TW202116806A - 結合nkg2d之抗體 - Google Patents

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勞福 荷斯
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Abstract

本發明大體上係關於結合NKG2D之抗體，包括例如用於活化T細胞及/或NK細胞之多特異性抗原結合分子。另外，本發明係關於編碼此類抗體之聚核苷酸，以及包含此類聚核苷酸之載體及宿主細胞。本發明進一步係關於產生該等抗體之方法，及使用該等抗體治療疾病之方法。

Description

結合NKG2D之抗體
本發明大體上係關於結合NKG2D之抗體，包括例如用於活化T細胞及/或NK細胞之多特異性抗原結合分子。另外，本發明係關於編碼此類抗體之聚核苷酸，以及包含此類聚核苷酸之載體及宿主細胞。本發明進一步係關於用於產生該等抗體之方法，及使用該等抗體治療疾病之方法。
癌症免疫療法為極其活躍之研究領域，且癌症免疫療法現用於治療許多不同類型之癌症。儘管用免疫檢查點抑制劑獲得了有前景的臨床結果，但仍僅有較低百分比之患者對此等新穎療法有反應。此顯然證實了對超出檢查點抑制以外活化免疫系統以改良較大數目之癌症晚期患者的臨床益處之新穎的不同治療方法之高需求。
NKG2D為1991年首次描述的表現於細胞毒性效應細胞上之活化受體(Houchnins等人(1991) J Exp Med 173, 1017-1020)。其在細胞質尾區中不具有自身信號傳導基元，但經由帶電胺基酸與10 kDa之轉接蛋白質DNAX活化蛋白(DAP10)結合。DAP10具有在其酪胺酸殘基處磷酸化之後募集磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)，最終引起NK細胞之活化、細胞毒性及CD8 T細胞共刺激的細胞質YxxM基元。NKG2D組成性表現於幾乎所有NK細胞、CD8 T細胞、γδ T細胞及NKT細胞亞群上，但不表現於正常組織中(Bauer等人(1999) Science 285, 727-729)。NKG2D表現可藉由不同細胞因子調節；IL-2及IL-15誘導上調，而TGFβ及L-21顯示下調NKG2D。亦可在腫瘤浸潤性淋巴細胞NKG2D上偵測到。
NKG2D經由NKG2D配體(NKG2DL)之上調充當經轉型細胞之感測器。許多病毒及腫瘤已產生避免經由NKG2D感測的機制，表明此受體在腫瘤及病毒感染之免疫監視中起到重要作用且使其成為癌症免疫療法之引人注目的目標。
Kwong等人已報導具有雙重拮抗及促效活性之抗NKG2D抗體KYK-2.0 (Kwong 等人(2008) J Mol Biol 384, 1143-1156；WO 2010/017103)。來源於該抗體之雙特異性抗體已報導於WO 2016/134371中。靶向NKG2D、CD16及腫瘤相關抗原之三特異性抗體已報導於例如WO 2018/148445中。
然而，仍需要具有改良功效及/或安全性的例如用於癌症免疫療法中道靶向NKG2D之抗體。
本發明提供新穎抗體，包括雙特異性抗體，其結合NKG2D且具有用於治療目的之尤其有利之特性。
本發明人已研發出具有出人意料之改良特性的新穎抗體，其結合NKG2D。舉例而言，該抗體以高親和力結合NKG2D (人類及食蟹獼猴兩者)，且具體而言，在表現NKG2D之免疫細胞上顯示結合以及促效活性(亦即，活化或共刺激)。本發明亦涵蓋多特異性抗原結合分子，其結合NKG2D及第二抗原，從而併入新穎NKG2D抗體且將良好功效及可製造性與低毒性及有利藥物動力學特性進行組合。此等(多特異性)抗體可用於治療目的，尤其用於癌症療法，具體而言癌症免疫療法中。重要的是，本發明之(多特異性)抗體尤其適合於與其他免疫治療劑，諸如T細胞活化劑組合。
在第一態樣中，本發明提供一種結合NKG2D之抗體，其中該抗體包含第一抗原結合域，其包含： (i)       包含SEQ ID NO: 73之重鏈互補決定區(HCDR) 1、選自由SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104及SEQ ID NO: 105組成之群的HCDR 2以及SEQ ID NO: 75之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 76之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 77之LCDR 2及SEQ ID NO: 78之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； (ii)      包含SEQ ID NO: 65之HCDR 1、SEQ ID NO: 66之HCDR 2及SEQ ID NO: 67之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 68之LCDR 1、SEQ ID NO: 69之LCDR 2及SEQ ID NO: 70之LCDR 3的VL； (iii)    包含SEQ ID NO: 1之HCDR 1、SEQ ID NO: 2之HCDR 2及SEQ ID NO: 3之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 4之LCDR 1、SEQ ID NO: 5之LCDR 2及SEQ ID NO: 6之LCDR 3的VL； (iv)   包含SEQ ID NO: 25之HCDR 1、SEQ ID NO: 26之HCDR 2及SEQ ID NO: 27之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 28之LCDR 1、SEQ ID NO: 29之LCDR 2及SEQ ID NO: 30之LCDR 3的VL； (iv)     包含SEQ ID NO: 49之HCDR 1、SEQ ID NO: 50之HCDR 2及SEQ ID NO: 51之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 52之LCDR 1、SEQ ID NO: 53之LCDR 2及SEQ ID NO: 54之LCDR 3的VL； (v)      包含SEQ ID NO: 57之HCDR 1、SEQ ID NO: 58之HCDR 2及SEQ ID NO: 59之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 60之LCDR 1、SEQ ID NO: 61之LCDR 2及SEQ ID NO: 62之LCDR 3的VL； (vi)     包含SEQ ID NO: 9之HCDR 1、SEQ ID NO: 10之HCDR 2及SEQ ID NO: 11之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 12之LCDR 1、SEQ ID NO: 13之LCDR 2及SEQ ID NO: 14之LCDR 3的VL； (vii)   包含SEQ ID NO: 17之HCDR 1、SEQ ID NO: 18之HCDR 2及SEQ ID NO: 19之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 20之LCDR 1、SEQ ID NO: 21之LCDR 2及SEQ ID NO: 22之LCDR 3的VL； (ix)   包含SEQ ID NO: 33之HCDR 1、SEQ ID NO: 34之HCDR 2及SEQ ID NO: 35之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 36之LCDR 1、SEQ ID NO: 37之LCDR 2及SEQ ID NO: 38之LCDR 3的VL；或 (x)    包含SEQ ID NO: 41之HCDR 1、SEQ ID NO: 42之HCDR 2及SEQ ID NO: 43之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 44之LCDR 1、SEQ ID NO: 45之LCDR 2及SEQ ID NO: 46之LCDR 3的VL。
在一個態樣中，本發明提供一種結合NKG2D之抗體，其中該抗體包含第一抗原結合域，其包含： (i)       包含與選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 80之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (ii)      包含與SEQ ID NO: 71之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 72之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (iii)    包含與SEQ ID NO: 7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (iv)     包含與SEQ ID NO: 31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (v)      包含與SEQ ID NO: 55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 56之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (vi)     包含與SEQ ID NO: 63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (vii)   包含與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (viii) 包含與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (ix)   包含與SEQ ID NO: 39之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 40之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；或 (x)    包含與SEQ ID NO: 47之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 48之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在一個態樣中，該抗體為IgG抗體，特定言之IgG1 抗體。在一個實施例中，該抗體為全長抗體。在另一態樣中，該抗體為選自以下之群的抗體片段：Fv分子、scFv分子、Fab分子及F(ab')2 分子。
在一個態樣中，該抗體為多特異性抗體，特定言之雙特異性抗體。在一個態樣中，該抗體包含結合第二抗原之第二抗原結合域。在一個態樣中，該第二抗原為目標細胞抗原，特定言之腫瘤細胞抗原。
在一個態樣中，該抗體包含由第一亞單元及第二亞單元構成之Fc域。在一個態樣中，該Fc域為IgG Fc域，特定言之IgG1 Fc域。在一個態樣中，該Fc域為人類Fc域。在一個態樣中，該Fc域包含一或多個降低Fc受體結合及/或效應功能之胺基酸取代。在一個態樣中，該抗體不結合FcγRIIIa (CD16a)。
在一個態樣中，該第一抗原結合域及/或該第二抗原結合域為Fab分子。
在一些態樣中，該第一抗原結合域為Fab分子，其中該Fab輕鏈及該Fab重鏈之該等可變域VL及VH或該等恆定域CL及CH1，尤其該等可變域VL及VH係相互置換。在一個此類態樣中，第二抗原結合域為習知Fab分子。在另一此類態樣中，該第二抗原結合域為Fab分子，其中在該恆定域CL中，位置124處之胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且位置處123之胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在該恆定域CH1中，位置147處之胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在替代性態樣中，該第二抗原結合域為Fab分子，其中該Fab輕鏈及該Fab重鏈之該等可變域VL及VH或該等恆定域CL及CH1，尤其該等可變域VL及VH係相互置換。在一個此類態樣中，該第一抗原結合域為習知Fab分子。在另一此類態樣中，該第一抗原結合域為Fab分子，其中在該恆定域CL中，位置124處之該胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之該胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在該恆定域CH1中，位置147處之該胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之該胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個態樣中，該第一抗原結合域及該第二抗原結合域各自為Fab分子，且該抗體包含由第一亞單元及第二亞單元構成之Fc域；且(i)該第一抗原結合域在該Fab重鏈之C端與該Fc域之該第一亞單元之N端融合且該第二抗原結合域在該Fab重鏈之該C端與該Fc域之該第二亞單元之N端融合，或(ii)該第二抗原結合域在該Fab重鏈之該C端與該Fc域之該第一亞單元之該N端融合且該第一抗原結合域在該Fab重鏈之該C端與該Fc域之該第二亞單元之該N端融合。
在一個態樣中，該Fc域包含促進該Fc域之該第一亞單元與該第二亞單元結合的修飾。在一個態樣中，該Fc域之該第一亞單元之CH3域中的一胺基酸殘基係經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在第一亞單元之該CH3域內產生隆凸，其可位於該第二亞單元之CH3域內的凹穴中，且該Fc域之該第二亞單元之該CH3域中的一胺基酸殘基係經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在該第二亞單元之該CH3域內產生凹穴，該第一亞單元之該CH3域內的該隆凸可位於該凹穴內。
根據本發明之另一態樣，提供一種編碼本發明抗體的經分離聚核苷酸及一種包含本發明之經分離聚核苷酸的宿主細胞。在另一態樣中，提供一種產生結合NKG2D之抗體的方法，其包含以下步驟：(a)在適合該抗體表現之條件下培養本發明之宿主細胞，及視情況(b)回收該抗體。本發明亦涵蓋一種結合NKG2D之抗體，其係藉由本發明方法產生。
本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含本發明抗體及醫藥學上可接受之載劑。
本發明亦涵蓋使用本發明抗體及醫藥組合物的方法。在一個態樣中，本發明提供一種根據本發明之抗體或醫藥組合物，其用作藥物。在一個態樣中，提供一種根據本發明之抗體或醫藥組合物，其用於治療疾病。在一特定態樣中，該疾病為癌症。在一特定態樣中，與T細胞活化劑，諸如結合CD3之抗體，尤其結合CD3及目標細胞抗原(特定言之腫瘤細胞抗原)之雙特異性抗體組合進行使用。
亦提供根據本發明之抗體或醫藥組合物在製造藥物中的用途，根據本發明之抗體或醫藥組合物在製造治療疾病(特定言之癌症)之藥物中的用途。在一特定態樣中，與T細胞活化劑，諸如結合CD3之抗體，尤其結合CD3及目標細胞抗原(特定言之腫瘤細胞抗原)之雙特異性抗體組合進行治療。本發明亦提供一種治療個體之疾病(特定言之癌症)的方法，其包含向該個體投與有效量之根據本發明之抗體或醫藥組合物。在一特定態樣中，該方法進一步包含投與T細胞活化劑，諸如結合CD3之抗體，尤其結合CD3及目標細胞抗原(特定言之腫瘤細胞抗原)之雙特異性抗體。
I.   定義
除非下文中另有定義，否則術語在本文中的使用如此項技術一般所用。 如本文所用，術語「第一」、「第二」或「第三」與抗原結合域等相關時，係在存在的各類型部分超過一種時為了便於區分而使用。此等術語之使用並非旨在賦予該部分之特定次序或取向，除非明確如此陳述。
術語「抗NKG2D抗體」及「結合NKG2D之抗體」係指能夠以充足親和力結合NKG2D，使得抗體適用作靶向NKG2D之診斷劑及/或治療劑的抗體。在一個態樣中，抗NKG2D抗體與不相關非NKG2D蛋白之結合程度小於抗體與NKG2D之結合的約10%，如例如藉由表面電漿子共振(SPR)所量測。在某些態樣中，結合NKG2D之抗體具有≤ 1 μM、≤ 500 nM、≤ 200 nM或≤ 100 nM之解離常數(KD )。當抗體如例如藉由SPR所量測具有1 μM或更小之KD 時，稱抗體「特異性結合」NKG2D。在某些態樣中，抗NKG2D抗體結合在來自不同物種之NKG2D當中為保守性的NKG2D之抗原決定基。
反之，「不結合」某一抗原之抗體不能夠以充足親和力結合所述抗原而使得抗體適用作靶向所述抗原之診斷劑及/或治療劑。在某些態樣中，不結合某一抗原之抗體與所述抗原之解離常數(KD )為＞ 1 μM。
本文中之術語「抗體」係以最廣泛含義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含完整抗體之一部分，結合完整抗體所結合之抗原。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scFv及scFab)、單域抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。關於某些抗體片段之綜述，參見Hollinger及Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用，其係指結構與原生抗體結構實質上類似的抗體。 如本文所用之術語「單株抗體」係指獲自實質上同質之抗體群體的抗體，亦即，除可能之變異抗體，例如含有天然存在之突變或在單株抗體製劑產生期間出現的變異抗體之外，該群體中所包含之個別抗體為完全相同的及/或結合相同抗原決定基，此類變異體一般以少量存在。相比於典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑，單株抗體製劑中之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」指示抗體之特徵係自實質上同質之抗體群體獲得，且不應視為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法，此類方法及其他用於製得單株抗體之例示性方法皆描述於本文中。
「經分離」抗體為已自其天然環境之組分分離的抗體。在一些態樣中，抗體經純化至大於95%或99%之純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細電泳法)或層析(例如離子交換或逆相HPLC、親和力層析、尺寸排阻層析)方法所測定。用於評估抗體純度之方法的綜述參見例如Flatman等人,J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。在一些態樣中，本發明提供之抗體為經分離抗體。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，同時重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同來源或物種之抗體。
「人類化」抗體係指包含來自非人類CDR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些態樣中，人類化抗體將包含實質上全部至少一個且通常兩個可變域，其中全部或實質上全部CDR對應於非人類抗體之CDR，且全部或實質上全部FR對應於人類抗體之FR。此類可變域在本文中稱為「人類化可變區」。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。在一些態樣中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，CDR殘基所來源於之抗體)之對應殘基取代，例如以恢復或改良抗體特異性或親和力。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已經受人類化之抗體。
「人類抗體」為胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體的胺基酸序列之抗體。人類抗體之此定義特定地排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。在某些態樣中，人類抗體來源於非人類轉殖基因哺乳動物，例如小鼠、大鼠或兔。在某些態樣中，人類抗體來源於融合瘤細胞株。自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段在本文中亦視為人類抗體或人類抗體片段。
術語「抗原結合域」係指抗體中包含結合抗原之一部分或全部且與之互補的區域的部分。抗原結合域可由例如一或多個抗體可變域(亦稱為抗體可變區)提供。在較佳態樣中，抗原結合域包含抗體輕鏈可變域(VL)及抗體重鏈可變域(VH)。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原之結合的域。原生抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別為VH及VL)一般具有類似結構，其中各域包含四個保守性構架區(FR)及互補決定區(CDR)。參見例如Kindt等人,Kuby Immunology ,第6版, W.H. Freeman & Co.,第91頁 (2007)。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。此外，可使用來自結合抗原之抗體的VH或VL域分別篩選互補VL或VH域之文庫來分離結合特定抗原之抗體。參見例如Portolano等人,J. Immunol. 150 :880-887 (1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628 (1991)。如本文關於可變區序列所用，「Kabat編號」係指Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版.公共衛生署(Public Health Service), 美國國家衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991)所闡述之編號系統。
如本文所用，重鏈及輕鏈之所有恆定區及恆定域的胺基酸位置均根據Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版, 公共衛生署, 美國國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991)中所描述之Kabat編號系統進行編號，在本文中稱為「根據Kabat編號」或「Kabat編號」。具體而言，κ及λ同型之輕鏈恆定域CL使用Kabat編號系統(參見Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版, 公共衛生署, 美國國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991)之第647-660頁)，且重鏈恆定域(CH1、鉸鏈、CH2及CH3)使用Kabat EU索引編號系統(參見第661-723頁)，在此情況下，在本文中藉由提及「根據Kabat EU索引編號」或「Kabat EU索引編號」來進一步闡明。
如本文所用之術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中的序列高變且決定抗原結合特異性之區(例如「互補決定區」(「CDR」))中之每一者。一般而言，抗體包含六個CDR；VH中三個(HCDR1、HCDR2、HCDR3)且VL中三個(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。本文之例示性CDR包括： (a)    出現在胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處之高變環(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987))； (b)    出現在胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)處之CDR (Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest ,第5版.公共衛生署, 美國國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991))；及 (c)    出現在胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)及93-101 (H3)處之抗原接點(MacCallum等人， J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))。
除非另有指示，否則CDR根據Kabat等人(見上文)確定。熟習此項技術者將理解，CDR名稱亦可根據Chothia (見上文)、McCallum (見上文)或任何其他科學上可接受的命名法系統確定。
「構架」或「FR」係指除互補決定區(CDR)以外的可變域殘基。可變域之FR通常由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列一般按以下次序出現在VH (或VL)中：FR1-HCDR1 (LCDR1)-FR2-HCDR2(LCDR2)-FR3-HCDR3(LCDR3)-FR4。
除非另有指示，否則本文中根據Kabat等人(見上文)對可變域中之CDR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)進行編號。
出於本文之目的，「接受體人類構架」為包含來源於如以下所定義之人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「來源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含與其相同的胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些態樣中，胺基酸變化之數目為10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小，或2或更小。在一些態樣中，VL接受體人類構架與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列在序列上一致。
「人類共同構架」為表示所選人類免疫球蛋白VL或VH構架序列中最常出現之胺基酸殘基的構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之子群。一般而言，序列子群為如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest ,第五版, NIH出版物91-3242, Bethesda MD (1991), 第1至3卷中之子群。
本文中之術語「免疫球蛋白分子」係指具有天然存在之抗體之結構的蛋白質。舉例而言，IgG類之免疫球蛋白為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚體糖蛋白，其由二硫鍵鍵結之兩個輕鏈及兩個重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變域(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變區；後接三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變域(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變區，隨後為恆定輕鏈(CL)域，亦稱為輕鏈恆定區。免疫球蛋白之重鏈可歸為五種類型之一，該五種類型稱為α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG)或μ (IgM)，其中一些可進一步劃分成亞型，例如γ1 (IgG1 )、γ2 (IgG2 )、γ3 (IgG3 )、γ4 (IgG4 )、α1 (IgA1 )及α2 (IgA2 )。免疫球蛋白之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型之一，該兩種類型稱為卡帕(kappa；κ)及拉姆達(lambda；λ)。免疫球蛋白基本上由經由免疫球蛋白鉸鏈區連接之兩個Fab分子及一個Fc域組成。
抗體或免疫球蛋白之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。抗體存在五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干者可進一步劃分成子類(同型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
「Fab分子」係指由免疫球蛋白之重鏈(「Fab重鏈」)之VH及CH1域以及輕鏈(「Fab輕鏈」)之VL及CL域組成的蛋白質。
「互換型(crossover)」Fab分子(亦稱為「Crossfab」)意謂Fab重鏈及輕鏈之可變域或恆定域交換(亦即相互置換)的Fab分子，亦即互換型Fab分子包含由輕鏈可變域VL及重鏈恆定域1 CH1構成之肽鏈(VL-CH1，在N端至C端方向上)及由重鏈可變域VH及輕鏈恆定域CL構成之肽鏈(VH-CL，在N端至C端方向上)。為了清楚起見，在Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域交換的互換型Fab分子中，包含重鏈恆定域1 CH1之肽鏈在本文中稱為(互換型) Fab分子之「重鏈」。反之，在Fab輕鏈與Fab重鏈之恆定域交換的互換型Fab分子中，包含重鏈可變域VH的肽鏈在本文中稱為(互換型) Fab分子之「重鏈」。
與此相反，「習知」Fab分子意謂呈其天然型式之Fab分子，亦即包含由重鏈可變域及恆定域構成之重鏈(VH-CH1，在N端至C端方向上)及由輕鏈可變域及恆定域構成之輕鏈(VL-CL，在N端至C端方向上)。
本文中之術語「Fc域」或「Fc區」用於定義含有恆定區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈之C端區。該術語包括原生序列Fc區及變異Fc區。在一個態樣中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，宿主細胞所產生之抗體可能在重鏈C端經歷一或多個(特定言之，一或兩個)胺基酸之轉譯後裂解。因此，宿主細胞藉由表現編碼全長重鏈之特定核酸分子產生的抗體可包括全長重鏈，或其可包括全長重鏈之裂解變異體。在重鏈之最末兩個C端胺基酸為甘胺酸(G446)及離胺酸(K447，根據Kabat EU索引編號)的情況下，情況可為如此。因此，Fc區之C端離胺酸(Lys447)或C端甘胺酸(Gly446)及離胺酸(Lys447)可能存在或可能不存在。若另外無指示，則包括Fc區(或如本文所定義之Fc域之亞單元)之重鏈的胺基酸序列在本文中表示為不具有C端甘胺酸-離胺酸二肽。在一個態樣中，包含於根據本發明之抗體中的包括如本文中所指定之Fc區(亞單元)的重鏈包含額外C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。在一個態樣中，包含於根據本發明之抗體中的包括如本文中所指定之Fc區(亞單元)的重鏈包含額外C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)。除非本文另有說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest ,第5版,公共衛生署,美國國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991)(亦參見上文)中所描述。如本文所用之Fc域之「亞單元」係指形成二聚Fc域之兩個多肽中之一者，亦即包含免疫球蛋白重鏈之C端恆定區的多肽，其能夠穩定自結合。舉例而言，IgG Fc域之亞單元包含IgG CH2及IgG CH3恆定域。
「融合」意謂組分(例如Fab分子及Fc域亞單元)藉由肽鍵、直接或經由一或多個肽連接子連接。
術語「多特異性」意謂抗體能夠特異性結合至少兩種不同的抗原決定子。多特異性抗體可為例如雙特異性抗體。通常，雙特異性抗體包含兩個抗原結合位點，其各自對不同抗原決定子具有特異性。在某些態樣中，多特異性(例如雙特異性)抗體能夠同時結合兩個抗原決定子，特定言之在兩個不同細胞上表現之兩個抗原決定子。
如本文所用之術語「價」表示抗原結合分子中存在指定數目個抗原結合位點。因而，術語「單價結合抗原」表示抗原結合分子中存在一個(且不超過一個)對該抗原具有特異性之抗原結合位點。
「抗原結合位點」係指提供與抗原之相互作用的抗原結合分子之位點，亦即一或多個胺基酸殘基。舉例而言，抗體之抗原結合位點包含來自互補決定區(CDR)之胺基酸殘基。原生免疫球蛋白分子通常具有兩個抗原結合位點，Fab分子通常具有單個抗原結合位點。
如本文所用，術語「抗原決定子」或「抗原」係指多肽大分子上與抗原結合域結合形成抗原結合域-抗原複合物之位點(例如胺基酸之連續延伸部或由非連續胺基酸之不同區構成的構形組態。適用的抗原決定子可發現於例如腫瘤細胞表面上、病毒所感染細胞之表面上、其他病變細胞表面上、免疫細胞表面上、游離於血清中及/或細胞外基質(ECM)中。在較佳態樣中，抗原為人類蛋白。
除非另有指示，否則「NKG2D」係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))的任何原生NKG2D。該術語涵蓋「全長」未經處理NKG2D以及由細胞中之處理產生的NKG2D之任何形式。該術語亦涵蓋天然存在之NKG2D之變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一個態樣中，NKG2D為人類NKG2D，特定言之人類NKG2D之細胞外域(ECD)。人類NKG2D之胺基酸序列及其ECD分別展示於SEQ ID NO: 87及SEQ ID NO: 88中。亦參見UniProt (www.uniprot.org)條目P26718 (版本176)。在另一態樣中，NKG2D為食蟹獼猴(長尾獼猴) NKG2D，特定言之食蟹獼猴NKG2D之ECD。食蟹獼猴NKG2D之胺基酸序列及其ECD分別展示於SEQ ID NO: 89及SEQ ID NO: 90中。亦參見UniProt條目P61252 (版本71)。在另一態樣中，NKG2D為鼠類(小家鼠) NKG2D，特定言之鼠類NKG2D之ECD。鼠類NKG2D之胺基酸序列及其ECD分別展示於SEQ ID NO: 91及SEQ ID NO: 92中。亦參見UniProt條目O54709 (版本151)。在某些態樣中，本發明抗體結合在來自不同物種之NKG2D抗原(特定言之人類及食蟹獼猴NKG2D)當中為保守性的NKG2D之抗原決定基。在較佳態樣中，抗體結合人類NKG2D。在一個態樣中，第一抗原結合域對人類及食蟹獼猴NKG2D具有交叉反應性(亦即結合人類及食蟹獼猴NKG2D)。
如本文所用之「目標細胞抗原」係指目標細胞(例如腫瘤細胞，諸如癌細胞或腫瘤基質細胞)表面上所呈遞的抗原決定子(在彼情況下為「腫瘤細胞抗原」)。較佳地，目標細胞抗原不為NKG2D，及/或表現於不同於NKG2D之細胞上。在一個態樣中，目標細胞抗原為CEA。
「CEA」代表癌胚抗原(亦稱為癌胚抗原相關細胞黏附分子5 (CEACAM5))。人類CEA之胺基酸序列展示於UniProt條目P06731 (版本188)中。除非另有指示，否則如本文所用之「CEA」係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))的任何原生CEA。該術語涵蓋「全長」的未經處理之CEA以及由細胞中之處理產生的CEA之任何形式。該術語亦涵蓋天然存在之CEA之變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一個態樣中，CEA為人類CEA。在一個態樣中，CEA為細胞膜結合CEA。在一個態樣中，CEA為表現於細胞(例如癌細胞)表面上之CEA。
「親和力」係指分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如，抗原)之間的非共價相互作用之總量的強度。除非另有指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間的1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(KD )表示。可藉由此項技術中已知之公認方法(包括本文所描述之該等方法)來量測親和力。用於量測親和力之較佳方法為表面電漿子共振(SPR)。
「親和力成熟」抗體係指一或多個互補決定區(CDR)相較於親本抗體具有一或多種變化的抗體，親本抗體不具有該等變化，此類變化引起抗體對抗原之親和力改良。
「減少之結合」(例如減少的Fc受體結合)係指相應相互作用的親和力降低，如藉由例如SPR所量測。為了清楚起見，該術語亦包括親和力降低至零(或低於分析方法之偵測極限)，亦即相互作用完全消除。反之，「增加之結合」係指相應相互作用的結合親和力增強。
如本文所用之「T細胞活化」係指T淋巴細胞(特定言之，細胞毒性T淋巴細胞)的一或多種細胞反應，選自：增殖、分化、細胞介素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒性活性及活化標記物表現。適於量測T細胞活化的分析在此項技術中已知且描述於本文中。
如本文所用之「T細胞活化劑」係指能夠例如藉由結合且活化諸如CD3之T細胞受體(之組分)來誘導T細胞活化的分子。因此，例示性T細胞活化劑可為結合CD3，特定言之CD3之ε亞單元之抗體。適用於本發明之特定T細胞活化劑為結合CD3及諸如腫瘤細胞抗原之目標細胞抗原的雙特異性抗體。此類T細胞活化雙特異性抗體在本文中亦稱作「T細胞雙特異性抗體」或「TCB」。
除非另有指示，否則「CD3」係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))的任何原生CD3。該術語涵蓋「全長」的未經處理之CD3以及由細胞中之處理產生的CD3之任何形式。該術語亦涵蓋天然存在之CD3之變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一個態樣中，CD3為人類CD3，特定言之人類CD3之ε亞單元(CD3ε)。人類CD3ε之胺基酸序列展示於UniProt (www.uniprot.org)條目P07766(版本202)中。在另一態樣中，CD3為食蟹獼猴(長尾獼猴) CD3，特定言之食蟹獼猴CD3ɛ。食蟹獼猴CD3ε之胺基酸序列展示於NCBI GenBank編號BAB71849.1中。在某些態樣中，適用於本發明之T細胞活化劑結合在來自不同物種之CD3抗原(特定言之人類及食蟹獼猴CD3)當中為保守性的CD3之抗原決定基。在較佳態樣中，T細胞活化劑結合人類CD3。
「促進Fc域之第一亞單元於第二亞單元結合的修飾」為肽主鏈之操縱或Fc域亞單元之轉譯後修飾，其減少或阻止包含Fc域亞單元之多肽與完全相同之多肽結合形成均二聚體。如本文所用之促進結合之修飾較佳地包括對期望結合之兩個Fc域亞單元(亦即，Fc域之第一亞單元及第二亞單元)中之每一者的單獨修飾，其中該等修飾彼此互補以便促進兩個Fc域亞單元之結合。舉例而言，促進結合的修飾可改變Fc域亞單元中之一或兩者的結構或電荷以便使其結合在空間上或在靜電上分別為有利的。因此，(雜)二聚化發生於包含第一Fc域亞單元之多肽與包含第二Fc域亞單元之多肽之間，在與亞單元中之每一者融合之其他組分(例如抗原結合域)不相同之意義上，該(雜)二聚化可能不同。在一些態樣中，促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的修飾包含Fc域中之胺基酸突變，具體而言胺基酸取代。在一較佳態樣中，促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的修飾包含Fc域之兩個亞單元中之每一者中的單獨胺基酸突變，具體而言胺基酸取代。
術語「效應功能」係指可歸於抗體之Fc區的彼等生物活性，其因抗體同型而異。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、細胞介素分泌、免疫複合物介導之抗原呈遞細胞之抗原攝入、細胞表面受體(例如B細胞受體)下調及B細胞活化。
「活化Fc受體」為一種Fc受體，其與抗體之Fc域接合之後，引發信號傳導事件，該等事件刺激攜帶受體之細胞執行效應功能。人類活化Fc受體包括FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)及FcαRI (CD89)。在一個態樣中，活化Fc受體為FcγRIIIa (CD16a)。包括其序列之人類FcγRIIIa (CD16a)描述於UniProt條目P08637 (版本203)中。
抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)為促使免疫效應細胞溶解抗體塗佈之目標細胞的免疫機制。目標細胞為包含Fc區之抗體或其衍生物特異性結合(一般經由Fc區的N端之蛋白質部分結合)的細胞。如本文所用，術語「降低之ADCC」定義為在圍繞目標細胞之介質中、在指定的抗體濃度下、在指定時間內藉由上文所定義之ADCC機制溶解之目標細胞的數目減少，及/或在圍繞目標細胞之介質中、在指定時間內藉由ADCC機制達成指定數目個目標細胞溶解所需的抗體濃度增加。ADCC之降低係相對於由同類型宿主細胞使用相同的標準生產、純化、調配及儲存方法(熟習此項技術者已知)所產生、但尚未經工程改造之相同抗體介導的ADCC而言。舉例而言，在其Fc域中包含降低ADCC之胺基酸取代的抗體所介導之ADCC降低係相對於Fc域中無此胺基酸取代之相同抗體所介導的ADCC而言。適於量測ADCC的分析為此項技術中熟知(參見例如PCT公開案第WO 2006/082515號或PCT公開案第WO 2012/130831號)。
如本文所用，術語「工程改造(engineer/engineered/engineering)」視為包括任何肽主鏈操縱或天然存在或重組多肽或其片段之轉譯後修飾。工程改造包括胺基酸序列、糖基化模式或個別胺基酸之側鏈基團之修飾，以及此等方法之組合。
如本文所用之術語「胺基酸突變」意欲涵蓋胺基酸取代、缺失、插入及修飾。取代、缺失、插入及修飾可進行任意組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵，例如與Fc受體的結合減少，或與另一肽的結合增加。胺基酸序列缺失及插入包括胺基酸之胺基端及/或羧基端缺失及插入。較佳胺基酸突變為胺基酸取代。出於改變例如Fc區之結合特徵之目的，尤佳的為非保守胺基酸取代，亦即用具有不同結構及/或化學特性之一個胺基酸置換另一胺基酸。胺基酸取代包括經非天然存在之胺基酸置換或經二十種標準胺基酸之天然存在之胺基酸衍生物(例如4-羥基脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥基離胺酸)置換。胺基酸突變可使用此項技術中熟知之遺傳學或化學方法產生。遺傳學方法可包括定點突變誘發、PCR、基因合成及類似方法。預期藉由除基因工程改造以外的諸如化學修飾之方法改變胺基酸側鏈基團的方法亦可為適用的。本文中可使用各種名稱指示相同的胺基酸突變。舉例而言，將Fc域之位置329處之脯胺酸取代為甘胺酸可指示為329G、G329、G329 、P329G或Pro329Gly。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入空位以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將任何保守取代視為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的的比對可以此項技術中之技能內的各種方式達成，例如使用公開可獲得的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign (DNASTAR)軟體或FASTA程式包。熟習此項技術者可測定適用於比對序列之參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。或者，可使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生一致性百分比值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.設計，且原始程式碼已在美國版權局(U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559與使用者文檔一起提交，其以美國版權註冊號TXU510087註冊且描述於WO 2001/007611中。
出於本文之目的，除非另有指示，否則胺基酸序列一致性%值係使用FASTA套裝36.3.8c版或更新版中之ggsearch程式，用BLOSUM50比較矩陣來產生。FASTA程式包的作者為W. R. Pearson及D. J. Lipman (「Improved Tools for Biological Sequence Analysis」，PNAS 85 (1988) 2444-2448)、W. R. Pearson (「Effective protein sequence comparison」 Meth. Enzymol. 266 (1996) 227-258及Pearson等人(Genomics 46 (1997) 24-36)，且公開獲自www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml或www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta。或者，可使用在fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi可獲取的公共伺服器來比較序列，使用ggsearch (全域蛋白質：蛋白質)程式及預設選項(BLOSUM50；開端：-10；ext：-2；Ktup = 2)以確保進行全域比對而非局域比對。胺基酸一致性百分比在輸出比對標題中給出。
術語「聚核苷酸」或「核酸分子」包括包含核苷酸聚合物之任何化合物及/或物質。各核苷酸由鹼基，具體而言嘌呤或嘧啶鹼基(亦即胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(亦即去氧核糖或核糖)及磷酸酯基構成。核酸分子通常用鹼基序列描述，因此該等鹼基表示核酸分子之一級結構(線性結構)。鹼基序列通常係自5'至3'表示。在本文中，術語核酸分子涵蓋去氧核糖核酸(DNA)，包括例如互補DNA (cDNA)及基因組DNA；核糖核酸(RNA)，詳言之信使RNA (mRNA)；DNA或RNA之合成形式；及包含兩個或更多個此等分子之混合聚合物。核酸分子可呈線性或環狀。另外，術語核酸分子包括有義股及反義股兩者，以及單股及雙股形式。此外，本文描述之核酸分子可含有天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸之實例包括具有衍生化糖或磷酸酯主鏈鍵聯或經化學修飾之殘基的經修飾核苷酸鹼基。核酸分子亦涵蓋DNA及RNA分子，其適用作活體外及/或活體內，例如在宿主或患者中直接表現本發明抗體的載體。此類DNA (例如cDNA)或RNA (例如mRNA)載體可未經修飾或經修飾。舉例而言，mRNA可經化學修飾以增強RNA載體之穩定性及/或所編碼分子之表現，使得可將mRNA注射至個體中以在活體內產生抗體(參見例如Stadler等人, (2017) Nature Medicine 23:815-817，或EP 2 101 823 B1)。
「經分離」核酸分子係指已自其天然環境之組分分離之核酸分子。經分離核酸分子包括通常含有核酸分子之細胞中所含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置處。
「編碼抗體之經分離聚核苷酸(或核酸)」係指一或多個編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之聚核苷酸分子，包括單一載體或單獨載體中之該等聚核苷酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置處之該等聚核苷酸分子。
如本文所用之術語「載體」係指能夠傳播至其所連接之另一核酸的核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入其已引入至之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能夠導引其可操作地連接之核酸的表現。此等載體在本文中稱為「表現載體」。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉型體」及「經轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及自其衍生之後代(不考慮繼代次數)。後代之核酸含量與親本細胞可能不完全相同，而是可能含有突變。本文包括針對原始轉型細胞篩選或選擇具有相同功能或生物活性之突變型後代。宿主細胞為可用以產生本發明抗體的任何類型之細胞系統。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如HEK細胞、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞(僅舉數例)，且亦包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或培養植物或動物組織內所包含的細胞。在一個態樣中，本發明之宿主細胞為真核生物細胞，特定言之哺乳動物細胞。在一個態樣中，宿主細胞不為人體內之細胞。
術語「醫藥組合物」或「醫藥調配物」係指呈准許其中所含活性成分之生物活性有效之形式且不含有對該組合物將投與之個體具有不可接受之毒性的額外組分的製劑。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥組合物或調配物中除活性成分以外之對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其文法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指嘗試改變所治療個體之疾病之自然過程的臨床介入且可出於預防或在臨床病理學過程中進行。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性結果、預防癌轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病病況及緩解或改良預後。在一些態樣中，本發明抗體用於延遲疾病發展或減慢疾病之進展。
「個體(individual/subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些態樣中，該個體為人類。
藥劑(例如醫藥組合物)之「有效量」係指在劑量上及對於所需時段有效以達成所需治療性或預防性結果的量。
術語「藥品說明書」用以指待慣常包括於治療性產品之商業包裝中的說明，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或警告的資訊。
II. 組合物及方法  本發明提供結合NKG2D之抗體，包括結合NKG2D及第二抗原之多特異性抗體。該等抗體顯示NKG2D上之優良結合及促效活性與關於治療應用(例如在功效及安全性、藥物動力學以及可製造性方面)之其他有利特性的組合。本發明抗體適用於例如治療諸如癌症之疾病。
本發明抗體尤其適用於例如與諸如T細胞雙特異性抗體(TCB)之T細胞活化劑組合(共)刺激細胞毒性T細胞。本發明抗體亦可有效地活化其他表現NKG2D之免疫細胞，諸如自然殺手(NK)細胞及γδ T細胞，甚至不需要經由諸如FcγRIIIa (CD16a)之活化Fc受體同步刺激。經由避免對Fc受體結合及活化功能之需求，咸信本發明抗體能夠實現高效免疫細胞活化，且全身性副作用之風險低於需要Fc受體結合及活化功能的NKG2D抗體。本發明抗體亦可呈多特異性型式使用，從而結合NKG2D及目標細胞抗原(例如腫瘤抗原)以達成靶向免疫細胞活化，但同樣不結合活化Fc受體(特定言之FcγRIIIa (CD16a))以降低全身性副作用之風險。
A.       抗NKG2D抗體  本發明提供結合NKG2D之抗體。
在第一態樣中，本發明提供一種結合NKG2D之抗體，其中該抗體包含第一抗原結合域，其包含： (i)       包含SEQ ID NO: 73之重鏈互補決定區(HCDR) 1、選自由SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104及SEQ ID NO: 105組成之群的HCDR 2以及SEQ ID NO: 75之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 76之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 77之LCDR 2及SEQ ID NO: 78之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； (ii)      包含SEQ ID NO: 65之HCDR 1、SEQ ID NO: 66之HCDR 2及SEQ ID NO: 67之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 68之LCDR 1、SEQ ID NO: 69之LCDR 2及SEQ ID NO: 70之LCDR 3的VL； (iii)    包含SEQ ID NO: 1之HCDR 1、SEQ ID NO: 2之HCDR 2及SEQ ID NO: 3之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 4之LCDR 1、SEQ ID NO: 5之LCDR 2及SEQ ID NO: 6之LCDR 3的VL； (iv)   包含SEQ ID NO: 25之HCDR 1、SEQ ID NO: 26之HCDR 2及SEQ ID NO: 27之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 28之LCDR 1、SEQ ID NO: 29之LCDR 2及SEQ ID NO: 30之LCDR 3的VL； (v)    包含SEQ ID NO: 49之HCDR 1、SEQ ID NO: 50之HCDR 2及SEQ ID NO: 51之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 52之LCDR 1、SEQ ID NO: 53之LCDR 2及SEQ ID NO: 54之LCDR 3的VL； (vi)   包含SEQ ID NO: 57之HCDR 1、SEQ ID NO: 58之HCDR 2及SEQ ID NO: 59之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 60之LCDR 1、SEQ ID NO: 61之LCDR 2及SEQ ID NO: 62之LCDR 3的VL； (vii)  包含SEQ ID NO: 9之HCDR 1、SEQ ID NO: 10之HCDR 2及SEQ ID NO: 11之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 12之LCDR 1、SEQ ID NO: 13之LCDR 2及SEQ ID NO: 14之LCDR 3的VL； (viii) 包含SEQ ID NO: 17之HCDR 1、SEQ ID NO: 18之HCDR 2及SEQ ID NO: 19之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 20之LCDR 1、SEQ ID NO: 21之LCDR 2及SEQ ID NO: 22之LCDR 3的VL； (ix)   包含SEQ ID NO: 33之HCDR 1、SEQ ID NO: 34之HCDR 2及SEQ ID NO: 35之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 36之LCDR 1、SEQ ID NO: 37之LCDR 2及SEQ ID NO: 38之LCDR 3的VL；或 (x)    包含SEQ ID NO: 41之HCDR 1、SEQ ID NO: 42之HCDR 2及SEQ ID NO: 43之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 44之LCDR 1、SEQ ID NO: 45之LCDR 2及SEQ ID NO: 46之LCDR 3的VL。
在一個態樣中，本發明提供一種結合NKG2D之抗體，其中該抗體包含第一抗原結合域，其包含： (i)       包含與選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 80之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (ii)      包含與SEQ ID NO: 71之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 72之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (iii)    包含與SEQ ID NO: 7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (iv)   包含與SEQ ID NO: 31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (v)    包含與SEQ ID NO: 55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 56之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (vi)   包含與SEQ ID NO: 63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (vii)  包含與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (ix)     包含與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (ix)   包含與SEQ ID NO: 39之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 40之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；或 (x)    包含與SEQ ID NO: 47之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 48之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在一個態樣中，抗體包含第一抗原結合域，其包含： 包含SEQ ID NO: 73之重鏈互補決定區(HCDR) 1、選自由SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104及SEQ ID NO: 105組成之群的HCDR 2及SEQ ID NO: 75之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 76之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 77之LCDR 2及SEQ ID NO: 78之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)。
在一個態樣中，抗體包含第一抗原結合域，其包含： 包含SEQ ID NO: 73之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 74之HCDR 2及SEQ ID NO: 75之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 76之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 77之LCDR 2及SEQ ID NO: 78之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)。
在一個態樣中，抗體包含第一抗原結合域，其包含： 包含SEQ ID NO: 73之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 102之HCDR 2及SEQ ID NO: 75之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 76之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 77之LCDR 2及SEQ ID NO: 78之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)。
在一特定態樣中抗體包含第一抗原結合域，其包含： 包含SEQ ID NO: 73之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 104之HCDR 2及SEQ ID NO: 75之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 76之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 77之LCDR 2及SEQ ID NO: 78之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)。
在一個態樣中，抗體為人類化抗體。在一個態樣中，抗原結合域為人類化抗原結合域(亦即，人類化抗體之抗原結合域)。在一個態樣中，VH及/或VL為人類化可變區。在一個態樣中，VH為人類化可變區，且VL為人類可變區。
在一個態樣中，VH及/或VL包含接受體人類構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。
在一個態樣中，VH包含以下重鏈可變區序列之一或多個重鏈構架序列(亦即，FR1、FR2、FR3及/或FR4序列)：選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的重鏈可變區序列，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的重鏈可變區序列，最特定言之SEQ ID NO: 112之重鏈可變區序列。在一個態樣中，VH包含與以下胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列：選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，最特定言之SEQ ID NO: 112之胺基酸序列。在一個態樣中，VH包含與以下胺基酸序列至少約95%一致之胺基酸序列：選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，最特定言之SEQ ID NO: 112之胺基酸序列。在一個態樣中，VH包含與以下胺基酸序列至少約98%一致之胺基酸序列：選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，最特定言之SEQ ID NO: 112之胺基酸序列。在某些態樣中，具有至少95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗體保留結合NKG2D之能力。在某些態樣中，在以下胺基酸序列中，總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失：選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，最特定言之SEQ ID NO: 112之胺基酸序列。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在CDR外部之區域中(亦即在FR中)。在一個態樣中，VH包含選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，最特定言之SEQ ID NO: 112之胺基酸序列。視情況，VH包含以下胺基酸序列：選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，最特定言之SEQ ID NO: 112之胺基酸序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個態樣中，VL包含SEQ ID NO: 80之輕鏈可變區序列之一或多個輕鏈構架序列(亦即，FR1、FR2、FR3及/或FR4序列)。在一個態樣中，VL包含與SEQ ID NO: 80之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VL包含與SEQ ID NO: 80之胺基酸序列至少約95%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VL包含與SEQ ID NO: 80之胺基酸序列至少約98%一致的胺基酸序列。在某些態樣中，具有至少95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗體保留結合NKG2D之能力。在某些態樣中，在SEQ ID NO: 80之胺基酸序列中，總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在CDR外部之區域中(亦即在FR中)。在一個態樣中，VL包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列。視情況，VL包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個態樣中，VH包含與以下胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列：選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，最特定言之SEQ ID NO:112之胺基酸序列；且VL包含與SEQ ID NO: 80之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VH包含選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，最特定言之SEQ ID NO:112之胺基酸序列；且VL包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種結合NKG2D之抗體，其中抗體包含第一抗原結合域，其包含：包含選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列，最特定言之SEQ ID NO:112之胺基酸序列的VH；及包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列的VL。
在另一態樣中，本發明提供一種結合NKG2D之抗體，其中抗體包含第一抗原結合域，其包含：選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH序列，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH序列，最特定言之SEQ ID NO:112之VH序列；及SEQ ID NO: 80之VL序列。
在另一態樣中，本發明提供一種結合NKG2D之抗體，其中抗體包含第一抗原結合域，其包含VH及VL，該VH包含選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH，最特定言之SEQ ID NO: 112之VH的重鏈CDR序列；該VL包含SEQ ID NO: 80之VL之輕鏈CDR序列。
在另一態樣中，第一抗原結合域包含：以下VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列：選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH，最特定言之SEQ ID NO: 112之VH；以及SEQ ID NO: 11之VL的LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列。
在一個態樣中，VH包含：以下VH之重鏈CDR序列：選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH，最特定言之SEQ ID NO: 112之VH；以及與以下VH之構架序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的構架：選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH，最特定言之SEQ ID NO: 112之VH。在一個態樣中，VH包含：以下VH之重鏈CDR序列：選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH，最特定言之SEQ ID NO: 112之VH；以及與以下VH之構架序列具有至少95%序列一致性的構架：選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH，最特定言之SEQ ID NO: 112之VH。在另一態樣中，VH包含：以下VH之重鏈CDR序列：選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH，最特定言之SEQ ID NO: 112之VH；以及與以下VH之構架序列具有至少98%序列一致性的構架：選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH，更特定言之選自由SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的VH，更特定言之SEQ ID NO: 112之VH。
在一個態樣中，VL包含SEQ ID NO: 80之VL之輕鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 80之VL之構架序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的構架。在一個態樣中，VL包含SEQ ID NO: 80之VL之輕鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 80之VL之構架序列具有至少95%序列一致性的構架。在另一態樣中，VL包含SEQ ID NO: 80之VL之輕鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 80之VL之構架序列具有至少98%序列一致性的構架。
在一個態樣中，抗體包含第一抗原結合域，其包含： 包含SEQ ID NO: 65之HCDR 1、SEQ ID NO: 66之HCDR 2及SEQ ID NO: 67之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 68之LCDR 1、SEQ ID NO: 69之LCDR 2及SEQ ID NO: 70之LCDR 3的VL。
在一個態樣中，抗體為人類抗體。在一個態樣中，抗原結合域為人類抗原結合域(亦即，人類抗體之抗原結合域)。在一個態樣中，VH及/或VL為人類可變區。
在一個態樣中，VH及/或VL包含人類構架，例如人類免疫球蛋白構架。
在一個態樣中，VH包含SEQ ID NO: 71之重鏈可變區序列之一或多個重鏈構架序列(亦即，FR1、FR2、FR3及/或FR4序列)。在一個態樣中，VH包含與SEQ ID NO: 71之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VH包含與SEQ ID NO: 71之胺基酸序列至少約95%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VH包含與SEQ ID NO: 71之胺基酸序列至少約98%一致的胺基酸序列。在某些態樣中，具有至少95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗體保留結合NKG2D之能力。在某些態樣中，在SEQ ID NO: 71之胺基酸序列中，總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在CDR外部之區域中(亦即在FR中)。在一個態樣中，VH包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列。視情況，VH包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個態樣中，VL包含SEQ ID NO: 72之輕鏈可變區序列之一或多個輕鏈構架序列(亦即，FR1、FR2、FR3及/或FR4序列)。在一個態樣中，VL包含與SEQ ID NO: 72之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VL包含與SEQ ID NO: 72之胺基酸序列至少約95%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VL包含與SEQ ID NO: 72之胺基酸序列至少約98%一致的胺基酸序列。在某些態樣中，具有至少95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗體保留結合NKG2D之能力。在某些態樣中，在SEQ ID NO: 72之胺基酸序列中，總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在CDR外部之區域中(亦即在FR中)。在一個態樣中，VL包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列。視情況，VL包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個態樣中，VH包含與SEQ ID NO: 71之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 72之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VH包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種結合NKG2D之抗體，其中該抗體包含第一抗原結合域，其包含：包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 72之胺基酸序列的VL。
在另一態樣中，本發明提供一種結合NKG2D之抗體，其中該抗體包含第一抗原結合域，其包含SEQ ID NO: 71之VH序列及SEQ ID NO: 72之VL序列。
在另一態樣中，本發明提供一種結合NKG2D之抗體，其中該抗體包含第一抗原結合域，其包含：包含SEQ ID NO: 71之VH之重鏈CDR序列的VH，及包含SEQ ID NO: 72之VL之輕鏈CDR序列的VL。
在另一態樣中，第一抗原結合域包含SEQ ID NO: 71之VH的HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列以及SEQ ID NO: 72之VL的LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列。
在一個態樣中，VH包含SEQ ID NO: 71之VH之重鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 71之VH之構架序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的構架。在一個態樣中，VH包含SEQ ID NO: 71之VH之重鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 71之VH之構架序列具有至少95%序列一致性的構架。在另一態樣中，VH包含SEQ ID NO: 71之VH之重鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 71之VH之構架序列具有至少98%序列一致性的構架。
在一個態樣中，VL包含SEQ ID NO: 72之VL之輕鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 72之VL之構架序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的構架。在一個態樣中，VL包含SEQ ID NO: 72之VL之輕鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 72之VL之構架序列具有至少95%序列一致性的構架。在另一態樣中，VL包含SEQ ID NO: 72之VL之輕鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 72之VL之構架序列具有至少98%序列一致性的構架。
在一個態樣中，抗體包含第一抗原結合域，其包含： 包含SEQ ID NO: 1之HCDR 1、SEQ ID NO: 2之HCDR 2及SEQ ID NO: 3之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 4之LCDR 1、SEQ ID NO: 5之LCDR 2及SEQ ID NO: 6之LCDR 3的VL。
在一個態樣中，抗體為人類抗體。在一個態樣中，抗原結合域為人類抗原結合域(亦即，人類抗體之抗原結合域)。在一個態樣中，VH及/或VL為人類可變區。
在一個態樣中，VH及/或VL包含人類構架，例如人類免疫球蛋白構架。
在一個態樣中，VH包含SEQ ID NO: 7之重鏈可變區序列之一或多個重鏈構架序列(亦即，FR1、FR2、FR3及/或FR4序列)。在一個態樣中，VH包含與SEQ ID NO: 7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VH包含與SEQ ID NO: 7之胺基酸序列至少約95%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VH包含與SEQ ID NO: 7之胺基酸序列至少約98%一致的胺基酸序列。在某些態樣中，具有至少95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗體保留結合NKG2D之能力。在某些態樣中，在SEQ ID NO: 7之胺基酸序列中，總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在CDR外部之區域中(亦即在FR中)。在一個態樣中，VH包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。視情況，VH包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個態樣中，VL包含SEQ ID NO: 8之輕鏈可變區序列之一或多個輕鏈構架序列(亦即，FR1、FR2、FR3及/或FR4序列)。在一個態樣中，VL包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 8至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VL包含與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列至少約95%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VL包含與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列至少約98%一致的胺基酸序列。在某些態樣中，具有至少95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗體保留結合NKG2D之能力。在某些態樣中，在SEQ ID NO: 8之胺基酸序列中，總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在CDR外部之區域中(亦即在FR中)。在一個態樣中，VL包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。視情況，VL包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個態樣中，VH包含與SEQ ID NO: 7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，且VL包含與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VH包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種結合NKG2D之抗體，其中該抗體包含第一抗原結合域，其包含：包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的VL。
在另一態樣中，本發明提供一種結合NKG2D之抗體，其中該抗體包含第一抗原結合域，其包含SEQ ID NO: 7之VH序列及SEQ ID NO: 8之VL序列。
在另一態樣中，本發明提供一種結合NKG2D之抗體，其中該抗體包含第一抗原結合域，其包含：包含SEQ ID NO: 7之VH之重鏈CDR序列的VH，及包含SEQ ID NO: 8之VL之輕鏈CDR序列的VL。
在另一態樣中，第一抗原結合域包含SEQ ID NO: 7之VH的HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列以及SEQ ID NO: 8之VL的LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列。
在一個態樣中，VH包含SEQ ID NO: 7之VH之重鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 7之VH之構架序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的構架。在一個態樣中，VH包含SEQ ID NO: 7之VH之重鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 7之VH之構架序列具有至少95%序列一致性的構架。在另一態樣中，VH包含SEQ ID NO: 7之VH之重鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 7之VH之構架序列具有至少98%序列一致性的構架。
在一個態樣中，VL包含SEQ ID NO: 8之VL之輕鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 8之VL之構架序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的構架。在一個態樣中，VL包含SEQ ID NO: 8之VL之輕鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 8之VL之構架序列具有至少95%序列一致性的構架。在另一態樣中，VL包含SEQ ID NO: 8之VL之輕鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 8之VL之構架序列具有至少98%序列一致性的構架。
在一個態樣中，本發明提供一種結合NKG2D之抗體，其中該抗體包含第一抗原結合域，其包含如上文提供之態樣中之任一者中的VH序列及如上文提供之態樣中之任一者中的VL序列。
在一個態樣中，抗體包含人類恆定區。在一個態樣中，抗體為包含人類恆定區之免疫球蛋白分子，特定言之包含人類CH1、CH2、CH3及/或CL域之IgG類免疫球蛋白分子。人類恆定域之例示性序列載於SEQ ID NO 83及84 (分別為人類κ及λ CL域)及SEQ ID NO: 85 (人類IgG1重鏈恆定域CH1-CH2-CH3)中。在一個態樣中，抗體包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 84之胺基酸序列，特定言之SEQ ID NO: 83之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，抗體包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 85之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。特定言之，重鏈恆定區可包含如本文所描述之Fc域中之胺基酸突變。
在一個態樣中，第一抗原結合域包含人類恆定區。在一個態樣中，第一抗原結合部分為包含人類恆定區，特定言之人類CH1及/或CL域之Fab分子。在一個態樣中，第一抗原結合域包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 84之胺基酸序列，特定言之SEQ ID NO: 83之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。特定言之，輕鏈恆定區可包含如本文在「電荷修飾」下所描述的胺基酸突變及/或可包含互換型Fab分子中之一或多個(特定言之，兩個) N端胺基酸的缺失或取代。在一些態樣中，第一抗原結合域包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含與包含於SEQ ID NO: 85之胺基酸序列中的CH1域序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。特定言之，重鏈恆定區(具體而言CH1域)可包含如本文在「電荷修飾」下所描述的胺基酸突變。
在一個態樣中，抗體為單株抗體。
在一個態樣中，抗體為IgG抗體，特定言之IgG1 抗體。在一個態樣中，抗體為全長抗體。
在另一態樣中，抗體為選自以下之群的抗體片段：Fv分子、scFv分子、Fab分子及F(ab')2 分子；特定言之Fab分子。在另一態樣中，抗體片段為雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體。
包含於根據本發明之抗體中的第一抗原結合域結合NKG2D。
在一較佳態樣中，抗體包含不超過一個結合NKG2D的抗原結合域。在一個態樣中，抗體提供與NKG2D之單價結合。在其他態樣中，抗體包含超過一個(例如兩個、三個或四個)結合NKG2D之抗原結合域。在一個態樣中，抗體提供與NKG2D之多價結合。在一個態樣中，抗體包含兩個結合NKG2D的抗原結合域。在一個態樣中，抗體提供與NKG2D之二價結合。在另一態樣中，抗體包含四個結合NKG2D的抗原結合域。在一個態樣中，抗體提供與NKG2D之四價結合。
在其中抗體包含超過一個結合NKG2D之抗原結合域的態樣中，較佳地，所有此等抗原結合域完全相同，亦即其具有相同分子型式(例如習知或互換型Fab分子)且包含相同胺基酸序列。
在另一態樣中，第一抗原結合域為選自以下之群的抗體片段：Fv分子、scFv分子、Fab分子及F(ab')2 分子。
在一個態樣中，第一抗原結合域為Fab分子。在一較佳態樣中，第一抗原結合域為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1 (特定言之可變域VL及VH)係相互置換(亦即，第一抗原結合域為互換型Fab分子)。
在另一態樣中，根據上文態樣中之任一者之抗體可併有如下文章節II. A. 1.-10.中所描述之任一特徵(單個或組合)。
在一較佳態樣中，抗體包含Fc域，特定言之IgG Fc域，更特定言之IgG1 Fc域。在一個態樣中，Fc域為人類Fc域。在一個態樣中，Fc域為人類IgG1 Fc域。Fc域由第一亞單元及第二亞單元構成，且可併有下文中關於Fc域變異體(章節II. A. 10.)描述之任一特徵(單個或組合)。
在另一較佳態樣中，抗體包含結合第二抗原之第二抗原結合域(亦即，抗體為多特異性抗體，如下文(章節II. A. 9.)中進一步描述)。
1.    抗體片段  在某些態樣中，本文所提供之抗體為抗體片段。
在一個態樣中，抗體片段為Fab、Fab'、Fab'-SH或F(ab')2 分子，詳言之如本文所描述之Fab分子。「Fab'分子」與Fab分子之不同之處在於在包括一或多個來自抗體鉸鏈區的半胱胺酸之CH1域的羧基端處添加有殘基。Fab'-SH為其中恆定域之半胱胺酸殘基攜帶游離硫醇基之Fab'分子。胃蛋白酶處理得到F(ab')2 分子，其具有兩個抗原結合位點(兩個Fab分子)及Fc區之一部分。
在另一態樣中，抗體片段為雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體。「雙功能抗體」為兩個抗原結合位點可為二價或雙特異性之抗體片段。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人, Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及Hollinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人, Nat. Med. 9:129-134 (2003)中。
在另一態樣中，抗體片段為單鏈Fab分子。「單鏈Fab分子」或「scFab」為由抗體重鏈可變域(VH)、抗體重鏈恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子組成之多肽，其中該等抗體域及該連接子在N端至C端方向上具有以下次序中之一者：a) VH-CH1-連接子-VL-CL；b) VL-CL-連接子-VH-CH1；c) VH-CL-連接子-VL-CH1；或d) VL-CH1-連接子-VH-CL。特定言之，該連接子為具有至少30個胺基酸，較佳地32至50個胺基酸之多肽。該等單鏈Fab分子經由CL域與CH1域之間的天然二硫鍵穩定化。另外，此等單鏈Fab分子可藉由經由插入半胱胺酸殘基(例如可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100，根據Kabat編號)而產生鏈間二硫鍵來進一步穩定化。
在另一態樣中，抗體片段為單鏈可變片段(scFv)。「單鏈可變片段」或「scFv」為藉由連接子連接的抗體之重鏈(VH)與輕鏈(VL)之可變域之融合蛋白。詳言之，連接子為具有10至25個胺基酸之短多肽，且通常富含於甘胺酸中以用於可撓性以及富含於絲胺酸或蘇胺酸中以用於溶解性，且可連接VH之N端與VL之C端或反之亦然。儘管移除恆定區且引入連接子，但此蛋白質保留原始抗體之特異性。關於scFv片段之綜述，參見例如Plückthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷, Rosenburg及Moore編, (Springer-Verlag, NewYork), 第269-315頁 (1994)；亦參見WO93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。
在另一態樣中，抗體片段為單域抗體。「單域抗體」為包含抗體之重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些態樣中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。
抗體片段可藉由各種技術製得，包括(但不限於)完整抗體之蛋白水解分解以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌)重組產生，如本文所描述。
2.    嵌合抗體及人類化抗體  在某些態樣中，本文所提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81:6851-6855 (1984))中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或子類已自親本抗體之類別或子類別變化。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些態樣中，本文所提供之抗體為人類化抗體。通常，可使非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中CDR (或其部分)來源於非人類抗體，且FR (或其部分)來源於人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些態樣中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，CDR殘基所來源於之抗體)之對應殘基取代，例如以恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及製得方法綜述於例如Almagro及Fransson,Front. Biosci . 13:1619-1633 (2008)中，且進一步描述於例如Riechmann等人,Nature 332:323-329 (1988)；Queen等人,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人,Methods 36:25-34 (2005)(描述特異性決定區(SDR)移植)；Padlan,Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (描述「表面重塑」)；Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60 (2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人,Methods 36:61-68 (2005)及Klimka等人,Br. J. Cancer , 83:252-260 (2000)(描述FR改組之「導引選擇」方法)。
可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合(best-fit)」方法選擇之構架區(參見例如Sims等人,J. Immunol . 151:2296 (1993))；來源於具有輕鏈或重鏈可變區之特定子組之人類抗體的共同序列之構架區(參見例如Carter等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 89:4285 (1992)；及Presta等人,J. Immunol ., 151:2623 (1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,Front. Biosci . 13:1619-1633 (2008))；及來源於篩選FR文庫之構架區(參見例如Baca等人,J. Biol. Chem . 272:10678-10684 (1997)及Rosok等人,J. Biol. Chem . 271:22611-22618 (1996))。
3.    人類抗體  在某些態樣中，本文所提供之抗體為人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知之各種技術產生。人類抗體大體上描述於van Dijk及van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及Lonberg,Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008)中。
人類抗體可藉由將免疫原投與至已經修飾以回應於抗原攻毒而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的轉殖基因動物來製備。此類動物通常含有全部或一部分人類免疫球蛋白基因座，其置換內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此類轉殖基因動物中，內源性免疫球蛋白基因座一般已不活化。對於自轉殖基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。亦參見例如美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，描述XENOMOUSETM 技術；美國專利第5,770,429號，描述HUMAB®技術；美國專利第7,041,870號，描述K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，描述VELOCIMOUSE®技術。可進一步修改由此類動物產生之完整抗體之人類可變區，例如藉由與不同人類恆定區組合來修飾。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製得。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類融合骨髓瘤細胞株(參見例如KozborJ. Immunol. , 133: 3001 (1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , 第51-63頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及Boerner等人,J. Immunol. , 147: 86 (1991))。經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 103:3557-3562 (2006)中。額外方法包括例如美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue 26(4):265-268 (2006)(描述人類-人類融合瘤)中所描述之彼等方法。人類融合瘤技術(三源融合瘤技術(Trioma technology))亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology , 20(3):927-937 (2005)以及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology , 27(3):185-91 (2005)中。
人類抗體亦可藉由分離選自人源噬菌體呈現文庫之可變域序列產生。此類可變域序列隨後可與所需人類恆定域組合。下文描述用於自抗體文庫選擇人類抗體之技術。
4.    文庫源抗體  在某些態樣中，本文所提供之抗體來源於文庫。本發明抗體可藉由針對具有一或多種所需活性之抗體篩選組合文庫來分離。用於篩選組合文庫之方法綜述於例如Lerner等人之Nature Reviews 16:498-508 (2016)中。舉例而言，此項技術中已知多種方法用於產生噬菌體呈現文庫及針對具有所需結合特徵之抗體篩選此類文庫。此類方法綜述於例如Frenzel等人之mAbs 8:1177-1194 (2016)；Bazan等人之Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012)及Zhao等人之Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016)以及Hoogenboom等人之Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等人編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)及Marks及Bradbury之Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)中。
在某些噬菌體呈現方法中，VH及VL基因之譜系分別藉由聚合酶鏈反應(PCR)選殖且在噬菌體文庫中隨機重組，隨後可如Winter等人之Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994)中所描述針對抗原結合噬菌體進行篩選。噬菌體通常以單鏈Fv (scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。來自免疫來源之文庫提供抗免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，可選殖(例如自人類)原初譜系以提供抗廣泛範圍之非自體抗原以及自體抗原之抗體之單一來源而無需任何免疫接種，如Griffiths等人之EMBO Journal 12: 725-734 (1993)所描述。此外，原初文庫亦可藉由自幹細胞選殖未經重排V基因區段及使用含有無規序列之PCR引子編碼高度可變CDR3區及實現活體外重排來以合成方式製得，如Hoogenboom及Winter之Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992)所描述。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號、第7,985,840號、第7,785,903號及第8,679,490號以及美國專利公開案第2005/0079574號、第2007/0117126號、第2007/0237764號及第2007/0292936號。
此項技術中已知之用於針對具有一或多種所需活性之抗體篩選組合文庫的方法之其他實例包括核糖體及mRNA呈現，以及用於細菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞上之抗體呈現及選擇的方法。用於酵母菌表面呈現之方法綜述於例如Scholler等人之Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012)及Cherf等人之Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015)以及Zhao等人之Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012)中。用於核糖體呈現之方法描述於例如He等人之Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997)及Hanes等人之PNAS 94:4937-4942 (1997)中。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段在本文中視為人類抗體或人類抗體片段。
5.    糖基化變異體  在某些態樣中，改變本文所提供之抗體以增大或減小抗體糖基化之程度。在抗體上添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來便利地實現。
在抗體包含Fc區之情況下，可改變連接於其上之寡醣。由哺乳動物細胞產生之原生抗體通常包含分支鏈雙觸角寡醣，其一般藉由N鍵連接至Fc區之CH2域之Asn297。參見例如Wright等人TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些態樣中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以便產生具有某些改良特性之抗體變異體。
在一個態樣中，提供具有非岩藻糖基化寡醣，亦即缺少連接(直接地或間接地)至Fc區之岩藻糖的寡醣結構的抗體變異體。特定言之，此類非岩藻糖基化寡醣(亦稱作「去岩藻糖基化」寡醣)為缺少連接至雙觸角寡醣結構之主幹中之第一GlcNAc的岩藻糖殘基之N鍵聯寡醣。在一個態樣中，提供Fc區中非岩藻糖基化寡醣之比例相較於原生或親本抗體增加的抗體變異體。舉例而言，非岩藻糖基化寡醣之比例可為至少約20%、至少約40%、至少約60%、至少約80%或甚至約100% (亦即不存在岩藻糖基化寡醣)。非岩藻糖基化寡醣之百分比為如藉由例如WO 2006/082515中所描述之MALDI-TOF質譜法所量測，相對於連接至Asn 297之所有寡醣(例如複合、雜交及高甘露糖結構)的總和，缺少岩藻糖殘基之寡醣的(平均)量。Asn297係指位於Fc區中約位置297 (Fc區殘基之EU編號)處的天冬醯胺殘基；然而，歸因於抗體之輕微序列變化，Asn297亦可位於位置297上游或下游約±3個胺基酸處，亦即位置294與300之間。Fc區中之非岩藻糖基化寡醣之比例增加的此類抗體可具有改良之FcγRIIIa受體結合及/或改良之效應功能，詳言之改良之ADCC功能。參見例如US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能夠產生岩藻糖基化減少之抗體的細胞株之實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人Arch. Biochem. Biophys . 249:533-545 (1986)；US 2003/0157108；及WO 2004/056312，尤其在實例11處)，及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因、FUT8 、基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人Biotech. Bioeng . 87:614-622 (2004)；Kanda, Y.等人,Biotechnol. Bioeng ., 94(4):680-688 (2006)；及WO2003/085107)，或GDP-岩藻糖合成或轉運蛋白之活性降低或消除的細胞(參見例如US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在另一態樣中，提供具有等分寡糖之抗體變異體，例如其中連接至抗體之Fc區的雙觸寡醣經GlcNAc平分。此類抗體變異體可具有如上文所描述的降低之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能。此類抗體變異體之實例描述於例如Umana等人, Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)；Ferrara等人, Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540、WO 2003/011878中。
亦提供寡醣中之至少一個半乳糖殘基與Fc區連接的抗體變異體。此類抗體變異體可具有改良之CDC功能。此類抗體變異體描述於例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；及WO 1999/22764中。
6.    經半胱胺酸工程改造之抗體變異體  在某些態樣中，可能需要產生經半胱胺酸工程改造之抗體，例如THIOMABTM 抗體，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在較佳態樣中，經取代之殘基出現在抗體之可接近位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基藉此定位於抗體之可接近位點處且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生如本文中進一步描述之免疫結合物。經半胱胺酸工程改造之抗體可如例如美國專利第7,521,541號、第8,30,930號、第7,855,275號、第9,000,130號或WO 2016040856中所描述來產生。
7.    抗體衍生物  在某些態樣中，可對本文所提供之抗體進一步修飾以含有此項技術中已知且可易於獲得的額外非蛋白質部分。適合於抗體衍生化之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或未分支鏈的。連接至抗體之聚合物的數目可變化，且若連接超過一種聚合物，則聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物的數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良抗體之特定特性或功能、抗體衍生物是否將用於限定條件下之療法等考慮因素來確定。
8.    免疫結合物  本發明亦提供免疫結合物，其包含與一或多種治療劑結合(化學鍵結)的本文中之抗NKG2D抗體，該等治療劑諸如細胞毒性劑、化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之蛋白質毒素、酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一個態樣中，免疫結合物為抗體-藥物結合物(ADC)，其中抗體與上文所提及之一或多種治療劑結合。抗體通常使用連接子連接至一或多種該等治療劑。包括治療劑及藥物及連接子之實例的ADC技術之概述闡述於Pharmacol Review 68:3-19 (2016)中。
在另一態樣中，免疫結合物包含與酶促活性毒素或其片段結合之本發明抗體，該酶促活性毒素或其片段包括(但不限於)白喉A鏈(diphtheria A chain)、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈(ricin A chain)、相思子毒素A鏈(abrin A chain)、莫迪素A鏈(modeccin A chain)、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨(dianthin)蛋白、洋商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecenes)。
在另一態樣中，免疫結合物包含與放射性原子結合以形成放射性結合物的本發明抗體。各種放射性同位素可用於產生放射性結合物。實例包括At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 及Lu之放射性同位素。當放射性結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如TC99m 或I123 ；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱磁共振成像，MRI)之自旋標記，諸如I123 、I131 、In111 、F19 、C13 、N15 、O17 、釓、錳或鐵。
可使用各種雙功能蛋白偶合劑製得抗體與細胞毒性劑之結合物，該等雙功能蛋白偶合劑諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺酸酯之雙功能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人,Science 238:1098 (1987)中所描述來製備。經碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見WO 94/11026。連接子可為「可裂解連接子」，其有助於細胞毒性藥物在細胞中釋放。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫鍵連接子(Chari等人,Cancer Res . 52:127-131 (1992)；美國專利第5,208,020號)。
本文之免疫結合物或ADC明確涵蓋(但不限於)用交聯試劑製備之此類結合物，該等交聯試劑包括(但不限於) BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB，及SVSB (丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，該等交聯試劑可商購(例如購自Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A)。
9.    多特異性抗體  在某些態樣中，本文所提供之抗體為多特異性抗體，特定言之雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩種不同抗原決定子(例如兩種不同蛋白質，或相同蛋白質上之兩個不同抗原決定基)具有結合特異性的單株抗體。在某些態樣中，多特異性抗體具有三個或更多個結合特異性。在某些態樣中，結合特異性中之一者係針對NKG2D，且其他特異性係針對任何其他抗原。在某些態樣中，多特異性抗體可結合NKG2D之兩個(或更多個)不同抗原決定基。多特異性(例如雙特異性)抗體亦可用於將細胞毒性劑或細胞定位至表現NKG2D之細胞。多特異性抗體可呈全長抗體或抗體片段形式製備。
用於製得多特異性抗體之技術包括(但不限於)對具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對進行重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305: 537 (1983))；以及「臼包杵(knob-in-hole)」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號，及Atwell等人, J. Mol. Biol. 270:26 (1997))。多特異性抗體亦可藉由以下方式製得：對靜電轉向效應進行工程改造來製得抗體Fc-雜二聚體分子(參見例如WO 2009/089004)；使兩種或更多種抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號，及Brennan等人,Science 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈來產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人,J. Immunol. , 148(5):1547-1553 (1992)，及WO 2011/034605)；使用共同輕鏈技術以避免輕鏈錯配問題(參見例如WO 98/50431)；使用「雙功能抗體」技術來製得雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448 (1993))；以及使用單鏈Fv (scFv)二聚體(參見例如Gruber等人,J. Immunol. , 152:5368 (1994))；以及例如Tutt等人J. Immunol . 147: 60 (1991)中所描述製備三特異性抗體。
本文中亦包括經工程改造的具有三個或更多個抗原結合位點之抗體(包括例如「章魚抗體(Octopus antibodies)」或DVD-Ig)(參見例如WO 2001/77342及WO 2008/024715)。具有三個或更多個抗原結合位點之多特異性抗體的其他實例可見於WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792及WO 2013/026831中。多特異性抗體或其抗原結合片段亦包括「雙重作用FAb」或「DAF」，其包含結合NKG2D以及另一不同抗原或NKG2D之兩個不同抗原決定基的抗原結合位點(參見例如US 2008/0069820及WO 2015/095539)。
多特異性抗體亦可呈相同抗原特異性之一或多個結合臂中具有域互換之不對稱形式提供(所謂的「CrossMab」技術)，亦即藉由交換VH/VL域(參見例如WO 2009/080252及WO 2015/150447)、CH1/CL域(參見例如WO 2009/080253)或完整Fab臂(參見例如WO 2009/080251、WO 2016/016299，亦參見Schaefer等人，PNAS, 108 (2011) 1187-1191；及Klein等人，MAbs 8 (2016) 1010-20)提供。不對稱Fab臂亦可藉由將帶電或不帶電胺基酸突變引入域界面中以導引正確Fab配對來進行工程改造。參見例如WO 2016/172485。
多特異性抗體之各種其他分子型式為此項技術中已知的且包括在本文中(參見例如Spiess等人, Mol Immunol 67 (2015) 95-106)。
本發明之多特異性抗體之較佳態樣描述於下文中。
在一個態樣中，本發明提供一種結合NKG2D之抗體，其包含結合如本文所描述之NKG2D的第一抗原結合域且包含結合第二抗原的第二抗原結合域。
根據本發明之較佳態樣，包含於抗體中之抗原結合域為Fab分子(亦即，抗原結合域由各自包含可變域及恆定域之重鏈及輕鏈構成)。在一個態樣中，該第一抗原結合域及/或該第二抗原結合域為Fab分子。在一個態樣中，該Fab分子為人類分子。在另一態樣中，該Fab分子為人類化分子。在又一態樣中，該Fab分子包含人類重鏈及輕鏈恆定域。
較佳地，抗原結合域中之至少一者為互換型Fab分子。此類修飾減少來自不同Fab分子之重鏈及輕鏈之錯配，由此改良重組產生中之本發明之(多特異性)抗體之產率及純度。在適用於本發明之(多特異性)抗體的較佳互換型Fab分子中，Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域(分別為VL及VH)交換。然而，即使在此域交換之情況下，(多特異性)抗體製劑可包含歸因於錯配之重鏈與輕鏈之間的所謂本斯-瓊斯型(Bence Jones-type)相互作用的某些副產物(參見Schaefer等人, PNAS, 108 (2011) 11187-11191)。為了進一步減少來自不同Fab分子之重鏈與輕鏈之錯配且因此增加所需(多特異性)抗體之純度及產率，帶相反電荷之帶電胺基酸可引入於結合第一抗原(NKG2D)之Fab分子或結合第二抗原(例如目標細胞抗原，諸如腫瘤細胞抗原)之Fab分子之CH1及CL域中的特定胺基酸位置處，如本文進一步描述。在包含於(多特異性)抗體中之習知Fab分子(諸如例如圖 12 中所示)中或在包含於(多特異性)抗體中之VH/VL互換型Fab分子中(但並非兩者中)進行電荷修飾。在較佳態樣中，在包含於(多特異性)抗體中之習知Fab分子(其在較佳態樣中結合第二抗原，例如目標細胞抗原，諸如腫瘤細胞抗原)中進行電荷修飾。
在根據本發明之一較佳態樣中，(多特異性)抗體能夠同時結合第一抗原(亦即，NKG2D)及第二抗原(例如目標細胞抗原，諸如腫瘤細胞抗原)。在一個態樣中，(多特異性)抗體能夠藉由同時結合NKG2D及目標細胞抗原而使表現NKG2D之細胞(諸如T細胞或NK細胞)與目標細胞(諸如腫瘤細胞)交聯。在一個態樣中，此同時結合引起目標細胞，特定言之表現目標細胞抗原之腫瘤細胞溶解。在一個態樣中，此同時結合引起表現NKG2D之細胞(諸如T細胞或NK細胞)活化。在其他態樣中，此同時結合引起選自以下之群的表現NKG2D之細胞(諸如T細胞或NK細胞)的細胞反應：增殖、分化、細胞介素分泌、細胞毒性效應分子釋放、細胞毒性活性及活化標記物表現。在一個態樣中，(多特異性)抗體與NKG2D結合而不同時結合目標細胞抗原不會引起表現NKG2D之細胞(諸如T細胞或NK細胞)活化。
在某些此等態樣中，本發明之(多特異性)抗體與T細胞活化劑，諸如結合CD3之抗體，特定言之結合CD3及目標細胞抗原(特定言之腫瘤細胞抗原)之雙特異性抗體組合。
較佳地，根據本發明之態樣中之任一者的T細胞為細胞毒性T細胞。在一些態樣中T細胞為CD8+ T細胞。在其他態樣中，T細胞為γδ T細胞。
a)    第一抗原結合域  本發明之(多特異性)抗體包含至少一個結合NKG2D之抗原結合域(第一抗原結合域)。在較佳態樣中，NKG2D為人類NKG2D或食蟹獼猴NKG2D，最特定言之人類NKG2D。在一個態樣中，第一抗原結合域對人類及食蟹獼猴NKG2D具有交叉反應性(亦即結合人類及食蟹獼猴NKG2D)。在一些態樣中，NKG2D為NKG2D之細胞外域。
在一較佳態樣中，(多特異性)抗體包含不超過一個結合NKG2D之抗原結合域。在一個態樣中，(多特異性)抗體提供與NKG2D之單價結合。在其他態樣中，(多特異性)抗體包含超過一個(例如兩個、三個或四個)結合NKG2D之抗原結合域。在一個態樣中，(多特異性)抗體提供與NKG2D之多價結合。在一個態樣中，(多特異性)抗體包含兩個結合NKG2D的抗原結合域。在一個態樣中，(多特異性)抗體提供與NKG2D之二價結合。在另一態樣中，(多特異性)抗體包含四個結合NKG2D的抗原結合域。在一個態樣中，(多特異性)抗體提供與NKG2D之四價結合。
在其中(多特異性)抗體包含超過一個結合NKG2D之抗原結合域的態樣中，較佳地，所有此等抗原結合域完全相同，亦即其具有相同分子型式(例如習知或互換型Fab分子)且包含如本文所描述在CH1及CL域中包括相同胺基酸取代(若存在)的相同胺基酸序列。
在一個態樣中，結合NKG2D之抗原結合域為選自以下之群的抗體片段：Fv分子、scFv分子、Fab分子及F(ab')2 分子。在一較佳態樣中，結合NKG2D之抗原結合域為Fab分子。
在一些態樣中，結合NKG2D之抗原結合域為如本文所描述之互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL相互交換/置換的Fab分子。在此等態樣中，結合第二抗原(例如目標細胞抗原，諸如腫瘤細胞抗原)之抗原結合域較佳地為習知Fab分子。
在替代性態樣中，結合NKG2D之抗原結合域為習知Fab分子。在此等態樣中，結合第二抗原(例如目標細胞抗原，諸如腫瘤細胞抗原)之抗原結合域為如本文所描述之互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL相互交換/置換的Fab分子。
在較佳態樣中，第一抗原結合域為其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1 (特定言之可變域VL及VH)相互置換的Fab分子(亦即，根據此類態樣，第一抗原結合域為其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域或恆定域交換的互換型Fab分子)。在一個此類態樣中，第二抗原結合域為習知Fab分子。
b)   第二抗原結合域  在某些態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含結合第二抗原之抗原結合域(第二抗原結合域)。第二抗原較佳地不為NKG2D，亦即不同於NKG2D。在一個態樣中，第二抗原為表現於與NKG2D不同之細胞上(例如表現於除T細胞或NK細胞外之細胞上)的抗原。在一個態樣中，第二抗原不為活化Fc受體，特定言之FcγRIIIa (CD16a)。在一個態樣中，抗體不結合活化Fc受體，特定言之FcγRIIIa (CD16a)。在一個態樣中，第二抗原不為CD3。在一個態樣中，抗體不結合CD3。
在較佳態樣中，第二抗原為目標細胞抗原，特定言之腫瘤細胞抗原。在一特定態樣中，第二抗原為CEA。根據本發明，第二抗原結合域能夠將(多特異性)抗體導引至目標位點，例如表現第二抗原之某一具體類型之腫瘤細胞。
在一較佳態樣中，(多特異性)抗體包含不超過一個結合第二抗原的抗原結合域。在一個態樣中，(多特異性)抗體提供與第二抗原之單價結合。在其他態樣中，(多特異性)抗體包含超過一個(例如兩個、三個或四個)結合第二抗原的抗原結合域。在一個態樣中，(多特異性)抗體提供與第二抗原之多價結合。在一個態樣中，(多特異性)抗體包含兩個結合第二抗原的抗原結合域。在一個態樣中，(多特異性)抗體提供與第二抗原之二價結合。
在其中(多特異性)抗體包含超過一個結合第二抗原之抗原結合域，特定言之Fab分子，較佳地，此等抗原結合域中之每一者結合相同抗原決定子。在一更佳態樣中，所有此等抗原結合域完全相同，亦即其具有相同分子型式(例如習知或互換型Fab分子)且包含如本文所描述在CH1及CL域中包括相同胺基酸取代(若存在)的相同胺基酸序列。
在一個態樣中，結合第二抗原之抗原結合域為選自以下之群的抗體片段：Fv分子、scFv分子、Fab分子及F(ab')2 分子。在一較佳態樣中，結合第二抗原之抗原結合域為Fab分子。在另一態樣中，結合第二抗原之抗原結合域為Fv分子。
在一些態樣中，結合第二抗原之抗原結合域為習知Fab分子。在此等態樣中，結合NKG2D之抗原結合域為如本文所描述之互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL相互交換/置換的Fab分子。
在替代性態樣中，結合第二抗原之抗原結合域為如本文所描述之互換型Fab分子，亦即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL相互交換/置換的Fab分子。在此等態樣中，結合NKG2D之抗原結合域為習知Fab分子。
在一個態樣中，第二抗原結合域包含人類恆定區。在一個態樣中，第二抗原結合域為包含人類恆定區，特定言之人類CH1及/或CL域的Fab分子。人類恆定域之例示性序列載於SEQ ID NO 83及84 (分別為人類κ及λ CL域)及SEQ ID NO: 85 (人類IgG1重鏈恆定域CH1-CH2-CH3)中。在一個態樣中，第二抗原結合域包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含與SEQ ID NO: 83或SEQ ID NO: 84之胺基酸序列，特定言之SEQ ID NO: 83之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。特定言之，輕鏈恆定區可包含如本文在「電荷修飾」下所描述的胺基酸突變及/或可包含互換型Fab分子中之一或多個(特定言之，兩個) N端胺基酸的缺失或取代。在一些態樣中，第二抗原結合域包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含與包含於SEQ ID NO: 85之胺基酸序列中的CH1域序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。特定言之，重鏈恆定區(具體而言CH1域)可包含如本文在「電荷修飾」下所描述的胺基酸突變。
在一些態樣中，第二抗原為CEA，特定言之人類CEA。
在一個態樣中，第二抗原結合域包含：包含SEQ ID NO: 114之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 115之HCDR 2及SEQ ID NO: 116之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 117之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 118之LCDR 2及SEQ ID NO: 119之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)。
在一個態樣中，第二抗原結合域包含：包含SEQ ID NO: 120之VH之重鏈CDR序列的VH，及包含SEQ ID NO: 121之VL之輕鏈CDR序列的VL。
在一個態樣中，第二抗原結合域之VH包含與SEQ ID NO: 120之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，及/或第二抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO: 121之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VH包含SEQ ID NO: 120之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 121之胺基酸序列。
在另一態樣中，第二抗原結合域包含：包含SEQ ID NO: 122之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 123之HCDR 2及SEQ ID NO: 124之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 125之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 126之LCDR 2及SEQ ID NO: 127之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)。
在一個態樣中，第二抗原結合域為(來源於)人類化抗體。在一個態樣中，第二抗原結合域為人類化抗原結合域(亦即，人類化抗體之抗原結合域)。在一個態樣中，第二抗原結合域之VH及/或VL為人類化可變區。
在一個態樣中，第二抗原結合域之VH包含接受體人類構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。
在一個態樣中，第二抗原結合域之VH包含SEQ ID NO: 128之重鏈可變區序列之一或多個重鏈構架序列(亦即，FR1、FR2、FR3及/或FR4序列)。在一個態樣中，VH包含與SEQ ID NO: 128之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VH包含與SEQ ID NO: 128之胺基酸序列至少約95%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VH包含與SEQ ID NO: 128之胺基酸序列至少約98%一致的胺基酸序列。在某些態樣中，具有至少95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗體保留結合第二抗原之能力。在某些態樣中，在SEQ ID NO: 128之胺基酸序列中，總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在CDR外部之區域中(亦即在FR中)。在一個態樣中，VH包含SEQ ID NO: 128之胺基酸序列。視情況，VH包含SEQ ID NO: 128之胺基酸序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個態樣中，第二抗原結合域之VL包含SEQ ID NO: 129之輕鏈可變區序列之一或多個輕鏈構架序列(亦即，FR1、FR2、FR3及/或FR4序列)。在一個態樣中，VL包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 129至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VL包含與SEQ ID NO: 129之胺基酸序列至少約95%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VL包含與SEQ ID NO: 129之胺基酸序列至少約98%一致的胺基酸序列。在某些態樣中，具有至少95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗體保留結合第二抗原之能力。在某些態樣中，在SEQ ID NO: 129之胺基酸序列中，總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在CDR外部之區域中(亦即在FR中)。在一個態樣中，VL包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列。視情況，VL包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個態樣中，第二抗原結合域之VH包含與SEQ ID NO: 128之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，且第二抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO: 129之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VH包含SEQ ID NO: 128之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列。
在另一態樣中，第二抗原結合域包含：包含SEQ ID NO: 128之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列的VL。
在另一態樣中，第二抗原結合域包含SEQ ID NO: 128之VH序列及SEQ ID NO: 129之VL序列。
在另一態樣中，第二抗原結合域包含：包含SEQ ID NO: 128之VH之重鏈CDR序列的VH及包含SEQ ID NO: 129之VL之輕鏈CDR序列的VL。
在另一態樣中，第二抗原結合域包含SEQ ID NO: 128之VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列以及SEQ ID NO: 129之VL之LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列。
在一個態樣中，第二抗原結合域之VH包含SEQ ID NO: 128之VH之重鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 128之VH之構架序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的構架。在一個態樣中，VH包含SEQ ID NO: 128之VH之重鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 128之VH之構架序列具有至少95%序列一致性的構架。在另一態樣中，VH包含SEQ ID NO: 128之VH之重鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 128之VH之構架序列具有至少98%序列一致性的構架。
在一個態樣中，第二抗原結合域之VL包含SEQ ID NO: 129之VL之輕鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 129之VL之構架序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的構架。在一個態樣中，VL包含SEQ ID NO: 129之VL之輕鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 129之VL之構架序列具有至少95%序列一致性的構架。在另一態樣中，VL包含SEQ ID NO: 129之VL之輕鏈CDR序列及與SEQ ID NO: 129之VL之構架序列具有至少98%序列一致性的構架。
在另一態樣中，第二抗原結合域包含：包含SEQ ID NO: 165之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 168之HCDR 2及SEQ ID NO: 171之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 177之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 126之LCDR 2及SEQ ID NO: 179之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)。
在一個態樣中，第二抗原結合域包含： (i)       包含SEQ ID NO: 122之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 123之HCDR 2及SEQ ID NO: 172之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 125之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 126之LCDR 2及SEQ ID NO: 180之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； (ii)      包含SEQ ID NO: 122之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 123之HCDR 2及SEQ ID NO: 173之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 125之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 126之LCDR 2及SEQ ID NO: 181之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； (iii)    包含SEQ ID NO: 122之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 123之HCDR 2及SEQ ID NO: 174之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 125之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 126之LCDR 2及SEQ ID NO: 182之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； (iv)   包含SEQ ID NO: 166之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 169之HCDR 2及SEQ ID NO: 124之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 178之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 126之LCDR 2及SEQ ID NO: 127之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； (v)    包含SEQ ID NO: 122之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 170之HCDR 2及SEQ ID NO: 124之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 125之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 126之LCDR 2及SEQ ID NO: 127之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； (vi)   包含SEQ ID NO: 122之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 123之HCDR 2及SEQ ID NO: 175之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 125之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 126之LCDR 2及SEQ ID NO: 183之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； (vii)  包含SEQ ID NO: 122之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 169之HCDR 2及SEQ ID NO: 175之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 125之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 126之LCDR 2及SEQ ID NO: 183之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； (viii) 包含SEQ ID NO: 122之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 169之HCDR 2及SEQ ID NO: 175之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 125之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 126之LCDR 2及SEQ ID NO: 183之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； (ix)   包含SEQ ID NO: 122之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 123之HCDR 2及SEQ ID NO: 176之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 125之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 126之LCDR 2及SEQ ID NO: 182之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； (x)    包含SEQ ID NO: 122之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 169之HCDR 2及SEQ ID NO: 176之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 125之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 126之LCDR 2及SEQ ID NO: 182之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； (xi)   包含SEQ ID NO: 166之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 169之HCDR 2及SEQ ID NO: 172之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 125之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 126之LCDR 2及SEQ ID NO: 180之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)；或 (xii)  包含SEQ ID NO: 167之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 170之HCDR 2及SEQ ID NO: 172之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 125之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 126之LCDR 2及SEQ ID NO: 180之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)。
在一個態樣中，第二抗原結合域為(來源於)人類化抗體。在一個態樣中，第二抗原結合域為人類化抗原結合域(亦即，人類化抗體之抗原結合域)。在一個態樣中，第二抗原結合域之VH及/或VL為人類化可變區。
在一個態樣中，第二抗原結合域之VH包含接受體人類構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。
在一個態樣中，第二抗原結合域之VH包含選自由以下組成之群的重鏈可變區序列之一或多個重鏈構架序列(亦即，FR1、FR2、FR3及/或FR4序列)：SEQ ID NO: 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206。在一個態樣中，VH包含與選自由SEQ ID NO: 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206組成之群的胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VH包含與選自由SEQ ID NO: 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206組成之群的胺基酸序列至少約95%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VH包含與選自由SEQ ID NO: 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206組成之群的胺基酸序列至少約98%一致的胺基酸序列。在某些態樣中，具有至少95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗體保留結合第二抗原之能力。在某些態樣中，在SEQ ID NO: 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204或206之胺基酸序列中，總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在CDR外部之區域中(亦即在FR中)。在一個態樣中，VH包含選自由SEQ ID NO: 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206組成之群的胺基酸序列。視情況，VH包含選自由SEQ ID NO: 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206組成之群的胺基酸序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個態樣中，第二抗原結合域之VL包含選自以下之群的輕鏈可變區序列之一或多個輕鏈構架序列(亦即，FR1、FR2、FR3及/或FR4序列)：SEQ ID NO: 185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205及207。在一個態樣中，VL包含與選自SEQ ID NO: 185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205及207之群的胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VL包含與選自SEQ ID NO: 185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205及207之群的胺基酸序列至少約95%一致的胺基酸序列。在一個態樣中，VL包含與選自SEQ ID NO: 185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205及207之群的胺基酸序列至少約98%一致的胺基酸序列。在某些態樣中，具有至少95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守性取代)、插入或缺失，但包含彼序列之抗體保留結合第二抗原之能力。在某些態樣中，在SEQ ID NO: 185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205及207之胺基酸序列中，總共1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些態樣中，取代、插入或缺失發生在CDR外部之區域中(亦即在FR中)。在一個態樣中，VL包含選自SEQ ID NO: 185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205及207之群的胺基酸序列。視情況，VL包含選自SEQ ID NO: 185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205及207之群的胺基酸序列，包括彼序列之轉譯後修飾。
在一個態樣中，第二抗原結合域之VH包含： (i)       與SEQ ID NO: 184之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，且第二抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO: 185之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (ii)      與SEQ ID NO: 186之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，且第二抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO: 187之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (iii)  與SEQ ID NO: 188之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，且第二抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO: 189之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (iv)   與SEQ ID NO: 190之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，且第二抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO: 191之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (v)    與SEQ ID NO: 192之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，且第二抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO: 193之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (vi)   與SEQ ID NO: 194之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，且第二抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO: 195之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (vii)  與SEQ ID NO: 196之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，且第二抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO: 197之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (viii) 與SEQ ID NO: 198之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，且第二抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO: 199之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (ix)   與SEQ ID NO: 200之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，且第二抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO: 201之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (x)    與SEQ ID NO: 202之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，且第二抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO: 203之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列； (xi)   與SEQ ID NO: 204之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，且第二抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO: 205之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列；或 (xii)  與SEQ ID NO: 206之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，且第二抗原結合域之VL包含與SEQ ID NO: 207之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列。
在一個態樣中，VH包含： (i)       SEQ ID NO: 184之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO: 185之胺基酸序列； (ii)   SEQ ID NO: 186之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO: 187之胺基酸序列； (iii)  SEQ ID NO: 188之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO: 189之胺基酸序列； (iv)   SEQ ID NO: 190之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列； (v)    SEQ ID NO: 192之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO: 193之胺基酸序列； (vi)   SEQ ID NO: 194之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO: 195之胺基酸序列； (vii)  SEQ ID NO: 196之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO: 197之胺基酸序列； (viii) SEQ ID NO: 198之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO: 199之胺基酸序列； (ix)   SEQ ID NO: 200之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO: 201之胺基酸序列； (x)    SEQ ID NO: 202之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO: 203之胺基酸序列； (xi)   SEQ ID NO: 204之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列；或 (xii)  SEQ ID NO: 206之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO: 207之胺基酸序列。
在另一態樣中，第二抗原結合域包含： (i)       包含SEQ ID NO: 184之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 185之胺基酸序列的VL； (ii)   包含SEQ ID NO: 186之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 187之胺基酸序列的VL； (iii)  包含SEQ ID NO: 188之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 189之胺基酸序列的VL； (iv)   包含SEQ ID NO: 190之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列的VL； (v)    包含SEQ ID NO: 192之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 193之胺基酸序列的VL； (vi)   包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 195之胺基酸序列的VL； (vii)  包含SEQ ID NO: 196之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 197之胺基酸序列的VL； (viii) 包含SEQ ID NO: 198之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 199之胺基酸序列的VL； (ix)   包含SEQ ID NO: 200之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 201之胺基酸序列的VL； (x)    包含SEQ ID NO: 202之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 203之胺基酸序列的VL； (xi)   包含SEQ ID NO: 204之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 205之胺基酸序列的VL；或 (xii)  包含SEQ ID NO: 206之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO: 207之胺基酸序列的VL。
在另一態樣中，第二抗原結合域包含： (i)       SEQ ID NO: 184之VH序列及SEQ ID NO: 185之VL序列； (ii)   SEQ ID NO: 186之VH序列及SEQ ID NO: 187之VL序列； (iii)  SEQ ID NO: 188之VH序列及SEQ ID NO: 189之VL序列； (iv)   SEQ ID NO: 190之VH序列及SEQ ID NO: 191之VL序列； (v)    SEQ ID NO: 192之VH序列及SEQ ID NO: 193之VL序列； (vi)   SEQ ID NO: 194之VH序列及SEQ ID NO: 195之VL序列； (vii)  SEQ ID NO: 196之VH序列及SEQ ID NO: 197之VL序列； (viii) SEQ ID NO: 198之VH序列及SEQ ID NO: 199之VL序列； (ix)   SEQ ID NO: 200之VH序列及SEQ ID NO: 201之VL序列； (x)    SEQ ID NO: 202之VH序列及SEQ ID NO: 203之VL序列； (xi)   SEQ ID NO: 204之VH序列及SEQ ID NO: 205之VL序列；或 (xii)  SEQ ID NO: 206之VH序列及SEQ ID NO: 207之VL序列。
在另一態樣中，第二抗原結合域包含： (i)       包含SEQ ID NO: 184之VH之重鏈CDR序列的VH，及包含SEQ ID NO: 185之VL之輕鏈CDR序列的VL； (ii)   包含SEQ ID NO: 186之VH之重鏈CDR序列的VH，及包含SEQ ID NO: 187之VL之輕鏈CDR序列的VL； (iii)  包含SEQ ID NO: 188之VH之重鏈CDR序列的VH，及包含SEQ ID NO: 189之VL之輕鏈CDR序列的VL； (iv)   包含SEQ ID NO: 190之VH之重鏈CDR序列的VH，及包含SEQ ID NO: 191之VL之輕鏈CDR序列的VL； (v)    包含SEQ ID NO: 192之VH之重鏈CDR序列的VH，及包含SEQ ID NO: 193之VL之輕鏈CDR序列的VL； (vi)   包含SEQ ID NO: 194之VH之重鏈CDR序列的VH，及包含SEQ ID NO: 195之VL之輕鏈CDR序列的VL； (vii)  包含SEQ ID NO: 196之VH之重鏈CDR序列的VH，及包含SEQ ID NO: 197之VL之輕鏈CDR序列的VL； (viii) 包含SEQ ID NO: 198之VH之重鏈CDR序列的VH，及包含SEQ ID NO: 199之VL之輕鏈CDR序列的VL； (ix)   包含SEQ ID NO: 200之VH之重鏈CDR序列的VH，及包含SEQ ID NO: 201之VL之輕鏈CDR序列的VL； (x)    包含SEQ ID NO: 202之VH之重鏈CDR序列的VH，及包含SEQ ID NO: 203之VL之輕鏈CDR序列的VL； (xi)   包含SEQ ID NO: 204之VH之重鏈CDR序列的VH，及包含SEQ ID NO: 205之VL之輕鏈CDR序列的VL；或 (xii)  包含SEQ ID NO: 206之VH之重鏈CDR序列的VH，及包含SEQ ID NO: 207之VL之輕鏈CDR序列的VL。
在另一態樣中，第二抗原結合域包含： (i)       SEQ ID NO: 184之VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列，及SEQ ID NO: 185之VL之LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列； (ii)   SEQ ID NO: 186之VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列，及SEQ ID NO: 187之VL之LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列； (iii)  SEQ ID NO: 188之VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列，及SEQ ID NO: 189之VL之LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列； (iv)   SEQ ID NO: 190之VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列，及SEQ ID NO: 191之VL之LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列； (v)    SEQ ID NO: 192之VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列，及SEQ ID NO: 193之VL之LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列； (vi)   SEQ ID NO: 194之VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列，及SEQ ID NO: 195之VL之LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列； (vii)  SEQ ID NO: 196之VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列，及SEQ ID NO: 197之VL之LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列； (viii) SEQ ID NO: 198之VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列，及SEQ ID NO: 199之VL之LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列； (ix)   SEQ ID NO: 200之VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列，及SEQ ID NO: 201之VL之LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列； (x)    SEQ ID NO: 202之VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列，及SEQ ID NO: 203之VL之LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列； (xi)   SEQ ID NO: 204之VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列，及SEQ ID NO: 205之VL之LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列；或 (xii)  SEQ ID NO: 206之VH之HCDR1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列，及SEQ ID NO: 207之VL之LCDR1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列。
在一個態樣中，第二抗原結合域之VH包含選自由SEQ ID NO: 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206組成之群的重鏈CDR序列，及與選自由SEQ ID NO: 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206組成之群的VH之構架序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的構架。在一個態樣中，VH包含選自由SEQ ID NO: 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206組成之群的VH之重鏈CDR序列，及與選自由SEQ ID NO: 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206組成之群的VH之構架序列具有至少95%序列一致性的構架。在另一態樣中，VH包含選自由SEQ ID NO: 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206組成之群的VH之重鏈CDR序列，及與選自由SEQ ID NO: 184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204及206組成之群的VH之構架序列具有至少98%序列一致性的構架。
在一個態樣中，第二抗原結合域之VL包含選自SEQ ID NO: 185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205及207之群的VL之輕鏈CDR序列，及與選自SEQ ID NO: 185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205及207之群的VL之構架序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的構架。在一個態樣中，VL包含選自SEQ ID NO: 185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205及207之群的VL之輕鏈CDR序列，及與選自SEQ ID NO: 185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205及207之群的VL之構架序列具有至少95%序列一致性的構架。在另一態樣中，VL包含選自SEQ ID NO: 185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205及207之群的VL之輕鏈CDR序列，及與選自SEQ ID NO: 185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205及207之群的VL之構架序列具有至少98%序列一致性的構架。
在一個態樣中，第二抗原結合域包含如在上文之此章節中所提供之任一態樣中的VH序列及如在上文之此章節中所提供之任一態樣中的VL序列。
c)    電荷修飾  本發明之(多特異性)抗體可包含其中所含Fab分子中之胺基酸取代，其在減少輕鏈與不匹配重鏈之錯配(本斯-瓊斯型副產物；Bence-Jones-type side product)方面尤其有效，該錯配可發生在其一個(或多個，在分子包含超過兩個抗原結合Fab分子之情況下)結合臂中具有VH/VL交換的基於Fab之多特異性抗體之產生中(亦參見PCT公開案第WO 2015/150447號，特定言之參見其中之實例，該公開案以全文引用之方式併入本文中)。所需(多特異性)抗體相較於非所需副產物(詳言之出現在其一個結合臂中具有VH/VL域交換之多特異性抗體中的本斯-瓊斯型副產物)之比可藉由在CH1及CL域中之特定胺基酸位置處引入具有相反電荷之帶電胺基酸(有時在本文中稱為「電荷修飾」)來改良。
因此，在其中(多特異性)抗體之第一及第二抗原結合域皆為Fab分子的一些態樣中，且在抗原結合域中之一者(特定言之第一抗原結合域)中，Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH係相互置換， i) 在第二抗原結合域之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經帶正電胺基酸取代(根據Kabat編號)，且其中在第二抗原結合域之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸經帶負電胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)；或 ii)     在第一抗原結合域之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經帶正電胺基酸取代(根據Kabat編號)，且其中在第一抗原結合域之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸經帶負電胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。
(多特異性)抗體不同時包含i)及ii)提及之修飾。具有VH/VL交換之抗原結合域之恆定域CL及CH1不相互置換(亦即，保持不交換)。
在一更特定態樣中， i) 在第二抗原結合域之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合域之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；或 ii)     在第一抗原結合域之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合域之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個此類態樣中，在第二抗原結合域之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合域之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一態樣中，在第二抗原結合域之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合域之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一較佳態樣中，在第二抗原結合域之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合域之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一更佳態樣中，在第二抗原結合域之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合域之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一更佳態樣中，在第二抗原結合域之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合域之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在較佳態樣中，若根據上文態樣之胺基酸取代發生於第二抗原結合域之恆定域CL及恆定域CH1中，則第二抗原結合域之恆定域CL屬於κ同型。
或者，根據上文態樣之胺基酸取代可發生於第一抗原結合域之恆定域CL及恆定域CH1中，而非第二抗原結合域之恆定域CL及恆定域CH1中。在較佳之此類態樣中，第一抗原結合域之恆定域CL屬於κ同型。
因此，在一個態樣中，在第一抗原結合域之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合域之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一態樣中，在第一抗原結合域之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合域之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在再一態樣中，在第一抗原結合域之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合域之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個態樣中，在第一抗原結合域之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合域之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一態樣中，在第一抗原結合域之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合域之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一較佳態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含： (a)    結合NKG2D之第一抗原結合域，其中該第一抗原結合域為其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH相互置換的Fab分子且包含如本文中關於第一抗原結合域所提供之態樣中之任一者中的重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)； (b)    結合第二抗原之第二抗原結合域； 其中在第二(及視情況存在之第三)抗原結合域之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一較佳態樣中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一較佳態樣中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且在第二(及視情況存在之第三)抗原結合域之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
d)   多特異性抗體型式  根據本發明之(多特異性)抗體可具有各種組態。例示性組態描繪於圖 12 中。
在較佳態樣中，包含於(多特異性)抗體中之抗原結合域為Fab分子。在此等態樣中，第一抗原結合域、第二抗原結合域、第三抗原結合域等在本文中可分別稱作第一Fab分子、第二Fab分子、第三Fab分子等。
在較佳態樣中，第一及第二抗原結合域各自為Fab分子。在一些態樣中，第一及/或第二(特定言之第二)抗原結合域可為Fv分子。
在其中第一及第二抗原結合域各自為Fab分子之態樣中，第一抗原結合域較佳為如本文所描述互換型Fab分子(亦即其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL相互交換/置換的Fab分子)，且第二抗原結合域為習知Fab分子，或反之亦然。
在其中(多特異性)抗體包含超過一個結合NKG2D之抗原結合域及/或超過一個結合第二抗原之抗原結合域的態樣中，較佳地，結合NKG2D之所有抗原結合域為如本文所描述之互換型Fab分子，且結合第二抗原之所有抗原結合域為習知Fab分子，或反之亦然。
在較佳態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含由第一亞單元及第二亞單元構成之Fc域。Fc域之第一亞單元及第二亞單元能夠穩定結合。
根據本發明之(多特異性)抗體可具有不同組態，亦即第一抗原結合域、第二抗原結合域及視情況存在之抗原結合域可彼此融合及以不同方式與Fc域融合。組分可彼此直接融合或較佳地經由一或多個適合之肽連接子融合。在Fab分子與Fc域之亞單元之N端融合的情況下，其通常經由免疫球蛋白鉸鏈區進行。
在較佳態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含： (a)    結合NKG2D之第一抗原結合域， (b)    結合第二抗原之第二抗原結合域，及 (c)    由第一亞單元及第二亞單元構成之Fc域； 其中第一及第二抗原結合域各自為Fab分子，且 其中(i)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，或(ii)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，且第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合。
例示性之此類組態描繪於圖 12F 中。
在一個此類態樣中，第一抗原結合域為如本文所描述之互換型Fab分子，且第二抗原結合域為習知Fab分子。在一更特定的此類態樣中，第一抗原結合域為其中可變域VH及VL相互交換/置換的互換型Fab分子，且第二抗原結合域為包含如本文所描述之電荷修飾的習知Fab分子。
在另一此類態樣中，第一抗原結合域為習知Fab分子，且第二抗原結合域為如本文所描述之互換型Fab分子。在一更特定的此類態樣中，第一抗原結合域為包含如本文所描述之電荷修飾的習知Fab分子，且第二抗原結合域為其中可變域VH及VL相互交換/置換的互換型Fab分子。
在另一此類態樣中，Fc域包含促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的修飾。
在又一此類態樣中，(多特異性)抗體基本上由第一及第二抗原結合域及Fc域以及視情況存在之一或多個肽連接子組成。
在其他態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含： (a)    結合NKG2D之第一抗原結合域， (b)    結合第二抗原之第二抗原結合域， (c)    結合NKG2D之第三抗原結合域，及 (d)    由第一亞單元及第二亞單元構成之Fc域； 其中第一、第二及第三抗原結合域各自為Fab分子，且 其中(i)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，且第三抗原結合域在Fab重鏈之C端與第一抗原結合域之Fab重鏈之N端融合，或(ii)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且第三抗原結合域在Fab重鏈之C端與第一抗原結合域之Fab重鏈之N端融合。
例示性之此類組態描繪於圖 12E 中。
在一個此類態樣中，第一及第三抗原結合域各自為如本文所描述之互換型Fab分子，且第二抗原結合域為習知Fab分子。在一更特定的此類態樣中，第一及第三抗原結合域各自為其中可變域VH及VL相互交換/置換的互換型Fab分子，且第二抗原結合域為包含如本文所描述之電荷修飾的習知Fab分子。
在另一此類態樣中，第一及第三抗原結合域各自為習知Fab分子，且第二抗原結合域為如本文所描述之互換型Fab分子。在一更特定的此類態樣中，第一及第三抗原結合域各自為包含如本文所描述之電荷修飾的習知Fab分子，且第二抗原結合域為其中可變域VH及VL相互交換/置換的互換型Fab分子。
在另一此類態樣中，Fc域包含促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的修飾。
在又一此類態樣中，(多特異性)抗體基本上由第一、第二及第三抗原結合域及Fc域以及視情況存在之一或多個肽連接子組成。
在其他態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含： (a)    結合NKG2D之第一抗原結合域， (b)    結合第二抗原之第二抗原結合域， (c)    結合NKG2D之第三抗原結合域，及 (d)    由第一亞單元及第二亞單元構成之Fc域； 其中第一、第二及第三抗原結合域各自為Fab分子，且 其中(i)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，第二抗原結合域在Fab重鏈之N端與Fc域之第二亞單元之C端融合，且第三抗原結合域在Fab重鏈之C端與第一抗原結合域之Fab重鏈之N端融合，或(ii)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，第二抗原結合域在Fab重鏈之N端與Fc域之第一亞單元之C端融合，且第三抗原結合域在Fab重鏈之C端與第一抗原結合域之Fab重鏈之N端融合。
例示性之此類組態描繪於圖 12C 中。
在一個此類態樣中，第一及第三抗原結合域各自為如本文所描述之互換型Fab分子，且第二抗原結合域為習知Fab分子。在一更特定的此類態樣中，第一及第三抗原結合域各自為其中可變域VH及VL相互交換/置換的互換型Fab分子，且第二抗原結合域為包含如本文所描述之電荷修飾的習知Fab分子。
在另一此類態樣中，第一及第三抗原結合域各自為習知Fab分子，且第二抗原結合域為如本文所描述之互換型Fab分子。在一更特定的此類態樣中，第一及第三抗原結合域各自為包含如本文所描述之電荷修飾的習知Fab分子，且第二抗原結合域為其中可變域VH及VL相互交換/置換的互換型Fab分子。
在另一此類態樣中，Fc域包含促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的修飾。
在又一此類態樣中，(多特異性)抗體基本上由第一、第二及第三抗原結合域及Fc域以及視情況存在之一或多個肽連接子組成。
在其他態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含： (a)    結合NKG2D之第一抗原結合域， (b)    結合第二抗原之第二抗原結合域， (c)    結合NKG2D之第三抗原結合域， (d)    結合NKG2D之第四抗原結合域， (e)    結合NKG2D之第五抗原結合域，及 (f)    由第一亞單元及第二亞單元構成之Fc域； 其中第一、第二、第三、第四及第五抗原結合域各自為Fab分子，且 其中(i)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與第三抗原結合域之Fab重鏈之N端融合，且第三抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，(ii)第四抗原結合域在Fab重鏈之C端與第五抗原結合域之Fab重鏈之N端融合，且第五抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，且(iii)第二抗原結合域在Fab重鏈之N端與Fc域之第一或第二亞單元之C端融合。
例示性之此類組態描繪於圖 12B 中。
在一個此類態樣中，第一、第三、第四及第五抗原結合域各自為如本文所描述之互換型Fab分子，且第二抗原結合域為習知Fab分子。在一更特定的此類態樣中，第一、第三、第四及第五抗原結合域各自為其中可變域VH及VL相互交換/置換的互換型Fab分子，且第二抗原結合域為包含如本文所描述之電荷修飾的習知Fab分子。
在另一此類態樣中，第一、第三、第四及第五抗原結合域各自為習知Fab分子，且第二抗原結合域為如本文所描述之互換型Fab分子。在一更特定的此類態樣中，第一、第三、第四及第五抗原結合域各自為包含如本文所描述之電荷修飾的習知Fab分子，且第二抗原結合域為其中可變域VH及VL相互交換/置換的互換型Fab分子。
在另一此類態樣中，Fc域包含促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的修飾。
在又一此類態樣中，(多特異性)抗體基本上由第一、第二、第三、第四及第五抗原結合域及Fc域以及視情況存在之一或多個肽連接子組成。
在其他態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含： (a)    結合NKG2D之第一抗原結合域， (b)    結合第二抗原之第二抗原結合域， (c)    結合NKG2D之第三抗原結合域， (d)    結合第二抗原之第四抗原結合域， (e)    由第一亞單元及第二亞單元構成之Fc域； 其中第一、第二、第三及第四抗原結合域各自為Fab分子，且 其中第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，第二抗原結合域在Fab重鏈之N端與Fc域之第一亞單元之C端融合，第三抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，且第四抗原結合域在Fab重鏈之N端與Fc域之第二亞單元之C端融合。
例示性之此類組態描繪於圖 12A 中。
在一個此類態樣中，第一及第三抗原結合域各自為如本文所描述之互換型Fab分子，且第二及第四抗原結合域各自為習知Fab分子。在一更特定的此類態樣中，第一及第三抗原結合域各自為其中可變域VH及VL相互交換/置換的互換型Fab分子，且第二及第四抗原結合域各自為包含如本文所描述之電荷修飾的習知Fab分子。
在另一此類態樣中，第一及第三抗原結合域各自為習知Fab分子，且第二及第四抗原結合域各自為如本文所描述之互換型Fab分子。在一更特定的此類態樣中，第一及第三抗原結合域各自為包含如本文所描述之電荷修飾的習知Fab分子，且第二及第四抗原結合域各自為其中可變域VH及VL相互交換/置換的互換型Fab分子。
在另一此類態樣中，(多特異性)抗體基本上由第一、第二、第三及第四抗原結合域及Fc域以及視情況存在之一或多個肽連接子組成。
在其他態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含： (a)    結合NKG2D之第一抗原結合域， (b)    結合第二抗原之第二抗原結合域， (c)    結合NKG2D之第三抗原結合域，及 (d)    由第一亞單元及第二亞單元構成之Fc域； 其中第一及第三抗原結合域各自為Fab分子，且第二抗原結合域為Fv分子，且 其中第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，第三抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，且第二抗原結合域(i)在Fv重鏈之N端與Fc域之第一亞單元之C端融合及在Fv輕鏈之N端與Fc域之第二亞單元之C端融合，或(ii)在Fv重鏈之N端與Fc域之第二亞單元之C端融合及在Fv輕鏈之N端與Fc域之第一亞單元之C端融合。
例示性之此類組態描繪於圖 12D 中。
在一個此類態樣中，第一及第三抗原結合域各自為習知Fab分子。
在另一此類態樣中，Fc域包含促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的修飾。
在又一此類態樣中，(多特異性)抗體基本上由第一、第二及第三抗原結合域及Fc域以及視情況存在之一或多個肽連接子組成。
在其中Fab分子在Fab重鏈之C端經由免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域之亞單元中之每一者之N端融合的(多特異性)抗體之組態中，兩個Fab分子、鉸鏈區及Fc域基本上形成免疫球蛋白分子。在一較佳態樣中，免疫球蛋白分子為IgG類免疫球蛋白。在一甚至更佳態樣中，免疫球蛋白為IgG1 子類免疫球蛋白。在另一態樣中，免疫球蛋白為IgG4 子類免疫球蛋白。在一更佳態樣中，免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。在其他態樣中，免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人類化免疫球蛋白。在一個態樣中，免疫球蛋白包含人類恆定區，特定言之人類Fc區。
抗原結合域可直接或經由包含一或多個胺基酸(通常約2至20個胺基酸)之肽連接子與Fc域融合或彼此融合。肽連接子為此項技術中已知且描述於本文中。適合的非免疫原性肽連接子包括例如(G4 S)n 、(SG4 )n 、(G4 S)n 或G4 (SG4 )n 肽連接子。「n」一般為整數1至10，通常為2至4。在一個態樣中，該肽連接子之長度為至少5個胺基酸，在一個態樣中，長度為5至100個胺基酸，在另一態樣中為10至50個胺基酸。在一個態樣中，該肽連接子為(GxS)n 或(GxS)n Gm ，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸，且(x=3，n=3、4、5或6，且m=0、1、2或3)或(x=4，n=2、3、4或5，且m=0、1、2或3)，在一個態樣中，x=4且n=2或4。在一個態樣中，該肽連接子為(G4 S)2 或(G4 S)4 。在特定態樣中，上文所描述之多特異性抗體型式中用於使第一及第二Fab分子之Fab重鏈彼此融合的肽連接子為(G4 S)2 。在其他特定態樣中，上文所描述之多特異性抗體型式中用於使Fab分子或Fv分子與Fc域之C端融合的肽連接子為(G4 S)4 。適合之肽連接子亦可包含免疫球蛋白鉸鏈區(之一部分)。尤其在Fab分子與Fc域亞單元之N端融合的情況下，其可在存在或不存在額外肽連接子的情況下經由免疫球蛋白鉸鏈區或其一部分融合。在特定態樣中，上文所描述之多特異性抗體型式中Fab分子與Fc域亞單元之N端係經由免疫球蛋白鉸鏈區，較佳地經由與Fc域相同之子類之免疫球蛋白鉸鏈區(例如其中Fc域具有IgG1 子類的IgG1 鉸鏈區)融合。
在一個態樣中，本發明提供一種(多特異性)抗體，其包含： (a)    結合NKG2D之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域包含：包含SEQ ID NO: 73之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 104之HCDR 2及SEQ ID NO: 75之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 76之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 77之LCDR 2及SEQ ID NO: 78之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)， (b)    結合第二抗原，特定言之目標細胞抗原，更特定言之腫瘤細胞抗原之第二抗原結合域，及 (c)    由第一亞單元及第二亞單元構成之Fc域； 其中第一及第二抗原結合域各自為Fab分子，且 其中(i)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，或(ii)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，且第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合。
在一個態樣中，本發明提供一種(多特異性)抗體，其包含： (a)    結合NKG2D之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域包含：包含SEQ ID NO: 73之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 104之HCDR 2及SEQ ID NO: 75之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 76之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 77之LCDR 2及SEQ ID NO: 78之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)， (b)    結合第二抗原，特定言之目標細胞抗原，更特定言之腫瘤細胞抗原之第二抗原結合域，及 (c)    由第一亞單元及第二亞單元構成的Fc域，其包含促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的修飾； 其中第一及第二抗原結合域各自為Fab分子； 其中(i)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，或(ii)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，且第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合。
在一個態樣中，本發明提供一種(多特異性)抗體，其包含： (a)    結合NKG2D之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域包含：包含SEQ ID NO: 73之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 104之HCDR 2及SEQ ID NO: 75之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 76之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 77之LCDR 2及SEQ ID NO: 78之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)， (b)    結合第二抗原，特定言之目標細胞抗原，更特定言之腫瘤細胞抗原之第二抗原結合域，及 (c)    由第一亞單元及第二亞單元構成之Fc域； 其中第一及第二抗原結合域各自為Fab分子； 其中(i)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，或(ii)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，且第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合；且 其中Fc域包含一或多個減少與Fc受體之結合及/或效應功能的胺基酸取代，及/或其中抗體不結合FcγRIIIa (CD16a)。
在一個態樣中，本發明提供一種(多特異性)抗體，其包含： a)     結合NKG2D之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH或恆定域CL及CH1相互置換的Fab分子，且包含：包含SEQ ID NO: 73之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 104之HCDR 2及SEQ ID NO: 75之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 76之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 77之LCDR 2及SEQ ID NO: 78之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； b)     結合第二抗原，特定言之目標細胞抗原，更特定言之腫瘤細胞抗原之第二抗原結合域，其中第二抗原結合域為(習知) Fab分子； c)     由第一亞單元及第二亞單元構成之Fc域； 其中(i)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，或(ii)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，且第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合。
在根據本發明之(多特異性)抗體之所有不同組態中，本文所描述之胺基酸取代(「電荷修飾」)(若存在)可處於第二抗原結合域/Fab分子之CH1及CL域中，或第一抗原結合域/Fab分子之CH1及CL域中。較佳地，其處於第二抗原結合域/Fab分子之CH1及CL域中。根據本發明之概念，若如本文所描述之胺基酸取代發生在第二抗原結合域/Fab分子中，則此類胺基酸取代不發生在第一抗原結合域/Fab分子中。反之，若如本文所描述之胺基酸取代發生在第一抗原結合域/Fab分子中，則此類胺基酸取代不發生在第二抗原結合域/Fab分子中。胺基酸取代較佳地發生在包含其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH1相互置換之Fab分子的(多特異性)抗體中。
在根據本發明之(多特異性)抗體之較佳態樣中，尤其在如本文所描述之胺基酸取代發生在第二抗原結合域/Fab分子中的情況下，第二Fab分子之恆定域CL屬於κ同型。在根據本發明之(多特異性)抗體之其他態樣中，特定言之在如本文所描述之胺基酸取代發生在第一抗原結合域/Fab分子中之情況下，第一抗原結合域/Fab分子之恆定域CL屬於κ同型。在一些態樣中，第二抗原結合域/Fab分子之恆定域CL及第一抗原結合域/Fab分子之恆定域CL屬於κ同型。
在一個態樣中，本發明提供一種(多特異性)抗體，其包含： a)     結合NKG2D之第一抗原結合域，其中第一抗原結合域為其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH相互置換的Fab分子，且包含：包含SEQ ID NO: 73之重鏈互補決定區(HCDR) 1、SEQ ID NO: 104之HCDR 2及SEQ ID NO: 75之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 76之輕鏈互補決定區(LCDR)1、SEQ ID NO: 77之LCDR 2及SEQ ID NO: 78之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； b)     結合第二抗原，特定言之目標細胞抗原，更特定言之腫瘤細胞抗原之第二抗原結合域，其中第二抗原結合域為(習知) Fab分子； c)     由第一亞單元及第二亞單元構成之Fc域； 其中在b)中之第二抗原結合域之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最佳地經精胺酸(R)取代)，且其中在b)中之第二抗原結合域之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；且 其中(i)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，或(ii)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，且第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合。
根據以上態樣中之任一者，(多特異性)抗體之組分(例如Fab分子、Fc域)可直接或經由本文所描述或此項技術中已知之各種連接子(特定言之包含一或多個胺基酸，通常約2至20個胺基酸之肽連接子)融合。適合之非免疫原性肽連接子包括例如(G4 S)n 、(SG4 )n 、(G4 S)n 或G4 (SG4 )n 肽連接子，其中n一般為整數1至10，通常為2至4。
在根據本發明之此等態樣的一個態樣中，第一抗原結合域包含：包含與SEQ ID NO: 112之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 80之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
在根據本發明之此等態樣的一個態樣中，在Fc域之第一亞單元中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在Fc域之第二亞單元中，位置407處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)，且視情況，位置366處之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換(T366S)，且位置368處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A) (根據Kabat EU索引編號)。
在根據本發明之此等態樣的另一態樣中，在Fc域之第一亞單元中，另外，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(S354C)，或位置356處之麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(E356C) (特定言之，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換)，且在Fc域之第二亞單元中，另外，位置349處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(Y349C) (根據Kabat EU索引編號)。
在根據本發明之此等態樣的又一態樣中，在Fc域之第一亞單元及第二亞單元中之每一者中，位置234處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L234A)，位置235處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L235A)，且位置329處之脯胺酸殘基經甘胺酸殘基置換(P329G) (根據Kabat EU索引編號)。
在根據本發明之此等態樣的又一態樣中，Fc域為人類IgG1 Fc域。
在一個態樣中，本發明提供一種結合NKG2D及CEA之(多特異性)抗體，其包含：包含與SEQ ID NO: 209之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽，包含與SEQ ID NO: 210之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽，包含與SEQ ID NO: 211之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽，及包含與SEQ ID NO: 212之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽。在一個態樣中，本發明提供一種結合NKG2D及CEA之(多特異性)抗體，其包含：包含SEQ ID NO: 209之胺基酸序列的多肽，包含SEQ ID NO: 210之胺基酸序列的多肽，包含SEQ ID NO: 211之胺基酸序列的多肽，及包含SEQ ID NO: 212之胺基酸序列的多肽。
在另一態樣中，本發明提供一種結合NKG2D及CEA之(多特異性)抗體，其包含：包含與SEQ ID NO: 213之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽，包含與SEQ ID NO: 214之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽，包含與SEQ ID NO: 215之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽，及包含與SEQ ID NO: 216之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽。在一個態樣中，本發明提供一種結合NKG2D及CEA之(多特異性)抗體，其包含：包含SEQ ID NO: 213之胺基酸序列的多肽，包含SEQ ID NO: 214之胺基酸序列的多肽，包含SEQ ID NO: 215之胺基酸序列的多肽，及包含SEQ ID NO: 216之胺基酸序列的多肽。
在其他態樣中，本發明提供一種結合NKG2D及CEA之(多特異性)抗體，其包含：包含與SEQ ID NO: 213之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽，包含與SEQ ID NO: 214之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽(其中VL區序列(SEQ ID NO: 193)經選自由SEQ ID NO: 185、187、189、191、195、197、199、201、203、205及207組成之群的VL區序列置換)，包含與SEQ ID NO: 215之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽，及包含與SEQ ID NO: 216之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽(其中VH區序列(SEQ ID NO: 192)經選自由SEQ ID NO: 184、186、188、190、194、196、198、200、202、204及206組成之群的VH區序列置換)。在一個態樣中，本發明提供一種結合NKG2D及CEA之(多特異性)抗體，其包含：包含SEQ ID NO: 213之胺基酸序列的多肽，包含SEQ ID NO: 214之胺基酸序列的多肽(其中VL區序列((SEQ ID NO: 193)經選自由SEQ ID NO: 185、187、189、191、195、197、199、201、203、205及207組成之群的VL區序列置換)，包含SEQ ID NO: 215之胺基酸序列的多肽，及包含SEQ ID NO: 216之胺基酸序列的多肽(其中VH區序列(SEQ ID NO: 192)經選自由SEQ ID NO: 184、186、188、190、194、196、198、200、202、204及206組成之群的VH區序列置換)。較佳地，在上文態樣中，VH區及VL區(SEQ ID NO 192及193)經對應於表 16 中所鑑別之結合子的VH區及VL區對置換。
2.    Fc域變異體  在較佳態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含由第一亞單元及第二亞單元構成的Fc域。
(多特異性)抗體之Fc域由包含免疫球蛋白分子之重鏈域的一對多肽鏈組成。舉例而言，免疫球蛋白G (IgG)分子之Fc域為二聚體，其中各亞單元包含CH2及CH3 IgG重鏈恆定域。Fc域之兩個亞單元能夠彼此穩定結合。在一個態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含不超過一個Fc域。
在一個態樣中，(多特異性)抗體之Fc域為IgG Fc域。在一較佳態樣中，Fc域為IgG1 Fc域。在另一態樣中，Fc域為IgG4 Fc域。在一更特定態樣中，Fc域為包含位置S228 (Kabat EU索引編號)之胺基酸取代(特定言之，胺基酸取代S228P)的IgG4 Fc域。此胺基酸取代減少活體內IgG4 抗體之Fab臂交換(參見Stubenrauch等人, Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010))。在一更佳態樣中，Fc域為人類Fc域。在一更佳態樣中，Fc域為人類IgG1 Fc域。人類IgG1 Fc區之例示性序列載於SEQ ID NO: 86中。
a)    促進雜二聚化之Fc域修飾  根據本發明之(多特異性)抗體包含可與Fc域之兩個亞單元中之一者或另一者融合的不同抗原結合域，因此Fc域之兩個亞單元通常包含於兩個不完全相同多肽鏈中。此等多肽之重組共表現及後續二聚化產生兩種多肽之若干種可能的組合。為了改良(多特異性)抗體在重組產生時之產率及純度，因此將有利於的是在(多特異性)抗體之Fc域中引入促進所需多肽之結合的修飾。
因此，在較佳態樣中，根據本發明之(多特異性)抗體之Fc域包含促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的修飾。人類IgG Fc域中之兩個亞單元之間最廣泛蛋白質-蛋白質相互作用的位點位於Fc域之CH3域中。因此，在一個態樣中，該修飾位於Fc域之CH3域中。
存在若干種用於Fc域之CH3域中之修飾以便進行雜二聚化的方法，其詳盡描述於例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291中。通常，在所有此類方法中，Fc域之第一亞單元之CH3域與Fc域之第二亞單元之CH3域皆以互補方式經工程改造，使得各CH3域本身(或包含其之重鏈)不可再發生均二聚，而是被迫與以互補方式經工程改造之另一CH3域雜二聚(使得第一CH3域及第二CH3域雜二聚，而不在兩個第一CH3域或兩個第二CH3域之間形成均二聚體)。涵蓋此等用於改良重鏈雜二聚化之不同方法作為與(多特異性)抗體中之重-輕鏈修飾(例如一個結合臂中之VH及VL交換/置換及在CH1/CL界面中引入具有相反電荷之帶電胺基酸之取代)組合的不同替代方案，該等修飾減少重/輕鏈錯配及本斯-瓊斯型副產物。
在一特定態樣中，促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的該修飾為所謂的「臼包杵」修飾，包含Fc域之兩個亞單元中之一者中的「杵」修飾及Fc域之兩個亞單元中之另一者中的「臼」修飾。
臼包杵技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人, Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。一般而言，方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入對應凹穴(「臼」)，使得隆凸可位於凹穴中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈來構築隆凸。大小與隆凸相同或相似的補償性凹穴係藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈而形成於第二多肽之界面中。
因此，在一較佳態樣中，在(多特異性)抗體之Fc域之第一亞單元之CH3域中，一胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在第一亞單元之CH3域內產生隆凸，其可位於第二亞單元之CH3域內之凹穴中，且在Fc域之第二亞單元之CH3域中，一胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在第二亞單元之CH3域內產生凹穴，第一亞單元之CH3域內之隆凸可位於該凹穴內。
較佳地，具有較大側鏈體積之該胺基酸殘基係選自由精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)組成之群。
較佳地，具有較小側鏈體積的胺基酸殘基係選自由丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)組成之群。
隆凸及凹穴可藉由改變編碼多肽之核酸產生，例如藉由定點突變誘發或藉由肽合成產生。
在一特定態樣中，在Fc域之第一亞單元(「杵」亞單元) (之CH3域)中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在Fc域之第二亞單元(「臼」亞單元) (之CH3域)中，位置407處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)。在一個態樣中，在Fc域之第二亞單元中，另外，位置366之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基(T366S)置換且位置368之白胺酸殘基經丙胺酸殘基(L368A)置換(根據Kabat EU索引編號)。
在又一態樣中，在Fc域之第一亞單元中，另外，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(S354C)或位置356處之麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(E356C)(特定言之，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換)，且在Fc域之第二亞單元中，另外，位置349處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。引入此等兩個半胱胺酸殘基使得Fc域之兩個亞單元之間形成二硫橋鍵，進一步穩定二聚體(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
在一較佳態樣中，Fc域之第一亞單元包含胺基酸取代S354C及T366W，且Fc域之第二亞單元包含胺基酸取代Y349C、T366S、L368A及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。
在一較佳態樣中，結合CD3之抗原結合域與Fc域之第一亞單元(包含「杵」修飾)融合(視情況經由結合第二抗原之第二抗原結合域及/或肽連接子)。不希望受理論束縛，結合CD3之抗原結合域與Fc域之含杵亞單元之融合將(進一步)使包含兩個結合CD3之抗原結合域之抗體的產生減至最少(兩種含杵多肽發生空間位阻)。
涵蓋用於增強雜二聚化之CH3修飾的其他技術作為本發明之替代方案且此等技術描述於例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中。
在一個態樣中，替代地使用EP 1870459中所描述之雜二聚化方法。此方法係基於在Fc域之兩個亞單元之間的CH3/CH3域界面中的特定胺基酸位置引入具有相反電荷的帶電胺基酸。本發明之(多特異性)抗體之特定態樣為(Fc域之)兩個CH3域中之一者中的胺基酸突變R409D、K370E及Fc域之CH3域中之另一者中的胺基酸突變D399K、E357K (根據Kabat EU索引編號)。
在另一態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變T366W及Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變T366S、L368A、Y407V；以及另外Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變R409D、K370E及Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變D399K、E357K (根據Kabat EU索引編號)。
在另一態樣中，本發明之(多特異性)抗體包含Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變S354C、T366W及Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變Y349C、T366S、L368A、Y407V，或該(多特異性)抗體包含Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變Y349C、T366W及Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變S354C、T366S、L368A、Y407V，以及另外在Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變R409D、K370E及Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變D399K、E357K (全部根據Kabat EU索引編號)。
在一個態樣中，替代地使用WO 2013/157953中所描述之雜二聚化方法。在一個態樣中，第一CH3域包含胺基酸突變T366K且第二CH3域包含胺基酸突變L351D (根據Kabat EU索引編號)。在另一態樣中，第一CH3域進一步包含胺基酸突變L351K。在另一態樣中，第二CH3域進一步包含選自Y349E、Y349D及L368E之胺基酸突變(特定言之L368E)(根據Kabat EU索引編號)。
在一個態樣中，替代地使用WO 2012/058768中所描述之雜二聚化方法。在一個態樣中，第一CH3域包含胺基酸突變L351Y、Y407A，且第二CH3域包含胺基酸突變T366A、K409F。在另一態樣中，第二CH3域包含位置T411、D399、S400、F405、N390或K392之另一胺基酸突變，例如選自以下之胺基酸突變：a) T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W；b) D399R、D399W、D399Y或D399K；c) S400E、S400D、S400R或S400K；d) F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W；e) N390R、N390K或N390D；f) K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E (根據Kabat EU索引編號)。在另一態樣中，第一CH3域包含胺基酸突變L351Y、Y407A，且第二CH3域包含胺基酸突變T366V、K409F。在另一態樣中，第一CH3域包含胺基酸突變Y407A，且第二CH3域包含胺基酸突變T366A、K409F。在另一態樣中，第二CH3域進一步包含胺基酸突變K392E、T411E、D399R及S400R (根據Kabat EU索引編號)。
在一個態樣中，替代地使用WO 2011/143545中所描述之雜二聚化方法，例如，其中在選自由368及409組成之群的位置進行胺基酸修飾(根據Kabat EU索引編號)。
在一個態樣中，替代地使用WO 2011/090762中所描述之雜二聚化方法，其亦使用上文所描述之臼包杵技術。在一個態樣中，第一CH3域包含胺基酸突變T366W，且第二CH3域包含胺基酸突變Y407A。在一個態樣中，第一CH3域包含胺基酸突變T366Y，且第二CH3域包含胺基酸突變Y407T (根據Kabat EU索引編號)。
在一個態樣中，(多特異性)抗體或其Fc域屬於IgG2 子類，且替代地使用WO 2010/129304中所描述之雜二聚化方法。
在一替代性態樣中，促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的修飾包含介導靜電轉向效應之修飾，例如PCT公開案WO 2009/089004中所描述。一般而言，此方法涉及用帶電胺基酸殘基置換兩個Fc域亞單元之界面處之一或多個胺基酸殘基，使得均二聚體形成變得在靜電上不利，但雜二聚化在靜電上有利。在一個此類態樣中，第一CH3域包含帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，特定言之K392D或N392D)對K392或N392的胺基酸取代，且第二CH3域包含帶正電胺基酸(例如離胺酸(K)或精胺酸(R)，特定言之D399K、E356K、D356K或E357K，且更特定言之D399K及E356K)對D399、E356、D356或E357的胺基酸取代。在另一態樣中，第一CH3域進一步包含帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，特定言之K409D或R409D)對K409或R409的胺基酸取代。在另一態樣中，第一CH3域進一步或替代地包含帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D))對K439及/或K370的胺基酸取代(全部根據Kabat EU索引編號)。
在又一態樣中，替代地使用WO 2007/147901中所描述之雜二聚化方法。在一個態樣中，第一CH3域包含胺基酸突變K253E、D282K及K322D，且第二CH3域包含胺基酸突變D239K、E240K及K292D (根據Kabat EU索引編號)。
在又一態樣中，替代地使用WO 2007/110205中所描述之雜二聚化方法。
在一個態樣中，Fc域之第一亞單元包含胺基酸取代K392D及K409D，且Fc域之第二亞單元包含胺基酸取代D356K及D399K (根據Kabat EU索引編號)。
b)   降低Fc受體結合及/或效應功能之Fc域修飾  Fc域賦予(多特異性)抗體有利的藥物動力學特性，包括促進於目標組織中良好積聚之長血清半衰期及有利的組織-血液分佈比率。同時，(多特異性)抗體經由其Fc域與表現Fc受體之細胞的結合會引起表現Fc受體之細胞(諸如NK細胞)與其他表現NKG2D之細胞(諸如CD8 T細胞)交聯，且從而引起全身性投與後的不期望之毒性。此外，Fc受體信號傳導路徑之共活化可引起細胞介素釋放，其與(多特異性)抗體之T細胞活化特性及長半衰期組合導致細胞介素受體之過度活化及全身性投與後的嚴重副作用。除T細胞以外之(Fc受體攜帶)免疫細胞之活化甚至可歸因於T細胞(例如NK細胞)之潛在破壞而降低(多特異性)抗體之功效。
因此，在較佳態樣中，根據本發明之(多特異性)抗體之Fc域相較於原生IgG1 Fc域展現降低之Fc受體結合親和力及/或降低之效應功能。在一個此類態樣中，Fc域(或包含該Fc域之(多特異性)抗體)相較於原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域之(多特異性)抗體)展現小於50%、特定言之小於20%、更特定言之小於10%及最特定言之小於5%之Fc受體結合親和力，及/或相較於原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域之(多特異性)抗體)展現小於50%、特定言之小於20%、更特定言之小於10%及最特定言之小於5%之效應功能。在一個態樣中，Fc域(或包含該Fc域之(多特異性)抗體)實質上不結合Fc受體及/或誘導效應功能。在一較佳態樣中，Fc受體為Fcγ受體。在一個實施例中，Fc受體為人類Fc受體。在一個態樣中，Fc受體為活化Fc受體。在一特定態樣中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更具體而言人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具體而言人類FcγRIIIa (CD16a)。在一個態樣中，效應功能為選自CDC、ADCC、ADCP及細胞介素分泌之群的一或多者。在一較佳態樣中，效應功能為ADCC。在一個態樣中，Fc域相較於原生IgG1 Fc域展現實質上類似的與新生兒Fc受體(FcRn)之結合親和力。當Fc域(或包含該Fc域之(多特異性)抗體)展現原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域之(多特異性)抗體)之FcRn結合親和力的大於約70%、特定言之大於約80%、更特定言之大於約90%時，實現實質上類似之FcRn結合。
在某些態樣中，Fc域經工程改造以具有相較於未經工程改造之Fc域降低之Fc受體結合親和力及/或降低之效應功能。在較佳態樣中，(多特異性)抗體之Fc域包含一或多個降低Fc域之Fc受體結合親和力及/或效應功能的胺基酸突變。通常，Fc域之兩個亞單元中之每一者中存在相同的一或多個胺基酸突變。在一個態樣中，胺基酸突變降低Fc域之Fc受體結合親和力。在一個態樣中，胺基酸突變將Fc域之Fc受體結合親和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在其中存在超過一個降低Fc域之Fc受體結合親和力的胺基酸突變之態樣中，此等胺基酸突變之組合可將Fc域之Fc受體結合親和力降低至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在一個態樣中，包含經工程改造Fc域的(多特異性)抗體相較於包含未經工程改造Fc域之(多特異性)抗體展現小於20%、特定言之小於10%、更特定言之小於5%之Fc受體結合親和力。在一較佳態樣中，Fc受體為Fcγ受體。在一些態樣中，Fc受體為人類Fc受體。在一些態樣中，Fc受體為活化Fc受體。在一特定態樣中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更具體而言人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具體而言人類FcγRIIIa (CD16a)。較佳地，減少與此等受體中之每一者的結合。在一些態樣中，亦降低對補體組分之結合親和力，即對C1q之特異性結合親和力。在一個態樣中，對新生兒Fc受體(FcRn)的結合親和力未降低。當Fc域(或包含該Fc域之(多特異性)抗體)展現Fc域之未經工程改造形式(或包含Fc域之該未經工程改造形式的(多特異性)抗體)之FcRn結合親和力的大於約70%時，實現實質上類似之FcRn結合，亦即保留Fc域對該受體之結合親和力。Fc域或包含該Fc域之本發明之(多特異性)抗體可展現此親和力之大於約80%及甚至大於約90%。在某些態樣中，(多特異性)抗體之Fc域經工程改造以具有相較於未經工程改造之Fc域降低之效應功能。降低之效應功能可包括(但不限於)以下中之一或多者：降低之補體依賴性細胞毒性(CDC)、降低之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、減少之抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、減少之細胞介素分泌、減少之免疫複合物介導之抗原呈遞細胞抗原攝入、減少之NK細胞結合、減少之巨噬細胞結合、減少之單核球結合、減少之多形核細胞結合、減少之誘導細胞凋亡之直接信號傳導、減少之目標所結合抗體之交聯、減少之樹突狀細胞成熟或減少之T細胞激活。在一個態樣中，降低之效應功能為選自以下之群的一或多者：降低之CDC、降低之ADCC、減少之ADCP及減少之細胞介素分泌。在一較佳態樣中，降低之效應功能為降低之ADCC。在一個態樣中，降低之ADCC為藉由未經工程改造Fc域(或包含未經工程改造Fc域之(多特異性)抗體)誘導的ADCC之小於20%。
在一個態樣中，降低Fc域之Fc受體結合親和力及/或效應功能的胺基酸突變為胺基酸取代。在一個態樣中，Fc域在選自E233、L234、L235、N297、P331及P329之群的位置處包含胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在一更特定態樣中，Fc域在選自L234、L235及P329之群的位置處包含胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在一些態樣中，Fc域包含胺基酸取代L234A及L235A (根據Kabat EU索引編號)。在一個此類態樣中，Fc域為IgG1 Fc域，特定言之人類IgG1 Fc域。在一個態樣中，Fc域包含在位置P329處之胺基酸取代。在一更特定態樣中，胺基酸取代為P329A或P329G，特定言之P329G (根據Kabat EU索引編號)。在一個態樣中，Fc域包含在位置P329處之胺基酸取代及在選自E233、L234、L235、N297及P331之位置處之另一胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在一更特定態樣中，另一胺基酸取代為E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在較佳態樣中，Fc域包含在位置P329、L234及L235處之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在更佳態樣中，Fc域包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G (「P329G LALA」、「PGLALA」或「LALAPG」)。具體而言，在較佳態樣中，Fc域之各亞單元包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G (Kabat EU索引編號)，亦即在Fc域之第一亞單元及第二亞單元中之每一者中，位置234處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L234A)，位置235處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L235A)，且位置329處之脯胺酸殘基經甘胺酸殘基置換(P329G)(根據Kabat EU索引編號)。
在一個此類態樣中，Fc域為IgG1 Fc域，特定言之人類IgG1 Fc域。「P329G LALA」胺基酸取代組合幾乎完全消除人類IgG1 Fc域之Fcγ受體(以及補體)結合，如PCT公開案第WO 2012/130831號中所描述，該公開案以全文引用之方式併入本文中。WO 2012/130831亦描述製備此類突變Fc域的方法及測定其特性(諸如Fc受體結合或效應功能)的方法。
相較於IgG1 抗體，IgG4 抗體展現降低之Fc受體結合親和力及降低之效應功能。因此，在一些態樣中，本發明之(多特異性)抗體之Fc域為IgG4 Fc域，特定言之人類IgG4 Fc域。在一個態樣中，IgG4 Fc域包含位置S228處之胺基酸取代，具體而言胺基酸取代S228P (根據Kabat EU索引編號)。為了進一步降低其Fc受體結合親和力及/或其效應功能，在一個態樣中，IgG4 Fc域包含位置L235處之胺基酸取代，具體而言胺基酸取代L235E (根據Kabat EU索引編號)。在另一態樣中，IgG4 Fc域包含位置P329處之胺基酸取代，具體而言胺基酸取代P329G (根據Kabat EU索引編號)。在一較佳態樣中，IgG4 Fc域包含位置S228、L235及P329處之胺基酸取代，具體而言胺基酸取代S228P、L235E及P329G (根據Kabat EU索引編號)。此類IgG4 Fc域突變體及其Fcγ受體結合特性描述於PCT公開案第WO 2012/130831號中，該公開案以全文引用之方式併入本文中。
在一較佳態樣中，相較於原生IgG1 Fc域展現降低之Fc受體結合親和力及/或降低之效應功能的Fc域為包含胺基酸取代L234A、L235A及視情況存在之P329G的人類IgG1 Fc域或包含胺基酸取代S228P、L235E及視情況存在之P329G的人類IgG4 Fc域(根據Kabat EU索引編號)。
在某些態樣中，已消除Fc域之N-糖基化。在一個此類態樣中，Fc域包含位置N297處之胺基酸突變，特定言之天冬醯胺經丙胺酸(N297A)或天冬胺酸(N297D)置換的胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。
除上文及PCT公開案第WO 2012/130831號中所描述之Fc域以外，具有降低之Fc受體結合及/或效應功能的Fc域亦包括具有Fc域殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代的Fc域(美國專利第6,737,056號)(根據Kabat EU索引編號)。此類Fc突變體包括具有胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或兩者以上之取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸的所謂「DANA」 Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
突變Fc域可使用此項技術中熟知之遺傳學或化學方法藉由胺基酸缺失、取代、插入或修飾來製備。遺傳學方法可包括DNA編碼序列之定點突變誘發、PCR、基因合成及類似方法。恰當的核苷酸變化可藉由例如定序來檢驗。
與Fc受體的結合可例如藉由ELISA或藉由表面電漿子共振(SPR)、使用標準儀器(諸如BIAcore儀器(GE Healthcare))容易地測定，且可藉由重組表現來獲得諸如Fc受體。或者，Fc域或包含Fc域之(多特異性)抗體的Fc受體結合親和力可使用已知表現特定Fc受體之細胞株(諸如表現FcγIIIa受體之人類NK細胞)評估。
Fc域或包含Fc域之(多特異性)抗體之效應功能可藉由此項技術中已知之方法量測。用於評定所關注分子之ADCC活性的活體外分析之實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及Hellstrom等人, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)中。或者，可採用非放射性分析(參見例如用於流動式細胞測量術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。適用於此類分析之效應細胞包括外周血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可例如在動物模型中，諸如Clynes等人, Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)中所揭示之動物模型中活體內評定所關注分子之ADCC活性。
在一些態樣中，Fc域與補體組分(具體而言C1q)的結合減少。因此，在其中Fc域經工程改造而具有降低之效應功能的一些態樣中，該降低之效應功能包括降低之CDC。可進行C1q結合分析以確定Fc域或包含Fc域之(多特異性)抗體是否能夠結合C1q且因此具有CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評定補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人, J Immunol Methods 202, 163 (1996)；Cragg等人, Blood 101, 1045-1052 (2003)；Cragg及Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004))。
亦可使用此項技術中已知之方法(參見例如Petkova, S.B.等人,Int'l. Immunol . 18(12):1759-1769 (2006)；WO 2013/120929)進行FcRn結合及活體內清除率/半衰期測定。
B.        聚核苷酸  本發明進一步提供一種經分離聚核苷酸，其編碼本發明抗體。此經分離聚核苷酸可為單個聚核苷酸或複數個聚核苷酸。
編碼本發明之(多特異性)抗體的聚核苷酸可表現為編碼整個抗體之單個聚核苷酸或共表現之多個(例如兩個或更多個)聚核苷酸。由共表現之聚核苷酸編碼之多肽可經由例如二硫鍵或其他方式結合，以形成功能性抗體。舉例而言，抗體之輕鏈部分可由與包含抗體之重鏈之抗體部分分離的聚核苷酸編碼。當共表現時，重鏈多肽將與輕鏈多肽結合以形成抗體。在另一實例中，包含兩個Fc域亞單元中之一者及視情況存在之一或多個Fab分子(之部分)的抗體部分可由與包含兩個Fc域亞單元中之另一者及視情況存在之Fab分子(之部分)的抗體部分分離的聚核苷酸編碼。共表現時，Fc域亞單元將結合而形成Fc域。
在一些態樣中，經分離聚核苷酸編碼如本文所描述的根據本發明之整個抗體分子。在其他態樣中，經分離聚核苷酸編碼如本文中所描述的根據本發明之抗體中所包含之多肽。
在某些態樣中，聚核苷酸或核酸為DNA。在其他態樣中，本發明之聚核苷酸為RNA，例如呈信使RNA (mRNA)形式。本發明之RNA可為單股或雙股RNA。
C.       重組方法  本發明抗體可例如藉由固態肽合成(例如梅里菲爾德固相合成(Merrifield solid phase synthesis))或重組產生獲得。為了重組產生，例如如上文所描述之編碼抗體之一或多個聚核苷酸經分離且插入至一或多個載體中以供進一步選殖及/或在宿主細胞中表現。此聚核苷酸可使用習知程序容易地分離及定序。在一個態樣中，提供一種載體，特定言之表現載體，其包含本發明之聚核苷酸(亦即單個聚核苷酸或複數個聚核苷酸)。可使用已為熟習此項技術者所熟知之方法來構築含有抗體之編碼序列以及適當轉錄/轉譯控制信號的表現載體。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/基因重組。參見例如Maniatis等人, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及Ausubel等人, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)中所描述之技術。表現載體可為質體、病毒之部分，或可為核酸片段。表現載體包括表現卡匣，編碼抗體之聚核苷酸(亦即編碼區)以與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件可操作結合之方式經選殖至該表現卡匣中。如本文所用，「編碼區」為由轉譯成胺基酸之密碼子組成的核酸之一部分。雖然「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)未轉譯成胺基酸，但其可視為編碼區(若存在)之部分，但任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'及3'非轉譯區及類似序列)不為編碼區之部分。兩個或更多個編碼區可存在於單一聚核苷酸構築體中，例如單一載體上，或單獨的聚核苷酸構築體中，例如單獨(不同)的載體上。此外，任何載體可含有單一編碼區，或可包含兩個或更多個編碼區，例如本發明載體可編碼一或多個多肽，其經由蛋白水解裂解而轉譯後或共轉譯分離成最終蛋白質。另外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可編碼與編碼本發明抗體的聚核苷酸或其變異體或衍生物融合或未融合的異源編碼區。異源編碼區包括(但不限於)專用元件或基元，諸如分泌性信號肽或異源功能域。可操作結合係在基因產物(例如多肽)之編碼區與一或多個調控序列相關以使得在調控序列之影響或控制下表現基因產物時進行。若誘導啟動子功能導致編碼所需基因產物之mRNA轉錄且若兩個DNA片段之間的鍵聯性質不干擾表現調控序列導引基因產物表現的能力或不干擾DNA模板轉錄的能力，則兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其相關之啟動子)係「可操作地結合」。因此，若啟動子能夠實現核酸轉錄，則啟動子區與編碼多肽之核酸將可操作地結合。啟動子可為僅導引預定細胞中之DNA實質性轉錄的細胞特異性啟動子。除啟動子以外的其他轉錄控制元件(例如強化子、操縱子、抑制子及轉錄終止信號)可與導引細胞特異性轉錄之聚核苷酸可操作地結合。適合之啟動子及其他轉錄控制區揭示於本文中。各種轉錄控制區已為熟習此項技術者所知。此等區域包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，諸如(但不限於)啟動子及強化子區段，其來自巨細胞病毒(例如即刻早期啟動子，與內含子-A結合)、猿猴病毒40 (例如早期啟動子)及反轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因之彼等區域(諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β-血球蛋白)，以及能夠在真核細胞中控制基因表現之其他序列。額外之適合轉錄控制區包括組織特異性啟動子及強化子以及誘導性啟動子(例如可由四環素誘導之啟動子)。類似地，各種轉譯控制元件已為一般熟習此項技術者所知。此等元件包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，以及來源於病毒系統的元件(特定言之，內部核糖體進入位點或IRES，亦稱為CITE序列)。表現卡匣亦可包括其他特徵，諸如複製起點，及/或染色體整合元件，諸如反轉錄病毒長末端重複序列(LTR)，或腺相關病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。
本發明之聚核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌肽或信號肽的額外編碼區結合，從而導引由本發明之聚核苷酸編碼的多肽之分泌。舉例而言，若抗體之分泌為所需的，則編碼信號序列之DNA可置於本發明抗體或其片段之核酸上游。根據信號假設，哺乳動物細胞所分泌之蛋白質具有信號肽或分泌性前導序列，一旦生長蛋白鏈跨越粗糙內質網之輸出已起始，該信號肽或分泌性前導序列即自成熟蛋白質裂解。一般熟習此項技術者認識到，脊椎動物細胞分泌的多肽一般具有與多肽之N端融合的信號肽，該信號肽自所轉譯之多肽裂解而產生呈分泌或「成熟」形式的多肽。在某些態樣中，使用原生信號肽，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽，或保留導引與其可操作地結合之多肽之分泌的能力的彼序列之功能衍生物。或者，可使用異源哺乳動物信號肽，或其功能衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶之前導序列取代。
可用以促進稍後純化(例如，組胺酸標籤)或協助標記抗體的編碼短蛋白序列之DNA可包括於編碼抗體(片段)之聚核苷酸內或處於該聚核苷酸末端處。
在另一態樣中，提供一種宿主細胞，其包含本發明之聚核苷酸(亦即，單個聚核苷酸或複數個聚核苷酸)。在某些態樣中，提供一種宿主細胞，其包含本發明之載體。聚核苷酸及載體可併有本文分別關於聚核苷酸及載體所描述之任一特徵(單個或組合)。在一個此類態樣中，宿主細胞包含一或多個載體(例如經載體轉型或轉染)，該一或多個載體包含一或多個編碼本發明抗體(之部分)的聚核苷酸。如本文所用，術語「宿主細胞」係指可經工程改造以產生本發明抗體或其片段的任何種類之細胞系統。適合於複製及支援抗體表現的宿主細胞為此項技術中所熟知。此類細胞在適當時可經特定表現載體轉染或轉導，且可生長含有大量載體之細胞以用於接種大型醱酵槽，從而獲得足量的抗體用於臨床應用。適合之宿主細胞包括原核微生物，諸如大腸桿菌，或各種真核細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或其類似物。舉例而言，可在細菌中生產多肽，尤其在不需要糖基化時。在表現之後，可自可溶性部分之細菌細胞糊狀物分離出多肽且可將該多肽進一步純化。除原核生物以外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適用於編碼多肽之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已「人類化」，從而使得所產生之多肽具有部分或完全人類糖基化型態的真菌及酵母菌株。參見Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)，及Li等人, Nat Biotech 24, 210-215 (2006)。適用於表現(糖基化)多肽的宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物細胞及昆蟲細胞。已鑑別出眾多可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )細胞之桿狀病毒株。植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述用於在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM 技術)。脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40轉型的猴腎CV1細胞株(COS-7)；人類胚腎細胞株(293或293T細胞，如例如Graham等人, J Gen Virol 36, 59 (1977)中所描述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cells)(TM4細胞，如例如Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)中所描述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞(MMT 060562)；TRI細胞(如例如Mather等人, Annals N. Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)中所描述)；MRC 5細胞及FS4細胞。其他適用之哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr- CHO細胞(Urlaub等人, Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。關於適用於蛋白質產生之某些哺乳動物宿主細胞株之綜述，參見例如Yazaki及Wu, Methods in Molecular Biology, 第248卷(B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ), 第255-268頁 (2003)。宿主細胞包括經培養細胞，例如經培養之哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞(僅舉數例)，且亦包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或經培養之植物或動物組織中所包含的細胞。在一個態樣中，宿主細胞為真核細胞，特定言之哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個態樣中，宿主細胞不為人體內之細胞。
在此等系統中表現外源基因之標準技術為此項技術中已知的。表現包含抗原結合域之重鏈或輕鏈之多肽(諸如抗體)的細胞可經工程改造以便亦表現抗體鏈中之另一者，使得所表現產物為具有重鏈及輕鏈兩者的抗體。
在一個態樣中，提供一種產生根據本發明之抗體的方法，其中該方法包含在適合於表現抗體之條件下培養包含如本文所提供之編碼抗體之聚核苷酸的宿主細胞，及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
本發明之(多特異性)抗體之組分可在基因上彼此融合。(多特異性)抗體可經設計使得其組分直接彼此融合或經由連接子序列間接融合。連接子之組成及長度可根據此項技術中熟知之方法確定且可測試其功效。本文提供(多特異性)抗體之不同組分之間的連接子序列之實例。亦可包括額外序列以併有裂解位點，從而視需要分離融合體之個別組分，該等額外序列例如肽鏈內切酶識別序列。
如本文所描述製備的抗體可藉由此項技術中已知的技術(諸如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和力層析、尺寸排阻層析及其類似者)純化。用於純化特定蛋白質的實際條件將部分地視諸如淨電荷、疏水性、親水性等因素而定，且對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的。對於親和力層析純化，可使用抗體所結合之抗體、配體、受體或抗原。舉例而言，關於本發明抗體之親和力層析純化，可使用具有蛋白A或蛋白G之基質。可使用序列蛋白A或G親和力層析及尺寸排阻層析來分離基本上如實例中所描述之抗體。抗體之純度可藉由各種熟知分析方法中之任一者來測定，該等方法包括凝膠電泳、高壓液相層析及其類似者。
D.       分析  可藉由此項技術中已知之各種分析，針對其物理/化學特性及/或生物活性鑑別、篩選或表徵本文所提供之抗體。
1.    結合分析  抗體對目標抗原或Fc受體之結合(親和力)可例如藉由表面電漿子共振(SPR)，使用諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)之標準儀器測定，且受體或目標蛋白可藉由諸如重組表現獲得。或者，抗體對不同受體或目標抗原之結合可使用表現特定受體或目標抗原之細胞株，例如藉由流動式細胞測量術(FACS)來評估。用於量測與人類或食蟹獼猴NKG2D之結合活性的具體說明性及例示性態樣描述於下文中。
在一個態樣中，藉由SPR來如下測定NKG2D結合活性： 在Biacore B4000儀器(GE Healthcare)上進行SPR。使用標準胺偶合化學方法以約1500共振單位(RU)之表面密度將抗Fab捕獲抗體(GE Healthcare，#28958325)固定在S系列感測器晶片CM5 (GE Healthcare)上。使用PBS-T (包括0.05% Tween20之10 mM磷酸鹽緩衝生理鹽水，pH 7.4)作為運行及稀釋緩衝液。將流動細胞設定成25℃且用運作緩衝液預塗佈兩次。
藉由以10 µl/min之流動速率持續60秒注射約10 µg/ml溶液來捕獲抗體。藉由在1:3稀釋後以600 nM、300 nM、150 nM開始，以30 µl/min之流動速率持續180 s注射呈溶液的各種濃度之di huNKG2D ECD Fc avi (SEQ ID NO: 96)或di cyNKG2D ECD Fc avi (SEQ ID NO: 97)來量測結合。解離階段經監測長達450 s且藉由自樣本溶液切換為運行緩衝液來觸發。藉由用10 mM甘胺酸pH 2.1以30 µl/min之流動速率洗滌2×90 s以及額外穩定180 s之時段來使表面再生。藉由減除用單獨的捕獲抗體自表面獲得之反應來校正整體折射率差異。亦減除空白注射(=二次參考)。為了計算KD 、ka 及kd ，使用Biacore 4000評估軟體1.1 (GE Healthcare)或TraceDrawer 1.6.1 (Ridgeview Instruments AB)中之朗繆爾1:1模型。
2.    活性分析  本發明之(多特異性)抗體之生物活性可藉由如實例中所描述之各種分析來量測。生物活性可例如包括誘導表現NKG2D之細胞之增殖、誘導表現NKG2D之細胞中之信號傳導、誘導表現NKG2D之細胞中之活化標記物的表現、誘導表現NKG2D之細胞分泌細胞介素、誘導目標細胞(諸如腫瘤細胞)溶解及誘導腫瘤消退及/或改善存活率。
E.        組合物、調配物及投與途徑  在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所提供之任何抗體，其用於例如以下治療方法中之任一者中。在一個態樣中，醫藥組合物包含根據本發明之抗體及醫藥學上可接受之載劑。在另一態樣中，醫藥組合物包含根據本發明之抗體及至少一種例如下文所描述之額外治療劑。
進一步提供一種產生呈適於活體內投與之形式的本發明抗體的方法，該方法包含：(a)獲得根據本發明之抗體，及(b)調配抗體與至少一種醫藥學上可接受之載劑，由此調配用於活體內投與之抗體製劑。
本發明之醫藥組合物包含有效量的溶解或分散於醫藥學上可接受之載劑中的抗體。片語「醫藥學上可接受」係指分子實體及組合物在所用劑量及濃度下對於接受者而言一般為無毒性的，亦即當在適當時投與至動物(諸如人類)時，不會產生有害的過敏反應或其他不良反應。含有抗體及視情況存在之額外活性成分的醫藥組合物之製備為熟習此項技術者根據本發明將已知的，如藉由以引用之方式併入本文中的Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版 Mack印刷公司, 1990所例示。此外，關於動物(例如人類)投與，應理解，製劑應滿足FDA生物學標準辦公室(FDA Office of Biological Standards)或其他國家之對應機關所要求的無菌性、發熱性、總體安全及純度標準。較佳組合物為凍乾調配物或水溶液。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括一般熟習此項技術者將已知的任何及所有溶劑、緩衝劑、分散介質、包衣、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等張劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、抗氧化劑、蛋白質、藥物、藥物穩定劑、聚合物、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料、此類類似物質及其組合(參見例如以引用之方式併入本文中的Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版 Mack印刷公司, 1990, 第1289-1329頁)。除非任何習知載劑與活性成分不相容，否則考慮將其用於醫藥組合物中。
本發明抗體(及任何額外治療劑)可藉由任何合適方式投與，該等方式包括非經腸、肺內及鼻內投與，且視需要針對局部治療，包括病灶內投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。部分視投與之短期或長期性而定，可藉由任何適合途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥。
非經腸組合物包括彼等為藉由注射(例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射)投與所設計的組合物。為了注射，本發明抗體可在水溶液中，特定言之在生理學上相容之緩衝液(諸如漢克氏溶液(Hanks' solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理鹽水緩衝液)中調配。溶液可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，抗體可呈粉末形式以在使用之前用適合媒劑(例如無菌無熱原質水)復原。無菌可注射溶液係藉由將所需量之本發明抗體併入視需要具有下文所列舉之各種其他成分的適當溶劑中來製備。無菌性很容易例如藉由經過無菌過濾膜過濾來實現。一般而言，分散液係藉由將各種滅菌活性成分併入含有基本分散介質及/或其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液、懸浮液或乳液之無菌粉末情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，其得到活性成分加上來自預先無菌過濾之液體介質的任何額外所需成分的粉末。必要時，液體介質應經過適當緩衝，且在與足量鹽水或葡萄糖一起注射之前，首先使液體稀釋劑呈等張性。該組合物必須在製造及儲存條件下穩定，且避免諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。應瞭解，內毒素污染應最低限度地保持在安全水準，例如低於0.5 ng/mg蛋白質。適合的醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)：緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨(hexamethonium chloride)；氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)；氯化苯索銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成鹽之抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子性界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之化合物，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、葡聚糖或其類似物。視情況，懸浮液亦可含有適合穩定劑或增加化合物溶解性以允許製備高度濃溶液之藥劑。另外，活性化合物之懸浮液可製備為適當之油性注射懸浮液。適合親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯；或脂質體。
活性成分可截留於微膠囊中，例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備之微膠囊，例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；截留於膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版, Mack印刷公司, 1990)中。可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有多肽之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形製品形式，例如膜或微膠囊。在特定態樣中，可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來實現。
除先前描述之組合物以外，抗體亦可調配為儲槽式製劑。此類長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內植入)或藉由肌肉內注射來投與。因此，舉例而言，抗體可用適合聚合材料或疏水性材料(例如於可接受之油中的乳液)或離子交換樹脂調配，或調配為微溶性衍生物，例如微溶性鹽。
包含本發明抗體的醫藥組合物可藉助於習知混合、溶解、乳化、囊封、包覆或凍乾製程製造。醫藥組合物可使用一或多種有助於將蛋白質處理成可在醫藥學上使用之製劑的生理學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑而以習知方式調配。適當之調配物視所選投與途徑而定。
抗體可調配成游離酸或鹼、中性或鹽形式之組合物。醫藥學上可接受之鹽為實質上保持游離酸或鹼之生物活性的鹽。此等鹽包括酸加成鹽，例如與蛋白質組合物之游離胺基形成的鹽，或與無機酸(諸如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、酒石酸或杏仁酸)形成的鹽。與游離羧基形成之鹽亦可來源於無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)。相較於對應的游離鹼形式，醫藥鹽往往更可溶於水性及其他質子溶劑中。
F.        治療方法及組合物  本文所提供之任何抗體可用於治療方法中。本發明抗體可用作免疫治療劑，例如治療癌症的免疫治療劑。
為了用於治療方法中，本發明抗體將以符合良好醫學實踐的方式調配、給藥及投與。在此情形下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病況、病症起因、藥劑遞送位點、投與方法、投與時程及醫學從業者已知之其他因素。
在一個態樣中，提供本發明抗體以用作藥物。在其他態樣中，提供用於治療疾病之本發明抗體。在某些態樣中，提供用於治療方法中的本發明抗體。在一個態樣中，本發明提供一種用於治療有需要之個體之疾病的本發明抗體。在某些態樣中，本發明提供一種用於治療患有疾病之個體的方法中之抗體，該方法包含向個體投與有效量之抗體。在某些態樣中，待治療之疾病為增生性病症。在一較佳態樣中，疾病為癌症。在某些態樣中，若待治療之疾病為癌症，則該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑，例如抗癌劑。在其他態樣中，本發明提供一種用於誘導目標細胞(特定言之腫瘤細胞)溶解的本發明抗體。在某些態樣中，本發明提供一種用於誘導個體中之目標細胞(特定言之腫瘤細胞)溶解之方法的本發明抗體，該方法包含向個體投與有效量之抗體以誘導目標細胞溶解。在某些態樣中，該方法進一步包含投與T細胞活化劑，諸如結合CD3之抗體，特定言之結合CD3及目標細胞抗原(特定言之腫瘤細胞抗原)之雙特異性抗體。在某些態樣中，與T細胞活化劑，諸如結合CD3之抗體，特定言之結合CD3及目標細胞抗原(特定言之腫瘤細胞抗原)之雙特異性抗體組合使用。根據以上態樣中之任一者的「個體」為哺乳動物，較佳地人類。
在另一態樣中，本發明提供本發明抗體用於製造或製備藥物之用途。在一個態樣中，藥物用於治療有需要之個體的疾病。在另一態樣中，藥物用於治療疾病之方法中，該方法包含向患有疾病之個體投與有效量之藥物。在某些態樣中，待治療之疾病為增生性病症。在一較佳態樣中，疾病為癌症。在一個態樣中，若待治療之疾病為癌症，則該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑，例如抗癌劑。在另一態樣中，藥物係用於誘導目標細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶解。在又一態樣中，藥物係用於在個體中誘導目標細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶解的方法中，該方法包含向個體投與有效量之藥物以誘導目標細胞溶解。在某些態樣中，該方法進一步包含投與T細胞活化劑，諸如結合CD3之抗體，特定言之結合CD3及目標細胞抗原(特定言之腫瘤細胞抗原)之雙特異性抗體。在某些態樣中，與T細胞活化劑，諸如結合CD3之抗體，特定言之結合CD3及目標細胞抗原(特定言之腫瘤細胞抗原)之雙特異性抗體組合進行治療。根據以上態樣中之任一者的「個體」可為哺乳動物，較佳地人類。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療疾病之方法。在一個態樣中，該方法包含向患有此類疾病之個體投與有效量之本發明抗體。在一個態樣中，向該個體投與組合物，該組合物包含呈醫藥學上可接受之形式的本發明抗體。在某些態樣中，待治療之疾病為增生性病症。在一較佳態樣中，疾病為癌症。在某些態樣中，若待治療之疾病為癌症，則該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑，例如抗癌劑。在某些態樣中，該方法進一步包含投與T細胞活化劑，諸如結合CD3之抗體，特定言之結合CD3及目標細胞抗原(特定言之腫瘤細胞抗原)之雙特異性抗體。根據以上態樣中之任一者的「個體」可為哺乳動物，較佳地人類。
在另一態樣中，本發明提供一種用於誘導目標細胞(特定言之腫瘤細胞)溶解之方法。在一個態樣中，該方法包含使目標細胞與本發明抗體在T細胞(特定言之細胞毒性T細胞)存在下接觸。在另一態樣中，提供一種用於在個體中誘導目標細胞(特定言之，腫瘤細胞)溶解的方法。在一個此類態樣中，該方法包含向個體投與有效量之本發明抗體以誘導目標細胞溶解。在某些態樣中，該方法進一步包含投與T細胞活化劑，諸如結合CD3之抗體，特定言之結合CD3及目標細胞抗原(特定言之腫瘤細胞抗原)之雙特異性抗體。在一個態樣中，「個體」為人類。
在某些態樣中，待治療之疾病為增生性病症，特定言之癌症。癌症之非限制性實例包括膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌及腎癌。可使用本發明抗體治療的其他細胞增生病症包括(但不限於)位於以下中之贅瘤：腹部、骨骼、乳房、消化系統、肝臟、胰臟、腹膜、內分泌腺(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睾丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭頸部、神經系統(中樞及周邊)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾臟、胸部區域及泌尿生殖系統。亦包括癌前病況或病變及癌症轉移。在某些態樣中，癌症係選自以下組成之群：腎癌、膀胱癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、腦癌、頭頸癌及前列腺癌。在一個態樣中，該癌症為表現第二抗原之癌症。熟習此項技術者容易認識到，在許多情況下，抗體可能不會提供治癒，而僅僅可能提供部分益處。在一些態樣中，具有一些益處之生理變化亦視為治療上有益的。因此，在一些態樣中，提供生理學變化之抗體之量視為「有效量」。需要治療之個體(subject/individual)或患者通常為哺乳動物，更具體而言為人類。
在一些態樣中，向個體投與有效量之本發明抗體以治療疾病。
為了預防或治療疾病，本發明抗體(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)之適當劑量將視以下而定：待治療之疾病類型、投與途徑、患者體重、抗體類型、疾病嚴重程度及病程、抗體係為了預防目的抑或治療目的而投與、先前或同時之治療干預、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷。負責投與的從業者無論如何將確定組合物中活性成分之濃度及適用於個別個體的劑量。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投與或經各個時間點多次投與、藥團投與及脈衝式輸注。
一次性或歷經一系列治療向患者適當地投與抗體。視疾病的類型及嚴重程度而定，約1 µg/kg至15 mg/kg (例如0.1 mg/kg至10 mg/kg)抗體可為向患者投與的初始候選劑量，不論是例如藉由一或多次分開投與抑或藉由連續輸注。視上文所提及之因素而定，一個典型的日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg之範圍內或大於100 mg/kg。對於歷經數日或更長時間之重複投與，治療一般將視病況而定持續至發生對疾病症狀之所需抑制為止。抗體之一個例示性劑量將在約0.005 mg/kg至約10 mg/kg範圍內。在其他非限制性實例中，每次投與時的劑量亦可包含每公斤體重約1微克、每公斤體重約5微克、每公斤體重約10微克、每公斤體重約50微克、每公斤體重約100微克、每公斤體重約200微克、每公斤體重約350微克、每公斤體重約500微克、每公斤體重約1毫克、每公斤體重約5毫克、每公斤體重約10毫克、每公斤體重約50毫克、每公斤體重約100毫克、每公斤體重約200毫克、每公斤體重約350毫克、每公斤體重約500毫克至每公斤體重約1000毫克或1000毫克以上，及可自其中推導的任何範圍。在本文所列數值之可推導範圍之非限制性實例中，基於上文所描述之數值，可投與的範圍為每公斤體重約5 mg至約每公斤體重約100 mg、每公斤體重約5微克至約每公斤體重約500毫克等。因此，可向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任何組合)之一或多種劑量。此類劑量可間歇地投與，例如每週或每三週(例如以使得患者接受約二至約二十或例如約六劑抗體)。可投與初始較高起始劑量，接著可投與一或多種較低劑量。然而，其他劑量方案可為適用的。此療法之進展易於藉由習知技術及分析來監測。
本發明抗體一般將以有效達成預期目的之量使用。為用於治療或預防疾病病況，本發明抗體或其醫藥組合物以有效量投與或施加。
針對全身性投藥，可首先根據活體外分析(諸如細胞培養分析)估計有效劑量。隨後可在動物模型中調配劑量以實現循環濃度範圍，包括如在細胞培養物中測定的IC50 。此類資訊可用於更準確地確定適用於人類之劑量。
亦可使用此項技術中熟知的技術根據活體內資料(例如動物模型)估計初始劑量。
劑量及時間間隔可個別地經調整以提供足以維持治療作用之抗體的血漿含量。常見的患者注射投與劑量在約0.1至50毫克/公斤/天，通常約0.5至1毫克/公斤/天之範圍內。治療有效血漿含量可藉由每天投與多次劑量來實現。血漿含量可例如藉由HPLC來量測。
本發明抗體的有效劑量一般將提供治療益處而不引起實質毒性。抗體之毒性及治療功效可在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥程序來確定。可使用細胞培養分析及動物研究來測定LD50 (50%群體致死劑量)及ED50 (50%群體治療有效劑量)。毒性作用與治療作用之間的劑量比為治療指數，其可表述為比率LD50 /ED50 。展現大治療指數之抗體較佳。在一個態樣中，根據本發明之抗體展現高治療指數。自細胞培養分析及動物研究獲得之資料可用於調配適用於人類的劑量範圍。劑量較佳在循環濃度範圍內，其包括毒性極小或無毒性的ED50 。劑量可視各種因素而在此範圍內變化，該等因素例如所用劑型、所用投與途徑、個體之狀況及其類似因素。可由個別醫師根據患者狀況選擇確切調配物、投與途徑及劑量(參見例如Fingl等人, 1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第1章, 第1頁，其以全文引用之方式併入本文中)。
用本發明抗體治療之患者的主治醫師將知曉如何及何時因毒性、器官功能異常及其類似因素而終止、中斷或調整投與。反之，主治醫師亦將知曉在臨床反應不足(排除毒性)時將治療調整至較高水準。管理所關注病症時所投與之劑量的量值將隨待治療之病況的嚴重程度、投與途徑及其類似因素而變化。病況之嚴重程度可例如部分地藉由標準預後評估方法來加以評估。此外，劑量及可能的給藥頻率亦將根據個別患者之年齡、體重及反應而變化。
本發明抗體可與療法中之一或多種其他藥劑組合投與。舉例而言，本發明抗體可與至少一種額外治療劑共投與。術語「治療劑」涵蓋經投與以治療需要此類治療之個體之症狀或疾病的任何藥劑。此類額外治療劑可包含適合於治療特定疾病的任何活性成分，較佳為具有互補活性、彼此間無不利影響的彼等活性成分。在某些態樣中，額外治療劑為免疫調節劑、細胞生長抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性劑、細胞凋亡活化劑或提高細胞對細胞凋亡誘導劑之敏感度的藥劑。在一個態樣中，額外治療劑為抗癌劑，例如微管瓦解劑、抗代謝物、拓樸異構酶抑制劑、DNA嵌入劑、烷化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡活化劑或抗血管生成劑。在較佳態樣中，額外治療劑為T細胞活化劑。在一個此類態樣中，額外治療劑為結合CD3之抗體，特定言之結合CD3及目標細胞抗原(特定言之腫瘤細胞抗原)之雙特異性抗體。在一個態樣中，額外治療劑結合之目標細胞抗原與第二抗原相同，及/或如同第二抗原一樣共表現(例如在相同目標細胞上)。
在一個態樣中，額外治療劑為CD3×CEA雙特異性抗體。可與本發明之抗NKG2D (多特異性)抗體組合使用的CD3×CEA雙特異性抗體之其他態樣描述於下文中。在一特定態樣中，額外治療劑為CEA-TCB (SEQ ID NO 130-135 (CD3)及138-143 (CEA)之CDR序列、SEQ ID NO 136及137 (CD3)以及144及145 (CEA)之可變區序列、SEQ ID NO 154-157之完整序列)或CEA-TCB (2) (SEQ ID NO 130-135 (CD3)及146-151 (CEA)之CDR序列、SEQ ID NO 136及137 (CD3)以及152及153 (CEA)之可變區序列、SEQ ID NO 158-161之完整序列)。
此類其他藥劑宜以有效用於預期目的之量組合存在。此類其他藥劑之有效量視所用抗體之量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因素而定。該等抗體一般係以相同劑量且以如本文所描述之投與途徑，或本文所描述之劑量的約1至99%，或以憑經驗/臨床上確定適當之任何劑量及任何途徑使用。
上文提及之此類組合療法涵蓋組合投與(其中相同或分開之組合物中包括兩種或更多種治療劑)以及分開投與，在此情況下，本發明抗體的投與可在額外治療劑及/或佐劑投與之前、同時及/或之後進行。本發明抗體亦可與放射線療法組合使用。
與本發明抗體組合之 CD3×CEA 雙特異性抗體 CD3×CEA雙特異性抗體包含特異性結合CD3之第一抗原結合部分及特異性結合CEA之第二抗原結合部分。
在一個態樣中，第一抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO:130之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 131之HCDR2及SEQ ID NO: 132之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 133之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 134之LCDR2及SEQ ID NO: 135之LCDR3的輕鏈可變區。
在一個態樣中，第二抗原結合部分包含：包含SEQ ID NO: 138之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 139之HCDR2、SEQ ID NO: 140之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 141之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 142之LCDR2及SEQ ID NO: 143之LCDR3的輕鏈可變區；或(ii)包含SEQ ID NO: 146之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 147之HCDR2及SEQ ID NO: 148之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 149之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 150之LCDR2及SEQ ID NO: 151之LCDR3的輕鏈可變區。
在一特定態樣中，CD3×CEA雙特異性抗體包含： (i)       第一抗原結合部分，其特異性結合CD3且包含：包含SEQ ID NO:130之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 131之HCDR2及SEQ ID NO: 132之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 133之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 134之LCDR2及SEQ ID NO: 135之LCDR3的輕鏈可變區；及 (ii)      第二抗原結合部分，其特異性結合CEA且包含：包含SEQ ID NO: 138之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 139之HCDR2及SEQ ID NO: 140之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 141之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 142之LCDR2及SEQ ID NO: 143之LCDR3的輕鏈可變區；或(ii)包含SEQ ID NO: 146之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 147之HCDR2及SEQ ID NO: 148之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 149之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 150之LCDR2及SEQ ID NO: 151之LCDR3的輕鏈可變區。
在一個態樣中，第一抗原結合部分包含與SEQ ID NO: 136之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列及與SEQ ID NO: 137之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列。
在一個態樣中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO: 136之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 137之輕鏈可變區序列。
在一個態樣中，第二抗原結合部分包含：與SEQ ID NO: 144之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列及與SEQ ID NO: 145之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列；或(ii)與SEQ ID NO: 152之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列及與SEQ ID NO: 153之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列。
在一個態樣中，第二抗原結合部分包含：SEQ ID NO: 144之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 145之輕鏈可變區序列；或(ii)SEQ ID NO: 152之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 153之輕鏈可變區序列。
在一些態樣中，第一及/或第二抗原結合部分為Fab分子。在一些態樣中，第一抗原結合部分為其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變區或恆定區交換的互換型Fab分子。在此等態樣中，第二抗原結合部分較佳地為習知Fab分子。
在其中雙特異性抗體之第一及第二抗原結合部分皆為Fab分子的一些態樣中，且在抗原結合部分中之一者(特定言之第一抗原結合部分)中，Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL及VH係相互置換， i) 在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經帶正電胺基酸取代(根據Kabat編號)，且其中在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸經帶負電胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)；或 ii)     在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經帶正電胺基酸取代(根據Kabat編號)，且其中在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸經帶負電胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。
雙特異性抗體不同時包含i)及ii)提及之修飾。具有VH/VL交換之抗原結合部分之恆定域CL及CH1不相互置換(亦即，保持不交換)。
在一更特定態樣中， i) 在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；或 ii)     在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個此類態樣中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在另一態樣中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一特定態樣中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一更特定態樣中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一更特定態樣中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在特定態樣中，若根據以上態樣之胺基酸取代發生於第二抗原結合部分之恆定域CL及恆定域CH1中，則第二抗原結合部分之恆定域CL屬於κ同型。
在一些態樣中，第一及第二抗原結合部分視情況經由肽連接子彼此融合。
在一些態樣中，第一及第二抗原結合部分各自為Fab分子，且(i)第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端融合，或(ii)第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第二抗原結合部分之Fab重鏈之N端融合。
在一些態樣中，CD3×CEA雙特異性抗體提供與CD3之單價結合。
在特定態樣中，CD3×CEA雙特異性抗體包含特異性結合CD3之單一抗原結合部分及特異性結合CEA之兩個抗原結合部分。因此，在一些態樣中，CD3×CEA雙特異性抗體包含特異性結合CEA之第三抗原結合部分。在一些態樣中，第三抗原部分與第一抗原結合部分一致(例如亦為Fab分子且包含相同胺基酸序列)。
在特定態樣中，CD3×CEA雙特異性抗體進一步包含由第一亞單元及第二亞單元構成的Fc域。在一個態樣中，Fc域為IgG Fc域。在一特定態樣中，Fc域為IgG1 Fc域。在另一態樣中，Fc域為IgG4 Fc域。在一更特定態樣中，Fc域為包含位置S228 (Kabat EU索引編號)之胺基酸取代(特定言之，胺基酸取代S228P)的IgG4 Fc域。此胺基酸取代減少活體內IgG4 抗體之Fab臂交換(參見Stubenrauch等人, Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010))。在另一特定態樣中，Fc域為人類Fc域。在一尤佳態樣中，Fc域為人類IgG1 Fc域。人類IgG1 Fc區之例示性序列載於SEQ ID NO: 86中。
在其中第一、第二及視情況存在之第三抗原結合部分各自為Fab分子的一些態樣中，(a)(i)第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端融合且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，或(ii)第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第二抗原結合部分之Fab重鏈之N端融合且第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合；且(b)第三抗原結合部分當存在時在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合。
在特定態樣中，Fc域包含促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的修飾。人類IgG Fc域中之兩個亞單元之間的最廣泛蛋白質-蛋白質相互作用的位點位於CH3域中。因此，在一個態樣中，該修飾位於Fc域之CH3域中。
在一特定態樣中，促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的該修飾為所謂的「臼包杵」修飾，包含Fc域之兩個亞單元中之一者中的「杵」修飾及Fc域之兩個亞單元中之另一者中的「臼」修飾。臼包杵技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人, Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。一般而言，方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入對應凹穴(「臼」)，使得隆凸可位於凹穴中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈來構築隆凸。大小與隆凸相同或相似的補償性凹穴係藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈而形成於第二多肽之界面中。
因此，在一些態樣中，Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在第一亞單元之CH3域內產生隆凸，該隆凸可定位於第二亞單元之CH3域內的凹穴中，且Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸殘基係經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在第二亞單元之CH3域內產生凹穴，第一亞單元之CH3域內的隆凸可定位於該凹穴內。較佳地，具有較大側鏈體積之該胺基酸殘基係選自由精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)組成之群。較佳地，具有較小側鏈體積的胺基酸殘基係選自由丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)組成之群。隆凸及凹穴可藉由改變編碼多肽之核酸產生，例如藉由定點突變誘發或藉由肽合成產生。
在一特定的此類態樣中，在Fc域之第一亞單元中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在Fc域之第二亞單元中，位置407處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)，且視情況，位置366處之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換(T366S)，且位置368處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A) (根據Kabat EU索引編號)。在另一態樣中，在Fc域之第一亞單元中，另外，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(S354C)或位置356處之麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(E356C)(特定言之，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換)，且在Fc域之第二亞單元中，另外，位置349處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。在一較佳態樣中，Fc域之第一亞單元包含胺基酸取代S354C及T366W，且Fc域之第二亞單元包含胺基酸取代Y349C、T366S、L368A及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。
在一些態樣中，Fc域包含一或多個降低Fc受體結合及/或效應功能的胺基酸取代。
在一特定態樣中，Fc受體為Fcγ受體。在一個態樣中，Fc受體為人類Fc受體。在一個態樣中，Fc受體為活化Fc受體。在一特定態樣中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更具體而言人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具體而言人類FcγRIIIa (CD16a)。在一個態樣中，效應功能為選自以下之群的一或多者：補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)及細胞介素分泌。在一特定態樣中，效應功能為ADCC。
通常，相同的一或多個胺基酸取代存在於Fc域之兩個亞單元中之每一者中。在一個態樣中，一或多個胺基酸取代降低Fc域之Fc受體結合親和力。在一個態樣中，一或多個胺基酸取代使Fc域之Fc受體結合親和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。
在一個態樣中，Fc域在選自E233、L234、L235、N297、P331及P329之群的位置處包含胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在一更特定態樣中，Fc域在選自L234、L235及P329之群的位置處包含胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在一些態樣中，Fc域包含胺基酸取代L234A及L235A (根據Kabat EU索引編號)。在一個此類態樣中，Fc域為IgG1 Fc域，特定言之人類IgG1 Fc域。在一個態樣中，Fc域包含在位置P329處之胺基酸取代。在一更特定態樣中，胺基酸取代為P329A或P329G，特定言之P329G (根據Kabat EU索引編號)。在一個態樣中，Fc域包含在位置P329處之胺基酸取代及在選自E233、L234、L235、N297及P331之位置處之另一胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在一更特定態樣中，另一胺基酸取代為E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定態樣中，Fc域包含在位置P329、L234及L235處之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在更特定態樣中，Fc域包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G (「P329G LALA」、「PGLALA」或「LALAPG」)。具體而言，在較佳態樣中，Fc域之各亞單元包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G (Kabat EU索引編號)，亦即在Fc域之第一亞單元及第二亞單元中之每一者中，位置234處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L234A)，位置235處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L235A)，且位置329處之脯胺酸殘基經甘胺酸殘基置換(P329G)(根據Kabat EU索引編號)。在一個此類態樣中，Fc域為IgG1 Fc域，特定言之人類IgG1 Fc域。
在一較佳態樣中，CD3×CEA雙特異性抗體包含： (i)       特異性結合CD3之第一抗原結合部分，其包含：包含SEQ ID NO:130之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 131之HCDR2及SEQ ID NO: 132之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 133之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 134之LCDR2及SEQ ID NO: 135之LCDR3的輕鏈可變區，其中第一抗原結合部分為其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變區或恆定區(特定言之恆定區)交換的互換型Fab分子； (ii)   特異性結合CEA之第二及第三抗原結合部分，其包含：包含SEQ ID NO: 138之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 139之HCDR2及SEQ ID NO: 140之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 141之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 142之LCDR2及SEQ ID NO: 143之LCDR3的輕鏈可變區，其中第二及第三抗原結合部分各自為Fab分子，特定言之習知Fab分子； (iii)    由第一亞單元及第二亞單元構成之Fc域； 其中第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端融合，且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且其中第三抗原結合部分在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合。
在一個態樣中，第一抗原結合部分包含與SEQ ID NO: 136之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列及與SEQ ID NO: 137之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列。
在一個態樣中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO: 136之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 137之輕鏈可變區序列。
在一個態樣中，第二及第三抗原結合部分包含與SEQ ID NO: 144之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列及與SEQ ID NO: 145之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列。
在一個態樣中，第二及第三抗原結合部分包含SEQ ID NO: 144之重鏈可變區及SEQ ID NO: 145之輕鏈可變區。
根據以上態樣之Fc域可單獨或組合併有上文關於Fc域所描述之所有特徵。
在一個態樣中，抗原結合部分及Fc區藉由肽連接子，特定言之藉由如SEQ ID NO: 154及SEQ ID NO: 155中之肽連接子彼此融合。
在一個態樣中，CD3×CEA雙特異性抗體包含：包含與SEQ ID NO: 154之序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的多肽，包含與SEQ ID NO: 155之序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的多肽，包含與SEQ ID NO: 156之序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的多肽，及包含與SEQ ID NO: 157之序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的多肽(特定言之兩個多肽)。
在一個態樣中，CD3×CEA雙特異性抗體包含：包含SEQ ID NO: 154之序列的多肽，包含SEQ ID NO: 155之序列的多肽，包含SEQ ID NO: 156之序列的多肽，及包含SEQ ID NO: 157之序列的多肽(特定言之兩個多肽)。
在一特定態樣中，CD3×CEA雙特異性抗體為西必沙他單抗(cibisatamab)(WHO Drug Information (International Nonproprietary Names for Pharmaceutical Substances), Recommended INN: 目錄80, 2018, 第32卷, 第3期, 第438頁)。
在一個態樣中，CD3×CEA雙特異性抗體包含： (i)       特異性結合CD3之第一抗原結合部分，其包含：包含SEQ ID NO:130之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 131之HCDR2及SEQ ID NO: 132之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 133之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 134之LCDR2及SEQ ID NO: 135之LCDR3的輕鏈可變區，其中第一抗原結合部分為其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變區或恆定區(特定言之可變區)交換的互換型Fab分子； (ii)      特異性結合CEA之第二及第三抗原結合部分，其包含：包含SEQ ID NO: 146之重鏈CDR (HCDR) 1、SEQ ID NO: 147之HCDR2及SEQ ID NO: 148之HCDR3的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 149之輕鏈CDR (LCDR) 1、SEQ ID NO: 150之LCDR2及SEQ ID NO: 151之LCDR3的輕鏈可變區，其中第二及第三抗原結合部分各自為Fab分子，特定言之習知Fab分子； (iii)  由能夠穩定結合之第一亞單元與第二亞單元構成之Fc域， 其中第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與第一抗原結合部分之Fab重鏈之N端融合，且第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且其中第三抗原結合部分在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合。
在一個態樣中，第一抗原結合部分包含與SEQ ID NO: 136之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列及與SEQ ID NO: 137之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列。
在一個態樣中，第一抗原結合部分包含SEQ ID NO: 136之重鏈可變區序列及SEQ ID NO: 137之輕鏈可變區序列。
在一個態樣中，第二及第三抗原結合部分包含與SEQ ID NO: 152之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區序列及與SEQ ID NO: 153之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區序列。在一個態樣中，第二及第三抗原結合部分包含SEQ ID NO: 152之重鏈可變區及SEQ ID NO: 153之輕鏈可變區。
根據以上態樣之Fc域可單獨或組合併有上文關於Fc域所描述之所有特徵。
在一個態樣中，抗原結合部分及Fc區藉由肽連接子，特定言之藉由如SEQ ID NO: 158及SEQ ID NO: 159中之肽連接子彼此融合。
在一個態樣中，在(ii)中之第二及第三Fab分子之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)，特定言之經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在(ii)中之第二及第三Fab分子之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
在一個態樣中，雙特異性抗體包含：包含與SEQ ID NO: 158之序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的多肽，包含與SEQ ID NO: 159之序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的多肽，包含與SEQ ID NO: 160之序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的多肽，及包含與SEQ ID NO: 161之序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列的多肽(特定言之兩個多肽)。
在一個態樣中，雙特異性抗體包含：包含SEQ ID NO: 158之序列的多肽，包含SEQ ID NO: 159之序列的多肽，包含SEQ ID NO: 160之序列的多肽，及包含SEQ ID NO: 161之序列的多肽(特定言之兩個多肽)。
亦涵蓋熟練從業者將已知之其他CD3×CEA雙特異性抗體以用於本發明中。
在一個態樣中，CD3×CEA雙特異性抗體為MEDI565 (AMG211，MT111)。
G.       製品  在本發明之另一態樣中，提供一種含有適用於治療、預防及/或診斷上文所描述病症之物質的製品。製品可包含容器及在容器上或容器隨附之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。容器容納組合物本身或組合物與可有效治療、預防及/或診斷病況之另一組合物之組合，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可被皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內輸液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明抗體。標籤或藥品說明書指示組合物用於治療所選病況。此外，製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明抗體；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一種細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此態樣中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病況之藥品說明書。或者或另外，該製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭及注射器。
H.       用於診斷及偵測之方法及組合物  在某些態樣中，本文所提供之任何抗體適用於偵測其目標(例如NKG2D)在生物樣本中的存在。如本文所使用，術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。在某些態樣中，生物樣本包含細胞或組織，諸如前列腺組織。
在一個態樣中，提供一種用於診斷或偵測方法中的根據本發明之抗體。在另一態樣中，提供一種偵測NKG2D在生物樣本中之存在的方法。在某些態樣中，該方法包含使生物樣本與本發明抗體在允許抗體與NKG2D結合之條件下接觸，及偵測抗體與NKG2D之間是否形成複合物。此方法可為活體外或活體內方法。在一個態樣中，本發明抗體係用於選擇符合使用結合NKG2D之抗體的療法之條件的個體，例如其中NKG2D為選擇患者之生物標記。
可使用本發明抗體診斷之例示性病症包括癌症。
在某些態樣中，提供根據本發明之抗體，其中抗體經標記。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光、色基、電子緻密、化學發光及放射性標記)，以及例如經由酶促反應或分子相互作用間接偵測之部分，諸如酶或配體。例示性標記包括(但不限於)放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H及131 I；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；若丹明及其衍生物；丹醯基；繖酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號)；螢光素；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡萄糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與採用過氧化氫氧化染料前驅體之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)偶合；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基及其類似標記。
III.     序列
胺基酸序列 SEQ ID NO
HCDR1 5C5 SYAMS 1
HCDR2 5C5 AISGSGGSTYYADSVKG 2
HCDR3 5C5 ELYREYMDY 3
LCDR1 5C5 QGDSLRSYYAS 4
LCDR2 5C5 GKNNRPS 5
LCDR3 5C5 NSRDSFSIHQNV 6
VH 5C5 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKELYREYMDYWGQGTLVTVSS 7
VL 5C5 SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSFSIHQNVFGGGTKLTVL 8
HCDR1 13C6 SYWIG 9
HCDR2 13C6 IIYPGDSDTRYSPSFQG 10
HCDR3 13C6 LYPVGVYFDY 11
LCDR1 13C6 RASQSISSWLA 12
LCDR2 13C6 DASSLES 13
LCDR3 13C6 QQYWSYWM 14
VH 13C6 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARLYPVGVYFDYWGQGTLVTVSS 15
VL 13C6 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYWSYWMFGQGTKVEIK 16
HCDR1 001 YWMT 17
HCDR2 001 CIHGGSSGSTYYASWVNG 18
HCDR3 001 PGYRSWSKTFDL 19
LCDR1 001 RASQDISESLN 20
LCDR2 001 AASSLQS 21
LCDR3 001 QQANSFPLT 22
VH 001 QQLEQSGGGLVTPGGSLKLCCIGSGFDFNTYWMTWVRQAPGKGLEWIGCIHGGSSGSTYYASWVNGRFTLSRDIDQSTGCLQVNSLTAADTAMYYCARPGYRSWSKTFDLWGQGTMVTVSS 23
VL 001 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISESLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK 24
HCDR1 013 IYWMS 25
HCDR2 013 RIYGGSSDYTAYASWVNG 26
HCDR3 013 LNPSFSRSFDY 27
LCDR1 013 RASQGIFSWLV 28
LCDR2 013 GASTLQS 29
LCDR3 013 QQGYSTPYT 30
VH 013 EQSGGGAGGGLVKPGGSLELCCKASGFDFSIYWMSWVRQSPGKGLEWIGRIYGGSSDYTAYASWVNGRFTLSRDIDQSTGCLQLNSLTAADTAMYYCVRLNPSFSRSFDYWGQGTLVTVSS 31
VL 013 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIFSWLVWYQQKPGKAPELLMYGASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYSTPYTFGQGTKVEIK 32
HCDR1 014 SYAMS 33
HCDR2 014 RISDGGGTIYYTDSVKG 34
HCDR3 014 HRLYDSIGAYAMDV 35
LCDR1 014 RASQSISSYLN 36
LCDR2 014 DASNLET 37
LCDR3 014 QQANSFPLT 38
VH 014 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSRISDGGGTIYYTDSVKGRFTIARDNSKNTLYLEMKSLRAEDTAVYYCAKHRLYDSIGAYAMDVWGQGTTVAVSS 39
VL 014 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGPGTKVDIK 40
HCDR1 018 YWMT 41
HCDR2 018 CIHGGDSGATYYANWVNG 42
HCDR3 018 PGYPSWSKTFDL 43
LCDR1 018 QASQDISNALN 44
LCDR2 018 AASTLQS 45
LCDR3 018 QHSNSFPLT 46
VH 018 QQLEQSGGGLVTPGGSLKVCCKASGFDFTTYWMTWVRQAPEKGLEWIGCIHGGDSGATYYANWVNGRFTLSRDIDQSTGCLQLNSLTAADTAMYYCARPGYPSWSKTFDLWGQGTMVTVSS 47
VL 018 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNALNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSNSFPLTFGGGTKVEIK 48
HCDR1 230 YWMT 49
HCDR2 230 CIHGGGSGTTSYASWVNG 50
HCDR3 230 PGYRSWSKTFDL 51
LCDR1 230 QANQDISNALN 52
LCDR2 230 AASSLQS 53
LCDR3 230 QQAASFPLT 54
VH 230 QQLEQSGGGLVKPGGSLELCCIASGFDFSTYWMTWVRQAPGKGLEWIGCIHGGGSGTTSYASWVNGRFTLSRDIDQSTGCLQLTSLTAADTAMYYCARPGYRSWSKTFDLWGQGTMVTVSS 55
VL 230 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQANQDISNALNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAAYYCQQAASFPLTFGGGTKVEIK 56
HCDR1 296 SYAMS 57
HCDR2 296 AIGIGGGGTYYADSVKG 58
HCDR3 296 GASFDFINFFPY 59
LCDR1 296 RASQGISNDLA 60
LCDR2 296 AASSLQS 61
LCDR3 296 QQTYSTPLT 62
VH 296 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIGIGGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYHCAKGASFDFINFFPYWGQGTLVTVSS 63
VL 296 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNDLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSTPLTFGGGTKVEIK 64
HCDR1 320 DYAMS 65
HCDR2 320 YNSFSVGSTDYADSVKG 66
HCDR3 320 HSGNYYTGPFHY 67
LCDR1 320 RASQGISSYLA 68
LCDR2 320 AASSLES 69
LCDR3 320 QQSYSTPIT 70
VH 320 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSYNSFSVGSTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCSKHSGNYYTGPFHYWGQGTLVTVSS 71
VL 320 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPITFGQGTRLEIK 72
HCDR1 395 TFWMT 73
HCDR2 395 CIHGGSGSRDYASWVNG 74
HCDR3 395 PGYRSWSKTFDL 75
LCDR1 395 RASQDISGALN 76
LCDR2 395 AASSLQS 77
LCDR3 395 QQANSFPLT 78
VH 395 QEQLEQSGGGLVTPGGSLKLCCTASGFDFNTFWMTWVRQAPGKGLEWIGCIHGGSGSRDYASWVNGRFTLSRDIDQSTACLQVNSLTAADTAMYYCARPGYRSWSKTFDLWGQGTMVTVSS 79
VL 395 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISGALNWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK 80
未靶向VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGTLVTVSS 81
未靶向VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIK 82
人類κ CL域 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 83
人類λ CL域 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 84
人類IgG1重鏈恆定區(CH1-CH2-CH3) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 85
hIgG1 Fc區 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 86
huNKG2D MGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV 87
huNKG2D ECD NSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV 88
cyNKG2D MGWIRGRRPRHNLEMSEFHNYKLGLAKSDFSTRCQKQRCPVIKSKCRENASPLFFCCFIAVAMGIRFIIMVTIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFNESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSIPNTYICMQRTV 89
cyNKG2D ECD NSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFNESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSIPNTYICMQRTV 90
muNKG2D MALIRDRKSHHSEMSKCHNYDLKPAKWDTSQEQQKQRLALTTSQPGENGIIRGRYPIEKLKISPMFVVRVLAIALAIRFTLNTLMWLAIFKETFQPVLCNKEVPVSSREGYCGPCPNNWICHRNNCYQFFNEEKTWNQSQASCLSQNSSLLKIYSKEEQDFLKLVKSYHWMGLVQIPANGSWQWEDGSSLSYNQLTLVEIPKGSCAVYGSSFKAYTEDCANLNTYICMKRAV 91
muNKG2D ECD NKEVPVSSREGYCGPCPNNWICHRNNCYQFFNEEKTWNQSQASCLSQNSSLLKIYSKEEQDFLKLVKSYHWMGLVQIPANGSWQWEDGSSLSYNQLTLVEIPKGSCAVYGSSFKAYTEDCANLNTYICMKRAV 92
his avi huNKG2D ECD HHHHHHGSGLNDIFEAQKIEWHEGGGGSNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV 93
mono huNKG2D ECD Fc kh avi (杵) GLNDIFEAQKIEWHEDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV 94
mono huNKG2D ECD Fc kh avi (臼) DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK 95
di huNKG2D ECD Fc avi GLNDIFEAQKIEWHEDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV 96
di cyNKG2D ECD Fc avi GLNDIFEAQKIEWHEDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFNESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSIPNTYICMQRTV 97
di muNKG2D ECD Fc avi GLNDIFEAQKIEWHEDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSNKEVPVSSREGYCGPCPNNWICHRNNCYQFFNEEKTWNQSQASCLSQNSSLLKIYSKEEQDFLKLVKSYHWMGLVQIPANGSWQWEDGSSLSYNQLTLVEIPKGSCAVYGSSFKAYTEDCANLNTYICMKRAV 98
di huNKG2D ECD mu IgG1 Fc DGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDAPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGGGGGSGGGGSGGGGSNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV 99
ECD FL MICB Fc avi (杵) AEPHSLRYNLMVLSQDESVQSGFLAEGHLDGQPFLRYDRQKRRAKPQGQWAEDVLGAKTWDTETEDLTENGQDLRRTLTHIKDQKGGLHSLQEIRVCEIHEDSSTRGSRHFYYDGELFLSQNLETQESTVPQSSRAQTLAMNVTNFWKEDAMKTKTHYRAMQADCLQKLQRYLKSGVAIRRTVPPMVNVTSSEVSEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHNTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRIRQGEEQRFTCYMEHSGNHGTHPVPSGKVLVLQSQRTVDASGGSPTPPTPGGGSADKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGLNDIFEAQKIEWHE 100
ECD FL MICB Fc avi (臼) DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK 101
HCDR1 (395, P1AE4972, P1AE4973, P1AE4975, P1AE4977, P1AE4978, P1AE4979, P1AE4980, P1AE4981) TFWMT 73
HCDR2 (P1AE4972) S IHGGSGSRDYASWVNG 102
HCDR2 (P1AE4973, P1AE4975, P1AE4977, P1AE4978, P1AE4979) SIHGGSGSRDYADSVKG 103
HCDR2 (P1AE4980) SIHGGSGSRDYSPSFQG 104
HCDR2 (P1AE4981) SIHGGSGSRDYNPSLKS 105
HCDR3 (395, P1AE4972, P1AE4973, P1AE4975, P1AE4977, P1AE4978, P1AE4979, P1AE4980, P1AE4981) PGYRSWSKTFDL 75
VH 395(C50S) = P1AE4972 QEQLEQSGGGLVTPGGSLKLCCTASGFDFNTFWMTWVRQAPGKGLEWIGS IHGGSGSRDYASWVNGRFTLSRDIDQSTACLQVNSLTAADTAMYYCARPGYRSWSKTFDLWGQGTMVTVSS 106
Hu395 P1AE4973 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFNTFWMTWVRQAPGKGLEWVGSIHGGSGSRDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYRSWSKTFDLWGQGTTVTVSS 107
Hu395 P1AE4975 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFNTFWMTWVRQAPGKGLEWVGSIHGGSGSRDYADSVKGRFTISRDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYRSWSKTFDLWGQGTTVTVSS 108
Hu395 P1AE4977 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFNTFWMTWVRQAPGKGLEWVGSIHGGSGSRDYADSVKGRFTISRDIDQSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYRSWSKTFDLWGQGTTVTVSS 109
Hu395 P1AE4978 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFNTFWMTWVRQAPGKGLEWVGSIHGGSGSRDYADSVKGRFTISADIDQSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYRSWSKTFDLWGQGTTVTVSS 110
Hu395 P1AE4979 VH QEQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFNTFWMTWVRQAPGKGLEWVGSIHGGSGSRDYADSVKGRFTISRDIDQSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYRSWSKTFDLWGQGTTVTVSS 111
Hu395 P1AE4980 VH QEQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGFDFNTFWMTWVRQMPGKGLEWMGSIHGGSGSRDYSPSFQGQVTISADIDQSTAYLQWSSLKASDTAMYYCARPGYRSWSKTFDLWGQGTTVTVSS 112
Hu395 P1AE4981 VH QEQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFDFNTFWMTWIRQPPGKGLEWIGSIHGGSGSRDYNPSLKSRVTISVDIDQNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARPGYRSWSKTFDLWGQGTTVTVSS 113
B9 HCDR1 SYWMH 114
B9 HCDR2 FIRNKANGGTTEYAASVKG 115
B9 HCDR3 DRGLRFYFDY 116
B9 LCDR1 TLRRGINVGAYSIY 117
B9 LCDR2 YKSDSDKQQGS 118
B9 LCDR3 MIWHSGASAV 119
B9 VH VQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 120
B9 VL QAVLTQPASLSASPGASASLTCTLRRGINVGAYSIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQGSGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSGASAVFGGGTKLTVL 121
huA5B7 HCDR1 DYYMN 122
huA5B7 HCDR2 FIGNKANAYTTEYSASVKG 123
huA5B7 HCDR3 DRGLRFYFDY 124
huA5B7 LCDR1 RASSSVTYIH 125
huA5B7 LCDR2 ATSNLAS 126
huA5B7 LCDR3 QHWSSKPPT 127
huA5B7 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 128
huA5B7 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK 129
CD3 HCDR1 TYAMN 130
CD3 HCDR2 RIRSKYNNYATYYADSVKG 131
CD3 HCDR3 HGNFGNSYVSWFAY 132
CD3 LCDR1 GSSTGAVTTSNYAN 133
CD3 LCDR2 GTNKRAP 134
CD3 LCDR3 ALWYSNLWV 135
CD3 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 136
CD3 VL QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 137
CEA HCDR1 EFGMN 138
CEA HCDR2 WINTKTGEATYVEEFKG 139
CEA HCDR3 WDFAYYVEAMDY 140
CEA LCDR1 KASAAVGTYVA 141
CEA LCDR2 SASYRKR 142
CEA LCDR3 HQYYTYPLFT 143
CEA VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSS 144
CEA VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIK 145
CEA (2) HCDR1 DTYMH 146
CEA (2) HCDR2 RIDPANGNSKYVPKFQG 147
CEA (2) HCDR3 FGYYVSDYAMAY 148
CEA (2) LCDR1 RAGESVDIFGVGFLH 149
CEA (2) LCDR2 RASNRAT 150
CEA (2) LCDR3 QQTNEDPYT 151
CEA (2) VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS 152
CEA (2) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIK 153
CEA-TCB HC1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 154
CEA-TCB HC2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 155
CEA-TCB LC1 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 156
CEA-TCB LC2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRKRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 157
CEA-TCB (2) HC1 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 158
CEA-TCB (2) HC2 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 159
CEA-TCB (2) LC1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 160
CEA-TCB (2) LC2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 161
A5B7 HCDR2 FIGNKANGYTTEYSASVKG 162
A5B7 VH EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMNWVRQPPGKALEWLGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTLTVSS 163
A5B7 VL QTVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQHWSSKPPTFGGGTKLEIK 164
HCDR1共同序列 DYXMN，其中 X為Y或A或E 165
HCDR1 DY A MN 166
HCDR1 DY E MN 167
HCDR2共同序列 X1 IX2 NKANAYTTEYSASVKG，其中 X1 為F或V， X2 為G或S 168
HCDR2 V I S NKANAYTTEYSASVKG 169
HCDR2 FI S NKANAYTTEYSASVKG 170
HCDR3共同序列 DRGX1 RFX2 FDY，其中 X1 為L或I， X2 為Y或G或Q或S 171
HCDR3 DRG I RF G FDY 172
HCDR3 DRGLRF S FDY 173
HCDR3 DRG I RFYFDY 174
HCDR3 DRG I RF Q FDY 175
HCDR3 DRG I RF S FDY 176
LCDR1共同序列 XASSSVTYIH，其中 X為R或H 177
LCDR1 H ASSSVTYIH 178
LCDR3共同序列 QHWSSX1 X2 PT，其中 X1 為K或V或Q或I， X2 為P或S 179
LCDR3 QHWSS V PPT 180
LCDR3 QHWSS Q PPT 181
LCDR3 QHWSS IS PT 182
LCDR3 QHWSSK S PT 183
P006.038 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSS 184
P006.038 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIK 185
P005.097 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFSFDYWGQGTTVTVSS 186
P005.097 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSQPPTFGQGTKLEIK 187
P005.103 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFYFDYWGQGTTVTVSS 188
P005.103 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIK 189
P002.139 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYAMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 190
P002.139 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK 191
P001.177 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 192
P001.177 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK 193
P005.102 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSS 194
P005.102 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIK 195
P005.102-combo1 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSS 196
P005.102-combo1 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIK 197
P005.102-combo2 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFSDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSS 198
P005.102-combo2 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIK 199
P005.103-combo1 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFSFDYWGQGTTVTVSS 200
P005.103-combo1 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIK 201
P005.103-combo2 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFSFDYWGQGTTVTVSS 202
P005.103-combo2 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIK 203
P006.038-combo1 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYAMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSS 204
P006.038-combo1 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIK 205
P006.038-combo2 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYEMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSS 206
P006.038-combo2 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIK 207
hu N(A2B2)A-avi-His QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGTQQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNKLSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSALSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNLTCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNITLSINPVKREDAGTYWCEVFNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENLINVDGSGLNDIFEAQKIEWHEARAHHHHHH 208
NKG2D (P1AE4980) VL - CH1 - Fc (杵, PGLALA) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISGALNWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIKASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 209
CEA (huA5B7) VH - CH1 - Fc (臼, PGLALA) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 210
NKG2D (P1AE4980) VH - CL QEQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGFDFNTFWMTWVRQMPGKGLEWMGSIHGGSGSRDYSPSFQGQVTISADIDQSTAYLQWSSLKASDTAMYYCARPGYRSWSKTFDLWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 211
CEA (huA5B7) VL - CL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 212
NKG2D (P1AE4980) VH - CH1 - Fc (杵, PGLALA) QEQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGFDFNTFWMTWVRQMPGKGLEWMGSIHGGSGSRDYSPSFQGQVTISADIDQSTAYLQWSSLKASDTAMYYCARPGYRSWSKTFDLWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 213
CEA (P001.177) VL - CH1 - Fc (臼, PGLALA) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 214
NKG2D (P1AE4980) VL - CL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISGALNWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 215
CEA (P001.177) VH - CL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 216
C26 VH QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS 217
C26 VL DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPITFGGGTKVEIK 218
ADI27743 VH QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS 219
ADI27743 VL DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPTFGGGTKVEIK 220
C26 IgG (PG LALA) HC QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 221
C26 IgG (PG LALA) LC DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPITFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 222
ADI27743 IgG (PG LALA) HC QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 223
ADI27743 IgG (PG LALA) LC DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 224
NKG2D (C26) VL - CH1 - Fc (臼, PGLALA) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPITFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 225
NKG2D (C26) VH - CL QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 226
NKG2D (ADI27743) VL - CH1 - Fc (臼, PGLALA) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 227
NKG2D (ADI27743) VH - CL QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 228
CEA (huA5B7) VH - CH1 - Fc (杵, PGLALA) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 229
CEA (huA5B7) VL - CL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 230
IV. 實例  以下為本發明之方法及組合物之實例。應理解，考慮到上文所提供之一般描述，可實踐各種其他態樣。
實例 1. 通用方法及工具 重組 DNA 技術 使用標準方法操控DNA，如Sambrook, J.等人, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold spring Harbor, New York, 1989中所描述。分子生物試劑係根據製造商之說明書使用。關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列的總體資訊提供於Kabat, E.A.等人 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, NIH出版物第91-3242號中。
DNA 定序 藉由雙股定序法測定DNA序列。
基因合成 所需基因區段係使用適當模板藉由PCR產生，或藉由自動化基因合成法在Geneart AG (Regensburg, Germany)自合成寡核苷酸及PCR產物合成。將側接有單數個限制性核酸內切酶裂解位點的基因區段選殖至標準選殖/定序載體中。自經轉型之細菌純化質體DNA且藉由UV光譜法來測定濃度。經次選殖之基因片段之DNA序列係藉由DNA定序來確認。設計具有適合限制位點的基因區段以允許次選殖至各別表現載體中。所有構築體經設計具有5'端DNA序列，該序列編碼靶向真核細胞中分泌之蛋白質的前導肽。
產生 NKG2D 受體及 MIC-B 配體 產生NKG2D受體以及MIC-B配體之若干構築體以用作噬菌體呈現之抗原、轉殖基因兔之蛋白質免疫接種之免疫原以及篩選及表徵工具。選殖呈4種不同構築體形式的人類NKG2D之細胞外域(ECD)：1、具有N端H6-avi-標籤以形成非共價二聚體(his avi huNKG2D ECD)(SEQ ID NO: 93)，2、呈與avi標記人類IgG1 Fc-杵鏈之C端融合的單價Fc融合體形式，該avi標記人類IgG1 Fc-杵鏈與『空』人類IgG1 Fc-臼鏈配對(mono huNKG2D ECD Fc kh avi)(SEQ ID NO: 94及95)，3、呈藉由完整鉸鏈區二聚化的與avi標記人類IgG1 Fc之C端融合之二聚體Fc融合體形式(di huNKG2D ECD Fc avi)(SEQ ID NO: 96)，及4、呈藉由完整鉸鏈區二聚化的與鼠類IgG1 Fc之C端融合之二聚體Fc融合體形式(di huNKG2D ECD mu IgG1 Fc)(SEQ ID NO: 99)。此鼠類Fc融合體用於增加轉殖基因兔之免疫原性。如同上文所概述的與avi標記人類IgG1 Fc之C端融合之人類二聚體Fc融合體以類似方式選殖食蟹獼猴及鼠類NKG2D (分別為di cyNKG2D ECD Fc avi及di muNKG2D ECD Fc avi)之ECD (分別為SEQ ID NO 97及98)。此外，呈與攜帶C端avi標籤且與『空』人類IgG1 Fc-臼鏈配對之人類IgG1 Fc-杵鏈融合的單價N端融合體形式選殖NKG2D配體MIC-B (ECD FL MIC-B Fc avi)之ECD (SEQ ID NO 100及101)。以上受體及MIC-B配體描繪於圖 1 中。除di huNKG2D ECD mu IgG1 Fc以外，其包含允許在共表現Bir A生物素接合酶之後進行定點生物素化的N端avi標籤。除表現卡匣以外，各載體含有用於在表現EBV-EBNA之細胞株中自主複製的EBV oriP序列。其短暫轉染至HEK 293細胞中，從而穩定地表現EBV源蛋白質EBNA。同時共轉染的編碼生物素接合酶Bir A之質體允許avi標籤在活體內發生特異性生物素化。隨後使用蛋白A MabSelectSure管柱繼之以凝膠過濾來純化Fc標記蛋白，而藉由Ni-NTA親和力層析繼之以凝膠過濾來純化H6標記NKG2D構築體。
產生表現 NKG2D/DAP10 之細胞株 將編碼人類NKG2D及DAP10之全長cDNA次選殖至哺乳動物表現載體中。使用脂染胺LTX試劑(Invitrogen，#15338100)根據製造商方案將質體轉染至CHO-K1M (Roche)及293T (ATCC，CRL-3216)細胞中。將穩定轉染之NKG2D/DAP10陽性CHO細胞維持的補充有10 nM L-麩醯胺酸(Gibco，#25030081)之CDM2 Opt.1.1培養基(GIBCO，#08-0059)中。將293T細胞維持於補充有10%胎牛血清(Gibco，#16140063)及1% GlutaMAX補充物(Gibco；#31331-028)的DMEM (Gibco，#11965092)中。轉染後兩天，針對CHO細胞將嘌呤黴素(Invivogen；#ant-pr-1)添加為6 µg/mL，且針對293T細胞添加為1 µg/mL。在初始選擇之後，藉由BD FACSAria III細胞分選儀(BD Biosciences)分選具有NKG2D之最高細胞表面表現之細胞且培養以確立穩定細胞純系。經4週之時段使用抗NKG2D抗體KYK-2.0 (Kwong等人 (2008) J Mol Biol 384, 1143-1156)及PerCP結合Fc γ特異性山羊抗人類IgG (Jackson ImmunoResearch，#109-126-097)作為二級抗體藉由FACS分析確認表現量及穩定性。
實例 2. 藉由噬菌體呈現產生抗 NKG2D 抗體 產生通用 Fab 文庫 基於人類生殖系基因產生Fab型式之兩個通用噬菌體呈現抗體文庫。在輕鏈(L3)之CDR3及重鏈(H3)之CDR3中使用橫跨此等CDR之不同長度之隨機引子使文庫隨機化且藉由「重疊延伸剪接」(SOE)PCR自3各片段組裝。組裝足夠量的全長隨機Fab片段之後，將其用NcoI/NheI 以及類似處理之受體噬菌粒載體消化。使用噬菌粒載體接合Fab文庫插入物，且將經純化接合體用於轉型至大腸桿菌TG1。使用輔助噬菌體VCSM13補救呈現Fab文庫之噬菌粒粒子且藉由PEG/NaCl純化進行純化以供用於選擇。
藉由噬菌體呈現自通用 Fab 文庫選擇抗 NKG2D 結合子 經4輪淘選以交替方式針對di muNKG2D ECD Fc avi (SEQ ID NO: 98)及di huNKG2D ECD Fc avi (SEQ ID NO: 96)或di huNKG2D ECD Fc avi (SEQ ID NO: 96)及his avi huNKG2D ECD (SEQ ID NO: 93)自文庫選擇NKG2D結合子。
藉由ELISA如下鑑別特定結合子：將100 µl之50 nM生物素化di huNKG2D ECD Fc avi (SEQ ID NO: 96)或his avi huNKG2D ECD (SEQ ID NO: 93)塗佈於中性抗生物素蛋白培養盤上。添加含有Fab之細菌上清液且使用抗Flag/HRP二級抗體經由其Flag標籤偵測結合Fab。初選展現顯著優於背景(如純系5C5及純系13C6)之信號的純系，以供定序及進一步分析。
純化 Fab 純化來自細菌培養物之Fab以測定動力學參數。對於各純系，將500 ml培養物接種含有對應噬菌粒之細菌且用1 mM IPTG在OD600 0.9下進行誘導。隨後，在25℃下培育培養物過夜且藉由離心收集。於25 ml PPB緩衝液(30 mM Tris-HCl pH 8、1 mM EDTA、20%蔗糖)中培育再懸浮集結粒20 min之後，再次離心細菌，且收集上清液。藉由25 ml 5 mM MgSO4 溶液重複此培育步驟一次。將兩個培育步驟的上清液合併，過濾且裝載於IMAC管柱(His gravitrap, GE Healthcare)上。隨後，用40 ml洗滌緩衝液(500 mM NaCl、20 mM咪唑、20 mM NaH2 PO4 pH 7.4)洗滌管柱。溶離(500 mM NaCl、500 mM咪唑、20 mM NaH2 PO4 pH 7.4)之後，使用PD10管柱(GE Healthcare)再緩衝溶離液。隨後藉由SPR分析(ProteOn XPR36，Biorad)以純系5C5 (SEQ ID NO: 7(VH)及SEQ ID NO: 8 (VL))之100 nM至6.25 nM及純系13C6 (SEQ ID NO: 15 (VH)及SEQ ID NO: 16 (VL))之200 nM至12.5 nM範圍內的稀釋系列研究經純化Fab之動力學參數。
藉由表面電漿子共振 (SPR) 測定親和力 在25℃下使用ProteOn XPR36儀器(Biorad)，用藉由中性抗生物素蛋白捕獲固定在NLC晶片上之生物素化單huNKG2D ECD Fc kh avi (SEQ ID NO: 94及SEQ ID NO: 95)及di huNKG2D ECD Fc avi (SEQ ID NO: 96)，藉由表面電漿子共振來量測所選Fab純系之親和力(KD )。重組抗原(配體)之固定：用PBST (10 mM磷酸鹽、150 mM氯化鈉pH 7.4、0.005% Tween 20)將抗原稀釋至10 μg/ml，隨後在垂直取向上以不同接觸時間按30 微升/分鐘注射以進行固定。分析物之注射：關於一步法動力學(one-shot kinetics)量測，注射方向改為水平取向，將兩倍稀釋度之各系列經純化Fab (200與6.25 nM之間的不同濃度範圍)沿著各別通道1至5以60 μl/min同時注射，其中結合時間分別為200 s或300 s，且解離時間為360 s。沿第六通道注射緩衝液(PBST)以提供「管線內」空白用於參照。使用簡單的一比一朗繆爾結合模型，在ProteOn Manager v3.1軟體中，藉由同時擬合結合及解離感測器圖譜來計算結合速率常數(kon )及解離速率常數(koff )。平衡解離常數(KD )按比率koff /kon 來計算。所有量測之動力學及熱力學資料彙總於下表 1 中。在IgG層級上評定純系5C5及13C6與食蟹獼猴NKG2D之交叉反應性，亦即與di cyNKG2D ECD Fc avi之結合(參見實例 9 )。表 1. 如藉由SPR所測定的抗NKG2D Fab與人類NKG2D之親和力。
   mono huNKG2D ECD Fc kh di huNKG2D ECD Fc avi
抗體 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
5C5 3.6E+05 5.5E-03 1.5E-08 2.5E+05 5.6E-03 2.2E-08
13C6 1.2E+04 9.6E-04 7.9E-08 9.5E+03 7.0E-04 7.4E-08
可變抗體域選殖至 IgG 表現載體 (IgG 轉化率 ) 將噬菌體呈現源性抗體5C5及13C6之Fab分別轉化成IgG1/λ或κ抗體。為此，將重鏈及輕鏈V域之PCR擴增DNA片段框內插入含有各別接受者哺乳動物表現載體之人類IgG1恆定重鏈或人類恆定λ或恆定κ輕鏈中。抗體表現藉由MPSV啟動子驅動且藉由位於CDS下游之合成polyA信號序列終止轉錄。除表現卡匣以外，各載體含有用於在表現EBV-EBNA之細胞株中自主複製的EBV oriP序列。
實例 3. 藉由免疫接種轉殖基因兔產生抗 NKG2D 抗體 動物照護、兔免疫接種及器官移除 除藉由上文所描述之噬菌體呈現產生之抗體以外，其他抗體來源於免疫接種NKG2D抗原之後的表現人類化抗體譜系之轉殖基因兔(參見例如WO 2000/46251、WO 2002/12437、WO 2005/007696、WO 2006/047367、WO 2007/019223及WO 2008/027986，其所有以全文引用之方式併入本文中)。動物係根據附件A「動物收容及照護指南」圈養在AAALAC所認可之動物設施中。所有動物免疫接種方案及實驗均經Upper Bavaria政府審批通過(許可證號55.2-1-54-2532-90-14)且係根據德國動物福利法(German Animal Welfare Act)及歐洲議會及理事會之指令2010/63 (Directive 2010/63 of the European Parliament and Council)進行。
兔使用重組人類NKG2D ECD蛋白(his avi huNKG2D ECD (SEQ ID NO: 93))或與鼠類IgG1 Fc之C端融合之重組人類NKG2D ECD (di huNKG2D ECD mu IgG1 Fc (SEQ ID NO: 99))免疫接種，或使用編碼全長人類NKG2D及DAP10之質體表現載體與以重組方式表現全長人類NKG2D及DAP10之CHO細胞交替地以遺傳方式免疫接種。
藉由ELISA在來自經免疫接種動物之血清中測定抗原特異性滴度(參見下文)。
B 細胞 選殖 分離兔周邊血液單核細胞(PBMC)以供B細胞選殖。經由與一層HEK293細胞非特異性黏著而耗乏巨噬細胞及單核球。使用於上清液中之細胞(周邊血液淋巴球(PBL))以用於抗原淘選步驟。經由與經抗原塗佈之培養盤(his avi huNKG2D ECD (SEQ ID NO: 93)或以重組方式表現全長人類NKG2D及DAP10之HEK293T細胞結合來富集抗原特異性B細胞。藉由流動式細胞測量術對富集之細胞進行單細胞分選。
如Seeber等人(Seeber等人(2014) PLoS One 4; 9(2))所描述培養兔B細胞，且將上清液用於藉由ELISA之第1級篩選(參見下文)。
PCR 擴增及次選殖 V 域以用於 IgG 抗體之重組表現 由B細胞溶解物製備總RNA，且將其用於藉由逆轉錄酶反應產生cDNA。使用cDNA以藉由PCR使用適當引子擴增免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區(VH及VL)。
針對兔單株二價抗體之重組表現，藉由懸垂選殖法(overhang cloning method) (Haun等人(1992) Biotechniques 13, 515-518；Li等人(2007) Nature Methods 4, 251-256)將編碼VH或VL之PCR產物以cDNA形式選殖至表現載體中。表現載體含有由包括內含子A之5' CMV啟動子及3' BGH聚腺苷酸化序列組成之表現卡匣。除表現卡匣以外，質體含有pUC18源性複製起點及為大腸桿菌中之質體擴增賦予安比西林(ampicillin)抗性的β-內醯胺酶基因。使用基礎質體之三個變異體：一個質體含有設計成接納VH區之兔IgG恆定區，而兩個額外質體含有兔或人類κ LC恆定區以接納VL區。藉由PCR使用重疊引子來擴增編碼κ或γ恆定區及VL/VH插入序列之經線性化表現質體。將經純化之PCR產物與T4 DNA-聚合酶一起培育，產生單股懸垂物。藉由添加dCTP停止反應。在下一步驟中，將質體及插入物合併且用recA培育，其誘發定點重組。將經重組質體轉型至大腸桿菌。次日，藉由質體製備、限制分析及DNA-定序選取生長菌落且測試恰當的重組質體。對於藉由ELISA之第2級篩選(參見下文)，將經分離之重鏈(HC)及輕鏈(LC)質體短暫共轉染至HEK293細胞中，且在1週後收集上清液，隨後進行微純化。
實例 4. 藉由 ELISA 篩選用於 NKG2D 結合之抗 NKG2D 抗體 對於來源於轉殖基因兔之免疫接種的純系之篩選，使用B細胞培養上清液(第1級篩選，參見上文)或次選殖及微純化IgG(第2級篩選，參見上文)。
人類 NKG2D 之 蛋白質結合 ELISA 以0.5 µg/ml之濃度用25微升/孔的生物素化his avi huNKG2D ECD (SEQ ID NO: 93)塗佈經Nunc抗生蛋白鏈菌素塗佈之培養盤(MicroCoat，#11974998001)，且在室溫(RT)下培育1小時。用3×90微升/孔的PBST緩衝液(10×PBS，Roche #11666789001 + 0.1% Tween 20)洗滌之後，以3 µg/ml之濃度開始按1:3稀釋度或替代地以原始樣本之1:30稀釋度添加25 µl抗NKG2D抗體，且在室溫下培育1 h。洗滌(3×90微升/孔的PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔的抗hu κ鏈HRP (辣根過氧化酶)結合物(Millipore，#AP502P，1:2000)且在室溫下培育1 h。洗滌(3×90微升/孔的PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔的TMB (3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)受質(Roche，#11835033001)。在OD 370/492 nm下執行量測，且結果彙總於下表 2 中。
所有抗體特異性地且以劑量依賴性方式結合經固定his avi huNKG2D ECD。表 2. 藉由ELISA測定抗NKG2D抗體與重組人類NKG2D之結合。EC50 及OD max (n.d. = 未測定)
分子 EC50 [nM] OD max
純系001 0.8 2.5
純系013 2 2.5
純系014 1 1.7
純系018 1.1 2.3
純系230 n.d. 2.4
純系296 n.d. 2.1
純系320 1.4 2.4
純系395 n.d. 2.4
獼猴 NKG2D 之 蛋白質結合 ELISA 以0.25 µg/ml之濃度用25微升/孔的生物素化di cyNKG2D ECD Fc avi (SEQ ID NO: 97)塗佈經Nunc抗生蛋白鏈菌素塗佈之培養盤(MicroCoat，#11974998001)，且在室溫(RT)下培育1小時。如上文所描述對人類NKG2D進行分析。
結果彙總於表 3 中。所有抗體與食蟹獼猴NKG2D交叉反應，且此亦藉由表面電漿子共振證實(參見實例 9 )。表 3. 藉由ELISA測定抗NKG2D抗體與重組食蟹獼猴NKG2D之結合。EC50 及OD max (n.d. = 未測定)
抗體 EC50 [nM] OD max
純系001 0.3 1.7
純系013 0.4 1.5
純系014 n.d. 0.4
純系018 0.4 1.3
純系230 1.3 1.6
純系296 0.7 0.9
純系320 0.4 0.9
純系395 0.6 1.4
鼠類 NKG2D 之 蛋白質結合 ELISA 以1 µg/ml之濃度用25微升/孔的生物素化di muNKG2D ECD Fc avi (SEQ ID NO: 98)塗佈經Nunc抗生蛋白鏈菌素塗佈之培養盤(MicroCoat，#11974998001)，且在室溫(RT)下培育1小時。如上文所描述對人類NKG2D進行分析。
結果彙總於表 4 中。抗體不與鼠類NKG2D交叉反應或僅極弱地交叉反應。表 4. 藉由ELISA測定抗NKG2D抗體與重組鼠類NKG2D之結合。EC50 及OD max (n.d. = 未測定)
抗體 EC50 [nM] OD max
純系001 n.d. 0.2
純系013 n.d. 0.4
純系014 n.d. 0.1
純系018 n.d. 0.1
純系230 n.d. 0.3
純系296 n.d. 0.3
純系320 n.d. 0.1
純系395 n.d. 0.3
人類 NKG2D 細胞表面結合 ELISA 將25微升/孔的以重組方式表現全長人類NKG2D及DAP10的HEK293T細胞(15000個細胞/孔)或未經修飾之HEK293T接種至384孔聚D-離胺酸培養盤(Corning，#356662)中，且在37℃下於細胞培養基(Gibco，#42430-25 + 10% FCS (PAN，#P30-2006) + 1 µg/ml嘌呤黴素+1×青黴素/鏈黴素(Roche，#11074440001，500×))中培育過夜。次日，移除培養基之後，以3 µg/ml之濃度開始按1:3稀釋度或替代地以原始樣本之1:20稀釋度添加25 µl抗NKG2D抗體，且在4℃下培育2 h。洗滌(1×90 µl，PBST)之後，藉由添加30微升/孔的戊二醛達到最終濃度0.05% (Sigma，#G5882)，在室溫下保持10 min來固定細胞。洗滌(2×90微升/孔的PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔的抗hu κ POD (Millipore，#AP502P，1:2000)且在室溫下培育1 h。洗滌(3×90微升/孔的PBST緩衝液)之後，添加25微升/孔的TMB受質(Roche，#11835033001)且培育6-10 min。在Tecan Safire 2儀器上在OD 370/492 nm下進行量測。
結果彙總於表 5 中。除在此分析中可能未偵測到結合之較弱結合子純系013及014以外，所有抗體特異性地且以劑量依賴性方式結合以重組方式表現全長人類NKG2D及DAP10之HEK293T細胞。此等抗體均未結合未經轉染之HEK293T參考細胞。表 5. 藉由ELISA測定抗NKG2D抗體之細胞結合。EC50 及OD max (n.d. = 未測定)
HEK293T 人類NKG2D HEK293T
抗體 EC50 [nM] OD max EC50 [nM] OD max
純系001 2.2 1.0 n.d. 0.2
純系013 n.d. n.d. n.d. 0.2
純系014 n.d. n.d. n.d. 0.2
純系018 1.9 0.8 n.d. 0.1
純系230 n.d. 0.7 n.d. 0.2
純系296 n.d. 0.5 n.d. 0.2
純系320 n.d. 1.0 n.d. 0.2
純系395 n.d. 0.8 n.d. 0.2
實例 5. 藉由 ELISA 篩選用於 MIC-B 競爭之抗 NKG2D 抗體 以2 µg/ml之濃度用25微升/孔的重組人類MIC-B (ECD FL MIC-B Fc avi，SEQ ID NO 100及101)塗佈384孔Maxisorp培養盤(Nunc，#464718)，且在室溫(RT)下培育1小時。用3×90微升/孔的PBST緩衝液(10×PBS (Roche，#11666789001) + 0.1% Tween 20)洗滌之後，在室溫下用90 µl阻斷緩衝液(10×PBS (Roche，# 11666789001) + 2%牛血清白蛋白部分V、游離脂肪酸(Roche，# 10735086001) + 0.05% Tween 20)培育各孔1 h。同時，在室溫下於聚丙烯培養盤(Weidman，#23490-101)上將重組生物素化人類NKG2D與抗NKG2D抗體(2 µg/ml NKG2D與1:3稀釋度之抗體，以3 µg/ml之濃度開始)一起培育1 h。洗滌(3×90微升/孔的PBST緩衝液)之後，將25微升/孔的NKG2D-抗體混合物轉移至分析培養盤且在室溫下培育1 h。洗滌(3×90微升/孔PBST緩衝液)之後，以1:2000稀釋度添加25微升/孔的Poly-HRP40-抗生蛋白鏈菌素(Fitzgerald，#65R-S104PHRPx)且在室溫下培育1 h。在另一洗滌步驟(3×90微升/孔的PBST緩衝液)之後，將25 µl TMB受質(Roche，#11835033001)添加至各孔中。在OD 370/492 nm下進行量測。
結果展示於圖 2 及表 6 中。純系013及014之「負」抑制曲線可由藉由抗體交聯之NKG2D與培養盤上固定之MIC-B的較強再結合說明(零值為在無抗NKG2D抗體之情況下重組生物素化人類NKG2D與培養盤固定之MIC-B的結合)。因此，關於NKG2D:MIC-B相互作用，具有此特徵曲線之抗體為非抑制性的。另8種抗體以不同效力抑制NKG2D與其配體MIC-B之結合。表 6. 抗NKG2D抗體之NKG2D：MIC-B抑制之EC50 (*當未達到完整上平穩段或下平穩段時予以估計)。
抗體 EC50 [ng/ml]*
純系13C6 111
純系5C5 717
純系001 560
純系013 無抑制
純系014 無抑制
純系018 332
純系230 1065
純系296 20
純系320 67
純系395 1636
實例 6. IgG 之增量表現、純化及分析 在於F17培養基(Invitrogen)中培養之經短暫轉染之HEK293細胞(人胚腎細胞株293源性)中產生抗體分子。為進行轉染，使用「293-Free」轉染試劑(Novagen)。自個別表現質體表現如上文所描述之各別抗體重鏈及輕鏈分子。如製造商之說明書中所規定進行轉染。在轉染後3至7天收集含免疫球蛋白細胞培養上清液，且冷凍於-80℃下直至純化為止。關於人類免疫球蛋白在例如HEK293細胞中之重組表現的總體資訊提供於：Meissner等人(2001) Biotechnol Bioeng 75, 197-203(以引用之方式併入本文中)中。
在兩個步驟中藉由使用蛋白A-SepharoseTM 親和力層析(GE Healthcare)之親和力層析及Superdex200 (GE Healthcare)尺寸排阻層析自上清液純化重組抗體。簡言之，將含抗體之澄清培養上清液裝載至用PBS緩衝液(10 mM Na2 HPO4 、1 mM KH2 PO4 、137 mM NaCl及2.7 mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe蛋白A (5-50 ml)管柱上。用平衡緩衝液洗淨未結合之蛋白質。用100 mM檸檬酸鹽緩衝液pH 2.8溶離抗體。用1/10溶離體積之2 M Tris緩衝液pH 9.0中和含蛋白質溶離份。在後續步驟中，合併經溶離蛋白質溶離份且根據以下三個選項中之一者進行處理：a)用Amicon Ultra離心過濾裝置(MWCO: 30 K，Millipore)濃縮且裝載於用pH 6.0之20 mM組胺酸、140 mM NaCl平衡的Superdex200 HiLoad 16/60凝膠過濾管柱(GE Healthcare)上，或b)裝載至用pH 6.0之20 mM組胺酸、140 mM NaCl平衡的Superdex200 HiLoad 16/60凝膠過濾管柱(GE Healthcare)上，或c)用10K Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific)透析。合併單體抗體溶離份。根據Pace等人(1995) Protein Science 4, 2411-2423(以引用之方式併入)使用基於胺基酸序列計算的莫耳消光係數，藉由以320 nm下之光密度(OD)作為背景校正測定280 nm下之OD來測定經純化抗體及衍生物之蛋白質濃度。將抗體樣本急凍且儲存於-80℃下。
藉由CE-SDS LabChip GX (PerkinElmer)在存在或不存在還原劑之情況下確認抗體之同質性。在還原條件下，在CE-SDS之後以類似於所計算分子量之表觀分子大小鑑別IgG之輕鏈及重鏈多肽鏈。
在UltiMate 3000 HPLC系統(Thermo Fisher Scientific)上使用BioSuite High Resolution SEC (250 Å，5 µm運行)藉由分析型SEC (尺寸排阻層析)確認抗體之品質。藉由施加pH 6.2之200 mM K2 HPO4 /KH2 PO4 、250 mM KCl來進行自層析物質之溶離。所有所分析樣本的分析型SEC之主峰＞ 91%。
實例 7. 藉由 FACS 篩選用於 NKG2D 結合之抗 NKG2D 抗體 (IgG) 為進行NK-92細胞結合之EC50 判定，用Zenon™人類IgG標記套組(Thermo Fisher Scientific)預先標記抗體。用5倍過量之Zenon試劑A將IgG染色，且用等量之Zenon試劑B阻斷未結合染色試劑。在製備1:3之步驟中的稀釋系列之後，在4℃下將96孔培養盤中之5.0×104 個NK-92細胞/孔與50 µL預先標記之抗體溶液一起培育1 h。用FACS緩衝液(2.5% FCS於PBS中)洗滌細胞兩次，且再懸浮於70 µL緩衝液中。使用BD FACS Canto裝置量測螢光，且測定EC50 (表 7 )。
抗體展現特異性及劑量依賴性NK92細胞結合，其中EC50值的範圍在0.988至0.031 µg/mL中。對於為弱細胞結合子之純系013、014及5C5，可能未測定EC50 值。表 7. 如藉由FACS所測定的NKG2D抗體之NK92細胞結合之EC50 (n.d. = 未測定)。
抗體 EC50 [µg/mL]
純系018 0.758
純系13C6 0.058
純系5C5 n.d.
純系230 0.988
純系013 n.d.
純系320 0.734
純系001 0.729
純系395 0.203
純系296 0.031
純系014 n.d.
實例 8. 藉由抗 NKG2D 抗體 (IgG) 再定向溶解目標細胞 目標細胞之鈣黃綠素標記 藉由在50 mL Falcon試管中離心(300× g，5 min)收集P815細胞(鼠類FcγR表現肥大細胞株)，且隨後在P815生長培養基中再懸浮至1.0×106 個細胞/毫升。每5.0×106 個細胞添加50 μL鈣黃綠素-AM，且在37℃下培育標記反應物30 min。用AIM-V分析培養基洗滌細胞3次，且再懸浮至6.0×105 個細胞/毫升。
抗體治療 在分析培養基中將抗體調節至80 µg/mL。隨後，藉由將40 µL預稀釋液與80 µL AIM-V培養基混合根據培養盤方案在V形底培養盤中於AIM-V培養基中製備1:3稀釋液。將P815細胞調節至6.0×105 個細胞/毫升，且將50微升/孔的細胞懸浮液添加至抗體稀釋液中，得到3.0×104 個細胞/孔，且在37℃下培育30 min以使抗體與細胞之Fc受體結合。
隨後，將培養盤在400× g下離心3 min，且捨棄上清液。在分析培養基中將NK-92細胞再懸浮至7.5×105 個細胞/毫升。將P815細胞再懸浮於200 µL NK-92細胞懸浮液(=1.5×105 個細胞/孔= E:T比1:5)中。將培養盤在37℃下培育4 h。
鈣黃綠素釋放 在420× g下離心培養盤4 min之後，捨棄上清液，且用200 µL PBS洗滌細胞一次(最終離心420× g，4 min)。隨後將細胞再懸浮於200 µL/孔的1% TritonX-100 PBS中，且將180 µL之經溶解細胞轉移至Costar®分析培養盤(96孔，黑色，底部透明)中，且量測螢光(激發濾波器485 nm，帶通濾波器530 nm)。以量測值除最大釋放之商的形式測定「細胞殺傷%」，其中在分析培養基中將細胞再懸浮於200 µL 1% TritonX-100中。
結果展示於圖 3 中。所測試抗體展現不同程度之細胞殺傷。詳言之，對於純系395及5C5，可觀測到活化NK92細胞之劑量依賴性細胞殺傷。
實例 9. 藉由表面電漿子共振 (SPR) 測定抗 NKG2D 抗體 (IgG) 之動力學速率常數及對人類及食蟹獼猴 NKG2D 之親和力 藉由使用由GE Healthcare供應之胺偶合套組，在pH 5.0下使用BIACORE B4000儀器(GE Healthcare)將約1500共振單位(RU)之捕獲抗體(10 µg/ml人類Fab捕獲套組，GE Healthcare Life Sciences，#28958325)偶合至CM5晶片(GE Healthcare，#BR-1005-30)上。樣本及系統緩衝液為PBS-T (10 mM磷酸鹽緩衝生理鹽水，包括0.05% Tween20) pH 7.4。將流動細胞設定成25℃且將樣本區塊設定成12℃並用運行緩衝液預塗佈兩次。藉由以10 µl/min之流動速率持續60秒注射約10 µg/ml溶液來捕獲抗體。藉由在1:3稀釋後以600 nM、300 nM、150 nM開始，以30 µl/min之流動速率持續180 s注射呈溶液的各種濃度之di huNKG2D ECD Fc avi (SEQ ID NO: 96)或di cyNKG2D ECD Fc avi (SEQ ID NO: 97)來量測結合。解離階段經監測長達450 s且藉由自樣本溶液切換為運行緩衝液來觸發。藉由用甘胺酸pH 2.1溶液以30 µl/min之流動速率洗滌2×90 s以及額外穩定180 s之時段來使表面再生。藉由減除自抗人類Fab表面獲得之反應來校正整體折射率差異。亦減除空白注射(=二次參考)。為了計算KD 、ka 及kd (參見表 8 )，使用Biacore 4000評估軟體1.1 (GE Healthcare)或TraceDrawer 1.6.1 (Ridgeview Instruments AB)中之朗繆爾1:1模型。
此等促效抗NKG2D抗體之親和力在次奈莫耳(純系395)至微莫耳(純系014)親和力範圍內。其全部與食蟹獼猴NKG2D交叉反應，而對於純系296，在人類NKG2D結合(3.8 nM)與食蟹獼猴NKG2D結合(710 nM)之間存在187倍之差異。純系395展現在3位數皮莫耳範圍內的與所有抗體之人類及食蟹獼猴NKG2D的最高親和力。表 8. 動力學速率常數及與人類及食蟹獼猴NKG2D之親和力。
   di huNKG2D ECD Fc avi di cyNKG2D ECD Fc avi
抗體 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
純系13C6 3.4E+04 2.8E-04 8.2E-09 2.0E+04 9.2E-04 4.7E-08
純系018 4.3E+04 1.3E-03 2.9E-08 3.9E+04 8.0E-04 2.1E-08
純系001 5.2E+04 4.5E-04 8.5E-09 4.8E+04 2.1E-04 4.5E-09
純系5C5 2.2E+05* 1.4E-02* 6.3E-08* 1.1E+05 9.1E-04 8.4E-09
純系230 4.3E+04 1.6E-04 3.6E-09 4.0E+04 1.0E-04 2.6E-09
純系395 5.7E+04 3.2E-05 5.5E-10 4.7E+04 3.6E-05 7.8E-10
純系013 8.4E+04 1.3E-03 1.6E-08 8.1E+04 6.4E-04 7.9E-09
純系296 2.1E+05 7.9E-04 3.8E-09 1.3E+05* 9.0E-02* 7.1E-07*
純系320 8.3E+04 9.1E-03 1.1E-07 7.8E+04 4.7E-03 6.1E-08
純系014 1.1E+05* 2.1E-01* 2.0E-06* 4.7E+04* 6.1E-02* 1.3E-06*
* 藉由TraceDrawer 1.6.1 (Ridgeview Instruments AB)計算
實例 10. 藉由 SPR 進行針對人類 NKG2D 之 抗 NKG2D 抗體 (IgG) 之抗原決定基分組 (binning) 藉由含1 M NaCl之50 mM NaOH的三次1分鐘注射來調節SA晶片(GE Healthcare，#BR-1005-31)之感測器表面，之後使配體固定。使用BIACORE T200儀器(GE Healthcare)將約200至300共振單位(RU)之mono huNKG2D ECD Fc kh avi (SEQ ID NO 94及95)偶合至感測器晶片表面上。在配體注射之後進行使用含50%異丙醇之1 M NaCl及50 mM NaOH的另一次洗滌。樣本及系統緩衝液為PBS-T (10 mM磷酸鹽緩衝生理鹽水，包括0.05% Tween20) pH 7.4。將流動細胞設定成25℃，將樣本區塊設定成12℃，且用運行緩衝液預塗佈感測器晶片表面兩次。藉由「雙重」注射來注射第一及第二抗體，其各自濃度為200 nM，持續180 s，流動速率為30 µl/min。必需用第一抗體使固定之抗原飽和。解離階段經監測長達120 s且藉由自樣本溶液切換為運行緩衝液來觸發。藉由用甘胺酸pH 2.1溶液以30 µl/min之流動速率洗滌40 s以及額外穩定180 s之時段來使表面再生。藉由減除自空白表面獲得之反應來校正整體折射率差異。亦減除空白注射(=二次參考)。藉由Biacore T200評估軟體3.0 (GE Healthcare)分析結合反應。
若第二抗體之抗原決定基不與第一抗體之抗原決定基相同或不重疊，則其可能僅結合藉由第一抗體飽和之抗原。例示性感測器圖譜展示於圖 4 中。若兩種抗體之抗原決定基完全相同或重疊，則將發生完全或部分阻斷。以第二抗體(表 9 )相對於第一抗體之結合水準(第一抗體之結合水準值經設定成100%)的結合%之形式來計算阻斷。表 9. 針對彼此(包括各別自阻斷對照)所測試之不同抗體組。值表示第二抗體之結合相對於第一抗體之結合反應的百分比。粗體數值指示同時結合，加底線數值指示相互阻斷。同時結合與阻斷之間的界限界定於30%。表 9A
   第二抗體
第一抗體 純系018 純系13C6 純系5C5 純系230 純系013 純系320 純系001 純系296
純系018 0 0 -5 3 81 -3 4 2
純系13C6 2 0 -4 4 57 0 5 3
純系5C5 50 101 0 56 121 75 56 32
純系230 -1 -1 -5 0 83 -4 -1 0
純系013 79 70 49 89 0 3 83 66
純系320 6 9 16 8 7 0 8 8
純系001 -1 -2 -6 3 80 -1 0 -2
純系296 15 13 8 21 97 14 20 0
表 9B
   第二抗體
第一抗體 純系13C6 純系5C5 純系013 純系320 純系306 純系002 純系132 純系366
純系13C6 0 -7 46 -5 3 0 25 66
純系5C5 92 0 106 62 48 43 -13 123
純系013 74 53 0 4 85 54 33 10
純系320 13 11 4 0 10 6 -27 51
純系306 -1 -3 77 -5 0 -2 -12 90
純系002 4 1 33 -3 5 0 -8 15
純系132 178 36 113 56 72 62 0 141
純系366 71 46 -5 24 89 5 25 0
表 9C
   第二抗體
第一抗體 純系13C6 純系5C5 純系013 純系320 純系001 純系296 純系014 純系395
純系13C6 0 -9 48 -6 -1 -4 -15 3
純系5C5 90 0 100 58 44 24 77 52
純系013 72 51 0 4 79 59 63 83
純系320 21 16 10 0 14 8 46 20
純系001 3 -1 78 -2 0 1 52 8
純系296 20 10 93 13 20 0 49 28
純系014 85 14 79 71 63 62 0 72
純系395 -5 -12 66 -4 -5 -3 53 0
可藉由此基於SPR之競爭分析確立三個不同抗原決定基組(bin)(表 10 )。大部分抗體屬於抗原決定基組1，兩種抗體代表抗原決定基組2 (純系5C5及132)，且三種抗體代表抗原決定基組3 (純系013、014及366)。表 10. 抗NKG2D抗體之抗原決定基組。
組1 組2 組3
純系13C6 純系5C5 純系013
純系018 純系132 純系014
純系230    純系366
純系296      
純系001      
純系306      
純系395      
純系002      
純系320      
選擇抗NKG2D抗體純系5C5、320、230、013、296及395進行進一步分析。
實例 11. 抗 NKG2D 抗體 (IgG) 與 免疫細胞上之人類 NKG2D 之特異性結合 使用NKG2D陽性免疫細胞，亦即NK細胞、γδ T細胞及CD8 T細胞，確認所選抗體純系與人類NKG2D之結合。藉由流動式細胞測量術評定抗體與人類NKG2D陽性NK細胞株NK92、人類CD8 T細胞、擴增人類NK細胞及擴增人類γδ T細胞之結合。實驗中包括非結合對照(具有L234A L235A P329G (Fc區中之「PGLALA」)突變的非靶向IgG (SEQ ID NO 81及82之VH及VL序列))。
方法 與人類 NK 細胞株 NK92 之 結合 檢查NK92細胞之活力，且將細胞再懸浮並調節至1百萬個細胞/毫升之密度。將100 µl之此細胞懸浮液(含有10萬個細胞)接種於96孔圓底培養盤中。使培養盤在400×g下離心4 min且移除上清液。隨後將40 µl稀釋抗體或FACS緩衝液添加至細胞中且在4℃下培育30 min。培育後，用每孔150 µl FACS緩衝液洗滌細胞兩次。隨後將20 μl稀釋之APC抗人類Fc特異性二級抗體(Jackson ImmunoResearch，#109-116-170)添加至細胞中。在4℃下再培育細胞30 min。為移除未結合抗體，用150微升/孔之FACS緩衝液再次洗滌細胞兩次。為固定細胞，將含有1% PFA之100 µl FACS緩衝液添加至孔中。在量測之前，將細胞再懸浮於150 µl FACS緩衝液中。使用BD CantoII流式細胞儀量測螢光。
與 CD8 T 細胞之 結合 檢查新近分離之PBMC的活力且在FACS緩衝液中將細胞調節至1百萬個細胞/毫升之密度。將100 µl PBMC (含有10萬個細胞)接種至96孔圓底培養盤中。使培養盤在400×g下離心4 min且移除上清液。隨後添加0.5 μl Fc嵌段(BD Bioscience)，每孔總體積20 μl，且將培養盤在4℃下培育30 min。移除上清液，隨後將40 µl稀釋NKG2D抗體添加至細胞並在4℃下再培育30 min。培育後，用每孔150 µl FACS緩衝液洗滌細胞兩次。隨後將20 µl稀釋FITC抗人類Fc特異性二級抗體(Jackson ImmunoResearch，#109-096-098)與CD8 APC (純系SK1，BioLegend)及CD3 PE/Cy7 (純系UCHT1，BioLegend)一起添加至細胞中以偵測NKG2D抗體及鑑別PBMC內呈CD8及CD3陽性細胞形式之CD8 T細胞。在4℃下再培育細胞30 min。為移除未結合抗體，用150微升/孔之FACS緩衝液再次洗滌細胞兩次。為固定細胞，將含有1% PFA之100 µl FACS緩衝液添加至孔中。在量測之前，將細胞再懸浮於150 µl FACS緩衝液中。使用BD CantoII流式細胞儀量測螢光。
與擴增 NK 細胞之 結合 檢查擴增NK細胞之活力且在FACS緩衝液中將細胞調節至1百萬個細胞/毫升之密度。將100 µl此等細胞懸浮液(含有10萬個細胞)接種至96孔圓底培養盤中。使培養盤在400×g下離心4 min且移除上清液。隨後添加0.5 μl Fc嵌段(BD Bioscience)，每孔總體積20 μl，且將培養盤在4℃下培育30 min。移除上清液，隨後將40 µl稀釋NKG2D抗體添加至細胞並在4℃下再培育30 min。培育後，用每孔150 µl FACS緩衝液洗滌細胞兩次。隨後將20 μl稀釋之FITC抗人類Fc特異性二級抗體(Jackson ImmunoResearch，#109-096-098)添加至細胞中。在4℃下再培育細胞30 min。為移除未結合抗體，用150微升/孔之FACS緩衝液再次洗滌細胞兩次。為固定細胞，將含有1% PFA之100 µl FACS緩衝液添加至孔中。在量測之前，將細胞再懸浮於150 µl FACS緩衝液中。使用BD CantoII流式細胞儀量測螢光。
與擴增 γδ T 細胞之 結合 檢查擴增γδ T細胞之活力且在FACS緩衝液中將細胞調節至1百萬個細胞/毫升之密度。將100 µl此等細胞懸浮液(含有10萬個細胞)接種至96孔圓底培養盤中。使培養盤在400×g下離心4 min且移除上清液。隨後將40 µl稀釋NKG2D抗體添加至細胞並在4℃下再培育30 min。培育後，用每孔150 µl FACS緩衝液洗滌細胞兩次。隨後將20 μl稀釋之二級FITC抗人類Fc特異性二級抗體(Jackson ImmunoResearch，#109-096-098)添加至細胞中。在4℃下再培育細胞30 min。為移除未結合抗體，用150微升/孔之FACS緩衝液再次洗滌細胞兩次。為固定細胞，將含有1% PFA之100 µl FACS緩衝液添加至孔中。在量測之前，將細胞再懸浮於150 µl FACS緩衝液中。使用BD CantoII流式細胞儀量測螢光。
產生擴增人類 NK 細胞 使用NK細胞分離套組(Miltenyi Biotec，#130-092-657)自PBMC分離NK細胞。為此，以磁性方式間接標記非NK細胞，之後使用MACS分離器磁性分離。隨後使未標記NK細胞穿過MACS管柱，而將非NK細胞保留於管柱中。
細胞分離之後，隨後使用NK細胞活化/擴增套組(Miltenyi Biotec，#130-094-483)培養NK細胞。當以NK擴增培養物為起始物質時，抗生物素珠粒粒子裝載有針對CD335及CD2之生物素化抗體。隨後將此等粒子以1:2之珠粒細胞比一次添加至細胞培養物中。將細胞以1百萬個細胞/毫升之細胞密度置於24孔細胞培養盤中。培育NK細胞6天且每天檢測。必要時添加新鮮培養基。在第6天，再懸浮細胞並計數。隨後將NK細胞保持於100萬至150萬個細胞/毫升下以供進一步培養。用於NK細胞之擴增培養基含有NK MACS培養基(NK MACS基礎培養基(Miltenyi Biote，#130-107-879)以及2% NK MACS補充物(#130-107-210)、5%人類AB血清及500 IU/ml IL2 (Proleukin，Novartis)。
產生擴增人類 γδ T 細胞 用於產生擴增人類γδ T細胞之方案改編自Rincon-Orozco等人(2005) J Immunol 175, 2144-2151 (以引用之方式併入本文中)。簡言之，將新近分離之PBMC以1百萬個細胞/毫升再懸浮於γδ T細胞擴增培養基(RPMI 1640、10% FBS、1% Glutamax、100 mM丙酮酸鈉、10 mM MEM NEAA、100 μM β-巰基乙醇、1 μg/ml IPP (Sigma-Aldrich)及100 U/mL IL-2 (Proleukin，Novartis)中且塗鋪在24孔細胞培養盤中。在第3天及第7天替換一半培養基。在分離後第10天，使用人類TCRγδ T細胞分離套組(Miltenyi Biotec，#130-092-892)分離γδ T細胞。γδ 將T細胞在24孔細胞培養盤中以1至2百萬個細胞/毫升保持於γδ T細胞擴增培養基中以進一步擴增。
結果 所選抗體5C5、320、230、013、296及395以濃度依賴性方式結合所測試免疫細胞(圖 5 )。NKG2D之表現量在各免疫細胞亞群上不同，但各純系在所有NKG2D陽性免疫細胞上的由EC50 值指示之結合強度(表 11 )相當。有趣的是，關於其結合特性，NKG2D抗體聚集成兩組：A組具有較高總體結合，且B組具有較低(相較於A為約一半) NKG2D結合(圖 5 )。在所有所測試NKG2D陽性免疫細胞(NK細胞、CD8 T細胞及γδ T細胞)上觀測到此模式，且其指示兩組促效NKG2D抗體之間的結合模式之差異。表 11. NKG2D抗體與NKG2D陽性免疫細胞之EC50 值結合
EC50 (nM) NK92 NK細胞 γδT細胞 CD8 T細胞
5C5 0.47 (0.30至0.73) 0.40 (0.27至0.59) 0.28 (0.11至0.73)   
230 2.72 (2.15至3.43) 2.87 (2.65至3.11) 3.31 (2.97至3.69) 0.83 (0.67至1.04)
013 122.2 (66.47至224.6) 48.8 (41.17至57.85) 132.9 (20.30至869.9) 264 (8.42至8276)
320 8.97 (7.95至10.11) 3.68 (3.49至3.88) 3.84 (2.36至6.26) 13.05 (2.38至71.53)
296 0.63 (0.34至1.15) 0.48 (0.39至0.61) 1.32 (1.03至1.69) 0.13 (0.058至0.31)
395 2.49 (2.16至2.86) 未量測 1.94 (1.81至2.08) 未量測
抗NKG2D抗體特異性地結合於經描述表現NKG2D之免疫細胞。大部分抗體具有低EC50 值(0.28至13.5 nM)，指示與NKG2D之高親和力結合，其對於為NK細胞、γδ T細胞及CD8 T細胞之不同所測試免疫細胞亞群而言係相當的。
實例 12. 用 交聯抗 NKG2D 抗體 (IgG) 活化 NKG2D 陽性免疫細胞 接下來，確認人類NKG2D IgG1 抗體之促效活性。
抗NKG2D抗體在NK92細胞上之活性 在藉由將所指示濃度之抗體塗佈至蛋白A珠粒進行交聯之後，測試NKG2D在人類NK細胞株NK92上之活化。將呈遞抗NKG2D抗體之蛋白A珠粒與NK92細胞共培育24 h。隨後藉由流式微珠陣列(cytometric bead array；CBA)測定NK92細胞至上清液中釋放之IFNγ，作為由NKG2D活化誘導之NK92細胞活化的標記物。
測試所有抗NKG2D抗體之促效活性，且隨後選擇最佳促效純系以供進一步表徵。
在圖 6 中，測試一系列抗NKG2D抗體之實例的IFNγ釋放，且將其活性與僅具有誘導NK92細胞之IFNγ釋放之微小活性的基準促效抗NKG2D抗體KYK-2.0 (Kwong等人(2008) J Mol Biol 384, 1143-1156)進行比較。
選擇最佳促效抗NKG2D抗體以更詳細地再測試其功能活性。
所選抗NKG2D抗體在交聯後以濃度依賴性方式誘發NK92細胞之IFNγ釋放，其效力具有差異(圖 7A )。促效抗NKG2D抗體對NKG2D之活化僅可由經交聯抗體誘導；呈溶液之抗NKG2D抗體在此環境中不具有誘導IFNγ釋放之促效潛能(圖 7B )。此指示，吾人之促效抗NKG2D抗體在無任何交聯劑存在之情況下將不誘導免疫細胞活化，因此預期此等抗體無全身性活化。
抗NKG2D抗體在初級人類NK細胞上之活性 隨後在作為更具生理性之細胞群體的擴增初級人類NK細胞上測試在人類NK92細胞株上顯示促效活性的抗NKG2D抗體。使用相同設定來評定抗體對此細胞類型之功能活性。如在NK92細胞上所見，由至上清液中之IFNγ及TNFα釋放所指示，所有所測試抗NKG2D抗體相較於非結合同型對照IgG1 誘導人類NK細胞之活化(圖 8 )。非結合同型對照IgG1 (參見上文)歸因於IgG1 抗體結合及交聯NK細胞上之Fc受體的能力而誘導某一背景活性。此意謂在此設定中，促效NKG2D抗體之所量測效應為優於單獨的Fc受體活化的活化Fc受體及NKG2D之組合(藉由對照可見)。
抗NKG2D抗體在人類γδ T細胞上之活性 在NK細胞上測試促效抗NKG2D抗體之後，亦測試其是否可活化γδ T細胞。γδ T細胞為第二細胞群體，據報導其在NKG2D觸發後即刻反應。為得到足量γδ T細胞，用IPP (焦磷酸異戊烷)及IL-2活化新近分離之PBMC以優先擴增γδ T細胞。分離擴增之γδ T細胞，且隨後與結合至蛋白A珠粒之促效NKG2D IgG1抗體共培養。再次，實驗中包括非結合同型對照(參見上文)。24小時後，收集上清液，且藉由CBA測定TNFα至上清液中之釋放。所測試NKG2D抗體誘導γδ T細胞至上清液中之TNFα釋放，指示抗體對NKG2D之活化(圖 9 )，如關於另一所測試細胞亞群所見。
方法 再懸浮蛋白A Dynabead (Invitrogen，#10001D)，且在5 ml PBS中稀釋10 μl珠粒溶液。隨後，將50 μl稀釋珠粒溶液轉移至96孔圓底培養盤之各孔中，其對應於約200'000個珠粒/孔。藉由假定1 μl儲備珠粒溶液含有約2百萬個珠粒來進行計算。使培養盤在400×g下離心3 min且移除上清液。隨後，將50 μl稀釋於PBS中之抗NKG2D抗體添加至珠粒中，且在冰箱中培育1 h以使抗體與珠粒結合。
培育之後，使培養盤再次在400× g下離心3 min，且用每孔150 μl PBS洗滌兩次以移除未由蛋白A珠粒捕獲之抗體。計數可為NK92、擴增人類NK細胞或擴增人類γδT細胞之效應細胞，且檢查活力。將NK92及擴增NK細胞再懸浮於含有10% FCS、1%麩醯胺酸及10 ng/ml Proleukin之RPMI 1640中，且將γδ T細胞再懸浮於含有10% FBS、1% GlutaMax及100 U/ml IL-2 (Proleukin，Novartis)之RPMI 1640中。將100 μl濃度為1百萬個細胞/毫升之細胞懸浮液接種於含有蛋白A珠粒之96孔圓底培養盤之各孔中，且在37℃下培育24 h。
培育24 h之後，收集含有釋放之細胞介素的上清液，且儲存於-20℃或直接用於CBA (BD Bioscience)分析。視效應細胞而定，分析不同細胞介素。根據製造商之說明書進行CBA分析，但代替50 µl珠粒及樣本體積，僅使用25 µl珠粒及樣本體積，且相應地調適所有其他試劑量。使用BD FACS CantoII流式細胞儀進行分析。
實例 13. 用交聯之抗 NKG2D 抗體共刺激 CD8 T 細胞 純系 使用NLV特異性CD8 T細胞純系及MART1特異性CD8 T細胞純系評定抗NKG2D抗體之共刺激潛能。所用CD8 T細胞純系為NKG2D陽性的。為解決抗NKG2D抗體之共刺激潛能(其中CD3抗體提供初級刺激(「信號1」)，用抗人類抗體塗佈96孔培養盤以固定抗NKG2D抗體且用抗小鼠抗體塗佈以捕獲CD3抗體。隨後，將CD8 T細胞添加至培養盤且培育24 h。刺激之後，收集CD8 T細胞純系且藉由量測CD25上調來分析活化。另外，用NLV特異性CD8 T細胞純系在無CD3抗體存在之情況下進行相同實驗，以評定抗NKG2D抗體在無信號1存在之情況下直接活化CD8 T細胞的潛能。再次，實驗中包括非結合同型對照(參見上文)。
更詳細地，為測試抗NKG2D抗體對CD8 T細胞純系之共刺激，在4℃下用2 μg/ml抗人類IgG (Jackson ImmunoResearch，#109-006-098)及2 μg/ml抗小鼠IgG (Jackson ImmunoResearch，#115-005-071)以每孔50 μl PBS塗佈96孔圓底培養盤過夜。次日，用含有1% BSA之200 μl PBS洗滌培養盤三次。隨後將200 μl含有1% BSA之PBS添加至各孔中且在37℃下培育90 min以用BSA阻斷游離塑膠表面。移除上清液之後，將0.25 μg/ml的50微升/孔之CD3抗體(BioLegend，#317304)及各別抗NKG2D 人類IgG1抗體或對照中添加至各孔。在37℃下培育培養盤90 min。然後，用200微升/孔之含有1% BSA之PBS洗滌培養盤三次且儲存於冰箱中直至傍晚添加CD8 T細胞純系之100'000個細胞為止。在37℃下培育細胞過夜。次日，收集CD8 T細胞純系，用FACS緩衝液洗滌兩次，且在4℃下用CD8 FITC (純系SK-1，BioLegend)、CD25 PE (純系M-A251，BioLegend)及CD69 BV421或CD69 APC(純系FN50，BioLegend)染色30 min。為移除未結合抗體，用150微升/孔之FACS緩衝液再次洗滌細胞兩次。為固定細胞，將含有1% PFA之100 µl FACS緩衝液添加至孔中。在量測之前，將細胞再懸浮於150 µl FACS緩衝液中。使用BD CantoII或Fortessa流式細胞儀量測螢光。
結果顯示於圖 10 中。吾人可確認，吾人之促效NKG2D抗體對CD8 T細胞具有獨有共刺激潛能且依賴於「信號1」，該信號在此由誘導CD8 T細胞活化之CD3抗體遞送。
實例 14. 人類化促效抗 NKG2D 抗體 395 藉由轉殖基因兔之免疫接種獲得促效抗NKG2D抗體395。雖然VL域已為人類的，但VH域屬於兔序列且必須經人類化。更精確而言，VL域為在CDRL1中具有3個成熟胺基酸(S28D、S31G及Y32A)及在CDRL3中具有3個成熟胺基酸(S91A、Y92N及T94F)的人類生殖系IGKV1D-39#01。CDRL2中未發生變化。另外，分別在FR2L及FR3L中觀測到兩個體細胞突變：K45N及F71Y。此人類可變域未經修飾。抗體395之可變重鏈為在構架區及CDR中具有若干體細胞突變的自生殖系RABBIT_IGHV1S7#01成熟的兔VH：FR H1中8個，HCDR1中4個，FR H2中沒有，HCDR2中4個，且FR H3中6個。另外，純系395之免疫球蛋白VH域在Kabat位置21、50及79處含有3個額外半胱胺酸。根據其生殖系，位置21及79形成二硫橋鍵。位置50之半胱胺酸無搭配物，因為生殖系之搭配物C35已成熟而變為蘇胺酸。
人類化消除額外二硫橋鍵，因為人類生殖系不呈現此特徵。處於可發展性原因，C50突變成其接近類似物絲胺酸，以避免過多影響純系395與其目標NKG2D之結合。經選擇作為受體構架之人類生殖系均不具有Kabat位置50之絲胺酸。
選擇hVH5_51、hVH3_23及hVH4_59作為受體構架。其表示具有與抗體395之VH域的高度序列類似性且不具有或僅具有較小預測Abangle偏差(表示各別人類化可變重鏈域相較於原始兔可變重鏈之取向變化，該等可變重鏈皆與未經修飾人類輕鏈可變域配對)的常用人類生殖系。另外，將抗體395之VH域之CDR接枝至曲妥珠單抗(trastuzumab)之VH構架(基於VH3_23之構架)上且充分表徵為穩定抗體。
選擇圖 11 中所示之人類化序列來表現及測試其結合及功能。該等序列亦載於SEQ ID NO 107、108、109、110、111、112及113 (分別為序列P1AE4973、P1AE4975、P1AE4977、P1AE4978、P1AE4979、P1AE4980及P1AE4981)中。序列P1AE4972 (SEQ ID NO: 106)對應於具有C50S突變的抗體395 (SEQ ID NO: 79)之親本VH序列。
考慮HCDR2末端處之一些正向突變，因為推測此等殘基遠離抗原NKG2D結合位點。另一方面，亦考慮一些回復突變以便更緊密黏著至純系395之原始胺基酸。突出實例為hVH3_23上之S49G回復突變。在一些變異體中，亦考慮N端QE基元，因為彼等胺基酸位於HCDR3之後部。「CDR4」環之特徵在於已再引入於一些變異體中之序列IDQS，因為此環有時與作為可變重鏈域之第四CDR之抗原接觸。
已使用抗體395之人類化VH域變異體及其原始人類VL域來產生雙特異性NKG2D×CEA抗體，隨後測試其結合及功能性(參見實例 17 及18 )。
實例 15. 產生雙特異性 NKG2D 抗體 產生若干型式之雙特異性NKG2D抗體且使用CEA作為例示性第二特異性進行測試。雙特異性抗體型式稱為D、J、K、I、L及M，且示意性地描繪於圖 12 中。D型式對於NKG2D及CEA為二價，J型式對於NKG2D為四價且對於CEA為單價，K、I及L型式對於NKG2D為二價且對於CEA為單價，而M型式對於NKG2D及CEA為單價。在不同重鏈之情況下，藉由應用臼包杵技術來實現雜二聚化。為避免輕鏈錯配，除I型式不需要以外，應用CrossMab (Fab域互換)技術。在雙特異性抗體之互換(在此等實例中為NKG2D結合的)Fab部分中，VH及VL域彼此交換，而特異性電荷突變(在此等實例中分別為147E/213E (Kabat EU索引)及123R/124K (Kabat))經引入非互換(在此等實例中為CEA結合的)Fab之恆定域CH1及CL中。
選擇以IgG形式顯示良好促效活性之促效抗NKG2D抗體5C5、013、230、320及395進行不同雙特異性抗體型式之功能評定。在包含兔VH域之抗體395中，CDRH2中之未配對半胱胺酸C50經絲胺酸置換而不影響結合或功能。將抗體B9 (CDR及VH及VL序列SEQ ID NO 114-119、120及121；亦參見WO 2007/071422 (SEQ ID NO 27-29、32-34、22及26)；以全文引用之方式併入本文中)及huA5B7 (CDR及VH及VL序列SEQ ID NO 122-127、128及129；亦參見EP申請案第19182505.8號以及主張其優先權之PCT申請案，以全文引用之方式併入本文中)用作用於第二特異性之例示性抗CEA抗體。表 13. 雙特異性NKG2D×CEA抗體型式之概述。
純系 D 型式 J 型式 K 型式 I 型式 L 型式 M 型式
5C5 B9 B9 B9 B9 - -
013 B9 - B9 B9 - -
230 - -    B9 - -
320 B9 B9 B9 B9 B9 -
395 - - - B9 - B9
產生雙特異性抗體 藉由瞬時轉染HEK293 EBNA細胞來產生雙特異性抗體。離心細胞，且培養基經預溫熱CD CHO培養基(Thermo Fisher，#10743029)置換。在CD CHO培養基中混合表現載體，添加聚乙烯亞胺(PEI；Polysciences，#23966-1)，使溶液渦旋且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞(2百萬個/毫升)與載體/PEI溶液混合，轉移至燒瓶中且在具有5% CO2 氛圍的振盪培育箱中於37℃下培育3小時。培育後，添加具有補充劑(總體積之80%)之Excell培養基(Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, W. Zhou及A. Kantardjieff編, Springer Verlag 2014)。轉染後一天，添加補充劑(進料，總體積之12%)。7天後藉由離心及隨後過濾(0.2 μm過濾器)收集細胞上清液，且藉由如下文所指示之標準方法自所收集之上清液純化蛋白質。
純化及分析雙特異性抗體 參考標準方案，自經過濾細胞培養上清液純化蛋白質。簡言之，藉由蛋白A親和力層析(平衡緩衝液：20 mM檸檬酸鈉、20 mM磷酸鈉，pH 7.5；溶離緩衝液：20 mM檸檬酸鈉，pH 3.0)自細胞培養上清液純化含Fc之蛋白質。在pH 3.0下實現溶離，隨後立即pH中和樣本。藉由離心(Millipore Amicon® ULTRA-15，#UFC903096)濃縮蛋白質，且藉由尺寸排阻層析在pH 6.0之20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉中自單體蛋白質分離聚集之蛋白質。
根據Pace等人 (Protein Science, 4, 2411-2423 (1995)使用基於胺基酸序列計算之質量消光係數量測280 nm下之吸光度來測定經純化蛋白質之濃度。在存在及不存在還原劑之情況下使用LabChipGXII (Perkin Elmer)藉由CE-SDS分析蛋白質之純度及分子量。在25℃下使用分析型尺寸排阻管柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)，在運行緩衝液(分別為25 mM K2 HPO4 、125 mM NaCl、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽，pH 6.7或200 mM KH2 PO4 、250 mM KCl pH 6.2)中平衡，藉由HPLC層析進行聚集體含量之測定。
實例 16. 比較不同促效抗 NKG2D 抗體之不同雙特異性抗體型式 使用抗CEA抗體B9作為例示性第二特異性，將所選的具有良好促效活性之抗NKG2D抗體(5C5、013、230及320)轉化成I型式之雙特異性抗體。雙特異性抗體應藉由腫瘤細胞上經由CEA之交聯而誘導免疫細胞上NKG2D之活化。
與次佳固定濃度之CEA×CD3雙特異性抗體(CEA-T細胞雙特異性抗體(TCB)，SEQ ID NO 130-137 (CD3 CDR及VH/VL)、138-145 (CEA CDR及VH/VL)及154-157；提供「信號1」)組合在Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中測試雙特異性抗體之功能活性。在此分析中，在存在經由CD3活化藉由CEA-TCB遞送之信號1的情況下接合NKG2D使得NFAT之活化增加。此活化使得在添加螢光素酶受質後發光增加。
如圖 13 中所展示，所有四個所測試CEA-NKG2D構築體均能夠基於固定濃度之CEA-TCB以濃度依賴性方式誘導活化。含有抗NKG2D純系320及230之構築體具有最高活性，接著為含有抗NKG2D純系013及5C5之構築體。此等結果證明，吾人所選促效抗NKG2D抗體能夠在存在此實例中經由CD3接合藉由CEA-TCB遞送之「信號1」的情況下，在於腫瘤細胞上經由CEA交聯之後增加T細胞活化。
選擇抗NKG2D抗體320以進一步評估不同雙特異性抗體型式。其為所測試I型式中之最強效者之一，因此被認為是用於進一步評估不同雙特異性型式之良好候選者。將四種額外雙特異性型式設計成對於NKG2D及CEA具有不同價態，能夠鑑別具有促效NKG2D之理想特性的型式。再次使用抗CEA抗體B9作為例示性第二特異性來產生雙特異性型式D、J、K及L，且與CEA-TCB組合在Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中測試其功能活性。將新型式之活性與先前所測試之I型式進行比較，且隨後選擇具有誘導NKG2D活化之最高效力的型式。型式D及L具有最高效力，類似於先前所測試之I型式之活性。型式K及J具有相較於另一所測試型式大大減弱之活性，且因此不考慮用於進一步表徵(圖 14 )。
進一步測試雙特異性抗體型式D、J、K、L及I之抗體320與表現NKG2D之NK92細胞及表現CEA之LS180細胞的結合，其藉由流動式細胞測量術來量測。
在NK92細胞上，四價構築體J具有最低EC50值，接著為具有類似結合之320 IgG及I型式，且型式K、L及D具有最弱結合(圖 15A )。在表現CEA之LS180細胞上，型式D、J、K及I具有相較於型式L降低的CEA結合。型式L具有與各別B9 IgG相當之EC50，但總體結合較高(圖 15B )。
在下一步驟中，測試所選型式的兩種額外強效促效抗NKG2D抗體5C5及013。將抗NKG2D抗體5C5轉化成型式D、J及K，且將抗體013轉化成型式D及K。與CEA-TCB組合在Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中測試功能活性且與各別I型式之活性進行比較。如關於抗體320以及關於抗體5C5 (圖 16A )及抗體013 (圖 16B )所見，先前所測試之型式I為最強效型式之一，且二價型式K具有最低活性。
隨後將額外強效促效抗NKG2D抗體(抗體395)轉化成雙特異性I型式，其為至今最強效之雙特異性型式。另外，用抗體395產生IgG樣1+1型式(M型式)。與CEA-TCB組合在Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中測試此等構築體之功能活性，且與抗體320之I型式之功能活性相比較，抗體320之I型式為至今所測試的最強效者之一。如圖 17 中所見，抗NKG2D抗體395之兩種雙特異性型式相比抗體320之該等兩種形式明星更強效。比較抗體395之該兩種型式，M型式相比I型式具有較高總體活性，且因此經選擇用於進一步表徵(圖 17 )。
藉由流動式細胞測量術評定抗NKG2D抗體395之兩種雙特異性型式I及M與NK92上之NKG2D(圖 18A )及L180細胞上之CEA(圖 18B )的結合。二價I型式與NKG2D之結合程度與對應395 IgG相當。單價型式M歸因於單價結合而具有較高總體結合(亦即，更具分子結合性)，但EC50值仍類似於關於各別395 IgG所見之值。在CEA陽性LS180細胞上，M型式具有較高總體結合以及相較於各別B9 IgG更高之EC50值。I型式僅具有弱CEA結合，指示CEA結合子B9之C端融合對於CEA結合具有負面影響。
為進一步表徵抗體395之雙特異性M型式及抗體320之I型式，於Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中在CEA高量MKN-45細胞、CEA中等量LS-180細胞及CEA低量HT-29細胞上測試兩種構築體。抗體320之I型式在CEA高量MKN-45細胞及CEA中等量LS-180上具有良好活性，但在CEA低量HT-29細胞上僅具有極弱活性(圖 19A )，而抗體395之M型式在全部三個所測試CEA細胞株上具有良好活性(圖 19B )，且活性僅略微低於CEA低量細胞株上之活性。
隨後選擇M型式用於進一步表徵，因為M型式之促效抗NKG2D抗體395相較於所有其他所測試雙特異性構築體具有最高效力。作為下一步驟，使用自健康供體新近分離之PBMC，藉由流動式細胞測量術測試雙特異性型式M與表現於CD8 T細胞及NK細胞上之NKG2D的結合。作為陰性對照，測試與NKG2D陰性CD4 T細胞之結合，且實驗中包括非結合對照(在Fc區中具有L234A L235A P329G (「PGLALA」)突變之非靶向IgG (SEQ ID NO 81及82之VH及VL序列)，亦參見上文)。如所預期，雙特異性構築體顯示與CD8 T細胞(圖 20A )及NK細胞(圖 20B )之強結合，但不與CD4 T細胞結合(圖 20C )，而非結合對照顯示不與任何所測試細胞類型結合。
隨後使用新近分離之PBMC在表現CEA之腫瘤細胞的共培養分析中測試所選雙特異性抗體(M型式之抗體395)的功能活性，以評定與TCB組合在NKG2D接合之後CD8 T細胞的活化。量測早期活化標記物CD69及晚期活化標記物CD25之上調以作為CD8 T細胞活化之標記物。相較於用單獨的CEA-TCB (2)處理，在結腸直腸腺癌細胞株LS-180存在下，NKG2D×CEA雙特異性抗體處理與CD3×CEA雙特異性抗體(CEA-TCB (2)，SEQ ID NO 130-137 (CD3 CDR及VH/VL)、146-153 (CEA CDR及VH/VL)及158-161)組合誘導CD8 T細胞上之CD25及CD69上調增加(圖 21A 及 圖 21B )。在MKN-45細胞存在下，NKG2D×CEA雙特異性抗體亦提昇由CEA-TCB介導之CD8 T細胞活化，其藉由NKG2D×CEA雙特異性抗體與CEA-TCB之組合相較於單獨的CEA-TCB增加的CD8 T細胞上之CD25及CD69上調可見(圖 21C 及圖 21D )。
方法 Jurkat NFAT NKG2D 報導細胞分析 藉由Jurkat NFAT Fluc細胞(Promega)之穩定轉染來產生表現NKG2D之Jurkat NFAT細胞(Jurkat NFAT NKG2D)。在含有2% FBS、1% GlutaMax (Gibco)及200 µg/ml潮黴素之進階RPMI 1640 (Gibco)培養基中培養細胞。將Jurkat NFAT NKG2D報導細胞與腫瘤細胞株MKN45 (DSMZ ACC 409)、LS180 (ATCC CL-187)、HT-29 (ATCC HTB-38)或HeLa (ATCC CRM-CCL-2)共培養。在分析培養基(含有2% FCS及1% GlutaMax(Gibco)之進階RPMI 1640 (Gibco))中進行分析。
使用胰蛋白酶剝離腫瘤細胞。對細胞計數且檢查活力。將目標細胞再懸浮於分析培養基中，且將60 000個細胞接種在白色平底96孔培養盤中之每孔中。隨後以所指示濃度添加T細胞雙特異性抗體(TCB)、NKG2D雙特異性抗體。對Jurkat NFAT NKG2D報導細胞計數，檢查活力，且對應於效應目標(E:T)比1.6:1每孔接種10萬個細胞。此外，將2%最終體積之GloSensor cAMP試劑(E1291，Promega)添加至各孔中。所指示之培育時間之後，使用Tecan Spark10M裝置量測發光。
NK92 及腫瘤細胞株結合 檢查NK92細胞或腫瘤細胞(MKN-45，LS180)之活力，且將細胞再懸浮並調節至1百萬個細胞/毫升之密度。將100微升/孔之此細胞懸浮液(含有10萬個細胞)接種於96孔圓底培養盤中。使培養盤在400×g下離心4 min且移除上清液。隨後將40 µl稀釋抗體或FACS緩衝液添加至細胞中且在4℃下培育30 min。培育後，用每孔150 µl FACS緩衝液洗滌細胞兩次。隨後將20 μl稀釋之APC抗人類Fc特異性二級抗體(Jackson ImmunoResearch，#109-116-170)添加至細胞中。在4℃下再培育細胞30 min。為移除未結合抗體，用150微升/孔之FACS緩衝液再次洗滌細胞兩次。為固定細胞，將含有1% PFA之100 µl FACS緩衝液添加至孔中。在量測之前，將細胞再懸浮於150 µl FACS緩衝液中。使用BD流式細胞儀量測螢光。
PBMC 結合 檢查新近分離之周邊血液單核細胞(PBMC)之活力，且在FACS緩衝液中將細胞調節至1百萬個細胞/毫升之密度。將100微升/孔之PBMC (含有10萬個細胞)接種至96孔圓底培養盤中。使培養盤在400×g下離心4 min且移除上清液。隨後添加0.5 μl Fc嵌段(BD Bioscience)，每孔總體積20 μl，且將培養盤在4℃下培育30 min。移除上清液，隨後將40 µl稀釋之抗NKG2D抗體添加至細胞並在4℃下再培育30 min。培育後，用每孔150 µl FACS緩衝液洗滌細胞兩次。隨後將20 µl稀釋之PE抗人類Fc特異性二級抗體(Jackson ImmunoResearch，#109-116-170)與CD3 FITC (純系UCHT1，BioLegend)、CD8 APC/Cy7 (純系SK1，BioLegend)、CD4 APC (純系RPA-T4，BioLegend)及CD56 BV421 (純系HCD56，BioLegend)一起添加至細胞中，以偵測抗NKG2D抗體及鑑別PBMC內作為CD8及CD3雙重陽性細胞之CD8 T細胞、作為CD4及CD3雙重陽性細胞之CD4 T細胞及作為CD3陰性及CD56陽性細胞之NK細胞。在4℃下再培育細胞30 min。為移除未結合抗體，用150微升/孔之FACS緩衝液再次洗滌細胞兩次。為固定細胞，將含有1% PFA之100 µl FACS緩衝液添加至孔中。在量測之前，將細胞再懸浮於150 µl FACS緩衝液中。使用BD流式細胞儀量測螢光。
與 T 細胞 雙特異性抗體 (TCB) 組合的 CD8 T 細胞 活化 自健康供體血液分離PBMC，且在開始分析之前檢查活力。使用胰蛋白酶(Gibco)剝離目標細胞(MKN-45或LS180)，且檢查活力。將目標細胞以60萬個細胞/毫升之密度再懸浮於分析培養基(含有2% FBS及1% GlutaMax (Gibco)之進階RPMI 1640 (Gibco))中。將細胞以30 000個細胞/孔接種至96孔培養盤中。將抗體稀釋於分析培養基中，且將所指示濃度之稀釋抗NKG2D抗體或TCB添加至目標細胞。隨後添加細胞密度為6百萬個細胞/毫升(E:T 10:1)的分離之PBMC，得到300 000個細胞/孔且最終體積為200微升/孔。在37℃下於培育箱中培育分析48 h。然後，收集PBMC且藉由流動式細胞測量術分析。將細胞在400× g下離心4 min且用PBS洗滌一次。將Aqua Live染料(L34957，Thermo Fisher Scientific)添加在50 μl PBS (於PBS中1:1000稀釋)中且在室溫下培育20 min。然後添加100 μl FACS緩衝液，且將培養盤在400× g下離心4 min。移除上清液，且用150 μl FACS緩衝液再次洗滌細胞。隨後將30微升/孔的含有CD3 FITC (純系UCHT1，BioLegend)、CD8 APC/Cy7 (純系SK1，BioLegend)、CD56 BV421 (純系HCD56，BioLegend)、CD25 PE (純系M-A251，BioLegend)、CD69 APC (純系FN50，BioLegend)及CD44 AF700 (純系IM7，BioLegend)之抗體混合物添加至細胞中。在冰箱中培育細胞30 min。然後用FACS緩衝液洗滌細胞兩次，且再懸浮於每孔100 µl含有1% PFA之FACS緩衝液中。量測之前，將細胞再懸浮於150 µl FACS緩衝液中。使用BD LSR Fortessa裝置進行分析。
實例 17. 使用表面電漿子共振 (BIACORE) 測定 包含抗體 395 之人類化變異體的 M 型式之雙特異性 NKG2D×CEA 抗體與人類 NKG2D 及人類 CEA 的 親和力 使用BIACORE T200儀器藉由表面電漿子共振評定包含抗體395之人類化變異體的M型式之雙特異性NKG2D×CEA抗體的親和力。在CM5晶片上，在約12'000 RU下在流動細胞2及3上藉由標準胺偶合固定抗penta-His捕獲抗體(Qiagen Penta·His Antibody，不含BSA；#34660)。作為各別配體，在流動細胞2上捕獲his avi huNKG2D ECD (SEQ ID NO: 93)，且在流動細胞3上以約20 RU捕獲含有人類CEA之A2域的hu N(A2B2)A-avi-His (SEQ ID NO: 208)。隨後以800至0.366 nM之範圍內的3倍稀釋度注射包含抗體395之人類化變異體的M型式之雙特異性NKG2D×CEA抗體作為分析物，接觸時間為120 s，解離時間為250或1000 s，且流動速率為30 µl/min。藉由2個脈衝之10 mM甘胺酸/HCl pH 2.0，持續60 s來實現抗H6標籤捕獲抗體之層級下之再生。資料以未固定之流槽1及零濃度之分析物作為雙重參考。將分析物之感測器圖譜與簡單1:1朗格繆爾相互作用模型擬合。兩種目標之親和力常數[KD ]彙總於表 14 中。表 14. 結合人類NKG2D及人類CEA (A2域)的M型式之雙特異性NKG2D×CEA抗體之親和力常數。此等雙特異性抗體包含促效抗NKG2D抗體395之不同人類化VH域變異體。
人類化變異體 與 hu NKG2D ECD 之親和力 [M] 與hu N(A2B2)A 之親和力[M]
P1AE4972 (非人類化比較物) 1.05E-08 3.34E-09
P1AE4973 1.45E-08 2.55E-09
P1AE4975 1.86E-08 3.66E-09
P1AE4977 2.29E-08 3.77E-09
P1AE4978 3.74E-08 3.84E-09
P1AE4979 1.72E-08 5.13E-09
P1AE4980 1.26E-08 3.45E-09
P1AE4981 4.63E-08 3.23E-09
包含促效抗NKG2D抗體395之人類化VH域變異體的雙特異性NKG2D×CEA抗體的親和力略低於具有非人類化親本兔VH域之構築體(P1AE4972)。然而，P1AE4980具有與P1AE4972極其相當的人類NKG2D親和力(13 nM比11 nM)。此等雙特異性抗體與人類CEA (A2域)之親和力差異並不顯著，因為其全部包含相同CEA結合子(huA5B7)。
選擇人類化變體P1AE4980 (M型式，與CEA結合子huA5B7組合)以用於進一步詳細功能表徵。此外，此雙特異性分子如藉由動態光散射(DLS)所測定為熱穩定的(Tagg 63℃)且適合於細胞株發育。
為了進一步增加此較佳分子P1AE4980 (M型式，與CEA結合子huA5B7組合)之效力，CEA結合子huA5B7經親和力成熟結合子置換(參見實例 19 )。
實例 18. 雙特異性 M 型式之抗 NKG2D 抗體 395 之人類化變異體的功能表徵 將促效抗NKG2D抗體395之親本(具有C50S突變)及七種人類化變異體轉化成使用CEA結合子huA5B7作為第二特異性的M型式之NKG2D×CEA雙特異性抗體。將雙特異性型式之人類化變異體與NK92上之NKG2D的結合與親本抗體395 (P1AE4972，包括C50S突變)之結合進行比較。變異體P1AE4980顯示與親本抗體相當之NKG2D結合，變異體P1AE4973、P1AE4975、P1AE4977及P1AE4979之結合略微降低，變異體P1AE4978之結合降低更多，且變異體P1AE4981僅微弱地結合NKG2D (圖 22 ，表 15 )。表 15. 雙特異性M型式之抗NKG2D抗體395之人類化變異體與NK92細胞之結合的EC50值
人類化變異體 EC50( nM) 95% 置信區間
P1AE4972 8.471 7.768至9.256
P1AE4973 17.59 14.73至21.54
P1AE4975 14.92 13.28至16.88
P1AE4977 19.61 17.45至22.24
P1AE4978 35.52 27.02至50.19
P1AE4979 13.14 11.78至14.71
P1AE4980 7.376 6.208至8.783
P1AE4981 68.25 62.51至75.51
此外，與CEA-TCB組合在Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中測試七種人類化變異體之功能活性且與表現高量CEA之腫瘤細胞株MKN-45 (圖 23A 及圖 23B )上及表現低量CEA之腫瘤細胞株HT-29 (圖 23C 及圖 23D )上的親本抗體395 (具有C50S突變)之功能活性進行比較。在兩種所測試腫瘤細胞株上，雙特異性型式之所有395種人類化變異體具有良好活性。變異體P1AE4980之活性始終與符合結合資料之親本抗體中之一者非常接近。
隨後選擇人類化變體P1AE4980以用於進一步表徵，因為其顯示良好NKG2D結合且在人類化變異體當中具有最高功能活性並且活性與親本抗體395相當。
在下一步驟中，吾人測試經由NKG2D接合對CEA-TCB活性之提昇是否取決於NKG2D經由表現於腫瘤細胞上之CEA的交聯。在Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中在CEA陰性、FolR1陽性HeLa細胞上測試FolR1×CD3雙特異性抗體(FolR1-TCB)與CEA-TCB之組合。在此設定中，信號1可經由FolR1-TCB遞送，但NKG2D×CEA雙特異性抗體歸因於缺乏HeLa細胞上之CEA表現而無法交聯。FolR1-TCB能夠活化Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析，但活化無法藉由添加NKG2D×CEA雙特異性抗體來增強(圖 24A )。作為陽性對照，在表現CEA之HT-29及MKN-45細胞上測試NKG2D×CEA雙特異性抗體及CEA-TCB之組合。在此，NKG2D×CEA雙特異性抗體可交聯且相較於單獨的CEA-TCB增加了Jurkat NFAT NKG2D細胞之活化，其藉由發光之較大增加來量測(圖 24 B 及圖 24C )。
隨後，在脫落CEA (sCEA)存在下測試NKG2D×CEA雙特異性抗體之功能活性。在存在濃度增加之sCEA的情況下，在Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中於MKN-45上測試NKG2D×CEA雙特異性抗體與CEA-TCB之組合。
僅在高濃度(＞ 5 μg/ml)下，sCEA對NKG2D×CEA雙特異性抗體之活性具有負面影響(圖 25 )。
在下一步驟中，亦測試可溶NKG2D配體之存在是否可干擾NKG2D×CEA雙特異性抗體與CEA-TCB之組合的活性。將可溶MICA (sMICA；R&D Systems，#1300-MA-050)及可溶ULBP2 (sULBP2；R&D Systems，#1298-UL-050)添加至NKG2D×CEA雙特異性抗體與CEA-TCB之組合，且測試Jurkat NFAT NKG2D細胞之活化並與在不存在可溶NKG2D配體之情況下的活化相比較。
在Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中，可溶MICA或可溶ULBP2之nM添加並不變化NKG2D×CEA雙特異性抗體與CEA-TCB之組合的活性(圖 26 )。此等結果顯示NKG2D×CEA雙特異性抗體之活性不受可溶NKG2D配體之存在影響/抑制。
實例 19. 使用抗體 huA5B7 之親和力成熟變異體產生 NKG2D×CEA 雙特異性抗體 CEA結合子huA5B7為抗體A5B7之人類化型式。抗體A5B7揭示於例如M. J. Banfield等人, Proteins 1997, 29(2), 161-171中，且其結構可呈PDB ID:1CLO形式發現於蛋白質結構資料庫PDB (www.rcsb.org, H.M. Berman等人, The Protein Data Bank, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 235-242)中。A5B7之CDR及可變區序列載於SEQ ID NO 122 (HCDR1)、162 (HCDR2)、124 (HCDR3)、125 (LCDR1)、126 (LCDR2)、127 (LCDR3)、163 (VH)及164 (VL)中。huA5B7之產生描述於EP申請案第19182505.8號及主張其優先權之PCT申請案中。huA5B7之CDR及可變區序列載於SEQ ID NO 122 (HCDR1)、123 (HCDR2)、124 (HCDR3)、125 (LCDR1)、126 (LCDR2)、127 (LCDR3)、128 (VH)及129 (VL)中。
為了進一步增加較佳分子P1AE4980之效力(參見上文實例 17 )，CEA結合子huA5B7經其親和力成熟變異體置換。huA5B7之親和力成熟描述於EP申請案第19182505.8號及主張其優先權之PCT申請案中。
huA5B7之所選親和力成熟變異體之CDR及可變區序列載於序列表中，且對應SEQ ID NO彙總於下表 16 中。表 16. 抗體huA5B7之親和力成熟變異體之CDR及可變區序列(SEQ ID NO)。
結合子 HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 VH VL
huA5B7 122 123 124 125 126 127 128 129
P006.038 122 123 172 125 126 180 184 185
P005.097 122 123 173 125 126 181 186 187
P005.103 122 123 174 125 126 182 188 189
P002.139 166 169 124 178 126 127 190 191
P001.177 122 170 124 125 126 127 192 193
P005.102 122 123 175 125 126 183 194 195
P005.102-combo1 122 169 175 125 126 183 196 197
P005.102-combo2 122 169 175 125 126 183 198 199
P005.103-combo1 122 123 176 125 126 182 200 201
P005.103-combo2 122 169 176 125 126 182 202 203
P006.038-combo1 166 169 172 125 126 180 204 205
P006.038-combo2 167 170 172 125 126 180 206 207
合成所有親和力成熟變異體之可變域，且基於臼包杵及CrossMab技術(分別針對正確重鏈/重鏈及重鏈/輕鏈配對)與PGLALA Fc域突變之組合，將其選殖至編碼IgG樣NKG2D×CEA雙特異性抗體之質體中。此實例中所製備之雙特異性分子之示意性說明展示於圖 27 中。將包含huA5B7及其親和力成熟變異體之VH及VL序列(參見表 16 )的重鏈及輕鏈與對NKG2D具有特異性之重鏈及輕鏈(包含純系P1AE4980之VH及VL序列，分別為SEQ ID NO 112及80)組合。包含CEA結合子P011.177之例示性的此類雙特異性抗體之序列載於SEQ ID NO 213、214、215及216中。
使用習知(基於非PCR)選殖技術製備構築體，且使其表現於短暫轉染之適於懸浮之CHO K1細胞中，該等細胞係於無動物組分及無血清培養基中生長。參考標準方案，自經過濾細胞培養上清液純化蛋白質。簡言之，藉由親和力層析，使用蛋白A，自細胞培養上清液純化含有Fc之蛋白質。在pH 3.0下實現溶離，接著立即中和樣本。濃縮蛋白質，且在pH 6.0之20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉中藉由尺寸排阻層析將聚集的蛋白質與單體蛋白質分離。
實例 20. 包含親和力成熟 CEA 結合子之雙特異性 CEA×NKG2D 抗體的表徵 如上文實例 19 中所描述將兩個親和力成熟CEA結合子P002.139及P001.177轉化成雙特異性分子。將此等兩個分子與表現中等量CEA之LS180腫瘤細胞的結合與含有親本人類化A5B7 CEA結合子之對應分子(huA5B7)的結合相比較。藉由流動式細胞測量術分析分子與腫瘤細胞之結合(圖 28 )。含有親和力成熟CEA結合子P002.139及P001.177之雙特異性分子與CEA之結合略優於具有親本huA5B7結合子之對應分子。
在下一步驟中，在Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中於MKN45細胞(圖 29 )以及LS180及HT29細胞(圖 30 )上測定此等三種雙特異性NKG2D×CEA抗體之功能活性。具有親和力成熟CEA結合子P002.139或P001.177之分子的活性在一些條件下比關於包含huA5B7 CEA結合子之分子所量測之活性略強。
如上文實例 16 中所描述進行實驗。對於傑卡特NFAT NKG2D報導細胞分析，在一些情況下，如下使用384孔培養盤。將10 000個目標細胞接種於白色平底384孔培養盤中。隨後以所指示濃度添加TCB及雙特異性NKG2D×CEA抗體，且對應於E:T比1.5:1添加15 000個Jurkat NFAT NKG2D報導細胞。
實例 21. 使用 NKG2D 結合子 C26 及 ADI27743 的 抗 NKG2D ( 雙特異性 ) 抗體之選殖、產生及純化 合成抗NKG2D抗體C26及ADI27743之可變域(WO 2018/148445)，且將其選殖至編碼M型式之人類IgG1或雙特異性分子的質體中(圖 12F )，該等分子各自具有PGLALA Fc域突變。雙特異性抗體包含抗CEA抗體huA5B7作為第二結合子。產生之分子之完整胺基酸序列載於SEQ ID NO 221-222 (C26 IgG)、SEQ ID NO 223-224 (ADI27743 IgG)、SEQ ID NO 225、226、229及230 (C26雙特異性)以及SEQ ID NO 227-230 (ADI27743雙特異性)中。
利用習知(基於非PCR)選殖技術及適於懸浮之CHO K1細胞(最初自ATCC接收且適於在Evitria的懸浮培養物中無血清生長)，由Evitria (Switzerland)使用其專有載體系統製備所得構築體。為進行產生，Evitria使用其專有的無動物組分及無血清培養基(eviGrow及eviMake2)及其專有的轉染試劑(eviFect)。
根據標準方案，自經過濾細胞培養上清液純化蛋白質。簡言之，藉由親和力層析，使用蛋白A，自細胞培養上清液純化含有Fc之蛋白質。在pH 3.0下實現溶離，接著立即中和樣本。濃縮蛋白質，且在pH 6.0之20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉中藉由尺寸排阻層析將聚集的蛋白質與單體蛋白質分離。
實例 22. 比較抗 NKG2D 抗體 P1AE4980 與 C26 及 ADI27743 NK92 細胞株上之 NKG2D 之 結合 測試來自實例 21 的抗NKG2D抗體P1AE4980、C26及ADI27743與NK92細胞上之NKG2D的結合。
在含有2% FBS、1% GlutaMax (Gibco)及10 ng/ml Proleukin (Novartis)之進階RPMI 1640培養基(Gibco)中培養NK92細胞。檢查NK92細胞之活力，且將細胞再懸浮並調節至150萬個細胞/毫升之密度。將100 µl之此細胞懸浮液(含有15萬個細胞)接種於96孔圓底培養盤中。使培養盤在400×g下離心4 min且移除上清液。隨後將40 µl稀釋抗體或FACS緩衝液添加至細胞中且在4℃下培育30 min。培育後，用每孔150 µl FACS緩衝液洗滌細胞兩次。隨後將30 μl稀釋之二級PE抗人類Fc特異性二級抗體(Jackson ImmunoResearch，#109-116-170)添加至細胞中。在4℃下再培育細胞30 min。為移除未結合抗體，用150微升/孔之FACS緩衝液再次洗滌細胞兩次。為進行量測，將細胞再懸浮於150 µl FACS緩衝液中。使用BD流式細胞儀量測螢光。
如圖 31 中所示，抗NKG2D抗體P1AE4980顯示最高NK92細胞總體結合，指示相較於ADI27743及C26，結合至細胞之抗體數目最高。抗NKG2D抗體C26在最高測試濃度下僅極其微弱地結合NK92。
亦測試來自實例 21 之對應雙特異性NKG2D×CEA抗體的結合。
如關於IgG所見，包含P1AE4980作為NKG2D結合子之雙特異性抗體相較於包含C26或ADI27743之雙特異性抗體顯示最高總體NK92細胞結合(圖 32 )。
Jurkat NFAT NKG2D 報導細胞分析中之功能活性之測試 如上文實例 16 中所描述，使用腫瘤細胞株MKN45 (DSMZ ACC 409)及HT-29 (ATCC HTB-38)，與5 nM CEA-TCB組合，於Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中測試包含C26、ADI27743或P1AE4980作為NKG2D結合子的雙特異性CEA×NKG2D抗體。
在MKN45 (圖 33 )或HT-29 (圖 34 )細胞存在下，Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析顯示，相較於包含ADI27743或C26之雙特異性抗體，包含P1AE4980作為NKG2D結合子之雙特異性抗體與5 nM CEA-TCB組合引起Jurkat NFAT NKG2D細胞之最高活化。包含ADI27743之雙特異性抗體相較於包含P1AE4980之雙特異性抗體適度地活化Jurkat NFAT NKG2D細胞。包含C26之雙特異性抗體在兩種所測試目標細胞株存在下僅極其微弱地活化Jurkat NFAT NKG2D細胞。
實例 23. 比較包含野生型或效應子沉默 Fc 域之 抗 NKG2D 抗體 評定具有野生型或效應子沉默Fc域之抗NKG2D抗體對NK細胞之活化。對於此分析，使用(單特異性)人類IgG1 型式之抗體P1AE4980或395。
自全血新近分離PBMC。對分離之PBMC計數且檢查活力。將細胞以3百萬個細胞/毫升之密度再懸浮於RPMI + 10% FBS + 1% Glutamax中。在96孔U形底培養盤中每孔接種100 µl細胞懸浮液(得到300 000個細胞/孔)。將50 µl稀釋之抗NKG2D抗體添加至各孔，得到總共150微升/孔。
將培養盤於培育箱中在37℃下培育24小時，隨後在350× g下離心2 min。收集PBMC且接種於另一96孔U形底培養盤中以供藉由流動式細胞測量術分析。將細胞在400× g下離心4 min且用PBS洗滌一次。將50 µl稀釋之Aqua Live/Dead染料(於PBS中1:1000稀釋，Invitrogen，#L34965)添加至各孔中且在4℃下培育30 min。隨後，添加150 µl FACS緩衝液(1×PBS，2% FBS，1% 0.5 M EDTA pH 8，0.25% NaN3 (20%))，且使培養盤在400× g下離心4 min。移除上清液，且用150 μl FACS緩衝液再次洗滌細胞。隨後，將30微升/孔的FITC抗人類CD3 (BioLegend，#300406)、Brilliant Violet 421™抗人類CD56 (BioLegend，#318328)、APC抗人類CD69 (BioLegend，#310910)之抗體混合物添加至細胞中。在4℃下培育細胞60 min。然後用FACS緩衝液洗滌細胞兩次，且再懸浮於每孔100 µl含有1% PFA之FACS緩衝液中以固定細胞。在4℃下培育培養盤過夜。在次日進行FACS量測之前，將細胞再懸浮於150 µl FACS緩衝液中。使用BD LSR Fortessa裝置進行分析。
如圖 35 中所示，具有野生型Fc域之抗NKG2D抗體誘導NK細胞上之CD69上調，其指示活化。相比之下，具有效應子沉默Fc域之抗NKG2D抗體(包含PGLALA突變)不誘導NK細胞上之CD69上調。此指示，在不存在功能Fc域之情況下，吾人之促效抗NKG2D抗體將不誘導表現NK或其他Fcγ受體之免疫細胞的全身性活化(而是僅在結合目標細胞抗原及經由目標細胞抗原交聯之後部分活化表現NKG2D之細胞)。 *   *   *
雖然出於清楚理解之目的，前述發明已藉助於說明及實例較詳細地加以描述，但該等描述及實例不應解釋為限制本發明之範疇。本文所引用之全部專利及科學文獻之揭示內容均以全文引用之方式明確併入。
圖 1 .實例1中所構築之NKG2D受體及MIC-B配體的示意性說明。選殖相對於該構築體之受體或配體部分呈單體(『mono』)或二聚體(『di』)形式的與人類或鼠類Fc域融合或不融合的NKG2D受體及MIC-B配體。除di huNKG2D ECD mu IgG1 Fc以外的所有構築體攜帶至少一個用於定點生物素標記之avi標籤。(A) his avi huNKG2D ECD、(B) mono huNKG2D ECD Fc kh avi、(C) di huNKG2D ECD Fc avi、(D) di huNKG2D ECD mu IgG1 Fc、(E) di cyNKG2D ECD Fc avi、(F) di muNKG2D ECD Fc avi、(G) ECD FL MIC-B Fc avi。圖 2 .藉由ELISA對用於MIC-B競爭之抗NKG2D抗體的篩選。展示NKG2D與MIC-B之結合相對於在沒有抗NKG2D抗體的情況下，重組之經生物素標記之人類NKG2D與培養盤固定之MIC-B之結合的抑制百分比。圖 3 .藉由抗NKG2D抗體對目標細胞之再定向溶解。如藉由自經標記之P815目標細胞釋放的鈣黃綠素所測定的抗NKG2D抗體之細胞殺傷百分比。各純系之抗體濃度(自左至右)為40.0、13.33、4.44、1.48、0.49、0.165、0.055、0.018、0.006、0.002 µg/ml。圖 4 .展示結合不同抗原決定基的兩次注射之抗體的SPR感測器圖譜之實例。圖 5. 如藉由流動式細胞測量術所量測，抗NKG2D抗體相較於非結合對照抗體與(A)人類NK細胞株NK92、(B)擴增人類NK細胞、(C)擴增人類γδT細胞及(D)新近分離之人類CD8 T細胞的結合。圖 6. 抗NKG2D抗體對NKG2D陽性免疫細胞之活化。將人類NK細胞株NK92與在蛋白A珠粒上捕獲之抗NKG2D抗體(IgG1 )一起共培養。藉由使用CBA技術量測至上清液中之INFγ釋放來測定NK細胞之活化。圖 7. 抗NKG2D抗體對NKG2D陽性免疫細胞之活化。將人類NK細胞株NK92與在蛋白A珠粒(A)上或溶液(B)中捕獲之抗NKG2D抗體(IgG1 )一起共培養。藉由使用CBA技術量測至上清液中之INFγ釋放來測定NK細胞之活化。圖 8. 抗NKG2D抗體對NKG2D陽性免疫細胞之活化。將人類初級擴增NK細胞與在蛋白A珠粒上捕獲之抗NKG2D抗體(IgG1 )一起共培養。藉由利用CBA技術量測至上清液之INFγ及TNFα釋放來測定NK細胞之活化。圖 9. 抗NKG2D抗體對NKG2D陽性免疫細胞之活化。將人類初級擴增γδ T細胞與在蛋白A珠粒上捕獲之抗NKG2D抗體(IgG1 )一起共培養。藉由利用CBA技術量測至上清液之TNFα釋放來測定NK細胞之活化。圖 10. 抗NKG2D抗體對CD8 T細胞純系之共刺激。在具有與固定濃度之CD3抗體(A及C)組合或不存在CD3抗體(B)的經塗佈抗NKG2D抗體(IgG1 )之培養盤中培養NLV特異性(A及B)及MART1特異性(C) CD8 T細胞純系。將如藉由流式細胞測量術所測定的CD25之上調用作CD8 T細胞純系之活化的標記物。圖 11. 抗NKG2D抗體395之人類化VH域與HCDR2中之未配對半胱胺酸經絲胺酸(藉由星號指示位置)置換的非人類化親本兔序列395 (P1AE4972)的比對。圖 12. NKG2D雙特異性抗體型式(其中CEA作為例示性第二特異性)之示意性說明。(A) D型式、(B) J型式、(C) K型式、(D) I型式、(E) L型式、(F) M型式。圖 13. 與5 nM CEA-TCB組合，於Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中在MKN-45細胞上測試若干抗NKG2D抗體作為靶向CEA之雙特異性構築體的功能活性。在處理後5小時之後，藉由量測發光來測定Jurkat NFAT NKG2D報導細胞之活化。圖 14. 與5 nM CEA-TCB組合，於Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中在MKN-45細胞上測試不同雙特異性型式(其中CEA作為第二特異性)之抗NKG2D抗體320的功能活性。在處理後5小時之後，藉由量測發光來測定Jurkat NFAT NKG2D報導細胞之活化。圖 15. 如藉由流動式細胞測量術所量測且相較於各別IgG，抗NKG2D抗體320之NKG2D×CEA雙特異性抗體與NKG2D陽性NK92細胞(A)及CEA陽性LS180細胞(B)之結合。圖 16. 與5 nM CEA-TCB組合，於Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中在MKN45細胞上測試不同雙特異性型式(其中CEA作為第二特異性)之抗NKG2D抗體5C5 (A)及013 (B)的功能活性。在添加處理後5小時之後，藉由量測發光來測定Jurkat NFAT NKG2D報導細胞之活化。圖 17. 與5 nM CEA-TCB組合，於Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中在MKN45細胞上，將抗NKG2D抗體395之兩種雙特異性型式(M及I)的功能活性與抗NKG2D抗體320之I型式之功能活性進行比較。在添加處理後5小時之後，藉由量測發光來測定Jurkat NFAT NKG2D報導細胞之活化。圖 18. 如藉由流動式細胞測量術所量測且相較於各別IgG，抗NKG2D抗體395之NKG2D×CEA雙特異性抗體與NKG2D陽性NK92細胞(A)及CEA陽性LS180細胞(B)之結合。圖 19. 在具有不同表現量之CEA之腫瘤細胞株存在下，在Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中測試兩種不同NKG2D×CEA雙特異性抗體之功能活性。在處理後5小時之後，藉由量測發光來測定Jurkat NFAT NKG2D報導細胞之活化。(A) I型式之抗NKG2D抗體320之雙特異性抗體，(B) M型式之抗NKG2D抗體395之雙特異性抗體。圖 20. 如藉由流動式細胞測量術所量測，M型式之抗NKG2D抗體395之雙特異性抗體與新近分離之PBMC內的CD8 T細胞(A)、NK細胞(B)及CD4 T細胞(C)之結合。圖 21. 如藉由流動式細胞測量術所量測，T細胞雙特異性抗體(TCB)及M型式之抗NKG2D抗體395之NKG2D×CEA雙特異性抗體的組合對CD8 T細胞之活化。(A、B)在單獨或與0.4 nM NKG2D×CEA雙特異性抗體組合使用0.1 nM CEA-TCB (2)處理LS180腫瘤細胞48 h後，PBMC內之CD8 T細胞上之CD69 (A)及CD25 (B)之上調。(C、D)在單獨或與2 nM NKG2D×CEA雙特異性抗體組合使用CEA-TCB處理MKN-45細胞48 h後，PBMC內CD8 T細胞上之CD69 (C)及CD25 (D)之上調。圖 22. 藉由流動式細胞測量術量測雙特異性M型式之抗NKG2D抗體395之人類化變異體與表現於NK92細胞上之NKG2D的結合，且與親本抗NKG2D抗體(P1AE4972)進行比較。(A) P1AE4973、P1AE4975、P1AE4977。(B) P1AE4978、P1AE4979、P1AE4980、P1AE4981。圖 23. 與5 nM CEA-TCB組合，在Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中在MKN-45細胞(A、B)及HT-29細胞(C、D)上測試雙特異性M型式之抗NKG2D抗體395之人類化變異體的功能活性，且與親本抗體(P1AE4972)之各別型式之活性進行比較。在處理後5小時之後，藉由量測發光來測定Jurkat NFAT NKG2D報導細胞之活化。圖 24. 使用CEA陰性腫瘤細胞株(HeLa (A))及兩個CEA陽性腫瘤細胞株(HT29 (B)及MKN-45 (C))在Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中測試與TCB組合的雙特異性M型式之人類化抗NKG2D抗體變異體P1AE4980之功能活性。在處理後5小時之後，藉由量測發光來測定Jurkat NFAT NKG2D報導細胞之活化。圖 25. 使用濃度增加之脫落CEA (shed CEA；sCEA)(A)在Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中在MKN-45細胞上測試與CEA-TCB組合的NKG2D×CEA雙特異性抗體(人類化抗NKG2D抗體變異體P1AE4980，M型式)之功能活性。同時，在同一分析(B)中測試與CEA-TCB組合的NKG2D×CEA雙特異性抗體及單獨的CEA-TCB之功能活性以作為參考。在處理後5小時之後，藉由量測發光來測定Jurkat NFAT NKG2D報導細胞之活化。圖 26. 在Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中，在MKN-45細胞上，將在可溶NKG2D配體MICA (sMICA，10 μg/ml)或ULBP2 (sULBP2，10 μg/ml)存在下NKG2D×CEA雙特異性抗體(人類化抗體變異體P1AE4980，M型式)及CEA-TCB之功能活性與NKG2D×CEA雙特異性抗體及CEA-TCB (在無配體存在下)之活性進行比較。在處理後5小時之後，藉由量測發光來測定Jurkat NFAT NKG2D報導細胞之活化。圖 27. 實例 19 中所製備之NKG2D×CEA雙特異性抗體之示意性說明，該等NKG2D×CEA雙特異性抗體含有作為NKG2D結合子之抗體P1AE4980，以及作為CEA結合子之抗體huA5B7及其親和力成熟變異體。圖 28. 將抗CEA抗體huA5B7、P002.139及P001.177之兩種親和力成熟變異體之雙特異性NKG2D×CEA抗體與表現於LS180腫瘤細胞上之CEA之結合與含有親本CEA結合子huA5B7之對應雙特異性NKG2D×CEA抗體的結合進行比較。用螢光標記之類二級抗體偵測雙特異性抗體之結合，且藉由流動式細胞測量術分析螢光。圖 29. 在96孔培養盤中，與5 nM CEA-TCB組合，於Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中在表現高量CEA之MKN45細胞上測試含有huA5B7、P002.139或P001.177作為CEA結合子之雙特異性NKG2D×CEA抗體的功能活性。在添加處理後5小時之後，藉由量測發光來測定Jurkat NFAT NKG2D報導細胞之活化。圖 30. 在384孔培養盤中，與5 nM CEA-TCB (A、C)或1 nM CEA-TCB (B、D)組合於Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中在表現中等量CEA之LS180細胞(A、B)上及在表現低量CEA之HT29細胞(C、D)上測試含有huA5B7、P002.139或P001.177作為CEA結合子之雙特異性NKG2D×CEA抗體的功能活性。在添加處理後3小時之後，藉由量測發光來測定Jurkat NFAT NKG2D報導細胞之活化。圖 31. 藉由流動式細胞測量術測試抗NKG2D抗體C26、ADI27743及P1AE4980與NK92細胞上之NKG2D之結合。用螢光標記之二級抗體偵測結合之抗體。圖 32. 藉由流動式細胞測量術測試含有C26、ADI27743或P1AE4980作為NKG2D結合子之雙特異性NKG2D×CEA抗體與NK92細胞上之NKG2D的結合。用螢光標記之二級抗體偵測結合之抗體。圖 33. 與5 nM CEA-TCB組合，於Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中在表現高量CEA之MKN45腫瘤細胞株上測試含有C26、ADI27743或P1AE4980作為NKG2D結合子之雙特異性NKG2D×CEA抗體。在添加處理後6小時之後，藉由量測發光來測定Jurkat NFAT NKG2D報導細胞之活化。圖 34. 與5 nM CEA-TCB組合，於Jurkat NFAT NKG2D報導細胞分析中在表現較低CEA之HT-29腫瘤細胞株上測試含有C26、ADI27743或P1AE4980作為NKG2D結合子之雙特異性NKG2D×CEA抗體。在添加處理後6小時之後，藉由量測發光來測定Jurkat NFAT NKG2D報導細胞之活化。圖 35. 用包含野生型或效應子沉默Fc域之NKG2D抗體處理PBMC 24 h，且隨後藉由流動式細胞測量術測定NK細胞上之CD69上調。
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Claims (31)

  1. 一種結合NKG2D之抗體，其中該抗體包含第一抗原結合域，其包含： (i)    包含SEQ ID NO: 73之重鏈互補決定區(HCDR) 1、選自由SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104及SEQ ID NO: 105組成之群的HCDR 2以及SEQ ID NO: 75之HCDR 3的重鏈可變區(VH)，及包含SEQ ID NO: 76之輕鏈互補決定區(LCDR) 1、SEQ ID NO: 77之LCDR 2及SEQ ID NO: 78之LCDR 3的輕鏈可變區(VL)； (ii)   包含SEQ ID NO: 65之HCDR 1、SEQ ID NO: 66之HCDR 2及SEQ ID NO: 67之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 68之LCDR 1、SEQ ID NO: 69之LCDR 2及SEQ ID NO: 70之LCDR 3的VL； (iii)  包含SEQ ID NO: 1之HCDR 1、SEQ ID NO: 2之HCDR 2及SEQ ID NO: 3之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 4之LCDR 1、SEQ ID NO: 5之LCDR 2及SEQ ID NO: 6之LCDR 3的VL； (iv)   包含SEQ ID NO: 25之HCDR 1、SEQ ID NO: 26之HCDR 2及SEQ ID NO: 27之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 28之LCDR 1、SEQ ID NO: 29之LCDR 2及SEQ ID NO: 30之LCDR 3的VL； (v)    包含SEQ ID NO: 49之HCDR 1、SEQ ID NO: 50之HCDR 2及SEQ ID NO: 51之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 52之LCDR 1、SEQ ID NO: 53之LCDR 2及SEQ ID NO: 54之LCDR 3的VL； (vi)   包含SEQ ID NO: 57之HCDR 1、SEQ ID NO: 58之HCDR 2及SEQ ID NO: 59之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 60之LCDR 1、SEQ ID NO: 61之LCDR 2及SEQ ID NO: 62之LCDR 3的VL； (vii)  包含SEQ ID NO: 9之HCDR 1、SEQ ID NO: 10之HCDR 2及SEQ ID NO: 11之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 12之LCDR 1、SEQ ID NO: 13之LCDR 2及SEQ ID NO: 14之LCDR 3的VL； (viii) 包含SEQ ID NO: 17之HCDR 1、SEQ ID NO: 18之HCDR 2及SEQ ID NO: 19之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 20之LCDR 1、SEQ ID NO: 21之LCDR 2及SEQ ID NO: 22之LCDR 3的VL； (ix)   包含SEQ ID NO: 33之HCDR 1、SEQ ID NO: 34之HCDR 2及SEQ ID NO: 35之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 36之LCDR 1、SEQ ID NO: 37之LCDR 2及SEQ ID NO: 38之LCDR 3的VL；或 (x)    包含SEQ ID NO: 41之HCDR 1、SEQ ID NO: 42之HCDR 2及SEQ ID NO: 43之HCDR 3的VH，及包含SEQ ID NO: 44之LCDR 1、SEQ ID NO: 45之LCDR 2及SEQ ID NO: 46之LCDR 3的VL。
  2. 如請求項1之抗體，其中該第一抗原結合域包含： (i)    包含與選自由SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112及SEQ ID NO: 113組成之群的胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 80之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (ii)   包含與SEQ ID NO: 71之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 72之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (iii)  包含與SEQ ID NO: 7之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (iv)   包含與SEQ ID NO: 31之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (v)    包含與SEQ ID NO: 55之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 56之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (vi)   包含與SEQ ID NO: 63之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 64之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (vii)  包含與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 16之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (viii) 包含與SEQ ID NO: 23之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 24之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL； (ix)   包含與SEQ ID NO: 39之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 40之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL；或 (x)    包含與SEQ ID NO: 47之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VH，及/或包含與SEQ ID NO: 48之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的VL。
  3. 如請求項1或請求項2之抗體，其中該抗體為IgG抗體，特定言之IgG1 抗體。
  4. 如請求項1或請求項2之抗體，其中該抗體為全長抗體。
  5. 如請求項1或請求項2之抗體，其中該抗體為選自以下之群的抗體片段：Fv分子、scFv分子、Fab分子及F(ab')2 分子。
  6. 如請求項1或請求項2之抗體，其中該抗體為多特異性抗體，特定言之雙特異性抗體。
  7. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含結合第二抗原之第二抗原結合域。
  8. 如請求項7之抗體，其中該第二抗原為目標細胞抗原，特定言之腫瘤細胞抗原。
  9. 2、7及8中任一項之抗體，其中該抗體包含由第一亞單元及第二亞單元構成之Fc域。
  10. 如請求項9之抗體，其中該Fc域為IgG Fc域，特定言之IgG1 Fc域。
  11. 如請求項9之抗體，其中該Fc域為人類Fc域。
  12. 如請求項9之抗體，其中該Fc域包含一或多個降低Fc受體結合及/或效應功能的胺基酸取代。
  13. 2、7及8中任一項之抗體，其中該抗體不結合FcγIIIa (CD16a)。
  14. 2、7及8中任一項之抗體，其中該第一抗原結合域及/或該第二抗原結合域為Fab分子。
  15. 2、7及8中任一項之抗體，其中該第一抗原結合域為Fab分子，其中該Fab輕鏈及該Fab重鏈之該等可變域VL及VH或該等恆定域CL及CH1，尤其該等可變域VL及VH係相互置換。
  16. 如請求項7或請求項8之抗體，其中該第二抗原結合域為習知Fab分子。
  17. 如請求項7或請求項8之抗體，其中該第二抗原結合域為Fab分子，其中在該恆定CL域中，位置124處之胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在該恆定域CH1中，位置147處之胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  18. 如請求項7或請求項8之抗體，其中該第二抗原結合域為Fab分子，其中該Fab輕鏈及該Fab重鏈之該等可變域VL及VH或該等恆定域CL及CH1，尤其該等可變域VL及VH係相互置換。
  19. 2、7及8中任一項之抗體，其中該第一抗原結合域為習知Fab分子。
  20. 2、7及8中任一項之抗體，其中該第一抗原結合域為Fab分子，其中在該恆定域CL中，位置124處之該胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之該胺基酸係獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在該恆定域CH1中，位置147處之該胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)，且位置213處之該胺基酸係獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  21. 如請求項7或請求項8之抗體，其中該第一抗原結合域及該第二抗原結合域各自為Fab分子，且該抗體包含由第一亞單元及第二亞單元構成之Fc域；且(i)該第一抗原結合域在該Fab重鏈之C端與該Fc域之該第一亞單元之N端融合，且該第二抗原結合域在該Fab重鏈之該C端與該Fc域之該第二亞單元之N端融合，或(ii)該第二抗原結合域在該Fab重鏈之該C端與該Fc域之該第一亞單元之該N端融合，且該第一抗原結合域在該Fab重鏈之該C端與該Fc域之該第二亞單元之該N端融合。
  22. 如請求項9之抗體，其中該Fc域包含促進該Fc域之該第一亞單元與該第二亞單元結合的修飾。
  23. 如請求項9之抗體，其中該Fc域之該第一亞單元之CH3域中的一胺基酸殘基係經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在該第一亞單元之該CH3域內產生隆凸，該隆凸可定位於該第二亞單元之CH3域內的凹穴中，且該Fc域之該第二亞單元之該CH3域中的胺基酸殘基係經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在該第二亞單元之該CH3域內產生凹穴，該第一亞單元之該CH3域內的該隆凸可定位於該凹穴內。
  24. 一種經分離聚核苷酸，其編碼如請求項1至23中任一項之抗體。
  25. 一種宿主細胞，其包含如請求項24之經分離聚核苷酸。
  26. 一種產生結合NKG2D之抗體的方法，其包含以下步驟：(a)在適合該抗體表現之條件下培養如請求項25之宿主細胞，及視情況(b)回收該抗體。
  27. 一種結合NKG2D之抗體，其係藉由如請求項26之方法產生。
  28. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至23中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  29. 一種如請求項1至23中任一項之抗體或如請求項28之醫藥組合物的用途，其用於製造治療疾病之藥物。
  30. 如請求項29之用途，其中該疾病為癌症。
  31. 如請求項29或30之用途，其中該藥物進一步包含或組合使用T細胞活化劑，諸如結合CD3之抗體，尤其結合CD3及目標細胞抗原，特定言之腫瘤細胞抗原之雙特異性抗體。
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