DE69831222T2

DE69831222T2 - Verbindungen zur immundiagnose von prostatakrebs und deren verwendung

Info

Publication number: DE69831222T2
Application number: DE69831222T
Authority: DE
Inventors: Jiangchun Xu; C. Davin DILLON
Original assignee: Corixa Corp
Current assignee: Corixa Corp
Priority date: 1997-02-25
Filing date: 1998-02-25
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2018-02-26
Also published as: JP2007114212A; DK0972201T3; WO1998037418A3; JP2001513886A; US20020081580A1; ES2248891T3; EP1630235A3; IL131539A0; EP0972201B1; EP1630235A2; JP2008249727A; EP0972201A2; BR9807734A; WO1998037418A2; AR012035A1; CO4870792A1; CA2281954A1; US6887660B2; JP2006201187A; DE69831222D1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Behandlung und Beobachtung von Prostatakrebs. Die Erfindung betrifft ganz besonders Polypeptide, die mindestens einen Teil eines Prostata-Proteins umfassen. Derartige Polypeptide können für die Herstellung von Verbindungen, wie zum Beispiel Antikörpern, verwendet werden, die für das Diagnostizieren und die Beobachtung des Verlaufs von Prostatakrebs und möglicherweise anderen Tumorarten in einem Patienten nützlich sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Prostatakrebs ist die häufigste Form von Krebs unter Männern, mit einem geschätzten Vorkommen von 30% bei Männern im Alter von über 50. Überwältigende klinische Evidenz zeigt, dass menschlicher Prostatakrebs die Neigung hat, Knochen zu metastasieren, und die Erkrankung scheint unvermeidlich von einem Androgen-abhängigen in einen Androgen-unempfänglichen Zustand fortzuschreiten, was zu erhöhter Patientensterblichkeit führt. Diese vorherrschende Erkrankung ist derzeit an zweiter Stelle als Ursache von Krebstod unter Männern in den USA.
Trotz beträchtlicher Forschung in Richtung Diagnose und Therapie der Erkrankung bleibt Prostatakrebs schwierig zu detektieren und zu behandeln. Gewöhnlich beruht die Behandlung auf chirurgischem Eingriff und/oder Bestrahlungstherapie, aber diese Verfahren sind bei einem signifikanten Prozentsatz der Fälle unwirksam. Zwei früher identifizierte Prostata-spezifische Proteine – Prostata-spezifisches Antigen (PSA) und saure Prostataphosphatase (PAP) – haben begrenztes diagnostisches und therapeutisches Potential. PSA-Niveaus korrelieren beispielsweise nicht immer gut mit der Gegenwart von Prostatakrebs, indem sie in einem Prozentsatz von nicht-Prostatakrebs-Fällen positiv sind, einschließlich benigner Prostatahyperplasie (BPH). Überdies korrelieren PSA-Messungen mit dem Prostatavolumen und zeigen den Grad der Metastase nicht an.
Demgemäß verbleibt im Fachgebiet ein Bedarf für verbesserte und diagnostische Verfahren für Prostatakrebs.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Immundiagnose von Prostatakrebs bereit, zusammen mit Kits zur Verwendung in derartigen Verfahren. Es werden Polypeptide offenbart, die mindestens einen immunogenen Teil eines Prostatatumor-Proteins oder eine Variante des besagten Proteins umfassen, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet, wobei das Prostatatumor-Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch ein DNA-Molekül kodiert wird, welches eine Sequenz hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotidsequenzen rezitiert in SEQ ID NOs: 2–3, 74 und 107 und Varianten davon. Derartige Polypeptide können in der Diagnose und Beobachtung von Prostatakrebs nutzbringend eingesetzt werden.
In einem spezifischen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren für das Detektieren von Prostatakrebs in einem Patienten bereitgestellt, umfassend: (a) Das Kontaktieren einer biologischen Probe, welche von einem Patienten erhalten wurde, mit einem Bindungsmittel, das in der Lage ist, an eines der oben erwähnten Polypeptide zu binden; und (b) Das Detektieren eines Proteins oder Polypeptids in der Probe, das an das Bindungsmittel bindet. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Bindungsmittel ein Antikörper, am meisten bevorzugt wird ein monoklonaler Antikörper.
In verwandten Aspekten werden Verfahren zur Beobachtung des Verlaufs von Prostatakrebs in einem Patienten bereitgestellt, umfassend: (a) Das Kontaktieren einer biologischen Probe, welche von einem Patienten erhalten wurde, mit einem Bindungsmittel, das in der Lage ist, an eines der oben erwähnten Polypeptide zu binden; (b) Die Bestimmung der Menge von einem Protein oder Polypeptid in der Probe, das an das Bindungsmittel bindet; (c) Die Wiederholung der Schritte (a) und (b); und das Vergleichen der Mengen an Polypeptid, das in den Schritten (b) und (c) detektiert wurde.
In verwandten Aspekten stellt die vorliegende Erfindung Antikörper, vorzugsweise monoklonale Antikörper, bereit, die an die erfinderischen Polypeptide binden, ebenso wie diagnostische Kits, umfassend derartige Antikörper, und Verfahren zur Verwendung derartiger Antikörper, um die Entwicklung von Prostatakrebs zu hemmen.
Die vorliegende Erfindung stellt überdies Verfahren für das Detektieren von Prostatakrebs bereit, umfassend: (a) Das Erhalten einer biologischen Probe von einem Patienten; (b) Das Kontaktieren der Probe mit einem ersten und einem zweiten Oligonukleotid-Primer in einer Polymerase-Ketten-Reaktion, wobei mindestens der eine von den Oligonukleotid-Primern spezifisch ist für ein DNA Molekül, welches eines der oben erwähnten Polypeptide kodiert; und (c) Das Detektieren einer DNA Sequenz in der Probe, welche in Gegenwart des ersten und zweiten Oligonukleotid-Primers amplifiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst mindestens einer der Oligonukleotid- Primer mindestens etwa 10 zusammenhängende Nukleotide eines DNA Moleküls, welches eine partielle Sequenz hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 2–3, 74 und 107.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Detektion von Prostatakrebs in einem Patienten bereit, umfassend: (a) Das Erhalten einer biologischen Probe von dem Patienten; (b) Das Kontaktieren der Probe mit einer Oligonukleotidprobe, welche spezifisch ist für ein DNA Molekül, das eines der oben erwähnten Polypeptide kodiert; und (c) Das Detektieren einer DNA Sequenz in der Probe, welche an die Oligonukleotidprobe hybridisiert. Vorzugsweise umfasst die Oligonukleotidprobe mindestens etwa 15 zusammenhängende Nukleotide eines DNA Moleküls, welches eine partielle Sequenz hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 2–3, 74 und 107.
In verwandten Aspekten werden diagnostische Kits bereitgestellt, umfassend die oben erwähnten Oligonukleotidproben oder -primer.
Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nach Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die angefügten Zeichnungen offensichtlich werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie oben angemerkt richtet sich die vorliegende Erfindung im Allgemeinen auf Zusammensetzungen und Verfahren für die Immundiagnose und Beobachtung von Prostatakrebs. Die erfinderischen Zusammensetzungen sind im Allgemeinen Polypeptide, die mindestens einen Teil eines Prostatatumor-Proteins umfassen. In der vorliegenden Erfindung sind auch Moleküle (wie zum Beispiel ein Antikörper oder ein Fragment davon) eingeschlossen, die an die erfinderischen Polypeptide binden. Derartige Moleküle werden hierin als "Bindungsmittel" bezeichnet.
Insbesondere offenbart die gegenständliche Erfindung Polypeptide, umfassend mindestens einen Teil eines menschlichen Prostatatumor-Proteins, oder eine Variante von einem derartigen Protein, wobei das Prostatatumor-Protein eine Aminosäuresequenz einschließt, die durch ein DNA Molekül kodiert wird, welches eine Sequenz hat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Nukleotidsequenzen, die in SEQ ID NOs: 2–3, 4 und 107 rezitiert werden, den Komplementen der besagten Nukleotidsequenzen und Varianten davon, die mindestens 70% Identität zu der besagten Nukleotidsequenz aufweisen. Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff „Polypeptid" Aminosäureketten jeder Länge, einschließlich Proteinen voller Länge, wobei die Aminosäurereste durch kovalen te Peptidbindungen verbunden sind. Daher kann ein Polypeptid, umfassend einen Teil eines der oben erwähnten Prostata-Proteine, ganz aus dem Teil bestehen, oder der Teil kann in einem größeren Polypeptid vorliegen, das zusätzliche Sequenzen enthält. Die zusätzlichen Sequenzen können aus dem nativen Protein abgeleitet sein oder können heterolog sein, und derartige Sequenzen können immunreaktiv und/oder antigen sein.
Wie hierin verwendet, ist ein „immunogener Teil" eines menschlichen Prostatatumor-Proteins ein Teil, der in der Lage ist, eine Immunreaktion in einem Patienten, dem Prostatakrebs auferlegt ist, auszulösen, und der als solcher an Antikörper bindet, die in den Seren aus einem Prostatakrebs-Patienten vorliegen. Immunogene Teile der hierin beschriebenen Proteine können daher in Antikörper- Bindungsassays identifiziert werden. Derartige Assays können im Allgemeinen unter Verwendung jedes beliebigen aus einer Vielzahl von Mitteln durchgeführt werden, die Fachleuten bekannt sind, wie zum Beispiel in Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988, beschrieben. Ein Polypeptid kann beispielsweise auf einem festen Untergrund immobilisiert werden (wie nachstehend beschrieben) und mit Patientenseren kontaktiert werden, um das Binden von Antikörpern in Seren an das immobilisierte Polypeptid zuzulassen. Ungebundene Seren können dann entfernt und gebundene Antikörper unter Verwendung von beispielsweise ¹²⁵I-markiertem Protein A detektiert werden. Alternativ dazu kann ein Polypeptid verwendet werden, um monoklonale und polyklonale Antikörper zur Verwendung bei der Detektion des Polypeptids in Blut und anderen Flüssigkeiten von Prostatakrebs-Patienten zu erzeugen.
Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen auch Varianten der oben erwähnten Polypeptide und DNA Moleküle. Eine Polypeptid„variante" ist, wie hierin verwendet, ein Polypeptid, dass sich von dem rezitierten Polypeptid nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet, sodass die therapeutischen, antigenen und/oder immunogenen Eigenschaften des Polypeptids erhalten bleiben. Polypeptidvarianten weisen mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt mindestens etwa 90% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95% Identität zu den identifizierten Polypeptiden auf. Für Prostatatumor-Polypeptide mit immunreaktiven Eigenschaften können Varianten alternativ dazu durch das Modifizieren der Aminosäuresequenz eines der oben erwähnten Polypeptide und durch das Auswerten der Immunreaktivität des modifizierten Polypeptids identifiziert werden. Für Prostatatumor-Polypeptide, die nützlich zur Erzeugung diagnostischer Bindungsmittel sind, kann eine Variante durch das Auswerten eines modifizierten Polypeptids bezüglich seiner Fähigkeit, Antikörper zu erzeugen, die die Gegenwart oder Abwesenheit von Prostatakrebs detektieren, identifiziert werden. Derartige modifizierte Sequenzen können beispielsweise unter Verwendung der hierin beschriebenen repräsentativen Verfahren hergestellt und getestet werden.
Wie hierin verwendet ist eine "konservative Substitution^„ eine, in welcher eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure, die ähnliche Eigenschaften hat, substituiert wird, sodass ein Fachmann in Peptidchemie erwarten würde, dass die Sekundärstruktur und hydropathische Beschaffenheit des Polypeptids im Wesentlichen unverändert sein würde. Im Allgemeinen stellen die folgenden Gruppen von Aminosäuren konservative Änderungen dar: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; und (5) phe, tyr, trp, his.
Varianten können auch oder alternativ dazu andere Modifikationen enthalten, einschließlich der Deletion oder Hinzufügung von Aminosäuren, die einen minimalen Einfluss auf die antigenen Eigenschaften, die Sekundärstruktur und die hydropathische Beschaffenheit des Polypeptids haben. Ein Polypeptid kann beispielsweise an eine Signal-(oder Leader-)Sequenz am N-terminalen Ende des Proteins konjugiert sein, die kotranslational oder posttranslational den Transfer des Proteins steuert. Das Polypeptid kann auch an einen Linker oder eine andere Sequenz zur Erleichterung der Synthese, Reinigung oder Identifikation des Polypeptids (z. B. poly-His) konjugiert werden, oder um die Bindung des Polypeptids an einen festen Untergrund zu verbessern. Ein Polypeptid kann beispielsweise an eine Immunglobulin-Fc-Region konjugiert werden.
Eine Nukleotid„variante" ist eine Sequenz, die sich von der rezitierten Nukleotidsequenz darin unterscheidet, dass sie eine oder mehrere Nukleotiddeletionen, -substitutionen oder -hinzufügungen hat. Derartige Modifikationen können unter Verwendung von Standard-Mutagenesetechniken leicht eingeführt werden, wie zum Beispiel Oligonukleotid-gesteuerte ortsspezifische Mutagenese, wie beispielsweise von Adelman et al. (DNA, 2: 183, 1983) gelehrt wird. Nukleotidvarianten können natürlich vorkommende allelische Varianten oder nicht natürlich vorkommende Varianten sein. Variante Nukleotidsequenzen weisen mindestens etwa 70%, stärker bevorzugt mindestens etwa 80% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 90% Identität zu der rezitierten Sequenz auf. Derartige variante Nukleotidsequenzen werden im Allgemeinen unter stringenten Bedingungen an die rezitierte Sequenz hybridisieren. Wie hierin verwendet, bezieht sich „stringente Bedingungen" auf das Vorwaschen in einer Lösung von 6 × SSC, 0,2% SDS; das Hybridisieren bei 65°C, 6 × SSC, 0,2% SDS über Nacht; gefolgt von zwei Waschungen von jeweils 30 Minuten in 1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C und zwei Waschungen von jeweils 30 Minuten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C.
Wie hierin verwendet schließt "Polypeptide^„ auch Kombinations- oder Fusionspolypeptide ein. Ein „Kombinationspolypeptid" ist ein Polypeptid, das mindestens einen der oben erwähnten immunogenen Teile und eine oder mehrere zusätzliche immunogene Prostatatumor-spezifische Sequenzen umfasst, die mittels einer Peptidverbindung zu einer einzigen Aminosäurekette verbunden sind. Die Sequenzen können direkt verbunden sein (d. h. ohne dazwischenliegende Aminosäuren) oder können durch eine gebundene Sequenz (z. B. Gly-Cys-Gly), die die immunogenen Eigenschaften der Polypeptid-Komponenten nicht signifikant verringert, verbunden werden.
Die Prostatatumor-Proteine der vorliegenden Erfindung und DNA Moleküle, die derartige Proteine kodieren, können aus Prostatatumor-Gewebe unter Verwendung jedes beliebigen einer Vielzahl von Verfahren, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, isoliert werden. DNA Sequenzen, die einem Gen entsprechen (oder einem Teil davon), das eines der erfinderischen Prostatatumor-Proteine kodiert, können aus einer Prostatatumor-cDNA-Bank unter Verwendung einer Subtraktionstechnik wie nachstehend im Detail beschrieben isoliert werden. Beispiele derartiger DNA Sequenzen werden in SEQ ID NOs: 1–107, 109–111, 115–171, 173–175, 177 und 179–224 bereitgestellt. So erhaltene partielle DNA Sequenzen können verwendet werden, um Oligonukleotid-Primer für die Amplifikation von DNA Sequenzen voller Länge in einer Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) unter Verwendung von Techniken, die im Fachgebiet wohlbekannt sind (siehe zum Beispiel Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263, 1987; Erlich, Hrsg. PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989), zu gestalten. Sobald eine DNA Sequenz, die ein Polypeptid kodiert, erhalten wird, kann jede oben erwähnte Modifikation unter Verwendung von Standard-Mutagenesetechniken leicht eingeführt werden, wie zum Beispiel Oligonukleotid-gesteuerte ortsspezifische Mutagenese, wie von, beispielsweise, Adelman et al. (DNA, 2: 183, 1983) gelehrt wird.
Die hierin offenbarten Prostatatumor-Polypeptide können auch durch synthetische oder rekombinante Mittel erzeugt werden. Synthetische Polypeptide, die weniger als etwa 100 Aminosäuren und im Allgemeinen weniger als etwa 50 Aminosäuren haben, können unter Verwendung von Techniken, die Fachleuten wohlbekannt sind, erzeugt werden. Derartige Polypeptide können beispielsweise unter Verwendung jeder im Handel erhältlichen Festphasen-Technik synthetisiert werden, wie zum Beispiel des Merrifield-Verfahrens für Festphasen-Synthese, wo die Aminosäuren nacheinander zu einer wachsenden Aminosäurekette hinzugefügt werden (siehe beispielsweise Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2146, 1963). Eine Anlage für die automatisierte Synthese von Polypeptiden ist von Händlern, wie zum Beispiel Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA), im Handel erhältlich und kann gemäß den Anleitungen des Herstellers betrieben werden.
Alternativ dazu kann jedes der oben erwähnten Polypeptide durch das Einfügen einer das Polypeptid kodierenden DNA Sequenz in einen Expressionsvektor und das Exprimieren des Proteins in einem geeigneten Wirt rekombinant hergestellt werden. Jeder beliebige aus einer Vielzahl von Expressionsvektoren, die Fachleuten bekannt sind, kann eingesetzt werden, um rekombinante Polypeptide dieser Erfindung zu exprimieren. Die Expression kann in jeder passenden Wirtszelle erreicht werden, die mit einem Expressionsvektor transformiert oder transfiziert worden ist, der ein DNA Molekül enthält, das ein rekombinantes Polypeptid kodiert. Geeignete Wirtszellen schließen Prokaryoten, Hefe und höhere eukaryotische Zellen ein. Vorzugsweise sind die eingesetzten Wirtszellen E. coli, Hefe oder eine Säugerzelllinie, wie zum Beispiel CHO-Zellen. Die auf diese Weise exprimierten DNA Sequenzen können natürlich vorkommende Polypeptide, Teile natürlich vorkommender Polypeptide oder andere Varianten davon kodieren.
Im Allgemeinen werden die hierin offenbarten Polypeptide ungeachtet ihres Herstellungsverfahrens in im Wesentlichen reiner Form hergestellt (d. h. die Polypeptide sind, wie durch Aminosäurezusammensetzung und Analyse der Primärsequenz bestimmt, homogen). Vorzugsweise sind die Polypeptide mindestens etwa 90% rein, stärker bevorzugt mindestens etwa 95% rein und am meisten bevorzugt mindestens etwa 99% rein. In bestimmten Ausführungsformen, die nachstehend detaillierter beschrieben werden, werden die im Wesentlichen reinen Polypeptide zur Verwendung in einem oder mehreren der hierin offenbarten Verfahren in pharmazeutische Zusammensetzungen oder Impfstoffe eingebracht.
In einem verwandten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Fusionsproteine bereit, die ein erstes und zweites erfinderisches Polypeptid umfassen oder alternativ dazu ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung und ein bekanntes Prostata-Antigen, zusammen mit Varianten derartiger Fusionsproteine. Die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung können auch ein Linker-Peptid zwischen dem ersten und zweiten Polypeptid einschließen.
Eine DNA Sequenz, die ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung kodiert, wird unter Verwendung bekannter rekombinanter DNA Techniken konstruiert, um getrennte DNA Sequenzen, die das erste und zweite Polypeptid kodieren, zu einem geeigneten Expressionsvektor zusammenzusetzen. Das 3' Ende einer DNA Sequenz, die das erste Polypeptid kodiert, wird mit oder ohne Peptid-Linker an das 5' Ende einer DNA Sequenz, die das zweite Polypeptid kodiert, ligiert, sodass die Leserahmen der Sequenzen in Phase sind, um die mRNA-Translation der beiden DNA Sequenzen zu einem einzigen Fusionsprotein zu erlauben, das die biologische Aktivität sowohl des ersten als auch des zweiten Polypeptids beibehält.
Eine Peptid-Linkersequenz kann eingesetzt werden, um das erste und zweite Polypeptid durch einen ausreichenden Abstand zu trennen, um sicherzustellen, dass sich jedes Polypeptid in seine Sekundär- und Tertiärstruktur faltet. Eine derartige Peptid-Linkersequenz wird in das Fusionsprotein unter Verwendung von Standardtechniken, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, eingebracht. Geeignete Peptid-Linkersequenzen können auf den folgenden Faktoren beruhend ausgewählt werden: (1) Ihre Fähigkeit, eine flexible ausgestreckte Konformation einzunehmen; (2) Ihre Unfähigkeit, eine Sekundärstruktur anzunehmen, die mit bifunktionellen Epitopen auf dem ersten und zweiten Polypeptid interagieren könnte; und (3) Das Fehlen hydrophober oder geladener Reste, die mit den funktionellen Polypeptid-Epitopen reagieren könnten. Bevorzugte Peptid-Linkersequenzen enthalten Gly-, Asn- und Ser-Reste. Andere fast neutrale Aminosäuren, wie zum Beispiel Thr und Ala können auch in der Linkersequenz verwendet werden. Aminosäuresequenzen, die als Linker nutzbringend eingesetzt werden können, schließen jene in Maratea et al., Gene 40: 39–46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258–8262, 1986; US Patent Nr. 4.935.233 und US Patent Nr. 4.751.180 offenbarten ein. Die Linkersequenz kann 1 bis etwa 50 Aminosäuren lang sein. Peptidsequenzen sind nicht erforderlich, wenn das erste und zweite Polypeptid nicht essentielle N-terminale Aminosäureregionen haben, die verwendet werden können, um die funktionellen Domänen zu trennen und sterische Interferenz zu verhindern.
Die ligierten DNA Sequenzen sind mit geeigneten transkriptionellen oder translationalen regulatorischen Elementen funktionell verbunden. Die für die Expression von DNA verantwortlichen regulatorischen Elemente befinden sich nur 5' von der DNA Sequenz, die das erste Polypeptid kodiert. Auf ähnliche Weise liegen Stopp-Kodons, die zum Beenden der Translation erforderlich sind, und Transkriptionsterminationssignale nur 3' der DNA Sequenz, die das zweite Polypeptid kodiert.
Polypeptide und/oder Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Bindungsmittel zu erzeugen, wie zum Beispiel Antikörper oder Fragmente davon, die in der Lage sind, metastatische menschliche Prostatatumoren zu detektieren. Bindungsmittel der vorliegenden Erfindung können im Allgemeinen unter Verwendung von Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, hergestellt werden, einschließlich der hierin beschriebenen repräsentativen Verfahren. Bindungsmittel sind in der Lage, unter Verwendung des hierin beschriebenen repräsentativen Assays zwischen Patienten mit und ohne Prostatakrebs zu unterscheiden. Mit anderen Worten werden Antikörper oder andere Bindungsmittel, die gegen ein Prostatatumor-Protein oder einen geeigneten Teil davon erzeugt werden, ein Signal erzeugen, dass die Gegenwart eines primären oder metastatischen Prostatakrebses in mindestens etwa 20% der Patienten anzeigt, die von der Erkrankung befallen sind, und wird ein negatives Signal erzeugen, das die Abwesenheit der Erkrankung in mindestens etwa 90% der Individuen ohne primären oder metastatischen Prostatakrebs anzeigt. Geeignete Teile derartiger Prostatatumor-Proteine sind Teile, die ein Bindungsmittel erzeugen können, das die Gegenwart von primärem oder metastatischem Prostatakrebs in im Wesentlichen allen (d. h. mindestens etwa 80%, und vorzugsweise mindestens etwa 90%) Patienten anzeigt, für die Prostatakrebs unter Verwendung des Proteins voller Länge angezeigt würde, und das die Abwesenheit von Prostatakrebs in im Wesentlichen allen Proben anzeigt, die negativ wären, wenn sie mit dem Protein voller Länge getestet würden. Die nachstehend beschriebenen repräsentativen Assays, wie zum Beispiel der Sandwich Assay mit zwei Antikörpern, können im Allgemeinen eingesetzt werden, um die Fähigkeit eines Bindungsmittels, metastatische menschliche Prostatatumoren zu detektieren, auszuwerten.
Die Fähigkeit eines wie hierin beschrieben hergestellten Polypeptids und/oder Fusionsproteins, Antikörper zu erzeugen, die in der Lage sind, primäre oder metastatische Prostatatumoren zu detektieren, kann im Allgemeinen durch das Erzeugen eines oder mehrerer Antikörper gegen das Polypeptid (beispielsweise unter Verwendung eines hierin beschriebenen repräsentativen Verfahrens) und das Bestimmen der Fähigkeit derartiger Antikörper, derartige Tumoren in Patienten zu detektieren, ausgewertet werden. Diese Bestimmung kann durch das Analysieren biologischer Proben aus Patienten mit und ohne primärem oder metastatischem Prostatakrebs auf die Gegenwart eines Polypeptids, das an die erzeugten Antikörper bindet, gemacht werden. Derartige Testassays können beispielsweise unter Verwendung eines nachstehend beschriebenen repräsentativen Verfahrens durchgeführt werden. Polypeptide, die zum Detektieren von mindestens 20% der primären oder metastatischen Prostatatumoren fähige Antikörper durch derartige Verfahren erzeugen, werden als nützlich bei Assays für die Detektion primärer oder metastatischer Prostatatumoren betrachtet. Polypeptidspezifische Antikörper können allein oder in Kombination verwendet werden, um die Empfindlichkeit zu verbessern.
Zur Detektion primärer oder metastatischer menschlicher Prostatatumoren fähige Polypeptide und/oder Fusionsproteine können als Marker für das Diagnostizieren von Prostatakrebs oder für das Beobachten des Krankheitsverlaufs bei Patienten verwendet werden. In einer Ausführungsform kann Prostatakrebs bei einem Patienten durch das Auswerten einer von dem Patienten erhaltenen biologischen Probe auf die Menge eines oder mehrerer oben erwähnter Polypeptide relativ zu einem vorbestimmten Grenzwert diagnostiziert werden. Wie hierin verwendet, schließen geeignete „biologische Proben" Blut, Seren, Urin und/oder Prostatasekrete ein.
Der Spiegel eines oder mehrerer der oben erwähnten Polypeptide kann unter Ver wendung eines für das/die Polypeptid/e spezifischen Bindungsmittels ausgewertet werden. Ein „Bindungsmittel" im Zusammenhang dieser Erfindung ist ein Mittel (wie zum Beispiel eine Verbindung oder eine Zelle), das wie oben beschrieben an ein Polypeptid bindet. Wie hierin verwendet, bezieht sich „Bindung" auf eine nicht kovalente Assoziation zwischen zwei getrennten Molekülen (von denen jedes frei (d. h. in Lösung) sein oder auf der Oberfläche einer Zelle oder auf einem festen Untergrund vorliegen kann), so dass sich ein „Komplex" bildet. Ein derartiger Komplex kann frei oder auf einem Untergrundmaterial (entweder kovalent oder nicht kovalent) immobilisiert sein. Die Bindungsfähigkeit kann im Allgemeinen durch das Bestimmen einer Bindungskonstante für die Komplexbildung ausgewertet werden. Die Bindungskonstante ist der Wert, der erhalten wird, wenn die Konzentration des Komplexes durch das Produkt der Konzentrationen der Komponenten dividiert wird. Im Allgemeinen sagt man von zwei Verbindungen, dass sie im Zusammenhang der vorliegenden Verbindung „binden", wenn die Bindungskonstante für die Komplexbildung etwa 10³ l/mol übersteigt. Die Bindungskonstante kann unter Verwendung von Verfahren, die Fachleuten wohlbekannt sind, bestimmt werden.
Jedes Mittel, das den oben angegebenen Erfordernisse genügt, kann ein Bindungsmittel sein. Ein Bindungsmittel kann beispielsweise ein Ribosom mit oder ohne Peptidkomponente, ein RNA Molekül oder ein Peptid sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Bindungspartner ein Antikörper oder ein Fragment davon. Derartige Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Zusätzlich können die Antikörper einzelkettig, chimär, CDR-transplantiert oder humanisiert sein. Antikörper können durch die hierin beschriebenen Verfahren und durch andere Verfahren, die Fachleuten wohlbekannt sind, hergestellt werden.
Es gibt eine Vielzahl von Assayformaten, die dem Fachmann bekannt sind, für die Verwendung eines Bindungspartners, um Polypeptidmarker in einer Probe zu detektieren. Siehe z. B. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht der Assay die Verwendung eines Bindungspartners, der auf einem festen Untergrund immobilisiert ist, ein, um an das Polypeptid zu binden und es vom Rest der Probe zu entfernen. Das gebundene Polypeptid kann dann unter Verwendung eines zweiten Bindungspartners, der eine Reporter-Gruppe enthält, detektiert werden. Geeignete zweite Bindungspartner schließen Antikörper ein, die an den Bindungspartner-/Polypeptid-Komplex binden. Alternativ dazu kann ein kompetitiver Assay verwendet werden, bei dem ein Polypeptid mit einer Reporter-Gruppe markiert wird und man es nach Inkubation des Bindungspartners mit der Probe an den immobilisierten Bindungspartner binden lässt. Das Ausmaß, mit dem Komponenten der Probe das Binden des markierten Polypeptids an den Bindungspart ner hemmen, zeigt die Reaktivität der Probe mit dem immobilisierten Bindungspartner an.
Der feste Untergrund kann jedes Material, das Fachleuten bekannt ist, sein, an das sich das Antigen anlagern kann. Der feste Untergrund kann beispielsweise eine Testvertiefung in einer Mikrotiterplatte oder eine Nitrozellulose oder andere geeignete Membran sein. Alternativ dazu kann der Untergrund eine Kugel oder Scheibe, wie zum Beispiel Glas, Fiberglas, Latex oder ein Plastikmaterial, wie zum Beispiel Polystyrol oder Polyvinylchlorid, sein. Der Untergrund kann auch ein magnetisches Teilchen oder ein faseroptischer Sensor, wie zum Beispiel die in beispielsweise US Patent Nr. 5.359.681 offenbarten, sein. Das Bindungsmittel kann auf dem festen Untergrund unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken, die Fachleuten bekannt sind, immobilisiert werden, die im Patent und der wissenschaftlichen Literatur reichlich beschrieben werden. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Immobilisierung" sowohl auf nicht kovalente Assoziation, wie zum Beispiel Adsorption, als auch auf kovalente Anlagerung (die eine direkte Verbindung zwischen dem Antigen und funktionellen Gruppen auf dem Untergrund oder eine Verbindung durch ein Vernetzungsmittel sein kann). Immobilisierung durch Adsorption an eine Vertiefung in einer Mikrotiterplatte oder an eine Membran wird bevorzugt. In derartigen Fällen kann die Adsorption durch das Kontaktieren des Bindungsmittels mit dem festen Untergrund für einen geeigneten Zeitraum in einem geeigneten Puffer erreicht werden. Die Kontaktzeit variiert mit der Temperatur, liegt aber typischerweise zwischen etwa 1 Stunde und etwa 1 Tag. Im Allgemeinen genügt das Kontaktieren einer Vertiefung einer Plastik-Mikrotiterplatte (wie zum Beispiel Polystyrol oder Polyvinylchlorid) mit einer von etwa 10 ng bis etwa 10 μg und vorzugsweise etwa 100 ng bis etwa 1 μg reichenden Menge an Bindungsmittel, um eine adäquate Menge an Bindungsmittel zu immobilisieren.
Kovalente Anlagerung des Bindungsmittels an einen festen Untergrund kann im Allgemeinen erreicht werden, indem man den Untergrund zuerst mit einem bifunktionellen Reagenz reagieren lässt, das sowohl mit dem Untergrund als auch mit einer funktionellen Gruppe, wie zum Beispiel einer Hydroxyl- oder Aminogruppe auf dem Bindungsmittel reagieren wird. Das Bindungsmittel kann beispielsweise unter Verwendung von Benzochinon oder durch Kondensation einer Aldehydgruppe auf dem Untergrund mit einem Amin oder einem aktiven Wasserstoff auf dem Bindungspartner kovalent an Untergründe angelagert werden, die eine passende Polymer-Beschichtung haben (siehe zum Beispiel Pierce Immunotechnology Katalog und Handbuch, 1991, bei A12–A13).
In bestimmten Ausführungsformen ist der Assay ein Sandwich Assay mit zwei Antikörpern. Dieser Assay kann durchgeführt werden, indem zuerst ein Antikörper, der auf einem festen Untergrund immobilisiert worden ist, gewöhnlich der Vertiefung einer Mikrotiterplatte, mit der Probe kontaktiert wird, sodass man Polypeptide in der Probe an den immobilisierten Antikörper binden lässt. Ungebundene Probe wird dann von den immobilisierten Polypeptid-Antikörper-Komplexen entfernt und ein zweiter (eine Reporter-Gruppe enthaltender) Antikörper, der in der Lage ist, an eine andere Stelle auf dem Polypeptid zu binden, wird hinzugefügt. Die Menge an zweitem Antikörper, die an dem festen Untergrund gebunden bleibt, wird dann unter Verwendung von einem für die spezifische Reporter-Gruppe passenden Verfahren bestimmt.
Genauer gesagt, sobald der Antikörper wie oben beschrieben auf dem Untergrund immobilisiert wird, werden die verbleibenden Proteinbindungsstellen auf dem Untergrund typischerweise blockiert. Jedes geeignete, Fachleuten bekannte Blockierungsmittel, wie zum Beispiel Rinderserumalbumin oder Tween 20^TM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Der immobilisierte Antikörper wird dann mit der Probe inkubiert, und man lässt Polypeptid an den Antikörper binden. Die Probe kann vor der Inkubation mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, wie zum Beispiel phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), verdünnt werden. Im Allgemeinen ist eine passende Kontaktzeit (d. h. Inkubationszeit) der Zeitraum, der ausreicht, um die Gegenwart von Polypeptid in einer Probe zu detektieren, die von einem Individuum mit Prostatakrebs erhalten wurde. Vorzugsweise reicht die Kontaktzeit aus, um einen Bindungsgrad zu erreichen, der mindestens etwa 95% von dem ist, der im Gleichgewicht zwischen gebundenem und ungebundenem Polypeptid erreicht wird. Fachleute werden erkennen, dass die zum Erreichen des Gleichgewichts notwendige Zeit leicht durch Analysieren des Bindungsgrades, der über einen Zeitraum auftritt, bestimmt werden kann. Bei Raumtemperatur reicht eine Inkubationszeit von etwa 30 Minuten im Allgemeinen aus.
Ungebundene Probe kann dann durch Waschen des festen Untergrunds mit einem passenden Puffer, wie zum Beispiel PBS, das 0,1% Tween 20^TM enthält, entfernt werden. Der zweite Antikörper, der eine Reporter-Gruppe enthält, kann dann dem festen Untergrund hinzugefügt werden. Bevorzugte Reporter-Gruppen schließen Enzyme (wie zum Beispiel Meerrettich-Peroxidase), Substrate, Kofaktoren, Inhibitoren, Farbstoffe, Radionuklide, lumineszierende Gruppen, fluoreszierende Gruppen und Biotin ein. Die Konjugation von Antikörper an die Reporter-Gruppe kann unter Verwendung von Standardverfahren, die Fachleuten bekannt sind, erreicht werden.
Der zweite Antikörper wird dann mit dem immobilisierten Antikörper-/Polypeptid-Komplex für eine Zeitdauer inkubiert, die ausreicht, das gebundene Polypeptid zu detektieren. Eine passende Zeitdauer kann im Allgemeinen durch das Analysieren des Bindungsgrades bestimmt werden, der über einen Zeitraum auftritt. Ungebundener zweiter Antikörper wird dann entfernt und gebundener zweiter Antikörper wird unter Verwendung der Reporter-Gruppe detektiert. Das für das Detektieren der Reporter-Gruppe eingesetzte Verfahren hängt von der Beschaffenheit der Reporter-Gruppe ab. Für radioaktive Gruppen sind Szintillationszählung oder autoradiographische Verfahren im Allgemeinen passend. Spektroskopische Verfahren können verwendet werden, um Farbstoffe, lumineszierende Gruppen und fluoreszierende Gruppen zu detektieren. Biotin kann unter Verwendung von Avidin, das an eine andere Reporter-Gruppe (gewöhnlich eine radioaktive oder fluoreszierende Gruppe oder ein Enzym) gekoppelt ist, detektiert werden. Enzym-Reporter-Gruppen können im Allgemeinen durch die Hinzufügung von Substrat (im Allgemeinen für einen spezifischen Zeitraum) detektiert werden, gefolgt von spektroskopischer oder anderer Analyse der Reaktionsprodukte.
Um die Gegenwart oder Abwesenheit von Prostatakrebs zu bestimmen, wird das detektierte Signal der Reporter-Gruppe, die an den festen Untergrund gebunden bleibt, im Allgemeinen mit einem Signal verglichen, das einem vorbestimmten Grenzwert entspricht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Grenzwert das durchschnittliche mittlere Signal, das erhalten wird, wenn der immobilisierte Antikörper mit Proben von Patienten ohne Prostatakrebs inkubiert wird. Im Allgemeinen wird eine Probe, die ein Signal erzeugt, das drei Standardabweichungen über dem vorbestimmten Grenzwert liegt, als positiv für Prostatakrebs betrachtet. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform wird der Grenzwert unter Verwendung einer Receiver-Operator-Kurve gemäß dem Verfahren von Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown und Co., 1985, S. 106–7, bestimmt. Kurz gesagt, kann in dieser Ausführungsform der Grenzwert aus einer grafischen Darstellung von Paaren von Raten der wirklich Positiven (d. h. Empfindlichkeit) und Raten der falsch Positiven (100 Spezifität), die jedem möglichen Grenzwert für das diagnostische Testergebnis entsprechen, bestimmt werden. Der Grenzwert auf der grafischen Darstellung, der der oberen linken Ecke am nächsten ist (d. h. der Wert, der die größte Fläche umschließt) ist der genaueste Grenzwert, und eine Probe, die ein Signal erzeugt, das höher als der durch dieses Verfahren bestimmte Grenzwert ist, kann als positiv betrachtet werden. Alternativ dazu kann der Grenzwert entlang der grafischen Darstellung nach links verschoben werden, um die Rate der falsch Positiven zu minimieren, oder nach rechts, um die Rate der falsch Negativen zu minimieren. Im Allgemeinen wird eine Probe, die ein Signal erzeugt, das höher als der durch dieses Verfahren bestimmte Grenzwert ist, als positiv für Prostatakrebs betrachtet.
In einer verwandten Ausführungsform wird der Assay in einem Durchfluss- oder Streifentest-Format durchgeführt, wobei der Antikörper auf einer Membran, wie zum Beispiel Nitrozellulose, immobilisiert ist. Im Durchflusstest binden Polypeptide in der Probe an den immobilisierten Antikörper, während die Probe durch die Membran tritt. Ein zweiter, markierter Antikörper bindet dann an den Antikörper-/Polypeptid-Komplex, während eine den zweiten Antikörper enthaltende Lösung durch die Membran fließt. Das Detektieren von gebundenem zweiten Antikörper kann dann wie oben beschrieben durchgeführt werden. Im Streifentest-Format wird ein Ende der Membran, an die Antikörper gebunden ist, in eine Lösung getaucht, die die Probe enthält. Die Probe wandert entlang der Membran durch eine Region, die zweiten Antikörper enthält, und zum Bereich des immobilisierten Antikörpers. Eine Konzentration von zweitem Antikörper im Bereich des immobilisierten Antikörpers zeigt die Gegenwart von Prostatakrebs an. Typischerweise erzeugt die Konzentration von zweitem Antikörper an jener Stelle ein Muster, wie zum Beispiel eine Linie, die visuell abgelesen werden kann. Die Abwesenheit eines derartigen Musters zeigt ein negatives Ergebnis an. Im Allgemeinen wird die Menge an Antikörper, die auf der Membran immobilisiert ist, so gewählt, dass ein visuell unterscheidbares Muster erzeugt wird, wenn die biologische Probe eine Menge an Polypeptid enthält, die ausreichen würde, in dem oben diskutierten Format ein positives Signal im Sandwich Assay mit zwei Antikörpern zu erzeugen. Die auf der Membran immobilisierte Menge an Antikörper reicht von etwa 25 ng bis etwa 1 μg, und stärker bevorzugt von etwa 50 ng bis etwa 500 ng. Derartige Tests können typischerweise mit einer sehr kleinen Menge der biologischen Probe durchgeführt werden.
Natürlich existieren zahlreiche andere Assayprotokolle, die zur Verwendung mit den Antigenen oder Antikörpern der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Die oben erwähnten Beschreibungen sollen nur exemplarisch sein.
In einer anderen Ausführungsform können die oben erwähnten Polypeptide als Marker für den Verlauf von Prostatakrebs verwendet werden. In dieser Ausführungsform können Assays, wie sie oben für die Diagnose von Prostatakrebs beschrieben wurden, über die Zeit durchgeführt werden, und die Änderung in der Menge des reaktiven Polypeptids (der reaktiven Polypeptide) ausgewertet werden. Die Assays können beispielsweise alle 24–72 Stunden für einen Zeitraum von 6 Monaten bis 1 Jahr durchgeführt werden, und danach anschließend nach Bedarf durchgeführt werden. Im Allgemeinen schreitet Prostatakrebs in jenen Patienten voran, bei denen die Menge an durch das Bindungsmittel detektiertem Polypeptid mit der Zeit zunimmt. Im Gegensatz dazu schreitet Prostatakrebs nicht voran, wenn die Menge an reaktivem Polypeptid mit der Zeit entweder konstant bleibt oder abnimmt.
Antikörper zur Verwendung in den oben erwähnten Verfahren können durch jede beliebige einer Vielzahl von Techniken, die Fachleuten bekannt sind, hergestellt werden. Siehe z. B. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Bei einer derartigen Technik wird ein Immunogen, das das antigene Polypeptid umfasst, anfänglich in einen beliebigen einer großen Vielzahl von Säugern (z. B. Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schafe und Ziegen) injiziert. In diesem Schritt können die Polypeptide dieser Erfindung ohne Modifikation als Immunogen dienen. Alternativ dazu kann, besonders für relativ kurze Polypeptide, eine überlegene Immunantwort ausgelöst werden, wenn das Polypeptid mit einem Trägerprotein verbunden ist, wie zum Beispiel Rinderserumalbumin oder Keyhole-Limpet-Hämocyanin. Das Immunogen wird in den tierischen Wirt injiziert, vorzugsweise gemäß einem vorbestimmten Plan, der eine oder mehrere Booster-Immunisierungen einbringt, und die Tiere werden von Zeit zu Zeit geblutet. Für das Polypeptid spezifische polyklonale Antikörper können dann aus derartigen Antiseren durch beispielsweise Affinitätschromatographie unter Verwendung des an einen geeigneten festen Untergrund gekoppelten Polypeptids gereinigt werden.
Für das antigene Polypeptid von Interesse spezifische monoklonale Antikörper können beispielsweise unter Verwendung der Technik von Kohler und Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511–519, 1976, und Verbesserungen dazu hergestellt werden. Kurz gesagt beziehen diese Verfahren die Herstellung von unsterblichen Zelllinien ein, die in der Lage sind, Antikörper herzustellen, die die gewünschte Spezifität haben (d. h. Reaktivität mit dem Polypeptid von Interesse). Derartige Zelllinien können beispielsweise aus Milzzellen hergestellt werden, die von einem Tier erhalten werden, das wie oben beschrieben immunisiert wurde. Die Milzzellen werden dann beispielsweise durch Fusion mit einem Myelomzell-Fusionspartner unsterblich gemacht, vorzugsweise einem, der syngen mit dem immunisierten Tier ist. Eine Vielzahl von Fusionstechniken kann eingesetzt werden. Die Milzzellen und Myelomzellen können mit einem nichtionischen Detergenz einige Minuten lang kombiniert werden und dann bei niedriger Dichte auf einem selektiven Medium ausplattiert werden, das das Wachstum von Hybridzellen, aber nicht von Myelomzellen unterstützt. Eine bevorzugte Selektionstechnik verwendet die HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin) – Selektion. Nach einer ausreichenden Zeit, normalerweise etwa 1 bis 2 Wochen, werden Hybridkolonien beobachtet. Einzelne Kolonien werden selektiert und auf Bindungsaktivität gegen das Polypeptid getestet. Hybridome, die hohe Reaktivität und Spezifität haben, werden bevorzugt.
Monoklonale Antikörper können aus den Überständen wachsender Hybridomkolonien isoliert werden. Zusätzlich können verschiedene Techniken eingesetzt werden, um die Ausbeute zu verbessern, wie zum Beispiel Injektion der Hybridom-Zelllinie in die Peritonealhöhle eines geeigneten Wirtsvertebraten, wie zum Beispiel der Maus. Monoklonale Antikörper können dann aus der Ascitesflüssigkeit oder dem Blut isoliert werden. Verunreinigungen können von den Antikörpern durch übliche Techniken, wie zum Beispiel Chromatographie, Gelfiltration, Fällung und Extraktion entfernt werden. Die Polypeptide dieser Erfindung können im Reinigungsvorgang bei beispielsweise einem Affinitätschromatographieschritt verwendet werden.
Monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch als therapeutische Reagenzien verwendet werden, um Prostatatumore zu verringern oder zu eliminieren. Die Antikörper können allein (beispielsweise um Metastasen zu hemmen) oder an ein oder mehrere therapeutische Mittel gekoppelt verwendet werden. Geeignete Mittel in dieser Hinsicht schließen Radionuklide, Differenzierungsinduktoren, Arzneistoffe, Toxine und Derivate davon ein. Bevorzugte Radionuklide schließen ⁹⁰Y, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹¹At und ²¹²Bi ein. Bevorzugte Arzneistoffe schließen Methotrexat und Pyrimidin- und Purin-Analoga ein. Bevorzugte Differenzierungsinduktoren schließen Phorbolester und Buttersäure ein. Bevorzugte Toxine schließen Ricin, Abrin, Diphtherietoxin, Choleratoxin, Gelonin, Pseudomonas-Exotoxin, Shigellatoxin und das antivirale Protein aus Kermesbeere ein.
Ein therapeutisches Mittel kann an einen geeigneten monoklonalen Antikörper entweder direkt oder indirekt (z. B. mittels einer Linker-Gruppe) gekoppelt (z. B. kovalent gebunden) werden. Eine direkte Reaktion zwischen einem Mittel und einem Antikörper ist möglich, wenn jeder einen Substituenten besitzt, der in der Lage ist, mit dem anderen zu reagieren. Eine nukleophile Gruppe, wie zum Beispiel eine Amino- oder Sulfhydrylgruppe, auf einem kann beispielsweise in der Lage sein, mit einer carbonylhaltigen Gruppe, wie zum Beispiel einem Anhydrid oder einem Säurehalogenid, oder mit einer Alkylgruppe, die eine guten Abgangsgruppe (z. B. ein Halogenid) enthält, auf dem anderen zu reagieren.
Alternativ dazu kann es wünschenswert sein, ein therapeutisches Mittel und einen Antikörper mittels einer Linker-Gruppe zu koppeln. Eine Linker-Gruppe kann als ein Abstandshalter funktionieren, um einen Antikörper von einem Mittel fernzuhalten, um Interferenz mit den Bindungsfähigkeiten zu vermeiden. Eine Linker-Gruppe kann auch dazu dienen, die chemische Reaktivität eines Substituenten auf einem Mittel oder einem Antikörper zu erhöhen, und daher die Kopplungseffizienz zu erhörten. Eine Erhöhung in der chemischen Reaktivität kann auch die Verwendung von Mitteln, oder funktionellen Gruppen auf Mitteln, erleichtern, die ansonsten nicht möglich wäre.
Es wird Fachleuten offensichtlich sein, dass eine Vielzahl von bifunktionellen oder polyfunktionellen Reagenzien, sowohl homo- als auch heterofunktionell (wie zum Beispiel die im Katalog der Pierce Chemical Co., Rockford, IL beschriebenen) als Linker-Gruppe eingesetzt werden können. Das Koppeln kann beispielsweise durch Amino gruppen, Carboxylgruppen, Sulfhydrylgruppen oder oxidierte Kohlenhydratreste bewirkt werden. Es gibt zahlreiche Referenzen, die eine derartige Methodik beschreiben, z. B. US Patent Nr. 4.671.958 an Rodwell et al.
Wo ein therapeutisches Mittel wirksamer ist, wenn es von dem Antikörperteil der Immunkonjugate der vorliegenden Erfindung befreit ist, kann es wünschenswert sein, eine Linker-Gruppe zu verwenden, die während oder nach der Internalisierung in eine Zelle abspaltbar ist. Etliche verschiedene abspaltbare Linker-Gruppen sind beschrieben worden. Die Mechanismen für die intrazelluläre Freisetzung eines Mittels von diesen Linker-Gruppen schließen Spaltung durch Reduktion einer Disulfidbindung (z. B. US Patent Nr. 4.489.710 an Spitler), durch Bestrahlung einer photolabilen Bindung (z. B. US Patent Nr. 4.625.014 an Senter et al.), durch Hydrolyse derivatisierter Aminosäureseitenketten (z. B. US Patent Nr. 4.638.045 an Kohn et al.), durch Serum-Komplementvermittelte Hydrolyse (z. B. US Patent Nr. 4.671.958 an Rodwell et al.) und säurekatalysierte Hydrolyse (z. B. US Patent Nr. 4.569.789 an Blattler et al.) ein.
Es kann wünschenswert sein, mehr als ein Mittel an einen Antikörper zu koppeln. In einer Ausführungsform werden mehrere Moleküle eines Mittels an ein Antikörpermolekül gekoppelt. In einer anderen Ausführungsform kann mehr als eine Art von Mittel an einen Antikörper gekoppelt werden. Ungeachtet der jeweiligen Ausführungsform können Immunkonjugate mit mehr als einem Mittel auf eine Vielzahl von Weisen hergestellt werden. Beispielsweise kann mehr als ein Mittel direkt an ein Antikörpermolekül gekoppelt werden, oder Linker, die mehrere Stellen für die Anlagerung bereitstellen, können verwendet werden. Alternativ dazu kann ein Träger verwendet werden.
Ein Träger kann die Mittel auf eine Vielzahl von Weisen tragen, einschließlich kovalentem Binden, entweder direkt oder mittels einer Linker-Gruppe. Geeignete Träger schließen Proteine, wie zum Beispiel Albumine (z. B. US Patent Nr. 4.507.234 an Kato et al.), Peptide und Polysaccharide, wie zum Beispiel Aminodextran (z. B. US Patent Nr. 4.699.784 an Shih et al.), ein. Ein Träger kann ein Mittel auch durch nicht kovalente Bindung oder durch Einkapseln, wie zum Beispiel in einem Liposomvesikel (z. B. US Patent Nr. 4.429.008 und 4.873.088), tragen. Für Radionuklid-Mittel spezifische Träger schließen kleine radiohalogenierte Moleküle und chelatbildende Verbindungen ein. US Patent Nr. 4.735.792 offenbart beispielsweise repräsentative kleine radiohalogenierte Moleküle und ihre Synthese. Ein Radionuklid-Chelat kann aus chelatbildenden Verbindungen gebildet werden, die jene einschließen, die Stickstoff und Schwefelatome als Donoratome zur Bindung von Metall- oder Metalloxid-Radionukliden enthalten. US Patent Nr. 4.673.562 an Davison et al. offenbart beispielsweise repräsentative chelatbildende Verbindungen und ihre Synthese.
Eine Vielzahl von Verabreichungswegen für die Antikörper und Immunkonjugate können verwendet werden. Die Verabreichung wird typischerweise intravenös, intramuskulär, subkutan oder an die Unterlage eines herausgeschnittenen Tumors sein. Es wird offensichtlich sein, dass die genaue Dosis des Antikörper/Immunkonjugates in Abhängigkeit von dem verwendeten Antikörper, der Antigendichte auf dem Tumor, und der Clearance-Rate des Antikörpers variieren wird.
Diagnostische Reagenzien der vorliegenden Erfindung können auch DNA Sequenzen umfassen, die eines oder mehrere der oben erwähnten Polypeptide kodieren, oder einen oder mehrere Teile davon. Beispielsweise können mindestens zwei Oligonukleotid-Primer in einem auf einer Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) beruhenden Assay eingesetzt werden, um von einer biologischen Probe abgeleitete Prostatatumor-spezifische cDNA zu amplifizieren, wobei mindestens einer von den Oligonukleotid-Primern für ein DNA Molekül spezifisch ist, das ein Prostatatumor-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert. Die Gegenwart der amplifizierten cDNA wird dann unter Verwendung von Techniken, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, wie zum Beispiel Gelelektrophorese, detektiert. Auf ähnliche Weise können Oligonukleotidproben, die spezifisch für ein DNA Molekül sind, das ein Prostatatumor-Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, in einem Hybridisierungsassay verwendet werden, um die Gegenwart eines erfindungsgemäßen Polypeptids in einer biologischen Probe zu detektieren.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck für ein DNA Molekül spezifische/r Oligonukleotid-Primer/-Probe" eine Oligonukleotidsequenz, die mindestens etwa 80%, vorzugsweise mindestens etwa 90% and stärker bevorzugt mindestens etwa 95% Identität zu dem besagten DNA Molekül hat. Oligonukleotid-Primer und/oder -Proben die in den erfinderischen diagnostischen Verfahren nutzbringend eingesetzt werden können, haben vorzugsweise mindestens etwa 10–40 Nukleotide. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Oligonukleotid-Primer mindestens etwa 10 zusammenhängende Nukleotide eines DNA Moleküls, das eine Sequenz hat, ausgewählt aus SEQ ID NOs: 1–107, 109–111, 115–171, 173–175, 177 und 179–224. Vorzugsweise umfassen Oligonukleotidproben zur Verwendung in den erfinderischen diagnostischen Verfahren mindestens etwa 15 zusammenhängende Oligonukleotide eines DNA Moleküls, das eine Sequenz hat, die in SEQ ID NOs: 1–107, 109–111, 115–171, 173–175, 177 und 179–224 bereitgestellt wird. Techniken für sowohl auf PCR beruhende Assays als auch Hybridisierungsassays sind im Fachgebiet wohlbekannt (siehe beispielsweise Mullis et al. ebd.; Ehrlich, ebd.). Primer oder Proben können daher verwendet werden, um Prostatatumor-spezifische Sequenzen in biologischen Proben, einschließlich Blut, Samen, Prostatagewebe und/oder Prostatatumor-Gewebe, zu detektieren.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung, die einen immunogenen Teil eines Prostatatumor-Proteins umfassen, können auch für die Immuntherapie von Prostatakrebs verwendet werden, wobei das Polypeptid die eigene Immunreaktion des Patienten gegen Prostatatumor-Zellen stimuliert. In weiteren Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung von einem oder mehreren der immunreaktiven Polypeptide, die durch ein DNA Molekül kodiert werden, das eine Sequenz hat, die in SEQ ID NO: 2, 3, 74 und 107 bereitgestellt wird, (oder von DNA, die derartige Polypeptide kodiert) für die Immuntherapie von Prostatakrebs in einem Patienten bereit. Wie hierin verwendet, bezieht sich ein „Patient" auf jedes warmblütige Tier, vorzugsweise einen Menschen. Ein Patient kann von einer Erkrankung befallen sein, oder er kann frei von detektierbarer Erkrankung sein. Demgemäß können die oben erwähnten immunreaktiven Polypeptide verwendet werden, um Prostatakrebs zu behandeln oder die Entwicklung von Prostatakrebs zu hemmen. Die Polypeptide können entweder vor oder nach dem chirurgischen Entfernen von Primärtumoren und/oder der Behandlung durch Verabreichung von Strahlentherapie und gewöhnlichen chemotherapeutischen Arzneistoffen verabreicht werden.
In diesen Ausführungsformen liegt das Polypeptid im Allgemeinen in einer pharmazeutischen Zusammensetzung und/oder einem Impfstoff vor. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können ein oder mehrere Polypeptide umfassen, von denen jedes eine oder mehrere der oben erwähnten Sequenzen (oder Varianten davon) und einen physiologisch verträglichen Träger enthalten kann. Die Impfstoffe können ein oder mehrere derartige Polypeptide und einen unspezifischen Enhancer der Immunreaktion, wie zum Beispiel ein Adjuvans, eine biologisch abbaubare Mikrokugel (z. B. Polylactid-co-glycolid) oder ein Liposom (in welches das Polypeptid eingebracht ist) umfassen. Pharmazeutische Zusammensetzungen und Impfstoffe können auch andere Epitope von Prostatatumor-Antigenen enthalten, entweder in ein Kombinationspolypeptid (d. h. ein einzelnes Polypeptid, das mehrere Epitope enthält) eingebracht oder in einem getrennten Polypeptid vorliegend.
Alternativ dazu kann eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Impfstoff DNA enthalten, die eines oder mehrere der oben erwähnten Polypeptide kodiert, sodass das Polypeptid in situ erzeugt wird. In derartigen pharmazeutischen Zusammensetzungen und Impfstoffen kann die DNA in jedem beliebigen aus einer Vielzahl von Abgabesystemen, die Fachleuten bekannt sind, vorliegen, einschließlich Expressionssystemen für Nukleinsäuren, Bakterien und viralen Expressionssystemen. Passende Expressionssysteme für Nukleinsäuren enthalten die für Expression im Patienten notwendigen DNA Sequenzen (wie zum Beispiel einen geeigneten Promotor). Bakterielle Abgabesysteme beziehen die Verabreichung eines Bakteriums (wie zum Beispiel Bacillus-Calmette-Guerrin) ein, das ein Epitop eines Prostatazell-Antigens auf seiner Zelloberfläche exprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA unter Verwendung eines viralen Expressionssystems eingeführt werden (z. B. Vaccinia oder ein anderes Pockenvirus, Retrovirus oder Adenovirus), was die Verwendung eines nicht pathogenen (fehlerhaften), replikationskompetenten Virus einbeziehen kann. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Fisher-Hoch et al., PNAS 86: 317–321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569: 86–103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8: 17–21, 1990; US Patente Nr. 4.603.112, 4.769.330, und 5.017.487; WO 89/01973; US Patent Nr. 4.777.127; GB 2.200.651; EP 0.345.242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6: 616–627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252: 431–434, 1991; Kolls et al., PNAS 99: 215–219, 1994; Kass-Eisler et al., PNAS 90: 11498–11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88: 2838–2848, 1993; und Guzman et al., Cir. Res. 73: 1202–1207, 1993, offenbart. Techniken für das Einbeziehen von DNA in derartige Expressionssysteme sind Fachleuten wohlbekannt. Die DNA kann auch „nackt" sein, wie beispielsweise in der veröffentlichten PCT Anmeldung WO 90/11092, und in Ulmer et al., Science 259: 1745–1749, 1993, rezensiert von Cohen, Science 259: 1691–1692, 1993, beschrieben. Die Aufnahme nackter DNA kann durch das Beschichten der DNA auf biologisch abbaubare Kugeln erhöht werden, die effizient in die Zellen transportiert werden.
Wege und Häufigkeit der Verabreichung ebenso wie Dosierung werden von Individuum zu Individuum variieren und können den derzeit in der Immuntherapie anderer Erkrankungen verwendeten gleichen. Im Allgemeinen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Impfstoffe durch Injektion (z. B. intrakutan, intramuskulär, intravenös oder subkutan), intranasal (z. B. durch Aspiration) oder oral verabreicht werden. Zwischen 1 und 10 Dosen können über einen Zeitraum von 3–24 Wochen verabreicht werden. Vorzugsweise werden 4 Dosen in einem Abstand von 3 Monaten verabreicht, und Booster-Verabreichungen können danach regelmäßig gegeben werden. Alternative Protokolle können für einzelne Patienten passend sein. Eine geeignete Dosis ist eine Menge Polypeptid oder DNA, die wirksam ist, eine (zelluläre oder humorale) Immunreaktion gegen Prostatatumor-Zellen in einem behandelten Patienten zu erzeugen. Eine geeignete Immunreaktion liegt mindestens 10–50% über dem basalen (d. h. unbehandelten) Niveau. Im Allgemeinen reicht die in einer Dosis vorliegende (oder in situ durch die DNA in einer Dosis hergestellte) Menge Polypeptid von etwa 1 pg bis etwa 100 mg pro kg des Wirts, typischerweise von etwa 10 pg bis etwa 1 mg, und vorzugsweise von etwa 100 pg bis etwa 1 μg. Geeignete Dosisgrößen werden mit der Größe des Patienten variieren, werden aber typischerweise von etwa 0,01 ml bis etwa 5 ml reichen.
Während jeder geeignete Träger, der Fachleuten bekannt ist, bei den pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung eingesetzt werden kann, wird die Art des Trägers abhängig von der Verabreichungsweise variieren. Zur parenteralen Verabreichung, wie zum Beispiel subkutanen Injektion, umfasst der Träger vorzugsweise Wasser, Kochsalzlösung, Alkohol, ein Lipid, ein Wachs und/oder Puffer. Zur oralen Verabreichung kann jeder oben erwähnte Träger oder ein fester Träger, wie zum Beispiel Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Saccharose und/oder Magnesiumcarbonat, eingesetzt werden. Biologisch abbaubare Mikrokugeln (z. B. Polylactid-co-glycolid) können auch als Träger für die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung eingesetzt werden. Geeignete biologisch abbaubare Mikrokugeln werden beispielsweise in US Patent Nr. 4.897.268 und 5.075.109 offenbart.
Jeder beliebige aus einer Vielzahl von nicht spezifischen Immunreaktions-Enhancern kann in den Impfstoffen dieser Erfindung eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein Adjuvans eingeschlossen werden. Die meisten Adjuvantien enthalten einen Stoff, der so gestaltet ist, dass das Antigen vor schnellem Abbau geschützt wird, wie zum Beispiel Aluminiumhydroxid oder Mineralöl, und einen unspezifischen Stimulator der Immunreaktion, wie zum Beispiel Lipid A, Bordella pertussis oder Mycobacterium tuberculosis. Derartige Adjuvantien sind beispielsweise als Freund's Incomplete Adjuvant und Complete Adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, Mi) und Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ) im Handel erhältlich.
Hierin offenbarte Polypeptide können auch bei der ex vivo Behandlung von Prostatakrebs eingesetzt werden. Zellen des Immunsystems, wie zum Beispiel T-Zellen, können beispielsweise unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Zelltrennungssystems, wie zum Beispiel das CEPRATE^TM System von CellPro Incorporated (Bothell, WA) (siehe US Patent Nr. 5.240.856; US Patent Nr. 5.215.926; WO 89/06280; WO 91/16116 und WO 92/07243) aus dem peripheren Blut eines Patienten isoliert werden. Die getrennten Zellen werden mit einem oder mehreren der immunreaktiven Polypeptide stimuliert, die in einem Abgabevehikel, wie zum Beispiel einer Mikrokugel, enthalten sind, um Antigen-spezifische T-Zellen bereitzustellen. Die Population von Tumorantigenspezifischen T-Zellen wird dann unter Verwendung von Standardtechniken ausgeweitet und die Zellen werden zurück an den Patienten verabreicht.
Die folgenden Beispiele werden als Illustration und nicht als Beschränkung angeboten.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON PROSTATATUMOR-POLYPEPTIDEN
Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung von Prostatatumor-Polypeptiden aus einer Prostatatumor-cDNA-Bank.
Eine menschliche Prostatatumor-cDNA-Expressionsbank wurde aus Prostatatumor-poly A⁺-RNA unter Verwendung eines Superscript Plasmidsystem für cDNA-Synthese und Plasmidklonierungs-Kits (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD 20897) nach dem Protokoll des Herstellers konstruiert. Genau gesagt wurden Prostatatumor-Gewebe mit Polytron (Kinematica, Schweiz) homogenisiert und Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des Trizol-Reagenzes (BRL Life Technologies) wie durch den Hersteller angewiesen extrahiert. Die poly A⁺-RNA wurde dann unter Verwendung eines Qiagen Oligotex Spin-Säulen mRNA Reinigungs-Kits (Qiagen, Santa Clarita, CA 91355) gemäß dem Protokoll des Herstellers gereinigt. Die Erststrang-cDNA wurde unter Verwendung des NotI/Oligo-dT18 Primers synthetisiert. Doppelsträngige cDNA wurde synthetisiert, mit EcoRI/BAXI Adaptoren (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert und mit NotI verdaut. Nach der Größenfraktionierung mit Chroma Spin-1000 Säulen (Clontech, Palo Alto, CA 94303) wurde die cDNA in die EcoRI/NotI Stelle von pCDNA3.1 (Invitrogen) ligiert und durch Elektroporation in ElectroMax E. coli DH10B Zellen (BRL Life Technologies) transformiert.
Unter Verwendung des gleichen Verfahrens wurde eine cDNA-Expressionsbank aus normalem menschlichem Pankreas aus einem Pool von sechs Gewebeexemplaren (Clontech) hergestellt. Die cDNA-Banken wurden durch Bestimmen der Zahl der unabhängigen Kolonien, des Prozentsatzes von Klonen, die Inserts trugen, der durchschnittlichen Insertgröße und durch Sequenzanalyse charakterisiert. Die Prostatatumor-Bank enthielt 1,64 × 10⁷ unabhängige Kolonien, wobei 70% der Klone ein Insert hatten und die durchschnittliche Insertgröße 1745 Basenpaare betrug. Die cDNA-Bank aus normalem Pankreas enthielt 3,3 × 10⁶ unabhängige Kolonien, wobei 69% der Klone Inserts hatten und die durchschnittliche Insertgröße 1120 Basenpaare betrug. Eine Sequenzanalyse zeigte für beide Banken, dass die Mehrheit der Klone eine cDNA Sequenz voller
Länge hatten und aus mRNA mit minimaler rRNA- und mitochondrialer DNA-Kontamina tion synthetisiert waren.
Eine Subtraktion der cDNA-Bank wurde unter Verwendung der oben erwähnten cDNA-Banken aus Prostatatumor und normalem Pankreas wie von Hara of al. (Blood, 84: 189–199, 1994) beschrieben mit einigen Modifikationen durchgeführt. Genau gesagt wurde eine Prostatatumor-spezifische subtrahierte cDNA-Bank wie folgt erzeugt. Die cDNA-Bank aus normalem Pankreas (70 μg) wurde mit EcoRI, NotI und SfuI verdaut, gefolgt von einer Auffüllreaktion mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung wurde die DNA in 100 μl H₂O gelöst, hitzedenaturiert und mit 100 μl (100 μg) Photoprobe Biotin (Vector Laboratories, Burlingame, CA) gemischt. Wie vom Hersteller empfohlen wurde die so erhaltene Mischung 20 Minuten lang mit einer 270 W Sonnenlampe auf Eis bestrahlt. Zusätzliches Photoprobe Biotin (50 μl) wurde hinzugefügt und die Biotinylierungsreaktion wurde wiederholt. Nach fünfmaliger Extraktion mit Butanol wurde die DNA mit Ethanol gefällt und in 23 μl H₂O gelöst, um die Treiber-DNA zu bilden.
Um die Tracer-DNA zu bilden, wurden 10 μg Prostatatumor-cDNA-Bank mit BamHI und XhoI verdaut, mit Phenol-Chloroform extrahiert und durch Chroma Spin-400 Säulen (Clontech) durchgeleitet. Nach der Ethanolfällung wurde die Tracer-DNA in 5 μl H₂O gelöst. Die Tracer-DNA wurde mit 15 μl Treiber-DNA und 20 μl 2 × Hybridisierungspuffer (1,5 M NaCl/10 mM EDTA/50 mM HEPES pH 7,5/0,2% Natriumdodecylsulfat) gemischt, mit Mineralöl überlagert, und vollständig hitzedenaturiert. Die Probe wurde sofort in ein 68°C warmes Wasserbad transferiert und 20 Stunden lang inkubiert (lange Hybridisierung [LH]). Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Streptavidin-Behandlung unterzogen, gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion. Dieser Vorgang wurde noch dreimal wiederholt. Die subtrahierte DNA wurde gefällt, in 12 μl H₂O gelöst, mit 8 μl Treiber-DNA und 20 μl 2 × Hybridisierungspuffer gemischt, und 2 Stunden lang einer Hybridisierung bei 68°C unterzogen (kurze Hybridisierung [SH]). Nach dem Entfernen der biotinylierten doppelsträngigen DNA wurde die subtrahierte cDNA in die BamHI/XhoI-Stelle von Chloramphenicol resistentem pBCSK+ (Stratagene, La Jolla, CA 92037) ligiert und durch Elektroporation in ElectroMax E. coli DH10B Zellen transformiert, um eine Prostatatumor-spezifische subtrahierte cDNA-Bank zu erzeugen (Prostata Subtraktion 1).
Um die subtrahierte cDNA-Bank zu analysieren, wurde Plasmid-DNA aus 100 unabhängigen Klonen hergestellt, die zufällig aus der subtrahierten Prostatatumorspezifischen Bank gewählt wurden und auf der Insertgröße beruhend eingruppiert wurden. Repräsentative cDNA-Klone wurden überdies durch DNA Sequenzierung mit einem Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Automatischen Sequenzierer Modell 373A (Foster City, CA) charakterisiert. Für sechs cDNA-Klone, im Folgenden als F1-13, F1-12, F1-16, H1-1, H1-9 und H1-4 bezeichnet, wurde gezeigt, dass sie in der subtrahierten Prostata-spezifischen cDNA-Bank reichlich vorhanden waren. Die bestimmten 3' und 5' Sequenzen für F1-12 werden in SEQ ID NO: 2 bzw. 3 bereitgestellt, wobei die bestimmten 3' cDNA Sequenzen für F1-13, F1-16, H1-1, H1-9 und H1-4 in SEQ ID NO: 1 bzw. 4–7 bereitgestellt werden.
Die cDNA Sequenzen für die isolierten Klone wurden mit bekannten Sequenzen in der Genbank unter Verwendung der EMBL und GenBank Datenbanken (Ausgabe 96) verglichen. Von vier der Prostatatumor-Klone, F1-13, F1-16, H1-1 und H1-4, wurde bestimmt, dass sie die folgenden früher identifizierten Proteine kodierten: Prostataspezifisches Antigen (PSA), menschliches glanduläres Kallikrein, menschliches Tumor expression enhanced-Gen und Untereinheit 11 der mitochondrialen Cytochrom C Oxidase. Es wurde festgestellt, dass H1-9 identisch zu einer früher identifizierten menschlichen autonom replizierenden Sequenz ist. Zu der cDNA Sequenz für F1-12 wurden keine signifikanten Homologien festgestellt.
Anschließende Untersuchungen führten zur Isolierung einer cDNA Sequenz voller Länge für F1-12. Diese Sequenz wird in SEQ ID NO: 107 bereitgestellt, wobei die korrespondierende vorhergesagte Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 108 bereitgestellt wird.
Um weniger reichlich vorhandene Prostatatumor-spezifische Gene zu klonieren, wurde eine cDNA-Bank Subtraktion durch das Subtrahieren der oben beschriebenen Prostatatumor-cDNA-Bank mit der normalen Pankreas-cDNA-Bank und mit den drei am reichlichsten vorhandenen Genen in der vorher subtrahierten Prostatatumor-spezifischen cDNA-Bank, menschliches glanduläres Kallikrein, Prostata-spezifisches Antigen (PSA) und Untereinheit II der mitochondrialen Cytochrom C Oxidase, durchgeführt. Genau gesagt wurde je 1 μg von den cDNAs von menschlichem glandulärem Kallikrein, Prostata-spezifischem Antigen (PSA) und von der Untereinheit II der mitochondrialen Cytochrom C Oxidase in pCDNA3.1 zu der Treiber-DNA hinzugefügt und eine Subtraktion wurde wie oben beschrieben durchgeführt, um eine zweite subtrahierte cDNA-Bank bereitzustellen, die im Folgenden als "subtrahierte Prostatatumor-spezifische cDNA-Bank mit Spike" bezeichnet wird.
Zweiundzwanzig cDNA-Klone wurden aus der subtrahierten Prostatatumor-spezifischen cDNA-Bank mit Spike isoliert. Die bestimmten 3' und 5' cDNA Sequenzen für die als J1-17, L1-12, N1-1862, J1-13, J1-19, J1-25, J1-24, K1-58, K1-63, L1-4 und L1-14 bezeichneten Klone werden in SEQ ID NOs: 8–9, 10–11, 12–13, 14–15, 16–17, 18–19, 20–21, 22–23, 24–25, 26–27 bzw. 28–29 bereitgestellt. Die bestimmten 3' cDNA Sequenzen für die als J1-12, J1-16, J1-21, K1-48, K1-55, L1-2, L1-6, N1-1858, N1-1860, N1-1861, N1-1864 bezeichneten Klone werden in SEQ ID NOs: 30–40 bereitgestellt. Ein Vergleich dieser Sequenzen mit denen in der Genbank, wie oben beschrieben, deckte keine signifikanten Homologien zu drei der fünf am reichlichsten vorhandenen DNA Spezies (J1-17, L1-12 und N1-1862; SEQ ID NOs: 8–9, 10–11 bzw. 12–13) auf. Es wurde festgestellt, dass eine der beiden verbleibenden am reichlichsten vorhandenen Spezies (J1-12; SEQ ID NO: 30) identisch zu dem früher identifizierten menschlichen pulmonalen oberflächenassoziierten Protein war, und von der anderen (K1-48; SEQ ID NO: 33) wurde bestimmt, dass sie Homologie zur R. norvegicus mRNA für 2-Arylpropionyl-CoA-Epimerase hatte. Es wurde festgestellt, dass von den 17 weniger reichlich vorhandenen cDNA-Klonen, die aus der subtrahierten Prostatatumor-spezifische cDNA-Bank mit Spike isoliert worden waren, vier (J1-16, K1-55, L1-6 und N1-1864; SEQ ID NOs: 31, 34, 36 bzw. 40) identisch zu früher identifizierten Sequenzen waren, von zweien (J1-21 und N1-1860; SEQ ID NOs: 32 bzw. 38) wurde festgestellt, dass sie Homologie zu nicht menschlichen Sequenzen zeigten und von zweien (L12 und N1-1861; SEQ ID NOs: 35 bzw. 39) wurde festgestellt, dass sie Homologie zu bekannten menschlichen Sequenzen zeigten. Keine signifikanten Homologien wurden zu den Polypeptiden J1-13, J1-19, J1-24, J1-25, K1-58, K1-63, L1-4, L1-14 (SEQ ID NOs: 14–15, 16–17, 20–21, 18–19, 22–23, 24–25, 26–27, bzw. 28–29) festgestellt.
Anschließende Untersuchungen führten zur Isolierung von cDNA Sequenzen voller Länge für J1-17, L1-12 und N1-1862 (SEQ ID NOs: 109–111). Die korrespondierenden vorhergesagten Aminosäuresequenzen werden in SEQ ID NOs: 112–114 bereitgestellt.
In einem weiteren Experiment wurden vier zusätzliche Klone durch Subtrahieren einer Prostatatumor cDNA-Bank mit cDNA aus normaler Prostata, die aus einem Pool von drei poly-A⁺ RNAs aus normaler Prostata hergestellt wurde, identifiziert (Prostata Subtraktion 2). Die bestimmten cDNA Sequenzen für diese Klone, die im Folgenden als U1-3064, U1-3065, V1-3692 and 1A-3905 bezeichnet werden, werden in SEQ ID NO: 69–72 bereitgestellt. Ein Vergleich der bestimmten Sequenzen mit denen in der Genbank deckte keine signifikanten Homologien zu U1-3065 auf.
Eine zweite Subtraktion mit Spike (Prostata Subtraktion Spike 2) wurde durch das Subtrahieren einer Prostatatumor-spezifischen cDNA-Bank mit Spike mit einer cDNA-Bank aus normalem Pankreas durchgeführt und überdies mit PSA, J1-17, pulmonalem oberflächenassoziiertem Protein, mitochondrialer DNA, Untereinheit II der Cytochrom C Oxidase, N1-1862, autonom replizierender Sequenz, L1-12 und dem Tumor expression enhanced-Gen, mit Spike subtrahiert. Vier zusätzliche Klone, im Folgenden als V1-3686, R1-2330, 1B-3976 und V1-3679 bezeichnet, wurden isoliert. Die bestimmten cDNA Sequenzen für diese Klone werden in SEQ ID NO: 73–76 bereitgestellt. Ein Vergleich dieser Sequenzen mit denen in der Genbank deckte keine signifikanten Homologien zu V1-3686 und R1-2330 auf.
Die weitere Analyse der drei oben beschriebenen Prostata Subtraktionen (Prostata Subtraktion 2, sutstrahierte Prostatatumor-spezifische cDNA-Bank mit Spike und Prostata Subtraktion Spike 2) führte zur Identifizierung von sechzehn zusätzlichen Klonen, die als 1G-4736, 1G-4738, 1G-4741, 1G-4744, 1G-4734, 1H-4774, 1H-4781, 1H-4785, 1H-4787, 1H-4796, 1I-4810, 1I-4811, 1J-4876, 1K-4884 und 1K-4896 bezeichnet werden. Die bestimmten cDNA Sequenzen für diese Klone werden in SEQ ID NOs: 77–92 bereitgestellt. Ein Vergleich dieser Sequenzen mit denen in der Genbank, wie oben beschrieben, deckte keine signifikanten Homologien zu 1G-4741, 1G-4734, 1I-4807, 1J-4876 and 1K-4896 (SEQ ID NOs: 79, 81, 87, 90 bzw. 92) auf. Die weitere Analyse der isolierten Klone führte zur Bestimmung ausgedehnter cDNA Sequenzen für 1G-4736, 1G-4738, 1G-4741, 1G-4744, 1H-4774, 1H-4781, 1H-4785, 1H-4787, 1H-4796, 1I-4807, 1J-4876, 1K-4884 und 1K-4896, bereitgestellt in SEQ ID NOs: 179–188 bzw. 191–193, und zur Bestimmung zusätzlicher partieller cDNA Sequenzen für 1I-4810 and 1I-4811, bereitgestellt in SEQ ID NOs: 189 bzw. 190.
Eine weitere Subtraktion wurde durch das Subtrahieren einer cDNA-Bank aus normaler Prostata mit cDNA aus normalem Pankreas durchgeführt (Prostata Subtraktion 3). Dies führte zur Identifizierung von sechs zusätzlichen Klonen, die als 1G-4761, 1G-4762, 1H-4766, 1H-4770, 1H-4771 und 1H-4772 (SEQ ID NOs: 93–98) bezeichnet werden. Ein Vergleich dieser Sequenzen mit denen in der Genbank deckte keine signifikanten Homologien zu 1G-4761 und 1H-4771 (SEQ ID NOs: 93 bzw. 97) auf. Die weitere Analyse der isolierten Klone führte zur Bestimmung ausgedehnter cDNA Sequenzen für 1G-4761, 1G-4762, 1H-4766 und 1H-4772 bereitgestellt in SEQ ID NOs: 194–196 bzw. 199, und zur Bestimmung zusätzlicher partieller cDNA Sequenzen für 1H-4770 und 1H-4771, bereitgestellt in SEQ ID NOs: 197 bzw. 198.
Die Subtraktion einer aus einem Pool von polyA-RNA aus drei Prostatakrebs-Patienten hergestellten Prostatatumor cDNA-Bank mit einer cDNA-Bank aus normalem Pankreas (Prostata Subtraktion 4) führte zur Identifizierung von acht Klonen, die als 1D-4297, 1D-4309, 1D.1-4278, 1D-4288, 1D-4283, 1D-4304, 1D-4296 und 1D-4280 (SEQ ID NOs: 99–107) bezeichnet werden. Diese Sequenzen wurden wie oben beschrieben mit denen in der Genbank verglichen. Keine signifikanten Homologien wurden zu 1D-4283 und 1D-4304 (SEQ ID NOs: 103 bzw. 104) festgestellt. Die weitere Analyse der isolierten Klone führte zur Bestimmung von ausgedehnten cDNA Sequenzen für 1D- 4309, 1D.1-4278, 1D-4288, 1D-4283, 1D-4304, 1D-4296 und 1D-4280, bereitgestellt in SEQ ID NOs: 200–206).
cDNA-Klone, die in der oben beschriebenen Prostata Subtraktion 1 und Prostata Subtraktion 2 isoliert wurden, wurden durch Colony-PCR amplifiziert und ihre mRNA Expressionsniveaus in Prostatatumor, normaler Prostata und in verschiedenen anderen normalen Geweben unter Verwendung der Mikroarray-Technologie (Synteni, Palo Alto, CA) bestimmt. Kurz gesagt wurden die PCR-Amplifikationsprdukte in einem Arrayformat auf Objektträger gepunktet, wobei jedes Produkt eine einzigartige Position auf dem Array besetzt. Aus den zu testenden Gewebeproben wurde mRNA extrahiert, revers transkribiert und fluoreszenzmarkierte cDNA-Proben wurden erzeugt. Die Mikroarrays wurden mit den markierten cDNA-Proben sondiert, die Objektträger abgetastet und die Fluoreszenzintensität wurde gemessen. Diese Intensität korreliert mit der Hybridisierungsintensität. Es wurde festgestellt, dass zwei neuartige Klone (als P509S und P510S bezeichnet) in Prostatatumor und normaler Prostata überexprimiert und in allen anderen normalen getesteten Gewebe (Leber, Pankreas, Haut, Knochenmark, Hirn, Brust, Nebenniere, Blase, Hoden, Speicheldrüse, Dickdarm, Niere, Eierstock, Lunge, Rückenmark, Skelettmuskel und Kolon) auf niedrigen Niveaus exprimiert wurden. Die bestimmten cDNA Sequenzen für P509S und P510S werden in SEQ ID NO: 223 bzw. 224 bereitgestellt. Ein Vergleich dieser Sequenzen mit denen in der Genbank, wie oben beschrieben, deckte Homologie zu früher identifizierten ESTs auf.
BEISPIEL 2
BESTIMMUNG DER GEWEBESPEZIFITÄT VON PROSTATATUMOR-POLYPEPTIDEN
Unter Verwendung spezifischer Primer wurden die mRNA Expressionsniveaus für die repräsentativen Prostatatumor-Polypeptide F1-16, H1-1, J1-17, L1-12, F1-12 und N1-1862 in einer Vielzahl von normalen und Tumorgeweben unter Verwendung von RT-PCR geprüft.
Kurz gesagt wurde Gesamt-RNA aus einer Vielzahl von normalen und Tumorgeweben unter Verwendung des Trizol-Reagenzes wie oben beschrieben extrahiert. Die Erststrang-Synthese wurde unter Verwendung von 1–2 μg Gesamt-RNA mit Superscript II reverser Transkriptase (BRL Life Technologies) bei 42°C eine Stunde lang ausgeführt. Die cDNA wurde dann durch PCR mit genspezifischen Primern amplifiziert. Um die semiquantitative Beschaffenheit der RT-PCR sicherzustellen, wurde β-Aktiv als interne Kontrolle für jedes geprüfte Gewebe verwendet. Zuerst wurden serielle Verdünnungen der Erststrang-cDNAs hergestellt und RT-PCR-Assays wurden unter Verwendung von Primern, die für β-Aktiv spezifisch sind, durchgeführt. Dann wurde eine Verdünnung gewählt, die die Amplifikation der β-Aktiv-Vorlage im linearen Bereich ermöglichte und die empfindlich genug war, die Unterschiede in der anfänglichen Kopienzahl widerzuspiegeln. Unter Verwendung dieser Bedingungen wurden die Spiegel von β-Aktiv für jede reverse Transkriptionsreaktion von jedem Gewebe bestimmt. DNA-Kontamination wurde durch DNAse-Behandlung minimiert und durch Absichern eines negativen PCR-Ergebnisses bei der Verwendung von Erststrang-cDNA, die ohne Hinzufügen von reverser Transkriptase hergestellt wurde.
mRNA-Expressionsniveaus wurden in vier verschiedenen Arten von Tumorgewebe (Prostatatumor von 2 Patienten, Brusttumor von 3 Patienten, Kolontumor, Lungentumor) und 16 verschiedenen normalen Geweben, einschließlich Prostata, Kolon, Niere, Leber, Lunge, Eierstock, Pankreas, Skelettmuskel, Haut, Magen, Hoden, Knochenmark und Hirn geprüft. Es wurde festgestellt, dass F1-16 auf hohen Niveaus in Prostatatumor-Gewebe, Kolontumor und normaler Prostata exprimiert wurde, und auf niedrigeren Niveaus in normaler Leber, Haut und Hoden, wobei die Expression in den anderen Geweben nicht detektierbar war. Es wurde festgestellt, dass H1-1 auf hohen Niveaus in Prostatatumor, Lungentumor, normaler Prostata, normalem Kolon und normalem Hirn exprimiert wurde, auf viel niedrigeren Niveaus in normaler Lunge, Pankreas, Skelettmuskel, Haut, Dünndarm, Knochenmark und in den anderen getesteten Geweben nicht detektiert wurde. J1-17 und L1-12 scheinen in Prostata spezifisch überexprimiert zu werden, wobei beide Gene auf hohen Niveaus in Prostatatumor und normaler Prostata, aber auf niedrigem bis nicht detektierbarem Niveau in allen anderen geprüften Geweben exprimiert werden. Es wurde festgestellt, dass N1-1862 in 60% der Prostatatumoren überexprimiert wurde und in nomalem Kolon und normaler Niere detektierbar war. Die RT-PCR Ergebnisse zeigen daher an, dass F1-16, N1-1, J1-17, N1-1862 und L1-12 entweder Prostata-spezifisch sind oder auf signifikant erhöhten Niveaus in Prostata exprimiert werden.
Weitere RT-PCR Untersuchungen zeigten, dass F1-12 in 60% der Prostatatumoren überexprimiert wird, in normaler Niere nachweisbar, aber in allen anderen getesteten Geweben nicht detektierbar ist. In ähnlicher Weise wurde gezeigt, das R1-2330 in 40% der Prostatatumoren überexprimiert wurde, in normaler Niere und Leber detektierbar, aber in allen anderen getesteten Geweben nicht detektierbar war. Es wurde festgestellt, dass U1-3064 in 60% der Prostatatumoren überexprimiert und auch in Brust- und Kolontumoren exprimiert wurde, aber in normalen Geweben nicht detektierbar war.
Die Charakterisierung von R1-2330, U1-3064 und 1D-4279 durch RT-PCR zeigte, dass diese drei Antigene in Prostata und/oder Prostatatumoren überexprimiert wurden. Die Northern-Analyse mit vier Prostatatumoren, zwei normalen Prostataproben, zwei BPH-Prostatas und normalen Kolon, Niere, Leber, Lunge, Pankreas, Skelettmuskel, Hirn, Magen, Hoden, Dünndarm und Knochenmark zeigte, dass L1-12 in Prostatatumoren und normaler Prostata überexprimiert wird, während es in anderen normalen getesteten Geweben nicht detektierbar ist. J1-17 wurde in zwei Prostatatumoren und nicht in den anderen getesteten Geweben detektiert. Es wurde festgestellt, dass N1-1862 in drei Prostatatumoren überexprimiert und in normaler Prostata, Kolon und Niere, aber nicht in den anderen getesteten Geweben exprimiert wird. Es wurde festgestellt, dass F1-12 in zwei Prostatatumoren stark exprimiert wurde und in allen anderen getesteten Geweben nicht detektierbar war.
Die oben beschriebene Mikroarray-Technologie wurde verwendet, um die Expressionsniveaus repräsentativer hierin beschriebener Antigene in Prostatatumor, Brusttumor und den folgenden normalen Geweben zu bestimmen: Prostata, Leber, Pankreas, Haut, Knochenmark, Hirn, Brust, Nebenniere, Blase, Hoden, Speicheldrüse, Dickdarm, Niere, Eierstock, Lunge, Rückenmark, Skelettmuskel und Kolon. Es wurde festgestellt, dass L1-12 in normaler Prostata und Prostatatumor überexprimiert wird, wobei Expression im normalen Skelettmuskel detektiert wurde. Es wurde festgestellt, dass sowohl J1-12 als auch F1-12 in Prostatatumor überexprimiert wurden, wobei die Expression in allen anderen getesteten Geweben geringer oder nicht detektierbar war. Es wurde festgestellt, dass N1-1862 in Prostatatumor und normaler Prostata auf hohen Niveaus und in normalem Dickdarm und normalem Kolon auf niedrigeren Niveaus exprimiert wurde, wobei die Expression in allen anderen getesteten Geweben nicht detektierbar war. Es wurde festgestellt, dass R1-2330 in Prostatatumor und normaler Prostata überexprimiert und in allen anderen getesteten Geweben auf niedrigeren Niveaus exprimiert wurde. Es wurde festgestellt, dass 1D-4279 in Prostatatumor und normaler Prostata überexprimiert, in normalem Rückenmark auf niedrigeren Niveaus exprimiert wurde, und in allen anderen getesteten Geweben nicht detektierbar war.
BEISPIEL 3
ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON PROSTATATUMOR-POLYPEPTIDEN DURCH AUF PCR BERUHENDE SUBTRAKTION
Eine cDNA-Subtraktionsbank, die cDNA aus normaler Prostata enthielt, die mit cDNAs aus zehn anderen normalen Geweben (Hirn, Herz, Niere, Leber, Lunge, Eierstock, Plazenta, Skelettmuskel, Milz und Thymus) subtrahiert und dann einer ersten Runde von PCR-Amplifikation unterzogen worden war, wurde von Clontech gekauft. Diese Bank wurde einer zweiten Runde von PCR-Amplifikation nach dem Protokoll des Herstellers unterzogen. Die sich ergebenden cDNA-Fragmente wurden in den Vektor pT7 Blue T-vector (Novagen, Madison, WI) subkloniert und in XL-1 Blue MRF' E. coli (Stratagene) transformiert. DNA wurde aus unabhängigen Klonen isoliert und mit einem Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Automatischen Sequenzierer Modell 373A sequenziert.
Neunundfünfzig positive Klone wurden sequenziert. Ein Vergleich der Sequenzen dieser Klone mit denen in der Genbank, wie oben beschrieben, deckte keine signifikanten Homologien zu 25 dieser Klone, im Folgenden als P5, P8, P9, P18, P20, P30, P34, P36, P38, P39, P42, P49, P50, P53, P55, P60, P64, P65, P73, P75, P76, P79 und P84 bezeichnet, auf. Die bestimmten cDNA Sequenzen für diese Klone werden in SEQ ID NO: 41–45, 47–52 bzw. 54–65 bereitgestellt. Es wurde festgestellt, dass P29, P47, P68, P80 und P82 (SEQ ID NO: 46, 53 bzw. 66–68) einen gewissen Grad an Homologie zu früher identifizierten DNA Sequenzen hatten. Nach bestem Wissen der Erfinder ist von keiner dieser Sequenzen bisher gezeigt worden, dass sie in Prostata vorliegt. Weitere Untersuchungen unter Verwendung der auf PCR beruhenden oben beschriebenen Methodik führten zur Isolierung von mehr als 180 zusätzlichen Klonen, von denen für 23 Klone festgestellt wurde, dass sie keine signifikanten Homologien zu bekannten Sequenzen zeigten. Die bestimmten cDNA Sequenzen für diese Klone werden in SEQ ID NO: 115–123, 127, 131, 137, 145, 147–151, 153, 156–158 und 160 bereitgestellt. Es wurde festgestellt, dass dreiundzwanzig Klone (SEQ ID NO: 124–126, 128–130, 132–136, 138–144, 146,152,154,155 und 159) Homologie zu früher identifizierten ESTs zeigten. Es wurde festgestellt, dass zehn zusätzliche Klone (SEQ ID NO: 161–170) einen gewissen Grad an Homologie zu bekannten Genen hatten. Es wurde festgestellt, dass ein zusätzlicher Klon, mit P703 bezeichnet, fünf Spleißvarianten hatte. Die bestimmten DNA Sequenzen für die Varianten, die als DE1, DE13 und DE14 bezeichnet werden, werden in SEQ ID NOs: 171, 175 bzw. 177 bereitgestellt, wobei die korrespon dierenden vorhergesagten Aminosäuresequenzen in SEQ ID NO: 172, 176 bzw. 178 bereitgestellt wird. Die DNA Sequenzen für die als DE2 und DE6 bezeichneten Spleißvarianten werden in SEQ ID NOs: 173 bzw. 174 bereitgestellt.
Für repräsentative Klone wurden die mRNA-Expressionsniveaus in Tumorgeweben (Prostata (n = 5), Brust (n = 2), Kolon und Lunge), normalen Geweben (Prostata (n = 5), Kolon, Niere, Leber, Lunge (n = 2), Eierstock (n = 2), Skelettmuskel, Haut, Magen, Dünndarm und Hirn) und aktivierten und nicht aktivierten PBMC durch RT-PCR wie oben beschrieben bestimmt. Die Expression wurde, wenn nicht anders angegeben, in einer Probe von jeder Gewebeart untersucht.
Es wurde festgestellt, dass P9 in normaler Prostata und Prostatatumor im Vergleich zu allen normalen gesteten Geweben stark exprimiert wurde, mit Ausnahme von normalem Kolon, das vergleichbare Expression zeigte. Es wurde festgestellt, dass P20 in normaler Prostata und Prostatatumor im Vergleich zu allen zwölf normalen gesteten Geweben stark exprimiert wurde. Eine mäßige Erhöhung in der Expression von P20 in Brusttumor (n = 2), Kolontumor und Lungentumor wurde im Vergleich zu allen normalen Geweben außer Lunge (1 von 2) gesehen. Erhöhte Expression von P18 wurde in normaler Prostata, Prostatatumor und Brusttumor im Vergleich zu anderen normalen Geweben außer Lunge und Magen festgestellt. Eine mäßige Erhöhung in der Expression von P5 wurde in normaler Prostata im Vergleich zu den meisten anderen normalen Geweben beobachtet. Eine etwas erhöhte Expression wurde jedoch in normaler Lunge und PBMC gesehen. Erhöhte Expression von P5 wurde auch in Prostatatumoren (2 von 5), Brusttumor und einer Lungentumorprobe beobachtet. Für P30 wurden ähnliche Expressionsniveaus in normaler Prostata und Prostatatumor im Vergleich zu sechs von zwölf anderen normalen getesteten Geweben gesehen. Erhöhte Expression wurde in Brusttumoren, einer Lungentumorprobe und einer Kolontumorprobe, und auch in normalen PBMC gesehen. Es wurde festgestellt, dass P29 in Prostatatumor (5 von 5) und normaler Prostata (5 von 5) im Vergleich zur Mehrheit der normalen Gewebe überexprimiert wurde. Eine wesentliche Expression von P29 wurde jedoch in normalem Kolon und normaler Lunge (2 von 2) beobachtet. Es wurde festgestellt, dass P80 in Prostatatumor (5 von 5) und normaler Prostata (5 von 5) im Vergleich zu allen anderen normalen getesteten Geweben überexprimiert wurde, wobei erhöhte Expression auch in Kolontumor gesehen wurde.
Weitere Untersuchungen unter Verwendung der oben erwähnten Methodik führten zur Isolierung von zwölf zusätzlichen Klonen, im Folgenden als 10-d8, 10-h10, 11-c8, 7-g6, 8-b5, 8-b6, 8-d4, 8-d9, 8-g3, 8-h11, g-f12 und g-f3 bezeichnet. Die bestimmten DNA Sequenzen für 10-d8, 10-h10, 11-c8, 8-d4, 8-d9, 8-h11, g-f12 und g-f3 werden in SEQ ID NO: 207, 208, 209, 216, 217, 220, 221 bzw. 222 bereitgestellt. Die bestimmten vorwärts und rückwärts verlaufenden DNA Sequenzen für 7-g6, 8-b5, 8-b6 und 8-g3 werden in SEQ ID NO: 210 und 211; 212 und 213; 214 und 215; bzw. 218 und 219, bereitgestellt. Ein Vergleich dieser Sequenzen mit denen in der Genbank deckte keine signifikanten Homologien zu den Sequenzen von 7-g6 und g-f3 auf. Es wurde festgestellt, dass die Klone 10-d8, 11-c8 und 8-h11 Homologie zu früher isolierten ESTs zeigten, während festgestellt wurde, dass 10-h10, 8-b5, 8-b6, 8-d4, 8-d9, 8-g3 und g-f12 Homologie zu früher identifizierten Genen hatten.
BEISPIEL 4
POLYPEPTIDSYNTHESE
Polypeptide können auf einem Applied Biosystems 430A Peptid Sythetisierer unter Verwendung von FMOC-Chemie mit HPTU (O-Benzotriazol-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat)-Aktivierung synthetisiert werden. Eine Gly-Cys-Gly-Sequenz kann an den Aminoterminus des Peptids angelagert werden, um ein Verfahren für die Konjugation, das Binden an eine immobilisierte Oberfläche oder das Markieren des Peptids bereitzustellen. Die Spaltung des Peptids von dem festen Untergrund kann unter Verwendung des folgenden Spaltungsgemisches ausgeführt werden: Trifluoressigsäure: Ethandithiol: Thioanisol: Wasser: Phenol (40:1:2:2:3). Nach 2 Stunden langem Spalten können die Peptide in kaltem Methyl-t-butylether gefällt werden. Die Peptidpellets können dann in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) enthaltendem Wasser gelöst und vor der Reinigung durch C18 Reverse Phase HPLC lyophilisiert werden. Ein Gradient von 0%–60% Acetonitril (0,1% TFA enthaltend) in Wasser (0,1% TFA enthaltend) kann verwendet werden, um die Peptide zu eluieren. Nach dem Lyophilisieren der reinen Fraktionen können die Peptide unter Verwendung von Elektrospray oder anderen Arten von Massenspektrometrie und durch Aminosäureanalyse charakterisiert werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Verfahren für die Detektion von Prostatakrebs in einem Patienten, umfassend: (a) Das Kontaktieren einer biologischen Probe, welche von dem Patienten erhalten wurde, mit einem Antikörper oder einem Antigen-bindenden Fragment davon, welcher spezifisch an ein Prostata-Protein oder einem immunogenen Teil davon bindet, wobei das besagte Prostata-Protein eine Aminosäuresequenz umfaßt, die durch ein DNA Molekül kodiert wird, welches eine Sequenz hat, die in einer der Sequenzen SEQ ID Nos: 2, 3, 74 und 107 rezitiert wird, die Komplemente von den besagten Nukleotidsequenzen und Varianten von den besagten Nukleotidsequenzen, welche mindestens 70% Identität zu den besagten Nukleotidsequenzen aufweisen; und (b) Das Detektieren eines Proteins oder Polypeptids in der Probe, welches an den Antikörper oder einem Antigen-bindenden Fragment davon bindet, dadurch den Prostatakrebs in dem Patienten detektierend.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist.
Ein Verfahren für die Beobachtung des Verlaufs von Prostatakrebs in einem Patienten, umfassend: (a) Das Kontaktieren einer biologischen Probe, welche von dem Patienten erhalten wurde, mit einem Antikörper oder einem Antigen-bindenden Fragment davon, der spezifisch an ein Prostata-Protein oder einen immunogenen Teil davon bindet, wobei das besagte Prostata-Protein eine Amiosäuresequenz umfaßt, die durch ein DNA Molekül kodiert wird, welches eine Sequenz hat, die in einer der Sequenzen SEQ ID Nos: 2, 3, 74 und 107 rezitiert wird, die Komplemente von den besagten Nukleotidsequenzen und Varianten von besagten Nuklotidsequenzen, welche mindestens 70% Identität zu den besagten Nukleotidsequenzen aufweisen; (b) Die Bestimmung der Menge von einem Protein oder Polypeptid in der Probe, welche an den Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon bindet; (c) Die Wiederholung der Schritte (a) und (b); und (d) Das Vergleichen der Menge an Polypeptid, welches in den Schritten (b) und (c) detektiert wurde, um den Verlauf von dem Prostatakrebs in dem Patienten zu beobachten.
Ein monoklonaler Antiköper, welcher an ein Polypeptid bindet, welches ein Prostata-Protein, oder einen immunogenen Teil davon umfaßt, wobei das besagte Prostata-Protein eine Amunosäuresequenz umfaßt, die durch ein DNA Molekül kodiert wird, welches eine Sequenz hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotidsequenzen rezitiert in SEQ ID Nos: 2, 3, 74 und 107, die Komplemente von den besagten Nukleotidsequenzen und Varianten von den besagten Nukleotidsequenzen, welche mindestens 70% Identität zu den besagten Nukleotidsequenzen aufweisen
Eine therapeutisch wirksame Menge von einem monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 5, für die Herstellung eines Medikaments für die Inhibition der Entstehung von Prostatakrebs in einem Patienten.
Der monoklonale Antikörper nach Anspruch 6, wobei der monoklonale Antikörper an ein therapeutisches Mittel konjugiert ist.
Ein Verfahren für die Defektion von Prostatakrebs in einem Patienten, umfassend: (a) Das Kontaktieren einer biologischen Probe, welche von dem Patienten erhalten wurde, mit mindestens zwei Oligonukleotid-Primern in einer Polymerase-Ketten-Reaktion, wobei mindestens das eine von den Oligonukleotiden spezifisch ist für das DNA Molekül, welches ein Polypeptid kodiert, das ein Prostata-Protein oder einen immunogenen Teil davon umfaßt, das besagte Protein eine Aminosäuresequenz umfaßt, die durch ein DNA Molekül kodiert wird, welches eine Sequenz hat die in einer der Sequenzen SEQ ID Nos: 2, 3, 74 oder 107 rezitiert wird, die Komplemente von den besagten, Nukleotidsequenzen und Varianten von den besagten Nukleotidsequenzen, welche mindestens 70% Idendität zu den besagten Nukleotidsequenzen aufweisen, und (b) Das Detektieren einer DNA Sequenz in der Probe, welche in Gegenwart der Oligonukleotid-Primer amplifiziert wird, dadurch den Prostatakrebs delektierend.
Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei mindestens einer von den Oligonukleotid-Primem wenigstens ungefähr 10 zusammenhängende Nukleotide von einem DNA Molekül umfaßt, welches eine Sequenz hat, ausgewählt von den SEQ ID Nos: 2, 3, 74 und 107.
Ein Kit für die Diagnose, umfassend: (a) einen oder mehrere monoklonale Antikörper nach Anspruch 5; und (b) ein Detektionsreagenz.
Das Kit nach Anspruch 10, wobei die monoklonalen Antikörper auf einem festen Untergrund immobilisiert sind.
Das Kit nach Anspruch 11, wobei der feste Untergrund Nitrozellulose, Latex oder Plastikmaterialien umfaßt.
Das Kit nach Anspruch 10, wobei das Detektions-Reagenz eine Reporter-Gruppe umfaßt, die an einen Antikörper konjugiert ist.
Das Kit nach Anspruch 13, wobei die Reporter-Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Radioisotopen, fluoreszierenden Gruppen, lumineszierenden Gruppen, Enzymen, Biotin und Farbstoffpartikel.
Ein Kit für die Diagnose, umfassend mindestens zwei Oligonukleotidprimer, mindestens einer von den Oligonukleotidprimern ist spezifisch für ein DNA Molekül, welches ein Polypeptid kodiert, das ein Prostata-Protein oder einen immunogenen Teil davon umfaßt, das besagte Prostata-Protein eine Aminosäuesequenz umfaßt, die durch ein DNA Molekül kodiert wird, welches eine Sequenz hat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotidsequenzen, die in den SEQ ID Nos: 2, 3, 74 und 107 rezitiert sind, die Komplemente von den besagten Nukleotidsequenzen und Varianten von besagten Nukleotidsequenzen, welche mindestens 70% Identität zu den besagten Nukleotidsequenzen aufweisen.
Ein diagnostisches Kit nach Anspruch 15, wobei mindestens einer von den Oligonukleotidprimern wenigstens ungefähr 10 zusammenhängende Nukleotide von einem DNA Molekül umfaßt, welches eine Sequenz hat, ausgewählt von den SEQ ID Nos: 2, 3, 74 und 107.
Ein Verfahren für die Detektion von Prostatakrebs in einem Patienten, umfassend: (a) Das Kontaktieren einer biologischen Probe, welche von dem Patienten erhalten wurde, mit einer Oligonukleotidprobe, welche spezifisch ist für ein DNA Molekül, das ein Polypeptid kodiert, welches ein Prostata-Protein oder einen immunogenen Teil davon umfaßt, das besagte Prostata-Protein eine Aminosäuresequenz umfaßt, die durch ein DNA Molekül kodiert wird, welches eine Sequenz hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotidsequenzen rezitiert in SEQ ID Nos: 2, 3, 74 und 107, die Komplemente von den besagten Nukleotidsequenzen und Varianten von den besagten Nukleotidsequenzen, welche mindestens 70% Identität zu den besagten Nukleotidsequenzen aufweisen; und (b) Das Detektieren einer DNA Sequenz in der Probe, welche an die Oligonukleotidproben hybridisiert, dadurch den Prostatakrebs in dem Patienten detektierend.
Das Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Oligonukleotidprobe wenigstens ungefähr 15 zusammenhängende Nukleotide von einem DNA Molekül umfaßt, welches ein Sequenz hat ausgewählt auf der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nos: 2, 3, 74 und 107.
Ein Kit für die Diagnose, umfassend eine Oligonukleotidprobe, welche spezifisch ist für ein DNA Molekül, das ein Polypeptid kodiert, welches ein Prostata-Protein oder einen immunogenen Teil davon umfaßt, das besagte Prostata-Protein eine Aminosäuresequenz umfaßt, die durch ein DNA Molekül kodiert wird, welches eine Sequenz hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotidsequenzen rezitiert in SEQ ID Nos: 2, 3, 74 und 107, die Komplemente von besagten Nukleotidsequenzen und Varianten von den besagten Nukleotidsequenzen, welche mindestens 70% Identität zu den besagten Nukleotidsequenzen aufweisen.
Das diagnostische Kit nach Anspruch 19, wobei die Oligonukleotidprobe wenigstens ungefähr 15 zusammenhängende Nukleotide von einem DNA Molekül umfaßt, welches eine Sequenz hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID Nos: 2, 3, 74 und 107.