Tabelle 2 Multivariate Analyse, die das Ergebnis einer proportionalen Risiko-Regressionsanalyse des gleichzeitigen Einflusses des nodalen Status und der Oberflächenxepression des CD44-v6-Epitops auf die OAS zeigt. Es wurde Cox′s partielles nichtparametrisches Re gressionsmodell benutzt, um die Voraussagekraft der Faktorkombinationen zu bestimmen.

Abbildungen

Fig. 1 Schematische Darstellung eines varianten CD44-Moleküls, das die varianten Exons v1 bis v10 enthält. Schraffierte Kästen stellen den Standardanteil dar (nicht maßstabsge recht). Die Lokalisierung der Epitope, die von den monoklonalen Antikörpern VFF7 und VFF8 erkannt werden, sind angezeigt. Die Spezifität der polyklonalen Antiseren anti- CD44v, anti-DI und anti-DIII ist durch die Balken CD44v, DI bzw. DIII angezeigt.

Fig. 2 Aktuariale Überlebenskurve zum Zusammenhang von Lymphknotenbeteiligung und Überlebenszeit, berechnet auf Grundlage der Kaplan-Meier-Kalkulation und logarithini schem Reihentest.

Fig. 3 Aktuariale Überlebenskurve zum Zusammenhang von Tumorgradierung und Überle benszeit, berechnet auf Grundlage der Kaplan-Meier-Kalkulation und logarithmischem Rei hentest.

Fig. 4 Aktuariale Überlebenskurve zum Zusammenhang von Exon-v3-Expression und Überlebenszeit, berechnet auf Grundlage der Kaplan-Meier-Kalkulation und logarithmi schem Reihentest. Patienten mit primärem invasivem Mammakarzinom, das CD44-v3-Epi top exprimiert, versus Nicht-Exprimierer. 6/28 Patienten mit v3-negativem Primärtumor und 12/31 mit v3-positivem Tumor starben im Beobachtungszeitraum von 70 Monaten.

Fig. 5 Aktuariale Überlebenskurve zum Zusammenhang von Exon-v6-Expression und Überlebenszeit, berechnet auf Grundlage der Kaplan-Meier-Kalkulation und logarithmi schem Reihentest. Patienten mit primärem invasivem Mammakarzinom, das CD44-v6-Epi top exprimiert, versus Nicht-Exprimierer. 1/14 Patienten mit v6-negativem Primärtumor und 17/45 mit v6-positivem Tumor starben im Beobachtungszeitraum von 70 Monaten.

Fig. 6 Aktuariale Überlebenskurve zum Zusammenhang von v3-Expression, kombiniert mit Gradierung, und Überlebenszeit, berechnet auf Grundlage der Kaplan-Meier-Kalkulation und logarithmischem Reihentest.

Fig. 7 Aktuariale Überlebenskurve zum Zusammenhang von v6-Expression, kombiniert mit Gradierung, und Überlebenszeit, berechnet auf Grundlage der Kaplan-Meier-Kalkulation und logarithmischem Reihentest.

Fig. 8 CD44v-Expression im menschlichen Mammakarzinom. Duktal-invasives Mamma karzinom. A: Primärtumor. B: Lymphknotenmetastasen. Gegenfärbung: Hämatoxylin. Ori ginalvergrößerung: 20×.

Beispiele Tumoren und Gewebe

Gefrorene Gewebe (aufbewahrt bei -70°C) wurden von der Universitätsfrauenklinik Hei delberg, Deutschland, erhalten. Sie wurden für die Immunhistologie eingesetzt, wobei die unten beschriebenen Antikörper verwendet wurden. Eingeschlossen waren 61 Proben von primären Mammakarzinomen, 9 lokale Rezidive von Mammakarzinomen, 4 Fälle von reinen in-situ-Karzinomen und 16 axilläre Lymphknotenmetastasen (von den gleichen Patienten wie die Primärtumoren). Die Fälle wurden zufällig ausgewählt und schlossen eine repräsen tative Auswahl von histologischen Tumortypen, Stadien und Gradierungen ein. Zum Ver gleich wurden Proben von normalem Brustgewebe, duktalen Hyperplasien und Fibroade nomen ausgewählt.

Beispiel 1: Herstellung der Antikörper gegen Epitope, die von varianten Exonsequen zen des CD44-Gens kodiert werden Klonierung von pGEX-Fusionsproteinen

Die gesamte variante Region des HPKII-Typs von CD44v (Hofmann et al., 1991) wurde aus menschlicher Keratinozyten-cDNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifi ziert. Die beiden PCR-Primer 5′-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3′, Posi tionen 25-52, und 5′-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3′, Positionen 1013-984 der LCLC97-varianten Region, wie von Hofmann et al. beschrieben, enthielten eine EcoRI-Erkennungsstelle, die benutzt wurde, um das PCR-Produkt direkt in den Vektor pGEX-2T (Smith et al., 1988) zu klonieren. Das resultierende Konstrukt (pGEX CD44v HPKII, v3-v10) kodiert für ein Fusionsprotein von ∼70 kD.

Um Subklone der varianten Regionen zu erhalten, die für Affinitätsreinigungen und Western-Blot-Analysen verwendet werden konnten, wurden Fragmente kloniert, die DI (v3), DII/III (vs, v6), und DIII (v6, v7) enthielten, wobei die passenden Restriktionsschnitt stellen verwendet wurden. Fusionsprotein DI enthält die CD44-Sequenz, die von Stamen kovic et al. (1989) beschrieben wurde, von Position 744 bis zur Position 142 der Sequenz von variantem CD44, wie sie von Hofmann et al. (1991) beschrieben-wurde. Fusionsprotein DII/III enthält die variante Sequenz von Position 290-460, Fusionsprotein DIII die variante Sequenz von Position 378-638 (Hofmann et al., 1991). Die DI und DIII enthaltenden Fragmente wurden in das pGEX-Vektorsystem, das DII/III-Fragment in den pATH-Vektor (Angel et al., 1988) kloniert.

Polyklonales Antiserum

Die Herstellung und Reinigung des polyklonalen Antiserums gegen die variante Region des CD44-Moleküls ist in der Literatur beschrieben (Heider et al., 1993). Die Exonspezifität des Gesamtserums (anti-CD44v) sowie affinitätsgereinigter Fraktionen (anti-DI, anti-DIII) ist in Fig. 1 angezeigt.

Monoklonale Antikörper

Weibliche BALB/c-Mäuse wurden mit affinitätsgereinigtem Fusionsprotein immunisiert, das aus pGEX CD44v HPKII (Exons v3-v10) wie oben beschrieben erhalten wurde. Milzzellen eine Tieres mit hohem Antikörpertiter wurde mit P3X63Ag8.653-Myelomzellen unter Ver wendung von Polyethylenglykol 4000 fusioniert. Hybridome wurden in HAT-Medium selektiert (Kearney et al., 1979). Bestimmung der Antikörpertiter im Serum sowie das An tikörperscreening wurden mittels ELISA durchgeführt. Die Microtiterplatten wurden mit Fusionsprotein beschichtet, mit seriellen Verdünnungen von Serumproben oder Hybridoma überständen inkubiert, und spezifische Antikörper wurden mit Peroxidase-gekoppelten Antikörpern gegen Maus-IgG detektiert. Hybridome, die mit Glutathion-Transferase rea gierten, wurden eliminiert. Die verbleibenden Antikörper wurden mit ELISA-Tests weiter charakterisiert, wobei Fusionsproteine der variablen Domänen DI (Exon v3), DII/III (Exons v5, v6) bzw. Dill (Exons v6, v7) verwendet wurden. Die Reaktivität der Antikörper mit menschlichen Hautkeratinozyten wurde immunhistochemisch untersucht.

Die Exonspezifität dieser Antikörper ist in Fig. 1 dargestellt. VFF7 erkennt ein Epitop in der Aminosäuresequenz von Exon v6. VFF8 erkennt ein Epitop in der Aminosäuresequenz von Exon v5.

Beispiel 2: Immunhistochemie von Gewebsschnitten von Mammakarzinomen

Gefrierschnitte (6 µm) wurden in eisgekühltem Methanol 4 min., dann in Aceton 1 min. fi xiert, in PBS (8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCI, 1.44 g/l Na₂HPO₄, 0.24 g/l KH₂PO₄, pH 7.4) gewa schen und mit normalem Ziegenserum (10% in PBS) präinkubiert. Dann wurden sie 3x mit PBS gewaschen und für 1 Stunde mit dem Primärantikörper (in PBS, 1% BSA) inkubiert. Für monoklonale Antikörper wurde eine Endkonzentration von 5 µg/ml verwendet. Affini tätsgereinigte polyklonale Seren wurden auf normalen Hautkeratinozyten titriert, um opti male Färbungsergebnisse zu erhalten. Endogene Peroxidase wurde mit 0.3% H₂O₂ in Me thanol blockiert und die Schnitte mit biotinyliertem Zweitantikörper (entweder anti-Maus oder anti-Kaninchen F(ab′)₂, DAKO Corp., Santa Barbara, CA, USA, abhängig vom ver wendeten Primärantikörper) inkubiert. Der Immunkomplex wurde mit Meerrettich-Peroxi dase visualisiert, die als Streptavidin-Biotin-Peroxidasekomplex an Biotin gekoppelt wurde (DAKO). Nach dreißigminütiger Inkubation mit dem Streptavidin-Biotin-Pernoxidase-Komplex wurden die Schnitte mit 3,3-Amino-9-ethyl-carbazol (Sigma Chemicals, Deisenhofen, Deutschland) für 5 bis 10 min. entwickelt und die Reaktion mit H₂O abgestoppt. Die Zellen wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt, mit Glyzerin-Gelatine eingedeckelt und mikrosko pisch untersucht.

Eine Auswertung der Expression von Spleißvarianten wurde bei einer Gesamtzahl von 60 primären Brusttumoren durchgeführt. Bei 59 Patienten wurden in einem ausreichend langen Zeitraum Nachfolgeuntersuchungen durchgeführt (Mittel 35 Monate, Bereich 3-77), um eine Auswertung des prognostischen Einflusses zu erlauben. Das mittlere Alter der Patien ten betrug 51(31-79) Jahre. 21 Frauen hatten keine axillären Lymphknotenmetastasen. Zwischen einem und neun positive Knoten wurden in 21 Patienten gefunden, 10 oder mehr tra ten bei 16 Patienten auf. 11 Patienten erhielten nach der primären chirurgischen Therapie keine weitere adjuvante Therapie, während 12 Patienten mit 30 mg Tamoxifen für 2 Jahre behandelt wurden und 36 Patienten je sechs Zyklen zytotoxische Chemotherapie erhielten. Die Gefrierschnitte wurden kodiert und in verschiedenen Laboratorien unabhängig vonein ander im Hinblick auf nukleäre und histologische Gradierung sowie auf immunhistologische Färbung mit Antikörpern gegen das v6-Epitop ausgewertet. Die Auswertung der gefärbten Objektträger wurde ohne Kenntnis des Krankheitsverlaufs durchgeführt. Parallel dazu wurden andere CD44-Epitope untersucht. Die Färbung wurde auf einer Skala von 0-4 ge wichtet. Eine Färbung von 0-1 wurde als negativ (14 Patienten), eine Färbung von 2-4 po sitiv (45 Patienten) bewertet.

Literatur

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Claims

1. Verfahren zur Diagnose außerhalb des menschlichen Körpers und/oder Analyse von Mammakarzinomen, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren auf dem Nach weis von einem oder mehreren variablen Exons des Gens CD44 und/oder auf dem Nachweis von einem oder mehreren Epitopen, die von einem oder mehreren variablen Exons des Gens CD44 kodiert werden, beruht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das variable Exon Exon v6 ist bzw. das Epitop von Exon v6 kodiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Exon die Nukleotidse quenz oder eine degenerierte oder allele Variante oder ein Fragment dieser Sequenz enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Epitop die Aminosäu resequenz QATPSSTTEETATQKEQWFGNRWHEGYRQTPREDSHSTTGTAoder eine allele Variante oder ein Fragment dieser Sequenz enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Epitop die Aminosäu resequenz TTEETATQKEQWFGNRWHEGYRQTPREDoder eine allele Variante oder ein Fragment dieser Sequenz enthält.

6. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein Epitop gerichtet ist, das in der Aminosäuresequenz QATPSSTTEETATQKEQWFGNRWHEGYRQTPREDSHSTTGTAoder einer allelen Variante dieser Sequenz enthalten ist.

7. Antikörper nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein Epitop ge richtet ist, das in der Aminosäuresequenz TTEETATQKEQWFGNRWHEGYRQTPREDoder einer allelen Variante dieser Sequenz enthalten ist.

8. Antikörper nach den Ansprüchen 6 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal ist.

9. Antikörper nach den Ansprüchen 6 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß er das F_ab- oder F(ab′)₂-Fragment eines Immunglobulins, ein rekombinant hergestellter single chain-Antikörper (scFv) oder ein chimärer bzw. humanisierter Antikörper ist.

10. Verwendung eines Antikörpers gemäß den Ansprüchen 6 bis 9 zur Diagnose und/oder Analyse von Mammakarzinomen.

11. Verwendung eines Antikörpers gemäß den Ansprüchen 6 bis 9 zur Diagnose und/oder Analyse von Metastasen.

12. Mittel zur Verwendung bei der Diagnose und/oder Analyse von Krebserkrankungen, geeignet für ein Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 5.

13. Mittel zur Verwendung bei der Diagnose und/oder Analyse von Krebserkankungen, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9 enthält.

14. Mittel nach einem der Ansprüche 12 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Form einer Verpackungseinheit vorliegt, in der mehrere Komponenten separat enthal ten sind.