DE4320623C2 - Verfahren zur Diagnose und Analyse von Adenokarzinomen - Google Patents

Verfahren zur Diagnose und Analyse von Adenokarzinomen

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Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Analyse und/oder Diagnose von Adenokarzinomen, insbesondere des Magens, DNA-Moleküle und Antikörper für solche Verfahren sowie deren Verwendung.
Adenokarzinome sind Karzinome, die sich vom Epithelgewebe exokriner, seltener endokri­ ner Drüsen oder von zylinderzellhaltiger Schleimhaut herleiten. Diese Klasse von Tumoren mit oft hoher Malignität hat große klinische Bedeutung z. B. bei den Karzinomen des Ma­ gens, Kolons, Rektums, Pankreas, Corpus uteri, der Mamma, Niere und Galle. Verbesserte Verfahren zur Diagnose und/oder Analyse dieser Erkrankungen, insbesondere auf Grundla­ ge von molekularen Markern, gewinnen daher steigende Bedeutung.
Beispielsweise sind 97% aller Magentumoren Adenokarzinome. Sie können in zwei große histologische Kategorien eingeteilt werden, den "intestinalen" und den "diffusen" Typ (Lauren, 1965). Tumoren vom intestinalen, nicht jedoch vom diffusen Typ, sind oft von einer chronischen Gastritis B und insbesondere von intestinalen Metaplasien begleitet, die für Vorläufer von dysplastischen Veränderungen und von Adenokarzinomen des intestinalen Typs gehalten werden (Jida et Kusama, 1982; Gass, 1983; Kato et al., 1981; Sipponen et al., 1983; Sirula et al., 1974; Strickland et Mackay, 1973). Pathogenetische Unterschiede zwischen diesen beiden Adenokarzinom-Typen spiegeln sich auch in der Beobachtung wi­ der, daß Patienten mit Tumoren vom diffusen Typ oft zur Blutgruppe A gehören, was einen möglichen Einfluß von genetischen Faktoren auf das Krebsrisiko anzeigt (Piper, 1978), während Umweltfaktoren, z. B. Infektionen mit Helicobacterpylori, möglicherweise für die Entwicklung von Tumoren vom intestinalen Typ wichtig sind (Parsonnet et al., 1991; Nomuraetal., 1991).
Es wurde kürzlich gezeigt, daß die Expression von Varianten des Oberflächen-Glykopro­ teins CD44 notwendig und hinreichend ist, um sogenanntes spontanes metastatisches Ver­ halten sowohl in einer nicht-metastasierenden Pankreas-Adenokarzinom-Zellinie der Ratte als auch in einer nicht-metastasierenden Fibrosarkom-Zellinie der Ratte auszulösen (Günthert et al., 1991; Herrlich et al., 1993). Während die kleinste CD44-Isoform, die Standardform CD44s, in einer Reihe verschiedener Gewebe, darunter Epithelzellen, ubiqui­ tär exprimiert wird, werden bestimmte Spleißvarianten von CD44 (CD44v) nur auf einer Untergruppe von Epithelzellen exprimiert. Die CD44-Isoformen werden durch alternatives Spleißen so erzeugt, daß die Sequenzen von 10 Exons (v1-v10) in CD44s komplett ausge­ schnitten werden, jedoch bei den größeren Varianten in verschiedenen Kombinationen vor­ kommen können (Screaton et al., 1992; Heider et al., 1993; Hofmann et al., 1991). Die Varianten unterscheiden sich dadurch, daß an einer bestimmten Stelle des extrazellulären Teils des Proteins unterschiedliche Aminosäuresequenzen insertiert sind. Solche Varianten konnten in verschiedenen menschlichen Tumorzellen und in menschlichem Tumorgewebe nachgewiesen werden. So wurde kürzlich die Expression von CD44-Varianten im Verlauf der kolorektalen Karzinogenese untersucht (Heider et al., 1993). Die Expression von CD44-Varianten fehlt in normalem menschlichen Kolonepithel, und nur eine schwache Expression ist in den proliferierenden Zellen der Krypten nachweisbar. In späteren Stadien der Tumorprogression, z. B. in Adenokarzinomen, exprimieren alle malignen Entartungen Varianten von CD44.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung von neuen Verfahren zur Diagno­ se und Analyse von Adenokarzinomen, insbesondere des Magens, sowie die Bereitstellung von Mitteln für solche Verfahren.
Diese Aufgabe konnte mit der vorliegenden Erfindung gelöst werden. Sie betrifft ein Ver­ fahren zur Diagnose und/oder Analyse von Adenokarzinomen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß CD44-Varianten als molekulare Marker verwendet werden. Der Nachweis dieser Varianten kann auf Proteinebene mittels Antikörpern oder auf Nukleinsäureebene mittels Nukleinsäuresonden erfolgen. Die Erfindung betrifft demzufolge auch Antikörper und Nu­ kleinsäuren, die als Sonden für solche Verfahren geeignet sind, die Verwendung solcher Antikörper und Nukleinsäuren zur Diagnose und Analyse von Adenokarzinomen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung. Bevorzugt sind Verfahren zur Untersuchung der Expression von Molekülen, die die Exons v5 und/oder v6 enthalten bzw. von Molekülen, die Amino­ säuresequenzen enthalten, die durch die Exons v5 und/oder v6 kodiert werden. Entspre­ chend betrifft die Erfindung bevorzugt auch Nukleinsäuren, die mit dem Exon v5 bzw. v6 hybridisieren können, Antikörper gegen Epitope, die von den Exons v5 und/oder v6 kodiert werden, die Verwendung solcher Nukleinsäuren und Antikörper sowie Verfahren zur Her­ stellung solcher Antikörper. Besonders bevorzugt sind Verfahren zur Diagnose und/oder Analyse von Magenkarzinomen, insbesondere zur Unterscheidung und/oder Analyse von Magenkarzinomen des intestinalen und des diffusen Typs.
Die Nuklein- und Aminosäuresequenz des varianten Teils des CD44-Gens ist bekannt (Hofmann et al., 1991). Die Existenz degenerierter oder alleler Varianten ist für die Ausfüh­ rung der Erfindung nicht von Bedeutung; solche Varianten sind daher ausdrücklich mit ein­ geschlossen. Die Sequenzen von Exon v5
und Exon v6
(einschließlich der Gegenstränge der dargestellten Nukleotidsequenzen) sind besonders be­ vorzugt. Als Mittel, um die Erfindung auszuführen, können Antikörper dienen, insbesondere solche, die gegen Epitope innerhalb der Sequenz von Exon v5, besonders bevorzugt inner­ halb der Sequenz
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oder innerhalb der Sequenz von Exon v6, besonders bevorzugt innerhalb der Sequenz
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gerichtet sind. Besonders bevorzugt sind monoklonale Antikörper. Für das erfindungsge­ mäße Verfahren können jedoch auch polyklonale Antikörper, Fab- oder F(ab′)₂-Fragmente von Antikörpern, rekombinant hergestellte single-chain-Antikörper (scFv), chimäre bzw. humanisierte Antikörper oder äquivalente Moleküle dienen, die Exon-v6-kodierte Epitope spezifisch binden. Die Herstellung von Antikörpern gegen bekannte Aminosäuresequenzen kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen (Catty, 1989). Beispielsweise kann ein Peptid dieser Sequenz synthetisch hergestellt und als Antigen in einem Immunisierungspro­ tokoll eingesetzt werden. Ein anderer Weg ist die Herstellung eines Fusionsproteins, das die gewünschte Aminosäuresequenz enthält, indem eine Nukleinsäure (die synthetisch oder z. B. durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus einer geeigneten Probe hergestellt werden kann), die für diese Sequenz kodiert, in einen Expressionsvektor integriert und das Fu­ sionsproiein in einem Wirtsorganismus exprimiert wird. Das gegebenenfalls gereinigte Fu­ sionsprotein kann dann als Antigen in einem Immunisierungsprotokoll eingesetzt und Insert­ spezifische Antikörper oder, im Falle monoklonaler Antikörper, Hybridome, die insertspezi­ fische Antikörper exprimieren, mit geeigneten Verfahren selektiert werden. Solche Verfah­ ren sind Stand der Technik. Heider et al. (1993) und Koopman et al. (1993) beschreiben die Herstellung von Antikörpern gegen variante Epitope von CD44. Ebenfalls als Mittel zur Ausführung können Nukleinsäuren dienen, die mit varianten Exons, insbesondere v5 oder v6, hybridisieren, insbesondere solche mit einer Homologie von mehr als 80% zur entspre­ chenden Exonsequenz. Die Herstellung solcher Nukleinsäuren kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen.
Die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnose und/oder Analyse von Adenokarzinomen kann zweckmäßig durch Untersuchungen von aus dem Körper entnom­ menen Proben, beispielsweise aus Biopsien, erfolgen. Vorteilhaft können dabei die erfin­ dungsgemäßen Mittel verwendet werden. Beispielsweise können Gewebsschnitte immun­ histochemisch mit den erfindungsgemäßen Antikörpern mit an sich bekannten Methoden untersucht werden. Aus Gewebeproben gewonnene Extrakte können ferner mit anderen immunologischen Methoden unter Verwendung der besagten Antikörper untersucht wer­ den, beispielsweise in Western Blots, Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA), Radioimmunoassays (RIA) oder verwandten Immunoassays. Der Nachweis der Expression varianter Exons kann auch auf Nukleinsäureebene erfolgen, beispielsweise durch Hybridisie­ rung von aus Gewebeproben gewonnener RNA (Northern Blot) oder revers transkribierter und PCR-amplifizierter RNA mit geeigneten Proben, oder durch Hybridisierung von Nu­ kleinsäuren in Gewebsschnitten mit geeigneten Proben (in-situ-Hybridisierung). Die Unter­ suchungen können qualitativ, semiquantitativ oder quantitativ erfolgen. Durch Nachweis und/oder Quantifizierung der Expression varianter CD44-Epitope erhobene Daten können so in die Diagnose und Prognose einfließen. Vorteilhaft kann dabei die Kombination mit anderen prognostischen Parametern sein, etwa mit der Gradierung.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Mittel eignen sich hervorragend zur Diagnose und/oder Analyse von Adenokarzinomen, insbesondere solchen des Magens.
Polyklonale Antiseren, die gegen die Epitope v3-v10 gerichtet sind (CD44v in Fig. 1), färb­ ten 42/42 Gefrierschnitte von Magentumoren (Tabelle 1, Beispiele in Fig. 2a,b). Die Fär­ bung war heterogen im Hinblick auf Intensität und Verteilung. Zwischen 5% und 100% der Tumorzellen waren mit unterschiedlicher Intensität angefärbt. Dies bestätigt den Befund von Heider et al. (1993), daß Adenokarzinome CD44-Spleißvarianten exprimieren. Überra­ schend zeigten die nachfolgenden Untersuchungen jedoch, daß sich die Feinanalyse des Ex­ pressionsmusters der verschiedenen varianten Exons zur Diagnose und/oder Analyse von Adenokarzinomen eignet. Dabei sind sowohl qualitative als auch semiquantitative Schluß­ folgerungen möglich.
Um die Aminosäuresequenzen, die durch die varianten Exons kodiert werden (sie werden in diesem Teil der Beschreibung als "variante Epitope" oder nur "Epitope" bezeichnet), zu identifizieren, wurden Gefrierschnitte von Tumoren mit exonspezifischen (in diesem Teil der Beschreibung wird der Begriff "Exon" auch für variante Epitope benutzt) monoklonalen Antikörpern (mAb) untersucht. Fast alle Tumoren, die positiv mit dem polyklonalen Antise­ rum reagierten, reagierten ebenso positiv mit einem mAb gegen Exon v5 (VFF8; Tabelle 1; ein Beispiel zeigt Fig. 2f). Im Gegensatz dazu war die Reaktion mit dem v6-spezifischen Antikörper VFF4 viel stärker eingeschränkt, nur 26/42 Tumoren reagierten positiv (Tabelle 1). Mabs, die andere Exons erkannten (v3/4, v7, v8-10), banden nicht (Tabelle 1).
Überraschenderweise waren 23 der 26 VFF4-positiven Tumoren Adenokarzinome des inte­ stinalen Typs, während 14 der 16 v6-negativen Fälle Siegelringkarzinome des diffusen Typs waren (ein Beispiel ist in Fig. 2c gezeigt).
Die vorliegende Erfindung gestattet es somit erstmalig, anhand molekularer Marker ver­ schiedene Subtypen von Adenokarzinomen zu unterscheiden, insbesondere Adenokarzino­ me des Magens vom intestinalen Typ von denen des diffusen Typs.
Von 10 Patienten waren sowohl Primärtumoren als auch Lymphknotenmetastasen erhält­ lich. Fünf dieser Paare gehörten zum intestinalen Typ und fünf zum diffusen Typ. Epitope, die durch das polyklonale Antiserum erkannt wurden, waren sowohl auf den Primärtumoren als auch auf den Metastasen von allen 10 Tumorpaaren präsent (Tabelle 2; Fig. 2a und b zeigen den Primärtumor Nr. 9069/90 von Tabelle 2 und die zugehörige Lymphknotenmeta­ stase). Alle Tumorproben (Primärtumoren und Metastasen) reagierten mit dem für Exon v5 spezifischen mAb VFF8. Alle Proben, die zum intestinalen Typ gehören, reagierten positiv nach Inkubation mit dem für Exon v6 spezifischen mAb VFF4, während von den Siegelring­ karzinomen nur ein Paar zur VFF4⁺-Gruppe gehörte (vgl. Tabelle 2). Es wurden keine Un­ terschiede in der Färbungsintensität zwischen Primärtumoren und Metastasen entdeckt, noch gab es konsistente Unterschiede im Anteil von CD44v-positiven Zellen zwischen Primärtumor und Metastasen (Tabelle 2). Dies trifft insbesondere auf die Lymphknotenme­ tastasen der VFF4(Exon v6)-negativen Siegelringkarzinome des diffusen Typs zu, die eben­ falls nicht mit diesem mAb reagierten (Tabelle 2). Die vorliegende Erfindung stellt somit erstmalig ein Verfahren sowie die Mittel zu seiner Durchführung bereit, mit dem durch Analyse von Metastasen direkte Rückschlüsse auf den Primärtumor eines Adenokarzinoms möglich sind.
Um zu untersuchen, ob die Expression von CD44v in Adenokarzinomen, insbesondere des Magens, ein Ergebnis des Transformationsprozesses ist, oder ob CD44 bereits im Normal­ gewebe, z. B. des Gastrums, exprimiert wird, wurden Gefrierschnitte von normaler gastri­ scher Mucosa von zwölf verschiedenen Patienten durch immunhistochemische Färbung mit für CD44-Varianten spezifischen Antikörpern analysiert. Alle zwölf Proben färbten positiv mit dem polyklonalen Serum sowie mit einigen der monoklonalen Antikörper. Mit dem polyklonalen Antiserum (Exons v3-v10) und dem mAb VFF8 (Exon-Sequenz v5) wurden positive Reaktionen auf dem mucoiden Oberflächenepithel, in der foveolären Proliferations­ zone und in Arealen von intestinaler Metaplasie erhalten (ein Beispiel ist in Fig. 2d gezeigt). Interessanterweise reagierten diese letzteren Areale auch positiv mit VFF4 (Exon-Sequenz v6), während andere Teile des normalen Magenepithels nicht mit diesem mAb reagierten (Fig. 2c). Alle anderen mAbs (VFF11, VFF9, VFF14; Epitopspezifität vgl. Fig. 1) reagier­ ten nicht. In bestimmten Bereichen der Magenmucosa wird also eine Spleißvariante von CD44 exprimiert, die die Exonsequenz v5 trägt, und die deshalb in der Expression den Zel­ len von Karzinomen des diffusen Typs ähnelt. Bereiche der Magenmucosa, die durch inte­ stinale Metaplasien gekennzeichnet sind, tragen dagegen Epitope beider Exons v5 und v6 und sind in der Expression daher Karzinomen vom intestinalen Typ ähnlich. Diese Befunde unterstützen die These, daß die Tumoren von diesen jeweiligen Zelltypen abstammen und das Expressionsmuster der Zellen aufrechterhalten, von denen sie abstammen. Die vorlie­ gende Erfindung macht solche Analysen von Adenokarzinomen, insbesondere des Magens, erstmalig möglich.
Um zu untersuchen, ob die Expressionsmuster der Spleißvarianten in normalem Gewebe und in Tumorgewebe gleich oder unterschiedlich sind, wurde RNA von Normalgewebe und aus Tumoren isoliert, revers transkribiert, durch PCR amplifiziert und mit Exon-spezifischen Proben hybridisiert. Für die PCR wurden Primer benutzt, die auf der 5′- bzw. 3′-Seite der Insertionsstelle der varianten Exons lokalisiert sind. Durch Ethidiumbromidfärbung von Agarosegelen wurde sowohl in Proben aus normaler Mucosa als auch in Tumorproben ein dominantes PCR-Produkt detektiert, das nach seiner Größe der Form CD44s entsprach. PCR-Produkte geringerer Prominenz wurden nach Übertragung auf Nylonmembranen und Hybridisierung mit Exon-spezifischen Proben nachgewiesen (Fig. 3). Durch Hybridisierung mit einer v5-spezifischen bzw. einer v6-spezifischen Probe wurde die Expression von Exon v5 bzw. v6 enthaltender RNA nachgewiesen. Es ergab sich eine deutliche Differenz im Mu­ ster der RNA, die in normalem Gewebe und in Tumoren exprimiert wurde. Die RNA-Mu­ ster unterschieden sich ferner von Tumor zu Tumor.
RNA von 10 der 12 Proben von normaler Magenmucosa, die auch in der Immunhistochemie untersucht worden waren, ergab zwei dominante Banden, die mit Exons v6 hybridisierten, und zwei dominante Banden ähnlicher Größe, die mit Exon v5 hybridisierten (vier repräsen­ tative Beispiele sind in Fig. 3A und B gezeigt). RNA aus Tumorproben ergab ein komplexe­ res und variableres Muster der Spleißprodukte. Die Tumoren enthielten zumindest teilweise auch größere Spleißvarianten bis zu einer Größe, die die Anwesenheit aller varianten Exon­ sequenzen vermuten läßt (Fig. 3). Offensichtlich waren nicht alle der durch diese Exons kodierten Epitope der Immunhistochemie zugänglich. Sowohl Tumoren vom diffusen als auch vom intestinalen Typ zeigten starke Expression von Transkripten, die Exon v5 enthiel­ ten (Fig. 3A, Spuren 1-5). Allerdings gab es einen klaren Unterschied zwischen Tumoren vom diffusen und vom intestinalen Typ, was die Hybridisierung mit der Exon-v6-spezifi­ schen Probe betraf. Während in allen vier Proben vom intestinalen Typ Amplifizierungspro­ dukte nachgewiesen werden konnten, die Exon v6 enthielten (vgl. Fig. 3B, Spuren 1-4), zeigte die Probe eines Tumors vom diffusen Typ fast keine Hybridisierung mit der v6-spezi­ fischen Probe (Fig. 3B, Spur 5). Die vorliegende Erfindung gestattet somit Diagnose und Analyse von Adenokarzinomen anhand molekularer Marker auf Nukleinsäureebene, und stellt die Mittel dafür zur Verfügung (Nukleinsäuren, die mit Exon-spezifischen Sequenzen hybridisieren). Insbesondere gestattet das erfindungsgemäße Verfahren die Unterscheidung von Magenkarzinomen vom diffusen und vom intestinalen Typ sowie die Analyse der ent­ sprechenden Metastasen auf Nukleinsäureebene.
Das erfindungsgemäße Verfahren sowie die dafür bereitgestellten Mittel gestatten also Dia­ gnose und Analyse von Adenokarzinomen anhand neuer molekularer Marker. Die Unter­ scheidung histologischer Typen von Adenokarzinomen mit entsprechenden prognostischen und therapeutischen Konsequenzen wird damit möglich, ferner die Analyse von Metastasen mit Rückschluß auf einen möglicherweise unbekannten Primärtumor. Insbesondere eignen sich die Exons v5 und v6 als Marker.
Tabelle 1
Expression von varianten CD44-Epitopen auf den Zelloberflächen von Magentumoren
Tabelle 2
Expression von varianten CD44-Epitopen in Primärtumoren des Magens und den entsprechenden Lymphknotenmetastasen
Abbildungen
Fig. 1: Schematische Darstellung einer CD44-Spleißvariante. Diese beispielhafte Variante trägt alle varianten Exonsequenzen an der einzigen Insertionsstelle. Schraffierte Kästen symbolisieren CD44-Standardsequenzen (CD44s). Das polyklonale Antiserum (anti-CD44v) reagiert mit einem bakteriellen Fusionsprotein, das durch die varianten Exons v3 bis v10 kodiert wird, angezeigt durch den Balken CD44v. Die anderen Balken zeigen die ungefähre Lokalisierung der Epitope der monoklonalen Antikörper VFF4, VFF8, VFF9, VFF11 und VFF14 an. Alle monoklonalen Antikörper sind exonspezifisch. Für VFF11 und VFF14 wurde die Spezifität noch nicht exakt bestimmt.
Fig. 2: Immunhistochemie von normaler Mucosa sowie Adenokarzinomen des Magens. Eine fokal betonte anti-CD44v-positive Reaktion zeigt sich in Tumorzellen eines mäßig differenzierten Adenokarzinoms (intestinaler Typ nach Lauren) des Magens (a) sowie in einer regionalen Lymphknotenmetastase (b). In normaler Mucosa des Magens mit chroni­ scher Gastritis reagieren die Foci von intestinalen Metaplasien positiv mit mAb VFF4 (c, Pfeile) sowie mit mAb VFF8 (d, Pfeile), begleitet von einer zusätzlichen Reaktion auf der mucoiden Oberfläche und dem foveolären Epithel (d, Pfeilspitzen). Fast alle Becherzellkar­ zinome des Magens (diffuser Typ nach Lauren) zeigen eine negative Reaktion mit mAb VFF4 (e), und im Gegensatz zu Adenokarzinomen des intestinalen Typs ist das normale mucoide Epithel negativ (e, Pfeilspitzen). In den meisten Fällen zeigt sich in diesen Becher­ zellkarzinomen eine positive Reaktion mit mAb VFF8 (f), und auch das verbliebene normale mucoide Epithel zeigt Immunreaktivität (f; Pfeilspitzen).
(ABC-Methode a, b: anti-CD44v polyklonales Serum, 140 x; c: VFF4, 80x; d: VFF8, 80x; e: VFF4, 210x; f: VFF8, 210x; Gegenfärbung Hämatoxylin).
Fig. 3: Southern-Blot-Analyse von PCR-Amplifikationsprodukten von einzelnen Proben von normaler gastrischer Mucosa, von primären Magentumoren und entsprechenden Lymphknotenmetastasen. Die PCR-Primer waren spezifisch für CD44-Exons, die den vari­ anten Exonsequenzen benachbart sind. cDNAs wurden durch reverse Transkription erzeugt und vor der CD44-spezifischen Amplifikation durch GAPDH-PCR kontrolliert, um Qualität und Häufigkeit der synthetisierten cDNAs zu beurteilen. Die PCR-Produkte, die mit den CD44-Standardprimern (s. Beispiele) erhalten wurden, wurden durch Elektrophorese in einem 1.2%igen Agarosegel aufgetrennt und auf Hybond N⁺-Membranen (Amersham, Braunschweig, Deutschland) übertragen. Die gleichen Filter wurden nacheinander mit Exon-v5-spezifischen (Positionen 243 bis 356 der publizierten menschlichen CD44v-Se­ quenz nach Hofmann et al., 1991) (A) und Exon-v6-spezifischen (Positionen 360 bis 482) (B) Proben hybridisiert. Spuren 1 bis 5: 5 verschiedene primäre Adenokarzinome des Ma­ gens (PT) mit entsprechenden Lymphknotenmetastasen (LN), die in der Probensammlung, die immunhistochemisch untersucht wurde, nicht enthalten waren; Spuren 1 bis 4: intestina­ ler Typ; Spur 5: diffuser Typ, Spuren 6 bis 9: Normale gastrische Mucosa von vier ver­ schiedenen Patienten aus der Korpus-(Spuren 6-8) und Antrumregion (Spur 9).
Fig. 4: Reverse Transkription/PCR-Amplifikation von CD44-Transkripten in Magenkarzi­ nom-Zellinien. Oberer Teil: PCR-Amplifikationsprodukte nach Benutzung von CD44-Stan­ dardprimern (s. Beispiele). Die Erststrangsynthese wurde mit polyadenylierter RNA aus den Magenkarzinomzellinien 2474, 2957 und 3051 durchgeführt. Unterer Teil: GADPH-spezifi­ sche PCR-Amplifikationsprodukte der gleichen RNA-Proben. Die Proben wurden in einem 1.2%igen Agarosegel aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht sichtbar gemacht.
Fig. 5: Southern-Blot-Analyse von CD44-PCR-Amplifikationsprodukten in Magenkarzi­ nom-Zellinien. Die PCR-Reaktionen von Fig. 5 wurden in einem 1.2%igen Agarosegel auf­ getrennt, auf eine Hybond N⁺-Membran übertragen und nacheinander mit Proben hybridi­ siert, die für verschiedene variante CD44-Exons spezifisch waren. v3-10 enthält Nukleotide von Position 25 bis 1013; v5/v6 enthält Nukleotide von Position 244 bis 468; v8-10 enthält Nukleotide von Position 623 bis 981 der veröffentlichten menschlichen varianten CD44- Exonsequenzen (Hofmann et al., 1991).
Beispiele Tumoren und Gewebe
Tumorproben und Normalgewebe wurden aus den Beständen der Abteilung Pathologie der Universität Würzburg, Deutschland, ausgewählt. Die Proben waren unmittelbar nach der chirurgischen Entnahme schockgefroren und bis zur Verwendung bei -80°C gelagert wor­ den. Normalgewebe wurde von zwölf verschiedenen Tumor-Patienten sowohl aus der Kor­ pus- als auch aus der Antrumregion des Magens entnommen. Pathologische Gewebe wur­ den von einer Gesamtzahl von 47 Patienten mit einem Durchschnittsalter von 63 Jahren erhalten. Von den Primärkarzinomen gehörten 29 zum intestinalen und 18 zum diffusen Typ nach Lauren (1965). Die Tumorstadien reichten von lokalisiert (pT1) bis ausgedehnt (pT4), die histologische Gradierung von gut differenzierten (G1) bis schlecht differenzierten (G3) Adenokarzinomen.
Beispiel 1 Herstellung der Antikörper gegen Epitope, die von varianten Exonsequenzen des CD44-Gens kodiert werden Klonierung von pGEX-Fusionsproteinen
Die gesamte variante Region des HPKII-Typs von CD44v (Hofmann et al., 1991) wurde aus menschlicher Keratinozyten-cDNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifi­ ziert. Die beiden PCR-Primer 5′-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3′, Posi­ tionen 25-52, und 5′-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3′, Positionen 1013-984 der LCLC97-varianten Region, wie von Hofmann et al. beschrieben, enthielten eine EcoRI-Erkennungsstelle, die benutzt wurde, um das PCR-Produkt direkt in den Vektor pGEX-2T (Smith et al., 1988) zu klonieren. Das resultierende Konstrukt (pGEX CD44v HPKII, v3-v10) kodiert für ein Fusionsprotein von 70 kD.
Um Subklone der varianten Regionen zu erhalten, die für Affinitätsreinigungen und Western-Blot-Analysen verwendet werden konnten, wurden Fragmente kloniert, die DI (v3), DII/III (v5, v6), und DIII (v6, v7) enthielten, wobei die passenden Restriktionsschnitt­ stellen verwendet wurden. Fusionsprotein DI enthält die CD44-Sequenz, die von Stamen­ kovic et al. (1989) beschrieben wurde, von Position 744 bis zur Position 142 der Sequenz von variantem CD44, wie sie von Hofmann et al. (1991) beschrieben wurde. Fusionsprotein DII/III enthält die variante Sequenz von Position 290-460, Fusionsprotein Dill die variante Sequenz von Position 378-638 (Hofmann et al., 1991). Die DI und DIII enthaltenden Fragmente wurden in das pGEX-Vektorsystem, das DII/III-Fragment in den pATH-Vektor (Angel et al., 1988) kloniert.
Polyklonales Antiserum
Die Herstellung und Reinigung des polyklonalen Antiserums gegen die variante Region des CD44-Moleküls ist in der Literatur beschrieben (Heider et al., 1993). Die Exonspezifität des Gesamtserums (anti-CD44v) ist in Fig. 1 angezeigt.
Monoklonale Antikörper
Weibliche BALB/c-Mäuse wurden mit affinitätsgereinigtem Fusionsprotein immunisiert, das aus pGEX CD44v HPKII (Exons v3-v10) wie oben beschrieben erhalten wurde. Milzzellen eine Tieres mit hohem Antikörpertiter wurde mit P3X63Ag8.653-Myelomzellen unter Ver­ wendung von Polyethylenglykol 4000 fusioniert. Hybridome wurden in HAT-Medium selektiert (Kearney et al., 1979). Bestimmung der Antikörpertiter im Serum sowie das An­ tikörperscreening wurden mittels ELISA durchgeführt. Die Microtiterplatten wurden mit Fusionsprotein beschichtet, mit seriellen Verdünnungen von Serumproben oder Hybridoma­ überständen inkubiert, und spezifische Antikörper wurden mit Peroxidase-gekoppelten Antikörpern gegen Maus-IgG detektiert. Hybridome, die mit Glutathion-Transferase rea­ gierten, wurden eliminiert. Die verbleibenden Antikörper wurden mit ELISA-Tests weiter charakterisiert, wobei Fusionsproteine der variablen Domänen DI (Exon v3), DII/III (Exons v5, v6) bzw. DIII (Exons v6, v7) verwendet wurden. Die Reaktivität der Antikörper mit menschlichen Hautkeratinozyten wurde immunhistochemisch untersucht.
Die Exonspezifität dieser Antikörper ist in Fig. 1 dargestellt.
Beispiel 2 Immunhistochemie
Gefrierschnitte wurden in eisgekühltem Methanol 10 min. fixiert, in PBS (8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.44 g/l Na₂HPO₄, 0.24 g/l KH₂PO₄, pH 7.4) gewaschen und mit normalem Ziegen­ serum (10% in PBS) präinkubiert. Dann wurden sie 3× mit PBS gewaschen und für 1 Stun­ de mit dem Primärantikörper (in PBS, 1% BSA) inkubiert. Endogene Peroxidase wurde mit 0.3% H₂O₂ in Methanol blockiert und die Schnitte mit biotinyliertem Zweitantikörper (entweder anti-Maus oder anti-Kaninchen F(ab′)₂, DAKO Corp., Santa Barbara, CA, USA, abhängig vom verwendeten Primärantikörper) inkubiert. Der Immunkomplex wurde mit Meerrettich-Peroxidase visualisiert, die als Streptavidin-Biotin-Peroxidasekomplex an Biotin gekoppelt wurde (DAKO). Nach dreißigminütiger Inkubation mit dem Streptavidin-Biotin- Peroxidase-Komplex wurden die Schnitte mit 3,3-Amino-9-ethyl-carbazol (Sigma Chemi­ cals, Deisenhofen, Deutschland) für 5 bis 10 min. entwickelt und die Reaktion mit H₂O abgestoppt. Die Zellen wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt, mit Glyzerin-Gelatine einge­ deckelt und mikroskopisch untersucht.
Beispiel 3 Western-Blot-Analyse
Zellen wurden durch Ultraschall lysiert und in SDS-Gel-Probenpuffer 3 min. gekocht (Lämmli, 1970). Gleiche Proteinmengen (ermittelt durch Färbung des Gels mit Coomassie Brilliant Blue) wurden elektrophoretisch in einem denaturierenden 6%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt (Lämmli, 1970). Die Proteine wurden auf Polyvinyliden Difluorid-Membran (Millipore, Eschborn, Deutschland) übertragen, wobei ein Transblot-Gerät (BIO-RAD La­ boratories, München, Deutschland) verwendet wurde. Unspezifische Wechselwirkungen wurden durch Präinkubation der Membranen mit einer Milchpulversuspension (10% Trockenmilchpulver in PBS) blockiert. Die Membranen wurden dann bei Raumtemperatur mit dem polyklonalen anti-CD44-Antiserum (vgl. Fig. 1) inkubiert, gefolgt von einer weite­ ren Inkubation mit mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Amersham, Braunschweig, Deutschland). Die Inkubationszeit betrug jeweils eine Stunde. Nach jeder Antikörperinkubation wurden die Membranen mit PBS gewaschen, das 0.3% Tween 20 (Sigma) enthielt. Die Bindung der Antikörper wurde unter Verwendung eines Enhanced Chemoluminiscent System (Amersham) nachgewiesen.
Beispiel 4 Reverse Transkription/PCR-Amplifikation
2 µg Gesamt-RNA (aus Geweben) oder polyA⁺-RNA (aus Zellinien) wurden isoliert und revers transkribiert, wie in der Literatur beschrieben (Günthert et al., 1991). 5 µl der Erst­ strang-cDNA wurden mit Tag-Polymerase (Amersham) in 50 µl unter den vom Hersteller empfohlenen Pufferbedingungen amplifiziert. Für die GAPDH-PCR wurden Oligonukleoti­ de verwendet, die zu den Positionen 8-29 und 362-339 der publizierten cDNA-Sequenz (Allen et al., 1987) homolog waren. Nach 26 Amplifikationsrunden (95°C für 1 min., 62°C für 1 min., 72°C für 2.5 min.) wurden 10 µl des Reaktionsansatzes in einem 1.4%igen Agarosegel aufgetrennt und das Amplifikationsprodukt nach Färbung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht visualisiert. Zur Amplifikation der varianten CD44-Transkripte wurden Primer verwendet, die homolog zu den Positionen 513-540 (5′-oligo) und 900-922 (3′- oligo) der publizierten menschlichen CD44-Sequenz (Stamenkovic et al., 1989) waren. Nach 36 Amplifikationsmnden (94°C für 1 min., 62°C für 1 min., 72°C für 2.5 min.) wur­ den 10 µl des Reaktionsansatzes in einem Agarosegel aufgetrennt, nach Färbung des Gels mit Ethidiumbromid unter UV-Licht visualisiert und anschließend auf Nylon-Membranen für die Durchführung der Southern Blots (vgl. Fig. 3 und 5 sowie die zugehörigen Abbildungs­ texte) nach Standardprotokollen (Sambrook et al., 1985) übertragen.
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Claims (14)

1. Verfahren zur Diagnose außerhalb des menschlichen Körpers und/oder Analyse von Adenokarzinomen, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren auf dem Nachweis des variablen Exons v5 des Gens CD44 und/oder auf dem Nachweis von einem oder mehreren Epitopen, die von dem variablen Exon v5 des Gens CD44 kodiert werden, beruht.
2. Verfahren zur Diagnose außerhalb des menschlichen Körpers und/oder Analyse von Adenokarzinomen des Magens, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren auf dem Nachweis von einem oder mehreren variablen Exons des Gens CD44 und/oder auf dem Nachweis von einem oder mehreren Epitopen, die von einem oder mehreren variablen Exons des Gens CD44 kodiert werden, beruht.
3. Verfahren nach Anspruch 2 zur Unterscheidung von Magenkarzinomen vom intestina­ len und vom diffusen Typ.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das variable Exon Exon v5 ist bzw. das Epitop von Exon v5 kodiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Exon für die Aminosäuresequenz
(D) VDRNGTTAYEGNWNPEAHPPLIHHEHHEEEETPHSTST
oder eine allele Variante oder ein Fragment dieser Sequenz kodiert.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das variable Exon Exon v6 ist bzw. das Epitop von Exon v6 kodiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Exon für die Ami­ nosäuresequenz
QATPSSTTEETATQKEQWFGNRWHEGYRQTPREDSHSTTGTA,
oder eine eine allele Variante oder ein Fragment dieser Sequenz kodiert.
8. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Nukleotidsequenz oder eine degenerierte oder ailele Variante oder einen Gegenstrang dieser Sequenz enthält, in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
9. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Nukleotidsequenz oder eine degenerierte oder allele Variante oder einen Gegenstrang dieser Sequenz enthält, in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7.
10. Verwendung eines Antikörpers gegen variantes CD44, der gegen ein Epitop gerichtet ist, das in der Aminosäuresequenz von Exon v5,
(D) VDRNGTTAYEGNWNPEAHPPLIHHEHHEEEETPHSTST,
vorzugsweise
HPPLIHHEHHEEEETPHSTST
oder einer allelen Variante oder einem Fragment dieser Sequenzen enthalten ist, in ei­ nem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.
11. Verwendung eines Antikörpers gegen variantes CD44, der gegen ein Epitop gerichtet ist, das in der Aminosäuresequenz von Exon v6,
QATPSSTTEETATQKEQWFGNRWHEGYRQTPREDSHSTTGTA,
vorzugsweise
TTEETATQKEQWFGNRWHEGYRQTPRED
oder einer allelen Variante oder einem Fragment dieser Sequenzen enthalten ist, in ei­ nem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 7.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper monoklonal ist.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper das Fab- oder F(ab′)₂-Fragment eines Immunglobulins, ein rekombinant hergestellter single-chain-Antikörper (scFv) oder ein chimärer bzw. humanisierter Antikörper ist.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 13 zur Diagnose und/oder Analyse von Metastasen.
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DE4014510A1 (de) * 1990-05-07 1991-11-14 Kernforschungsz Karlsruhe Variante cd44-oberflaechenproteine, diese kodierende c-dna-sequenzen, antikoerper gegen diese proteine sowie ihre verwendung in der diagnostik und therapie

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