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Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung stellt Methoden zur
Diagnose von Krebs, insbesondere von metastatischem Krebs, bereit.
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Die gewachsene Anzahl von Krebsfällen, die
rund um die Welt berichtet wurden, ist von großer Wichtigkeit. Derzeit sind
nur einige wenige Behandlungen für
spezielle Krebsarten verfügbar,
und diese liefern keine absolute Garantie auf Erfolg. Die meisten
Behandlungen stützen
sich auf eine Vorgehensweise, die das Auslöschen schnell wachsender Zellen
in der Hoffnung beinhaltet, dass schnell wachsende kanzerogene Zellen entweder
der Behandlung erliegen werden oder zumindest hinlänglich in
einer Anzahl reduziert werden, die dem Körpersystem die Eliminierung
der verbleibenden Zellen erlaubt. Darüber hinaus wirken viele von
diesen Behandlungen nachteilig auf nicht-maligne Zellen. Folglich
muss vor dem Beginn vieler Therapien eine Einschätzung der Ernsthaftigkeit des
Zustandes durchgeführt
werden. Zwecks höchster
Effektivität
erfordern diese Behandlungen nicht nur eine frühe Entdeckung der Malignität, sondern
auch eine Beurteilung der Schwere der Malignität.
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Wenngleich verschiedene Arten von
Krebs verschiedene Eigenschaften aufweisen, so teilen doch viele
Krebse den Umstand, dass sie um unheilbar zu werden, Metastasen
bilden müssen.
Bis zu dem Zeitpunkt an dem Metastasen auftreten ist ein Tumor,
obschon er bösartig
sein kann, auf einen Bereich des Körpers begrenzt. Dies kann Unbehagen
und/oder Schmerz begründen
oder gar zu ernsthafteren Problemen führen, aber wenn er lokalisiert
werden kann, kann er chirurgisch entfernt werden und, bei Durchführung mit
entsprechender Sorgfalt, keine weiteren Probleme begründen. Wenn
Metastasen einsetzen, sind kanzerogene Zellen in den Körper eingedrungen,
und obwohl eine chirurgische Resektion den Muttertumor entfernen
kann, betrifft dies nicht andere Tumore. Allein Chemotherapie oder
eine bestimmte Art der gezielten Therapie bewirkt dann eine Möglichkeit
des Erfolgs.
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Die Entwicklung der Tumormetastasen
ist ein mehrstufiger Vorgang, der Lokalinvasion und Zerstörung von
interzellulärer
Matrix, Intravasation in Blutgefäße, Lymphgefäße oder
andere Transportkanäle, Überleben in
dem Blutkreislauf, Extravasation aus den Gefäßen in die zweite Stelle und
Wachstum an einem neuen Ort beinhaltet (Fidler, et al., Adv. Cancer
Res. 28, 149-250 (1978), Liotta, et al., Cancer Treatment Res. 40, 223-238
(1988), Nicolson, Biochim. Biophy. Acta 948, 175-224 (1988) und
Zetter, N. Eng. J. Med. 322, 605-612 (1990)). Erfolg in der Herstellung
metastatischer Ablagerungen erfordert Tumorzellen, die dazu fähig sind,
diese Schritte nacheinander durchführen zu können. Üblich für viele Schritte der Metastasenentwicklung
ist ein Erfordernis der Beweglichkeit. Die fortgeschrittene Bewegung
von malignen Tumorzellen ist ein großer Beitrag für das Voranschreiten
der Krankheit hin zu Metastasen. Gesteigerte Zellbeweglichkeit wurde
mit einem fortgeschrittenen metastatischen Potenzial in sowohl tierischen
als auch menschlichen Tumoren verbunden (Hosaka, et al., Gann 69,
273-276 (1978) und Haemmerlin, et al., Int. J. Cancer 27, 603-610
(1981)).
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Tumorangiogenese ist wesentlich für beides,
die primäre
Tumorexpansion und die metastatische Tumorverbreitung, und die Angiogenese
selbst erfordert eine ECM Degradation (Blood et al., Biochim. Biophys. Acta
1032: 89-118 (1990)). Daher ist Malignizität eine systemische Krankheit,
in welcher Wechselwirkungen zwischen den neoplastischen Zellen und
deren Umfeld eine ausschlaggebende Rolle während der Entwicklung des pathologischen
Prozesses spielen (Fidler, I. J., Cancer Metastasis Rev. 5: 29-49 (1986)).
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Die Identifikation der Änderungen
in der Genexpressionen, welche mit malignen Tumoren, inklusive derer,
welche am Tumorwachstum beteiligt sind, verbunden sind, ist offenbar
ein Erfordernis nicht nur für
ein vollständiges
Verständnis
von Krebs sondern auch, um neue vernünftige Therapien gegen Krebs
zu entwickeln.
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Ein weiteres Problem erwächst dadurch,
dass die für
kanzerogene Zellen charakteristischen Gene sehr häufig abnormal
expremierte Wirtgene sind. Es ist recht häufig der Fall, dass ein bestimmter
Proteinmarker für
einen gegebenen Krebs, während
er in hohen Pegeln in Verbindung mit dem Krebs exprimiert wird, ebenfalls
irgendwo anders auf dem Körper
exprimiert wurde, wenngleich bei niedrigen Pegeln.
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Prostatakrebs ist die weitest verbreitete
Art von Krebs bei Männern
und die zweithäufigste
Ursache für Krebstod
unter älteren
Männern
(Boring, et al., Cancer J. Clinicians, 7-26 (1994)). Klinische Radikalprostatektomie
bietet einem Patienten mit lokal begrenzter Erkrankung eine exzellente
Aussicht auf Heilung. Unglücklicherweise
ist Prostatakrebs, wenn er diagnostiziert wurde nachdem sich Metastasen
ausgebildet hatten, eine tödliche
Erkrankung, für
die es keine wirksame Behandlung gibt, die das Überleben signifikant erhöht. Jüngste Fortschritte
bei Prostatakrebsdiagnosen haben die frühere Erkennung von menschlichem
Prostatakrebs durch Anwendung des PSA Tests ermöglicht (Catalona, et al., J.
Urol., 151, 1283-1290 (1994)). Unglücklicherweise wurde diese frühe Erkennung
nicht durch eine Verbesserung in der Bestimmung, welche Tumore sich
hin zu dem meta statischen Zustand entwickeln können, begleitet (Cookson, et
al., J. Urology 154, 1070-1073 (1995) und Aspinall, et al., J. Urology
154, 622-628 (1995)). Da viele Individuen mit Prostatakrebs nicht
nachteilig durch den Krebs beeinflusst sind erwuchs eine beträchtliche
Kontroverse bezüglich
der Verwendung dieser Tests. Daher sind Methoden zur frühen Erkennung
und frühen
Beurteilung des Potenzials für
oder von der Schwere des Krebses, welche zur Behandlung von beispielsweise
metastatischer Erkrankung beachtet werden können, wünschenswert.
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Bao und Zetter berichteten in einer
auf der Jahresversammlung der Amerikanischen Gesellschaft für Krebsforschung
(American Association for Cancer Research annual meeting) (18. bis
22. März
1995) präsentierten
Zusammenfassung die Differentialexpression einer neuartigen mRNA,
die in hochmetastatischen Rattentumorzelllinien, aber nicht in einer
niedrigmetastatischen Variante, exprimiert wurden. cDNA wurde isoliert und
soll ein Protein mit 68% Übereinstimmung
zu dem Rattenthymosin β4 kodiert haben. Jedenfalls wurde über die
Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz nicht berichtet.
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Zusammeafasaung der Erfindung
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Wir haben nun entdeckt, dass Menschen
ein Gen haben, welches ein neuartiges Protein aus der Thymosin β Familie
entschlüsselt.
Dieses neuartige Protein, welches hier als Thymosin ß15
bezeichnet wird, hat so wie andere Mitglieder aus der Thymosin β Familie
die Fähigkeit,
G-actin zu binden und abzusondern, aber im Gegensatz zu dem was
von anderen Mitgliedern bekannt ist reguliert es auch direkt die
Zellbeweglichkeit in prostatischen Krebszellen. Wir haben eine cDNA
des menschlichen Thymosin ß15 Gens (SEQ ID NR.: 1) isoliert
und haben die Aminosäuresequenz
(SEQ ID NR.: 2) abgeleitet. Wir haben gezeigt, dass erweiterte Transkripte
(mRNA) und Expression des Thymosin ß15 Gens in nicht-testikulären Zellen
eine hohe Korrelation zu dem Zustand der Erkrankung in einer Vielzahl
von Krebsen wie beispielsweise Prostata-, Lungen-, Melanom- und
Brustkrebs, insbesondere metastatischen Krebsen, aufweist. Folglich
kann das Erkennen erhöhter Spiegel
des Transkripts oder Genproduktes in nicht-testikulären Geweben nicht nur in einer
diagnostischen Art und Weise, sondern auch in einer prognostischen
Art und Weise für
bestimmte Krebssorten verwendet werden.
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In einem ersten Gesichtspunkt liefert
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Prognose von Prostatakrebs
enthaltend:
- a. Messung von Thymosin β15 Mengen,
um einen Thymosin β15-Spiegel
in einer Probe, die aus dem Prostatatumor eines Individuums erhältlich ist,
zu erhalten,
- b. Korrelation des Thymosin β15-Spiegels mit einem
Grundlinienspiegel, wobei der Grundlinienspiegel bestimmt ist durch
Messung der Spiegel von Thymosin ß15 in einer Probe von
einem nicht erkranktem Individuum; wobei eine Expression von Thymosin β15
in der Tumorprobe größer als
der Grundlinienspiegel ein höheres
Risiko von Tumormetastasen anzeigt.
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Das Verfahren kann die Schritte umfassen:
- a. Kontaktierung der Probe mit einem Antikörperfragment, welches selektiv
menschliches Thymosin β15 bindet und
- b. Detektion, ob der Antikörper
oder das Antikörperfragment
durch die Probe gebunden ist, und dadurch Messung der Spiegel von
anwesendem menschlichem Thymosin β15.
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In dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung können
Spiegel von Thymosin ß15 durch Messung des Proteins direkt
oder indirekt durch Messung des Thymosin β15 entschlüsselnden
Transskripts (mRNA) ermittelt werden. mRNA Spiegel können beispielsweise
durch Verwendung einer RNA-abhängigen
Polymerasekettenreaktion wie beispielsweise die reverse Transkriptase
PCR oder Northern- Blot-Analyse
gemessen werden.
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Basislinienpegel können leicht
durch Messung der Pegel von Thymosin β15 in einer Probe
von erkrankungsfreien Individuen bestimmt werden.
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Der Ausdruck „unikales Fragment" bezieht
sich auf einen Abschnitt der Nukleotidsequenz oder des Polypeptids
der vorliegenden Erfindung, welcher Sequenzen (entweder Nukleotide
oder Aminosäurereste) enthalten
wird, die in Thymosin ß15 (SEQ ID NR.: 2), aber nicht in
anderen Mitgliedern der Thymosin-Familie anwesend sind. Dies kann
bestimmt werden, wenn die Hybridisierung dieses Fragmentes unter
stringenten Bedingungen derartig ist, dass es nicht an andere Mitglieder
der Thymosin-Familie hybridisiert. Solche Fragmente können aus 2 entnommen werden. Eine
bevorzugte Gruppe unikaler Fragmente sind solche, die Aminosäure 7 bis
12 der SEQ ID NR.: 2, Aminosäure
21 bis 24 der SEQ ID NR.: 2 und Aminosäure 36 bis 45 der SEQ ID NR.:
2 beinhalten oder Polynukleotide beinhalten, die diese verschlüsseln. Vorzugsweise
ist das unikale Nukleotidsequenzfragment 10 bis 60 Nukleotide lang,
besonders bevorzugt 20 bis 50 Nukleotide und ganz besonders bevorzugt
30 bis 50 Nukleotide. Vorzugsweise ist das unikale Polypeptidsequenzfragment
4 bis 20 Aminosäuren
lang, besonders bevorzugt 6 bis 15 Aminosäuren, ganz besonders bevorzugt
6 bis 10 Aminosäuren.
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Beschreibung der Figuren
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1 ist
die Nukleotidsequenz (SEQ ID NR..: 1) von Tß15 cDNA und
die vorausgesagte Aminosäurensequenz
(SEQ ID NR.: 2) (Einzelbuchstabenschlüssel). Die Sequenznummern der
Nukleotide und Aminosäuren
sind auf der rechten Seite der Sequenzen angezeigt. Das Translationsinitiationskodon
ATG ist unterstrichen und das -Terminationskodon TAA ist mit einem
Sternchen gekennzeichnet. Eine vermutliche Aktinbindungsregion ist
unterstrichen. Diese Sequenzdaten sind von GenBank unter der Zutrittsnummer
U25684 erhältlich.
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2 zeigt
die Aufstellung der abgeleiteten Tβ15 Proteinsequenz und
einige der anderen ß Thymosin Isoformen. Identische Aminosäurebereiche
sind durch schwarze Buchstaben in schwarz gerahmten, weißgrundigen
Kästchen
dargestellt. Schwarze Buchstaben ohne Kästchen korrespondieren mit
den nicht identischen Bereichen. Punkte korrespondieren mit zur
Optimierung der Aufstellung in die Sequenz eingefügten Lücken.
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3A und 3B zeigen in situ Hybridisierung
mit einer antisense-Ribosonde (riboprobe) für Tβ15 bei Patienten
mit prostatischem Drüsenkrebs. 3A zeigt eine Differentialexpression
in Tumoren. Der kleine Pfeil zeigt erfolgreiches Anfärben. Der
große
Pfeil zeigt erfolgloses Anfärben. 3B zeigt, dass in schlecht differenzierten
und invasiven Prostatakrebsen einzelne Zellen, die in das Grundgewebe
(stroma) einfallen, mit starker Anfärbung (Pfeil) wiedergegeben
werden.
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4A, 4B und 4C zeigen serumstimulierte Migration
von kontrolltransfizierten und Tβ15-transfizierten Dunning
R-3327-Varianten
und deren Wachstumsrate.
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4A:
Vektorkontroll-transfizierte (O,∇) und Tβ15 antisense
(•,
) transfizierte AT3.1
Zellklonen.
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4B:
Vektorkontroll-transfizierte (O,∇) und Tβ15 sense-transfizierte (•,
AT2.1 Zellklonen. Die
Daten sind als das Mittel ± SE
(n = 4) ausgedrückt.
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4C:
Wachstumskurven von kontroll-transfizierten und Tß15 (sense
oder antisense) transfizierten Dunning R-3327 Klonen. Zellen von
vektorkontroll-transfiziertem AT2.1 (o), Tβ15 sense-transfiziertem AT2.1 (•), vektorkontroll-transfiziertem
AT3.1 (∇)
und T 15 antisense-transfiziertem AT3.1
sind bei ur sprünglich 10
4 Zellen pro Well in RPMI 1640 mit 10% FBS
und 250 nM Dexamethason in 12 Wellplatten ausplattiert. Die Zellen
wurden abgeerntet und bei den angezeigten Zeiten gezählt. Die Punkte
repräsentieren
das Mittel ± SE
(n = 3).
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5A, 5B, 5C und 5D zeigen
eine immunohistochemische Anfärbung
von menschlichem Prostatakrebsgewebe mit einem zu Thymosin β15
affinitätsgereinigtem
Polyklonalantikörper.
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- A: Nicht-malignes prostatisches Ephitelia (großer Pfeil)
und hochgradig protatisches intraepitheliales Neoplasia (PIN) (kleiner
Pfeil).
- B: Mittelmäßig differenzierter
Prostatakrebs, der heterogene Immunoanfärbung zeigt (kleiner Pfeil,
erfolgreich; großer
Pfeil, nicht erfolgreich).
- C: Schlecht differenzierter Prostatakrebs.
- D: Einzelne in das Grundgewebe (stroma) einfallende Zellen zeigen
starke Anfärbungen.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Obwohl gezeigt wurde, dass Mitglieder
der Thymosin β Familie G-actin binden und absondern, wurde zuvor
noch nicht gezeigt, dass sie die Zellbeweglichkeit verändern. Unsere
Untersuchungen legen jedenfalls offen, dass Thymosin β15
direkt die Zellbeweglichkeit in Prostatakrebszellen reguliert. Wir
haben gezeigt, dass die Expression von Thymosin ß15 in
hoch-metastatischen Prostatakrebszelllinien verglichen mit schlecht-metastatischen
oder nicht-metastatischen Linien hochgeregelt ist. Zusätzlich wurde
Thymosin ß15 in menschlichen Prostatakrebsproben aber nicht
in normaler menschlicher Prostata exprimiert. Wenngleich es nicht
gewünscht
wird, durch die Theorie gebunden zu werden, zeigt dies, dass β15
eine Rolle in dem Prozess der metastatischen Transformation spielt.
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Folglich kann die Evaluation und
der Vergleich von Spiegeln des Transkripts (mRNA) oder Genproduktes,
entweder normal oder mutiert, in nicht-testikulärem Gewebe sowohl diagnostisch
als auch prognostisch bei bestimmtem Krebs sein. Beispielsweise
ist ein gehobener Pegel Indikativ für eine größere Tendenz der metastatischen
Aktivität.
Weiter kann man durch Überwachung
eines bestimmten neoplastischen Wachstums über einen Zeitabschnitt und
Vergleich der Änderungen
im Spiegel die Veränderungen
in der metastatischen Aktivität
evaluieren. Der Pegel von ß15 kann ebenfalls dazu verwendet
werden, um die Ernsthaftigkeit eines bestimmten Tumors zu bestimmen.
Wir haben herausgefunden, dass die β15-Expression mit dem
Grad der Tumorernsthaftigkeit korreliert. Beispielsweise ist die
Expression von β15 in Prostatazellen gut mit dem Gleason-Grad
von Prostatakarzinomen korreliert.
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf ein Verfahren zur Krebsdiagnose, insbesondere von Prostata-,
Lungen-, Melanom- und
Brustkrebs, bei einem Patienten durch Messung der Thymosin ß15-Spiegel
in einer biologischen Probe, die von dem Patienten erhalten wurde.
Ein Spiegel von Thymosin β15 in der Probe größer als
der Basislinienspiegel ist kennzeichnend für Krebs. Basislinienspiegel
können
leicht durch Messung der Thymosin β15-Pegel in einer Probe von erkrankungsfreien
Individuen bestimmt werden.
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Biologische Proben beinhalten beispielsweise
Blut, Gewebe, Serum, Fäzes,
Urin, Auswurf, Cerebrospinalflüssigkeit
und Überstand
von Zelllysat. Vorzugsweise verwendet man Gewebeproben. Die Bestimmung der
Basislinie und der Vergleich der Pegel ist durch standardisierte
Arten der Analyse, die auf der derzeitigen Offenbarung beruhen,
erfolgt.
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Wie oben angeführt liefert die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zur Prognose in einem Individuum mit Prostatakrebs
durch die Messung von Spiegeln von Thymosin ß15 in einer
Tumorprobe, die von einem zu untersuchenden Patienten erhalten wurde.
Expression von Thymosin β15 in der Tumorprobe, die größer als der
Basislinienspiegel für
das bestimmte Gewebe ist, kennzeichnet ein höheres Risiko von Tumormetastasen. Diese
Information kann durch den Arzt dazu verwendet werden, die effizienteste
Art der Behandlung zu bestimmen.
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Veränderungen im Zustand eines
Patienten können
durch Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung durch
Vergleichen der Änderungen
in Thymosin ß15-Expressionsspiegeln in dem Tumor in dem Subjekt über die
Zeit überwacht
werden.
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Ebenfalls liefert die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des metastatischen Potentials
eines Tumors durch Messung des Spiegels der Thymosin ß15-Expression
in dem Tumor. Eine Expression von Thymosin β15 in dem Tumor
größer als
ein Basislinienspiegel für
das bestimmte Gewebe signalisiert ein gesteigertes metastatisches
Potential.
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Aus der Technik gut bekannte Standardnachweistechniken
zum Nachweis von RNA, DNA, Proteinen und Peptiden können leicht
dazu verwendet werden, Thymosin ß15 oder dessen Transkript
zur Diagnose von Krebs, insbesondere metastatischem Krebs, nachzuweisen
oder festzustellen, ob ein primärer
Tumor eine bestimmte metastatische Phase erreicht hat oder nicht
erreicht hat.
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Solche Techniken können den
Nachweis mit Nukleotidsonden (nucleotide grobes) beinhalten oder können den
Nachweis des Proteins durch beispielsweise Antikörper oder deren Äquivalente
umfassen. Vorzugsweise können
die Nukleotidsonden jede beliebige sein, welches stärker an
die in SEQ ID NR.: 1 gezeigte Sequenz hybridisiert als an andere
natürlich
vorkommende Thymosin-Sequenzen.
Arten der Sonde beinhalten cDNA, Ribosonden, synthetische Oligonukleotide
und genimische Sonden. Die Art der verwendeten Sonden wird im Allgemeinen
durch die bestimmte Situation vorgegeben, wie beispielsweise Ribosonden
für eine
in situ-Hybridisierung und cDNA für Northern-Blots. Die bevorzugtesten
Sonden sind diejenigen, welche mit der DNA der SEQ ID NR.: 1 korrespondieren.
Vorzugsweise ist die Sonde auf die Thymosin ß15-Kodierungsregion,
d.h. Nukleotide 98-232 der SEQ ID NR.: 1, gerichtet. Höchst bevorzugt
ist die Sonde an die Nukleotidregionen unikal zu Thymosin ßl5
gerichtet, d.h. Nukleotide 113-133, 158-169 oder 200-239 der SEQ
ID NR.: 1. Nachweis des Thymosin β15 Enkodierungsgens ist
per se zweckmäßig in dem
Screening von Mutanten, welche mit gesteigerter Expression in Verbindung
stehen. Weitere Formen von Assays zum schnelleren Nachweis von Targets,
die mit Spiegeln von Expressionstranskripten und anderen Fxpressionsprodukten
assoziiert sind, sind im Allgemeinen ebenfalls zweckmäßig. Die
Sonden können
so kurz sein, wie es nötig
ist, um differenziert Thymosin ß15 mRNA Transkripte zu
erkennen und können
so kurz sein wie beispielsweise 15 Basen.
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Eine Sonde kann ebenfalls durch einen
Fachmann auf diesem Gebiet ausgehend von der Aminosäuresequenz
der SEQ ID NR.: 2 reversiert gestaltet werden. Die Verwendung solcher
Sonden kann jedoch insofern begrenzt sein, als es wünschenswert
ist, dass jede gegebene reversiert-gestaltete Sequenz nicht zwingenderweise
gut oder überhaupt
mit irgendeiner gegebenen komplementären Sequenz, die von demselben Peptid
wegen der Degeneration des genetischen Codes reversiert-gestaltet
wurde, hybridisiert. Dies ist ein für den Fachmann hinsichtlich
seiner Überlegungen üblicher
Faktor, und die Degeneration irgendeiner gegebenen Sequenz ist häufig so
weit, dass sich eine große
Anzahl an Sonden für
irgendeine Sequenz ergibt.
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Die Art der Markierung der Sonden
kann irgendeine geeignete sein, wie beispielsweise die Verwendung
von Radioisotopen, zum Beispiel von 32P
und 35S. Die Markierung mit Radioisotopen
kann, gleichwohl ob die Sonde chemisch oder biologisch synthetisiert
wurde, unter der Verwendung von geeignet markierten Basen erreicht
werden. Andere Arten der Markierung können Enzym- oder Antikörpermarkierung,
wie diese beispielsweise für
ELISA charakteristisch ist, beinhalten.
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Der Nachweis von RNA Transkripten
kann durch Northern-Blotting erreicht werden, bei welchem zum Beispiel
eine Herstellung von RNA auf einem denaturierenden Agarosegel laufen
gelassen wird, und auf einen geeigneten Träger, wie beispielsweise aktivierte
Zellulose, Nitrozellulose oder Glas- oder Nylonmembrane, transferiert
werden. Radiomarkierte cDNA oder RNA wird danach zur Herstellung
hybridisiert, gewaschen und durch Autoradiographie analysiert.
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Eine in situ Hybridisierungsvisualisierung
kann ebenfalls verwendet werden, wobei eine radioaktiv markierte
antisense cRNA-Sonde
mit einem dünnen
Abschnitt einer Biopsyprobe hybridisiert, gewaschen, mit RNase gespalten
und einer für
die Autoradiographie sensitiven Emulsion ausgesetzt wurde. Die Proben
können
mit Hämatoxylon
angefärbt
sein, um die histologische Zusammensetzung der Probe darzustellen,
und die Dunkelfelddarstellung mit einem geeigneten Lichtfilter lässt die
entwickelte Emulsion erscheinen. Nicht-radioaktive Markierungen
wie beispielsweise Digoxigenin können
ebenfalls verwendet werden.
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Immunohistochemie kann dazu verwendet
werden, eine Expression von menschlichem Thymosin β15 in
einer Biopsyprobe nachzuweisen. Ein geeigneter Antikörper wird
mit beispielsweise einer dünnen
Zellschicht in Kontakt gebracht, gewaschen und danach mit einem
zweiten, markierten Antikörper
kontaktiert. Das Markieren kann durch Enzyme wie beispielsweise
Peroxidase, Avidin oder durch Radiomarkierung erfolgen. Chromogene
Markierungen sind generell insofern vorzuziehen, als sie unter dem
Mikroskop nachgewiesen werden können.
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Allgemeiner ist der Nachweis des
Proteins durch ein Immunoassay wie beispielsweise durch ELISA oder
RIA bevorzugt, was sehr schnell erfolgen kann. Daher ist allgemein
die Verwendung von Antikörpern
oder Antikörperäquivalenten
zur Detektion von Thymosin β15 bevorzugt.
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Es muss nicht notwendig sein, das
Substrat zu markieren, vorausgesetzt, dass das Produkt des enzymatischen
Prozesses nach weisbar und selbst charakteristisch ist (wie beispielsweise
Wasserstoffperoxid). Sollte es notwendig sein, das Substrat zu markieren,
dann kann dies ebenfalls eine Enzymmarkierung, Markierung mit Radioisotopen,
Antikörpermarkierung,
Fluoreszensmarkermarkierung oder eine andere geeignete Form, die
leicht für
einen Fachmann auf diesem Gebiet erkennbar ist, umfassen.
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Antikörper können wie unten beschrieben
hergestellt werden und in irgendeiner geeigneten Art und Weise zum
Nachweis der Expression von Thymosin β15 verwendet werden.
Auf Antikörper
basierende Techniken beinhalten ELISA (enzyme linked immunosorbent
assay) und RIA (radioimmunoassay). Irgendein herkömmliches
Verfahren kann für
solche Immunoassays zum Einsatz gelangen. Die Verfahren können in
geeigneter Weise ausgeführt
werden wie dieses: ein Thymosin ß15-Standard ist mit einem
Radioisotop wie beispielsweise 125I oder 35S oder einem assayfähigen Enzym wie beispielsweise
Meerrettich-Peroxidase oder Alkaliphosphatase markiert und, zusammen
mit der unmarkierten Probe, mit dem korrespondierenden Antikörper in
Kontakt gebracht, worauf ein zweiter Antikörper zur Bindung des ersten
verwendet wird und die Radioaktivität oder das immobilisierte Enzym
wird untersucht (Kompetitives Assay); alternativ kann das in der
Probe vorhandene Thymosin β15 mit dem korrespondierenden
immobilisierten Antikörper
zur Reaktion gebracht werden, der radioisotop- oder enzymmarkierte
anti-Thymosin β15-Antikörper
kann mit dem System reagieren und Radioaktivität oder das untersuchte Enzym
wird untersucht (ELISA-Sandwich-Assay). Andere konventionelle Verfahren
können
ebenfalls wie üblich
zum Einsatz kommen.
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Die oben genannten Techniken können im
Wesentlichen wie ein „Einschritt"-
oder ein „Zweischritt"-Assay
ausgeführt
sein. Das „Einschritt"-Assay
beinhaltet eine Kontaktierung des Antigens mit dem immobilisierten
Antikörper
und, ohne Waschvorgang, eine Kontaktierung des Gemisches mit dem
markierten Antikörper. Das „Zweischritt"-Assay
beinhaltet das Waschen vor der Kontaktierung des Gemisches mit dem
markierten Antikörper.
Andere kon ventionelle Methoden können
ebenfalls wie üblich
zum Einsatz kommen.
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Enzymatische Markierung und Radiomarkierung
von Thymosin ß15 und/oder den Antikörpern kann mit konventionellen
Mitteln erfolgen. Derartige Mittel beinhalten im Allgemeinen die
kovalente Bindungsknüpfung
des Enzyms zu dem Antigen oder dem besagten Antikörper, wie
beispielsweise durch Glutaraldehyd, insbesondere so, dass die Aktivität des Enzyms
nicht nachteilig beeinflusst wird, wobei damit gemeint ist, dass das
Enzym immer noch zur Interaktion mit dem Substrat fähig sein
muss, obwohl es nicht für
alle Enzyme erforderlich ist, aktiv zu sein, vorausgesetzt, dass
genügend
aktive übrig
bleiben, um die Durchführung
des Assays zu erlauben. Tatsächlich
sind manche Techniken zur Enzymbindung nicht-spezifisch (wie beispielsweise die
Verwendung von Formaldehyd) und werden nur einen Anteil des aktiven
Enzyms erhalten.
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Üblicherweise
ist es wünschenswert,
eine Komponente des Assaysystems an einem Träger zu immobilisieren und dabei
den anderen Komponenten des Systems zu ermöglichen, dass sie mit dem Komponenten in
Kontakt gebracht werden und ohne mühselige und zeitaufwändige Arbeit
leicht wieder entfernt werden können.
Einer zweiten Phase ist es möglich,
von der ersten entfernt immobilisiert zu werden, aber eine Phase
ist üblicherweise
ausreichend.
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Es ist möglich, das Enzym selbst an
dem Träger
zu immobilisieren, aber wenn ein Festphasenenzym benötigt wird,
dann wird dies im Allgemeinen am besten durch Bindung an den Antikörper und
Anhaftung des Antikörpers
an einen Träger
erreicht, wofür
Modelle und Systeme aus der Technik bekannt sind. Einfaches Polyethylen
kann einen geeigneten Träger
liefern.
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Zum Markieren geeignete Enzyme sind
nicht besonders beschränkt,
aber können
beispielsweise aus den Mitgliedern der Oxidase-Gruppe ausgewählt werden. Diese katalysieren
die Herstellung von Wasserstoffperoxid durch Reaktion mit deren
Substraten, und Glukoseoxidase wird häufig wegen ihrer guten Stabilität, Einfachheit
der Erhältlichkeit
und der Kostengünstigkeit
als auch dessen leichte Erhältlichkeit
des Substrats (Glukose), verwendet. Die Aktivität der Oxidase kann durch Messung
der Konzentration des Wasserstoffperoxids, das nach der Reaktion
des Enzym-markierten Antikörpers
mit dem Substrat gebildet wurde, unter in der Technik bekannten
kontrollierten Bedingungen untersucht werden.
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Andere Techniken können zum
Nachweis von Thymosin ß15 je nach Präferenz verwendet werden. Eine
solche Technik ist Western-Blotting
(Towbin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 76: 4350 (1979)), worin eine
geeignet behandelte Probe auf einem SDS-PAGE Gel laufen gelassen
wird, bevor es auf einem festen Träger transferiert wird, wie
beispielsweise einem Nitrocellulosefilter. (Unmarkierte) anti-Thymosin β15
Antikörper werden
danach mit dem Träger
in Kontakt gebracht und durch ein zweites immunologisches Reagenz
wie beispielsweise markiertes Protein A oder anti-Immunoglobulin
(geeignete Markierungen inklusive 125I,
Meerrettich-Peroxidase und Alkaliphosphatase) untersucht werden.
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Proben für diagnostische Zwecke können aus
irgendeiner Anzahl von Quellen erhalten werden. Eine Probe, die
direkt von dem Tumor wie beispielsweise dem Grundgewebe (Stroma)
oder dem Cytosol erhalten wurde, kann zur Bestimmung des metastatischen
Potentials des Tumors verwendet werden. Es kann ebenfalls dazu geeignet
sein, die Probe von anderen biologischen Präparaten. wie beispielsweise
von Blut oder Urin zu erhalten. Solche Diagnosen können von
bestimmter Wichtigkeit hinsichtlich der überwachung des Fortschritts eines
Patienten wie beispielsweise nach einem zur Entfernung eines Tumors
erfolgten chirurgischen Eingriffs sein. Wenn eine Referenzmessung
nach einer Operation durchgeführt
wurde und danach in weiteren regelmäßigen Zeitabständen durchgeführt wurde,
kann jeder Anstieg kennzeichnend für einen Rückfall oder möglicherweise
eine Metastase sein.
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Vorzugsweise stammt die Probe von
dem Tumor selbst.
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Die Antikörper können gegen entweder ein Peptid
von Thymosin ß15 oder den gesamten Muskel gerichtet sein.
Solch ein Peptid kann zusammen mit einem Trägerprotein wie beispielsweise
ein KLH zu einem tierischen System oder, falls es lang genug ist,
z.B. schätzungsweise
25 Aminosäurereste,
ohne einen Träger präsentiert
werden. Bevorzugte Peptide beinhalten zum Thymosin ß15
unikale Abschnitte wie beispielsweise Aminosäure 7 bis 12 der SEQ ID NR.:
2, Aminosäure
21 bis 24 von SEQ ID NR.: 2 und Aminosäure 36 bis 45 von SEQ ID NR.:
2.
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Durch die oben genannte Technik generierte
polyclonale Antikörper
können
direkt verwendet werden oder geeignete Antikörper herstellende Zellen können von
dem Tier isoliert werden und zur Bildung eines Hybridoms durch bekannte
Mittel verwendet werden (Kohler und Milstein, Nature 256: 795. (1975)).
Die Auswahl eines geeigneten Hybridoms ist ebenfalls für einen
Fachmann ersichtlich, und der erhaltene Antikörper kann in einem geeigneten
Assay zur Identifikation von Thymosin β15 verwendet werden.
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Die vorliegende Erfindung liefert
einen zweckmäßigen Reagenzsatz
zur Messung von menschlichen Thymosin ß15-Spiegeln. Dieser
Reagenzsatz beinhaltet Antikörper
oder Antikörperfragmente,
welche selektiv menschliches Thymosin ß15 binden oder eine
Gruppe von DNA Oligonucleotidprimern, welche die Synthese von cDNA,
die menschliches Thymosin β15 kodiert, ermöglicht.
Vorzugsweise umfassen die Primer zumindest 10 Nukleotide und hybridisieren
unter stringenten Bedingungen an ein DNA Fragment welches die in
SEQ ID NR.: 1 angegebene Nukleotidsequenz hat. Wie hierbei verwendet
bedeutet der Ausdruck „stringente
Bedingungen", dass die Hybridisierung nur auftreten wird, wenn zumindest
95% und vorzugsweise zumindest 97% Übereinstimmung zwischen den
Sequenzen besteht.
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Menschliches Thymosin β15
verschlüsselnde
DNA und rekombinantes menschliches Thymosin β15 kann gemäß den in
der
EP 934412 dargelegten
Verfahren hergestellt werden.
-
Die nachfolgenden Beispiele dienen
der Darstellung der vorliegenden Erfindung und sind nicht dazu beabsichtigt,
die Erfindung in irgendeiner Art und Weise zu begrenzen.
-
BEISPIELE
-
VERFABREN:
-
RT-PCR Analyse
-
Die gesamte RNA jeder einzelnen Zelllinie
wurde mit RNase freier DNase I verdaut (GIBCO BRL, Gaithersburg,
MD). 5 μg
der DNase I verdauten gesamten RNA wurden unter Verwendung des cDNA
Zyklisierungsreagenzsatz (Cyling Kit) (Invitrogen) revers transkribiert.
Das revers transkribierte Gemisch wurde mit einer Spin Säule 300
(Pharmocia, Piscataway, NJ) gereinigt. 10 μl der gereinigten cDNA wurde
mit einem Primersatz von Tβ15 vorwärts Primer (forward primer)
amplifiziert:
5'-TATCAGCTAGTGGCTGCACCCGCG-3' (SEQ ID NR.: 3)
und reverser Primer:
5'-AAATGCTGACCTTTCAGTCAGGGT-3' (SEQ ID
NR.: 4); Tβ4 vorwärts
Primer:
5'-ACTCTCAATTCCACCA TCTCCCAC-3' (SEQ ID NR.: 5), reverser
Primer:
5'-GCCTCTGAGCAGATCGTCTCTCCTTG-3' (SEQ ID NR.: 6); und
Tβ10 vorwärts
Primer:
5'-ATAATATCCCTGGGCAAACCGGTG-3' (SEQ ID NR.: 7), reverser
Primer:
5'-GAGTGGAG TACCTGGAGCGCGAGC-3' (SEQ ID NR.: 8),
entsprechend.
Die PCR Amplifikation wurde in 50 μl eines PCR Reaktionspuffers
(50 mM KCl, 10 mM Tris [pH 8,5], 1,5 mM MgCl2)
mit 1 mM von dNTPs, 50 pmol eines jedes Primers, und 2,5 U Taq-Polymerase (GIBCO BRL), überschichtet
mit 50 μl
eines Mineral öls
(SIGMA), durchgeführt.
Das PCT Profil war 94°C,
30 sec; 60°C, 30
sec; und 72°C,
2 min mit 30 Zyklen. Die Kontrolluntersuchungen der RT-PCR wurden
unter Verwendung von Aliquoten aus denselben Proben durchgeführt und
mit Primern an dem ß-Aktingen amplifiziert (Clontech, Palo
Alto, CA). Die Amplifikationsprodukte wurden auf 1,4%igen Agarosegelen
separiert.
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In situ-Hybridisierung
-
Die Antisense und Sense Tß15
mRNA Sonden (probes) wurden unter Verwendung von Tβ15 cDNA, die
in den eurkaryotischen Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen) als
Templat eingefügt
wurde, und einem Digoxigenin RNA Markierungsreagenzsatz (Kit) (Boehringer
Mannheim) hergestellt. Die Formalin-fixierten Paraffineingebetteten
Sektionen wurden entwachst, rehydratisiert und mit Proteinase K
(50 μg/ml)
in 100 mM Tris, 50 mM EDTA Puffer (pH8) für 8 min bei 37°C verdaut.
Die Hybridisierung wurde in einem automatisierten Gerät (Ventana
Medical Systems, Tucson, AZ) für
60 min bei 42°C
mit 10 pM Digoxigenin-markierter Ribosonde (riboprobe) in 100 μl eines Hybridisierungspuffers
(50% deionisiertes Formamid, 4fach SSC, 10% Dextransulfat, 1% SDS
und denatoriertem Herringsperma DNA (400 μg/ml)) je Sektion unter einem
Flüssigkeitsschutzüberzug durchgeführt. Die
höchste
Stringenz der Posthybridisationswaschvorgänge lag bei 45°C für 15 min
in 0,1 × SSC.
Die gebundene Digoxigenin-markierte Sonde (probe) wurde durch anti-Digoxigeninalkaliphosphatasekonjugate
nachgewiesen und durch eine Nitroblau-Tetrazolium- und 5-Bromo-4-chloro-3-indolphosphat-(NBT-BCIP)Farbreaktion
angezeigt. Die Sektionen wurden mit Kernschnellrot (nuclear fast
red) gegengefärbt.
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Zellbeweglichkeit
-
Die Migration der Transfektanten
wurde unter Verwendung eines Multiwellkammerassays wie zuvor beschrieben
untersucht (Kunda, et al., J. Cell Biol. 130, 725 (1995)). 48 Wellchemotaxiskammern
wurden mit 8 μm
Porositätspolycarbonatfiltern
(Nucleopore Corp., Pleasanton, CA) überlagert, welche mit 11,5 μg/ml Fibro nectin
(Capple Organon Technica, Durham, NC) enthaltenden PBS vorbeschichtet
wurden. Die Migration von 5.000 Zellen, die in dem oberen Well platziert
wurden, hin zu dem fötalen
Rinderserum in dem unteren Well wurde einer vierstündigen Inkubation
bei 37°C
folgend untersucht. Nach Entfernung der Zellen von der oberen Seite
der Filter wurden Zellen, die durch die Filter hindurchliefen und
an der unteren Seite anhafteten in Formalin fixiert, mit PBS gewaschen
und mit Gill's Triple Strength Hematoxylin (Polysciences, Warrington, PA)
gefärbt
und unter Lichtmikroskopie gezählt.
-
Immunohistochemisches Färben
-
Die menschlichen Prostatakrebssektionen
wurden unter Verwendung eines Immunoperoxidase ABC Reagenzsatzes
(Kit) (Vector, Burlingame, CA) untersucht. Knapp beschrieben wurden
die 5 μm
Gewebesektionen in Xylol entparaffinisiert, in abgestuften Alkoholen
rehydratisiert und für
die endogene Peroxidase mit 3% Wasserstoffperoxid (Sigma) in Methanol
für 30
min blockiert. Die Sektionen wurden mit normalem Ziegenserum für 30 min
behandelt und danach mit einem affinitätsgereinigten anti Tβ15
C-terminalem Peptidantikörper für 2 Stunden
bei Raumtemperatur bei einer Verdünnung von 1 : 100 (v/v) inkubiert,
gefolgt von einer Inkubation mit einem biotinyliertem Ziegen-anti-Kaninchen
IgG Antikörper
für 30
min. Nach Inkubation mit einem vorgefertigten ABC-Komplex für 30 min
wurden die spezifisch gebundenen Antikörper durch Verwendung von Peroxidase-Substrat,
dem 3,3'-Diaminobenzidintetra-hydrochlorid
(DAB), visualisiert. Die Sektionen wurden mit Gill's Hematoxylin
gegengefärbt.
-
ERGEBNISSE
-
Klonen von menschlichem
Thymosin β15 durch RT-PCR
-
5 μg
der DNase I verdauten gesamten RNA der menschlichen Prostatakrebszellenlinie
PC-3 wurden unter Verwendung eines cDNA Zyklisierungsreagenzsatz
(Cycling Kit) (Invitrogen) revers transkribiert. Das reverse Transkriptionsgemisch
wurde mit ei ner Spin Säule
300 (Pharmocia, Piscataway, NY) gereinigt. 10 μl der gereinigten cDNA-Reaktion
wurden mit den Primern F1 (5'-TATCAGCTAGTGGCTGCACCCGCG-3')
(SEQ ID NR.: 8) und RI (5'-AAATGCTGACCTTTCAGTCAGGGT-3') (SEQ ID
NR.: 9), die zum Binden (anneal) an die äußeren Enden der Thymosin ß15-Sequenz
gestaltet werden, amplifiziert. Die PCR-Amplifikation wurde in 50 μl PCR-Reaktionspuffer (50
mM KCl, 10 mM Tris [pH 8,5], 1,5 mM MgCl2)
mit 1 mM Lösung
von dNTPs, 50 pmol von jedem Primer und 2,5 U Taq-Polymerase (GIBCO
BRL), überschichtet
mit 50 μl
Mineralöl
(Sigma), durchgeführt.
Das PCR Profil war 94°C,
30 sec; 60°C,
30 sec; und 72°C,
2 min für
30 Zyklen. Die Kontrolluntersuchungen der RT-PCR wurden unter Verwendung
von Aliquoten von denselben Proben durchgeführt und mit Primern zu dem ß-Actingen
(Clontech, Palo Alto, CA) amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte
wurden auf 1,6% Agarosegelen separiert. Das amplifizierte PCR-Produkt
wurde an pCR unter Verwendung des TA Klonierungsreagenzsatzes (Cloning
Kit) (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert und dann die DNA sequenziert.
Die Sequenz des PCR-Produktes der menschlichen Prostatakrebszellen,
die durch die Thymosin β15-Primer amplifiziert wurden, sind in 1 (SEQ ID Nr.: 1 und 2)
dargelegt.
-
Expression von Tβ15
mRNA in menschlichem Prostatakrebs
-
Zur Bestimmung, ob dieses Thymosin-Familienmitglied
in menschlichem Prostatakrebs exprimiert werden kann, haben wir
die menschliche Prostatakrebszellenlinie PC-3 durch RT-PCR mit vorwärts gerichteten
und reversen Primern für
Thymosin β15 untersucht. Die PC-3-Zellen zeigten einen
niedrigen Spiegel von Thymosin β15-Expression. Die DNA-Sequenz
des amplifizierten PCR-Produktes
war 100%ig identisch mit der Thymosin ß15-Sequenz von Ratten.
Wir führten
in situ-Hybridisierungsstudien an Proben von Patienten mit verschiedenen
Graden des Prostatakrebses unter Verwendung einer Thymosin β15-Sonde
(probe) durch. Die Gewebesektionen erlaubten einen direkten Vergleich
von normalen und malignen Elementen auf denselben Proben. Die stromalen
Elemente innerhalb und um die Tumorzellmassen herum, sowie auch das
nichtmaligne prostatische Epithelium benachbart zu dem Tumor zeigte
eine kleine Hintergrundhybridisierung mit der Thymosin ß15-Antisense
Sonde (probe). Im Gegensatz dazu wiesen die spezifischen Tumorzellinseln
ein starkes spezifisches Thymosin β15-Signal auf, wenn
sie mit Antisense (3A,
kleiner Pfeil) sondiert wurden, aber nicht mit einer Sense RNA Sonde
(probe) (Daten hier nicht gezeigt). Wenngleich nahezu alle der Tumorzellen in
den positiven Inseln Thymosin β15-mRNA exprimierten, waren
nicht alle Patientenproben positiv und nicht alle Inseln in einer
einzigen Prostata waren positiv (3A,
großer
Pfeil). Die Mehrheit der negativen Tumorzellen waren in nicht-invasiven
in situ-Karzinomen, während
hochinvasive Tumore durchwegs positiv waren (3B). Daher ist ein neues β Thymosin,
welches erstmalig in metastatischem Prostatakrebszelllinien von Ratten
detektiert wurde, in menschlichem Prostatakrebs hochreguliert.
-
Einfluss von Tβ15
auf die Zellbeweglichkeit
-
Zur Bestimmung, ob die Thymosin ß15-Expression
einen Einfluss auf die Zellbeweglichkeit hat, transfizierten wir
hochgradig bewegliche AT3.1 Zellen mit einem eukariontischen Expressionsvektor
(pcDNA3), der das Thymosin β15-Gen in Antisense Orientierung
beinhaltet, angetrieben durch den konstitutiven menschlichen Cytomegalovirus
Promoter. Die in selektiven (G418) Medien wachsenden transfizierten
Zellen wurden zur Expression von Antisense-Transkripten des Thymosin β15-Gens
durch strangspezifische Amplifikation der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) (Zhou, et al., Cancer Res. 52, 4280-4285 (1992) bearbeitet.
Die Analyse der Zellbeweglichkeit in einem Multiwell-Boyden-Kammerapparat (Boyden,
S.V., J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962)) unter Verwendung von fötalem Rinderserum
als Migrationsstimulanz offenbarte, dass die Zellbeweglichkeit der
Transfektanten, die die Expression von Antisense-Transkripten zeigten,
relativ zu den direkten Vektorkontrollen (vector-only controls)
( 4A) wesentlich verringert
war. Zwei Antisense transfizierte Klone, die keine Antisense-Transkripte
exprimierten, zeigten keinerlei verringerte Rate der Zellbeweglichkeit
(Daten sind hier nicht dargestellt). In einem weiteren Experiment
zeigten schlecht bewegliche AT2.1 Zellen, die mit Sense-Thymosin β15-Konstrukten transfiziert
wurden und die Exprimierung von Thymosin β15 durch Northern-Analyse
bestätigten,
eine relativ zu deren Vektorkontrollen (4B) signifikant angestiegene stimulierte Zellbeweglichkeit.
Die Sense- und die Antisense-Thymosin β15 Transfektanten
zeigten beide ähnliche
Raten der Zellproliferation relativ zu Kontrollen, die differenzierte
Spezifizitäten
für verschiedene
zelluläre
Ereignisse nahe legten ( 4C).
Die Ergebnisse zeigen, dass Thymosin ß15, welches in dem
hochgradig beweglichen AT3.1 und AT6.1 Dunning Tumorzelllinien hochgeregelt
ist, ein positiver Regulator der Zellbeweglichkeit ist, was wiederum
ein wichtiger Bestandteil von Krebsmetastasen ist.
-
Immunohistochemischer Nachweis
von Tβ15 im Prostatakarzinom
-
Ein polyklonaler Antikörper wurde
gegen ein die 11 C-terminalen Aminosäuren des Thymosin β15
repräsentierenden
Peptid laufen gelassen. Synthetisierte Peptide wurden mit einem
Träger,
dem Schlüssellochnapfschneckenhemocyanin
(keyhole limpet hemocyanin) (KLH) gekuppelt und in Kaninchen injiziert.
Das Antiserum wurde über
eine das C-terminale Peptid gekoppelte CNBr-aktivierte Sepharose 4B Säule affinitätsgereinigt.
Zur Prüfung
der Spezifizität
des gereinigten Antikörpers
haben wir eine Western-Analyse des GST/Thymosin β Fusionsproteins
mit dem affinitätsgereinigten
anti-C-terminalem Antikörper
durchgeführt.
Der gereinigte Antikörper
reagierte stark mit dem GST-Thymosin β15-Fusionsprotein,
aber reagierte nicht über
kreuz mit dem GST-Thymosin β4 und nicht – dessen
Spezifizität
darstellend – mit
GST allein.
-
Wir verwendeten die affinitätsgereinigten
polyklonalen Thymosin β15 Antikörper zur immunohistochemischen
Untersuchung des menschlichem Prostatakarzinom. Die Ergebnisse sind
unten in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Thymosin β15-Immunoanfärbung wurde in
den Zytoplasmen der Epitheliumzellen in neoplastischen Prostatas,
aber nicht in normalen Prostatas und nicht in den stromalen Zellen
beobachtet (5A, großer Pfeil).
Unter den untersuchten malignen Epithelia zeigten die schlecht differenzierten
Prostatakarzinome die am meisten extensive und intensive Thymosin β15-Immunoreaktion
(5C), gefolgt durch die moderat differenzierten
Prostatakarzinomen, in welchen nicht alle Karzinome Thymosin β15
exprimierten, was eine partielle Positivität zeigt (5B). In manchen Fällen zeigte hochgradig prostatisches
intraepitheliales Neoplasia (PIN) Thymosin β15-Immunofärbung, aber
in einem schwächeren
Ausmaß (5A, kleiner Pfeil). In schlecht differenzierten
invasiven Karzinomen zeigten in das Grundgewebe (stroma) einfallende
einzelne Zellen intensive Färbung
(5D). Die Expression
von Thymosin ß15 korrelierte gut mit dem Gleason Grad des
Prostatakarzinoms.
-
TABELLE
1
Thymosin β15 Expression in menschlichem Prostatakarzinom
-
Die Erfindung wurde einschließlich des
bevorzugten Ausführungs beispiels
derselben detailliert beschrieben. Es wäre wünschenswert, dass Fachleute
auf auf dieser Offenbarung fußenden Überlegungen
Modifikationen und Verbesserungen im Rahmen der Erfindung, wie sie
in den Ansprüchen
dargestellt ist, durchführen
können.
-
Sequenzliste
-
- (1) Allgemeine Informationen
- (i) Anmelder: Bruce R. Zetter und Lere Bao
- (ii) Titel der Erfindung: Verfahren zur Diagnose und Prognose
von Krebs
- (iii) Anzahl der Sequenzen: 8
- (iv) Korrespondenzadresse:
- (A) Empfänger:
Dike, Bronstein, Roberts & Cushman
- (B) Strasse: 130 Water Street
- (C) Stadt: Boston
- (D) Staat: MA
- (E) Land: USA
- (F) PLZ: 02019
- (v) Computerlesbare Form:
- (A) Art des Mediums: Diskette
- (B) Computer: IBM kompatibel
- (C) Arbeitssystem: DOS
- (D) Software: FastSEQ Version 1.5
- (vi) gegenwärtige
Anmeldedaten:
- (A) Anmeldenummer:
- (B) Anmeldedatum: 17. Juni 1996
- (C) Klassifikation:
- (vii) frühere
Anmeldedaten:
- (A) Anmeldenummer:
- (B) Anmeldedatum:
- (viii) Anwalt – Informationen
- (A) Name: David, Resnick S
- (B) Registrierungsnr.: 34.235
- (C) Referenz-/Registernr.: 46403
- (ix) Telekommunikations – Informationen
- (A) Telefon: 617-523-3400
- (B) Telefax: 617-523-6440
- (C) Telex: 200291 STRE
- (2) Informationen über
SEQ ID Nr. 1:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge:
412 Basenpaare
- (B) Typus: Nucleinsäure
- (C) Strängigkeit:
einzel
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekül
Typ: cDNA
- (iii) hypothetisch: nein
- (iv) Antisense: nein
- (v) Fragment Typ:
- (vi) Originalquelle:
- (ix) Eigenschaft:
- (A) Name/Schlüssel:
Kodierungssequenz
- (B) Lage: 98...232
- (D) andere Information: Exon 1
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 1:
- (2) Information über
SEQ ID Nr.: 2:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge:
45 Aminosäuren
- (B) Typus: Aminosäure
- (C) Strängigkeit:
einzel
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekül
Typ: Protein
- (iii) hypothetisch: nein
- (iv) Antisense: nein
- (v) Fragment Typ: intern
- (vi) Originalquelle:
- (xi) Sequenzbeschreibung : SEQ ID Nr. 2:
- (2) Information über
SEQ ID Nr. 3:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge:
24 Basenpaare
- (B) Typus: Nucleinsäure
- (C) Strängigkeit:
einzel
- (D) Typologie: linear
- (ii) Molekül
Typ: cDNA
- (iii) hypothetisch: nein
- (iv) Antisense: nein
- (v) Fragment Typ:
- (vi) Originalquelle:
- (xi) Sequenzbeschreibung : SEQ ID Nr. 3:
- (2) Information über
SEQ ID Nr. 4:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge:
24 Basenpaare
- (B) Typus: Nucleinsäure
- (C) Strängigkeit:
einzel
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekül
Typ: cDNA
- (iii) hypothetisch: nein
- (iv) Antisense: nein
- (v) Fragment Typ:
- (vi) Originalquelle:
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 4:
- (2) Information über
SEQ ID Nr. 5:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge:
24 Basenpaare
- (B) Typus: Nucleinsäure
- (C) Strängigkeit:
einzel
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp:
cDNA
- (iii) hypothetisch: nein
- (iv) Antisense: nein
- (v) Fragmenttyp:
- (vi) Originalquelle:
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 5:
- (2) Information über
SEQ ID Nr.: 6:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge:
26 Basenpaare
- (B) Typus: Nucleinsäure
- (C) Strängigkeit:
einzel
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp:
cDNA
- (iii) hypothetisch: nein
- (iv) Antisense: nein
- (v) Fragmenttyp:
- (vi) Originalquelle:
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 6:
- (2) Information über
SEQ ID Nr. 7:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge:
24 Basenpaare
- (B) Typus: Nucleinsäure
- (C) Strängigkeit:
einzel
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp:
cDNA
- (iii) hypothetisch: nein
- (iv) Antisense: nein
- (v) Fragmenttyp:
- (vi) Originalquelle
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 7:
- (2) Information über
SEQ ID Nr. 8:
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (A) Länge:
24 Basenpaare
- (B) Typus: Nucleinsäure
- (C) Strängigkeit:
einzel
- (D) Topologie: linear
- (ii) Molekültyp:
cDNA
- (iii) hypothetisch: nein
- (iv) Antisense: nein
- (v) Fragmenttyp:
- (vi) Originalquelle:
- (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 8: