JP3642431B2 - がんの診断法および予後予測法 - Google Patents
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Description
本発明はがん、特に転移がんの診断方法を提供する。
世界中で報告されているがん患者の増加は非常に懸念されている。現在、特殊な型のがんに対しては少数の治療法しか使用できず、これらの方法でも成功は完全には保証されない。多くの治療法は、急速に増殖しているがん性細胞が治療により死滅する、あるいは、少なくとも、残留細胞が身体系で除去可能になるまで十分に減少することを期待して、急速に増殖している細胞を死滅させることを含む方法を利用している。さらに、これらの治療法の多くは非悪性細胞に対し有害に作用する。その結果、多くの治療法を開始する前に、状態の重症度を把握することが必要である。最も高い効果を得るために、これらの治療法では、がんを早期に発見するだけではなく、がんの重症度を知ることが必要である。
がんはその形によって特性が異なるが、多くのがんに共通の一つの要素は、致死的になるには、転移が必要なことである。転移が起こるまで、腫瘍は、悪性である可能性があるものの、体の一つの領域に閉じ込められている。この結果、不快感および/または疼痛が生じることがあり、また、さらに重篤な問題が引き起こされることさえあるが、がんが局在している場合には、外科的に除去することができ、適切なケアをはらって外科的除去した場合には、それ以上問題が生じることはない。しかし、一度転移が起こると、がん性細胞は身体に浸潤するため、外科的切除で親の腫瘍を除去することはできるが、他の腫瘍には対処できない。その場合には、化学療法またはある種の特別な形の標的療法のみしか成功の見込みがない。
腫瘍転移のプロセスは、局所浸潤および細胞間マトリックスの破壊、血管、リンパ管またはその他の輸送チャンネルへの異物侵入、循環血中での生存、血管から第二部位への遊出、新しい場所での増殖を含む多段階の事象である(Fidler他,Adv.Cancer Res.28,149−250(1978),Liotta他,Cancer Treatment Res.40,223−238(1988),Nicolson,Biochim,Biophy.Acta 948,175−224(1988)およびZetter,N.Eng.J.Med.322,605−612(1990))。転移デポジットの確立に成功するには、腫瘍細胞がこれらのステップを順次遂行できなければならない。転移のプロセスの多くのステップに共通なことは運動性が必要なことである。悪性腫瘍細胞の運動性が高まることが、病気が転移に向かって進行する主な要因である。動物及びヒトの腫瘍で、細胞の運動性の上昇は転移能の上昇と関連づけられた(Hosaka他、Gann 69,273−276(1978)およびHaemmerlin他,Int.J.Cancer 27,603−610(1981))。
腫瘍起因性血管形成は原発腫瘍の拡大と転移腫瘍の広がりの両者に必須であり、血管形成それ自体はECM分解を必要とする(Blood他,Biochim.Biophys.Acta 1032:89−118(1990))。従って、がんは、病態の進行の間に腫瘍細胞とその環境の間の相互作用が重要な役割を果たしている全身疾患である(Fidler I.J.Cancer Metastasis Rev.5:29−49(1986))。
腫瘍の進行に関与するものも含め、悪性腫瘍に関連する遺伝子発現の変化を同定することが、がんを十分理解するためだけではなく、がんに対する新しい合理的な治療法を開発するためにも必要な条件であることは明らかである。
がん性細胞に特徴的な遺伝子は異常に発現されている宿主遺伝子であることが非常に多いという別な問題も生じる。所与のがんに対する特定のタンパク質マーカーはそのがんと関連して高レベルに発現されるが、低レベルではあるが、全身のどこでも発現されることが多い。
前立腺がんは男性で最も一般的ながんであり、高齢の男性ではがん死の二番目に多い死因である(Boring他,Cancer J.Clinicians,7−26(1994))。臨床的に、根治的前立腺摘出術により局在する疾患を有する患者には、治癒するすばらしい可能性が与えられる。残念ながら、転移後に診断が確立された場合には、前立腺がんは生存率を有意に上昇させる有効な治療法のない致死的疾患である。最近の前立腺がんの診断の進歩により、PSAテストを使用してヒトの前立腺がんを早期に発見できるようになった(Catalona他,J.Urol.,151,1283−1290(1994))。残念ながら、このような早期発見に引き続き、どの腫瘍が転移の段階に進行する可能性があるかを決定することについては進歩が認められなかった(Cookson他,J.Urology 154,1070−1073(1995)およびAspinall他,J.Urology 154,622−628(1995))。多くの前立腺がん患者はがんによる有害な作用を受けていないことから、このようなテストの使用にはかなりの議論がある。従って、例えば転移疾患の治療を考慮に入れることのできる、がんの可能性または重症度を早期に発見し、早期に知るための方法が望ましい。
BaoおよびZetterは、米国がん研究学会年会(1995年3月18日から22日)で発表した抄録の中で、転移性の高いラット腫瘍細胞株中で発現されるが、転移性の低い変異株では発現されない新規なmRNAの差次的発現を報告した。cDNAが単離され、これはラットチモシンβ4と68%同一のタンパク質をコード化することが報告された。しかし、そのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は報告されなかった。
発明の概要
本発明者らはここで、ヒトがチモシンβファミリーの新規タンパク質をコード化する遺伝子を有することを発見した。本明細書でチモシンβ15と呼ぶこの新規のタンパク質はチモシンβファミリーのその他のものと同様にG−アクチンと結合し、隔離するが、他のものについて知られていることとは異なり、前立腺がん細胞の運動性を直接制御してもいる。我々は、ヒトのチモシンβ15遺伝子のcDNA(配列番号1)を単離し、そのアミノ酸配列(配列番号2)を推定した。我々は、非精巣細胞におけるチモシンβ15の転写物(mRNA)および発現の上昇が、前立腺がん、肺がん、黒色腫および乳がんなどの多くのがん、特に転移がんの疾病状態と非常に相関することを発見した。従って、非精巣組織で高レベルの転写物または遺伝子産物を発見することは、特定のがんの診断だけではなく、予後の予測に使用できる。
本発明の第一の態様では、患者から得た生物検体中のチモシンβ15濃度を測定することにより、患者のがん、特に、前立腺がん、肺がん、黒色腫および乳がんを診断する方法が提供される。試料中のチモシンβ15濃度が基準値より大きい場合には、がんであることを示す。生物検体には、例えば、血液、組織、血清、便、尿、喀痰、脳脊髄液および細胞溶解液の上清が含まれる。好ましくは組織検体を使用する。基準値および比較値は本発明の開示に基づく分析の標準様式により決定する。
別の態様では、本発明は、検査すべき患者から得た腫瘍試料中のチモシンβ15濃度を測定することにより、がん、特に前立腺がん、肺がん、黒色腫および乳がんを有する個体の予後を予測する方法を提供する。腫瘍試料中のチモシンβ15の発現がその特定の組織に対する基準値より高い場合には、腫瘍転移のリスクが大きいことを示す。
さらに別の態様では、本発明は、腫瘍中のチモシンβ15の発現レベルを測定することによりその腫瘍の転移能または転移可能性を測定する方法を提供する。腫瘍中のチモシンβ15の発現がその特定の組織に対する基準値より高い場合には、転移能が高いことを示す。
さらに別の態様では、対象患者の腫瘍内のチモシンβ15発現レベルの変化を経時的に比較することにより、状態の変化をモニターすることができる。
本発明の方法では、チモシンβ15をコード化する転写物(mRNA)を測定して直接的または間接的にタンパク質を測定することにより、チモシンβ15の濃度を確認できる。mRNA濃度は、例えば、RNA依存性ポリメラーゼ連鎖反応、例えば、逆転写酵素PCRまたはノーザンブロット分析を使用して測定できる。
基準値は、疾患を持たない個体の試料中のチモシンβ15濃度を測定することにより容易に決定できる。
本発明はまた、ヒトチモシンβ15と選択的に結合する抗体または抗体断片を使用してヒトチモシンβ15濃度を測定する方法も提供する。この方法は、
a.試料又は試料調製物をヒトチモシンβ15と選択的に結合する抗体または抗体断片と接触させるステップと、
b.抗体または抗体断片が試料と結合しているかを検出し、それにより、存在するヒトチモシンβ15濃度を測定し、陰性の結果は陽性の結果より予後が良いことを示すステップと、
を含む。
「固有断片」とは、チモシンβ15(配列番号2)中には存在するが、チモシンファミリーのその他のものには存在しない配列(ヌクレオチドまたはアミノ酸残基)を含む、本発明のヌクレオチド配列またはポリペプチドの部分を意味する。これは、ストリンジェントな条件下でその断片のハイブリッド形成プロフィールが、チモシンファミリーのその他のものとはハイブリッドを形成しないものであるときに、決定できる。このような断片は第2図から確認できる。好ましい固有断片の組み合わせは、配列番号2のアミノ酸7から12、配列番号2のアミノ酸21から24および配列番号2のアミノ酸36から45またはこれらをコード化するポリヌクレオチドを含有するものである。好ましくは、固有ヌクレオチド配列断片は10〜60ヌクレオチド、より好ましくは20〜50ヌクレオチド、最も好ましくは30〜50ヌクレオチドの長さである。好ましくは、固有ポリペプチド配列断片は、4〜20アミノ酸、より好ましくは6〜15アミノ酸、最も好ましくは6〜10アミノ酸の長さである。
図面の説明
第1図は、Tβ15cDNAのヌクレオチド配列(配列番号1)および予想アミノ酸配列である(配列番号2)(一文字コード)。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列番号は配列の右端に示す。翻訳開始コドンATGには下線を付し、終結コドンTAAにはアスタリスクを付した。推定されるアクチン結合領域には下線を付した。これらの配列データは、受入番号U25684でGenBankから入手できる。
第2図は、推定されるTβ15タンパク質配列およびその他のβチモシンアイソフォームの一部の配列を示す。アミノ酸同一領域は黒枠中に白字で示す。枠で囲っていない黒字は非同一領域に対応する。点は配列の最適化のために配列に導入された間隙に対応する。
第3Aおよび第3B図は、前立腺線がん患者での、Tβ15についてアンチセンス側のリボプローブによるin situハイブリッド形成を示す。第3A図は、腫瘍における差次的発現を示す。小さな矢印は染色陽性を示す。大きな矢印は染色陰性を示す。第3B図は、低分化型浸潤性前立腺がんでは、間質内に浸潤している単細胞が強く染色されることを示している(矢印)。
第4A図、第4B図および第4C図は、対照でトランスフェクトしたDunning R−3327変異体およびTβ15でトランスフェクトしたDunning R−3327変異体の血清刺激による移動およびその増殖速度を示している。第4A図、対照ベクターでトランスフェクトした(○、▽)AT3.1細胞クローンおよびTβ15のアンチセンス側でトランスフェクトした(●、▼)AT3.1細胞クローン。第4B図、対照ベクターでトランスフェクトした(○、▽)AT2.1細胞クローンおよびTβ15のセンス側でトランスフェクトした(●、▼)AT2.1細胞クローン。データは平均±SE(n=4)で表す。第4C図、対照でトランスフェクトしたDunning R−3327クローンおよびTβ15の(センスまたはアンチセンス側)でトランスフェクトしたDunning R−3327クローンの増殖曲線。12ウェルプレートで、対照ベクターでトランスフェクトしたAT2.1(○)、Tβ15センスでトランスフェクトしたAT2.1(●)、対照ベクターでトランスフェクトしたAT3.1(▽)およびTβ15のアンチセンス側でトランスフェクトしたAT3.1(▼)由来の細胞を10%FBSおよび250nMのデキサメサゾンを含有するRPMI1640中に104細胞/ウェルの初期濃度で植え付けた。所与の時間に、細胞を採取し、計測した。各点は平均±SE(n=3)を表す。
第5A図、第5B図、第5C図および第5D図は、親和性により精製したチモシンβ15に対するポリクローナル抗体を使用したヒト前立腺がん組織の免疫組織化学染色を示す。A.非悪性前立腺上皮(大きな矢印)および高度前立腺上皮内腫瘍(PIN)(小さな矢印)。B.不均一な免疫染色を示す中分化型前立腺がん(小さな矢印:陽性;大きな矢印:陰性)。C.低分化型前立腺がん。D.強い染色を示す間質に浸潤している単細胞。
発明の詳細な説明
チモシンβファミリーはG−アクチンに結合し、これを隔離することが示されているが、細胞の移動性を変化させることはこれまで示されていない。しかし、我々の研究により、チモシンβ15が前立腺がん細胞の細胞移動性を直接制御することが明らかとなった。転移性の低い前立腺がん細胞株または非転移性細胞株と比べ、転移性の高い細胞株で、チモシンβ15の発現が増加する方向に制御されることを発見した。さらに、チモシンβ15はヒトの前立腺がん検体では発現されたが、正常なヒトの前立腺では発現されなかった。理論と結びつけることを望んでいないが、このことは、β15が転移的トランスフォーメーションの過程に関与していることを示している。
従って、非精巣組織中の正常なまたは変異した転写物(mRNA)または遺伝子産物の濃度を測定し、比較することにより、特定のがんを診断し、その予後を予測することができる。例えば、濃度が上昇すると、転移活性が高くなる傾向があることを示している。さらに、特定の腫瘍増殖を経時的に観察し、レベルの変化を比較することにより、転移活性の変化を評価することができる。β15の濃度を使用して、特定の腫瘍の重症度を決定することもできる。我々は、β15の発現は腫瘍の重症度と相関することを発見した。例えば、前立腺細胞中でのβ15の発現は前立腺がんのグリーソンのグレードとよく相関する。
本発明は、患者から得た生物検体中のチモシンβ15濃度を測定することにより、その患者のがん、特に前立腺がん、肺がん、黒色腫および乳がんを診断する方法を提供する。試料中のチモシンβ15濃度が基準値より高い場合には、がんであることが示される。基準値は、疾患を持たない個体からの試料中のチモシンβ15濃度を測定することにより、容易に決定できる。
生物検体には、例えば、血液、組織、血清、便、尿、喀痰、脳脊髄液および細胞溶解液の上清が含まれる。好ましくは組織検体を使用する。基準値および比較値は本発明の開示に基づく分析の標準様式により決定する。
本発明は、検査すべき患者から得た腫瘍試料中のチモシンβ15濃度を測定することにより、がん、特に前立腺がん、肺がん、黒色腫および乳がんを有する対象での予後を予測する方法も提供する。腫瘍試料中のチモシンβ15の発現がその特定の組織に対する基準値より高い場合には、腫瘍転移のリスクが大きいことを示す。この情報は、医師が最も効果的な治療コースを決定するのに使用できる。
対象患者の腫瘍内のチモシンβ15発現レベルの変化を経時的に比較することにより、本発明の方法を使用して、患者の状態の変化をモニターすることができる。
本発明はまた、腫瘍中のチモシンβ15の発現レベルを測定することによりその腫瘍の転移能を決定する方法を提供する。腫瘍中のチモシンβ15の発現がその特定の組織に対する基準値より高い場合には、転移能が高いことを示す。
RNA、DNA、タンパク質およびペプチドを検出するための当業界でよく知られている標準検出手法を利用して、容易にチモシンβ15またはその転写物を検出し、がん、特に転移がんを診断し、あるいは原発腫瘍が特定の転移相に達しているかいないかを確認することができる。
このような手法には、ヌクレオチドプローブを使用する方法が含まれ、例えば、抗体またはその同等物によるタンパク質の検出を含んでいてもよい。好ましくは、ヌクレオチドプローブは、配列番号1で示される配列と、その他の天然のチモシン配列よりも、より強力にハイブリッド形成するものなら何でもよい。プローブの種類には、cDNA、リボプローブ、合成オリゴヌクレオチドおよびゲノムプローブが含まれる。使用するプローブの種類は一般に、特定の状況で支配され、例えば、in situハイブリッド形成ではリボプローブが、ノーザンブロット法ではcDNAが使用される。最も好ましいプローブは、配列番号1のDNAに対応するものである。好ましくは、プローブはチモシンβ15コード領域、すなわち、配列番号1のヌクレオチド98〜232に対するものである。最も好ましくは、プローブはチモシンβ15に固有のヌクレオチド領域、例えば、配列番号1のヌクレオチド113〜133,158〜169または200〜232のヌクレオチド領域に対するものである。チモシンβ15をコード化する遺伝子自体を検出することは、発現の増加に関連する突然変異のスクリーニングに有用である。発現のレベル、転写物またはその他の発現産物の濃度とより容易に関連する標的を検出するその他の形のアッセイも一般に有用である。プローブはチモシンβ15mRNA転写物を識別して認識するのに必要な長さまで短くてよく、例えば15塩基であってよい。
当業者は、配列番号2のアミノ酸配列からプローブをリバースエンジニアリングすることもできる。しかし、所与のリバースエンジニアリング配列がすべて良好にハイブリッド形成するとは限らず、あるいは、遺伝コードの縮重のために、同じペプチドからリバースエンジニアリングにより得られた任意の所与の相補配列とはまったくハイブリッド形成しないと考えられることから、このようなプローブの使用は限定される可能性がある。これは当業者が計算に入れている共通した要素であり、任意の所与の配列の縮重は任意の一つの配列に対して多数のプローブを生成してしまうほど広範であることが多い。
プローブの標識の形は適当なものであれば何でもよく、放射性同位元素、例えば32Pおよび35Sを使用できる。プローブが化学的に合成されたものであっても、生物学的に合成されたものであっても、好適に標識された塩基を使用して、放射性同位元素により標識を実施できる。他の型の標識には、ELISAの特徴であるような酵素または抗体標識も含まれる。
RNA転写物は、ノーザンブロット法で検出することができ、例えば、RNAの調製物を変性アガロースゲルにかけ、活性化セルロース、ニトロセルロースまたはガラス膜もしくはナイロン膜などの好適な支持体に移す。次いで、放射線標識したcDNAまたはRNAをこの調製物とハイブリッド形成させ、洗い、オートラジオグラフィで分析する。
In situハイブリッド形成による可視化を使用することもでき、放射活性標識したアンチセンスcRNAプローブを生検試料の薄切片とハイブリッド形成させ、洗浄し、RNエースで切断し、オートラジオグラフィ用感受性エマルジョンに曝露する。試料をヘマトキシロンで染色して、試料の組織学的組成を示すことができ、好適な光フィルタを使用する暗視野イメージングにより発色されたエマルジョンが示される。ジゴキシゲニンなどの非放射活性標識も使用できる。
免疫組織化学を使用して生検試料中のヒトチモシンβ15の発現を検出することができる。好適な抗体を、例えば、細胞の薄層と接触させ、洗浄し、次いで、第二の標識抗体と接触させる。標識は、ペルオキシダーゼ、アビジンなどの酵素で実施しても、放射性標識で実施してもよい。色素標識は顕微鏡下で検出できるため、一般に好ましい。
例えばELISAまたはRIAなどのイムノアッセイによりタンパク質を検出することが一般に好ましく、この方法は非常に迅速に実施できる。従って、チモシンβ15の検出に抗体または抗体同等物を使用することが一般に好ましい。
(例えば、過酸化水素など)酵素的プロセスの産物がそれ自体で検出可能で、特徴的な場合には、物質を標識する必要はない。しかし、物質を標識する必要がある場合には、標識には、酵素標識、放射性同位元素による標識、抗体標識、蛍光マーカ標識または当業者には容易に明らかである任意のその他の好適な形も包含される。
抗体を後述のように調製し、任意の好適な方法で使用して、チモシンβ14の発現を検出することができる。抗体をベースとする手法には、ELISA(酵素結合イムノソルベントアッセイ)およびRIA(ラジオイムノアッセイ)が含まれる。このようなイムノアッセイには、任意の慣用の手順を使用できる。この手順は次のように実施するのが好適である。チモシンβ15の標準物質を、125Iもしくは35Sなどの放射性同位元素またはホースラディッシュペルオキシダーゼもしくはアルカリ性ホスファターゼなどの検定可能な酵素で標識し、非標識試料と共に、対応の抗体と接触させ、そこで、第二抗体を使用して、第一抗体と結合させ、放射活性または固定酵素を検定する(競合アッセイ)か、試料中のチモシンβ15を対応の固定した抗体と反応させ、放射性同位元素または酵素で標識した抗チモシンβ15抗体をその系と反応させ、放射活性または酵素を検定する(ELISAサンドイッチアッセイ)。他の従来法も好適であれば使用できる。
上記手法は本質的に「一段階」または「二段階」検定として実施できる。「一段階」検定は、抗原を固定した抗体と接触させ、洗浄することなく、この混合物を標識した抗体と接触させることを含む。「二段階」検定は、混合物を標識した抗体と接触させる前に洗浄することを含む。他の従来法も好適であれば使用できる。
チモシンβ15および/または抗体の酵素標識および放射性標識は慣用の手段で実施できる。このような手段は一般に、特に酵素活性に有害な影響を与えないように、グルタルアルデヒドなどにより、酵素と当該の抗原または抗体とを共有結合させることが含まれる。これは、酵素がその基質と相互作用できる状態を維持していなければならないことを意味するが、アッセイを実施できる活性が残っている場合には、必ずしも酵素全部が活性である必要はない。実際、酵素結合手法の中には非特異的で(例えばホルムアルデヒドを使用するもの)、活性酵素の割合しか得られないものもある。
通常、アッセイ系の一つの成分を支持体上に固定することにより、その系のその他の成分をその成分と接触させて、骨の折れる、時間の懸かる作業を行うことなく容易に除去できるのが望ましい。第二の相を第一の相と離れたところに固定することができるが、通常、一相で十分である。
支持体上に酵素自体を固定することができるが、固相酵素が必要な場合は、一般に、抗体に結合させ、この抗体を支持体に固定することにより実施するのが一般に最良であり、そのためのモデルおよびシステムは当業界でよく知られている。単純なポリエチレンが好適な支持体となりうる。
標識に使用できる酵素は特に限定されないが、例えば、オキシダーゼ群から選択できる。これらの酵素はその基質と反応することにより過酸化水素の生成を触媒する。グルコースオキシダーゼは、安定性がよく、入手し易く、安価であり、またその基質(グルコース)が容易に入手できることからよく使われる。オキシダーゼの活性は、当業界でよく知られた制御された条件下で酵素標識抗体と基質との反応後に形成される過酸化水素の濃度を測定することにより検定できる。
好みに応じて、チモシンβ15の検出に他の手法を使用することもできる。このような手法の一つはウェスタンブロット(Towbin他,Proc.Nat.Acad.Sci.76:4350(1979))であり、この方法では、好適に処理した試料をSDS−PAGEゲルにかけてから、ニトロセルロースフィルタなどの固体支持体に移す。次いで、(非標識)抗チモシンβ15抗体をこの支持体と接触させ、標識したプロテインAまたは抗免疫グロブリン(好適な標識には125I、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼを含む)などの二次免疫学試薬で検定する。
診断用の試料はいくつの材料から得てもよい。間質またはサイトソルなどの腫瘍から直接得た試料を使用して、腫瘍の転移能を測定することができる。血液または尿などのその他の生物検体から試料を得ることも適切である。このような診断は術後または腫瘍除去後などに、患者の進行をモニターする際に特に重要である。術後に基準値を得、その後定期的に測定すると、その値の上昇は、再発またはおそらく転移を示すであろう。試料は腫瘍自体から採取するのが好ましい。
チモシンβ15のペプチドまたはチモシンβ15の分子全体に対して抗体を産生することができる。このようなペプチドは、動物の系にはKLHなどの担体タンパク質と共に提示することができ、あるいは、ペプチドが十分長い、すなわちアミノ酸残基を25個有する場合には、担体なしに提示することができる。好ましいペプチドは、配列番号2のアミノ酸7〜12、配列番号2のアミノ酸21〜24および配列番号2のアミノ酸36〜45などのチモシンβ15に固有の領域を含む。
上記手法で生成したポリクローナル抗体は直接使用することができ、あるいは、知られている方法で、好適な抗体産生細胞を動物から単離して、ハイブリドーマの形成に使用することもできる(KohlerおよびMilestein,Nature 256:795(1975))。適切なハイブリドーマの選択も当業者には明らかであり、得られた抗体を適切な検定に使用して、チモシンβ15を同定することができる。
本発明はヒトチモシンβ15濃度を測定する便利なキットを提供する。このキットは、ヒトチモシンβ15と選択的に結合する抗体または抗体断片またはヒトチモシンβ15をコード化するcDNAを合成させる一組のDNAオリゴヌクレオチドプライマーを含む。好ましくは、プライマーは少なくとも10個のヌクレオチドを含んでおり、ストリンジェントな条件下で配列番号1に示すヌクレオチド配列を有するDNA断片とハイブリッドを形成する。本明細書で使用する「ストリンジェントな条件」とは、配列間の同一性が少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%である場合にのみ、ハイブリッド形成が起こることを意味している。
ヒトチモシンβ15および組換えヒトチモシンβ15をコード化するDNAは、同時係属出願のU.S.S.N.08/664,856号に記載の方法で製造でき、この開示は本明細書に含むものとする。
本明細書で引用した参考文献はすべて参考として本明細書に組み込むものとする。
以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、いかなる意味でも本発明を限定するものではない。
実施例
方法
RT−PCR分析
各細胞系からの全RNAを、RN−アーゼを含まないDNアーゼI(GIBCO BRL、Gaithersburg、メリーランド州)で消化した。DNアーゼIで消化された全RNA5μgを、cDNA Cyling Kit(Invitrogen)を使用して逆転写した。逆転写混合物を、Spin Column 300(Pharmocia、Piscataway、ニュージャージー州)で精製した。精製したcDNA10μlを、Tβ15の前進プライマー5'−TATCAGCTAGTGGCTGCACCCGCG−3'(SEQ ID NO:3)およびその復帰プライマー5'−AAATGCTGACCTTTCAGTCAGGGT−3'(SEQ ID NO:4)と、Tβ4の前進プライマー5'−ACTCTCAATTCCACCATCTCCCAC−3'(SEQ ID NO:5)およびその復帰プライマー5'−GCCTCTGAGCAGATCGTCTCTCCTTG−3'(SEQ ID NO:6)と、Tβ10の前進プライマー5'−ATAATATCCCTGGGCAAACCGGTG−3'(SEQ ID NO:7)およびその復帰プライマー5'−GAGTGGAGTACCTGGAGCGCGAGC−3'(SEQ ID NO:8)の各1対のプライマーでそれぞれ増幅した。PCR増幅は、dNTP1mMと各プライマー50ピコモルとTaqポリメラーゼ2.5U(GIBCO BRL)を含有する、PCR反応緩衝液(50mMのKCl、10mMのトリス[pH8.5]、1.5mMのMgCl2)50μl中で行われ、その重層として鉱油(Sigma)50μlが用いられた。PCRプロフィルは、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で2分のサイクルが30回であった。同一試料の一部を使用してRT−PCRの対照調査を実施し、プライマーで増幅してβ−アクチン遺伝子(Clontech,Palo Alto、カリフォルニア州)を得た。増幅生成物を、1.4%のアガロースゲル上に分離した。
in situハイブリッド形成法
鋳型としてTβ15cDNAを挿入した真核性発現ベクターpcDNA3(Invitrogen)と、ジゴキシゲニンRNA標識キット(Boehringer Mannheim)を使用して、アンチセンスおよびセンスTβ15mRNAプローブを調製した。ホルマリンで固定したパラフィン包理切片を脱ろうし、再水和させ、プロテイナーゼK(50μg/ml)を溶かした100mMのトリスと50mMのEDTA緩衝液(pH8)を用いて37℃で8分間、消化させた。次に自動化機器(Ventana Medical Systems、Tuscon、アリゾナ州)を用い、42℃で60分間、ハイブリッド形成を行った。この形成は、1切片につき、ジゴキシゲニン標識したリボプローブ10ピコモルをハイブリッド形成緩衝液(50%脱イオン化ホルムアミド、4倍SSC、10%デキストラン硫酸、1%SDS、および変性へリング精子DNA(400μg/ml))100μlに溶かしたものを使用し、液体カバーガラス下で行った。ハイブリッド形成後の洗液が最もストリンジェントなものは、0.1倍SSC中で45℃、15分間の場合であった。結合ジゴキシゲニン標識プローブをアンチジゴキシゲニンアルカリホスファターゼ抱合体で検出し、ニトロブルーテトラゾリウムとリン酸5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル(NBT−BCIP)の呈色反応によって視認できるようにした。これら切片を、核ファーストレッドで対比染色した。
細胞運動
トランスフェクタントの移動について、前述の多層チャンバ分析法(Kunda他、J.Cell Biol,130,725(1995年))を用いて調査した。48層走化性チャンバに、8μmの多孔性ポリカーボネートフィルタ(Nucleopore Corp.、Pleasanton、カリフォルニア州)をかぶせた。このフィルタは、11.5μg/mlのフィブロネクチン(Capple Organon Technica、Durham、ノースカロライナ州)を含有するPBSで、事前に被覆されたものである。37℃で4時間恒温放置した後、上層に配置された5000個の細胞について、下層のウシ胎児血清への移動を分析した。フィルタの上面から細胞を除去した後、そのフィルタを通過して下面に付着している細胞をホルマリンに固定し、PBSで洗浄し、Gillの三重強度ヘマトキシリン(Polysciences、Warrington、ペンシルバニア州)で染色し、光学顕微鏡法によりカウントした。
免疫組織化学的染色
ヒト前立腺ガン切片について、免疫ペルオキシダーゼABCキット(Vector、Burlingame、カリフォルニア州)を使用して調査した。簡単に、キシレン中で5μmの組織片からパラフィンを除去し、グレード付けされたアルコールで再水和し、3%過酸化水素(Sigma)を溶かしたメタノールを用いて内在ペルオキシダーゼを30分間ブロックした。これら切片を正常なヤギ血清で30分間処理し、次いで1:100(体積/体積)に希釈された、親和精製したアンチTβ−15C末端ペプチド抗体を用いて室温で2時間培養し、その後、ビオチニル化したヤギのアンチウサギIgG抗体で30分間培養した。事前に形成されたABC複合体で30分間培養した後、ペルオキシダーゼ基質、3,3'−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(DAB)を使用して、特に結合抗体を視認できるようにした。これらの切片を、Gillのヘマトキシリンで対比染色した。
結果
RT−PCRによるヒトチモシンβ15のクローン化
DNアーゼIで消化したヒト前立腺ガン腫細胞系PC−3の全RNA5μgを、cDNA Cycling Kit(Invitrogen)を使用して逆転写した。逆転写混合物をSpin Column 300(Pharmocia、Piscataway、ニューヨーク)で精製した。精製されたcDNA反応10μlを、チモシンβ15配列の外端をアニールするために設計されたプライマーF1(5'−TATCAGCTAGTGGCTGCACCCGCG−3')(SEQ ID NO:8)およびRI(5'−AAATGCTGACCTTTCAGTCAGGGT−3')(SEQ ID NO:9)で増幅した。PCR増幅は、dNTP1mMと各プライマー50ピコモルとTaqポリメラーゼ(GIBCO BRL)2.5Uを含有する、PCR反応緩衝液(50mMのKCl、10mMのトリス[pH8.5]、1.5mMのMgCl2)50μl中で行われ、この緩衝液にには鉱油(Sigma)50μlの重層が設けられた。PCRプロフィルは、94℃で30秒、60℃で30秒、および72℃で2分のサイクルが30回であった。同一試料の一部を使用してRT−PCRの対照調査を実施し、プライマーで増幅してβ−アクチン遺伝子(Clontech、Palo Alto、カリフォルニア州)を得た。増幅生成物を、1.6%のアガロースゲル上に分離した。増幅したPCR生成物を、TAクローニングキット(Invitrogen、San Diego、カリフォルニア州)を使用して、pCRと結合させ、次いでDNA配列化した。チモシンβ15プライマーで増幅させたヒト前立腺ガン腫細胞のPCR生成物の配列を、第1図に記載する(SEQ ID NO:1および2)。
ヒト前立腺ガンにおけるTβ15mRNAの発現
このチモシンファミリーの一部がヒト前立腺ガンで発現するか否かを判定するため、本出願人は、チモシンβ15の前進プライマーおよび復帰プライマーを有するRT−PCRを用い、ヒト前立腺ガン腫細胞系PC−3で試験を行った。PC−3細胞では、チモシンβ15の低レベルの発現が見られた。増幅したPCR生成物のDNA配列は、ラットチモシンβ15配列と100%同一であった。本出願人はチモシンβ15プローブを使用して、前立腺ガン腫の様々な段階にある患者からの試料に関し、in situハイブリッド形成調査を実施した。組織片によって、同一試料での正常要素と悪性要素の直接対比が可能になった。腫瘍細胞集団内およびその周囲の基質要素、ならびに腫瘍に隣接する非悪性前立腺上皮では、チモシンβ15アンチセンスプローブによるバックグラウンドのハイブリッド形成がほとんど見られなかった。これとは対照的に、特定の腫瘍細胞の島では、アンチセンスでプローブされた場合に強力な特定のチモシンβ15シグナルが顕れた(第3A図、小さい矢印)が、センスRNAプローブの場合は顕れなかった(データは示さない)。陽性の島ではほとんどすべての腫瘍細胞でチモシンβ15mRNAが発現したが、患者標本のすべてが陽性というわけではなく、また、一前立腺でのすべての島が陽性というわけではない(第3A図、大きい矢印)。大多数の負の腫瘍細胞は非侵襲性のin situガン腫であったが、侵襲性の高い腫瘍は一貫して陽性であった(第3B図)。従って、始めに転移性ラット前立腺ガン腫細胞系で検出された新規なβチモシンは、ヒト前立腺ガンにアップレギュレートされる。
Tβ15の細胞移動に対する効果
チモシンβ15の発現が細胞移動に効果を及ぼすか否かを判定するため、本出願人は、移動性の高いAT3.1細胞に真核性発現ベクター(pcDNA3)を移入した。この発現ベクターは、構成的ヒトサイトメガロウィスルスプロモータによって移動する、アンチセンス配向のチモシンβ15遺伝子を含有するものである。選択的(G418)媒体中で成長する移入済みの細胞について、ストランド特定ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅(Zhou他、Cancer Res.52,4280−4285(1992年))による、チモシンβ15遺伝子のアンチセンス転写の発現に関する試験を行った。刺激薬としてウシ胎児血清を使用する、多層Boydenチャンバ装置(Boyden,S.V.,J.Exp.Med.115.453−466(1962))内での細胞移動に関する分析によれば、アンチセンス転写の発現を示すトランスファクタントの移動は、ベクターのみによる対照と比較して著しく減少することが明らかになった(第4A図)。アンチセンス転写を発現しない二種類のアンチセンス移入済みクローンでは、細胞移動速度を何ら減少させることができなかった(データは示さない)。その他の実験では、センスチモシンβ15構成物が移入され、かつNorthern分析によってチモシンβ15の発現が確認された低移動性AT2.1細胞では、そのベクター対照と比較して、刺激による移動性が著しく増加することが示された(第4B図)。対照では、細胞での異なる事象に対し異なる特異性が示されるのに対し、センスおよびアンチセンスチモシンβ15トランスフェクタントでは、その細胞増殖速度には類似が見られた(第4C図)。この結果によれば、高移動性AT3.1およびAT6.1Dunning腫瘍細胞系でアップレギュレートされたチモシンβ15は、ガン転移の重要な成分である、細胞移動の正の調節因子であることが実証される。
前立腺ガン腫におけるTβ15の免疫組織化学的検出
ポリクローン性抗体は、チモシンβ15の11C末端アミノ酸を示すペプチドに対して作成した。担体であるキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)と合成ペプチドを結合させ、これをウサギに注射した。抗血清を、C末端ペプチドと結合したCNBr活性化セファロース4Bカラムで親和精製した。精製した抗体の特異性を試験するため、本出願人は親和精製したアンチC末端抗体で、GST/チモシンβ融合タンパク質のWestern分析を行った。精製された抗体は、GST−チモシンβ15融合タンパク質と強く反応したが、GST−チモシンβ4とは交差反応せず、GSTのみではその特異性が示されなかった。
本出願人は、ヒト前立腺ガン腫の免疫組織化学的研究のため、親和精製されたポリクローン性チモシンβ15抗体を使用した。その結果を以下の表1に要約する。チモシンβ15免疫染色は、腫瘍性前立腺の上皮細胞の細胞質中で観察されたが、正常な前立腺および基質細胞には見られなかった(第5A図、大きい矢印)。調査した悪性上皮の中では、分化の少ない前立腺ガン腫が最も広範で強力なチモシンβ15免疫反応を示し(第5C図)、次にその反応を示すのは適度に分化した前立腺ガン腫であって、この場合、すべてのガン腫が部分陽性を示すチモシンβ15を発現するわけではない(第5B図)。同様に高いグレードの前立腺上皮内腫瘍(PIN)では、チモシンβ15の免疫染色が見られる場合があるが、その範囲はより狭いものであった(第5A図、小さい矢印)。分化の少ない侵襲性ガン腫では、支質に侵入する単一の細胞が強い染色を示した(第5D図)。チモシンβ15の発現は、前立腺ガン腫のGleasonグレードを全く相関するものである。
本発明は、その好ましい実施形態を含んだ詳細を記載する。しかしその当業者ならば、この開示の考察に基づき、請求の範囲に述べられている本発明の精神および範囲から逸脱することなく、修正および改良を加えることが可能であることを理解されよう。
配列表
(1)一般情報
(i)出願人:BRUCE R.ZETTERおよびLEREBAO
(ii)発明の名称:がんの診断法および予後予想法
(iii)配列の数:8
(iv)連絡先:
(A)宛先:DIKE.BRONSTEIN.ROBERTS & CUSHMAN
(B)通り:130 WATER STREET
(C)市:ボストン
(D)州:マサチューセッツ州
(E)国:米国
(F)郵便番号:02019
(V)コンピュータ可読フォーム:
(A)媒体:ディスケット
(B)コンピュータ:IBM互換性
(C)OS:DOS
(D)ソフトウェア:FastSEQ バーション1.5
(vi)現出願データ:
(A)出願番号:
(B)出願日:1996年6月17日
(C)分類:
(vii)先願データ:
(A)出願番号:
(B)出願日:
(viii)弁理士/事務所情報:
(A)氏名:DAVID.RESNICK S
(B)登録番号:34.235
(C)参照番号:46403
(ix)通信情報:
(A)電話:617−523−3400
(B)ファックス:617−523−6440
(C)テレックス:200291STRE
(2)配列番号:1
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:412
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル配列:No
(iv)アンチセンス:No
(v)フラグメント型:
(vi)起源:
(ix)特徴:
(A)特徴を表す記号:コーディング配列
(B)存在位置:98...232
(D)他の情報:エキソン1
(xi)配列:配列番号1
(2)配列番号:2
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:45
(B)配列の型:アミノ酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(iii)ハイポセティカル配列:No
(iv)アンチセンス:No
(v)フラグメント型:中間フラグメント
(vi)起源:
(xi)配列:配列番号2
(2)配列番号:3
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:24
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル配列:No
(iv)アンチセンス:No
(v)フラグメント型:
(vi)起源:
(xi)配列:配列番号3
(2)配列番号:4
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:24
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル配列:No
(iv)アンチセンス:No
(v)フラグメント型:
(vi)起源:
(xi)配列:配列番号4
(2)配列番号:5
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:24
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル配列:No
(iv)アンチセンス:No
(v)フラグメント型:
(vi)起源:
(xi)配列:配列番号5
(2)配列番号:6
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:26
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル配列:No
(iv)アンチセンス:No
(v)フラグメント型:
(vi)起源:
(xi)配列:配列番号6
(2)配列番号:7
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:24
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル配列:No
(iv)アンチセンス:No
(v)フラグメント型:
(vi)起源:
(xi)配列:配列番号7
(2)配列番号:8
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:24
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(iii)ハイポセティカル配列:No
(iv)アンチセンス:No
(v)フラグメント型:
(vi)起源:
(xi)配列:配列番号8
Claims (5)
- a.試料又は試料調製物をヒトチモシンβ15と選択的に結合する抗体または抗体断片と接触させるステップと、
b.前記抗体または前記抗体断片が前記試料と結合しているかを検出し、それにより、存在するヒトチモシンβ15濃度を測定するステップと
を含むヒトチモシンβ15濃度を測定する方法であって、ヒトチモシンβ15濃度が個体の状態の予後を示し、陰性の結果は陽性の結果より予後が良いことを示す方法。 - 前記抗体または前記抗体断片を検出可能に標識する請求の範囲第1項に記載の方法。
- 一組のDNAオリゴヌクレオチドプライマーを含むヒトチモシンβ15濃度を測定するためのキットであって、前記一組のDNAオリゴヌクレオチドプライマーによりヒトチモシンβ15をコード化するcDNA合成を測定できるキット。
- 前記プライマーが少なくとも10個のヌクレオチドを含み、ストリンジェントな条件下で配列番号1に記載のヌクレオチド配列のDNA断片とハイブリッドを形成する請求の範囲第3項に記載のキット。
- ヒトチモシンβ15に選択的に結合する抗体または抗体断片を含むヒトチモシンβ15濃度を測定するキット。
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