DE69635925T2

DE69635925T2 - Verfahren und Vorrichtung zum Beurteilen der metastatischen Tendenz von Tumoren

Info

Publication number: DE69635925T2
Application number: DE69635925T
Authority: DE
Inventors: Rachel Bar-Shavit
Original assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co
Current assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co
Priority date: 1995-08-10
Filing date: 1996-08-08
Publication date: 2007-01-25
Anticipated expiration: 2016-08-09
Also published as: US6183954B1; EP0846263B1; EP0846263A2; DE69635925D1; IL114890A0; EP0846263A4; IL114890A; ES2260771T3; ATE320602T1; CA2229108C; WO1997007387A2; CA2229108A1; WO1997007387A3; US6395496B1; AU6667496A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Beurteilen der metastatischen Tendenz von Epithelkarzinomzellen und von Melanomzellen.
Hintergrund der Erfindung
Die Metastasierung ist ein von vielen Faktoren abhängiger Prozess, durch den Tumorzellen aus dem Primärtumor entweichen, sich durch Blut- und Lymphgefäße verbreiten, sich der Immunabwehr des Wirts entziehen und sich an spezifischen Zielorganen anlagern, an denen sie extravasieren und rekolonialisieren. Metastatische Zellen müssen während der Extravasation der Blutgefäße die Basalmembran finden und durchqueren. Der metastatische Prozess wird gewöhnlich als ein Drei-Schritt-Modell beschrieben, wobei sich metastatische Zellen zuerst an die Basalmembran anheften müssen, dann durch proteolytische Enzyme die Basallamina verdauen müssen und schließlich durch die Gefäßwand migrieren müssen.
Die Beurteilung des metastatischen Potentials eines spezifischen Tumors ist für diagnostische und prognostische Zwecke, für das Bestimmen des optimalen Behandlungsverlaufs sowie für verschiedene Forschungszwecke, wie das Entwickeln therapeutischer Verfahren und Medikamente für die Behandlung von Metastasen, wesentlich.
Die Korrelation zwischen verschiedenen Biomolekülen und der metastatischen Tendenz von Tumorzellen wurde zuvor beschrieben. Es wurde eine Verbindung einer erhöhten Invasivität der Basalmembran, wobei es sich um den ersten Schritt beim Metastarseprozess handelt, mit dem Nichtvorhandensein des Östrogenrezeptors und der Expression von Vimentin in einer menschlichen Brustkrebs-Zelllinie offenbart (Thompson u.a., J. of Cellular Physiol., 150:534–544 (1992)). Eine Korrelation zwischen dem invasiven Potential verschiedener menschlicher Brustkrebs-Zelllinien und der Bindung und dem Abbau von Hyaluronan wurde auch beschrieben (Cultry u.a., J. of Cellular Physiol., 160:275–286 (1994)). Das metastatische Potential verschiedener Tumorzelllinien wurde auch mit der Amplifikation in der Expression verschiedener Protoonkogene in der Art des HER-2/Neu-Protoonkogens, das in 25% des menschlichen primären Brustkrebes amplifiziert ist, in Verbindung gebracht, und seine Amplifikation sieht in Verbindung mit einer kürzeren Rückfallzeit und einem geringeren Gesamtüberleben (Slamon u.a., Science, 244:707–712 (1989)).
Wenngleich gegenwärtig eine Änderung des Niveaus einiger der vorstehend erwähnten Biomoleküle, insbesondere die Amplifikation der HER-2/Neu-Protoonkogene, für Prognosezwecke verwendet wird, war die prognostische Verwendung der Expression oder Amplifikation dieses Gens recht kontrovers (Press, M.F. u.a., Cancer Res, 53:4960–4970 (1993)). Die prognostischen Faktoren, die gegenwärtig zum Beurteilen des Brusttumorzustands verwendet werden, sind die Tumorgröße, der histologische Grad, der Steroidhormon-Rezeptorstatus, die DNA-Ploidität, der proliferative Index, Cathepsin D und die Analyse von Wachstumsfaktorrezeptoren in der Art des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors.
Es gibt heute einen großen Bedarf an zusätzlichen, genauen prognostischen Faktoren für Tumorzellen, welche leicht zu identifizieren sind und welche in guter Korrelation mit der metastatischen Tendenz dieser Zellen stehen.
Der Thrombinrezeptor (ThR) wurde geclont und als ein Element der Sieben-Transmembrandomänen-Superfamilie von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren identifiziert. Er wird durch Segmentierung der Arg⁴¹-Ser⁹²-Reste des extrazellurären N-Terminus-Teils des Rezeptors durch das Proteasethrombin aktiviert. Durch die Segmentierung wird der Ligand des Thrombinrezeptors, der ein integraler Teil des Rezeptors selbst ist, freigelegt. Auf diese Weise dient der ThR im Laufe der Zellaktivierung als ein klassisches Substrat für Protease, statt als der traditionelle Ligand-Rezeptor-Komplex (Vu u.a., Cell, 64:1057–1068, (1991)). Vor kurzem wurde berichtet, dass W256-Karzinom- und Maus-Melanom-Tumorzellen funktionelle Thrombinrezeptoren enthalten (Wojtukiewicz u.a., Cancer Res., 55:698–704 (1995)), in dieser Veröffentlichung wurde jedoch nur die Existenz und Funktion des Thrombinrezeptors beurteilt, und es wurde nicht das Niveau seiner Expression und auch nicht seine Verbindung mit der Bösartigkeit des Tumors bestimmt.
Die Rolle von Thrombin bei der Tumorzellenmetastasierung wird in Walz und Fenton (Invasion Metastasis 14(1–6):303–308, (1994–1995)) betrachtet. Die Beteiligung des Gewebefaktors beim Einleiten der Thrombinerzeugung und die Aktivierung des Thrombinrezeptors an malignen Melanomzellen sind in Fischer u.a. beschrieben (Cancer Research 55:1629– 1632 (1995)).
Ein Metastase-assoziiertes Kandidaten-Gen, nämlich mtal, ist in Toh u.a. (Gene 159:97–104 (1995)) beschrieben. Es wird gezeigt, dass die Expression dieses Gens direkt mit dem metastatischen Potential von zwei verschiedenen metastatischen Brustkrebs-Zellsystemen korreliert.
Inoue u.a. (J. Cellular Physiol., 156:212–271 (1993)) berichten, dass es Unterschiede in der Transferrin-Antwort und den Anzahlen von Transferrin-Rezeptoren bei Brustkarzinomlinien von Ratten und Menschen mit verschiedenen metastatischen Potentialen gibt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem überraschenden Ergebnis, dass es eine direkte Korrelation zwischen dem Niveau der ThR-Expression in Epithelkarzinomzellen und Melanomzellen und ihren metastatischen Tendenzen gibt, so dass hohe Niveaus der ThR-Expression in aggressiven metastatischen Epithelkarzinomzellen und Melanomzellen vorhanden sind und niedrige bis moderate Expressionsniveaus in gemäßigt metastatischen Epithelkarzinomzellen und Melanomzellen festgestellt werden können und im Wesentlichen keine feststellbare Expression von ThR in nicht metastatischen Epithelkarzinomzellen und Melanomzellen vorhanden ist.
Das erwähnte überraschende Ergebnis ermöglicht das Beurteilen der metastatischen Tendenz von Epithelkarzinomzellen und Melanomzellen durch Bestimmen des Niveaus der ThR-Expression darin.
Demgemäß sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Beurteilen der metastatischen Tendenz von Epithelkarzinomzellen und Melanomzellen vor, welches die folgenden Schritte aufweist:

(a) Bestimmen eines Testniveaus eines Zellparameters in den Zellen, wobei das Parameterniveau ist: (aa) das Niveau des Thrombinrezeptors (ThR) oder (ab) das Niveau der Expression einer Gencodierung für ThR
(b) Vergleichen des Testniveaus mit einem Kontrollniveau, das ein Niveau eines entsprechenden Parameters ist, das aus einer Zelle mit einer bekannten metastatischen Tendenz erhalten wurde, wobei ein hohes oder niedriges Testniveau eine hohe bzw. eine niedrige metastatische Tendenz angibt.

Der Begriff "metastatische Tendenz" bezeichnet die ausgedrückte metastatische Kapazität von Tumoren, die bereits ihre metastatische Ausbreitung begonnen haben und damit begonnen haben, in Zielorganen zu rekolonialisieren sowie das künftige metastatische Potential von Tumoren, die sich noch in der anfänglichen vormetastatischen Phase befinden und in der Zukunft metastasieren können. Eine hohe metastatische Tendenz bezeichnet eine Situation, in der die Tumorzellen schnell metastasieren und an vielen Zielstellen kolonialisieren. Eine moderate metastatische Tendenz bezeichnet Tumorzellen, die langsam metastasieren und nur an wenigen Zielstellen kolonialisieren, und eine niedrige metastatische Tendenz bezeichnet Tumorzellen, die praktisch nicht metastasieren und an ihrer ursprünglichen Stelle beschränkt bleiben. Die Tumorzellen, deren metastatische Tendenz beurteilt wird, können von dem ursprünglichen Epithelkarzinom oder Melanom stammen.
Das ThR-Niveau kann entweder durch Analysieren des Expressionsniveaus der Gencodierung für den Thrombinrezeptor, d.h. durch Bestimmen des mRNA-Niveaus, oder durch direktes Bestimmen des Niveaus des entweder auf den Membranen der Zellen oder innerhalb des Cytoplasmas vorhandenen Thrombinrezeptors bestimmt werden.
Die mRNA-Niveaus können beispielsweise durch Separieren der von den analysierten Zellen erhaltenen mRNA-Moleküle auf einem Elektrophoretogramm (Northern Blot) und anschließendes Identifizieren der separierten Thrombin-mRNA durch Hybridisierung mit geeigneten Proben, die detektierbare Marker aufweisen, durch In-Situ-Hybridisierung an der mRNA, die in der isolierten Epithelkarzinomzelle oder Melanomzelle vorhanden ist oder in isoliertem Gewebe vorhanden ist, das von dem Epithelkarzinom oder Melanom erhalten wird, mit geeigneten Proben, die detektierbare Marker tragen, oder durch RT-PCR-Amplifikation unter Verwendung geeigneter Primer bestimmt werden.
Das ThR-Niveau kann für Rezeptoren bestimmt werden, die an der Membran der Epithelkarzinomzellen und Melanomzellen vorhanden sind und/oder innerhalb der Zelle vorhanden sind. Die Bestimmung kann beispielsweise unter Verwendung von Antikörpern, die in der Lage sind, den Thrombinrezeptor zu erkennen (entweder in seiner membranalen oder cytoplasmalen Form oder in beiden Formen) in einer der Immunproben nach dem neuesten Stand der Technik oder durch Bestimmen des Niveaus der Bindung eines markierten Liganden an den Thrombinrezeptor ausgeführt werden.
Sobald das Niveau des Thrombinrezeptors, entweder durch mRNA- oder durch Proteinbestimmung, bestimmt wurde, sollte es mit dem entsprechenden Niveau entweder der mRNA- oder des Thrombinrezeptors anderer Zellen, deren metastatische Tendenz a priori bekannt ist, wobei diese Zellen auch normale Nicht-Tumorzellen oder Tumorzellen von etablierten Zelllinien, von denen bekannt ist, dass sie eine hohe, niedrige oder moderate metastatische Tendenz aufweisen, sein können, verglichen werden.
In der Praxis und während der klinischen Verwendung ist es nicht erforderlich, jedes erhaltene ThR-Niveau erneut zu kalibrieren, weil es dem Anwender durch Vorerfahrungen bereits bekannt ist, welches spezifische Farbmuster einer In-Situ-Hybridisierung, welches eindeutige Muster der Bandbildung beim Western oder Northern Blot oder welche spezifische Menge der unter Verwendung von RT-PCR amplifizierten mRNA angibt, dass das ThR-Niveau hoch ist, so dass die Epithelkarzinomzelle und Melanomzelle eine hohe metastatische Tendenz aufweist. Es ist auch möglich, die von den getesteten Epithelkarzinomzellen und Melanomzellen erhaltenen Niveaus mit zwei entsprechenden Kontrollniveaus zu vergleichen, wobei das eine von stark metastatischen Zelllinien erhalten wird und das andere von gering metastatischen Zelllinien erhalten wird, um genauer zu bestimmen, ob das getestete Niveau hoch, gering oder mittel ist.
Zellen, die nach dem vorstehend beschriebenen Vergleich ein hohes ThR-Niveau zeigen, sind jene, welche eine hohe metastatische Tendenz aufweisen, Zellen, die ein niedriges oder fast kein Niveau von ThR zeigen, sind jene, die eine geringe metastatische Tendenz aufweisen, und Zellen, die mittlere Niveaus zeigen, sind jene, die gewöhnlich moderat metastatisch sind.
Wenn die ThR-Bestimmung durch Bestimmen des Niveaus des Thrombinrezeptors ausgeführt wird, kann dies Antikörper einschließen, die in der Lage sind, sich spezifisch an den ThR zu binden, entweder wenn er auf den Membranoberflächen der Epithelkarzinomzellen vorhanden ist oder wenn er innerhalb der Zellen vorhanden ist, wobei der Antikörper zu dem Peptid S-F-L-L-R-N-P-N-D-K, optional zusammen mit Reagenzien zum Ausführen einer geeigneten Immunprobe, weiterentwickelt wird. Alternativ kann die Bestimmung des ThR-Proteinniveaus auf einer Ligandenbindeanalyse beruhen, welche einen detektierbar markierten Liganden aufweist, wobei der Ligand das synthetische Peptid ist, das Resten Ser⁴²-Lys⁵¹ des nativen Thrombinrezeptors entspricht (der so genannte "innere Ligand").
Die Erfindung wird nun weiter mit Bezug auf einige spezifische nicht einschränkende Darstellungen und Ausführungsformen erläutert.
Kurzbeschreibung der Zeichnung
1 – ein DNA-Elektrophoretogramm, Bahn A: 250-Basenpaarfragment von menschlicher ThR-DNA, erhalten unter Verwendung menschlicher RT-PCR-Umbilikalendothelzellen als Quelle; Bahnen B, C: gleiche Reaktion wie in der Bahn A ohne DNA; Bahn D: Molekulargewichtssmarker,
2 – pGEM-Vektorrestriktionsabbildung, wobei das menschliche ThR-250-Basenpaarfragment an den Stellen der BamH1- und ECOR1-Restriktionsenzyme in den pGEM-Vektor eingefügt wurde; (die Größe des pGEM-3-Vektors beträgt 2867 b.p., Sequenzreferenzpunkte: 1 – SP6-RNA-Polymerasetranskription; 72 – T7-RNA-Polymerasetranskriptions-Einleitungsstelle; 2851 – 2868 – SP6-RNA-Polymerase-Promotor; 73.89 – T7-RNA-Polymerase-Promotor; 7.63 – mehrere Clonierstellen; 100.158 lac-Operon-Sequenzen; 1100 – 1960 – β-Lactomase-Codierbereich),
3 – Elektrophoretogramm von ThR-mRNA, erhalten von verschiedenen menschlichen Brustzelllinien; Bahnen A, B: MDA 435; Bahnen C, D, E: MDA 231; Bahnen F, G: MCF-7,
4 – In-Situ-Hybridisierung von Antisense-(A, C) oder Sense-(B, D)-mRNA-Proben für menschliche Brustkrebs-Zelllinien ohne metastatisches Potential MCF-7 (C, D) oder mit hohem metastatischem Potential MDA 231 (A, B),
5 – Bindung von Anti-ThR-Antikörpern an den N-Terminus-Rest Ser⁴²-Lys⁵¹ von menschlichem ThR, bestimmt durch ELISA (SIH-AB-Antikörper gegen menschliches ThR; SIH-WR-weiße Kaninchen; pre-SIH-pre-Immunserum von weißen Kaninchen; BR schwarzes Kaninchen),
6 – Western Blot von ThR exprimierenden Zelllinien (Bahnen A–D) und Zelllinien, die ThR nicht exprimieren (Bahnen E und F); Bahn G: Molekulargewichtsmarker und
7 – SDS-PAGE des ¹²⁵I-Thrombinrezeptor-Agonistenpeptids an SMC: (Bahnen 1, 2: unbehandelte Zellen; Bahnen 3, 4: mit Heparinase vorbehandelte Zellen; Bahnen 5, 6: mit Chondrotirase ABC behandelte Zellen; Bahnen 2, 4, 5: Zellen bei Vorhandensein eines markierten Liganden; Bahnen 1, 3, 6: Zellen bei Nichtvorhandensein eines markierten Liganden).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Präparation von Proben, die im Northern Blot und bei der In-Situ-Hybridisierung verwendet werden
(a) Verfahren
Ein 250-Basenpaarfragment des Thrombinrezeptors wurde durch PCR unter Verwendung der folgenden von den menschlichen Thrombinrezeptoren abgeleiteten Sequenzen als Primer erhalten:

Primer 1: 5' ATGGAATTCTGCCACCTTAGATCC
Primer 2: 5' ATGGGATGCGGAGGCTGACTACAA

Es wurde durch Nukleotidsequenzanalyse gezeigt, dass die 250-Basenpaarfragmente der interne Teil des geclonten Thrombinrezeptors (ThR), Nukleotide 329–575 (nach Vu u.a., Cell 64:1057–1068), einschließlich des internen Ligandenbereichpeptids und darüber hinausgehender Sequenzen (d.h. SFLLRNPNDKYEPFWEDEEKNESGLTEYRLVSINKSSPLQKQLPAFISE DASGYLTSSWLTLFVPSVYTGVFVVSLP), waren. Die Länge des Fragments wurde durch Elektrophorese an 1-%-Agarosegel in TAE-(0.04M Tris-Acetat, 0.001M EDTA)-Puffer bestimmt.
Die 250-Basenpaarfragmente wurden an den Stellen von BamH1- und ECOR1-Restriktionsenzymen in einen pGEM-Vektor eingefügt, und die pGEM-Restriktionsabbildung ist in 2 dargestellt.
Bakterien (E.coli-Stamm DH5) wurden mit dem Vektor transformiert und in großen Mengen gezüchtet. Das Plasmid wurde durch Wizard^TM Maxi prep (DNA-Reinigungssystem, USA) isoliert. Das 250-Basenpaarfragment wurde durch Digestion mit den Restriktionsenzymen ECOR1 und BamH1 (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Deutschland) von dem Plasmid isoliert. Das gereinigte Fragment, das durch Ethanolausfällung nach der Geneclean-Prozedur unter Verwendung von Geneclean II Kit, B10, (101 Joshua Way, Vista CA 92083) gereinigt wurde, wurde unter Verwendung des Random Prime Labeling von [α-³²P]-dCTP (Satz von Boehringer-Mannheim, Cat. 1004760, Mannheim, Deutschland) markiert (nach Feinberg, A.P. und Vogelstein, B., Anal. Biochem., 137:266, 1984).
Riboproben wurden unter Verwendung des RNA Color Kit für die nichtradioaktive In-Situ-Hybridisierung (RNP3300, Amersham, Buckinghamshire, England) präpariert. Hierfür wurde das Plasmid (pGEM-3) durch Digestion mit ECOR1 für die Quelle der RNA-Polymerase linearisiert (unter Verwendung des SP6-Promoters, der in pGEM-3 vorhanden ist). Parallel dazu wurde die Digestion mit BamH1 ausgeführt, und linearisierte DNA wurde als Quelle für die T7-RNA-Polymerase (in dem pGEM-3-Plasmid vorhanden) verwendet. Beide linearisierten DNA wurden nach den Anweisungen des Herstellers mit ihrer geeigneten RNA-Polymerase (entweder SP6 oder T7) und mit Nukleotiden und der Transkriptionsreaktion (Wilkinson, D.G., in "In-Situ Hybridisation: A practical approach", Ed. D.G. Wilkinson, IRL Press, Oxford, S. 1–14, 1992, Brunnings, S. u.a., "In-Situ Hybridisation: A Guide to radioactive and Non-radioactive In-Situ Hybridisation Systems", Amersham International Amersham, 1993) inkubiert. Die Aufnahme von Fluorescein-11-UTP während der Transkriptionsreaktion bestimmte das Ausmaß der Synthese.
Riboproben in beiden Richtungen, nämlich Antisense, hergestellt unter Verwendung des T7-SP6-Promoters, und Sense, hergestellt unter Verwendung des T7-Promoters, der zur Kontrolle verwendet wurde, wurden zu in Paraffin eingebetteten Deckgläsern hinzugefügt, woraufhin ein geeigneter Paraffinentfernungsschritt ausgeführt wurde. Die Erfassung der spezifisch hybridisierten mRNA wurde nach einer geeigneten Blockierung und Hinzufügung des Alkaliphosphatase-konjugierten Antikörpers während einer Stunde bei Zimmertemperatur, bei Entwicklung unter Vorhandensein von NBT und BCIP als Substrate, in einem geeigneten Nachweispuffer ausgewertet.
(b) Ergebnisse
Die durch PCR-Amplifikation erhaltene ThR-DNA wurde bei einer 1-%-Agarosegelelektrophorese in TAE-(0.04M Tris-Acetat, 0.001M EDTA)-Puffer separiert, und die Separationsergebnisse sind in 1 dargestellt, wobei die Bahn A das vorstehend erwähnte 250-b.p.-Fragment ist, die Bahnen B, C die gleiche Reaktion sind, wie vorstehend beschrieben wurde, wobei keine DNA vorhanden ist, und die Bahn D Molekulargewichtsmarker sind, welche die Größe der durch PCR erhaltenen Probe bestätigen.
II. Niveau der ThR-Expression in drei Epithelkarzinom-Zelllinien unterschiedlichen metastatischen Potentials
1. RNA-Bestimmung
(a) Verfahren
Es wurden drei Epithelkarzinom-Zelllinien verwendet, nämlich MCF-7, gekennzeichnet als ein Epithelkarzinom mit minimal aggressiven Eigenschaften, welches in Nacktmäusen ohne Matrigel wächst, jedoch selbst bei Vorhandensein von Matrigel nicht metastasiert, MDA 231, welches ein moderat aggressives Karzinom ist, welches nicht ohne Matrigel in Nacktmäusen wächst, jedoch mit moderaten Mengen von Matrigel wächst, und MDA 435, welches ein sehr aggressives Karzinom ist, welches mit einer weit gestreuten Metastasierung selbst bei Nichtvorhandensein von Matrigel in Nacktmäusen wächst.
20 μg/Bahn von RNA wurden von den vorstehend erwähnten drei Karzinomlinien erhalten und auf einem 1,5-%-Agarose/Formaldehyd-Gel separiert. Der 250-b.p.-ThR-DNA-Marker mit [α-³²P]-dCTP, der wie im vorstehenden Beispiel I beschrieben erhalten wurde, wurde als die Hybridisierungsprobe für die separierte mRNA verwendet.
(b) Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt, wobei die Bahnen A und B die Ergebnisse bei der stark metastatischen Zelllinie MDA 435 sind, die Bahnen C, D und E die Ergebnisse bei der moderat metastatischen Zelllinie MDA 231 sind und die Bahnen F und G die Ergebnisse bei der gering metastatischen Zelllinie MCF-7 sind.
Wie ersichtlich ist, hat die stark metastatische Zelllinie große Mengen ThR-mRNA exprimiert, die moderat metastatische Zelllinie mittlere Mengen ThR-mRNA exprimiert und haben die nicht metastatischen Zelllinien im Wesentlichen kein ThR-mRNA exprimiert.
Um zu gewährleisten, dass die Gesamtmengen von mRNA an allen drei Zelllinien im Wesentlichen gleich waren, wurden auch die Mengen von β-Actin-mRNA bestimmt, und es wurde herausgefunden, dass sie in allen drei Zelllinien in etwa gleich waren (Daten nicht dargestellt).
2. Proteinbestimmung
(a) Verfahren
Die stark metastatische MDA-435-Zelllinie und die nicht metastatische MCF-7-Zelllinie wurden verwendet. Lysate von Zellen wurden präpariert, und es wurden entweder 200 μg/Bahn (Bahnen A, C, E) oder 100 μg/Bahn (Bahnen B, D, F) zur Separation auf der SDS-Phase zusammen mit Molekulargewichtsmarkern angewendet.
(b) Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt. Wie ersichtlich ist, weisen Bahnen von Zelllinien, die stark metastatisch sind (Bahnen A–D) ein hohes Niveau an ThR-Protein auf, während Bahnen, die nicht metastatisch sind, im Wesentlichen keine Expression von ThR zeigen (Bahnen E, F).
III. Durch In-Situ-Hybridisierung mit metastatischen und nicht metastatischen Epithelkarzinom-Zelllinien erfasste ThR-Expression
(a) Verfahren
Die im vorstehenden Beispiel II erhaltenen Daten in Bezug auf die Mengen von mRNA-ThR in verschiedenen Karzinomzelllinien, wie durch Northern Blot bestimmt wurde, wurden durch In-Situ-Hybridisierungsanalyse der MDA-435- und MCF-7-Zelllinien-Monoschichten unter Verwendung sowohl von Sense- als von Antisense-Riboproben von ThR, welche wie in Beispiel I beschrieben erhalten wurden, bestätigt.
Die Zellmonoschichten wurden 10 Minuten lang im Ethanol fixiert und sequentiell durch 5 Minuten dauernde Inkubationen in 70% Ethanol, 50% Ethanol und 30% Ethanol hydriert. Anschließend wurde eine zehnminütige Inkubation in 5 mM MgCl₂, gefolgt von einer Behandlung der Zellen mit 0,02N HCl für 10 Minuten und Waschen in 5 mM EDTA in 2xSSC (50 °C, 30 Minuten), ausgeführt. Keine Proteinase-K-Behandlung wurde an den Zellmonoschichten ausgeführt. Schließlich wurden die Zellen mit 4%-Formaldehyd (25 Minuten), gefolgt von 2 Waschgängen in 5 mM MgCl₂, behandelt. Linearisiertes Plasmid mit dem relevanten Enzym (geschätzt – 600 ng) wurde für die Riboprobensynthese (geschätzt – 20 ng/Wanne) verwendet und über Nacht bei 55 °C mit den Zellmonoschichten inkubiert.
(b) Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt, wobei die Antisense-Richtung der Riboproben in den Bildern A und C dargestellt ist und Sense-Riboproben in den Bildern B und D dargestellt sind. Die verwendeten Zelllinien waren entweder die nicht metastatischen MCF-7-Zellen (Bilder C und D) oder die stark metastatischen MDA-435-Zellen (Bilder A und B).
Wie ersichtlich ist, wurde in den MCF-7-Zellen keine Hybridisierung festgestellt, während in den aggressiven metastatischen Zellen eine starke und umfangreiche Verteilung der Probe vorhanden war.
IV. In-Situ-Hybridisierung von in Paraffin eingebetteten Brusttumoren
Die In-Situ-Hybridisierung mit den vorstehend erwähnten Riboproben wurde auch für in Paraffin eingebettete Brusttumore von Patienten mit einer stark invasiven Metastase und Patienten mit einem Primärtumor anscheinend ohne metastatische Ausbreitung ausgeführt. Hierfür wurde eine Hybridisierung unter Verwendung von Digoxigenin(Fluorescein-11)-UTP RNA Color Kit (Amersham, RPN 3300) verwendet. Vorläufige Daten zeigen eine spezifische Einfärbung der Karzinomzellen von Patienten mit einer Metastase, d.h. eine ausgeprägte Einfärbung mit der durch den SP6-Promotor erhaltenen Antisense-Riboprobe und keine Einfärbung mit der durch den T7-Promotor erhaltenen Sense-Riboprobe sowie eine ausgeprägte Einfärbung um Gefäßwände herum im gesamten Brustbereich. Patienten ohne Metastasen wiesen keine erkennbare Einfärbung auf.
V. Anti-Human-ThR-Antikörper
(a) Präparationsverfahren
Ein synthetisches Peptid, das Rückständen Ser⁴²-Lys⁵¹ des nativen Thrombins (S-F-L-L-R-N-P-N-D-K) entspricht, wurde zum Immunisieren eines Kaninchens durch subkutane Koinjektion mit Complete Freund's Adjuvant (1:1-Verhältnis) für die erste Injektion, und dann nach 2–3 Wochen eine weitere Injektion des Peptids, welches zu KLH mit Incomplete Freund's Adjuvant konjugiert war (nach "Antibodies. A Laboratory Manual", von Ed Harlow und David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) verwendet. Das so erhaltene Immunserum wurde unter Verwendung des vorstehend erwähnten synthetischen Peptids für Antikörper affinitätsgereinigt.
5 μg/Bahn des vorstehend erwähnten synthetischen Peptids wurden verwendet, um ELISA-Platten zu beschichten, und das wie vorstehend beschrieben von dem Kaninchen erhaltene Serum wurde durch Hinzufügen serieller Verdünnungen des Antikörpers (2–16 Stunden, 4 °C) gefolgt von 3 Waschgängen und einer anschließenden Inkubation bei 24 °C während 1 Stunde mit Alkaliphosphatase-konjugierten Anti-Rabbit-Antikörpern (Promega; Hollow Road, Madison, WI, USA), hinzugefügt bei einer Verdünnung von 1:5000, auf Spezifität analysiert. Die Wannen wurden dann dreimal gewaschen, und es wurde das Substrat Nitrophenylphosphat (PNPP) in Diethanolaminpuffer hinzugefügt. Die positive Reaktion wurde durch die Farbentwicklung beim Außendurchmesser 405 nm ausgewertet.
(b) Ergebnisse
Wie in 5 ersichtlich ist, war das Serum von immunisiertem tierischem SIH WR 2318 (♢) und SH BR 2318 (•) in der Lage, spezifisch an das synthetische Peptid zu binden, was mit dem Serum von nicht immunisiertem tierischem SIH WR pre (⎕) und SIH BR pre
zu vergleichen ist, welches keine spezifische Bindung zeigte.
VI. Identifizieren des Niveaus von ThR-Protein unter Verwendung einer Ligandenbindeprobe
(a) Verfahren zur Präparation markierter Liganden
Ein synthetisches 14-Aminosäurepolypeptid, das dem internen Thrombinrezeptorliganden entspricht, wurde radioaktiv markiert. Das radioaktive Markieren des 14-Aminosäurepeptids (S-F-L-L-R-N-P-N-D-K-Y-E-P-F) wurde unter Verwendung vom Chloramin T ausgeführt, wie zuvor beschrieben wurde (McConahay, P.J. u.a., Method Enzymol., 70:210 (1980)). Kurz gesagt, wurden 10 μg des Peptids zu 60 μl von 0,2 M Natriumphosphat, pH-Wert 7,2, enthaltend 1 μCi Na¹²⁵I, hinzugefügt. Chloramin T (10 μl von 1 mg/ml) wurde 45 Sekunden lang bei Zimmertemperatur hinzugefügt, und die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 50 μl 0,05% Natriummetabisulfit und 50 μl von 10 mM KI unterbrochen. Die Reaktionsmischung wurde dann auf eine Sephadex G-10-Säule angewendet. Fraktionen wurden in Phosphatpuffer gesammelt (0,1M, pH-Wert 7,2). Die spezifische Aktivität war 0,8–1,1 × 10⁵ cpm/ng Peptid, und das markierte Material bis zu 4 Wochen bei –70 °C gehalten.
(b) Verfahren zum Binden und Vernetzen der markierten Peptide an glatte Muskelzellen (SMC)
SMC-Zellen wurden als Modell der ThR-tragenden Zellen verwendet, wie durch Binden eines wie zuvor in (VIa) beschrieben präparierten markierten Liganden erfasst werden kann.
5 × 10⁵ Zellen-Wanne wurden bis zum Zusammenfließen in 60-mm-Kulturwannen gezüchtet. Zusammenfließende Kulturen wurden auf 4 °C überführt, einmal mit PBS gewaschen und 2 Stunden lang bei verschiedenen Konzentrationen von ¹²⁵I-Peptid bei Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines tausendfachen Überschusses nicht markierten Peptids inkubiert. Die Kulturen wurden dreimal mit PBS gewaschen und anschließend 30 Minuten Lang bei 24 °C mit dem bifunktionalen Vernetzer Disuccinimidylsuberat (DSS, 4 mM) in 0,2 % BSA enthaltendem DMEM inkubiert. Am Ende dieser Inkubation wurden die Zellen gewaschen und zur Analyse durch SDS-PAGE im SDS-PAGE-Probenpuffer gelöst.
(c) Ergebnise
Wie in 7 ersichtlich ist, konnte der Komplex des ThR und des markierten Liganden (Bahnen 2, 4, 5) mit einem Molekulargewicht von etwa 70 kDa, verglichen mit ThR ohne Liganden (Bahnen 1, 3, 6) erfasst werden, was zeigt, dass die Ligandenbindungsanalyse für das Nachweisen von ThR gültig ist.
VII. Das durch RT-PCR bestimmte ThR-Miveau
(a) Verfahren
Unterschiedliche Mengen von RNA (2,5, 5 und 10 μg/Reaktion) der drei Zelllinien MCF-7, MDA-231 bzw. MDA-435 wurden verwendet, um cDNA zu präparieren. Ein Zehntel (5 μl von den 50 μl der gesamten Reaktionsmischung) der verwendeten cDNA wurde weiter zur PCR-Amplifikation bei Vorhandensein der ThR-Primer verwendet. Die PCR-Produkte wurden auf 1%-Agarosegel im TAE-Puffer separiert.
(b) Ergebnisse
Wie in 8 ersichtlich ist, konnte bei keiner der verwendeten Konzentrationen ein ausgeprägtes Bandprodukt von ThR für die nicht metastatischen MCF-7-Zellen beobachtet werden. Die stark metastatischen MDA-231-Zellen zeigten bei allen verwendeten Konzentrationen ein hohes ThR-Niveau, während die moderat metastatischen MDA-435-Zellen ein ausgeprägtes Band zeigten, jedoch nur bei den hohen Konzentrationen von 5 und 10 μg/Reaktion.

Claims

In-Vitro-Verfahren zum Beurteilen der metastatischen Tendenz von Epithelkarzinomzellen mit den folgenden Schritten: (a) Bestimmen eines Testniveaus eines Zellparameters in den Zellen, wobei das Parameterniveau ist: (aa) das Niveau des Thrombinrezeptors (ThR) oder (ab) das Niveau der Expression einer Genkodierung für ThR, (b) Vergleichen des Testniveaus mit einem Kontrollniveau, das ein Niveau eines entsprechenden Parameters ist, das aus einer Kontroll-Epithelkarzinomzelle mit einer bekannten metastatischen Tendenz oder einer nichtmetastatischen Epithelkarzinomzelle erhalten wurde, wobei ein hohes oder niedriges Testniveau eine hohe bzw. eine niedrige metastatische Tendenz angibt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestimmung des Niveaus der Expression einer Genkodierung für den Thrombinrezeptor die folgenden Schritte aufweist: (i) Erhalten der mRNA von den Epithelkarzinomzellen, (ii) Separieren der mRNA-Moleküle auf einem Elektrophoretogramm, (iii) Anwenden von Proben, die einen detektierbaren Marker tragen, auf das Elektrophoretogramm, wobei die Proben in der Lage sind, mit der mRNA des Thrombinrezeptors spezifisch zu hybridisieren, und (iv) Bestimmen des Niveaus des Markers auf dem Elektrophoretogramm.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestimmung des Niveaus der Expression einer Genkodierung für den Thrombinrezeptor eine In-Situ-Hybridisierung der Epithelkarzinomzellen mit einen detektierbaren Marker tragenden Proben, wobei diese Proben mit der mRNA des Thrombinrezeptors spezifisch hybridisieren, und das Bestimmen des Niveaus des an den Epithelkarzinomzellen angebrachten Markers einschließt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestimmung des Niveaus der Expression einer Genkodierung für den Thrombinrezeptor die folgenden Schritte aufweist: (i) Synthetisieren von cDNA durch Umkehrtranskription, wobei die ThR-mRNA als eine Matrize dient, (ii) Verstärken der cDNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und (iii) Bestimmen des Niveaus der verstärkten cDNA.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestimmung des Niveaus des Thrombinrezeptors durch eine Immunprobe vorgenommen wird, bei der Antikörper verwendet werden, die in der Lage sind, sich spezifisch an den auf den Membranen der Epithelkarzinomzellen und/oder innerhalb der Zellen vorhandenen Thrombinrezeptor zu binden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestimmung des Niveaus des Thrombinrezeptors vorgenommen wird, indem ein Ligand des Thrombinrezeptors verwendet wird, der einen detektierbaren Marker trägt, und das Niveau der Bindung des markierten Liganden mit den Epithelkarzinomzellen bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Ligand das synthetische Peptid S-F-L-L-R-N-P-N-D-K ist.
In-Vitro-Verfahren zum Beurteilen der metastatischen Tendenz von Melanomzellen mit den folgenden Schritten: (a) Bestimmen eines Testniveaus eines Zellparameters in den Zellen, wobei das Parameterniveau ist: (aa) das Niveau des Thrombinrezeptors (ThR) oder (ab) das Niveau der Expression einer Genkodierung für ThR, (b) Vergleichen des Testniveaus mit einem Kontrollniveau, das ein Niveau eines entsprechenden Parameters ist, das aus einer Kontroll-Melanomzelle mit einer bekannten metastatischen Tendenz oder einer nichtmetastatischen Melanomzelle erhalten wurde, wobei ein hohes oder niedriges Testniveau eine hohe bzw. eine niedrige metastatische Tendenz angibt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Bestimmung des Niveaus der Expression einer Genkodierung für den Thrombinrezeptor die folgenden Schritte aufweist: (i) Erhalten der mRNA von den Melanomzellen, (ii) Separieren der mRNA-Moleküle auf einem Elektrophoretogramm, (iii) Anwenden von Proben, die einen detektierbaren Marker tragen, auf das Elektrophoretogramm, wobei die Proben in der Lage sind, mit der mRNA des Thrombinrezeptors spezifisch zu hybridisieren, und (iv) Bestimmen des Niveaus des Markers auf dem Elektrophoretogramm.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Bestimmung des Niveaus der Expression einer Genkodierung für den Thrombinrezeptor eine In-Situ-Hybridisierung der Melanomzellen mit einen detektierbaren Marker tragenden Proben, wobei diese Proben mit der mRNA des Thrombinrezeptors spezifisch hybridisieren, und das Bestimmen des Niveaus des an den Melanomzellen angebrachten Markers einschließt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Bestimmung des Niveaus der Expression einer Genkodierung für den Thrombinrezeptor die folgenden Schritte aufweist: (i) Synthetisieren von cDNA durch Umkehrtranskription, wobei die ThR-mRNA als eine Matrize dient, (ii) Verstärken der cDNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und (iii) Bestimmung des Niveaus der verstärkten cDNA.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Bestimmung des Niveaus des Thrombinrezeptors durch eine Immunprobe vorgenommen wird, bei der Antikörper verwendet werden, die in der Lage sind, sich spezifisch an den auf den Membranen der Melanomzellen und/oder innerhalb der Zellen vorhandenen Thrombinrezeptor zu binden.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Bestimmung des Niveaus des Thrombinrezeptors vorgenommen wird, indem ein Ligand des Thrombinrezeptors verwendet wird, der einen detektierbaren Marker trägt, und das Niveau der Bindung des markierten Liganden mit den Melanomzellen bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Ligand das synthetische Peptid S-F-L-L-R-N-P-N-D-K ist.