DE69735020T2

DE69735020T2 - Verfahren zur Diagnose von Prostatakrebs

Info

Publication number: DE69735020T2
Application number: DE69735020T
Authority: DE
Inventors: Bruce R. Zetter; Lere Bao
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 1996-06-17
Filing date: 1997-06-13
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2017-06-14
Also published as: ES2196345T3; AU723144B2; US5858681A; EP0922223A1; DE69720471T2; WO1997048982A1; PT922223E; JP3642431B2; AU3487497A; EP0922223B1; CA2257858A1; ATE314652T1; DE69735020D1; ATE236406T1; DE69720471D1; EP1270745A2; JP2000513098A; EP1270745A3; US6150117A; DK0922223T3

Description

Technischer Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Methoden zur Diagnose von Krebs, insbesondere von metastatischem Krebs, bereit.
Die gewachsene Anzahl von Krebsfällen, die rund um die Welt berichtet wurden, ist von großer Wichtigkeit. Derzeit sind nur einige wenige Behandlungen für spezielle Krebsarten verfügbar, und diese liefern keine absolute Garantie auf Erfolg. Die meisten Behandlungen stützen sich auf eine Vorgehensweise, die das Abtöten schnell wachsender Zellen in der Hoffnung einbezieht, dass schnell wachsende Krebszellen entweder der Behandlung erliegen werden oder zumindest hinlänglich in einer Anzahl reduziert werden, die dem Körpersystem die Eliminierung der verbleibenden Zellen erlaubt. Darüber hinaus wirken viele von diesen Behandlungen nachteilig auf nicht-maligne Zellen. Folglich muss vor dem Beginn vieler Therapien eine Einschätzung der Ernsthaftigkeit des Zustandes durchgeführt werden. Zwecks höchster Effektivität erfordern diese Behandlungen nicht nur eine frühe Entdeckung der Malignität, sondern auch eine Beurteilung der Schwere der Malignität.
Wenngleich verschiedene Arten von Krebs verschiedene Eigenschaften aufweisen, so teilen doch viele Krebse den Umstand, dass sie, um unheilbar zu werden, Metastasen bilden müssen. Bis zu dem Zeitpunkt an dem Metastasen auftreten ist ein Tumor, obschon er bösartig sein kann, auf einen Bereich des Körpers begrenzt. Dies kann Unbehagen und/oder Schmerz begründen oder gar zu ernsthafteren Problemen führen, aber wenn er lokalisiert werden kann, kann er chirurgisch entfernt werden und, bei Durchführung mit entsprechender Sorgfalt, keine weiteren Probleme verursachen. Wenn Metastasen einsetzen, sind Krebszellen in den Körper eingedrungen, und obwohl eine chirurgische Resektion den Muttertumor entfernen kann, betrifft dies nicht andere Tumore. Allein Chemotherapie oder eine bestimmte Art der gezielten Therapie bewirkt dann eine Möglichkeit des Erfolgs.
Die Entwicklung der Tumormetastasen ist ein mehrstufiger Vorgang, der Lokalinvasion und Zerstörung von interzellulärer Matrix, Intravasation in Blutgefäße, Lymphgefäße oder andere Transportkanäle, Überleben im Blutkreislauf, Extravasation aus den Gefäßen in die zweite Stelle und Wachstum an einem neuen Ort beinhaltet (Fidler, et al., Adv. Cancer Res. 28, 149–250 (1978), Liotta, et al., Cancer Treatment Res. 40, 223–238 (1988), Nicolson, Biochim. Biophy. Acta 948, 175–224 (1988) und Zetter, N. Eng. J. Med. 322, 605–612 (1990)). Erfolg bei der Gründung metastatischer Ablagerungen erfordert von Tumorzellen, dass sie dazu fähig sind, diese Schritte nacheinander durchführen zu können. Vielen Schritten der Metastasenentwicklung gemeinsam ist ein Erfordernis der Beweglichkeit. Die verstärkte Bewegung von malignen Tumorzellen ist ein Hauptbeitrag für das Voranschreiten der Krankheit hin zu Metastasen. Gesteigerte Zellbeweglichkeit wurde mit einem fortgeschrittenen metastatischen Potenzial in sowohl tierischen als auch menschlichen Tumoren in Verbinudng gebracht (Hosaka, et al., Gann 69, 273–276 (1978) und Haemmerlin, et al., Int. J. Cancer 27, 603–610 (1981)).
Tumorangiogenese ist wesentlich sowohl für die primäre Tu morexpansion als auch die metastatische Tumorverbreitung, und die Angiogenese selbst erfordert eine ECM-Degradation (Blood et al., Biochim. Biophys. Acta 1032:89–118 (1990)). Daher ist Malignität eine systemische Krankheit, in welcher Wechselwirkungen zwischen den neoplastischen Zellen und deren Umfeld eine ausschlaggebende Rolle während der Entwicklung des pathologischen Prozesses spielen (Fidler, I. J., Cancer Metastasis Rev. 5:29–49 (1986)).
Die Identifikation der Änderungen in der Genexpression, welche mit malignen Tumoren, inklusive derer, welche am Tumorwachstum beteiligt sind, verbunden sind, ist offenbar ein Erfordernis nicht nur für ein vollständiges Verständnis von Krebs sondern auch, um neue vernünftige Therapien gegen Krebs zu entwickeln.
Ein weiteres Problem erwächst dadurch, dass die für Krebszellen charakteristischen Gene sehr häufig abnormal exprimierte Wirtsgene sind. Es ist recht häufig der Fall, dass ein bestimmter Proteinmarker für einen gegebenen Krebs, während er in hohen Pegeln in Verbindung mit dem Krebs exprimiert wird, ebenfalls irgendwo anders auf dem Körper exprimiert wurde, wenngleich mit niedrigen Pegeln.
Prostatakrebs ist die weitest verbreitete Art von Krebs bei Männern und die zweithäufigste Ursache für Krebstod unter älteren Männern (Boring, et al., Cancer J. Clinicians, 7–26 (1994)). Radikalprostatektomie bietet einem Patienten mit lokal begrenzter Erkrankung klinisch eine exzellente Aussicht auf Heilung. Unglücklicherweise ist Prostatakrebs, wenn er diagnostiziert wurde nachdem sich Metastasen ausgebildet hatten, eine tödliche Erkrankung, für die es keine wirksame Behandlung gibt, die das Überleben signifikant erhöht. Jüngste Fortschritte bei Prostatakrebsdiagnosen haben die frühere Erkennung von menschlichem Prostatakrebs durch Anwendung des PSA-Tests ermöglicht (Catalona, et al., J. Urol., 151, 1283–1290 (1994)). Unglücklicherweise wurde diese frühe Erkennung nicht durch eine Verbesserung in der Bestimmung, welche Tumore sich hin zu dem metastatischen Zustand entwickeln können, begleitet (Cookson, et al., J. Urology 154, 1070–1073 (1995) und Aspinall, et al., J. Urology 154, 622–628 (1995)). Da viele Personen mit Prostatakrebs nicht nachteilig durch den Krebs beeinflusst sind, erwuchs eine beträchtliche Kontroverse bezüglich der Verwendung dieser Tests. Daher sind Methoden zur frühen Erkennung und frühen Beurteilung des Potentials für oder der Schwere des Krebses, welche zur Behandlung von beispielsweise metastatischer Erkrankung berücksichtigt werden können, wünschenswert.
Bao und Zetter berichteten in einer auf der Jahresversammlung der Amerikanischen Gesellschaft für Krebsforschung (American Association for Cancer Research annual meeting) (18. bis 22. März 1995) präsentierten Zusammenfassung die Differentialexpression einer neuartigen mRNA, die in hochmetastatischen Rattentumorzelllinien, aber nicht in einer niedrigmetastatischen Variante, exprimiert wurden. cDNA wurde isoliert und soll ein Protein mit 68% Übereinstimmung zu dem Rattenthymosin β4 kodiert haben. Jedoch wurde über die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz nicht berichtet.
Zusammenfassung der Erfindung
Wir haben nun entdeckt, dass Menschen ein Gen haben, welches ein neuartiges Protein aus der Thymosin β Familie kodiert. Dieses neuartige Protein, welches hier als Thymosin β15 bezeichnet wird, hat so wie andere Mitglieder aus der Thymosin β-Familie die Fähigkeit, G-actin zu binden und abzuson dern, aber im Gegensatz zu dem, was von anderen Mitgliedern bekannt ist, reguliert es auch direkt die Zellbeweglichkeit in Prostatakrebszellen. Wir haben eine cDNA des menschlichen Thymosin β15-Gens (SEQ ID NR.: 1) isoliert und haben die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR.: 2) abgeleitet. Wir haben gezeigt, dass erweiterte Transkripte (mRNA) und Expression des Thymosin β15 Gens in nicht-testikulären Zellen eine hohe Korrelation zu dem Zustand der Erkrankung in einer Vielzahl von Krebsen wie beispielsweise Prostata-, Lungen-, Melanom- und Brustkrebs, insbesondere metastatischen Krebsen, aufweist. Folglich kann das Erkennen erhöhter Spiegel des Transkripts oder Genproduktes in nicht-testikulären Geweben nicht nur in einer diagnostischen Art und Weise, sondern auch in einer prognostischen Art und Weise für bestimmte Krebssorten verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren zur Diagnose von Prostatakrebs bei einem Patienten durch Messung der Spiegel von Thymosin β15 in einer vom Patienten gewonnenen biologischen Probe an. Thymosin β15-Spiegel in der Probe oberhalb eines Grundlinienspiegels weisen auf Krebs hin. Biologische Proben umfassen beispielsweise Blut, Gewebe, Serum, Stuhl, Urin, Sputum, Zerebrospinalflüssigkeit und Überstand von Zellysat. Bevorzugt verwendet man Gewebeproben. Die Bestimmung der Grundlinien und der Vergleichsspiegel erfolgt durch Standard-Analyseverfahren auf der Basis der vorliegenden Offenbarung.
Diese Beschreibung stellt ein Verfahren zur Bestimmung des metastatischen Potentials eines Tumors durch Messung des Spiegels der Thymosin β15-Expression im Tumor bereit. Eine Thymosin β15-Expression in diesem Tumor, die größer als der Grundlinienspiegel für das spezielle Gewebe ist, weist auf ein erhöhtes metastatisches Potential hin.
Veränderungen des Zustands können durch Vergleich der Verän derungen der Spiegel der Thymosin β15-Expression im Tumor dieser Person mit der Zeit verfolgt werden.
In den Verfahren der vorliegenden Erfindung können Spiegel von Thymosin β15 durch Messung des Proteins direkt oder indirekt durch Messung des Thymosin β15 kodierenden Transskripts (mRNA) ermittelt werden. mRNA Spiegel können beispielsweise durch Verwendung einer RNA-abhängigen Polymerasekettenreaktion wie beispielsweise die reverse Transkriptase PCR oder Northern-Blot-Analyse gemessen werden.
Grundlinienspiegel können leicht durch Messung der Pegel von Thymosin β15 in einer Probe von erkrankungsfreien Individuen bestimmt werden.
Diese Beschreibung gibt auch ein Verfahren zur Messung von menschlichen Thymosin β15-Spiegeln unter Verwendung eines Antikörpers oder Antikörperfragments an, das menschliches Thymosin β15 selektiv bindet. Das Verfahren umfaßt die Schritte:

a. Kontaktieren einer Probe oder einer Zubereitung davon mit einem selektiv menschliches Thymosin β15 bindenden Antikörper oder Antikörperfragment, und
b. Ermitteln, ob der Antikörper oder das Antikörperfragment durch die Probe gebunden ist, und dadurch Messung der Spiegel von vorhandenem menschlichem Thymosin β15, wobei ein negatives Ergebnis eine bessere Prognose anzeigt als ein positives.

Der Ausdruck „unikales Fragment" bezieht sich auf einen Abschnitt der Nukleotidsequenz oder des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, welcher Sequenzen (entweder Nukleotide oder Aminosäurereste) enthalten wird, die in Thymosin β15 (SEQ ID NR.: 2), aber nicht in anderen Mitgliedern der Thymosin-Familie anwesend sind. Dies kann bestimmt werden, wenn die Hybridisierung dieses Fragmentes unter stringenten Be dingungen derartig ist, dass es nicht an andere Mitglieder der Thymosin-Familie hybridisiert. Solche Fragmente können aus 2 entnommen werden. Eine bevorzugte Gruppe unikaler Fragmente sind solche, die Aminosäure 7 bis 12 der SEQ ID NR.: 2, Aminosäure 21 bis 24 der SEQ ID NR.: 2 und Aminosäure 36 bis 45 der SEQ ID NR.: 2 beinhalten oder Polynukleotide beinhalten, die diese verschlüsseln. Vorzugsweise ist das unikale Nukleotidsequenzfragment 10 bis 60 Nukleotide lang, besonders bevorzugt 20 bis 50 Nukleotide und ganz besonders bevorzugt 30 bis 50 Nukleotide. Vorzugsweise ist das unikale Polypeptidsequenzfragment 4 bis 20 Aminosäuren lang, besonders bevorzugt 6 bis 15 Aminosäuren, ganz besonders bevorzugt 6 bis 10 Aminosäuren.
Beschreibung der Zeichnungen
1 ist die Nukleotidsequenz (SEQ ID NR..: 1) von Tβ15-cDNA und die vorausgesagte Aminosäurensequenz (SEQ ID NR.: 2) (Einzelbuchstabenschlüssel). Die Sequenznummern der Nukleotide und Aminosäuren sind auf der rechten Seite der Sequenzen angezeigt. Das Translationsinitiationskodon ATG ist unterstrichen und das -Terminationskodon TAA ist mit einem Sternchen gekennzeichnet. Eine vermutliche Aktinbindungsregion ist unterstrichen. Diese Sequenzdaten sind von GenBank unter der Zutrittsnummer U25684 erhältlich.
2 zeigt die Aufstellung der abgeleiteten Tβ15 Proteinsequenz und einige der anderen β Thymosin Isoformen. Identische Aminosäurebereiche sind durch schwarze Buchstaben in schwarz gerahmten, weißgrundigen Kästchen dargestellt. Schwarze Buchstaben ohne Kästchen korrespondieren mit den nicht identischen Bereichen. Punkte korrespondieren mit zur Optimierung der Aufstellung in die Sequenz eingefügten Lücken.
3A und 3B zeigen in situ Hybridisierung mit einer antisense-Ribosonde (riboprobe) für Tβ15 bei Patienten mit Prostata-Adenokarzinom. 3A zeigt eine Differentialexpression in Tumoren. Der kleine Pfeil zeigt erfolgreiches Anfärben. Der große Pfeil zeigt erfolgloses Anfärben. 3B zeigt, dass in schlecht differenzierten und invasiven Prostatakrebsen einzelne Zellen, die in das Grundgewebe (stroma) einfallen, mit starker Anfärbung (Pfeil) wiedergegeben werden.
4A, 4B und 4C zeigen serumstimulierte Migration von kontrolltransfizierten und Tβ15-transfizierten Dunning R-3327-Varianten und deren Wachstumsrate.
4A: Vektorkontroll-transfizierte (☐,☐) und Tβ15 antisense (•,
) transfizierte AT3.1 Zellklone.
4B: Vektorkontroll-transfizierte (☐,☐) und Tβ15 sense-transfizierte (•,
) AT2.1 Zellklone. Die Daten sind als das Mittel ± SE (n = 4) ausgedrückt.
4C: Wachstumskurven von kontroll-transfizierten und Tβ15 (sense oder antisense) transfizierten Dunning R-3327 Klonen. Zellen von vektorkontroll-transfiziertem AT2.1 (o), Tβ15 sense-transfiziertem AT2.1 (•), vektorkontroll-transfiziertem AT3.1 (☐) und Tβ15 antisense-transfiziertem AT3.1 (
) sind bei ursprünglich 10⁴ Zellen pro Well in RPMI 1640 mit 10% FBS und 250 nM Dexamethason in 12-Well-Platten ausplattiert. Die Zellen wurden abgeerntet und bei den angezeigten Zeiten gezählt. Die Punkte repräsentieren das Mittel ± SE (n = 3).
5A, 5B, 5C und 5D zeigen eine immunohistochemische Anfärbung von menschlichem Prostatakrebsgewebe mit einem zu Thymosin β15 affinitätsgereinigtem Polyklonalantikörper.

A: Nicht-malignes Prostataephitel (großer Pfeil) und hoch gradig protatische intraepitheliale Neoplasie (PIN) (kleiner Pfeil).
B: Mäßig differenzierter Prostatakrebs, der heterogene Immunoanfärbung zeigt (kleiner Pfeil, erfolgreich; großer Pfeil, nicht erfolgreich).
C: Schlecht differenzierter Prostatakrebs.
D: Einzelne in das Grundgewebe (stroma) einfallende Zellen zeigen starke Anfärbungen.

Eingehende Beschreibung der Erfindung
Obwohl gezeigt wurde, dass Mitglieder der Thymosin β Familie G-actin binden und absondern, wurde zuvor noch nicht gezeigt, dass sie die Zellbeweglichkeit verändern. Unsere Untersuchungen legen jedoch offen, dass Thymosin β15 direkt die Zellbeweglichkeit in Prostatakrebszellen reguliert. Wir haben gezeigt, dass die Expression von Thymosin β15 in hochmetastatischen Prostatakrebszelllinien verglichen mit schlecht-metastatischen oder nicht-metastatischen Linien hochgeregelt ist. Zusätzlich wurde Thymosin β15 in menschlichen Prostatakrebsproben, aber nicht in normaler menschlicher Prostata exprimiert. Wenngleich es nicht gewünscht wird, durch die Theorie gebunden zu werden, zeigt dies, dass β15 eine Rolle in dem Prozess der metastatischen Transformation spielt.
Folglich kann die Evaluation und der Vergleich von Spiegeln des Transkripts (mRNA) oder Genproduktes, entweder normal oder mutiert, in nicht-testikulärem Gewebe sowohl diagnostisch als auch prognostisch für einen bestimmten Krebs sein. Beispielsweise weist ein gehobener Pegel auf eine größere Tendenz der metastatischen Aktivität hin. Weiter kann man durch Überwachung eines bestimmten neoplastischen Wachstums über einen Zeitabschnitt und Vergleich der Änderungen im Spiegel die Veränderungen in der metastatischen Aktivität evaluieren. Der Pegel von β15 kann ebenfalls dazu verwendet werden, um die Schwere eines bestimmten Tumors zu bestimmen. Wir haben gefunden, dass die β15-Expression mit dem Grad der Tumorschwere korreliert. Beispielsweise ist die Expression von β15 in Prostatazellen gut mit dem Gleason-Grad von Prostatakarzinomen korreliert.
Die vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren zur Diagnose von Prostatakrebs bei einem Patienten durch Messung der Thymosin β15-Spiegel in einer biologischen Probe an, die von dem Patienten erhalten wurde. Spiegel von Thymosin β15 in der Probe größer als der Grundlinienspiegel sind kennzeichnend für Krebs. Grundlinienspiegel können leicht durch Messung der Thymosin β15-Spiegel in einer Probe von erkrankungsfreien Individuen bestimmt werden.
Biologische Proben beinhalten beispielsweise Blut, Gewebe, Serum, Stuhl, Urin, Auswurf, Cerebrospinalflüssigkeit und Überstand von Zelllysat. Vorzugsweise verwendet man Gewebeproben. Die Bestimmung der Grundlinie und der Vergleichsspiegel erfolgt durch standardisierte Arten der Analyse, die auf der derzeitigen Offenbarung beruhen.
Veränderungen im Zustand eines Patienten können durch Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren durch Vergleichen der Änderungen in Thymosin β15-Expressionsspiegeln im Tumor der Person mit der Zeit überwacht werden.
Diese Beschreibung gibt auch ein Verfahren zur Bestimmung des metastatischen Potentials eines Tumors durch Messung des Spiegels der Thymosin β15-Expression im Tumor an. Eine Expression von Thymosin β15 in dem Tumor größer als ein Grundlinienspiegel für das bestimmte Gewebe zeigt ein gesteigertes metastatisches Potential an.
Aus der Technik gut bekannte Standardnachweistechniken zum Nachweis von RNA, DNA, Proteinen und Peptiden können leicht dazu verwendet werden, Thymosin β15 oder dessen Transkript zur Diagnose von Krebs, insbesondere metastatischem Krebs, nachzuweisen oder festzustellen, ob ein primärer Tumor eine bestimmte metastatische Phase erreicht hat oder nicht.
Solche Techniken können den Nachweis mit Nukleotidsonden (nucleotide probes) einschließen oder können den Nachweis des Proteins durch beispielsweise Antikörper oder deren Äquivalente umfassen. Vorzugsweise können die Nukleotidsonden jede beliebige sein, welche stärker an die in SEQ ID NR.: 1 gezeigte Sequenz hybridisiert als an andere natürlich vorkommende Thymosin-Sequenzen. Arten der Sonde beinhalten cDNA, Ribosonden, synthetische Oligonukleotide und genomische Sonden. Die Art der verwendeten Sonden wird im Allgemeinen durch die bestimmte Situation vorgegeben, wie beispielsweise Ribosonden für eine in situ-Hybridisierung und cDNA für Northern-Blots. Die meist bevorzugten Sonden sind diejenigen, welche mit der DNA der SEQ ID NR.: 1 korrespondieren. Vorzugsweise ist die Sonde auf die Thymosin β15-Kodierungsregion, d.h. Nukleotide 98–232 der SEQ ID NR.: 1, gerichtet. Höchst bevorzugt ist die Sonde auf die für Thymosin β15 unikalen Nukleotidregionen gerichtet, d.h. Nukleotide 113–133, 158–169 oder 200–239 der SEQ ID NR.: 1. Nachweis des Thymosin β15 kodierenden Gens ist per se zweckmäßig in dem Screening von Mutantionen, welche mit gesteigerter Expression in Verbindung stehen. Weitere Formen von Assays zum schnelleren Nachweis von Targets, die mit Spiegeln von Expressionstranskripten und anderen Expressionsprodukten assoziiert sind, sind im Allgemeinen ebenfalls brauchbar. Die Sonden können so kurz sein, wie es nötig ist, um differenziert Thymosin β15 mRNA Transkripte zu erkennen und können so kurz sein wie beispielsweise 15 Basen.
Eine Sonde kann ebenfalls durch einen Fachmann auf diesem Gebiet ausgehend von der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR.: 2 rückwärts entwickelt werden. Die Verwendung solcher Sonden kann jedoch insofern begrenzt sein, weil man erkennt, dass wegen der Degeneration des genetischen Codes nicht jede gegebene zurückentwickelte Sequenz notwendigerweise gut oder überhaupt mit irgendeiner gegebenen komplementären Sequenz, die von demselben Peptid zurückentwickelt wurde, hybridisiert. Dies ist ein für den Fachmann hinsichtlich seiner Überlegungen üblicher Faktor, und die Degeneration irgendeiner gegebenen Sequenz ist häufig so weit, dass sich eine große Anzahl an Sonden für irgendeine Sequenz ergibt.
Die Art der Markierung der Sonden kann irgendeine geeignete sein, wie beispielsweise die Verwendung von Radioisotopen, zum Beispiel von ³²P und ³⁵S. Die Markierung mit Radioisotopen kann, gleich ob die Sonde chemisch oder biologisch synthetisiert wurde, unter der Verwendung von geeignet markierten Basen erreicht werden. Andere Arten der Markierung können Enzym- oder Antikörpermarkierung, wie diese beispielsweise für ELISA charakteristisch ist, beinhalten.
Der Nachweis von RNA Transkripten kann durch Northern-Blotting erreicht werden, bei welchem zum Beispiel eine Herstellung von RNA auf einem denaturierenden Agarosegel. laufen gelassen wird, und auf einen geeigneten Träger, wie beispielsweise aktivierte Zellulose, Nitrozellulose oder. Glas- oder Nylonmembrane, transferiert werden. Radiomarkierte cDNA oder RNA wird danach zur Herstellung hybridisiert, gewaschen und durch Autoradiographie analysiert.
Eine in situ Hybridisierungsvisualisierung kann ebenfalls verwendet werden, wobei eine radioaktiv markierte antisense cRNA-Sonde mit einem dünnen Abschnitt einer Biopsieprobe hybridisiert, gewaschen, mit RNase gespalten und einer für die Autoradiographie sensitiven Emulsion ausgesetzt wurde.
Die Proben können mit Hämatoxylon angefärbt sein, um die histologische Zusammensetzung der Probe darzustellen, und die Dunkelfelddarstellung mit einem geeigneten Lichtfilter lässt die entwickelte Emulsion erscheinen. Nicht-radioaktive Markierungen wie beispielsweise Digoxigenin können ebenfalls verwendet werden.
Immunohistochemie kann dazu verwendet werden, eine Expression von menschlichem Thymosin β15 in einer Biopsieprobe nachzuweisen. Ein geeigneter Antikörper wird mit beispielsweise einer dünnen Zellschicht in Kontakt gebracht, gewaschen und danach mit einem zweiten, markierten Antikörper kontaktiert. Das Markieren kann durch Enzyme wie beispielsweise Peroxidase, Avidin oder durch Radiomarkierung erfolgen. Chromogene Markierungen sind generell insofern vorzuziehen, als sie unter dem Mikroskop nachgewiesen werden können.
Allgemeiner ist der Nachweis des Proteins durch ein Immunoassay wie beispielsweise durch ELISA oder RIA bevorzugt, was sehr schnell erfolgen kann. Daher ist allgemein die Verwendung von Antikörpern oder Antikörperäquivalenten zur Detektion von Thymosin β15 bevorzugt.
Es kann unnötig sein, das Substrat zu markieren, vorausgesetzt, dass das Produkt des enzymatischen Prozesses nachweisbar und selbst charakteristisch ist (wie beispielsweise Wasserstoffperoxid). Sollte es notwendig sein, das Substrat zu markieren, dann kann dies ebenfalls eine Enzymmarkierung, Markierung mit Radioisotopen, Antikörpermarkierung, Fluoreszensmarkermarkierung oder eine andere geeignete Form, die leicht für einen Fachmann auf diesem Gebiet erkennbar ist, umfassen.
Antikörper können wie unten beschrieben hergestellt werden und in irgendeiner geeigneten Art und Weise zum Nachweis der Expression von Thymosin β15 verwendet werden. Auf Antikörpern basierende Techniken beinhalten ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) und RIA (radioimmunoassay). Irgendein herkömmliches Verfahren kann für solche Immunassays zum Einsatz gelangen. Die Verfahren können in geeigneter Weise ausgeführt werden wie dieses: ein Thymosin β15-Standard wird mit einem Radioisotop wie beispielsweise ¹²⁵I oder ³⁵S oder einem assayfähigen Enzym wie beispielsweise Meerrettich-Peroxidase oder Alkaliphosphatase markiert und, zusammen mit der unmarkierten Probe, mit dem korrespondierenden Antikörper in Kontakt gebracht, worauf ein zweiter Antikörper zur Bindung des ersten verwendet wird und die Radioaktivität oder das immobilisierte Enzym wird untersucht (Kompetitives Assay); alternativ läßt man das in der Probe vorhandene Thymosin β15 mit dem korrespondierenden immobilisierten Antikörper reagieren, den radioisotop- oder enzymmarkierten anti-Thymosin β15-Antikörper mit dem System reagieren und Radioaktivität oder das untersuchte Enzym wird untersucht (ELISA-Sandwich-Assay). Andere konventionelle Verfahren können ebenfalls wie üblich zum Einsatz kommen.
Die oben genannten Techniken können im Wesentlichen als „Einschritt"- oder ein „Zweischritt"-Assay ausgeführt werden. Das „Einschritt"-Assay beinhaltet eine Kontaktierung des Antigens mit dem immobilisierten Antikörper und, ohne Waschvorgang, eine Kontaktierung des Gemisches mit dem markierten Antikörper. Das „Zweischritt"-Assay beinhaltet das Waschen vor der Kontaktierung des Gemisches mit dem markierten Antikörper. Andere konventionelle Methoden können ebenfalls wie üblich zum Einsatz kommen.
Enzymatische Markierung und Radiomarkierung von Thymosin β15 und/oder den Antikörpern kann mit konventionellen Mitteln erfolgen. Derartige Mittel beinhalten im Allgemeinen die kovalente Bindungsknüpfung des Enzyms zu dem Antigen oder dem besagten Antikörper, wie beispielsweise durch Glutaraldehyd, insbesondere so, dass die Aktivität des Enzyms nicht nachteilig beeinflusst wird, wobei damit gemeint ist, dass das Enzym immer noch zur Interaktion mit dem Substrat fähig sein muss, obwohl es nicht für alle Enzyme erforderlich ist, aktiv zu sein, vorausgesetzt, dass genügend aktive bleibt, um die Durchführung des Assays zu erlauben. Tatsächlich sind manche Techniken zur Enzymbindung nicht-spezifisch (wie beispielsweise die Verwendung von Formaldehyd) und werden nur einen Anteil des aktiven Enzyms ergeben.
Üblicherweise ist es wünschenswert, eine Komponente des Assaysystems an einem Träger zu immobilisieren und dabei den anderen Komponenten des Systems zu ermöglichen, dass sie mit dem Komponenten in Kontakt gebracht werden und ohne mühselige und zeitaufwendige Arbeit leicht wieder entfernt werden können. Einer zweiten Phase ist es möglich, von der ersten entfernt immobilisiert zu werden, aber eine Phase ist üblicherweise ausreichend.
Es ist möglich, das Enzym selbst an dem Träger zu immobilisieren, aber wenn ein Festphasenenzym benötigt wird, dann wird dies im Allgemeinen am besten durch Bindung an den Antikörper und Anhaftung des Antikörpers an einen Träger erreicht, wofür Modelle und Systeme aus der Technik bekannt sind. Einfaches Polyethylen kann einen geeigneten Träger liefern.
Zum Markieren geeignete Enzyme sind nicht besonders beschränkt, aber können beispielsweise aus den Mitgliedern der Oxidase-Gruppe ausgewählt werden. Diese katalysieren die Bildung von Wasserstoffperoxid durch Reaktion mit deren Sub straten, und Glukoseoxidase wird häufig wegen ihrer guten Stabilität, leichte Erhältlichkeit und der Kostengünstigkeit als auch der leichten Erhältlichkeit ihres Substrats (Glukose), verwendet. Die Aktivität der Oxidase kann durch Messung der Konzentration des Wasserstoffperoxids, das nach der Reaktion des Enzym-markierten Antikörpers mit dem Substrat gebildet wurde, unter in der Technik bekannten kontrollierten Bedingungen untersucht werden.
Andere Techniken können zum Nachweis von Thymosin β15 je nach Präferenz verwendet werden. Eine solche Technik ist Western-Blotting (Towbin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 (1979)), worin eine geeignet behandelte Probe auf einem SDS-PAGE Gel laufen gelassen wird, bevor es auf einem festen Träger transferiert wird, wie beispielsweise einem Nitrocellulosefilter. (Unmarkierte) anti-Thymosin β15 Antikörper werden danach mit dem Träger in Kontakt gebracht und durch ein zweites immunologisches Reagenz wie beispielsweise markiertes Protein A oder anti-Immunoglobulin (geeignete Markierungen inklusive ¹²⁵I, Meerrettich-Peroxidase und Alkaliphosphatase) untersucht werden.
Proben für diagnostische Zwecke können aus irgendeiner Anzahl von Quellen erhalten werden. Eine Probe, die direkt von dem Tumor wie beispielsweise dem Grundgewebe (Stroma) oder dem Cytosol erhalten wurde, kann zur Bestimmung des metastatischen Potentials des Tumors verwendet werden. Es kann ebenfalls dazu geeignet sein, die Probe von anderen biologischen Präparaten wie beispielsweise von Blut oder Urin zu erhalten. Solche Diagnosen können von bestimmter Wichtigkeit hinsichtlich der Überwachung des Fortschritts eines Patienten wie beispielsweise nach einem zur Entfernung eines Tumors erfolgten chirurgischen Eingriffs sein. Wenn eine Referenzmessung nach einer Operation durchgeführt wurde und danach in weiteren regelmäßigen Zeitabständen durchgeführt wurde, kann jeder Anstieg kennzeichnend für einen Rückfall oder möglicherweise eine Metastase sein. Vorzugsweise stammt die Probe von dem Tumor selbst.
Die Antikörper können gegen entweder ein Peptid von Thymosin β15 oder das gesamte Molekül gerichtet sein. Solch ein Peptid kann zusammen mit einem Trägerprotein wie beispielsweise ein KLH zu einem tierischen System oder, falls es lang genug ist, z.B. schätzungsweise 25 Aminosäurereste, ohne einen Träger präsentiert werden. Bevorzugte Peptide beinhalten zum Thymosin β15 unikale Abschnitte wie beispielsweise Aminosäure 7 bis 12 der SEQ ID NR.: 2, Aminosäure 21 bis 24 von SEQ ID NR.: 2 und Aminosäure 36 bis 45 von SEQ ID NR.: 2.
Durch die oben genannte Technik generierte polyklonale Antikörper können direkt verwendet werden oder geeignete Antikörper herstellende Zellen können von dem Tier isoliert werden und zur Bildung eines Hybridoms durch bekannte Mittel verwendet werden (Kohler und Milstein, Nature 256:795. (1975)). Die Auswahl eines geeigneten Hybridoms ist ebenfalls für einen Fachmann ersichtlich, und der erhaltene Antikörper kann in einem geeigneten Assay zur Identifikation von Thymosin β15 verwendet werden.
Menschliches Thymosin β15 verschlüsselnde DNA und rekombinantes menschliches Thymosin β15 kann gemäß den in der EP 934 412 dargelegten Verfahren hergestellt werden.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Darstellung der vorliegenden Erfindung und sind nicht dazu beabsichtigt, die Erfindung in irgendeiner Art und Weise zu begrenzen.
BEISPIELE
VERFAHREN:
RT-PCR Analyse
Die gesamte RNA jeder einzelnen Zelllinie wurde mit RNase freier DNase I verdaut (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). 5 μg der mit DNase I verdauten gesamten RNA wurden unter Verwendung des cDNA Zyklisierungsreagenzsatz (Cyling Kit) (Invitrogen) revers transkribiert. Das revers transkribierte Gemisch wurde mit einer Spin Säule 300 (Pharmocia, Piscataway, NJ) gereinigt. 10 μl der gereinigten cDNA wurde mit einem Primersatz von Tβ15 vorwärts Primer (forward primer):
5'-TATCAGCTAGTGGCTGCACCCGCG-3' (SEQ ID NR.: 3)
und reverser Primer:
5'-AAATGCTGACCTTTCAGTCAGGGT-3' (SEQ ID NR.: 4), bzw.
Tβ4 vorwärts Primer:
5'-ACTCTCAATTCCACCA TCTCCCAC-3' (SEQ ID NR.: 5),
reverser Primer:
5'-GCCTCTGAGCAGATCGTCTCTCCTTG-3' (SEQ ID NR.: 6);
und Tβ10 vorwärts Primer:
5'-ATAATATCCCTGGGCAAACCGGTG-3' (SEQ ID NR.: 7),
reverser Primer:
5'-GAGTGGAG TACCTGGAGCGCGAGC-3' (SEQ ID NR.: 8) amplifiziert. Die PCR Amplifikation wurde in 50 μl eines PCR Reaktionspuffers (50 mmol/l KCl, 10 mmol/l Tris [pH 8,5], 1,5 mmol/l MgCl₂) mit 1 mmol/l von dNTPs, 50 pmol eines jedes Primers, und 2,5 U Taq-Polymerase (GIBCO BRL), überschichtet mit 50 μl eines Mineralöls (SIGMA), durchgeführt. Das PCT Profil war 94°C, 30 sec; 60°C, 30 sec; und 72°C, 2 min mit 30 Zyklen. Die Kontrolluntersuchungen der RT-PCR wurden unter Verwendung von Aliquoten aus denselben Proben durchgeführt und mit Primern an dem β-Aktingen amplifiziert (Clontech, Palo Alto, CA). Die Amplifikationsprodukte wurden auf 1,4%igen Agarosegelen separiert.
In situ-Hybridisierung
Die Antisense und Sense Tβ15 mRNA Sonden (probes) wurden unter Verwendung von Tβ15 cDNA, die in den eukaryotischen Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen) als Templat eingefügt wurde, und einem Digoxigenin RNA Markierungsreagenzsatz (Kit) (Boehringer Mannheim) hergestellt. Die Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten Sektionen wurden entwachst, rehydratisiert und mit Proteinase K (50 μg/ml) in 100 mmol/l Tris, 50 mmol/l EDTA Puffer (pH8) für 8 min bei 37°C verdaut. Die Hybridisierung wurde in einem automatisierten Gerät (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) für 60 min bei 42°C mit 10 pM Digoxigenin-markierter Ribosonde (riboprobe) in 100 μl eines Hybridisierungspuffers (50% deionisiertes Formamid, 4fach SSC, 10% Dextransulfat, 1% SDS und denatoriertem Herringsperma DNA (400 μg/ml)) je Sektion unter einem Flüssigkeitsschutzüberzug durchgeführt. Die höchste Stringenz der Posthybridisationswaschvorgänge lag bei 45°C für 15 min in 0,1 × SSC. Die gebundene Digoxigenin-markierte Sonde (probe) wurde durch anti-Digoxigeninalkaliphosphatasekonjugate nachgewiesen und durch eine Nitroblau-Tetrazolium- und 5-Bromo-4-chloro-3-indolphosphat-(NBT-BCIP)Farbreaktion angezeigt. Die Sektionen wurden mit Kernschnellrot (nuclear fast red) gegengefärbt.
Zellbeweglichkeit
Die Migration der Transfektanten wurde unter Verwendung eines Multiwellkammerassays wie zuvor beschrieben untersucht (Kunda, et al., J. Cell Biol. 130, 725 (1995)). 48 Well-Chemotaxiekammern wurden mit 8 μm Porositätspolycarbonatfiltern (Nucleopore Corp., Pleasanton, CA) überlagert, welche mit 11,5 μg/ml Fibronectin (Capple Organon Technica, Durham, NC) enthaltenden PBS vorbeschichtet wurden. Die Migration von 5.000 Zellen, die in dem oberen Well platziert wurden, hin zu dem fötalen Rinderserum in dem unteren Well wurde einer vierstündigen Inkubation bei 37°C folgend untersucht. Nach Entfernung der Zellen von der oberen Seite der Filter wurden Zellen, die durch die Filter hindurchliefen und an der unteren Seite anhafteten in Formalin fixiert, mit PBS gewaschen und mit Gill's Triple Strength Hematoxylin (Polysciences, Warrington, PA) gefärbt und unter Lichtmikroskopie gezählt.
Immunohistochemisches Färben
Die menschlichen Prostatakrebssschnitte wurden unter Verwendung eines Immunoperoxidase ABC Reagenzsatzes (Kit) (Vector, Burlingame, CA) untersucht. Knapp beschrieben wurden die 5 μm Gewebesschnitten in Xylol entparaffinisiert, in abgestuften Alkoholen rehydratisiert und für die endogene Peroxidase mit 3% Wasserstoffperoxid (Sigma) in Methanol für 30 min blockiert. Die Schnitte wurden mit normalem Ziegenserum für 30 min behandelt und danach mit einem affinitätsgereinigten anti Tβ15 C-terminalem Peptidantikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur bei einer Verdünnung von 1:100 (v/v) inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit einem biotinyliertem Ziegen-anti-Kaninchen IgG Antikörper für 30 min. Nach Inkubation mit einem vorgefertigten ABC-Komplex für 30 min wurden die spezifisch gebundenen Antikörper durch Verwendung von Peroxidase-Substrat, dem 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB), visualisiert. Die Sektionen wurden mit Gill's Hematoxylin gegengefärbt.
ERGEBNISSE
Klonen von menschlichem Thymosin β15 durch RT-PCR
5 μg der DNase I verdauten gesamten RNA der menschlichen Prostatakrebszellenlinie PC-3 wurden unter Verwendung eines cDNA Zyklisierungsreagenzsatz (Cycling Kit) (Invitrogen) revers transkribiert. Das reverse Transkriptionsgemisch wurde mit einer Spin Säule 300 (Pharmocia, Piscataway, NY) gereinigt. 10 μl der gereinigten cDNA-Reaktion wurden mit den Primern F1 (5'-TATCAGCTAGTGGCTGCACCCGCG-3') (SEQ ID NR.: 8) und RI (5'-AAATGCT GACCTTTCAGTCAGGGT-3') (SEQ ID NR.: 9), die zum Binden (anneal) an die äußeren Enden der Thymosin β15-Sequenz gestaltet werden, amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 50 μl PCR-Reaktionspuffer (50 mmol/l KCl, 10 mmol/l Tris [pH 8,5], 1,5 mmol/l MgCl₂) mit 1 mmol/l Lösung von dNTPs, 50 pmol von jedem Primer und 2,5 U Taq-Polymerase (GIBCO BRL), überschichtet mit 50 μl Mineralöl (Sigma), durchgeführt. Das PCR Profil war 94°C, 30 sec; 60°C, 30 sec; und 72°C, 2 min für 30 Zyklen. Die Kontrolluntersuchungen der RT-PCR wurden unter Verwendung von Aliquoten von denselben Proben durchgeführt und mit Primern zu dem β-Actingen (Clontech, Palo Alto, CA) amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte wurden auf 1,6% Agarosegelen separiert. Das amplifizierte PCR-Produkt wurde an pCR unter Verwendung des TA Klonierungsreagenzsatzes (Cloning Kit) (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert und dann die DNA sequenziert. Die Sequenz des PCR-Produktes der menschlichen Prostatakrebszellen, die durch die Thymosin β15-Primer amplifiziert wurden, sind in 1 (SEQ ID Nr.: 1 und 2) dargelegt.
Expression von Tβ15 mRNA in menschlichem Prostatakrebs
Zur Bestimmung, ob dieses Thymosin-Familienmitglied in menschlichem Prostatakrebs exprimiert werden kann, haben wir die menschliche Prostatakrebszelllinie PC-3 durch RT-PCR mit vorwärts-gerichteten und reversen Primern für Thymosin β15 untersucht. Die PC-3-Zellen zeigten einen niedrigen Spiegel von Thymosin β15-Expression. Die DNA-Sequenz des amplifizierten PCR-Produktes war 100%ig identisch mit der Thymosin β15-Sequenz von Ratten. Wir führten in situ-Hybridisierungsstudien an Proben von Patienten mit verschiedenen Graden des Prostatakrebses unter Verwendung einer Thymosin β15-Sonde (probe) durch. Die Gewebesektionen erlaubten einen direkten Vergleich von normalen und malignen Elementen auf denselben Proben. Die stromalen Elemente innerhalb und um die Tumorzellmassen herum, sowie auch das nichtmaligne prostatische Epithelium benachbart zu dem Tumor zeigte eine kleine Hintergrundhybridisierung mit der Thymosin β15-Antisense Sonde (probe). Im Gegensatz dazu wiesen die spezifischen Tumorzellinseln ein starkes spezifisches Thymosin β15-Signal auf, wenn sie mit Antisense (3A, kleiner Pfeil) sondiert wurden, aber nicht mit einer Sense RNA Sonde (probe) (Daten hier nicht gezeigt). Wenngleich nahezu alle der Tumorzellen in den positiven Inseln Thymosin β15-mRNA exprimierten, waren nicht alle Patientenproben positiv und nicht alle Inseln in einer einzigen Prostata waren positiv (3A, großer Pfeil). Die Mehrheit der negativen Tumorzellen waren in nicht-invasiven in situ-Karzinomen, während hochinvasive Tumore durchwegs positiv waren (3B). Daher ist ein neues β Thymosin, welches erstmalig in metastatischem Prostatakrebszelllinien von Ratten detektiert wurde, in menschlichem Prostatakrebs hochreguliert.
Einfluss von Tβ15 auf die Zellbeweglichkeit
Zur Bestimmung, ob die Thymosin β15-Expression einen Einfluss auf die Zellbeweglichkeit hat, transfizierten wir hochgradig bewegliche AT3.1 Zellen mit einem eukariontischen Expressionsvektor (pcDNA3), der das Thymosin β15-Gen in Antisense Orientierung beinhaltet, angetrieben durch den konstitutiven menschlichen Cytomegalovirus Promoter. Die in selektiven (G418) Medien wachsenden transfizierten Zellen wurden zur Expression von Antisense-Transkripten des Thymo sin β15-Gens durch strangspezifische Amplifikation der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Zhou, et al., Cancer Res. 52, 4280–4285 (1992) bearbeitet. Die Analyse der Zellbeweglichkeit in einem Multiwell-Boyden-Kammerapparat (Boyden, S.V., J. Exp. Med. 115, 453–466 (1962)) unter Verwendung von fötalem Rinderserum als Migrationsstimulanz offenbarte, dass die Zellbeweglichkeit der Transfektanten, die die Expression von Antisense-Transkripten zeigten, relativ zu den direkten Vektorkontrollen (vector-only controls) (4A) wesentlich verringert war. Zwei Antisense transfizierte Klone, die keine Antisense-Transkripte exprimierten, zeigten keinerlei verringerte Rate der Zellbeweglichkeit (Daten sind hier nicht dargestellt). In einem weiteren Experiment zeigten schlecht bewegliche AT2.1 Zellen, die mit Sense-Thymosin β15-Konstrukten transfiziert wurden und die Exprimierung von Thymosin β15 durch Northern-Analyse bestätigten, eine relativ zu deren Vektorkontrollen (4B) signifikant angestiegene stimulierte Zellbeweglichkeit. Die Sense- und die Antisense-Thymosin β15 Transfektanten zeigten beide ähnliche Raten der Zellproliferation relativ zu Kontrollen, die differenzierte Spezifizitäten für verschiedene zelluläre Ereignisse nahe legten (4C). Die Ergebnisse zeigen, dass Thymosin β15, welches in dem hochgradig beweglichen AT3.1 und AT6.1 Dunning Tumorzelllinien hochgeregelt ist, ein positiver Regulator der Zellbeweglichkeit ist, was wiederum ein wichtiger Bestandteil von Krebsmetastasen ist.
Immunohistochemischer Nachweis von Tβ15 im Prostatakarzinom
Ein polyklonaler Antikörper wurde gegen ein die 11 C-terminalen Aminosäuren des Thymosin β15 repräsentierendes Peptid laufen gelassen. Das synthetisierte Peptid wurde mit einem Träger, dem Schlüssellochnapfschneckenhemocyanin (keyhole limpet hemocyanin) (KLH) gekuppelt und in Kaninchen injiziert. Das Antiserum wurde über eine das C-terminale Peptid gekoppelte CNBr-aktivierte Sepharose 4B Säule affini tätsgereinigt. Zur Prüfung der Spezifizität des gereinigten Antikörpers haben wir eine Western-Analyse des GST/Thymosin β Fusionsproteins mit dem affinitätsgereinigten anti-C-terminalem Antikörper durchgeführt. Der gereinigte Antikörper reagierte stark mit dem GST-Thymosin β15-Fusionsprotein, aber reagierte nicht über kreuz mit dem GST-Thymosin β4 und nicht – dessen Spezifizität darstellend – mit GST allein.
Wir verwendeten die affinitätsgereinigten polyklonalen Thymosin β15 Antikörper zur immunohistochemischen Untersuchung des menschlichem Prostatakarzinoms. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Thymosin β15-Immunoanfärbung wurde in den Zytoplasmen der Epithelzellen in neoplastischen Prostatae, aber nicht in normalen Prostatae und nicht in den stromalen Zellen beobachtet (5A, großer Pfeil). Unter den untersuchten malignen Epithelia zeigten die schlecht differenzierten Prostatakarzinome die am meisten extensive und intensive Thymosin β15-Immunoreaktion (5C), gefolgt durch die moderat differenzierten Prostatakarzinomen, in welchen nicht alle Karzinome Thymosin β15 exprimierten, was eine partielle Positivität zeigt (5B). In manchen Fällen zeigte hochgradig prostatisches intraepitheliales Neoplasia (PIN) Thymosin β15-Immunofärbung, aber in einem schwächeren Ausmaß (5A, kleiner Pfeil). In schlecht differenzierten invasiven Karzinomen zeigten in das Grundgewebe (stroma) einfallende einzelne Zellen intensive Färbung (5D). Die Expression von Thymosin β15 korrelierte gut mit dem Gleason Grad des Prostatakarzinoms. TABELLE 1 Thymosin β15 Expression in menschlichem Prostatakarzinom

(BPH: Benign Prostata Hyperplasia; CA-Karzinom)
a. weniger als 10% der Zellen zeigten Positivität
b. heterogenes Färben mit 30–75% der Zellen, die Positivität zeigen
c. homogenes Färben mit 75–100 der Zellen, die Positivität zeigen

Die Erfindung wurde einschließlich ihrer bevorzugten Ausführungsformen detailliert beschrieben. Es ist jedoch erkennbar, dass Fachleute bei Würdigung dieser Offenbarung Modifikationen und Verbesserungen im Rahmen der Erfindung, wie sie in den Ansprüchen dargestellt ist, durchführen können.
Sequenzliste

Claims

Verfahren zur Diagnose von Prostatakrebs bei einem Patienten, umfassend die Messung der Spiegel von Thymosin β15 in einer vom Patienten gewonnenen biologischen Probe, wobei Thymosin β15-Spiegel oberhalb eines Grundlinienspiegels auf Prostatakrebs hinweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die biologische Probe aus Blut, Gewebe, Serum, Stuhl, Urin, Sputum, Zerebrospinalflüssigkeit und Überstand von Zellysat ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Spiegel des mRNA exprimierenden Thymosin β15 gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die mRNA durch Anwendung einer RNA-abhängigen Polymerasekettenreaktion detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Spiegel von Thymosin β15-Protein detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die mRNA mit einer Northern-Blot-Analyse durch Hybridisieren der mRNA aus der biologischen Probe in eine Thymosin β15-Nukleotidprobe detektiert wird.