KR102667951B1 - Steap-1에 결합하는 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일반적으로, 예를 들어 T 세포 활성화를 위한, 이중특이성 항원 결합 분자를 포함한, STEAP-1에 결합하는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기와 같은 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기와 같은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항체의 생성 방법, 및 질병의 치료에서 그의 사용 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 일반적으로, 예를 들어 T 세포 활성화를 위한, 이중특이성 항원 결합 분자를 포함한, STEAP-1에 결합하는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기와 같은 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 상기와 같은 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항체의 생성 방법, 및 질병의 치료에서 그의 사용 방법에 관한 것이다.
STEAP-1(전립선-1의 6-막관통 상피 항원)은 정상 조직 중 전립선 세포에서 우세하게 발현되는 339 아미노산 세포 표면 단백질이다. STEAP-1 단백질 발현은 전립선암의 다양한 상태에 걸쳐 높은 수준으로 유지되며, STEAP-1은 또한 폐 및 결장과 같은 다른 인간암에서도 고도로 과-발현된다. 정상 및 암 조직에서 STEAP-1의 발현 프로파일은 예를 들어 면역요법에 대한 치료 표적으로서 그의 잠재적인 용도를 제시하였다. WO 2008/052187은 항-STEAP-1 항체 및 그의 면역접합체를 보고한다. STEAP-1/CD3(scFv)2 이중특이성 항체가 WO 2014/165818에 기재되어 있다.
전립선, 폐 및 결장 중의 다양한 암 및 암의 전이를 치료하기 위해 추가적인 약물이 필요하다. 상기 목적에 특히 유용한 약물은 STEAP-1에 결합하는 항체, 특히 표적 세포상의 STEAP-1 및 T-세포상의 CD3와 같은 활성화 T 세포 항원에 결합하는 이중특이성 항체를 포함한다. 상기와 같은 항체의 그의 2개의 표적 모두에의 동시 결합은 표적 세포와 T 세포를 강제로 일시적으로 상호작용하게 하여, 임의의 세포독성 T 세포의 활성화 및 표적 세포의 후속적인 용해를 야기할 것이다.
치료학적 목적을 위해서, 항체가 충족시켜야 할 중요한 요건은 시험관내(약물의 보관을 위해서) 및 생체내(환자에의 투여 후에) 모두에서의 충분한 안정성이다. 아스파라진 탈아미드화, 아스파테이트 이성질화, 숙신이미드 형성, 및 트립토판 산화와 같은 변형이 재조합 항체에 대한 전형적인 저하이며 시험관내 안정성 및 생체내 생물학적 기능 모두에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명은 STEAP-1에 결합하고 예를 들어 숙신이미드 형성에 의한 저하에 내성이며 따라서 양호한 안정성을 나타내는, 이중특이성 항체를 포함한 신규의 항체를 제공한다. 상기 제공된 (이중특이성) 항체는 낮은 독성 및 유리한 약동학적 성질과 함께 양호한 효능 및 생산성을 추가로 겸비한다.
본 발명자는 STEAP-1에 결합하는 뜻밖의 개선된 성질을 갖는 신규의 항체를 개발하였다. 특히, 상기 항체는, 예를 들어 숙신이미드 형성에 의한 저하에 내성이며, 따라서 치료학적 목적에 요구되는 바와 같이 특히 안정성이다. 더욱 또한, 발명자는 상기 신규의 STEAP-1 항체를 포함하여, STEAP-1 및 활성화 T 세포 항원에 결합하는 이중특이성 항원 결합 분자를 개발하였다.
따라서, 첫 번째 양태에서 본 발명은 STEAP-1에 결합하는 항체를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 질량 분광분석에 의해 측정된 바와 같이, pH 7.4, 37 ℃에서 4주 후에 약 5% 미만의 숙신이미드 저하, 및/또는 pH 6.0, 40 ℃에서 4주 후에 약 10% 미만의 숙신이미드 저하를 나타낸다.
추가의 양태에서 본 발명은 STEAP-1에 결합하는 항체를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 VH는 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 14의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 항체는 IgG, 특히 IgG1 항체이다. 하나의 실시양태에서, 상기 항체는 전장 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 Fv 분자, scFv 분자, Fab 분자, 및 F(ab')2 분자의 그룹 중에서 선택된 항체 단편이다. 하나의 실시양태에서, 상기 항체는 다중특이성 항체이다.
본 발명은 또한 (a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 부분[여기에서 상기 제1 항원은 STEAP-1이고 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다], 및 (b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부분을 포함하는, 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분의 VH는 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 부분의 VL은 서열번호 14의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원은 CD3, 특히 CD3ε이다. 하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 서열번호 15의 HCDR 1, 서열번호 16의 HCDR 2 및 서열번호 17의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 18의 LCDR 1, 서열번호 19의 LCDR 2 및 서열번호 20의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분의 VH는 서열번호 21의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 부분의 VL은 서열번호 22의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 제1 및/또는 제2 항원 결합 부분은 Fab 분자이다. 하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1, 특히 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체된 Fab 분자이다. 하나의 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 불변 도메인에서 124번 위치의 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧(Kabat)에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고 123번 위치의 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되며, 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고 213번 위치의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된 Fab 분자이다. 하나의 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 부분은 임의적으로 펩타이드 링커를 통해 서로에 융합된다. 하나의 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 부분은 각각 Fab 분자이고, (i) 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되거나, 또는 (ii) 상기 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 하나의 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 항원 결합 부분을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 제3 항원 부분은 상기 제1 항원 결합 부분과 동일하다. 하나의 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 제1, 제2, 및 존재하는 경우, 제3 항원 결합 부분은 각각 Fab 분자이고; (i) 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고 상기 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되거나, 또는 (ii) 상기 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되고; 상기 제3 항원 결합 부분(존재하는 경우)은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 하나의 실시양태에서, 상기 Fc 도메인은 IgG, 특히 IgG1 Fc 도메인이다. 하나의 실시양태에서, 상기 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 하나의 실시양태에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인 중의 아미노산 잔기는 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체되어, 제2 서브유닛의 CH3 도메인내 공동에 위치할 수 있는 제1 서브유닛의 CH3 도메인내 돌기를 생성시키고, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인 중의 아미노산 잔기는 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체되어, 상기 제1 서브유닛의 CH3 도메인내 돌기가 위치할 수 있는 상기 제2 서브유닛의 CH3 도메인내 공동을 생성시킨다. 하나의 실시양태에서, 상기 Fc 도메인은 Fc 수용체에의 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드(들)를 제공한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터(들), 및 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드(들) 또는 발현 벡터(들)를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 진핵생물 세포, 특히 포유동물 세포이다.
또 다른 양태에서, STEAP-1에 결합하는 항체의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하고 b) 상기 항체를 회수하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생성된, STEAP-1에 결합하는 항체를 포함한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체, 이중특이성 항원 결합 분자 및 약학 조성물의 사용 방법을 포함한다. 하나의 양태에서 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체, 이중특이성 항원 결합 분자 또는 약학 조성물을 제공한다. 하나의 양태에서 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체, 이중특이성 항원 결합 분자 또는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시양태에서 상기 질병은 암이다.
또한, 질병의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 용도뿐만 아니라, 개체에서 질병을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 개체에게 치료 유효량의 약학적으로 허용 가능한 형태의 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 포함하는 조성물을 투여함을 포함한다. 특정한 실시양태에서 상기 질병은 암이다. 상기 실시양태 중 어느 하나에서 개채는 바람직하게는 포유동물, 특히 인간이다.
도 1. 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자의 예시적인 배열. (A,D) "1+1 CrossMab" 분자의 삽화. (B,E) 대체 순서의 Crossfab 및 Fab 성분("역전된")을 갖는 "2+1 IgG Crossfab" 분자의 삽화. (C,F) "2+1 IgG Crossfab" 분자의 삽화. (G,K) 대체 순서의 Crossfab 및 Fab 성분("역전된")을 갖는 "1+1 IgG Crossfab" 분자의 삽화. (H,L) "1+1 IgG Crossfab" 분자의 삽화. (I,M) 2개의 CrossFab를 갖는 "2+1 IgG Crossfab" 분자의 삽화. (J,N) 2개의 Crossfab 및 대체 순서의 Crossfab 및 Fab 성분("역전된")을 갖는 "2+1 IgG Crossfab" 분자의 삽화. (O,S) "Fab-Crossfab" 분자의 삽화. (P,T) "Crossfab-Fab" 분자의 삽화. (Q,U) "(Fab)2-Crossfab" 분자의 삽화, (R,V) "Crossfab-(Fab)2" 분자의 삽화, (W,Y) "Fab-(Crossfab)2" 분자의 삽화, (X,Z) "(Crossfab)2-Fab" 분자의 삽화. 검은색 점: 이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 중의 임의의 변형. ++,--: CH1 및 CL 도메인에 임의적으로 도입된 반대 전하의 아미노산. Crossfab 분자를 VH 및 VL 영역의 교환을 포함하는 것으로서 묘사하지만, -CH1 및 CL 도메인에 전하 변형이 도입되지 않은 실시양태에서- CH1 및 CL 도메인의 교환을 선택적으로 포함할 수 있다.
도 2. 실시예에서 제조된 T-세포 이중특이성 (TCB) 항체 분자의 삽화. 모든 시험된 TCB 항체 분자는 전하 변형과 함께 "역전된, 2+1 IgG CrossFab"로서 생성되었다(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, STEAP-1 결합제에서 전하 변형, EE = 147EE, 213E; RK = 123R, 124K).
도 3. 반도르투주맵의 가변 도메인의 서열 분석. (A) 상기 서열 중 핫스폿 위치의 예측. (B) 반도르투주맵의 가변 도메인 서열 중 CDR 영역 및 예측되는 핫스폿의 주석 표시.
도 4. 상이한 STEAP-1 TCB 항체 분자에 의해 유도된, 24h(A) 또는 48h(B) 후 LnCAP 세포를 발현하는 STEAP-1의 T-세포 매개된 용해(E:T = 10:1, 인간 PBMC 효과기 세포). SD와 함께 3회 중복을 묘사한다.
도 5. 주르캣(Jurkat)-NFAT 리포터 세포상의 인간 CD3 및 LnCAP(A) 또는 22Rv1 세포(B)상의 인간 STEAP-1에의 상이한 STEAP-1 TCB 항체 분자의 동시 결합시, 발광에 의해 측정된 바와 같은 주르캣 활성화. STEAP-1-음성 CHO-K1 세포주는 대조용으로서 제공되었다(C). SD와 함께 3회 중복을 묘사한다.
도 6. 인간 STEAP-1-발현 CHO-hSTEAP-1 세포(A) 및 CD3-발현 주르캣 NFAT 세포(B)에의 STEAP-1 TCB 항체 분자의 결합.
도 2. 실시예에서 제조된 T-세포 이중특이성 (TCB) 항체 분자의 삽화. 모든 시험된 TCB 항체 분자는 전하 변형과 함께 "역전된, 2+1 IgG CrossFab"로서 생성되었다(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, STEAP-1 결합제에서 전하 변형, EE = 147EE, 213E; RK = 123R, 124K).
도 3. 반도르투주맵의 가변 도메인의 서열 분석. (A) 상기 서열 중 핫스폿 위치의 예측. (B) 반도르투주맵의 가변 도메인 서열 중 CDR 영역 및 예측되는 핫스폿의 주석 표시.
도 4. 상이한 STEAP-1 TCB 항체 분자에 의해 유도된, 24h(A) 또는 48h(B) 후 LnCAP 세포를 발현하는 STEAP-1의 T-세포 매개된 용해(E:T = 10:1, 인간 PBMC 효과기 세포). SD와 함께 3회 중복을 묘사한다.
도 5. 주르캣(Jurkat)-NFAT 리포터 세포상의 인간 CD3 및 LnCAP(A) 또는 22Rv1 세포(B)상의 인간 STEAP-1에의 상이한 STEAP-1 TCB 항체 분자의 동시 결합시, 발광에 의해 측정된 바와 같은 주르캣 활성화. STEAP-1-음성 CHO-K1 세포주는 대조용으로서 제공되었다(C). SD와 함께 3회 중복을 묘사한다.
도 6. 인간 STEAP-1-발현 CHO-hSTEAP-1 세포(A) 및 CD3-발현 주르캣 NFAT 세포(B)에의 STEAP-1 TCB 항체 분자의 결합.
정의
하기에 달리 정의되지 않는 한, 용어들은 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "항원 결합 분자"란 용어는 그의 가장 넓은 의미로, 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 예는 면역글로불린 및 그의 유도체, 예를 들어 단편이다.
"이중특이성"이란 용어는 항원 결합 분자가 적어도 2개의 별개의 항원 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 이중특이성 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함하며, 이들은 각각 상이한 항원 결정인자에 특이적이다. 몇몇 실시양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 2개의 항원 결정인자, 특히 2개의 별개의 세포상에서 발현된 2개의 항원 결정인자에 동시에 결합할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "결합가"란 용어는 항원 결합 분자 중의 명시된 수의 항원 결합 부위의 존재를 나타낸다. 이와 같이, "항원에의 1가 결합"이란 용어는 항원 결합 분자 중의 항원에 특이적인 하나(및 하나 이하)의 항원 결합 부위의 존재를 나타낸다.
"항원 결합 부위"는 항원과의 상호작용을 제공하는 항원 결합 분자의 부위, 즉 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 부위는 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 본래의 면역글로불린 분자는 전형적으로 2개의 항원 결합 부위를 가지며, Fab 분자는 전형적으로 단일 항원 결합 부위를 갖는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "항원 결합 부분"이란 용어는 항원 결정인자에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 분자를 지칭한다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 부분은 상기 부분이 부착된 개체(예를 들어 제2 항원 결합 부분)가 표적 부위, 예를 들어 항원 결정인자를 갖는 특정 유형의 종양 세포로 향하게 할 수 있다. 또 다른 실시양태에서 항원 결합 부분은 그의 표적 항원, 예를 들어 T 세포 수용체 복합 항원을 통해 신호전달을 활성화시킬 수 있다. 항원 결합 부분은 본 명세서에서 추가로 정의되는 바와 같은 항체 및 그의 단편을 포함한다. 특정한 항원 결합 부분은 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항원 결합 부분은 본 명세서에 추가로 정의되고 당해 분야에 공지된 바와 같은 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변 영역은 5개의 아이소타입: α, δ, ε, γ, 또는 μ 중 어느 하나를 포함한다. 유용한 경쇄 불변 영역은 2개의 아이소타입: κ 및 λ 중 어느 하나를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "항원 결정인자"란 용어는 "항원" 및 "에피토프"와 유의어이며, 항원 결합 부분이 결합하여, 항원 결합 부분-항원 복합체를 형성하는 폴리펩타이드 거대분자상의 부위(예를 들어 아미노산의 연속적인 신장부 또는 비-연속적인 아미노산의 상이한 영역들로 구성된 입체형태적 배열)를 지칭한다. 유용한 항원 결정인자는 예를 들어 종양 세포의 표면상에서, 바이러스-감염된 세포의 표면상에서, 다른 병든 세포의 표면상에서, 면역 세포의 표면상에서, 혈청 및/또는 세포외 기질(ECM) 중에서 자유롭게 발견될 수 있다. 본 명세서에서 항원으로서 지칭되는 단백질(예를 들어 STEAP-1, CD3)은 달리 표시되지 않는 한, 임의의 척추동물 공급원, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 영장류(예를 들어 인간), 비-인간 영장류(예를 들어 키노몰구스 원숭이) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)로부터의 임의의 본래 형태의 단백질일 수 있다. 특정한 실시양태에서 상기 항원은 인간 단백질이다. 본 명세서에서 특정한 단백질을 참조하는 경우, 상기 용어는 "전장"의 가공되지 않은 단백질뿐만 아니라, 세포 중에서의 가공으로부터 생성되는 임의의 형태의 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 상기 단백질의 천연 변이체, 예를 들어 이어맞추기 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 항원으로서 유용한 예시적인 인간 단백질은 CD3, 특히 CD3의 입실론 서브유닛(인간 서열에 대해서 UniProt no. P07766(버전 185), NCBI RefSeq no. NP_000724.1, 서열번호 24; 또는 키노몰구스[필리핀 원숭이] 서열에 대해서 UniProt no. Q95LI5(버전 69), NCBI GenBank no. BAB71849.1, 서열번호 25 참조), 또는 STEAP-1(전립선 1의 6-막관통 상피 항원; UniProt no. Q9UHE8(버전 137); 인간 서열에 대해서 NCBI RefSeq no. NP_036581.1, 서열번호 23 참조)이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자는 상이한 종들로부터의 CD3 또는 STEAP-1 항원들간에 보존되는 CD3 또는 STEAP-1의 에피토프에 결합한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자는 인간 STEAP-1에 결합한다.
"특이적 결합"은 상기 결합이 항원에 대해 선택성이며 불필요하거나 비-특이적인 상호작용과 구별될 수 있음을 의미한다. 특정한 항원 결정인자에 결합하는 항원 결합 부분의 능력은 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA) 또는 당해 분야의 숙련가에게 친숙한 다른 기법, 예를 들어 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법(예를 들어 BIAcore 장비상에서 분석된다)(문헌[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)]), 및 전통적인 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)])을 통해 측정될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 관련되지 않은 단백질에 대한 항원 결합 부분의 결합 정도는 예를 들어 SPR에 의해 측정되는 바와 같이 항원에 대한 항원 결합 부분의 결합의 약 10% 미만이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항원에 결합하는 항원 결합 부분, 또는 상기 항원 결합 부분을 포함하는 항원 결합 분자는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, 또는 ≤0.001 nM(예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
"친화성"은 분자(예를 들어 수용체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 짝(예를 들어 리간드)간의 비-공유 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원들(예를 들어 항원 결합 부분과 항원, 또는 수용체와 그의 리간드)간의 1:1 상호작용을 반영하는 본래의 결합 친화성을 지칭한다. 분자 X의 그의 짝 Y에 대한 친화성을 일반적으로 해리 상수(KD)에 의해 나타낼 수 있으며, 상기 상수는 해리 및 결합속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비이다. 따라서, 균등한 친화성은 상기 속도 상수들의 비가 동일하게 남아있는 한 상이한 속도 상수를 포함할 수도 있다. 친화성을 본 명세서에 기재된 것들을 포함하여 당해 분야에 공지된 잘 확립된 방법에 의해 측정할 수 있다. 친화성의 특정한 측정 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR)이다.
"감소된 결합", 예를 들어 Fc 수용체에의 감소된 결합은 예를 들어 SPR에 의해 측정된 바와 같이, 각 상호작용에 대한 친화성의 감소를 지칭한다. 명확성을 위해서, 상기 용어는 또한 0(또는 분석 방법의 검출 한계 미만), 즉 상호작용의 완전한 제거까지의 친화성의 감소를 포함한다. 환언하면, "증가된 결합"은 각 상호작용에 대한 결합 친화성의 증가를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "활성화 T 세포 항원"은 T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구(항원 결합 분자와 상호작용시 T 세포 활성화를 유도할 수 있다)의 표면상에서 발현되는 항원 결정인자를 지칭한다. 구체적으로, 항원 결합 분자와 활성화 T 세포 항원의 상호작용은 상기 T 세포 수용체 복합체의 신호전달 캐스케이드를 촉발시킴으로써 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. 특정한 실시양태에서 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 CD3의 입실론 서브유닛(인간 서열에 대해서 UniProt no. P07766(버전 144), NCBI RefSeq no. NP_000724.1, 서열번호 24; 또는 키노몰구스[필리핀 원숭이] 서열에 대해서 UniProt no. Q95LI5(버전 49), NCBI GenBank no. BAB71849.1, 서열번호 25 참조)이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "T 세포 활성화"는 증식, 분화, 사이토킨 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현 중에서 선택된, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 하나 이상의 세포 반응을 지칭한다. T 세포 활성화 측정에 적합한 분석은 당해 분야에 공지되어 있으며 본 명세서에 기재되어 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "표적 세포 항원"은 표적 세포, 예를 들어 암세포와 같은 종양 중의 세포 또는 종양 기질의 세포의 표면상에 존재하는 항원 결정인자를 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 상기 표적 세포 항원은 STEAP-1, 특히 인간 STEAP-1이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, Fab 분자에 관하여 "제1", "제2" 또는 "제3" 등과 같은 용어는 하나 초과의 각 유형의 부분이 존재하는 경우 구분의 편이성을 위해 사용된다. 이들 용어의 사용은 명백히 서술되지 않는 한 이중특이성 항원 결합 분자의 특정한 순서 또는 배향을 부여하고자 하는 것이 아니다.
"융합된"은 성분(예를 들어 Fab 분자 및 Fc 도메인 서브유닛)이 펩타이드 결합에 의해, 직접 또는 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결됨을 의미한다.
"Fab 분자"는 면역글로불린의 중쇄("Fab 중쇄")의 VH 및 CH1 도메인 및 경쇄("Fab 경쇄")의 VL 및 CL 도메인으로 이루어지는 단백질을 지칭한다.
"크로스오버" Fab 분자(또한 "Crossfab"라 칭한다)는 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 또는 불변 도메인이 교환된(즉 서로에 의해 교체된) Fab 분자를 의미한다, 즉 크로스오버 Fab 분자는 경쇄 가변 도메인 VL 및 중쇄 불변 도메인 1 CH1(VL-CH1, N-에서 C-말단 방향으로)으로 구성된 펩타이드 쇄, 및 중쇄 가변 도메인 VH 및 경쇄 불변 도메인 CL(VH-CL, N-에서 C-말단 방향으로)으로 구성된 펩타이드 쇄를 포함한다. 명확성을 위해서, 상기 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인들이 교환된 크로스오버 Fab 분자에서, 상기 중쇄 불변 도메인 1 CH1을 포함하는 펩타이드 쇄를 본 명세서에서 (크로스오버) Fab 분자의 "중쇄"로서 지칭한다. 환언하면, 상기 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 도메인들이 교환된 크로스오버 Fab 분자에서, 상기 중쇄 가변 도메인 VH를 포함하는 펩타이드 쇄를 본 명세서에서 (크로스오버) Fab 분자의 "중쇄"로서 지칭한다.
상기에 대조적으로, "통상적인" Fab 분자는 천연 포맷의, 즉 중쇄 가변 및 불변 도메인(VH-CH1, N-에서 C-말단 방향으로)으로 구성된 중쇄 및 경쇄 가변 및 불변 도메인(VL-CL, N-에서 C-말단 방향으로)으로 구성된 경쇄를 포함하는 Fab 분자를 의미한다.
"면역글로불린 분자"란 용어는 천연 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, IgG 부류의 면역글로불린은 다이설파이드-결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-에서부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 도메인(VH)(또한 가변 중 도메인 또는 중쇄 가변 영역이라 칭한다)에 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)(또한 중쇄 불변 영역이라 칭한다)을 갖는다. 유사하게, N-에서부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 도메인(VL)(또한 가변 경 도메인 또는 경쇄 가변 영역이라 칭한다)에 이어서 불변 경(CL) 도메인(또한 경쇄 불변 영역이라 칭한다)을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG), 또는 μ(IgM)라 칭하는 5가지 유형 중 하나로 할당될 수 있으며, 이들 중 일부는 하위 유형, 예를 들어 γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 경쇄를 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 근거로, 카파(κ) 및 람다(λ)라 칭하는 2가지 유형 중 하나로 할당할 수 있다. 면역글로불린은 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결된, 2개의 Fab 분자 및 Fc 도메인으로 필수적으로 이루어진다.
본 명세서에서 "항체"란 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되며 다양한 항체 구조, 예를 들어 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "단클론 항체"란 용어는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 획득되는 항체를 지칭한다, 즉 상기 집단 중에 포함된 개별적인 항체들은 동일하고/하거나, 상기 단클론 항체의 생성 중 발생할 수 있는 가능한 변이체(상기와 같은 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 상기 항원상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 따라서, "단클론"이라는 수식어구는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 획득된다는 항체의 특징을 가리키며, 임의의 특정한 방법에 의한 상기 항체의 생성을 요구하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체를 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 부분을 함유하는 트랜스제닉 동물을 사용하는 방법에 의해 제조할 수 있으며, 상기와 같은 방법 및 단클론 항체의 다른 예시적인 제조 방법들은 본 발명에 개시되어 있다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 것, 즉 그의 자연 환경 중에 있지 않은 것이다. 특정 수준의 정제가 필요하지 않다. 예를 들어, 단리된 항체를 그의 본래 또는 자연 환경으로부터 제거할 수 있다. 숙주 세포에서 발현된 재조합적으로 생성된 항체는 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나, 분별되거나, 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 본래 또는 재조합 항체이므로 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 이와 같이, 본 발명의 항체 및 이중특이성 항원 결합 분자는 단리된다. 일부 실시양태에서, 항체를 예를 들어 전기영동(예를 들어 SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 측정된 바와 같은 95% 또는 99%를 초과하는 순도로 정제시킨다. 항체 순도의 평가를 위한 방법에 대한 리뷰를 위해, 예를 들어 문헌[Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)] 참조.
"전장 항체", "온전한 항체" 및 "완전 항체"란 용어는 본 명세서에서 본래의 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하기 위해 호환 가능하게 사용된다.
"항체 단편"은 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 상기 완전 항체의 일부를 포함하는 상기 완전 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 다이아바디, 선형 항체, 단쇄 항체 분자(예를 들어 scFv), 및 단일-도메인 항체를 포함한다. 몇몇 항체 단편의 리뷰를 위해서, 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)] 참조. scFv 단편의 리뷰를 위해서, 예를 들어 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 참조; 또한 WO 93/16185; 및 미국특허 제 5,571,894 호 및 미국특허 제 5,587,458 호 참조. 구조 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의에 대해서, 미국특허 제 5,869,046 호 참조. 다이아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어 EP 0 404 097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)] 참조. 트라이아바디 및 테트라바디가 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9, 129-134(2003)]에 개시되어 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부 또는 경쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이다. 몇몇 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(문헌[Domantis, Inc., Waltham, MA]; 예를 들어 미국특허 제 6,248,516 B1 호 참조). 항체 단편을 본 발명에 개시된 바와 같은 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 완전 항체의 단백질분해 절단뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어 에스케리키아 콜라이 또는 파지)에 의한 생산에 의해 제조할 수 있다.
"항원 결합 도메인"이란 용어는 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 이들에 상보성인 구역을 포함하는 항체의 부분을 지칭한다. 항원 결합 도메인은 예를 들어 하나 이상의 항체 가변 도메인(또한 항체 가변 영역이라 칭한다)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이란 용어는 항원에 대한 항체의 결합에 관련된 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 본래 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조들을 가지며, 이때 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 고가변 영역(HVR)을 포함한다. 예를 들어 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91(2007)] 참조. 단일의 VH 또는 VL 도메인이면 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 가변 영역 서열과 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "카밧 넘버링"은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 의해 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 모든 불변 영역 및 도메인의 아미노산 위치는 본 명세서에서 "카밧에 따른 넘버링" 또는 "카밧 넘버링"이라 지칭되는, 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 기재된 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다. 구체적으로 상기 카밧 넘버링 시스템(문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 647-660 페이지 참조)은 카파 및 람다 아이소타입의 경쇄 불변 도메인 CL에 대해 사용되고, 카밧 EU 지수 넘버링 시스템(661-723 페이지 참조)은 중쇄 불변 도메인(CH1, 힌지, CH2 및 CH3)에 대해 사용되며, 이를 본 명세서에서, 상기의 경우에 "카밧 EU 지수에 따른 넘버링"이라 칭함으로써 더욱 명확히 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "고가변 영역" 또는 "HVR"이란 용어는 서열이 고가변성이고("상보성 결정 영역" 또는 "CDR") 및/또는 구조적으로 한정된 고리("고가변 고리")를 형성하고 및/또는 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")를 함유하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 중의 3개(H1, H2, H3), 및 VL 중의 3개(L1, L2, L3)를 포함한다. 본 명세서에서 예시적인 HVR은
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101 (H3)에서 존재하는 고가변 고리(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]);
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)에서 존재하는 CDR(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]);
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)에서 존재하는 항원 접촉부(문헌[MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]); 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)을 포함하는, (a), (b) 및/또는 (c)의 조합
을 포함한다.
달리 표시하지 않는 한, 가변 도메인 중의 HVR 잔기 및 다른 잔기(예를 들어 FR 잔기)를 본 명세서에서 상기 카밧 등에 따라 넘버링한다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 고가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 상응하게, 상기 HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기의 순서로 존재한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메릭 항체를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기에서 상기 HVR(예를 들어 CDR)의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 항체의 것들에 상응하며, 상기 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 항체의 것들에 상응한다. 상기와 같은 가변 도메인을 본 명세서에서 "인간화된 가변 영역"이라 칭한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화된 항체 중의 일부 FR 잔기를 비-인간 항체(예를 들어 HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환시켜, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화성을 복원시키거나 개선시킨다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다. 본 발명에 의해 포함되는 "인간화된 항체"의 다른 형태는 불변 영역이 원래 항체의 경우로부터 추가로 변형되거나 또는 변화되어, 특히 Clq 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 관하여 본 발명에 따른 성질을 생성시키는 것들이다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특별히 제외시킨다. 몇몇 실시양태에서, 인간 항체는 비-인간 트랜스제닉 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼로부터 유래된다. 몇몇 실시양태에서, 인간 항체는 하이브리도마 세포주로부터 유래된다. 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편을 또한 본 명세서에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주한다.
항체 또는 면역글로불린의 "부류"는 이들의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5개의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 다수는 하위부류(아이소타입)들, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 세분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류들에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 칭한다.
본 명세서에서 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"이란 용어는 상기 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 한정하는데 사용된다. 상기 용어는 고유 서열 Fc 영역 및 변형 Fc 영역을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 변할 수도 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 대개 Cys226으로부터 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복시-말단까지 연장되는 것으로 한정된다. 그러나, 숙주 세포에 의해 생산된 항체는 상기 중쇄의 C-말단으로부터 하나 이상, 특히 하나 또는 2개의 아미노산의 번역-후 절단을 겪을 수도 있다. 따라서, 전장 중쇄를 암호화하는 특정한 핵산 분자의 발현에 의해 숙주 세포에 의해 생산된 항체는 전장 중쇄를 포함하거나, 또는 전장 중쇄의 절단된 변이체(또한 본 명세서에서 "절단된 변형 중쇄"라 칭한다)를 포함할 수 있다. 이는 상기 중쇄의 최종 2개의 C-말단 아미노산이 글리신(G446) 및 리신(K447, 카밧 EU 지수에 따른 넘버링)인 경우일 수 있다. 따라서, 상기 Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447) 또는 C-말단 글리신(Gly446) 및 리신(K447)이 존재할 수도, 또는 존재하지 않을 수도 있다. Fc 도메인(또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛)을 포함하는 중쇄의 아미노산 서열을 본 명세서에서 달리 나타내지 않는 한 C-말단 글리신-리신 다이펩타이드 없이 나타낸다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자에 포함된, 본 명세서에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛을 포함한 중쇄는 추가적인 C-말단 글리신-리신 다이펩타이드(G446 및 K447, 카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자에 포함된, 본 명세서에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛을 포함한 중쇄는 추가적인 C-말단 글리신 잔기(G446, 카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 본 발명의 조성물, 예를 들어 본 명세서에 기재된 약학 조성물은 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 집단을 포함한다. 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 집단은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 절단된 변형 중쇄를 갖는 분자를 포함할 수 있다. 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 집단은, 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%가 절단된 변형 중쇄를 갖는, 전장 중쇄를 갖는 분자 및 절단된 변형 중쇄를 갖는 분자의 혼합물로 이루어질 수 있다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 집단을 포함하는 조성물은 추가적인 C-말단 글리신-리신 다이펩타이드(G446 및 K447, 카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)와 함께 본 명세서에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 집단을 포함하는 조성물은 추가적인 C-말단 글리신 잔기(G446, 카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)와 함께 본 명세서에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 상기와 같은 조성물은 본 명세서에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛을 포함하는 중쇄를 포함하는 분자로 구성된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자; 추가적인 C-말단 글리신 잔기(G446, 카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)와 함께 본 명세서에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛을 포함하는 중쇄를 포함하는 분자; 및 추가적인 C-말단 글리신-리신 다이펩타이드(G446 및 K447, 카밧의 EU 지수에 따른 넘버링)와 함께 본 명세서에 명시된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛을 포함하는 중쇄를 포함하는 분자의 집단을 포함한다. 본 명세서에 달리 명시되지 않는 한, 상기 Fc 영역 또는 불변 영역 중의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 넘버링 시스템(또한 EU 지수라 칭한다)(또한 상기 참조)에 따른다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 Fc 도메인의 "서브유닛"은 이량체성 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩타이드 중 하나, 즉 안정한 자기-회합이 가능한, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 예를 들어, IgG Fc 도메인의 서브유닛은 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
"Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형"은 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩타이드가 동일한 폴리펩타이드와 회합하여 동종이량체를 형성하는 것을 감소시키거나 방지하는, 펩타이드 주쇄의 조작 또는 Fc 도메인 서브유닛의 번역-후 변형이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 회합을 촉진하는 변형은 회합을 원하는 2개의 Fc 도메인 서브유닛(즉 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛) 각각에 대해 수행된 별도의 변형들을 포함하며, 여기에서 상기 변형들은 상기 두 Fc 도메인 서브유닛의 회합을 촉진하기 위해서 서로에 상보성이다. 예를 들어, 회합을 촉진하는 변형은, 상기 Fc 도메인 서브유닛의 회합을 각각 입체적으로 또는 정전기적으로 유리하게 만들도록 이들 서브유닛 중 하나 또는 둘 다의 구조 또는 전하를 변경시킬 수 있다. 따라서, (이종)이량체화는 제1 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩타이드와 제2 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩타이드 사이에서 일어나며, 이들은 각각의 서브유닛에 융합된 추가의 성분(예를 들어 항원 결합 부분)이 동일하지 않다는 의미에서 동일하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 회합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인 중의 아미노산 돌연변이, 구체적으로 아미노산 치환을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 회합을 촉진하는 변형은 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 각각에, 별도의 아미노산 돌연변이, 구체적으로 아미노산 치환을 포함한다.
"효과기 기능"이란 용어는, 항체 아이소타입에 따라 변하는 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성들을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적인 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC), 항체-의존적인 세포 식작용(ADCP), 사이토킨 분비, 항원 제공 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 흡수, 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "조작하다, 조작된, 조작하는"이란 용어는 펩타이드 주쇄의 임의의 조작 또는 천연 또는 재조합 폴리펩타이드 또는 그의 단편의 번역-후 변형을 포함하는 것으로 간주된다. 조작은 아미노산 서열의, 글리코실화 패턴의, 또는 개별적인 아미노산의 측쇄 그룹의 변형뿐만 아니라 이들 접근법의 조합을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "아미노산 돌연변이"란 용어는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포함함을 의미한다. 최종 구조물이 목적하는 특성, 예를 들어 Fc 수용체에의 감소된 결합, 또는 또 다른 펩타이드와의 증가된 회합을 갖는 한, 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의의 조합을 수행하여 최종 생성물에 도달할 수 있다. 아미노산 서열 결실 및 삽입은 아미노산의 아미노- 및/또는 카복시-말단 결실 및 삽입을 포함한다. 특정한 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들어 Fc 영역의 결합 특성을 변경시키기 위해서, 비-보존적 아미노산 치환, 즉 하나의 아미노산의, 상이한 구조 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산에 의한 교체가 특히 바람직하다. 아미노산 치환은 비-천연 아미노산에 의한 또는 20개의 표준 아미노산의 천연 아미노산 유도체(예를 들어 4-하이드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-하이드록시리신)에 의한 교체를 포함한다. 아미노산 돌연변이를 당해 분야에 주지된 유전학적 또는 화학적 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 유전학적 방법은 부위-지향된 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 유전자 조작 이외의 방법, 예를 들어 화학적 변형에 의해 아미노산의 측쇄 그룹을 변경시키는 방법이 또한 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 동일한 아미노산 돌연변이를 나타내기 위해 본 명세서에서 다양한 명칭을 사용할 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인의 329번 위치의 프롤린으로부터 글리신으로의 치환을 329G, G329, G329, P329G, 또는 Pro329Gly로서 나타낼 수 있다.
참조 폴리펩타이드 서열에 관한 "아미노산 서열 일치성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우 최대의 서열 일치성 퍼센트를 성취하기 위해서, 및 상기 서열 일치성의 부분으로서 어떠한 보존적인 치환도 고려하지 않고, 서열과 도입 틈을 정렬시킨 후에, 기준 폴리펩타이드 서열 중의 아미노산 잔기들과 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기들의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 일치성 퍼센트를 측정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식들로, 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, Clustal W, 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어 또는 FASTA 프로그램 패키지를 사용하여 성취될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 서열들을 정렬시키기에 적합한 매개변수들, 예를 들어 비교하는 서열들의 전체길이에 대해 최대의 정렬을 성취하기 위해 필요한 임의의 연산을 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서, 아미노산 서열 일치성% 값을 BLOSUM50 비교 행렬과 함께 FASTA 패키지 버전 36.3.8c 또는 이후의 ggsearch 프로그램을 사용하여 생성시킨다. 상기 FASTA 프로그램 패키지는 문헌[W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448]; 문헌[W. R. Pearson (1996) "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzymol. 266:227- 258]; 및 문헌[Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36]에 기재되어 있으며, http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml로부터 공개적으로 입수할 수 있다. 한편으로, http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi에서 접근가능한 공개 서버를 사용하여 서열을 비교하고, ggsearch(전체 단백질:단백질) 프로그램 및 디폴트 옵션(BLOSUM50; 끊김: -10; 확장: -2; Ktup = 2)을 사용하여 국소적인 정렬보다는 전체적인 정렬을 수행하도록 한다. 아미노산 일치성 퍼센트를 출력 정렬 헤더에 제공한다.
"폴리뉴클레오타이드"란 용어는 단리된 핵산 분자 또는 구조물, 예를 들어 전령 RNA(mRNA), 바이러스-유래된 RNA, 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비-통상적인 결합(예를 들어 아미드 결합, 예를 들어 펩타이드 핵산(PNA) 중에서 발견되는 결합을 포함할 수 있다. "핵산 분자"란 용어는 폴리뉴클레오타이드 중에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들어 DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드는 그의 본래 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 목적을 위해 단리된 벡터 중에 함유된 폴리펩타이드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오타이드가 고려된다. 단리된 폴리뉴클레오타이드의 추가의 예는 이종 숙주 세포 중에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 용액 중 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 통상적으로 함유하는 세포 중에 함유된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하지만, 상기 폴리뉴클레오타이드 분자는 염색체외에 존재하거나 또는 그의 자연적인 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사물뿐만 아니라 양성 및 음성 가닥 형태, 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 합성적으로 생성된 상기와 같은 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 전사 종결자와 같은 조절 요소이거나 또는 상기를 포함할 수 있다.
"[예를 들어 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자]를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드(또는 핵산)"는 단일 벡터 또는 별도의 벡터 중의 상기와 같은 폴리뉴클레오타이드 분자(들), 및 숙주 세포 중의 하나 이상의 장소에 존재하는 상기와 같은 핵산 분자(들)를 포함하여, 항체 중쇄 및 경쇄(또는 그의 단편)를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 분자를 지칭한다.
"발현 카세트"란 용어는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 명시된 핵산 요소와 함께 재조합적으로 또는 합성적으로 생성되는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 상기 재조합 발현 카세트를 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 또는 핵산 단편에 통합시킬 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열들 중에서도 전사되는 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 발현 카세트는 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
"벡터" 또는 "발현 벡터"란 용어는 특정한 유전자를 상기가 세포에서 작동적으로 관련되도록 도입시키고 그의 발현을 지시하는데 사용되는 DNA 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조물로서 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈내에 통합된 벡터를 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 다량의 안정한 mRNA의 전사를 허용한다. 일단 상기 발현 벡터가 세포내에 있으면, 상기 유전자에 의해 암호화되는 리보핵산 분자 또는 단백질이 상기 세포 전사 및/또는 번역 기구에 의해 생성된다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
"숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"이란 용어는 호환적으로 사용되며 상기와 같은 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이들은 계대의 수와 상관 없이 1차 형질전환된 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일할 필요는 없으며, 돌연변이를 함유할 수도 있다. 원래 형질전환된 세포에 대해 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손은 본 발명에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 생성시키는데 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어 몇가지 언급하자면, 포유동물 배양된 세포, 예를 들어 HEK 세포, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포를 포함하나, 또한 트랜스제닉 동물, 트랜스제닉 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포를 포함한다.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 도메인에 의한 맞물림에 이어서 수용체-함유 세포를 자극하여 효과기 기능을 수행하는 신호전달 사건을 이끌어내는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32), 및 FcαRI(CD89)를 포함한다.
항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)은 면역 효과기 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해에 이르는 면역 기전이다. 상기 표적 세포는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 그의 유도체가 일반적으로 상기 Fc 영역에 대해 N-말단인 단백질 부분을 통해 특이적으로 결합하는 세포이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "감소된 ADCC"란 용어는 상기 정의된 ADCC의 기전에 의해 주어진 시간에, 표적 세포 주변의 매질 중에서 주어진 농도의 항체를 용해시키는 표적 세포수의 감소, 및/또는 ADCC의 기전에 의해 주어진 시간에 주어진 수의 표적 세포의 용해를 성취하는데 요구되는, 상기 표적 세포 주변의 매질 중 항체의 농도의 증가로서 정의된다. 상기 ADCC의 감소는 동일한 표준 생성, 정제, 제형화 및 보관 방법(당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다)을 사용하여, 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성된, 그러나 조작되지는 않은 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC에 대한 것이다. 예를 들어 Fc 도메인 중에 ADCC를 감소시키는 아미노산 치환을 포함하는 항체에 의해 매개되는 ADCC의 감소는 상기 Fc 도메인 중에 상기 아미노산 치환이 없는 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC에 비례한다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석은 당해 분야에 주지되어 있다(예를 들어 PCT 공보 WO 2006/082515 또는 PCT 공보 WO 2012/130831 참조).
작용제의 "유효량"은 상기 작용제가 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 생성시키기에 필요한 양을 지칭한다.
작용제, 예를 들어 약학 조성물의 "치료 유효량"은 필요한 투여량 및 기간 동안 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하기에 유효한 양을 지칭한다. 작용제의 치료 유효량은 예를 들어 질병의 부작용을 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화하거나 또는 방지한다.
"개체" 또는 "피실험자"는 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 가축(예를 들어 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 비인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한다. 특히, 상기 개체 또는 피실험자는 인간이다.
"약학 조성물"이란 용어는, 함유된 활성 성분의 생물학적 활성을 유효하게 하는 형태이고 조성물이 투여되는 피실험자에게 허용 가능하지 않게 독성인 추가적인 성분은 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"는 활성 성분 외에, 피실험자에게 무독성인 약학 조성물 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 비제한적으로 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "치료"(및 "치료하다" 및 "치료하는"과 같은 그의 문법상 어미변화)는 치료 중인 개체에서 질병의 자연적인 과정을 변경시키고자 하는 임상적 중재를 지칭하며, 예방을 위해서 또는 임상적 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질병의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 사용하여 질병의 발생을 지연시키거나 또는 질병의 진행을 늦춘다.
"패키지 삽입지"는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 함유하는, 상기와 같인 치료 제품의 상업적인 패키지 중에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하는데 사용된다.
실시양태의 상세한 설명
본 발명은 STEAP-1, 특히 인간 STEAP-1에 결합하고, 예를 들어 숙신이미드 형성에 의한 저하에 내성이며, 따라서 치료학적 목적에 요구되는 바와 같이 특히 안정성인 항체 및 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 또한, 상기 분자는 예를 들어 효능 및/또는 안전성뿐만 아니라 생산성에 관하여, 치료학적 용도에 유리한 다른 성질을 또한 갖는다.
STEAP-1 항체
따라서, 첫 번째 양태에서 본 발명은 STEAP-1에 결합하는 항체를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 질량 분광분석에 의해 측정된 바와 같이, pH 7.4, 37 ℃에서 4주 후에 약 5% 미만의 숙신이미드 저하, 및/또는 pH 6.0, 40 ℃에서 4주 후에 약 10% 미만의 숙신이미드 저하를 나타낸다. 하나의 실시양태에서, 상기 항체는 질량 분광분석에 의해 측정된 바와 같이, pH 7.4, 37 ℃에서 4주 후에 약 3% 미만의 숙신이미드 저하, 특히 약 1% 미만의 숙신이미드 저하를 나타낸다. 하나의 실시양태에서, 상기 항체는 질량 분광분석에 의해 측정된 바와 같이, pH 6.0, 40 ℃에서 4주 후에 약 7.5% 미만의 숙신이미드 저하, 특히 약 5% 미만의 숙신이미드 저하를 나타낸다.
추가의 양태에서 본 발명은 STEAP-1에 결합하는 항체를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 1의 HCDR 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 6의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 7의 LCDR 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간화된 항체이다. 하나의 실시양태에서, 상기 VH는 인간화된 VH이고/이거나 상기 VL은 인간화된 VL이다. 하나의 실시양태에서, 상기 항체는 상기 실시양태 중 어느 하나에서와 같은 CDR을 포함하고, 수용체 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 콘센서스 프레임워크를 추가로 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 VH는 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 14의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 VH는 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 VH 서열, 및 서열번호 14의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 VL 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 또는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항체는 STEAP-1에 결합하는 능력은 유지한다. 몇몇 실시양태에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 11, 12 또는 13에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고/되었거나, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호 14에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 밖의 영역에서(즉 FR에서) 발생한다. 임의적으로, 상기 항체는 서열번호 11, 12 또는 13의 VH 서열 및/또는 서열번호 14의 VL 서열, 및 상기 서열의 번역-후 변형을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 그룹 중에서 선택된 VH 서열, 및 서열번호 14의 VL 서열을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 13의 VH 서열 및 서열번호 14의 VL 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 항체는 인간 불변 영역을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 항체는 인간 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 분자, 특히 인간 CH1, CH2, CH3 및/또는 CL 도메인을 포함하는 IgG 부류 면역글로불린 분자이다. 인간 불변 도메인의 예시적인 서열을 서열번호 39 및 40(각각 인간 카파 및 람다 CL 도메인) 및 서열번호 41(인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 CH1-CH2-CH3)에 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 39 또는 서열번호 40의 아미노산 서열, 특히 서열번호 39의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 서열번호 41의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
특히, 상기 중쇄 불변은 본 명세서에 기재된 바와 같이 Fc 도메인 중에 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 항체는 단클론 항체이다.
하나의 실시양태에서, 상기 항체는 IgG, 특히 IgG1 항체이다. 하나의 실시양태에서, 상기 항체는 전장 항체이다.
하나의 실시양태에서, 상기 항체는 Fc 도메인, 특히 IgG Fc 도메인, 보다 특히 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 하나의 실시양태에서 상기 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 상기 항체의 Fc 도메인은 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인과 관련하여 본 명세서에 기재된 특징들 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 Fv 분자, scFv 분자, Fab 분자, 및 F(ab')2 분자; 특히 Fab 분자의 그룹 중에서 선택된 항체 단편이다.
또 다른 실시양태에서, 상기 항체 단편은 다이아바디, 트라이아바디 또는 테트라바디이다.
추가의 양태에서, 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 항체는 하기의 섹션에 기재되는 바와 같은 특징들 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다.
글리코실화 변이체
몇몇 실시양태에서, 본 발명에 제공된 항체를 상기 항체가 글리코실화되는 정도가 증가하거나 또는 감소하도록 변경시킨다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실을 편의상 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 수행할 수 있다.
상기 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 상기에 부착된 올리고사카라이드를 변경시킬 수도 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 고유 항체는 전형적으로 상기 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 이중촉각 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들어 문헌[Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)] 참조). 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물들, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산뿐만 아니라 상기 이중촉각 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 중 GlcNAc에 부착된 퓨코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체에서 상기 올리고사카라이드의 변형을 몇몇 개선된 성질들을 갖는 항체 변이체를 생성시키기 위해 수행할 수도 있다.
하나의 실시양태에서, 퓨코실화되지 않은 올리고사카라이드, 즉 Fc 영역에 부착된(직접적으로 또는 간접적으로) 퓨코스가 없는 올리고사카라이드 구조를 갖는 항체 변이체를 제공한다. 상기와 같은 퓨코실화되지 않은 올리고사카라이드(또한 "아퓨코실화된" 올리고사카라이드라 칭한다)는 특히 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 줄기 중 제1 GlcNAc에 부착된 퓨코스 잔기가 없는 N-결합된 올리고사카라이드이다. 하나의 실시양태에서, 본래 또는 모 항체에 비해 Fc 영역 중에 증가된 비율의 퓨코실화되지 않은 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체를 제공한다. 예를 들어, 상기 퓨코실화되지 않은 올리고사카라이드의 비율은 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 적어도 약 80%, 또는 심지어 약 100%(즉 퓨코실화된 올리고사카라이드가 존재하지 않는다)일 수 있다. 상기 퓨코실화되지 않은 올리고사카라이드의 백분율은 예를 들어 WO 2006/082515에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광분석에 의해 측정시 Asn297에 부착된 모든 올리고사카라이드(예를 들어 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조)의 합에 비해, 퓨코스 잔기가 없는 올리고사카라이드의 (평균) 양이다. Asn297은 Fc 영역 중의 약 297번 위치에 위치한 아스파라진 잔기를 지칭하지만(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링); Asn297은 또한 항체 중의 작은 서열 변화로 인해, 297번 위치의 상류 또는 하류 약 ±3 아미노산, 즉 294 내지 300번 위치에 위치할 수 있다. 상기 Fc 영역 중에 증가된 비율의 퓨코실화되지 않은 올리고사카라이드를 갖는 상기와 같은 항체는 개선된 FcγRIIIa 수용체 결합 및/또는 개선된 효과기 기능, 특히 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어 US 2003/0157108; US 2004/0093621 참조.
감소된 퓨코실화를 갖는 항체를 생성시킬 수 있는 세포주의 예는 단백질 퓨코실화 결함성 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; US 2003/0157108; 및 WO 2004/056312, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-퓨코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들어 문헌[Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004)]; 문헌[Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조), 또는 GDP-퓨코스 합성 또는 수송 단백질의 활성이 감소되거나 제거된 세포(예를 들어 US2004259150, US2005031613, US2004132140, US2004110282 참조)를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 양분된 올리고사카라이드, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 양분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체를 제공한다. 상기와 같은 항체 변이체는 상술한 바와 같은 감소된 퓨코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체의 예는 예를 들어 문헌[Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)]; 문헌[Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)]; WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878에 기재되어 있다.
상기 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 중에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체를 또한 제공한다. 상기와 같은 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 개시되어 있다.
시스테인 조작된 항체 변이체
몇몇 실시양태에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "thioMAb"를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 상기 항체의 접근가능한 부위에 위치하며, 이를 사용하여 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이 상기 항체를 다른 부분, 예를 들어 약물 부분 또는 링커-약물 부분에 접합시켜 면역접합체를 생성시킬 수 있다. 시스테인 조작된 항체를 예를 들어 미국특허 제 7,521,541 호, 미국특허 제 8,30,930 호, 미국특허 제 7,855,275 호, 미국특허 제 9,000,130 호 또는 WO2016040856에 기재된 바와 같이 생성시킬 수 있다.
항체 유도체
몇몇 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체를, 당해 분야에 공지되고 쉽게 입수할 수 있는 추가적인 비단백질성 부분을 함유하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 부분은 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수 중 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며 분지되거나 분지되지 않을 수도 있다. 상기 항체에 부착된 중합체들의 수는 변할 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 부착되는 경우, 이들 중합체는 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 상기 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형을 비제한적으로, 개선시키고자 하는 상기 항체의 특정한 성질 또는 기능, 상기 이중특이성 항체 유도체를 한정된 조건하에서 치료법에 사용할 것인지의 여부 등을 포함한 고려사항을 기준으로 결정할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 방사선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 부분의 접합체를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 비단백질성 부분은 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 상기 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 비제한적으로 통상적인 세포에는 해롭지 않지만 상기 비단백질성 부분을, 상기 항체-비단백질성 부분에 근접한 세포를 죽이는 온도로 가열하는 파장을 포함한다.
면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 치료제, 예를 들어 세포독성제, 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된(화학적으로 결합된) 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-STEAP-1 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
하나의 실시양태에서, 면역접합체는 항체가 상기 언급한 치료제 중 하나 이상에 접합된 항체-약물 접합체(ADC)이다. 상기 항체를 전형적으로는 링커를 사용하여 상기 치료제 중 하나 이상에 연결시킨다. 치료제 및 약물 및 링커의 예를 포함한 ADC 기술의 개요는 문헌[Pharmacol Review 68:3-19 (2016)]에 제시되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 그의 단편, 예를 들어 비제한적으로 디프테리아-A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류라이테스 포르디이 단백질, 다이안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센에 접합된 본 발명에 개시된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사성접합체를 형성하는 본 발명에 개시된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소들을 방사성접합체의 생성에 이용할 수 있다. 예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 상기 방사성접합체가 검출에 사용되는 경우 상기 접합체는 섬광조영술 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵자기 공명(NMR) 영상화(또한 자기공명 영상화, mri로서 공지됨)용 스핀 표지, 예를 들어 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체를 다양한 이중기능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이중작용성 유도체(예를 들어 다이메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스터(예를 들어 다이숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소시아네이트(예를 들어 톨루엔 2,6-다이아이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌[Vitetta et al., Science 238:1098(1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-아이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(MX-DTPA)은 상기 항체에의 방사성핵종의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026 참조. 상기 링커는 세포 중의 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단성 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(문헌[Chari et al., Cancer Res. 52:127-131(1992)]; 미국특허 제 5,208,020 호)를 사용할 수 있다.
상기 면역접합체 또는 ADC는 가교결합제 시약, 예를 들어 비제한적으로 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(숙신이미딜-4-(비닐설폰)벤조에이트)(이들은 예를 들어 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc.), 미국 일리노이주 록빌 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있다)로 제조된 상기와 같은 접합체가 본 발명에서 명백히 고려된다.
다중특이성 항체
몇몇 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 예를 들어 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 부위, 즉 상이한 항원상의 상이한 에피토프 또는 동일한 항원상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 다중특이성 항체는 3 또는 그 이상의 결합 특이성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 상기 결합 특이성 중 하나는 STEAP-1에 대한 것이며 다른(2 이상) 특이성은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 몇몇 실시양태에서, 이중특이성 항체는 STEAP-1의 2개(또는 그 이상)의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다중특이성(예를 들어 이중특이성) 항체를 또한, 세포독성제 또는 세포를 STEAP-1을 발현하는 세포로 국소화하는데 사용할 수 있다. 다중특이성 항체를 완전 길이 항체 또는 항체 단편으로부터 제조할 수 있다.
다중특이성 항체의 제조 기법은 비제한적으로 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현(문헌[Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))] 참조), 및 "놉-홀" 공학(예를 들어 미국특허 제 5,731,168 호 및 문헌[Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)] 참조)을 포함한다. 다중특이성 항체를 또한 항체 Fc-이종이량체성 분자의 제조를 위한 공학 정전기 스티어링 효과(예를 들어 WO 2009/089004 참조); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교-결합(예를 들어 미국특허 제 4,676,980 호, 및 문헌[Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이성 항체를 생성시키기 위한 류신 지퍼의 사용(예를 들어 문헌[Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 및 WO 2011/034605 참조); 경쇄 잘못 짝짓기 문제를 우회하기 위한 공통적인 경쇄 기술의 사용(예를 들어 WO 98/50431 참조); 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 "다이아바디" 기술의 사용(예를 들어 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단쇄 Fv(sFv) 이량체의 사용(예를 들어 문헌[Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌[Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 3중특이성 항체의 제조에 의해 제조할 수 있다.
"옥토퍼스 항체" 또는 DVD-Ig를 포함하여, 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본 명세서에 포함된다(예를 들어 WO 2001/77342 및 WO 2008/024715 참조). 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다중특이성 항체의 다른 예를 WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO2010/145792, 및 WO 2013/026831에서 찾을 수 있다. 상기 이중특이성 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 STEAP-1뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위, 또는 STEAP-1의 2개의 상이한 에피토프를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들어 US 2008/0069820 및 WO 2015/095539 참조).
다중-특이성 항체를 또한 동일한 항원 특이성의 하나 이상의 결합 가지 중에 도메인 크로스오버를 갖는 비대칭 형태로, 즉 VH/VL 도메인(예를 들어 WO 2009/080252 및 WO 2015/150447 참조), CH1/CL 도메인(예를 들어 WO 2009/080253 참조) 또는 완전한 Fab 가지(예를 들어 WO 2009/080251, WO 2016/016299, 또한 문헌[Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191], 및 문헌[Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20] 참조)를 교환함으로써 제공할 수 있다. 비대칭 Fab 가지를 또한, 하전된 또는 하전되지 않은 아미노산 돌연변이를 도메인 계면에 도입시켜 Fab 짝짓기를 유도함으로써 조작할 수 있다. 예를 들어 WO 2016/172485 참조.
다중특이성 항체에 대한 다양한 추가의 분자 포맷이 당해 분야에 공지되어 있으며 본 명세서에 포함된다(예를 들어 문헌[Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106] 참조).
또한 본 명세서에 포함된, 특정 유형의 다중특이성 항체는 T 세포를 재표적화하여 표적 세포를 사멸시키기 위해, 표적 세포, 예를 들어 종양 세포상의 표면 항원에, 및 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 활성화, 불변 성분, 예를 들어 CD3에 동시에 결합하도록 설계된 이중특이성 항체이다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 다중특이성 항체, 특히 이중특이성 항체이며, 여기에서 상기 결합 특이성 중 하나는 STEAP-1에 대한 것이고, 다른 하나는 CD3에 대한 것이다.
상기 목적에 유용할 수 있는 이중특이성 항체 포맷의 예는 비제한적으로 소위 "BiTE"(이중특이성 T 세포 관여자) 분자(여기에서 2개의 scFv 분자가 가요성 링커에 의해 융합된다)(예를 들어 WO2004/106381, WO2005/061547, WO2007/042261, 및 WO2008/119567, 문헌[Nagorsen and Buerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)] 참조); 다이아바디(문헌[Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)]) 및 그의 유도체, 예를 들어 탠덤 다이아바디("TandAb"; 문헌[Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-56 (1999)]); 다이아바디 포맷을 기본으로 하지만 추가적인 안정화를 위한 C-말단 다이설파이드 가교를 특징으로 하는 "DART"(이중 친화성 재표적화) 분자(문헌[Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)]), 및 소위 트라이오맵(완전 하이브리드 마우스/래트 IgG 분자이다(문헌[Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)]에 리뷰되어 있다))를 포함한다. 본 명세서에 포함된 특정한 T 세포 이중특이성 항체 포맷은 WO 2013/026833, WO2013/026839, WO 2016/020309; 문헌[Bacac et al., Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498]에 기재되어 있다.
STEAP-1 및 제2 항원에 결합하는 이중특이성 항원 결합 분자
본 발명은 또한 이중특이성 항원 결합 분자, 즉 2개의 별개의 항원 결정인자(제1 및 제2 항원)에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 2개의 항원 결합 부분을 포함하는 항원 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 특정한 실시양태에 따라, 상기 이중특이성 항원 결합 분자에 포함된 항원 결합 부분은 Fab 분자(즉, 각각 가변 및 불변 도메인을 포함하는 중쇄 및 경쇄로 구성된 항원 결합 도메인)이다. 하나의 실시양태에서, 상기 제1 및/또는 제2 항원 결합 부분은 Fab 분자이다. 하나의 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간이다. 특정한 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간화된다. 더욱 또 다른 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
바람직하게, 상기 항원 결합 부분 중 적어도 하나는 크로스오버 Fab 분자이다. 상기와 같은 변형은 상이한 Fab 분자로부터 중쇄 및 경쇄의 잘못 짝짓기를 감소시켜, 재조합체 생성에서 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선시킨다. 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자에 유용한 특정한 크로스오버 Fab 분자에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인(각각 VL 및 VH)이 교환된다. 그러나 이러한 도메인 교환의 경우에조차, 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 제조는 잘못짝지은 중쇄와 경쇄간의 소위 벤스 존스-유형 상호작용으로 인해 몇몇 부산물을 포함할 수 있다(문헌[Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191] 참조). 상이한 Fab 분자로부터 중쇄 및 경쇄의 잘못짝짓기를 추가로 감소시키고 따라서 목적하는 이중특이성 항원 결합 분자의 순도 및 수율을 증가시키기 위해서, 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산을 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같은, 제1 항원(STEAP-1)에 결합하는 Fab 분자(들) 또는 제2 항원(예를 들어 활성화 T 세포 항원, 예를 들어 CD3)에 결합하는 Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인 중의 특정한 아미노산 위치에 도입시킬 수 있다. 전하 변형은 이중 특이성 항원 결합 분자 중에 포함된 통상적인 Fab 분자(들)(예를 들어 도 1 A-C, G-J에 되시된 바와 같은)에서, 또는 상기 이중특이성 항원 결합 분자 중에 포함된 VH/VL 크로스오버 Fab 분자(들)(예를 들어 도 1 D-F, K-N에 도시된 바와 같은)에서 이루어 질 수 있다(그러나 둘 다는 아님). 특정한 실시양태에서, 상기 전하 변형은 이중특이성 항원 결합 분자 중에 포함된 통상적인 Fab 분자(들)(상기는 특정 실시양태에서 제1 항원, 즉 STEAP-1에 결합한다)에서 이루어진다.
본 발명에 따른 특정한 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 항원(즉 STEAP-1) 및 제2 항원(예를 들어 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3)에 동시에 결합할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 동시에 결합하는 STEAP-1 및 활성화 T 세포 항원에 의해 T 세포 및 표적 세포와 가교결합할 수 있다. 훨씬 더 특정한 실시양태에서, 상기와 같은 동시적인 결합은 표적 세포, 특히 STEAP-1 발현 종양 세포의 용해를 생성시킨다. 하나의 실시양태에서, 상기와 같은 동시적인 결합은 T 세포의 활성화를 생성시킨다. 다른 실시양태에서, 상기와 같은 동시적인 결합은 증식, 분화, 사이토킨 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현의 그룹 중에서 선택된, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 세포 반응을 생성시킨다. 하나의 실시양태에서, STEAP-1에의 동시적인 결합 없이, 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3에의 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 결합은 T 세포 활성화를 생성시키지 않는다.
하나의 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 T 세포의 세포독성 활성을 표적 세포로 다시 향하게 할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 다시-향하는 것은 표적 세포에 의한 MHC-매개된 펩타이드 항원 제공 및/또는 T 세포의 특이성과 관련이 없다. 특히, 본 발명의 실시양태 중 어느 하나에 따른 T 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 실시양태에서 상기 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 특히 CD8+ T 세포이다.
제1 항원 결합 부분
본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 STEAP-1(제1 항원)에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부분, 특히 Fab 분자를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 STEAP-1에 결합하는 2개의 항원 결합 부분, 특히 Fab 분자를 포함한다. 특정한 상기와 같은 실시양태에서, 각각의 이들 항원 결합 부분은 동일한 항원 결정인자에 결합한다. 훨씬 더 특정한 실시양태에서, 상기 항원 결합 부분은 모두 동일하다, 즉 이들은 본 명세서에 기재된 바와 같은 CH1 및 CL 도메인 중에 동일한 아미노산 치환(존재하는 경우)을 포함하여 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 STEAP-1에 결합하는 2개 이하의 항원 결합 부분, 특히 Fab 분자를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 상기 STEAP-1에 결합하는 항원 결합 부분(들)은 통상적인 Fab 분자이다. 상기와 같은 실시양태에서, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 부분(들)은 본 명세서에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 서로에 의해 교환/대체된 Fab 분자이다.
또 다른 실시양태에서, 상기 STEAP-1에 결합하는 항원 결합 부분(들)은 본 명세서에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 서로에 의해 교환/대체된 Fab 분자이다. 상기와 같은 실시양태에서, 제2 항원에 결합하는 항원 결합 부분(들)은 통상적인 Fab 분자이다.
상기 STEAP-1 결합 부분은 상기 이중특이성 항원 결합 분자를 표적 부위로, 예를 들어 STEAP-1을 발현하는 특정 유형의 종양 세포로 향하게 할 수 있다.
상기 이중특이성 항원 결합 분자의 제1 항원 결합 부분은 과학적으로 분명히 불합리하지 않거나 불가능하지 않은 한, STEAP-1에 결합하는 항체와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 (a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 부분[여기에서 상기 제1 항원은 STEAP-1에 결합하고 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다], 및 (b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부분을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다.
특정한 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 1의 HCDR 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 6의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 7의 LCDR 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 인간화된 항체(로부터 유래된)이다. 하나의 실시양태에서, 상기 VH는 인간화된 VH이고/이거나 상기 VL은 인간화된 VL이다. 하나의 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 상기 실시양태 중 어느 하나에서와 같은 CDR을 포함하고, 수용체 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 콘센서스 프레임워크를 추가로 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분의 VH는 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 항원 결합 부분의 VL은 서열번호 14의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 VH 서열, 및 서열번호 14의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 VL 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 그룹 중에서 선택된 VH 서열, 및 서열번호 14의 VL 서열을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 13의 VH 서열 및 서열번호 14의 VL 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 인간 불변 영역을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 인간 불변 영역, 특히 인간 CH1 및/또는 CL 도메인을 포함하는 Fab 분자이다. 인간 불변 도메인의 예시적인 서열을 서열번호 39 및 40(각각 인간 카파 및 람다 CL 도메인) 및 서열번호 41(인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 CH1-CH2-CH3)에 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 39 또는 서열번호 40의 아미노산 서열, 특히 서열번호 39의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 상기 경쇄 불변 영역은 "전하 변형" 하에 본 명세서에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함하고/하거나 크로스오버 Fab 분자 중에 있는 경우 하나 이상(특히 2개)의 N-말단 아미노산의 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 41의 아미노산 서열 중에 포함된 CH1 도메인 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 상기 중쇄 불변 영역(구체적으로 CH1 도메인)은 "전하 변형" 하에 본 명세서에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
제2 항원 결합 부분
본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 항원(STEAP-1과 상이한)에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부분, 특히 Fab 분자를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 부분은 본 명세서에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 서로에 의해 교환/대체된 Fab 분자이다. 상기와 같은 실시양태에서, 상기 제1 항원(즉 STEAP-1)에 결합하는 항원 결합 부분(들)은 바람직하게는 통상적인 Fab 분자이다. 상기 이중특이성 항원 결합 분자 중에 포함된 STEAP-1에 결합하는 하나 초과의 항원 결합 부분, 특히 Fab 분자가 존재하는 실시양태에서, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 부분은 바람직하게는 크로스오버 Fab 분자이며 상기 STEAP-1에 결합하는 항원 결합 부분은 통상적인 Fab 분자이다.
또 다른 실시양태에서, 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 부분은 통상적인 Fab 분자이다. 상기와 같은 실시양태에서, 상기 제1 항원(즉 STEAP-1)에 결합하는 항원 결합 부분(들)은 본 명세서에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 서로에 의해 교환/대체된 Fab 분자이다. 상기 이중특이성 항원 결합 분자 중에 포함된 제2 항원에 결합하는 하나 초과의 항원 결합 부분, 특히 Fab 분자가 존재하는 실시양태에서, 상기 STEAP-1에 결합하는 항원 결합 부분은 바람직하게는 크로스오버 Fab 분자이며 상기 제2 항원에 결합하는 항원 결합 부분은 통상적인 Fab 분자이다.
일부 실시양태에서, 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원(또한 본 명세서에서 "활성화 T 세포 항원 결합 부분, 또는 활성화 T 세포 항원 결합 Fab 분자"라 칭한다)이다. 특정한 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이하의 항원 결합 부분을 포함한다. 하나의 실시양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 상기 활성화 T 세포 항원에 대해 1가 결합을 제공한다.
특정한 실시양태에서, 상기 제2 항원은 CD3, 특히 인간 CD3(서열번호 24) 또는 키노몰구스 CD3(서열번호 25), 가장 특히 인간 CD3이다. 하나의 실시양태에서 상기 제2 항원 결합 부분은 인간 및 키노몰구스 CD3에 대해 교차-반응성이다(즉 특이적으로 결합한다). 일부 실시양태에서, 상기 제2 항원은 CD3의 입실론 서브유닛(CD3 입실론)이다.
하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 서열번호 15의 HCDR 1, 서열번호 16의 HCDR 2, 서열번호 17의 HCDR 3, 서열번호 18의 LCDR 1, 서열번호 19의 LCDR 2 및 서열번호 20의 LCDR 3을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 서열번호 15의 HCDR 1, 서열번호 16의 HCDR 2 및 서열번호 17의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 18의 LCDR 1, 서열번호 19의 LCDR 2 및 서열번호 20의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 인간화된 항체(로부터 유래된)이다. 하나의 실시양태에서, 상기 VH는 인간화된 VH이고/이거나 상기 VL은 인간화된 VL이다. 하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 상기 실시양태 중 어느 하나에서와 같은 CDR을 포함하고, 수용체 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 콘센서스 프레임워크를 추가로 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 서열번호 21의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 VH 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 서열번호 22의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 VL 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 서열번호 21의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 VH 서열, 및 서열번호 22의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 VL 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분의 VH는 서열번호 21의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 항원 결합 부분의 VL은 서열번호 22의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 서열번호 21의 VH 서열, 및 서열번호 22의 VL 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 인간 불변 영역을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 인간 불변 영역, 특히 인간 CH1 및/또는 CL 도메인을 포함하는 Fab 분자이다. 인간 불변 도메인의 예시적인 서열을 서열번호 39 및 40(각각 인간 카파 및 람다 CL 도메인) 및 서열번호 41(인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 CH1-CH2-CH3)에 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 서열번호 39 또는 서열번호 40의 아미노산 서열, 특히 서열번호 39의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 상기 경쇄 불변 영역은 "전하 변형" 하에 본 명세서에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함하고/하거나 크로스오버 Fab 분자 중에 있는 경우 하나 이상(특히 2개)의 N-말단 아미노산의 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 서열번호 41의 아미노산 서열 중에 포함된 CH1 도메인 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 상기 중쇄 불변 영역(구체적으로 CH1 도메인)은 "전하 변형" 하에 본 명세서에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1, 특히 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체된 Fab 분자이다(즉 상기와 같은 실시양태에 따라, 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 도메인이 교환된 크로스오버 Fab 분자이다). 하나의 상기와 같은 실시양태에서, 제1(및 제3, 존재하는 경우) 항원 결합 부분은 통상적인 Fab 분자이다.
하나의 실시양태에서, 제2 항원(예를 들어 활성화 T 세포 항원, 예를 들어 CD3)에 결합하는 하나 이하의 항원 결합 부분이 상기 이중특이성 항원 결합 분자 중에 존재한다(즉 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 항원에 대해 1가 결합을 제공한다).
전하 변형
본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 비-합치 중쇄(벤스-존스-유형 부산물)와 경쇄의 잘못짝짓기[이는 이들의 결합 가지 중 하나(이상, 2개 초과의 항원-결합 Fab 분자를 포함하는 분자의 경우에)에서 VH/VL 교환과 함께 Fab-기재 이중-/다중특이성 항원 결합 분자의 생성에서 발생할 수 있다]를 감소시키기에 특히 효율적인, 상기 분자 중에 포함된 Fab 분자의 아미노산 치환을 포함할 수 있다(또한 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된 PCT 공보 WO 2015/150447, 특히 상기 중의 실시예 참조). 바람직하지 못한 부산물, 특히 결합 가지 중 하나에서 VH/VL 도메인 교환과 함께 이중특이성 항원 결합 분자에서 발생하는 벤스 존스-유형 부산물에 대한 목적하는 이중특이성 항원 결합 분자의 비를, CH1 및 CL 도메인 중의 특정한 아미노산 위치에 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산을 도입시킴으로써 개선시킬 수 있다(때때로 본 명세서에서 "전하 변형"이라 칭한다).
상응하게, 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 제1 및 제2 항원 결합 부분이 둘 다 Fab 분자인 일부 실시양태에서, 및 상기 항원 결합 부분 중 하나(특히 제2 항원 결합 부분)에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되며,
i) 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산은 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환되거나(카밧 EU 지수에 따른 넘버링); 또는
ii) 상기 제2 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 상기 제2 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산은 음으로 하전된 아미노산에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
상기 이중특이성 항원 결합 분자는 i) 및 ii)하에서 언급된 변형을 모두 포함하지는 않는다. 상기 VH/VL 교환을 갖는 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로에 의해 교체되지 않는다(즉 교환되지 않고 남아있는다).
보다 특정한 실시양태에서,
i) 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환되거나(카밧 EU 지수에 따른 넘버링); 또는
ii) 상기 제2 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 상기 제2 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 상기와 같은 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
추가의 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
특정한 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 123번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되며(카밧에 따른 넘버링), 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
보다 특정한 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 123번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되며(카밧에 따른 넘버링), 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
훨씬 더 특정한 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 123번 위치의 아미노산은 아르기닌(R)에 의해 치환되며(카밧에 따른 넘버링), 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
특정한 실시양태에서, 상기 실시양태에 따른 아미노산 치환이 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1 중에서 이루어지는 경우, 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL은 카파 아이소타입의 것이다.
한편으로, 상기 실시양태에 따른 아미노산 치환은 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1 대신에 상기 제2 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 이루어질 수 있다. 특정한 상기와 같은 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL은 카파 아이소타입의 것이다.
상응하게, 하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 상기 제2 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산 또는 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
추가의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 상기 제2 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
더욱 또 다른 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 123번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되며(카밧에 따른 넘버링), 상기 제2 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 123번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되며(카밧에 따른 넘버링), 상기 제2 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
또 다른 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 123번 위치의 아미노산은 아르기닌(R)에 의해 치환되며(카밧에 따른 넘버링), 상기 제2 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
특정한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는
(a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 부분[여기에서 상기 제1 항원은 STEAP-1이고 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자이다], 및 (b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부분(여기에서 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되는 Fab 분자이다)을 포함하며, 여기에서
상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 넘버링)(특정한 실시양태에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로), 123번 위치의 아미노산은 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧에 따른 넘버링)(특정한 실시양태에서 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 독립적으로), 상기 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환되고(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)에 의해 독립적으로 치환된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
이중특이성 항원 결합 분자 포맷
본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자의 성분을 다양한 배열로 서로 융합시킬 수 있다. 예시적인 배열을 도 1에 묘사한다.
특정한 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자 중에 포함된 항원 결합 부분은 Fab 분자이다. 상기와 같은 실시양태에서, 제1, 제2, 제3 등의 항원 결합 부분을 본 명세서에서 각각 제1, 제2, 제3 등의 Fab 분자라 칭할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 제1 및 제2 항원 결합 부분을 임의적으로 펩타이드 링커를 통해 서로에 융합시킨다. 특정한 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 항원 결합 부분은 각각 Fab 분자이다. 하나의 상기와 같은 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 또 다른 상기와 같은 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. (i) 상기 제2 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되거나, 또는 (ii) 상기 제1 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된 실시양태에서, 추가로 상기 제1 항원 결합 부분의 Fab 경쇄 및 상기 제2 항원 결합 부분의 Fab 경쇄를 임의적으로 펩타이드 링커를 통해 서로에 융합시킬 수 있다.
표적 세포 항원, 예를 들어 STEAP-1에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 항원 결합 부분(예를 들어 Fab 분자)을 갖는 이중특이성 항원 결합 분자(예를 들어 도 1A, D, G, H, K, L에 도시된 바와 같은)가, 특히 상기 표적 세포 항원의 내면화가 고친화성 항원 결합 부분의 결합에 이어서 예상되는 경우에 유용하다. 상기와 같은 경우에, 표적 세포 항원에 특이적인 하나 초과의 항원 결합 부분의 존재는 상기 표적 세포 항원의 내면화를 증대시킬 수 있으며, 이에 의해 그의 유용성이 감소될 수 있다. 그러나, 다른 경우에 표적 세포 항원에 특이적인 2개 이상의 항원 결합 부분(예를 들어 Fab 분자)을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자(예를 들어 도 1B, 1C, 1E, 1F, 1I, 1J, 1M 또는 1N에 도시된 예 참조)는, 예를 들어 표적 부위에 대한 표적화를 최적화하거나 표적 세포 항원의 가교결합을 허용하는데 유리할 것이다.
상응하게, 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 항원 결합 부분을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분은 제1 항원, 즉 STEAP-1에 결합한다. 하나의 실시양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분은 Fab 분자이다.
하나의 실시양태에서, 상기 제3 항원 부분은 제1 항원 결합 부분과 동일하다. 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 제3 항원 결합 부분은 과학적으로 분명히 불합리하지 않거나 불가능하지 않은 한, STEAP-1에 결합하는 제1 항원 결합 부분 및/또는 항체와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분은 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분은 서열번호 1의 HCDR 1, 서열번호 2의 HCDR 2 및 서열번호 6의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 7의 LCDR 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분은 인간화된 항체(로부터 유래된)이다. 하나의 실시양태에서, 상기 VH는 인간화된 VH이고/이거나 상기 VL은 인간화된 VL이다. 하나의 실시양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분은 상기 실시양태 중 어느 하나에서와 같은 CDR을 포함하고, 수용체 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 콘센서스 프레임워크를 추가로 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분의 VH는 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제3 항원 결합 부분의 VL은 서열번호 14의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분은 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 VH 서열, 및 서열번호 14의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 VL 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분은 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분은 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 그룹 중에서 선택된 VH 서열, 및 서열번호 14의 VL 서열을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분은 서열번호 13의 VH 서열 및 서열번호 14의 VL 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분은 인간 불변 영역을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분은 인간 불변 영역, 특히 인간 CH1 및/또는 CL 도메인을 포함하는 Fab 분자이다. 인간 불변 도메인의 예시적인 서열을 서열번호 39 및 40(각각 인간 카파 및 람다 CL 도메인) 및 서열번호 41(인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 CH1-CH2-CH3)에 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분은 서열번호 39 또는 서열번호 40의 아미노산 서열, 특히 서열번호 39의 아미노산 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 상기 경쇄 불변 영역은 "전하 변형" 하에 본 명세서에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함하고/하거나 크로스오버 Fab 분자 중에 있는 경우 하나 이상(특히 2개)의 N-말단 아미노산의 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분은 서열번호 41의 아미노산 서열 중에 포함된 CH1 도메인 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 상기 중쇄 불변 영역(구체적으로 CH1 도메인)은 "전하 변형" 하에 본 명세서에 기재된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 제3 및 제1 항원 결합 부분은 각각 Fab 분자이고 상기 제3 항원 결합 부분은 상기 제1 항원 결합 부분과 동일하다. 따라서, 이들 실시양태에서, 상기 제1 및 제3 항원 결합 부분은 동일한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하며 도메인들의 동일한 배열(즉 통상적이거나 크로스오버)을 갖는다. 더욱 또한, 이들 실시양태에서, 상기 제3 항원 결합 부분은 상기 제1 항원 결합 부분과 동일한 아미노산 치환(존재하는 경우)을 포함한다. 예를 들어 본 명세서에서 "전하 변형"으로서 기재된 아미노산 치환이 상기 각각의 제1 항원 결합 부분 및 제3 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1 중에서 이루어질 것이다. 한편으로, 상기 아미노산 치환은 상기 제2 항원 결합 부분(특정한 실시양태에서 또한 Fab 분자이다)의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서 이루어질 수 있으나, 상기 제1 항원 결합 부분 및 제3 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에서는 이루어질 수 없다.
제1 항원 결합 부분처럼, 제3 항원 결합 부분은 특히 통상적인 Fab 분자이다. 그러나, 상기 제1 및 제3 항원 결합 부분이 크로스오버 Fab 분자인(및 상기 제2 항원 결합 부분이 통상적인 Fab 분자인) 실시양태가 또한 고려된다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 상기 제1 및 제3 항원 결합 부분은 각각 통상적인 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 결합 부분은 본 명세서에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교환/교체된 Fab 분자이다. 다른 실시양태에서, 상기 제1 및 제3 항원 결합 부분은 각각 크로스오버 Fab 분자이고 상기 제2 항원 결합 부분은 통상적인 Fab 분자이다.
제3 항원 결합 부분이 존재하는 경우, 특정한 실시양태에서 제1 및 제3 항원 부분은 STEAP-1에 결합하고 제2 항원 결합 부분은 제2 항원, 특히 활성화 T 세포 항원, 보다 특히 CD3, 가장 특히 CD3 입실론에 결합한다.
특정한 실시양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함한다. 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛은 안정하게 회합할 수 있다.
본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는 상이한 배열을 가질 수 있다, 즉 제1, 제2(및 임의적으로 제3) 항원 결합 부분이 서로 및 Fc 도메인에 상이한 방식으로 융합될 수 있다. 상기 성분들은 서로에 직접 또는 바람직하게는 하나 이상의 적합한 펩타이드 링커를 통해 융합될 수 있다. Fab 분자의 융합이 Fc 도메인의 서브유닛의 N-말단에 대한 경우, 이는 전형적으로 면역글로불린 힌지 영역을 통해서이다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 부분은 각각 Fab 분자이고 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C 말단에서 상기 제2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 또는 상기 Fc 도메인의 서브유닛 중 다른 하나의 N-말단에 융합될 수 있다. 특정한 상기와 같은 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 통상적인 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 결합 부분은 본 명세서에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 상기 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교환/교체된 Fab 분자이다. 다른 상기와 같은 실시양태에서, 상기 제1 Fab 분자는 크로스오버 Fab 분자이고 상기 제2 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다.
하나의 실시양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 부분은 각각 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되고, 상기 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정한 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩타이드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1G 및 1K에 도식적으로 묘사된다(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이다). 임의적으로, 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가로 서로 융합될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 부분은 각각 Fab 분자이고, 상기 제1 및 제2 항원 결합 부분은 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다. 특정한 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩타이드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제1 및 제2 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1A 및 1D에 도식적으로 묘사된다(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이고 제1 항원 결합 부분은 통상적인 Fab 분자이다). 상기 제1 및 제2 Fab 분자는 상기 Fc 도메인에 직접 또는 펩타이드 링커를 통해 융합될 수 있다. 특정한 실시양태에서 상기 제1 및 제2 Fab 분자는 각각 상기 Fc 도메인에 면역글로불린 힌지 영역을 통해 융합된다. 특정한 실시양태에서, 상기 면역글로불린 힌지 영역은, 특히 상기 Fc 도메인이 IgG1 Fc 도메인인 경우, 인간 IgG1 힌지 영역이다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 부분은 각각 Fab 분자이고, 상기 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 또는 (상술한 바와 같이) 상기 Fc 도메인의 서브유닛 중 다른 하나의 N-말단에 융합된다. 특정한 상기와 같은 실시양태에서, 상기 제1 항원 결합 부분은 통상적인 Fab 분자이고, 상기 제2 항원 결합 부분은 본 명세서에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 상기 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교환/교체된 Fab 분자이다. 다른 상기와 같은 실시양태에서, 상기 제1 Fab 분자는 크로스오버 Fab 분자이고 상기 제2 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다.
하나의 실시양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 부분은 각각 Fab 분자이고, 상기 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되고, 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정한 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩타이드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1H 및 1L에 도식적으로 묘사된다(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이고 제1 항원 결합 부분은 통상적인 Fab 분자이다). 임의적으로, 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가로 서로에 융합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제3 항원 결합 부분, 특히 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 특정한 상기와 같은 실시양태에서, 상기 제1 및 제3 Fab 분자는 각각 통상적인 Fab 분자이고, 상기 제2 Fab 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 상기 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교환/교체된 Fab 분자이다. 다른 상기와 같은 실시양태에서, 상기 제1 및 제3 Fab 분자는 크로스오버 Fab 분자이고 상기 제2 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다.
특정한 실시양태에서, 제2 및 제3 항원 결합 부분은 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정한 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩타이드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되며, 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1B 및 1E(이들 예에서 제2 항원 결합 부분은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이고 제1 및 제3 항원 결합 부분은 통상적인 Fab 분자이다), 및 도 1J 및 1N(이들 예에서 제2 항원 결합 부분은 통상적인 Fab 분자이고, 제1 및 제3 항원 결합 부분은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이다)에 도식적으로 묘사된다. 상기 제2 및 제3 Fab 분자를 상기 Fc 도메인에 직접적으로 또는 펩타이드 링커를 통해 융합시킬 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 제2 및 제3 Fab 분자는 각각 Fc 도메인에 면역글로불린 힌지 영역을 통해 융합된다. 특정한 실시양태에서, 상기 면역글로불린 힌지 영역은, 특히 상기 Fc 도메인이 IgG1 Fc 도메인인 경우, 인간 IgG1 힌지 영역이다. 임의적으로, 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가로 서로에 융합될 수 있다.
또 다른 상기와 같은 실시양태에서, 제1 및 제3 항원 결합 부분은 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 제2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정한 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩타이드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되며, 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1C 및 1F(이들 예에서 제2 항원 결합 부분은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이고 제1 및 제3 항원 결합 부분은 통상적인 Fab 분자이다), 및 도 1I 및 1M(이들 예에서 제2 항원 결합 부분은 통상적인 Fab 분자이고, 제1 및 제3 항원 결합 부분은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이다)에 도식적으로 묘사된다. 상기 제1 및 제3 Fab 분자를 상기 Fc 도메인에 직접적으로 또는 펩타이드 링커를 통해 융합시킬 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 제1 및 제3 Fab 분자는 각각 Fc 도메인에 면역글로불린 힌지 영역을 통해 융합된다. 특정한 실시양태에서, 상기 면역글로불린 힌지 영역은, 특히 상기 Fc 도메인이 IgG1 Fc 도메인인 경우, 인간 IgG1 힌지 영역이다. 임의적으로, 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 추가로 서로에 융합될 수 있다.
Fab 분자가 Fab 중쇄의 C-말단에서 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인의 각각의 서브유닛의 N-말단에 융합되는 이중특이성 항원 결합 분자의 배열에서, 2개의 Fab 분자, 힌지 영역 및 Fc 도메인은 면역글로불린 분자를 필수적으로 형성한다. 특정한 실시양태에서 상기 면역글로불린 분자는 IgG 부류 면역글로불린이다. 훨씬 더 특정한 실시양태에서 상기 면역글로불린은 IgG1 하위부류 면역글로불린이다. 또 다른 실시양태에서 상기 면역글로불린은 IgG4 하위부류 면역글로불린이다. 추가의 특정한 실시양태에서 상기 면역글로불린인 인간 면역글로불린이다. 다른 실시양태에서 상기 면역글로불린은 키메릭 면역글로불린 또는 인간화된 면역글로불린이다. 하나의 실시양태에서, 상기 면역글로불린은 인간 불변 영역, 특히 인간 Fc 영역을 포함한다.
본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자 중 일부에서, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 임의적으로 펩타이드 링커를 통해 서로에 융합된다. 상기 제1 및 제2 Fab 분자의 배열에 따라, 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄는 그의 C-말단에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합되거나, 또는 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 그의 C-말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합될 수 있다. 상기 제1 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄의 융합은 합치되지 않은 Fab 중쇄 및 경쇄의 잘못짝짓기를 추가로 감소시키며, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자 중 일부의 발현에 필요한 플라스미드의 수를 또한 감소시킨다.
상기 항원 결합 부분은 상기 Fc 도메인에 또는 서로에 직접적으로, 또는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로는 약 2 내지 20 아미노산을 포함하는 펩타이드 링커를 통해 융합될 수 있다. 펩타이드 링커는 당해 분야에 공지되어 있으며 본 명세서에 기재되어 있다. 적합한, 비-면역원성 링커 펩타이드는 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n, 또는 G4(SG4)n 펩타이드 링커이며, 여기에서 "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 정수이다. 하나의 실시양태에서 상기 펩타이드 링커는 적어도 5 아미노산의 길이, 하나의 실시양태에서 5 내지 100의 길이, 추가의 실시양태에서, 10 내지 50 아미노산의 길이를 갖는다. 하나의 실시양태에서 상기 펩타이드 링커는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm이며, 이때 G=글리신, S=세린, 및 (x=3, n=3, 4, 5 또는 6, 및 m=0, 1, 2 또는 3) 또는 (x=4, n=2, 3, 4 또는 5 및 m=0, 1, 2, 또는 3), 하나의 실시양태에서 x=4 및 n=2 또는 3, 추가의 실시양태에서 x=4 및 n=2이다. 하나의 실시양태에서 상기 펩타이드 링커는 (G4S)2이다. 상기 제1 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄를 서로에 대해 융합시키기에 특히 적합한 펩타이드 링커는 (G4S)2이다. 상기 제1 및 제2 Fab 단편의 Fab 중쇄를 연결시키기에 적합한 예시적인 펩타이드 링커는 서열 (D)-(G4S)2를 포함한다(서열번호 37 및 38). 또 다른 적합한 상기와 같은 링커는 서열 (G4S)4를 포함한다. 추가로, 링커들은 면역글로불린 힌지 영역(의 일부)을 포함할 수 있다. 특히 Fab 분자가 Fc 도메인 서브유닛의 N-말단에 융합되는 경우, 상기를 면역글로불린 힌지 영역 또는 그의 일부를 통해, 추가의 펩타이드 링커와 함께 또는 상기 링커 없이 융합시킬 수 있다.
몇몇 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역에 의해 교체되고), 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)), 및 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 이들 폴리펩타이드는 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해 공유 결합된다.
몇몇 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역에 의해 교체되고), 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4)), 및 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 이들 폴리펩타이드는 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해 공유 결합된다.
일부 실시양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역에 의해 교체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는, 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드를 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역에 의해 교체되고), 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 이들 실시양태 중 일부에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 크로스오버 Fab 경쇄 폴리펩타이드(여기에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역은 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유한다)(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 이들 실시양태 중 다른 실시양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 적합한 경우, 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드와 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(2)-CL(2)-VL(1)-CL(1)), 또는 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))를 추가로 포함한다.
이들 실시양태에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는 (i) Fc 도메인 서브유닛 폴리펩타이드(CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛의 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) 및 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이들 폴리펩타이드는 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해 공유 결합된다.
일부 실시양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역에 의해 교체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는, 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역에 의해 교체되고), 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4))를 포함한다.
이들 실시양태 중 일부에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 크로스오버 Fab 경쇄 폴리펩타이드(여기에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역은 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유한다)(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 이들 실시양태 중 다른 실시양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 적합한 경우, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드와 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1)), 또는 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2))를 추가로 포함한다.
이들 실시양태에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는 (i) Fc 도메인 서브유닛 폴리펩타이드(CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛의 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) 및 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이들 폴리펩타이드는 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해 공유 결합된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 Fc 도메인을 포함하지 않는다. 특정한 상기와 같은 실시양태에서, 제1, 및 존재하는 경우 제3 Fab 분자는 각각 통상적인 Fab 분자이고, 제2 Fab 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 크로스오버 Fab 분자, 즉 상기 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교환/교체된 Fab 분자이다. 다른 상기와 같은 실시양태에서, 상기 제1, 및 존재하는 경우 제3 Fab 분자는 각각 크로스오버 Fab 분자이고 상기 제2 Fab 분자는 통상적인 Fab 분자이다.
하나의 상기와 같은 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 및 제2 항원 결합 부분, 및 임의적으로 하나 이상의 펩타이드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제1 및 제2 항원 결합 부분은 모두 Fab 분자이고 상기 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1O 및 1S(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이고 제1 항원 결합 부분은 통상적인 Fab 분자이다)에 도식적으로 묘사된다. 또 다른 상기와 같은 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 및 제2 항원 결합 부분, 및 임의적으로 하나 이상의 펩타이드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제1 및 제2 항원 결합 부분은 모두 Fab 분자이고 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1P 및 1T(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이고 제1 항원 결합 부분은 통상적인 Fab 분자이다)에 도식적으로 묘사된다.
일부 실시양태에서, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되며, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 항원 결합 부분, 특히 제3 Fab 분자를 추가로 포함하고, 여기에서 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 몇몇 상기와 같은 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩타이드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1Q 및 1U(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이고 제1 및 항원 결합 부분은 각각 통상적인 Fab 분자이다), 또는 도 1X 및 1Z(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 통상적인 Fab 분자이고, 제1 및 제3 항원 결합 부분은 각각 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이다)에 도식적으로 묘사된다.
일부 실시양태에서, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되며, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 항원 결합 부분, 특히 제3 Fab 분자를 추가로 포함하고, 여기에서 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 N-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C-말단에 융합된다. 몇몇 상기와 같은 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩타이드 링커로 필수적으로 이루어지며, 여기에서 상기 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 N-말단에서 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C-말단에 융합된다. 상기와 같은 배열은 도 1R 및 1V(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이고 제1 및 항원 결합 부분은 각각 통상적인 Fab 분자이다), 또는 도 1W 및 1Y(이들 예에서 제2 항원 결합 도메인은 통상적인 Fab 분자이고, 제1 및 제3 항원 결합 부분은 각각 VH/VL 크로스오버 Fab 분자이다)에 도식적으로 묘사된다.
몇몇 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역에 의해 교체된다) 폴리펩타이드(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다.
몇몇 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역에 의해 교체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다.
몇몇 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역에 의해 교체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다.
몇몇 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역에 의해 교체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다.
몇몇 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역에 의해 교체되고) 폴리펩타이드(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
몇몇 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역에 의해 교체되고) 폴리펩타이드(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
몇몇 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역에 의해 교체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 상기 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
몇몇 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고(즉 상기 제2 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역에 의해 교체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 상기 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(1)-CL(1))를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(3)-CL(3))를 포함한다.
몇몇 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고(즉 상기 제1 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역에 의해 교체되고), 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는(즉 상기 제3 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역에 의해 교체되는) 폴리펩타이드(VH(2)-CH1(2)-VL(1)-CH1(1)-VL(3)-CH1(3))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(1)-CL(1)) 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(2)-CL(2))를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
몇몇 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고(즉 상기 제1 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역에 의해 교체되고), 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는(즉 상기 제3 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역에 의해 교체되는) 폴리펩타이드(VH(2)-CH1(2)-VH(1)-CL(1)-VH(3)-CL(3))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(1)-CH1(1)) 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(2)-CL(2))를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(3)-CH1(3))를 추가로 포함한다.
몇몇 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고(즉 상기 제3 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역에 의해 교체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고(즉 상기 제1 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 가변 영역은 경쇄 가변 영역에 의해 교체되고), 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(3)-CH1(3)-VL(1)-CH1(1)-VH(2)-CH1(2))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 상기 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(1)-CL(1)) 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(2)-CL(2))를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
몇몇 실시양태에서 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는, 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고(즉 상기 제3 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역에 의해 교체되고), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하고(즉 상기 제1 Fab 분자는 크로스오버 Fab 중쇄를 포함하고, 여기에서 상기 중쇄 불변 영역은 경쇄 불변 영역에 의해 교체되고), 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VH(3)-CL(3)-VH(1)-CL(1)-VH(2)-CH1(2))를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 상기 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(1)-CH1(1)) 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩타이드(VL(2)-CL(2))를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩타이드 결합을 공유하는 폴리펩타이드(VL(3)-CH1(3))를 추가로 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 부분[여기에서 상기 제1 항원은 STEAP-1이고 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부분(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되는 Fab 분자이다);
c) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
(i) a)하의 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 b)하의 제2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, b)하의 제2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나, 또는
(ii) b)하의 제2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 a)하의 제1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, a)하의 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 부분[여기에서 상기 제1 항원은 STEAP-1이고 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부분(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되는 Fab 분자이다);
c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 부분과 동일한 제3 항원 결합 부분; 및
d) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
(i) a)하의 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 b)하의 제2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, b)하의 제2 항원 결합 부분 및 c)하의 제3 항원 결합 부분은 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 d)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나, 또는
(ii) b)하의 제2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 a)하의 제1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, a)하의 제1 항원 결합 부분 및 c)하의 제3 항원 결합 부분은 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 d)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 부분[여기에서 상기 제1 항원은 STEAP-1이고 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부분(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체되는 Fab 분자이다);
c) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
(i) a)하의 제1 항원 결합 부분 및 b)하의 제2 항원 결합 부분은 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자의 모든 상이한 배열에서, 본 명세서에 기재된 아미노산 치환(존재하는 경우)은 제1 및 (존재하는 경우) 제3 항원 결합 부분/Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인 중에, 또는 제2 항원 결합 부분/Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인 중에 존재할 수 있다. 바람직하게, 상기 치환은 제1 및 (존재하는 경우) 제3 항원 결합 부분/Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인 중에 존재한다. 본 발명의 개념에 따라, 본 명세서에 기재된 바와 같은 아미노산 치환이 상기 제1(및 존재하는 경우 제3) 항원 결합 부분/Fab 분자 중에서 이루어지는 경우, 제2 항원 결합 부분/Fab 분자에서는 상기와 같은 아미노산 치환이 이루어지지 않는다. 환언하면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 아미노산 치환이 제2 항원 결합 부분/Fab 분자에서 이루어지는 경우, 제1(및 존재하는 경우 제3) 항원 결합 부분/Fab 분자에서는 상기와 같은 아미노산 치환은 이루어지지 않는다. 아미노산 치환은 특히 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH1이 서로에 의해 교체되는 Fab 분자를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자 중에서 이루어진다.
본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자의 특정한 실시양태에서, 특히 본 명세서에 기재된 바와 같은 아미노산 치환이 제1(및 존재하는 경우 제3) 항원 결합 부분/Fab 분자에서 이루어지는 실시양태에서, 상기 제1(및 존재하는 경우 제3) Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 아이소타입의 것이다. 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자의 다른 실시양태에서, 특히 본 명세서에 기재된 바와 같은 아미노산 치환이 제2 항원 결합 부분/Fab 분자에서 이루어지는 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 부분/Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 아이소타입의 것이다. 일부 실시양태에서, 제1(및 존재하는 경우 제3) 항원 결합 부분/Fab 분자 및 제2 항원 결합 부분/Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 아이소타입의 것이다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 부분[여기에서 상기 제1 항원은 STEAP-1이고 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부분(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되는 Fab 분자이다);
c) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
a)하의 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 123번 위치의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링)(가장 특히 아르기닌(R)에 의해), a)하의 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되며(카밧 EU 지수에 따른 넘버링);
(i) a)하의 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 b)하의 제2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, b)하의 제2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나, 또는
(ii) b)하의 제2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 a)하의 제1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, a)하의 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 부분[여기에서 상기 제1 항원은 STEAP-1이고 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부분(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되는 Fab 분자이다);
c) 상기 제1 항원에 결합하고 상기 제1 항원 결합 부분과 동일한 제3 항원 결합 부분; 및
d) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
a)하의 제1 항원 결합 부분 및 c)하의 제3 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 123번 위치의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링)(가장 특히 아르기닌(R)에 의해), a)하의 제1 항원 결합 부분 및 c)하의 제3 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1 에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되며(카밧 EU 지수에 따른 넘버링);
(i) a)하의 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 b)하의 제2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, b)하의 제2 항원 결합 부분 및 c)하의 제3 항원 결합 부분은 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 d)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나, 또는
(ii) b)하의 제2 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 a)하의 제1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, a)하의 제1 항원 결합 부분 및 c)하의 제3 항원 결합 부분은 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 d)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 부분[여기에서 상기 제1 항원은 STEAP-1이고 상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부분(여기에서 상기 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 입실론이고, 상기 제2 항원 결합 부분은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되는 Fab 분자이다);
c) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
a)하의 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 123번 위치의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링)(가장 특히 아르기닌(R)에 의해), a)하의 제1 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되며(카밧 EU 지수에 따른 넘버링);
a)하의 제1 항원 결합 부분 및 b)하의 제2 항원 결합 부분은 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
상기 실시양태 중 어느 하나에 따라, 이중특이성 항원 결합 분자의 성분들(예를 들어 Fab 분자, Fc 도메인)은 직접적으로 또는 본 명세서에 기재되거나 당해 분야에 공지된 다양한 링커, 특히 하나 이상의 아미노산, 전형적으로는 약 2 내지 20 아미노산을 포함하는 펩타이드 링커를 통해 융합될 수 있다. 적합한, 비-면역원성 펩타이드 링커는 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n, 또는 G4(SG4)n 펩타이드 링커이며, 여기에서 n은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 정수이다.
특정한 양태에서, 본 발명은
a) 제1 항원에 결합하는 제1 및 제3 항원 결합 부분[여기에서 상기 제1 항원은 STEAP-1이고 상기 제1 및 제2 항원 결합 부분은 각각 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 (통상적인) Fab 분자이다];
b) 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부분(여기에서 상기 제2 항원은 CD3이고 상기 제2 항원 결합 부분은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 교체되는 Fab 분자이다);
c) 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공하며; 여기에서
a)하의 제1 및 제3 항원 결합 부분의 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산은 리신(K)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링), 123번 위치의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)에 의해 치환되고(카밧에 따른 넘버링)(가장 특히 아르기닌(R)에 의해), a)하의 제1 및 제3 항원 결합 부분의 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되고(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 213번 위치의 아미노산은 글루탐산(E)에 의해 치환되며(카밧 EU 지수에 따른 넘버링); 추가로
a)하의 제1 항원 결합 부분은 Fab 중쇄의 C-말단에서 b)하의 제2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, b)하의 제2 항원 결합 부분 및 a)하의 제3 항원 결합 부분은 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 c)하의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
본 발명의 상기 양태에 따른 하나의 실시양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛에서 366번 위치의 트레오닌 잔기는 트립토판 잔기(T366W)에 의해 교체되고, Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 407번 위치의 타이로신 잔기는 발린 잔기(Y407V)에 의해 교체되고, 임의적으로 366번 위치의 트레오닌 잔기는 세린 잔기(T366S)에 의해 교체되고, 368번 위치의 류신 잔기는 알라닌 잔기(L368A)에 의해 교체된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
본 발명의 상기 양태에 따른 추가의 실시양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛에서 354번 위치의 세린 잔기는 시스테인 잔기(S354C)에 의해 교체되거나 또는 356번 위치의 글루탐산은 시스테인 잔기(E356C)에 의해 교체되고(특히 354번 위치의 세린 잔기는 시스테인 잔기에 의해 교체된다), Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 349번 위치의 타이로신 잔기는 시스테인 잔기(Y349C)에 의해 교체된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
본 발명의 상기 양태에 따른 더욱 추가의 실시양태에서, Fc 도메인의 각각의 제1 및 제2 서브유닛에서, 234번 위치의 류신 잔기는 알라닌 잔기(L234A)에 의해 교체되고, 235번 위치의 류신 잔기는 알라닌 잔기(L235A)에 의해 교체되고, 329번 위치의 프롤린 잔기는 글리신 잔기(P329G)에 의해 교체된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
본 발명의 상기 양태에 따른 더욱 추가의 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다.
특히 구체적인 실시양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자는 서열번호 32의 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 33의 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 34의 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열번호 35의 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 추가의 특히 구체적인 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자는 서열번호 28의 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 29의 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 34의 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열번호 35의 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 추가의 구체적인 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
더욱 또 다른 구체적인 실시양태에서, 이중특이성 항원 결합 분자는 서열번호 30의 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 61의 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 34의 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열번호 35의 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 추가의 구체적인 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
Fc 도메인
특정한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함한다. 상기 이중특이성 항원 결합 분자와 관련하여 본 명세서에 기재된 Fc 도메인의 특징을 본 발명의 항체 중에 포함된 Fc 도메인에 균등하게 적용할 수 있을 것으로 생각된다.
상기 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩타이드 쇄로 이루어진다. 예를 들어, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체이며, 이들의 각 서브유닛은 CH2 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛은 서로 안정한 회합이 가능하다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 하나 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정한 실시양태에서 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 또 다른 실시양태에서 상기 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 Fc 도메인은 S228번 위치(카밧 EU 지수 넘버링)에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 상기 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 가지 교환을 감소시킨다(문헌[Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)] 참조). 추가의 특정한 실시양태에서 상기 Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 훨씬 더 특정한 실시양태에서, 상기 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 인간 IgG1 Fc 영역의 예시적인 서열은 서열번호 36에 제공된다.
이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자는 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나 또는 다른 하나에 융합될 수 있는 상이한 항원 결합 부분을 포함하며, 따라서 상기 Fc 도메인의 2개 서브유닛은 전형적으로 2개의 일치하지 않는 폴리펩타이드 쇄에 포함된다. 이들 폴리펩타이드의 재조합 공-발현 및 후속의 이량체화는 상기 두 폴리펩타이드의 다수의 가능한 조합들을 도출한다. 따라서, 재조합체 생산에서 이중특이성 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선시키기 위해서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인에 목적하는 폴리펩타이드의 회합을 촉진하는 변형을 도입시키는 것이 유리할 것이다.
상응하게, 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 서브유닛간의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용 부위는 상기 Fc 도메인의 CH3 도메인 중에 있다. 따라서, 하나의 실시양태에서 상기 변형은 상기 Fc 도메인의 CH3 도메인 중에 있다.
이종이량체화를 수행하기 위한 상기 Fc 도메인의 CH3 도메인 중의 변형에 대한 다수의 접근법들이 존재하며, 이들은 예를 들어 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291에 충분히 기재되어 있다. 전형적으로, 모든 상기와 같은 접근법에서 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인과 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인을 모두, 각각의 CH3 도메인(또는 상기를 포함하는 중쇄)이 자신과 더 이상 동종이량체화할 수 없지만 상보적으로 조작된 다른 CH3 도메인과는 강제로 이종이량체화하도록(상기 제1 및 제2 CH3 도메인이 이종이량체화하고 상기 2개의 제1 또는 2개의 제2 CH3 도메인들간에는 동종이량체가 형성되지 않도록) 상보적인 방식으로 조작한다. 개선된 중쇄 이종이량체화를 위한 이러한 상이한 접근법은 중/경쇄 잘못짝짓기 및 벤스 존스-유형 부산물을 감소시키는 상기 이중특이성 항원 결합 분자 중의 중-경쇄 변형(예를 들어 하나의 결합 가지에 VH 및 VL 교환/교체 및 CH1/CL 계면 중에 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 치환의 도입)과 함께 상이한 대안으로서 간주된다.
구체적인 실시양태에서 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 상기 변형은 소위 "놉-홀" 변형이며, 상기 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나에서 "놉" 변형 및 상기 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 다른 하나에서 "홀" 변형을 포함한다.
상기 놉-홀 기술은 예를 들어 미국특허 제 5,731,168 호; 미국특허 제 7,695,936 호; 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 문헌[Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 돌기가 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해하도록 공동내에 위치할 수 있게 상기 돌기("놉")를 제1 폴리펩타이드의 접촉면에 도입시키고 상응하는 공동("홀")을 제2 폴리펩타이드의 접촉면에 도입시킴을 수반한다. 돌기는 상기 제1 폴리펩타이드의 접촉면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들어 타이로신 또는 트립토판)로 교체시킴으로써 구성된다. 상기 돌기와 동일하거나 유사한 크기의 보상 공동이, 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것(예를 들어 알라닌 또는 트레오닌)으로 교체시킴으로써 상기 제2 폴리펩타이드의 접촉면에 생성된다.
상응하게, 특정한 실시양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체되어, 상기 제1 서브유닛의 CH3 도메인내에, 상기 제2 서브유닛의 CH3 도메인내의 공동에 위치할 수 있는 돌기를 생성시키고, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체되어, 상기 제2 서브유닛의 CH3 도메인내에, 상기 제1 서브유닛의 CH3 도메인내의 돌기가 위치할 수 있는 공동을 생성시킨다.
바람직하게 상기 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 타이로신(Y) 및 트립토판(W)으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
바람직하게 상기 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
상기 돌기 및 공동을, 예를 들어 부위-특이적인 돌연변이유발에 의해서 또는 펩타이드 합성에 의해서, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 변경시킴으로써 만들 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛("놉" 서브유닛)의 CH3 도메인에서, 366번 위치의 트레오닌 잔기를 트립토판 잔기로 교체시키고(T366W), 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛("홀" 서브유닛)의 CH3 도메인에서 407번 위치의 타이로신 잔기를 발린 잔기로 교체시킨다(Y407V). 하나의 실시양태에서, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가로 366번 위치의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로 교체시키고(T366S) 368번 위치의 류신 잔기를 알라닌 잔기로 교체시킨다(L368A)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
더욱 추가의 실시양태에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛에서 추가로 354번 위치의 세린 잔기를 시스테인 잔기로 교체시키거나(S354C) 또는 356번 위치의 글루탐산 잔기를 시스테인 잔기로 교체시키고(E356C)(특히 354번 위치의 세린 잔기를 시스테인 잔기로 교체시키고), 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가로 349번 위치의 타이로신 잔기를 시스테인 잔기로 교체시킨다(Y349C)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 상기 Fc 영역의 2개 서브유닛 사이에 다이설파이드 가교를 형성시키고, 이는 상기 이량체를 더욱 안정화시킨다(문헌[Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)]).
특정한 실시양태에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다.
특정한 실시양태에서 제2 항원(예를 들어 활성화 T 세포 항원)에 결합하는 항원 결합 부분을 Fc 도메인의 제1 서브유닛("놉" 변형을 포함한다)에 융합시킨다(임의적으로, STEAP-1에 결합하는 제1 항원 결합 부분, 및/또는 펩타이드 링커를 통해). 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 Fc 도메인의 놉-함유 서브유닛에의, 제2 항원, 예를 들어 활성화 T 세포 항원에 결합하는 항원 결합 부분의 융합은 활성화 T 세포 항원에 결합하는 2개의 항원 결합 부분을 포함하는 항원 결합 분자의 생성(2개의 놉-함유 폴리펩타이드의 입체 충돌)을 (더욱) 최소화할 것이다.
상기 이종이량체화를 실행하기 위한 CH3-변형의 다른 기법을 본 발명에 따른 대안으로서 고려하며, 이는 예를 들어 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291에 기재되어 있다.
하나의 실시양태에서 EP 1870459에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안으로 사용된다. 상기 접근법은 상기 Fc 도메인의 2개 서브유닛 사이의 CH3/CH3 도메인 계면에서 특정한 아미노산 위치에 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 도입을 기본으로 한다. 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자에 대한 하나의 바람직한 실시양태는 아미노산 돌연변이 R409D; 상기 2개의 CH3 도메인(Fc 도메인의) 중 하나에서 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; 상기 Fc 도메인의 CH3 도메인 중 다른 하나에서 E357K이다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인 중에 아미노산 돌연변이 T366W 및 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인 중에 아미노산 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, 및 추가로 아미노산 돌연변이 R409D; 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인 중에 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인 중에 E357K를 포함한다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자는 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인 중에 아미노산 돌연변이 S354C, T366W 및 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인 중에 아미노산 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함하거나, 또는 상기 이중특이성 항원 결합 분자는 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인 중에 아미노산 돌연변이 Y349C, T366W 및 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인 중에 아미노산 돌연변이 S354C, T366S, L368A, Y407V, 및 추가로 아미노산 돌연변이 R409D; 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인 중에 K370E 및 아미노산 돌연변이 D399K; 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인 중에 E357K를 포함한다(모두 카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 실시양태에서 WO 2013/157953에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안으로 사용된다. 하나의 실시양태에서 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366K를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351D를 포함한다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 추가의 실시양태에서 상기 제1 CH3 도메인은 추가의 아미노산 돌연변이 L351K를 포함한다. 추가의 실시양태에서 상기 제2 CH3 도메인은 Y349E, Y349D 및 L368E(바람직하게는 L368E) 중에서 선택된 추가의 아미노산 돌연변이를 포함한다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 실시양태에서 WO 2012/058768에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안으로 사용된다. 하나의 실시양태에서 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가의 실시양태에서 상기 제2 CH3 도메인은 T411, D399, S400, F405, N390, 또는 K392번 위치에 추가의 아미노산 돌연변이, 예를 들어 a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E 또는 T411W, b) D399R, D399W, D399Y 또는 D399K, c) S400E, S400D, S400R, 또는 S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V 또는 F405W, e) N390R, N390K 또는 N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F 또는 K392E(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 중에서 선택된 돌연변이를 포함한다. 추가의 실시양태에서 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366V, K409F를 포함한다. 추가의 실시양태에서 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가의 실시양태에서 상기 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K392E, T411E, D399R 및 S400R(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)을 추가로 포함한다.
하나의 실시양태에서 WO 2011/143545에 기재된 이종이량체화 접근법, 예를 들어 368 및 409번(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 위치에 아미노산 변형을 갖는 접근법이 대안으로 사용된다.
하나의 실시양태에서 상술한 놉-홀 기술을 또한 사용하는 WO 2011/090762에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안으로 사용된다. 하나의 실시양태에서 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366W를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함한다. 하나의 실시양태에서 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366Y를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407T를 포함한다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 실시양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 Fc 도메인은 IgG2 하위부류의 것이며 WO 2010/129304에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안으로 사용된다.
또 다른 실시양태에서 상기 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형은 예를 들어 PCT 공보 WO 2009/089004에 기재된 바와 같은 정전기적 조타 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법은 상기 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 계면에서, 하나 이상의 아미노산 잔기를, 동종이량체 형성은 정전기적으로 불리하게 되지만 이종이량체화는 정전기적으로 유리하게 되도록 하전된 아미노산 잔기에 의해 교체시킴을 수반한다. 하나의 상기와 같은 실시양태에서 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 글루탐산(E), 또는 아스파트산(D), 바람직하게는 K392D 또는 N392D)에 의한 K392 또는 N392의 아미노산 치환을 포함하고 제2 CH3 도메인은 양으로 하전된 아미노산(예를 들어 리신(K) 또는 아르기닌(R), 바람직하게는 D399K, E356K, D356K, 또는 E357K, 및 보다 바람직하게는 D399K 및 E356K)에 의한 D399, E356, D356 또는 E357의 아미노산 치환을 포함한다. 추가의 실시양태에서 상기 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D), 바람직하게는 K409D 또는 R409D)에 의한 K409 또는 R409의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서 상기 제1 CH3 도메인은 추가로 또는 한편으로 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D))에 의한 K439 및/또는 K370의 아미노산 치환을 포함한다(모두 카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
더욱 추가의 실시양태에서 WO 2007/147901에 기재된 이종이량체화 접근법이 대안으로 사용된다. 하나의 실시양태에서 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K253E, D282K, 및 K322D를 포함하고 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 D239K, E240K, 및 K292D를 포함한다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
더욱 또 다른 실시양태에서 WO 2007/110205에 기재된 이종이량체화 접근법을 대안으로 사용할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 상기 Fc 도메인의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 K392D 및 K409D를 포함하고, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 D356K 및 D399K를 포함한다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
상기 Fc 도메인은 상기 이중특이성 항원 결합 분자(또는 항체)에, 표적 조직 중의 양호한 축적 및 유리한 조직-혈액 분배비에 기여하는 긴 혈청 반감기를 비롯하여 유리한 약동학적 성질을 부여한다. 그러나, 동시에 상기는 상기 이중특이성 항원 결합 분자(또는 항체)의, 바람직한 항원-함유 세포에 대해서보다는 Fc 수용체를 발현하는 세포에 대한 바람직하지 못한 표적화를 유도할 수 있다. 더욱이, Fc 수용체 신호전달 경로의 공-활성화는 T 세포 활성화 성질(예를 들어 제2 항원 결합 부분이 활성화 T 세포 항원에 결합하는 이중특이성 항원 결합 분자의 실시양태에서) 및 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 긴 반감기와 함께, 전신 투여시 사이토킨 수용체의 과도한 활성화 및 심한 부작용을 생성시키는 사이토킨 방출을 유도할 수 있다. T 세포 이외의 (Fc 수용체-함유) 면역세포의 활성화는 심지어, 예를 들어 NK 세포에 의한 T 세포의 잠재적인 파괴로 인해 상기 이중특이성 항원 결합 분자(특히 제2 항원 결합 부분이 활성화 T 세포 항원에 결합하는 이중특이성 항원 결합 분자)의 효능을 감소시킬 수도 있다.
따라서, 특정한 실시양태에서, 본 발명에 따른 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 고유의 IgG1 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 하나의 상기와 같은 실시양태에서 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)은 고유의 IgG1 Fc 도메인(또는 고유의 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)에 비해, 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 및 가장 바람직하게는 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화성, 및/또는 고유의 IgG1 Fc 도메인 도메인(또는 고유의 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)에 비해, 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 및 가장 바람직하게는 5% 미만의 효과기 기능을 나타낸다. 하나의 실시양태에서, 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)은 Fc 수용체에 실질적으로 결합하지 않고/않거나 효과기 기능을 유도하지 않는다. 추가의 실시양태에서 상기 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 하나의 실시양태에서 상기 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 하나의 실시양태에서 상기 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적인 실시양태에서 상기 Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로는 인간 FcγRIIIa이다. 하나의 실시양태에서 상기 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP, 및 사이토킨 분비의 그룹 중에서 선택된 하나 이상이다. 특정한 실시양태에서 상기 효과기 기능은 ADCC이다. 하나의 실시양태에서 상기 Fc 도메인은 고유의 IgG1 Fc 도메인 도메인에 비해, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대해 실질적으로 유사한 결합 친화성을 나타낸다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합은 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 고유의 IgG1 Fc 도메인(또는 고유의 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)의 약 70% 초과, 특히 약 80% 초과, 보다 특히 약 90% 초과의 결합 친화성을 나타낼 때 성취된다.
몇몇 실시양태에서 상기 Fc 도메인을, 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해, Fc 수용체에 대해 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작한다. 특정한 양태에서, 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 상기 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이는 상기 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 각각에 존재한다. 하나의 양태에서, 상기 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시킨다. 하나의 실시양태에서 상기 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 상기 Fc 도메인의 결합 친화성을 적어도 2배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배까지 감소시킨다. 상기 Fc 수용체에 대한 상기 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시키는 하나 초과의 아미노산 돌연변이가 존재하는 실시양태에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 Fc 수용체에 대한 상기 Fc 도메인의 결합 친화성을 적어도 10배, 적어도 20배, 또는 심지어 적어도 50배까지 감소시킬 수 있다. 하나의 실시양태에서, 조작된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자와 비교하여 20% 미만, 특히 10% 미만, 보다 특히 5% 미만의 Fc 수용체에 대한 결합 친화성을 나타낸다. 특정한 실시양태에서 상기 Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일부 실시양태에서 상기 Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일부 실시양태에서 상기 Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적인 실시양태에서 상기 Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로는 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게, 이들 수용체 각각에 대한 결합이 감소된다. 일부 실시양태에서 보체 성분에 대한 결합 친화성, 구체적으로 C1q에 대한 결합 친화성이 또한 감소된다. 하나의 실시양태에서 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화성은 감소되지 않는다. FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 상기 Fc 도메인의 결합 친화성의 보존은 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 상기 Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인의 조작되지 않은 형태를 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)의 조작되지 않은 형태의 약 70% 초과의 결합 친화성을 나타낼 때 성취된다. 상기 Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자는 약 80% 초과 및 심지어 약 90% 초과의 상기와 같은 친화성을 나타낼 수 있다. 몇몇 실시양태에서 상기 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인을, 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해, 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작한다. 상기 감소된 효과기 기능은 비제한적으로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 감소된 보체 의존적인 세포독성(CDC), 감소된 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC), 감소된 항체-의존적인 세포 식작용(ADCP), 감소된 사이토킨 분비, 항원-제공 세포에 의한 감소된 면역 복합체-매개된 항원 흡수, NK 세포에 대한 감소된 결합, 대식세포에 대한 감소된 결합, 단핵세포에 대한 감소된 결합, 다형핵세포에 대한 감소된 결합, 감소된 직접적인 신호전달 유도 세포사멸, 표적-결합된 항체의 감소된 가교결합, 감소된 수지상세포 성숙화, 또는 감소된 T 세포 프라이밍. 하나의 실시양태에서 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC, 감소된 ADCC, 감소된 ADCP, 및 감소된 사이토킨 분비의 그룹 중에서 선택된 하나 이상이다. 특정한 실시양태에서 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 ADCC이다. 하나의 실시양태에서 상기 감소된 ADCC는 조작되지 않은 Fc 도메인(또는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자)에 의해 유도된 ADCC의 20% 미만이다.
하나의 실시양태에서 Fc 수용체에 대한 상기 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 하나의 실시양태에서 상기 Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)의 그룹 중에서 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서 상기 Fc 도메인은 L234, L235 및 P329(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)의 그룹 중에서 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서 상기 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 하나의 상기와 같은 실시양태에서, 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 하나의 실시양태에서 상기 Fc 도메인은 P329번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서 상기 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)이다. 하나의 실시양태에서 상기 Fc 도메인은 P329번 위치에서 아미노산 치환 및 E233, L234, L235, N297 및 P331(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 중에서 선택된 위치에서 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서 상기 추가의 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정한 실시양태에서 상기 Fc 도메인은 P329, L234 및 L235(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 특정한 실시양태에서 상기 Fc 도메인은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA", "PGLALA" 또는 "LALAPG")를 포함한다. 구체적으로, 특정한 실시양태에서, 상기 Fc 도메인의 각각의 서브유닛은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다, 즉 상기 Fc 도메인의 각각의 제1 및 제2 서브유닛에서 234번 위치의 류신 잔기는 알라닌 잔기(L234A)로 교체되고, 235번 위치의 류신 잔기는 알라닌 잔기(L235A)로 교체되고 329번 위치의 프롤린 잔기는 글리신 잔기(P329G)로 교체된다(카밧 EU 지수에 따른 넘버링).
하나의 상기와 같은 실시양태에서, 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 상기 아미노산 치환들의 "P329G LALA" 조합은 본 명세서에 내용 전체가 참고로 인용된 PCT 공보 WO 2012/130831에 기재된 바와 같이, 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체(뿐만 아니라 보체) 결합을 거의 완전히 없앤다. WO 2012/130831은 또한 상기와 같은 돌연변이 Fc 도메인의 제조 방법 및 Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능과 같은 그의 성질을 측정하는 방법을 기재한다.
IgG4 항체는 IgG1 항체와 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 실시양태에서 본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 하나의 실시양태에서 상기 IgG4 Fc 도메인은 S228번 위치에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. Fc 수용체에 대한 그의 결합 친화성 및/또는 그의 효과기 기능을 추가로 감소시키기 위해서, 하나의 실시양태에서 상기 IgG4 Fc 도메인은 L235번 위치에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 L235E(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 또 다른 실시양태에서 상기 IgG4 Fc 도메인은 P329번 위치에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 P329G(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 특정한 실시양태에서 상기 IgG4 Fc 도메인은 S228, L235 및 P329번 위치에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함한다. 상기와 같은 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 그의 Fcγ 수용체 결합 성질은 본 명세서에 내용 전체가 참고로 인용된 PCT 공보 WO 2012/130831에 기재되어 있다.
특정한 실시양태에서 고유의 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인, 또는 아미노산 치환 S228P, L235E 및 임의적으로 P329G(카밧 EU 지수에 따른 넘버링)를 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 Fc 도메인의 N-글리코실화가 제거되었다. 하나의 상기와 같은 실시양태에서, 상기 Fc 도메인은 N297번 위치에서 아미노산 돌연변이, 특히 알라닌에 의해(N297A) 또는 아스파트산에 의해(N297D)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링) 아스파라진을 교체하는 아미노산 치환을 포함한다.
본 명세서에서 상기에 및 PCT 공보 WO 2012/130831에 기재된 Fc 도메인 외에, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖는 Fc 도메인은 또한 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국특허 제 6,737,056 호)(카밧 EU 지수에 따른 넘버링). 상기와 같은 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체(알라닌으로의 잔기 265 및 297의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함(미국특허 제 7,332,581 호))를 포함한다.
돌연변이체 Fc 도메인을 당해 분야에 주지된 유전학적 또는 화학적 방법을 사용하여 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조할 수 있다. 유전학적 방법은 암호화 DNA 서열의 부위-특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함한다. 정확한 뉴클레오타이드 변화를 예를 들어 서열분석에 의해 확인할 수 있다.
Fc 수용체에의 결합을 예를 들어 ELISA에 의해서 또는 BIAcore 장비(GE 헬쓰케어)와 같은 표준 장비를 사용하는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해서 쉽게 측정할 수 있으며 Fc 수용체 자체를 재조합 발현에 의해 수득할 수 있다. 한편으로, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인 또는 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자의 결합 친화성을 특정한 Fc 수용체, 예를 들어 인간 NK 세포 발현 FcγIIIa 수용체를 발현하는 것으로 공지된 세포주를 사용하여 평가할 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자의 효과기 기능을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 예들은 미국특허 제 5,500,362 호; 문헌[Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)] 및 문헌[Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)]; 미국특허 제 5,821,337 호; 문헌[Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)]에 기재되어 있다. 한편으로, 비-방사성 분석 방법이 사용될 수 있다(예를 들어 유식 세포측정을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.) 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 참조). 상기와 같은 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
일부 실시양태에서, 보체 성분, 구체적으로 C1q에의 상기 Fc 도메인의 결합을 감소시킨다. 상응하게 상기 Fc 도메인이 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작하는 일부 실시양태에서, 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC를 포함한다. C1q 결합 분석을 수행하여, 상기 Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자가 C1q에 결합할 수 있고 따라서 CDC 활성을 갖는지의 여부를 측정할 수 있다. 예를 들어 WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조. 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996)]; 문헌[Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)] 참조).
FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 결정을 또한 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다(예를 들어 문헌[Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)]; WO 2013/120929 참조).
폴리뉴클레오티드
본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 단편은 항원 결합 단편이다.
본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 전체 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오타이드로서 또는 공-발현되는 다수의(예를 들어 2개 이상의) 폴리뉴클레오타이드로서 발현시킬 수 있다. 공-발현되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드들은 예를 들어 다이설파이드 결합 또는 다른 수단을 통해 회합하여 기능성 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 경쇄 부분은 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 중쇄를 포함하는 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 부분으로부터의 별도의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있다. 공-발현시, 상기 중쇄 폴리펩타이드는 상기 경쇄 폴리펩타이드와 회합하여 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 형성할 것이다. 또 다른 예에서, 상기 2개의 Fc 도메인 서브유닛 중 하나 및 임의적으로 하나 이상의 Fab 분자(의 부분)를 포함하는 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 부분은 상기 2개의 Fc 도메인 서브유닛 중 다른 하나 및 임의적으로 Fab 분자(의 부분)를 포함하는 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 부분으로부터의 별도의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있었다. 공-발현시, 상기 Fc 도메인 서브유닛은 회합하여 Fc 도메인을 형성할 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 전체 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 암호화한다. 다른 실시양태에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자에 포함된 폴리펩타이드를 암호화한다.
몇몇 실시양태에서 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 DNA이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 RNA, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA)의 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 예를 들어 고상 펩타이드 합성(예를 들어 메리필드(Merrifield) 고상 합성) 또는 재조합 생성에 의해 수득할 수 있다. 제조합체 생성을 위해서 예를 들어 상술한 바와 같은 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자(단편)를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 단리하고 숙주 세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터내에 삽입한다. 상기와 같은 폴리뉴클레오타이드는 통상적인 과정을 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터를 제공한다. 당해 분야의 숙련가들에게 주지된 방법을 사용하여 적합한 전사/번역 조절 신호와 함께 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자(단편)의 암호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 예를 들어 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)]; 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)]에 기재된 기법들 참조. 상기 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스의 부분이거나 또는 핵산 단편일 수 있다. 상기 발현 벡터는 발현 카세트를 포함하며, 상기 카세트 내로 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자(단편)(즉 암호화 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 함께 작동가능하게 회합되어 클로닝된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "암호화 영역"은 아미노산으로 번역된 코돈들로 이루어지는 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않지만, (존재하는 경우) 암호화 영역의 부분인 것으로 간주될 수 있고, 임의의 인접 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론, 5' 및 3' 번역되지 않은 영역 등은 암호화 영역의 부분이 아니다. 2개 이상의 암호화 영역이 단일 폴리뉴클레오타이드 구조물 중에, 예를 들어 단일 벡터상에, 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 구조물 중에, 예를 들어 별도의(상이한) 벡터상에 존재할 수 있다. 더욱 또한, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 함유하거나 또는 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있다, 예를 들어 본 발명의 벡터는 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있으며, 이들은 단백질 분해 절단을 통해 최종 단백질로 번역-후 또는 번역과 함께 분리된다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오타이드, 또는 핵산은 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자(단편)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 그의 변이체 또는 유도체에 융합되거나 또는 융합되지 않은 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은 비제한적으로 전문화된 요소 또는 동기, 예를 들어 분비신호 펩타이드 또는 이종 기능성 도메인을 포함한다. 작동성 회합은 유전자 산물의 암호화 영역, 예를 들어 폴리펩타이드가, 상기 유전자 산물의 발현을 조절 서열(들)의 영향 또는 통제하에 두는 방식으로 하나 이상의 조절 서열들과 회합하는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예를 들어 폴리펩타이드 암호화 영역 및 상기와 회합된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 목적하는 유전자 산물을 암호화하는 mRNA의 전사를 생성시키고 상기 두 DNA 단편간의 결합의 성질이 상기 유전자 산물의 발현을 지시하는 상기 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 또는 상기 DNA 주형이 전사되는 능력을 방해하지 않는 경우 "작동적으로 회합된다". 따라서, 프로모터 영역은 상기 프로모터가 상기 핵산의 전사를 실행할 수 있는 경우 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 작동적으로 회합될 것이다. 상기 프로모터는 오직 예정된 세포에서만 상기 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포-특이성 프로모터일 수 있다. 프로모터 외에, 다른 전사 조절 요소들, 예를 들어 인헨서, 오퍼레이터, 리프레서, 및 전사 종결 신호가 상기 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 회합되어 세포-특이성 전사를 지시할 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역들을 본 명세서에 개시한다. 다양한 전사 조절 영역들이 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 여기에는 비제한적으로 척추동물 세포에서 기능하는 전사 조절 영역, 예를 들어 비제한적으로 거대세포바이러스로부터의 프로모터 및 인헨서 분절(예를 들어 인트론-A와 함께, 전초기 프로모터), 유인원 바이러스 40(예를 들어 초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예를 들어 라우스 육종 바이러스)를 포함한다. 다른 전사 조절 영역은 척추동물 유전자로부터 유래된 것들, 예를 들어 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈뿐만 아니라 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열들을 포함한다. 추가의 적합한 전사 조절 영역은 조직-특이성 프로모터 및 인헨서뿐만 아니라 유도성 프로모터(예를 들어 프로모터 유도성 테트라사이클린)를 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소들이 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 공지되어 있다. 여기에는 비제한적으로 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소들(특히 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES, 또한 CITE 서열로서 지칭됨)이 있다. 상기 발현 카세트는 또한 다른 특징들, 예를 들어 복제 기원, 및/또는 염색체 통합 요소, 예를 들어 레트로바이러스 긴 말단 반복부(LTR), 또는 아데노-회합된 바이러스(AAV) 반전 말단 반복부(ITR)를 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 암호화 영역을 분비 또는 신호 펩타이드(본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 분비를 지시한다)를 암호화하는 추가적인 암호화 영역과 회합시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 분비를 원하는 경우, 신호 서열을 암호화하는 DNA를 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산의 상류에 둘 수 있다. 상기 신호 가설에 따라, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은, 일단 거친 소포체를 가로질러 성장하는 단백질 쇄의 수출이 개시되었으면, 성숙한 단백질로부터 절단된 신호 펩타이드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당해 분야의 통상적인 숙련가들은 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩타이드가 일반적으로 상기 폴리펩타이드의 N-말단에 융합된 신호 펩타이드(상기는 번역된 폴리펩타이드로부터 절단되어 상기 폴리펩타이드의 분비된 또는 "성숙한" 형태를 생성시킨다)를 가짐을 안다. 몇몇 실시양태에서, 본래의 신호 펩타이드, 예를 들어 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩타이드, 또는 상기와 작동적으로 회합된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 능력을 유지하는 상기 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 한편으로, 이종 포유동물 신호 펩타이드, 또는 그의 기능성 유도체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 야생형 리더 서열을 인간 조직 플라스미노겐 활성제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환시킬 수 있다.
나중의 정제를 촉진하거나(예를 들어 히스티딘 태그) 또는 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 표지화를 지원하는데 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열을 암호화하는 DNA를, 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자(단편) 암호화 폴리뉴클레오타이드 내에 또는 상기의 단부에 포함시킬 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 몇몇 실시양태에서 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드 및 벡터는 각각 폴리뉴클레오타이드 및 벡터와 관련하여 본 명세서에 기재된 특징들 중 어느 하나를 단독으로 또는 함께 통합할 수 있다. 하나의 상기와 같은 실시양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함한다(예를 들어 상기 벡터로 형질전환되거나 형질감염되었다). 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "숙주 세포"란 용어는 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 또는 그의 단편을 생성시키도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포계를 지칭한다. 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 복제하고 그의 발현을 지지하기에 적합한 숙주 세포는 당해 분야에 주지되어 있다. 상기와 같은 세포를 특정한 발현 벡터로 적합하게 형질감염시키거나 형질도입시킬 수 있으며 다량의 벡터 함유 세포를 대규모 발효기의 시딩을 위해 증식시켜 임상용으로 충분한 양의 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 수득할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 또는 다양한 진핵생물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등을 포함한다. 예를 들어 폴리펩타이드를, 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우, 세균 중에 생성시킬 수 있다. 발현 후에, 상기 폴리펩타이드를 용액 분획 중 세균 세포 페이스트로부터 단리하고 추가로 정제할 수 있다. 원핵생물 외에, 진핵 미생물, 예를 들어 섬유상 진균 또는 효모, 예를 들어 글리코실화 경로가 "인간화되어" 부분적인 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩타이드를 생산하는 진균 및 효모 균주가 폴리펩타이드-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)], 및 문헌[Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)] 참조.
(글리코실화된) 폴리펩타이드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포이다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다. 식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 미국특허 제 5,959,177 호, 미국특허 제 6,040,498 호, 미국특허 제 6,420,548 호, 미국특허 제 7,125,978 호 및 미국특허 제 6,417,429 호(트랜스제닉 식물에서 항체를 생성시키기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)(상표) 기술을 개시한다) 참조. 척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 현탁액에서 증식시키기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통(예를 들어 문헌[Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 아기 햄스터 신장세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들어 문헌[Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장세포(VERO-76), 인간 경부암종 세포(HELA), 개 신장세포(MDCK), 버팔로 래트 간세포(BRL 3A), 인간 폐세포(W138), 인간 간세포(Hep G2), 마우스 유방 종양세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들어 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은), MRC 5 세포, 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어 dhfr- CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예를 들어 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0를 포함한다. 단백질 생산에 적합한 몇몇 포유동물 숙주 세포주의 리뷰를 위해서, 예를 들어 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)] 참조. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어 단지 몇 개를 언급하자면, 포유동물 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포뿐만 아니라, 트랜스제닉 동물, 트랜스제닉 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포들을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 진핵생물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배신장(HEK) 세포 또는 림프양 세포(예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
상기 시스템에서 외부 유전자를 발현하기 위한 표준 기술이 당해 분야에 공지되어 있다. 항체와 같은 항원 결합 도메인의 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나를 포함하는 폴리펩타이드를, 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄를 모두 갖는 항체이도록 상기 항체쇄의 다른 하나를 또한 발현시키기 위해 조작할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 생성 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 본 명세서에 제공된 바와 같은 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에서 배양하고, 임의적으로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배지)로부터 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 회수함을 포함한다.
본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자(또는 항체)의 성분을 유전자에 의해 서로 융합시킬 수 있다. 상기 이중특이성 항원 결합 분자를, 그의 성분이 서로 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 융합되도록 설계할 수 있다. 상기 링커의 조성 및 길이는 당해 분야에 주지된 방법에 따라 결정될 수 있으며 효능에 대해 시험될 수 있다. 이중특이성 항원 결합 분자의 상이한 성분들간의 링커 서열의 예를 본 명세서에 제공한다. 추가의 서열을 또한 포함시켜, 목적하는 경우 상기 융합의 개별적인 성분, 예를 들어 엔도펩티다제 인식 서열을 분리시키는 절단 부위를 통합시킬 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자는 일반적으로 적어도 항원 결정인자에 결합할 수 있는 항체 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 천연 또는 비천연 항체 및 그의 단편의 부분을 형성하고 상기로부터 유래될 수 있다. 다클론 항체 및 단클론 항체의 생성 방법은 당해 분야에 주지되어 있다(예를 들어 문헌[Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조). 비천연 항체를 고상 펩타이드 합성을 사용하여 구성하거나, 재조합적으로 생성시키거나(예를 들어 미국특허 제 4,186,567 호에 기재된 바와 같이), 또는 예를 들어 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합적 라이브러리를 선별함으로써 수득할 수 있다(예를 들어 미국특허 제 5,969,108 호(McCafferty) 참조).
항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역의 임의의 동물 종을 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자에 사용할 수 있다. 본 발명에 유용한 비제한적인 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 영역은 쥐, 영장류, 또는 인간 기원일 수 있다. 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자가 인간용인 경우, 항체의 키메릭 형태를 사용할 수 있으며, 여기에서 상기 항체의 불변 영역은 인간으로부터이다. 상기 항체의 인간화된 형태 또는 완전한 인간 형태를 또한 당해 분야에 주지된 방법에 따라 제조할 수 있다(예를 들어 미국특허 제 5,565,332 호(Winter) 참조). 인간화를 다양한 방법들, 예를 들어 비제한적으로 (a) 비-인간(예를 들어 공여 항체) CDR을 중요한 프레임워크 잔기(예를 들어 양호한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능의 유지에 중요한 것들)의 유지와 함께 또는 상기 유지 없이 인간(예를 들어 수용 항체) 프레임워크 및 불변 영역상에 접목시키거나, (b) 오직 비-인간 특이성-결정 영역(SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기)만을 인간 프레임워크 및 불변 영역상에 접목시키거나, 또는 (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 상기를 표면 잔기의 교체에 의해 인간-유사 섹션으로 "은폐"시킴으로써 성취할 수 있다. 인간화된 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌[Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)]에 리뷰되어 있으며, 예를 들어 문헌[Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988)]; 문헌[Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)]; 미국특허 제 5,821,337 호, 미국특허 제 7,527,791 호, 미국특허 제 6,982,321 호 및 미국특허 제 7,087,409 호; 문헌[Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)](특이성 결정 영역(SDR) 이식을 기재한다); 문헌[Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)]("재표면화"를 기재한다)]; 문헌[Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)]("FR 셔플링"을 기재한다)]; 및 문헌[Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)] 및 문헌[Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)](FR 셔플링으로의 "유도된 선택" 접근을 개시함)에 추가로 기재되어 있다. 인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 비제한적으로 "최적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Sims et al., J. Immunol. 151:2296(1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285(1992)]; 및 문헌[Presta et al., J. Immunol. 151:2623(1993)] 참조); 인간 성숙한(체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식세포계열 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633(2008)] 참조); 및 선별 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684(1997)] 및 문헌[Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618(1996)] 참조)을 포함한다.
인간 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 기법들을 사용하여 생성시킬 수 있다. 인간 항체는 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)] 및 문헌[Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 일반적으로 기재되어 있다. 인간 항체를, 항원 공격에 응답하여 인간 가변 영역을 갖는 완전 항체 또는 완전한 인간 항체를 생산하도록 변형시킨 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조할 수 있다. 상기와 같은 동물은 전형적으로 인간 면역글로불린 유전자좌(상기는 내인성 면역글로불린 유전자좌를 교체하거나, 또는 염색체외에 존재하거나 또는 동물의 염색체내로 무작위로 통합된다)의 전부 또는 일부를 함유한다. 상기와 같은 트랜스제닉 마우스에서, 상기 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 획득하기 위한 방법들에 대한 리뷰에 대해서, 문헌[Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)] 참조. 또한 예를 들어 미국특허 제 6,075,181 호 및 미국특허 제 6,150,584 호(제노마우스(XENOMOUSE)(상표) 기술을 기재한다); 미국특허 제 5,770,429 호(HuMab(등록상표) 기술을 기재한다); 미국특허 제 7,041,870 호(K-M 마우스(K-M MOUSE)(등록상표) 기술을 기재한다) 및 미국특허 출원 공보 US 2007/0061900(벨로시마우스(VelociMouse)(등록상표) 기술을 기재한다) 참조. 상기와 같은 동물에 의해 생성된 완전 항체로부터의 인간 가변 영역을 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 병용함으로써 추가로 변형시킬 수 있다.
인간 항체를 또한 하이브리도마-기재 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 단클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되었다(예를 들어 문헌[Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)]; 문헌[Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 문헌[Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 또한 문헌[Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가적인 방법들은 예를 들어 미국특허 제 7,189,826 호(하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 IgM 항체의 생산을 기재한다) 및 문헌[Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)](인간-인간 하이브리도마를 기재한다)에 기재된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트라이오마 기술)이 또한 문헌[Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)] 및 문헌[Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체를 또한 본 명세서에 기재된 바와 같이, 인간 항체 라이브러리로부터 단리에 의해 생성시킬 수 있다.
본 발명에 유용한 항체를 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합적 라이브리러를 선별함으로써 단리시킬 수 있다. 조합적 라이브러리의 선별 방법이 예를 들어 문헌[Lerner et al. in Nature Reviews 16:498-508 (2016)]에 리뷰되어 있다. 예를 들어 파지 디스플레이 라이브러리의 생성 및 목적하는 결합 특성을 갖는 항체에 대한 상기와 같은 라이브러리의 선별에 대한 다양한 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기와 같은 방법은 예를 들어 문헌[Frenzel et al. in mAbs 8:1177-1194 (2016)]; 문헌[Bazan et al. in Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012)] 및 문헌[Zhao et al. in Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016)]뿐만 아니라 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)] 및 문헌[Marks and Bradbury in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]에 리뷰되어 있다.
몇몇 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리를 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝시키고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합시키며, 이어서 이를 문헌[Winter et al., Annual Review of Immunology, 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 선별할 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 나타낸다. 면역된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마의 구성 요구 없이 면역원에 대한 고-친화성 항체를 제공한다. 한편으로, 미경험 레퍼토리를 문헌[Griffiths et al., EMBO Journal 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 클로닝시켜(예를 들어 인간으로부터) 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기-항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 미경험 라이브러리를 또한, 문헌[Hoogenboom and Winter, Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 조각을 클로닝시키고 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고가변성 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내에서 재배열을 수행함으로써 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공보는 예를 들어 하기를 포함한다: 미국특허 제 5,750,373 호; 미국특허 제 7,985,840 호; 미국특허 제 7,785,903 호 및 미국특허 제 8,679,490 호뿐만 아니라 미국특허 공보 2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 및 2007/0292936을 포함한다. 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합적 라이브러리의 선별에 대해 당해 분야에 공지된 방법의 추가적인 예는 리보솜 및 mRNA 디스플레이뿐만 아니라, 세균, 포유동물 세포, 곤충 세포 또는 효모 세포상에서의 항체 디스플레이 및 선택 방법을 포함한다. 효모 표면 디스플레이에 대한 방법은 예를 들어 문헌[Scholler et al. in Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012)] 및 문헌[Cherf et al. in Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015)]뿐만 아니라 문헌[Zhao et al. in Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012)]에 리뷰되어 있다. 리보솜 디스플레이에 대한 방법은 예를 들어 문헌[He et al. in Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997)] 및 문헌[Hanes et al. in PNAS 94:4937-4942 (1997)]에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 제조된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 당해 분야에 공지된 기법, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 젤 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제할 수 있다. 특정 단백질의 정제에 사용되는 실제 조건은 부분적으로, 순 전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 의존할 것이며, 이는 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제를 위해서 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원을 사용할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해서, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 기질을 사용할 수 있다. 연속적인 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 필수적으로 실시예에 기재된 바와 같이 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 단리할 수 있다. 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 순도를 젤 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함한 임의의 다양한 주지된 분석 방법들에 의해 측정할 수 있다.
분석
본 명세서에 제공된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 당해 분야에 공지된 다양한 분석에 의해 그의 물리/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인하거나, 선별하거나 특성규명할 수 있다.
친화성 분석
Fc 수용체 또는 표적 항원에 대한 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 친화성을 예를 들어 표준 장비, 예를 들어 BIAcore 장비(GE 헬쓰케어), 및 재조합 발현에 의해 수득될 수 있는 바와 같은 수용체 또는 표적 단백질을 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정할 수 있다. 한편으로, 상이한 수용체 또는 표적 항원에 대한 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 결합을, 예를 들어 유식 세포측정(FACS)에 의해 특정 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 사용하여 평가할 수 있다. 결합 친화성의 측정을 위한 구체적이고 예시적인 실시양태를 하기에 기재한다.
하나의 실시양태에 따라, KD를 25 ℃에서 BIACORE(등록상표) T000 기계(GE 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정한다.
Fc-부분과 Fc 수용체간의 상호작용을 분석하기 위해서, His-태그된 재조합 Fc-수용체를 CM5 칩상에 고정화된 항-펜타(Penta) His 항체(퀴아겐(Qiagen))에 의해 포획하고 이중특이성 구조물을 분석물로서 사용한다. 간단히, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, GE 헬쓰케어)을 공급자의 설명에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항 펜타-His 항체를 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 5.0에 의해, 5 ㎕/분의 유량으로 주사전에 40 ㎍/㎖로 희석하여 대략 6500 반응 단위(RU)의 결합된 단백질을 성취한다. 상기 리간드의 주사에 이어서, 1 M 에탄올아민을 주사하여 반응하지 않은 기를 차단한다. 후속적으로 Fc-수용체를 4 또는 10 nM에서 60s 동안 포획한다. 동역학적 측정을 위해서, 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 일련의 4배 희석물(500 nM 내지 4000 nM의 범위)을 25 ℃에서 120s 동안 30 ㎕/분의 유량으로 HBS-EP(GE 헬쓰케어, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4) 중에서 주사한다.
상기 표적 항원에 대한 친화성을 측정하기 위해서, 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를, 상기 항 펜타-His 항체에 대해 기재된 바와 같은 활성화된 CM5-센서 칩 표면상에 고정화된 항 인간 Fab 특이 항체(GE 헬쓰케어)에 의해 포획한다. 결합된 단백질의 최종량은 대략 12000 RU이다. 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 300 nM에서 90s 동안 포획한다. 상기 표적 항원을 250 내지 1000 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/분의 유량으로 180s 동안 유동셀에 통과시킨다.
벌크 굴절률 차이를, 참조 유동셀상에서 획득된 반응을 공제함으로써 보정한다. 정상상태 반응을 사용하여 랭뮤어 결합 등온선의 비-선형 곡선 정합에 의해 해리 상수 KD를 유도하였다. 결합률(kon) 및 해리율(koff)을, 결합 및 해리 센서그램을 동시에 정합시킴으로써 간단한 1 대 1 랭뮤어 결합 모델(BIACORE(등록상표) T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수(KD)를 koff/kon 비로서 계산한다. 예를 들어 문헌[Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)] 참조.
활성 분석
본 발명의 이중특이성 항원 결합 분자(또는 항체)의 생물학적 활성을 실시예에 기재된 바와 같은 다양한 분석에 의해 측정할 수 있다. 생물학적 활성은 예를 들어 T 세포의 증식의 유도, T 세포에서 신호전달의 유도, T 세포에서 활성화 마커의 발현의 유도, T 세포에 의한 사이토킨 분비의 유도, 종양 세포와 같은 표적 세포의 용해의 유도, 및 종양 퇴화의 유도 및/또는 생존의 개선을 포함할 수 있다.
조성물, 제형화 및 투여 경로
추가의 양태에서, 본 발명은 예를 들어 하기의 치료 방법들 중 어느 하나에 사용하기 위한, 본 명세서에 제공된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 중 어느 하나를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 약학 조성물은 본 명세서에 제공된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 중 어느 하나 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 본 명세서에 제공된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 중 어느 하나 및 예를 들어 하기에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 생체내에서 투여에 적합한 형태로 생성시키는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 (a) 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 수득하고, (b) 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체와 제형화함을 포함하며, 이에 의해 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 제제를 생체내 투여를 위해 제형화한다.
본 발명의 약학 조성물은 치료 유효량의, 약학적으로 허용 가능한 담체 중에 용해되거나 분산된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 포함한다. "약학적으로 또는 약물학적으로 허용 가능한"이란 어구는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성인, 즉 적합한 대로 동물, 예를 들어 인간에게 투여시 불리하거나, 알러지성이거나 또는 다른 부적합한 반응을 생성시키지 않는 분자 존재 및 조성물을 지칭한다. 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 및 임의적으로 추가적인 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제제는 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990]에 예시된 바와 같이, 본 명세에 비추어 당해 분야의 숙련가들에게 공지될 것이다. 더욱이, 동물(예를 들어 인간) 투여를 위해서, 제제는 FDA 생물 표준 관청 또는 다른 국가의 상응하는 당국에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다. 바람직한 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 공지된 바와 같은 모든 용매, 완충제, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 산화방지제, 보존제(예를 들어 항균제, 항진균제), 등장성제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 산화방지제, 단백질, 약물, 약물 안정제, 중합체, 젤, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 염료, 상기와 유사한 물질 및 이들의 조합을 포함한다(예를 들어 본 명세서에 참고로 인용된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] 참조). 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 상용성이지 않은 한을 제외하고, 상기 치료 또는 약학 조성물에서의 그의 용도가 고려된다.
본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자(및 임의의 추가적인 치료제)를 임의의 적합한 수단, 예를 들어 비경구, 폐내, 및 비내에 의해, 및 경우에 따라 국소 치료, 병변내 투여를 위해 투여할 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 부분적으로 투여가 짧은지 또는 만성적인지에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다.
비경구 조성물은 주사에 의해, 예를 들어 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내 근육내, 경막내 또는 복강내 주사에 의해 투여하기 위해 설계된 것들을 포함한다. 주사용으로, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 수용액 중에, 바람직하게는 생리학적으로 적합한 완충제, 예를 들어 행크 용액, 링거액, 또는 생리식염수 완충제 중에서 제형화할 수 있다. 상기 용액은 제형화제, 예를 들어 현탁, 안정화 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 한편으로, 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자는 사용전에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열성 물질 제거수로 조성되는 분말 형태 중에 존재할 수 있다. 멸균 주사액은 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 필요에 따라, 하기에 열거되는 다양한 다른 성분들과 함께 적합한 용매 중에 필요한 양으로 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을 기본 분산 매질 및/또는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 중에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사액, 현탁액 또는 유화액의 제조에 사용하기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균-여과된 액체 매질로부터 활성 성분 + 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 제공하는 진공-건조 또는 동결-건조이다. 상기 액체 매질을 필요한 경우 적합하게 완충시켜야 하며 상기 액체 희석제를 주사전에 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성으로 만들어야 한다. 상기 조성물은 제조 및 보관 조건하에서 안정해야 하며, 미생물, 예를 들어 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 내독소 오염을, 예를 들어 0.5 ng/㎎ 단백질 미만의 안전 수준에서 최소로 유지시켜야 함을 알 것이다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체는 비제한적으로 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 상기 현탁액의 점도를 개선시키는 화합물, 예를 들어 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 임의적으로, 상기 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하도록 상기 화합물의 용해도를 증가시키는 작용제를 함유할 수 있다. 추가로, 상기 활성 화합물의 현탁액을 적합한 대로 유성 주사 현탁액으로서 제조할 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스터, 예를 들어 에틸 클리에이트 또는 트라이글리세라이드, 또는 리포솜을 포함한다.
활성 성분을 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해서 또는 계면 중합에 의해서 제조된 미세캡슐, 예를 들어 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어 리포솜, 알부민 미소구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐) 중의 또는 거대유화액 중의 각각의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 미세캡슐 중에 포집할 수 있다. 상기와 같은 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)]에 개시되어 있다. 서방성 제제를 제조할 수도 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 상기 폴리펩타이드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질(상기 기질은 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다)을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 주사성 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 중에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합의 사용에 의해 발생될 수 있다.
앞서 기재된 조성물들 외에, 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 또한 데포 제제로서 제형화할 수 있다. 상기와 같은 장기간 작용하는 제형은 이식(예를 들어 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들어 허용 가능한 오일 중의 유화액으로서) 또는 이온 교환 수지와, 또는 드물게 용해성인 유도체, 예를 들어 드물게 용해성인 염으로서 제형화할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포집 또는 동결건조 공정에 의해 제조할 수 있다. 약학 조성물을 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제, 또는 상기 단백질의, 약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 가공을 용이하게 하는 보조제를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화할 수 있다. 적합한 제형화는 선택된 투여 경로에 따라 변한다.
상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 유리산 또는 염기, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 상기 유리산 또는 염기의 생물학적 활성을 실질적으로 유지시키는 염이다. 상기는 산 부가염, 예를 들어 단백질성 조성물의 유리 아미노기와 형성되거나 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타타르산 또는 만델산과 같은 유기산과 형성되는 것들을 포함한다. 유리 카복실기와 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철 수산화물; 또는 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기염기로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 및 다른 양성자성 용매 중에서 더 용해성으로 되는 성향이 있다.
치료 방법 및 조성물
본 발명에 제공된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 중 어느 하나를 치료 방법에 사용할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를, 예를 들어 암의 치료에 면역요법제로서 사용할 수 있다.
치료 방법에 사용하기 위해서, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 양호한 의학적 실행과 일관되는 방식으로 제형화하고, 복용시키고, 투여할 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자들은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개체 환자의 임상적 조건, 질환의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자들을 포함한다.
하나의 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 추가의 양태에서, 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 질병의 치료가 필요한 개체에서 질병의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 질병이 있는 개체에게 치료 유효량의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 투여함을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 치료되는 질병은 증식성 질환이다. 특정한 실시양태에서 상기 질병은 암이다. 몇몇 실시양태에서 상기 방법은 상기 개체에게 치료 유효량의 적어도 하나의 추가적인 치료제, 예를 들어 상기 치료되는 질병이 암인 경우 항암제를 투여함을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는데 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 투여하여 표적 세포의 용해를 유도함을 포함하는, 상기 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에 사용하기 위한 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 제공한다. 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 제조 또는 조제에서 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 용도를 제공한다. 하나의 실시양태에서 상기 약제는 질병의 치료가 필요한 개체에서 상기 질병을 치료하기 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 질병이 있는 개체에게 치료 유효량의 상기 약제를 투여함을 포함하는 상기 질병의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 몇몇 실시양태에서 상기 치료되는 질병은 증식성 질환이다. 특정한 실시양태에서 상기 질병은 암이다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게 치료 유효량의 적어도 하나의 추가적인 치료제, 예를 들어 상기 치료되는 질병이 암인 경우 항암제를 투여함을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 것이다. 더욱 추가의 실시양태에서, 상기 약제는 개체에게 유효량의 상기 약제를 투여하여 표적 세포의 용해를 유도함을 포함하는, 상기 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 질병의 치료 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 상기와 같은 질병을 갖는 개체에게 치료 유효량의 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 투여함을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 약학적으로 허용 가능한 형태로 포함하는 조성물을 상기 개체에게 투여한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 치료되는 질병은 증식성 질환이다. 특정한 실시양태에서 상기 질병은 암이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게 치료 유효량의 적어도 하나의 추가적인 치료제, 예를 들어 상기 치료되는 질병이 암인 경우 항암제를 투여함을 추가로 포함한다. 상기 실시양태 중 어느 하나에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서 상기 방법은 표적 세포를 T 세포, 특히 세포독성 T 세포의 존재하에서 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자와 접촉시킴을 포함한다. 추가의 양태에서, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법을 제공한다. 하나의 상기와 같은 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체에게 유효량의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 투여하여 표적 세포의 용해를 유도함을 포함한다. 하나의 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 치료되는 질병은 증식성 질환, 특히 암이다. 암의 비제한적인 예는 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평상피세포 암종, 골암, 및 신장암을 포함한다. 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 사용하여 치료될 수 있는 다른 세포 증식 질환은 비제한적으로 복부, 골, 유방, 소화계, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 고환, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 영역 및 비뇨생식계 중에 위치한 종양을 포함한다. 또한 전암성 상태 또는 병변 및 암 전이가 포함된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 암은 신장암, 방광암, 피부암, 폐암, 결장직장암, 유방암, 뇌암, 두경부암 및 전립선암으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 추가의 실시양태에서, 상기 암은 전립선암이다. 다수의 사례에서 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자가 치유를 제공하는 것이 아니라 단지 부분적인 이점을 제공할 수 있음을 안다. 일부 실시양태에서, 일부 이점을 갖는 생리학적 변화도 또한 치료학적으로 이로운 것으로 간주된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 생리학적 변화를 제공하는 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 양은 "유효량" 또는 "치료 유효량"으로 간주된다. 치료가 필요한 피실험자, 환자 또는 개체는 전형적으로 포유동물, 보다 특히 인간이다.
일부 실시양태에서, 유효량의 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 세포에 투여한다. 다른 실시양태에서, 치료 유효량의 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 질병의 치료를 위해 개체에게 투여한다.
질병의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 적합한 투여량(단독으로 사용되거나 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 함께 사용될 때)은 치료되는 질병의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 유형, 상기 질병의 중증도 및 과정, 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자가 예방 또는 치료 목적으로 사용되는지의 여부, 선행 또는 동반 치료법, 환자의 임상 병력 및 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 변할 것이다. 투여를 담당하는 의사는 어쨌든 조성물 중의 활성 성분(들)의 농도 및 개체 피실험자에게 적합한 용량(들)을 결정할 것이다. 비제한적으로 단일 또는 다양한 시점에 걸친 수회 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입을 포함한 다양한 투여 스케줄이 본 명세서에서 고려된다.
상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여한다. 상기 질병의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏(예를 들어 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏)의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자가, 예를 들어 1회 이상의 분리 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든 간에, 상기 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 임의의 전형적인 1일 투여량은 상기 언급한 인자들에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸쳐 반복된 투여를 위해서, 상기 조건에 따라, 상기 치료를 일반적으로는 질병 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 지속할 수 있다. 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.005 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 다른 비제한적인 예에서, 하나의 용량은 또한 약 1 마이크로그램/㎏ 체중, 약 5 마이크로그램/㎏ 체중, 약 10 마이크로그램/㎏ 체중, 약 50 마이크로그램/㎏ 체중, 약 100 마이크로그램/㎏ 체중, 약 200 마이크로그램/㎏ 체중, 약 350 마이크로그램/㎏ 체중, 약 500 마이크로그램/㎏ 체중, 약 1 밀리그램/㎏ 체중, 약 5 밀리그램/㎏ 체중, 약 10 밀리그램/㎏ 체중, 약 50 밀리그램/㎏ 체중, 약 100 밀리그램/㎏ 체중, 약 200 밀리그램/㎏ 체중, 약 350 밀리그램/㎏ 체중, 약 500 밀리그램/㎏ 체중, 내지 약 1000 ㎎/㎏ 체중 이상, 및 상기 중에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본 명세서에 나열된 숫자로부터 유도될 수 있는 범위의 비제한적인 예에서, 약 5 ㎎/㎏ 체중 내지 약 100 ㎎/㎏ 체중, 약 5 마이크로그램/㎏ 체중 내지 약 500 밀리그램/㎏ 체중 등을 상술한 숫자를 근거로 투여할 수 있다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 5.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 상기와 같은 용량을 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다(예를 들어 상기 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 수령하도록) 투여할 수 있다. 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서 하나 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 그러나, 다른 투여량 섭생도 유용할 수 있다. 상기 치료법의 진행을 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터한다.
본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 일반적으로는 의도하는 목적을 성취하기에 유효한 양으로 사용할 것이다. 질병 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위해서, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자, 또는 그의 약학 조성물을 치료 유효량으로 투여하거나 적용시킨다. 치료 유효량의 측정은 특히 본 명세서에 제공된 상세한 명세에 비추어 충분히 당해 분야의 숙련가들의 능력내에 있다.
전신 투여를 위해서, 치료 유효 용량을 초기에 시험관내 분석, 예를 들어 세포 배양 분석으로부터 추정할 수 있다. 이어서 1회 용량을 동물 모델에서 제형화하여 세포 배양물에서 측정된 바와 같은 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 성취할 수 있다. 상기와 같은 정보를 사용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 측정할 수 있다.
초기 투여량을 또한 생체내 데이터, 예를 들어 동물 모델로부터, 당해 분야에 주지된 기법을 사용하여 추정할 수 있다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 동물 데이터를 기준으로 인간에 대한 투여를 쉽게 최적화할 수 있다.
투여량 및 투여 간격을, 치료 효과를 유지시키기에 충분한 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 혈장 수준을 제공하도록 개별적으로 조절할 수 있다. 주사에 의한 투여에 유용한 환자 투여량은 약 0.1 내지 50 ㎎/㎏/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 ㎎/㎏/일의 범위이다. 치료학적으로 유효한 혈장 수준은 매일 수회 용량의 투여에 의해 성취될 수 있다. 혈장 중 수준을 예를 들어 HPLC에 의해 측정할 수 있다.
국소 투여 또는 선택적인 흡수의 경우에, 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관련될 수 없다. 당해 분야의 숙련가는 과도한 실험 없이 치료학적으로 유효한 국소 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.
본 명세서에 기재된 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 치료 유효량은 일반적으로, 실질적인 독성을 유발시키지 않으면서 치료학적 이점을 제공할 것이다. 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 독성 및 치료 효능을 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학적 과정에 의해 측정할 수 있다. 세포 배양 분석 및 동물 연구를 사용하여 LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 유효한 용량)을 측정할 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량비는 치료 지수이며, 이를 LD50/ED50 비로서 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자가 바람직하다. 하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 획득된 데이터를 인간에 사용하기에 적합한 투여량 범위를 공식화하는데 사용할 수 있다. 상기 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도 범위내에 있다. 상기 투여량은 다양한 인자들, 예를 들어 사용되는 투여형, 사용되는 투여 경로, 피실험자의 조건 등에 따라 상기 범위내에서 변할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 조건에 비추어 개별 의사가 선택할 수 있다(예를 들어 문헌[Fingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다) 참조).
본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자로 치료되는 환자의 주치의는 독성, 기관 기능이상 등으로 인해 언제, 어떻게 투여를 종료, 중단 또는 조절해야 하는지를 알 것이다. 환언하면, 상기 주치의는 임상 반응이 적합하지 않은 경우 치료를 보다 높은 수준으로 조절해야 함을 또한 알 것이다(독성 제외). 관심 질환의 관리에서 투여되는 용량의 크기는 치료되는 상태의 중증도, 투여 경로 등에 따라 변할 것이다. 상기 상태의 중증도를 예를 들어 부분적으로 표준 예후 평가 방법에 의해 평가할 수 있다. 더욱이, 용량 및 추정상 용량 빈도가 또한 개별적인 환자의 연령, 체중, 및 응답에 따라 변할 것이다.
다른 작용제 및 치료
본 발명의 항체 및 이중특이성 항원 결합 분자를 치료법에서 하나 이상의 다른 작용제와 함께 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 적어도 하나의 추가적인 치료제와 공-투여할 수 있다. "치료제"란 용어는 치료가 필요한 개체에서 증상 또는 질병을 치료하기 위해 투여될 수 있는 임의의 작용제를 포함한다. 상기와 같은 추가적인 치료제는 치료되는 특정한 적응증에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 갖는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 추가적인 치료제는 면역조절제, 세포성장억제제, 세포 부착의 억제제, 세포독성제, 세포사멸의 활성제, 또는 세포사멸 유도제에 대한 세포의 감수성을 증가시키는 작용제이다. 특정한 실시양태에서, 상기 추가적인 치료제는 항암제, 예를 들어 미세소관 붕괴제, 대사길항물질, 국소이성화효소 억제제, DNA 삽입제, 알킬화제, 호르몬요법, 키나제 억제제, 수용체 길항물질, 종양세포 세포사멸의 활성제, 또는 혈관형성방지제이다.
상기와 같은 다른 작용제들은 적합하게는 의도된 목적에 유효한 양으로 함께 존재한다. 상기와 같은 다른 작용제의 유효량은 사용되는 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 양, 질환 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 다른 인자들에 따라 다르다. 상기 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 일반적으로는 동일한 투여량으로, 본 명세서에 기재된 투여 경로로, 또는 본 명세서에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 경험상/임상적으로 적합한 것으로 판정되는 임의의 경로에 의해 사용한다.
상기에 나타낸 상기와 같은 복합 요법은 병행 투여(2개 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 조성물 중에 포함되는 경우) 및 분리된 투여(이 경우 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자의 투여는 상기 추가적인 치료제 및/또는 보조제의 투여 전, 상기 투여와 동시에, 및/또는 상기 투여에 이어서 발생할 수 있다)를 포함한다. 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 또한 방사선요법과 함께 사용할 수 있다.
제조 물품
본 발명의 또 다른 양태에서, 상술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품을 제공한다. 상기 제조 물품은 용기 및 상기 용기 상의 또는 상기 용기와 결합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질들, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로, 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 함께 유지하며 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들어 상기 용기는 정맥내 용액 주머니 또는 피하주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자이다. 상기 표지 또는 패키지 삽입물은 상기 조성물이 선택 상태의 치료에 사용됨을 가리킨다. 더욱이, 상기 제조 물품은 (a) 조성물이 함유된 제1 용기(여기에서 상기 조성물은 본 발명의 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 포함한다); 및 (b) 조성물이 함유된 제2 용기(여기에서 상기 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시양태에서 제조 물품은 상기 조성물을 사용하여 특정 상태를 치료할 수 있음을 가리키는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 제조 물품은 약학적으로 허용 가능한 완충제, 예를 들어 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 물품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직할 수 있는 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수도 있다.
진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
몇몇 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 항-STEAP-1 항체 중 어느 하나는 생물학적 샘플 중 STEAP-1의 존재를 검출하기에 유용하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "검출"이란 용어는 정량적인 또는 정성적인 검출을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예를 들어 전립선 조직을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-STEAP-1 항체를 제공한다. 추가의 양태에서, 생물학적 샘플 중의 STEAP-1의 존재의 검출 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-STEAP-1 항체와, STEAP-1에 대한 상기 항-STEAP-1 항체의 결합을 허용하는 조건하에서 접촉시키고, 상기 항-STEAP-1 항체와 STEAP-1 사이에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출함을 포함한다. 상기와 같은 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 항-STEAP-1 항체를 사용하여 항-STEAP-1 항체에 의한 치료법이 가능한(예를 들어 STEAP-1이 환자의 선택을 위한 생물마커인 경우) 환자를 선택한다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 질환은 암, 특히 전립선암을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 표지된 항-STEAP-1 항체를 제공한다. 표지는 비제한적으로 직접적으로 검출되는 표지 또는 부분(예를 들어 형광, 발색성, 전자-밀도, 화학발광, 및 방사성 표지)뿐만 아니라, 간접적으로, 예를 들어 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 부분, 예를 들어 효소 또는 리간드를 포함한다. 예시적인 표지는 비제한적으로 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예를 들어 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루세리페라제, 예를 들어 개똥벌레 루시페라제 및 세균 루시페라제(미국특허 제 4,737,456 호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 페록시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 과산화 수소를 사용하여 염료 전구체, 예를 들어 HRP를 산화시키는 효소와 결합된 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제, 락토페록시다제, 또는 마이크로페녹시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함한다.
아미노산 서열
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기에 제공된 일반적인 설명을 고려하여 다양한 다른 실시양태들을 실행할 수 있다.
실시예 1
구조물 및 도구의 일반적인 내용
재조합 DNA 기법
문헌[Sambrook, J. et al, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물학 시약들은 제조사의 설명서에 따라 사용하였다.
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오타이드 서열에 관한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 제공되어 있다.
유전자 합성
필요한 경우, 목적하는 유전자 분절을 적합한 주형을 사용하여 PCR에 의해 생성시키거나 또는 자동화된 유전자 합성에 의해 합성 올리고뉴클레오타이드 및 PCR 산물로부터 진아트(Geneart) AG(독일 로젠스부르크 소재)에서 합성하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위가 측면에 인접한 유전자 분절을 표준 클로닝/서열분석 벡터내에 클로닝하였다. 상기 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 정제하고 UV 분광학에 의해 농도를 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 유전자 분절을 각각의 발현 벡터내로의 서브클로닝을 허용하기에 적합한 제한 부위로 설계하였다. 모든 구조물을 진핵생물 세포에서의 분비를 위해 단백질을 표적화하는 리더 펩타이드를 암호화하는 5'-단부 DNA 서열로 설계하였다.
DNA 서열분석
DNA 서열을 이중 가닥 서열분석에 의해 측정하였다.
항-STEAP-1/항-CD3 T 세포 이중특이성(TCB) 항체의 클로닝
반도르투주맵의 가변 도메인을 다양한 STEAP-1-특이성 T 세포 이중특이성 (TCB) 항체 변이체의 생성에 사용하였다. 각각의 발현 플라스미드의 생성을 위해서, 반도르투주맵(서열번호 10 및 14) 또는 그의 변이체의 가변 영역 서열을 사용하였으며 각각의 수용자 포유동물 발현 벡터 중에 이미 삽입된 각각의 불변 영역과 인프레임 서브클로닝하였다. 생성 분자의 도식적 예시를 도 2에 나타낸다.
항-STEAP-1/항-CD3 T 세포 이중특이성 (TCB) 항체의 제조
하기의 분자를 제조하였으며, 그의 도식적 예시를 도 2에 제공한다:
A. 분자 A: 2+1 IgG CrossFab "역전된"(STEAP-1 결합제에 대한 C-말단 CD3 결합제), 전하 변형을 갖는다(CD3 결합제 중의 VH/VL 교환, STEAP-1 결합제 중의 전하 변형)(서열번호 26, 27, 34 및 35)
B. 분자 B: 2+1 IgG CrossFab "역전된"(STEAP-1 결합제에 대한 C-말단 CD3 결합제), 전하 변형을 갖는다(CD3 결합제 중의 VH/VL 교환, STEAP-1 결합제 중의 전하 변형; 2개의 STEAP-1 결합 부분 모두에서 D100aE 돌연변이)(서열번호 28, 29, 34 및 35)
C. 분자 C: 2+1 IgG CrossFab "역전된"(STEAP-1 결합제에 대한 C-말단 CD3 결합제), 전하 변형을 갖는다(CD3 결합제 중의 VH/VL 교환, STEAP-1 결합제 중의 전하 변형; 2개의 STEAP-1 결합 부분 모두에서 D100bE 돌연변이)(서열번호 30, 31, 34 및 35)
D. 분자 D: 2+1 IgG CrossFab "역전된"(STEAP-1 결합제에 대한 C-말단 CD3 결합제), 전하 변형을 갖는다(CD3 결합제 중의 VH/VL 교환, STEAP-1 결합제 중의 전하 변형; 2개의 STEAP-1 결합 부분 모두에서 D100aE/D100bE 돌연변이)(서열번호 32, 33, 34 및 35)
상기 언급된 분자의 발현은 키메릭 MPSV 프로모터 또는 CMV 프로모터에 의해 구동되었다. 폴리아데닐화는 CDS의 3' 단부에 위치한 합성 폴리A 신호 서열에 의해 구동되었다. 또한, 각각의 벡터는 상염색체 복제를 위한 EBV OriP 서열을 함유하였다.
모든 구조물의 생성을 위해서, 현탁액 중에서 증식하는 HEK293-EBNA 세포를 형질감염 시약으로서 폴리에틸렌이민을 사용하여 각각의 발현 벡터로 동시-형질감염시켰다. 이와 같이, 모든 "2+1 IgG CrossFab" 구조물의 생성을 위해서, 상응하는 발현 벡터를 1:2:1:1 비("벡터 중쇄(VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3)":"벡터 경쇄(VL-CL)":"벡터 중쇄(VH-CH1-CH2-CH3)":"벡터 경쇄(VH-CL)")로 동시-형질감염시켰다.
HEK293 EBNA 세포를 6 mM L-글루타민 및 250 ㎎/l G418을 함유하는 무혈청 엑셀(Excell) 배양 배지 중의 현탁액에서 배양하였다. 600 ㎖ 튜브스핀 플라스크(최대 수행 부피 400 ㎖)에서 생성을 위해 600 백만 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 시딩하였다. 형질감염 전에, 세포를 5분간 210 x g까지 원심분리시키고 상등액을 예온된 20 ㎖ CD CHO 배지로 교체하였다. 발현 벡터를 20 ㎖ CD CHO 배지에서 400 ㎍ DNA의 최종량으로 혼합하였다. 1080 ㎕ PEI 용액(2.7 ㎍/㎖)의 첨가 후에, 상기 배지를 15s 동안 와동시키고 후속적으로 실온에서 10분간 배양하였다. 그 후에, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고, 600 ㎖ 튜브스핀 플라스크로 옮기고, 37 ℃에서 3시간 동안 가습된 5% CO2 분위기로 배양기에서 배양하였다. 상기 배양 단계 후에, 6 mM L-글루타민, 5 g/L 펩소이, 및 1.0 mM VPA를 함유하는 360 ㎖ 엑셀 배지를 가하고 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 하루 후에, 7% 공급물 7을 가한다. 7일의 배양 후에, 상등액을 3600 x g(시그마 8K 원심분리기)에서 20 내지 30분 동안 원심분리에 의해 정제하기 위해 수집하고, 상기 용액을 멸균 여과하고(0.22 ㎛ 필터) 나트륨 아지드를 0.01% w/v의 최종 농도로 가하고, 4 ℃에서 보관하였다.
모든 분자를 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 이어서 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 세포 배양 상등액으로부터 정제시켰다. 친화성 크로마토그래피를 위해서, 상등액을 25 ㎖ 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, pH 7.5로 평형화시킨 하이트랩(HiTrap) 단백질A HP 컬럼(CV = 5 ㎖, GE 헬쓰케어)상에 로딩하였다. 결합되지 않은 단백질을 적어도 10 컬럼 부피의 20 mM 나트륨 포스페이트, 20 mM 나트륨 시트레이트, pH 7.5로 세척하여 제거하였다. 표적 단백질을 6 컬럼 부피의 20 mM 나트륨 시트레이트, 100 mM 염화 나트륨, 100 mM 글리신, pH 3.0으로 용출시켰다. 단백질 용액을 1/10 부피의 0.5 M 나트륨 포스페이트, pH 8.0을 가하여 중화시켰다. 단백질 A 크로마토그래피 후에 제조과정 중 분석을 위해서, 단일 분획 중의 분자의 순도 및 분자량을 환원제의 부재하에서 SDS-PAGE에 의해 분석하고 쿠마씨(엑스페데온(Expedeon)으로부터의 인스탄트블루(InstantBlue)(상표))로 염색하였다. NuPAGE(등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 젤 시스템(4-12% 비스-트리스, 인비트로젠, 미국 소재)을 제조사의 설명에 따라 사용하였다. 표적 단백질의 선택된 분획을 농축시키고 여과한 후에, 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화 나트륨, pH 6.0, 0.01% 트윈20으로 평형화시킨 하이로드 슈퍼덱스(HiLoad Superdex) 200 컬럼(GE 헬쓰케어)상에 로딩하였다. 상기 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를, 아미노산 서열을 근거로 계산된 몰 소광 계수를 사용하여 280 ㎚에서 광학 밀도(OD)에 의해 측정하였다. 또한, 모든 분자의 질량 분광측정 분석을 정체성 확인을 위해 수행하였다.
STEAP-1 발현 CHO-K1 세포주의 생성
전장 인간 STEAP-1을 암호화하는 유전자를 포유동물 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 상기 플라스미드를 제조사의 프로토콜(인비트로젠, #15338100)에 따라 리포펙타민 LTX 시약을 사용하여 CHO-K1(ATCC CRL-9618)내로 형질감염시켰다. 안정하게 형질감염된 STEAP-1-양성 CHO 세포를, 10% 소 태아 혈청(깁코, #16140063) 및 1% GlutaMAX 보충제(깁코: #31331-028)가 보충된 DMEM/F-12 배지(깁코, #11320033)에서 유지시켰다. 형질감염 2일 후에, 퓨로마이신(인비트로젠; #ant-pr-1)을 6 ㎍/㎖로 가하고 세포를 수회 계대배양을 위해 배양하였다. 초기 선택 후에, STEAP-1의 최고의 세포 표면 발현을 갖는 세포를 BD FACSAria II 세포 분류기(BD 바이오사이언시즈(Biosciences))에 의해 분류하고 배양하여 안정한 세포 클론을 확립시켰다. 상기 발현 수준 및 안정성을 4주의 기간에 걸쳐 2차 항체로서 반도르투주맵 및 PerCP-접합된 Fc 감마-특이성 염소 항-인간 IgG(잭슨 임뮤노리써치(Jackson ImmunoResearch), #109-126-097)를 사용하여 FACS 분석에 의해 확인하였다.
실시예 2
반도르투주맵-기반 서열 변이체의 생성 및 특성규명
반도르투주맵의 서열 분석
아스파라진 탈아미드화, 아스파테이트 이성질화, 숙신이미드 형성 및 트립토판 산화와 같은 변형은 재조합 항체에 전형적인 저하이며, 시험관내 안정성 및 생체내 생물학적 기능 모두에 영향을 미칠 수 있다. 아스파테이트 이성질화, 아스파라진 탈아미드화 또는 숙신이미드 형성이 용이한 잠재적인 아미노산 서열 패턴의 존재를 선별하기 위해서 반도르투주맵 CDR 서열(카밧에 따른 서열번호 1, 2, 3, 7, 8 및 9)의 컴퓨터 분석을 수행하였다. 더욱 또한, 산화 가능성을 갖는 트립토판의 존재에 대해서 CDR 영역을 분석하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 반도르투주맵 서열의 분석은 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 도메인의 CDR 영역에서 잠재적인 핫스폿을 밝혀내었다.
반도르투주맵 서열의 변이체(분자 B-D)의 생성
최소의 아이소-아스파테이트 및 숙신이미드 형성 및 최적의 안정성을 갖는 항-STEAP-1 항체를 제조하기 위해서, 변형된 HCDR3 서열을 갖는 반도르투주맵 서열의 다수의 변이체를 생성시켰다. 특히, 100a 및 100b(카밧 넘버링)번 위치의 아스파테이트 잔기를 글루타메이트에 의해 개별적으로 또는 함께(서열번호 4, 5 및 6) 교체하고 생성되는 플라스미드(서열번호 28, 29, 34 및 35(돌연변이 D100aE, 분자 B); 서열번호 30, 31, 34 및 35(돌연변이 D100bE, 분자 C); 서열번호 32-35(돌연변이 D100aE/D100bE, 분자 D))를 각각의 TCB 항체 분자의 발현을 위해 생성시켰다.
화학적 저하 시험
도입된 돌연변이가 HCDR3 중의 예측된 핫스폿을 제거하고, 안정성을 증가시키고 항-STEAP-1 항체의 결합 역가의 상실을 방지함을 확인하기 위해서, 모든 구조물(분자 A-D)을 2개의 분액으로 분할하고, 각각 20 mM His/HisCl, 140 mM NaCl, pH 6.0 또는 PBS, pH 7.4내에 재-완충시키고, 40 ℃(His/NaCl) 또는 37 ℃(PBS)에서 배양하였다. 또한, 대조용 샘플을 -80 ℃에서 보관하였다. pH 7.4에서의 배양은 상기 분자의 혈장 중 상황에의 노출을 반영하며 생체내 상기 분자의 안정성에 대한 결론을 끌어낼 수 있게 한다. 대조적으로, 감소된 pH(여기에서 pH 6)를 갖는 완충제 제형은 항체-기반 구조물의 장기간 보관에 보다 적합하며 이러한 조건하에서의 스트레스 시험은 분자의 반감기를 예측가능하게 한다.
28일의 배양 기간 후에, 샘플을 분석하고 STEAP-1-결합 부분의 결합 효능(상대적인 활성 농도)에 대해 비교하였다. 상기 분석을 질량 분광분석 및 세포-기반 ELISA에 의해 간접적으로 수행하였다.
질량 분광분석에 의한 스트레스받은 분자 A-D의 특성규명
반도르투주맵 및 그의 변이체의 CDR내 예측된 위치에서 스트레스-유도된 단백질 저하를 확인하기 위해서, 분자 A-D의 질량 분광분석을 수행하였다. 80 ㎍의 참조 및 스트레스받은 단백질 샘플을 37 ℃에서 124.5 ㎕ 100 mM 트리스, 5.6 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, 10 mM TCEP (트리스(2-카복시에틸)포스핀(피어스 프로테인 바이올로지 프로덕츠(Pierce Protein Biology Products)), pH 6.0 중에서 1h 동안 변성시키고 환원시켰다. 완충제를 0.5 ㎖ 제바 스핀(Zeba Spin) 탈염 컬럼(피어스 프로테인 바이올로지 프로덕츠)에서 20 mM 히스티딘 클로라이드, 0.5 mM TCEP, pH 6.0으로 교환하였다. 단백질 샘플을 140 ㎕의 최종 부피로 ㎍ 단백질당 0.05 ㎍ 트립신(프로메가(Promege))의 첨가 후에 37 ℃에서 밤새 절단하였다. 7 ㎕의 10% 포름산(FA) 용액의 첨가에 의해 절단을 정지시켰다.
상기 절단된 샘플을 사용시까지 -80 ℃에서 보관하였다. 분석을 나노액퀴티(nanoAcquity) UPLC(워터스(Waters)) 및 오르비트랩 퓨전(Orbitrap Fusion) 질량 분광계(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))를 사용하여 UHPLC-MS/MS에 의해 수행하였다. 약 2.4 ㎍의 절단된 융합 단백질을 5 ㎕에 주사하였다. 크로마토그래피 분리를 액퀴티 BEH300 C18 컬럼, 1x 150 ㎜, 1.7 ㎛, 300 Å(워터스)상에서 60 ㎕/분의 유량을 사용하여 역상에 의해 수행하였다. 이동상 A 및 B는 각각 UPLC 등급 수 및 아세토나이트릴 중에 0.1%(v/v) 포름산을 함유하였다. 50 ℃의 컬럼 온도를 사용하였으며, 90분에 걸쳐 1% 내지 40% 이동상 B의 구배를 적용하였다. 오르비트랩 퓨전을 데이터-의존 방식으로 사용하였다. 본질적인 MS 환경은 이온화(분무 전압: 3.6 kV, 이온 전달 튜브: 250 ℃, 기화기: 100 ℃), 전체 MS(AGC: 2 x 105, 분해능: 12 x 104, m/z 범위: 300-2000, 최대 주사시간: 100 ms); MS/MS(AGC; 1 x 104, 최대 주사시간: 100 ms, 단리 폭: 2 Da)이었다. 표준화된 충돌 에너지는 35%로 설정하였다.
펩타이드 맵핑을 적용하여 분자 A-D에 대해 예상된 핫스폿(N53(HCDR2), N97(HCDR3), D100a(HCDR3) 및 W50(LCDR2)(카밧 넘버링))의 탈아미드화, 이성질화 및 산화 수준을 정량분석하였다.
상기 HCDR3 영역을 갖는 펩타이드에서, 어느 한 조건에서 분자 A-D 중 어느 것에서도 N97번 위치에서 탈아미드화 또는 숙신이미드 형성이 검출되지 않았다(데이터 도시 안 됨). 그러나, pH 6에서 스트레스 노출은, 예측된 핫스폿 아스파테이트 100a를 또한 갖는 동일한 HCDR3 펩타이드에서 상이한 수준의 아스파테이트 저하를 생성시켰다. 상이한 수준의 숙신이미드 및 아이소-아스파테이트 형성이 4주 후에 His/NaCl pH 6.0 중에서 40 ℃에서 4개의 시험된 분자의 각각의 트립신분해 펩타이드 중에서 검출되었다(표 1). pH 6.0에서 스트레스 노출 후에, 최고의 전체 수준이 분자 A에서 검출되었다. 분자 B에서 D100a→E100a뿐만 아니라 분자 C에서 D100b→E100b의 돌연변이의 도입은 숙신이미드 수준의 현저한 감소를 유도한다. 그러나, 상기 두 돌연변이(D100aE/D100bE)(분자 D) 모두의 조합은 숙신이미드 수준을 3%까지 강하게 감소시켰으며, 이는 상기 긴 스트레스 노출 기간 동안 무시할만한 양이었다. 더욱 또한, 분자 D에서 아이소-아스파테이트는 검출되지 않았다. 상기 결과는 분자 A 중의 2개의 아스파테이트(D100a 및 D100b) 모두 및 분자 C 또는 B 중의 아스파테이트 중 어느 하나(D100a 또는 D100b)가 스트레스 후 발견된 전체 숙신이미드 및 아이소-아스파테이트 수준에 기여함을 가리킨다. 또한, pH 7.4에서 스트레스 노출 후 분자 D의 HCDR3에서 단백질 저하는 전혀 검출되지 않았으며, 이는 상기 새롭게 설계된 서열 변이체의 온전함을 입증한다.
[표 1]
상기 STEAP-1 결합제의 중쇄(HCDR2) 중에 N53 위치를 갖는 펩타이드의 분석은 모든 구조물에서 PBS, pH 7.4 중에서 37 ℃에서 4주 후에 N53 탈아미드화의 작은 증가를 밝혀낸 반면, pH 6에서는 현저한 증가가 검출되지 않았다(표 2). W50(LCDR2)의 산화는 모든 샘플에 대해서 2% 미만이었다(표 3). 결과적으로 이러한 추정적인 핫스폿에 관한 분자 최적화는 수행되지 않았다.
[표 2]
[표 3]
세포-기반 ELISA를 사용하는 스트레스후 결합 역가의 특성규명
pH 7.4 또는 6.0에서 1 내지 4주 스트레스에 의해 야기된 결합 역가의 감소를 정량분석하기 위해서, 인간 STEAP-1을 안정하게 발현하는 CHO-K1 세포를 사용하는 세포-기반 ELISA를 사용하였다. 상기 세포-기반 ELISA를 위해서, 96-웰 플레이트의 웰당 10,000 세포를 시딩하고 37 ℃, 5% CO2에서 18h 동안 배양하였다. 상등액을 자동화된 세척기(BIOTEK)를 사용하여 제거하고, 생육 배지 중의 항체 구조물의 100 ㎕의 일련의 희석물(10 pM - 30 nM)을 각 웰에 가하였다. 4 ℃에서 1h의 배양 후에, 웰을 비우고 100 ㎕의 PBS 중의 0.05% 글루타르알데하이드를 RT에서 10분간 가하였다. PBS/0.025% 트윈20(PBST)으로 4회 세척 후에, 차단 완충제(롯슈) 중에서 1:20000 희석된 100 ㎕의 항-인간-IgG-HRP(잭슨)를 가하고 플레이트를 실온(RT)에서 1h 동안 배양하였다. 웰을 PBST로 6회 세척하고, 신호를 웰당 100 ㎕의 TMB를 사용하여 발생시키고, 10분 후에 50 ㎕ 1M HCl로 상기 반응을 정지시키고 흡광도를 450 ㎚에서 측정하였다. 데이터(표 4)를, 스트레스받은 샘플의 결합 EC50을 처리되지 않은 샘플의 상기 EC50으로 나누고 100을 곱한 "결합%"로서 나타내었다.
모든 시험된 TCB 항체가 분자당 2개의 STEAP-1-결합 부분을 포함하고 STEAP-1에 대한 1가 결합의 친화성이 40 내지 60 nM의 범위임을 고려하면, 오직 2개의 기능성 STEAP-1-결합 부분을 갖는 분자만이 상기 ELISA에서 검출될 수 있음을 상상할 수 있다. 대조적으로, 단지 하나의 기능성 STEAP-1 결합 부분만을 갖는 분자는 상기 프로토콜에 기재된 세척 단계 동안 씻겨나가는 것으로 추정된다. 따라서, 상승된 숙신이미드 수준을 갖는 분자에 대한 결합 상실의 누적 백분율은 HCDR3(분자 A-C)에서 검출되는 단백질 저하보다 더 높다.
[표 4]
반도르투주맵-기반 TCB 항체 변이체(분자 A-D)의 생화학적 특성규명
생화학적 및 생물물리학적 성질을 특성규명하고 비교하기 위해서, 신규의 항-STEAP-1 항체 서열 변이체(분자 B-D)를 갖는 모든 TCB를 분석하고 반도르투주맵 서열(분자 A)을 갖는 TCB 항체와 비교하였다. 결과를 표 5에 요약한다:
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
겉보기 소수성을 25 mM Na-포스페이트, 1.5 M 암모늄 설페이트, pH 7.0으로 평형화시킨 HIC-에테르-5PW(토소(Tosoh)) 컬럼상에 20 ㎍의 샘플을 주사함으로써 측정하였다. 60분 이내에 0에서 100%까지의 완충제 B(25 mM Na-포스페이트, pH 7.0)의 선형 구배로 용출을 수행하였다. 체류 시간을 공지된 소수성을 갖는 단백질 표준에 비교하였다.
열 안정성
샘플을 20 mM 히스티딘/히스티딘 클로라이드, 140 mM NaCl, pH 6.0 중에 1 ㎎/㎖의 농도로 제조하고, 0.4 ㎛ 필터 플레이트를 통해 원심분리에 의해 광학적 384-웰 플레이트로 옮기고 파라핀 오일로 덮었다. 상기 샘플을 25 ℃에서부터 80 ℃까지 0.05 ℃/분의 속도로 가열하면서 다이나프로(DynaPro) 플레이트 판독기(와이어트(Wyatt))상에서 동적 광 산란에 의해 열역학적 반경을 반복해서 측정한다.
FcRn 친화성 크로마토그래피
FcRn을 기재된 바와 같이 발현시키고, 정제하고 비오틴화하였다(문헌[Schlothauer et al., MAbs (2013) 5(4), 576-86]). 결합을 위해서, 상기 제조된 수용체를 스트렙트아비딘-세파로스(GE 헬쓰케어)에 가하였다. 생성되는 FcRn-세파로스 기질을 컬럼 틀에 충전하였다. 상기 컬럼을 20 mM 2-(N-모르폴린)-에탄설폰산(MES), 140 mM NaCl, pH 5.5(용출제 A)로 0.5 ㎖/분의 유량으로 평형화시켰다. 30 ㎍의 항체 샘플을 용출제 A로 1:1의 부피비로 희석하고 FcRn 컬럼에 적용하였다. 상기 컬럼을 5 컬럼 부피의 용출제 A로 세척한 다음 35 컬럼 부피로 20 내지 100% 20 mM 트리스/HCl, 140 mM NaCl, pH 8.8(용출제 B)의 선형 구배로 용출시켰다. 상기 분석을 25 ℃에서 컬럼 오븐으로 수행하였다. 용출 프로파일을 280 ㎚에서 흡광도를 연속 측정하여 모니터하였다. 체류 시간을 공지된 친화성을 갖는 단백질 표준에 비교하였다.
헤파린 친화성 크로마토그래피
헤파린 친화성을 50 mM 트리스, pH 7.4로 평형화시킨 TSKgel 헤파린-5PW(토소) 컬럼상에 30 내지 50 ㎍의 샘플을 주사함으로써 측정하였다. 37분 이내에 0에서 100%까지의 완충제 B(50 mM 트리스, 1 M NaCl, pH 7.4 mM)의 선형 구배로 용출을 수행하였다. 체류 시간을 공지된 친화성을 갖는 단백질 표준에 비교하였다.
모든 시험된 생물물리학적 및 생화학적 성질에 관하여 신규의 항-STEAP-1 항체 서열 변이체(분자 B-D)를 갖는 시험된 TCB 중 어느 하나와 반도르투주맵 서열(분자 A)을 갖는 분자간에 현저한 차이는 발견되지 않았다(표 5). 모든 샘플은 스트레스시 단지 미미한 응집 및 단편화만을 보였으며, 이는 pH 6에서 스트레스 노출후 관찰된 활성 상실(분자 A-C)이 HCDR3 영역 중 확인된 위치에서 화학적 단백질 저하에 기인함을 지지한다.
[표 5]
실시예 3
STEAP-1 TCB 항체 변이체의 기능적 특성규명
STEAP-1 TCB 항체 변이체에 의해 유도된, T-세포 매개된 종양 용해
상이한 STEAP-1 TCB 항체 변이체(분자 A-D)에 의해 매개된 T-세포 사멸을 STEAP-1 발현 LnCAP 세포상에서 평가하였다. 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 효과기 세포로서 사용하였으며 이중특이성 항체와 24h 및 48h 배양시 사멸이 검출되었다. 부착성 표적 세포를 트립신/EDTA로 수확하고, 세척하고, 편평-바닥 96-웰 플레이트를 사용하여 30 000 세포/웰의 밀도로 도말하였다. 세포를 밤새 부착되도록 방치하였다. PBMC를, 건강한 인간 공여자로부터 수득한 헤파린처리된 혈액의 농축된 림프구 제제의 히스토파크(Histopaque) 밀도 원심분리에 의해 제조하였다. 신선한 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 히스토파크 구배에 걸쳐 층상화하였다(시그마, #H8889). 원심분리(450 x g, 30분, 실온) 후에, 상기 PBMC-함유 간기 이상의 혈장은 버리고 PBMC를 새로운 팔콘 튜브로 옮기고 후속적으로 50 ㎖의 PBS로 채웠다. 상기 혼합물을 원심분리시키고(400 x g, 10분, 실온), 상등액을 버리고 PBMC 펠릿을 멸균 PBS로 2회 세척하였다(원심분리 단계 350 x g, 10분). 생성되는 PBMC 집단을 자동적으로 카운트하고(ViCell) 37 ℃, 5% CO2에서 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬(Biochrom), K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지에서 세포 배양기에서 추후의 사용시까지(24h 이내) 보관하였다.
사멸 분석을 위해서, 상기 항체를 지시된 농도(0.01 pM 내지 1 nM의 범위)로 3회 중복하여 가하였다. PBMC를 표적 세포에 10:1의 최종 E:T 비가 획득되도록 가하였다. 표적 세포 사멸을 37 ℃, 5% CO2에서 24h 및 48h의 배양 후에 세포사멸/괴사 세포에 의해 세포 상등액내로 방출된 LDH의 정량분석(LDH 검출 키트, 롯슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), #11 644 793 001)에 의해 평가하였다. 상기 표적 세포의 최대 용해(=100%)를, 표적 세포와 1% 트리톤 X-100과의 배양에 의해 성취하였다. 최소 용해(=0%)는 이중특이성 구조물 없이 효과기 세포와 공-배양된 표적 세포를 지칭한다. 24h(도 4A) 및 48h(도 4B) 후의 결과는 T-세포 매개된 종양 용해가 시험된 분자에 의해 유사하게 유도되며 분자 B-D에서 STEAP-1 결합제의 변형은 상기 분자의 사멸 효능에 음으로 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
STEAP-1 TCB 항체 변이체에 의해 유도된 T-세포 활성화(주르캣-NFAT 활성화 분석)
세포상의 CD3 및 인간 STEAP-1에 동시 결합시 효과기 세포의 CD3-매개된 활성화를 유도하는 STEAP-1 TCB 항체 변이체의 능력을 종양 항원 양성 표적 세포(LnCAP, 22RV1) 및 주르캣-NFAT 리포터 세포(NFAT 프로모터를 갖는 CD3-발현 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주; 글로리스판스 주르캣(GloResponse Jurkat) NFAT-RE-luc2P, 프로메가 #CS176501)의 공-배양물을 사용하여 평가하였다. STEAP-1 항원(표적 세포상에서 발현된) 및 CD3 항원(주르캣-NFAT 리포터 세포상에서 발현된)에 상기 TCB 분자의 동시 결합시, 상기 NFAT 프로모터는 활성화되며 활성 개똥벌레 루시퍼라제의 발현을 유도한다. 발광 신호(루시페라제 기질의 첨가시 획득됨)의 강도는 CD3 활성화 및 신호전달의 강도에 비례한다.
상기 분석을 위해서, 인간 종양 세포를 수확하고 생육력을 ViCell을 사용하여 측정하였다. 20 000 세포/웰을 편평-바닥, 백색-벽 96-웰-플레이트(#655098, 그라이너 바이오 원(greiner bio-one))에 도말하고 희석된 항체 또는 배지(대조용의 경우)를 가하였다(2.6 pM 내지 200 nM의 범위).
후속적으로, 주르캣-NFAT 리포터 세포를 수확하고 생육력을 ViCell을 사용하여 평가하였다. 세포를 세포 배양 배지에 재-현탁시키고 종양 세포에 가하여 5:1의 최종 효과기 대 표적(E:T) 비 및 웰당 100 ㎕의 최종 부피를 획득하였다. 세포를 가습 배양기에서 37 ℃에서 6h 동안 배양하였다. 상기 배양 시간의 끝에서, 100 ㎕/웰의 ONE-Glo 용액(프로메가, 1:1 ONE-Glo 및 분석 배지 부피/웰)을 웰에 가하고 암실에서 실온에서 10분간 배양하였다. 발광을 WALLAC Victor3 ELISA 판독기(퍼킨엘머(PerkinElmer)2030), 검출 시간으로서 5초/웰을 사용하여 검출하였다.
도 5에 도시된 바와 같이, 모든 평가된 STEAP-1 TCB 항체 분자는 STEAP-1-발현 LnCAP(도 5A) 및 22Rv1(도 5B) 세포상의 CD3을 통한 T 세포 가교결합 및 후속적인 T 세포 활성화를 유도한다. STEAP-1-음성 CHO-K1 세포(도 5C)상에서 T 세포 활성화를 관찰할 수 없다.
STEAP-1 TCB 항체 변이체의 STEAP-1- 및 CD3-발현 세포에의 결합
STEAP-1 TCB 항체 변이체(분자 A-D)의 결합을, STEAP-1-발현 CHO-hSTEAP-1 세포(인간 STEAP-1을 안정하게 과발현하도록 형질감염된 햄스터 난소로부터 유래된 상피 세포주) 및 CD3-발현 주르캣-NFAT 리포터 세포(프로메가 #CS176501)를 사용하여 시험하였다.
간단히, 부착성 CHO-hSTEAP-1 세포를 세포 용해 완충제(깁코, #13151014)를 사용하여 수확하고, 카운트하고, 생육성에 대해 검사하고, FACS 완충제(100 ㎕ PBS 0.1% BSA) 중에 2 x 106 세포/㎖로 재-현탁하였다. 주르캣 현탁액 세포를 또한 수확하고, 카운트하고 생육력에 대해 검사하였다. 100 ㎕의 세포 현탁액(0.2 x 106 세포 함유)을 증가하는 농도의 STEAP-1 TCB 항체(31 pM 내지 1000 nM)와 함께 4 ℃에서 30분간 환저 96-웰 플레이트에서 배양하고, 0.1% BSA(FACS 완충제)를 함유하는 저온 PBS로 2회 세척하고, 4 ℃에서 1:50 예비-희석된 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647-접합된 애피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편 염소-인간 IgG Fcγ 단편 특이성 2차 항체(잭슨 임뮤노 리써치 랩(Jackson Immuno Research Lab), 알렉사 플루오르 647 #109-606-008, FACS 완충제 중에서 희석)와 함께 추가로 30분간 재-배양하고, 저온 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하였다.
염색된 세포를 100 ㎕ 2% 파라포름알데하이드-함유 FACS 완충제 중에 재-현탁시키고 4 ℃에서 30분간 배양하여 상기 염색을 고정시켰다. 최종적으로, 세포를 350 x g 및 4 ℃에서 4분간 원심분리시키고, 상등액을 버리고 세포 펠릿을 200 ㎕ FACS 완충제에 재-현탁시켰다. 염색을 FACS 칸토(Canto) II(소프트웨어 FACS Diva)를 사용하여 FACS에 의해 분석하였다. 결합 곡선을 그래프패드프리즘6를 사용하여 획득하였다(도 6A, CHO-hSTEAP-1 세포에 결합; 도 6B, 주르캣 세포에 결합).
도 6에 도시된 바와 같이, 모든 평가된 STEAP-1 TCB 항체 분자는 인간 STEAP-1을 발현하는 인간 CHO 세포(도 6A) 및 주르캣 NFAT 세포상에서 발현된 인간 CD3(도 6B)에 농도-의존적인 결합을 보이며, 이는 분자 B-D에서 STEAP-1 결합제의 변형이 세포상의 STEAP-1에 대한 그의 결합에 음성적인 영향을 미치지 않음을 가리킨다.
상기 발명을 이해의 명확성을 위해서 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 기재하였지만, 상기 설명 및 실시예를 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 내용은 전체가 명백히 본 명세서에 참고로 인용된다.
SEQUENCE LISTING
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
<120> Antibodies binding to STEAP-1
<130> P34188
<140> PCT/EP2018/058043
<141> 2018-03-29
<150> EP 17164466.9
<151> 2017-04-03
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
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Ala
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Asn Tyr Asp Tyr Asp Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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<223> STEAP-1 VH (DE)
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<220>
<223> STEAP-1 VH (EE)
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Asn Tyr Asp Tyr Glu Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
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Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
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Thr Tyr Ala Met Asn
1 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 16
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
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<220>
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<400> 18
Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
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<220>
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<400> 19
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
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<211> 9
<212> PRT
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<220>
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Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3 VH
<400> 21
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3 VL
<400> 22
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 23
<211> 339
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Met Glu Ser Arg Lys Asp Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met
1 5 10 15
Lys Pro Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Val Leu Leu His Leu His Gln
35 40 45
Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu Leu Gln His Thr
50 55 60
Gln Glu Leu Phe Pro Gln Trp His Leu Pro Ile Lys Ile Ala Ala Ile
65 70 75 80
Ile Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His
85 90 95
Pro Leu Ala Thr Ser His Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu
100 105 110
Val Ile Asn Lys Val Leu Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu
115 120 125
Val Tyr Leu Pro Gly Val Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly
130 135 140
Thr Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr
145 150 155 160
Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala
165 170 175
Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu
180 185 190
Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp
195 200 205
Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile
210 215 220
Val Gly Leu Ala Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser
225 230 235 240
Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Ser Lys
245 250 255
Leu Gly Ile Val Ser Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Leu Ile Phe
260 265 270
Ala Trp Asn Lys Trp Ile Asp Ile Lys Gln Phe Val Trp Tyr Thr Pro
275 280 285
Pro Thr Phe Met Ile Ala Val Phe Leu Pro Ile Val Val Leu Ile Phe
290 295 300
Lys Ser Ile Leu Phe Leu Pro Cys Leu Arg Lys Lys Ile Leu Lys Ile
305 310 315 320
Arg His Gly Trp Glu Asp Val Thr Lys Ile Asn Lys Thr Glu Ile Cys
325 330 335
Ser Gln Leu
<210> 24
<211> 207
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 25
<211> 198
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 25
Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys
50 55 60
Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu
65 70 75 80
Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro
85 90 95
Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn
100 105 110
Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp
115 120 125
Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys
130 135 140
Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn
165 170 175
Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly
180 185 190
Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195
<210> 26
<211> 452
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Molecule A (STEAP-1 VH-CH1(EE)-Fc(knob, PGLALA))
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Asn Tyr Asp Tyr Asp Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro
450
<210> 27
<211> 677
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Molecule A (STEAP-1 VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc(knob, PGLALA))
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Tyr Ile Ser Asn Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Arg Asn Tyr Asp Tyr Asp Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro
210 215 220
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Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
610 615 620
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
625 630 635 640
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
645 650 655
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
660 665 670
Leu Ser Leu Ser Pro
675
<210> 34
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Molecule A-D (STEAP-1 VL-CL(RK))
<400> 34
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Molecule A-D (CD3 VH-CL)
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1 5 10 15
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20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 36
<211> 225
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
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<211> 10
<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
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Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<213> Homo sapiens
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
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85 90 95
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<213> Homo sapiens
<400> 41
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
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225 230 235 240
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Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325
Claims (40)
- STEAP-1에 결합하는 항체로서, 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항체.
- 제 1 항에 있어서,
VH가 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열번호 14의 아미노산 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 항체. - 제 1 항에 있어서,
IgG 또는 IgG1 항체인 항체. - 제 1 항에 있어서,
전장 항체인 항체. - 제 1 항에 있어서,
Fv 분자, scFv 분자, Fab 분자, 및 F(ab')2 분자의 그룹 중에서 선택된 항체 단편인 항체. - 제 1 항에 있어서,
다중특이성 항체인 항체. - (a) 제1 항원에 결합하는 제1 항원 결합 부분, 및
(b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부분
을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자로서,
상기 제1 항원은 STEAP-1이고,
상기 제1 항원 결합 부분은 서열번호 1의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 2의 HCDR 2, 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열번호 7의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 8의 LCDR 2 및 서열번호 9의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 7 항에 있어서,
제1 항원 결합 부분의 VH가 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13의 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 제1 항원 결합 부분의 VL이 서열번호 14의 아미노산 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 8 항에 있어서,
제2 항원이 CD3 또는 CD3ε인 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 9 항에 있어서,
제2 항원 결합 부분이 서열번호 15의 HCDR 1, 서열번호 16의 HCDR 2 및 서열번호 17의 HCDR 3을 포함하는 VH, 및 서열번호 18의 LCDR 1, 서열번호 19의 LCDR 2 및 서열번호 20의 LCDR 3을 포함하는 VL을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 10 항에 있어서,
제2 항원 결합 부분의 VH가 서열번호 21의 아미노산 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 부분의 VL이 서열번호 22의 아미노산 서열에 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 7 항에 있어서,
제1 및/또는 제2 항원 결합 부분이 Fab 분자인 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 7 항에 있어서,
제2 항원 결합 부분이, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 교체된 Fab 분자인 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 7 항에 있어서,
제1 항원 결합 부분이, 불변 도메인 CL에서 124번 위치의 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧(Kabat)에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고 123번 위치의 아미노산이 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)(카밧에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되며, 불변 도메인 CH1에서 147번 위치의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환되고 213번 위치의 아미노산이 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D)(카밧 EU 인덱스에 따른 넘버링)에 의해 독립적으로 치환된 Fab 분자인 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 7 항에 있어서,
제1 및 제2 항원 결합 부분이 임의적으로 펩타이드 링커를 통해 서로에 융합되는 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 7 항에 있어서,
제1 및 제2 항원 결합 부분이 각각 Fab 분자이고, (i) 상기 제2 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되거나, (ii) 상기 제1 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되는 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 7 항에 있어서,
제3 항원 결합 부분을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 17 항에 있어서,
제3 항원 부분이 제1 항원 결합 부분과 동일한 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 7 항에 있어서,
제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 19 항에 있어서,
제1, 제2, 및 존재하는 경우 제3 항원 결합 부분이 각각 Fab 분자이고; (i) 상기 제2 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제1 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고 상기 제1 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되거나, (ii) 상기 제1 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 상기 제2 항원 결합 부분의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고 상기 제2 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되고; 존재하는 경우 상기 제3 항원 결합 부분이 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되는 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 19 항에 있어서,
Fc 도메인이 IgG 또는 IgG1 Fc 도메인인 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 19 항에 있어서,
Fc 도메인이 인간 Fc 도메인인 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 19 항에 있어서,
Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인 중의 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체되어, 제2 서브유닛의 CH3 도메인내 공동에 위치할 수 있는 제1 서브유닛의 CH3 도메인내 돌기를 생성시키고, 상기 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인 중의 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 교체되어, 상기 제1 서브유닛의 CH3 도메인내 돌기가 위치할 수 있는 상기 제2 서브유닛의 CH3 도메인내 공동을 생성시키는 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 19 항에 있어서,
Fc 도메인이 Fc 수용체에의 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제 25 항에 따른 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하는 하나 이상의 벡터.
- 제 25 항의 폴리뉴클레오타이드(들) 또는 상기 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- STEAP-1에 결합하는 항체의 생산 방법으로서,
a) 제1항의 항체를 암호화하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, 및
b) 임의적으로 상기 항체를 회수하는 단계
를 포함하는 방법. - 제 28 항에 따른 방법에 의해 생산된, STEAP-1에 결합하는 항체.
- 제 1 항 내지 제 24 항 및 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이중특이성 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
- 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
약제로서 사용하기 위한 항체. - 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
질병의 치료에 사용하기 위한 항체. - 제 32 항에 있어서,
질병이 암인 항체. - 제 1 항 내지 제 6 항 및 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
질병의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 항체. - 제 34 항에 있어서,
질병이 암인 항체. - 제 7 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
약제로서 사용하기 위한 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 7 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
질병의 치료에 사용하기 위한 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 37 항에 있어서,
질병이 암인 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 7 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
질병의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 이중특이성 항원 결합 분자. - 제 39 항에 있어서,
질병이 암인 이중특이성 항원 결합 분자.
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