JP7326584B2 - 抗ｈｌａ－ｇ抗体及びその使用 - Google Patents

抗ｈｌａ－ｇ抗体及びその使用 Download PDF

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Description

本発明は、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体、その調製、製剤及びその使用方法に関する。
ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）としても知られるヒト主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ、６は、ヒトにおいてＨＬＡ－Ｇ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ非古典的クラスＩ重鎖パラログに属する。このクラスＩ分子は、重鎖と軽鎖からなるヘテロ二量体（ベータ－２ミクログロブリン）である。重鎖は膜に固定されているが、排出／分泌される場合もある。
重鎖は、３つのドメイン：アルファ１、アルファ２及びアルファ３からなる。アルファ１及びアルファ２ドメインは、２つのアルファヘリックスが隣接するペプチド結合溝を形成する。小さなペプチド（およそ９－ｍｅｒ）は、他のＭＨＣ Ｉタンパク質と同様にこの溝に結合することができる。
第２の鎖は、他のＭＨＣ Ｉタンパク質と同様に重鎖に結合するベータ２ミクログロブリンである。
ＨＬＡ－Ｇについては、７つのアイソフォーム、３つの分泌型及び４つの膜結合型が存在する（図１に概略的に示される）。
ＨＬＡ－Ｇは、機能的に活性な複合オリゴマー構造物（Ｋｕｒｏｋｉ，Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２００７）１７２７－１７２９）を形成することができる。ジスルフィド結合二量体が、２つのＨＬＡ－Ｇ分子のＣｙｓ４２の間に形成される。（Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１（２００６）１０４３９－１０４４７。三量体及び四量体の複合体は、例えば、Ｋｕｒｏｋｉ，Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２００７）１７２７－１７２９，Ａｌｌａｎ Ｄ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２６８（２００２）４３－５０ ａｎｄ Ｔ Ｇｏｎｅｎ－Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７１（２００３）１３４３－１３５１）にも記載されている。
ＨＬＡ－Ｇは、胎盤の栄養膜細胞層上に主に発現される。いくつかの腫瘍（膵臓、乳房、皮膚、結腸直腸、胃及び卵巣を含む）はＨＬＡ－Ｇを発現する（Ｌｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２１（２０１５）７８２－７９１；Ａｍｉｏｔ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６８（２０１１）４１７－４３１）。発現はまた、炎症性疾患、ＧｖＨＤ及びがん等の病的症状に関連することが報告されている。ＨＬＡ－Ｇの発現は、がんの予後不良に関連することが報告されている。腫瘍細胞は、ＨＬＡ－Ｇ発現を介して免疫寛容／抑制を誘導することによって宿主免疫監視から逃れる。
ＨＬＡ－Ｇは、他のＭＨＣ Ｉ分子と高い相同性（９８％超）を共有するため、他のＭＨＣ Ｉ分子に対する交差反応性のない真にＨＬＡ－Ｇ特異的抗体を生成することは困難である。
ＨＬＡ－Ｇと異なる様式で相互作用する特定の抗体が以前に記載された：組織抗原、５５（２０００）５１０－５１８は、モノクローナル抗体、例えば８７Ｇ及びＭＥＭ－Ｇ／９に関する；Ｎｅｏｐｌａｓｍａ ５０（２００３）３３１－３３８は、インタクトＨＬＡ－Ｇオリゴマー複合体（例えば、８７Ｇ及びＭＥＭ－Ｇ９）並びにＨＬＡ－Ｇを含まない重鎖（例えば、４Ｈ８４、ＭＥＭ－Ｇ／１及びＭＥＭ－Ｇ／２）の両方を認識する特定のモノクローナル抗体に関する；Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６４（２００３）３１５－３２６は、ＨＬＡ－Ｇ発現ＪＥＧ３腫瘍細胞（例えば、ネイティブＨＬＡ－Ｇ１分子と排他的に反応するＭＥＭ－Ｇ／０９及び－Ｇ／１３）に対して試験したいくつかの抗体に関する。ＭＥＭ－Ｇ／０１は全てのアイソフォームの変性ＨＬＡ－Ｇ重鎖を認識する（４Ｈ８４ ｍＡｂと同様）が、ＭＥＭ－Ｇ／０４は選択的に変性したＨＬＡ－Ｇ１、－Ｇ２及び－Ｇ５アイソフォームを認識し、Ｗｉｅｎｄｌ ｅｔ ａｌ Ｂｒａｉｎ ２００３ １７６－８５は、例えば８７Ｇ、４Ｈ８４、ＭＥＭ－Ｇ／９等の異なるモノクローナルＨＬＡ－Ｇ抗体に関する。
上記の刊行物は、ヒトＨＬＡ－Ｇ又はヒトＨＬＡ－Ｇ－β２Ｍ ＭＨＣ複合体に結合する抗体を報告している。しかしながら、ＨＬＡファミリーの高い多型性及び高い相同性のために、抗体の大部分は、真に特異的なＨＬＡ－Ｇ結合特性を欠き、多くの場合、他のＨＬＡファミリーメンバーとも結合又は交差反応する（β２ＭとのＭＨＣ複合体として、又はそのβ２Ｍを含まない形態で）か、又は単にＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ複合体のその受容体ＩＬＴ２及び／又はＩＬＴ４への結合を阻害しない（非アンタゴニスト抗体とみなされる）。
国際公開第２０１９／２０２０４０号は、抗体ＨＬＡ－Ｇ－００９０を含むＨＬＡ－Ｇ抗体に関する。国際公開第２０１９／２０２０４１号は、抗体ＨＬＡ－Ｇ－００９０を含む多重特異性ＨＬＡ－Ｇ抗体に関する。
本明細書中に記載される発明は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗体であって、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、を含む抗体を提供する。
本発明の一実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗体であって、
Ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
Ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、抗体である。
本発明の一実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗体であって、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体である。
本発明の一実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗体であって、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体である。
そのような抗体は、他の種からのＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ ＭＨＣ Ｉ複合体に対する交差反応性を伴わずに、それらの結合特性、ＨＬＡ－Ｇに対するそれらの高い特異性等の非常に価値のある特性を有する。それらは、細胞上のＨＬＡ－Ｇに結合し、これらの細胞上に発現されたＨＬＡ－ＧへのＩＬＴ２及び／又はＩＬＴ４の結合を阻害することができる。それらは、ＨＬＡ－Ｇ抗体ＨＬＡ－Ｇ－００９０から生成されている。
国際公開第２０１９／２０２０４０号に記載されているＨＬＡ－Ｇ抗体ＨＬＡ－Ｇ－００９０は、ＣＤＲの１つ（軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸３１、３２及び３３にＮＳＳモチーフを含むＣＤＲ－Ｌ１）にグリコシル化部位を含むため、その結合特性は、潜在的な開発可能性の責任を構成するＮ－グリコシル化によって影響を受ける。
ＨＬＡ－Ｇ－００９０の可変領域の相同性モデルは、軽鎖（ＬＣ）位置３１～３３が非常に溶媒接触性であることを示した。さらに、Ｎ３１及びＳ３２の側鎖は、ＣＤＲ－Ｈ３の方向に内側を指すと予測され、それらは抗体パラトープの一部である可能性が高い。実際、いくつかの公開されている抗体－抗原Ｘ線複合体構造物は、これらの残基が抗原との化学的相互作用を受けていることを実証している。したがって、ＬＣ位置３１～３３に変異を導入することによって抗体の結合親和性が悪化するリスクが高かった。したがって、ＬＣ位置３１、３２、及び３３に変異を有する抗体ＨＬＡ－Ｇ－００９０の様々な変異体を設計したが、それらからほとんどの変異体は結合特性又は発現性を悪化させた。驚くべきことに、グリコシル化部位が除去されたＨＬＡＧ－００９０のこれらの様々な変異体の中で、２つの変異体ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ及びＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ａのみが、ＬＣのＣＤＲ－Ｌ１でＮ－グリコシル化をもはや示さない（したがって、Ｆａｂグリコシル化を検出することができなかった）が、更に改善された結合特性、良好な発現性及び安定性を示すことが見出された。最近承認された全ての医薬抗体産物が哺乳動物細胞、特にＣＨＯ細胞（例えば、Ｗａｌｓｈ Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２０１８）１１３６－１１４５を参照されたい）で産生されるため、結合領域にグリコシル化部位を有しない抗体（ＶＨ及びＶＬ、特にＣＤＲ）を提供することは、これらの抗体を、グリコシル化によって結合特性を（少なくとも部分的に）損なうリスクなしに哺乳動物発現系での産生に容易に使用することができるため、有益な利点となる。
更なる実施形態では、本発明のＨＬＡ－Ｇ抗体はヒト起源のＦｃドメインを含む。一実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧアイソタイプのものであり、好ましい一実施形態ではＩｇＧ１アイソタイプのものである。
更なる実施形態では、本発明のＨＬＡ－Ｇ抗体は、二重特異性抗体、特にヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特性抗体であって、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及びヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分を含む抗体である。
一実施形態では、本発明のＨＬＡ－Ｇ抗体は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及びヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分を含み、
ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、を含み、
ヒトＣＤ３に結合するＴ細胞活性化抗原に結合する第２の抗原結合部分は、
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、を含む二重特異性抗体である。
本発明の一実施形態は、そのような二重特異性抗体であり、
第１の抗原結合部分は、
Ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
Ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
第２の抗原結合部分は、
Ｃ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
Ｄ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
Ｅ）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
本発明の一実施形態は、そのような二重特異性抗体であり、
第１の抗原結合部分は、
配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
第２の抗原結合部分は、
配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
本発明の一実施形態は、そのような二重特異性抗体であり、
第１の抗原結合部分は、
配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
第２の抗原結合部分は、
配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
本発明の一実施形態は、そのような二重特異性抗体であり、
第１の抗原結合部分は、
配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
第２の抗原結合部分は、
配列番号７４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合するそのような二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇ抗体の特性に加えて、ＨＬＡ－Ｇ発現細胞上のＴ細胞による抗体媒介ＩＦＮガンマ分泌の誘導、ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の存在下でのＴ細胞活性化、ＨＬＡ－Ｇ発現細胞上のＴ細胞媒介腫瘍細胞殺傷の誘導、及び異なるがん異種移植マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性、更には腫瘍退縮のような更に有益な特性を示す。
本発明は、本明細書に記載の抗体又は二重特異性抗体をコードする単離された核酸を提供する。
本発明は、そのような核酸を含む宿主細胞を提供する。
本発明は、抗体が産生されるように宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法を提供する。
本発明は、宿主細胞から抗体を回収することを更に含む、抗体を産生するそのような方法を提供する。
本発明は、宿主細胞が真核生物であるそのような宿主細胞によって産生される抗体を提供する。
本発明は、本明細書に記載の抗体及び薬学的に許容され得る担体を含む医薬製剤を提供する。
本発明は、医薬として使用するための本明細書に記載の抗体を提供する。
本発明は、がんの治療に使用するための本明細書に記載の抗体を提供する。
本発明は、医薬の製造における本明細書に記載の抗体の使用を提供する。一実施形態では、医薬は、がんの治療のためのものである。
本発明は、がんを有する個体を治療する方法であって、有効量の本明細書に記載の抗体を個体に投与することを含む、方法を提供する。
ＨＬＡ－Ｇの異なるアイソフォーム。 図２Ａ：β２Ｍに関連するＨＬＡ－Ｇ分子の概略図。図２Ｂ：特定の受容体に関連するＨＬＡ－Ｇ分子の構造：所与の受容体（ＩＬＴ４及びＫＩＲ２ＤＬ１等）と複合体を形成するＨＬＡ－Ｇ構造物。ＩＬＴ４構造物（ＰＤＢコード：２ＤＹＰ）。ＫＩＲ２ＤＬ１構造物は、ＰＤＢコード１ＩＭ９（ＫＩＲ２ＤＬ１：ＨＬＡ－Ｃｗ４複合体構造物）から得られ、ＨＬＡ－Ｃｗ４及びＨＬＡ－Ｇ構造物の重ね合わせによってＨＬＡ－Ｇ上に配置された。受容体をリボン表示で示し、ＨＬＡ－Ｇを分子表面表示で示す。他のＨＬＡパラログにおいて特有であるか又は保存されているＨＬＡ－Ｇ残基は、それぞれ白色及び灰色に着色されている。特有の表面残基を、キメラカウンター抗原におけるＨＬＡコンセンサス配列によって置き換えた。 概略的抗体－抗原結合アッセイの原理－ＨＬＡ－Ｇへの結合に関するＨＬＡ－Ｇ抗体の相対活性濃度（ＲＡＣ） 図４Ａ：ＨＬＡ－Ｇ－００９０のＮ－グリコシル化の質量スペクトルはＦａｂ－グリコシル化を示す。図４Ｂ：ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ及びＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３ＡのＮ－グリコシル化の質量スペクトル：Ｆａｂ－グリコシル化は検出不可能。 ＳＫＯＶ３細胞（ＨＬＡ－Ｇ発現なし、ＪＥＧ３細胞（ＨＬＡ－Ｇを発現）及びＳＫＯＶ３－ＨＬＡ－Ｇ細胞（ＨＬＡ－ＧでトランスフェクトされたＳＫＯＶ３細胞）上の抗ＨＬＡ－Ｇ抗体ＨＬＡ－Ｇ－００９０、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ及びＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ａ（２μｇ／ｍｌ）についての例示的ＦＡＣＳ染色。 ＪＥＧ３腫瘍細胞上に天然に発現されたＨＬＡ－Ｇに対する組換え可溶性ＩＬＴ２（ＩＬＴ２ Ｆｃドメイン融合物）の相互作用及び結合を改変／阻害するＨＬＡ－Ｇ抗体ＨＬＡ－Ｇ－００９０、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ及びＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ａの能力。ＪＥＧ３細胞を、ＪＥＧ３細胞へのＩＬＴ２結合が阻害／遮断されるように、ＨＬＡ－Ｇ抗体でプレインキュベート／前処理する。対照を、ＨＬＡ－Ｇ抗体前処理なしのＪＥＧ３細胞（ＩＬＴ２－Ｆｃのみ）及びアイソタイプ抗体を用いて実施した。 抗体Ｐ１ＡＦ７９７７、Ｐ１ＡＦ７９７８及びＰ１ＡＦ７９７９によるＴ細胞上に発現されたＣＤ３への二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の結合。 二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体Ｐ１ＡＦ７９７７、Ｐ１ＡＦ７９７８及びＰ１ＡＦ７９７９は、ＨＬＡ－ＧでトランスフェクトされたＪＥＧ３細胞及びＳＫＯＶ３細胞への結合を示した。 Ｔ細胞による、抗体Ｐ１ＡＦ７９７７、Ｐ１ＡＦ７９７８及びＰ１ＡＦ７９７９による、二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体媒介／誘導ＩＦＮガンマ分泌。 二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体Ｐ１ＡＦ７９７７、Ｐ１ＡＦ７９７８及びＰ１ＡＦ７９７９は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害／腫瘍細胞殺傷を誘導した。 腫瘍退縮をもたらす、組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）でトランスフェクトしたＳＫＯＶ３ヒト卵巣癌腫を持つヒト化ＮＳＧマウスにおける抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体Ｐ１ＡＦ７９７７のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果。 ヒト乳がんＰＤＸ腫瘍（ＢＣ００４）を有するヒト化ＮＳＧマウスにおける抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体Ｐ１ＡＦ７９７７を用いた用量応答研究。異なる用量で試験したマウスにおいて腫瘍退縮が観察されるまでの強い腫瘍成長阻害。 本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的な構成。（Ａ、Ｄ）「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図。（Ｂ、Ｅ）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分とＦａｂ成分の順序が異なる（「反転型」）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｃ、Ｆ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｇ、Ｋ）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分とＦａｂ成分の順序が異なる（「反転型」）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｈ、Ｌ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｉ、Ｍ）２個のＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図。（Ｊ、Ｎ）黒点：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意の修飾。＋＋、－－：ＣＨ１及びＣＬドメインにおいて任意に導入される反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含むものとして示されるが、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない実施形態では、代替的にＣＨ１ドメインとＣＬドメインの交換を含む。 ＳＫＯＶ３ ＨＬＡＧ細胞の存在下での二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体Ｐ１ＡＦ７９７７（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｐ０３５）によるＴ細胞活性化の誘導。 非ストレス条件下、４０℃、ｐＨ６で１４日後、又は３７℃、ｐＨ７．４で１４日後にＳＰＲで測定した、元々の最適化されたＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＣＤ３ｏｐｔ（＝Ｐ０３５－０９３（Ｐ０３５））の組換えＣＤ３に対する相対結合活性（ＩｇＧフォーマット）。 フローサイトメトリーで測定した、元々のＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＣＤ３ｏｐｔ（＝Ｐ０３５－０９３（Ｐ０３５））のＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に対する結合（ＩｇＧフォーマット）。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に対する抗体結合は、蛍光標識された抗ヒトＦｃ特異的二次抗体を用いて検出された。 実施例８で使用したＣＤ３活性化アッセイの概略図。 元々の最適化されたＣＤ３バインダ、ＣＤ３ｏｒｉｇ及びＣＤ３ｏｐｔ（＝Ｐ０３５－０９３（Ｐ０３５））によるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ活性化（ＩｇＧフォーマット）。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞を、ＣＤ３ｏｒｉｇ若しくはＣＤ３ｏｐｔ（＝Ｐ０３５－０９３（Ｐ０３５））ＩｇＧ ＰＧＬＡＬＡ、又は陰性対照としてのＣＤ３ｏｐｔ ＩｇＧ ｗｔの存在下で、抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ（ＣＨＯ－ＰＧＬＡＬＡ）細胞と共インキュベートした。ＣＤ３活性化を、２４時間後に発光を測定することで定量化した。
本明細書で使用される場合、「ＨＬＡ－Ｇ」、「ヒトＨＬＡ－Ｇ」、「ＨＬＡＧ」という用語は、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）（例示的な配列番号３５）としても知られるＨＬＡ－Ｇヒト主要組織適合遺伝子複合体、クラスＩ、Ｇを指す。典型的には、ＨＬＡ－Ｇは、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ又はβ２ｍ）と共にＭＨＣクラスＩ複合体を形成する。一実施形態では、ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇとβ２ミクログロブリンとのＭＨＣクラスＩ複合体を指す。好ましい一実施形態では、ＨＬＡ－Ｇは、ＨＬＡ－Ｇ１としても知られるＨＬＡ－Ｇ及びβ２ミクログロブリンの細胞表面結合ＭＨＣクラスＩ複合体を指す（この明細書の図１、及び、例えば、Ｂｌａｓｃｈｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，１１（２００５）６９９－７１０、とりわけ、図１を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する」、「ヒトＨＬＡ－Ｇに特異的に結合する」、「ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する」又は「抗ＨＬＡ－Ｇ」抗体（単一特異性、多重特異性又は二重特異性のいずれか）又は抗原結合部分は、５．０×１０－８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一実施形態では１．０×１０－９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一実施形態では５．０×１０－８ｍｏｌ／ｌ～１．０×１０－１３ｍｏｌ／ｌのＫＤ値の結合親和性で、ヒトＨＬＡ－Ｇ抗原又はその細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合する抗体／抗原結合部分を指す。一実施形態では、抗体は、配列番号３９を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する）
結合親和性は、例えばＨＬＡ－Ｇ細胞外ドメイン（例えば、その天然に存在する３次元構造）を含む構築物を使用して、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ウプサラ、スウェーデン）等の標準的な結合アッセイで決定される。一実施形態では、結合親和性は、配列番号３９を含むＭＨＣクラスＩ複合体を含む例示的な可溶性ＨＬＡ－Ｇを使用する標準的な結合アッセイで決定される。
ＨＬＡ－Ｇは、通常のＭＨＣ Ｉフォールドを有し、２本の鎖からなる。鎖１は、アルファ１、アルファ２及びアルファ３の３つのドメインからなる。アルファ１及びアルファ２ドメインは、２つのアルファヘリックスが隣接するペプチド結合溝を形成する。小さなペプチド（およそ９ｍｅｒ）は、他のＭＨＣＩタンパク質と同様にこの溝に結合することができる。鎖２は、様々な他のＭＨＣＩタンパク質と共有されるベータ２ミクログロブリン（β２Ｍ）である。
ＨＬＡ－Ｇは、機能的に活性な複合オリゴマー構造物（Ｋｕｒｏｋｉ，Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２００７）１７２７－１７２９）を形成することができる。ジスルフィド結合二量体が、２つのＨＬＡ－Ｇ分子のＣｙｓ４２の間に形成される。（Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１（２００６）１０４３９－１０４４７。三量体及び四量体の複合体は、例えば、Ｋｕｒｏｋｉ，Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２００７）１７２７－１７２９，Ａｌｌａｎ Ｄ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２６８（２００２）４３－５０ ａｎｄ Ｔ Ｇｏｎｅｎ－Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７１（２００３）１３４３－１３５１）にも記載されている。ＨＬＡ－Ｇは、他のＭＨＣクラスＩ分子のほとんどとは異なり、いくつかの遊離システイン残基を有する。Ｂｏｙｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９９：１６１８０（２００２）は、組換え可溶性型ＨＬＡ－Ｇ５が分子間Ｃｙｓ４２－Ｃｙｓ４２ジスルフィド結合を有するジスルフィド結合二量体を形成し得ることを報告した。さらに、膜結合型ＨＬＡ－Ｇ１は、ＨＬＡ－Ｇを内因的に発現するＪＥＧ３細胞株の細胞表面上にジスルフィド結合二量体を形成することもできる。ＨＬＡ－Ｇ１及びＨＬＡ－Ｇ５のジスルフィド結合二量体形態は、栄養膜細胞の細胞表面にも見られた（Ａｐｐｓ，Ｒ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，６８：３５９（２００６））。
ＨＬＡ－Ｇは、胎盤の栄養膜細胞層上に主に発現される。いくつかの腫瘍（膵臓、乳房、皮膚、結腸直腸、胃及び卵巣を含む）はＨＬＡ－Ｇを発現する（Ｌｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２１（２０１５）７８２－７９１；Ａｍｉｏｔ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６８（２０１１）４１７－４３１）。発現はまた、炎症性疾患、ＧｖＨＤ及びがん等の病的症状に関連することが報告されている。ＨＬＡ－Ｇの発現は、がんの予後不良に関連することが報告されている。腫瘍細胞は、ＨＬＡ－Ｇ発現を介して免疫寛容／抑制を誘導することによって宿主免疫監視から逃れる。
ＨＬＡ－Ｇについては、７つのアイソフォーム、３つの分泌型及び４つの膜結合型が存在する（図１に概略的に示される）。ＨＬＡ－Ｇの最も重要な機能的アイソフォームには、ｂ２－ミクログロブリン（β２Ｍ）関連ＨＬＡ－Ｇ１及びＨＬＡ－Ｇ５が含まれる。しかしながら、これらのアイソフォームの免疫寛容原性効果は異なり、リガンドの形態（単量体、二量体）及びリガンド－受容体相互作用の親和性に依存する。
ＨＬＡ－Ｇタンパク質は、標準的な分子生物学技術を用いて産生され得る。ＨＬＡ－Ｇアイソフォームの核酸配列は、当技術分野で公知である。例えば、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＡＹ３５９８１８を参照されたい。
ＨＬＡ－Ｇ異性体型は、ＩＬＴ、特にＩＬＴ２、ＩＬＴ４、又はそれらの組み合わせを介したシグナル伝達を促進する。
ＩＬＴ：ＩＬＴは、免疫細胞活性化の調節に関与し、免疫細胞の機能を制御する活性化及び阻害性受容体のＩｇ型を表す（Ｂｏｒｇｅｓ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２４４：１２３－１３６（１９９９））。ＩＬＴは３つのグループに分類される：（ｉ）阻害性、細胞質免疫受容体チロシン依存性阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有し、阻害性シグナル（ＩＬＴ２、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５及びＬＩＲ８）を伝達するもの；（ｉｉ）活性化、短い細胞質尾部及び荷電アミノ酸残基を膜貫通ドメイン（ＩＬＴ１、ＩＬＴ７、ＩＬＴ８及びＬＩＲ６アルファ）に含有し、Ｆｃ受容体の関連する共通ガンマ鎖の細胞質免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を介して活性化シグナルを送達するもの；並びに（ｉｉｉ）膜貫通ドメインを欠く可溶性分子ＩＬＴ６。いくつかの最近の研究は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＩＬＴの免疫調節的役割を強調している。最も特徴的な免疫阻害性受容体であるＩＬＴ２、ＩＬＴ３、及びＩＬＴ４受容体は、単球、Ｂ細胞、樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、並びにＮＫ細胞及びＴ細胞のサブセットを含む広範囲の免疫細胞上に発現される。ＩＬＴ２はＴ細胞サブセット上で発現され、ライゲーション時にこれらの細胞の活性化及び増殖を阻害することが示されている（Ｃｏｌｏｎｎａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１１，６６：２５１４－２５２１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１６５：３７４２－３７５５）。ＩＬＴ３及びＩＬＴ４は、未成熟ＤＣをＩＬ－１０、ビタミンＤ３又はサプレッサーＣＤ８ Ｔ細胞を含む公知の免疫抑制因子に曝露することによって上方制御される（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３：２３７－２４３（２００２））。ＤＣ上のＩＬＴの発現は、炎症性刺激、サイトカイン、及び成長因子によって厳密に制御され、ＤＣ活性化後に下方制御される（Ｊｕ，Ｘ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３３１：１５９－１６４（２００４））。ＩＬＴ２及びＩＬＴ４受容体の発現は、ヒストンアセチル化によって高度に制御され、細胞の骨髄系においてのみ厳密に制御された遺伝子発現に寄与する（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｈ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７１：６６１１－６６２０（２００３））。
阻害性受容体ＩＬＴ２及びＩＬＴ４の関与は、単球のサイトカイン及びケモカインの分泌／放出プロファイルを変化させ、Ｆｃ受容体シグナル伝達を阻害することができる（Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ，６６：３７５－３８１（１９９９））。ＤＣ上のＩＬＴ３の役割及び機能は、Ｓｕｃｉｕ－Ｆｏｃａのグループによって正確に説明されている（Ｓｕｃｉｕ－Ｆｏｃａ，Ｎ．，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，５：７－１１（２００５））。ＩＬＴ３のリガンドは不明であるが、ＩＬＴ４はＨＬＡクラスＩ分子の第３のドメイン（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ及びＨＬＡ－Ｇ）に結合し、ＭＨＣクラスＩ結合についてＣＤ８と競合することが知られている（Ｓｈｉｒｏｉｓｈｉ，Ｍ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１００：８８５６－８８６１（２００３））。いくつかの阻害性ＩＬＴ受容体の優先的リガンドはＨＬＡ－Ｇである。ＨＬＡ－Ｇは、母体－胎児寛容において、及び腫瘍細胞が免疫認識及び破壊から逃れる機構において潜在的な役割を果たす（Ｈｕｎｔ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆａｓｅｂ Ｊ，１９：６８１－６９３（２００５））。ＨＬＡ－Ｇ－ＩＬＴ相互作用によるＤＣ機能の調節は、ＤＣの生物学における重要な経路である可能性が最も高い。ＩＬＴ２及びＩＬＴ４受容体を高度に発現するヒト単球由来ＤＣは、ＨＬＡ－Ｇで治療し、同種異系Ｔ細胞で刺激した場合、Ｔ細胞アネルギーを誘導する可能性を有する安定な寛容原性様表現型（ＣＤ８０ｌｏｗ、ＣＤ８６ｌｏｗ、ＨＬＡ－ＤＲｌｏｗ）を依然として維持することが決定されている（Ｒｉｓｔｉｃｈ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３５：１１３３－１１４２（２００５））。さらに、ＩＬＴ２及びＩＬＴ４受容体を高度に発現するＤＣとのＨＬＡ－Ｇ相互作用は、ＭＨＣクラスＩＩ提示経路に関与するいくつかの遺伝子の下方制御をもたらした。プロフェッショナルＡＰＣによって豊富に発現されるリソソームチオールレダクターゼであるＩＦＮアンマ誘導性リソソームチオールレダクターゼ（ＧＩＬＴ）は、ＨＬＡ－Ｇ修飾ＤＣで大幅に減少した。抗原を選択するためのｉｎ ｖｉｖｏ Ｔ細胞応答が標的遺伝子破壊後にＧＩＬＴを欠く動物において減少したことから、プライミングされたＣＤ４＋Ｔ細胞のレパートリは、ＧＩＬＴのＤＣ発現によって影響され得る（Ｍａｒｉｅ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：１３６１－１３６５（２００１））。ＤＣ上のＨＬＡ－Ｇ／ＩＬＴ相互作用は、ＭＨＣクラスＩＩ分子のアッセンブリ及び細胞表面への輸送を妨害し、その結果、構造的に異常なＭＨＣクラスＩＩ分子の提示又は発現の効率が低下する可能性がある。ＨＬＡ－Ｇは、ＩＬＴ阻害性受容体を高度に発現するヒト単球由来ＤＣ上の不変鎖（ＣＤ７４）、ＨＬＡ－ＤＭＡ、及びＨＬＡ－ＤＭＢ遺伝子の転写を著しく減少させることが決定された（Ｒｉｓｔｉｃｈ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ；Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３５：１１３３－１１４２（２００５））。
ＫＩＲ２ＤＬ４がＨＬＡ－Ｇを発現する細胞に結合することから、ＨＬＡ－Ｇの別の受容体はＫＩＲ２ＤＬ４である（米国特許出願公開第２００３２３２０５１号；Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８（１９９８）１９８０；Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｅ．Ｏ．Ｌｏｎｇ．［好評された正誤表がＪ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９１（２０００）２０２７に見られる］ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８９（１９９９）１０９３；Ｐｏｎｔｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９６（１９９９）５６７４）。ＫＩＲ２ＤＬ４（２ＤＬ４とも呼ばれる）は、活性化受容体及び阻害性受容体の両方と構造的特徴を共有するＫＩＲファミリーメンバー（ＣＤ１５８ｄとも呼ばれる）である（Ｓｅｌｖａｋｕｍａｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４８（１９９６）２８５）．。２ＤＬ４は、阻害機能を示唆する細胞質ＩＴＩＭと、ＫＩＲの活性化に典型的な特徴である膜貫通領域の正に荷電したアミノ酸とを有する。他のクローン分布ＫＩＲとは異なり、２ＤＬ４は全てのＮＫ細胞によって転写される（Ｖａｌｉａｎｔｅ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７（１９９７）７３９；Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８（１９９８）１９８０；Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｅ．Ｏ．Ｌｏｎｇ．［公表された正誤表がＪ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９１（２０００）２０２７に見られる］ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８９（１９９９）１０９３）。
ＨＬＡ－Ｇはまた、細胞傷害性Ｔ細胞上のＣＤ８（Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４（１９９１），７３７－７４０）と相互作用し、活性化ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞においてＣＤ９５媒介性アポトーシスを誘導することが示されている（Ｆｏｕｒｎｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１６４（２０００），６１００－６１０４）。細胞傷害性Ｔ細胞を排除するこの機構は、妊娠、炎症性疾患及びがんにおける免疫回避及び寛容の誘導の機構の１つに報告されている（Ａｍｏｄｉｏ Ｇ．ｅｔ ａｌ，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，８４（２０１４），２５５－２６３）。
本明細書で使用される場合、改変ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と「交差反応しない」又は「（特異的に）結合しない」抗ＨＬＡ－Ｇ抗体（単一特異性、多重特異性又は二重特異性のいずれか）又は抗原結合部分であって、ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸がＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられており、複合体が配列番号４０を含み、マウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体が配列番号４１を含み、ラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体が配列番号４３を含み、ヒトＨＬＡ－Ａ２ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体が配列番号３５及び配列番号３３を含む、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体（単一特異性、多重特異性又は二重特異性のいずれか）又は抗原結合部分は、これらの対抗原のいずれにも実質的に結合しない抗ＨＬＡ－Ｇ抗体（単一特異性、多重特異性又は二重特異性のいずれか）又は抗原結合部分を指す。一実施形態では、改変ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と「交差反応しない」又は「特異的に結合しない」抗ＨＬＡ－Ｇ抗体（単一特異性、多重特異性又は二重特異性のいずれか）又は抗原結合部分であって、ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸がＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられており、複合体が配列番号４０を含み、マウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体が配列番号４１を含み、ラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体が配列番号４３を含み、及び／又はヒトＨＬＡ－Ａ２ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体が配列番号３５及び配列番号３３を含む、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体（単一特異性、多重特異性又は二重特異性のいずれか）又は抗原結合部分は、例えば表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば実施例２に記載される）で有意な結合／相互作用を示さない抗ＨＬＡ－Ｇ抗体（単一特異性、多重特異性又は二重特異性のいずれか）又は抗原結合部分を指す。結合結合結合／相互作用は、標準的な結合アッセイ、例えばそれぞれの抗原：改変ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体を用いて表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）により決定され、ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸はＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられており、複合体は配列番号４０を含み、マウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体は配列番号４１を含み、ラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体は配列番号４３を含み、及び／又はヒトＨＬＡ－Ａ２ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体は配列番号３５及び配列番号３３を含む。アッセイ設定並びに抗原の構築／調製は実施例に記載されている。
「ＪＥＧ－３細胞上のＨＬＡ－ＧへのＩＬＴ２結合を阻害する（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６）」という用語は、例えば実施例５に記載されるアッセイにおける（組換え）ＩＬＴ２の結合相互作用の阻害を指す。
本明細書で使用される「活性化Ｔ細胞抗原」は、抗体との相互作用によりＴ細胞の活性化を誘導することのできる、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面上に発現される抗原決定基を指す。具体的には、抗体の活性化Ｔ細胞抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達のカスケードをトリガーすることによりＴ細胞活性化を誘導することができる。特定の実施形態では、活性化Ｔ細胞抗原はＣＤ３、特にＣＤ３のイプシロンサブユニット（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０７７６６（バージョン１８９）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号８８；又はカニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号１０８を参照されたい）である。
「ＣＤ３」は、別途明記しない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意のネイティブＣＤ３を指す。ＣＤ３は、例示的な活性化Ｔ細胞抗原である。「ＣＤ３」という用語は、「全長」の、プロセシングされていないＣＤ３、及び細胞内でのプロセシングによりもたらされる任意の形態のＣＤ３を包含する。この用語は、ＣＤ３の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施形態では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｐ０７７６６（バージョン１８９）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００７２４．１に示されている。配列番号８８も参照されたい。カニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］ＣＤ３εのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１に示されている。配列番号８９も参照されたい。
本明細書で使用される場合、「ヒトＣＤ３に結合する」、「ヒトＣＤ３に特異的に結合する」、「ヒトＣＤ３に結合する」又は「抗ＣＤ３」抗体（単一特異性、多重特異性又は二重特異性のいずれか）又は抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴アッセイで有意な結合／相互作用を示す、ヒトＣＤ３抗原又はその細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合する抗抗体（単一特異性、多重特異性又は二重特異性のいずれか）又は抗原結合部分を指す。一実施形態ではＫＤ値が５．０×１０－８ｍｏｌ／ｌ以下の結合親和性を有し、一実施形態ではＫＤ値が１．０×１０－９ｍｏｌ／ｌ以下であり、一実施形態ではＫＤ値が５．０×１０－８ｍｏｌ／ｌ～１．０×１０－－１３ｍｏｌ／ｌである。一実施形態では、抗体は、配列番号８８を含むＣＤ３に結合する。
結合親和性は、例えばＨＬＡ－Ｇ細胞外ドメイン（例えば、その天然に存在する３次元構造）を含む構築物を使用して、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ウプサラ、スウェーデン）等の標準的な結合アッセイで決定される。一実施形態では、結合親和性は、配列番号８８を含む例示的ＣＤ３を使用する標準的な結合アッセイで決定される。
したがって、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合し、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及びヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分を含む多重特異性又は二重特異性は、本明細書に記載のヒトＨＬＡ－Ｇに対する（第１の）抗原結合部分と結合し、本明細書に記載のヒトＣＤ３に対する別の（第２の）抗原結合部分と結合する抗体を指す。
本明細書で使用する「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクタ分子の放出、細胞傷害性活性、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の１つ以上の細胞応答を指す。Ｔ細胞活性化を測定するために適したアッセイは、当技術分野で既知であり、本明細書に記載されている。
本明細書の目的において「アクセプターヒトフレームワーク」とは、以下に定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸変更の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して、配列が同一である。
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定されるものではないが、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた、様々な抗体構造を包含する。
「抗体断片」とは、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含む、インタクト抗体以外の分子である。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成した多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
「二重特異性」との用語は、抗体が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗体は、２つの抗原結合部位又は部分を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、２つの抗原決定基（特に、２つの別個の細胞で発現する２つの抗原決定基）に同時に結合することができる。
「価数」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体内の特定数の抗原結合部位の存在を示す。この場合、「抗原に対する一価の結合」という用語は、抗体内の抗原に特異的な１つの（及び１つを超えない）抗原結合部位の存在を示す。
本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」及び「抗原結合部分」という用語は交換可能であり、抗原との相互作用を提供する抗体の部位、すなわち１つ以上のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。ネイティブ免疫グロブリン分子は、典型的には、２つの抗原結合部位を含み、Ｆａｂ分子は、典型的には、１つの抗原結合部位を有する。「抗原結合部位」及び「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施形態では、抗原結合部分は、標的部位に、例えば、抗原決定基を有する特定の種類の腫瘍細胞に結合する部分（例えば、第２の抗原結合部分）に指向することができる。別の実施形態では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合体抗原を介してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分は、本明細書に更に定義される抗体及びその断片を含む。特定の抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域と抗体軽鎖可変領域とを含む、抗体の抗原結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、抗原結合部分は、本明細書で更に定義され、当該技術分野で知られているような抗体定常領域を含んでいてもよい。有用な重鎖定常領域は、α、δ、ε、γ又はμの５つのアイソタイプのいずれかを含む。有用な軽鎖定常領域は、κ及びλの２つのアイソタイプのいずれかを含む。好ましい一実施形態では、そのような定常領域はヒト起源のものである。
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」又は「抗原」という用語は、抗原結合部分が結合して抗原結合部分－抗原複合体を形成するポリペプチド高分子上の部位を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に認めることができる。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の供給源又は種に由来する抗体を指し、一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りは、異なる供給源又は種に由来する。
抗体の「クラス」とは、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分けられてもよい。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。好ましい一実施形態では、そのようなサブクラス（アイソタイプ）はヒト起源のものである。好ましい一実施形態では、本発明の抗体はＩｇＧアイソタイプのものであり、別の好ましい実施形態では、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。
一態様では、抗体はヒト起源の定常領域を含む。一態様では、抗体は、ヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含むヒト定常領域、特にＩｇＧアイソタイプ、より詳しくはＩｇＧ１アイソタイプを含む免疫グロブリン分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号４７及び４８（それぞれヒトカッパＣＬドメイン及びラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号４９（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）又は配列番号５０（突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域）に示される。薬剤、例えば薬学的製剤の「有効量」は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために、必要な投与量及び期間で有効な量を指す。
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。該用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域とを含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変動してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシ末端まで伸長するよう定義されている。しかし、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ以上、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後開裂を受けてもよい。したがって、全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞によって産生する抗体は、全長重鎖を含んでいてもよく、又は全長重鎖の開裂した変異体を含んでいてもよい（本明細書で「開裂した変異体重鎖」とも呼ばれる）。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）である場合であってもよい。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｋ４４７）が存在してもよく、又は存在していなくてもよい。Ｆｃドメイン（又は本明細書に定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、特に示されていない場合には、本明細書では、Ｃ末端グリシン－リジンジペプチドを含まずに示される。本発明の一実施形態では、本発明による抗体又は二重特異性抗体含まれる本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。本発明の一実施形態では、本発明による抗体又は二重特異性抗体含まれる本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。本発明の組成物／製剤、例えば本明細書に記載の医薬組成物／製剤は、本発明の抗体又は二重特異性抗体の集団を含む。抗体又は二重特異性抗体の集団は、完全長重鎖を有する分子及び切断された変異体重鎖を有する分子を含み得る。抗体又は二重特異性抗体の集団は、完全長重鎖を有する分子と切断された変異体重鎖を有する分子との混合物からなり得、抗体又は二重特異性抗体の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％が切断された変異体重鎖を有する。本発明の一実施形態では、本発明の抗体又は二重特異性抗体の集合を含む組成物は、更なるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む抗体又は二重特異性抗体を含む。本発明の一実施形態では、本発明の抗体又は二重特異性抗体の集合を含む組成物は、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む抗体又は二重特異性抗体を含む。本発明の一実施形態では、そのような組成物は、本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子、更なるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子、更なるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）を含む本明細書で特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を含む分子で構成される抗体又は二重特異性抗体の集合を含む。本明細書で別途明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１（上も参照されたい）に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。Ｆｃドメインの「サブユニット」は、本明細書で使用される場合、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定した自己会合が可能な、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。好ましい一実施形態では、そのようなＦｃドメインは、ヒト起源、１つの好ましい実施形態ではＩｇＧアイソタイプ、別の好ましい実施形態のＩｇＧ１アイソタイプのものである。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、補体決定領域（ＣＤＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、以下の４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＣＤＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）において次の配列において出現する：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書で、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、又は本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように同義に使用される。
「融合した」が意味するのは、構成要素（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、ペプチド結合によって直接的に又は１つ以上のペプチドリンカーを介してのいずれかにより結合されていることである。
「Ｆａｂ分子」とは、免疫グロブリンの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと、免疫グロブリンの軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬドメイン及びＣＬドメインと、からなるタンパク質を指す。
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも呼ばれる）とは、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメインが交換されている（すなわち、互いに置き換わっている）Ｆａｂ分子を意味し、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（ＶＬ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）から構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＶＨ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）から構成されるペプチド鎖と、を含む。明確性のために、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１を含むペプチド鎖は、本明細書では、（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。逆に、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖は、本明細書では、（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。
これとは対照的に、「従来の」Ｆａｂ分子は、その天然のフォーマットでのＦａｂ分子を意味し、すなわち、重鎖可変ドメイン及び定常ドメインから構成される重鎖（ＶＨ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）と、軽鎖可変ドメイン及び定常ドメインから構成される軽鎖（ＶＬ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）と、を含む。「宿主細胞、」、「宿主細胞株、」及び「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞としては、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び継代の数にかかわらず宿主細胞に由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞と完全に同一の核酸含量でない場合があるが、突然変異を含んでもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか又は選択されるのと同じ機能又は生物活性を有する変異体の子孫は、本発明に含まれる。
「ヒト抗体」とは、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体、又はヒト抗体レパートリ等のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト由来の抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体に対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体に対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、配列が超可変であり、及び／又は構造的に明確なループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触」）を含む抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、抗体は６つのＣＤＲを含み、３つがＶＨ中にあり（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、３つがＶＬ中にある（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、以下が挙げられる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（ＣＤＲ－Ｌ１）、５０～５２（ＣＤＲ－Ｌ２）、９１～９６（ＣＤＲ－Ｌ３）、２６～３２（ＣＤＲ－Ｈ１）、５３～５５（ＣＤＲ－Ｈ２）及び９６～１０１（ＣＤＲ－Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（ＣＤＲ－Ｌ１）、５０－５６（ＣＤＲ－Ｌ２）、８９－９７（ＣＤＲ－Ｌ３）、３１－３５ｂ（ＣＤＲ－Ｈ１）、５０－６５（ＣＤＲ－Ｈ２）、及び９５－１０２（ＣＤＲ－Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（ＣＤＲ－Ｌ１）、４６－５５（ＣＤＲ－Ｌ２）、８９－９６（ＣＤＲ－Ｌ３）、３０－３５ｂ（ＣＤＲ－Ｈ１）、４７－５８（ＣＤＲ－Ｈ２）、及び９３－１０１（ＣＤＲ－Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））；並びに
（ｄ）ＣＤＲアミノ酸残基２４～３４（ＣＤＲ－Ｌ１）、５０～５６（ＣＤＲ－Ｌ２）、８９～９７（ｖＬ３）、３１～３５（ＣＤＲ－Ｈ１）、５０～６３（ＣＤＲ－Ｈ２）及び９５～１０２（ＣＤＲ－Ｈ３）を含む（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の組み合わせ。
別段の示がない限り、可変ドメイン中のＣＤＲ残基及び他の残基（例えばＦＲ残基）は、本明細書ではＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に従ってナンバリングされる。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳類としては、家畜化動物（例えば、牛、羊、猫、犬、馬等）、霊長類（例えば、ヒト、サル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット等）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある特定の実施形態では、個体又は対象は、ヒトである。
「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から分離された抗体である。一実施形態では、抗体は単離された抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフ（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％超又は９９％超の純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８（２００７）７９－８７を参照されたい。
「単離された」核酸は、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離核酸は、元々その核酸分子を含む細胞に含まれているが、その核酸分子が、染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。
「抗ＨＬＡ－Ｇ抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体の重鎖及び軽鎖（又はそれらの断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内のそのような核酸分子（複数可）を含み、そのような核酸分子（複数可）は、宿主細胞内の１つ以上の場所に存在する。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生突然変異を含有するか、又はモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得る変異型抗体は例外であり、そのような変異型は一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない多様な技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。
「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾」は、ホモ二量体を形成するためのＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの同一のポリペプチドとの会合を減少又は防止する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。会合を促進する修飾は、本明細書で使用される場合、特に、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニット）のそれぞれに対し、別個の修飾を含み、修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するように、互いに相補的である。例えば、会合を促進する修飾は、それぞれ立体的又は静電的に望ましい会合を行うように、Ｆｃドメインサブユニットの片方又は両方の構造又は電荷を変えてもよい。したがって、（ヘテロ）二量化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、それぞれのサブユニットに融合する更なる構成要素（例えば、抗原結合部分）が同じではないという意味で、同一ではない場合がある。いくつかの実施形態では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的には、アミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、別個のアミノ酸変異、特定的にはアミノ酸置換を含む。Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進するそのような修飾は、多重特異性抗体又は二重特異性抗体のヘテロ二量体化において重要な役割を果たす（例えば、以下のＡ．２の例示的な多重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体も参照されたい）。
「ネイティブ抗体」とは、様々な構造を持つネイティブに存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、これに定常軽（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの種類の１つに割り当てられてもよい。
「添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通常含まれる指示を指すために用いられ、そのような治療製品に関する適応症、使用、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む。
参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための整列は、当技術分野における技術の範囲内にある種々の方法において、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を用いて生成している。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、使用者用書類と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、ここで、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルし得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含め、ＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、変わらない。
ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂに対する、ある特定のアミノ酸配列同一性％を有する又は含む、所与のアミノ酸配列Ａとして記述され得る）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によって、そのプログラムのＡとＢのアラインメントにおいて同一のマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ａ対Ｂの％アミノ酸配列同一性は、Ｂ対Ａの％アミノ酸配列同一性に等しくないことが理解されよう。特に明記しない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して直前の段落に記載されているように得られる。
「医薬製剤」という用語は、そこに含まれる有効成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、かつ、製剤が投与されるであろう被験者に許容できない毒性を有する追加成分を含まない製剤をいう。
「薬学的に許容され得る担体」は、対象に対して非毒性である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容され得る担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「治療」（及びその文法的な変形語、例えば、「治療する」又は「治療すること」）は、治療される個体の本来の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。治療の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行速度を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるため、又は疾患の進行を遅延させるために使用される。
「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体と抗原との結合に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインである。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般的に、同様の構造を有し、それぞれのドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む。（例えばＫｉｎｄｔ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（２００７），ｐａｇｅ ９１を参照されたい）抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のＶＨ又はＶＬドメインを使用し、それぞれ、相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリをスクリーニングして、単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１９９３）８８０－８８７；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２（１９９１）６２４－６２８）を参照されたい。
「ベクター」という用語は、本明細書では、連結している別の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。この用語には、自己複製する核酸構造としてのベクターだけでなく、ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも含まれる。ある種のベクターは、動作可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。
Ｉ．組成物及び方法
一態様では、本発明は、驚くべきことに、グルコシル化部位が除去されたＨＬＡ－Ｇ－００９０の様々な変異体のうち、２つの変異体ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ及びＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ａのみが、ＬＣのＣＤＲ－Ｌ１でグリコシル化をもはや示さない（したがって、Ｆａｂグリコシル化を検出することができなかった）が、更に改善された結合特性、良好な発現性及び安定性を示すという知見に部分的に基づく。最近承認された全ての医薬抗体産物が哺乳動物細胞、特にＣＨＯ細胞（例えば、Ｗａｌｓｈ Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２０１８）１１３６－１１４５を参照されたい）で産生されるため、結合領域にグリコシル化部位を有しない抗体（ＶＨ及びＶＬ、特にＣＤＲ）を提供することは、その後、これらの抗体を、グリコシル化によって結合特性を（少なくとも部分的に）損なうリスクなしに哺乳動物発現系での産生に容易に使用することができるため、有益な利点となる。特にＦｃドメインを含む抗体の場合、Ｆｃ領域中のアミノ酸残基ＡＳＮ２９７（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）に結合したＮ－グリカンは、溶解性及び熱安定性を維持し、水溶液中での（例えば、医薬組成物において）抗体の凝集を防ぐために必要であることから、グリコシル化機構を欠く宿主細胞（原核生物宿主細胞等）で抗体を製造しても、同等の品質の生成物は得られない。
Ａ．１ 例示的な抗ＨＬＡ－Ｇ抗体
本発明の一実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗体であって、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、を含む抗体を提供する。
本発明の一実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗体であって、
Ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
Ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、抗体である。
本発明の一実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗体であって、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体である。
本発明の一実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗体であって、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体である。
実施形態では、そのような抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む（親）抗体と比較して、最大結合（Ｒｍａｘ）及び／又は結合親和性（ＫＤ）に関して改善された結合特性を有する（実施例２に示される）。更なる実施形態では、本発明のＨＬＡ－Ｇ抗体はヒト起源のＦｃドメインを含み、一実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＧアイソタイプのものであり、好ましい一実施形態ではＩｇＧ１アイソタイプのものである。一実施形態では、ヒト起源のそのようなＩｇＧ１アイソタイプＦｃドメインはアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
更なる実施形態では、本発明のＨＬＡ－Ｇ抗体は、ヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含むヒト起源の定常領域、特にＩｇＧアイソタイプの定常領域、より詳しくはＩｇＧ１アイソタイプの定常領域を含む。
一実施形態では、ＩｇＧ１アイソタイプのそのような定常領域はアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
そのようなＦｃドメイン含有抗体は、典型的には、例えば哺乳動物細胞、特にＣＨＯ細胞のような真核細胞で産生される場合、ＡＳＮ－２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）の位置でＮ－グリコシル化され得る。位置ＡＳＮ－２９７でのＮ－グリコシル化（ＥＵインデックス（Ｋａｂａｔを参照されたい）によるナンバリング）は、例えば、そのような抗体の高い安定性、低い凝集傾向及び／又は良好な薬物動態学的及び他の重要な品質特性に対する貴重な貢献となる（例えば、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ，ｍＡｂｓ（２０１１）５６８－５７６；ａｎｄ Ｒｅｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）１３２５－１３３）。したがって、本発明のそのようなＦｃドメイン含有抗体は、哺乳動物細胞、特にＣＨＯ細胞のような真核細胞における産生の準備が容易であり、結合領域においてグリコシル化（その結合特性を妨害し得る）されるリスクがないが、同時に、ＡＳＮ－２９７位におけるＮ－グリコシル化の利益及び有益な品質特性伴う。
本発明の一実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗体であって、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、（実施例２に示すように）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む（親）抗体と比較して、最大結合（Ｒｍａｘ）及び／又は結合親和性（ＫＤ）に関して改善された結合特性を有する抗体である。
実施形態では、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、
ａ）改変ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず、ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸がＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられており、複合体が配列番号４０を含む、及び／又は
ｂ）配列番号４１を含むマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応しない、及び／又は
ｃ）配列番号４３を含むラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応しない。
実施形態では、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、
ａ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６）（で発現されるＨＬＡ－Ｇ）へのＩＬＴ２結合を阻害するか；又は
ｂ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６）（で発現されるＨＬＡ－Ｇ）に結合し、ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６）へのＩＬＴ２結合を阻害する。
別の態様では、本発明は、抗ＨＬＡ－Ｇ抗原結合部分を含む多重特異性抗体に関する。本明細書に記載されるこれらの多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）は、選択され、改善された抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を第１の抗原結合部分／部位として使用する。これらの抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、高い特異性及び親和性（改善された結合特性、他の種及びヒトＨＬＡ－Ａコンセンサス配列との交差反応性なし）でｔｏＨＬＡ－Ｇに結合し、ＨＬＡ－ＧへのＩＬＴ２及び／又はＩＬＴ４の結合を特異的に阻害する能力を有する。
一実施形態では、本発明は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する多重特異性（好ましくは二重特異性）に関する。一実施形態では、本発明は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する多重特異性（好ましくは二重特異性）抗体が、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及びヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分を含む、多重特異性（好ましくは二重特異性）抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体に関する。本明細書に記載のこの二重特異性抗体は、ＣＤ３、特にＣＤ３イプシロンに特異的な第２の抗原結合部分／部位と結合し、したがってＣＤ３発現Ｔ細胞をＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞に引き付けることができ、同時にＨＬＡ－ＧへのＩＬＴ２／４結合を遮断することによって腫瘍環境におけるＨＬＡ－Ｇ誘導性免疫抑制を阻害することができる。したがって、これらの二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで強い腫瘍成長阻害及び腫瘍退縮を示す。
Ａ．２ 例示的な多重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体
本発明の一実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及びヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分を含み、
ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、を含み、
ヒトＣＤ３に結合するＴ細胞活性化抗原に結合する第２の抗原結合部分は、
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、を含む二重特異性抗体である。
本発明の別の実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及びヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分を含み、
第１の抗原結合部分は、
Ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
Ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
第２の抗原結合部分は、
Ｃ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
Ｄ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
Ｅ）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
本発明の別の実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及びヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分を含み、
第１の抗原結合部分は、
配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
第２の抗原結合部分は、
配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
本発明の別の実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及びヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分を含み、
第１の抗原結合部分は、
配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
第２の抗原結合部分は、
配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
本発明の別の実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及びヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分を含み、
第１の抗原結合部分は、
配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
第２の抗原結合部分は、
配列番号７４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
一実施形態では、これらの二重特異性抗体は、以下の１つ以上の特性を特徴とする：
ａ）ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の存在下（好ましくはＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６）の存在下）でのＴ細胞媒介性細胞傷害／腫瘍細胞殺傷の誘導、及び／又は
ｂ）ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の存在下（好ましくはＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６）でのＴ細胞によるＩＦＮガンマ分泌の誘導）、及び／又は
ｃ）ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長の阻害（マウス異種移植腫瘍モデルにおいて）、
ｄ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）ヒト化ＮＳＧマウスでトランスフェクトしたＳＫＯＶ３ヒト卵巣癌腫を有するヒト化ＮＳＧマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性／腫瘍退縮（実施例１３を参照されたい）、及び／又は
ｅ）ヒト乳がんＰＤＸ腫瘍（ＢＣ００４）を有するヒト化ＮＳＧマウスにおけるＨＬＡ－Ｇ ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性／腫瘍（実施例１４を参照されたい）。
一実施形態では、これらの二重特異性抗体は、以下の１つ以上の特性を更に特徴とする：二重特異性抗体は、
ａ）改変ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず、ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸がＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられており、複合体が配列番号４４を含む、及び／又は
ｂ）配列番号４１を含むマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応しない、及び／又は
ｃ）配列番号４３を含むラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応しない。
一実施形態では、これらの二重特異性抗体は、以下の１つ以上の特性を更に特徴とする：二重特異性抗体は、
ａ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６）（で発現されるＨＬＡ－Ｇ）へのＩＬＴ２結合を阻害するか；又は
ｂ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６）（で発現されるＨＬＡ－Ｇ）に結合し、ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６）へのＩＬＴ２結合を阻害する、及び／又は
多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち、異なる抗原上の異なるエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、３つ以上の結合特異性を有する。好ましい実施形態では、本明細書で提供される多重特異性抗体は二重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、結合特異性の一方はＨＬＡ－Ｇに対するものであり、他方の特異性はＣＤ３に対するものである。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体はＨＬＡ－Ｇの２つ（又はそれ以上）の異なるエピトープに結合し得る。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製され得る。
多重特異性抗体及び特に二重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）を参照されたい）及び「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号及びＡｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６（１９９７）を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、また、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の操作（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号を参照されたい）；２つ以上の抗体若しくは断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５））を参照されたい）；ロイシンジッパーを使用した二重特異性抗体の産生（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）及び国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照されたい）；軽鎖の誤対合問題を回避するための一般的な軽鎖技術の使用（例えば、国際公開第９８／５０４３１号を参照されたい）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）；並びに例えばＴｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されている三重特異性抗体の調製によって作製することができる。
例えば、「オクトパス抗体」を含め、３つ以上の抗原結合部位を有する操作抗体、又はＤＶＤ－Ｉｇもまたここに含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号及び国際公開第２００８／０２４７１５号を参照されたい）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号及び国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出され得る。二重特異性抗体又はその抗原結合断片には、ＨＬＡ－Ｇと別の異なる抗原、又はＨＬＡ－Ｇの２つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号明細書及び国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照されたい）。
多重特異性抗体はまた、同じ抗原特異性の１つ以上の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称形態で、すなわちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号及び国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照されたい）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（国際公開第２００９／０８０２５３号を参照されたい）又は完全なＦａｂアーム（国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号を参照、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１８７－１１９１、及びＫｌｅｉｎ ａｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０も参照されたい）を交換することによっても提供され得る。非対称Ｆａｂアームは、荷電又は非荷電アミノ酸変異をドメインインターフェースに導入して正しいＦａｂペアリングを指示することによって操作することもできる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照されたい。
多重特異性抗体の様々な更なる分子フォーマットが当技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６を参照されたい）。
本明細書に同様に含まれる特定のタイプの多重特異性抗体は、標的細胞、例えば腫瘍細胞上の表面抗原と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性型不変構成成分、例えば、Ｔ細胞を再標的化して標的細胞を死滅させるためのＣＤ３とに同時に結合するように設計された二重特異性抗体である。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、結合特異性のうちの一方がＨＬＡ－Ｇに対するものであり、他方がＣＤ３に対するものである多重特異性抗体、特に二重特異性抗体である。
この目的に役立ち得る二重特異性抗体フォーマットの例として、限定されないが、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーによって融合されている、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）分子（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、国際公開第２００５／０６１５４７号、国際公開第２００７／０４２２６１号、及び国際公開第２００８／１１９５６７号、Ｎａｇｏｒｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７，１２５５－１２６０（２０１１）を参照）；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，２９９－３０５（１９９６））及びその誘導体、例えばタンデムダイアボディ（「ＴａｎｄＡｂ」；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，４１－５６（１９９９））；ダイアボディフォーマットに基づくが、更なる安定化のためにＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９９，４３６－４４９（２０１０））、いわゆるトリオマブ（これはマウス／ラットＩｇＧハイブリッド分子全体である（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ３６，４５８－４６７（２０１０）に概説）が挙げられる。本明細書に含まれる特定のＴ細胞二重特異性抗体フォーマットは、国際公開第２０１３／０２６８３３号、国際公開第２０１３／０２６８３９号、国際公開第２０１６／０２０３０９号；Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（８）（２０１６）ｅ１２０３４９８に記載されている。
ＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体
本発明はまた、二重特異性抗体、すなわち、２つの異なる抗原決定基（第１の抗原及び第２の抗原）への特異的結合能を有する少なくとも２つの抗原結合部分を含む抗体を提供する。
開発された抗ＨＬＡ－Ｇ抗原結合部分及び抗ＣＤ３抗原結合部分に基づいて、本発明者らは、ＨＬＡ－Ｇ及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体を開発した。
実施例に示されるように、これらの二重特異性抗体は、良好な効力及び低い毒性を含む多数の顕著な特性を有する。
したがって、ある特定の態様では、本発明は、（ａ）ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分、及び（ｂ）ヒトＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合部分を含む二重特異性抗体であって、以下の特徴のいずれかを有する二重特異性抗体を提供する：－本発明の二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞のＴ細胞媒介殺傷を特異的に誘導する。いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞のＴ細胞媒介殺傷を特異的に誘導する。より具体的な実施形態では、二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞のＴ細胞媒介殺傷を特異的に誘導する。
一実施形態では、二重特異性抗体によるＴ細胞媒介殺傷の誘導は、ＨＬＡ－Ｇ発現細胞を用いて決定される。
一実施形態では、二重特異性抗体によるＴ細胞の活性化は、ＨＬＡ－Ｇ発現細胞の存在下での二重特異性抗体とのインキュベーション後のＴ細胞によるＣＤ２５及び／又はＣＤ６９の発現を、特にフローサイトメトリーによって測定することによって決定される。
具体的な実施形態では、二重特異性抗体によるＴ細胞媒介殺傷の誘導は、以下のように決定される：
ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の存在下でＴ細胞を活性化する抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ ＴＣＢの能力を、組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）でトランスフェクトしたＳＫＯＶ３細胞で試験する。Ｔ細胞の活性化を、Ｔ細胞上の細胞表面活性化マーカーＣＤ２５及び初期活性化マーカーＣＤ６９のＦＡＣＳ分析によって評価する。簡潔には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ Ｔｕｂｅｓ（ＰＡＮ＃Ｐ０４－６０１２５）を使用する密度勾配遠心分離によってヒト末梢血から単離する。ＰＢＭＣ及びＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ細胞を１０：１の比率で９６ウェルＵ字底プレートに播種する。次いで、共培養物を、実施例１２に記載のように異なる濃度のＨＬＡ－Ｇ－ＴＣＢと共にインキュベートし、５％Ｃｏ２を含むインキュベーター内で３７℃で２４時間インキュベートする。翌日、ＣＤ２５及びＣＤ６９の発現をフローサイトメトリーによって測定する。
フローサイトメトリー分析のため、細胞を、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５マウス抗ヒトＣＤ８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃５６５３１０）、ＰＥマウス抗ヒトＣＤ２５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃９０１２－０２５７）及びＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ６９（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃５５５５３３）により４℃で染色する。簡潔には、抗体を２倍の濃度に希釈し、２５μｌの抗体希釈液を２５μｌの予備洗浄した共培養物と共に各ウェルに添加する。細胞を４℃で３０分間染色し、２００μｌ／ウェルの染色緩衝液で２回洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離する。細胞ペレットを２００μｌの染色緩衝液に再懸濁し、２μｇ／ｍｌの最終濃度で生死識別のためにＤＡＰＩで染色する。次いで、試料を、ＢＤ ＬＳＲフローサイトメーターを使用して測定する。ＦｌｏｗＪｏ Ｖ．１０．１ソフトウェアを使用してデータ分析を行う。
本発明の二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞の存在下でＴ細胞を特異的に活性化する。いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞の存在下でＴ細胞を特異的に活性化する。より具体的な実施形態では、二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞の存在下でＴ細胞を特異的に活性化する。
一実施形態では、二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞の存在下でＴ細胞のＴ細胞媒介殺傷を誘導するか、又はＴ細胞を活性化する。一実施形態では、二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞の存在下におけるＴ細胞媒介殺傷の誘導又はＨＬＡ－Ｇを発現する細胞の存在下におけるＴ細胞の活性化のためのＥＣ５０の少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍又は少なくとも１００倍低いＥＣ５０で、ＨＬＡ－Ｇを発現する細胞の存在下において、Ｔ細胞媒介殺傷を誘導する、及び／又はＴ細胞を活性化する。
本発明の特定の実施形態によれば、二重特異性抗体二重特異性抗体に含まれる抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である（すなわち、重鎖及び軽鎖で構成される抗原結合ドメイン、それぞれが可変ドメインと定常ドメインを含む）。一実施形態では、第１及び／又は第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。一実施形態では、上記Ｆａｂ分子は、ヒトである。特定の実施形態では、上記Ｆａｂ分子は、ヒト化されている。更に別の実施形態では、上記Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。
好ましくは、抗原結合部分の少なくとも１つは、クロスオーバーＦａｂ分子である。そのような修飾は、異なるＦａｂ分子の重鎖と軽鎖の誤対合を低減し、それによって、組換え産生における本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を改善する。本発明の二重特異性抗体に有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＬ及びＶＨ）が交換されている。しかしながら、このドメイン交換によっても、二重特異性抗体の調製は、誤対合重鎖及び軽鎖の間の、いわゆる、ベンス・ジョーンズ型相互作用に起因して、ある特定の副生成物を含むことがある（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１１８７－１１１９１を参照されたい）。異なるＦａｂ分子からの重鎖と軽鎖の誤対合を更に減少させ、したがって所望の二重特異性抗体の純度及び収率を増加させるため、本明細書中に更に記載されるように、第１の抗原（ＨＬＡ－Ｇ）に結合するＦａｂ分子（複数可）、又は第２の抗原、活性化Ｔ細胞抗原、例えばＣＤ３、に結合するＦａｂ分子、のいずれかのＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおける特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸が導入され得る。電荷修飾は、二重特異性抗体に含まれる従来のＦａｂ分子（例えば、図１３Ａ～Ｃ、Ｇ～Ｊに示されている）、又は二重特異性抗体に含まれるＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子（例えば、図１３Ｄ～Ｆ、Ｋ～Ｎに示されている）のいずれかにおいて行われる（しかし、両方ではない）。特定の実施形態では、電荷修飾は、二重特異性抗体（特定の態様では、第１の抗原、すなわちＨＬＡ－Ｇに結合する）に含まれる従来のＦａｂ分子において行われる。
本発明による特定の実施形態では、二重特異性抗体は、第１の抗原（すなわちＨＬＡ－Ｇ）及び第２の抗原（例えば、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３）に同時に結合することができる。一実施形態では、二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ｇと活性化Ｔ細胞抗原とを同時に結合させることによって、Ｔ細胞と標的細胞とを架橋することができる。更により詳しい実施形態では、そのような同時結合は、標的細胞、特にＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の溶解をもたらす。一実施形態では、そのような同時結合は、Ｔ細胞の活性化をもたらす。他の実施形態では、そのような同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクタ分子の放出、細胞傷害活性及び活性化マーカーの発現の群から選択されるＴリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答を生じる。一実施形態では、ＨＬＡ－Ｇへの同時結合を伴わない、活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３への二重特異性抗体の結合は、Ｔ細胞活性化をもたらさない。
一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を標的細胞に向け直すことができる。特定の実施形態では、上記向け直しは、標的細胞によるＭＨＣ媒介ペプチド抗原提示及び／又はＴ細胞の特異性とは無関係である。
特に、本発明の実施形態のいずれかによるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞である。
ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分
本発明の二重特異性抗体は、ヒトＨＬＡ－Ｇ（第１の抗原）に結合する少なくとも１つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する２つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。そのような特定の実施形態では、これらの抗原結合部分のそれぞれは、同じ抗原決定基に結合する。なお更なる特定の実施形態では、これらの抗原結合部分の全てが同一であり、すなわち、それらは、（存在する場合は）本明細書中に記載されるＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおける同じアミノ酸置換を含む同じアミノ酸配列を含む。一実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する２個以下の抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。
特定の実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。そのような実施形態では、第２の抗原に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子である。
代替の実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合部分は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子である。そのような実施形態では、第２の抗原に結合する抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。
ＨＬＡ－Ｇ結合部分は、二重特異性抗体を標的部位、例えば、ヒトＨＬＡ－Ｇを発現する特定のタイプの腫瘍細胞に向けることができる。
二重特異性抗体の第１の抗原結合部分は、科学的に明らかに不合理又は不可能でない限り、ＨＬＡ－Ｇに結合する抗体に関して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
したがって、一態様では、本発明は、第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分を含む二重特異性抗体であって、第１の抗原がヒトＨＬＡ－Ｇ（一実施形態では、抗体は配列番号３９を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体に結合する）であり、第１の抗原結合部分は、
（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（好ましい一実施形態では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（好ましい一実施形態では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、を含む。
「（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（好ましい一実施形態では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン」のような用語は、配列番号７のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを指し、３つのＣＤＲは変化していない（すなわち、配列番号７と同じである）が、例えば、ＶＨのフレームワーク領域中の０、１、２、３、４又は５個のアミノ酸残基が、ＶＨ及び抗原結合部位の結合特性に影響を及ぼすことなく別のアミノ酸で変更／置換されている。結合特性に影響を及ぼす可能性が高いフレームワーク残基は周知であることから（例えば、Ｆｏｏｔｅ Ｊ．ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９２）２２４，４８７－４９９を参照されたい）、影響のない又はわずかなフレームワーク残基を置換のために選択することができる。同じことが、別のＶＨ又はＶＬに関する本明細書で使用される類似語にも当てはまる。
一実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
一実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ｇ（一実施形態では、配列番号３９を含むＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体）に結合する第１の結合部分は、
（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（好ましい一実施形態では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって、配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（好ましい一実施形態では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、を含む。
一実施形態では、第１の抗原結合部分は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
そのような抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、抗原結合部位（及びＣＤＲ－Ｌ１）にＮ－グルコシル化を有さず（実施例２に示されるように）、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む（親）抗体と比較して、最大結合（Ｒｍａｘ）及び／又は結合親和性（ＫＤ）に関して改善された結合特性を有し（実施例２に示されるように）、ＨＬＡ－Ａ ＭＨＣ Ｉ複合体又はマウス若しくはラットＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず、ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６）（に発現されるＨＬＡ－Ｇ）に結合し、ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６）（に発現されるＨＬＡ－Ｇ）へのＩＬＴ２結合を阻害することから、非常に価値のある特性を示す。
ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分
本発明の二重特異性抗体は、ヒトＣＤ３に結合する少なくとも１つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。
特定の実施形態では、ヒトＣＤ３に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬが交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子）である。そのような実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合部分は、好ましくは従来のＦａｂ分子である。二重特異性抗体に含まれるヒトＣＤ３に結合する抗原結合部分、特にＦａｂ分子が２つ以上存在する実施形態では、ヒトＣＤ３に結合する抗原結合部分は、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
代替的な実施形態では、第２の抗原に結合する抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。そのような実施形態では、第１の抗原（すなわち、ＨＬＡ－Ｇ）に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子である。二重特異性抗体に含まれる第２の抗原に結合する２つ以上の抗原結合部分、特にＦａｂ分子が存在する実施形態では、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合部分は、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、ヒトＣＤ３に結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
いくつかの実施形態では、第２の抗原は活性化Ｔ細胞抗原である（本明細書では「Ｔ細胞抗原結合部分を活性化する、又はＴ細胞抗原結合Ｆａｂ分子を活性化する」とも称される）。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、活性化Ｔ細胞抗原への特異的結合能を有する１つ以下の抗原結合部分を含む。一実施形態では、二重特異性抗体は活性化Ｔ細胞抗原への一価結合を提供する。
特定の実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３、特にヒトＣＤ３（配列番号８８）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号８９）、最も詳しくはヒトＣＤ３である。一実施形態では、第２の抗原結合部分はヒト及びカニクイザルＣＤ３に対して交差反応性である（すなわち、特異的に結合する）。いくつかの実施形態では、第２の抗原はＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３イプシロン）である。
一実施形態では、ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分は、（ａ）（ｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（好ましい一実施形態では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（好ましい一実施形態では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、を含む。
一実施形態では、ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分は、（ａ）（ｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメインであって、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（好ましい一実施形態では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって、配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（好ましい一実施形態では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、を含む。
一実施形態では、ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分は、（ａ）（ｉ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２を含むＶＨドメインであって、配列番号７４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（好ましい一実施形態では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列；及び（ｉｉｉ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１；（ｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインであって、配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％（好ましい一実施形態では、９８％又は９９％又は１００％）の配列同一性のアミノ酸配列を含むＶＬドメイン、を含む。
一実施形態では、ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
一実施形態では、ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分は、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
一実施形態では、ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分は、配列番号７４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
そのようなＣＤ３抗原結合部分／部位は、非常に有益な特性を示す（例えば、ＣＤ３及びＨＬＡ－Ｇに結合する二重特異性抗体として提供される場合（本明細書に記載のＨＬＡ－Ｇ抗原結合部分を有する））。それらは、以下を示す。
ａ）良好な熱安定性
ｂ）ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の存在下（好ましくはＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６）でのＴ細胞によるＩＦＮガンマ分泌の誘導）（実施例１１）、及び／又は
ｃ）ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の存在下（好ましくはＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６）の存在下）でのＴ細胞媒介性細胞傷害／腫瘍細胞殺傷の誘導（実施例１２）、及び／又は
ｄ）ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長の阻害（マウス異種移植腫瘍モデルにおいて）、
ｅ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）ヒト化ＮＳＧマウスでトランスフェクトしたＳＫＯＶ３ヒト卵巣癌腫を有するヒト化ＮＳＧマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性／腫瘍退縮（実施例１３を参照されたい）、及び／又は
ｆ）ヒト乳がんＰＤＸ腫瘍（ＢＣ００４）を有するヒト化ＮＳＧマウスにおけるＨＬＡ－Ｇ ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性／腫瘍（実施例１４を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１、特に可変ドメインＶＬとＶＨが、互いに置き換わっているＦａｂ分子である（すなわち、そのような実施形態によれば、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変又は定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である）。そのような一実施形態では、第１の（存在する場合には、第３の）抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
一実施形態では、第２の抗原（例えば、ＣＤ３等の活性化Ｔ細胞抗原）に結合する１つ以下の抗原結合部分が、二重特異性抗体中に存在する（すなわち、二重特異性抗体は、第２の抗原への一価結合を提供する）。
電荷修飾
本発明の二重特異性抗体は、それに含まれるＦａｂ分子に、１つ（又は２つより多い抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合には、更に多くの）結合アーム中にＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベース二重特異性抗体／抗体の産生において生じ得る、軽鎖と適合しない重鎖との誤対合（ベンス・ジョーンズ型副生成物）を低減するうえで特に効率的であるアミノ酸置換を含み得る（全体が本明細書に参照により組み込まれる国際公開第２０１５／１５０４４７号、特にその中の実施例も参照されたい）。望ましくない副生成物、特に、結合アームの１つにＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する二重特異性抗体に生じるベンス・ジョーンズ型副生成物と比較した、所望の二重特異性抗体の比を、ＣＨ１及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置と反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することによって改善することができる（本明細書で「電荷修飾」と呼ぶことがある）。
したがって、二重特異性抗体の第１及び第２の抗原結合部分が両方ともＦａｂ分子であり、抗原結合部分の１つ（特に、第２の抗原結合部分）において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっている、いくつかの実施形態では、
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、又は
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、負に帯電したアミノ酸によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
二重特異性抗体は、ｉ）及びｉｉ）に記述されている修飾を両方とも含むことはない。ＶＨ／ＶＬが置き換わっている抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置き換わっていない（すなわち、交換されていないままである）。
より具体的な実施形態では、
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、又は
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
そのような一実施形態では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されているか（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
更なる実施形態では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の実施形態では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
より詳しい実施形態では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
更により詳しい実施形態では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の実施形態では、上の実施形態によるアミノ酸置換が、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１でなされる場合、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
或いは、上記実施形態のアミノ酸置換は、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１ではなく、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１で行われてもよい。特定のそのような実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
したがって、一実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
更なる実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸は、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
更に別の実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
別の実施形態では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、
Ｉ）ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分であって、該第１の抗原結合部分が
Ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号３２；２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、
Ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、Ｆａｂ分子である、
第１の抗原結合部分と、
ＩＩ）ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分であって、
該第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、
Ｃ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
Ｄ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
Ｅ）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、
第２の抗原結合部分とを含み、
ＩＩＩ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の字実施形態では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって（特定の実施形態では、独立して、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
二重特異性抗体フォーマット
本発明の二重特異性抗体の構成要素は、種々の構成で互いに融合することができる。例示的な構成を図１３に示す。
特定の実施形態では、二重特異性抗体に含まれる抗原結合部分はＦａｂ分子である。そのような実施形態では、第１、第２、第３等の抗原結合部分は、本明細書においてそれぞれ、第１、第２、第３のＦａｂ分子等と称され得る。
一実施形態では、二重特異性抗体の第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、任意にペプチドリンカーを介して互いに融合される。特定の実施形態では、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子である。そのような一実施形態では、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される。別のそのような実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合される。（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている実施形態では、更に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とが、任意にペプチドリンカーを介して互いに融合され得る。
ＨＬＡ－Ｇ（例えば、図１３Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌに示すように）等の標的細胞抗原への特異的結合能を有する単一抗原結合部分（Ｆａｂ分子等）を有する二重特異性抗体は、特に高親和性抗原結合部分の結合後に標的細胞抗原の内在化が予想される場合に有用である。そのような場合、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内在化を増強し、それによってその利用可能性を低下させ得る。
しかしながら、他の場合では、例えば、標的部位への標的化を最適化するために、又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために、標的細胞抗原（図１３Ｂ、１３Ｃ、１３Ｅ、１３Ｆ、１３Ｉ、１３Ｊ、１３Ｍ又は１３Ｎに示す例を参照されたい）に特異的な２つ以上の抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ分子）を含む二重特異性抗体を有することが有利であろう。
したがって、特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、第３の抗原結合部分を含む。
一実施形態では、第３の抗原結合部分は第１の抗原、すなわちＨＬＡ－Ｇに結合する。一実施形態では、第３の抗原結合部分はＦａｂ分子である。
特定の実施形態では、第３の抗原部分は、第１の抗原結合部分と同一である。
二重特異性抗体の第３の抗原結合部分は、科学的に明らかに不合理又は不可能でない限り、第１の抗原結合部分及び／又はＨＬＡ－Ｇに結合する抗体に関して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
一実施形態では、第３の抗原結合部分は、
配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
特定の実施形態では、第３の抗原結合部分及び第１の抗原結合部分はそれぞれＦａｂ分子であり、第３の抗原結合部分は第１の抗原結合部分と同一である。したがって、これらの実施形態では、第１及び第３の抗原結合部分は、同じ重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、同じドメイン配置（すなわち、従来の又はクロスオーバーの）を有する。さらに、これらの実施形態では、第３の抗原結合部分は、存在する場合、第１の抗原結合部分と同じアミノ酸置換を含む。例えば、本明細書において「電荷修飾」と記載されるアミノ酸置換は、第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分のそれぞれの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われる。あるいは、上記アミノ酸置換は、第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１ではなく、第２の抗原結合部分（特定の実施形態ではＦａｂ分子でもある）の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１で行われ得る。
第１の抗原結合部分と同様に、第３の抗原結合部分は特に従来のＦａｂ分子である。しかしながら、第１及び第３の抗原結合部分がクロスオーバーＦａｂ分子である（及び第２の抗原結合部分が従来のＦａｂ分子である）実施形態も企図される。したがって、特定の実施形態では、第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はそれぞれ、従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子）である。他の実施形態では、第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分はそれぞれクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
第３の抗原結合部分が存在する場合、特定の実施形態では、第１及び第３の抗原部分はヒトＨＬＡ－Ｇに結合し、第２の抗原結合部分は第２の抗原ヒトＣＤ３、最も具体的にはＣＤ３イプシロンに結合する。
特定の実施形態では、二重特異性抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットは、安定な会合が可能である。
本発明による二重特異性抗体は、異なる構造を有することができ、すなわち、第１、第２（及び任意に第３）の抗原結合部分は、互いに、異なる様式でＦｃドメインに融合していてもよい。構成要素は、直接的に、又は好ましくは１つ以上の適切なペプチドリンカーを介して、互いに融合していてもよい。Ｆａｂ分子の融合が、ＦｃドメインのサブユニットのＮ末端へのものである場合、それは典型的には免疫グロブリンヒンジ領域を介するものである。
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、それぞれがＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような実施形態では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端又はＦｃドメインの他方のサブユニットのＮ末端に融合していてもよい。特定のそのような実施形態では、上記第１の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子）である。他のそのような実施形態では、上記第１のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。
一実施形態では、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、それぞれがＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な実施形態では、二重特異性抗体は、第１及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意に１つ以上のペプチドリンカーとから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１３Ｇ及び１３Ｋに概略的に描写されている（これらの実施例における第２の抗原結合ドメインは、ＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）。任意に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
別の実施形態では、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、それぞれがＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、それぞれがＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。具体的な実施形態では、二重特異性抗体は、第１のＦａｂ分子及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意に１つ以上のペプチドリンカーとから実質的になり、第１のＦａｂ分子及び第２のＦａｂ分子は、それぞれがＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１３Ａ及び１３Ｄ に概略的に描写されている（これらの実施例において、第２の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。第１及び第２のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に又はペプチドリンカーを介して融合していてもよい。特定の実施形態では、第１及び第２のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域によって、それぞれＦｃドメインに融合する。具体的な実施形態では、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域であり、特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１Ｆｃドメインである。
いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、それぞれがＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような実施形態では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端又は（上に記載されるように）Ｆｃドメインの他方のサブユニットのＮ末端に融合していてもよい。特定のそのような実施形態では、上記第１の抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子）である。他のそのような実施形態では、上記第１のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。
一実施形態では、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、それぞれがＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な実施形態では、二重特異性抗体は、第１及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意に１つ以上のペプチドリンカーとから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１３Ｈ及び１３Ｌに概略的に描写されている（これらの実施例において、第２の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。任意に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
いくつかの実施形態では、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。特定のそのような実施形態では、上記第１のＦａｂ分子及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ、従来のＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は、明細書に記載するクロスオーバーＦａｂ分子（すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨ及びＶＬ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が交換されている／互いに置き換わっているＦａｂ分子）である。他のそのような実施形態では、上記第１のＦａｂ分子及び第３のＦａｂ分子はそれぞれ、クロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。
特定のそのような実施形態では、第２及び第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な実施形態では、二重特異性抗体は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意に１つ以上のペプチドリンカーとから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１３Ｂ及び１３Ｅ（これらの実施例において、第２の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）と、図１３Ｊ及び１３Ｎ（これらの実施例において、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。第２及び第３のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に又はペプチドリンカーを介して融合していてもよい。特定の実施形態では、第２及び第３のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域によって、それぞれＦｃドメインに融合する。具体的な実施形態では、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域であり、特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１Ｆｃドメインである。任意に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
別のそのような実施形態では、第１及び第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な実施形態では、二重特異性抗体は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意に１つ以上のペプチドリンカーとから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１３Ｃ及び１３Ｆ（これらの実施例において、第２の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）と、図１３Ｉ及び１３Ｍ（これらの実施例において、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。第１及び第３のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に又はペプチドリンカーを介して融合していてもよい。特定の実施形態では、第１及び第３のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域によって、それぞれＦｃドメインに融合する。具体的な実施形態では、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域であり、特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１Ｆｃドメインである。任意に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
Ｆａｂ分子が、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットのそれぞれのＮ末端に融合している二重特異性抗体の構造において、２つのＦａｂ分子、ヒンジ領域及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子を本質的に形成する。特定の実施形態では、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラス免疫グロブリンである。なお更なる特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリンである。別の実施形態では、免疫グロブリンはＩｇＧ４サブクラス免疫グロブリンである。更に特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。他の実施形態では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一実施形態では、免疫グロブリンは、ヒト定常領域、特に、ヒトＦｃ領域を含む。
本発明の二重特異性抗体のいくつかにおいて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、任意にペプチドリンカーを介して互いに融合している。第１及び第２のＦａｂ分子の構造に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合していてもよく、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合していてもよい。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合は、適合しないＦａｂ重鎖及び軽鎖の誤対合を更に低減し、本発明の二重特異性抗体の一部の発現に必要なプラスミドの数も低減する。
抗原結合部分は、Ｆｃドメインに又は互いに、直接的に又は１つ以上のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合していてもよい。ペプチドリンカーは、当技術分野で公知であり、本明細書に説明される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが挙げられる。「ｎ」は、一般的に、１～１０、典型的には２～４の整数である。一実施形態では、上記ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸長を有し、一実施形態では、５～１００アミノ酸長、更なる実施形態では、１０～５０アミノ酸長を有する。一実施形態では、上記リンカーペプチドは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）、又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）であり、一実施形態では、ｘ＝４、ｎ＝２又は３、更なる実施形態では、ｘ＝４、ｎ＝２である。一実施形態では、上記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合するのに特に適したペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖に接続するのに好適な、例示的なペプチドリンカーは、配列（Ｄ）－（Ｇ４Ｓ）２を含む。別の適切なそのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。加えて、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含んでいてもよい。特に、Ｆａｂ分子が、ＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する場合、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介し、更なるペプチドリンカーを伴い、又は伴わずに融合してもよい。
ある特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられている）、次に、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））を更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合している。
ある特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられている）、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））を更に含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合している。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられている）、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。他の実施形態では、二重特異性抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域で置き換えられている）、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。
これらの実施形態のいくつかでは、二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））を更に含む。これらの実施形態の他のいくつかでは、二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドと共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＬ（１）－ＣＬ（１））、又は第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２））を更に含む。
これらの実施形態による二重特異性抗体は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））を更に含み得る。特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合している。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられている）、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。他の実施形態では、二重特異性抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられている）、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。
これらの実施形態のいくつかでは、二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））と共有する、第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチドを更に含む。これらの実施形態の他のものでは、二重特異性抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドと共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＬ（１））、又は第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２））を更に含む。
これらの実施形態による二重特異性抗体は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））を更に含み得る。特定の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合によって共有結合している。
本発明による二重特異性抗体の異なる構造の全てにおいて、本明細書に記載されるアミノ酸置換は、存在する場合、第１及び（存在する場合）第３の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメイン、又は第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１又はＣＬドメインにおけるものでありうる。好ましくは、それらは、第１及び（存在する場合）第３の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおけるものである。本発明の概念によれば、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる場合、そのようなアミノ酸置換は、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われない。逆に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる場合、そのようなアミノ酸置換は、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われない。アミノ酸置換は、特に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ１が互いに置き換わっているＦａｂ分子を含む二重特異性抗体において行われる。
本発明による二重特異性抗体の特定の実施形態では、特に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる場合、第１（及び存在する場合、第３）のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。本発明による二重特異性抗体の他の実施形態では、特に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる場合、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。いくつかの実施形態では、第１の（及び存在する場合は第３の）抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬと、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
特定の態様では、本発明は、
ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分であって、第１の抗原はＨＬＡ－Ｇであり、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分はそれぞれ、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む（従来の）Ｆａｂ分子である、第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分と、
ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子であり、（ｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は（ｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は（ｉｉｉ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号７５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第２の抗原結合部分と、
ｃ）第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインと、を含む二重特異性抗体を提供し、
ａ）での第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も特定的にはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、ａ）での第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、
さらに、
ａ）の下での第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の下での第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、ｂ）の下での第２の抗原結合部分及びａ）の下での第３の抗原結合部分はそれぞれ、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）の下でのＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合されている。
本発明のこれらの態様による一実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、位置３６６のトレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、位置４０７のチロシン残基がバリン残基で置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、任意に位置３６６のトレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本発明のこれらの態様による更なる実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基で置き換えられている（Ｓ３５４Ｃ）か又は位置３５６のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、位置３４９のチロシン残基がシステイン残基と置により置き換えられて（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本発明のこれらの態様による更なる実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットのそれぞれにおいて、位置２３４のロイシン残基がアラニン残基（Ｌ２３４Ａ）と置き換わっており、位置２３５のロイシン残基がアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３５Ａ）、位置３２９のプロリン残基がグリシン残基により置き換えられている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
本発明のこれらの態様による更なる実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
本発明の具体的な実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、配列番号７６の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７７の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７８の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号７９の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む（ＶＨ若しくはＶＬフレームワーク領域又は定常領域において、そのような二重特異性抗体の特異的結合特性及び定常領域の特性に影響を及ぼすことなくアミノ酸が置換されている）。
本発明の具体的な実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、配列番号７６の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７７の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７８の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号７９の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、
該二重特異性抗体は、以下の１つ以上の特性を有する：
二重特異性抗体は、以下を示す
ａ）ＨＬＡ－ＧへのＩＬＴ２及び／若しくはＩＬＴ４の結合の阻害（実施例１０を参照されたい）、並びに／又は
ｂ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）でトランスフェクトしたＳＫＯＶ３細胞上及び／若しくは内因性ＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ３細胞上でのＴ細胞による抗体媒介ＩＦＮガンマ分泌（ＩＦＮガンマ分泌が検出された）（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによる）（実施例１１を参照されたい）、並びに又は
ｃ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ ３ＨＬＡ－Ｇ）でトランスフェクトしたＳＫＯＶ３細胞及び／若しくは内因性ＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ３細胞に対するＴ細胞媒介性細胞傷害／腫瘍細胞殺傷（細胞傷害は、二重特異性抗体で治療した後の細胞におけるカスパーゼ８活性化を測定することによって検出された）（実施例１２を参照されたい）、並びに／又は
ｄ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）ヒト化ＮＳＧマウスでトランスフェクトしたＳＫＯＶ３ヒト卵巣癌腫を有するヒト化ＮＳＧマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性／腫瘍退縮（実施例１３を参照されたい）、及び／又は
ｅ）ヒト乳がんＰＤＸ腫瘍（ＢＣ００４）を有するヒト化ＮＳＧマウスにおけるＨＬＡ－Ｇ ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性／腫瘍（実施例１４を参照されたい）。
更に具体的な実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号７６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
本発明の更なる具体的な実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、配列番号８０の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８１の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８２の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号８３の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む（ＶＨ若しくはＶＬフレームワーク領域又は定常領域において、そのような二重特異性抗体の特異的結合特性及び定常領域の特性に影響を及ぼすことなくアミノ酸が置換されている）。
本発明の具体的な実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、配列番号８０の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８１の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８２の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号８３の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、
該二重特異性抗体は、以下の１つ以上の特性を有する：
二重特異性抗体は、以下を示す
ａ）ＨＬＡ－ＧへのＩＬＴ２及び／若しくはＩＬＴ４の結合の阻害（実施例１０を参照されたい）、並びに／又は
ｂ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）でトランスフェクトしたＳＫＯＶ３細胞上及び／若しくは内因性ＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ３細胞上でのＴ細胞による抗体媒介ＩＦＮガンマ分泌（ＩＦＮガンマ分泌が検出された）（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによる）（実施例１１を参照されたい）、並びに又は
ｃ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ ３ＨＬＡ－Ｇ）でトランスフェクトしたＳＫＯＶ３細胞及び／若しくは内因性ＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ３細胞に対するＴ細胞媒介性細胞傷害／腫瘍細胞殺傷（細胞傷害は、二重特異性抗体で治療した後の細胞におけるカスパーゼ８活性化を測定することによって検出された）（実施例１２を参照されたい）、並びに／又は
ｄ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）ヒト化ＮＳＧマウスでトランスフェクトしたＳＫＯＶ３ヒト卵巣癌腫を有するヒト化ＮＳＧマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性／腫瘍退縮（実施例１３を参照されたい）、及び／又は
ｅ）ヒト乳がんＰＤＸ腫瘍（ＢＣ００４）を有するヒト化ＮＳＧマウスにおけるＨＬＡ－Ｇ ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性／腫瘍（実施例１４を参照されたい）。
更に具体的な実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号８０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
本発明の更なる具体的な実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、配列番号８４の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８５の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８６の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号８７の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む（ＶＨ若しくはＶＬフレームワーク領域又は定常領域において、そのような二重特異性抗体の特異的結合特性及び定常領域の特性に影響を及ぼすことなくアミノ酸が置換されている）。
本発明の具体的な実施形態は、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、配列番号８４の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８５の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８６の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号８７の配列と少なくとも９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、
該二重特異性抗体は、以下の１つ以上の特性を有する：
二重特異性抗体は、以下を示す。
ａ）ＨＬＡ－ＧへのＩＬＴ２及び／若しくはＩＬＴ４の結合の阻害（実施例１０を参照されたい）、並びに／又は
ｂ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）でトランスフェクトしたＳＫＯＶ３細胞上及び／若しくは内因性ＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ３細胞上でのＴ細胞による抗体媒介ＩＦＮガンマ分泌（ＩＦＮガンマ分泌が検出された）（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによる）（実施例１１を参照されたい）、並びに又は
ｃ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ ３ＨＬＡ－Ｇ）でトランスフェクトしたＳＫＯＶ３細胞及び／若しくは内因性ＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ３細胞に対するＴ細胞媒介性細胞傷害／腫瘍細胞殺傷（細胞傷害は、二重特異性抗体で治療した後の細胞におけるカスパーゼ８活性化を測定することによって検出された）（実施例１２を参照されたい）、並びに／又は
ｄ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）ヒト化ＮＳＧマウスでトランスフェクトしたＳＫＯＶ３ヒト卵巣癌腫を有するヒト化ＮＳＧマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性／腫瘍退縮（実施例１３を参照されたい）、及び／又は
ｅ）ヒト乳がんＰＤＸ腫瘍（ＢＣ００４）を有するヒト化ＮＳＧマウスにおけるＨＬＡ－Ｇ ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性／腫瘍（実施例１４を参照されたい）。
更に具体的な実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号８４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号８６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
Ｆｃドメイン
特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。二重特異性抗体に関連して本明細書に記載されるＦｃドメインの特徴は、Ｆｃヘテロ二量体化に関連する修飾を除いて、本発明の単一特異性抗ＨＬＡＧ抗体に含まれるＦｃドメインに等しく適用され得ることが理解される。
二重特異性抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、ダイマーであり、それぞれのサブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は１つを超えるＦｃドメインを含まない。
一実施形態では、二重特異性抗体のＦｃドメインはＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング）。このアミノ酸置換は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を低減する（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照されたい）。更に特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。更により特定的な実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明による二重特異性抗体は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合し得る異なる抗原結合部分を含み、したがってＦｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え同時発現及びその後の二量化によって、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組換え産生における二重特異性抗体の収率及び純度を改善するため、二重特異性抗体のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利である。
したがって、特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も長いタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一実施形態では、当該修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
ヘテロ二量体化を強化するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中の修飾に複数の手法が存在し、それらは例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に十分に記載されている。典型的には、全てのそのような手法において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは、両方とも、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）がもはやそれ自体とホモ二量体化することができず、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化させるような（第１及び第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量体化し、２つの第１又は２つの第２のＣＨ３ドメインの間にホモ二量体が形成されないような）、相補的な様式で操作される。改善された重鎖ヘテロ二量体化のためのこれらの異なる手法は、重鎖／軽鎖の誤対合及びベンス・ジョーンズ型副生成物を低減する、二重特異性抗体における重鎖－軽鎖修飾との組み合わせでの異なる代替例として考慮される（例えば、１つの結合アームにおけるＶＨ及びＶＬの交換／置き換え、並びにＣＨ１／ＣＬ界面における反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）。
具体的な実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」修飾と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他の１つに「ホール」修飾とを含む。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載される。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある対応する空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。
したがって、特定の実施形態では、二重特異性抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換わり、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置換え可能である。
好ましくは、より大きな側鎖量を有する当該アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。
好ましくは、より小さな側鎖量を有する当該アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。
突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作り出すことができる。
具体的な実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、位置３６６のトレオニン残基が、トリプトファン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメイン（「ホール」サブユニット）の第２のサブユニット（のＣＨ３ドメイン）において、位置４０７のチロシン残基は、バリン残基と置き換わっている（Ｙ４０７Ｖ）。一実施形態では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３６６のトレオニン残基が、セリン残基と置き換わっており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基が、アラニン残基と置き換わっている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
なお更なる実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｓ３５４Ｃ）か、又は位置３５６のグルタミン酸残基が、システイン残基と置き換わっており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基と置き換わっており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換わっている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの間にジスルフィド架橋の形成が生じ、二量体が更に安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
特定の実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
特定の実施形態では、第２の抗原（例えば、活性化Ｔ細胞抗原）に結合する抗原結合部分は、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含む）に融合（任意に、ＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及び／又はペプチドリンカーを介して）される。理論に拘束されることを望むものではないが、第２の抗原（例えば、活性化Ｔ細胞抗原）に結合する抗原結合部分の、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットへの融合は、活性化Ｔ細胞抗原に結合する２つの抗原結合部分を含む抗体の生成を（更に）最小限に抑える（２つのノブ含有ポリペプチドの立体衝突）。
ヘテロ二量体化を強化するＣＨ３修飾のための他の技術が本発明による代替例として考慮され、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されている。
一実施形態では、欧州特許第１８７０４５９号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置における反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づく。本発明の二重特異性抗体の好ましい一実施形態は、（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインの一方におけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他方におけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
別の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、追加的に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
別の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むか、又は当該二重特異性抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、追加的に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋを含む（全てＫａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一実施形態では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、更なるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。更なる実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、更に、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅ（好ましくはＬ３６８Ｅ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）から選択されるアミノ酸変異を含む。
一実施形態では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０又はＫ３９２にある更なるアミノ酸変異、例えば、（ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、（ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、（ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ又はＳ４００Ｋ、（ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、（ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、（ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。更なる実施形態では、第２のＣＨ３ドメインは、更に、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一実施形態では、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されるヘテロ二量化手法が代わりに使用され、例えば、３６８及び４０９からなる群から選択される位置にアミノ酸改変を有する（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一実施形態では、上に記載するホールにノブを入れる技術も使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されるヘテロ二量化手法が、代わりに使用される。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ｔを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
一実施形態では、二重特異性抗体又はそのＦｃドメインは、ＩｇＧ２サブクラスのものであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。
代替的な実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、ＰＣＴ国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるように、静電操縦効果に介在する修飾を含む。一般的に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの界面に、ホモ二量体生成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量化が静電的に望ましいように、帯電したアミノ酸残基による１つ以上のアミノ酸残基の置き換えを含む。そのような一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、Ｋ３９２又はＮ３９２の負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）によるアミノ酸置換を含み、第２のＣＨ３ドメインは、Ｄ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６又はＥ３５７の正に帯電したアミノ酸によるアミノ酸置換（例えば、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ又はＥ３５７Ｋ、より好ましくはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）を含む。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、更に、Ｋ４０９又はＲ４０９の負に帯電したアミノ酸によるアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）を含む。更なる実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、更に、又はこれに代えて、Ｋ４３９及び／又はＫ３７０の負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））（全てＫａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）によるアミノ酸置換を含む。
なお更なる実施形態では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用する。一実施形態では、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ及びＫ２９２Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
更に別の実施形態では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されるヘテロ二量体化手法を代わりに使用してもよい。
一実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクタ機能を下げるＦｃドメイン修飾
Ｆｃドメインは、二重特異性抗体（又は抗体）に、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期を含む好ましい薬物動態特性及び好ましい組織血液分布比を付与する。しかしながら、それは同時に、好ましい抗原担持細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞への（二重特異性）抗体（又は抗体）の望ましくない標的化をもたらすことがある。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン分泌／放出をもたらすことがあり、これはＴ細胞活性化特性（例えば、第２の抗原結合部分が活性化Ｔ細胞抗原に結合する、二重特異性抗体の実施形態では）及び二重特異性抗体の長い半減期と組み合わさって、全身投与するとサイトカイン受容体の過剰な活性化及び重篤な副作用を生じる。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体を有する）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によるＴ細胞の潜在的破壊のため、二重特異性抗体（特に、第２の抗原結合部分が活性化Ｔ細胞抗原に結合する二重特異性抗体）の有効性を低下させることさえある。
したがって、特定の実施形態では、本発明による二重特異性抗体のＦｃドメインは、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及び／又はエフェクタ機能の低減を呈する。そのような一実施形態では、Ｆｃドメイン（又は当該Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体）は、ネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む抗体）と比較して、５０％未満、特に２０％未満、より具体的には１０％未満、とりわけ５％未満の結合親和性をＦｃ受容体に示す、及び／又はネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメインドメイン（又はネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む抗体）と比較して、５０％未満、特に２０％未満、より具体的には１０％未満、とりわけ５％未満のエフェクタ機能を示す。一実施形態では、Ｆｃドメインドメイン（又は当該Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない及び／又はエフェクタ機能を誘導しない。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施形態では、エフェクタ機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される１つ以上である。特定の実施形態では、エフェクタ機能はＡＤＣＣである。一実施形態では、Ｆｃドメインドメインは、ネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメインドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に実質的に同様の結合親和性を示す。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は当該Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体）が、ネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体）の約７０％超、特に約８０％超、より特には約９０％超の結合親和性をＦｃＲｎに対して呈するとき、達成される。
特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性が低下し、及び／又はエフェクタ機能が低下するように操作される。特定の実施形態では、二重特異性抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクタ機能を下げる１つ以上のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、同じ１つ以上のアミノ酸変異が存在する。一実施形態では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を下げる。一実施形態では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に下げる。Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を下げる１つより多いアミノ酸変異が存在する実施形態では、これらのアミノ酸変異の組み合わせが、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、又は更に少なくとも５０分の１まで下げてもよい。一実施形態では、操作Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体は、非操作Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体と比較して、２０％未満、特に１０％未満、より特には５％未満の結合親和性をＦｃ受容体に対して呈する。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も特定的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらそれぞれの受容体に対する結合が低下する。いくつかの実施形態では、相補性構成要素に対する結合親和性（特定的にはＣ１ｑに対する結合親和性）も低下する。一実施形態では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は、低下しない。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合、すなわち、当該受容体へのＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は当該Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体）が、Ｆｃドメインの非操作形態（又は当該Ｆｃドメインの非操作形態を含む二重特異性抗体）の結合親和性の約７０％超をＦｃＲｎ対して呈するとき、達成される。Ｆｃドメイン又は当該Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体は、そのような親和性の約８０％超、更には約９０％超を呈し得る。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体のＦｃドメインは、非操作Ｆｃドメインと比較して、エフェクタ機能が低減されるように操作される。エフェクタ機能の低減として、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞への結合の低減、マクロファージへの結合の低減、単球への結合の低減、多形核細胞への結合の低減、直接的なシグナル伝達誘導性アポトーシスの低減、標的結合抗体の架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの１つ以上を挙げることができるが、これらに限定されない。一実施形態では、エフェクタ機能の低下は、ＣＤＣの低下、ＡＤＣＣの低下、ＡＤＣＰの低下及びサイトカイン分泌の低下の群から選択される１つ以上である。特定の実施形態では、低下したエフェクタ機能は、低下したＡＤＣＣである。一実施形態では、ＡＤＣＣの低減は、操作されていないＦｃドメイン（又は操作されていないＦｃドメインを含む二重特異性抗体）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
一実施形態では、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクタ機能を下げるアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。そのような一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含む。より具体的な実施形態では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）である。一実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。より具体的な実施形態では、更なるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５のアミノ酸置換（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。より特定的な実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）。具体的には、特定の実施形態では、Ｆｃドメインのそれぞれのサブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリング）を含み、すなわち、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットそれぞれにおいて、位置２３４のロイシン残基が、アラニン残基（Ｌ２３４Ａ）と置き換わっており、位置２３５のロイシン残基が、アラニン残基（Ｌ２３５Ａ）と置き換わっており、位置３２９のプロリン残基が、グリシン残基（Ｐ３２９Ｇ）と置き換わっている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
そのような一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（同様に補体）結合をほとんど完全に消滅させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号は、そのような変異Ｆｃドメインの調製方法及びその特性、例えばＦｃ受容体結合又はエフェクタ機能を決定するための方法も記載する。
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及びエフェクタ機能の低減を呈する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の（二重特異性）抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである。一実施形態では、ＩｇＧ４Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。Ｆｃ受容体及び／又はそのエフェクタ機能に対する結合親和性を更に低下させるために、一実施形態では、ＩｇＧ４Ｆｃドメインは、位置Ｌ２３５にアミノ酸置換を含み、特定的には、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。別の実施形態では、ＩｇＧ４Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、特定的には、アミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。特定の実施形態では、ＩｇＧ４Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９にアミノ酸置換を含み、特異的には、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。そのようなＩｇＧ４ Ｆｃドメイン変異体及びこれらのＦｃγ受容体結合特性は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。
特定の実施形態では、ネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクタ機能の低下を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）。
突然変異型Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を用い、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等を含んでいてもよい。正しいヌクレオチド変化は、例えば、スクリーニングによって確認することができる。
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の標準的な装置と組換え発現によって得られ得るＦｃ受容体を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。代替的に、Ｆｃ受容体に関するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む（二重特異性）抗体の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価してもよい。
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む（二重特異性）抗体のエフェクタ機能は、当技術分野に既知の方法によって測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））。そのようなアッセイに有用なエフェクタ細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば動物モデル、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されているものにおいてｉｎ ｖｉｖｏで評価されてもよい。
いくつかの実施形態では、相補性構成要素に対する（特定的にはＣ１ｑに対する）Ｆｃドメインの結合が低下する。したがって、Ｆｃドメインが低減されたエフェクタ機能を有するように操作されるいくつかの実施形態では、当該低減されたエフェクタ機能は、低減されたＣＤＣを含む。Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む二重特異性抗体がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施してもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２、１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １０１、１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ １０３、２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。
ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定は、当該技術分野に既知の方法を使用して実施することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照されたい）。
更なる態様では、上記の実施形態のいずれかによる抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、以下の１～６項に記載される特徴のうちのいずれかを、単独又は組み合わせで組み込み得る。
１．抗体親和性
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数ＫＤを有する。
好ましい一実施形態では、ＫＤは、約１０応答単位（ＲＵ）の固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示に従って、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を用いて抗原を５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）になるまで希釈した後に、５μＬ／分の流速で注入して、およそ１０応答単位（ＲＵ）のカップリングしたタンパク質を得る。抗原の注入に続いて、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応基をブロックする。動態測定のため、Ｆａｂの二倍連続希釈物（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中に２５℃で約２５μｌ／分の流速で注入する。会合速度（ｋｏｎ又はｋａ）及び解離速度（ｋｏｆｆ又はｋｄ）を、会合センサグラム及び解離センサグラムを同時に適合することによって、単純１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ バージョン３．２）を使用して計算する。平衡解離定数ＫＤは、ｋｄ／ｋａ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３（１９９９）８６５－８８１を参照されたい。上述の表面プラズモン共鳴アッセイによりオン速度が１０６Ｍ－１ ｓ－１を超える場合、オン速度を、ストップフローを装備した分光測色計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを有する８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光測色計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計で測定される抗原の増加した濃度の存在下でＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加又は減少を測定する蛍光クエンチ技法を使用することによって決定することができる。
２．抗体断片
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び以下に記載する他の断片が挙げられるがこれらに限定されない。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）１２９－１３４を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｉｎ；Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４），ｐｐ．２６９－３１５、また国際公開第９３／１６１８５号、並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許第０ ４０４ ０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）１２９－１３４、及びＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）６４４４－６４４８を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３９ １２９－１３４）においても記載されている。
シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号Ｂ１を参照されたい）。
抗体断片は、本明細書に記載されているように、インタクトな抗体のタンパク質分解消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はファージ）による生産を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができる。
３．キメラ抗体及びヒト化抗体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）６８５１－６８５５に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類に由来する可変領域）とヒト定常領域を含む。更なる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のそれらから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
ある特定の実施形態では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体が、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体由来であり、かつＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列由来である１つ以上の可変ドメインを含む。任意に、ヒト化抗体はまた、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復するか、又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
ヒト化抗体及びその作製方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｊ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３（２００８）１６１９－１６３３に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３－３２９；Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）１００２９－１００３３；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１、及び同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）２５－３４（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフト化を記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（１９９１）４８９－４９８（「リサーフェシング」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）４３－６０（「ＦＲシャッフリング」を記載）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６（２００５）６１－６８ ａｎｄ Ｋｌｉｍｋａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８３（２０００）２５２－２６０（ＦＲシャッフリングに対する「ガイド選択」アプローチを記載）に更に記載されている。
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、これらに限定されないが、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（１９９３）２２９６－２３０８を参照されたい；軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１９９２）４２８５－４２８９；及びＰｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（１９９３）２６２３－２６３２）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｊ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３（２００８）１６１９－１６３３を参照されたい）；及びＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９９７）１０６７８－１０６８４ ａｎｄ Ｒｏｓｏｋ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１９９６９ ２２６１１－２２６１８を参照されたい）が含まれる。
４．ヒト抗体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５（２００１）３６８－３７４ ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０（２００８）４５０－４５９に記載されている。
ヒト抗体は、免疫原を、インタクトなヒト抗体又は抗原性チャレンジに応答してヒト可変領域を有するインタクト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に投与することによって調製されてもよい。そのような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わるか、又は染色体外に存在するか、又は動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有する。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（２００５）１１１７－１１２５を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する米国特許第６，０７５，１８１号及び米国特許第６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号；及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。そのような動物によって生成されたインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、更に改変されてもよい。
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｄ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３（１９８４）３００１－３００５；Ｂｒｏｄｅｕｒ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７），ｐｐ．５１－６３；及びＢｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）８６－９５を参照されたい）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して作製されたヒト抗体は、Ｌｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３（２００６）３５５７－３５６２に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載する）、及びＮｉ，Ｊ．，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ ２６（２００６）２６５－２６８（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載する）を含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ，Ｈ．Ｐ．ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｓ．，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２０（２００５）９２７－９３７及びＶｏｌｌｍｅｒｓ，Ｈ．Ｐ．ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２７（２００５）１８５－１９１にも記載されている。
ヒト抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても作製され得る。その後、そのような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせられ得る。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。
５．ライブラリ由来の抗体
本発明の抗体は、１つ以上の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８（２００１）１－３７に概説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８（１９９０）５５２－５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２（１９９１）６２４－６２８；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９２）５８１－５９７；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８（２００３）１６１－１７５；Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２００４）２９９－３１０；Ｌｅｅ，Ｃ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（２００４）１０７３－１０９３；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｆ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（２００４）１２４６７－１２４７２；及びＬｅｅ，Ｃ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（２００４）１１９－１３２に更に記載されている。
ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローニングされ、ファージライブラリ中でランダムに再結合され、次いで、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（１９９４）４３３－４５５に記載されているように抗原結合ファージのスクリーニングを行うことができる。ファージは、典型的には、抗体断片を一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片のいずれかとしてディスプレイする。免疫源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。代替的に、ナイーブレパートリは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１２（１９９３）７２５－７３４によって記載されているように、免疫化を行わずに、広範囲の非自己抗原及びまた自己抗原に対する抗体の単一の供給源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブライブラリは、幹細胞から再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダムな配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、非常に可変的なＣＤＲ３領域をコードし、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７（１９９２）３８１－３８８に記載されているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再配列を達成することによって、合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリについて記載する特許公報としては、例えば：米国特許第５，７５０，３７３号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書ではヒト抗体又はヒト抗体断片とみなされる。
６．抗体変異体
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適正な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製されてもよい。そのような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせは、最終構築物が、所望の特徴（例えば、抗原結合）を有する限り、最終構築物に到達するように行うことができる。
ａ）置換、挿入及び欠失変異体
ある特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発のための目的の部位には、ＣＤＲ及びＦＲが含まれる（好ましい実施形態では、抗体の結合特性に関連しないフレームワーク残基である（例えば、Ｆｏｏｔｅ Ｊ．ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９２）２２４，４８７－４９９を参照されたい））。例示的な変化は、表１において、「例示的な置換」という見出しの下に提供され、またアミノ酸側鎖クラスを参照して以下に更に記載されている通りである。保存的置換は、表１において、「好ましい置換」の見出しの下に示される。アミノ酸置換が目的とする抗体に導入され、生成物が所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低減、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされ得る。

表１
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類され得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うであろう。
１つのタイプの置換変異体は、親抗体の１つ以上のＣＤＲを置換することを含む（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）。一般に、更なる試験ために選択される結果として生じる変異体（複数可）は、親抗体と比較して特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）の修正（例えば、改善）を有し、かつ／又は実質的に保持された親抗体の特定の生物学的特性を有する。例示的な置換変異体は、親和性成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して、簡便に生成され得る。簡単に言えば、１つ以上のＣＤＲ残基が変異され、そしてファージ上に表示された変異体抗体が、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）のためにスクリーニングされる。
抗体親和性を向上させるために、例えば、ＣＤＲにおいて改変（例えば、置換）を行ってもよい。そのような改変は、ＣＤＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７（２００８）１７９－１９６）、及び／又はＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）において行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリの構築及び二次ライブラリからの再選択による親和性成熟は、例えばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８（２００２）１－３７のＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、多様性が、様々な方法（例えば、エラー－プローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のうちのいずれかによって、成熟させるために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリが作製される。次いで、このライブラリをスクリーニングして、所望の親和性を有する抗体変異体を同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、一度に４～６残基）がランダム化されるＣＤＲ指向手法を含む。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニン走査突然変異誘発又はモデル化を用いて、特異的に同定され得る。特にＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３が標的とされることが多い。
ある特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ以上のＣＤＲ内で起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保守的な改変（例えば、本明細書で提供されるような保守的な置換）は、ＣＤＲにおいて行われてもよい。そのような変更は、ＣＤＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの範囲外であり得る。上記で提供された変異体ＶＨ及びＶＬ配列の特定の実施形態では、各ＣＤＲは、改変されていないか、又は１以上、２以上、又は３以上のアミノ酸置換を含まない。
突然変異誘発を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４（１９８９）１０８１－１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基又は標的残基群（例えば、荷電残基、例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕ）が同定され、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。あるいは、又は加えて、抗体と抗原との間の接点を特定するための抗原－抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は除去されてもよい。変異体は、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。
アミノ酸配列挿入には、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに１個又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体のＮ末端又はＣ末端と酵素（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドとの融合が含まれる。
ｂ）Ｆｃ領域変異体
ある特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾が本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それにより、Ｆｃ領域変異体が生成され得る。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置でアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでいてもよい。
エフェクタ機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９において１つ以上の置換を含むものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ突然変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ突然変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ＦｃＲに対する結合が改善又は減少したある特定の抗体変異体が記載される。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、国際公開第２００４／０５６３１２号及びＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４。を参照されたい）
本発明の一実施形態では、そのような抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するか、又は突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１である。別の実施形態では、又は突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ、又はＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ若しくはＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ４（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１のＥＵインデックスによるナンバリング）
半減期が長くなり、新生児Ｆｃ受容体に対する結合が向上した抗体は、胎児に対する成熟ＩｇＧの移動を担い（Ｇｕｙｅｒ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７（１９７６）５８７－５９３及びＫｉｍ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）２４２９－２４３４）、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有する変異体を含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。
Ｆｃ領域変異体の他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２２（１９８８）７３８－７４０；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。
ｃ）システイン操作抗体変異体
ある特定の実施形態では、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されているシステイン人工抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作成することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換残基は、抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書に更に記載されるように、抗体を薬物部位又はリンカー薬物部位等のような他の部位に抱合して免疫抱合体を作製するために使用することができる。ある特定の実施形態では、任意の１つ以上の下記の残基が、システインで置換されていてもよい。軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成され得る。
ｄ）抗体誘導体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で公知であり、容易に入手可能な更なる非タンパク質性部分を含有するように更に改変され得る。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。このポリマーは、任意の分子量を有していてもよい、分岐していてもよい、又は分岐していなくてもよい。抗体に接続するポリマーの数は変化し得て、１つを超えるポリマーが接続する場合、ポリマーは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定するものではないが、改良される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下で治療に使用されるかどうか等の考慮事項に基づいて決定することができる。
別の実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る抗体及び非タンパク質性部分の抱合体が提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ，Ｎ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２（２００５）１１６００－１１６０５）。放射線は、任意の波長を有していてもよく、限定されないが、通常の細胞に有害ではないが、非タンパク質性部分を、抗体非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅する温度まで加熱する波長を含む。
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される組換え法及び組成物を使用して生成されてもよい。一実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＬＡ－Ｇ抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又は抗体のＶＨを構成するアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードしていてもよい。更なる実施形態では、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施形態では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態では、宿主細胞は、（例えば、形質転換された）以下を含む：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸と、抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクターと、抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターとを含むベクター。好ましい一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は二重特異性抗体を作製する方法であって、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意に、抗体を宿主細胞（又は宿主細胞培養物）から回収することとを含む、方法が提供される。
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の組換え産生のために、例えば、上述のもの等の抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために、１つ以上のベクター中に挿入される。そのような核酸は、従来の手順（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）を使用して容易に単離され、配列決定され得る。
本明細書に記載の抗体をコードするベクター真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞のクローニング又は発現に最も適した宿主細胞。
脊椎動物細胞を宿主として使用してもよい。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６（１９７７）５９－７４）に記載されるような２９３細胞又は２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ、Ｊ．Ｐ．、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３－２５２）に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４－６８、ＭＲＣ ５細胞及びＦＳ４細胞である。ほとんどの有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６－４２２０）、及び、骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｗｕ，Ａ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００４），ｐｐ．２５５－２６８を参照されたい。
ある程度まで、原核細胞も使用することができるが、時にはより高い努力及びより複雑な手順が可能である。細菌中の抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号及び米国特許第５，８４０，５２３号を参照されたい。（また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における抗体断片の発現を記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｋ．Ａ．，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照されたい）発現後、本発明の抗体は、細菌細胞ペーストから可溶性画分で単離されてもよく、更に精製されてもよい。
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載）を参照されたい。
Ｃ．アッセイ
本明細書に提供される抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物活性について、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって、特定され得るか、スクリーニングされ得るか、又は特徴付けられ得る。
１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、本発明の抗体を、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット等の公知の方法によって、その抗原結合活性について試験する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｅ．（ｅｄ．），Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９６）において提供される。
２．活性アッセイ
一態様では、生物学的活性を有するその抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を特定するためのアッセイが提供される。生物学的活性には、例えば、Ｔ細胞を含む異なる免疫細胞の活性化及び／又は増殖を増強する能力が含まれ得る。例えば、それらは免疫調節性サイトカイン（例えば、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－ガンマ）及び／又は腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ））の分泌を増強する。増強されるか又は増強され得る他の免疫調節サイトカインは、例えば、異なる細胞型に結合するＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ１２、グランザイムＢ等である。ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏでそのような生体活性を有する抗体も提供される。
ある特定の実施形態では、例えば以下の実施例に記載されているように、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。
Ｄ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗ＨＬＡ－Ｇ抗体はいずれも、生体試料中のＨＬＡ－Ｇの存在の検出に有用である。本明細書で使用される「検出」という用語は、定量的又は定性的な検出を包含する。ある特定の実施形態では、生物学的試料は、免疫細胞、又はＴ細胞浸潤物及び又は腫瘍細胞等の細胞若しくは組織を含む。
一実施形態では、診断又は検出の方法で使用するための抗ＨＬＡ－Ｇ抗体が提供される。更なる態様では、生物学的試料中のＨＬＡ－Ｇの存在を検出する方法が提供される。ある特定の実施形態では、上記方法は、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＨＬＡ－Ｇへの結合を許容する条件下で、生物学的試料を本明細書に記載の抗ＨＬＡ－Ｇ抗体と接触させること、及び抗ＨＬＡ－Ｇ抗体とＨＬＡ－Ｇとの間に複合体が形成されるかどうかを検出することを含む。そのような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法又はｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。一実施形態では、例えば、ＨＬＡ－Ｇが患者の選択のためのバイオマーカである場合、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を使用して、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体での療法に適格な対象を選択する。
ある特定の実施形態では、標識化抗ＨＬＡ－Ｇ抗体が提供される。ラベルには、直接検出されるラベル又は部位（例えば、蛍光ラベル、発色性ラベル、電子密度ラベル、化学発光ラベル、放射性ラベル等）、及び酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される部位（例えば、酵素又はリガンド等）が含まれるが、これらに限定されるものではない。例示的なラベルには、以下のものが含まれる：放射性同位元素３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体のようなフルオロフォア、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ルシフェラーゼ、例えば ホタルルシフェラーゼ及び細菌性ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼのような複素環オキシダーゼ、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼのような色素前駆体を酸化するために過酸化水素を用いる酵素、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定したフリーラジカル、及びそのようなものと結合したもの。
Ｅ．医薬製剤
本明細書に記載の抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の薬学的製剤は、所望の純度を有するそのような抗体を１つ以上の任意の薬学的に許容され得る担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ．）（１９８０））と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製される。薬学的に許容され得る担体は、一般的に、採用される用量及び濃度において受領者に無毒であり、以下を含むが、これらに限定されるものではない：リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリ（ビニルピロリドン）等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸。単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトールのような糖類；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤。ここにおける例示的な薬学的に許容され得る担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質等の介在性薬物分散剤を更に含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ｒｈｕＰＨ２０を含め、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と組み合わせる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されるものが挙げられ、後者の製剤は、酢酸ヒスチジン緩衝液を含む。
本明細書の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要に応じて２以上の活性成分を含んでもよく、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含んでもよい。例えば、更に提供することが望ましい場合がある。そのような有効成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。
有効成分は、例えば、コアセルベーション技法によって、又は界面重合、例えば、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにおいて、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルによって調製されたマイクロカプセル内に封入することができる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ．）（１９８０）に開示されている。
徐放性調製物を調製してもよい。持続放出調製物の好適な例としては、本抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、又はマイクロカプセルの形態である。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は一般に、滅菌される。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成され得る。
Ｆ．治療方法及び組成物
本明細書中に提供される抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体のいずれかは、治療方法において使用され得る。
一態様では、医薬として使用するための抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。更なる態様では、がんの治療に使用するための抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。ある特定の実施形態では、治療の方法で使用するための抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体が提供される。ある特定の実施形態では、本発明は、有効量の抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を個体に投与することを含む、がんを有する個体を治療する方法において使用するための抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。
更なる実施形態では、本発明は、例えば、ＴＮＦアルファ（ＴＮＦａ）及びＩＦＮガンマ（ＩＦＮｇ）等の免疫賦活性サイトカインの分泌、又は免疫細胞の更なる動員によって、免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び単球、マクロファージ、樹状細胞、形質細胞様樹状細胞を含む骨髄系細胞のような）の増殖及び／又は活性化を直接的又は間接的に誘導するための、免疫調節剤として使用するための抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、免疫調節／又は免疫細胞の増殖、例えばＴＮＦａ及びＩＦＮガンマのような免疫賦活性サイトカインの分泌による活性化、又は免疫細胞の更なる動員を直接的又は間接的に誘導するために有効な抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を個体に投与することを含む、免疫調節剤の方法／個体における免疫細胞の増殖、例えばＴＮＦａ及びＩＦＮガンマのような免疫賦活性サイトカインの分泌による活性化、又は更なる免疫細胞の動員を直接的又は間接的に誘導する方法において使用するための抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。
更なる実施形態では、本発明は、免疫賦活剤として使用するための／又は腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）分泌を刺激するための、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、免疫細胞の増殖、例えばＴＮＦａ及びＩＦＮｇのような免疫賦活性サイトカインの分泌による活性化、又は免疫細胞の更なる動員を直接的又は間接的に誘導するために有効な抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を個体に投与することを含む、個体における免疫細胞の増殖、例えばＴＮＦａ及びＩＦＮｇのような免疫賦活性サイトカインの分泌による活性化、又は免疫細胞の更なる動員を直接的又は間接的に誘導するための免疫調節方法において使用するための抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を提供する。
本明細書で使用される「がん」という用語は、例えば、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、肺細気管支肺胞がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部若しくは頸部のがん、皮膚若しくは眼内の黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰の癌腫、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌腫、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形膠芽細胞腫、星細胞種、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮がん、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ球性白血病（上述のがんのいずれかの難治性態様を含む）、又は上述のがんの１つ以上の組み合わせであってもよい。
上記の実施形態のいずれかによる「個体」は、好ましくはヒトである。更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の使用を提供する。一実施形態では、医薬は、がんの治療のためのものである。更なる実施形態では、医薬は、がんを治療する方法であって、がんを有する個体に有効量の医薬を投与することを含む方法における使用のためのものである。更なる実施形態では、医薬は、がん細胞の細胞媒介性溶解を誘導するためのものである。更なる実施形態では、医薬は、がんに罹患している個体においてがん細胞の細胞媒介性溶解を誘導する方法において使用するためのものであり、がん細胞におけるアポトーシスを誘導するために／又はがん細胞増殖を阻害するために有効な量の医薬を個体に投与することを含む。上記の実施形態のいずれかに従った「個体」は、ヒトであってもよい。
更なる一態様では、本発明は、がんを治療するための方法を提供する。一実施形態では、上記方法は、有効量の抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を、がんを有する個体に投与することを含む。上記の実施形態のいずれかに従った「個体」は、ヒトであってもよい。
更なる態様では、本発明は、がんに罹患している個体においてがん細胞の細胞媒介性溶解を誘導する方法を提供する。一実施形態では、上記方法は、がんに罹患している個体においてがん細胞の細胞媒介溶解を誘導するために、有効量の抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を個体に投与することを含む。一実施形態では、「個体」は、ヒトである。
更なる態様では、本発明は、例えば上記の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書で提供される抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体のいずれかを含む医薬製剤を提供する。一実施形態では、薬学的製剤は、本明細書中に提供される抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体のいずれかと、薬学的に許容され得る担体とを含む。
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療のために望まれる場合、病変内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口輸液には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。投薬は、任意の適切な経路によるもの、例えば、一部には、投与が一時的であるか慢性的であるかに依存して、注射によって、例えば、静脈又は皮下への注射によるものであってもよい。単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス輸注を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図される。
本発明の抗体は、良好な医療行為と一致した方法で製剤化され、投与され、投与されるであろう。これに関連して考慮すべき要因としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。抗体は、必ずしもそうである必要はないが、任意に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに製剤化される。有効量のそのような他の作用物質は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、及び上述の他の要因に依存する。これらは、一般に、ここに記載されている投与量と同じ投与量で、又はここに記載されている投与量の約１～９９％、又は経験的／臨床的に適切であると判断される任意の投与量で、及び任意の投与経路で使用される。
疾患の予防又は治療について、本発明の抗体の適切な投薬量は（単独で、又は１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴及び抗体への応答、並びに主治医の裁量に依存するだろう。本発明の抗体は、好適には、患者に一度に又は一連の治療にわたって投与される。疾患の種類及び重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体を、例えば、１回以上の別個の投与によるか、又は連続的な注入によるかにかかわらず、患者に投与するための初期の候補投薬量とすることができる。典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、治療は通常、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ以上の用量が、患者に投与され得る。そのような用量は、間欠的に、例えば、毎週又は３週間に１回（例えば、患者が約２～約２０回、又は例えば、約６回用量の抗体を受けるように）投与され得る。最初の多めの投与量、それに続く１回以上の量の少ない用量を投与してよい。例示的な投薬レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量、続いて約２ｍｇ／ｋｇの抗体の毎週の維持用量を投与することを含む。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であってもよい。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
上記の製剤又は治療方法のいずれかは、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の代わりに、又はそれに加えて、本発明の免疫抱合体を使用して実施され得ることが理解される。
上記の製剤又は治療方法のいずれかは、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体又は抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の代わりに、又はそれに加えて、本発明の免疫抱合体を使用して実施され得ることが理解される。
ＩＩ．製造物品
本発明の別の態様では、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器上の又は容器に関連付けられたラベル又は添付文書を含む。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、静注溶液袋等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、状態を治療、予防、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と単独で又は組み合わせて使用される組成物を保持し、無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される病態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造物品は、（ａ）組成物を含む第１の容器を含み、この組成物は本発明の抗体を含み、（ｂ）組成物を含む第２の容器を含み、この組成物は細胞疾患性又は他の治療剤を更に含む。製造物品は、本発明のこの実施形態では、その組成物を特定の状態を治療するために使用可能であることを示すパッケージ添付文書を更に備えていてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、製造物品は、薬学的に許容され得る緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、注射器等、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
以下の実施例及び図は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の思想から逸脱することなく、定められた手順に変更を加えることができると理解される。
アミノ酸配列の説明
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体／抗原結合部分（可変領域の配列番号及び補体決定領域（ＣＤＲ））：
配列番号１ 重鎖ＣＤＲ－Ｈ１、ＨＬＡ－Ｇ－００９０
配列番号２ 重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、ＨＬＡ－Ｇ－００９０
配列番号３ 重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、ＨＬＡ－Ｇ－００９０
配列番号４ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ－００９０
配列番号５ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、ＨＬＡ－Ｇ－００９０
配列番号６ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３、ＨＬＡ－Ｇ－００９０
配列番号７ 重鎖可変ドメインＶＨ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０
配列番号８ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０
配列番号９ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｎ３１Ｄ
配列番号１０ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｎ３１Ｄ
配列番号１１ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｎ３１Ｌ
配列番号１２ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｎ３１Ｌ
配列番号１３ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｎ３１Ｑ
配列番号１４ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｎ３１Ｑ
配列番号１５ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｎ３１Ｓ
配列番号１６ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｎ３１Ｓ
配列番号１７ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｎ３１Ｔ
配列番号１８ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｎ３１Ｔ
配列番号１９ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｎ３１Ｙ
配列番号２０ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｎ３１Ｙ
配列番号２１ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｎ３１Ｙ－Ｎ３８Ｙ
配列番号２２ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｎ３１Ｙ－Ｎ３８Ｙ
配列番号２３ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ
配列番号２４ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ
配列番号２５ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ａ
配列番号２６ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ａ
配列番号２７ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ｄ
配列番号２８ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ｄ
配列番号２９ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ｐ
配列番号３０ 軽鎖可変ドメインＶＬ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ｐ
更なる配列
配列番号３１ 例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ
配列番号３２ 例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
配列番号３３ 例示的なヒトβ２Ｍ
配列番号３４ 改変ヒトＨＬＡ－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸はＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸（＝デグラフト化ＨＬＡ－Ｇも図１を参照されたい）ＥＣＤによって置換されている）
配列番号３５ 例示的ヒトＨＬＡ－Ａ２
配列番号３６ 例示的なヒトＨＬＡ－Ａ２ ＥＣＤ
配列番号３７ 例示的なマウスＨ２Ｋｄ ＥＣＤ
配列番号３８ 例示的なラットＲＴ１Ａ ＥＣＤ
配列番号３９ 例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号４０ 例示的な改変ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸はＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸（＝デグラフト化ＨＬＡ－Ｇ）によって置き換えられている、図２も参照されたい）
配列番号４１ 例示的なマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号４２ ヒトＨＬＡ－Ｇに特異的な位置がマウスＨ２Ｋｄフレームワークにグラフトされた例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ／マウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号４３ 例示的なラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号４４ ヒトＨＬＡ－Ｇに特異的な位置がラットＲＴ１Ａフレームワークにグラフトされた例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ／ラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号４５ リンカー及びｈｉｓ－Ｔａｇ
配列番号４６ ペプチド
配列番号４７ ヒトκ軽鎖定常領域
配列番号４８ ヒトλ軽鎖定常領域
配列番号４９ ＩｇＧ１由来のヒト重鎖定常領域
配列番号５０ 変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有する、ＩｇＧ１由来のヒト重鎖定常領域
配列番号５１ ＩｇＧ４由来のヒト重鎖定常領域
抗ＣＤ３抗体／抗原結合部分（可変領域及び相補性決定領域（ＣＤＲ））：
配列番号５２ 重鎖ＣＤＲ－Ｈ１、Ｐ０３５－０９３（Ｐ０３５と略す）
配列番号５３ 重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、Ｐ０３５－０９３
配列番号５４ 重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、Ｐ０３５－０９３
配列番号５５ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、Ｐ０３５－０９３
配列番号５６ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、Ｐ０３５－０９３
配列番号５７ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３、Ｐ０３５－０９３
配列番号５８ 重鎖可変ドメインＶＨ、Ｐ０３５－０９３
配列番号５９ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｐ０３５－０９３
配列番号６０ 重鎖ＣＤＲ－Ｈ１、クローン２２（Ｃｌ２２と略記）
配列番号６１ 重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、クローン２２
配列番号６２ 重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、クローン２２
配列番号６３ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、クローン２２
配列番号６４ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、クローン２２
配列番号６５ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３、クローン２２
配列番号６６ 重鎖可変ドメインＶＨ、クローン２２
配列番号６７ 軽鎖可変ドメインＶＬ、クローン２２
配列番号６８ 重鎖ＣＤＲ－Ｈ１、Ｖ９
配列番号６９ 重鎖ＣＤＲ－Ｈ２、Ｖ９
配列番号７０ 重鎖ＣＤＲ－Ｈ３、Ｖ９
配列番号７１ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１、Ｖ９
配列番号７２ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２、Ｖ９
配列番号７３ 軽鎖ＣＤＲ－Ｌ３、Ｖ９
配列番号７４ 重鎖可変ドメインＶＨ、Ｖ９
配列番号７５ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｖ９
二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体：
Ｐ１ＡＦ７９７７（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ ＣＤ３ Ｐ０３５－０９３（Ｐ０３５））：
配列番号７６ 軽鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７７
配列番号７７ 軽鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７７
配列番号７８ 重鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７７
配列番号７９ 重鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７７
Ｐ１ＡＦ７９７８（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ ＣＤ３ Ｃｌｏｎｅ ２２（Ｃｌ２２））：
配列番号８０ 軽鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７８
配列番号８１ 軽鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７８
配列番号８２ 重鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７８
配列番号８３ 重鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７８
Ｐ１ＡＦ７９７９（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ ＣＤ３ Ｖ９）：
配列番号８４ 軽鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７９
配列番号８５ 軽鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７９
配列番号８６ 重鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７９
配列番号８７ 重鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７９
更なる配列
配列番号８８ 例示的なヒトＣＤ３
配列番号８９ 例示的なカニクイザルＣＤ３
配列番号９０ ヒトＣＤ３イプシロンストーク－Ｆｃ（ノブ）－Ａｖｉ
配列番号９１ ヒトＣＤ３デルタストーク－Ｆｃ（ホール）－Ａｖｉ
配列番号９２ ＣＤ３ｏｒｉｇ ＶＨ
配列番号９３ ＣＤ３ｏｒｉｇ ＶＬ
配列番号９４ ＣＤ３ｏｒｉｇ ＩｇＧ ＨＣ
配列番号９５ Ｐ０３５ ＩｇＧ ＨＣ
配列番号９６ ＣＤ３ｏｒｉｇ／Ｐ０３５ ＩｇＧ ＬＣ
ＨＬＡ－Ｇ－００９０抗体のアミノ酸配列（下線付きの相補性決定領域（ＣＤＲ）及びＣＤＲ－Ｌ１の非修飾Ｎ－グリコシル化部位を有する可変領域（太字））：
配列番号７：重鎖可変ドメインＶＨ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＬＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＲＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＶＳＶＱＧＲＩＴＬＩＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＲＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＶＲＡＶＡＰＦＤＹＷＧＱＧＶＬＶＴＶＳＳ
抗ＣＤ３結合部分（下線付きの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する可変領域）のアミノ酸配列：
配列番号５８ 重鎖可変ドメインＶＨ、Ｐ０３５－０９３（Ｐ０３５と略す）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＡＳＮＦＰＡＳＹＶＳＹＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号５９ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｐ０３５－０９３（Ｐ０３５）
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＧＱＡＦＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号６６ 重鎖可変ドメインＶＨ、クローン２２（Ｃｌ２２と略す）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＱＦＳＳＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＨＴＴＦＰＳＳＹＶＳＹＹＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号６７ 軽鎖可変ドメインＶＬ、クローン２２（Ｃｌ２２）
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＧＱＡＦＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号７４ 重鎖可変ドメインＶＨ、Ｖ９
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴＹＮＱＫＦＫＤＲＦＴＩＳＶＤＫＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号７５ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｖ９
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体のアミノ酸配列：
Ｐ１ＡＦ７９７７（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ ＣＤ３ Ｐ０３５－０９３（Ｐ０３５））：
配列番号７６ 軽鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７７
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＡＳＮＦＰＡＳＹＶＳＹＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号７７ 軽鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７７
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＮＰＳＮＮＫＮＮＬＡＷＹＱＱＱＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＦＣＱＱＹＹＲＴＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＲＫＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号７８ 重鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７７
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＬＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＲＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＶＳＶＱＧＲＩＴＬＩＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＲＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＶＲＡＶＡＰＦＤＹＷＧＱＧＶＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＥＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＥＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
配列番号７９ 重鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７７
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＬＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＲＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＶＳＶＱＧＲＩＴＬＩＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＲＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＶＲＡＶＡＰＦＤＹＷＧＱＧＶＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＥＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＥＫＶＥＰＫＳＣＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＧＱＡＦＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
Ｐ１ＡＦ７９７８（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ ＣＤ３ Ｃｌｏｎｅ ２２（Ｃｌ２２））：
配列番号８０ 軽鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７８
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＱＦＳＳＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＨＴＴＦＰＳＳＹＶＳＹＹＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号８１ 軽鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７８
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＮＰＳＮＮＫＮＮＬＡＷＹＱＱＱＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＦＣＱＱＹＹＲＴＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＲＫＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号８２ 重鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７８
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＬＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＲＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＶＳＶＱＧＲＩＴＬＩＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＲＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＶＲＡＶＡＰＦＤＹＷＧＱＧＶＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＥＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＥＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
配列番号８３ 重鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７８
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＬＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＲＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＶＳＶＱＧＲＩＴＬＩＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＲＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＶＲＡＶＡＰＦＤＹＷＧＱＧＶＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＥＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＥＫＶＥＰＫＳＣＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＧＱＡＦＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
Ｐ１ＡＦ７９７９（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｖ９）：
配列番号８４ 軽鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７９
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＳＦＴＧＹＴＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＬＩＮＰＹＫＧＶＳＴＹＮＱＫＦＫＤＲＦＴＩＳＶＤＫＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＹＹＧＤＳＤＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号８５ 軽鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７９
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＮＰＳＮＮＫＮＮＬＡＷＹＱＱＱＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＦＣＱＱＹＹＲＴＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＲＫＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号８６ 重鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７９
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＬＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＲＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＶＳＶＱＧＲＩＴＬＩＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＲＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＶＲＡＶＡＰＦＤＹＷＧＱＧＶＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＥＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＥＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
配列番号８７ 重鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７９
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＬＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＩＳＧＤＳＶＳＳＮＲＡＡＷＮＷＩＲＱＳＰＳＲＧＬＥＷＬＧＲＴＹＹＲＳＫＷＹＮＤＹＡＶＳＶＱＧＲＩＴＬＩＰＤＴＳＫＮＱＦＳＬＲＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＶＲＡＶＡＰＦＤＹＷＧＱＧＶＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＥＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＥＫＶＥＰＫＳＣＤＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＮＴＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ
以下に、本発明の特定の実施形態を列挙する。
１．ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗体であって、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、を含む抗体。
２．抗体が、
Ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
Ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、実施形態１に記載の抗体。
３．抗体が、ヒト起源の、特にＩｇＧアイソタイプの、より詳しくはＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含む、実施形態１又は２に記載の抗体。
４．抗体が、ヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含む、ヒト起源の、特にＩｇＧアイソタイプの、より詳しくはＩｇＧ１アイソタイプの定常領域を含む、実施形態１又は２に記載の抗体。
５．抗体が、
ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む（親）抗体と比較して、最大結合（Ｒｍａｘ）及び／又は結合親和性（ＫＤ）に関して改善された結合特性を有する（実施例２に示す）、
ｂ）改変ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず、ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸がＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられており、複合体が配列番号４０を含む（実施例２に示す）、及び／又は
ｃ）配列番号４１を含むマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応しない（実施例２に示す）、及び／又は
ｄ）配列番号４３を含むラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応しない（実施例２に示す）、実施形態１～４のいずれか１つに記載の抗体。
６．抗体が、
ａ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６）へのＩＬＴ２結合を阻害する（実施例５に示す）；又は
ｂ）ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６）（で発現されるＨＬＡ－Ｇ）に結合し、ＪＥＧ－３細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６）へのＩＬＴ２結合を阻害する（実施例５に示す）、実施形態１～３のいずれか１つに記載の抗体。
７．抗体が、多重特異性抗体（好ましくは二重特異性抗体）である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の抗体。
８．抗体が、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体である、実施形態７に記載の抗体。
９．抗体がヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及びヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分を含み、
ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分は、
Ａ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
Ｂ）（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、を含み、
ヒトＣＤ３に結合するＴ細胞活性化抗原に結合する第２の抗原結合部分は、
Ｃ）（ａ）（ｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
Ｄ）（ａ）（ｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、又は
Ｅ）（ａ）（ｉ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメイン、を含む、実施形態７に記載の抗体。
１０．第１の抗原結合部分は、
Ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
Ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
第２の抗原結合部分は、
Ｃ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
Ｄ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
Ｅ）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、実施形態９に記載の二重特異性抗体。
１１．第１の抗原結合部分は、
配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
第２の抗原結合部分は、
配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、実施形態１０に記載の二重特異性抗体。
１２．第１の抗原結合部分は、
配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
第２の抗原結合部分は、
配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、実施形態１０８に記載の二重特異性抗体。
１３．第１の抗原結合部分は、
配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
第２の抗原結合部分は、
配列番号７４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、実施形態１０に記載の二重特異性抗体。
１４．二重特異性抗体は、以下を示す
ａ）ＨＬＡ－ＧへのＩＬＴ２及び／若しくはＩＬＴ４の結合の阻害（実施例１３に示す）、並びに／又は
ｂ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）でトランスフェクトしたＳＫＯＶ３細胞上及び／若しくは内因性ＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ３細胞上でのＴ細胞による抗体媒介ＩＦＮガンマ分泌（ＩＦＮガンマ分泌が検出された）（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによる）（実施例１４に示す）、並びに／又は
ｃ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ ３ＨＬＡ－Ｇ）でトランスフェクトしたＳＫＯＶ３細胞及び／若しくは内因性ＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ３細胞に対するＴ細胞媒介細胞傷害／腫瘍細胞殺傷（細胞傷害は、二重特異性抗体で治療した後の細胞におけるカスパーゼ８活性化を測定することによって検出された）（実施例１５に示す）、並びに／又は
ｄ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）ヒト化ＮＳＧマウスでトランスフェクトしたＳＫＯＶ３ヒト卵巣癌腫を有するヒト化ＮＳＧマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性／腫瘍退縮（実施例１６に示す）、並びに／又は
ｅ）ヒト乳がんＰＤＸ腫瘍（ＢＣ００４）を有するヒト化ＮＳＧマウスにおけるＨＬＡ－Ｇ ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性／腫瘍（実施例１７に示す）、を示す、実施形態８～１３のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
１５．第１及び第２の抗原結合部分がＦａｂ分子である、実施形態９～１４のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
１６．第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換わっているＦａｂ分子である、実施形態９～１５のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
１７．第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、定常ドメインにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換され（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換され（Ｋａｂａｔによるナンバリング）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換され（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、実施形態９～１６のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
１８．第３の抗原結合部分を含み、第３の抗原部分が第１の抗原結合部分と同一である、実施形態９～１７のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
１９．第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む、実施形態９～１８のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
２０．第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び存在する場合には第３の抗原結合部分がそれぞれＦａｂ分子であり、
（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されるか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合され、第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されるかのいずれかであり、
第３の抗原結合部分が、存在する場合、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、実施形態１９に記載の二重特異性抗体。
２１．ＦｃドメインがヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ１アイソタイプのものである、実施形態１９又は２０に記載の二重特異性抗体。
２２．Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクタ機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態１９又は２０に記載の二重特異性抗体。
２３．抗体が、突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスよるナンバリング）を有するＩｇＧ１アイソタイプの抗体である、実施形態２２に記載の二重特異性抗体。
２４．Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が、より大きな側鎖量を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に配置可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基が、より小さな側鎖量を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が配置可能である、実施形態１９～２３のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
２５．抗体が、Ｆｃドメインの第１のサブユニットに突然変異Ｔ３６６Ｗを有し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットに突然変異Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｓ及びＬ３６８Ａを有するＩｇＧ１アイソタイプ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）である、実施形態２４に記載の二重特異性抗体。
２６．抗体が、Ｆｃドメインの第１のサブユニットに更なる突然変異Ｓ３５４Ｃを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットに更なる突然変異Ｙ３４９Ｃを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、実施形態２５に記載の二重特異性抗体。
２７．抗体が、Ｆｃドメインの第１のサブユニットに更なる突然変異Ｙ３４９Ｃを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットに更にＳ３５４Ｃ突然変異を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）、実施形態２５に記載の二重特異性抗体。
２８．実施形態１～４のいずれか１つに記載の抗体又は実施形態９～２７のいずれか１つに記載の二重特異性抗体をコードする、単離された核酸。
２９．実施形態２８に記載の核酸を含む宿主細胞、好ましくは真核生物宿主細胞。
３０．実施形態２９に記載の宿主細胞を培養して、抗体又は二重特異性抗体を産生することを含む、実施形態１～４のいずれか１つに記載の抗体、又は実施形態９～２２７のいずれか１つに記載の二重特異性抗体の製造方法。
３１．抗体又は二重特異性抗体を宿主細胞から回収することを更に含む、実施形態３０に記載の方法。
３２．抗体が実施形態３０又は３１に記載の方法に従って産生され、宿主細胞が真核宿主細胞（好ましい一実施形態では、哺乳動物宿主細胞、別の好ましい実施形態では、ＣＨＯ細胞）である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の抗体又は実施形態９～２７のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
３３．抗体が真核宿主細胞（好ましい一実施形態では、哺乳動物宿主細胞、別の好ましい実施形態では、ＣＨＯ細胞）で産生される、実施形態１～４のいずれか１つに記載の抗体又は実施形態９～２７のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
３４．医薬として使用するための、実施形態１～４のいずれか１つに記載の抗体又は実施形態９～２７のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
３５．がんの治療において使用するための、実施形態１～４のいずれか１つに記載の抗体又は実施形態９～２７のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
３６．医薬の製造における、実施形態１～４のいずれか１つに記載の抗体又は実施形態９～２７のいずれか１つに記載の二重特異性抗体の使用。
３７．医薬ががんの治療用である、実施形態３６に記載の使用。
３８．がんを有する個体を治療する方法であって、個体に有効量の実施形態１～４のいずれか１つに記載の抗体又は実施形態９～２７のいずれか１つに記載の二重特異性抗体を投与することを含む、方法。
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９において説明されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書によって使用した。
遺伝子及びオリゴヌクレオチド合成
所望の遺伝子セグメントを、Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ（レーゲンスブルク、ドイツ）での化学合成によって調製した。合成した遺伝子断片を増殖／増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローン化された遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシングによって確認された。あるいは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、又はＰＣＲによって短い合成ＤＮＡ断片を組立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドを、Ｍｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ（プラネグ－マルティンスリート、ドイツ）によって調製した。
基本的／標準的な哺乳動物発現プラスミドの説明
所望の遺伝子／タンパク質（例えば完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、若しくはＭＨＣクラスＩ分子、例えばＨＬＡ－Ｇ、又はペプチド及びベータ２ミクログロブリンに融合したＭＨＣクラスＩ分子、例えばＨＬＡ－Ｇ結合ペプチド及び／又はベータ２ミクログロブリンに融合したＨＬＡ－Ｇ）の発現のために、以下の機能的要素を含む転写単位が使用される：
－イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス（Ｐ－ＣＭＶ）由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、
－ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－発現される遺伝子／タンパク質（例えば完全長抗体重鎖又はＭＨＣクラスＩ分子）、及び
－ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。
発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットに加えて、塩基性／標準的な哺乳動物発現プラスミドは、
－大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、及び
－大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子を含む。
タンパク質決定
精製ポリペプチドのタンパク質濃度を、精製ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を決定することにより求めた。
実施例１
ＨＬＡ－Ｇキメラ分子の作製
他のＭＨＣ Ｉ分子との高い相同性（９８％超）のため、ＨＬＡ－Ｇ分子による免疫化は、ＭＨＣ－Ｉ交差反応性抗体並びに真にＨＬＡ－Ｇ特異的抗体の混合物から構成されるポリクローナル血清の生成をもたらす。
これまでのところ、他のヒトＭＨＣ－Ｉ（例えばＨＬＡ－Ａ）に対する交差反応性を伴わずに真にＨＬＡ－Ｇ特異的抗体を選択し、受容体遮断機能を有するものを更に選択するための手段は提供されていない。
本発明者らは、構造的適合性及び受容体相互作用に必要な位置と組み合わせて固有のＨＬＡ－Ｇ位置を同定した（ＩＬＴ２／４及びＫＩＲ２ＤＬ４。）。
次いで、異なるげっ歯類種（ラットＲＴ１Ａ及びマウスＨ２ｋｄ等）由来のＭＨＣクラスＩ複合体分子上にヒトＨＬＡ－Ｇの特有な近位位置を「グラフト」して、「キメラ」免疫原／スクリーニング抗原を生成した。
生成された抗体を結合／特異性（それぞれ対抗原に対する交差反応性なし／特異性なし）についてのストリンジェントなスクリーニング／試験に供した。
結合試験のための抗原：
－レック配列番号４３を含むヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣ複合体として発現されるＨＬＡ－Ｇ
－ラットＲＴ－１及びマウスＨ２ｋｄにグラフトしたＨＬＡ－Ｇ特異的配列（配列番号４６：ヒトＨＬＡ－Ｇに特異的な位置がマウスＨ２ＫｄフレームワークにグラフトされたヒトＨＬＡ－Ｇ／マウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体及び配列番号４８：ヒトＨＬＡ－Ｇに特異的な位置がラットＲＴ１ＡフレームワークにグラフトされたヒトＨＬＡ－Ｇ／ラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体）
－天然ＨＬＡ－Ｇ ＭＨＣクラスＩ複合体発現細胞（例えばＪｅｇ３細胞）、又はヒトＨＬＡ－Ｇトランスフェクト細胞株ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ＋及びＰＡ－ＴＵ－８９０２ ＨＬＡ－Ｇ＋
交差反応性試験のための対抗原：
－異なるペプチドと組み合わせた他のＨＬＡ－Ａ配列（ＨｌＡ－Ａコンセンサス配列でデグラフト化されたＨＬＡ－Ａ２及びＨＬＡ－Ｇ）との対抗原（ＭＨＣクラスＩ複合体）（例えば、ＨＬＡ－Ｇフレームワーク上の配列番号３５（ＨＬＡ－Ａ２）及び配列番号４０ ＨＬＡ－Ａコンセンサス配列を参照されたい）
－ラットＲＴ－１及びマウスＨ２ｋｄ（配列番号４３及び配列番号４１）等の他の種からの対抗原（ＭＨＣクラスＩ複合体）
－ＨＬＡ－Ｇ発現の非存在を特徴とする非改変腫瘍細胞株ＳＫＯＶ３及びＰＡ－ＴＵ－８９０２。
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の特異的結合を決定するためのキメラＨＬＡ－Ｇ抗原の設計（図２を参照されたい）：
結合アッセイで使用するための、ＨＬＡ－Ｇ固有位置（配列番号４４）を保有するキメララットＭＨＣ Ｉ分子（ＲＴ１－Ａ）の設計：
ＩＭＧＴ由来の２５７９個のＨＬＡ－Ａ、３２８３個のＨＬＡ－Ｂ、２１３３個のＨＬＡ－Ｃ、１５個のＨＬＡ－Ｅ、２２個のＨＬＡ－Ｆ及び５０個のＨＬＡ－Ｇ配列のアラインメントによって、ＨＬＡ－Ｇ固有の位置を同定した（２０１４年２月６日現在）。３つの配列セットＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ＋ＨＬＡ－Ｅ＋ＨＬＡ－Ｆの組み合わせセットのいずれかの配列の１％未満（ほとんどが約０％）に存在するＨＬＡ－Ｇの残基は、ＨＬＡ－Ｇ固有位置と呼ばれる。
４つのコアＨＬＡ－Ｇ固有位置（アルファ－１では２つ、アルファ－３では２つ）は、ＨＬＡ－Ｇ配列のセットにおいて多型を示さず、他のＨＬＡ遺伝子のいずれもこれらの位置にＨＬＡ－Ｇ特異的残基を含有しない（Ｍ１００については１×ＨＬＡ－Ａ、Ｑ１０３については１×ＨＬＡ－Ｂ、及びＱ１０３については１×ＨＬＡ－Ｃを除く）。
ヒトＨＬＡ－Ｇ（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，Ｃ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ １０２：３３６０－３３６５（２００５）；ＰＤＢコード：１ＹＤＰ）の結晶構造にラットＲＴ１－Ａ（Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２４：９７５－９９０（２００２）；ＰＤＢコード：１ＫＪＭ）の結晶構造を重ねた。アルファ鎖及び関連するベータ２ミクログロブリンの全体構造は保存されている。
ＨＬＡ－Ｇ固有の位置を、配列及び構造アラインメントの比較によってＲＴ１－Ａ構造において同定した。第１の工程では、ＨＬＡ－Ｇ及びＲＴ１－Ａの分子表面に露出され、したがって抗体にとってアクセス可能な固有のＨＬＡ－Ｇ位置が同定された。タンパク質フォールド内に埋もれている固有の位置は、操作のために除外された。第２の工程において、対応する領域「ＨＬＡ－Ｇ様」を作製するため、すなわち、人工的であろうＨＬＡ－Ｇ／ラットＲＴ１－Ａキメラエピトープを生成するのではなく、固有の位置を含む実際のＨＬＡ－Ｇエピトープを生成するためにも交換される必要がある構造的に近位の残基を同定した。このようにして突然変異のために選択された全ての位置を、ＨＬＡ－Ｇ由来のそれぞれの残基の構造的適合について分析して、突然変異時の分子構造の起こり得る局所的障害を回避した。
結合アッセイで使用するためのＨＬＡ－Ｇ固有の位置（配列番号４２）を有するキメラマウスＭＨＣ Ｉ分子（Ｈ２Ｋｄ）を同様に生成した。
交差反応性試験のためのＨＬＡ－Ａコンセンサス配列に対するＨＬＡ－Ｇ固有位置の「デグラフト化」によるＨＬＡ－Ａベースのカウンター抗原の設計（配列番号４０＝改変ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸はＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸（＝デグラフト化ＨＬＡ－Ｇ）によって置き換えられている）
ヒトＨＬＡ－Ｇ（ＰＤＢコード：１ＹＤＰ）の結晶構造において、多重配列アラインメントに由来する固有の位置を解析した。第１に、ＨＬＡ－Ｇ表面上に露出されておらず、したがって抗体にとってアクセスできない位置を操作のため除外した。第２に、表面露出残基をアミノ酸交換の実現可能性について分析した（すなわち、関連する位置の変異時の分子構造の可能性のある局所的な障害の排除）。合計で１４の位置を交換のため検証した。有効位置のアミノ酸を、ＩＭＧＴ（２０１４年２月６日現在）からダウンロードした２５７９個のＨＬＡ－Ａ配列の多重配列アラインメントに由来するＨＬＡ－Ａコンセンサス配列に対して変異させた。
可溶性古典的及び非古典的ＭＨＣクラスＩ分子のための発現プラスミドの作製
組換えＭＨＣクラスＩ遺伝子は、それぞれのＭＨＣクラスＩ分子、ベータ２ミクログロブリン、及びそれぞれのＭＨＣクラスＩ分子によって結合されることが知られているペプチドからなるＮ末端伸長融合分子をコードする。
可溶性ＭＨＣクラスＩ分子の一過性発現のための発現プラスミドは、可溶性ＭＨＣクラスＩ分子の他に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点と、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子とを含んでいた。
可溶性ＭＨＣクラスＩ分子の転写単位は、以下の機能要素を含んでいた：
－イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス（Ｐ－ＣＭＶ）由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、
－ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－核酸をコードするＮ末端切断Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ソルターゼＡ、及び
－ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。
様々な種に由来する成熟可溶性ＭＨＣクラスＩ分子のアミノ酸配列は以下の通りである：
配列番号３９：例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号４０：例示的な改変ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸はＨＬＡコンセンサスアミノ酸によって置き換えられている（＝デグラフト化ＨＬＡ－Ｇ、図２も参照されたい）
配列番号４１：例示的なマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号４２：ヒトＨＬＡ－Ｇに特異的な位置がマウスＨ２Ｋｄフレームワークにグラフトされた例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ／マウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ複合体
配列番号４３：例示的なラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体
配列番号４４：ヒトＨＬＡ－Ｇに特異的な位置がラットＲＴ１Ａフレームワークにグラフトされた例示的なヒトＨＬＡ－Ｇ／ラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ複合体
例示的なＨＬＡ－Ａ２ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体について、以下の成分を使用し、複合体を大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）で発現させ、精製した。
ＭＨＣＩ複合体ＨＬＡ－Ａ２／ｂ２Ｍ（配列番号３５及び３３）（両方とも追加のＮ末端メチオニンを有する）＋ＶＬＤＦＡＰＰＧＡペプチド（配列番号４６）＋リンカー及びｈｉｓ－Ｔａｇ（配列番号４５）
実施例２
ＣＤＲ－Ｌ１におけるＮ－グリコシル化モチーフの除去
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体ＨＬＡ－Ｇ－００９０のＣＤＲ－Ｌ１は、軽鎖（ＬＣ）の位置３１から３３を含む古典的なＮ－グリコシル化モチーフ「ＮＳＳ」を含有する。潜在的な開発可能性の責任を構成し得るため、このモチーフを除去することを決定した。ＨＬＡ－Ｇ－００９０の可変領域の相同性モデルは、ＬＣ位置３１～３３が非常に溶媒接触性であることを示した。さらに、Ｎ３１及びＳ３２の側鎖は、ＣＤＲ－Ｈ３の方向に内側を指すと予測され、それらは抗体パラトープの一部である可能性が高い。実際、いくつかの公開されている抗体－抗原Ｘ線複合体構造物は、これらの残基が抗原との化学的相互作用を受けていることを実証している。したがって、ＬＣ位置３１～３３に変異を導入することによって抗体の結合親和性が悪化するリスクが高いと考えられた。リスクを改善するために、ＬＣ位置３１、３２及び３３に突然変異を有する抗体ＨＬＡ－Ｇ－００９０の１１個の異なる変異体を設計し、ＩｇＧ１フォーマットでＨＥＫ２９３Ｆ細胞で産生させた。
突然変異変異体ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｎ３１Ｙ－Ｎ３８Ｙは、Ｎ－グリコシル化モチーフとは別に第２の突然変異（Ｎ３８Ｙ）を含み、その除去に関連せず、生殖系列同一性を増加させていることに留意されたい。
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体配列（可変領域及びＣＤＲの配列番号）の要約：
得られた抗ＨＬＡ－Ｇ特異的抗体の結合及び他の特性、並びに生物学的活性を以下の実施例に記載されるように決定し、既知の参照であるＨＬＡ－Ｇ－００９０と比較した。
発現及び精製
アフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ）による精製及び透析後のＨＥＫ２９３Ｆ細胞における０．５Ｌ発現からの発現収率を以下の表に示す。
位置ＬＣ３１（Ｎ３１Ｘ）を含む突然変異を有する変異体は、発現力価の大幅な低下及び多くの場合、材料の質の低下を示したが、ＬＣ３２及びＬＣ３３位の変異体は、良好から許容可能な発現力価及び良好な材料の質を示した。
ＨＬＡ－Ｇ結合
ｗｔ－ＨＬＡ－Ｇ親和性／速度論
個々の５ｎＭ抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のｗｔ－ＨＬＡ－Ｇ複合体（配列番号３９）に対する親和性を、ＣＭ３センサーチップ上の抗ｈＦｃ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ－１００８－３９）で捕捉し、ＨＢＳ－Ｐ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）泳動緩衝液に希釈した１１ｎＭ～３００ｎＭの濃度及び６０μｌ／分の流速で、１２０秒の会合時間及び６００秒の解離時間でｗｔ－ＨＬＡ－Ｇ抗原を注入することによって決定した。各サイクルの後、３Ｍ ＭｇＣｌ２で洗浄することによって表面を再生した。Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して速度論結合曲線を評価し、結合特性の計算には１：１ラングミュア結合モデルを使用した。
ＨＬＡＧ抗体のＲＡＣ（相対活性濃度）（アッセイスキームを図３に示す）。
個々の抗ＨＬＡ－Ｇ抗体（ＨＢＳ－Ｐ＋中１０ｎＭ溶液）のＨＬＡ－ＧバインダのＲＡＣを、ＣＭ３センサーチップ上の抗ｈＦｃ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ－１００８－３９）で捕捉し、ＨＢＳ－Ｐ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）泳動緩衝液に希釈した３００ｎＭの濃度及び１０μｌ／分の流速で、６０秒の会合時間及び６００秒の解離時間でｗｔ－ＨＬＡ－Ｇ抗原を注入することによって決定した。各サイクルの後、３Ｍ ＭｇＣｌ２で洗浄することによって表面を再生した。最終的なＲＡＣ及びＲｍａｘ値を、「結合」報告点及び捕捉レベルから計算する。Ｒｍａｘ＝（ＭＷ分析物／ＭＷリガンド）×ＲＵ捕捉リガンド＊相互作用の化学量論。
１１個の変異体を、Ｆｃ部分を介して抗体をＣＭ３チップに固定化し、組換え一本鎖ＨＬＡ－Ｇモノマー／ヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体（配列番号３９）を分析物として使用するＳＰＲ結合実験で評価した。動力学パラメータを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置での２５℃での単回サイクル動力学測定によって決定した。
これらのうち、許容可能な発現力価を有する４つの変異体（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ａ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ｄ、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ｐ）を、同じＳＰＲ装置及び実験設定を使用したより正確な多重サイクル動態測定で更に評価した。
２つの変異体ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ及びＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ａは、親抗体ＨＬＡ－Ｇ－００９０と比較して改善された結合親和性を有するが、２つの変異体ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ｄ及びＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ｐは、それぞれ５倍及び２倍の結合親和性を失っている。驚くべきことに、試験した変異体では、Ｎ－グリコシル化モチーフの除去は、動態測定においてより高いＲｍａｘ値をもたらし、Ｎ－グリコシル化抗体よりも成功した複合体形成の割合が高いことを示している。
可溶性ヒトＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ａコンセンサス特異的配列を有する可溶性デグラフト化ヒトＨＬＡ－Ｇ、及びラット／マウスホモログに対する抗ＨＬＡ－Ｇ抗体及び変異体の交差反応性
２つの結合親和性改善変異体ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ及びＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ａの結合特性を更に調べるために、４つのカウンタースクリーニング構築物に対するＳＰＲ結合実験を行った。これらの組換え一本鎖ペプチド－ＭＨＣ複合体構築物は、マウスＨ２－Ｋ１（配列番号４１）、ラットＲＴ１（配列番号４３）、及びヒトＨＬＡ－Ｇ β２Ｍ ＭＨＣクラスＩ複合体であり、ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸はＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸（配列番号４０）で置き換えられていた。後者の構築物は、全てのＨＬＡ－Ｇ特異的残基がそれらのＨＬＡ－Ａコンセンサス対応物によって置き換えられたＨＬＡ－Ｇのバージョンを構成する。ここでも、抗体をＣＭ３チップに固定化し、一本鎖ペプチド－ＭＨＣ構築物をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置で分析物として２５℃で使用した。
ストレス下での安定性
親抗体並びに２つの派生変異体ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ及びＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ａを、２つの異なる条件下で１３日間ストレス負荷を行った：
・ｐＨ６．０ ２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ；４０℃にて（Ｈｉｓ ４０℃）
・ｐＨ７．４ ＰＢＳ；３７℃にて（ＰＢＳ ３７℃）。
その後、ＳＥＣ及びＳＰＲを使用して材料を分析して、化学分解及び標的結合に対する起こり得る影響を調査した。参照のため、ストレス負荷された材料を貯蔵条件下で維持された材料と比較した：
・ｐＨ６．０ ２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ；－８０℃で凍結（参照）
結果を以下の表に列挙する（参照と比較した相対％）：
３つ全ての抗体が非常に類似した安定性プロファイルを示しているが、変異体ＨＬＡＧ－００９０＿ＶＬ－Ｓ３２Ｐは、３７℃のＰＢＳ中でのストレス後に、親抗体を含む他の２つよりも多くのＨＬＡ－Ｇ結合（ＳＰＲ相対活性濃度（ＲＡＣ））を保持している。
熱安定性試験
精製タンパク質の熱安定性試験のために、Ｕｎｃｌｅデバイスを使用した（ＵＮＣＨＡＩＮＥＤ ＬＡＢＳ、米国マサチューセッツ州ボストン）。２６６ｎｍ及び４７３ｎｍでの静的光散乱と並行して固有蛍光を使用して、精製タンパク質の凝集温度（Ｔａｇｇ）及び融解温度（Ｔｍ）を決定する。０．１℃／分ステップで３０℃から９０℃までの温度勾配を実行した。試料あたり９μｌの体積を有するガラスキュベットを使用し、濃度は２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０緩衝液中１ｍｇ／ｍＬであった。解析には、ソフトウェアＵＮｃｌｅ解析（ＵＮＣＨＡＩＮＥＤ ＬＡＢＳ）を用いた。
質量分析及びＮ－グリコシル化
インタクト試料のデコンボリューションされた質量スペクトルは、ＨＬＡ－Ｇ－００９０＿ＶＬ－Ｓ３２Ｐ及びＨＬＡ－Ｇ－００９０＿ＶＬ－Ｓ３３ＡにおけるＮ－グリコシル化部位／ＮＳＳモチーフの除去のＮ－グリコシル化に対する影響を記録している。サンプルをＰＮＧａｓｅ Ｆを用いて調製して、全てのＮ結合型グリカンを除去し、抗体の分子量のみを得た。ＰＮＧａｓｅ Ｆは、Ｎ結合型Ｆｃ－グリカンの切断に完全に特異的であるが、Ｎ結合型Ｆａｂ－グリカンを切断する場合、はるかに低い有効性を示す。ＨＬＡ－Ｇ－００９０は、不完全な脱グリコシル化に由来する明確なＮ－グリコシル化パターンを示しており、したがってＦａｂ－グリコシル化を示している（図４Ａを参照されたい）。ＨＬＡ－Ｇ－００９０＿ＶＬ－Ｓ３２Ｐ及びＨＬＡ－Ｇ－００９０＿ＶＬ－Ｓ３３Ａについては、残留Ｎ－グリコシル化の徴候を検出することができない（図４Ｂを参照されたい）。
実施例３
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体のＩＬＴ２及びＩＬＴ４結合阻害
Ｆｃタグ付きＩＬＴ２及びＩＬＴ４をそれぞれＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートにコーティングすることによって、ＥＬＩＳＡを設定する。インキュベーション及び洗浄工程の後、それぞれの抗体を１００ｎＭの濃度で添加する。可溶性Ｈｉｓタグ化単量体、二量体又は三量体ＨＬＡ－Ｇをウェルに添加した。インキュベーション及び洗浄工程の後、結合した受容体の検出を抗Ｈｉｓ抗体－ＰＯＤ抱合体によって行う。阻害率（％）を、抗ＨＬＡ－Ｇ又はＩＬＴ２／４抗体を含まないＩＬＴ２／４＋ＨＬＡ－Ｇ（一量体、二量体又は三量体）を有するウェルから得られた値と比較して計算し（１００％結合＝０％阻害）、表に示す。
実施例４
細胞上に発現された天然又は組換えＨＬＡ－ＧへのＨＬＡ－Ｇ抗体の結合（ＦＡＣＳ分析によって評価）
フローサイトメトリー分析のため、細胞を４℃で抗ＨＬＡ－Ｇ ｍＡｂで染色した。簡潔には、各細胞懸濁液をポリプロピレンチューブ（２×１０５細胞／チューブ）に移し、５℃で１０分間予冷した。次いで、細胞を２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（４℃）で洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離した。抗ＨＬＡ－Ｇ抗体ＨＬＡＧ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ、ＨＬＡＧ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ａ、ＨＬＡＧ－００９０を染色緩衝液で５０μｇ／ｍｌの開始濃度に希釈した。抗体の５倍段階希釈を実施して、最終濃度を得た（１０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０１６μｇ／ｍｌ、０．００３２μｇ／ｍｌ）。次いで、ＦＡＣＳ緩衝液をチューブから吸引し、細胞ペレットを１００μｌの抗体溶液に再懸濁し、５℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を２ｍｌの染色緩衝液で１回洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離した。
検出のために、蛍光標識抗種抗体（Ａｌｅｘａ ４８８に抱合化させたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ａ１１０１３）を染色緩衝液で１０μｇ／ｍｌに希釈し、細胞ペレットを１００μｌの検出抗体に再懸濁した。５℃で１時間インキュベートした後、細胞を２ｍｌの染色緩衝液で再び１回洗浄し、５００μｌの染色緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ ＣＥＬＥＳＴＡで測定した。
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体ＨＬＡ－Ｇ－００９０、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ及びＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ（１０μｇ／ｍｌ）についての例示的なＦＡＣＳ染色を図５のＦＡＣＳオーバーレイで示す：ＨＬＡ－Ｇ ００９０、ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ及びＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐの両方の脱グリコシル化変異体は、ＨＬＡ－Ｇ発現ＳＫＯＶ３細胞及びＪＥＧ細胞に良好な結合を示すが、親ＳＫＯＶ３細胞には結合しない。それぞれのＨＬＡ－Ｇ抗体のＭＦＩ値をヒストグラムに示す。
実施例５
抗ＨＬＡ－Ｇ抗体は、ＪＥＧ３細胞上に発現されたＨＬＡ－ＧへのＩＬＴ２の結合を阻害／調節する
分析のため、ＪＥＧ３細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３６）を、異なる抗ＨＬＡ－Ｇ抗体とのプレインキュベーションの有無にかかわらず、ＩＬＴ２－ｃ－Ｍｙｃ－Ｆｃ融合タンパク質（対照＝阻害なし）で染色した。
結合／結合阻害を以下のように決定した：組換えＩＬＴ２－ｃ－Ｍｙｃ－Ｆｃタンパク質を、記載のように抗ＨＬＡ－Ｇ ｍＡｂとプレインキュベートしたＪＥＧ３細胞又は参照としての未処理ＪＥＧ３細胞のいずれかに添加した。抗ＨＬＡ－Ｇ抗体とのプレインキュベーションのため、２×１０５個の細胞をポリプロピレンチューブに移した。抗ＨＬＡ－Ｇ抗体ＨＬＡＧ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ、ＨＬＡＧ－００９０－ＶＬ－Ｓ３３Ａ及びＨＬＡ－Ｇ－００９０を染色緩衝液で８０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、抗体溶液２５μｌを調製した細胞に添加し、５℃で１時間インキュベートした。ＩＬＴ２－ｃ－Ｍｙｃ－Ｆｃ又は（対照ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ－Ｉｍｍｕｎｏ－Ｒｅｓｅａｒｃｈ＃００９－０００－００３））を染色緩衝液で２０μｇ／ｍｌの２倍濃度に希釈し、調製した細胞に１０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、５℃で２時間インキュベートした。細胞を２００μｌの染色緩衝液で２回洗浄した。ヒトＩＬＴ２－ｃ－Ｍｙｃ－Ｆｃタンパク質を、染色緩衝液中１０μｇ／ｍｌの希釈で蛍光標識抗Ｍｙｃタグ（９Ｅ１０）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（ａｂｃａｍ；＃ａｂ２２３８９５）で検出した。細胞を５０μｌの検出抗体希釈液に再懸濁し、５℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を２ｍｌの染色緩衝液で１回洗浄し、５００μｌの染色緩衝液に再懸濁した後、ＦＡＣＳ ＣＥＬＥＳＴＡで測定した。
対照として、ＪＥＧ－３プレインキュベーション細胞に結合した抗ＨＬＡ－Ｇ抗体を、抗種抗体（Ａｌｅｘａ ４８８に抱合させたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ａ１１０１３）を使用することによって検出し、染色緩衝液で１０μｇ／ｍｌに希釈し、細胞ペレットを１００μｌ／ウェルの検出抗体に再懸濁した。５℃で１時間インキュベートした後、細胞を染色緩衝液で再び１回洗浄し、５００μｌの染色緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ ＣＥＬＥＳＴＡで測定した。
図６のヒストグラムは、ＪＥＧ３腫瘍細胞上に天然に発現されたＨＬＡ－Ｇに対する組換えＩＬＴ２の相互作用及び結合を改変／阻害するＨＬＡ－Ｇ抗体のそれぞれの能力を示す。
以下の表は、実験の結果を要約する。ＪＥＧ３細胞への抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の結合は、＋＝弱い結合－＋＋＋＝強い結合として示されている。ＨＬＡ－Ｇ発現ＪＥＧ３細胞へのＩＬＴ２の結合を阻害／遮断又は増加させる抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の能力。最後の列では、細胞への組換えＩＬＴ２の結合又はその阻害／遮断を示す／定量する（抗ＨＬＡ－Ｇ抗体の非存在下でのＩＬＴ２－ｃ－Ｍｙｃ－Ｆｃの染色を１００％結合＝０％阻害に設定した）：
実施例６
最適化ＣＤ３バインダの生成
配列番号９２及び９３のＶＨ及びＶＬ配列を含む本明細書において「ＣＤ３ｏｒｉｇ」と呼ばれる以前に記載されたＣＤ３バインダ（詳細については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１３１７１２号を参照されたい）から出発して、本発明者らは、重鎖ＣＤＲ３のカバット方式による位置９７及び１００における２つのアスパラギン脱アミド化配列モチーフの除去によってこのバインダの特性を最適化することを目的とした。
この目標に対して、本発明者らは、ファージディスプレイに適した、Ｋａｂａｔ位置９７と１００の両方のアスパラギンが除去された重鎖の抗体ライブラリを生成し、更にＡｓｎ９７及びＡｓｎ１００を置き換えることによって引き起こされる親和性の喪失を親和性成熟プロセスを通して補償するためにランダム化されたＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２及びＨ３を生成した。
このライブラリは、マイナーコートタンパク質ｐ３への融合を介して線状ファージに置かれ（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２，５８１－５９７）、組み換えＣＤ３εへの結合のために選択された。
初期のスクリーニングにおいて１０の候補クローンが特定され、ＳＰＲによってＦａｂ断片（大腸菌内で産生された）として測定された、組み換え抗原上の許容可能な結合を示した。
しかしながら、これらクローンのうち１つだけが、ＩｇＧフォーマットへの変換後、フローサイトメトリーによって測定された、ＣＤ３を発現する細胞への許容可能な結合活性を示した。
本明細書においてＰ０３５－０９３（Ｐ０３５）（＝「ＣＤ３ｏｐｔ」）と呼ばれ、それぞれ配列番号５８及び５９のＶＨ配列及びＶＬ配列を含む、選択されたクローンを更に評価し、以下に記載されるように二重特異性フォーマットに変換した。
実施例７
最適化ＣＤ３バインダのＣＤ３への結合
組み換えＣＤ３への結合
組換えＣＤ３への結合を、Ｆｃ領域にＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ（「ＰＧＬＡＬＡ」、ＥＵナンバリング）変異を有するヒトＩｇＧ１フォーマット（配列番号９４及び９６（ＣＤ３ｏｒｉｇ）、並びに配列番号９５及び９６（Ｐ０３５＝ＣＤ３ｏｐｔ））の両方において、最適化ＣＤ３バインダＰ０３５－０９３（Ｐ０３５）（＝”ＣＤ３ｏｐｔ”）及び元のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」についての表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。
脱アミド部位除去の効果と抗体の安定性へのその効果とを評価するために、元々の最適化ＣＤ３バインダの組み換えＣＤ３への結合を、３７℃又は４０℃の１４日間の温度ストレス後に試験した。－８０℃で保存した試料を参照として使用した。基準試料及び４０℃でストレスを加えられた試料は、２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ中、ｐＨ６．０であり、３７℃でストレスを加えられた試料は、ＰＢＳ中、ｐＨ７．４であり、全て濃度１．２～１．３ｍｇ／ｍｌであった。ストレス期間（１４日間）後、更なる分析のために、ＰＢＳ中の試料を透析して２０ｍＭ Ｈｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に戻した。
試料の相対活性濃度（ＲＡＣ）を、以下の通りＳＰＲにより決定した。
ＳＰＲは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行われた。抗Ｆａｂ捕捉抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，＃２８９５８３２５）は、標準的なアミンカップリングケミストリーを用いて、結果として４０００～６０００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度で、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化された。泳動用及び希釈緩衝液として、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を使用した。２μｇ／ｍｌの濃度のＣＤ３抗体を、５μｌ／分の流量で６０秒間注入した。ＣＤ３抗原（以下を参照されたい）は、１０μｇ／ｍｌの濃度で１２０秒間注入され、解離は、５μｌ／分の流量で１２０秒間監視された。チップ表面は、１０ｍＭグリシンｐＨ２．１のそれぞれ６０秒間の２つの連続した注入によって再生された。容積屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことによって、及びブランク制御フローセルから得られる応答を差し引くことによって訂正された。評価のために、結合反応は、注入終了から５秒後に取られた。結合シグナルを正規化するために、ＣＤ３結合は、抗Ｆａｂ応答（固定化された抗Ｆａｂ抗体上でのＣＤ３抗体の捕捉の際に得られるシグナル（ＲＵ））によって分けられた。相対活性濃度は、各温度ストレスを加えられた試料を、対応するストレスを加えられていない試料に対して参照することにより計算した。
使用された抗原は、ノブ・イントゥ・ホール改変及びＣ末端Ａｖｉ－ｔａｇを伴うヒトＦｃドメインに融合された、ＣＤ３デルタ及びＣＤ３イプシロン外部ドメインのヘテロ二量体であった（配列番号９０及び９１を参照されたい）。
この実験の結果を図１５に示す。見てわかるように、最適化ＣＤ３バインダであるＣＤ３ｏｐｔ Ｐ０３５－０９３（Ｐ０３５）（＝ＣＤ３ｏｐｔ）は、元々のＣＤ３バインダであるＣＤ３ｏｒｉｇと比較して、温度ストレス（３７℃、ｐＨ７．４で２週間）後、ＣＤ３への強く改善された結合を示した。この結果は、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期とともに中性ｐＨでの抗体の製剤に関連して、脱アミド部位除去が成功であったことと、脱アミド部位除去によって優れた安定性特性を有する抗体が得られたことを示している。
Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３への結合
ヒトレポーターＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ上のＣＤ３への結合を、Ｆｃ領域にＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ（「ＰＧＬＡＬＡ」、ＥＵナンバリング）変異を有するヒトＩｇＧ１フォーマット（配列番号９４及び９６（ＣＤ３ｏｒｉｇ）並びに配列番号９５及び９６（Ｐ０３５＝ＣＤ３ｏｐｔ））の両方において、最適化ＣＤ３バインダＰ０３５－０９３（Ｐ０３５）（＝ＣＤ３ｏｐｔ）及び元のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」について、ＦＡＣＳによって決定した。
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞（ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ；Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）は、ＮＦＡＴプロモーターを伴うヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株であり、ヒトＣＤ３を発現する。細胞を、ＲＰＭＩ１６４０、２ｇ／ｌグルコース、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｘ ＮＥＡＡ、１ｘ ピルビン酸ナトリウム中、１ｍｌあたり０．１～０．５ｍｉｏ細胞で培養した。最終濃度であるハイグロマイシンＢ １ｍｌあたり２００μｇを、細胞を継代するときにはいつでも添加した。
結合アッセイのために、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。抗体染色を、９６ウェル丸底プレート内で行った。したがって、１ウェルあたり１００，０００～２００，０００細胞が、播種された。プレートを４分間４００×ｇで遠心分離し、上清を取り除いた。試験抗体をＦＡＣＳ緩衝液で希釈し、２０μｌの抗体溶液を４℃で３０分間細胞に添加した。未結合抗体を除去するため、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、希釈二次抗体（ＰＥ抱合化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃｇ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１０９－１１６－１７０）を添加した。４℃で３０分のインキュベーションの後、未結合の二次抗体を洗い流した。測定の前に、細胞を２００μｌ ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁し、次いでＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ装置を使用してフローサイトメトリーによって分析した。
図１６に示すように、最適化されたＣＤ３バインダＰ０３５－０９３（Ｐ０３５）（＝ＣＤ３ｏｐｔ）及び元のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」は、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３に比較的良好に結合した。
実施例８
最適化ＣＤ３バインダの機能活性
最適化ＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｐｔ」の機能活性を、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞アッセイで試験し、元々のＣＤ３バインダ「ＣＤ３ｏｒｉｇ」の活性と比較した。ＩｇＧの機能活性を試験するために、抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ細胞を、増加する濃度のＣＤ３ｏｐｔヒトＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ又はＣＤ３ｏｒｉｇヒトＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡの存在下で、Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞と共インキュベートした。Ｔ細胞架橋のＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞上のＣＤ３の活性化は、ルシフェラーゼの産生を誘発するのであり、活性化マーカーとして発光を測定することができる。ＣＤ３ｏｒｉｇヒトＩｇＧ１ ｗｔが、抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ細胞に結合できず、したがってＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に架橋されることができない、陰性対照として含まれていた。アッセイの概略図を図１７に示す。
抗ＰＧＬＡＬＡ発現ＣＨＯ細胞は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＰＧＬＡＬＡ）に特異的に結合する抗体を、その表面上に発現するように操作されているＣＨＯ－Ｋ１細胞である（本明細書に参照により組み込まれる、国際公開第２０１７／０７２２１０号を参照されたい）。これらの細胞は、５％ＦＣＳ＋１％ＧｌｕＭａｘを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養された。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞は、実施例７で説明されている通りである。
ＣＤ３ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡが、ＣＨＯ上に発現された抗ＰＧＬＡＬＡ及びＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴレポーター細胞上に発現されたＣＤ３に同時に結合する際、ＮＦＡＴプロモーターが、活性化されて、活性ホタルルシフェラーゼの発現を引き起こす。（ルシフェラーゼ基質の付加時に得られる）発光シグナルの強度は、ＣＤ３活性化及びシグナル伝達の強度に比例する。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞は、懸濁物中で成長するのであり、ＲＰＭＩ１６４０、２ｇ／ｌグルコース、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ＦＣＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎ、１ｘ ＮＥＡＡ、１ｘ ピルビン酸ナトリウム中、１ｍｌあたり０．１～０．５ｍｉｏ細胞、ハイグロマイシン１ｍｌあたり２００μｇで培養された。アッセイのために、ＣＨＯ細胞を採取し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存度を決定した。平底、白壁の９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ＃６５５０９８）内で、１００μｌ培地に３００００標的細胞／ウェルをプレートし、５０μｌ／ウェルの希釈された抗体又は培地（対照のため）を、ＣＨＯ細胞に添加した。続いて、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を回収し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存度を評価した。細胞を、１．２ｍｉｏ細胞／ｍｌで細胞培地内でハイグロマイシンＢなしで再懸濁し、６００００細胞／ウェル（５０μｌ／ウェル）でＣＨＯ細胞に添加し、最終エフェクタ対標的（Ｅ：Ｔ）比２：１、及び１ウェルあたり最終体積２００μｌを得た。次いで、４μｌのＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｅ１２９１）を、各ウェルに添加した（最終体積の２％）。細胞を、加湿したインキュベーター内において３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、ＴＥＣＡＮ Ｓｐａｒｋ １０Ｍを使用して発光を検出した。
図１８に示されるように、最適化されたＣＤ３バインダＰ０３５－０９３（Ｐ０３５）（＝ＣＤ３ｏｐｔ）は、架橋時にＣＤ３ｏｒｉｇと同様の活性をＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞に対して有した。
実施例９
ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体（抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体）の作製
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９において説明されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書によって使用した。
遺伝子及びオリゴヌクレオチド合成
所望の遺伝子セグメントを、Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ（レーゲンスブルク、ドイツ）での化学合成によって調製した。合成した遺伝子断片を増殖／増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローン化された遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシングによって確認された。あるいは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、又はＰＣＲによって短い合成ＤＮＡ断片を組立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドを、Ｍｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ（プラネグ－マルティンスリート、ドイツ）によって調製した。
基本的／標準的な哺乳動物発現プラスミドの説明
所望の遺伝子／タンパク質（例えば、抗体重鎖又は抗体軽鎖）の発現のため、以下の機能的要素を含む転写単位を使用する。
－イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス（Ｐ－ＣＭＶ）由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、
－ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－発現される遺伝子／タンパク質（例えば完全長抗体重鎖又はＭＨＣクラスＩ分子）、及び
－ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。
発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットに加えて、塩基性／標準的な哺乳動物発現プラスミドは、
－大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、及び
－大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子を含む。
タンパク質決定
精製ポリペプチドのタンパク質濃度を、精製ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を決定することにより求めた。
組換えモノクローナル二重特異性抗体のための発現プラスミドの作製
組換えモノクローナル抗体遺伝子は、それぞれの免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖をコードする。
一過性発現モノクローナル抗体分子のための発現プラスミドは、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖発現カセットの他に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点と、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子とを含んでいた。
それぞれの抗体重鎖又は抗体軽鎖の転写単位は、以下の機能要素を含んでいた：
－イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス（Ｐ－ＣＭＶ）由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、
－ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－－マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、及び
－ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。
一過性発現及び分析特性評価
組換え産生を、Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）中で培養したＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞株２９３由来）の一過性トランスフェクションによって行った。モノクローナル抗体の産生のため、細胞を、それぞれの免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含有するプラスミドで同時トランスフェクトした。トランスフェクション「２９３－フェクチン」には、トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。トランスフェクションは、製造業者の説明書に明記されているように実施した。細胞培養上清をトランスフェクションの３～７日後に回収した。上清を低温（例えば－８０℃）で保存した。
例えばＨＥＫ２９３細胞におけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般情報を以下に示す：Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（２００１）１９７－２０３．
組換えＤＮＡ技術のための上記の方法、組換えモノクローナル抗体のための発現プラスミドの作製、並びに一過性発現及び分析的特徴づけを使用して、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する以下の二重特異性抗体を作製し、分析した：
ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体（抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体）（ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗原結合部分／部位及びヒトＣＤ３に結合する抗原結合部分／部位の可変領域ＶＨ／ＶＬ及び超可変領域（ＨＶＲ）の配列番号）：
「クローン２２（「Ｃｌ２２」と略す）」は、最適化ＣＤ３バインダである（国際公開第２０２０／１２７６１９号を参照されたい）；「Ｐ０３５－０９３（「Ｐ０３５」と略す）は別の最適化された変異体ＣＤ３バインダである；Ｖ９は、例えばＲｏｄｒｉｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ（１９９２）７，４５－５０及び国際公開第１９９２／２２６５３号に記載されている別のＣＤ３バインダである（国際公開第１９９２／２２６５３号の配列番号２０及び１７はＶＨ配列及びＶＬ配列である）
二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体：
Ｐ１ＡＦ７９７７（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ ＣＤ３ Ｐ０３５－０９３（Ｐ０３５））：
配列番号７６ 軽鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７７
配列番号７７ 軽鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７７
配列番号７８ 重鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７７
配列番号７９ 重鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７７
Ｐ１ＡＦ７９７８（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ ＣＤ３ Ｃｌｏｎｅ ２２（Ｃｌ２２））：
配列番号８０ 軽鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７８
配列番号８１ 軽鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７８
配列番号８２ 重鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７８
配列番号８３ 重鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７８
Ｐ１ＡＦ７９７９（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ ＣＤ３ Ｖ９）：
配列番号８４ 軽鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７９
配列番号８５ 軽鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７９
配列番号８６ 重鎖１ Ｐ１ＡＦ７９７９
配列番号８７ 重鎖２ Ｐ１ＡＦ７９７９
実施例１０
ＨＬＡ－Ｇに対する二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体（Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体）の結合及び安定性
ストレス下での安定性
同じＨＬＡ－Ｇ標的化バインダＨＬＡＧ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ及び３つの異なるＣＤ３ｅバインダを特徴とする３つのＴＣＢ分子を、２つの異なる条件下で１４日間ストレス負荷を行った：
・ｐＨ６．０ ２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ；４０℃にて（Ｈｉｓ ４０℃）
・ｐＨ７．４ ＰＢＳ；３７℃にて（ＰＢＳ ３７℃）。
その後、ＣＤ－ＳＤＳ、ＳＥＣ、及び表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）ＳＰＲを使用して材料を分析して、化学分解及び標的結合に対して起こり得る影響を調査した。参照のため、ストレス負荷された材料を貯蔵条件下で維持された材料と比較した：
・ｐＨ６．０ ２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ；－８０℃で凍結（参照）
結果を以下の表に列挙する：
３つ全てのＴＣＢが、ストレス負荷後に中程度の結合喪失を伴う許容され得る安定性プロファイルを示す。さらに、熱安定性は、ＤＬＳ（Ｔａｇｇ）によって測定され、ヒトＩｇＧについて知られている正常範囲内である。ＲＡＣ結合は、実施例２に記載のように表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって決定した。
実施例１１
Ｔ細胞上に発現したＣＤ３への二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体（Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体）の結合（フローサイトメトリーによって評価した場合）
簡潔には、１００ｍｌの新鮮な血液を三角フラスコに採取し、１００ｍｌの単離緩衝液（２％ＦＢＳ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）と混合した。次いで、２５ｍｌの懸濁液を５０ｍｌチューブ内の１５ｍｌのフィコール上に慎重に移し、制動なしで８００ｇで１５分間遠心分離した。次いで、フィコール勾配中のＰＢＭＣ層を、単離緩衝液を含む新しい５０ｍｌチューブに移し、４℃で１０分間３００ｇで遠心分離した。次いで、ＰＢＭＣを２回洗浄し、細胞を１０ｍｌの単離緩衝液にプールした。ＰＢＭＣを更に使用するまで－８０℃で凍結した。Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ陰性選択ヒトＴ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、＃１７９５１）を製造業者の説明書に従って使用してＰＢＭＣから単離した。次いで、Ｔ細胞へのＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢの結合をフローサイトメトリーによって測定した。簡潔には、５００μｌのＴ細胞（５×１０５細胞）を各ＦＡＣＳチューブに添加した。Ｔ細胞を２ｍｌの染色緩衝液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で洗浄し、３００ｇで４℃で５分間遠心分離した。ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢを培地中５～０．０５μｇ／ｍｌの範囲の異なる濃度で希釈した。次いで、Ｔ細胞を１００μｌのＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢ希釈液に再懸濁し、４℃の暗所で３０分間インキュベートした。２ｍｌの染色緩衝液で１回洗浄した後、細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、次いで、暗所において４℃で３０分間、１００μｌの二次抗体希釈物（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識抗ヒトＩｇＧ、１：２００）に再懸濁した。Ｔ細胞を２ｍｌの染色緩衝液で２回洗浄し、４℃で５分間、３００ｇで遠心分離した。最後に、細胞を５００μｌの培地に再懸濁し、Ｔ細胞へのＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢの結合をＢＤ ＬＳＲ上で検出した。ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢ Ｐ１ＡＦ７９７７（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｐ０３５）；異なる濃度のＴ細胞上のＣＤ３に対するＰ１ＡＦ７９７８（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｃｌ２２）及びＰ１ＡＦ７９７９（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｖ９）の結合を図７に示す。
実施例１２
細胞上に発現した天然又は組換えＨＬＡ－Ｇへの二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体（Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体）の結合（フローサイトメトリーによって評価した場合）
異なる細胞及び細胞株で発現されたＨＬＡ－Ｇに対する抗ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢ ｍＡｂの結合能をＦＡＣＳ分析によって評価した。天然のＨＬＡ－Ｇ発現ＪＥＧ３腫瘍細胞又はＳｋｏｖ３トランスフェクタント及びそれぞれの親の非トランスフェクト細胞への結合が記載されれる。
フローサイトメトリー分析のため、細胞を４℃で抗ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢ ｍＡｂで染色した。簡潔には、２５μｌ／ウェルの各細胞懸濁液（５×１０４細胞／ウェル）をポリプロピレン９６ウェルＶ底プレートに移し、５℃の冷蔵庫で１０分間予冷した。抗ＨＬＡ－Ｇ試料を染色緩衝液で８０μｇ／ｍｌの２倍の開始濃度に希釈した。抗体の４倍連続希釈を行い、２５μｌ／ウェルの抗体溶液を調製した細胞に添加し、５℃で１時間インキュベートした。細胞を２００μｌ／ウェルの染色緩衝液で２回洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離した。その後、細胞ペレットを２５μｌの染色緩衝液に再懸濁した。検出のため、蛍光標識抗種抗体（ＰＥに抱合化したロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＃７０９－１１６－１４９）を染色緩衝液で１：１００に希釈し、２５μｌ／ウェルの検出抗体を細胞懸濁液に添加した。５℃で１時間インキュベートした後、細胞を染色緩衝液で再び２回洗浄し、７０μｌの染色緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで測定した。二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体（Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体）Ｐ１ＡＦ７９７７（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｐ０３５）；Ｐ１ＡＦ７９７８（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｃｌ２２）及びＰ１ＡＦ７９７９（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｖ９）は、ＨＬＡＧでトランスフェクトされたＪＥＧ３細胞及びＳＫＯＶ３細胞への結合を示した（図８を参照されたい）。ＦＡＣＳ結合のＥＣ５０値を以下の表に列挙する。
実施例１３
二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体（Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体）のＩＬＴ２及び－４結合阻害
Ｆｃタグ付きＩＬＴ２及びＩＬＴ４をそれぞれＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートにコーティングすることによって、ＥＬＩＳＡを設定した。インキュベーション及び洗浄工程の後、それぞれの抗体を１００ｎＭの濃度で添加する。可溶性Ｈｉｓタグ化単量体、二量体又は三量体ＨＬＡ－Ｇをウェルに添加した。インキュベーション及び洗浄工程の後、結合した受容体の検出を抗Ｈｉｓ抗体－ＰＯＤ抱合体によって行った。阻害率（％）を、抗ＨＬＡ－Ｇ又はＩＬＴ２／４抗体を含まないＩＬＴ２／４＋ＨＬＡ－Ｇ（一量体、二量体又は三量体）を有するウェルから得られた値と比較して計算し（１００％結合＝０％阻害）、以下の表に示す。
実施例１４
二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体（Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体）はＴ細胞によるＩＦＮガンマ分泌を媒介した
組換えＨＬＡ－ＧでトランスフェクトしたＳＫＯＶ３細胞（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）及び内因性ＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ３細胞を使用して、ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の存在下でＴ細胞によるＩＦＮガンマ分泌を誘導する抗ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢの能力を試験した。ＩＦＮガンマ分泌をＬｕｍｉｎｅｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって検出した。ＴＣＢ治療後のＴ細胞によるＩＦＮガンマ分泌の測定のため、ＰＢＭＣとＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ細胞又はＪＥＧ３細胞との共培養物を抗ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢと共にインキュベートした。簡潔には、ＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ Ｔｕｂｅｓ（ＰＡＮ＃Ｐ０４－６０１２５）を使用する密度勾配遠心分離によってヒト末梢血から単離した。ＰＢＭＣ及びＳＫＯＶ ３ ＨＬＡ－Ｇ細胞を１０：１の比率で９６ウェルＵ字底プレートに播種する。次いで、共培養物を、図（図９）に示されるように異なる濃度でＨＬＡ－Ｇ－ＴＣＢと共にインキュベートし、５％Ｃｏ２を含むインキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートした。翌日、上清を回収し、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ ＭＡＰキット（Ｌｕｍｉｎｅｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造業者の説明書に従って使用してＩＦＮガンマ分泌を測定した。二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３（Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ））抗体Ｐ１ＡＦ７９７７（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｐ０３５）；Ｐ１ＡＦ７９７８（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｃｌ２２）及びＰ１ＡＦ７９７９（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｖ９）は、Ｔ細胞によるＩＦＮガンマ分泌を誘導した（図９）。ＥＣ５０値を以下の表に列挙する。
実施例１５
二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体（Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体）によるＴ細胞媒介性細胞傷害／腫瘍細胞殺傷の誘導
ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の存在下でＴ細胞媒介性細胞傷害を誘導する抗ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢの能力を、組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ ３ ＨＬＡ－Ｇ）でトランスフェクトしたＳＫＯＶ３細胞及び内因性ＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ３細胞で試験した。細胞傷害を、ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢによる治療後の細胞におけるカスパーゼ８活性化を測定することによって検出した。ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体（ＴＣＢ）治療後のカスパーゼ８活性化の測定のため、ＰＢＭＣとＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ細胞又はＪＥＧ３細胞との共培養物を抗ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢと共に２４時間インキュベートし、カスパーゼ８活性化を、カスパーゼ８ Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ８２００）を用いて測定した。簡潔には、ＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ Ｔｕｂｅｓ（ＰＡＮ＃Ｐ０４－６０１２５）を使用する密度勾配遠心分離によってヒト末梢血から単離した。ＰＢＭＣ及びＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ又はＪＥＧ３細胞を、黒色透明底９６ウェルプレートに１０：１（１００μｌ／ウェル）の比で播種した。次いで、共培養物を、図（図１０）に示されるように異なる濃度でＨＬＡ－Ｇ－ＴＣＢと共にインキュベートし、５％Ｃｏ２を含むインキュベーター中、３７℃で２４時間又は４８時間インキュベートした。翌日、１００μｌのＣａｓｐａｓｅ８ Ｇｌｏ基質を各ウェルに添加し、室温で１時間シェーカー上に置いた。発光をＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ２機で測定した。カスパーゼ８活性化／細胞傷害に対応する相対発光単位（ＲＬＵ）をグラフにプロットする（図１０）。二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３（Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ））抗体Ｐ１ＡＦ７９７７（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｐ０３５）；Ｐ１ＡＦ７９７８（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｃｌ２２）及びＰ１ＡＦ７９７９（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｖ９）は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害／腫瘍細胞殺傷を誘導した。腫瘍細胞殺傷のＥＣ５０値を以下の表に列挙する。
実施例１６
組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）でトランスフェクトしたＳＫＯＶ３ヒト卵巣癌腫を有するヒト化ＮＳＧマウスにおける二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３（Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ））抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性
ヒト化ＮＳＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国によるＣＤ３４でヒト化されたＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ＋臍帯血細胞）マウス（ｎ＝１５）に、５×１０６個のＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ細胞を総体積１００μｌで皮下注射した。腫瘍が２００ｍｍ３の平均体積に達すると、マウスを無作為化し、毎週二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３（Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ））抗体（Ｐ１ＡＦ７９７７（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｐ０３５））（５ｍｇ／ｋｇ）で治療した。対照として、１群のマウスに週１回ヒスチジン緩衝液（ビヒクル）のｉ．ｖ．注射を行った。腫瘍体積を研究終了まで週２回測定した。この実験の結果を図１１に示す。結果は、２つの試験群においてノギスによって測定された腫瘍体積データ（中央値及び四分位範囲（ＩＱＲ））を示す。抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体Ｐ１ＡＦ７９７７は、ＳＫＯＶ３－ＨＬＡ－Ｇ腫瘍モデルにおいて強い腫瘍増殖阻害／腫瘍退縮を示した。
実施例１７
ヒト乳がんＰＤＸ腫瘍（ＢＣ００４）を有するヒト化ＮＳＧマウスにおける二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３（Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ））抗体の用量応答研究
ヒト化ＮＳＧ（マウスあたり１×１０５個のＣＤ３４＋臍帯血細胞の静脈内注射によってヒト化されたＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ－２ Ｒγｎｕｌｌ）マウスに、２×１０６個のＢＣ００４乳がん細胞を５０μＬの総体積で乳腺脂肪体内に注射した。腫瘍が約２００ｍｍ３の平均体積に達すると、マウスを無作為化し（ｎ＝動物１５匹／群）、二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３（Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ））抗体（Ｐ１ＡＦ７９７７（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｐ０３５））を用いて３つの異なる用量（５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ）で毎週治療した。対照として、１群のマウスに週１回ヒスチジン緩衝液（ビヒクル）のｉ．ｖ．注射を行った。ノギス測定によって腫瘍体積を週２回測定した。図１２に示される実験の結果は、腫瘍体積データ（中央値及び四分位範囲（ＩＱＲ））を実証する。抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の３つの用量は全て、ＢＣ００４腫瘍モデルにおいて強い腫瘍成長阻害／腫瘍退縮を示した。最高用量（５ｍｇ／ｋｇ）は、２．５ｍｇ／ｋｇ及び０．５ｍｇ／ｋｇの治療群と比較してわずかに高い有効性を示す。
実施例１８
組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）をトランスフェクトしたＳＫＯＶ３細胞において、ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の存在下でのＴ細胞活性化の誘導を二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体（Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体）によって試験した。
ＨＬＡ－Ｇ発現腫瘍細胞の存在下でＴ細胞を活性化する抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３ ＴＣＢの能力を、組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）でトランスフェクトしたＳＫＯＶ３細胞で試験した。Ｔ細胞の活性化を、Ｔ細胞上の細胞表面活性化マーカーＣＤ２５及び初期活性化マーカーＣＤ６９のＦＡＣＳ分析によって評価した。簡潔には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ Ｔｕｂｅｓ（ＰＡＮ＃Ｐ０４－６０１２５）を使用する密度勾配遠心分離によってヒト末梢血から単離する。ＰＢＭＣ及びＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ細胞を１０：１の比率で９６ウェルＵ字底プレートに播種する。次いで、共培養物を抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３（Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ））抗体（Ｐ１ＡＦ７９７７（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｐ０３５））（０．０１ｎＭ）と共にインキュベートし、５％Ｃｏ２を含むインキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートした。翌日、ＣＤ２５及びＣＤ６９の発現をフローサイトメトリーによって測定した。
フローサイトメトリー分析のため、細胞を、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５マウス抗ヒトＣＤ８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃５６５３１０）、ＰＥ－Ｃｙ７マウス抗ヒトＣＤ４（Ｂｉｏｌｏｇｅｎｄ＃３１７４１４）、ＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３５６１０６）及びＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ６９（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃５５５５３３）により４℃で染色する。簡潔には、抗体を２倍の濃度に希釈し、２５μｌの抗体希釈液を２５μｌの予備洗浄した共培養物と共に各ウェルに添加する。細胞を４℃で３０分間染色し、２００μｌ／ウェルの染色緩衝液で２回洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離する。細胞ペレットを２００μｌの染色緩衝液に再懸濁し、２μｇ／ｍｌの最終濃度で生死識別のためにＤＡＰＩで染色する。次いで、試料を、ＢＤ ＬＳＲフローサイトメーターを使用して測定する。ＦｌｏｗＪｏ Ｖ．１０．１ソフトウェアを使用してデータ分析を行った。図１４は、ＳＫＯＶ３ ＨＬＡＧ細胞の存在下での二重特異性抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３抗体Ｐ１ＡＦ７９７７（ＨＬＡ－Ｇ－００９０－ＶＬ－Ｓ３２Ｐ／ＣＤ３ Ｐ０３５）によるＴ細胞活性化の誘導を示す。

Claims (28)

  1. ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する抗体であって、
    Ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
    Ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、抗体。
  2. 前記抗体が、ヒト起源のＦｃドメインを含む、請求項１に記載の抗体。
  3. 前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧアイソタイプのものである、請求項２に記載の抗体。
  4. 前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１アイソタイプのものである、請求項３に記載の抗体。
  5. 前記抗体が、ヒト起源の定常領域を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. 前記定常領域が、ＩｇＧアイソタイプのものである、請求項５に記載の抗体。
  7. 前記定常領域が、ヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含む、ＩｇＧ１アイソタイプのものである、請求項６に記載の抗体。
  8. 前記抗体が、
    ａ）改変ヒトＨＬＡ－Ｇβ２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応せず、ＨＬＡ－Ｇ特異的アミノ酸がＨＬＡ－Ａコンセンサスアミノ酸によって置き換えられており、前記複合体が配列番号４０を含む、及び／又は
    ｂ）配列番号４１を含むマウスＨ２Ｋｄ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応しない、及び／又は
    ｃ）配列番号４３を含むラットＲＴ１Ａ β２Ｍ ＭＨＣ Ｉ複合体と交差反応しない、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
  9. 前記抗体が、
    ａ）ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６として寄託されたＪＥＧ３細胞で発現されるＨＬＡ－ＧのＩＬＴ２結合を阻害する；又は
    ｂ）ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６として寄託されたＪＥＧ３細胞で発現されるＨＬＡ－Ｇに結合し、ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３６として寄託されたＪＥＧ－３細胞で発現されるＨＬＡ－ＧへのＩＬＴ２結合を阻害する、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 前記抗体が多重特異性抗体である、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
  11. 前記抗体が、ヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体である、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
  12. 前記抗体がヒトＨＬＡ－Ｇ及びヒトＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分及びヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分を含み、
    ヒトＨＬＡ－Ｇに結合する第１の抗原結合部分が、
    Ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
    Ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
    ヒトＣＤ３に結合する第２の抗原結合部分が、
    Ｃ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
    Ｄ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含むか、又は
    Ｅ）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項１０に記載の抗体。
  13. 第１の抗原結合部分が、
    配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
    第２の抗原結合部分が、
    配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号５９のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項１２に記載の二重特異性抗体。
  14. 第１の抗原結合部分が、
    配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
    第２の抗原結合部分が、
    配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項１２に記載の二重特異性抗体。
  15. 第１の抗原結合部分が、
    配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、
    第２の抗原結合部分が、
    配列番号７４のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項１２に記載の二重特異性抗体。
  16. 前記二重特異性抗体が、
    ａ）ＨＬＡ－ＧへのＩＬＴ２及び／又はＩＬＴ４の結合の阻害、及び／又は
    ｂ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）でトランスフェクトしたＳＫＯＶ３細胞上及び／又は内因性ＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ３細胞上でのＴ細胞による抗体媒介ＩＦＮガンマ分泌（ＩＦＮガンマ分泌が検出された）、及び又は
    ｃ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ ３ＨＬＡ－Ｇ）でトランスフェクトしたＳＫＯＶ３細胞及び／又は内因性ＨＬＡ－Ｇを発現するＪＥＧ３細胞に対するＴ細胞媒介細胞傷害／腫瘍細胞殺傷（細胞傷害は、二重特異性抗体で処置した後の細胞におけるカスパーゼ８活性化を測定することによって検出された）、及び／又は
    ｄ）組換えＨＬＡ－Ｇ（ＳＫＯＶ３ ＨＬＡ－Ｇ）ヒト化ＮＳＧマウスでトランスフェクトしたＳＫＯＶ３ヒト卵巣癌腫を有するヒト化ＮＳＧマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性／腫瘍退縮、及び／又は
    ｅ）ヒト乳がんＰＤＸ腫瘍（ＢＣ００４）を有するヒト化ＮＳＧマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性／腫瘍退縮、を示す、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  17. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードする、単離された核酸。
  18. 請求項１７に記載の核酸を含む宿主細胞。
  19. 前記宿主細胞が、真核生物宿主細胞である、請求項１８に記載の宿主細胞。
  20. 請求項１８又は１９に記載の宿主細胞を培養して、前記抗体又は二重特異性抗体を産生することを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の製造方法。
  21. 前記抗体又は二重特異性抗体を前記宿主細胞から回収することを更に含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記抗体が真核生物宿主細胞において産生される、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  23. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬製剤。
  24. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む、医薬。
  25. がんを治療するための医薬であって、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む、医薬。
  26. 医薬の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
  27. 前記医薬ががんの治療用である、請求項２６に記載の使用。
  28. がんを治療するための医薬であって、有効量の請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項１１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む、医薬。
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