DE4414787A1 - Verfahren zur Diagnose und Analyse von Zervixkarzinomen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Analyse und/oder Diagnose von Tumoren, ins­ besondere des Gebärmutterhalses (Zervix uteri), Mittel für solche Verfahren sowie deren Verwendung.

Trotz abnehmender Inzidenz (Petterson, 1988) ist die Prognose von Patienten mit fortgeschrittenen Stadien von Zervixkarzinomen schlecht (Perez et al., 1983; Park et Thig­ pen, 1993; Brady et al., 1986). Die Frühdiagnose basiert auf der Auswertung früher mor­ phologischer Veränderungen der Epithelzellen (zervikaler Abstrich). Es ist wünschenswert, definierte molekulare Marker zur frühen Krebserkennung, die für das Staging und als pro­ gnostische Faktoren verwendet werden können, zu finden. Die Expression alternativ ge­ spleißter CD44-Isoformen, die das sogenannte variante Exon v6 tragen, korreliert mit fort­ geschrittenen Stadien von menschlichen Kolonkarzinomen (Heider et al., 1993a) sowie ag­ gressiven und metastatischen menschlichen Lymphomen (Koopman et al., 1993) und wird auf metastatischen Pankreas- und Brust-Tumorzellinien der Ratte gefunden (Günthert et al., 1991). Verschiedene Laboratorien haben ferner über Veränderungen der CD44-Spleißmus­ ter bei menschlichen Krebserkrankungen berichtet (Heider et al., 1993b; Mayer et al., 1993). Experimentelle Studien in Tiermodellen und klinische Untersuchungen legen eine kausale Rolle dieser Proteine bei der Tumorprogression und besonders bei der lymphogenen metastatischen Ausbreitung nahe. Die normalen Funktionen der CD44-Varianten sind da­ gegen noch unbekannt. Viele Epithelien exprimieren Spleißvarianten, darunter die Epithel­ zellen der menschlichen Haut, Blase, des Magens und des Gebärmutterhalses (Günthert et al., 1991; Fox et al., 1993; Mackay et al., 1994). Bis jetzt ist noch nicht gezeigt worden, ob Tumorzellen, die von diesen Epithelien stammen, bei der metastatischen Ausbreitung von diesen Spleißvarianten Gebrauch machen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung von neuen Verfahren zur Diagnose und Analyse von Zervixkarzinomen sowie die Bereitstellung von Mitteln für sol­ che Verfahren.

Diese Aufgabe konnte mit der vorliegenden Erfindung gelöst werden. Sie betrifft ein Verfahren zur Diagnose und/oder Analyse von Tumoren, insbesondere Zervixkarzinomen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß variantes CD44 als molekularer Marker verwendet wird. Der Nachweis varianter CD44-Moleküle kann auf Proteinebene mittels Antikörpern oder auf Nukleinsäureebene, z. B. durch Hybridisierung mit spezifischen Nukleinsäureson­ den oder durch Analyse von Amplifikationsprodukten der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), insbesondere nach reverser Transkription (RT) von mRNA, erfolgen. Die Erfindung betrifft demzufolge auch Antikörper und Nukleinsäuren, die als Sonden bzw. Primer für solche Verfahren geeignet sind, und die Verwendung solcher Antikörper und Nukleinsäuren zur Diagnose und Analyse von Tumoren, insbesondere von Zervixkarzinomen. Bevorzugt sind Verfahren der Untersuchung der Expression von Molekülen, die eine Kombination der Exons v7 und v8 enthalten bzw. von Molekülen, die Aminosäuresequenzen enthalten, die durch eine Kombination der Exons v7 und v8 kodiert werden. Entsprechend betrifft" die Erfindung bevorzugt auch Antikörper gegen Epitope, die von Exons v7 und/oder v8 kodiert werden, insbesondere Antikörper, die Epitope erkennen, die gemeinsam von den Exons v7 und v8 kodiert werden (Übergangsepitope), sowie Nukleinsäuren, die mit den Exons v7 und/oder v8 hybridisieren können, ferner Primer, die zur RT-PCR-Amplifikation von RNA, die die Exons v7 und/oder v8 enthält, verwendet werden können. Ein weiterer Aspekt ist die Verwendung von Antikörpern oder Nukleinsäuren in den erfindungsgemäßen Verfahren.

Die Nuklein- und Aminosäuresequenz der varianten Exons des CD44-Gens ist be­ kannt (Hofmann et al., 1991, Screaton et al., 1992, Tölg et al., 1993). Die Existenz dege­ nerierter oder alleler Varianten ist für die Ausführung der Erfindung nicht von Bedeutung; solche Varianten sind daher ausdrücklich mit eingeschlossen. Die Sequenz von Exon v7 des menschlichen CD44-Gens ist

die von v8 ist

Als Mittel, um die Erfindung auszuführen, können Antikörper dienen, insbesondere solche, die gegen Epitope innerhalb der Aminosäuresequenz gerichtet sind, die gemeinsam von den Exons v7 und v8 kodiert werden (Übergangsepitope). Ein solcher Antikörper er­ kennt besonders bevorzugt ein Epitop innerhalb der Aminosäuresequenz

ASAHTSMPMQGRTTSPEDSSWTDFFNPISMPMGRGMQAGRRMDMDSSHSTTLQPTANPNT GLVEDLDRTGPLSMTTQ

oder einer allelen Variante dieser Sequenz.

Besonders bevorzugt sind monoklonale Antikörper. Für das erfindungsgemäße Ver­ fahren können jedoch auch andere Antikörpermoleküle verwendet werden, z. B. Fab- oder F(ab′)₂-Fragmente von Immunglobulinen, rekombinant hergestellte single-chain-Antikörper (scFv), chimäre bzw. humanisierte Antikörper sowie andere Moleküle, die spezifisch an Epitope binden, die durch Exons v7 und/oder v8 kodiert werden. Die Herstellung von Antikörpern gegen bekannte Aminosäuresequenzen kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen (Catty, 1989). Beispielsweise kann ein Peptid dieser Sequenz synthetisch herge­ stellt und als Antigen in einem Immunisierungsprotokoll eingesetzt werden. Ein anderer Weg ist die Herstellung eines Fusionsproteins, das die gewünschte Aminosäuresequenz enthält, indem eine Nukleinsäure (die synthetisch oder z. B. durch Polymerase-Kettenreak­ tion (PCR) aus einer geeigneten Probe hergestellt werden kann), die für diese Sequenz ko­ diert, in einen Expressionsvektor integriert und das Fusionsprotein in einem Wirtsorganis­ mus exprimiert wird. Das gegebenenfalls gereinigte Fusionsprotein kann dann als Antigen in einem Immumsierungsprotokoll eingesetzt und Insert-spezifische Antikörper oder, im Falle monoklonaler Antikörper, Hybridome, die insertspezifische Antikörper exprimieren, mit geeigneten Verfahren selektiert werden. Solche Verfahren sind Stand der Technik. Heider et al. (1993) und Koopman et al. (1993) beschreiben die Herstellung von Antikörpern gegen variante Epitope von CD44.

Ebenfalls als Mittel zur Ausführung können Nukleinsäuren dienen, die mit varianten Exons, insbesondere v7 und/oder v8, hybridisieren, insbesondere solche mit einer Homolo­ gie von mehr als 80% zu den entsprechenden Exonsequenzen. Die Herstellung solcher Nukleinsäuren kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen. Dies gilt analog auch für Primer, die in der RT-PCR von RNA zum Nachweis der Expression von Exon v7 und/oder v8 verwendet werden können.

Die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnose und/oder Analyse von Tumoren, insbesondere von Zervixkarzinomen, kann zweckmäßig durch Untersuchun­ gen von aus dem Körper entnommenen Proben, beispielsweise aus Biopsien, erfolgen. Vor­ teilhaft können dabei die erfindungsgemäßen Mittel verwendet werden. Beispielsweise können Gewebsschnitte immunhistochemisch mit den erfindungsgemäßen Antikörpern mit an sich bekannten Methoden untersucht werden. Aus Gewebeproben gewonnene Extrakte können ferner mit anderen immunologischen Methoden unter Verwendung der besagten Antikörper untersucht werden, beispielsweise in Western Blots, Enzyme-linked Immuno­ sorbent Assays (ELISA), Radioimmunoassays (RIA) oder verwandten Immunoassays. Der Nachweis der Expression varianter Exons kann auch auf Nukleinsäureebene erfolgen, bei­ spielsweise durch Hybridisierung von aus Gewebeproben gewonnener RNA (Northern Blot) oder RT-PCR-amplifizierter RNA mit geeigneten Primern, oder durch Hybridisierung von Nukleinsäuren in Gewebsschnitten mit geeigneten Proben (in-situ-Hybridisierung). Die Untersuchungen können qualitativ, semiquantitativ oder quantitativ erfolgen. Durch Nachweis und/oder Quantifizierung der Expression varianter CD44-Epitope erhobene Da­ ten können so in die Diagnose und Prognose einfließen. Vorteilhaft kann dabei die Kombi­ nation mit anderen prognostischen Parametern sein, etwa mit der Gradierung.

Die erfindungsgemäßen Verfahren und Mittel eignen sich hervorragend zur Diagno­ se und/oder Analyse von Tumoren, insbesondere von Zervixkarzinomen. 16 Zervixkarzi­ nome und 5 Proben von normalem Zervixepithel wurden im Hinblick auf die Oberflächen­ expression von N-terminalen und varianten Epitopen von CD44 (Fig. 1) und im Hinblick auf CD44-mRNA durch RT-PCR untersucht. Diese Daten erlauben Schlußfolgerungen im Hinblick sowohl auf (a) normale Differenzierung des Zervixepithels als auch (b) Karzinoge­ nese.

(a) Epitheliale Differenzierung

N-terminale Epitope sind auf den subepithelialen Stroma­ zellen und in allen epithelialen Schichten präsent (Fig. 2G). Die Präsenz von N-terminalen Epitopen zeigt CD44-Promotor-Aktivität in allen Stromazellen und epithelialen Schichten an. Epitope varianter Exons treten in Stromazellen nicht auf, werden jedoch in Epithelzellen stark exprimiert. Allerdings gehen diese Epitope in Richtung der epithelialen Oberfläche verloren und fehlen im stratum superficiale (Fig. 2A, C). Ein Epitop, das von dem Über­ gangsstück von Exons v7 und v8 gebildet wird und das von dem mAb VFF17 (anti-v7/v8) erkannt wird, fehlt völlig im normalen Epithel (Fig. 2E). Das Muster der Immunfärbung kann so interpretiert werden, daß es die Oberflächenexpression von einer oder mehreren CD44-Isoformen mit regulierter Zugänglichkeit der Epitope (z. B. durch Glykosylierung) oder mit regulierter Synthese durch alternatives Spleißen anzeigt. Dabei ist die Kombination der Exons v7/v8, die durch das Auftreten des Übergangsepitops angezeigt wird, ausge­ schlossen. Die O-Glykosylierungsstelle in der Nähe 5′-Endes von Exon v8 (Günthert et al., 1991; Screaton et al., 1992) könnte für die Nichtzugänglichkeit des Epitops für den Anti­ körper verantwortlich sein. Regulierte Synthese von CD44-Isoformen, die variante Exons enthalten, wurde in aktivierten Lymphozyten und Hautkeratinozyten beschrieben (Arch et al., 1992, Herrlich et al., 1993). Im Zervixepithel zeigen die hochaktiven und stark prolife­ rierenden Basalzellen die stärkste CD44v-Expression, während die mehr ruhenden Oberflä­ chenzellen dies nicht tun, obwohl Promotoraktivität besteht, wie der Nachweis des N-ter­ minalen Epitops zeigt. Deshalb repräsentieren diese Unterschiede Veränderungen beim Spleißen oder bei der Glykosylierung.

Um herauszufinden, ob alternatives Spleißen nachgewiesen werden kann, wurden RNAs durch semiquantitative RT-PCR analysiert. Hybridisierung mit Proben (synthetisiert durch PCR mit Exon-spezifischen Primern) für variante Exons bei langer Exposition doku­ mentieren die Präsenz alternativ gespleißter langer CD44-Transkripte in den RNA-Proben (Fig. 3). Das größte Fragment, das in allen Proben vorkommt, 850 minus 440 Basenpaare, könnte 3-4 variante Exon-Sequenzen tragen. Möglicherweise kodiert diese RNA-Spezies CD44 v3-v6 oder v4-v7. Zusätzlich ist wenigstens eine andere Spezies vorhanden, die so­ genannte epitheliale Variante CD44v8-v10 (ebenfalls mit einer Transkriptlänge von 850 bp). Diese Daten stützen die Annahme, daß eine CD44-Isoform, die gleichzeitig v7 und v8 ent­ hält, nicht existiert, und sprechen für die Abwesenheit des Übergangsepitops (v7/v8). Die Quelle der CD44s-RNA kann nicht eindeutig definiert werden. Aus den vorliegenden Daten kann nicht bestimmt werden, ob das stratum superficiale nur die CD44s-Isoform synthetisiert oder variante Epitope modifiziert.

(b) Karzinogenese

Im deutlichen Kontrast zum normalen Epithel zeigen 15 von 16 Proben von Zervixtumoren das v7/v8-Übergangsepitop (Fig. 2F). Dies zeigt an, daß ent­ weder eine dramatische Änderung in der Modifikation der Epitope oder, und dies ist wahr­ scheinlicher, eine dramatische Änderung im Spleißmuster auftritt. Obwohl die Immunfär­ bung nur semiquantitativ ist, zeigen ferner Antikörper-Verdünnungsexperimente, daß CD44-Expression in allen Krebszellen gegenüber normalem Epithel verstärkt ist. PCR-Da­ ten zeigen, daß fast alle Proben von malignem Gewebe RNA für CD44-Spleißvarianten enthalten (Fig. 4). Die Spuren 6 und 9 von Fig. 4 repräsentieren Proben mit nur einer klei­ nen Zahl von Tumorzellen. Deswegen war die zu erwartende Menge an CD44v-RNA zu gering, um ausreichend amplifiziert zu werden. Allerdings zeigten die Tumorzellen starke Expression varianter Epitope in der Immunfärbung. Die Ethidiumbromidfärbung doku­ mentiert die relative Häufigkeit von PCR-Produkten in Tumorproben im Vergleich zu Pro­ ben von normalem Epithel (Intensitätsunterschied der Hybridisierungssignale 20fach) (Fig. 3). Es ist zu beachten, daß die Bande, die CD44s darstellt, aus RNA von Tumorzellen oder Stromazellen stammen könnte. Die relative Häufigkeit varianter Exon-Sequenzen war von Probe zu Probe unterschiedlich. Interessanterweise waren unter den Proben mit der stärk­ sten Expression und der größten Anzahl unterschiedlicher Isoformen diejenigen von Patien­ ten, die zum Zeitpunkt der Operation bereits Lymphknotenmetastasen hatten.

Eine große mRNA-Spezies (1440 minus 440 Basenpaare der varianten Domäne), die einer Isoform von CD44 mit Exons v3-v10 entsprechen könnte, wurde in den in dieser Studie untersuchten Zervixkarzinomen häufig produziert. Dieses könnte die Isoform sein, die das v7/v8-Übergangsepitop enthält. Zusätzlich waren verschiedene kleinere Isoformen detektierbar, wobei das Hybridisierungsmuster sowohl CD44v3-v7, CD44v8-v10, als auch andere Varianten repräsentieren könnte. Es kann gefolgert werden, daß Zervixkarzinome eine zweifache Veränderung der CD44 Expression zeigen: Verstärkung der Produktion von CD44-Spleißvarianten sowie eine Änderung des Spleißmusters, die zum Erwerb eines neuen (Übergangs-)Epitops führt. Obwohl es noch nicht klar ist, welche molekularen Funktionen die verschiedenen Spleißvarianten erfüllen, scheint die Veränderung im Spleißmuster einen selektiven Vorteil zu vermitteln.

Informationen über die kombinierte Expression der Exons v7 und v8, wie sie z. B. durch Nachweis des Übergangsepitops durch routinemäßige Immunhistochemie erhalten werden können, können also wegen des überraschenden Auftretens dieser kombinierten Ex­ pression in Tumor-, nicht jedoch in Normalgewebe wertvolle Erkenntnisse für Diagnose und Prognose von Zervixkarzinomen ermöglichen.

Abbildungen

Fig. 1 Schematische Darstellungen einer CD44-Spleißvariante. Diese hypothetische Vari­ ante trägt die varianten Exons v2-v10. Die variante Region ist in die extrazelluläre Domäne in der Nähe der Transmembranregion (TM) eingefügt. Die polyklonalen Seren anti-CD44v3-v10, anti-v3-v4 und anti-v6-v7 reagieren mit bakteriellen Fu­ sionsproteinen, die durch die varianten Exons v3-v10, v3-v4 bzw. v6-v7 kodiert werden. Die anderen Balken zeigen die ungefähre Lokalisierung der Epitope der monoklonalen Antikörper VFF7, VFF8, VFF16 und VFF17 an. Die Antikörper VFF7, VFF8 und VFF16 sind jeweils für ein Exon spezifisch, wohingegen mAb VFF17 mit einem Epitop reagiert, daß von den Exons v7 und v8 gemeinsam ko­ diert wird.

Fig. 2 Immunhistochemie von normalem Zervixepithel (A, C, E, G) und einem Plattenepi­ thel-Karzinom der Zervix. (B, D, F, H). Alle normalen Zervixgewebeproben zeigen eine starke Färbungsreaktion mit den polyklonalen Seren anti-CD44v3-v10 (A) anti-v3-v4 (C), anti-v6-v7, VFF7, VFF8 und VFF16 (nicht gezeigt). Die Fär­ bungsreaktionen waren beschränkt auf das stratum basale und das stratum spino­ sum, während das stratum superficiale ungefärbt blieb. Der mAb VFF 17 zeigte überhaupt keine Färbung von normalen Epithelzellen (E). Der mAb SFF2, der ge­ gen CD44s gerichtet ist, färbte alle Zellschichten stark (G). Die meisten der Zer­ vixkarzinom-Proben zeigten starke Färbungsreaktionen mit allen polyklonalen Se­ ren und mAbs einschließlich mAb VFF17. Repräsentative Beispiele sind in den Fig. 2B (anti-CD44v3-v10), 2D (mAb VFF7), 2F (VFF17), und 2H (mAb SFF2) gezeigt. Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-Methode. Vergrößerung: × 140 (A-D, F-II), × 80 (E); Gegenfärbung: Hämatoxylin.

Fig. 3 Southern-Blot-Analyse von PCR-Amplifikationsprodukten von individuellen Pro­ ben von normalen Geweben des Zervix uteri. Die PCR-Primer waren spezifisch für CD44-Exons in der Nachbarschaft der varianten Exonsequenzen. cDNAs wurden durch reverse Transkription hergestellt und vor der CD44s-Amplifikation mit Glycerinaldehyd-Phosphat-Dehydrogenase-PCR getestet, um die Qualität und Menge der synthetisierten cDNAs zu überprüfen (K). Die PCR-Produkte, die mit CD44-Standard-Primern erhalten wurden, wurden auf 1.2%iger Agarose (I) aufge­ trennt und auf eine Hybond-N⁺-Membran (Amersham) transferiert. Der gleiche Filter wurde dann nacheinander mit Proben hybridisiert, die für die varianten Exons v3-v10 (A-H) spezifisch waren, wie in der Figur angezeigt. Spuren 1-4: normale Zervixproben von 4 verschiedenen Patienten. Expositionszeit: 45-60 Minuten.

Fig. 4 Southern-Blot-Analyse von PCR-Amplifikationsprodukten von individuellen Pro­ ben von Tumoren des Zervix uteri. Die PCR-Primer waren die gleichen wie in Fig. 3 beschrieben. Die PCR Produkte, die mit CD44-Standard-Primern erhalten wur­ den, wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt (I). Nach dem Southern Blotting wurde der Filter nacheinander mit Proben hybridisiert, die spezifisch für die vari­ anten Exons v3-v10 (A-H) waren, wie-in der Figur angezeigt Spur 1: negative Kontrolle; Spur 2: Brusttumorprobe als positive Kontrolle; Spuren 3-14: Zervix­ tumor-Proben von 12 verschiedenen Patientinnen. Spur 7 stellt den gleichen Tumor dar wie in Fig. 2 gezeigt. Expositionszeit: 2-5 Minuten (A-H), 15-20 Minuten (L).

Beispiele Tumor- und Normalgewebeproben

Tumor- und Normalgewebeproben des Gebärmutterhalses wurden von der Abtei­ lung für Gynäkologie der Universität Heidelberg (Deutschland) zur Verfügung gestellt. Alle Proben wurden sofort nach der chirurgischen Entnahme in flüssigem Stickstoff schockgefro­ ren und bis zur Verwendung bei -80°C aufbewahrt. 5 Normalproben wurden von Patienten erhalten, an denen eine totale Hysterektomie im Zusammenhang mit nichtneoplastischen Erkrankungen vorgenommen wurde. 16 Zervixkarzinomproben (15 Plattenepithelkarzinome und 1 Adenokarzinom) wurden ebenfalls untersucht. Die Stadien der Tumoren reichten vom FIGO-Stadium Ib (n=7) über Stadium IIb (n=5) bis zum Stadium IIIb (n=4).

Beispiel 1 Herstellung der Antikörper gegen Epitope, die von varianten Exonsequen­ zen des CD44-Gens kodiert werden Klonierung von pGEX-Fusionsproteinen

Die gesamte variante Region des HPKII-Typs von CD44v (Hofmann et al., 1991) wurde aus menschlicher Keratinozyten-cDNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Die beiden PCR-Primer 5′-CAGGCTGGGAGCCAAATGAAGAAAATG-3′, Positionen 25-52, und 5′-TGATAAGGAACGATTGACATTAGAGTTGGA-3′, Positionen 1013-984 der LCLC97-varianten Region, wie von Hofmann et al. beschrieben, enthielten eine EcoRI-Erkennungsstelle, die benutzt wurde, um das PCR-Produkt direkt in den Vektor pGEX-2T (Smith et al., 1988) zu klonieren. Das resultierende Konstrukt (pGEX CD44v HPKII, v3-v10) kodiert für ein Fusionsprotein von ∼70 kD.

Um Subklone der varianten Regionen zu erhalten, die für Affinitätsreinigungen und Western-Blot-Analysen verwendet werden konnten, wurden Fragmente kloniert, die DI (v3), DII/III (v5, v6), und DIII (v6, v7) enthielten, wobei die passenden Restriktionsschnitt­ stellen verwendet wurden. Fusionsprotein DI enthält die CD44-Sequenz, die von Stamen­ kovic et al. (1989) beschrieben wurde, von Position 744 bis zur Position 142 der Sequenz von variantem CD44, wie sie von Hofmann et al. (1991) beschrieben wurde. Fusionsprotein DII/III enthält die variante Sequenz von Position 290-460, Fusionsprotein DIII die variante Sequenz von Position 378-638 (Hofmann et al., 1991). Die DI und DIII enthaltenden Fragmente wurden in das pGEX-Vektorsystem, das DII/III-Fragment in den pATH-Vektor (Angel et al., 1988) kloniert.

Herstellung polyklonaler Seren und monoklonaler Antikörper

Es wurden monoklonale Antikörper (Maus-anti-Mensch-mAb) und polyklonale Se­ ren (Kaninchen-anti-Mensch-Antiserum) verwendet, die gegen verschiedene variante Epi­ tope des CD44 Moleküls gerichtet waren (Fig. 1).

Zur Herstellung monoklonaler Antikörper wurden weibliche BALB/c-Mäuse mit affinitätsgereinigtem Fusionsprotein immunisiert, das aus pGEX CD44v HPKII (Exons v3- v10) wie oben beschrieben erhalten wurde. Milzzellen eine Tieres mit hohem Antikörpertiter wurde mit P3X63Ag8.653-Myelomzellen unter Verwendung von Polyethylenglykol 4000 fusioniert. Hybridome wurden in HAT-Medium selektiert (Kearney et al., 1979). Bestim­ mung der Antikörpertiter im Serum sowie das Antikörperscreening wurden mittels ELISA durchgeführt. Die Microtiterplatten wurden mit Fusionsprotein beschichtet, mit seriellen Verdünnungen von Serumproben oder Hybridomaüberständen inkubiert, und spezifische Antikörper wurden mit Peroxidase-gekoppelten Antikörpern gegen Maus-IgG detektiert. Hybridome, die mit Glutathion-Transferase reagierten, wurden eliminiert. Die verbleibenden Antikörper wurden mit ELISA-Tests weiter charakterisiert, wobei Fusionsproteine der variablen Domänen DI (Exon v3), DII/III (Exons v5, v6),. DIII (Exons v6, v7), DI-IV (Exons v3-v8), DIII-VI (Exons v7-v10) bzw. v6 (Exon v6) verwendet wurden. Die Reak­ tivität der Antikörper mit menschlichen Hautkeratinozyten wurde immunhistochemisch untersucht.

Die Spezifität dieser Antikörper wurde an anderem Ort bereits dargestellt (Heider et al., 1993a; Koopman et al., 1993). Der mAb VFF17 ist gegen ein Epitop gerichtet, das ge­ meinsam von dem Exons v7 und v8 gebildet wird. Der mAb SFF2 erkennt ein Epitop in der Nähe des N-Terminus des CD44-Standardanteils und färbt CD44s sowie CD44v.

Beispiel 2: Immunhistochemie

Immunfärbungen wurden nach Standardprotokollen wie früher beschrieben durchge­ führt (Heider et al., 1993a; Heider et al., 1993b). Alle tiefgefrorenen Gewebeproben wur­ den in 7 µm breite Schnitte geschnitten, in eisgekühltem Methanol 10 min. fixiert, in PBS (8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.44 g/l Na₂HPO₄, 0.24 g/l KH₂PO₄, pH 7.4) gewaschen und mit normalem Ziegenserum (10% in PBS) präinkubiert. Dann wurden sie 3× mit PBS gewa­ schen und für 1 Stunde mit dem Primär-Antikörper (in PBS, 1% BSA) inkubiert. Endogene Peroxidase wurde mit 0.3% H₂O₂ in Methanol blockiert und die Schnitte mit biotinyliertem Zweit-Antikörper (entweder anti-Maus oder anti-Kaninchen F(ab′)₂, DAKO Corp., Santa Barbara, CA, USA, abhängig vom verwendeten Primär-Antikörper) inkubiert. Der Immun­ komplex wurde mit Meerrettich-Peroxidase visualisiert, die als Streptavidin-Biotin-Peroxi­ dasekomplex an Biotin gekoppelt wurde. Nach dreißigminütiger Inkubation mit dem Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex wurden die Schnitte mit 3,3-Amino-9-ethyl-car­ bazol (Sigma Chemicals, Deisenhofen, Deutschland) für 5 bis 10 min. entwickelt und die Reaktion mit H₂O abgestoppt. Die Zellen wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt, mit Gly­ zerin-Gelatine eingedeckelt und mikroskopisch untersucht.

Beispiel 3: Reverse Transkription/PCR-Amplifikation

3 µg Gesamt-RNA (isoliert aus Tumor- oder Normalgewebe) wurden isoliert und revers transkribiert, wie früher beschrieben (Günthert et al., 1993) 5 µl der Erststrang­ cDNA wurden mit Taq-Polymerase (Amersham) in einem Volumen von 50 µl in Taq-Poly­ merase-Puffer (Amersham) amplifiziert. Für die Glycerinaldehyd-Phosphat-Dehydrogenase- PCR wurden Oligonukleotide verwendet, die zu den Positionen 8-29 und 362-339 der pu­ blizierten cDNA-Sequenz (Allen et al., 1987) homolog waren. Für die Amplifikation der varianten CD44-Transkripte wurden Primer verwendet, die zu den Positionen 513-540 und 934-958 der publizierten menschlichen CD44-Sequenz (Stamenkovic et al., 1991) homolog waren. Nach 25 (GAPDH) bzw. 30 (CD44) Amplifikations-Zyklen (1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C, 2.5 Minuten bei 72°C) wurden 10 µl des Reaktionsansatzes in einem 1.2%igen Agarosegel aufgetrennt. Die Amplifikationsprodukte wurden nach Ethidiumbro­ mid-Färbung sichtbar gemacht und die CD44-Produkte danach für Southern-Blotting auf Nylonmembranen (Hybond-N⁺, Amersham) transferiert. ³²P-markierte Hybridisierungspro­ ben wurden mit PCR synthetisiert, wobei CD44v-Exon-spezifische Primer verwendet wur­ den, die zu den Positionen 24-53/81-110 (v3), 128-154/213-239 (v4), 243-71/327-356 (v5), 357-383/456-482 (v6), 489-515/585-614 (v7), 621-647/692-718 (v8), 722-75 0/779- 808 (v9) und 812-838/987-1013 (v10) (Hofmann et al., 1991) homolog waren.

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Claims (12)

1. Verfahren zur Diagnose außerhalb des menschlichen Körpers und/oder Analyse von Tumoren des Gebärmutterhalses, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren auf dem Nachweis von einem oder mehreren variablen Exons des Gens CD44 und/oder auf dem Nachweis von einem oder mehreren Epitopen, die von einem oder mehreren variablen Exons des Gens CD44 kodiert werden, beruht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das variable Exon Exon v7 oder v8 ist bzw. das Epitop von Exon v7 oder v8 kodiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gleichzeitige Ex­ pression von v7 und v8 untersucht wird bzw. das Epitop von Exon v7 und Exon v8 gemein­ sam kodiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Exons für die Aminosäuresequenz ASAHTSHPMQGIZTTPSPEDSSWTDFFNPISMPMGRGHQAGRRMDMDSSMSTTLQPTANPNT GLVEDLDRTGPLSMTTQoder eine allele Variante oder ein Fragment dieser Sequenz kodieren.

5. Verwendung eines Antikörpers in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.

6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, ein Fab- oder F(ab′)₂-Fragment eines Immunglobulins, ein re­ kombinant hergestellter single-chain-Antikörper (scFv) oder ein chimärer bzw. humanisier­ ter Antikörper ist.

7. Verwendung einer Nukleinsäure in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.

8. Antikörper gegen variantes CD44, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein Epitop gerichtet ist, das von den Exons v7 und v8 gemeinsam kodiert wird.

9. Antikörper nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein Epitop gerichtet ist, das in der Aminosäuresequenz ASAHTSHPMQGRTTPSPEDSSWTDFFNPISMPMGRGMQAGRRMDMDSSMSTTLQPTANPNT GLVEDLDRTGPLSMTTQoder einer allelen Variante oder einem Fragment dieser Sequenz enthalten ist.

10. Antikörper nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklo­ nal ist.

11. Antikörper nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Fab- oder F(ab′)₂-Fragment eines Immunglobulins, ein rekombinant hergestellter single­ chain-Antikörper (scFv) oder ein chimärer bzw. humanisierter Antikörper ist.

12. Verwendung eines Antikörpers gemäß der Ansprüche 8 bis 11 zur Diagnose und/oder Analyse von Zervixkarzinomen.