TW202342543A - 抗 hla-g 抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及結合至人類 HLA-G 之抗體、其多特異性抗體、該等抗體的製備、調配物及使用其等之方法。

Description

抗　HLA-G　抗體及其用途
本發明涉及抗 HLA-G 抗體、該等抗體的製備、調配物及使用其等之方法。
人類主要組織相容性複合物 (I 類，位於第 6 號染色體上) 亦稱為人類白細胞抗原 G (HLA-G)，是一種在人體內由 HLA-G 基因編碼的蛋白質。HLA-G 屬於 HLA 非典型 I 類重鏈旁系同源物。該 I 類分子係由一條重鏈及一條輕鏈組成的異二聚體 (β-2 微球蛋白)。重鏈錨定於膜中，但亦可脫落/分泌。 l  重鏈由三個域組成：α1、α2 及 α3。α1 及 α2 域形成肽結合槽，其側翼為兩個 α 螺旋。類似於其他 MHC I 蛋白，小分子肽 (約 9 個單體單元) 可結合至該槽。 l  第二條鏈為 β-2 微球蛋白，其結合至重鏈，與其他 MHC I 蛋白類似。
HLA-G 具有 7 種同功型，其中包括 3 種分泌型及 4 種膜結合型 (如圖 1 所示意性地示出)。
HLA-G 可形成功能活性複合物寡聚結構 (Kuroki, K 等人 Eur J Immunol. 37 (2007) 1727–1729)。在兩個 HLA-G 分子的 Cys 42 之間形成由二硫鍵連接的二聚體。(Shiroishi M 等人 J Biol Chem 281 (2006) 10439-10447。三聚體及四聚體複合物亦已闡述於例如以下文獻中：Kuroki, K 等人 Eur J Immunol. 37 (2007) 1727–1729；Allan D.S. 等人 J Immunol Methods.268 (2002) 43-50；及 T Gonen-Gross 等人 J Immunol 171 (2003)1343-1351)。
HLA-G 主要在胎盤的滋胚內層上表現。若干腫瘤 (包括胰臟、乳房、皮膚、大腸直腸、胃及卵巢) 表現 HLA-G (Lin, A. 等人, Mol Med. 21 (2015) 782–791；Amiot, L. 等人, Cell Mol Life Sci. 68 (2011) 417–431)。亦有報道稱該表現與炎症性疾病、GvHD 及癌症等病理狀況有關。據報導，HLA-G 之表現與癌症之不良預後有關。腫瘤細胞經由 HLA-G 表現誘導免疫耐受/抑制以逃避宿主免疫監視。
HLA-G 與其他 MHC I 分子具有高度同源性 (＞98%)，因此難以產生對其他 MHC I 分子無交叉反應性的真正的 HLA-G 特異性抗體。
先前描述了某些以不同方式與 HLA-G 交互作用的抗體：Tissue Antigens, 55 (2000) 510-518 涉及單株抗體，例如 87G 及 MEM-G/9；Neoplasma 50 (2003) 331-338 涉及某些可識別完整 HLA-G 寡聚複合物 (例如 87G 及 MEM-G9) 以及不含 HLA-G 的重鏈 (例如 4H84、MEM-G/1 及 MEM-G/2) 兩者的單株抗體；Hum Immunol. 64 (2003) 315-326 涉及在表現 HLA-G 的 JEG3 腫瘤細胞上測試的若干抗體 (例如，專門與天然 HLA-G1 分子反應的 MEM-G/09 及 MEM-G/13。MEM-G/01 識別 (類似於 4H84 mAb) 所有同功型的變性 HLA-G 重鏈，而 MEM-G/04 識別選擇性變性的 HLA-G1、HLA-G2 及 HLA-G5 同功型)；Wiendl 等人 Brain 2003 176-85 涉及不同的單株 HLA-G 抗體，例如 87G、4H84、MEM-G/9。
上述出版物報告了結合至人類 HLA-G 或人類 HLA-G-ß2M MHC 複合物的抗體。但是，由於 HLA 家族的高多型性及高同源性，大多數抗體缺乏真正的特異性 HLA-G 結合特性，並且通常亦與其他 HLA 家族成員 (作為與 ß2M 之 MHC 複合物或以其 ß2M 游離形式) 結合或交叉反應，或者它們根本不抑制 HLA-Gß2M MHC 複合物與其受體 ILT2 及/或 ILT4 的結合 (被視為非拮抗性抗體)。
WO2019/202040 涉及 HLA-G 抗體，該等抗體包括抗體 HLA-G-0090。WO 2019/202041 涉及多特異性 HLA-G 抗體，該等抗體包括抗體 HLA-G-0090。
本文所述之本發明提供一種結合至人類 HLA-G 之抗體，該抗體包含 A) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列，或 B) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列。
本發明的一個實施例為結合至人類 HLA-G 的抗體，其中該抗體 A) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列；或 B) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列。
本發明的一個實施例為結合至人類 HLA-G 的抗體，其中該抗體包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列。
本發明的一個實施例為結合至人類 HLA-G 的抗體，其中該抗體包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列。
該等抗體具有非常有價值的特性，例如其結合特性、其對 HLA-G 具有高度特異性而對來自其他物種的 HLA-A 及 HLA MHC I 複合物無交叉反應性。它們可結合至細胞上的 HLA-G 並抑制 ILT2 及/或 ILT4 與這些細胞上表現之 HLA-G 的結合。它們由 HLA-G 抗體 HLA-G-0090 產生。
由於 WO 2019/202040 中所述的 HLA-G 抗體 HLA-G-0090 在其中一個 CDR 中包含醣基化位點 (CDR-L1，其在輕鏈 (LC) 的胺基酸 31、32 及 33 處包含 NSS 基序)，因此其結合特性受 N-醣基化的影響，構成潛在的可開發性缺陷。
HLA-G-0090 可變區的同源模型表明輕鏈 (LC) 位置 31 至 33 的溶劑可及性高。此外，預計 N31 及 S32 的側鏈向內指向 CDR-H3 的方向，使它們可能成為抗體互補位之一部分的候選物。實際上，許多已發表的抗體-抗原 X 射線複合物結構記錄到這些殘基與抗原發生化學交互作用。因此，在 LC 位置 31-33 處引入突變後導致抗體的結合親和力下降的風險很高。因此，設計在 LC 位置 31、32 和 33 處具有突變的抗體 HLA-G-0090 的各種變異體，但大多數變異體使結合特性或表現能力下降。出人意料的是，發現在去除醣基化位點的 HLAG-0090 的這些各種變異體中，僅兩種變異體 HLA-G-0090-VL-S32P 及 HLA-G-0090-VL-S33A 表現出甚至改善的結合特性、良好的表現能力及穩定性，同時在 LC 的 CDR-L1 處不再顯示 N-醣基化 (因此無法偵測到 Fab 醣基化)。由於所有最近批准的醫藥抗體產品皆在哺乳動物細胞中產生，尤其是 CHO 細胞 (參見例如 Walsh G., Nature Biotech (2018) 1136-1145)，因此提供一種在結合區 (VH 及 VL，且尤其是 CDR) 無醣基化位點的抗體代表了一個有價值的優勢，因為這些抗體可易於用於哺乳動物表現系統的生產，而不藉由醣基化而 (至少部分地) 損害結合特性。
在另一個實施例中，本發明之 HLA-G 抗體包含人類來源的 Fc 域。在一個實施例中，Fc 域屬於 IgG 同型，在一個較佳的實施例中屬於 IgG1 同型。
在另一個實施例中，本發明之 HLA-G 抗體為雙特異性抗體，特定而言為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含結合至人類 HLA-G 之第一抗原結合部分及結合至人類 CD3 之第二抗原結合部分。
在一個實施例中，本發明之 HLA-G 抗體為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含結合至人類 HLA-G 之第一抗原結合部分及結合至人類 CD3 之第二抗原結合部分， 其中該結合至人類 HLA-G 之第一抗原結合部分包含 A) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列，或 B) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列； 且其中結合至 T 細胞活化抗原之該第二抗原結合部分結合至人類 CD3，該第二抗原結合部分包含 C) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 56 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列，或 D) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列，或 E) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 71 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 72 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列。
本發明的一個實施例為該等雙特異性抗體， 其中該第一抗原結合部分 A) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列；或 B) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列， 且其中該第二抗原結合部分 C) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；或 D) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；或 E) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。
本發明的一個實施例為該等雙特異性抗體， 其中該第一抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列； 且其中該第二抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列。
本發明的一個實施例為該等雙特異性抗體， 其中該第一抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列； 且其中該第二抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列。
本發明的一個實施例為該等雙特異性抗體， 其中該第一抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列； 且其中該第二抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。
該等結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 之雙特異性抗體除具有 HLA-G 抗體之特性以外，亦表現出另外的有價值的特性，例如藉由表現 HLA-G 的細胞上之 T 細胞誘導抗體所介導的 IFN γ 分泌、在表現 HLA-G 的腫瘤細胞存在之情況下活化 T 細胞、在表現 HLA-G 的細胞上誘導 T 細胞所介導的腫瘤細胞毒殺以及在不同的癌症異種移植小鼠模型中具有活體內抗腫瘤效力甚至腫瘤消退作用。
本發明提供一種分離之核酸，該核酸編碼如本文所述之抗體或雙特異性抗體。
本發明提供一種包含該等核酸的宿主細胞。
本發明提供一種產生抗體之方法，該方法包含培養宿主細胞，從而產生該抗體。
本發明提供該等產生抗體的方法，該方法進一步包含從宿主細胞回收該抗體。
本發明提供一種由該等宿主細胞產生的抗體，其中該宿主細胞為真核細胞。
本發明提供一種醫藥調配物，該醫藥調配物包含本文所述之抗體及醫藥上可接受之載劑。
本發明提供本文所述之抗體，其用為藥物。
本發明提供本文所述之抗體，其用於治療癌症。
本發明提供本文所述之抗體在製造藥物中之用途。在一個實施例中，該藥物用於治療癌症。
本發明提供一種治療罹患癌症的個體的方法，該方法包含投予該個體有效量之本文所述之抗體。
當在本文中使用時，術語「HLA-G」、「人類 HLA-G (human HLA-G)」、「HLAG」是指 HLA-G 人類主要組織相容性複合物 I 類 G，亦稱為人類白細胞抗原 G (HLA- G) (例示性 SEQ ID NO: 35)。通常，HLA-G 與 β2 微球蛋白 (B2M 或 β2m) 一起形成 MHC I 類複合物。在一個實施例中，HLA-G 是指 HLA-G 與 β2 微球蛋白的 MHC I 類複合物。在一較佳的實施例中，HLA-G 是指 HLA-G 及 β2 微球蛋白的細胞表面結合 MHC I 類複合物，亦稱為 HLA-G1 (參見本說明書的圖 1，以及例如 Blasschitz 等人，Molecular Human Reproduction，11(2005) 699-710，尤其是圖 1)。
如本文所使用，「結合至人類 HLA-G」、「特異性結合至人類 HLA-G」、「與人類 HLA-G 結合」或「抗 HLA-G」的抗體 (單特異性抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體) 或抗原結合部分是指以 5.0 × 10 -8mol/l 或更低之 K D值結合親和力特異性結合至人類 HLA-G 抗原或其胞外域 (ECD) 的抗體/抗原結合部分；在一個實施例中，K D值為 1.0 × 10 ‑9mol/l 或更低；在一個實施例中，K D值為 5.0 × 10 ‑8mol/l 至 1.0 × 10 -13mol/l。在一個實施例中，抗體結合至 HLA-G ß2M MHC I 複合物，該複合物包含 SEQ ID NO: 39。
結合親和力用標準結合測定法諸如表面電漿子共振技術 (BIAcore®，GE-Healthcare Uppsala，Sweden) 測定，例如使用包含 HLA-G 胞外域 (例如，在其天然存在的 3 維結構中) 的構建體。在一個實施例中，結合親和力用標準結合測定法測定，其中使用包含 MHC I 類複合物的例示性可溶性 HLA-G，該複合物包含 SEQ ID NO: 39。
HLA-G 具有規則的 MHC I 折疊並由兩條鏈組成：鏈 1 由三個域組成：α1、α2 及 α3。α1 及 α2 域形成肽結合槽，其側翼為兩個 α 螺旋。類似於其他 MHCI 蛋白，小分子肽 (約 9 個單體單元) 可結合至該槽。鏈 2 為 β2 微球蛋白 (ß2M)，其與各種其他 MHCI 蛋白共享。
HLA-G 可形成功能活性複合物寡聚結構 (Kuroki, K 等人 Eur J Immunol. 37 (2007) 1727–1729)。在兩個 HLA-G 分子的 Cys 42 之間形成由二硫鍵連接的二聚體。(Shiroishi M 等人 J Biol Chem 281 (2006) 10439-10447。三聚體及四聚體複合物亦已闡述於例如以下文獻中：Kuroki, K 等人 Eur J Immunol. 37 (2007) 1727–1729；Allan D.S. 等人 J Immunol Methods.268 (2002) 43-50；及 T Gonen-Gross 等人 J Immunol 171 (2003)1343-1351)。與大多數其他 MHC I 類分子不同，HLA-G 具有若干游離的半胱胺酸殘基。Boyson 等人, Proc Nat Acad Sci USA, 99: 16180 (2002) 報導了 HLA-G5 的重組可溶形式可經由分子間 Cys42-Cys42 二硫鍵形成二硫鍵連接的二聚體。此外，膜結合形式的 HLA-G1 亦可在內源性表現 HLA-G 的 JEG3 細胞株之細胞表面上形成二硫鍵連接的二聚體。在滋胚層細胞的細胞表面上亦已發現二硫鍵連接的二聚體形式的 HLA-G1 及 HLA-G5 (Apps, R., Tissue Antigens, 68:359 (2006))。
HLA-G 主要在胎盤的滋胚內層上表現。若干腫瘤 (包括胰臟、乳房、皮膚、大腸直腸、胃及卵巢) 表現 HLA-G (Lin, A. 等人, Mol Med. 21 (2015) 782–791；Amiot, L. 等人, Cell Mol Life Sci. 68 (2011) 417–431)。亦有報道稱該表現與炎症性疾病、GvHD 及癌症等病理狀況有關。據報導，HLA-G 之表現與癌症之不良預後有關。腫瘤細胞經由 HLA-G 表現誘導免疫耐受/抑制以逃避宿主免疫監視。
HLA-G 具有 7 種同功型，其中包括 3 種分泌型及 4 種膜結合型 (如圖 1 所示意性地示出)。HLA-G 的最重要的功能同功型包括與 b2-微球蛋白 (ß2M) 相關聯之 HLA-G1 及 HLA-G5。然而，這些同功型的耐受免疫效應有所不同，其取決於配體的形式 (單體、二聚體) 及配體-受體交互作用的親和力。
HLA-G 蛋白可使用標準分子生物學技術產生。HLA-G 同功型的核酸序列是本領域已知的。參見例如 GENBANK 存取編號 AY359818。
HLA-G 異構體形式通過 ILT、特定而言為 ILT2、ILT4 或其組合促進訊息傳導。
ILT：ILT 表示 Ig 型活化和抑制受體，其參與調節免疫細胞活化並控制免疫細胞之功能 (Borges, L. 等人, Curr Top Microbial Immunol, 244:123-136 (1999))。ILT 分為三組：(i) 抑制性 ILT，其含有細胞質免疫受體酪胺酸基抑制性基序 (ITIM) 並傳導抑制性訊息 (ILT2、ILT3、ILT4、ILT5 及 LIR8)； (ii) 活化 ILT，其在跨膜域 (ILT1、ILT7、ILT8 及 LIR6α) 中含有短細胞質尾部及帶電荷之胺基酸殘基，並通過 Fc 受體之相關共有 γ 鏈的細胞質免疫受體酪胺酸基活化基序 (ITAM) 遞送活化訊息；及 (iii) 缺乏跨膜域的可溶性分子 ILT6。最近許多研究強調了 ILT 在抗原呈遞細胞 (APC) 之表面的免疫調節作用。ILT2、ILT3 及 ILT4 受體為得到最充分表徵的免疫抑制受體，其在各種免疫細胞上表現，包括單核球、B 細胞、樹突細胞、漿細胞樣樹突細胞以及 NK 與 T 細胞之亞群。在 T 細胞亞群上表現的 ILT2 已被證明在連接時抑制這些細胞的活化及增殖 (Colonna M. 等人, J Immunol. 20011, 66:2514-2521, J Immunol 2000; 165:3742-3755)。ILT3 及 ILT4 藉由將未成熟之 DC 暴露於已知的免疫抑制因子 (包括 IL-10、維生素 D3 或抑制性 CD8 T 細胞) 而調升 (Chang, C. C. 等人, Nat Immunol, 3:237-243 (2002))。DC 上 ILT 之表現受炎症性刺激、細胞激素和生長因子的嚴格控制，並在 DC 活化後調降 (Ju, X. S. 等人, Gene, 331:159-164 (2004))。ILT2 及 ILT4 受體之表現受組蛋白乙醯化的嚴格調節，其有助於嚴格控制僅發生於骨髓系細胞中的基因表現 (Nakajima, H., J Immunol, 171:6611-6620 (2003))。
抑制性受體 ILT2 及 ILT4 的參與改變了單核球之細胞激素及趨化因子分泌/釋放特徵，並可抑制 Fc 受體傳訊 (Colonna, M. 等人 J Leukoc Biol, 66:375-381 (1999))。ILT3 對 DC 的作用及功能已由 Suciu-Foca 群組精確描述 (Suciu-Foca, N., Int Immunopharmacol, 5:7-11 (2005))。儘管 ILT3 之配體未知，但已知 ILT4 與 HLA I 類分子 (HLA-A、HLA-B、HLA-C 及 HLA-G) 的第三域結合，與 CD8 競爭 MHC I 類結合 (Shiroishi, M., Proc Natl Acad Sci USA, 100:8856-8861 (2003))。若干抑制性 ILT 受體的優先配體為 HLA-G。HLA-G 在母胎耐受及腫瘤細胞逃避免疫識別及破壞的機制中發揮潛在作用 (Hunt, J. S. 等人, Faseb J, 19:681-693 (2005))。藉由 HLA-G-ILT 交互作用對 DC 功能的調節最有可能是 DC 生物機制中的一條重要途徑。已測定高度表現 ILT2 及 ILT4 受體的人單核球衍生之 DC，當用 HLA-G 處理並用同種異體 T 細胞刺激時，仍然保持穩定的耐受樣表型 (CD80low、CD86low 及 HLA-DRlow) 誘導 T 細胞無反應性的潛力 (Ristich, V. 等人, Eur J Immunol, 35:1133-1142 (2005))。此外，HLA-G 與高度表現 ILT2 和 ILT4 受體的 DC 交互作用導致參與 MHC II 類呈遞途徑的若干基因下調。由專業 APC 大量表現的溶酶體硫醇還原酶 IFN-γ 誘導型溶酶體硫醇還原酶 (GILT) 在經 HLA-G 修飾之 DC 中大大減少。GILT 的 DC 表現可影響致敏的 CD4+ T 細胞的組庫（repertoire），因為在靶向基因破壞後缺乏 GILT 的動物中，活體內 T 細胞對選擇抗原的反應下降 (Marie, M. 等人, Science, 294:1361-1365 (2001))。DC 上的 HLA-G/ILT 交互作用干擾 MHC II 類分子組裝並轉運至細胞表面，其可能導致結構異常的 MHC II 類分子之呈遞或表現效率下降。已測定 HLA-G 顯著降低了人單核球衍生之 DC 高表現 ILT 抑制性受體上不變鏈 (CD74)、HLA-DMA 及 HLA-DMB 基因的轉錄 (Ristich, V. 等人，Eur J Immunol 35:1133-1142 (2005))。
HLA-G 的另一種受體為 KIR2DL4，因為 KIR2DL4 結合至表現 HLA-G 的細胞 (US2003232051；Cantoni, C. 等人 Eur J Immunol 28 (1998) 1980；Rajagopalan, S. 及 E. O. Long.[更正發表於 J Exp Med 191 (2000) 2027] J Exp Med 189 (1999) 1093；Ponte, M. 等人 PNAS USA 96 (1999) 5674)。KIR2DL4 (亦稱為 2DL4) 為 KIR 家族成員 (亦稱為 CD158d)，與活化及抑制受體共享結構特徵 (Selvakumar, A. 等人 Tissue Antigens 48 (1996) 285)。2DL4 具有細胞質 ITIM，表明具有抑制功能，並在跨膜區具有帶正電荷的胺基酸，其為活化 KIR 的典型特徵。與其他選殖分佈的 KIR 不同，2DL4 由所有 NK 細胞轉錄 (Valiante, N. M. 等人 Immunity 7 (1997) 739；Cantoni, C. 等人 Eur J Immunol 28 (1998) 1980；Rajagopalan, S. 及 E. O. Long.[更正發表於 J Exp Med 191 (2000) 2027] J Exp Med 189 (1999) 1093)。
HLA-G 亦被證明與細胞毒性 T 細胞上之 CD8 交互作用 (Sanders 等人, J. Exp. Med., 174 (1991), 737–740)，並在活化的 CD8 陽性細胞毒性 T 細胞中誘導 CD95 所介導之細胞凋亡 (Fournel 等人, J. Immun., 164 (2000), 6100-6104)。據報道，這種消除細胞毒性 T 細胞的機制為妊娠、炎症性疾病及癌症中免疫逃逸及誘導耐受性的機制之一 (Amodio G. 等人, Tissue Antigens, 84 (2014), 255-263)。
如本文所使用，與經修飾的人類 HLA-G ß2M MHC I 複合物「不發生交叉反應」或「不與之 (特異性) 結合」的抗 HLA-G 抗體 (單特異性抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體) 或抗原結合部分是指實質上不與任何這些逆抗原結合的抗 HLA-G 抗體 (單特異性抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體) 或抗原結合部分，其中 HLA-G 特異性胺基酸已被 HLA-A 共同胺基酸替換，該複合物包含 SEQ ID NO:40；小鼠 H2Kd ß2M MHC I 複合物包含 SEQ ID NO:41；大鼠 RT1A ß2M MHC I 複合物包含 SEQ ID NO:43，人類 HLA-A2 ß2M MHC I 複合物包含 SEQ ID NO:35 及 SEQ ID NO: 33。在一個實施例中，與經修飾的人類 HLA-G ß2M MHC I 複合物「不發生交叉反應」或「不與之 (特異性) 結合」的抗 HLA-G 抗體 (單特異性抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體) 或抗原結合部分是指在例如表面電漿子共振測定法 (如實例 2 中所述) 中未表現出顯著之結合/交互作用的抗 HLA-G 抗體 (單特異性抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體) 或抗原結合部分，其中 HLA-G 特異性胺基酸已被 HLA-A 共同胺基酸替換，該複合物包含 SEQ ID NO:40；小鼠 H2Kd ß2M MHC I 複合物包含 SEQ ID NO:41；大鼠 RT1A ß2M MHC I 複合物包含 SEQ ID NO:43，且/或人類 HLA-A2 ß2M MHC I 複合物包含 SEQ ID NO:35 及 SEQ ID NO: 33。該結合/交互作用用標準結合測定法諸如表面電漿子共振技術 (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden) 與相應抗原測定：經修飾的人類 HLA-G ß2M MHC I 複合物，其中 HLA-G 特異性胺基酸已被 HLA-A 共同胺基酸替換，該複合物包含 SEQ ID NO:40；小鼠 H2Kd ß2M MHC I 複合物包含 SEQ ID NO:41；大鼠 RT1A ß2M MHC I 複合物包含 SEQ ID NO:43 且/或人類 HLA-A2 ß2M MHC I 複合物包含 SEQ ID NO:35 及 SEQ ID NO: 33。該測定設置以及抗原之構建/製備如實例中所述。
術語「抑制 ILT2 與 JEG-3 細胞 (ATCC HTB36) 上 HLA-G 之結合)」是指在如實例 5 中所述之測定中抑制 (重組) ILT2 的結合交互作用。
如本文中所使用的「活化 T 細胞抗原 (activating T cell antigen)」，係指在 T 淋巴細胞 (特定而言細胞毒性 T 淋巴細胞) 之表面上表現之抗原決定位，其能夠在與抗體交互作用時誘導 T 細胞活化。具體而言，抗體與活化 T 細胞抗原之交互作用可藉由觸發 T 細胞受體複合體之傳訊級聯來誘導 T 細胞活化。在一特定實施例中，該活化 T 細胞抗原為 CD3，特定言之 CD3 之 ε 次單元 (參見 UniProt 編號 P07766 (第 189 版)，NCBI RefSeq 編號 NP_000724.1，就人序列而言，SEQ ID NO: 88；或 UniProt 編號 Q95LI5 (第 49 版)，NCBI GenBank 編號 BAB71849.1，就食蟹獼猴序列而言，SEQ ID NO: 108)。
除非另有說明，否則「CD3」係指源自任何脊椎動物的任何天然 CD3，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如人)、非人靈長類動物 (例如食蟹獼猴) 及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。CD3 為例示性活化的 T 細胞抗原。術語「CD3」涵蓋「全長」未經加工的 CD3 以及在細胞中加工所產生的任何形式之 CD3。該術語亦涵蓋天然 CD3 變異體，例如剪接變異體或等位基因變異體。在一實施例中，CD3 是人類 CD3，特別是人類 CD3 的 ε 次單元 (CD3ε)。人類 CD3ε 的胺基酸序列顯示於 UniProt (www.uniprot.org) 登錄號 P07766 (版本 189) 或 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_000724.1。亦可參見 SEQ ID NO: 88。食蟹獼猴 [Macaca fascicularis] CD3ε 的胺基酸序列顯示於 NCBI GenBank 號 BAB71849.1。亦可參見 SEQ ID NO: 89。
如本文所使用，「結合至人類 CD3」、「特異性結合至人類 CD3」、「與人類 CD3 結合」或「抗 CD3」的抗體 (單特異性抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體) 或抗原結合部分是指特異性結合至人類 CD3 抗原或其胞外域 (ECD) 的抗體 (單特異性抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體) 或抗原結合部分，其在表面電漿子共振測定中顯示出顯著的結合/交互作用。在一個實施例中，表示結合親和力的 K D值為 5.0 × 10 -8mol/l 或更低；在一個實施例中，K D值為 1.0 × 10 ‑9mol/l 或更低；在一個實施例中，K D值為 5.0 × 10 ‑8mol/l 至 1.0 × 10 -13mol/l。在一個實施例中，抗體結合至包含 SEQ ID NO: 88 的 CD3。
結合親和力用標準結合測定法諸如表面電漿子共振技術 (BIAcore®，GE-Healthcare Uppsala，Sweden) 測定，例如使用包含 HLA-G 胞外域 (例如，在其天然存在的 3 維結構中) 的構建體。在一個實施例中，結合親和力用標準結合測定法測定，其中使用包含 SEQ ID NO: 88 的例示性 CD3。
因此，結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 的多特異性或雙特異性抗體是指與如本文所述之人類 HLA-G 的 (第一) 抗原結合部分結合並與如本文所述之人類 CD3 的另一 (第二) 抗原結合部分結合的抗體，其包含結合至人類 HLA-G 的第一抗原結合部分及結合至人類 CD3 的第二抗原結合部分。
如本文中所使用的「T 細胞活化」，係指 T 淋巴細胞 (特定而言細胞毒性 T 淋巴細胞) 之一或多種細胞反應，選自：增殖、分化、細胞激素分泌、細胞毒性效應分子釋放、胞毒活性及活化標記之表現。測定 T 細胞活化之適宜分析係本技術中已知的並在本文中描述。
「受體人框架」為本文中之目的是如下述定義的衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架、包含輕鏈可變域 (VL) 框架或重鏈可變域 (VH) 框架的胺基酸序列之框架。「衍生自 (derived from)」人免疫球蛋白框架或人共有框架的受體人框架可包含與此等為相同的胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列的變更。在一些實施例中，胺基酸變化數為 10 或更少、9 或更少、8 或更少、7 或更少、6 或更少、5 或更少、4 或更少、3 或更少、或 2 或更少。在一些實施例中，VL 受體人類框架與 VL 人類免疫球蛋白框架序列或人類共同框架序列的序列相同。
本文中的術語「抗體」以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體 (例如，雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其等展示出所欲抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合的抗原之完整抗體的一部分。抗體片段之實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab’) 2、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子 (例如，scFv) 及抗原片段形成的多特異性抗體。
術語「雙特異性 (bispecific)」意指抗體能夠與至少二個不同的抗原決定位特異性結合。通常，雙特異性抗體包含兩個抗原結合位點或部分，其中每個抗原結合位點對不同抗原決定位具有特異性。在某些實施例中，雙特異性抗體能夠同時結合兩個抗原決定位，特定而言在兩種不同細胞上表現之兩個抗原決定位。
如本文中所使用的術語「化合價 (valent)」，表示抗體中存在指定數量之抗原結合位點。因此，術語「單價結合抗原 (monovalent binding to an antigen)」表示抗體中存在對抗原具有特異性之一個 (且不超過一個) 抗原結合位點。
如本文所使用之術語「抗原結合位點 (antigen binding site)」與「抗原結合部分 (antigen binding moiety)」可互換，並且是指提供與抗原之交互作用的抗體的位點，亦即一個或多個胺基酸殘基。例如，抗體之抗原結合位點包含來自互補決定區 (CDR) 之胺基酸殘基。未處理之 (native) 免疫球蛋白分子通常具有二個抗原結合位點，Fab 分子通常具有單個抗原結合位點。「抗原結合位點」及「抗原結合部分」是指特異性結合抗原決定位之多肽分子。在一個實施例中，抗原結合部分能夠將其所附著的實體 (例如第二抗原結合部分) 導引至標靶位點，例如導引至載有抗原決定位的特定類型之腫瘤細胞。在另一個實施例中，抗原結合部分能夠藉由其標靶抗原 (例如 T 細胞受體複合體抗原) 活化傳訊。抗原結合部分包括如本文進一步定義的抗體及其片段。特定抗原結合部分包括抗體之抗原結合域，其包含抗體重鏈可變區及抗體輕鏈可變區。在某些實施例中，抗原結合部分可包括如本文進一步定義及本技術中已知之抗體恆定區。可用之重鏈恆定區包括五種同型 (isotype) 中之任一者：α、δ、ε、γ 或 μ。可用之輕鏈恆定區包括二種同型中之任一者：κ 及 λ。在一較佳的實施例中，該等恆定區為人類來源。
如本文所使用，術語「抗原決定位 (antigenic determinant)」或「抗原 (antigen)」是指多肽大分子上的位點，抗原結合部分與該位點結合以形成抗原結合部分-抗原複合物。例如，可用之抗原決定位可存在於腫瘤細胞之表面上、受病毒感染之細胞之表面上、其他患病細胞之表面上、免疫細胞的表面上，不存在於血清中，及/或存在於細胞外基質 (ECM) 中。
術語「嵌合 (chimeric)」抗體指代其中重鏈及/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分源自不同來源或物種的抗體。
抗體之「類別 (class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG 及 IgM，且該等種類中之若干種可進一步分為亞類 (同型)，例如 IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgA 1及 IgA 2。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。在一較佳的實施例中，該等亞類 (同型) 為人類來源。在一較佳的實施例中，本發明之抗體屬於 IgG 同型，在另一較佳的實施例中屬於 IgG1 同型。
在一個態樣中，抗體包含人類來源的恆定區。在一個態樣中，抗體為包含人恆定區的免疫球蛋白分子，特定而言屬於 IgG 同型，更特定而言屬於 IgG1 同型，其包含人類 CH1、CH2、CH3 及/或 CL 域。人類恆定域的例示性序列在 SEQ ID NO: 47 及 SEQ ID NO: 48 (分別為人類 κ 和 λ CL 域) 以及 SEQ ID NO: 49 (人類 IgG1 重鏈恆定域 CH1-CH2-CH3) 或 SEQ ID NO: 50 (包含突變 L234A、L235A 及 P329G 的人類 IgG1 重鏈恆定區) 中給出。藥劑例如醫藥調配物的「有效量」是指在所需之給藥劑量和時間段內有效實現所需的治療或預防效果的量。
本文中的術語「Fc 域」或「Fc 區」，用於定義包含至少一部分恆定區的免疫球蛋白重鏈的 C 端區。該術語包括天然序列 Fc 區域和變異 Fc 區域。儘管 IgG 重鏈之 Fc 區之邊界可能略有變化，但通常將人 IgG 重鏈之 Fc 區定義為從 Cys226 或 Pro230 延伸至該重鏈之羧基端。但是，由宿主細胞產生的抗體可能經歷重鏈 C 端的一種或多種，特別是一種或兩種胺基酸之轉譯後切割。因此，由宿主細胞透過表現編碼全長重鏈的特定核酸分子而產生的抗體可包括全長重鏈，或者可包括全長重鏈的切割變異體 (在本文中也稱為「切割變異體重鏈」)。可能是這種情況，其中重鏈的最後兩個 C 端胺基酸為甘胺酸 (G446) 及離胺酸 (K447，根據 Kabat EU 索引編號)。因此，可以存在或可以不存在 Fc 區域之 C 端離胺酸 (Lys447) 或 C 端甘胺酸 (Gly446) 及離胺酸 (K447)。除非另有說明，否則包括 Fc 域 (或本文定義的 Fc 域的次單元) 之重鏈之胺基酸序列在本文中表示不含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽。在本發明的一個實施例中，如本文所指定之抗體或雙特異性抗體中所含之重鏈 (包含本文所指定之 Fc 域之次單元) 包含額外之 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 及 K447，根據 Kabat EU 索引編號)。在本發明的一個實施例中，如本文所指定之抗體或雙特異性抗體中所含之重鏈 (包含本文所指定之 Fc 域之次單元) 包含額外之 C 端甘胺酸殘基 (G446，根據 Kabat EU 索引編號)。本發明之組成物/調配物，諸如本文所述之醫藥組成物/調配物，包含本發明之抗體或雙特異性抗體群。抗體或雙特異性抗體群可包含具有全長重鏈之分子及具有切割變異體重鏈之分子。抗體或雙特異性抗體群可由具有全長重鏈之分子及具有切割變異體重鏈之分子之混合物組成，其中，抗體或雙特異性抗體之至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80% 或至少 90% 具有切割變異體重鏈。在本發明的一個實施例，包含本發明之抗體或雙特異性抗體群之組成物包含抗體或雙特異性抗體，該抗體或雙特異性抗體包含重鏈，該重鏈包括本文指定之 Fc 域之次單元及額外之 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 及 K447，根據 Kabat EU 索引編號)。在本發明的一個實施例中，包含本發明之抗體或雙特異性抗體群之組成物包含抗體或雙特異性抗體，該抗體或雙特異性抗體包含重鏈，該重鏈包括本文指定之 Fc 域之次單元及額外之 C 端甘胺酸殘基 (G446，根據 Kabat EU 索引編號)。在本發明的一個實施例中，此等組成物包含抗體或雙特異性抗體群，該抗體或雙特異性抗體群由以下分子組成：包含以下重鏈之分子，該重鏈包括本文所指定之 Fc 域之次單元；包含以下重鏈之分子，該重鏈包括本文所指定之 Fc 域之次單元及額外的 C 端甘胺酸殘基 (G446，根據 Kabat EU 索引編號)；以及包含以下重鏈之分子，該重鏈包括本文所指定之 Fc 域之次單元及額外之 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 及 K447，根據 Kabat EU 索引編號)。除非本文另有說明，否則 Fc 區或恆定區中胺基酸殘基之編號根據 EU 編號系統 (也稱為 EU 指數) 進行，如 Kabat 等人所述 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) (另見上文)。如本文中所使用的 Fc 域之「次單元」，是指形成二聚體 Fc 域之兩個多肽之一，即包含能夠穩定自締合之免疫球蛋白重鏈之 C 端恆定區之多肽。例如，IgG Fc 域之次單元包含 IgG CH2 及 IgG CH3 恆定域。在一較佳的實施例中，該等 Fc 域為人類來源，在一較佳的實施例中屬於 IgG 同型，在另一較佳的實施例中屬於 IgG1 同型。
「骨架 (framework)」或「FR」係指除互補決定區 (complement determining region) (CDR) 殘基之外的可變域殘基。可變域之 FR 通常由四個 FR 域組成：FR1、FR2、FR3、及 FR4。因此，CDR 及 FR 序列通常以如下順序出現在 VH (或 VL) 中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構實質上類似的結構或具有包含本文所定義之 Fc 區域的重鏈之抗體。
「融合」意指組分 (例如 Fab 分子及 Fc 域次單元) 經肽鍵直接或經由一或多個肽連接子連接。
「Fab 分子」係指由免疫球蛋白之重鏈 (「Fab 重鏈」) 之 VH 及 CH1 域及輕鏈 (「Fab 輕鏈」) 之 VL 及 CL 域組成之蛋白質。
「交換型 (crossover)」Fab 分子 (亦稱為「Crossfab」) 意指 Fab 分子，其中 Fab 重鏈及 Fab 輕鏈之可變域或恆定域被交換 (即彼此替換)，即，交換型 Fab 分子包含由輕鏈可變域 VL 及重鏈恆定域 1 CH1 組成之肽鏈 (VL-CH1，在 N 端至 C 端方向中)、及由重鏈可變域 VH 及輕鏈恆定域 CL 組成之肽鏈 (VH-CL，在 N 端至 C 端方向中)。為清楚起見，在 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域被交換之交換型 Fab 分子中，包含重鏈恆定域 1 CH1 之肽鏈在本文中稱為 (交換型) Fab 分子之「重鏈」。相反地，在 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之恆定域被交換之交換型 Fab 分子中，包含重鏈可變域 VH 之肽鏈在本文中稱為 (交換型) Fab 分子之「重鏈」。
與此相反，「習用」Fab 分子意指其自然形式 (即包含由重鏈可變域及恆定域組成之重鏈 (VH-CH1，在 N 端至 C 端方向中) 及由輕鏈可變域及恆定域組成之輕鏈 (VL-CL，在 N 端至 C 端方向中)) 之 Fab 分子。術語「宿主細胞 (host cell)」、「宿主細胞株 (host cell line)」及「宿主細胞培養物 (host cell culture)」可互換使用且係指已向其中引入外源性核酸的細胞，其包括此等細胞的子代細胞。宿主細胞包括「轉化子」和「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文包括與自原始轉變細胞中所篩選或選擇具有相同功能或生物活性的突變子代細胞。
「人抗體 (human antibody)」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人或人體細胞產生或自利用人抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人抗體編碼序列之非人來源衍生之抗體之胺基酸序列。人抗體的該定義特定地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。
「人源化 (humanized)」抗體係指包含來自非人 CDR 之胺基酸殘基及來自人 FR 之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人源化抗體將包括實質上所有至少一個 (且通常兩個) 可變域，其中所有或實質上所有 CDR (例如 CDR) 對應於非人抗體之其等，及所有或實質上所有 FR 對應對於人抗體之其等。人源化抗體視情況可包含衍生自人抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體 (例如非人抗體) 之「人源化形式 (humanized form)」係指已經歷人源化之抗體。
如本文所使用之術語「互補決定區 (complementarity determining region)」或「CDR」是指抗體可變域的每個區域，該區域在序列中是個高度可變的及/或形成結構上定義的環 (「高度變異環 (hypervariable loop)」) 及/或包含抗原接觸殘基 (「抗原接觸點 (antigen contact)」)。通常，抗體包括六個 CDR：三個在 VH 中 (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，及三個在 VL 中 (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。在本文中，例示性 CDR 包括： (a)  存在於胺基酸殘基 26-32 (CDR-L1)、50-52 (CDR-L2)、91-96 (CDR-L3)、26-32 (CDR-H1)、53-55 (CDR-H2) 及 96-101 (CDR-H3) 處之高度變異環 (Chothia 及 Lesk， J. Mol. Biol.196:901-917 (1987))； (b) 存在於胺基酸殘基 24-34 (CDR-L1)、50-56 (CDR-L2)、89-97 (CDR-L3)、31-35b (CDR-H1)、50-65 (CDR-H2) 及 95-102 (CDR-H3) 之 CDR (Kabat 等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))； (c)  存在於胺基酸殘基 27c-36 (CDR-L1)、46-55 (CDR-L2)、89-96 (CDR-L3)、30-35b (CDR-H1)、47-58 (CDR-H2) 及 93-101 (CDR-H3) 處之抗原接觸點 (MacCallum 等人 J. Mol. Biol.262: 732-745 (1996))；及 (d) (a)、(b) 及/或 (c) 之組合，包括 CDR 胺基酸殘基 24-34 (CDR-L1)、50-56 (CDR-L2)、89-97 (vL3)、31-35 (CDR-H1)、50-63 (CDR-H2) 及 95-102 (CDR-H3)。
除非另有說明，否則可變域中之 CDR 殘基及其他殘基 (例如，FR 殘基) 在本文中根據 Kabat 等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991) 所述之方法進行編號。
「個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體或受試者為人類。
「經隔離之」抗體是從其自然環境之組分中分離出來的抗體。在一個實施例中，抗體為分離之抗體。在一些實施例中，將抗體純化至大於 95% 或 99% 純度，藉由 (例如) 電泳 (例如 SDS-PAGE、等電位聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如，離子交換或反相 HPLC) 來測定。關於評估抗體純度之方法的綜述參見例如：Flatman, S. 等人，J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87。
「經單離之」核酸指已與其天然環境之組分分離的核酸分子。分離的核酸包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。
「編碼抗 HLA-G 抗體的分離之核酸 (Isolated nucleic acid encoding an anti-HLA-G antibody)」是指編碼抗體重鏈及輕鏈 (或其片段) 之一種或多種核酸分子，包括在單個載體或單獨載體中的該等核酸分子，且該等核酸分子存在於宿主細胞中的一個或多個位置。
如本文所用，術語「單株抗體」指代獲自實質上同源抗體之群體的抗體，亦即，該群體中所包含之個別抗體為相同的及/或結合同一抗原決定基，但不包括例如含有天然突變或產生於單株抗體製劑製造期間的可能之變異體抗體，該等變異體一般以少量存在。與通常包括針對不同決定位 (抗原決定基) 之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，意欲根據本發明使用的單株抗體可藉由多種技術來製造，包括但不限於融合瘤方法、重組 DNA 方法、噬菌體展示方法、及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法，本文描述此等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法。
「促進 Fc 域之第一次單元及第二次單元之締合之修飾」係對胜肽主鏈的操作或對 Fc 域次單元之轉譯後修飾，其減少或阻止包含 Fc 域次單元之多肽與相同多肽之締合形成同源二聚體。本文所用之促進締合之修飾，特別包括對期望締合之兩個 Fc 域次單元 (即 Fc 域之第一次單元及第二次單元) 中的每一個所進行之單獨修飾，其中，該修飾彼此互補，以便促進兩個 Fc 域次單元之締合。例如，促進締合之修飾可改變一個或兩個 Fc 域次單元之結構或電荷，以分別使其在空間或靜電上有利。因此，(雜)二聚化發生在包含第一 Fc 域次單元之多肽與包含第二 Fc 域次單元之多肽之間，其就進一步融合到每個次單元 (例如，抗原結合部分) 的組分而言可能有所不同。在一些實施例中，促進締合之修飾包括 Fc 域中之胺基酸突變，特別是胺基酸取代。在一個特定實施例中，促進締合之修飾包括 Fc 域之兩個次單元的每一個中之單獨的胺基酸突變，特別是胺基酸取代。該等促進 Fc 域之第一次單元及第二次單元締合的修飾在多特異性抗體或雙特異性抗體之異源二聚化中起重要作用 (另參見例如下文 A.2 例示性多特異性抗 HLA-G/抗 CD3 抗體)。
「天然抗體 (Native antibodies)」是指具有不同結構之天然免疫球蛋白分子。例如，Ig 天然 IgG 抗體為約 150,000 道耳頓、由二條相同的輕鏈及二條相同的重鏈經二硫鍵鍵合所構成之異四聚體醣蛋白。從 N 端至 C 端，每條重鏈具有可變區 (VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域，接著係三個恆定域 (CH1、CH2 及 CH3)。類似地，從 N 端至 C 端，每條輕鏈具有可變區 (VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，接著係輕鏈恆定 (CL) 域。基於其恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。
術語「包裝插頁」用於指涉通常包含在治療性產品的商業包裝中的說明，該說明包含有關使用此等治療性產品的適應症、用法、劑量、投予途徑、聯合治療、禁忌症及/或警告等資訊。
相對於參考多肽序列所述之「百分比 (%) 胺基酸序列同一性」，是指候選序列中胺基酸殘基與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保守取代作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸序列同一性百分比之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公眾可取得的電腦軟體諸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN 或 Megalign (DNASTAR) 軟件。本領域之技術人員可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大比對所需之任何演算法。然而，出於本文的目的，使用序列比較電腦程式 ALIGN-2 產生 ％ 胺基酸序列同一性值。ALIGN-2 序列比較電腦程式由建南德克公司 (Genentech，Inc.) 編寫，原始程式碼已與用戶文檔一起存檔於美國版權局，華盛頓特區，20559，並以美國版權註冊號 TXU510087 進行註冊。ALIGN-2 程式可從加利福尼亞南三藩市的建南德克公司 (Genentech，Inc.) 公眾可取得，亦可以從原始程式碼進行編譯。ALIGN-2 程式應編譯為在 UNIX 作業系統（包括數位 UNIX V4.0D）上使用。所有序列比較參數均由 ALIGN-2 程式設置，並且沒有變化。
在使用 ALIGN-2 進行胺基酸序列比較的情況下，既定胺基酸序列 A 對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 的 % 胺基酸序列同一性（其視情況表述為既定胺基酸序列 A，其對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 具有或包含一定 % 的胺基酸序列同一性）計算如下： 100 乘以分數 X/Y 其中 X 為序列排列程式 ALIGN-2 在 A 與 B 程式排列中評分為同一匹配的胺基酸殘基數，Y 為 B 中胺基酸殘基的總數。應當理解的是，在胺基酸序列 A 的長度不等於胺基酸序列 B 的長度的情況下，A 與 B 的 % 胺基酸序列同一性將不等於 B 與 A 的 % 胺基酸序列同一性。除非另有特別說明，否則如前一段所述，使用 ALIGN-2 電腦程式獲得本文使用的所有 % 胺基酸序列同一性值。
術語「醫藥調配物」指代以下製劑，其形式為允許其中所含之活性成分的生物活性有效，並且不包含對調配物將投予之受試者具有不可接受之毒性的其他成分。
「醫藥上可接受之載劑」係指藥學製劑中除對受試者無毒之活性成分以外的成分。醫藥上可接受之載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文中所使用的「治療 (treatment)」（及其語法變異體，諸如「治療 (treat)」或「治療 (treating)」），係指試圖改變受治療受試者之疾病自然病程的臨床干預，並且可進行預防或在臨床病理過程中執行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之抗體用於延遲疾病之發展或減慢疾病之進展。
術語「可變區 (variable region)」或「可變域 (variable domain)」係指參與抗體與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈 (分別為 VH 及 VL) 之可變域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保留骨架區 (FR) 及三個互補決定區 (CDR)。(參見例如：Kindt, T.J. 等人 Kuby Immunology，第 6 版，W.H. Freeman and Co.，N.Y.(2007)，第 91 頁)。單個 VH 或 VL 域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，可以使用 VH 或 VL 域從結合抗原的抗體中分離結合特定抗原的抗體，以分別篩選互補 VL 或 VH 域的文庫。參見例如：Portolano, S. 等人，J. Immunol .150 (1993) 880-887；Clackson, T. 等人，Nature 352 (1991) 624-628。
如本文所用，術語「載體」指代能夠傳遞與其連接之另一核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複制核酸結構之載體以及摻入已引入該宿主細胞的基因體中的載體。某些載體能夠引導與其操作性連接之核酸的表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。 I. 組成物及方法
在一個態樣中，本發明部分地基於以下發現，該發現是指出人意料的是，在去除醣基化位點的 HLA-G-0090 的這些各種變異體中，僅兩種變異體 HLA-G-0090-VL-S32P 及 HLA-G-0090-VL-S33A 表現出甚至改善的結合特性、良好的表現能力及穩定性，同時顯示在 LC 的 CDR-L1 處不再顯示醣基化 (因此無法偵測到 Fab 醣基化)。由於所有最近批准的醫藥抗體產品皆在哺乳動物細胞中產生，尤其是 CHO 細胞 (參見例如 Walsh G., Nature Biotech (2018) 1136-1145)因此提供一種在結合區 (VH 及 VL，且尤其是 CDR) 無醣基化位點的抗體代表了一個有價值的優勢，因為這些抗體然後可易於用於哺乳動物表現系統的生產，而不藉由醣基化而 (至少部分地) 損害結合特性。特定而言，對於包含 Fc 域的抗體，在缺乏醣基化機制 (諸如原核宿主細胞) 的宿主細胞中製造抗性不會產生具有可比性質量的產物，因為連接至胺基酸殘基 ASN297 (根據 Kabat EU 索引編號) 的 N-聚醣在 Fc 區需要保持溶解性及熱穩定性，並防止抗體在水溶液中聚集 (例如在醫藥組成物中)。 A.1 例示性抗 HLA-G 抗體
本發明的一個實施例為結合至人類 HLA-G 的抗體，該抗體包含 A) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列，或 B) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列。
本發明的一個實施例為結合至人類 HLA-G 的抗體，其中該抗體 A) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列；或 B) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列。
本發明的一個實施例為結合至人類 HLA-G 的抗體，其中該抗體包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列。
本發明的一個實施例為結合至人類 HLA-G 的抗體，其中該抗體包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列。
在實施例中，與 (親代) 抗體相比，該等抗 HLA-G 抗體在最大結合 (Rmax) 及/或結合親和力 (KD) 方面具有改善的結合特性，該親代抗體包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列 (如實例 2 中所示)。在另一個實施例中，本發明之 HLA-G 抗體包含人類來源的 Fc 域；在一個實施例中，Fc 域屬於 IgG 同型，在一較佳的實施例中，屬於 IgG1 同型。在一個實施例中，該等人類來源的 IgG1 同型 Fc 域包含胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (「P329G LALA」、「PGLALA」或「LALAPG」) (根據 Kabat EU 索引編號)。
在另一個實施例中，本發明之 HLA-G 抗體包含人類來源，特定而言 IgG 同型，更特定而言 IgG1 同型之恆定區，該恆定區包含人類 CH1、CH2、CH3 及/或 CL 域。
在一個實施例中，該等 IgG1 同型的恆定區包含胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (「P329G LALA」、「PGLALA」或「LALAPG」) (根據 Kabat EU 索引編號)。
該等包含 Fc 域的抗體通常可在 ASN-297 位點 (根據 Kabat EU 索引編號) 處發生 N-醣基化，例如當在真核細胞 (如哺乳動物細胞，特別而言 CHO 細胞) 中產生時。ASN-297 位置 (根據 EU 索引編號 (參見 Kabat)) 處之 N-醣基化代表對該等抗體之例如高穩定性、低聚集趨勢及/或良好的藥代動力學及其他關鍵質量特性的有價值的貢獻 (參見例如 Zheng 等人, mAbs (2011) 568-576；及 Reusch 等人, Glycobiology (2015) 1325–133)。因此，本發明之該等包含 Fc 域的抗體易於準備在真核細胞 (如哺乳動物細胞，特別而言 CHO 細胞) 中產生，而不存在結合區發生醣基化的風險 (其會干擾其結合特性)，但同時具有 ASN-297 位置處之 N-醣基化的益處和有價值的質量屬性。
本發明的一個實施例為結合至人類 HLA-G 的抗體，其中該抗體包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列，其中抗體與 (親代) 抗體相比，在最大結合 (Rmax) 及/或結合親和力 (KD) 方面具有改善的結合特性，該親代抗體包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列 (如實例 2 中所示)。
在實施例中，抗 HLA-G 抗體 a)   不與經修飾的人類 HLA-G ß2M MHC I 複合物交叉反應，其中 HLA-G 特異性胺基酸已被 HLA-A 共同胺基酸替換，該複合物包含 SEQ ID NO: 40；及/或 b)   不與包含 SEQ ID NO: 41 之小鼠 H2Kd ß2M MHC I 複合物交叉反應；及/或 c)   不與包含 SEQ ID NO: 43 之大鼠 RT1A ß2M MHC I 複合物交叉反應。
在實施例中，抗 HLA-G 抗體 a)   抑制 ILT2 結合至 JEG3 細胞 (上表現之 HLA-G) (ATCC 編號 HTB36)；或 b)   結合至 JEG3 細胞 (上表現之 HLA-G) (ATCC 編號 HTB36)，及抑制 ILT2 結合至 JEG-3 細胞 (上表現之 HLA-G) (ATCC 編號 HTB36)。
在另一態樣中，本發明涉及包含抗 HLA-G 抗原結合部分的多特異性抗體。如本文所述之這些多特異性抗體 (例如雙特異性抗體) 使用選定的、改善的抗 HLA-G 抗體作為第一抗原結合部分/位點。這些抗 HLA-G 抗體以高特異性及親和力 (改善之結合特性，與其他物種及人類 HLA-A 共同序列交叉反應性) 結合至 HLA-G，並具有特異性抑制 ILT2 及/或 ILT4 結合至HLA-G 的能力。
在一個實施例中，本發明涉及結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 的多特異性 (較佳的是雙特異性) 抗體。在一個實施例中，本發明涉及多特異性 (較佳的是雙特異性) 抗 HLA-G/抗 CD3 抗體，其中結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 的該多特異性 (較佳的是雙特異性) 抗體包含結合至人類 HLA-G 之第一抗原結合部分及結合至人類 CD3 之第二抗原結合部分。如本文所述之該雙特異性抗體與特異性第二抗原結合部分/位點結合至 CD3，尤其是 CD3epsiln，並因此能夠將表現 CD3 的 T 細胞吸引至表現 HLA-G 的腫瘤細胞，同時藉由阻斷 ILT2/4 結合至 HLA-G 而抑制 HLA-G 在腫瘤環境中所誘導之免疫抑制。因此，這些雙特異性抗 HLA-G/抗 CD3 抗體顯示出強烈的活體內腫瘤生長抑制及腫瘤消退作用。 A.2 例示性多特異性抗 HLA-G / 抗 CD3 抗體
本發明的一個實施例為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含結合至人類 HLA-G 之第一抗原結合部分及結合至人類 CD3 之第二抗原結合部分， 其中該結合至人類 HLA-G 之第一抗原結合部分包含 A) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列，或 B) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列； 且其中結合至 T 細胞活化抗原之該第二抗原結合部分結合至人類 CD3，該第二抗原結合部分包含 C) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 56 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列，或 C) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列，或 D) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 71 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 72 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列。
本發明的另一實施例為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含結合至人類 HLA-G 之第一抗原結合部分及結合至人類 CD3 之第二抗原結合部分， 其中該第一抗原結合部分 A) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列；或 B) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列， 且其中該第二抗原結合部分 C) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；或 D) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；或 E) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。
本發明的另一實施例為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含結合至人類 HLA-G 之第一抗原結合部分及結合至人類 CD3 之第二抗原結合部分， 其中該第一抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列； 且其中該第二抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列。
本發明的另一實施例為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含結合至人類 HLA-G 之第一抗原結合部分及結合至人類 CD3 之第二抗原結合部分， 其中該第一抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列； 且其中該第二抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列。
本發明的另一實施例為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含結合至人類 HLA-G 之第一抗原結合部分及結合至人類 CD3 之第二抗原結合部分， 其中該第一抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列； 且其中該第二抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。
在一個實施例中，這些雙特異性抗體的特徵在於以下特性中的一個或多個： a)   在表現 HLA-G 的腫瘤細胞存在之情況下 (較佳的是在 JEG3 細胞 (ATCC 編號 HTB36) 存在之情況下)誘導 T 細胞介導的細胞毒性/腫瘤細胞毒殺；及/或 b) 在表現 HLA-G 的腫瘤細胞存在之情況下 (較佳的是在 JEG3 細胞 (ATCC 編號 HTB36) 存在之情況下) 誘導 T 細胞之 IFN γ 分泌；及/或 c) 抑制活體內腫瘤生長 (在小鼠異種移植腫瘤模型中)， d) 在帶有經重組 HLA-G 轉染之 SKOV3 人類卵巢癌 (SKOV3 HLA-G) 人源化 NSG 小鼠中之活體內抗腫瘤效力/腫瘤消退作用 (參見實例 13)；及/或 e) 在帶有人類乳癌 PDX 腫瘤 (BC004) 之人源化 NSG 小鼠中 HLA-G CD3 T 細胞雙特異性之活體內抗腫瘤效力(參見實例 14)。
在一個實施例中，這些雙特異性抗體的其他特徵在於以下特性中的一個或多個：雙特異性抗體 a)   不與經修飾的人類 HLA-G ß2M MHC I 複合物交叉反應，其中 HLA-G 特異性胺基酸已被 HLA-A 共同胺基酸替換，該複合物包含 SEQ ID NO: 44；及/或 b)   不與包含 SEQ ID NO: 41 之小鼠 H2Kd ß2M MHC I 複合物交叉反應；及/或 c)   不與包含 SEQ ID NO: 43 之大鼠 RT1A ß2M MHC I 複合物交叉反應。
在一個實施例中，這些雙特異性抗體的其他特徵在於以下特性中的一個或多個：雙特異性抗體 a)   抑制 ILT2 結合至 JEG3 細胞 (上表現之 HLA-G) (ATCC 編號 HTB36)；或 b)   結合至 JEG3 細胞 (上表現之 HLA-G) (ATCC 編號 HTB36)，及抑制 ILT2 結合至 JEG-3 細胞 (上表現之 HLA-G) (ATCC 編號 HTB36)；及/或
多特異性抗體
多特異性抗體為對至少兩個不同位點 (即不同抗原上之不同抗原決定基或同一抗原上之不同抗原決定基) 具有結合特異性的單株抗體。在某些實施例中，多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。在一較佳的實施例中，本文所提供之多特異性抗體為雙特異性抗體。在某些實施例中，結合特異性之一針對 HLA-G，另一種特異性則針對 CD3。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至 HLA-G 的兩個 (或更多個) 不同抗原決定基。多特異性抗體可製成全長抗體或抗體片段。
用於製備多特異性且特定而言雙特異性抗體之技術包括但不限於重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對 (參見 Milstein 及 Cuello， Nature305: 537 (1983)) 及「杵臼」(knob-in-hole) 工程 (參見例如美國專利號 5,731,168，及 Atwell 等人 J. Mol. Biol. 270:26 (1997))。多特異性抗體也可透過以下方法進行製備：用於製備抗體 Fc-異二聚體分子的工程改造靜電轉向效應 (參見例如 WO 2009/089004)；交聯兩個或更多個抗體或片段 (參見例如美國專利號 4,676,980，及 Brennan 等人 , Science, 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體 (參見例如，Kostelny 等人, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 及 WO 2011/034605)；使用常用輕鏈技術防止輕鏈錯配問題 (參見例如 WO 98/50431)；使用「雙抗體」技術製備雙特異性抗體片段 (參見例如，Hollinger 等人 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))；以及使用單鏈 Fv (sFv) 二聚體 (參見例如Gruber 等人 ， J. Immunol.，152:5368 (1994))；以及按照例如 Tutt 等人 ( J. Immunol.147: 60 (1991)) 所述之方法製備三特異性抗體。
本文亦包括具有三個或更多個抗原結合位點的經工程改造之抗體，包括例如「章魚抗體」(Octopus antibodies) 或 DVD-Ig (參見例如 WO 2001/77342 及 WO 2008/024715)。具有三個或更多個抗原結合位點之多特異性抗體的其他實例可參見 WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792 及 WO 2013/026831 中。雙特異性抗體或其抗原結合片段亦包括「雙重作用 FAb」或「DAF」，其包含與 HLA-G 以及另一種不同抗原結合或 HLA-G 的兩個不同抗原決定基之抗原結合位點結合 (參見例如 US 2008/0069820 及 WO 2015/095539)。
多特異性抗體也可提供為不對稱形式，其包含在一個或多個具有相同抗原特異性之結合臂中交叉的域，即透過交換 VH/VL 域 (參見例如 WO 2009/080252 及 WO 2015/150447)、CH1/CL 域 (參見例如 WO 2009/080253) 或完整的 Fab 臂 (參見例如 WO 2009/080251、WO 2016/016299，另見 Schaefer 等人，PNAS，108 (2011) 1187-1191，及 Klein 等人，MAbs 8 (2016) 1010-20) 實現。還可透過將帶電荷或不帶電荷之胺基酸突變引入域界面引導正確 Fab 配對，從而設計不對稱之 Fab 臂。參見例如 WO 2016/172485。
用於多特異性抗體之各種其他分子形式為本技術領域中已知的並且包括在本文中 (參見例如 Spiess 等人，Mol Immunol 67 (2015) 95-106)。
還包括於本文中的特定類型之多特異性抗體為雙特異性抗體，該雙特異性抗體被設計為同時結合至標靶細胞 (例如腫瘤細胞) 上之表面抗原以及 T 細胞受體 (TCR) 之活化不變組分 (例如 CD3) 複合物，用於重標定 T 細胞以殺死標靶細胞。因此，在某些實施例中，本文中提供之抗體為多特異性抗體，特別為雙特異性抗體，其中，結合特異性之一針對 HLA-G，且另一種結合特異性則針對 CD3。
可用於此目的之雙特異性抗體形式包括但不限於所謂「BiTE」(bispecific T cell engager) 分子，其中，兩個 scFv 分子藉由柔性連接子（flexible linker）融合 (參見例如 WO2004/106381、WO2005/061547、WO2007/042261 及 WO2008/119567；Nagorsen 和 Bäuerle，Exp Cell Res 317，1255-1260 (2011))；雙抗體 (Holliger 等人，Prot Eng 9，299-305 (1996)) 及其衍生物，諸如串聯雙抗體 (「TandAb」；Kipriyanov 等人，J Mol Biol 293，41-56 (1999))；「DART」(雙親和性重定位) 分子，其基於雙抗體形式，但具有 C 端二硫鍵以供進一步穩定 (Johnson 等人，J Mol Biol 399，436-449 (2010))，以及所謂三功能抗體 (triomab)，它們為完整的小鼠/大鼠 IgG 雜合分子 (參見 Seimetz 等人的綜述：Cancer Treat Rev 36，458-467 (2010))。本文所包括之特定 T 細胞雙特異性抗體形式描述於：WO 2013/026833；WO2013/026839；WO 2016/020309；及 Bacac 等人 Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498。
結合至 HLA-G 並結合至 CD3 的雙特異性抗體
本發明亦提供一種雙特異性抗體，亦即包含至少兩個能夠與兩種不同抗原決定位 (第一抗原及第二抗原) 特異性結合之抗原結合部分的抗體。
基於本發明人所開發的抗 HLA-G 抗原結合部分及抗 CD3 抗原結合部分，本發明人開發出結合至 HLA-G 及結合至 CD3 的雙特異性抗體。
如實例中所示，這些雙特異性抗體具有許多顯著的特性，包括良好的效力及低毒性。
因此，在某些態樣中，本發明提供一種雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含 (a) 結合至人類 HLA-G 之第一抗原結合部分，及 (b) 特異性結合至人類 CD3 之第二抗原結合部分，其中該雙特異性抗體具有以下特徵中之任一者：-本發明之雙特異性抗體特異性誘導 T 細胞介導的毒殺表現 HLA-G 的細胞。在一些實施例中，本發明之雙特異性抗體特異性誘導 T 細胞介導的毒殺表現 HLA-G 的細胞。在一個更具體之實施例中，該雙特異性抗體特異性誘導 T 細胞介導的毒殺表現 HLA-G 的細胞。
-在一個實施例中，雙特異性抗體誘導的 T 細胞所介導的毒殺係使用表現 HLA-G 的細胞來測定。
-在一個實施例中，雙特異性抗體對 T 細胞之活化係藉由以下方法測定：測量 (特定而言藉由流式細胞分析技術) 在表現 HLA-G 的細胞存在之情況下與雙特異性抗體孵育後的 T 細胞的 CD25 及/或 CD69 之表現。
在一個具體實施例中，雙特異性抗體誘導的 T 細胞所介導的毒殺係使用以下方法測定： 在經重組 HLA-G 轉染之 SKOV3 細胞 (SKOV3HLA-G) 上測試抗 HLA-G/抗 CD3 TCB 在表現 HLA-G 的腫瘤細胞存在之情況下活化 T 細胞的能力。藉由 FACS 分析對 T 細胞上之細胞表面活化標誌物 CD25 及早期活化標誌物 CD69，對 T 細胞之活化進行評估。簡言之，使用淋巴細胞分離培養基管 (PAN #P04-60125)，藉由密度梯度離心從人周邊血中分離出周邊血單核細胞 (PBMC)。將 PBMC 與 SKOV3HLA-G 細胞以 10: 1 的比率接種至 96 孔 U 型底板。然後如實例 12 中所述，將共培養物與不同濃度之 HLA-G-TCB 孵育並於 37°C 下在包含 5% Co2 的培養箱中孵育 24 小時。第二天，藉由流式細胞分析技術測量 CD25 及 CD69 之表現。
在流式細胞分析中，於 4°C 下將細胞用 PerCP-Cy5.5 小鼠抗人 CD8 (BD Pharmingen # 565310)、PE 小鼠抗人 CD25 (eBioscience # 9012-0257) 及 APC 小鼠抗人 CD69 (BD Pharmingen # 555533) 染色。簡言之，將抗體稀釋至 2 倍濃度，並向包含 25 µl 預洗滌的共培養物的各孔中添加 25 µl 抗體稀釋液。將細胞於 4°C 下染色 30 分鐘，用 200 μl/孔染色緩衝液洗滌兩次，並以 300 g 離心 5 分鐘。將細胞沉澱重懸浮於 200 μl 染色緩衝液中，並用 DAPI 染色，在最終濃度為 2 μg/ml 的條件下區別死亡/存活細胞。然後使用 BD LSR 流式細胞儀測量樣品。使用 FlowJo V.10.1 軟體進行資料分析。
本發明之雙特異性抗體在表現 HLA-G 的細胞存在之情況下特異性活化 T 細胞。在一些實施例中，本發明之雙特異性抗體在表現 HLA-G 的細胞存在之情況下特異性活化 T 細胞。在一個更具體之實施例中，該雙特異性抗體在表現 HLA-G 的細胞存在之情況下特異性活化 T 細胞。
在一個實施例中，雙特異性抗體在表現 HLA-G 的細胞存在之情況下誘導 T 細胞所介導之毒殺或活化 T 細胞。在一個實施例中，雙特異性抗體在表現 HLA-G 的細胞存在之情況下誘導 T 細胞所介導之毒殺及/或活化 T 細胞，其 EC50 比在表現 HLA-G 的細胞存在之情況下誘導 T 細胞所介導之毒殺及/或活化 T 細胞的 EC50 低至少 5 倍、至少 10 倍、至少 15 倍、至少 20 倍、至少 25 倍、至少 50 倍、至少 75 倍或至少 100 倍。
如本發明之特定實施例，包含在雙特異性抗體中之抗原結合部分為 Fab 分子 (即，由重鏈和輕鏈組成之抗原結合域，其中每一個均包含可變域和恆定域)。在一個實施例中，第一抗原結合部分和/或第二抗原結合部分為 Fab 分子。在一個實施例中，所述 Fab 分子為人 Fab 分子。在一個特定實施例中，所述 Fab 分子為人源化分子。在另一個實施例中，所述 Fab 分子包含人重鏈及輕鏈恆定域。
較佳地，抗原結合部分中之至少一個為交叉 Fab 分子。此等修飾減少了來自不同 Fab 分子之重鏈及輕鏈的錯配，從而提高重組生產本發明之雙特異性抗體的產率和純度。在用於本發明之雙特異性抗體的特定交換型 Fab 分子中，交換了 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈 (分別為 VL 和 VH) 的可變域。然而，即使採用此域交換，由於錯配之重鏈與輕鏈之間的所謂 Bence Jones 型相互作用，雙特異性抗體的製備也可能包含某些副產物 (參見 Schaefer 等人, PNAS, 108 (2011) 11187-11191)。為進一步減少來自不同 Fab 分子之重鏈和輕鏈的錯配，從而提高所需之雙特異性抗體的純度和產率，可在與第一抗原 (HLA-G) 結合之 Fab 分子或與第二抗原 (活化 T 細胞抗原諸如 CD3) 結合之 Fab 分子的 CH1 和 CL 域中特定之胺基酸位置引入帶相反電荷的胺基酸，如本文中進一步所述。在包含在雙特異性抗體中的習知 Fab 分子 (諸如例如圖 13A 至圖 13C、圖 13G 至圖 13J 中所示的) 中或在包含在雙特異性抗體中的 VH/VL 交換型 Fab 分子 (諸如圖 13D 至圖 13F、圖 13K 至圖 13N 中所示的但不是兩者兼有) 進行電荷修飾。在特定實施例中，在雙特異性抗體中包含的習用 Fab 分子中進行電荷修飾 (在特定實施例中，其與第一抗原即 HLA-G 結合)。
在如本發明的一個特定實施例中，雙特異性抗體能夠同時與第一抗原 (亦即 HLA-G) 和第二抗原 (例如活化 T 細胞抗原，特定而言為 CD3) 結合。在一個實施例中，雙特異性抗體能夠藉由結合至 HLA-G 及活化 T 細胞抗原而交聯 T 細胞及標靶細胞。在一個甚至更特定的實施例中，該等同時結合導致標靶細胞、特定而言表現 HLA-G 之腫瘤細胞裂解。在一個實施例中，此等同時結合導致 T 細胞活化。在其他實施例中，此等同時結合導致 T 淋巴細胞、特別是細胞毒性 T 淋巴細胞之細胞回應，該細胞回應選自：增殖、分化、細胞激素分泌、細胞毒性效應分子釋放、胞毒活性及活化標記物之表現。在一個實施例中，雙特異性抗體與活化 T 細胞抗原、特定而言 CD3 結合，而非同時與 HLA-G 結合，並不導致 T 細胞活化。
在一個實施例中，雙特異性抗體能夠將 T 細胞之胞毒活性重定向至標靶細胞。在一個特定實施例中，該重定向不依賴於標靶細胞之 MHC 介導的肽抗原呈遞和/或 T 細胞之特異性。
特別地，根據本發明之任何實施例的 T 細胞為細胞毒性 T 細胞。在一些實施例中，T 細胞為 CD4 +或 CD8 +細胞，特別為 CD8 +T 細胞。
結合至人類 HLA-G 的第一抗原結合部分
本發明之雙特異性抗體包含至少一個結合至人類 HLA-G (第一抗原) 的抗原結合部分 (特定而言 Fab 分子)。在某些實施例中，雙特異性抗體包含兩個結合至人類 HLA-G 的抗原結合部分 (特定而言 Fab 分子)。在一個特定的該等實施例中，這些抗原結合部分中的每一個結合至相同的抗原決定位。在更具體的實施例中，所有這些抗原結合部分均相同，即它們包含相同之胺基酸序列，該胺基酸序列包括如本文所述之 CH1 和 CL 域中之相同的胺基酸取代 (如果有的話)。在一個實施例中，雙特異性抗體包含不超過兩個結合至人類 HLA-G 的抗原結合部分 (特定而言 Fab 分子)。
在特定實施例中，結合至人類 HLA-G 之抗原結合部分為習用 Fab 分子。在此等實施例中，與第二抗原結合之抗原結合部分為本文所述之交叉 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈和輕鏈之可變域 VH 及 VL 或恆定域 CH1 及 CL 彼此交換/替換的 Fab 分子。
在替代實施例中，結合至人類 HLA-G 之抗原結合部分為本文所述之交換型 Fab 分子，亦即，其中 Fab 重鏈和輕鏈之可變域 VH 和 VL 或恆定域 CH1 和 CL 彼此交換/替換的 Fab 分子。在此等實施例中，與第二抗原結合之抗原結合部分為習知 Fab 分子。
HLA-G 結合部分能夠將雙特異性抗體導向標靶位點，例如導向表現人類 HLA-G 的特定類型之腫瘤細胞。
除非在科學上明顯不合理或不可能，否則雙特異性抗體之第一抗原結合部分可單獨或組合地結合本文所述之與結合 HLA-G 的抗體有關的特徵中之任一者。
因此，在一個態樣中，本發明提供雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含結合至第一抗原的第一抗原結合部分，其中第一抗原為人類 HLA-G (在一個實施例中，結合至 HLA-G ß2M MHC I 複合物的抗體包含 SEQ ID NO: 39)，且該第一抗原結合部分包含 (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；且其中 VH 域包含與 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列具有至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (在一較佳的實施例中，98% 或 99% 或 100%) 之序列同一性的胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；且其中 VL 域包含與 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列具有至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (在一較佳的實施例中，98% 或 99% 或 100%) 之序列同一性的胺基酸序列。
術語如「VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；且其中 VH 域包含與 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列具有至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (在一較佳的實施例中，98% 或 99% 或 100%) 之序列同一性的胺基酸序列」是指具有 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列的 VH 域，其中 3 個 CDR 未改變 (亦即與 SEQ ID NO: 7 相同)，但例如在不影響 VH 與抗原結合位點的結合特性的情況下，VH 的骨架區中的零個、一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸殘基被另一種胺基酸改變/取代。由於具有高機率影響結合特性的骨架殘基是眾所周知的 (參見例如 Foote J. 及 Winter G., J. Mol. Biol. (1992) 224, 487-499)，因此可選擇取代無影響或影響極小的殘基。這同樣適用於本文使用的與另一個 VH 或 VL 相關的類似術語。
在一個實施例中，第一抗原結合部分包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列；以及 VL 域，其包含 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列。
在一個實施例中，結合至人類 HLA-G (在一個實施例中，結合至包含 SEQ ID NO: 39 的 HLA-G ß2M MHC I 複合物) 的第一抗原結合部分，包含 (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；且其中 VH 域包含與 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列具有至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (在一較佳的實施例中，98% 或 99% 或 100%) 之序列同一性的胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列；且其中 VL 域包含與 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列具有至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (在一較佳的實施例中，98% 或 99% 或 100%) 之序列同一性的胺基酸序列。
在一個實施例中，第一抗原結合部分包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列；以及 VL 域，其包含 SEQ ID NO:26 之胺基酸序列。
該等抗 HLA-G 抗體顯示出非常有價值的特性，因為它們在抗原結合位點 (及 CDR-L1) 處無 N-醣基化 (如實例 2 中所示)；與 (親代) 抗體相比，在最大結合 (Rmax) 及/或結合親和力 (KD) 方面具有改善的結合特性，該親代抗體包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列 (如實例 2 中所示)；與 HLA-A MHC I 複合物或鼠或大鼠 MHC I 複合物無交叉反應並結合至 (上表現之 HLA-G) JEG3 細胞 (ATCC 編號 HTB36)；並抑制 ILT2 結合至 (上表現之 HLA-G) JEG-3 細胞 (ATCC 編號 HTB36)。
結合至人類 CD3 的第二抗原結合部分
本發明之雙特異性抗體包含至少一個結合至人類 CD3 的抗原結合部分 (特定而言 Fab 分子)。
在特定實施例中，結合人類 CD3 之抗原結合部分為本文所述之交換型 Fab 分子，亦即其中 Fab 重鏈和輕鏈之可變域 VH 和 VL 或恆定域 CH1 和 CL 彼此交換/替換的 Fab 分子。在該等實施例中，結合至人類 HLA-G 之抗原結合部分較佳的為習用 Fab 分子。在其中存在多於一個結合至雙特異性抗體中包含的人類 CD3 的抗原結合部分 (特定而言 Fab 分子) 的實施例中，結合人類 CD3 的抗原結合部分較佳的為交換型 Fab 分子且結合至人類 HLA-G 的抗原結合部分為習用 Fab 分子。
在替代實施例中，與第二抗原結合之抗原結合部分為習知 Fab 分子。在該等實施例中，結合至第一抗原 (亦即 HLA-G) 的抗原結合部分為本文所述之交換型 Fab 分子，亦即，其中 Fab 重鏈和輕鏈之可變域 VH 和 VL 或恆定域 CH1 和 CL 彼此交換/替換的 Fab 分子。在其中存在多於一個結合至雙特異性抗體中包含的第二抗原的抗原結合部分 (特定而言 Fab 分子) 的實施例中，結合至人類 HLA-G 的抗原結合部分較佳的為交換型 Fab 分子且結合至人類 CD3 的抗原結合部分為習用 Fab 分子。
在一些實施例中，第二抗原為活化 T 細胞抗原 (在本文中也稱為「活化 T 細胞抗原結合部分或活化 T 細胞抗原結合 Fab 分子」)。在一個特定實施例中，雙特異性抗體包含不超過一個能夠特異性結合至活化 T 細胞抗原的抗原結合部分。在一個實施例中，雙特異性抗體提供與活化 T 細胞抗原之單價結合。
在特定實施例中，第二抗原為 CD3，特別為人 CD3 (SEQ ID NO: 88) 或食蟹猴 CD3 (SEQ ID NO: 89)，且最特別為 CD3。在一個實施例中，第二抗原結合部分與人及食蟹猴 CD3 交叉反應 (即與之特異性結合)。在一些實施例中，第二抗原為 CD3 的 ε 次單元 (CD3 ε)。
在一個實施例中，結合至人類 CD3 的第二抗原結合部分包含：(a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列；且其中 VH 域包含與 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列具有至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (在一較佳的實施例中，98% 或 99% 或 100%) 之序列同一性的胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 56 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列；且其中 VL 域包含與 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列具有至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (在一較佳的實施例中，98% 或 99% 或 100%) 之序列同一性的胺基酸序列。
在一個實施例中，結合至人類 CD3 的第二抗原結合部分包含：(a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；且其中 VH 域包含與 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列具有至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (在一較佳的實施例中，98% 或 99% 或 100%) 之序列同一性的胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列；且其中 VL 域包含與 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列具有至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (在一較佳的實施例中，98% 或 99% 或 100%) 之序列同一性的胺基酸序列。
在一個實施例中，結合至人類 CD3 的第二抗原結合部分包含：(a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列，(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列，且其中 VH 域包含與 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列具有至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (在一較佳的實施例中，98% 或 99% 或 100%) 之序列同一性的胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 71 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 72 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列，且其中 VL 域包含與 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列具有至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (在一較佳的實施例中，98% 或 99% 或 100%) 之序列同一性的胺基酸序列。
在一個實施例中，結合至人類 CD3 的第二抗原結合部分包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；以及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列。
在一個實施例中，結合至人類 CD3 的第二抗原結合部分包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列；以及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列。
在一個實施例中，結合至人類 CD3 的第二抗原結合部分包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列；以及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。
該等 CD3 抗原結合部分/位點顯示出非常有價值的特性 (例如，當提供為結合至 CD3 及 HLA-G 的雙特異性抗體時 (其中 HLA-G 抗原結合部分如本文所述))。它們顯示出： a) 良好的熱穩定性 b) 在表現 HLA-G 的腫瘤細胞存在之情況下 (較佳的是在 JEG3 細胞 (ATCC 編號 HTB36) 存在之情況下) 誘導 T 細胞之 IFN γ 分泌 (實例 11)；及/或 c)   在表現 HLA-G 的腫瘤細胞存在之情況下 (較佳的是在 JEG3 細胞 (ATCC 編號 HTB36)) 存在之情況下) 誘導 T 細胞介導的細胞毒性/腫瘤細胞毒殺 (實例 12)；及/或 d) 抑制活體內腫瘤生長 (在小鼠異種移植腫瘤模型中)， e) 在帶有經重組 HLA-G 轉染之 SKOV3 人類卵巢癌 (SKOV3 HLA-G) 人源化 NSG 小鼠中之活體內抗腫瘤效力/腫瘤消退作用 (參見實例 13)；及/或 f) 在帶有人類乳癌 PDX 腫瘤 (BC004) 之人源化 NSG 小鼠中 HLA-G CD3 T 細胞雙特異性之活體內抗腫瘤效力(參見實例 14)。
在一些實施例中，第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1、特別是可變域 VL 及 VH 彼此取代 (即根據此等實施例，第二抗原結合部分為交叉 Fab 分子，其中，Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域或恆定域發生交換)。在一個此等實施例中，第一 (及第三，如果有的話) 抗原結合部分為習知 Fab 分子。
在一個實施例中，不超過一個結合至第二抗原 (例如活化 T 細胞抗原，諸如 CD3) 的抗原結合部分存在於雙特異性抗體中 (即雙特異性抗體提供與第二抗原之單價結合)。
電荷修飾
本發明之雙特異性抗體可在其中所包含之 Fab 分子中包含胺基酸取代，其特別有效地減少輕鏈與不匹配重鏈之錯配 (Bence-Jones 型副產物)，該錯配可能發生在基於 Fab 之多特異性抗體的製備中，其中在其結合臂之一個 (或多個，如果分子包含兩個以上之抗原結合 Fab 分子) 中發生 VH/VL 交換 (另見 PCT 公開號 WO 2015/150447，特定而言其中的實例，其全部內容以引用方式併入本文)。所需的雙特異性抗體與不希望的副產物，特定而言在其結合臂之一中具有 VH/VL 域交換之雙特異性抗體中發生的 Bence Jones 型副產物之比率可透過在 CH1 和 CL 域中之特定胺基酸位置引入帶有相反電荷之胺基酸來改善 (有時在本文中稱為「電荷修飾」)。
因此，在一些實施例中，其中雙特異性抗體之第一抗原結合部分及第二抗原結合部分皆為 Fab 分子，且在抗原結合部分中的一者 (特定而言為第二抗原結合部分) 中，Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 和 VH 彼此替換， i) 在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被帶正電荷之胺基酸 (根據 Kabat 編號) 取代，且其中，在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸或位置 213 的胺基酸被帶負電荷之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 取代；或 ii) 在第二抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被帶正電荷之胺基酸 (根據 Kabat 編號) 取代，且其中，在第二抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸或位置 213 的胺基酸被帶負電荷之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
雙特異性抗體不包含 i) 及 ii) 下所提及的修飾。具有 VH/VL 交換之抗原結合部分之恆定域 CL 和 CH1 未彼此取代 (即保留未交換狀態)。
在一個更具體之實施例中， i) 在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或 組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸或位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代；或 ii) 在第二抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 獨立取代，並且在第二抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸或位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立取代。
在一個該等實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸或位置 213 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在另一個實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在一個特定實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在一個更特定之實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 指數編號) 取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 指數編號) 取代。
在一個甚至更特定的實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 的胺基酸被精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 指數編號) 取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 指數編號) 取代。
在特定實施例中，如果根據上述實施例之胺基酸取代發生在第一抗原結合部分之恆定域 CL 及恆定域 CH1 中，則第一抗原結合部分之恆定域 CL 為 κ 同種型。
可替代地，根據上述實施例之胺基酸取代可發生在第二抗原結合部分之恆定域 CL 及恆定域 CH1 中，而不是第一抗原結合部分之恆定域 CL 及恆定域 CH1 中。在特定的此等實施例中，第二抗原結合部分之恆定域 CL 為 κ 同種型。
因此，在一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第二抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸或位置 213 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在另一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第二抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在又一實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第二抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 的胺基酸被離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第二抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 指數編號) 取代，且位置 213 的胺基酸被麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 指數編號) 取代。
在另一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸經離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 處之胺基酸經離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，並且在第二抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸經麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 處之胺基酸經麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗體包含： I)       結合至人類 HLA-G 的第一抗原結合部分，且該第一抗原結合部分為 Fab 分子，其包含 A) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列；24 B) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列； 及 II) 結合至人類 CD3 的第二抗原結合部分， 其中該第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 和 VH 彼此替換，其包含 C) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列，或 D) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列，或 E) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列； 及 III) 其中，在第一抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代 (在一個特定實施例中，獨立地經離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 取代)，且位置 123 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代 (在一個特定實施例中，獨立地經離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) 取代)，並且在第一抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。
雙特異性抗體形式
如本發明之雙特異性抗體的組分可在各種組態中彼此融合。例示性構型如 圖 13所示。
在特定實施例中，雙特異性抗體中所包含之抗原結合部分為 Fab 分子。在此等實施例中，第一抗原結合部分、第二抗原結合部分、第三抗原結合部分等在本文中可分別稱為地第一 Fab 分子、第二 Fab 分子、第三 Fab 分子等。
在一個實施例中，雙特異性抗體之第一抗原結合部分與第二抗原結合部分彼此融合，視情況經由肽連接子彼此融合。在特定實施例中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 Fab 分子。在一個此等實施例中，第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合。在另一該等實施例中，第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合。另外，在其中，(i) 第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合或 (ii) 第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合的實施例中，第一抗原結合部分的 Fab 輕鏈可與第二抗原結合部分的 Fab 輕鏈彼此融合，視情況地，可透過胜肽連接子融合。
可使用能夠結合至標靶細胞抗原諸如 HLA-G 的具有單個抗原結合部分 (諸如 Fab 分子) 的雙特異性抗體 (例如，如 圖 13A 、圖 13D 、圖 13G 、圖 13H 、圖 13K 、圖 13L所示)，特定而言在高親和性抗原結合部分結合後預期標靶細胞抗原發生內化的情況下。在此等情況下，針對特定標靶細胞抗原的一種以上之抗原結合部分的存在可增強標靶細胞抗原的內在化，從而降低其可用性。
但是，在其他情況下，具有包含兩個或更多個針對特定標靶細胞抗原的抗原結合部分 (諸如 Fab 分子) 之雙特異性抗體 (例如，如 圖 13B 、圖 13C 、圖 13E 、圖 13F 、圖 13I 、圖 13J 、圖 13M或 圖 13N所示) 將為有利的，例如有利於優化對靶點的靶向或使標靶細胞抗原交聯。
因此，在特定實施例中，如本發明之雙特異性抗體包含第三抗原結合部分。
在一個實施例中，第三抗原結合部分結合至第一抗原 (亦即 HLA-G)。在一個實施例中，第三抗原結合部分為 Fab 分子。
在特定實施例中，第三抗原部分與第一抗原結合部分相同。
除非在科學上明顯不合理或不可能，否則雙特異性抗體之第三抗原結合部分可單獨或組合地結合本文所述之與結合 HLA-G 的第一抗原結合部分及/或抗體有關的特徵中之任一者。
在一個實施例中，第三抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列；或 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列；或
在特定實施例中，第三及第一抗原結合部分各自為 Fab 分子，並且第三抗原結合部分與第一抗原結合部分相同。因此，在這些實施例中，第一抗原結合部分及第三抗原結合部分包含相同的重鏈和輕鏈胺基酸序列，並且具有相同排列的域 (即習知或交叉)。此外，在這些實施例中，第三抗原結合部分包含與第一抗原結合部分相同的胺基酸取代 (如果有的話)。例如，本文所述之“電荷修飾”胺基酸取代將在第一抗原結合部分和第三抗原結合部分中的每個的恆定域 CL 和恆定域 CH1 中進行。可替代地，所述胺基酸取代可在第二抗原結合部分 (其在特定實施例中亦為 Fab 分子) 之恆定域 CL 及恆定域 CH1 中進行，但是不在第一抗原結合部分和第三抗原結合部分之恆定域 CL 及恆定域 CH1 中進行。
與第一抗原結合部分類似，第三抗原結合部分特別是習知 Fab 分子。但是，也可以設想其中，第一抗原結合部分及第三抗原結合部分為交叉 Fab 分子 (且第二抗原結合部分為習知 Fab 分子) 的實施例。因此，在特定實施例中，第一抗原結合部分及第三抗原結合部分各自為習知 Fab 分子，並且第二抗原結合部分為本文所述之交叉 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈和輕鏈之可變域 VH 及 VL 或恆定域 CL 及 CH1 彼此交換/替換的 Fab 分子。在其他實施例中，第一抗原結合部分及第三抗原結合部分各自為交叉 Fab 分子，並且第二抗原結合部分為習知 Fab 分子。
如果存在第三抗原結合部分，在一個特定實施例中，第一抗原部分及第三抗原部分結合至人類 HLA-G，並且第二抗原結合部分結合至第二抗原人類 CD3、最特別是 CD3 ε 結合。
在特定實施例中，雙特異性抗體包含 Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成。Fc 域之第一次單元及第二次單元能夠穩定締合。
如本發明之雙特異性抗體可具有不同的組態，亦即第一抗原結合部分、第二抗原結合部分 (及視情況存在之第三抗原結合部分) 可彼此融合並以不同方式與 Fc 域融合。這些成分可直接彼此融合或較佳地通過一個或多個合適的胜肽連接子融合。在 Fab 分子與 Fc 域的次單元之 N 端融合的情況下，其通常透過免疫球蛋白鉸鏈區融合。
在一些實施例中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 Fab 分子，並且第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域之第一次單元或第二次單元之 N 端融合。在此等實施例中，第一抗原結合部分可在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端或 Fc 域的次單元中另一個之 N 端融合。在特定的此等實施例中，所述第一抗原結合部分為習知 Fab 分子，並且第二抗原結合部分為本文所述之交叉 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈和輕鏈之可變域 VH 及 VL 或恆定域 CL 及 CH1 彼此交換/替換的 Fab 分子。在其他此等實施例中，所述第一 Fab 分子為交叉 Fab 分子，並且第二 Fab 分子為習知 Fab 分子。
在一個實施例中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 Fab 分子，第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域之第一次單元或第二次單元之 N 端融合，並且第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合部分之 Fab 重鏈之 N 端融合。在一個具體實施例中，雙特異性抗體基本上由第一 Fab 分子及第二 Fab 分子組成，Fc 域由第一次單元及第二次單元以及視情況存在的一個或多個肽連接子構成，其中第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第二 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且第二 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元或第二次單元之 N 端融合。 圖 13G及 圖 13K中示意性地描繪了此類構型 (在這些實例中，第二抗原結合域為 VH/VL 交換型 Fab 分子)。另外，視情況，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈及第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可彼此融合。
在另一個實施例中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 Fab 分子，並且第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。在一個具體實施例中，雙特異性抗體基本上由第一 Fab 分子及第二 Fab 分子組成，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元以及視情況由一個或多個肽連接子構成，其中第一 Fab 分子及第二 Fab 分子各自在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。圖 13A及圖 13D中示意性地描繪了此類組態 (在這些實例中，第二抗原結合域為 VH/VL 交換型 Fab 分子且第一抗原結合部分為習用 Fab 分子)。第一 Fab 分子及第二 Fab 分子可直接或透過肽連接子與 Fc 域融合。在一個特定實施例中，第一 Fab 分子及第二 Fab 分子各自透過免疫球蛋白鉸鏈區與 Fc 域融合。在一個具體實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人 IgG 1鉸鏈區，特別地，其中 Fc 域為 IgG 1Fc 域。
在一些實施例中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 Fab 分子，並且第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域之第一次單元或第二次單元之 N 端融合。在此等實施例中，第二抗原結合部分可在 Fab 重鏈之 C 端與第二抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端或 (如上文所述) Fc 域的次單元中另一個之 N 端融合。在特定的此等實施例中，所述第一抗原結合部分為習知 Fab 分子，並且第二抗原結合部分為本文所述之交叉 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈和輕鏈之可變域 VH 及 VL 或恆定域 CL 及 CH1 彼此交換/替換的 Fab 分子。在其他此等實施例中，所述第一 Fab 分子為交叉 Fab 分子，並且第二 Fab 分子為習知 Fab 分子。
在一個實施例中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 Fab 分子，第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域之第一次單元或第二次單元之 N 端融合，並且第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第一抗原結合部分之 Fab 重鏈之 N 端融合。在一個具體實施例中，雙特異性抗體基本上由第一 Fab 分子及第二 Fab 分子組成，Fc 域由第一次單元及第二次單元以及視情況存在的一個或多個肽連接子構成，其中第二 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第一 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元或第二次單元之 N 端融合。 圖 13H及 圖 13L中示意性地描繪了此類組態 (在這些實例中，第二抗原結合域為 VH/VL 交換型 Fab 分子且第一抗原結合部分為習用 Fab 分子)。另外，視情況，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈及第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可彼此融合。
在一些實施例中，第三抗原結合部分，特定而言第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元或第二次單元之 N 端融合。在特定的此等實施例中，所述第一 Fab 分子及第三 Fab 分子各自為習知 Fab 分子，並且第二 Fab 分子為本文所述之交叉 Fab 分子，即其中，Fab 重鏈和輕鏈之可變域 VH 及 VL 或恆定域 CL 及 CH1 彼此交換/替換的 Fab 分子。在其他此等實施例中，所述第一 Fab 分子及第三 Fab 分子各自為交叉 Fab 分子，並且第二 Fab 分子是習知 Fab 分子。
在一特定的該等實施例中，第二抗原結合部分及第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，並且第一抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈之 N 端融合。在一個具體實施例中，雙特異性抗體基本上由第一 Fab 分子、第二 Fab 分子及第三 Fab 分子組成，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元以及視情況存在的一個或多個肽連接子構成，其中第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第二 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且第二 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元之 N 端融合，且其中第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第二次單元之 N 端融合。 圖 13B及 圖 13E(在這些實例中，第二抗原結合域為 VH/VL 交換型 Fab 分子，並且第一抗原結合部分及第三抗原結合部分為習用 Fab 分子) 以及 圖 13J及 圖 13N(在這些實例中，第二抗原結合域為習用 Fab 分子，並且第一抗原結合部分及第三抗原結合部分為 VH/VL 交換型 Fab 分子) 中示意性地描繪了此類組態。第二 Fab 分子及第三 Fab 分子可直接或透過肽連接子與 Fc 域融合。在一個特定實施例中，第二 Fab 分子及第三 Fab 分子各自透過免疫球蛋白鉸鏈區與 Fc 域融合。在一個具體實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人 IgG 1鉸鏈區，特別地，其中 Fc 域為 IgG 1Fc 域。另外，視情況，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈及第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可彼此融合。
在另一該等實施例中，第一抗原結合部分及第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合，並且第二抗原結合部分在 Fab 重鏈之 C 端與第一抗原結合部分的 Fab 重鏈之 N 端融合。在一個具體實施例中，雙特異性抗體基本上由第一 Fab 分子、第二 Fab 分子及第三 Fab 分子組成，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元以及視情況存在的一個或多個肽連接子構成，其中第二 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與第一 Fab 分子的 Fab 重鏈之 N 端融合，並且第一 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第一次單元之 N 端融合，且其中第三 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域的第二次單元之 N 端融合。 圖 13C及 圖 13F(在這些實例中，第二抗原結合域為 VH/VL 交換型 Fab 分子，並且第一抗原結合部分及第三抗原結合部分為習用 Fab 分子) 以及 圖 13I及 圖 13M(在這些實例中，第二抗原結合域為習用 Fab 分子，並且第一抗原結合部分及第三抗原結合部分為 VH/VL 交換型 Fab 分子) 中示意性地描繪了此類組態。第一 Fab 分子及第三 Fab 分子可直接或透過肽連接子與 Fc 域融合。在一個特定實施例中，第一 Fab 分子及第三 Fab 分子各自透過免疫球蛋白鉸鏈區與 Fc 域融合。在一個具體實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人 IgG 1鉸鏈區，特別地，其中 Fc 域為 IgG 1Fc 域。另外，視情況，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈及第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可彼此融合。
在其中 Fab 分子在 Fab 重鏈之 C 端透過免疫球蛋白鉸鏈區與 Fc 域的次單元中的每個之 N 端融合的雙特異性抗體之組態中，兩個 Fab 分子、鉸鏈區和 Fc 域基本上形成免疫球蛋白分子。在一個特別實施例中，免疫球蛋白分子為 IgG 類免疫球蛋白。在更具體的實施例中，免疫球蛋白為 IgG 1亞類免疫球蛋白。在另一個實施例中，免疫球蛋白為 IgG 4亞類免疫球蛋白。在另一個特定實施例中，免疫球蛋白為人免疫球蛋白。在其他實施例中，免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。在一個實施例中，免疫球蛋白包含人恆定區，特別是人 Fc 區域。
在本發明之一些雙特異性抗體中，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈彼此融合，視情況經由肽連接子融合。根據第一 Fab 分子及第二 Fab 分子的構型不同，第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈可在其 C 端與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈之 N 端融合，或第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可在其 C 端與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈之 N 端融合。第一 Fab 分子與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈的融合進一步減少了 Fab 重鏈與輕鏈之錯配，並且還減少了表現本發明的一些雙特異性抗體所需的質體數量。
抗原結合部分可與 Fc 域直接融合或彼此融合，或者透過胜肽連接子與 Fc 融合或彼此融合，該胜肽連接子包含一個或多個胺基酸，通常約 2-20 個胺基酸。胜肽連接子為本領域中所公知的並且如本文所述。適合的非免疫原性肽連接子包括例如 (G 4S) n、(SG 4) n、(G 4S) n或 G 4(SG 4) n肽連接子。「N」通常為 1 至 10 的整數，特別為 2 至 4。在一個實施例中，該胜肽連接子的長度為至少 5 個胺基酸；在一個實施例中，長度為 5 至 100 個胺基酸；在另一個實施例中，長度為 10 至 50 個胺基酸。在一個實施例中，該胜肽連接子為 (GxS) n或 (GxS) nG m其中 G=甘胺酸，S=絲胺酸，並且 (x=3，n=3、4、5 或 6，且 m=0、1、2 或 3) 或 (x=4，n=2、3、4 或 5，且 m=0、1、2 或 3)，在一個實施例中，x=4 且 n=2 或 3，在另一個實施例中，x=4 且 n=2。在一個實施例中，該胜肽連接子為 (G 4S) 2。一種用於使第一 Fab 分子及第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈彼此融合的特別合適的胜肽連接子為 (G 4S) 2。一種適用於連接第一 Fab 片段及第二 Fab 片段之 Fab 重鏈的示例性肽連接子包含序列 (D)-(G 4S) 2。另一個適合的此等連接子包含序列 (G 4S) 4。另外，連接子可包含免疫球蛋白鉸鏈區 (的一部分)。特定而言，在其中 Fab 分子與 Fc 域次單元之 N 端融合的情況下，可透過包含附加的胜肽連接子或不含附加的胜肽連接子的免疫球蛋白鉸鏈區或其一部分融合。
在某些實施例中，如本發明之雙特異性抗體包含：多肽，其中第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (亦即第二 Fab 分子包含交換型 Fab 重鏈，其中重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VL (2)-CH1 (2)-CH2-CH3(-CH4))；及多肽，其中第一 Fab 分子之 Fab 重鏈與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH (1)-CH1 (1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含：多肽，其中第二 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VH (2)-CL (2))，並且與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL (1)-CL (1))。在某些實施例中，多肽透過例如二硫鍵共價連結。
在某些實施例中，如本發明之雙特異性抗體包含：多肽，其中第二 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (亦即第二 Fab 分子包含交換型 Fab 重鏈，其中重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH (2)-CL (2)-CH2-CH3(-CH4))；及多肽，其中第一 Fab 分子之 Fab 重鏈與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH (1)-CH1 (1)-CH2-CH3(-CH4))。在一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含：多肽，其中第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VL (2)-CH1 (2))，並且與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL (1)-CL (1))。在某些實施例中，多肽透過例如二硫鍵共價連結。
在一些實施例中，雙特異性抗體包含多肽，其中第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (亦即第二 Fab 分子包含交換型 Fab 重鏈，其中重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VL (2)-CH1 (2)-VH (1)-CH1 (1)-CH2-CH3(-CH4))。在其他實施例中，雙特異性抗包含多肽，其中第一 Fab 分子之 Fab 重鏈與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (亦即第二 Fab 分子包含交換型 Fab 重鏈，其中重鏈可變區被輕鏈可變區替換)，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH (1)-CH1 (1)-VL (2)-CH1 (2)-CH2-CH3(-CH4))。
在這些實施例中之一些實施例中，雙特異性抗體包含第二 Fab 分子之交換型 Fab 輕鏈多肽，其中第二 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VH (2)-CL (2))，並且與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL (1)-CL (1))。在這些實施例中之另一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含：多肽，其中第二 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VH (2)-CL (2)-VL (1)-CL (1))；或多肽，其中第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VL (1)-CL (1)-VH (2)-CL (2)) (在適當情況下)。
根據這些實施例之雙特異性抗體可進一步包含 (i) Fc 域次單元多肽 (CH2-CH3(-CH4))，或 (ii) 多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 重鏈與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH (3)-CH1 (3)-CH2-CH3(-CH4))，並且與第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL (3)-CL (3))。在某些實施例中，多肽透過例如二硫鍵共價連結。
在一些實施例中，雙特異性抗體包含多肽，其中第二 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (亦即第二 Fab 分子包含交換型 Fab 重鏈，其中重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 重鏈共享羧基端肽鍵，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH (2)-CL (2)-VH (1)-CH1 (1)-CH2-CH3(-CH4))。在其他實施例中，雙特異性抗包含多肽，其中第一 Fab 分子之 Fab 重鏈與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (亦即第二 Fab 分子包含交換型 Fab 重鏈，其中重鏈恆定區被輕鏈恆定區替換)，其繼而與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH (1)-CH1 (1)-VH (2)-CL (2)-CH2-CH3(-CH4))。
在這些實施例中之一些實施例中，雙特異性抗體包含第二 Fab 分子之交換型 Fab 輕鏈多肽，其中第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VL (2)-CH1 (2))，並且與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL (1)-CL (1))。在這些實施例中之另一些實施例中，雙特異性抗體進一步包含：多肽，其中第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈可變區與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈恆定區共享羧基端肽鍵，其繼而與第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL (2)-CH1 (2)-VL (1)-CL (1))；或多肽，其中第一 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽與第二 Fab 分子之 Fab 重鏈可變區共享羧基端肽鍵，其繼而與第二 Fab 分子之 Fab 輕鏈恆定區共享羧基端肽鍵 (VL (1)-CL (1)-VH (2)-CL (2)) (在適當情況下)。
根據這些實施例之雙特異性抗體可進一步包含 (i) Fc 域次單元多肽 (CH2-CH3(-CH4))，或 (ii) 多肽，其中，第三 Fab 分子之 Fab 重鏈與 Fc 域次單元共享羧基端肽鍵 (VH (3)-CH1 (3)-CH2-CH3(-CH4))，並且與第三 Fab 分子之 Fab 輕鏈多肽共享羧基端肽鍵 (VL (3)-CL (3))。在某些實施例中，多肽透過例如二硫鍵共價連結。
在如本發明之雙特異性抗體的所有不同組態中，本文所述之胺基酸取代 (如果存在) 可在第一抗原結合部分及 (如果存在) 第三抗原結合部分/Fab 分子的 CH1 和 CL 域中，或在第二抗原結合部分/Fab 分子的 CH1 和 CL 域中。較佳地，它們在第一抗原結合部分及 (如果存在) 第三抗原結合部分/Fab 分子的 CH1 和 CL 域中。根據本發明之概念，如果本文所述之胺基酸取代在第一抗原結合部分 (及 (如果存在) 第三) 抗原結合部分/Fab 分子中進行，則第二抗原結合部分/Fab 分子中不存在此類胺基酸取代。相反，如果本文所述之胺基酸取代在第二抗原結合部分/Fab 分子中進行，則第一 (及 (如果存在) 第三) 抗原結合部分/Fab 分子中不存在此類胺基酸取代。胺基酸取代特定而言在包含 Fab 分子的雙特異性抗體中進行，在該 Fab 分子中，Fab 輕鏈與 Fab 重鏈之可變域 VL 和 VH1 彼此替換。
在如本發明之雙特異性抗體的特定實施例中，特定而言，其中如本文所述之胺基酸取代在第一抗原結合部分/Fab 分子 (及如果存在時的第三抗原結合部分/Fab 分子) 中進行的情況下，第一 Fab 分子 (及如果存在時的第三 Fab 分子) 之恆定域 CL 為 κ 同型。在如本發明之雙特異性抗體的其他實施例中，特定而言，其中如本文所述之胺基酸取代在第二抗原結合部分/Fab 分子中進行的情況下，第二抗原結合部分/Fab 分子之恆定域 CL 為 κ 同型。在一些實施例中，第一 (及 (如果存在) 第三) 抗原結合部分/Fab 分子之恆定域 CL 及第二抗原結合部分/Fab 分子之恆定域 CL 為 κ 同種型。
在一個特定態樣中，本發明提供一種雙特異性抗體，其包含 a) 結合至第一抗原的第一抗原結合部分及第三抗原結合部分；其中第一抗原為 HLA-G，並且其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分各自為 (習用) Fab 分子，該 Fab 分子包含：重鏈可變區，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列； b) 結合至第二抗原的第二抗原結合部分；其中第二抗原為 CD3，且其中第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 和 VH 彼此替換，其包含：(i) 重鏈可變區，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列或 (ii) 重鏈可變區，其包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；或 (iii) 重鏈可變區，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列，及輕鏈可變區，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列；並且 c) Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成； 其中 在 a) 下所述之第一抗原結合部分及第三抗原結合部分之恆定域 CL 中，位置 124 處之胺基酸經離胺酸 (K) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 處之胺基酸經離胺酸 (K) 或精胺酸 (R) (根據 Kabat 編號) (更特定而言經精胺酸 (R)) 取代，且其中在 a) 下所述之第一抗原結合部分及第三抗原結合部分之恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸經麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 處之胺基酸經麩胺酸 (E) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代； 並且其中另外 在 a) 下所述之第一抗原結合部分在 Fab 重鏈的 C 端與在 b) 下所述之第二抗原結合部分的 Fab 重鏈的 N 端融合，並且在 b) 下所述之第二抗原結合部分及在 a) 下所述之第三抗原結合部分各自在 Fab 重鏈的 C 端與在 c) 下所述之 Fc 域的次單元中之一個的 N 端融合。
在如本發明之這些態樣的一個實施例中，在 Fc 域之第一次單元中，位置 366 處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基取代 (T366W)，並且在 Fc 域之第二次單元中，位置 407 處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基取代 (Y407V)，並且視情況，位置 366 處之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基取代 (T366S)，並且位置 368 處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基取代 (L368A) (根據 Kabat EU 索引編號)。
在如本發明之這些態樣的另一個實施例中，在 Fc 域之第一次單元中，位置 354 處之絲胺酸殘基又經半胱胺酸殘基取代 (S354C) 或位置 356 處之麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基取代 (E356C) (特定而言，位置 354 處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基取代)，並且在 Fc 域之第二次單元中，位置 349 處之酪胺酸殘基又經半胱胺酸殘基取代 (Y349C) (根據 Kabat EU 索引編號)。
在如本發明之這些態樣的又一個實施例中，在 Fc 域之第一次單元及第二次單元中的每個中，位置 234 處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基取代 (L234A)，位置 235 處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基取代 (L235A)，並且位置 329 處之脯胺酸殘基經甘胺酸殘基取代 (P329G) (根據 Kabat EU 索引編號)。
在如本發明之這些態樣的又一個實施例中，Fc 域為人類 IgG 1Fc 域。
本發明之一個具體實施例為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 的雙特異性抗體，其中該抗體包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 76 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 77 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 78 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 79 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列 (其中在 VH 或 VL 骨架區或在恆定區中，胺基酸經取代而不影響該等雙特異性抗體之特異性結合特性及恆定區之特性)。
本發明之一個具體實施例為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 的雙特異性抗體，其中該抗體包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 76 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 77 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 78 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 79 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列， 並且其中雙特異性抗體具有以下特性中之一者或多者： 該雙特異性抗體顯示出 a) 對 ILT2 及/或 ILT4 結合至 HLA-G 之抑制 (參見實例 10)；及/或 b) 藉由經重組 HLA-G 轉染的 SKOV3 細胞 (SKOV3 HLA-G) 上及/或表現內源性 HLA-G 的 JEG3 細胞上之 T 細胞的抗體介導的 IFN γ 分泌，其中檢測到該 IFN γ 分泌 (藉由 Luminex 技術) (參見實例 11)；及/或 c) 在經重組 HLA-G 轉染的 SKOV3 細胞 (SKOV 3HLA-G) 上及/或表現內源性 HLA-G 的 JEG3 細胞上之 T 細胞介導的細胞毒性/腫瘤細胞毒殺，其中在用雙特異性抗體治療後藉由測量細胞中的凋亡蛋白酶 8 活化檢測到該細胞毒性 (參見實例 12)；及/或 d) 在帶有經重組 HLA-G 轉染之 SKOV3 人類卵巢癌 (SKOV3 HLA-G) 人源化 NSG 小鼠中之活體內抗腫瘤效力/腫瘤消退作用 (參見實例 13)；及/或 e) 在帶有人類乳癌 PDX 腫瘤 (BC004) 之人源化 NSG 小鼠中 HLA-G CD3 T 細胞雙特異性之活體內抗腫瘤效力(參見實例 14)。
在另一具體實施例中，雙特異性抗體包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 76 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 77 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 78 之胺基酸序列；及多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 79 之胺基酸序列。
本發明之另一個具體實施例為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 的雙特異性抗體，其中該抗體包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 80 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 81 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 82 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 83 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列 (其中在 VH 或 VL 骨架區或在恆定區中，胺基酸經取代而不影響該等雙特異性抗體之特異性結合特性及恆定區之特性)。
本發明之一個具體實施例為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 的雙特異性抗體，其中該抗體包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 80 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 81 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 82 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 83 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列， 並且其中雙特異性抗體具有以下特性中之一者或多者： 該雙特異性抗體顯示出 a) 對 ILT2 及/或 ILT4 結合至 HLA-G 之抑制 (參見實例 10)；及/或 b) 藉由經重組 HLA-G 轉染的 SKOV3 細胞 (SKOV3 HLA-G) 上及/或表現內源性 HLA-G 的 JEG3 細胞上之 T 細胞的抗體介導的 IFN γ 分泌，其中檢測到該 IFN γ 分泌 (藉由 Luminex 技術) (參見實例 11)；及/或 c) 在經重組 HLA-G 轉染的 SKOV3 細胞 (SKOV 3HLA-G) 上及/或表現內源性 HLA-G 的 JEG3 細胞上之 T 細胞介導的細胞毒性/腫瘤細胞毒殺，其中在用雙特異性抗體治療後藉由測量細胞中的凋亡蛋白酶 8 活化檢測到該細胞毒性 (參見實例 12)；及/或 d) 在帶有經重組 HLA-G 轉染之 SKOV3 人類卵巢癌 (SKOV3 HLA-G) 人源化 NSG 小鼠中之活體內抗腫瘤效力/腫瘤消退作用 (參見實例 13)；及/或 e) 在帶有人類乳癌 PDX 腫瘤 (BC004) 之人源化 NSG 小鼠中 HLA-G CD3 T 細胞雙特異性之活體內抗腫瘤效力(參見實例 14)。
在另一具體實施例中，雙特異性抗體包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 80 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 81 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 82 之胺基酸序列；及多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 83 之胺基酸序列。
本發明之另一個具體實施例為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 的雙特異性抗體，其中該抗體包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 84 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 85 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 86 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 87 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列 (其中在 VH 或 VL 骨架區或在恆定區中，胺基酸經取代而不影響該等雙特異性抗體之特異性結合特性及恆定區之特性)。
本發明之一個具體實施例為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 的雙特異性抗體，其中該抗體包含：多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 84 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 85 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 86 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列；多肽，該多肽包含與 SEQ ID NO: 87 之序列至少 98% 或 99% 相同的胺基酸序列， 並且其中雙特異性抗體具有以下特性中之一者或多者： 該雙特異性抗體顯示出 a) 對 ILT2 及/或 ILT4 結合至 HLA-G 之抑制 (參見實例 10)；及/或 b) 藉由經重組 HLA-G 轉染的 SKOV3 細胞 (SKOV3 HLA-G) 上及/或表現內源性 HLA-G 的 JEG3 細胞上之 T 細胞的抗體介導的 IFN γ 分泌，其中檢測到該 IFN γ 分泌 (藉由 Luminex 技術) (參見實例 11)；及/或 c) 在經重組 HLA-G 轉染的 SKOV3 細胞 (SKOV 3HLA-G) 上及/或表現內源性 HLA-G 的 JEG3 細胞上之 T 細胞介導的細胞毒性/腫瘤細胞毒殺，其中在用雙特異性抗體治療後藉由測量細胞中的凋亡蛋白酶 8 活化檢測到該細胞毒性 (參見實例 12)；及/或 d) 在帶有經重組 HLA-G 轉染之 SKOV3 人類卵巢癌 (SKOV3 HLA-G) 人源化 NSG 小鼠中之活體內抗腫瘤效力/腫瘤消退作用 (參見實例 13)；及/或 e) 在帶有人類乳癌 PDX 腫瘤 (BC004) 之人源化 NSG 小鼠中 HLA-G CD3 T 細胞雙特異性之活體內抗腫瘤效力(參見實例 14)。
在另一具體實施例中，雙特異性抗體包含：多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 84 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 85 之胺基酸序列；多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 86 之胺基酸序列；及多肽，該多肽包含 SEQ ID NO: 87 之胺基酸序列。
Fc 結構域
在特定實施例中，本發明之雙特異性抗體包含 Fc 域，該 Fc 域由第一次單元及第二次單元構成。應理解，除與 Fc 異源二聚化相關的那些修飾外，本文所述之與雙特異性抗體相關的 Fc 域之特徵可同樣適用於本發明之單特異性抗 HLAG 抗體中所包含的 Fc 域。
雙特異性抗體之 Fc 域由包含免疫球蛋白分子之重鏈域的一對多肽鏈組成。例如，免疫球蛋白 G (IgG) 分子之 Fc 域為二聚體，其每個次單元包含 CH2 及 CH3 IgG 重鏈恆定域。Fc 域之兩個次單元能夠彼此穩定締合。在一個實施例中，本發明之雙特異性抗體包含不超過一個 Fc 域。
在一個實施例中，雙特異性抗體之 Fc 域為 IgG Fc 域。在一個特定實施例中，Fc 域為 IgG 1Fc 域。在另一個實施例中，Fc 結構域為 IgG 4Fc 結構域。在一個更具體之實施例中，Fc 結構域為 IgG 4Fc 結構域，其包含在位置 S228 (根據 Kabat EU 指數編號) 的胺基酸取代，特別是胺基酸取代 S228P。該胺基酸取代減少活體內 IgG 4抗體之 Fab 臂交換 (參見 Stubenrauch 等人，Drug Metabolism and Disposition 38，84-91 (2010))。在另一個特定實施例中，Fc 域為人 Fc 域。在一個甚至更特定的實施例中，Fc 結構域為人類 IgG 1Fc 結構域。
促進異源二聚化的 Fc 域修飾
如本發明之雙特異性抗體包含不同的抗原結合部分，其可與 Fc 域之兩個次單元中的一個或另一個融合，因此 Fc 域之兩個次單元通常包含在兩個不同的多肽鏈中。這些多肽的重組共表現及隨後的二聚化導致兩種多肽具有若干可能的組合。為改善重組生產中雙特異性抗體之產率和純度，在雙特異性抗體之 Fc 域中引入促進所需之多肽締合之修飾將為有利的。
因此，在特定實施例中，如本發明之雙特異性抗體的 Fc 域包含促進 Fc 域之第一次單元及第二次單元之締合之修飾。人類 IgG Fc 域之兩個次單元之間最廣泛的蛋白質-蛋白質相互作用位點在 Fc 域之 CH3 結構域中。因此，在一個實施例中，該修飾在 Fc 結構域之 CH3 結構域中。
存在多種對 Fc 域之 CH3 域進行修飾以便增強異源二聚化之方法，這些方法很好地描述於例如 WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291 中。通常，在所有此等方法中，Fc 域之第一次單元的 CH3 域及 Fc 域之第二次單元的 CH3 域均以互補的方式進行工程改造，以使每個 CH3 域 (或包含 CH3 域的重鏈) 不再能夠與自身發生同源二聚化，而是被迫與經互補工程改造之其他 CH3 域進行異源二聚化 (使得第一 CH3 域及第二 CH3 域異源二聚化，並且在兩個第一 CH3 域或兩個第二 CH3 域之間不形成同源二聚體)。這些用於改善重鏈異源二聚化之不同方法被視為與雙特異性抗體中重鏈-輕鏈修飾 (例如，一個結合臂中之 VH 和 VL 交換/替換，以及在 CH1/CL 界面中引入帶有相反電荷的胺基酸的取代基) 結合之不同選擇，其減少了重鏈/輕鏈錯配及 Bence Jones 型副產物。
在一個具體實施例中，該促進 Fc 結構域之第一次單元及第二次單元的締合的修飾為所謂的「杵臼」修飾，其包括在 Fc 結構域之兩個次單元中的一個的「杵」修飾及 Fc 結構域之兩個次單元中的另一個的「臼」修飾。
「杵臼」技術描述於例如：US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway 等人，Prot Eng 9，617-621 (1996)；及 Carter，J Immunol Meth 248，7-15 (2001)。通常，該方法包括在第一多肽之界面處引入一個突起 (「杵」)，並且在第二多肽之界面中引入一個對應的空腔 (「臼」)，以使該突起可定位於空腔中，從而促進異源二聚體形成並阻礙同源二聚體形成。透過用較大側鏈 (例如酪胺酸或色胺酸) 替換第一多肽界面上之較小的胺基酸側鏈來構建突起。透過將較大胺基酸側鏈替換為較小的胺基酸側鏈 (例如丙胺酸或蘇胺酸)，在第二多肽之界面中形成與突起具有相同或相近大小的互補空腔。
因此，在一個特定實施例中，在雙特異性抗體之 Fc 域的第一次單元的 CH3 域中，胺基酸殘基被具有較大側鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在第一次單元之 CH3 域內產生突起，該突起可定位在第二次單元之 CH3 域內的空腔中，並且在 Fc 域的第二次單元的 CH3 域中，胺基酸殘基被具有較小側鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在第二次單元之 CH3 域內產生空腔，第一次單元之 CH3 域內的突起為可定位在該空腔內。
較佳地，該具有較大側鏈體積的胺基酸殘基選自由以下所組成之群組：精胺酸 (R)、苯丙胺酸 (F)、酪胺酸 (Y) 和色胺酸 (W)。
較佳地，該具有較小側鏈體積的胺基酸殘基選自由以下所組成之群組：丙胺酸 (A)、絲胺酸 (S)、蘇胺酸 (T) 和纈胺酸 (V)。
可透過改變編碼多肽的核酸 (例如透過針對特定位點之突變或透過胜肽合成) 來製備突起和空腔。
在一個具體實施例中，在 Fc 域之第一次單元 (「杵」次單元) (的 CH3 域) 中，位置 366 處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基取代 (T366W)，並且在 Fc 域之第二次單元 (「臼」次單元) (的 CH3 域) 中，位置 407 處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基取代 (Y407V)。在一個實施例中，在 Fc 結構域之第二次單元中，位置 366 的蘇胺酸殘基又被絲胺酸殘基取代 (T366S)，並且位置 368 的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代 (L368A) (根據 Kabat EU 指數編號)。
在又一個實施例中，在 Fc 結構域之第一次單元中，位置 354 的絲胺酸殘基又被半胱胺酸殘基取代 (S354C) 或位置 356 的麩胺酸殘基被半胱胺酸殘基取代 (E356C) (特別是位置 354 的絲胺酸殘基被半胱胺酸殘基取代)，並且在 Fc 結構域之第二次單元中，位置 349 的酪胺酸殘基又被半胱胺酸殘基取代 (Y349C) (根據 Kabat EU 指數編號)。引入這兩個半胱胺酸殘基導致在 Fc 域之兩個次單元之間形成二硫鍵，從而進一步穩定二聚體 (Carter，J Immunol Methods 248，7-15 (2001))。
在一個特定實施例中，Fc 域之第一次單元包含胺基酸取代 S354C 和 T366W，並且 Fc 域之第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S、L368A 和 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。
在一個特定實施例中，結合至第二抗原 (例如活化 T 細胞抗原) 的抗原結合部分融合 (視情況經由結合至 HLA-G 第一抗原結合部分及/或肽連接子) 至 Fc 域之第一次單元 (包含「杵」修飾)。不希望被理論束縛，結合第二抗原諸如活化 T 細胞抗原的抗原結合部分與 Fc 域之含杵次單元的融合將 (進一步) 最大限度減少包含兩個結合至活化 T 細胞抗原的抗原結合部分之抗體的產生 (兩個含杵多肽之空間碰撞)。
可以設想將用於強制異源二聚化的 CH3 修飾的其他技術作為本發明之替代方案，並且這些技術描述於例如 WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291 中。
在一個實施例中，可替代地使用 EP 1870459 中所述之異源二聚化方法。該方法基於在 Fc 域之兩個次單元之間的 CH3/CH3 域界面的特定胺基酸位置引入帶有相反電荷的胺基酸。本發明之雙特異性抗體的一個較佳的實施例為 (Fc 域之) 兩個 CH3 域之一中的胺基酸突變 R409D 和 K370E；及 Fc 域的 CH3 域之另一個中的胺基酸突變 D399K 和 E357K (根據 Kabat EU 索引編號)。
在另一個實施例中，本發明之雙特異性抗體包含 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 T366W 和 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 T366S、L368A、Y407V，以及 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 R409D、K370E 和 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 D399K、E357K (根據 Kabat EU 索引編號)。
在另一個實施例中，本發明之雙特異性抗體包含 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 S354C、T366W 和 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 Y349C、T366S、L368A、Y407V，或者該雙特異性抗體包含 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 Y349C、T366W 和 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 S354C、T366S、L368A、Y407V，以及另外 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 R409D、K370E 和 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸突變 D399K、E357K (全部根據 Kabat EU 索引編號)。
在一個實施例中，可替換使用 WO 2013/157953 中所述之異源二聚化方法。在一個實施例中，第一 CH3 結構域包含胺基酸突變 T366K，並且第二 CH3 結構域包含胺基酸突變 L351D (根據 Kabat EU 指數編號)。在另一個實施例中，第一 CH3 結構域進一步包含胺基酸突變 L351K。在另一個實施例中，第二 CH3 結構域進一步包含選自 Y349E、Y349D 和 L368E (較佳的是 L368E) (根據 Kabat EU 指數編號) 的胺基酸突變。
在一個實施例中，可替換使用 WO 2012/058768 中所述之異源二聚化方法。在一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 L351Y、Y407A，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 T366A、K409F。在另一個實施例中，第二 CH3 域進一步包含位置 T411、D399、S400、F405、N390 或 K392 的胺基酸突變，所述位置選自例如：a) T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E 或 T411W；b) D399R、D399W、D399Y 或 D399K；c) S400E、S400D、S400R 或 S400K；d) F405I、F405M、F405T、F405S、F405V 或 F405W；e) N390R、N390K 或 N390D；f) K392V、K392M、K392R、K392L、K392F 或 K392E (根據 Kabat EU 索引編號)。在另一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 L351Y、Y407A，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 T366V、K409F。在另一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 Y407A，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 T366A、K409F。在另一個實施例中，第二 CH3 結構域進一步包含胺基酸突變 K392E、T411E、D399R 和 S400R (根據 Kabat EU 指數編號)。
在一個實施例中，可替代地使用 WO 2011/143545 中所述之異源二聚化方法，例如，在選自 368 和 409 (根據 Kabat EU 索引編號) 的位置處進行胺基酸修飾。
在一個實施例中，可替換使用 WO 2011/090762 中所述之異源二聚化方法，該方法同樣使用上述之「杵臼」技術。在一個實施例中，第一 CH3 域包含胺基酸突變 T366W，並且第二 CH3 域包含胺基酸突變 Y407A。在一個實施例中，第一 CH3 結構域包含胺基酸突變 T366Y，並且第二 CH3 結構域包含胺基酸突變 Y407T (根據 Kabat EU 指數編號)。
在一個實施例中，雙特異性抗體或其 Fc 域屬於 IgG 2亞類，並且可替代地使用 WO 2010/129304 中所述之異源二聚化方法。
在一個替代實施例中，促進 Fc 結構域之第一次單元及第二次單元的締合的修飾包括介導靜電轉向作用的修飾，例如 PCT 公開 WO 2009/089004 中所述。通常，此方法涉及用帶電荷的胺基酸殘基取代兩個 Fc 域次單元界面上的一個或多個胺基酸殘基，從而使同源二聚體形成在靜電上不利，但異源二聚化在靜電上有利。在一個此等實施例中，第一 CH3 結構域包含帶負電荷之胺基酸 (例如麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D)，較佳的是 K392D 或 N392D) 對 K392 和 N392 之胺基酸取代，並且第二 CH3 結構域包含帶正電荷之胺基酸 (例如離胺酸 (K) 或精胺酸 (R)，較佳的是 D399K、E356K、D356K 或 E357K 且更佳的是 D399K 和 E356K) 對 D399、E356、D356 或 E357 之胺基酸取代。在另一個實施例中，第一 CH3 結構域進一步包含帶負電荷之胺基酸 (例如麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D)，更佳的是 K409D 或 R409D) 對 K409 或 R409 之胺基酸取代。在另一個實施例中，第一 CH3 域進一步或可替代地包含帶負電荷之胺基酸 (例如麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D)) 對 K439 及/或 K370 之胺基酸取代 (全部根據 Kabat EU 索引編號)。
在又一個實施例中，可替代地使用 WO 2007/147901 中所述之異源二聚化方法。在一個實施例中，第一 CH3 結構域包含胺基酸突變 K253E、D282K 和 K322D，並且第二 CH3 結構域包含胺基酸突變 D239K、E240K 和 K292D (根據 Kabat EU 指數編號)。
在另一個實施例中，可替代地使用 WO 2007/110205 中所述之異源二聚化方法。
在一個實施例中，Fc 結構域之第一次單元包含胺基酸取代 K392D 和 K409D，並且Fc 結構域之第二次單元包含胺基酸取代 D356K 和 D399K (根據 Kabat EU 指數編號)。
減少 Fc 受體結合及 / 或效應功能之 Fc 域修飾
Fc 域賦予雙特異性抗體 (或抗體) 有利的藥代動力學特性，包括較長之血清半衰期，其有助於在標靶組織中獲得良好的蓄積和有利的組織-血液分配比。但是，與此同時，它可能導致不希望地將雙特異性抗體 (或抗體) 導向表現 Fc 受體的細胞，而不是較佳的攜帶抗原的細胞。此外，Fc 受體傳訊途徑之共活化可導致細胞激素分泌/釋放，其與 T 細胞活化特性 (例如在其中第二抗原結合部分結合至活化 T 細胞抗原的雙特異性抗體之實施例中) 及雙特異性抗體之長半衰期相結合，導致細胞激素受體之過度活化及全身投予時產生重度副作用。由於 T 細胞之潛在破壞 (例如藉由 NK 細胞之破壞)，除 T 細胞外的 (帶有 Fc 受體) 免疫細胞之活化甚至可能降低雙特異性抗體 (特定而言，其中第二抗原結合部分結合至活化 T 細胞抗原的雙特異性抗體) 之效力。
因此，在特定實施例中，與天然 IgG 1Fc 域相比，如本發明之雙特異性抗體的 Fc 域表現出對 Fc 受體的降低的結合親和性及/或降低的效應功能。在一個該等實施例中，Fc 域 (或包含該 Fc 域的雙特異性抗體) 與天然 IgG 1Fc 域 (或包含天然 IgG 1Fc 域的雙特異性抗體) 相比，表現出小於 50%、較佳的是小於 20%、更佳的是小於 10% 且最佳的是小於 5% 的對 Fc 受體的結合親和力，及/或與天然 IgG 1Fc 域 (或包含天然 IgG 1Fc 域的雙特異性抗體) 相比，表現出小於 50%、較佳的是小於 20%、更佳的是小於 10% 且最佳的是小於 5% 的效應功能。在一個實施例中，Fc 域 (或包含該 Fc 域的雙特異性抗體) 基本上不與 Fc 受體結合及/或誘導效應功能。在一個特定實施例中，Fc 受體為 Fcγ 受體。在一個實施例中，Fc 受體為人類 Fc 受體。在一個實施例中，Fc 受體為活化 Fc 受體。在一個具體實施例中，Fc 受體為活化人類 Fcγ 受體，更具體地為人類 FcγRIIIa、FcγRI 或 FcγRIIa，最具體地為 FcγRIIIa。在一個實施例中，效應功能為選自 CDC、ADCC、ADCP 和細胞激素分泌所組成之群組之一種或多種。在一個特定實施例中，效應功能為 ADCC。在一個實施例中，與天然 IgG 1Fc 域相比，Fc 域對新生 Fc 受體 (FcRn) 表現出基本類似的結合親和性。當 Fc 域 (或包含該 Fc 域的雙特異性抗體) 表現出大於約 70%、特定而言大於約 80%、更特定而言大於約 90% 的天然 IgG 1Fc 域 (或包含天然 IgG 1Fc 域的雙特異性抗體) 對 FcRn 的結合親和性時，實現了與 FcRn 的基本上類似的結合。
在某些實施例中，與非工程化 Fc 結構域相比，工程化的 Fc 結構域對 Fc 受體具有降低的結合親和性和/或降低的效應功能。在特定實施例中，雙特異性抗體之 Fc 域包含一種或多種胺基酸突變，其降低 Fc 域對 Fc 受體的結合親和性及/或效應功能。通常，在 Fc 域之兩個次單元中的每個中都存在相同的一個或多個胺基酸突變。在一個實施例中，胺基酸突變降低了 Fc 域與 Fc 受體的結合親和性。在一個實施例中，胺基酸突變將 Fc 域對 Fc 受體的結合親和力降低至少 2 倍、至少 5 倍或至少 10 倍。在存在多於一種降低胺基酸對 Fc 受體的結合親和性的胺基酸突變的實施例中，這些胺基酸突變的組合可使 Fc 結構域對 Fc 受體的結合親和性降低至少 10 倍、至少 20 倍或甚至至少 50 倍。在一個實施例中，與包含未經工程改造的 Fc 域的雙特異性抗體相比，包含突變 Fc 域的雙特異性抗體表現出小於 20%、特定而言小於 10%、更特定而言小於 5% 的與 Fc 受體的結合親和力。在一個特定實施例中，Fc 受體為 Fcγ 受體。在一些實施例中，Fc 受體為人 Fc 受體。在一些實施例中，Fc 受體為活化 Fc 受體。在一個具體實施例中，Fc 受體為活化人類 Fcγ 受體，更具體地為人類 FcγRIIIa、FcγRI 或 FcγRIIa，最具體地為人類 FcγRIIIa。較佳地，減少與這些受體中的每個之結合。在一些實施例中，亦降低了與補體組分的結合親和性，具體而言為與 C1q 的結合親和性。在一個實施例中，不降低對新生 Fc 受體 (FcRn) 的結合親和力。當 Fc 域 (或包含該 Fc 域的雙特異性抗體) 表現出大於約 70% 的非工程改造形式的 Fc 域 (或包含該非工程改造形式的 Fc 域的雙特異性抗體) 對 FcRn 之結合親和性時，實現了與 FcRn 基本上類似的結合，即 Fc 域對該受體的結合親和性得以保持。Fc 域或本發明之包含該 Fc 域的雙特異性抗體可表現出大於約 80% 及甚至大於約 90% 的此等親和性。在某些實施例中，與非工程改造的 Fc 域相比，雙特異性抗體之 Fc 域經工程改造以具有降低的效應功能。降低的效應功能可包括但不限於以下一種或多種：降低補體依賴性細胞毒性 (CDC)、抗體依賴型細胞媒介的細胞毒性 (ADCC)、降低抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP)、減少細胞激素分泌、減少抗原呈遞細胞的免疫複合體介導的抗原攝取、減少與 NK 細胞的結合、減少與巨噬細胞的結合、減少與單核細胞的結合、減少與多形核細胞的結合、減少直接信號傳導誘導的細胞凋亡、減少靶標結合抗體的交聯、降低樹突狀細胞成熟度或減少 T 細胞引發。在一個實施例中，降低的效應功能選自降低的 CDC、降低的 ADCC、降低的 ADCP 和減少的細胞激素分泌之群組中的一種或多種。在一個特定實施例中，降低的效應功能為降低的 ADCC。在一個實施例中，降低的 ADCC 小於非工程改造的 Fc 域 (或包含非工程改造的 Fc 域之雙特異性抗體) 誘導的 ADCC 的 20%。
在一個實施例中，降低 Fc 域與 Fc 受體的結合親和性及/或效應功能的胺基酸突變為胺基酸取代。在一個實施例中，Fc 域包含在選自 E233、L234、L235、N297、P331 和 P329 (根據 Kabat EU 索引編號) 的位置的胺基酸取代。在一個更具體之實施例中，Fc 域包含在選自 L234、L235 和 P329 (根據 Kabat EU 索引編號) 的位置的胺基酸取代。在一些實施例中，Fc 域包含 L234A 和 L235A (根據 Kabat EU 索引編號) 的胺基酸取代。在一個此等實施例中，Fc 域為 IgG 1Fc 域，特定而言為人類 IgG 1Fc 域。在一個實施例中，Fc 域包含在位置 P329 的胺基酸取代。在一個更具體之實施例中，胺基酸取代為 P329A 或 P329G，特定而言 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。在一個實施例中，Fc 域包含在位置 P329 的胺基酸取代，以及在選自 E233、L234、L235、N297 和 P331 (根據 Kabat EU 索引編號) 的位置的另一個胺基酸取代。在一個更具體之實施例中，該另一個胺基酸取代為 E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D 或 P331S。在特定實施例中，Fc 域包含在位置 P329、L234 和 L235 (根據 Kabat EU 索引編號) 的胺基酸取代。在更特定之實施例中，Fc 域包含胺基酸突變 L234A、L235A 和 P329G (「P329G LALA」、「PGLALA」或「LALAPG」)。具體地，在特定實施例中，Fc 結構域之每個次單元包含胺基酸取代 L234A、L235A 和 P329G (根據Kabat Eu指數編號)，即在 Fc 結構域之第一次單元及第二次單元中的每個中，位置 234 的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代 (L234A)，位置 235 的白胺酸殘基被丙胺酸殘基取代 (L235A)，並且位置 329 的脯胺酸殘基被甘胺酸殘基取代 (P329G) (根據 Kabat EU 指數編號)。
在一個此等實施例中，Fc 域為 IgG 1Fc 域，特定而言為人類 IgG 1Fc 域。胺基酸取代的「P329G LALA」組合幾乎完全消除了人類 IgG 1Fc 域的 Fcγ 受體 (以及補體) 結合，如 PCT 公開號 WO 2012/130831 所述，其全文以引用方式併入本文。WO 2012/130831 還描述了用於製備此等突變 Fc 域的方法及確定其性質 (例如 Fc 受體結合或效應功能) 的方法。
IgG 4抗體與 IgG 1抗體相比，表現出與 Fc 受體的降低的結合親和性和降低的效應功能。因此，在一些實施例中，本發明之雙特異性抗體的 Fc 域為 IgG 4Fc 域，特定而言為人類 IgG 4Fc 域。在一個實施例中，IgG 4Fc 域包含在位置 S228 的胺基酸取代，具體而言胺基酸取代 S228P (根據 Kabat EU 索引編號)。為進一步降低其與 Fc 受體的結合親和性及/或其效應功能，在一個實施例中，IgG 4Fc 域包含在位置 L235 的胺基酸取代，具體而言胺基酸取代 L235E (根據 Kabat EU 索引編號)。在另一個實施例中，IgG 4Fc 結構域包含在位置 P329 的胺基酸取代，具體地包含胺基酸取代 P329G (根據 Kabat EU 指數編號)。在一個特定實施例中，IgG 4Fc 結構域包含位置 S228、L235 和 P329 的胺基酸取代，具體地包含胺基酸取代 S228P、L235E 和 P329G (根據 Kabat EU 指數編號)。此等 IgG 4Fc 域突變體及其 Fcγ 受體結合性質描述於 PCT 公開號 WO 2012/130831中，其全文以引用方式併入本文。
在一個特定實施例中，與天然 IgG 1Fc 結構域相比，表現出降低的對 Fc 受體的結合親和性和/或降低的效應功能的 Fc 結構域為包含胺基酸取代 L234A、L235A 及視情況 P329G 的人類 IgG 1Fc 結構域或包含胺基酸取代 S228P、L235E 及視情況 P329G (根據 Kabat EU 指數編號) 的人類 IgG 4Fc 結構域。
可使用此技術領域中熟知的遺傳或化學方法，藉由胺基酸缺失、取代、插入或修飾來製備突變型 Fc 域。遺傳方法可包括編碼 DNA 序列的位點特異性突變、PCR、基因合成等。可透過例如測序來驗證核苷酸變化是否正確。
與 Fc 受體之結合可易於透過 ELISA 確定，或透過表面電漿子共振 (SPR) 使用標準儀器例如 BIAcore 儀器 (GE Healthcare) 進行確定，並且 Fc 受體可透過例如重組表現來獲得。可替代地，Fc 域或包含 Fc 域的雙特異性抗體對 Fc 受體之結合親和性可使用已知表現特定 Fc 受體的細胞株 (例如表現 FcγIIIa 受體的人 NK 細胞) 進行評估。
Fc 域或包含 Fc 域的雙特異性抗體的效應功能可透過此領域中所公知的方法進行測定。用於評估目標分子之 ADCC 活性的活體外分析方法的實例描述於例如：美國專利號 5,500,362；Hellstrom 等人，Proc Natl Acad Sci USA 83，7059-7063 (1986)；及 Hellstrom 等人，Proc Natl Acad Sci USA 82，1499-1502 (1985)；美國專利號 5,821,337；Bruggemann 等人，J Exp Med 166，1351-1361 (1987)。可替代地，可採用非放射性分析方法 (參見例如用於流式細胞技術之 ACTI™ 非放射性細胞毒性分析 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及 CytoTox 96 ®非放射性細胞毒性分析 (Promega, Madison, WI))。用於此等分析的有用的效應細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。可替代地或另外地，可在例如 Clynes 等人在 Proc Natl Acad Sci USA 95，652-656 (1998) 中公開的動物模型中在活體內評估目標分子之 ADCC 活性。
在一些實施例中，減少 Fc 域與補體成分之結合，具體地減少與 C1q 之結合。因此，在一些實施例中，其中，Fc 域被工程化為具有降低的效應功能，該降低的效應功能包括降低的 CDC。可實施 C1q 結合分析以測定 Fc 域或包含 Fc 域的雙特異性抗體能否結合 C1q 並因此具有 CDC 活性。參見例如 WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中的 C1q 和 C3c 結合 ELISA。為評估補體活化，可實施 CDC 測定 (參見例如：Gazzano-Santoro 等人，J Immunol Methods 202，163 (1996)；Cragg 等人，Blood 101，1045-1052 (2003)；及 Cragg 和 Glennie，Blood 103，2738-2743 (2004))。
FcRn 結合和活體內清除率/半衰期測定也可使用此領域中所公知的方法進行 (參見例如 Petkova, S.B. 等人， Int’l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)；WO 2013/120929)。
在又一態樣中，根據上述實施例中之任一者的抗 HLA-G 抗體可單獨或組合結合如以下 1-6 部分所述之任意特徵： 1. 抗體親和力
在某些實施例中，本文所提供之抗體具有 ≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM 或 ≤ 0.001 nM (例如，10 -8M 或更小例如 10 -8M 至 10 -13M，例如，10 -9M 至 10 -13M) 的解離常數 KD。
在一較佳的實施例中，使用表面電漿子共振測定法 (使用 BIACORE ®)，於 25°C 下用固定抗原 CM5 晶片在約 10 個反應單位 (RU) 下量測 KD。簡言之，根據供應商之說明書，用 N-乙基- N’-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽 (EDC) 及 N-羥基丁二醯亞胺 (NHS) 來活化羧基甲基化聚葡萄糖生物感測器晶片 (CM5, BIACORE, Inc.)。用 10 mM 醋酸鈉 (pH 4.8) 將抗原稀釋至 5 µg/ml (約 0.2 μM)，然後以 5 µl/min 的流速注入，以獲得大約 10 反應單位 (RU) 的偶合蛋白。注入抗原後，注入 1 M 乙醇胺以封閉未反應的基團。在動力學測量中，將 Fab 之兩倍連續稀釋液 (0.78 nM 至 500 nM) 在 25°C 下以約 25 µl/min 的流速注入含 0.05% 聚山梨醇酯 20 (TWEEN-20 TM) 界面活性劑 (PBST) 的 PBS 中。使用簡單的一對一朗繆爾結合模型 (one-to-one Langmuir binding model) (BIACORE ®評估軟體 3.2 版)，藉由同時擬合結合及解離感測器圖譜來計算締合速率 (kon 或 ka) 及解離速率 (koff 或 kd)。將平衡解離常數 KD 作為比率 kd/ka (koff/kon) 來計算。參見例如 Chen 等人, J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881。若藉由上述表面電漿子共振分析測定之締合速率超過 106 M-1 s-1，則締合速率可使用螢光淬滅技術量測，該技術在如光譜儀 (諸如具有攪拌式比色管之止流裝備型分光光度計 (Aviv Instruments) 或 8000-系列 SLM-AMINCO TM分光光度計 (ThermoSpectronic)) 中所量測之濃度增加之抗原存在下，在 25℃ 量測 PBS (pH 值 7.2) 中之 20 nM 抗-抗原抗體 (Fab 形式) 之螢光發射強度 (激發 = 295 nm；發射 = 340 nm，16 nm 帶通) 的增加或減少。 2. 抗體片段
在某些實施例中，本文提供的抗體是抗體片段。抗體片段包括但不限於 Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab') 2、Fv 和 scFv 片段以及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段的綜述，參見 Hudson, P.J. 等人, Nat. Med. 9 (2003) 129-134。關於 scFv 片段的綜述，參見例如：Plueckthun, A.，收錄於：The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113 卷，Rosenburg 及 Moore (主編)，Springer-Verlag，New York (1994)，第 269-315 頁；另外參見 WO 93/16185；及美國專利第 5,571,894 號及第 5,587,458 號。關於包含補救受體結合抗原決定位殘基且具有增加的體內半衰期之 Fab 及 F(ab') 2片段的論述，參見美國第 5,869,046 號專利。
雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點 (其可係二價或雙特異性的) 之抗體片段。參見例如：EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson, P.J. 等人，Nat. Med. 9 (2003) 129-134；及 Holliger, P. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448。三功能抗體及四功能抗體亦闡述於 Hudson, P.J. 等人, Nat. Med .9 (20039 129-134) 中。
單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或部分或抗體之輕鏈可變域之全部或部分之抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體 (Domantis, Inc.，Waltham, MA； 參見例如美國號 6,248,516 B1)。
抗體片段可藉由各種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞 (例如 大腸桿菌或噬菌體) 之產生。 3. 嵌合和人源化抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體闡述於例如美國專利第 4,816,567 號；及 Morrison, S.L. 等人 ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855) 中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人可變區 (例如，來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物如猴的可變區) 及人恆定區。在又一個實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類或子類相比於其親代抗體已發生變更。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體為人源化抗體。通常，非人抗體為人源化抗體以降低對人的免疫原性，同時保留親代非人抗體之特異性及親和力。通常，人源化抗體包含一個或多個可變域，其中 CDR (例如 CDR) (或其部分) 來源於非人類抗體，並且 FR (或其部分) 來源於人類抗體序列。人源化抗體視情況將包含人恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人源化抗體中的一些 FR 殘基經來自非人抗體 (例如衍生 CDR 殘基之抗體) 之對應殘基取代，以例如恢復或改善抗體特異性或親和力。
人源化抗體及其製造方法綜述於例如 Almagro, J.C. 及 Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633 中，且進一步闡述於例如以下各者中：Riechmann, I. 等人 ,Nature 332 (1988) 323-329；Queen, C. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033；美國專利第 5, 821,337、7,527,791、6,982,321 及 7,087,409 號；Kashmiri, S.V. 等人, Methods 36 (2005) 25-34 (描述 SDR (a-CDR) 移植)；Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (描述「表面重修」)；Dall’Acqua, W.F. 等人, Methods 36 (2005) 43-60 (描述「FR 改組」)；以及 Osbourn, J. 等人, Methods 36 (2005) 61-68 及 Klimka, A. 等人, Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (描述 FR 改組之「導向選擇」方法)。
可用於人源化的人類骨架區包括但不限於：使用「最佳匹配」方法選擇的骨架區 (參見例如 Sims, M.J. 等人, J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308；來源於輕鏈或重鏈可變區的特定亞組的人類抗體的共有序列的框架區 (參見例如：Carter, P. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及 Presta, L.G. 等人, J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632)；人類成熟的 (體細胞突變) 骨架區或人種系骨架區 (參見例如 Almagro, J.C. 及 Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633)；以及來源於篩選 FR 文庫的骨架區 (參見例如：Baca, M. 等人, J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684；及 Rosok, M.J. 等人, J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)。 4. 人抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體為人類抗體。可使用此領域中所公知的各種技術生產人抗體。人類抗體一般性闡述於以下文獻中：van Dijk, M.A. 及 van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374；以及 Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459。
可透過對轉基因動物投予免疫原來製備人抗體，該轉基因動物已被修飾以響應於抗原攻擊而產生完整的人抗體或具有人可變區的完整抗體。此等動物通常包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，其取代內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合到動物的染色體中。在此等轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已被滅活。關於自轉基因動物獲得人類抗體的方法的綜述，參見 Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125。另見例如：美國專利號 6,075,181 和 6,150,584 (描述了 XENOMOUSE TM技術)；美國專利號 5,770,429 (描述了 HuMab® 技術)；美國專利號 7,041,870 (描述了 K-M MOUSE® 技術)；及美國專利申請公開號 US 2007/0061900 (描述了 VelociMouse® 技術)。來自由此等動物產生的完整抗體的人類可變區可被進一步修飾，例如透過與不同的人類恆定區結合來修飾。
人抗體也可透過基於雜交瘤的方法進行製備。用於生產人單株抗體的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤細胞株已有描述。(參見例如：Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005；Brodeur, B.R. 等人, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63；及 Boerner, P. 等人, J. Immunol. 147 (1991) 86-95) 經由人類 B 細胞融合瘤技術生成的人類抗體亦闡述於 Li 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562 中。其他方法包括彼等闡述於例如美國專利第 7,189,826 號 (闡述由融合瘤細胞株產生單株人類 IgM 抗體) 及 Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (闡述人類-人類融合瘤) 中者。人類融合瘤技術 (三源融合瘤技術) 亦闡述於 Vollmers, H.P. 及 Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 以及 Vollmers, H.P. 及 Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191 中。
人抗體也可以藉由分離選自人源性噬菌體展示庫的 Fv 選殖株可變域序列來產生。然後可以將此等可變域序列與所需的人恆定域結合。下文描述了從抗體文庫中選擇人類抗體的技術。 5. 來源於文庫之抗體
用於本發明之抗體可透過篩選組合文庫中具有所需之一種或多種活性的抗體來分離。例如，此領域中所公知的多種方法用於產生噬菌體展示庫並篩選此等庫中具有所需之結合特性的抗體。該等方法綜述於例如 Hoogenboom, H.R. 等人, Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 中，並且進一步闡述於例如以下文獻中：McCafferty, J. 等人, Nature 348 (1990) 552-554；Clackson, T. 等人, Nature 352 (1991) 624-628；Marks, J.D. 等人, J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597；Marks, J.D.及 Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175；Sidhu, S.S. 等人, J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310；Lee, C.V. 等人, J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093；Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472；及 Lee, C.V. 等人, J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132。
在某些噬菌體顯示方法中，藉由聚合酶鏈反應 (PCR) 分別選殖 VH 及 VL 基因譜，且在噬菌體文庫中隨機重組，然後可如以下文獻中所述之方法來篩選抗原結合噬菌體：Winter, G. 等人, Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455。噬菌體通常以單鏈 Fv (scFv) 片段或 Fab 片段展示抗體片段。來自免疫源的文庫無需構建融合瘤即可向免疫原提供高親和性抗體。可替代地，可以在不進行任何免疫的情況下選殖天然譜系 (例如，來自人) 以向各種非自身以及自身抗原提供抗體的單一來源，如 Griffiths, A.D. 等人在 EMBO J. 12 (1993) 725-734 中所述。最後，還可以透過選殖幹細胞中未重排的 V 基因片段，並使用包含隨機序列的 PCR 引子來編碼高變異性 CDR3 區域並在 活體外完成重排，由此合成天然庫，如 Hoogenboom, H.R. 及 Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 中所述。描述人抗體噬菌體庫的專利公開包括例如：美國第 5,750,373 號專利及美國專利公開號 2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936 和 2009/0002360。
從人抗體庫分離的抗體或抗體片段在本文中被視作人抗體或人抗體片段。 6. 抗體變異體
在某些實施例中，考慮到本文提供之抗體的胺基酸序列變異體。例如，可能希望改善抗體的結合親和力及/或其他生物學特性。可藉由將適當的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異體。此等修飾包括例如抗體之胺基酸序列中的殘基的缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入和取代之任意組合以得到最終構建體，前提條件是最終構建體具有所需之特徵，例如抗原結合特徵。 a) 取代、插入和缺失變異體
在某些實施例中，提供了具有一個或多個胺基酸取代之抗體變異體。取代誘變的目標位點包括 CDR 及 FR (在一較佳的實施例中，骨架殘基與抗體之結合特性無關 (參見例如 Foote J. 及 Winter G., J. Mol. Biol. (1992) 224, 487-499)。表 1 中之「示例性取代」標題下提供了例示性變更，並且下文將參考胺基酸側鏈類別進行進一步描述。保留取代列於表 1 之「較佳取代」標題下。可將胺基酸取代引入目標抗體中，並篩選具有所需活性之產物，例如，保留/改善的抗原結合特徵、降低的免疫原性或改善的 ADCC 或 CDC。
表 1
原始 殘基 例示性 取代 較佳 取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據常見的側鏈特性進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp，Glu； (4) 鹼性：His，Lys，Arg; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly，Pro； (6) 芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代需要將這些類別中之一類的成員交換為另一類的成員。
一種類型之取代變異體涉及取代一個或多個親代抗體 ( 例如，人源化或人抗體) 之 CDR。通常，選擇用於進一步研究之所得變異體將相對於親代抗體在某些生物學特性 (例如提高親和性、降低免疫原性) 上具有修飾 (例如，改善) 及/或基本上保留親代抗體之某些生物學特性。例示性取代變異體是親和性成熟的抗體，其可以方便地產生，例如，使用基於噬菌體展示的親和性成熟技術，例如本文所述的那些。簡言之，一個或多個 CDR 殘基發生突變，並且變異體抗體在噬菌體上展示並篩選出特定的生物學活性 (例如，結合親和力)。
可以在 CDR 中進行更改 (例如，取代)，以改善抗體親和力。此類改變可在 CDR「熱點」(亦即由在體細胞成熟過程中經歷高頻率突變之密碼子編碼之殘基) (參見例如 Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196) 及/或 SDR (a-CDR) 中進行，其中對所得變異體 VH 或 VL 測試結合親和力。藉由構築並自二級庫中重新選擇來達成親和力成熟已闡述於例如 Hoogenboom, H.R. 等人 Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37 中。在親和力成熟的一些實施例中，透過多種方法（例如，易錯 PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變）中的任一種將多樣性引入選擇用於成熟的變異基因中。然後創建第二文庫。然後篩選該文庫，以識別具有所需之親和性的任何抗體變異體。引入多樣性的另一種方法是 CDR 定向方法，其中將若干 CDR 殘基 (例如，每次 4-6 個殘基) 隨機化。可藉由例如丙胺酸掃描誘變或建模以特異性識別參與抗原結合的 CDR 殘基。特別地，CDR-H3 和 CDR-L3 經常成為靶點。
在某些實施例中，在一個或多個 CDR 內可能發生取代、插入或缺失，只要此等修改不顯著降低抗體以結合抗原的能力即可。例如，可在 CDR 中進行實質上不降低結合親和力的保守性改變 (例如，本文所提供之保守性取代)。此類改變可在 CDR「熱點」或 SDR 外。在上文提供之變異體 VH 和 VL 序列的某些實施例中，每個 CDR 均未改變，或包含不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
如 Cunningham, B.C. 及 Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085 所述，用於識別可能誘變的抗體殘基或區域的一種有用的方法稱為「丙胺酸掃描誘變」。在該方法中，識別殘基或目標殘基組 (例如，帶電荷的殘基，如 arg、asp、his、lys 和 glu)，並用中性或帶負電荷的胺基酸 (例如，丙胺酸或聚丙胺酸) 取代以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在胺基酸位置引入更多取代，表明對初始取代具有良好的功能敏感性。可替代地或另外地，可使用抗原-抗體複合物之晶體結構來識別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基和鄰近殘基可靶向或消除為取代的候選物。可篩選變異體以確定它們是否包含所需之特性。
胺基酸序列插入包括胺基及/或羧基末端融合體之長度，從一個殘基到包含一百個或更多殘基之多肽，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有 N 端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子之其他插入變異體包括與抗體的 N 端或 C 端融合的酶 (例如，對於 ADEPT) 或提高抗體血清半衰期之多肽。 b)    Fc 區域變異體
在某些實施例中，可將一種或多種胺基酸修飾引入本文提供的抗體的Fc區中，從而產生Fc區變異體。Fc 區變異體可包含在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾 (例如取代) 的人 Fc 區序列 (例如人 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 Fc 區)。
效應子功能下降的抗體包括一個或多個 Fc 區域殘基 238、265、269、270、297、327 和 329 被取代之抗體 (美國第 6,737,056 號專利)。此等 Fc 突變體包括具有在胺基酸位置 265、269、270、297 及 327 中的兩者或更多者處的取代之 Fc 突變體，包括所謂的「DANA」Fc 突變體，其中殘基 265 及 297 被丙胺酸取代 (美國專利號 7,332,581)。
描述了某些與 FcR 之結合得到改善或減弱的抗體變異體。(參見例如：美國專利第 6,737,056 號；WO 2004/056312；及 Shields, R.L. 等人, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)
在本發明的一個實施例中，該等抗體為包含突變 L234A 及 L235A 或包含突變 L234A、L235A 及 P329G 的 IgG1。在另一個實施例或包含突變 S228P 及 L235E 或 S228P、L235E 或/及 P329G 的 IgG4 中 (根據 Kabat 等人所述之 Kabat EU 索引編號：Kabat 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)。
具有更長半衰期並改善了與新生 Fc 受體 (FcRn) (其負責將母體 IgG 轉移給胎兒，見 Guyer, R.L. 等人, J. Immunol. 117 (1976) 587-593 及 Kim, J.K. 等人, J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434) 之結合的抗體闡述於 US 2005/0014934 中。那些抗體包含其中具有一個或多個取代之 Fc 區域，其改善了 Fc 區域與 FcRn 之結合。此類 Fc 變異體包括在一個或多個 Fc 區域殘基上發生取代之 Fc 變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424 或 434，例如，Fc 區殘基 434 的取代（美國專利號 7,371,826）。
另參見 Duncan, A.R. 及 Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；及 WO 94/29351 涉及 Fc 區變異體的其他實例。 c) 經半胱胺酸工程改造之抗體變異體
在某些實施例中，可能希望創建半胱胺酸工程化抗體，例如「thioMAb」，其中抗體之一個或多個殘基被半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，取代殘基出現在抗體之可進入的位點。透過用半胱胺酸取代那些殘基，反應性硫醇基團由此被定位在抗體之可進入的位點，並可用於使抗體與其他部分 (例如藥物部分或連接子-藥物部分) 結合，以形成免疫結合物，如本文進一步所述。在某些實施例中，以下任何一個或多個殘基可被半胱胺酸取代：輕鏈的 V205 (Kabat 編號)；重鏈的 A118 (EU 編號)；及重鏈 Fc 區的 S400 (EU 編號)。半胱胺酸工程化抗體可按照例如美國專利號 7,521,541 所述的方法產生。 d) 抗體衍生物
在某些實施例中，可進一步修飾本文所提供之抗體，以使其包含本技術領域中已知且容易獲得的附加的非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸 (均聚物或隨機共聚物) 以及葡聚醣或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇 (例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，且可聚支鏈或無支鏈。連接至抗體的聚合物之數量可以變化，並且如果連接的聚合物超過一種，則它們可以為相同或不同之分子。通常，用於衍生化的聚合物之數量及/或類型可基於以下考慮因素來確定，該等考慮因素包括但不限於待改善之抗體的特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於指定條件下的治療中等。
在另一實施例中，提供了可藉由暴露於輻射而選擇性加熱之抗體及非蛋白質部分的結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管 (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605)。輻射可具有任何波長，且包括，但不限於不損害一般細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死抗體-非蛋白質部分附近之細胞之溫度的波長。 B. 重組方法及組成物
可以使用重組方法和組成物來製造抗體，例如，如美國專利號 4,816,567 中所述。在一個實施例中，提供編碼本文所述之抗 HLA-G 抗體之經分離之核酸。此等核酸編碼包含 VL 之胺基酸序列及/或包含抗體之 VH 之胺基酸序列 (例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在一進一步實施例中，提供一個或多個包含此核酸之載體 (例如，表現載體)。在一進一步實施例中，提供包含此核酸之宿主細胞。在此實施例中，宿主細胞包含 (例如，已轉化)：(1) 包含核酸之載體編碼包含抗體之 VL 之胺基酸序列及包含抗體之 VH 之胺基酸序列，或 (2) 包含核酸之第一載體編碼包含抗體之 VL 之胺基酸序列及包含核酸之第二載體編碼包含抗體之 VH 之胺基酸序列。在一較佳的實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如，中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞、HEK293 細胞或淋巴樣細胞 (例如，Y0、NS0、Sp20 細胞)。在一個實施例中，提供一種製備抗 HLA-G 抗體或雙特異性抗體之方法，其中該方法包括在適合於抗體表現的條件下培養包含上文所提供之編碼抗體的核酸的宿主細胞，並視情況從宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 中回收該抗體。
對於抗 HLA-G 抗體之重組生產，將例如上文所述之編碼抗體的核酸分離，並插入一種或多種載體中，以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此等核酸可藉由常規方法 (例如，使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針) 輕易地分離並定序。
最適用於選殖或表現編碼抗體之載體的宿主細胞為本文所述之真核細胞，較佳的是哺乳動物細胞。
脊椎動物細胞可用為宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞株。可用的哺乳動物宿主細胞株的其他實例包括：由 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV1 系；人胚胎腎系 (例如 Graham 等人, J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 中所述之 293 或 293 細胞)；幼地鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (例如 Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 中所述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人子宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳房腫瘤 (MMT 060562)；TRI 細胞 (例如 Mather, J.P. 等人, Annals N.Y.Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。最適用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 DHFR -CHO 細胞 (Urlaub, G. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；及骨髓瘤細胞株，例如 Y0、NS0 和 Sp2/0。有關某些適用於抗體生產的哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如：Yazaki, P. 和 Wu, A.M.，Methods in Molecular Biology，第 248 卷，Lo, B.K.C. 主編，Humana Press，Totowa，NJ (2004)，第 255-268 頁。
在某種程度上亦可使用原核細胞，但存在有時需要付出更大努力並採用更複雜之程序的缺陷。有關抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見例如 US 5,648,237、US 5,789,199 及 US 5,840,523。(另請參見 Charlton, K.A.，在：Methods in Molecular Biology，第 248 卷，Lo, B.K.C. (主編)，Humana Press, Totowa, NJ (2003), 第 245-254 頁，其中闡述了抗體片段在大腸桿菌中之表現。)在表現後，抗體可與細菌細胞糊中的可溶性部分分離 ，並可經過進一步純化。
植物細胞培養物亦可以用作宿主。 參見例如美國專利號 5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978 及 6,417,429 (描述了在基因轉殖植物中生產抗體的 PLANTIBODIES TM技術)。 C. 測定
可用此領域中所公知的各種分析法對本文所提供之抗 HLA-G 抗體的物理/化學性質及/或生物活性進行鑑定、篩選或表徵。 1. 結合測定及其他測定
在一個態樣中，測試本發明之抗體之抗原結合活性，例如藉由已知方法如 ELISA、西方墨點法等實現。Morris, G.E.提出對映射至抗體結合之抗原決定基的詳細例示性方法。(主編), Epitope Mapping Protocols, 收錄於: Methods in Molecular Biology, 第 66 卷, Humana Press, Totowa, NJ (1996)。 2. 活性測定
在一個態樣中，提供了鑑定抗 HLA-G 抗體之生物學活性的測定方法。生物活性可包括，例如，增強不同免疫細胞 (包括 T 細胞) 之活化及/或增殖的能力。例如，它們增強免疫調控細胞激素 (例如干擾素 γ (IFN-γ) 及/或腫瘤壞死因子 α (TNF α)) 之分泌。其他得到增強或可以得到增強的免疫調控細胞激素為例如結合至不同類型之 T 細胞的 IL1ß、IL6、IL12、顆粒酶 B 等。亦提供於體內及/或體外具有此等生物活性之抗體。
在某些實施例中，如下文實例中所述，測試本發明之抗體的該等生物活性。 D. 用於診斷和偵測之方法及組成物
在某些實施例中，本文提供的任何 HLA-G 抗體可用於偵檢生物樣品是否存在 HLA-G。如本文所用的術語「檢測」，涵蓋定量或定性檢測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織，諸如免疫細胞或 T 細胞浸潤及/或腫瘤細胞。
在一個實施例中，提供了一種用於診斷或偵測方法中的抗 HLA-G 抗體。在另一態樣中，提供了一種偵測生物樣品中是否存在 HLA-G 的方法。在某些實施例中，該方法包含在允許抗 HLA-G 抗體與 HLA-G 結合的條件下將生物樣品與如本文所述之抗 HLA-G 抗體接觸，並偵測抗 HLA-G 抗體與 HLA-G 之間是否形成了複合物。該等方法可為 活體外或 活體內方法。在一個實施例中，抗 HLA-G 抗體用於選擇適合用抗 HLA-G 抗體治療的受試者，例如其中 HLA-G 為用於選擇患者的生物標記。
在某些實施例中，提供了標記的抗 HLA-G 抗體。標記包括但不限於直接檢測的標記或部分 (例如螢光、發色、電子緻密、化學發光和放射性標記)，以及間接檢測 (例如，透過酶促反應或分子相互作用) 的部分，例如酶或配體。例示性標記包括但不限於：放射性同位素 32P、 14C、 125I、 3H 及 131I；螢光團，例如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；玫瑰紅及其衍生物；丹磺醯基；繖形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶 (美國專利號 4,737,456)；螢光素；2,3-二氫鄰苯二甲二酮；辣根過氧化物酶 (HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣類氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，與採用過氧化氫氧化染料前身 (例如 HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶) 的酶結合使用；生物素/抗生物素蛋白；旋轉標記；噬菌體標記；穩定自由基等。 E. 醫藥調配物
藉由將具有所需純度的該等抗體與一種或多種視情況選用之醫藥上可接受之載劑 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 第 16 版, Osol, A. (編) (1980)) 混合，來製備如本文所述之抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體的醫藥調配物，其為凍乾調配物或水溶液的形式。醫藥上可接受之載劑在採用的劑量和濃度下通常對受體無毒，其包括但不限於：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑 (例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨；芐索銨氯化物；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量 (小於約 10 個殘基) 多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑 (例如 EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子， 例如鈉；金屬錯合物 (例如鋅蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，例如聚乙二醇 (PEG)。本申請中的示例性醫藥上可接受之載劑還進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性透明質酸酶醣蛋白 (sHASEGP)，例如人可溶性 PH-20 透明質酸酶醣蛋白，諸如 rhuPH20 (HYLENEX ®, Baxter International, Inc.)。某些例示性 sHASEGP 及用法 (包括 rhuPH20) 描述於美國專利公開號 2005/0260186 和 2006/0104968 中。在一個態樣中，sHASEGP 與一種或多種附加的醣胺聚醣酶諸如軟骨素酶結合在一起。
例示性凍乾抗體製劑如美國第 6,267,958 號專利所述。水性抗體調配物包括美國專利第 6,171,586 號及 WO 2006/044908 中所述之調配物，後者調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文所述之調配物還可包含適合於所治療的特定適應症的多於一種活性成分，較佳地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。例如，可能需要進一步提供。此等活性成分適宜地以對預期目的有效的量組合存在。
活性成分可以包載在例如透過凝聚技術或透過介面聚合製備的微囊 (例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊) 中、膠體藥物遞送系統 (例如脂質體、白蛋白微球、微乳、奈米顆粒和奈米囊 (nanocapsule)) 中或粗滴乳狀液中。該等技術揭示於 Remington's Pharmaceutical Sciences, 第 16 版, Osol, A. (主編) (1980) 中。
可以製備緩釋製劑。緩釋製劑的適宜的實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質是成形物品的形式， 例如膜或微囊。
用於 體內投予的調配物通常是無菌的。無菌性可易於例如藉由無菌濾膜過濾來實現。 F. 治療方法及組成物
本文所提供之抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體中之任一者皆可用於治療方法中。
在一個態樣中，提供用為藥物的抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體。在另外的態樣中，提供用於治療癌症的抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體。在某些實施例中，提供用於治療方法中的抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體。在某些實施例中，本發明提供用於治療罹患癌症的個體之方法中的抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體，該方法包含投予該個體有效量之抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體。
在另外的實施例中，本發明提供用為免疫調控劑或用於直接或間接誘導免疫細胞 (如 T 細胞、B 細胞及骨髓細胞，包括單核球、巨噬細胞、樹突細胞、漿細胞樣樹突細胞) 之增殖及/或活化的抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體，其例如藉由分泌免疫刺激細胞激素如 TNFα (TNFa) 及 IFNγ (IFNg) 或進一步募集免疫細胞來發揮作用。在某些實施例中，本發明提供用為免疫調控劑或用於直接或間接誘導免疫細胞之增殖、活化的方法中的抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體，其例如藉由在個體中分泌免疫刺激細胞激素如 TNFa 及 IFNγ 或進一步募集免疫細胞來發揮作用，該方法包含投予該個體有效量之用為免疫調控劑或用於直接或間接誘導免疫細胞之增殖、活化的抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體，其例如藉由分泌免疫刺激細胞激素如 TNFa 及 IFNγ 或進一步募集免疫細胞來發揮作用。
在另外的實施例中，本發明提供用為免疫刺激劑或用於刺激腫瘤壞死因子 α (TNFα) 分泌的抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體。在某些實施例中，本發明提供用於免疫調控以直接或間接誘導增殖、活化的方法中的抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體，其例如藉由在個體中分泌免疫刺激細胞激素如 TNFa 及 IFNg 或進一步募集免疫細胞來發揮作用，該方法包含投予該個體有效量之用於免疫調控以直接或間接誘導增殖、活化的抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體，其例如藉由分泌免疫刺激細胞激素如 TNFa 及 IFNg 或進一步募集免疫細胞來發揮作用。
如本文所使用之術語「癌症 (cancer)」可為例如肺癌、非小細胞肺癌 (NSCL)、細支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門癌、胃癌 (stomach cancer/gastric cancer)、大腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何杰金氏病、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽道癌、中樞神經系統 (CNS) 腫瘤、脊髓軸腫瘤、腦幹膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤、淋巴瘤、淋巴球性白血病，包括上述癌症中任一種之難治型或上述癌症中一種或多種之組合。
根據上述任一實施例的「個體」較佳地為人。在另一態樣中，本發明提供了抗 HLA-G 抗體在用於製造或製備藥物中之用途。在一實施例中，該藥物用於治療癌症。在又一實施例中，該藥物用於治療癌症的方法中，該方法包含向患有癌症的個體投予有效量之藥物。在另一個實施例中，藥物用於誘導癌細胞的細胞所介導之裂解。在另外的實施例中，藥物用於誘導罹患癌症的個體的癌細胞的細胞所介導之裂解的方法中，該方法包含投予該個體有效量之藥物以誘導癌細胞凋亡或抑制癌細胞增殖。根據上述任一實施例的「個體」可以是人。
在又一態樣中，本發明提供用於治療癌症的方法。在一個實施例中，該方法包含向罹患癌症的個體投予有效量之抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體。根據上述任一實施例的「個體」可以是人。
在另外的態樣中，本發明提供一種在罹患癌症的個體中誘導癌細胞的細胞所介導之裂解的方法。在一個實施例中，該方法包含投予該個體有效量之抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體，以在罹患癌症的個體中誘導癌細胞的細胞所介導之裂解。在一個實施例中，「個體」為人。
在另外的態樣中，本發明提供包含本文所提供之抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體中任一者的醫藥調配物，其用於例如上述治療方法中之任一者中。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文所提供之抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體中之任一者及醫藥上可接受之載劑。
本發明之抗體（及任何另外治療劑）可藉由任何合適的方式投予，包括腸胃外、肺內和鼻內投予，且如果需要局部治療，則可以採用病灶內投予。腸胃外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投予。投藥可藉由任何適宜途徑進行，例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，此部分地取決於短暫投予抑或長期投予。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次投予、快速注射投予和脈衝輸注。
本發明之抗體將按照與良好醫學實踐一致的方式進行配製、給藥及施用。在這種情況下，考慮的因素包括待治療的具體障礙、待治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床病症、障礙的原因、遞送藥物的部位、施用方法、施用日程及醫療從業者已知的其他因素。該抗體並非必須、但可以視情況與一種或多種目前用於預防或治療所述疾病之藥劑一起配製。此等其他治療劑的有效量取決於存在於調製劑中存在的抗體量、病症或治療的類型以及上文討論的其他因素。這些通常以與本文中所述相同的劑量和投予途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任何劑量和藉由任何途徑使用。
對於疾病的預防或治療，本發明之抗體的適當劑量 (單獨使用或與一種或多種其他另外的治療劑組合使用) 將取決於待治療疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重度及病程、為了預防或是治療目的施用該抗體、之前的治療、患者的臨床病史及對該抗體的反應及主治醫師的判斷。在一次或一系列的治療中適宜地對患者施用抗體。根據疾病的類型和嚴重程度不同，約 1 µg/kg 至 15 mg/kg (例如 0.5mg/kg - 10 mg/kg) 的抗體可為例如藉由一次或多次分開的投予或藉由連續輸注來對患者投予的初始候選劑量。根據上述因素，一種典型的日劑量可在約 1 µg/kg 至 100 mg/kg 或更多的範圍內。對於在幾天或更長時間內重複投予，視病狀而定，治療通常將持續至出現期望的疾病症狀阻抑。抗體的一種例示性劑量將在從 0.05 mg/kg 至約 10 mg/kg 的範圍內。因此，可向患者投予約 0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg 或 10 mg/kg 中的一種或多種劑量 (或其任何組合)。該等劑量可間歇投予，例如每週或每三週投予 (例如使得患者接受約 2 至約 20 個、或例如約 6 個劑量的抗體)。可投予初始較高的負載劑量，隨後投予一個或多個較低劑量。例示性給藥方案包含投予約 4 mg/kg 的初始負載劑量，然後每週投予維持劑量為約 2 mg/kg 的抗體。然而，可以使用其他劑量方案。藉由習用技術和測定很容易監測此治療的進展。
應理解，上述調配物或治療方法中之任一者皆可使用本發明之免疫結合物來代替或補充抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體進行。
應理解，上述調配物或治療方法中之任一者皆可使用本發明之免疫結合物來代替或補充抗 HLA-G 抗體或抗 HLA-G/抗 CD3 雙特異性抗體進行。 II. 製品
在本發明之另一態樣中，提供含有可用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料的製品。製成品包括容器及容器上或與容器相關的標籤或藥品說明書。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV 溶液袋等。容器可以由多種材料諸如玻璃或塑膠所形成。該容器可容納組成物，該組成物本身或與有效治療、預防和/或診斷症狀的另一組成物結合使用，並可能具有無菌入口 (例如，容器可為具有可透過皮下注射針頭穿孔的塞子的靜脈內溶液袋或小管)。組成物中的至少一種活性劑為本發明之抗體。標籤或包裝插頁指示，該組成物可用於治療所選病狀。此外，該製品可以包括 (a) 其中包含有組成物的第一容器，其中，該組成物包含本發明之抗體；及 (b) 其中包含有組成物的第二容器，其中，組成物包含其他細胞毒性或其他治療劑。本發明之此實施例中的製成品可以進一步包含指示組成物可以用於治療具體疾病的藥品說明書。可替代地或另外地，製成品可以進一步包含第二 (或第三) 容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝劑，例如抑菌注射用水 (BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer 溶液和葡萄糖溶液。從商業和使用者的角度來看，它可以進一步包含其他材料，其中包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。
提供以下實例及圖式以幫助理解本發明，但本發明之真實範圍在所附申請專利範圍中闡明。應當理解的是，在不脫離本發明之精神的前提下，可以對所提出的步驟進行修改。
胺基酸序列說明
抗 HLA-G 抗體 / 抗原結合部分 ( 可變區及互補決定區 (CDR) 之 SEQ ID No) ：SEQ ID NO: 1    重鏈 CDR-H1，HLA-G-0090 SEQ ID NO: 2    重鏈 CDR-H2，HLA-G-0090 SEQ ID NO: 3    重鏈 CDR-H3，HLA-G-0090 SEQ ID NO: 4    輕鏈 CDR-L1，HLA-G-0090 SEQ ID NO: 5    輕鏈 CDR-L2，HLA-G-0090 SEQ ID NO: 6    輕鏈 CDR-L3，HLA-G-0090 SEQ ID NO: 7    重鏈可變域 VH，HLA-G-0090 SEQ ID NO: 8    輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090 SEQ ID NO: 9    輕鏈 CDR-L1，HLA-G-0090-VL-N31D SEQ ID NO: 10  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-N31D SEQ ID NO: 11 輕鏈 CDR-L1，HLA-G-0090-VL-N31L SEQ ID NO: 12  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-N31L SEQ ID NO: 13 輕鏈 CDR-L1，HLA-G-0090-VL-N31Q SEQ ID NO: 14  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-N31Q SEQ ID NO: 15 輕鏈 CDR-L1，HLA-G-0090-VL-N31S SEQ ID NO: 16  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-N31S SEQ ID NO: 17  輕鏈 CDR-L1，HLA-G-0090-VL-N31T SEQ ID NO: 18  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-N31T SEQ ID NO: 19 輕鏈 CDR-L1，HLA-G-0090-VL-N31Y SEQ ID NO: 20  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-N31Y SEQ ID NO: 21  輕鏈 CDR-L1，HLA-G-0090-VL-N31Y-N38Y SEQ ID NO: 22  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-N31Y-N38Y SEQ ID NO: 23 輕鏈 CDR-L1，HLA-G-0090-VL-S32P SEQ ID NO: 24  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-S32P SEQ ID NO: 25 輕鏈 CDR-L1，HLA-G-0090-VL-S33A SEQ ID NO: 26  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-S33A SEQ ID NO: 27 輕鏈 CDR-L1，HLA-G-0090-VL-S33D SEQ ID NO: 28  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-S33D SEQ ID NO: 29 輕鏈 CDR-L1，HLA-G-0090-VL-S33P SEQ ID NO: 30  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-S33P
其他序列SEQ ID NO: 31  例示性人類 HLA-G SEQ ID NO: 32  例示性人類 HLA-G 胞外域 (ECD) SEQ ID NO: 33  例示性人類 ß2M SEQ ID NO: 34  經修飾的人類 HLA-G (其中 HLA-G 特異性胺基酸已被 HLA-A 共同胺基酸替換 (= 去移植(degrafted) HLA-G，另見圖 1) ECD) SEQ ID NO: 35  例示性人類 HLA-A2 SEQ ID NO: 36  例示性人類 HLA-A2 ECD SEQ ID NO: 37  例示性小鼠 H2Kd ECD SEQ ID NO: 38  例示性大鼠 RT1A ECD SEQ ID NO: 39  例示性人類 HLA-G ß2M MHC I 類複合物 SEQ ID NO: 40 例示性經修飾的人類 HLA-G ß2M MHC I 類複合物 (其中 HLA-G 特異性胺基酸已被 HLA-A 共同胺基酸替換 (= 去移植HLA-G)，另見圖 2) SEQ ID NO: 41 例示性小鼠 H2Kd ß2M MHC I 類複合物 SEQ ID NO: 42 例示性人類 HLA-G/ 小鼠 H2Kd ß2M MHC I 類複合物 (其中人類 HLA-G 特異性位置被移植到小鼠 H2Kd 骨架上) SEQ ID NO: 43 例示性大鼠 RT1A ß2M MHC I 類複合物 SEQ ID NO: 44 例示性人類 HLA-G/大鼠 RT1A ß2M MHC I 類複合物 (其中人類 HLA-G 特異性位置被移植到大鼠 RT1A 骨架上) SEQ ID NO: 45  連接子及 His 標籤 SEQ ID NO: 46  肽 SEQ ID NO: 47  人類 κ 輕鏈恆定區 SEQ ID NO: 48  人類 λ 輕鏈恆定區 SEQ ID NO: 49 來源於 IgG1 的人類重鏈恆定區 SEQ ID NO: 50 來源於 IgG1 的人類重鏈恆定區，其包含突變 L234A、L235A 及 P329G SEQ ID NO: 51  來源於 IgG4 的人類重鏈恆定區
抗 CD3 抗體 / 抗原結合部分 ( 可變區及互補決定區 (CDRs)) ：SEQ ID NO: 52 重鏈 CDR-H1，P035-093 (縮寫為 P035) SEQ ID NO: 53  重鏈 CDR-H2，P035-093 SEQ ID NO: 54  重鏈 CDR-H3，P035-093 SEQ ID NO: 55 輕鏈 CDR-L1，P035-093 SEQ ID NO: 56 輕鏈 CDR-L2，P035-093 SEQ ID NO: 57 輕鏈 CDR-L3，P035-093 SEQ ID NO: 58 重鏈可變域 VH，P035-093 SEQ ID NO: 59  輕鏈可變域 VL，P035-093 SEQ ID NO: 60 重鏈 CDR-H1，殖株 22 (縮寫為 Cl22) SEQ ID NO: 61  重鏈 CDR-H2，殖株 22 SEQ ID NO: 62  重鏈 CDR-H3，殖株 22 SEQ ID NO: 63 輕鏈 CDR-L1，殖株 22 SEQ ID NO: 64 輕鏈 CDR-L2，殖株 22 SEQ ID NO: 65 輕鏈 CDR-L3，殖株 22 SEQ ID NO: 66 重鏈可變域 VH，殖株 22 SEQ ID NO: 67  輕鏈可變域 VL，殖株 22 SEQ ID NO: 68 重鏈 CDR-H1，V9 SEQ ID NO: 69  重鏈 CDR-H2，V9 SEQ ID NO: 70  重鏈 CDR-H3，V9 SEQ ID NO: 71 輕鏈 CDR-L1，V9 SEQ ID NO: 72 輕鏈 CDR-L2，V9 SEQ ID NO: 73 輕鏈 CDR-L3，V9 SEQ ID NO: 74 重鏈可變域 VH，V9 SEQ ID NO: 75  輕鏈可變域 VL，V9
雙特異性抗 HLA-G/ 抗 CD3 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體：
P1AF7977 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 P035-093 (P035)) ：SEQ ID NO: 76  輕鏈 1 P1AF7977 SEQ ID NO: 77  輕鏈 2 P1AF7977 SEQ ID NO: 78  重鏈 1 P1AF7977 SEQ ID NO: 79  重鏈 2 P1AF7977
P1AF7978 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 殖株 22 (Cl22)) ：SEQ ID NO: 80  輕鏈 1 P1AF7978 SEQ ID NO: 81  輕鏈 2 P1AF7978 SEQ ID NO: 82  重鏈 1 P1AF7978 SEQ ID NO: 83  重鏈 2 P1AF7978
P1AF7979 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 V9) ：SEQ ID NO: 84  輕鏈 1 P1AF7979 SEQ ID NO: 85  輕鏈 2 P1AF7979 SEQ ID NO: 86  重鏈 1 P1AF7979 SEQ ID NO: 87  重鏈 2 P1AF7979
其他序列SEQ ID NO: 88 例示性人類 CD3 SEQ ID NO: 89  例示性獼猴 CD3 SEQ ID NO: 90  人 CD3 ε 柄 – Fc(杵) – Avi SEQ ID NO: 91  人 CD3 δ 柄 – Fc (臼) – Avi SEQ ID NO: 92  CD3 origVH SEQ ID NO: 93  CD3 origVL SEQ ID NO: 94  CD3 origIgG HC SEQ ID NO: 95  P035 IgG HC SEQ ID NO: 96  CD3 原始/P035 IgG LC
HLA-G-0090 抗體之胺基酸序列 ( 可變區，包含具有底線的互補決定區 (CDR) 及 CDR-L1 中未經修飾之 N- 醣基化位點 ( 粗體 )) ： SEQ ID NO: 7：重鏈可變域 VH，HLA-G-0090： QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVS SNRAAWNWIRQSPSRGLEWLG RTYYRSKWYNDYAVSVQGRITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYCAS VRAVAPFDYWGQGVLVTVSS SEQ ID NO: 8：輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVL NSSNNKNNLA WYQQQPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQYYRTPWTFGQGTKVEIK
經修飾的 HLA-G-0090 抗體輕鏈可變區之胺基酸序列 ( 包含具有底線的互補決定區 (CDR) 及 CDR-L1 中經修飾的 N- 醣基化位點 ( 粗體 )) ： SEQ ID NO:10：輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-N31D DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVL DSS NNKNNLA WYQQQPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQYYRTPWTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 12：輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-N31L DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVL LSS NNKNNLA WYQQQPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQYYRTPWTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 14：輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-N31Q DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVL QSS NNKNNLA WYQQQPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQYYRTPWTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 16：輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-N31S DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVL SSS NNKNNLA WYQQQPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQYYRTPWTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 18：輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-N31T DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVL TSS NNKNNLA WYQQQPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQYYRTPWTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 20：輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-N31Y DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVL YSS NNKNNLA WYQQQPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQYYRTPWTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 22：輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-N31Y-N38Y DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVL YSS NNK NYLA WYQQQPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQYYRTPWTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 24：輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-S32P DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVL NPSNNKNNLA WYQQQPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQYYRTPWTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 26：輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-S33A DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVL NSANNKNNLA WYQQQPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQYYRTPWTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 28：輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090--S33D DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVL NSDNNKNNLA WYQQQPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQYYRTPWTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 30：輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-S33P DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KSSQSVL NSPNNKNNLA WYQQQPGQPPKLLIY WASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFC QQYYRTPWTFGQGTKVEIK
抗 CD3 結合部分之胺基酸序列 ( 可變區，包含具有底線的互補決定區 (CDR)) ： SEQ ID NO: 58 重鏈可變域 VH，P035-093 (縮寫為 P035) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMNWVRQAPGKGLEWVS RIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR ASNFPASYVSYFAYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 59  輕鏈可變域 VL，P035-093 (P035) QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC GSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIG GTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYC ALWYSNLWVFGGGTKLTVL SEQ ID NO: 66  重鏈可變域 VH，殖株 22 (縮寫為 Cl22) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFS SYAMNWVRQAPGKGLEWVS RIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVR HTTFPSSYVSYYGYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 67  輕鏈可變域 VL，殖株 22 (Cl22) QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC GSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIG GTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYC ALWYSNLWVFGGGTKLTVL SEQ ID NO: 74 重鏈可變域 VH，V9 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFT GYTMNWVRQAPGKGLEWVA LINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR SGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 75  輕鏈可變域 VL，V9 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIY YTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC QQGNTLPWTFGQGTKVEIK
雙特異性抗 HLA-G/ 抗 CD3 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體之胺基酸序列：
P1AF7977 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 P035-093 (P035)) ：SEQ ID NO: 76  輕鏈 1 P1AF7977 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRASNFPASYVSYFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 77  輕鏈 2 P1AF7977 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLNPSNNKNNLAWYQQQPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQYYRTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 78  重鏈 1 P1AF7977 QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVSSNRAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVQGRITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYCASVRAVAPFDYWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP SEQ ID NO: 79  重鏈 2 P1AF7977 QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVSSNRAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVQGRITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYCASVRAVAPFDYWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGGQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
P1AF7978 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 殖株 22 (Cl22)) ：SEQ ID NO: 80  輕鏈 1 P1AF7978 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 81  輕鏈 2 P1AF7978 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLNPSNNKNNLAWYQQQPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQYYRTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 82  重鏈 1 P1AF7978 QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVSSNRAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVQGRITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYCASVRAVAPFDYWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP SEQ ID NO: 83  重鏈 2 P1AF7978 QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVSSNRAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVQGRITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYCASVRAVAPFDYWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGGQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
P1AF7979 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 V9) ：SEQ ID NO: 84  輕鏈 1 P1AF7979 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 85  輕鏈 2 P1AF7979 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLNPSNNKNNLAWYQQQPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQYYRTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 86  重鏈 1 P1AF7979 QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVSSNRAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVQGRITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYCASVRAVAPFDYWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP SEQ ID NO: 87  重鏈 2 P1AF7979 QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDSVSSNRAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVQGRITLIPDTSKNQFSLRLNSVTPEDTAVYYCASVRAVAPFDYWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
下文中列出本發明之具體實施例： 1.   一種結合至人類 HLA-G 之抗體，其包含 A) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列，或 B) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列。 2.   如實施例 1 之抗體，其中該抗體 A) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列；或 B) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列。 3.   如實施例 1 或 2 中任一者之抗體，其中該抗體包含人類來源，特定而言 IgG 同型，更特定而言 IgG1 同型之 Fc 域。 4.   如實施例 1 或 2 中任一者之抗體，其中該抗體包含人類來源，特定而言 IgG 同型，更特定而言 IgG1 同型之恆定區，該恆定區包含人類 CH1、CH2、CH3 及/或 CL 域。 5.   如實施例 1 至 4 中任一者之抗體，其中該抗體 a) 與 (親代) 抗體相比，在最大結合 (Rmax) 及/或結合親和力 (KD) 方面具有改善的結合特性，該親代抗體包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列 (如實例 2 中所示)。 b)   不與經修飾的人類 HLA-G ß2M MHC I 複合物交叉反應，其中 HLA-G 特異性胺基酸已被 HLA-A 共同胺基酸替換，該複合物包含 SEQ ID NO: 40 (如實例 2 中所示)；及/或 c)   不與包含 SEQ ID NO: 41 之小鼠 H2Kd ß2M MHC I 複合物交叉反應 (如實例 2 中所示)；及/或 d)   不與包含 SEQ ID NO: 43 之大鼠 RT1A ß2M MHC I 複合物交叉反應 (如實例 2 中所示)。 6.   如實施例 1 至 3 中任一者之抗體，其中該抗體 a)   抑制 ILT2 結合至 JEG3 細胞 (上表現之 HLA-G) (ATCC 編號 HTB36) (如實例 5 中所示)；或 b)   結合至 JEG3 細胞 (上表現之 HLA-G) (ATCC 編號 HTB36)，及抑制 ILT2 結合至 JEG-3 細胞 (上表現之 HLA-G) (ATCC 編號 HTB36) (如實例 5 中所示)。 7.   如實施例 1 至 4 中任一者之抗體，其中該抗體為多特異性抗體 (較佳的是雙特異性抗體)。 8.   如實施例 7 之抗體，其中該抗體為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 之雙特異性抗體。 9.   如實施例 7 之抗體，其中該抗體為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含結合至人類 HLA-G 之第一抗原結合部分及結合至人類 CD3 之第二抗原結合部分，其中該結合至人類 HLA-G 之第一抗原結合部分包含 A) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列，或 B) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列； 且其中結合至 T 細胞活化抗原之該第二抗原結合部分結合至人類 CD3，該第二抗原結合部分包含 C) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 56 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列，或 D) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列，或 E) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 71 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 72 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列。 10. 如實施例 9 之雙特異性抗體， 其中該第一抗原結合部分 A) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列；或 B) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列， 且其中該第二抗原結合部分 C) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；或 D) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；或 E) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。 11. 如實施例 10 之雙特異性抗體， 其中該第一抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列； 且其中該第二抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列。 12. 如實施例 108 之雙特異性抗體， 其中該第一抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列； 且其中該第二抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列。 13. 如實施例 10 之雙特異性抗體， 其中該第一抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 24 之胺基酸序列； 且其中該第二抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。 14. 如實施例 8 至 13 中任一者之雙特異性抗體，其中 該雙特異性抗體顯示出 a) 對 ILT2 及/或 ILT4 結合至 HLA-G 之抑制 (如實例 13 中所示)；及/或 b) 藉由經重組 HLA-G 轉染的 SKOV3 細胞 (SKOV3 HLA-G) 上及/或表現內源性 HLA-G 的 JEG3 細胞上之 T 細胞的抗體介導的 IFN γ 分泌，其中檢測到該 IFN γ 分泌 (藉由 Luminex 技術) (如實例 14 中所示)；及/或 c) 在經重組 HLA-G 轉染的 SKOV3 細胞 (SKOV 3HLA-G) 上及/或表現內源性 HLA-G 的 JEG3 細胞上之 T 細胞介導的細胞毒性/腫瘤細胞毒殺，其中在用雙特異性抗體治療後藉由測量細胞中的凋亡蛋白酶 8 活化檢測到該細胞毒性 (如實例 15 中所示)；及/或 d) 在帶有經重組 HLA-G 轉染的 SKOV3 人類卵巢癌 (SKOV3 HLA-G) 人源化 NSG 小鼠中之活體內抗腫瘤效力/腫瘤消退作用 (如實例 16 中所示)；及/或 e) 在帶有人類乳癌 PDX 腫瘤 (BC004) 之人源化 NSG 小鼠中 HLA-G CD3 T 細胞雙特異性之活體內抗腫瘤效力(如實例 17 中所示)。 15. 如實施例 9 至 14 中任一者之雙特異性抗體，其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分為 Fab 分子。 16. 如實施例 9 至 15 中任一者之雙特異性抗體，其中第二抗原結合部分為 Fab 分子，其中可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1，特定而言 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 彼此替換。 17. 如實施例 9 至 16 中任一者之雙特異性抗體，其中第一抗原結合部分為 Fab 分子，其中在恆定域中，位置 124 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，且位置 123 處之胺基酸獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) (根據 Kabat 編號) 取代，且在恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代，且位置 213 處之胺基酸獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。 18. 如實施例 9 至 17 中任一者之雙特異性抗體，包含第三抗原結合部分，其中第三抗原部分與第一抗原結合部分相同。 19. 如實施例 9 至 18 中任一者之雙特異性抗體，包含由第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域。 20. 如實施例 19 之雙特異性抗體，其中第一抗原結合部分、第二抗原結合部分及在存在時之第三抗原結合部分各自為 Fab 分子； 且其中，(i) 該第二抗原結合部分在該 Fab 重鏈的 C 端與該第一抗原結合部分的該 Fab 重鏈的 N 端融合，且該第一抗原結合部分在該 Fab 重鏈的 C 端與該 Fc 域的該第一次單元的 N 端融合，抑或是 (ii) 該第一抗原結合部分在該 Fab 重鏈的 C 端與該第二抗原結合部分的該 Fab 重鏈的 N 端融合，且該第二抗原結合部分在該 Fab 重鏈的 C 端與該 Fc 域的該第一次單元的 N 端融合； 且其中，該第三抗原結合部分 (如存在) 在該 Fab 重鏈的 C 端與該 Fc 域的該第二次單元的 N 端融合。 21. 如實施例 19 或 20 之雙特異性抗體，其中 Fc 域為人類 IgG Fc 域，特定而言屬於 IgG1 同型。 22. 如實施例 19 或 20 中任一者之雙特異性抗體，其中 Fc 域包含降低與 Fc 受體之結合及/或效應功能之一種或多種胺基酸取代。 23. 如實施例 22 之雙特異性抗體，其中抗體為包含突變 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號) 的 IgG1 同型。 24. 如實施例 19 至 23 中任一者之雙特異性抗體，其中 Fc 域之第一次單元的 CH3 域中的胺基酸殘基經具有較大側鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在該第一次單元的 CH3 域內產生突起，該突起可定位在第二次單元的 CH3 域內的空腔中，並且 Fc 域之第二次單元的 CH3 域中的胺基酸殘基經具有較小側鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在該第二次單元的 CH3 域內產生空腔，該第一次單元的 CH3 域內的突起可定位在該空腔內。 25. 如實施例 24 之雙特異性抗體，其中抗體屬於 IgG1 同型，其在 Fc 域之第一次單元中包含突變 T366W，並在 Fc 域之第二次單元中包含突變 Y407V、T366S 及 L368A (根據 Kabat EU 索引編號)。 26. 如實施例 25 之雙特異性抗體，其中抗體包含在 Fc 域之第一次單元中的額外的突變 S354C 及在 Fc 域之第二次單元中的額外的突變 Y349C (根據 Kabat EU 索引編號)。 27. 如實施例 25 之雙特異性抗體，其中抗體包含在 Fc 域之第一次單元中的額外的突變 Y349C 及在 Fc 域之第二次單元中的額外的突變 S354C (根據 Kabat EU 索引編號)。 28. 一種分離之核酸，其編碼如實施例 1 至 4 中任一者之抗體或如實施例 9 至 27 中任一者之雙特異性抗體。 29. 一種宿主細胞，較佳為真核宿主細胞，其包含如實施例 28 之核酸。 30. 一種產生如實施例 1 至 4 中任一者之抗體或如實施例 9 至 227 中任一者之雙特異性抗體之方法，該方法包含培養如實施例 29 之宿主細胞，從而產生該抗體或雙特異性抗體。 31. 如實施例 30 之方法，其進一步包含自該宿主細胞回收該抗體或雙特異性抗體。 32. 如實施例 1 至 4 中任一者之抗體或如實施例 9 至 27 中任一者之雙特異性抗體，其中抗體根據實施例 30 至 31 中之方法產生，其中宿主細胞為真核宿主細胞 (在一較佳的實施例中，為哺乳動物宿主細胞；在另一較佳的實施例中為 CHO 細胞)。 33. 如實施例 1 至 4 中任一者之抗體或如實施例 9 至 27 中任一者之雙特異性抗體，其中抗體在真核宿主細胞 (在一較佳的實施例中，為哺乳動物宿主細胞；在另一較佳的實施例中為 CHO 細胞) 中產生。 34. 如實施例 1 至 4 中任一者之抗體或如實施例 9 至 27 中任一者之雙特異性抗體，其用為藥物。 35. 如實施例 1 至 4 中任一者之抗體或如實施例 9 至 27 中任一者之雙特異性抗體，其用於治療癌症。 36. 一種實施例 1 至 4 中任一者之抗體或如實施例 9 至 27 中任一者之雙特異性抗體在製造藥物中之用途。 37. 如實施例 36 之用途，其中藥物用於治療癌症。 38. 一種治療罹患癌症的個體之方法，該方法包含投予該個體有效量之如實施例 1 至 4 中任一者之抗體或如實施例 9 至 27 中任一者之雙特異性抗體。
實例
重組 DNA 技術
使用標準方法來操縱 DNA，如以下文獻中所述：Sambrook, J. 等人，Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989。根據製造商之說明使用分子生物試劑。
基因及寡核苷酸合成
所需的基因片段在 Geneart GmbH (Regensburg, Germany) 以化學合成製備。將所合成之基因片段選殖到大腸桿菌質體中進行繁殖/擴增。次選殖之片段的 DNA 序列藉由 DNA 測序予以驗證。作為另一種選擇，藉由退火經化學合成之寡核苷酸或經由 PCR 來組裝合成性短 DNA 片段。由 metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany) 製備相對應之寡核苷酸。
基礎 / 標準哺乳動物表現質體說明
為表現所需的基因/蛋白質 (例如全長抗體重鏈、全長抗體輕鏈或 MHC I 類分子，例如 HLA-G，或與肽及 β-2 微球蛋白融合的 MHC I 類分子，例如與 HLA-G 結合肽和/或 β-2 微球蛋白融合的 HLA-G)，使用包含以下功能元素的轉錄單元： —       來自包括內含子 A 的人類巨細胞病毒 (P-CMV) 的直接早期增強子和啟動子， —       人重鏈免疫球蛋白 5'-非轉譯區 (5'UTR)， —       鼠免疫球蛋白重鏈訊號序列， —       待表現的基因/蛋白質 (例如全長抗體重鏈或 MHC I 類分子)，及 —       牛生長激素多腺苷酸化序列 (BGH pA)。
除了包括所欲之待表現基因之表現單元/匣之外，基礎/標準哺乳動物表現質體亦含有 —       來自載體 pUC18 之複製起點，其允許該質體於大腸桿菌中複製，和 —       β-內醯胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予安比西林抗性。
蛋白質測定
使用基於多肽之胺基酸序列所計算的莫耳消光係數，藉由測定在 280 nm 處的光密度 (OD) 來測定純化的多肽的蛋白質濃度。
實例 1
產生 HLA-G 嵌合分子
由於與其他 MHC I 分子高度同源 (＞98%)，用 HLA-G 分子免疫導致多株血清之產生，其由 MHC-I 交叉反應性抗體以及真正的 HLA-G 特異性抗體的混合物組成。
目前尚無工具用於選擇真正的 HLA-G 特異性抗體而不與其他人類 MHC-I (例如 HLA-A) 產生交叉反應，並用於進一步選擇具有受體阻斷功能的那些抗體。
我們鑑定出獨特的 HLA-G 位置以及確保結構一致及受體交互作用所需的位置 (ILT2/4 及 KIR2DL4)。
然後將人類 HLA-G 的獨特的近端位置「移植」到來自不同囓齒動物物種 (例如大鼠 RT1A 及小鼠 H2kd) 的 MHC I 類複合物分子上，以產生「 嵌合」免疫原/篩選抗原。
對產生的抗體之結合/特異性進行嚴格篩選/測試 (分別無交叉反應性/對逆抗原無特異性) 接受結合測試的抗原： —       rec.HLA-G，表現為包含 SEQ ID NO: 43 的人類 HLA-G ß2M MHC 複合物 —       HLA-G 特異性序列，移植到大鼠 RT-1 及小鼠 H2kd (SEQ ID NO: 46：人類 HLA-G/小鼠 H2Kd ß2M MHC I 類複合物，其中對人類 HLA-G 具有特異性的位置被移植到小鼠 H2Kd 骨架上；以及 SEQ ID NO: 48：人類 HLA-G/大鼠 RT1A ß2M MHC I 類複合物，其中對人類 HLA-G 具有特異性的位置被移植到大鼠 RT1A 骨架上) —       表現天然 HLA-G MHC I 類複合物的細胞 (例如 Jeg3 細胞) 或經人類 HLA-G 轉染的細胞株 SKOV3 HLA-G+ 及 PA-TU-8902 HLA-G+ 接受交叉反應性測試的逆抗原： —       包含其他 HLA-A 序列 (HLA-A2 及 HLA-G 脫落 HlA-A 共同序列) 的逆抗原 (MHC I 類複合物) 與不同肽的組合 (參見例如 HLA-G 骨架上的 SEQ ID NO: 35 (HLA-A2) 及 SEQ ID NO: 40 HLA-A 共同序列) —       來自其他物種的逆抗原 (MHC I 類複合物)，諸如大鼠 RT-1 及小鼠 H2kd (SEQ ID NO: 43 及 SEQ ID NO: 41) —       未經修飾之細胞株 SKOV3 及 PA-TU-8902，其特徵在於不存在 HLA-G 表現。
設計嵌合 HLA-G 抗原以測定特異性抗 HLA-G 抗體之特異性結合 ( 見圖 2) ：
設計帶有 HLA-G 獨有位置的嵌合大鼠 MHC I 分子 (RT1-A) (SEQ ID NO: 44) 以用於結合測定中：
HLA-G 獨有位置藉由比對來自 IMGT 之 2579 HLA-A、3283 HLA-B、2133 HLA-C、15 HLA-E、22 HLA-F 及 50 HLA-G 序列來測定 (於2014 年 2 月 6 日可用)。HLA-G 中出現在 3 個序列集 HLA-A、HLA-B 及 HLA-C + HLA-E + HLA-F 組合集中任一者之序列中少於 1% (大部分約 0%) 的那些殘基被稱為 HLA-G 獨有位置。
4 個核心 HLA-G 獨有位置 (α-1 中的 2 個及 α-3 中的 2 個) 在 HLA-G 序列集中未顯示出多型性，並且其他 HLA 基因在這些位置處均不含 HLA-G 特異性殘基 (M100 之 1x HLA-A、Q103 之 1x HLA-B 及 Q103 之 1x HLA-C 除外)。
將大鼠 RT1-A 之晶體結構 (Rudolph, M.G. 等人 J.Mol.Biol.324: 975-990 (2002)；PDB 代碼：1KJM) 與人類 HLA-G 之晶體結構疊加 (Clements, C.S. 等人 PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 102: 3360-3365 (2005)：PDB 代碼：1YDP)。α-鏈及相關 β-2-微球蛋白的整體結構是保留的。
藉由序列比較及結構比對，在 RT1-A 結構中鑑定出 HLA-G 之獨有位置。第一步，鑑定出獨有 HLA-G 位置，其暴露於 HLA-G 及 RT1-A 的分子表面，因此抗體可觸及。將隱藏在蛋白質折疊中的獨有位置排除在工程改造之外。第二步，鑑定結構上的近端殘基，其亦需要交換以形成相應的區域「HLA-G 樣」，亦即產生含有獨有位置的實際 HLA-G 抗原決定基，而非產生 HLA-G/大鼠 RT1-A 人工嵌合抗原決定基。對由此選擇用於突變的所有位置進行分析，測定來自 HLA-G 的各個殘基的結構擬合，以避免突變時分子結構可能產生局部干擾。
類似地產生用於結合測定的帶有 HLA-G 獨有位置 (SEQ ID NO: 42) 的嵌合鼠 MHC I 分子 (H2Kd)。
藉由「去移植」 HLA-A 共同序列之 HLA-G 獨有位置以設計基於 HLA-A 的逆抗原用於交叉反應性測試 (SEQ ID NO: 40 = 經修飾的人類 HLA-G ß2M MHC I 類複合物 ( 其中 HLA-G 特異性胺基酸已被 HLA-A 共同胺基酸替換 (= 去移植 HLA-G))
針對來源於多序列比對的獨有位置，在人類 HLA-G 之晶體結構中進行分析 (PDB 代碼：1YDP)。首先，將未暴露於 HLA-G 表面上並由此無法被抗體觸及的位置排除在工程改造之外。其次，分析暴露的殘基表面實施胺基酸交換的可行性 (亦即排除相關位置突變時分子結構可能的局部擾動)。總共驗證了 14 個交換位置。將經驗證之位置的胺基酸突變為 HLA-A 共同序列，該序列來源於自 IMGT 下載的 2579 個 HLA-A 序列的多序列比對 (於2014 年 2 月 6 日可用)。
產生用於可溶性典型及非典型 MHC I 類分子的表現質體
重組 MHC I 類基因編碼 N 端延伸的融合分子，該分子由已知與相應 MHC I 類分子結合的肽、β-2 微球蛋白及相應 MHC I 類分子組成。
用於可溶性 MHC I 類分子瞬時表現的表現質體除可溶性 MHC I 類分子表現匣外亦包含來自載體 pUC18 之複製起點，其允許該質體於大腸桿菌中複製，及 β-內醯胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予安比西林抗性。
可溶性 MHC I 類分子之轉錄單元包含以下功能元素： -     來自包括內含子 A 的人類巨細胞病毒 (P-CMV) 的直接早期增強子和啟動子， -     人重鏈免疫球蛋白 5'-非轉譯區 (5'UTR)， -     鼠免疫球蛋白重鏈訊號序列， -     N-端截短的金黃葡萄球菌分選酶 A 編碼核酸，及 -     牛生長激素多腺苷酸化序列 (BGH pA)。
來自不同物種的成熟的可溶性 MHC I 類分子的胺基酸序列為： SEQ ID NO: 39：     例示性人類 HLA-G ß2M MHC I 類複合物 SEQ ID NO: 40：     例示性經修飾的人類 HLA-G ß2M MHC I 類複合物 (其中 HLA-G 特異性胺基酸已被 HLA 共同胺基酸替換 (= 去移植 HLA-G，另見圖 2) SEQ ID NO: 41：     例示性小鼠 H2Kd ß2M MHC I 類複合物 SEQ ID NO: 42：     例示性人類 HLA-G/小鼠 H2Kd ß2M MHC 複合物 (其中人類 HLA-G 特異性位置被移植到小鼠 H2Kd 骨架上) SEQ ID NO: 43：     例示性大鼠 RT1A ß2M MHC I 類複合物 SEQ ID NO: 44：     例示性人類 HLA-G/大鼠 RT1A ß2M MHC 複合物 (其中人類 HLA-G 特異性位置被移植到大鼠 RT1A 骨架上)
對於例示性 HLA-A2 ß2M MHC I 類複合物，使用以下組分，且複合物在大腸桿菌中表現並經過純化。
MHCI 複合物 HLA-A2/b2M (SEQ ID NO: 35 及 SEQ ID NO: 33) (皆帶有額外之 N 端甲硫胺酸) + VLDFAPPGA 肽 (SEQ ID NO: 46) + 連接子及 His 標簽 (SEQ ID NO: 45)
實例 2
去除 CDR-L1 中之 N- 醣基化基序
抗 HLA-G 抗體 HLA-G-0090 之 CDR-L1 包含典型 N-醣基化基序「NSS」，該基序包含輕鏈 (LC)之位置 31 至 33。決定去除該基序，因為它可能構成潛在的可開發性缺陷。HLA-G-0090 可變區的同源模型表明 LC 位置 31 至 33 的溶劑可及性高。此外，預計 N31 及 S32 的側鏈向內指向 CDR-H3 的方向，使它們可能成為抗體互補位之一部分的候選物。實際上，許多已發表的抗體-抗原 X 射線複合物結構記錄到這些殘基與抗原發生化學交互作用。因此，在 LC 位置 31-33 處引入突變後導致抗體的結合親和力下降的風險相當高。為降低風險，在 HEK293F 細胞中以 IgG1 形式設計並產生抗體 HLA-G-0090 的 11 種不同變異體，它們包含在 LC 位置處 31、32 及 33 的突變。
注意，突變變異體 HLA-G-0090-VL-N31Y-N38Y 在 N-醣基化基序之外包含第二個突變 (N38Y)，並與其去除無關，以增加種系同一性
抗 HLA-G 抗體序列總結 ( 可變區及 CDR 之 SEQ ID NO) ：
抗 HLA-G 抗體 CDR-H1 CDR-H2 CDR -H3 CDR -L1 CDR -L2 CDR -L3 VH VL
   SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:
HLA-G-0090 1 2 3 4 5 6 7 8
HLA-G-0090-VL-N31D 1 2 3 9 5 6 7 10
HLA-G-0090-VL-N31L 1 2 3 11 5 6 7 12
HLA-G-0090-VL-N31Q 1 2 3 13 5 6 7 14
HLA-G-0090-VL-N31S 1 2 3 15 5 6 7 16
HLA-G-0090-VL-N31T 1 2 3 17 5 6 7 18
HLA-G-0090-VL-N31Y 1 2 3 19 5 6 7 20
HLA-G-0090-VL-N31Y-N38Y 1 2 3 21 5 6 7 22
HLA-G-0090-VL-S32P 1 2 3 23 5 6 7 24
HLA-G-0090-VL-S33A 1 2 3 25 5 6 7 26
HLA-G-0090-VL-S33D 1 2 3 27 5 6 7 28
HLA-G-0090-VL-S33P 1 2 3 29 5 6 7 30
所獲得的抗 HLA-G 特異性抗體之結合及其他特性以及生物活性如以下實施例中所述測定，並與已知參考 HLA-G-0090 進行比較。
表現和純化
藉由親和層析法 (MabSelect Sure) 及透析純化後的 HEK293F 細胞中 0.5 L 表現的表現產量見下表。
   mg 單體含量 [%] (分析型 SEC) 純度 [%] (Caliper)
HLA-G-0090 3.2 98 99
HLA-G-0090-VL-N31D 0.4 97 98
HLA-G-0090-VL-N31L 0.4 98 99
HLA-G-0090-VL-N31Q 0.4 91 95
HLA-G-0090-VL-N31S 0.3 93 98
HLA-G-0090-VL-N31T 0.4 85 89
HLA-G-0090-VL-N31Y 0.3 89 94
HLA-G-0090-VL-N31Y-N38Y 0.7 94 98
HLA-G-0090-VL-S32P 2.4 98 99
HLA-G-0090-VL-S33A 2.1 98 99
HLA-G-0090-VL-S33D 2.4 98 99
HLA-G-0090-VL-S33P 1.4 98 99
包含涉及位置 LC 31 (N31X) 突變的變異體表現出的表現力價明顯降低，且通常損害材料質量，而 LC 32 和 LC33 位置變異體表現出良好至可接受的表現力價及良好的材料質量。
HLA-G 結合
wt-HLA-G 親和力 / 動力學
藉由在 CM3 感測器晶片上用抗 hFc (GE Healthcare BR-1008-39) 捕獲並注射用 HBS-P+ (GE Healthcare) 運行緩衝劑稀釋至濃度為 11 nM 至 300 nM 的 wt-HLA-G 抗原，測定各 5 nM 抗 HLA-G 抗體與 wt-HLA-G 複合物 (SEQ ID NO: 39) 之親和力，其中流速為 60 µl/min，結合時間為 120 秒，且解離時間為 600 秒。在每次循環後，藉由用 3 M MgCl2 洗滌來再生表面。使用 T200 評估軟體評估動力學結合曲線，並使用 1:1 朗繆爾結合模型計算結合特性。
HLAG 抗體之 RAC ( 相對活性濃度 ) ( 測定方案如圖 3 所示 )
藉由在 CM3 感測器晶片上用抗 hFc (GE Healthcare BR-1008-39) 捕獲並注射用 HBS-P+ (GE Healthcare) 運行緩衝劑稀釋至濃度為 300 nM 的 wt-HLA-G 抗原，測定各抗 HLA-G 抗體 (於 HBS-P+ 中之 10 nM 溶液) 之 HLA-G 結合子的 RAC，其中流速為 10 µl/min，結合時間為 60 秒，且解離時間為 600 秒。在每次循環後，藉由用 3 M MgCl2 洗滌來再生表面。最終 RAC 及 Rmax 值是由「結合」報告點及捕獲含量計算得出。Rmax = (MW 分析物/MW 配體) × RU 捕獲配體 × 交互作用的化學計量。
在 SPR 結合實驗中評估了 11 種變異體，其中將抗體經由 Fc 部分固定在 CM3 晶片上，並將重組單鏈 HLA-G 單體/人類 HLA-G ß2M MHC I 類複合物 (SEQ ID NO: 39) 用為分析物。動力學參數藉由在 Biacore T200 裝置上於 25°C 下進行單循環動力學測量來測定。
   ka [1/ms] kd [1/s] t ½ [s] Kd [nM] Rmax [%]
HLA-G-0090 1.19E+06 1.38E-03 501 1.2 86
HLA-G-0090-VL-N31D 1.94E+05 3.91E-03 177.3 20.2 66
HLA-G-0090-VL-N31L 5.28E+06 8.71E-03 79.6 1.7 91
HLA-G-0090-VL-N31Q 1.91E+06 3.73E-03 185.9 2.0 91
HLA-G-0090-VL-N31S 3.83E+05 9.22E-04 751.8 2.4 77
HLA-G-0090-VL-N31T 3.42E+05 7.69E-04 901.9 2.3 75
HLA-G-0090-VL-N31Y 5.49E+05 1.07E-03 646.2 2.0 78
HLA-G-0090-VL-N31Y-N38Y-GL 1.82E+09 4.30E+01 0 23.6 57
HLA-G-0090-VL-S32P 1.19E+06 1.24E-03 557.7 1.0 97
HLA-G-0090-VL-S33A 1.24E+06 1.24E-03 558.2 1.0 98
HLA-G-0090-VL-S33D 7.17E+05 3.44E-03 201.7 4.8 95
HLA-G-0090-VL-S33P 1.34E+06 2.36E-03 294.3 1.8 94
其中，使用相同的 SPR 裝置及實驗設置在更準確的多循環動力學測量中進一步評估具有可接受之表現力價的四種變異體 (HLA-G-0090-VL-S32P、HLA-G-0090-VL-S33A、HLA-G-0090-VL-S33D、HLA-G-0090-VL-S33P )。
   ka [1/ms] kd [1/s] t ½ [s] Kd [nM] Rmax [%]
HLA-G-0090 1.30E+06 1.78E-03 389.9 1.4 87
HLA-G-0090-VL-S32P 1.27E+06 1.57E-03 440.6 1.2 99
HLA-G-0090-VL-S33A 1.24E+06 1.49E-03 465.9 1.2 99
HLA-G-0090-VL-S33D 8.97E+05 6.67E-03 103.9 7.4 98
HLA-G-0090-VL-S33P 1.36E+06 3.68E-03 188.1 2.7 97
與親代抗體 HLA-G-0090 相比，兩種變異體 HLA-G-0090-VL-S32P 及 HLA-G-0090-VL-S33A 具有改善之結合親和力，而兩種變異體 HLA-G-0090-VL-S33D 及 HLA-G-0090-VL-S33P 的結合親和力則分別降低了 5 倍及 2 倍。出人意料的是，對於所測試的變異體，去除 N-醣基化基序導致在動力學測量中得到更高之 Rmax 值，表明成功形成複合物的比例高於形成 N-醣基化抗體的比例。
抗 HLA-G 抗體及變異體對可溶性人類 HLA-G 、具有 HLA-A 共同特異性序列的可溶性脫落的人類 HLA-G 及大鼠 / 小鼠同系物的交叉反應性
為進一步研究兩種結合親和力改善之變異體 HLA-G-0090-VL-S32P 及 HLA-G-0090-VL-S33A 的結合特性，使用四種反篩選構建體進行 SPR 結合實驗。這些重組單鏈肽-MHC 複合物構建體為鼠 H2-K1 (SEQ ID NO: 41)、大鼠 RT1 (SEQ ID NO: 43) 及人類 HLA-G ß2M MHC I 類複合物，其中 HLA-G 特異性胺基酸已被 HLA-A 共同胺基酸 (SEQ ID NO:40) 替換。後一種構建體構成一種形式的 HLA-G，其中所有 HLA-G 特異性殘基皆已被它們的 HLA-A 共同對應物替換。再次，將抗體固定在 CM3 晶片上，並將單鏈肽-MHC 構建體用為分析物在 Biacore T200 裝置上於 25°C 下進行評估。
抗原 抗體 交互作用
鼠 H2-K1 (SEQ ID NO:41) HLA-G-0090 無結合交互作用
鼠 H2-K1 (SEQ ID NO:41) HLA-G-0090-VL-S32P 無結合交互作用
鼠 H2-K1 (SEQ ID NO:41) HLA-G-0090-VL-S33A 無結合交互作用
大鼠 RT1 (SEQ ID NO:43) HLA-G-0090 無結合交互作用
大鼠 RT1 (SEQ ID NO:43) HLA-G-0090-VL-S32P 無結合交互作用
大鼠 RT1 (SEQ ID NO:43) HLA-G-0090-VL-S33A 無結合交互作用
HLA-G 骨架上的共同 HLA-A (SEQ ID NO:40) HLA-G-0090 無結合交互作用
HLA-G 骨架上的共同 HLA-A (SEQ ID NO:40) HLA-G-0090-VL-S32P 無結合交互作用
HLA-G 骨架上的共同 HLA-A (SEQ ID NO:40) HLA-G-0090-VL-S33A 無結合交互作用
HLA-G (SEQ ID NO:39) HLA-G-0090 極強之結合交互作用
HLA-G (SEQ ID NO:39) HLA-G-0090-VL-S32P 極強之結合交互作用
HLA-G (SEQ ID NO:39) HLA-G-0090-VL-S33A 極強之結合交互作用
應力下之穩定性
在兩種不同條件下對親代抗體以及兩種衍生之變異體 HLA-G-0090-VL-S32P 及 HLA-G-0090-VL-S33A 進行了 13 天的應力處理： l  pH 6.0 20 mM His/HisCl，140 mM NaCl；於 40°C 下 (His 40°C) l  pH 7.4 PBS；於 37°C 下 (PBS 37°C)。
然後，使用 SEC 及 SPR 對材料進行分析，以研究化學降解以及對標靶結合的可能的影響。作為參考，對經應力處理的材料與在以下儲存條件下保存的材料進行比較： l  pH 6.0 20 mM His/HisCl，140 mM NaCl；於 -80°C 下凍存 (參考)
結果列於下表中 (相比於參考的相對百分比)：
參數 HLA-G-0090_VL-S32P HLA-G-0090_VL-S33A HLA-G-0090
SEC 單體 [%] 參考 100 99 99
His 40°C 98 98 98
PBS 37°C 98 98 98
相比於參考 (作為 100%) ± 應力的相對 HLA-G 結合訊號，藉由 SPR RAC 測得 參考 100 100 100
His 40°C 99 99 99
PBS 37°C 98 96 96
雖然所有三種抗體皆顯示出非常相似的穩定性特徵，但變異體 HLAG-0090_VL-S32P 於 37°C 下在 PBS 中經應力處理後相比於其他兩種變異體 (包括其親代抗體) 保留了更多的 HLA-G 結合 (SPR 相對活性濃度 (RAC))。
熱穩定性測試
在經純化之蛋白質之熱穩定性測試中，使用 Uncle 裝置 (UNCHAINED LABS, Boston, MA, USA)。據此使用 266 nm 和 473 nm 下之靜態光散射及平行內在螢光測定經純化之蛋白質的聚集溫度 (Tagg) 及解構溫度 (Tm)。使用以 0.1°C/min 之步級從 30°C 升至 90°C 之溫度斜坡。使用每個樣品體積為 9 µl 的玻璃比色皿，其濃度為 1 mg/mL，溶於 20 mM 組胺酸、140 mM NaCl、pH 6.0 緩衝劑中。分析使用 UNcle 分析軟體 (UNCHAINED LABS)。
質譜分析及 N- 醣基化
完整樣品之解卷積質譜記錄了去除 HLA-G-0090_VL-S32P 及 HLA-G-0090_VL-S33A 中之 N-醣基化位點/NSS 基序對 N-醣基化的影響。將樣品用 PNGase F 製備以去除所有 N-連接之聚醣，並僅獲得抗體之分子量。雖然 PNGase F 對 N-連接之 Fc-聚醣之裂解具有完全特異性，但在裂解 N-連接之 Fc-聚醣時表現出的效力低得多。HLA-G-0090 顯示出來自不完全去醣基化之清晰的 N-醣基化模式，因此表明存在 Fab-醣基化 (見圖 4A)。未偵測到 HLA-G-0090_VL-S32P 及 HLA-G-0090_VL-S33A 之殘留 N-醣基化的徵象 (見圖 4B)。
實例 3
抗 HLA-G 抗體 之 ILT2 及 ILT4 結合抑制
藉由將 Fc 標記之 ILT2 和 ILT4 分別塗布到 Maxisorp 微量滴定盤上來設置 ELISA。經孵育及洗滌步驟之後，以 100 nM 的濃度添加相應的抗體。將可溶性 His 標記之單體、二聚體或三聚體 HLA-G 添加至孔中。經孵育及洗滌步驟之後，藉由抗 His-抗體-POD 結合物偵測結合之受體。與從包含 ILT2/4 + HLA-G (單體、二聚體或三聚體) 而不含抗 HLA-G 或 ILT2/4 抗體的孔中獲得的值進行比較，以計算抑制百分比 (%) (100% 結合 = 0% 抑制)，並將其顯示於表中。
實例 4
HLA-G 抗體與細胞上表現之天然或重組 HLA-G 的結合 ( 藉由 FACS 分析評估 )
在流式細胞分析中，將細胞於 4°C 下用抗 HLA-G mAb 染色。簡言之，將各細胞懸液轉移至聚丙烯管 (2 × 10 5個細胞/管) 中並於 5°C 下預冷 10 分鐘。然後將細胞用 2 ml FACS 緩衝劑 (4°C) 洗滌，並以 300 g 離心 5 分鐘。將抗 HLA-G 抗體 HLAG-0090-VL-S32P、HLAG-0090-VL-S33A、HLAG-0090 在染色緩衝劑中稀釋至起始濃度為 50 μg/ml。對抗體進行 5 倍連續稀釋以獲得最終濃度 (10 μg/ml、2 μg/ml、0.4 μg/ml、0.08 μg/ml、0.016 μg/ml、0.0032 μg/ml)。然後從管中吸取 FACS 緩衝劑，將細胞沉澱重懸浮於 100 μl 抗體溶液中，並於 5°C 下孵育 1 小時。然後將細胞用 2 ml 染色緩衝劑洗滌一次，並以 300 g 離心 5 分鐘。
為偵測螢光，將標記的抗物種抗體 (與 Alexa 488 結合之山羊抗人類 IgG (H+L)，Life Technologies # A11013) 用染色緩衝劑稀釋至 10 μg/ml，並將細胞沉澱重懸浮於 100 μl 偵測抗體中。於 5°C 下孵育 1 小時後，將細胞再次用 2 ml 染色緩衝劑洗滌一次，重懸浮於 500 μl 染色緩衝劑中，並在 FACS CELESTA 上測量。
抗 HLA-G 抗體 HLA-G-0090、HLA-G-0090-VL-S32P 及 HLA-G-0090-VL-S32P (10 µg/ml) 之例示性 FACS 顯示於圖 5 的 FACS 重疊圖中：HLA-G 0090、HLA-G-0090-VL-S32P 及 HLA-G-0090-VL-S32P 之去醣基化變異體皆顯示出與表現 HLA-G 的 SKOV3 細胞及 JEG 細胞的良好的結合，但未顯示與親代 SKOV3 細胞的良好的結合。相應 HLA-G 抗體的 MFI 值顯示於直方圖中。
實例 5
抗 HLA-G 抗體抑制 / 調控 ILT2 與 JEG3 細胞上表現之 HLA-G 的結合
在分析中，將 JEG3 細胞 (ATCC HTB36) 用 ILT2-c-Myc-Fc 融合蛋白 (對照 = 無抑制) 染色，其經過或不經與抗 HLA-G 抗體的預孵育。
依照以下方法測定結合/結合之抑制：將重組 ILT2-c-Myc-Fc 蛋白添加至與所述抗 HLA-G mAb 預孵育的 JEG3 細胞中，或添加至未經處理之 JEG3 細胞 (作為參考) 中。為了與抗 HLA-G 抗體預孵育，將 2 × 10 5個細胞轉移至聚丙烯管中。將抗 HLA-G 抗體 HLAG-0090-VL-S32P、HLAG-0090-VL-S33A 及 HLA-G-0090 用染色緩衝劑稀釋至濃度為 80 μg/ml，並將 25 μl 抗體溶液添加至所製備的細胞中，並於 5°C 下孵育 1 小時。將 ILT2-c-Myc-Fc 或 (對照人類 IgG (Jackson-Immuno-Research # 009-000-003)) 用染色緩衝劑稀釋至 20 μg/ml 的 2 倍濃度，並添加至所製備的細胞中，最終濃度為 10 μg/ml，並於 5°C 下孵育 2 小時。將細胞用 200 μl 染色緩衝劑洗滌兩次。用染色緩衝劑中稀釋液濃度為 10 μg/ml 的螢光標記的抗 Myc 標籤 (9E10) Alexa Fluor 647 (abcam; # ab223895) 偵測人類 ILT2-c-Myc-Fc 蛋白。將細胞重懸浮於 50 μl 偵測抗體稀釋液中，並於 5°C 下孵育 1 小時。然後將細胞用 2 ml 染色緩衝劑洗滌一次，並在 FACS CELESTA 測量前重懸浮於 500 μl 染色緩衝劑中。
作為對照，藉由使用抗物種抗體 (與 Alexa 488 結合之山羊抗人類 IgG (H+L)，Life technologies # A11013) 偵測結合至 JEG-3 預孵育細胞的抗 HLA-G 抗體，其用染色緩衝劑稀釋至 10 μg/ml，並將細胞沉澱重懸浮於 100 µl/孔偵測抗體中。於 5°C 下孵育 1 小時後，將細胞再次用緩衝劑洗滌一次，重懸浮於 500 μl 染色緩衝劑中，並在 FACS CELESTA 上測量。
圖 6 中的直方圖分別顯示了 HLA-G 抗體修飾/抑制重組 ILT2 與 JEG3 腫瘤細胞上天然表現之 HLA-G 的交互作用及結合的能力。
下表總結了實驗結果。抗 HLA-G 抗體與 JEG3 細胞之結合被描述為 + = 弱結合 - +++ = 強結合。抗 HLA-G 抗體抑制/阻斷或增加 ILT2 與表現 HLA-G 的 JEG3 細胞結合的能力。在最後一列中，顯示/量化了重組 ILT2 與細胞之結合或其抑制/阻斷 (將不存在抗 HLA-G 抗體的情況下的 ILT2-c-Myc-Fc 之染色設定為 100% 結合= 0% 抑制)：
抗體 結合至 JEG-3 細胞 HLA-G:ILT2 交互作用 對 ILT2 對 Jeg3 細胞之結合的抑制
ILT2-Fc ，無抗體 - - 0% 抑制
HLA-G-0090 +++ 抑制ILT2 之結合 72% 抑制
HLAG-0090-VL-S32P +++ 抑制ILT2 之結合 72% 抑制
HLAG-0090-VL-S33A +++ 抑制ILT2 之結合 72% 抑制
實例 6
產生優化 CD3 結合子
從先前描述的 CD3 結合子開始，在本文中稱為「CD3 原始」(詳細信息參見例如 WO2014/131712，其藉由引用併入本文)，其包含 SEQ ID NO: 92 及 SEQ ID NO: 93 的 VH 及 VL 序列，本發明人旨在藉由移除重鏈 CDR3 之 Kabat 位置 97 及 100 處之兩個天冬醯胺脫醯胺序列模體來最佳化此結合子的特性。
為此目的，吾等產生適用於噬菌體顯示的重鏈之抗體庫，其中移除 Kabat 位置 97 及 100 處之兩個天冬醯胺，且此外亦隨機分配 CDR H1、H2 及 H3 以補償經由親和力成熟過程置換 Asn97 及 Asn100 引起的親和力之損失。
此庫經由與次要外殼蛋白 p3 之融合經置於絲狀噬菌體上 (Marks 等人 (1991) J Mol Biol 222, 581-597)，且針對與重組 CD3ɛ 之結合進行組合。
10 個候選純系在初步篩選中鑒別，展示可接受之重組抗原上之結合，如藉由 SPR 量測為 Fab 片段 (在大腸桿菌中產生)。
然而，在轉化為 IgG 形式後，經由流式細胞量測術量測，此等純系中僅有一個展示對表現 CD3 之細胞的可接受之結合活性。
所選殖株在本文中稱為 P035-093 (P035) (=」CD3 優化」)，且分別包含 SEQ ID NO: 58 及 SEQ ID NO: 59 之 VH 及 VL 序列，進一步評估且轉化為如下文所述之雙特異性形式。
實例 7
優化 CD3 結合子與 CD3 之結合
與重組 CD3 之結合
針對在 Fc 區中具有 P329G L234A L235A (「PGLALA」，EU編號) 突變的兩者均呈人類 IgG1 形式的優化 CD3 結合子 P035-093 (P035) (=「CD3 優化」) 及原始 CD3 結合子「CD3 原始」(SEQ ID NO: 94 及 SEQ ID NO: 96 (CD3 原始) 以及 SEQ ID NO: 95 及 SEQ ID NO: 96 (P035=CD3 優化))，藉由表面電漿子共振 (SPR) 測定與重組 CD3 之結合。
為了評估脫醯胺位點移除的影響及其對抗體之穩定性的影響，在 37℃ 或 40℃ 溫度應力 14 天後測試了原始及優化 CD3 結合子與重組 CD3 的結合。在 -80℃ 儲存之樣品用作參考。參考樣品及在 40℃ 承受應力之樣品在 pH 6.0 的 20 mM His、140 mM NaCl 中，且在 37℃ 承受應力之樣品在 pH 7.4 的 PBS 中，所有濃度均為 1.2-1.3 mg/ml。在應力期 (14 天) 後，將 PBS 中之樣品透析回 20 mM His、140 mM NaCl、pH 6.0 中進行進一步分析。
樣品之相對活性濃度 (RAC) 如下藉由 SPR 測定。
SPR 在 Biacore T200 儀器 (GE Healthcare) 上進行。抗 Fab 捕獲抗體 (GE Healthcare, #28958325) 使用標準胺偶合化學固定在 Series S Sensor Chip CM5 (GE Healthcare) 上，產生 4000 – 6000 個共振單位 (RU) 之表面密度。使用 HBS-P+ (10 mM HEPES，150 mM NaCl pH 7.4，0.05% 界面活性劑 P20) 作為運行及稀釋緩衝液。將濃度為 2 μg/ml 之 CD3 抗體以 5 μl/分之流速注射 60 秒。將濃度為 10 μg/ml 之 CD3 抗原 (參見下文) 注射 120 秒，且以 5 μl/分之流速監測解離 120 秒。藉由連續兩次注射 pH 2.1 的 10 mM 甘胺酸，每次注射 60 秒，使晶片表面再生。藉由扣除空白注射且藉由扣除自空白對照流動池獲得之反應，校正本體折射率差。為了評估，在注射結束後 5 秒進行結合反應。為了使結合訊號標準化，將 CD3 結合除以抗 Fab 反應 (在固定化抗 Fab 抗體上捕獲 CD3 抗體後獲得之訊號 (RU))。藉由將每個溫度應力樣品與相應的非應力樣品進行比較，計算相對活性濃度。
所用抗原為 CD3 δ 及 CD3 ε 胞外域之異二聚體，該等胞外域與具有杵-臼修飾及 C 端 Avi-標籤的人 Fc 域 (參見 SEQ ID NO: 90 及 91) 融合。
此實驗之結果示於圖 15 中。如可見，與原始 CD3 結合子 CD3 原始相比，優化 CD3 結合子 CD3 優化P035-093 (P035) (=CD3 優化)展示，在溫度應力 (於 37℃ 下在 pH 7.4 下處理 2 週) 之後，與 CD3 之結合明顯改善。此結果證實，脫醯胺位點移除係成功的，且與活體內半衰期相關以及在中性 pH 下調配抗體，產生了具有優異穩定性特性之抗體。
與 Jurkat 細胞上之 CD3 之結合
針對在 Fc 區中具有 P329G L234A L235A (「PGLALA」，EU編號) 突變的兩者均呈人類 el IgG1 形式的優化 CD3 結合子r P035-093 (P035) (=CD3 優化) 及原始 CD3 結合子「CD3 原始」(SEQ ID NO: 94 及 SEQ ID NO: 96 (CD3 原始) 以及 SEQ ID NO: 95 及 SEQ ID NO: 96 (P035=CD3 優化))，藉由 FACS 測定與人類報導子 T 細胞株 Jurkat NFAT 上之 CD3 之結合。
Jurkat-NFAT 報告細胞 (GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P；Promega #CS176501) 為具有表現人 CD3 之 NFAT 啟動子的人類急性淋巴球性白血病報告細胞株。細胞在 RPMI1640、2 g/l 葡萄糖、2 g/l NaHCO 3、10% FCS、25 mM HEPES、2 mM L-麩醯胺酸、1 × NEAA、1 × 丙酮酸鈉中培養，每毫升 10 萬至 50 萬個細胞。每當細胞傳代時，添加最終濃度為 200 µg/ml 之潮黴素 B。
對於結合分析，收集 Jurkat NFAT 細胞，用 PBS 洗滌且重懸浮於 FACS 緩衝液中。抗體染色在 96 孔的圓底盤中進行。因此，每孔接種 100'000 至 200'000 個細胞。該盤以 400 x g 離心 4 分鐘，且移除上澄液。測試抗體在 FACS 緩衝液中稀釋，且在 4℃ 經過 30 分鐘將 20 μl 抗體溶液添加至細胞中。為了移除未結合之抗體，在添加稀釋的二級抗體 (PE 結合之 AffiniPure F(ab')2 片段山羊抗人 IgG Fcg 片段特異性； Jackson ImmunoResearch #109-116-170) 之前，將細胞用 FACS 緩衝液洗滌兩次。在 4℃ 培育 30 分鐘之後，未結合之二級抗體經洗去。在量測之前，細胞重懸浮於 200 μl FACS 緩衝液中，且隨後藉由流式細胞量測術使用 BD Canto II 裝置進行分析。
如圖 16 中所示，優化 CD3 結合子 P035-093 (P035) (=CD3 優化) 及原始 CD3 結合子「CD3 原始」同樣良好地與 Jurkat 細胞上之 CD3 結合。
實例 8
優化 CD3 結合子之功能活性
優化 CD3 結合子「CD3 優化」之功能活性在 Jurkat 報告細胞分析中進行測試，且與原始 CD3 結合子「CD3 原始」之活性進行比較。為了測試 IgG 之功能活性，在 CD3 優化人 IgG1 PGLALA 或 CD3 原始人 IgG1 PGLALA 之濃度增加之存在下，將抗 PGLALA 表現 CHO 細胞與 Jurkat NFAT 報告細胞一起共培育。T 細胞交聯之後 Jurkat NFAT 報告細胞上之 CD3 之活化誘導螢光素酶之產生，且冷光可以作為活化標記進行量測。包括 CD3 原始人 IgG1 wt 作為陰性對照，其無法與抗 PGLALA 表現 CHO 細胞結合，且因此無法在 Jurkat NFAT 細胞上交聯。分析之示意圖提供與圖 17 中。
抗 PGLALA 表現 CHO 細胞為 CHO-K1 細胞，其經工程改造以在其表面上表現特異性結合人 IgG 1Fc(PGLALA) 之抗體 (參見WO 2017/072210，該文獻以引用方式併入本文)。此等細胞在含 5% FCS + 1% GluMax 之 DMEM/F12 培養基中培養。Jurkat NFAT 報告細胞描述與實例 7 中。
在 CD3 huIgG1 PGLALA 與 Jurkat-NFAT 報告細胞上表現之 CHO 及 CD3 上表現之抗 PGLALA 同時結合後，NFAT 啟動子經活化且導致活性螢火蟲螢光素酶之表現。冷光訊號的強度 (藉由添加螢光素酶受質獲得) 與 CD3 活化及訊號傳遞的強度成正比。Jurkat-NFAT 報告細胞在懸浮液中生長，且在 RPMI1640、2 g/l 葡萄糖、2 g/l NaHCO3、10% FCS、25 mM HEPES、2 mM L-麩醯胺、1 × NEAA、1 × 丙酮酸鈉中培養，每毫升 10 萬至 50 萬個細胞，每毫升潮黴素有 200 µg。對於分析，收集 CHO 細胞，且使用 ViCell 測定存活率。將 30 000 個標靶細胞/孔平鋪於平底白壁 96 孔盤 (Greiner bio-one #655098) 與 100 μl 培養基中，且將 50 μl/孔的經稀釋之抗體或培養基 (用於對照組) 添加至 CHO 細胞中。隨後，收集 Jurkat-NFAT 報告細胞，且使用 ViCell 評估存活率。細胞以 120 萬個細胞/毫升重懸浮於無潮黴素 B 之細胞培養基中，且以 60 000 個細胞/孔 (50 μl/孔) 添加至 CHO 細胞中，以獲得 2:1 之最終效應子與目標 (E:T) 比及 200 μl/孔之最終體積。隨後，將 4 μl 的 GloSensor (Promega #E1291) 添加至各孔中 (最終體積之 2%)。在加濕培育箱中，使細胞在 37℃ 培育 24 小時。在培育時間結束時，使用 TECAN Spark 10M 偵測冷光。
如圖 18 中所示，在作為 CD3 原始交聯之後，優化 CD3 結合子 P035-093 (P035) (= CD3 優化) 對 Jurkat NFAT 細胞具有類似活性。
實例 9
產生結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 的雙特異性抗體 ( 抗 HLA-G/ 抗 CD3 抗體 )
重組 DNA 技術
使用標準方法來操縱 DNA，如以下文獻中所述：Sambrook, J. 等人，Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989。根據製造商之說明使用分子生物試劑。
基因及寡核苷酸合成
所需的基因片段在 Geneart GmbH (Regensburg, Germany) 以化學合成製備。將所合成之基因片段選殖到大腸桿菌質體中進行繁殖/擴增。次選殖之片段的 DNA 序列藉由 DNA 測序予以驗證。作為另一種選擇，藉由退火經化學合成之寡核苷酸或經由 PCR 來組裝合成性短 DNA 片段。由 metabion GmbH (Planegg-Martinsried, Germany) 製備相對應之寡核苷酸。
基礎 / 標準哺乳動物表現質體說明
為表現所需的基因/蛋白質 (例如抗體重鏈或抗體輕鏈)，使用包含以下功能元素的轉錄單元： -     來自包括內含子 A 的人類巨細胞病毒 (P-CMV) 的直接早期增強子和啟動子， -     人重鏈免疫球蛋白 5'-非轉譯區 (5'UTR)， -     鼠免疫球蛋白重鏈訊號序列， -     待表現的基因/蛋白質 (例如全長抗體重鏈或 MHC I 類分子)，及 -     牛生長激素多腺苷酸化序列 (BGH pA)。
除了包括所欲之待表現基因之表現單元/匣之外，基礎/標準哺乳動物表現質體亦含有 -       來自載體 pUC18 之複製起點，其允許該質體於大腸桿菌中複製，和 -       β-內醯胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予安比西林抗性。
蛋白質測定
使用基於多肽之胺基酸序列所計算的莫耳消光係數，藉由測定在 280 nm 處的光密度 (OD) 來測定純化的多肽的蛋白質濃度。
產生重組單株雙特異性抗體的表現質體
重組單株抗體基因編碼相應的免疫球蛋白重鏈及輕鏈。
用於單株抗體分子瞬時表現的表現質體除免疫球蛋白重鏈或輕鏈表現匣外亦包含來自載體 pUC18 之複製起點，其允許該質體於大腸桿菌中複製，及 β-內醯胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予安比西林抗性。
相應抗體重鏈或輕鏈之轉錄單元包含以下功能元素： -     來自包括內含子 A 的人類巨細胞病毒 (P-CMV) 的直接早期增強子和啟動子， -     人重鏈免疫球蛋白 5'-非轉譯區 (5'UTR)， -     鼠免疫球蛋白重鏈訊號序列，及 -     牛生長激素多腺苷酸化序列 (BGH pA)。
瞬時表現及分析表徵
藉由瞬時轉染在 F17 培養基 (Invitrogen Corp.) 中培養的 HEK293 細胞 (人類胚腎細胞株 293 源性) 進行重組生產。為產生單株抗體，將細胞與含有相應免疫球蛋白重鏈及輕鏈的質體共轉染。轉染時，使用「293-Fectin」轉染試劑 (Invitrogen)。按照製造商之說明進行轉染。在轉染後 3 至 7 天收穫細胞培養上清液。將上清液儲存於低溫 (例如 -80°C) 下。
有關人類免疫球蛋白在例如 HEK293 細胞中之重組表現的一般資訊，參見：Meissner, P. 等人, Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203。
使用上述用於重組 DNA 技術、產生用於單株抗體的表現質體以及瞬時表現及分析表徵的方法，產生並分析以下結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 的雙特異性抗體：
結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 的雙特異性抗體 ( 抗 HLA-G/ 抗 CD3 抗體 ) ( 結合人類 HLA-G 的抗原結合部分 / 位點及結合人類 CD3 的抗原結合部分 / 位點的可變區 VH/VL 及高度可變區 (HVR) 的 SEQ ID No) ：
抗 HLA-G 抗原結合位點 HVR-H1 HVR-H2 HVR-H3 HVR-L1 HVR-L2 HVR-L3 VH VL
HLA-G-0090-S32P SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 24
抗 CD3 抗原結合位點 HVR-H1 HVR-H2 HVR-H3 HVR-L1 HVR-L2 HVR-L3 VH VL
 P035-093 (P035) SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 57 SEQ ID NO: 58 SEQ ID NO: 59
殖株 22 (Cl22) SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 61 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 63 SEQ ID NO: 64 SEQ ID NO: 65 SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 67
V9 SEQ ID NO: 68 SEQ ID NO: 69 SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 72 SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 74 SEQ ID NO: 75
「殖株 22 (縮寫為「Cl22」)」為一種優化 CD3 結合子 (參見 WO 2020/127619)；「P035-093 (縮寫為「P035」) 為另一種優化變異體 CD3 結合子；V9 為另一種 CD3 結合子，其闡述於例如：Rodrigues 等人, Int J Cancer Suppl (1992) 7, 45-50；及 WO 1992/22653 (WO 1992/22653 之 SEQ ID NO: 20 及 SEQ ID NO: 17 為 VH 及 VL 序列) 中。
雙特異性抗 HLA-G/ 抗 CD3 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體：
P1AF7977 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 P035-093 (P035)) ：SEQ ID NO: 76  輕鏈 1 P1AF7977 SEQ ID NO: 77  輕鏈 2 P1AF7977 SEQ ID NO: 78  重鏈 1 P1AF7977 SEQ ID NO: 79  重鏈 2 P1AF7977
P1AF7978 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 殖株 22 (Cl22)) ：SEQ ID NO: 80  輕鏈 1 P1AF7978 SEQ ID NO: 81  輕鏈 2 P1AF7978 SEQ ID NO: 82  重鏈 1 P1AF7978 SEQ ID NO: 83  重鏈 2 P1AF7978
P1AF7979 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 V9) ：SEQ ID NO: 84  輕鏈 1 P1AF7979 SEQ ID NO: 85  輕鏈 2 P1AF7979 SEQ ID NO: 86  重鏈 1 P1AF7979 SEQ ID NO: 87  重鏈 2 P1AF7979
實例 10
雙特異性抗 HLA-G/ 抗 CD3 抗體 (T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體 ) 與 HLA-G 之結合及穩定性
應力下之穩定性
將具有相同 HLA-G 靶向結合子 HLAG-0090-VL-S32P 及三種不同 CD3e 結合子的三種 TCB 分子在兩種不同條件下應力處理 14 天： l  pH 6.0 20 mM His/HisCl，140 mM NaCl；於 40°C 下 (His 40°C) l  pH 7.4 PBS；於 37°C 下 (PBS 37°C)。
然後，使用 CD-SDS、SEC 及表面電漿子共振 (SPR) 對材料進行分析，以研究化學降解以及對標靶結合的可能的影響。作為參考，對經應力處理的材料與在以下儲存條件下保存的材料進行比較： l  pH 6.0 20 mM His/HisCl，140 mM NaCl；於 -80°C 下凍存 (參考)
結果列於下表中：
參數 P1AF7977 (HLA-G-0090-VL-S32P/CD3 P035) P1AF7978 (HLA-G-0090-VL-S32P/CD3 Cl22) P1AF7979 (HLA-G-0090-VL-S32P/CD3 V9)
CE-SDS [%] (Caliper，非還原) 參考 95 95 96
His 40°C 93 96 95
PBS 37°C 93 94 95
CE-SDS [%] (Caliper，還原) 參考 100 100 100
His 40°C 100 100 100
PBS 37°C 100 100 100
SEC 單體 [%] 參考 99 99 99
His 40°C 97 98 98
PBS 37°C 96 96 97
熱穩定性 (DLS T agg)    64 64 68
HLA-G CD3 HLA-G CD3 HLA-G CD3
HLAG 或 CD3 特異性結合 (分別) ± 應力，藉由 Biacore RAC 參考 100 100 100 100 100 100
His 40°C 100 99 99 97 99 96
PBS 37°C 98 96 98 92 98 91
所有三種 TCB 皆顯示出可接受之穩定性特徵，經應力處理後結合發生中度喪失。此外，藉由 DLS 測量熱穩定性 (T agg)，其處於人類 IgG 的已知正常範圍內。RAC 結合藉由表面電漿子共振 (Biacore) 測定，如實例 2 中所述。
實例 11
雙特異性抗 HLA-G/ 抗 CD3 抗體 (T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體 ) 與 T 細胞上表現之 CD3 的結合 ( 如藉由流式細胞分析技術所評估 )
簡言之，將 100 ml 新鮮血液採集到錐形瓶中，並與 100 ml 分離緩衝劑 (含 2% FBS 及 2mM EDTA 的 PBS) 混合。然後將 25 ml 懸浮液小心地轉移至 50 ml 管中的 15 ml ficoll 上，並在不制動的情況下以 800g 離心 15 分鐘。然後將 ficoll 梯度中的 PBMC 層轉移至包含分離緩衝劑的新的 50 ml 管中，並於 4°C 下以 300g 離心 10 分鐘。然後將 PBMC 洗滌兩次，並將細胞合併於 10 ml 分離緩衝劑中。將 PBMC 冷凍保存於 -80°C 下直至進一步使用。根據製造商的說明，使用 EasySep 陰性選擇人類 T 細胞分離套組 Stem cell, # 17951) 從 PBMC 中分離 T 細胞。然後藉由流式細胞分析技術測量 HLA-G TCB 與 T 細胞之結合。簡言之，將 500 µl T 細胞 (5 × 10 5個細胞) 添加至各 FACS 管中。將 T 細胞用 2 ml 染色緩衝劑 (含 2% FBS 的 PBS) 洗滌，並於 4°C 下以 300g 離心 5 分鐘。將 HLA-G TCB 用培養基中稀釋為 5 µg/ml 至 0.05 µg/ml 的不同濃度。然後將 T 細胞重懸浮於 100 μl HLA-G TCB 稀釋液中，於 4°C 下避光孵育 30 分鐘。將細胞用 2 ml 染色緩衝劑洗滌一次後，以 300g 離心 5 分鐘，然後重懸浮於 100 μl 二次抗體稀釋液 (Alexa Fluor 488 標記的抗人類 IgG，1:200) 中，於 4°C 下避光孵育 30 分鐘。將 T 細胞用 2ml 染色緩衝劑洗滌兩次，於 4°C 下以 300g 離心 5 分鐘。最後將細胞重懸浮於 500 μl 培養基中，在 BD LSR 上偵測 HLA-G TCB 與 T 細胞之結合。HLA-G TCBs P1AF7977 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 P035)；P1AF7978 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 Cl22) 及 P1AF7979 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 V9) 與 T 細胞上不同濃度之 CD3 的結合如圖 7 所示。
實例 12
雙特異性抗 HLA-G/ 抗 CD3 抗體 (T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體 ) 與細胞上表現之天然或重組 HLA-G 的結合 ( 如藉由流式細胞分析技術所評估 )
藉由 FACS 分析，評估抗 HLA-G TCB mAb 與不同細胞及細胞株上表現之 HLA-G 的結合能力。描述了與天然表現 HLA-G 的 JEG3 腫瘤細胞或 Skov3 轉染子及相應親代未轉染之細胞的結合。
在流式細胞分析中，將細胞於 4°C 下用抗 HLA-G TCB mAb 染色。簡言之，將 25 μl/孔的各細胞懸液 (5 × 104 個細胞/孔) 轉移至聚丙烯 96 孔 V 型底板中並於 5°C 冰箱預冷 10 分鐘。將抗 HLA-G 樣品用染色緩衝劑稀釋至 80 μg/ml 的 2 倍起始濃度。將抗體進行 4 倍連續稀釋，將 25 μl/孔的抗體溶液添加至所製備的細胞中，於 5℃ 下孵育 1 小時。將細胞用 200 μl/孔的染色緩衝劑洗滌兩次，以 300g 離心 5 分鐘。然後將細胞沉澱重懸浮於 25 μl 染色緩衝劑中。偵測時，將螢光標記的抗物種抗體 (與 PE 結合之驢抗人類 IgG (H+L)，Jackson Immuno Research # 709-116-149) 用染色緩衝劑以 1:100 稀釋，然後將 25 µl/孔的偵測抗體添加至細胞懸液中。於 5°C 下孵育 1 小時後，將細胞再次用染色緩衝劑洗滌兩次，重懸浮於 70 μl 染色緩衝劑中，並在 FACS Canto II 上測量。雙特異性抗 HLA-G/抗 CD3 抗體 (T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體) P1AF7977 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 P035)；P1AF7978 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 Cl22) 及 P1AF7979 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 V9) 顯示出與 JEG3 細胞及經 HLAG 轉染之 SKOV3 細胞的結合 (見圖 8)。FACS 結合之 EC50 值列於下表中。
細胞結合 EC50 (nM) JEG3 SKOV3 HLA-G
P1AF7977 0.42 1.5
P1AF7978 0.12 0.15
P1AF7979 0.36 0.58
實例 13
雙特異性抗 HLA-G/ 抗 CD3 抗體 (T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體 ) 之 ILT2 及 ILT4 結合抑制
藉由將 Fc 標記之 ILT2 和 ILT4 分別塗布到 Maxisorp 微量滴定盤上來設置 ELISA。經孵育及洗滌步驟之後，以 100 nM 的濃度添加相應的抗體。將可溶性 His 標記之單體、二聚體或三聚體 HLA-G 添加至孔中。經孵育及洗滌步驟之後，藉由抗 His-抗體-POD 結合物偵測結合之受體。與從包含 ILT2/4 + HLA-G (單體、二聚體或三聚體) 而不含抗 HLA-G 或 ILT2/4 抗體的孔中獲得的值進行比較，以計算抑制百分比 (%) (100% 結合 = 0% 抑制)，並將其顯示於下表中。
% 結合抑制 (133 nM) ILT2 ILT4
P1AF7977 (HLA-G-0090-VL-S32P/CD3 P035) 100 92
P1AF7978 (HLA-G-0090-VL-S32P/CD3 Cl22) 100 91
P1AF7979 (HLA-G-0090-VL-S32P/CD3 V9) 100 95
實例 14
雙特異性抗 HLA-G/ 抗 CD3 抗體 (T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體 ) 介導的 T 細胞之 IFN γ 分泌
使用經重組 HLA-G 轉染之 SKOV3 細胞 (SKOV3 HLA-G) 及表現內源性 HLA-G 的 JEG3 細胞，在表現 HLA-G 之腫瘤細胞存在之情況下測試抗 HLA-G TCB 誘導 T 細胞之 IFN γ 分泌的能力。藉由 Luminex 技術偵測到 IFN γ 分泌。為測量經 TCB 處理後之 T 細胞之 IFN γ 分泌，將 PBMC 及 SKOV3HLA-G 細胞或 JEG3 細胞與抗 HLA-G TCB 共培養。簡言之，使用淋巴細胞分離培養基管 (PAN #P04-60125)，藉由密度梯度離心從人周邊血中分離出 PBMC。將 PBMC與 SKOV 3 HLA-G 細胞以 10: 1 的比率接種至 96 孔 U 型底板。然後如圖 (圖 9) 中所示，將共培養物與不同濃度之 HLA-G-TCB 孵育並於 37°C 下在包含 5% Co2 的培養箱中孵育 24 小時。第二天，收集上清液，並使用 Milliplex MAP 套組 (Luminex 技術) 按照製造商之説明測量 IFN γ 分泌。雙特異性抗 HLA-G/抗 CD3 (T 細胞雙特異性 (TCB)) 抗體 P1AF7977 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 P035)；P1AF7978 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 Cl22) 及 P1AF7979 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 V9) 誘導 T 細胞之 IFN γ 分泌 (圖 9)。EC50 值列於下表中。
IFNγ 誘導 EC 50(nM) JEG3 SKOV3 HLA-G
P1AF7977 20 30
P1AF7978 2.2 2.6
P1AF7979 29 16
實例 15
雙特異性抗 HLA-G/ 抗 CD3 抗體 (T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體 ) 誘導 T 細胞介導的細胞毒性 / 腫瘤細胞毒殺
在經重組 HLA-G 轉染之 SKOV3 細胞 (SKOV 3 HLA-G) 及表現內源性 HLA-G 的 JEG3 細胞上，在表現 HLA-G 之腫瘤細胞存在之情況下測試抗 HLA-G TCB 誘導 T 細胞介導的細胞毒性的能力。藉由測量經 HLA-G TCB 處理後之細胞中之凋亡蛋白酶 8 來偵測細胞毒性。為測量經 HLA-G/抗 CD3 抗體 (TCB) 處理後之凋亡蛋白酶 8 活化，將 PBMC 及 SKOV3 HLA-G 細胞或 JEG3 細胞之共培養物與抗 HLA-G TCB 孵育 24 小時，然後使用凋亡蛋白酶 8 Glo 套組 (Promega, #G8200) 測量凋亡蛋白酶 8 活化。簡言之，使用淋巴細胞分離培養基管 (PAN #P04-60125)，藉由密度梯度離心從人周邊血中分離出 PBMC。將 PBMC 與 SKOV3 HLA-G 或 JEG3 細胞以 10:1 (每孔 100 μl) 之比率接種到黑色透明底 96 孔板中。然後如圖 (圖 10) 中所示，將共培養物與不同濃度之 HLA-G-TCB 孵育並於 37°C 下在包含 5% Co2 的培養箱中孵育 24 小時或 48 小時。第二天，向各孔中添加 100 μl 的凋亡蛋白酶 8 Glo 受質，並置於振蕩器上於室溫下處理 1 小時。在 BioTek Synergy 2 儀器上測量發光。對應於凋亡蛋白酶 8 活化/細胞毒性的相對發光單位 (RLU) 繪製於圖 (圖 10) 中。雙特異性抗 HLA-G/抗 CD3 (T 細胞雙特異性 (TCB)) 抗體 P1AF7977 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 P035)；P1AF7978 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 Cl22) 及 P1AF7979 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 V9) 誘導 T 細胞介導的細胞毒性/腫瘤細胞毒殺。腫瘤細胞毒殺之 EC50 值列於下表中。
T 細胞介導的細胞毒性誘導 EC 50(nM) JEG3 SKOV3 HLA-G
P1AF7977 12 1.4
P1AF7978 2.6 1.36
P1AF7979 4.6 1
實例 16
雙特異性抗 HLA-G/ 抗 CD3 (T 細胞雙特異性 (TCB)) 抗體在帶有經重組 HLA-G 轉染的 SKOV3 人類卵巢癌 (SKOV3 HLA-G) 之人源化 NSG 小鼠中之活體內抗腫瘤效力
將人源化 NSG (NOD/scid/IL-2Rγnull，經 CD34+ 臍帶血細胞人源化，購自美國 Jackson Laboratories) 小鼠 (n=15) 皮下注射 5 × 10 6個 SKOV3 HLA-G 細胞，總體積為 100 µl。在腫瘤平均體積達到 200 mm 3後，將小鼠隨機化，並且每週用雙特異性抗 HLA-G/抗 CD3 (T 細胞雙特異性 (TCB)) 抗體 (P1AF7977 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 P035)) (5 mg/kg) 進行治療。作為對照，一組小鼠每週接受靜脈注射組胺酸緩衝劑 (媒劑)。每週測量兩次腫瘤體積，直至研究終止。實驗結果如圖 11 所示。結果顯示了兩個研究組中藉由 caliper 卡尺測量的腫瘤體積資料 (中位數及四分位距 (IQR))。抗 HLA-G/抗 CD3 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體 P1AF7977 在 SKOV3-HLA-G 腫瘤模型中表現出強烈的腫瘤生長抑制/腫瘤消退作用。
實例 17
雙特異性抗 HLA-G/ 抗 CD3 (T 細胞雙特異性 (TCB)) 抗體在帶有人類乳癌 PDX 腫瘤 (BC004) 的人源化 NSG 小鼠中的劑量 - 緩解研究
向人源化 NSG (NOD/scid/IL-2Rγnull，每隻小鼠藉由靜脈注射 1 × 10 5個 CD34+ 臍帶血細胞而人源化) 小鼠之乳房內脂肪墊內注射 2 × 10 6個 BC004 乳癌細胞，總體積為 50 µL PBS。在腫瘤平均體積達到約 200 mm 3後，將小鼠隨機化 (每組動物數 n=15)，並且每週用三種不同劑量 (5 mg/kg, 2.5 mg/kg, 0.5 mg/kg) 的雙特異性抗 HLA-G/抗 CD3 (T 細胞雙特異性 (TCB)) 抗體 (P1AF7977 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 P035)) 進行治療。作為對照，一組小鼠每週接受靜脈注射組胺酸緩衝劑 (媒劑)。經由卡尺測量，每週測定兩次腫瘤體積。圖 12 所示之實驗結果展示了腫瘤體積資料 (中位數及四分位距 (IQR))。所有三種劑量的抗 HLA-G/抗 CD3 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體在 BC004 腫瘤模型中皆表現出強烈的腫瘤生長抑制/腫瘤消退作用。與 2.5 mg/kg 及 0.5 mg/kg 治療組相比，最高劑量 (5 mg/kg) 顯示出略高的效力。
實例 18
在經重組 HLA-G 轉染之 SKOV3 細胞 (SKOV3 HLA-G) 上，測試雙特異性抗 HLA-G/ 抗 CD3 抗體 (T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體 ) 在表現 HLA-G 之腫瘤細胞存在之情況下所誘導之 T 細胞活化
在經重組 HLA-G 轉染之 SKOV3 細胞 (SKOV3 HLA-G) 上，測試抗 HLA-G/抗 CD3 TCB 在表現 HLA-G 的腫瘤細胞存在之情況下活化 T 細胞的能力。藉由 FACS 分析對 T 細胞上之細胞表面活化標誌物 CD25 及早期活化標誌物 CD69，對 T 細胞之活化進行評估。簡言之，使用淋巴細胞分離培養基管 (PAN #P04-60125)，藉由密度梯度離心從人周邊血中分離出周邊血單核細胞 (PBMC)。將 PBMC 與 SKOV3 HLA-G 細胞以 10: 1 的比率接種至 96 孔 U 型底板。然後將共培養物與抗 HLA-G/抗 CD3 (T 細胞雙特異性 (TCB)) 抗體 (P1AF7977 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 P035)) (0.01nM) 孵育，並於 37°C 下在包含 5% Co2 的培養箱中孵育 24 小時。第二天，藉由流式細胞分析技術測量 CD25 及 CD69 之表現。
在流式細胞分析中，於 4°C 下將細胞用 PerCP-Cy5.5 小鼠抗 人類 CD8 (BD Pharmingen # 565310)、PE-Cy7 小鼠抗人類 CD4 (Biologend #317414)、FITC 小鼠抗人類 CD25 (Biolegend # 356106) 及 APC 小鼠抗人類 CD69 (BD Pharmingen # 555533) 染色。簡言之，將抗體稀釋至 2 倍濃度，並向包含 25 µl 預洗滌的共培養物的各孔中添加 25 µl 抗體稀釋液。將細胞於 4°C 下染色 30 分鐘，用 200 μl/孔染色緩衝液洗滌兩次，並以 300 g 離心 5 分鐘。將細胞沉澱重懸浮於 200 μl 染色緩衝液中，並用 DAPI 染色，在最終濃度為 2 μg/ml 的條件下區別死亡/存活細胞。然後使用 BD LSR 流式細胞儀測量樣品。使用 FlowJo V.10.1 軟體進行資料分析。圖 14 顯示了雙特異性抗 HLA-G/抗 CD3 抗體 P1AF7977 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 P035) 在 SKOV3 HLAG 細胞存在之情況下對 T 細胞活化之誘導。
圖 1 ：HLA-G 的不同同功型 圖 2 ：圖 2A ：與 ß2M 相關聯之 HLA-G 分子的示意圖 圖 2B ：與某些受體相關聯之 HLA-G 分子的結構：與給定受體諸如 ILT4 及 KIR2DL1 的複合物中的 HLA-G 結構。ILT4 結構 (PDB 代碼：2DYP)。KIR2DL1 結構取自 PDB 代碼 1IM9 (KIR2DL1：HLA-Cw4 複合物結構) 並藉由 HLA-Cw4 與 HLA-G 結構的疊加定位在 HLA-G 上。受體顯示於條帶圖示中，HLA-G 顯示於分子表面圖示中。在其他 HLA 旁系同源物中獨有或保留的 HLA-G 殘基分別著色為白色及灰色。在嵌合逆抗原 (counter antigen) 中，獨有的表面殘基被 HLA 共同序列替換。 圖 3 ：示意性抗體-抗原結合測定原理 - HLA-G 抗體與 HLA-G 結合的相對活性濃度 (RAC) 圖 4A ：HLA-G-0090 的 N-醣基化質譜表明存在 Fab-醣基化 圖 4B ：HLA-G-0090-VL-S32P 及 HLA-G-0090-VL-S33A 的 N-醣基化質譜：未檢測到 Fab-醣基化 圖 5 ：SKOV3 細胞 (不表現 HLA-G)、JEG3 細胞 (表現 HLA-G) 及 SKOV3-HLA-G 細胞 (經 HLA-G 轉染之 SKOV3 細胞) 上抗 HLA-G 抗體 HLA-G-0090、HLA-G-0090-VL-S32P 及 HLA-G-0090-VL-S33A (2 μg/ml) 的例示性 FACS 染色 圖 6 ：HLA-G 抗體 HLA-G-0090、HLA-G-0090-VL-S32P 及 HLA-G-0090-VL-S33A 修飾/抑制重組可溶性 ILT2 (ILT2Fc 域融合) 與 JEG3 腫瘤細胞上天然表現的 HLA-G 之交互作用及結合的能力。JEG3 細胞經 HLA-G 抗體預孵育/預處理，從而抑制/阻斷 ILT2 與 JEG3 細胞之結合。使用未經 HLA-G 抗體預處理 (僅 ILT2-Fc) 及同型抗體的 JEG3 細胞進行對照。 圖 7 ：雙特異性抗 HLA-G/抗 CD3 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體與藉由抗體 P1AF7977、P1AF7978 及 P1AF7979 在 T 細胞上表現的 CD3 之結合 圖 8 ：雙特異性抗 HLA-G/抗 CD3 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體 P1AF7977、P1AF7978 及 P1AF7979 顯示出與 JEG3 細胞及經 HLA-G 轉染之 SKOV3 細胞結合。 圖 9 ：雙特異性抗 HLA-G/抗 CD3 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體藉由抗體 P1AF7977、P1AF7978 及 P1AF7979 介導/誘導 T 細胞之 IFN γ 分泌 圖 10 ：雙特異性抗 HLA-G/抗 CD3 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體 P1AF7977、P1AF7978 及 P1AF7979 誘導 T 細胞所介導的細胞毒性/腫瘤細胞毒殺。 圖 11 ：抗 HLA-G/抗 CD3 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體 P1AF7977 在帶有經重組 HLA-G (SKOV3 HLA-G) 轉染的 SKOV3 人類卵巢癌的人源化 NSG 小鼠中之活體內抗腫瘤效力，導致腫瘤消退 圖 12 ：抗 HLA-G/抗 CD3 T 細胞雙特異性 (TCB) 抗體 P1AF7977 in 在帶有人類乳癌 PDX 腫瘤 (BC004) 的人源化 NSG 小鼠中之劑量-緩解研究。在經不同劑量治療的小鼠中觀察到強烈的腫瘤生長抑制直至腫瘤消退。 圖 13 ：本發明之雙特異性抗原結合分子的例示性組態。(A、D)「1+1 CrossMab」分子之圖示。(B、E)「2+1 IgG Crossfab」分子之圖示，具有 Crossfab 和 Fab 組成之順序替換 (「反向 (inverted)」)。(C、F)「2+1 IgG Crossfab」分子之圖示。(G、K)「1+1 IgG Crossfab」分子之圖示，具有 Crossfab 和 Fab 組成之順序替換 (「反向」)。(H、L)「1+1 IgG Crossfab」分子之圖示。(I、M)「2+1 IgG Crossfab」分子之圖示，具有二個 CrossFab。(J, N)。黑點：Fc 域中的視情況選用之修飾，其促進異源二聚化 (heterodimerization)。++、--：在 CH1 和 CL 域中視情況引入相反電荷的胺基酸。Crossfab 分子被描述為包含 VH 和 VL 區域的交換，但可以-在其中，CH1 和 CL 域中沒有引入電荷修飾的實施例中-交替地包含 CH1 和 CL 域的交換。 圖 14 ：雙特異性抗 HLA-G/抗 CD3 抗體 P1AF7977 (HLA-G-0090-VL-S32P/ CD3 P035) 在 SKOV3 HLAG 細胞存在之情況下對 T 細胞活化之誘導。 圖 15 ：原始及優化 CD3 結合子 CD3 原始及 CD3 優化(=P035-093 (P035)) 與重組 CD3 之相對結合活性，其藉由 SPR 在無應力條件下，在 40℃ pH 6 下 14 天後或在 37℃ pH 7.4 下 14 天後量測 (IgG 形式)。 圖 16 ：原始及優化 CD3 結合子 CD3 原始及 CD3 優化(=P035-093 (P035)) 與 Jurkat NFAT 細胞之結合，其藉由流式細胞分析技術量測 (IgG 形式)。與 Jurkat NFAT 細胞結合之抗體經螢光標記之抗人類 Fc 特異性二級抗體偵測。 圖 17 ：實例 8 中所用之 CD3 活化分析之示意圖。 圖 18 ：用原始及優化 CD3 結合子 CD3 原始及 CD3 優化(=P035-093 (P035)) 進行之 Jurkat NFAT 活化 (IgG 形式)。Jurkat NFAT 報告細胞與表現 CHO 之抗 PGLALA (CHO-PGLALA) 細胞在 CD3 原始或 CD3 優化(=P035-093 (P035)) IgG PGLALA 或 CD3 優化IgG wt (作為陰性對照) 存在之情況下共孵育。CD3 活化藉由在24小時後量測冷光而進行定量。 
<![CDATA[<110>  瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 (F. Hoffmann-La Roche AG)]]>
          <![CDATA[<120>  抗 HLA-G 抗體及其用途]]>
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                      100                 105                 110         
          Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  113]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Lys 
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  9]]>
          Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ala 
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  113]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-N31D]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asp Ser 
                      20                  25                  30          
          Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Lys 
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  11]]>
          Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Leu Ser Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ala 
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  113]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-N31L]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
          Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Lys 
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
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          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  13]]>
          Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Gln Ser Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ala 
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  113]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-N31Q]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Gln Ser 
                      20                  25                  30          
          Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Lys 
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈 CDR-L1，HLA-G-0090-VL-N31S]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Ser Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ala 
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  113]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-N31S]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
          Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Lys 
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  17]]>
          Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Thr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ala 
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  113]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-N31T]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
          Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Lys 
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  19]]>
          Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ala 
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  113]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-N31Y]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
          Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Lys 
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  21]]>
          Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ala 
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  113]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-N31Y-N38Y]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 
                      20                  25                  30          
          Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Lys 
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈 CDR-L1，HLA-G-0090-VL-S32P]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Pro Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ala 
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  113]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-S32P]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Pro 
                      20                  25                  30          
          Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Lys 
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  25]]>
          Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser Ala Asn Asn Lys Asn Asn Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ala 
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  113]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-S33A]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Ala Asn Asn Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Lys 
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  27]]>
          Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser Asp Asn Asn Lys Asn Asn Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ala 
          <![CDATA[<210>  28]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  28]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Asp Asn Asn Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Lys 
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  29]]>
          Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser Pro Asn Asn Lys Asn Asn Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ala 
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  113]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，HLA-G-0090-VL-S33P]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser 
                      20                  25                  30          
          Pro Asn Asn Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Lys 
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  314]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg 
                  35                  40                  45              
          Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr 
              50                  55                  60                  
          Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln 
                          85                  90                  95      
          Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly 
                      100                 105                 110         
          Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu 
                  115                 120                 125             
          Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys 
              130                 135                 140                 
          Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 
                          165                 170                 175     
          Glu Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His 
                      180                 185                 190         
          Pro Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe 
                  195                 200                 205             
          Tyr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln 
              210                 215                 220                 
          Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg 
                          245                 250                 255     
          Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu 
                      260                 265                 270         
          Arg Trp Lys Gln Ser Ser Leu Pro Thr Ile Pro Ile Met Gly Ile Val 
                  275                 280                 285             
          Ala Gly Leu Val Val Leu Ala Ala Val Val Thr Gly Ala Ala Val Ala 
              290                 295                 300                 
          Ala Val Leu Trp Arg Lys Lys Ser Ser Asp 
          305                 310                 
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  274]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg 
                  35                  40                  45              
          Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr 
              50                  55                  60                  
          Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln 
                          85                  90                  95      
          Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly 
                      100                 105                 110         
          Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu 
                  115                 120                 125             
          Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys 
              130                 135                 140                 
          Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 
                          165                 170                 175     
          Glu Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His 
                      180                 185                 190         
          Pro Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe 
                  195                 200                 205             
          Tyr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln 
              210                 215                 220                 
          Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg 
                          245                 250                 255     
          Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu 
                      260                 265                 270         
          Arg Trp 
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  99]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu 
          1               5                   10                  15      
          Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro 
                      20                  25                  30          
          Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys 
                  35                  40                  45              
          Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu 
              50                  55                  60                  
          Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp 
                          85                  90                  95      
          Arg Asp Met 
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  275]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  經修飾的人類 HLA-G (其中 HLA-G 特異性胺基酸已被 HLA-A 共同胺基酸替換]]>
                  (= 去移植 HLA-G)) ECD
          <![CDATA[<400>  34]]>
          Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Met Glu Pro Arg 
                  35                  40                  45              
          Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Glu Glu Thr 
              50                  55                  60                  
          Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Val Asn Leu Gly Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln 
                          85                  90                  95      
          Trp Met Ile Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly 
                      100                 105                 110         
          Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu 
                  115                 120                 125             
          Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys 
              130                 135                 140                 
          Arg Lys Cys Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 
                          165                 170                 175     
          Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His 
                      180                 185                 190         
          Pro Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe 
                  195                 200                 205             
          Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln 
              210                 215                 220                 
          Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg 
                          245                 250                 255     
          Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu 
                      260                 265                 270         
          Arg Trp Lys 
                  275 
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  341]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg 
                  35                  40                  45              
          Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr 
              50                  55                  60                  
          Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln 
                          85                  90                  95      
          Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly 
                      100                 105                 110         
          Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu 
                  115                 120                 125             
          Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys 
              130                 135                 140                 
          His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 
                          165                 170                 175     
          Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His 
                      180                 185                 190         
          Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe 
                  195                 200                 205             
          Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln 
              210                 215                 220                 
          Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg 
                          245                 250                 255     
          Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu 
                      260                 265                 270         
          Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile 
                  275                 280                 285             
          Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala Val Ile Thr Gly Ala Val Val Ala 
              290                 295                 300                 
          Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu 
                          325                 330                 335     
          Thr Ala Cys Lys Val 
                      340     
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  275]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg 
                  35                  40                  45              
          Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr 
              50                  55                  60                  
          Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln 
                          85                  90                  95      
          Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly 
                      100                 105                 110         
          Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu 
                  115                 120                 125             
          Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys 
              130                 135                 140                 
          His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys 
                          165                 170                 175     
          Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His 
                      180                 185                 190         
          Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe 
                  195                 200                 205             
          Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln 
              210                 215                 220                 
          Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg 
                          245                 250                 255     
          Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu 
                      260                 265                 270         
          Arg Trp Glu 
                  275 
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  275]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          Gly Pro His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Leu Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Asp Asn Pro Arg Phe Glu Pro Arg 
                  35                  40                  45              
          Ala Pro Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Gln Thr 
              50                  55                  60                  
          Gln Arg Ala Lys Ser Asp Glu Gln Trp Phe Arg Val Ser Leu Arg Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Gln Arg Cys Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Phe Gln 
                          85                  90                  95      
          Arg Met Phe Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Leu Leu Arg Gly 
                      100                 105                 110         
          Tyr Gln Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu 
                  115                 120                 125             
          Asp Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Leu Ile Thr Arg 
              130                 135                 140                 
          Arg Lys Trp Glu Gln Ala Gly Asp Ala Glu Tyr Tyr Arg Ala Tyr Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Leu Gly Asn 
                          165                 170                 175     
          Glu Thr Leu Leu Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr Tyr His 
                      180                 185                 190         
          Pro Arg Ser Gln Val Asp Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe 
                  195                 200                 205             
          Tyr Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu 
              210                 215                 220                 
          Thr Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Asn 
                          245                 250                 255     
          Tyr Thr Cys His Val His His Lys Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu 
                      260                 265                 270         
          Arg Trp Lys 
                  275 
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  274]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大鼠]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          Gly Ser His Ser Leu Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Leu Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu 
                      20                  25                  30          
          Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Met Glu Pro Arg 
                  35                  40                  45              
          Ala Arg Trp Met Glu Arg Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Gln Gln Thr 
              50                  55                  60                  
          Arg Ile Ala Lys Glu Trp Glu Gln Ile Tyr Arg Val Asp Leu Arg Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Gly Gly Ser His Thr Ile Gln 
                          85                  90                  95      
          Glu Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Ser Leu Leu Arg Gly 
                      100                 105                 110         
          Tyr Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu 
                  115                 120                 125             
          Asp Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Phe Ala Ala Gln Ile Thr Arg 
              130                 135                 140                 
          Asn Lys Trp Glu Arg Ala Arg Tyr Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Ser Arg Tyr Leu Glu Leu Gly Lys 
                          165                 170                 175     
          Glu Thr Leu Leu Arg Ser Asp Pro Pro Glu Ala His Val Thr Leu His 
                      180                 185                 190         
          Pro Arg Pro Glu Gly Asp Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe 
                  195                 200                 205             
          Tyr Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu 
              210                 215                 220                 
          Thr Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Asn 
                          245                 250                 255     
          Tyr Thr Cys Arg Val Glu His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Ser Gln 
                      260                 265                 270         
          Arg Trp 
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  440]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          Arg Ile Ile Pro Arg His Leu Gln Leu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln 
                      20                  25                  30          
          Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn 
                  35                  40                  45              
          Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu 
              50                  55                  60                  
          Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
              130                 135                 140                 
          Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe 
                          165                 170                 175     
          Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala 
                      180                 185                 190         
          Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu 
              210                 215                 220                 
          Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln Trp 
          225                 230                 235                 240 
          Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr 
                          245                 250                 255     
          Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp 
                      260                 265                 270         
          Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg 
                  275                 280                 285             
          Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro 
                          325                 330                 335     
          Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr 
                      340                 345                 350         
          Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr 
                  355                 360                 365             
          Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe 
              370                 375                 380                 
          Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg 
                          405                 410                 415     
          Trp Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp 
                      420                 425                 430         
          His Glu His His His His His His 
                  435                 440 
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  441]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  例示性經修飾的人類 HLA-G ß2M MHC I 類複合物 (其中 HLA-G 特異性胺基酸 ]]>
                 已被 HLA-A 共同胺基酸替換 (= 去移植 HLA-G))  
          <![CDATA[<400>  40]]>
          Arg Ile Ile Pro Arg His Leu Gln Leu Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln 
                      20                  25                  30          
          Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn 
                  35                  40                  45              
          Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu 
              50                  55                  60                  
          Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser 
                      100                 105                 110         
          Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
              130                 135                 140                 
          Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe 
                          165                 170                 175     
          Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala 
                      180                 185                 190         
          Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Glu Glu Thr Arg 
                  195                 200                 205             
          Asn Thr Lys Ala His Ala Gln Thr Asp Arg Val Asn Leu Gly Thr Leu 
              210                 215                 220                 
          Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Trp 
          225                 230                 235                 240 
          Met Ile Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr 
                          245                 250                 255     
          Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp 
                      260                 265                 270         
          Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg 
                  275                 280                 285             
          Lys Cys Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro 
                          325                 330                 335     
          Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr 
                      340                 345                 350         
          Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr 
                  355                 360                 365             
          Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe 
              370                 375                 380                 
          Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu Arg 
                          405                 410                 415     
          Trp Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu 
                      420                 425                 430         
          Trp His Glu His His His His His His 
                  435                 440     
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  441]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln 
                      20                  25                  30          
          Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn 
                  35                  40                  45              
          Cys Tyr Val Thr Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu 
              50                  55                  60                  
          Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Glu Thr Asp Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Asp Ser Met Ala 
                      100                 105                 110         
          Glu Pro Lys Thr Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
              130                 135                 140                 
          Pro His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe 
                          165                 170                 175     
          Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Asp Asn Pro Arg Phe Glu Pro Arg Ala 
                      180                 185                 190         
          Pro Trp Met Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Gln Thr Gln 
                  195                 200                 205             
          Arg Ala Lys Ser Asp Glu Gln Trp Phe Arg Val Ser Leu Arg Thr Ala 
              210                 215                 220                 
          Gln Arg Cys Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Phe Gln Arg 
          225                 230                 235                 240 
          Met Phe Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Leu Leu Arg Gly Tyr 
                          245                 250                 255     
          Gln Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp 
                      260                 265                 270         
          Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Leu Ile Thr Arg Arg 
                  275                 280                 285             
          Lys Trp Glu Gln Ala Gly Asp Ala Glu Tyr Tyr Arg Ala Tyr Leu Glu 
              290                 295                 300                 
          Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Leu Gly Asn Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Leu Leu Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr Tyr His Pro 
                          325                 330                 335     
          Arg Ser Gln Val Asp Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr 
                      340                 345                 350         
          Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Thr 
                  355                 360                 365             
          Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe 
              370                 375                 380                 
          Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Asn Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Cys His Val His His Lys Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu Arg 
                          405                 410                 415     
          Trp Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu 
                      420                 425                 430         
          Trp His Glu His His His His His His 
                  435                 440     
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  441]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  例示性人類 HLA-G/ 小鼠 H2Kd ß2M MHC I 類複合物 (其中人類 HLA-G 特異性]]>
                 位置被移植到小鼠 H2Kd 骨架上)
          <![CDATA[<400>  42]]>
          Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln 
                      20                  25                  30          
          Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn 
                  35                  40                  45              
          Cys Tyr Val Thr Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu 
              50                  55                  60                  
          Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Glu Thr Asp Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Asp Ser Met Ala 
                      100                 105                 110         
          Glu Pro Lys Thr Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
              130                 135                 140                 
          Pro His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe 
                          165                 170                 175     
          Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Ser Pro Arg Phe Glu Pro Arg Ala 
                      180                 185                 190         
          Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Gln Thr Gln 
                  195                 200                 205             
          Arg Ala Lys Ser Asp Glu Gln Trp Phe Arg Met Ser Leu Gln Thr Ala 
              210                 215                 220                 
          Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Phe Gln Arg 
          225                 230                 235                 240 
          Met Phe Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr 
                          245                 250                 255     
          Gln Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp 
                      260                 265                 270         
          Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Leu Ile Thr Lys Arg 
                  275                 280                 285             
          Lys Trp Glu Ala Ala Asn Asp Ala Glu Tyr Tyr Arg Ala Tyr Leu Glu 
              290                 295                 300                 
          Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Met Leu Gln Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr His His Pro 
                          325                 330                 335     
          Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr 
                      340                 345                 350         
          Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Thr 
                  355                 360                 365             
          Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe 
              370                 375                 380                 
          Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Lys Glu Gln Asn Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg 
                          405                 410                 415     
          Trp Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu 
                      420                 425                 430         
          Trp His Glu His His His His His His 
                  435                 440     
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  440]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大鼠]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          Ala Gln Phe Ser Ala Ser Ala Ser Arg Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln 
                      20                  25                  30          
          Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Phe Leu Asn 
                  35                  40                  45              
          Cys Tyr Val Ser Gln Phe His Pro Pro Gln Ile Glu Ile Glu Leu Leu 
              50                  55                  60                  
          Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Asn Ile Glu Met Ser Asp Leu Ser Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Glu Thr Asp Val Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Val Thr Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          Glu Pro Lys Thr Val Thr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
              130                 135                 140                 
          Ser His Ser Leu Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu Phe 
                          165                 170                 175     
          Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala 
                      180                 185                 190         
          Arg Trp Met Glu Arg Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Gln Gln Thr Arg 
                  195                 200                 205             
          Ile Ala Lys Glu Trp Glu Gln Ile Tyr Arg Val Asp Leu Arg Thr Leu 
              210                 215                 220                 
          Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Gly Gly Ser His Thr Ile Gln Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Gly Ser Leu Leu Arg Gly Tyr 
                          245                 250                 255     
          Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp 
                      260                 265                 270         
          Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Phe Ala Ala Gln Ile Thr Arg Asn 
                  275                 280                 285             
          Lys Trp Glu Arg Ala Arg Tyr Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Glu 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Ser Arg Tyr Leu Glu Leu Gly Lys Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Leu Leu Arg Ser Asp Pro Pro Glu Ala His Val Thr Leu His Pro 
                          325                 330                 335     
          Arg Pro Glu Gly Asp Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr 
                      340                 345                 350         
          Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Thr 
                  355                 360                 365             
          Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe 
              370                 375                 380                 
          Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Asn Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Cys Arg Val Glu His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Ser Gln Arg 
                          405                 410                 415     
          Trp Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp 
                      420                 425                 430         
          His Glu His His His His His His 
                  435                 440 
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  440]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  例示性人類 HLA-G/大鼠 RT1A ß2M MHC I 類複合物 (其中人類 HLA-G 特異性位置]]>
                 被移植到大鼠 RT1A 骨架上) 
          <![CDATA[<400>  44]]>
          Ala Gln Phe Ser Ala Ser Ala Ser Arg Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln 
                      20                  25                  30          
          Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Phe Leu Asn 
                  35                  40                  45              
          Cys Tyr Val Ser Gln Phe His Pro Pro Gln Ile Glu Ile Glu Leu Leu 
              50                  55                  60                  
          Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Asn Ile Glu Met Ser Asp Leu Ser Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Glu Thr Asp Val Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Val Thr Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          Glu Pro Lys Thr Val Thr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
              130                 135                 140                 
          Ser His Ser Leu Arg Tyr Phe Tyr Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu Phe 
                          165                 170                 175     
          Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser Ala Ser Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala 
                      180                 185                 190         
          Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Glu Gln Gln Thr Arg 
                  195                 200                 205             
          Ile Ala Lys Glu Trp Glu Gln Ile Tyr Arg Met Asp Leu Gln Thr Leu 
              210                 215                 220                 
          Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Ser Ser His Thr Ile Gln Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Met Tyr Gly Cys Asp Leu Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr 
                          245                 250                 255     
          Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp 
                      260                 265                 270         
          Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Phe Ala Ala Gln Ile Thr Lys Arg 
                  275                 280                 285             
          Lys Trp Glu Ala Ala Asn Tyr Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Glu 
              290                 295                 300                 
          Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Glu Ala His Val Thr His His Pro 
                          325                 330                 335     
          Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr 
                      340                 345                 350         
          Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Asp Leu Thr 
                  355                 360                 365             
          Gln Asp Val Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe 
              370                 375                 380                 
          Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Ser Gly Lys Glu Gln Asn Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Cys Arg Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Met Leu Arg 
                          405                 410                 415     
          Trp Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp 
                      420                 425                 430         
          His Glu His His His His His His 
                  435                 440 
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子及 His 標籤]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Leu Asn Asp 
          1               5                   10                  15      
          Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His His His His His 
                      20                  25                  30          
          His 
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  48]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 
                  35                  40                  45              
          Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 
              50                  55                  60                  
          Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 
          65                  70                  75                  80  
          His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 
                          85                  90                  95      
          Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 
                      100                 105 
          <![CDATA[<210>  49]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                          325             
          <![CDATA[<210>  50]]>
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          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                          325             
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  325]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
                  115                 120                 125             
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
              130                 135                 140                 
          Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 
                          165                 170                 175     
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
                      180                 185                 190         
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
                          245                 250                 255     
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
                      260                 265                 270         
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
                  275                 280                 285             
          Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 
              290                 295                 300                 
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Ser Leu Ser Leu 
                          325 
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 CDR-H1，P035-093 (縮寫為 P035)]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          Ser Tyr Ala Met Asn Trp 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 CDR-H2, P035-093]]>
          <![CDATA[<400>  53]]>
          Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys 
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 CDR-H3, P035-093]]>
          <![CDATA[<400>  54]]>
          Ala Ser Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  55]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈 CDR-L1，P035-093]]>
          <![CDATA[<400>  55]]>
          Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈 CDR-L2，P035-093]]>
          <![CDATA[<400>  56]]>
          Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  57]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈 CDR-L3，P035-093]]>
          <![CDATA[<400>  57]]>
          Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  58]]>
          <![CDATA[<211>  125]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈可變域 VH，P035-093]]>
          <![CDATA[<400>  58]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125 
          <![CDATA[<210>  59]]>
          <![CDATA[<211>  109]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，P035-093]]>
          <![CDATA[<400>  59]]>
          Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 
                          85                  90                  95      
          Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 
          <![CDATA[<210>  60]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  60]]>
          Ser Tyr Ala Met Asn 
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          <![CDATA[<210>  61]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 CDR-H2，殖株 22]]>
          <![CDATA[<400>  61]]>
          Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys 
          <![CDATA[<210>  62]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 CDR-H3，殖株 22]]>
          <![CDATA[<400>  62]]>
          His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr Gly Tyr 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  63]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈 CDR-L1，殖株 22]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  64]]>
          Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<22]]>3>  輕鏈 CDR-L3，殖株 22]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;400&gt;  65]]&gt;
          <br/>
          <br/><![CDATA[Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val 
          1               5                   
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          <![CDATA[<211>  125]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  66]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr 
                      100                 105                 110         
          Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125 
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          <![CDATA[<211>  109]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  67]]>
          Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 
                          85                  90                  95      
          Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 
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          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 CDR-H1，V9]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          Gly Tyr Thr Met Asn 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 CDR-H2，V9]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asp 
          <![CDATA[<210>  70]]>
          <![CDATA[<211>  13]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 CDR-H3，V9]]>
          <![CDATA[<400>  70]]>
          Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210>  71]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 CDR-L1，V9]]>
          <![CDATA[<400>  71]]>
          Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  72]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 CDR-L2，V9]]>
          <![CDATA[<400>  72]]>
          Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  73]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 CDR-L3，V9]]>
          <![CDATA[<400>  73]]>
          Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  74]]>
          <![CDATA[<211>  122]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈可變域 VH，V9]]>
          <![CDATA[<400>  74]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120         
          <![CDATA[<210>  75]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，V9]]>
          <![CDATA[<400>  75]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  76]]>
          <![CDATA[<211>  232]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈 1 P1AF7977]]>
          <![CDATA[<400>  76]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 
              130                 135                 140                 
          Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 
                          165                 170                 175     
          Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 
                      180                 185                 190         
          Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 
                  195                 200                 205             
          Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 
              210                 215                 220                 
          Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
          225                 230         
          <![CDATA[<210>  77]]>
          <![CDATA[<211>  220]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈 2 P1AF7977]]>
          <![CDATA[<400>  77]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Pro 
                      20                  25                  30          
          Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 
                  115                 120                 125             
          Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 
              130                 135                 140                 
          Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 
                      180                 185                 190         
          Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 
                  195                 200                 205             
          Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215                 220 
          <![CDATA[<210>  78]]>
          <![CDATA[<211>  449]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 1 P1AF7977]]>
          <![CDATA[<400>  78]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Arg Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 
                  35                  40                  45              
          Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 
              50                  55                  60                  
          Val Ser Val Gln Gly Arg Ile Thr Leu Ile Pro Asp Thr Ser Lys Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Phe Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Cys Ala Ser Val Arg Ala Val Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 
                  195                 200                 205             
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 
              210                 215                 220                 
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                          245                 250                 255     
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                      260                 265                 270         
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                  275                 280                 285             
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
              290                 295                 300                 
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                      340                 345                 350         
          Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                  355                 360                 365             
          Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
              370                 375                 380                 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 
                          405                 410                 415     
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                      420                 425                 430         
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro 
          <![CDATA[<210>  79]]>
          <![CDATA[<211>  674]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 2 P1AF7977]]>
          <![CDATA[<400>  79]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Arg Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 
                  35                  40                  45              
          Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 
              50                  55                  60                  
          Val Ser Val Gln Gly Arg Ile Thr Leu Ile Pro Asp Thr Ser Lys Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Phe Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Cys Ala Ser Val Arg Ala Val Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 
                  195                 200                 205             
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 
              210                 215                 220                 
          Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gln Ala Val Val Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr 
                          245                 250                 255     
          Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp 
                      260                 265                 270         
          Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr 
                  275                 280                 285             
          Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu 
              290                 295                 300                 
          Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly 
                          325                 330                 335     
          Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                      340                 345                 350         
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
                  355                 360                 365             
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
              370                 375                 380                 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                      420                 425                 430         
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 
                  435                 440                 445             
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 
              450                 455                 460                 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                          485                 490                 495     
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                      500                 505                 510         
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 
                  515                 520                 525             
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
              530                 535                 540                 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro 
          545                 550                 555                 560 
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                          565                 570                 575     
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 
                      580                 585                 590         
          Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
                  595                 600                 605             
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
              610                 615                 620                 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
          625                 630                 635                 640 
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                          645                 650                 655     
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                      660                 665                 670         
          Ser Pro 
          <![CDATA[<210>  80]]>
          <![CDATA[<211>  232]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  80]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr 
                      100                 105                 110         
          Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 
              130                 135                 140                 
          Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 
                          165                 170                 175     
          Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 
                      180                 185                 190         
          Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 
                  195                 200                 205             
          Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 
              210                 215                 220                 
          Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
          225                 230         
          <![CDATA[<210>  81]]>
          <![CDATA[<211>  220]]>
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          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈 2 P1AF7978]]>
          <![CDATA[<400>  81]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Pro 
                      20                  25                  30          
          Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 
                  115                 120                 125             
          Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 
              130                 135                 140                 
          Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 
                      180                 185                 190         
          Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 
                  195                 200                 205             
          Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215                 220 
          <![CDATA[<210>  82]]>
          <![CDATA[<211>  449]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<223>  重鏈 1 P1AF7978]]>
          <![CDATA[<400>  82]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Arg Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 
                  35                  40                  45              
          Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 
              50                  55                  60                  
          Val Ser Val Gln Gly Arg Ile Thr Leu Ile Pro Asp Thr Ser Lys Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Phe Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Cys Ala Ser Val Arg Ala Val Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 
                  195                 200                 205             
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 
              210                 215                 220                 
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                          245                 250                 255     
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                      260                 265                 270         
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                  275                 280                 285             
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
              290                 295                 300                 
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                      340                 345                 350         
          Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                  355                 360                 365             
          Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
              370                 375                 380                 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 
                          405                 410                 415     
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                      420                 425                 430         
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro 
          <![CDATA[<210>  83]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  83]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Arg Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 
                  35                  40                  45              
          Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 
              50                  55                  60                  
          Val Ser Val Gln Gly Arg Ile Thr Leu Ile Pro Asp Thr Ser Lys Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Phe Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Cys Ala Ser Val Arg Ala Val Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 
                  195                 200                 205             
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 
              210                 215                 220                 
          Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gln Ala Val Val Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr 
                          245                 250                 255     
          Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp 
                      260                 265                 270         
          Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr 
                  275                 280                 285             
          Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu 
              290                 295                 300                 
          Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly 
                          325                 330                 335     
          Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                      340                 345                 350         
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
                  355                 360                 365             
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
              370                 375                 380                 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                      420                 425                 430         
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 
                  435                 440                 445             
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 
              450                 455                 460                 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                          485                 490                 495     
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                      500                 505                 510         
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 
                  515                 520                 525             
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
              530                 535                 540                 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro 
          545                 550                 555                 560 
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                          565                 570                 575     
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 
                      580                 585                 590         
          Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
                  595                 600                 605             
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
              610                 615                 620                 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
          625                 630                 635                 640 
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                          645                 650                 655     
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                      660                 665                 670         
          Ser Pro 
          <![CDATA[<210>  84]]>
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          <![CDATA[<400>  84]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 
                          165                 170                 175     
          Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 
                      180                 185                 190         
          Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 
                  195                 200                 205             
          Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 
              210                 215                 220                 
          Asn Arg Gly Glu Cys 
          225                 
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          <![CDATA[<400>  85]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Pro 
                      20                  25                  30          
          Ser Asn Asn Lys Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Gln 
                  35                  40                  45              
          Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 
              50                  55                  60                  
          Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Arg Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 
                  115                 120                 125             
          Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 
              130                 135                 140                 
          Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 
                      180                 185                 190         
          Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 
                  195                 200                 205             
          Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215                 220 
          <![CDATA[<210>  86]]>
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          <![CDATA[<400>  86]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Arg Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 
                  35                  40                  45              
          Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 
              50                  55                  60                  
          Val Ser Val Gln Gly Arg Ile Thr Leu Ile Pro Asp Thr Ser Lys Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Phe Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Cys Ala Ser Val Arg Ala Val Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 
                  195                 200                 205             
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 
              210                 215                 220                 
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                          245                 250                 255     
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                      260                 265                 270         
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                  275                 280                 285             
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
              290                 295                 300                 
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                      340                 345                 350         
          Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                  355                 360                 365             
          Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
              370                 375                 380                 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 
                          405                 410                 415     
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                      420                 425                 430         
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro 
          <![CDATA[<210>  87]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈 2 P1AF7979]]>
          <![CDATA[<400>  87]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Arg Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 
                  35                  40                  45              
          Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 
              50                  55                  60                  
          Val Ser Val Gln Gly Arg Ile Thr Leu Ile Pro Asp Thr Ser Lys Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Phe Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 
                          85                  90                  95      
          Tyr Tyr Cys Ala Ser Val Arg Ala Val Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 
              130                 135                 140                 
          Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 
                  195                 200                 205             
          Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 
              210                 215                 220                 
          Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile 
                          245                 250                 255     
          Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln 
                      260                 265                 270         
          Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg 
                  275                 280                 285             
          Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 
              290                 295                 300                 
          Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly 
                          325                 330                 335     
          Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                      340                 345                 350         
          Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
                  355                 360                 365             
          Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
              370                 375                 380                 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                          405                 410                 415     
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                      420                 425                 430         
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
                  435                 440                 445             
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 
              450                 455                 460                 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                          485                 490                 495     
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                      500                 505                 510         
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
                  515                 520                 525             
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
              530                 535                 540                 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 
          545                 550                 555                 560 
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                          565                 570                 575     
          Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                      580                 585                 590         
          Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
                  595                 600                 605             
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
              610                 615                 620                 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
          625                 630                 635                 640 
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                          645                 650                 655     
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                      660                 665                 670         
          <![CDATA[<210>  88]]>
          <![CDATA[<211>  207]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  88]]>
          Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr 
                      20                  25                  30          
          Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 
                  35                  40                  45              
          Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys 
              50                  55                  60                  
          Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp 
          65                  70                  75                  80  
          His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu 
                      100                 105                 110         
          Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu 
              130                 135                 140                 
          Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn 
                          165                 170                 175     
          Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg 
                      180                 185                 190         
          Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 
                  195                 200                 205         
          <![CDATA[<210>  89]]>
          <![CDATA[<211>  198]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  獼猴]]>
          <![CDATA[<400>  89]]>
          Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr 
                      20                  25                  30          
          Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 
                  35                  40                  45              
          Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys 
              50                  55                  60                  
          Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn 
                      100                 105                 110         
          Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp 
                  115                 120                 125             
          Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys 
              130                 135                 140                 
          Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly 
                      180                 185                 190         
          Leu Asn Gln Arg Arg Ile 
                  195             
          <![CDATA[<210>  90]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人 CD3 ε 莖 - Fc(杵) – Avi]]>
          <![CDATA[<400>  90]]>
          Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys 
          1               5                   10                  15      
          Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro 
                      20                  25                  30          
          Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp 
                  35                  40                  45              
          Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg 
                          85                  90                  95      
          Val Ser Glu Asn Cys Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser 
                      100                 105                 110         
          Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
                  115                 120                 125             
          Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
              130                 135                 140                 
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
                          165                 170                 175     
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 
                      180                 185                 190         
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
                  195                 200                 205             
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 
              210                 215                 220                 
          Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys 
                          245                 250                 255     
          Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
                      260                 265                 270         
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
                  275                 280                 285             
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
              290                 295                 300                 
          Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
                          325                 330                 335     
          Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu 
                      340                 345                 350         
          Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 
                  355                 360 
          <![CDATA[<210>  91]]>
          <![CDATA[<211>  325]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人 CD3 δ 莖 - Fc (臼) – Avi]]>
          <![CDATA[<400>  91]]>
          Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys 
          1               5                   10                  15      
          Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr 
              50                  55                  60                  
          Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Arg Ser Glu Gln Leu Tyr Phe Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 
                          85                  90                  95      
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                      100                 105                 110         
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                  115                 120                 125             
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
              130                 135                 140                 
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
                          165                 170                 175     
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 
                      180                 185                 190         
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                  195                 200                 205             
          Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 
              210                 215                 220                 
          Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
                          245                 250                 255     
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr 
                      260                 265                 270         
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                  275                 280                 285             
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
              290                 295                 300                 
          Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Glu Trp His Glu 
                          325 
          <![CDATA[<210>  92]]>
          <![CDATA[<211>  125]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3orig VH]]>
          <![CDATA[<400>  92]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125 
          <![CDATA[<210>  93]]>
          <![CDATA[<211>  109]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3orig VL]]>
          <![CDATA[<400>  93]]>
          Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 
                          85                  90                  95      
          Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 
          <![CDATA[<210>  94]]>
          <![CDATA[<211>  453]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3orig IgG HC]]>
          <![CDATA[<400>  94]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 
                  115                 120                 125             
          Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 
              130                 135                 140                 
          Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 
                          165                 170                 175     
          Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 
                      180                 185                 190         
          Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 
                  195                 200                 205             
          Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 
              210                 215                 220                 
          Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
                          245                 250                 255     
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
                      260                 265                 270         
          Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
                  275                 280                 285             
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 
              290                 295                 300                 
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 
                          325                 330                 335     
          Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
                      340                 345                 350         
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 
                  355                 360                 365             
          Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
              370                 375                 380                 
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
                          405                 410                 415     
          Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 
                      420                 425                 430         
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
                  435                 440                 445             
          Leu Ser Leu Ser Pro 
              450             
          <![CDATA[<210>  95]]>
          <![CDATA[<211>  453]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P035 IgG HC]]>
          <![CDATA[<400>  95]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr 
                      100                 105                 110         
          Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 
                  115                 120                 125             
          Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 
              130                 135                 140                 
          Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 
                          165                 170                 175     
          Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 
                      180                 185                 190         
          Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 
                  195                 200                 205             
          Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 
              210                 215                 220                 
          Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
                          245                 250                 255     
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
                      260                 265                 270         
          Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
                  275                 280                 285             
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 
              290                 295                 300                 
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 
                          325                 330                 335     
          Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
                      340                 345                 350         
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 
                  355                 360                 365             
          Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
              370                 375                 380                 
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
                          405                 410                 415     
          Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 
                      420                 425                 430         
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
                  435                 440                 445             
          Leu Ser Leu Ser Pro 
              450             
          <![CDATA[<210>  96]]>
          <![CDATA[<211>  216]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213]]>>  人工]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  CD3orig / P035]]&gt;<![CDATA[ IgG LC
          <![CDATA[<400>  96]]>
          Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 
                          85                  90                  95      
          Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Thr Val 
                      100                 105                 110         
          Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 
                  115                 120                 125             
          Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 
              130                 135                 140                 
          Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 
                          165                 170                 175     
          Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 
                      180                 185                 190         
          Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 
                  195                 200                 205             
          Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
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Figure 12_A0101_SEQ_0018
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Figure 12_A0101_SEQ_0020
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Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
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Figure 12_A0101_SEQ_0040
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Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
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Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
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Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
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Figure 12_A0101_SEQ_0068
Figure 12_A0101_SEQ_0069
Figure 12_A0101_SEQ_0070
Figure 12_A0101_SEQ_0071
Figure 12_A0101_SEQ_0072
Figure 12_A0101_SEQ_0073
Figure 12_A0101_SEQ_0074
Figure 12_A0101_SEQ_0075
Figure 12_A0101_SEQ_0076
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Figure 12_A0101_SEQ_0083
Figure 12_A0101_SEQ_0084
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Figure 12_A0101_SEQ_0091
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Figure 12_A0101_SEQ_0100
Figure 12_A0101_SEQ_0101
Figure 12_A0101_SEQ_0102

Claims (29)

  1. 一種結合至人類 HLA-G 之抗體，其包含 (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列。
  2. 如請求項 1 之抗體，其中該抗體 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列。
  3. 如請求項 1 或 2 之抗體，其中該抗體包含人類來源之 Fc 域。
  4. 如請求項3之抗體，其中該人類來源之Fc域為IgG同型。
  5. 如請求項4之抗體，其中該IgG同型為IgG1同型。
  6. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含人類來源之恆定區，該恆定區包含人類 CH1、CH2、CH3 及/或 CL 域。
  7. 如請求項6之抗體，其中該人類來源之恆定區為IgG同型。
  8. 如請求項7之抗體，其中該IgG同型為IgG1同型。
  9. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體 a) 不與經修飾的人類 HLA-G ß2M MHC I 複合物交叉反應，其中 HLA-G 特異性胺基酸已被 HLA-A 共同胺基酸替換，該複合物包含 SEQ ID NO: 40；及/或 b) 不與包含 SEQ ID NO: 41 之小鼠 H2Kd ß2M MHC I 複合物交叉反應；及/或 c) 不與包含 SEQ ID NO: 43 之大鼠 RT1A ß2M MHC I 複合物交叉反應。
  10. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體 a) 抑制 ILT2 結合至 JEG3 細胞上表現之 HLA-G (ATCC 編號 HTB36)；或 b) 結合至 JEG3 細胞上表現之 HLA-G (ATCC 編號 HTB36)，及抑制 ILT2 結合至 JEG-3 細胞上表現之 HLA-G (ATCC 編號 HTB36)。
  11. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體為多特異性抗體。
  12. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 之雙特異性抗體。
  13. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體為結合至人類 HLA-G 及結合至人類 CD3 之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含結合至人類 HLA-G 之第一抗原結合部分及結合至人類 CD3 之第二抗原結合部分， 其中該結合至人類 HLA-G 之第一抗原結合部分包含 (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 2 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 25 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 5 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 6 之胺基酸序列， 且其中該結合至人類 CD3 之第二抗原結合部分包含 A) (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 52 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 53 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 54 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 55 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 56 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 57 之胺基酸序列，或 B)   (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 60 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 61 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 62 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 63 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 64 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 65 之胺基酸序列，或 C)   (a) VH 域，其包含 (i) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 68 之胺基酸序列、(ii) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 69 之胺基酸序列及 (iii) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 70 之胺基酸序列；以及 (b) VL 域，其包含 (i) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 71 之胺基酸序列、(ii) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 72 之胺基酸序列及 (iii) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 73 之胺基酸序列。
  14. 如請求項13之抗體， 其中該第一抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列， 且其中該第二抗原結合部分 A) 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列；或 B)   包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列；或 C)   包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。
  15. 如請求項14之抗體， 其中該第一抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列； 且其中該第二抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 58 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 59 之胺基酸序列。
  16. 如請求項14之抗體， 其中該第一抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列； 且其中該第二抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 66 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 67 之胺基酸序列。
  17. 如請求項14之抗體， 其中該第一抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 7 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 26 之胺基酸序列； 且其中該第二抗原結合部分 包含：VH 域，其包含 SEQ ID NO: 74 之胺基酸序列；及 VL 域，其包含 SEQ ID NO: 75 之胺基酸序列。
  18. 如請求項13之抗體，其中該雙特異性抗體顯示出 a)  對 ILT2 及/或 ILT4 結合至 HLA-G 之抑制；及/或 b)  藉由經重組 HLA-G 轉染的 SKOV3 細胞 (SKOV3 HLA-G) 上及/或表現內源性 HLA-G 的 JEG3 細胞上之 T 細胞的抗體介導的 IFN γ 分泌，其中檢測到該 IFN γ 分泌；及/或 c)  在經重組 HLA-G 轉染的 SKOV3 細胞 (SKOV 3HLA-G) 上及/或表現內源性 HLA-G 的 JEG3 細胞上之 T 細胞介導的細胞毒性/腫瘤細胞毒殺，其中在用該雙特異性抗體治療後藉由測量細胞中的凋亡蛋白酶 8 活化檢測到該細胞毒性；及/或 d) 在帶有經重組 HLA-G 轉染的 SKOV3 人類卵巢癌 (SKOV3 HLA-G) 人源化 NSG 小鼠中之活體內抗腫瘤效力/腫瘤消退；及/或 e)  在帶有人類乳癌 PDX 腫瘤 (BC004) 之人源化 NSG 小鼠中 HLA-G CD3 T 細胞雙特異性之活體內抗腫瘤效力。
  19. 一種分離之核酸，其編碼如請求項1至18中任一項之抗體。
  20. 一種宿主細胞，其包含如請求項19之核酸。
  21. 如請求項20之宿主細胞，其為真核宿主細胞。
  22. 一種產生如請求項1至18中任一項之抗體之方法，該方法包含培養如請求項20或21之宿主細胞，從而產生該抗體。
  23. 如請求項22之方法，其進一步包含自該宿主細胞回收該抗體。
  24. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體在真核宿主細胞中產生。
  25. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至18中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
  26. 如請求項1或2之抗體，其用為藥物。
  27. 如請求項1或2之抗體，其用於治療癌症。
  28. 一種如請求項1至18中任一項之抗體在製造藥物中之用途。
  29. 如請求項28之用途，其中該藥物係用於治療癌症。
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