JP2023175704A - Ｇｐｒｃ５ｄに結合する抗体 - Google Patents
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Abstract
【課題】ヒトＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合する二重特異性抗体を含む新規抗体を提供する。【解決手段】（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、特定の配列の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、別の特定の配列の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、別の特定の配列の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、別の特定の配列の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む第２の抗原結合部分とを含む、二重特異性抗原結合分子である。さらに、この抗体を製造するための方法と、疾患の処置におけるそれらの使用方法も提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、概して、例えばＴ細胞を活性化させるための二重特異性抗原結合分子を含む、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体に関する。加えて、本発明は、このような抗体をコードするポリヌクレオチドと、このようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞とに関する。本発明はさらに、この抗体を製造するための方法と、疾患の処置におけるそれらの使用方法とに関する。
ＥＵと米国で毎年約７５，０００人の新規患者が発生する多発性骨髄腫（ＭＭ）は、最も一般的な血液腫瘍の１つであり、未だにアンメットメディカルニーズが高い疾患である。多発性骨髄腫は、非機能性モノクローナル免疫グロブリンを分泌する最終分化した形質細胞を特徴とする。短期的には、レナリドミド及びポマリドミドなどの免疫調節薬とカルフィルゾミブ又はボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤が、多発性骨髄腫の第一選択療法のバックボーンであり続ける可能性がある（Ｍｏｒｅａｕ，Ｐ．ａｎｄ Ｓ．Ｖ．Ｒａｊｋｕｍａｒ，ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｉａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｔｏ ｒｅａｌｉｔｙ．Ｌａｎｃｅｔ，２０１６．３８８（１００４０）：ｐ．１１１－３）。しかし、これらの薬は、病的腫瘍細胞、例えば病的形質細胞（ＰＣ）を特異的に標的とするものではない。多発性骨髄腫では、該形質細胞を選択的に枯渇させるための努力がなされてきた。形質細胞を特異的にマークする表面タンパク質がないことが、多発性骨髄腫に対する抗体又は細胞療法の開発を妨げてきた。これまでのところ、ダラツムマブ（抗ＣＤ３８）及びエロツズマブ（抗ＣＤ３１９）などの生物学的製剤が成功した例は少ない。但し、これら２つの分子は形質細胞が独自に発現させるわけではない。それゆえ、多発性骨髄腫の形質細胞によって健康なドナーからの形質細胞と比較して差次的に発現されるＧタンパク質共役受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）など、多発性骨髄腫の形質細胞からの新規標的が、ＲＮＡシーケンシングを使用して特定された。ＧＰＲＣ５Ｄは多発性骨髄腫患者の予後と腫瘍量に関連していることが報告されている（Ａｔａｍａｎｉｕｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５Ｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｅｕｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１２．４２（９）：ｐ．９５３－６０；及びＣｏｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，ＧＰＲＣ５Ｄ ｉｓ ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｔｕｍｏｕｒ ｌｏａｄ ａｎｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１３．１８（６）：ｐ．３４８－５１）。
ＧＰＲＣ５Ｄは、リガンドが知られていないオーファン受容体であり、一般男性、特にがんにおける生物学的特性はほとんど知られていない。ＧＰＲＣ５Ｄをコードする遺伝子は、染色体１２ｐ１３．３上に位置し、３つのエクソンを含有し、約９．６ｋｂの長さをもつ（Ｂｒａｕｎｅｒ－Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｏｒｐｈａｎ ｆａｍｉｌｙ Ｃ Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＧＰＲＣ５Ｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，２００１．１５１８（３）：ｐ．２３７－４８）。大きな第１のエクソンは、７回膜貫通ドメインをコードする。動物の毛包のケラチン形成にＧＰＲＣ５Ｄが関与していることが示されている（Ｇａｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｆｅｔａｌ Ｓｋｉｎ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｋｅｙ Ｇｅｎｅｓ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｈａｉｒ Ｆｏｌｌｉｃｌｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｃａｓｈｍｅｒｅ Ｇｏａｔｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１６．１１（３）：ｐ．ｅ０１５１１１８；及びＩｎｏｕｅ，Ｓ．，Ｔ．Ｎａｍｂｕ，ａｎｄ Ｔ．Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，Ｔｈｅ ＲＡＩＧ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ，ＧＰＲＣ５Ｄ，ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈａｒｄ－ｋｅｒａｔｉｎｉｚｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ，２００４．１２２（３）：ｐ．５６５－７３）。
国際公開第２０１８／０１７７８６号には、ＧＰＲＣ５Ｄ特異的抗体又は抗原結合断片が開示されている。
標準治療では多発性骨髄腫患者を治すことができないことから、強力で特異的な新規治療法を開発する必要があることは明らかである。その１つとして、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体、特に、標的細胞上のＧＰＲＣ５ＤとＴ細胞上のＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原とに結合する二重特異性抗体が挙げられる。このような抗体が両方の標的に同時に結合すると、Ｔ細胞シナプスが形成され、（細胞傷害性）Ｔ細胞が活性化され、その後、標的細胞が溶解されることになる。
本発明は、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合する二重特異性抗体を含む新規抗体を提供する。特に、ＧＰＲＣ５Ｄを標的とする、本発明によるＴ細胞二重特異性抗体は、多発性骨髄腫を治療する効力を有する。
本発明者らは、新規のＧＰＲＣ５Ｄ抗体を組み込んだ、ＧＰＲＣ５Ｄと活性化Ｔ細胞抗原とに結合する二重特異性抗原結合分子を開発した。
第１の態様において、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分を含み、ここで、第１の抗原はＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分は、（ｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｉｉ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ ２、配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は（ｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む，重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；且つ（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分を含み、ここで、第２の抗原はＣＤ３であり、第２の抗原結合部分は、（ｉ）配列番号２９の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３０のＨＣＤＲ２、及び配列番号３１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３２の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号３３のＬＣＤＲ２、及び配列番号３４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉ）配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は（ｉｉ）配列番号１０６の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０７のＨＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０９の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１０のＬＣＤＲ２、及び配列番号１１１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分を含み、ここで、第１の抗原はＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分は、（ｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｉｉ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ ２、配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は（ｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ、及び配列番号９３のＨＣＤＲ３を含む，重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み；且つ（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分を含み、ここで、第２の抗原はＣＤ３であり、第２の抗原結合部分は、（ｉ）配列番号２９の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３０のＨＣＤＲ２、及び配列番号３１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３２の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号３３のＬＣＤＲ２、及び配列番号３４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉ）配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は（ｉｉ）配列番号１０６の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０７のＨＣＤＲ２、及び配列番号１０８のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０９の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１０のＬＣＤＲ２、及び配列番号１１１のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
別の実施態様において、（ｉ）第１の抗原結合部分のＶＨは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み；又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分のＶＨは、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬは、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み；又は（ｉｉｉ）第１の抗原結合部分のＶＨは、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬは、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み；又は（ｉｖ）第１の抗原結合部分のＶＨは、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬは、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み；又は（ｖ）第１の抗原結合部分のＶＨは、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬは、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み；又は（ｖｉ）第１の抗原結合部分のＶＨは、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬは、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、（ｉ）第２の抗原結合部分のＶＨは配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、且つ、第２の抗原結合部分のＶＬは配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）第２の抗原結合部分のＶＨは配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、且つ、第２の抗原結合部分のＶＬは配列番号１０５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のミノ酸配列を含み；又は（ｉｉｉ）第２の抗原結合部分のＶＨは配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、且つ、第２の抗原結合部分のＶＬは配列番号１１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様では、第１の及び／又は第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。これは、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であるか、第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であるか、又は第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分がＦａｂ分子であるかのいずれかを意味する。別の実施態様において、第２の抗原結合部分は、可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１、特にＦａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられている、Ｆａｂ分子である。別の実施態様において、第１の抗原結合部分は、定常ドメインにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、Ｆａｂ分子である。別の実施態様では、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分が互いに融合しており、場合によってペプチドリンカーを介して互いに融合している。別の実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は各々Ｆａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。別の実施態様において、二重特異性抗原結合分子は、第３の抗原結合部分を含む。別の実施態様において、第３の抗原部分は、第１の抗原結合部分と同一である。別の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。別の実施態様では、第１、第２、及び存在する場合は第３の抗原結合部分の各々がＦａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、且つ第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、且つ第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており；存在する場合は、第３の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。別の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインである。別の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。さらなる実施態様において、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。別の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生じ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を中に配置可能な空洞が生じる。別の実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１又は複数のアミノ酸置換を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子をコードする、１又は複数の単離されたポリヌクレオチドを提供する。さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（複数可）を含む１又は複数のベクター、特に発現ベクターを提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（複数可）又はベクター（複数可）を含む宿主細胞を提供する。
本発明の別の態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する二重特異性抗原結合分子を製造する方法であって、ａ）二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で、本明細書に記載の宿主細胞を培養する工程と、ｂ）任意選択的に二重特異性抗原結合分子を回収する工程とを含む方法。
別の態様では、本発明は、請求項２１に記載の方法により製造された、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する二重特異性抗原結合分子を提供する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本明細書に開示されている二重特異性抗原結合分子又は本明細書に開示されている薬学的組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、疾患の処置における使用のための、本明細書に開示されている二重特異性抗原結合分子又は本明細書に開示されている薬学的組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、疾患ががん又は自己免疫疾患である、本明細書に開示されている二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、疾患が多発性骨髄腫である、本明細書に開示されている二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物を提供する。
更なる態様では、本発明は、疾患の処置のための医薬の製造における、本明細書に開示されている二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。
別の態様では、本発明は、個体における疾患、特にがん、より具体的には多発性骨髄腫を処置する方法であって、本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を、薬学的に許容される形態で前記個体に投与することを含む方法に関する。或いは、疾患は、全身性紅斑性狼瘡及び／又は関節リウマチなどの自己免疫疾患，である。上記実施態様のいずれにおいても、個体は好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
定義
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当技術分野で一般に使用されるように使用される。
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当技術分野で一般に使用されるように使用される。
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及び誘導体、例えば、その断片である。
用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。一般的に、二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的な２つの抗原結合部位を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基に、特に２つの別個の細胞上に発現した２つの抗原決定基に、同時に結合することができる。
本明細書において使用される用語「価」は、特定数の抗原結合部位が抗原結合分子内に存在することを示す。したがって、「抗原への一価の結合」という用語は、抗原に特異的な１つの（且つ１つを超えない）抗原結合部位が抗原結合分子内に存在することを示す。
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、すなわち、１又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸残基を含む。天然免疫グロブリン分子は一般に、２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は一般に、単一の抗原結合部位を有する。
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様において、抗原結合部分は、それが結合している実体（例：第２の抗原結合部分）を、標的部位、例えば、抗原決定基を持つ特定の種類の腫瘍細胞に誘導することができる。別の実施態様では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えばＴ細胞受容体複合抗原を通してシグナル伝達を活性化することができる。抗原結合部分は、本明細書でさらに定義される抗体及びその断片を含む。特定の抗原結合部分は、抗体重鎖可変領域及び抗体軽鎖可変領域を含む抗体の抗原結合ドメインを含む。特定の実施態様では、抗原結合部分は、本明細書でさらに定義され、当技術分野で知られている、抗体定常領域を含みうる。有用な重鎖定常領域には、次の５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ又はμのいずれかが含まれる。有用な軽鎖定常領域には、次の２つのアイソタイプ：κ及びλのいずれかが含まれる。
ここで使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分－抗原複合体を形成するポリペプチド高分子上の部位（例：アミノ酸の連続したストレッチ又は非連続アミノ酸の異なる領域で構成されたコンフォメーション構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、その他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に、見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原と呼ばれるタンパク質（例：ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＤ３）は、霊長類（例：ヒト）、非ヒト霊長類（例：カニクイザル）、及びげっ歯類（例：マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源からのタンパク質の任意の天然型を指す。特定の実施態様では、抗原は、ヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は、「全長」、未処理のタンパク質だけではなく、細胞内でのプロセシングから生じる任意の型のタンパク質を包含する。この用語はまた、天然に存在するタンパク質バリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントを包含する。抗原として有用な例示的なヒトタンパク質は、ＣＤ３、特にＣＤ３のイプシロンサブユニット（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ．Ｐ０７７６６（バージョン１８５）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｎｏ．ＮＰ＿０００７２４、配列番号４０を；又はカニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ．Ｑ９５ＬＩ５（バージョン６９）、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ．ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号４１参照）、又はＧＰＲＣ５Ｄ（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ．Ｑ９ＮＺＤ１（バージョン１１５）；ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｎｏ．ＮＰ＿０６１１２４．１、配列番号４５参照）である。特定の実施態様では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、異なる種由来のＣＤ３又はＧＰＲＣ５Ｄ抗原の中でも保存されたＣＤ３又はＧＰＲＣ５Ｄのエピトープに結合する。特定の実施態様では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する。
「特異的結合」とは、結合が抗原について選択的であり、望ましくない又は非特異的な相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合部分の、特定の抗原決定基への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えばＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００）)、及び古典的結合アッセイ(Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））により測定することができる。一実施態様では、抗原結合部分の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合部分の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する抗原結合部分、又はその抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例：１０－８Ｍ以下、例：１０－８Ｍ‐１０－１３Ｍ、例：１０－９Ｍ‐１０－１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
「親和性」は、分子（例：受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例：リガンド）との間の非共有結合的相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例：抗原結合部分と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（ＫＤ）によって表され、これは、解離速度定数と結合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ、ｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じである限り、同等の親和性は、異なる速度定数を含むことがある。親和性は、本明細書に記載のものを含む当技術分野で既知の確立された方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「結合の減少」、例えば、Ｆｃ受容体への結合の減少は、例えばＳＰＲによって測定した場合の、それぞれの相互作用の親和性の低下を指す。明確に示すために、この用語は、ゼロ（又は解析方法の検出限界を下回る値）への親和性の低下、すなわち相互作用の完全な消失も含む。逆に、「結合の増加」は、それぞれの相互作用の結合親和性の上昇を指す。
本明細書で使用される「活性化Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に発現される抗原決定基を指し、抗原結合分子との相互作用時にＴ細胞活性化を誘導することができる。具体的には、抗原結合分子と活性化Ｔ細胞抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを誘発することによりＴ細胞活性化を誘導することができる。特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３、特にＣＤ３のイプシロンサブユニット（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ．Ｐ０７７６６（バージョン１４４）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ｎｏ．Ｎｐ＿０００７２４．１、配列番号４０を；又はカニクイザル［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ ｎｏ．Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ．ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号４１を参照）である。
本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球（特に細胞傷害性Ｔリンパ球）の１又は複数の細胞応答を指す。Ｔ細胞活性化を測定するのに適切なアッセイは、当技術分野で既知であり、本明細書に記載されている。
本明細書で使用される「標的細胞抗原」とは、標的細胞（例えば、がん細胞又は腫瘍間質の細胞など、腫瘍中の細胞）の表面に存在する抗原決定基を指す。特定の実施態様では、標的細胞抗原は、ＧＰＲＣ５Ｄ、特に配列番号４５に示されるヒトＧＰＲＣ５Ｄである。
本明細書で使用される場合、Ｆａｂ分子などに関して「第１の」、「第２の」又は「第３の」という用語は、各部分の種類が複数存在する場合を区別するために便宜的に使用されている。これらの用語の使用は、明示的に述べられていない限り、二重特異性抗原結合分子の特定の順序又は方向を付与することを意図するものではない。
「融合」とは、複数の成分同士（例：Ｆａｂ分子とＦｃドメインサブユニット）が、直接又は１若しくは複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合によって連結されていることを意味する。
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨ及びＣＨ１ドメインと軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬ及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも称される）とは、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている（すなわち互いによって置き換えられている）Ｆａｂ分子を意味し、すなわちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＬ－ＣＨ１）で構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨ－ＣＬ）で構成されるペプチド鎖とを含む。わかりやすくするために、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子では、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１を含むペプチド鎖を、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。逆に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子では、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖を、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ぶ。
これに対して、「従来の」Ｆａｂ分子とは、その天然フォーマットのＦａｂ分子、すなわち、重鎖可変ドメイン及び定常ドメイン（Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨ－ＣＨ１）で構成される重鎖と、軽鎖可変ドメイン及び定常ドメイン（Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＬ－ＣＬ）で構成される軽鎖とを含むＦａｂ分子を意味する。
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している２本の軽鎖と２本の重鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、可変ドメイン（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる）を有し、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）がそれに続く。同様に、各軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、可変ドメイン（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる）を有し、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽（ＣＬ）ドメインがそれに続く。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれ、そのうちのいくつかはサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）、及びα２（ＩｇＡ２）へとさらに分割される５種類のうちの１つに割り当てられる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２種類のうちの１つに割り当てられる。免疫グロブリンは、本質的に、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して連結されている、２つのＦａｂ分子と１つのＦｃドメインからなる。
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例：二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は同一であり、且つ／又は同じエピトープに結合するが、ありうるバリアント抗体、例えば天然に生じる変異を含んでいたり又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生するもの（通常、このようなバリアントは少量存在している）は除く。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の製造を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのこれらの方法及びその他の例示的な方法は本明細書に記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものであり、すなわち、その自然環境には存在しないものである。特別な精製レベルは必要とされない。例えば、単離された抗体は、その天然又は自然の環境から除去することができる。宿主細胞において発現させた組換え産生抗体は、本発明において単離されたとみなされ、任意の適切な技術によって分離分画し、又は部分的若しくは実質的に精製した天然又は組換え抗体も同様である。したがって、本発明の抗体及び二重特異性抗原結合分子は、単離されている。いくつかの実施態様において、抗体は、例えば電気泳動（例：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例：イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）法により決定して、９５％又は９９％を上回る純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばＦｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照のこと。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書では互換可能に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合し、インタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例：ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、ＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；並びに米国特許第５５７１８９４号及び同第５５８７４５８号を参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９３）を参照のこと。また、トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１２９－１３４（２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ社、マサチューセッツ州ウォルサム；例えば米国特許第６２４８５１６号参照）である。抗体断片は、本明細書に記載されるように、組換え宿主細胞（例：大腸菌又はファージ）による生産だけではなく、インタクトな抗体のタンパク質消化などを含むがこれらに限定されない様々な技術で作製することができる。
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により提供されうる。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。通常、天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ、ＶＬ）は、類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）備える。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。可変領域配列に関して本明細書で使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）によって規定されている番号付けシステムを指す。
本明細書で使用される場合、重鎖及び軽鎖のすべての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載され、本明細書では「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ番号付け」と呼ばれる、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる。具体的には、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）の６４７－６６０頁参照）は、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１－７２３頁参照）が、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３）に使用されるが、この場合、これを「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け」と呼ぶことによって、さらに明確にしている。
「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、本明細書では、配列が超可変であり、且つ／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、且つ／又は抗原接触残基（「抗原コンタクト（antigen contact）」を含む、抗体可変ドメインの各領域（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」；重鎖可変領域／ドメインのＣＤＲは、例えばＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と略記され；軽鎖可変領域／ドメインのＣＤＲは、例えばＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と略記される）を指す。一般的に、抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の、６つのＨＶＲを含む。本明細書における例示的なＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）、及び９６－１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）、及び９５－１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）、及び９３－１０１（Ｈ３）に生じる抗原コンタクト（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））；並びに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６－５６（Ｌ２）、４７－５６（Ｌ２）、４８－５６（Ｌ２）、４９－５６（Ｌ２）、２６－３５（Ｈ１）、２６－３５ｂ（Ｈ１）、４９－６５（Ｈ２）、９３－１０２（Ｈ３）、及び９４－１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ
を含む。
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）、及び９６－１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）、及び９５－１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）、及び９３－１０１（Ｈ３）に生じる抗原コンタクト（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））；並びに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６－５６（Ｌ２）、４７－５６（Ｌ２）、４８－５６（Ｌ２）、４９－５６（Ｌ２）、２６－３５（Ｈ１）、２６－３５ｂ（Ｈ１）、４９－６５（Ｈ２）、９３－１０２（Ｈ３）、及び９４－１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ
を含む。
特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例：ＦＲ残基）は、本明細書では、上掲のＫａｂａｔらに従って番号付けされる。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は通常、ＶＨ（又はＶＬ）に、ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４の順序で現れる。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基とヒトＦＲからのアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例：ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。このような可変ドメインを、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ぶ。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでよい。いくつかの実施態様において、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例：ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。抗体（例えば非ヒト抗体）の「ヒト化型」とは、ヒト化を遂げた抗体をいう。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して本発明による特性を生むように定常領域が元の抗体のものから追加的に改変又は変更されたものである。
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体のアミノ酸配列に、又はヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に、又は他のヒト抗体をコードする配列に対応するアミノ酸配列を有する、抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。特定の実施態様では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物、例えばマウス、ラット又はウサギに由来する。特定の実施態様では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞株に由来する。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片も、本明細書においてヒト抗体又はヒト抗体断片とみなされる。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、μと呼ばれる。
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域とバリアントＦｃ領域とを含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は多少変動するが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、重鎖のＣｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から、カルボキシル末端までと定義される。しかしながら、宿主細胞によって産生された抗体は、重鎖のＣ末端から１又は複数（特に１又は２）のアミノ酸の翻訳後切断を受ける場合がある。したがって、全長重鎖をコードする特異的な核酸分子の発現により宿主細胞によって産生される抗体は、全長重鎖を含みうるか又は全長重鎖の切断型バリアント（本明細書では「切断型バリアント重鎖」ともいう）を含みうる。これは、重鎖の最後の二のＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）とリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である場合に当てはまる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｋ４４７）は、存在することもしないこともありうる。Ｆｃドメイン（又は本明細書において定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、本明細書では、特に断らない限りＣ末端グリシン－リジンジペプチドを有さないものとして示される。本発明の一実施態様では、本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子に含まれる、本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本発明の一実施態様では、本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子に含まれる、本明細書に特定されるＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖は、追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書に記載される薬学的組成物といった本発明の組成物は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の集団を含む。抗体又は二重特異性抗原結合分子の集団は、完全長重鎖を有する分子と、切断された変異型重鎖とを含みうる。抗体又は二重特異性抗原結合分子の集団は、全長重鎖を有する分子と切断型バリアント重鎖を有する分子との混合物からなることがあり、この場合抗体又は二重特異性抗原結合分子の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％が切断型バリアント重鎖を有する。本発明の一実施態様では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の集団を含む組成物は、追加的なＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に明記されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を備えた抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施態様では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の集団を含む組成物は、追加的なＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に明記されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を備えた抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む。本発明の一実施態様では、このような組成物は、本明細書に明記されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を備えた分子から構成される抗体又は二重特異性抗原結合分子の集団；追加のＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に明記されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を備えた分子；及び追加のＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）を有する本明細書に明記されているＦｃドメインのサブユニットを含む重鎖を備えた分子を含む。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１（上記参照）に記載されているように、ＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。本明細書で使用されるＦｃドメインの「サブユニット」とは、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドの一方、すなわち免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含み、安定な自己結合能を有するポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの結合を促進する改変」は、Ｆｃドメインサブユニットを構成するポリペプチドと同じポリペプチドとの結合によるホモ二量体の形成を低減又は防止する、Ｆｃドメインサブユニットのペプチド骨格の操作又は翻訳後修飾である。本明細書で使用される結合を促進する改変とは、結合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（すなわちＦｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別々の改変を特に含み、これらの改変は、２つのＦｃドメインサブユニットの結合を促進するために、互いに対して相補的である。例えば、結合を促進する改変は、これらＦｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変化させて、それらの結合をそれぞれ立体的又は静電的に好ましいものにすることができる。したがって、第１のＦｃドメインサブユニットを構成するポリペプチドと第２のＦｃドメインサブユニットを構成するポリペプチドとの間に（ヘテロ）二量体化が起こり、これらのサブユニットは、各々のサブユニットに融合したさらなる成分（例えば抗原結合部分）が同じでないという意味で非同一でありうる。いくつかの実施態様では、結合を促進する改変は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、結合を促進する改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々に、別個のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因しうる生物活性を指し、抗体のアイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体を介した抗原取り込み、細胞表面受容体（例：Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
本明細書で使用される場合、「操作する（engineer）、操作された（engineered）、操作（engineering）」といった用語は、天然若しくは組換えポリペプチド又はその断片のペプチド骨格の何らかの操作又は翻訳後修飾を含むと考えられる。操作には、アミノ酸配列の、グリコシル化パターンの、又は個々のアミノ酸の側鎖基の改変と、このような手法の組み合わせとが含まれる。
本明細書で使用される用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び改変を包含することが意図される。例えばＦｃ受容体への結合の減少又は別のペプチドとの結合の増加などの所望の特性を最終的なコンストラクトが有することを条件に、置換、欠失、挿入、及び改変の任意の組み合わせを行って、最終的なコンストラクトに到達することができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入には、アミノ酸のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失及び挿入が含まれる。特定のアミノ酸変異は、アミノ酸の置換である。Ｆｃ領域の結合特性などを変化させる目的では、非保存的アミノ酸置換、すなわち、あるアミノ酸を異なる構造及び／又は化学特性を有する別のアミノ酸で置き換えることが特に好ましい。アミノ酸置換には、２０の標準的なアミノ酸の天然アミノ酸誘導体（例：４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）又は非天然アミノ酸による置き換えが含まれる。アミノ酸変異は、当技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いて生成することができる。遺伝学的方法には、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などが含まれうる。遺伝学的操作以外の方法、例えば化学修飾によってアミノ酸の側鎖基を変化させる方法も有用でありうると考えられる。本明細書では、同じアミノ酸変異を示すために、様々な表記が使用される。例えば、Ｆｃドメインの３２９位におけるプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙと表記される。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当分野の技術範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージなどの一般に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して得ることができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。但し、本明細書において、アミノ酸配列同一性％値は、ＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを備えたＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃ以降のｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用して生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ及びＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”，ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ （１９９６）“Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－２５８；並びにＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６によって作成され、現在ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌから一般に入手可能である。或いは、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉからアクセスできるパブリックサーバーを使い、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を使用して（ローカルではなく）グローバルアライメントを実行することで、これらの配列を比較することも可能である。アミノ酸の同一性パーセントは、出力アライメントヘッダーに示される。
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来型のホスホジエステル結合又は非従来型結合（例：ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含みうる。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明において単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持されている組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、又は天然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏの本発明のＲＮＡ転写物、並びにポジティブ及びネガティブな鎖形式、並びに二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、さらに、合成により生成されたそのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位又は転写ターミネーターといった調節エレメントを含んでも含まなくてもよい。
「［例えば本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子］をコードする単離されたポリヌクレオチド（又は核酸）」は、抗体重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする１又は複数のポリヌクレオチド分子を指し、これには、単一のベクター又は別々のベクター中のこのようなポリヌクレオチド分子（複数可）と、宿主細胞中の１又は複数の位置に存在するこのような核酸分子（複数可）とが含まれる。
用語「発現カセット」とは、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸要素を用いて、組換え又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片に組み込むことができる。発現ベクターの組換え発現カセット部分には、数ある配列の中でも特に、転写される核酸配列及びプロモーターが典型的に含まれる。特定の実施態様では、発現カセットは、本発明の抗体若しくは二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、細胞内で作動可能に結合している特定の遺伝子の発現を導入及び誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機構により生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞と、継代の数に関係なく、それに由来する子孫とが含まれる。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同じでなくてもよく、突然変異を含んでもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞でスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する、変異体の子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができる任意の種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、さらには、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は、培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞を含む。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる結合に続いて、受容体保有細胞を刺激してエフェクター機能を実行するシグナル伝達事象を生じさせるＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞により抗体でコートされた標的細胞の溶解を招く免疫機構である。標的細胞は、一般にはＦｃ領域のＮ末端であるタンパク質部分を介して、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体がＦｃ領域に特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される場合、用語「ＡＤＣＣの低下」とは、標的細胞を取り巻く培地中の所定の抗体濃度で、上で定義したＡＤＣＣの機序により所定の時間内に溶解する標的細胞の数の減少及び／又はＡＤＣＣの機序により所定の時間内に所定の数の標的細胞を溶解させるために必要な、標的細胞を取り巻く培地中の抗体濃度の上昇のいずれか、と定義される。ＡＤＣＣの低下は、同じ種類の宿主細胞によって、（当業者に既知の）同じ標準的な製造、精製、製剤化及び保存方法を使用して製造されるが操作されていない、同じ抗体により媒介されるＡＤＣＣと比較される。例えば、そのＦｃドメインにＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換を含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下は、このアミノ酸置換をＦｃドメインに含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当技術分野でよく知られている（例：国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号参照）。
「有効量」の薬剤は、それが投与される細胞又は組織の生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
薬剤（例：薬学的組成物）の「治療的有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を得るのに必要な投与量及び期間での有効な量を指す。薬剤の治療的有効量は、疾患の有害作用を、例えば排除し、低下させ、遅延させ、最小化し、又は防止する。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例：ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例：ヒト；サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例：マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象は、ヒトである。
用語「薬学的組成物」は、その中に含有される活性成分の生物活性を有効にさせるような形態であって、組成物が投与される対象にとって許容できない毒性を有する追加成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、薬学的組成物中の活性成分以外の成分で、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体には、限定されないが、バッファー、賦形剤、安定剤又は保存剤が含まれる。
本明細書において用いられる場合、「処置／治療（treatment）」（及び「処置する／治療する（treat）」又は「処置すること／治療すること（treating）」などの文法的変形）は、処置されている個体の疾病の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理の経過中に実施されうる。処置の望ましい作用には、限定されないが、疾患の発生又は再発の防止、症候の緩和、疾患の何らかの直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移の防止、疾患進行速度の低下、病態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、投与量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
実施態様の詳細な説明
本発明は、ＧＰＲＣ５Ｄ、特にヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体及び二重特異性抗原結合分子を提供する。加えて、この分子は、治療的用途にとって好ましい他の特性、例えば有効性及び／又は安全性、並びに生産可能性に関する特性も有する。
本発明は、ＧＰＲＣ５Ｄ、特にヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体及び二重特異性抗原結合分子を提供する。加えて、この分子は、治療的用途にとって好ましい他の特性、例えば有効性及び／又は安全性、並びに生産可能性に関する特性も有する。
ＧＰＲＣ５Ｄ抗体
第１の態様では、本発明は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体を提供し、該抗体は、（ｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６ＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５ＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｉｉ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は（ｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
第１の態様では、本発明は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体を提供し、該抗体は、（ｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６ＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５ＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｉｉ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｉｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は（ｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
いくつかの実施態様において、抗体は、ヒト化抗体である。一実施態様において、ＶＨはヒト化ＶＨであり、且つ／又はＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様において、抗体は、上記実施態様のいずれかにおけるＣＤＲを含み、さらにはアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
特定の実施態様において、（ｉ）ＶＨは、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み；又は（ｉｉ）ＶＨは、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み；又は（ｉｉｉ）ＶＨは、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み；又は（ｉｖ）ＶＨは、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み；又は（ｖ）ＶＨは、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み；又は（ｖｉ）ＶＨは、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のアミノ酸配列を含む。
特定の実施態様において、抗体は、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のＶＨと、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のＶＬ；又は（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のＶＨと、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のＶＬ；又は（ｉｉｉ）配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のＶＨと、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のＶＬ；又は（ｉｖ）配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のＶＨと、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のＶＬ；又は（ｖ）配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のＶＬ；又は（ｖｉ）配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のＶＨと、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一のＶＬを含む。
別の実施態様において、抗体は、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１抗体である。一実施態様において、抗体は、完全長抗体である。別の実施態様では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子の群より選択される抗体断片である。一実施態様において、抗体は、多重特異性抗体である。
特定の実施態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ又はＶＬ配列は、参照配列に対して置換（例：保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、その配列を含む抗体は、ＧＰＲＣ５Ｄへの結合能を保持する。特定の実施態様では、配列番号１３において合計１‐１０個のアミノ酸が置換、挿入、及び／若しくは欠失されており、且つ／又は配列番号１４において合計１‐１０個のアミノ酸が置換、挿入、及び／若しくは欠失されており、且つ／又は配列番号１５において合計１‐１０個のアミノ酸が置換、挿入、及び／若しくは欠失されており、且つ／又は配列番号１６において合計１‐１０個のアミノ酸が置換、挿入、及び／若しくは欠失されており、且つ／又は配列番号４８において合計１‐１０個のアミノ酸が置換、挿入、及び／若しくは欠失されており、且つ／又は配列番号５３において合計１‐１０個のアミノ酸が置換、挿入、及び／若しくは欠失されており、且つ／又は配列番号４９において合計１‐１０個のアミノ酸が置換、挿入、及び／若しくは欠失されており、且つ／又は配列番号５２において合計１‐１０個のアミノ酸が置換、挿入、及び／若しくは欠失されており、且つ／又は配列番号５７において合計１‐１０個のアミノ酸が置換、挿入、及び／若しくは欠失されており、且つ／又は配列番号６４において合計１‐１０個のアミノ酸が置換、挿入、及び／若しくは欠失されており、且つ／又は配列番号５８において合計１‐１０個のアミノ酸が置換、挿入、及び／若しくは欠失されており、且つ／又は配列番号６３において合計１‐１０個のアミノ酸が置換、挿入、及び／若しくは欠失されている。
特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、ＨＶＲの外側の（すなわちＦＲ内の）領域で生じる。場合によって、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号１３にＶＨ配列及び／又は配列番号１４にＶＬ配列を含む。場合によって、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号１５にＶＨ配列及び／又は配列番号１６にＶＬ配列を含む。場合によって、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号４４８にＶＨ配列及び／又は配列番号５３にＶＬ配列を含む。場合によって、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号４９にＶＨ配列及び／又は配列番号５２にＶＬ配列を含む。場合によって、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号５７にＶＨ配列及び／又は配列番号６４にＶＬ配列を含む。場合によって、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含めて、配列番号５８にＶＨ配列及び／又は配列番号６３にＶＬ配列を含む。
一実施態様において、抗体は、配列番号１３及び配列番号１５の群より選択されるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
一実施態様において、抗体は、配列番号１３及び配列番号１２の群より選択されるＶＨ配列と、配列番号１６のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、抗体は、配列番号１３のＶＨ配列と配列番号１４のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、抗体は、配列番号１５のＶＨ配列と配列番号１６のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、抗体は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、抗体は、配列番号４８のＶＨ配列と配列番号５３のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、抗体は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、抗体は、配列番号４９のＶＨ配列と配列番号５２のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、抗体は、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、抗体は、配列番号５７のＶＨ配列と配列番号６４のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、抗体は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、抗体は、配列番号５８のＶＨ配列と配列番号６３のＶＬ配列とを含む。
一実施態様において、抗体は、ヒト定常領域を含む。一実施態様において、抗体は、ヒト定常領域を含む免疫グロブリン分子、特にヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含むＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号３７及び３８（それぞれ、ヒトカッパＣＬドメイン、ヒトラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号３９（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に示されている。いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号３７又は配列番号３８のアミノ酸配列、特に配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施態様では、抗体は、配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域は、本明細書に記載されているように、Ｆｃドメインにアミノ酸変異を含みうる。
一実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。
一実施態様において、抗体は、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１抗体である。一実施態様において、抗体は、完全長抗体である。
一実施態様において、抗体は、Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ Ｆｃドメイン、より具体的にはＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。一実施態様において、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。抗体のＦｃドメインは、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに関して本明細書に記載される任意の特徴を、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
別の実施態様では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子の群より選択される抗体断片、特にＦａｂ分子である。別の実施態様では、抗体断片は、ダイアボディ、トリアボディ又はテトラボディである。
さらなる態様では、上記実施態様のいずれかによる抗体は、以下のセクションに記載される任意の特徴を、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
グリコシル化バリアント
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体を、抗体がグリコシル化される程度を上昇又は低下させるように変化させる。グリコシル化部位の抗体に対する付加又は欠失は、１又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を変化させることにより、簡便に達成される。
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体を、抗体がグリコシル化される程度を上昇又は低下させるように変化させる。グリコシル化部位の抗体に対する付加又は欠失は、１又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を変化させることにより、簡便に達成される。
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに結合しているオリゴ糖を変化させることができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって通常結合している分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照。オリゴ糖には、様々な糖質、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸の他、二分岐オリゴ糖構造の「幹」においてＧｌｃＮＡｃに付着したフコースが含まれうる。いくつかの実施態様において、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する抗体バリアントを作製するためになされうる。
一実施態様では、非フコシル化オリゴ糖、すなわちＦｃ領域に（直接的に又は間接的に）付着したフコースを欠くオリゴ糖構造を有する抗体バリアントが提供される。このような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる）は、特に、二分岐オリゴ糖構造の幹内の最初のＧｌｃＮＡｃに付着したフコース残基を欠くＮ結合型オリゴ糖である。一実施態様では、天然又は親抗体と比較してＦｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有する抗体バリアントが提供される。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％又はさらに約１００％（すなわちフコシル化オリゴ糖は存在しない）であってもよい。非フコシル化オリゴ糖のパーセンテージは、例えば国際公開第２００６／０８２５１５号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法で測定される、Ａｓｎ２９７に付着したすべてのオリゴ糖構造（例：複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域内のおよそ２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７は、抗体のわずかな配列変異に起因して、２９７位から上流又は下流に±３アミノ酸、すなわち２９４位から３００位の間に位置する場合もある。Ｆｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するこのような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合及び／又は改善されたエフェクター機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；同第２００４／００９３６２１号を参照のこと。
フコシル化が低下した抗体を産生できる細胞株の例には、タンパク質のフコシル化が欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）及びノックアウト細胞株、例えばアルファ－１、６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４－６２２（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）又はＧＤＰ－フコース合成若しくは輸送タンパク質の活性が低下若しくは停止されている細胞（例えば、米国特許第２００４２５９１５０号、同第２００５０３１６１３号、同第２００４１３２１４０号、同第２００４１１０２８２号参照）が含まれる。
さらなる実施態様では、二分オリゴ糖（例えば、抗体のＦｃ領域に付着した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されているもの）を有する抗体バリアントが提供される。このような抗体バリアントは、上述のとおり、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。このような抗体バリアントの例は、例えばＵｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７，１７６－１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ９３，８５１－８６１（２００６）；国際公開第９９／５４３４２号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００３／０１１８７８号に記載されている。
Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体バリアントも提供される。このような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有しうる。このような抗体バリアントは、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号；同第１９９８／５８９６４号；及び同第１９９９／２２７６４号に記載されている。
システイン操作抗体バリアント
特定の実施態様では、システイン操作抗体、例えば、抗体の１又は複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭａｂ」を作製することが望ましい。特定の実施態様では、置換された残基は、抗体の接近可能な部位に生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能部位に配置され、それは、本明細書でさらに説明するように、例えば薬物部分又はリンカー－薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートさせて免疫コンジュゲートを作製するために使用されうる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号、同第８３０９３０号、同第７８５５２７５号、同第９０００１３０号又は国際公開第２０１６０４０８５６号に記載のように生成することができる。
特定の実施態様では、システイン操作抗体、例えば、抗体の１又は複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭａｂ」を作製することが望ましい。特定の実施態様では、置換された残基は、抗体の接近可能な部位に生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能部位に配置され、それは、本明細書でさらに説明するように、例えば薬物部分又はリンカー－薬物部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートさせて免疫コンジュゲートを作製するために使用されうる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号、同第８３０９３０号、同第７８５５２７５号、同第９０００１３０号又は国際公開第２０１６０４０８５６号に記載のように生成することができる。
抗体誘導体
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むようにさらに改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分には、限定されないが、水溶性ポリマーが含まれる。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（prolypropylene）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例：グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が含まれる（但しこれらに限定されない）。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中での安定性のために製造上の利点を有しうる。ポリマーは、任意の分子量のものであってよく、分岐状でも未分岐状でもよい。抗体に結合しているポリマーの数は変化してよく、複数のポリマーが結合している場合、それらは同じ分子でも異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、抗体の改善されるべき特定の特性又は機能、その抗体誘導体が限定条件の下での治療に使用されるかどうかを含めた（但しこれらに限定されない）考慮事項に基づいて決定されうる。
特定の実施態様において、本明細書で提供される抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むようにさらに改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分には、限定されないが、水溶性ポリマーが含まれる。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレン（prolypropylene）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例：グリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物が含まれる（但しこれらに限定されない）。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中での安定性のために製造上の利点を有しうる。ポリマーは、任意の分子量のものであってよく、分岐状でも未分岐状でもよい。抗体に結合しているポリマーの数は変化してよく、複数のポリマーが結合している場合、それらは同じ分子でも異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又は種類は、抗体の改善されるべき特定の特性又は機能、その抗体誘導体が限定条件の下での治療に使用されるかどうかを含めた（但しこれらに限定されない）考慮事項に基づいて決定されうる。
別の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい非タンパク質部分と抗体とのコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１１６００－１１６０５（２００５））。放射線は、任意の波長であってよく、通常の細胞に害を与えないが抗体－非タンパク質部分の近位細胞が死滅する温度に非タンパク質部分を加熱する波長を含むがこれに限定されない。
イムノコンジュゲート
本発明はまた、細胞傷害性剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例：タンパク毒素；細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素的に活性の毒素、又はその断片）又は放射性同位体といった１又は複数の治療剤にコンジュゲート（化学的に結合）した、本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
本発明はまた、細胞傷害性剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例：タンパク毒素；細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素的に活性の毒素、又はその断片）又は放射性同位体といった１又は複数の治療剤にコンジュゲート（化学的に結合）した、本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体が上述の治療剤の１又は複数にコンジュゲートしている抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。抗体は、典型的には、リンカーを用いて治療剤の１又は複数に接続される。ＡＤＣ技術の概要は、治療剤及び薬物、並びにリンカーの例を含め、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ ６８：３－１９（２０１６）に記載されている。
別の実施態様において、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセン類（tricothecenes）を含む（但しこれらに限定されない）酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートしている、本明細書に記載の抗体を含む。
別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートして放射性コンジュゲートを形成する、本明細書に記載の抗体を含む。種々の放射性同位体が、放射性コンジュゲートの製造のために入手可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が含まれる。検出のために用いられる場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフ検査用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、或いは核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られる）のためのスピン標識（ここでもヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄等）を含みうる。
抗体と細胞傷害性剤とのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えばビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン ２，６－ジイソシアネート（toluene 2,6-diisocyanate））、及び二活性フッ素化合物（例えば１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているようにして調製することができる。炭素－１４－標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示的キレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞内で細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－１３１（１９９２）；米国特許第５２０８０２０号）が使用されうる。
本明細書におけるイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販（例：米国イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から）されている、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ及びスルホ－ＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋試薬を用いて調製されたコンジュゲートを明確に意図している。
多重特異性抗体
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち異なる抗原上の異なるエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、多重特異性抗体は、３つ以上の結合特異性を有する。特定の実施態様では、結合特異性の１つはＧＰＲＣ５Ｄに対するものであり、その他の（２つ以上の）特異性は、他の任意の抗原に対するものである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＧＰＲＣ５Ｄの２つ（又はそれ以上）の異なるエピトープに結合することができる。多重特異性（例：二重特異性）抗体はまた、細胞傷害性剤又は細胞をＧＰＲＣ５Ｄを発現する細胞に局在化させるために用いてもよい。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち異なる抗原上の異なるエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、多重特異性抗体は、３つ以上の結合特異性を有する。特定の実施態様では、結合特異性の１つはＧＰＲＣ５Ｄに対するものであり、その他の（２つ以上の）特異性は、他の任意の抗原に対するものである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＧＰＲＣ５Ｄの２つ（又はそれ以上）の異なるエピトープに結合することができる。多重特異性（例：二重特異性）抗体はまた、細胞傷害性剤又は細胞をＧＰＲＣ５Ｄを発現する細胞に局在化させるために用いてもよい。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現が含まれる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３））及び「ノブ・イン・ホール」エンジニアリング（例えば、米国特許第５７３１１６８号及びＡｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６（１９９７）参照）。多重特異性抗体はまた、抗体のＦｃ－ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果（electrostatic steering effect）を生み出すこと（例：国際公開第２００９／０８９００４号参照）；２つ以上の抗体又は断片を架橋すること（例：米国特許第４６７６９８０号及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）；二重特異性抗体を生成するためにロイシンジッパーを使用すること（例：Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）及び国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照）；軽鎖の誤対合の問題を回避するための一般的な軽鎖技術を使用すること（例：国際公開第９８／５０４３１号を参照）；二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例：Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例：Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照）；並びに、例えばＴｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されているように、三重特異性抗体を調製することによって、作製することができる。
例えば「オクトパス抗体」又はＤＶＤ－Ｉｇなど、３つ以上の抗原結合部位を有する操作抗体も、本明細書に含まれる（例：国際公開第２００１／７７３４２号及び同第２００８／０２４７１５号を参照）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、及び国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出すことができる。また、二重特異性抗体又はその抗原結合断片には、ＧＰＲＣ５Ｄ及び別の異なる抗原又はＧＰＲＣ５Ｄの２つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用（Dual Acting）Ｆａｂ」すなわち「ＤＡＦ」が含まれる（例：米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号及び国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照）。
多重特異性抗体は、同じ抗原特異性の１又は複数の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称の形で、すなわちＶＨ／ＶＬドメインを（例：国際公開第２００９／０８０２５２号及び同第２０１５／１５０４４７号参照）、ＣＨ１／ＣＬドメインを（例：国際公開第２００９／０８０２５３号参照）又は完全なＦａｂアームを（例：国際公開第２００９／０８０２５１号、同第２０１６／０１６２９９号、並びにＳｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１８７－１１９１及びＫｌｅｉｎ ａｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０参照）を交換することによっても提供されうる。非対称Ｆａｂアームは、荷電又は非荷電アミノ酸変異をドメイン界面に導入して、正しいＦａｂ対合を誘導することによっても操作されうる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５を参照のこと。
多重特異性抗体の様々なさらなる分子形式が当技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えばＳｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６参照）。
さらに本明細書に含まれる特定の種類の多重特異性抗体は、標的細胞（例：腫瘍細胞）上の表面抗原と、標的細胞を殺傷するためにＴ細胞を再標的化するためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体（ＣＤ３など）の活性化インバリアント成分とに同時結合するように設計された二重特異性抗体である。したがって、特定の実施態様では、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、特に結合特異性の一方がＧＰＲＣ５Ｄに対するものであり、もう一方がＣＤ３に対するものである二重特異性抗体である。
この目的のために有用でありうる二重特異性抗体フォーマットの例には、限定されないが、２つのｓｃＦｖ分子が可動性リンカーにより融合しているいわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（engager））分子（例：国際公開第２００４／１０６３８１号、同第２００５／０６１５４７号、同第２００７／０４２２６１号、及び同第２００８／１１９５６７号、Ｎａｇｏｒｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７，１２５５－１２６０（２０１１）)；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，２９９－３０５（１９９６））及びその誘導体、例えばタンデムダイアボディ（「ＴａｎｄＡｂ」；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，４１－５６（１９９９））；ダイアボディフォーマットに基づくがさらなる安定化のためにＣ末端ジスルフィド架橋を特徴として有する「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９９，４３６－４４９（２０１０））、及び全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子であるいわゆるトリオマブ（triomab）（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ３６，４５８－４６７（２０１０）に総説）が含まれる。本明細書に含まれる特定のＴ細胞二重特異性抗体フォーマットは、国際公開第２０１３／０２６８３３号、同第２０１３／０２６８３９号、同第２０１６／０２０３０９号；Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（８）（２０１６）ｅ１２０３４９８に記載されている。
ＧＰＲＣ５Ｄと第２の抗原とに結合する二重特異性抗原結合分子
本発明は、二重特異性抗原結合分子、すなわち２つの別個の抗原決定基（第１及び第２の抗原）に特異的に結合することのできる少なくとも２つの抗原結合部分を含む抗原結合分子も提供する。
本発明は、二重特異性抗原結合分子、すなわち２つの別個の抗原決定基（第１及び第２の抗原）に特異的に結合することのできる少なくとも２つの抗原結合部分を含む抗原結合分子も提供する。
本発明の特定の実施態様によれば、二重特異性抗原結合分子に含まれる抗原結合部分は、Ｆａｂ分子（すなわち、各々可変及び定常ドメインを含む重鎖及び軽鎖で構成される抗原結合ドメイン）である。一実施態様において、第１及び／又は第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ分子である。一実施態様では、前記Ｆａｂ分子は、ヒト分子である。特定の実施態様では、前記Ｆａｂ分子は、ヒト化分子である。また別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。
好ましくは、抗原結合部分の少なくとも１つは、クロスオーバーＦａｂ分子である。このような改変は、異なるＦａｂ分子由来の重鎖と軽鎖との誤対合を減少させ、それにより組換え生産における本発明の二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を向上させる。本発明の二重特異性抗原結合分子に有用な特定のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＬ、ＶＨ）が交換されている。しかしながら、このようなドメイン交換によっても、二重特異性抗原結合分子の調製は、誤対合した重鎖と軽鎖間のいわゆるベンズ・ジョーンズ型相互作用に起因するいくらかの副産物を含みうる（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１１８７－１１１９１参照）。異なるＦａｂ分子由来の重鎖と軽鎖の誤対合をさらに減少させ、したがって所望の二重特異性抗原結合分子の純度及び収率を上げるために、後で詳述するとおり、反対の電荷を有する荷電アミノ酸を、第１の抗原（ＧＰＲＣ５Ｄ）に結合するＦａｂ分子（複数可）又は第２の抗原（例：ＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原）に結合するＦａｂ分子のいずれかのＣＨ１及びＣＬドメイン内の特定のアミノ酸位置に導入することができる。電荷改変は、（例えば図１Ａ－Ｃ、Ｇ－Ｊに示すような）二重特異性抗原結合分子に含まれる従来のＦａｂ分子（複数可）又は（例えば図１Ｄ－Ｆ、Ｋ－Ｎに示すような）二重特異性抗原結合分子に含まれるＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子（複数可）のいずれかにおいて行われる（但し両方において行われることはない）。特定の実施態様では、電荷改変は、二重特異性抗原結合分子（特定の実施態様において第１の抗原、すなわちＧＰＲＣ５Ｄに結合するもの）に含まれる従来のＦａｂ分子（複数可）において行われる。
本発明による特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１の抗原（すなわちＧＰＲＣ５Ｄ）と、第２の抗原（例：活性化Ｔ細胞抗原、特にＣＤ３）とに同時結合することができる。一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＧＰＲＣ５Ｄと活性化Ｔ細胞抗原とに同時結合することにより、Ｔ細胞と標的細胞を架橋することができる。さらに詳細な実施態様では、かかる同時結合は、標的細胞、特にＧＰＲＣ５Ｄ発現腫瘍細胞の溶解を引き起こす。一実施態様では、かかる同時結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こす。他の実施態様では、かかる同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現の群から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答を引き起こす。一実施態様では、ＧＰＲＣ５Ｄへの同時結合を含まない活性化Ｔ細胞抗原（特にＣＤ３）への二重特異性抗原結合分子の結合は、Ｔ細胞の活性化を引き起こさない。
一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、標的細胞に対するＴ細胞の細胞傷害活性を再誘導することができる。特定の実施態様では、前記再誘導は、標的細胞によるＭＨＣを介したペプチド抗原の提示及び／又はＴ細胞の特異性とは無関係である。
特に、本発明の実施態様のいずれかによるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞、特にＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
第１の抗原結合部分
本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＧＰＲＣ５Ｄ（第１の抗原）に結合する少なくとも１つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する２つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。このような特定の実施態様では、これらの抗原結合部分の各々は、同じ抗原決定基に結合する。さらに詳細な実施態様では、これらの抗原結合部分はすべて同一であり、すなわちそれらは、（もしあれば）本明細書に記載される、ＣＨ１及びＣＬドメイン内に同じアミノ酸置換を含む同じアミノ酸配列を含む。一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する、２つ以下の抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、ＧＰＲＣ５Ｄ（第１の抗原）に結合する少なくとも１つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する２つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。このような特定の実施態様では、これらの抗原結合部分の各々は、同じ抗原決定基に結合する。さらに詳細な実施態様では、これらの抗原結合部分はすべて同一であり、すなわちそれらは、（もしあれば）本明細書に記載される、ＣＨ１及びＣＬドメイン内に同じアミノ酸置換を含む同じアミノ酸配列を含む。一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する、２つ以下の抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。
特定の実施態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部分（複数可）は、従来のＦａｂ分子である。かかる実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分（複数可）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。
代替的実施態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部分（複数可）は、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。かかる実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分（複数可）は、従来のＦａｂ分子である。
ＧＰＲＣ５Ｄ結合部分は、二重特異性抗原結合分子を標的部位へと、例えばＧＰＲＣ５Ｄを発現する特殊な腫瘍細胞へと誘導することができる。
科学的に明らかに不合理又は不可能でない限り、二重特異性抗原結合分子の第１の抗原結合部分は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体に関して本明細書に記載される任意の特徴を、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
したがって、一態様において本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分とを含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様において、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分とを含む二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様において、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分とを含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様において、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分とを含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様において、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分とを含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様において、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分とを含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。別の態様において、本発明は、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合部分と、（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分とを含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
いくつかの実施態様では、第１の抗原結合部分は、ヒト化抗体（に由来するもの）である。一実施態様において、ＶＨはヒト化ＶＨであり、且つ／又はＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様において、第１の抗原結合部分は、上記実施態様のいずれかにおけるＣＤＲを含み、さらにはアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一実施態様において、第１の抗原結合部分のＶＨは、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７、及び配列番号５８の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬは、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３、及び配列番号６４の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施態様において、第１の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７、及び配列番号５８の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列と、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３、及び配列番号６４の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列とを含む。
一実施態様において、第１の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７、及び配列番号５８の群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３、及び配列番号６４の群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
一実施態様において、第１の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７、及び配列番号５８の群から選択されるＶＨ配列と、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３、及び配列番号６４の群から選択されるＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１３のＶＨ配列と配列番号１４のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号１５のＶＨ配列と配列番号１６のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号４８のＶＨ配列と配列番号５３のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号４９のＶＨ配列と配列番号５２のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号５７のＶＨ配列と配列番号６４のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号５８のＶＨ配列と配列番号６３のＶＬ配列とを含む。一実施態様において、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施態様において、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号３７及び３８（それぞれ、ヒトカッパＣＬドメイン、ヒトラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号３９（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に示される。いくつかの実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号３７又は配列番号３８のアミノ酸配列、特に配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、本明細書の「電荷改変」の項に記載されているアミノ酸変異を含んでもよく、且つ／又はクロスオーバーＦａｂ分子内にある場合は、１若しくは複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失若しくは置換を含んでもよい。いくつかの実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号３９のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（特にＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷改変」の項に記載されているアミノ酸変異を含みうる。
第２の抗原結合部分
本発明の二重特異性抗原結合分子は、第２の抗原（ＧＰＲＣ５Ｄとは異なる）に結合する少なくとも１つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、第２の抗原（ＧＰＲＣ５Ｄとは異なる）に結合する少なくとも１つの抗原結合部分、特にＦａｂ分子を含む。
特定の実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分は、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。このような実施態様では、第１の抗原（すなわちＧＰＲＣ５Ｄ）に結合する抗原結合部分（複数可）は、好ましくは従来のＦａｂ分子である。二重特異性抗原結合分子に含まれるＧＰＲＣ５Ｄに結合する複数の抗原結合部分、特にＦａｂ分子が存在する実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分は、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
代替的な実施態様では、第２の抗原に結合する抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。このような実施態様では、第１の抗原（すなわちＧＰＲＣ５Ｄ）に結合する抗原結合部分（複数可）は、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわちＦａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。二重特異性抗原結合分子に含まれる第２の抗原に結合する複数の抗原結合部分、特にＦａｂ分子が存在する実施態様では、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部分は、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原に結合する抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
いくつかの実施態様では、第２の抗原は、活性化Ｔ細胞抗原（「活性化Ｔ細胞抗原結合部分」又は「活性化Ｔ細胞抗原結合Ｆａｂ分子」とも呼ばれる）である。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、活性化Ｔ細胞抗原への特異的結合能を有する１つ以下の抗原結合部分を含む。一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、活性化Ｔ細胞抗原への一価の結合をもたらす。
特定の実施態様では、第２の抗原は、ＣＤ３、特にヒトＣＤ３（配列番号４０）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号４１）、最も具体的にはヒトＣＤ３である。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３に交差反応性である（すなわち特異的に結合する）。いくつかの実施態様では、第２の抗原は、ＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３イプシロン）である。
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号２９のＨＣＤＲ １、配列番号３０のＨＣＤＲ ２、配列番号３１のＨＣＤＲ ３、配列番号３２のＬＣＤＲ １、配列番号３３のＬＣＤＲ ２、及び配列番号３４のＬＣＤＲ ３を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号２９のＨＣＤＲ １、配列番号３０のＨＣＤＲ ２、及び配列番号３１のＨＣＤＲ ３を含むＶＨと、配列番号３２のＬＣＤＲ １、配列番号３３のＬＣＤＲ ２、及び配列番号３４のＬＣＤＲ ３を含むＶＬとを含む。いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、ヒト化抗体（に由来するもの）である。一実施態様において、ＶＨはヒト化ＶＨであり、且つ／又はＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、上記実施態様のいずれかにおけるＣＤＲを含み、さらにはアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列と、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列とを含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分のＶＨは、配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合部分のＶＬは、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号３５のＶＨ配列と配列番号３６のＶＬ配列とを含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号９８のＨＣＤＲ １、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、配列番号１００のＨＣＤＲ ３、配列番号１０１のＬＣＤＲ １、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号９８のＨＣＤＲ １、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含むＶＨと、配列番号１０１のＬＣＤＲ １、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含むＶＬとを含む。いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、ヒト化抗体（に由来するもの）である。一実施態様において、ＶＨはヒト化ＶＨであり、且つ／又はＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、上記実施態様のいずれかにおけるＣＤＲを含み、さらにはアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１０５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列と、配列番号１０５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列とを含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分のＶＨは、配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合部分のＶＬは、配列番号１０５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１０４のＶＨ配列と配列番号１０５のＶＬ配列とを含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１０６のＨＣＤＲ １、配列番号１０７のＨＣＤＲ ２、配列番号１０８のＨＣＤＲ ３、配列番号１０９のＬＣＤＲ １、配列番号１１０のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１１１のＬＣＤＲ ３を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１０６のＨＣＤＲ １、配列番号１０７のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１０８のＨＣＤＲ ３を含むＶＨと、配列番号１０９のＬＣＤＲ １、配列番号１１０のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１１１のＬＣＤＲ ３を含むＶＬとを含む。
いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、ヒト化抗体（に由来するもの）である。一実施態様において、ＶＨはヒト化ＶＨであり、且つ／又はＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、上記実施態様のいずれかにおけるＣＤＲを含み、さらにはアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列と、配列番号１１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列とを含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分のＶＨは、配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合部分のＶＬは、配列番号１１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、配列番号１１２のＶＨ配列と配列番号１１３のＶＬ配列とを含む。
一実施態様において、第２の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施態様において、第２の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号３７及び３８（それぞれ、ヒトカッパＣＬドメイン、ヒトラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号３９（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に示される。いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号３７又は配列番号３８のアミノ酸配列、特に配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、本明細書の「電荷改変」の項に記載されているアミノ酸変異を含んでもよく、且つ／又はクロスオーバーＦａｂ分子内にある場合は、１若しくは複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失若しくは置換を含んでもよい。いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号３９のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（特にＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」の項に記載されているアミノ酸変異を含んでもよい。
いくつかの実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１、特に可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である（すなわち、このような実施態様によれば、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変又は定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である）。このような一実施態様では、第１の（及び存在する場合は第３の）抗原結合部分は、従来のＦａｂ分子である。
一実施態様では、第２の抗原（例：ＣＤ３などの活性化Ｔ細胞抗原）に結合する１つ以下の抗原結合部分が、二重特異性抗原結合分子中に存在する（すなわち二重特異性抗原結合分子は、第２の抗原への一価の結合をもたらす）。
電荷改変
本発明の二重特異性抗原結合分子は、その中に含まれるＦａｂ分子中にアミノ酸置換を含んでもよく、これは、本発明の二重特異性抗原結合分子の結合アームの１つ（又は３つ以上の抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合、２つ以上）にＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベースの二重／多重特異性抗原結合分子の生産において生じうる、マッチしない重鎖との軽鎖の誤対合（ベンズ・ジョーンズ型副産物）を減少させるのに特に有効である（参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１５／１５０４４７号、特にその実施例も参照されたい）。望ましくない副産物、特に、結合アームの１つにＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する二重特異性抗原結合分子中に生じるベンズ・ジョーンズ型副産物と比較した場合の所望の二重特異性抗原結合分子の比率は、ＣＨ１及びＣＬドメイン中の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入すること（本明細書では時に「電荷改変」という）により改善することができる。
本発明の二重特異性抗原結合分子は、その中に含まれるＦａｂ分子中にアミノ酸置換を含んでもよく、これは、本発明の二重特異性抗原結合分子の結合アームの１つ（又は３つ以上の抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合、２つ以上）にＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベースの二重／多重特異性抗原結合分子の生産において生じうる、マッチしない重鎖との軽鎖の誤対合（ベンズ・ジョーンズ型副産物）を減少させるのに特に有効である（参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１５／１５０４４７号、特にその実施例も参照されたい）。望ましくない副産物、特に、結合アームの１つにＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する二重特異性抗原結合分子中に生じるベンズ・ジョーンズ型副産物と比較した場合の所望の二重特異性抗原結合分子の比率は、ＣＨ１及びＣＬドメイン中の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入すること（本明細書では時に「電荷改変」という）により改善することができる。
したがって、二重特異性抗原結合分子の第１及び第２の抗原結合部分は共にＦａｂ分子であり、抗原結合部分の１つ（特に第２の抗原結合部分）において、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているいくつかの実施態様では、以下のとおりである：
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸が正電荷を持つアミノ酸により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が負電荷を持つアミノ酸により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；又は
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸が正電荷を持つアミノ酸により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が負電荷を持つアミノ酸により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸が正電荷を持つアミノ酸により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が負電荷を持つアミノ酸により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；又は
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸が正電荷を持つアミノ酸により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸が負電荷を持つアミノ酸により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
二重特異性抗原結合分子は、ｉ）及びｉｉ）に記載の改変の両方を含むことはない。ＶＨ／ＶＬ交換を有する抗原結合部分の定常ドメインＣＬとＣＨ１は、互いによって置き換えられない（すなわち交換されないまま）。
より具体的な実施態様では、
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；或いは
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
ｉ）第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；或いは
ｉｉ）第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
このような実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらなる実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらなるさらに特定の実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらなるさらに特定の実施態様では、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
特定の実施態様では、これら上記の実施態様によるアミノ酸置換が第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１で行われる場合、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬはカッパアイソタイプのものである。
代替的に、これら上記の実施態様によるアミノ酸置換は、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１の代わりに、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１で行われてもよい。これらの特定の実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。
したがって、一実施態様において、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸又は２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらなる実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており （Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらに別の実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
別の実施態様では、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ１２３位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、並びに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、並びに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、並びに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、並びに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、並びに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、並びに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、並びに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、並びに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、並びに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、並びに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、並びに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、並びに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、並びに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分、並びに
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分
を含み；
第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて１２４位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、且つ１２３位のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）（特定の実施態様では独立してリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により）、第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において１４７位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、且つ２１３位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
二重特異性抗原結合分子のフォーマット
本発明による二重特異性抗原結合分子の成分は、様々な構成で互いに融合することができる。例示的な構成が図１Ａ－Ｚに描かれている。
本発明による二重特異性抗原結合分子の成分は、様々な構成で互いに融合することができる。例示的な構成が図１Ａ－Ｚに描かれている。
特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子に含まれる抗原結合部分はＦａｂ分子である。このような実施態様では、第１、第２、第３（など）の抗原結合部分は、本明細書において、それぞれ第１、第２、第３（など）のＦａｂ分子と呼ばれことがある。
一実施態様において、二重特異性抗原結合分子の第１及び第２の抗原結合部分は互いに融合しており、場合によってペプチドリンカーを介して互いに融合している。特定の実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は各々Ｆａｂ分子である。このような一実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。別のこのような実施態様では、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している実施態様では、これに加えて、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖と第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖とが互いに融合していてもよく、場合によってペプチドリンカーを介して互いに融合していてもよい。
ＧＰＲＣ５Ｄなどの標的細胞抗原に特異的に結合することができる単一の抗原結合部分（Ｆａｂ分子など）を有する二重特異性抗原結合分子（例えば、図１Ａ、１Ｄ、１Ｇ、１Ｈ、１Ｋ、１Ｌに示すようなもの）は、特に高親和性抗原結合部分の結合に続いて標的細胞抗原の内在化が予想される場合に有用である。このような場合、標的細胞抗原に特異的な複数の抗原結合部分の存在は、標的細胞抗原の内在化を高め、それによりその利用可能性を低下させる。
しかしながら、他の場合には、標的細胞抗原に特異的な２つ以上の抗原結合部分（Ｆａｂ分子など）を含む二重特異性抗原結合分子（図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｍ又は１Ｎに示される例を参照）を有することは、例えば、標的部位への標的化を最適化するため又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために有利であろう。
したがって、特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３の抗原結合部分を含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、第１の抗原、すなわちＧＰＲＣ５Ｄに結合する。一実施態様では、第３の抗原結合部分はＦａｂ分子である。
一実施態様において、第３の抗原部分は、第１の抗原結合部分と同一である。
科学的に明らかに不合理又は不可能でない限り、二重特異性抗原結合分子の第３の抗原結合部分は、第１の抗原結合部分及び／又はＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体に関して本明細書に記載される任意の特徴を、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号４のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号５の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号６のＬＣＤＲ ２、及び配列番号７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
いくつかの実施態様では、第３の抗原結合部分は、ヒト化抗体（に由来するもの）である。一実施態様において、ＶＨはヒト化ＶＨであり、且つ／又はＶＬはヒト化ＶＬである。一実施態様において、第３の抗原結合部分は、上記実施態様のいずれかにおけるＣＤＲを含み、さらにはアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分のＶＨは、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７、及び配列番号５８の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第３の抗原結合部分のＶＬは、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３、及び配列番号６４の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７、及び配列番号５８の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列と、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３、及び配列番号６４の群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列とを含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７、及び配列番号５８の群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３、及び配列番号６４の群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５７、及び配列番号５８の群から選択されるＶＨ配列と、配列番号１４、配列番号１６、配列番号５２、配列番号５３、配列番号６３、及び配列番号６４の群から選択されるＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号１３のＶＨ配列と配列番号１４のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号１５のＶＨ配列と配列番号１６のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号４８のＶＨ配列と配列番号５３のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号４９のＶＨ配列と配列番号５２のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号５７のＶＨ配列と配列番号６４のＶＬ配列とを含む。
特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号５８のＶＨ配列と配列番号６３のＶＬ配列とを含む。
一実施態様において、第３の抗原結合部分は、ヒト定常領域を含む。一実施態様において、第３の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号３７及び３８（それぞれ、ヒトカッパＣＬドメイン、ヒトラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号３９（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）に示される。いくつかの実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号３７又は配列番号３８のアミノ酸配列、特に配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、本明細書の「電荷修飾」の項に記載されているアミノ酸変異を含んでもよく、且つ／又はクロスオーバーＦａｂ分子内にある場合は、１若しくは複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失若しくは置換を含んでもよい。いくつかの実施態様では、第３の抗原結合部分は、配列番号３９のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（特にＣＨ１ドメイン）は、本明細書の「電荷修飾」の項に記載されているアミノ酸変異を含みうる。
特定の実施態様では、第３及び第１の抗原結合部分は各々Ｆａｂ分子であり、第３の抗原結合部分は第１の抗原結合部分と同一である。したがって、このような実施態様では、第１及び第３の抗原結合部分は、同じ重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、同じドメイン構成を有する（すなわち従来の又はクロスオーバー））。さらに、このような実施態様では、第３の抗原結合部分は、存在する場合、第１の抗原結合部分と同じアミノ酸置換を含む。例えば、本明細書に「電荷改変」として記載されているアミノ酸置換は、第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分の各々の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われる。代替的に、前記アミノ酸置換は、第２の抗原結合部分（特定の実施態様ではＦａｂ分子でもある）の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われてもよいが、第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１では行われない。
第１の抗原結合部分と同様に、第３の抗原結合部分は特に、従来のＦａｂ分子である。しかしながら、第１及び第３の抗原結合部分がクロスオーバーＦａｂ分子である（且つ第２の抗原結合部分が従来のＦａｂ分子である）実施態様も考慮される。したがって、特定の実施態様では、第１及び第３の抗原結合部分は各々従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他の実施態様において、第１及び第３の抗原結合部分は各々クロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である。
第３の抗原結合部分が存在する場合、特定の実施態様では、第１及び第３の抗原部分はＧＰＲＣ５Ｄに結合し、第２の抗原結合部分は第２の抗原、特に活性化Ｔ細胞抗原、さらに具体的にはＣＤ３、最も具体的にはＣＤ３イプシロンに結合する。
特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットは、安定した結合をすることができる。
本発明による二重特異性抗原結合分子は、異なる構成を有することができる、すなわち第１、第２の（及び場合により第３の）抗原結合部分は、異なる方法で互いに及びＦｃドメインに融合されうる。これらの成分は、直接又は好ましくは１若しくは複数の適切なペプチドリンカーを介して、互いに融合されうる。Ｆａｂ分子の融合先がＦｃドメインのサブユニットのＮ末端である場合、それは典型的には免疫グロブリンのヒンジ領域を介する。
いくつかの実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は各々Ｆａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端又はＦｃドメインのもう一方のサブユニットのＮ末端に融合している。特定のこのような実施態様では、前記第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のこのような実施態様では、前記第１のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。
一実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分は各々Ｆａｂ分子であり、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、場合により１又は複数のペプチドリンカーとからなり、第１のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｇ及び１Ｋに模式的に描かれている（これらの例における第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）。場合によって、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖がさらに互いに融合していてもよい。
別の実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は各々Ｆａｂ分子であり、第１及び第２の抗原結合部分は各々、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合している。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、場合により１又は複数のペプチドリンカーとからなり、第１及び第２のＦａｂ分子は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットのうちの一方のＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ａ及び１Ｄに模式的に描かれている（これらの例では第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。第１及び第２のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合していてもよい。特定の実施態様では、第１及び第２のＦａｂ分子は各々、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１のＦｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
いくつかの実施態様では、第１及び第２の抗原結合部分は各々Ｆａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端又は（上述のように）Ｆｃドメインのサブユニットのもう一方のＮ末端に融合していてもよい。特定のこのような実施態様では、前記第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のこのような実施態様では、前記第１のＦａｂ分子はクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。
一実施態様において、第１及び第２の抗原結合部分は各々Ｆａｂ分子であり、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、場合により１又は複数のペプチドリンカーとからなり、第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｈ及び１Ｌに模式的に描かれている（これらの例では第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。場合によって、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖がさらに互いに融合していてもよい。
いくつかの実施態様では、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。特定のこのような実施態様では、前記第１及び第３のＦａｂ分子は各々従来のＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のこのような実施態様では、前記第１及び第３のＦａｂ分子は各々クロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。
特定のこのような実施態様では、第２及び第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合しており、第１の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、場合により１又は複数のペプチドリンカーとからなり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｂ及び１Ｅ（これらの例では第２の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）、並びに図１Ｊ及び１Ｎ（これらの例では第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に模式的に描かれている。第２及び第３のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合していてもよい。特定の実施態様では、第２及び第３のＦａｂ分子は各々、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１のＦｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。場合によって、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖とが、さらに互いに融合していてよい。
別のこのような実施態様では、第１及び第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインのサブユニットの一方のＮ末端に融合しており、第２の抗原結合部分はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２及び第３のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと、場合によって１又は複数のペプチドリンカーとからなり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｃ及び１Ｆ（これらの例では第２の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）、並びに図１Ｉ及び１Ｍ（これらの例では第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に模式的に描かれている。第１及び第３のＦａｂ分子は、直接又はペプチドリンカーを介してＦｃドメインに融合していてもよい。特定の実施態様では、第１及び第３のＦａｂ分子は各々、免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合している。特定の実施態様では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、特にＦｃドメインがＩｇＧ１のＦｃドメインである場合、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。場合によって、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖とが、さらに互いに融合していてよい。
Ｆａｂ分子がＦａｂ重鎖のＣ末端において免疫グロブリンのヒンジ領域を介してＦｃドメインのサブユニットの各々のＮ末端に融合している二重特異性抗原結合分子の構成においては、２つのＦａｂ分子、ヒンジ領域、及びＦｃドメインが、本質的に免疫グロブリン分子を形成する。特定の実施態様では、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。さらに特定の実施態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。さら特定の実施態様では、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。他の実施態様では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一実施態様において、免疫グロブリンは、ヒト定常領域、特にヒトＦｃ領域を含む。
本発明の二重特異性抗原結合分子のいくつかでは、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖と第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は互いに融合しており、場合によってペプチドリンカーを介して互いに融合している。第１及び第２のＦａｂ分子の構成に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖が、そのＣ末端において、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合していてもよく、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖が、そのＣ末端において、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合していてもよい。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合はさらに、マッチしないＦａｂ重鎖と軽鎖の誤対合を減少させ、また、本発明の二重特異性抗原結合分子のいくつかの発現に必要なプラスミドの数を削減する。
抗原結合部分は、Ｆｃドメインに、又は直接若しくはペプチドリンカーを介して互いに融合していてもよく、１又は複数のアミノ酸、典型的には約２‐２０のアミノ酸を含む。ペプチドリンカーは当分野において既知であり、本願明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は通常、１から１０、典型的には２から４の整数である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸長、一実施態様では５から１００アミノ酸長、さらなる実施態様では１０‐５０アミノ酸長を有する。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ［ここで、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、且つ（ｘ＝３、ｎ＝３，４，５又は６、ｍ＝０，１，２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２，３，４又は５、ｍ＝０，１，２又は３）］であり、一実施態様では、ｘ＝４、ｎ＝２又は３であり、さらなる実施態様ではｘ＝４、ｎ＝２である。一実施態様では、前記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合させるための特定の適切なペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖を接続するために適切な例示的なペプチドリンカーは、配列（Ｄ）－（Ｇ４Ｓ）２（配列番号４３及び４４）を含む。別の適切なこのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。加えて、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含むことができる。Ｆａｂ分子は、特にＦｃドメインのサブユニットのＮ末端に融合している場合、追加のペプチドリンカーの有無にかかわらず、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して融合されうる。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含んでいる）、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））とを含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。特定の実施態様では、これらのポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））とを含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。特定の実施態様では、これらのポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。
これらの実施態様のいくつかでは、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。他のこれらの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、必要に応じて、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＬ（１）－ＣＬ（１））、又は第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。
これらの実施態様による二重特異性抗原結合分子はさらに、（ｉ）Ｆｃドメインのサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））とを含みうる。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ端末ペプチド結合を共有し、次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。
これらの実施態様のいくつかでは、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。他のこれらの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、必要に応じて、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＬ（１））、又は第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））をさらに含む。
これらの実施態様による二重特異性抗原結合分子はさらに、（ｉ）Ｆｃドメインのサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がＦｃドメインのサブユニットとカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））と、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））とを含みうる。特定の実施態様では、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合により、共有結合している。
特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子はＦｃドメインを含まない。特定のこのような実施態様では、前記第１のＦａｂ分子と、存在する場合第３のＦａｂ分子は、各々が従来のＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のこのような実施態様では、前記第１のＦａｂ分子と、存在する場合第３のＦａｂ分子は、各々がクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２のＦａｂ分子は従来のＦａｂ分子である。
このような一実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２の抗原結合部分と、場合によって１又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第１及び第２の抗原結合部分は共にＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｏ及び１Ｓに模式的に描かれている（これらの例では第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。
別のこのような実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２の抗原結合部分と、場合によって１又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第１及び第２の抗原結合部分は共にＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｐ及び１Ｔに模式的に描かれている（これらの例では第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）。
いくつかの実施態様では、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、二重特異性抗原結合分子は、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定のこのような実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子と、場合によって１又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような構成は、図１Ｑ及び１Ｕ（これらの例では第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）又は図１Ｘ及び１Ｚ（これらの例では第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分は、各々ＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に模式的に描かれている。
いくつかの実施態様では、第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、二重特異性抗原結合分子は、第３の抗原結合部分、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＮ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合する。特定のこのような実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、本質的に、第１、第２、及び第３のＦａｂ分子から、場合によって１又は複数のペプチドリンカーからなり、第２のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＣ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子はＦａｂ重鎖のＮ末端において第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。このような構成は、図１Ｒ及び１Ｖ（これらの例では第２の抗原結合部分はＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子である）又は図１Ｗ及び１Ｙ（これらの例では第２の抗原結合部分は従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合部分は、各々ＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に模式的に描かれている。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２）を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（３）－ＣＨ１（３））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第２のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（３）－ＣＨ１（３））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））と、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第１のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち第３のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第１のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する（すなわち第３のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（３）－ＣＬ（３））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第３のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第１のＦａｂ分子は、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第３のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し、次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有し（すなわち第１のＦａｂ分子は、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられているクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、次に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖とカルボキシ末端ペプチド結合を共有する、ポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２））を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））と、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））とをさらに含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域とカルボキシ末端ペプチド結合を共有するポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））をさらに含む。
特定の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８８のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；並びにｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しており、又は（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；並びにｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しており、又は（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；並びにｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しており、又は（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；並びにｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しており、又は（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；並びにｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しており、又は（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；並びにｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しており、又は（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；並びにｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しており、又は（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
別の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分とｂ）の第２の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
別の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分とｂ）の第２の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
別の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分とｂ）の第２の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
別の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分とｂ）の第２の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
別の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分とｂ）の第２の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
別の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分とｂ）の第２の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
別の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分とｂ）の第２の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
本発明による二重特異性抗原結合分子の異なる構成のすべてにおいて、本明細書に記載のアミノ酸置換は、存在する場合、第１及び（存在する場合）第３の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインに、又は第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインに存在しうる。好ましくは、かかるアミノ酸置換は、第１及び（存在する場合）第３の抗原結合部分／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインに存在する。本発明の概念によれば、本発明に記載のアミノ酸置換が第１（及び存在する場合第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる場合、かかるアミノ酸置換は、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子では行われない。逆に、本明細書に記載のアミノ酸置換が第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子で行われる場合、かかるアミノ酸置換は、第１（及び存在する場合第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子では行われない。アミノ酸置換は、特に、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子を含む二重特異性抗原結合分子において行われる。
特に本明細書に記載のアミノ酸置換が第１（及び存在する場合第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子において行われる、本発明による二重特異性抗原結合分子の特定の実施態様では、第１（及び存在する場合第３）のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。特に本明細書に記載のアミノ酸置換が第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子で行われる、本発明による二重特異性抗原結合分子の他の実施態様では、第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。いくつかの実施態様では、第１（及び存在する場合第３）の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬ及び第２の抗原結合部分／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。
一実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）（Ｋａｂａｔによる番号付け）により置換されており、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、又はｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
一実施態様において、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原を結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
一実施態様において、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原を結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
一実施態様において、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第２及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
一実施態様において、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第２及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
一実施態様において、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第２及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
一実施態様において、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分がＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第２及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；並びにｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、又はｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；並びにｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、又はｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；並びにｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、又はｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；並びにｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、又はｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；並びにｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、又はｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；並びにｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、又はｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１の抗原に結合し、第１の抗原結合部分と同一である第３の抗原結合部分；並びにｄ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、（ｉ）ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合しているか、又はｉｉ）ｂ）の第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてａ）の第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ａ）の第１の抗原結合部分とｃ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｄ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
別の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、ａ）の第１の抗原結合部分とｂ）の第２の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
別の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、ａ）の第１の抗原結合部分とｂ）の第２の抗原結合部分は、それぞれＦａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
別の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、ａ）の第１の抗原結合部分とｂ）の第２の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
別の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、ａ）の第１の抗原結合部分とｂ）の第２の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
別の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、ａ）の第１の抗原結合部分とｂ）の第２の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
別の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号６のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、ａ）の第１の抗原結合部分とｂ）の第２の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
別の実施態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、配列番号７の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１２のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；ここで、ａ）の第１の抗原結合部分とｂ）の第２の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
上記実施態様のいずれによっても、二重特異性抗原結合分子の成分（例：Ｆａｂ分子、Ｆｃドメイン）は、直接融合していても、又は、本明細書に記載されているか若しくは当技術分野で既知である様々なリンカー、特に１若しくは複数のアミノ酸、典型的には約２‐２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合していてもよい。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれ、ここで、ｎは、通常１から１０、典型的には２から４の整数である。
特定の態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１及び第３の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１及び第２の抗原結合部分が、各々配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む（従来の）Ｆａｂ分子である、第１及び第３の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、ａ）の第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；さらにここで、ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とａ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１及び第３の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１及び第２の抗原結合部分が、各々配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む（従来の）Ｆａｂ分子である、第１及び第３の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、ａ）の第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；さらにここで、ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とａ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１及び第３の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１及び第２の抗原結合部分が、各々配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む（従来の）Ｆａｂ分子である、第１及び第３の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、ａ）の第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；さらにここで、ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とａ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１及び第３の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１及び第２の抗原結合部分が、各々配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む（従来の）Ｆａｂ分子である、第１及び第３の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、ａ）の第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；さらにここで、ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とａ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１及び第３の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１及び第２の抗原結合部分が、各々配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号５３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む（従来の）Ｆａｂ分子である、第１及び第３の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、ａ）の第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；さらにここで、ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とａ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１及び第３の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１及び第２の抗原結合部分が、各々配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む（従来の）Ｆａｂ分子である、第１及び第３の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、ａ）の第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；さらにここで、ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とａ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
特定の態様では、本発明は、ａ）第１の抗原に結合する第１及び第３の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１及び第２の抗原結合部分がそれぞれ、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む（従来の）Ｆａｂ分子である、第１及び第３の抗原結合部分；ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、Ｆａｂ分子が、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、第２の抗原結合部分；ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、二重特異性抗原結合分子を提供し；ここで、ａ）の第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により（特にアルギニン（Ｒ）により）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１及び第３の抗原結合部分の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；さらにここで、ａ）の第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｂ）の第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、ｂ）の第２の抗原結合部分とａ）の第３の抗原結合部分は、各々Ｆａｂ重鎖のＣ末端においてｃ）のＦｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端に融合している。
本発明のこの態様による一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、場合によって３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本発明のこの態様によるさらなる実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられているか（Ｓ３５４Ｃ）又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）（特に３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられている）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基により置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本発明のこの態様によるまた別の実施態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの各々において、２３４位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられており（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられており（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基がグリシン残基によって置き換えられている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本発明のこの態様によるまたさらなる実施態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
特定の具体的な実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらに具体的な特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
別の特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
別の特定の実施様態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１１６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１１７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１１５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１１６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１１７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
別の特定の実施様態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１１８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１１８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１１９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
別の特定の実施様態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２３のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１２２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２５のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
別の特定の実施様態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１２６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１２６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１２８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１２９のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
別の特定の実施様態では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１３０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１３１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１３２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１３３のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらなる特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１３１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１３２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び配列番号１３３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
Ｆｃドメイン
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。二重特異性抗原結合分子に関連して本明細書に記載されるＦｃドメインの特徴は、本発明の抗体に含まれるＦｃドメインに等しく当てはまる。
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。二重特異性抗原結合分子に関連して本明細書に記載されるＦｃドメインの特徴は、本発明の抗体に含まれるＦｃドメインに等しく当てはまる。
二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定に結合することができる。一実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、１つ以下のＦｃドメインを含む。
一実施態様において、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。さらに特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のｉｎ ｖｉｖｏでのＦａｂアーム交換を減少させる（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）参照）。さらなる特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。さらに特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的な配列は、配列番号４２に示されている。
ヘテロ二量体化を促すＦｃドメインの改変
本発明による二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又はもう一方に融合されうる異なる抗原結合部分を含み、したがって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には２つの非同一のポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化は、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせをもたらす。組換え生産における二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善するために、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに所望のポリペプチドの結合を促す改変を導入することが有利であろう。
本発明による二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又はもう一方に融合されうる異なる抗原結合部分を含み、したがって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には２つの非同一のポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化は、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせをもたらす。組換え生産における二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を改善するために、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに所望のポリペプチドの結合を促す改変を導入することが有利であろう。
したがって、特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの結合を促す改変を含んでいる。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のタンパク質間相互作用が最も広範な部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインである。したがって、一実施態様では、前記改変は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。
ヘテロ二量体させるために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインを改変するためのいくつかの手法が存在し、それらは、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に詳しく記載されている。典型的には、そのような手法のすべてにおいて、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）がもはや自身とホモ二量体化できず、相補的に設計された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化せざるを得ないように（第１及び第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量体化するように、且つ、２つの第１のＣＨ３ドメイン又は２つの第２のＣＨ３ドメインの間にホモ二量体が形成されないように）、両方とも相補的に設計されている。重鎖ヘテロ二量体化の改善のためのこれらの異なる手法は、重鎖／軽鎖誤対合及びベンズ・ジョーンズ型副産物を減少させる、二重特異性抗原結合分子における重鎖－軽鎖改変（例：１つの結合アームにおけるＶＨとＶＬの交換／置き換え及びＣＨ１／ＣＬ界面における反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）と組み合わせた異なる代替法として考慮される。
特定の実施態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの結合を促進する前記改変は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」改変であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ」改変を、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのもう一方に「ホール」改変を含む。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）、及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）に記載されている。通常、この方法は、隆起（「ノブ」）を第１のポリペプチドの界面に、対応する空洞（「ホール」）を第２のポリペプチドの界面に導入することを伴い、その結果、ヘテロ二量体の形成を促進し且つホモ二量体の形成を妨げるように隆起を空洞内に配置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例：チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じ又は類似の大きさの補完的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例：アラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの界面に作り出される。
このように、特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞に配置可能な隆起が生じ、また、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を中に配置可能な空洞が生じる。
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される。
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）からなる群より選択される。
隆起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により又はペプチド合成により、変化させることによって作製することができる。
特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられる（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
またさらなる実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｓ３５４Ｃ）か、又は３５６位のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｅ３５６Ｃ）（特に３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられる）、また、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基によって置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。これらの２つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、さらに二量体を安定させる（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
特定の実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットはアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
特定の実施態様では、第２の抗原（例：活性化Ｔ細胞抗原）に結合する抗原結合部分は、（場合によって、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する第１の抗原結合部分及び／又はペプチドリンカーを介して）Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」改変を含む）に融合している。理論に縛られることを望まないが、活性化Ｔ細胞抗原などの第２の抗原に結合する抗原結合部分の、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットへの融合は、活性化Ｔ細胞抗原に結合する２つの抗原結合部分を含む抗原結合分子の生成を（さらに）最小限に抑えることができる（２つのノブ含有ポリペプチドの立体衝突）。
ヘテロ二量体化させるためのＣＨ３改変のその他の技術は、本発明による代替法として企図され、例えば、以下に記載されている：国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号。
一実施態様では、ＥＰ第１８７０４５９号に記載されたヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面内の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づいている。本発明の二重特異性抗原結合分子の１つの好ましい実施態様は、（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインの一方におけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインのＣＨ３ドメインのもう一方におけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
別の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、さらにはＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅを、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
別の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６と、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖとを含むか、又は前記二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗと、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖと、さらにＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅと、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋとを含む（すべてＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一実施態様では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されたヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはさらなるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ、及びＬ３６８Ｅより選択されるアミノ酸変異（好ましくはＬ３６８Ｅ）をさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一実施態様では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されたヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる一実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０又はＫ３９２の位置に、例えばａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ又はＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅから選択されるさらなるアミノ酸変異を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる実施態様では、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ、及びＳ４００Ｒをさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一実施態様では、例えば３６８及び４０９からなる群より選択される位置にアミノ酸改変を用いる、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されたヘテロ二量体化の手法が代替的に使用される（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一実施態様では、上述のノブ・イントゥ・ホール技術も使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されるヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ｔを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一実施態様では、二重特異性抗原結合分子又はそのＦｃドメインはＩｇＧ２サブクラスであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されたヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。
代替的な一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの結合を促す改変は、例えば国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する改変を含む。一般に、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの界面の１又は複数のアミノ酸残基を荷電アミノ酸残基で置き換えることを伴い、その結果、ホモ二量体形成は静電的に不利になるが、ヘテロ二量体化は静電的に有利になる。このような一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負電荷を持つアミノ酸によるＫ３９２又はＮ３９２のアミノ酸置換（例：グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）を含み、第２のＣＨ３ドメインは、正電荷を持つアミノ酸によるＤ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６又はＥ３５７のアミノ酸置換（例：リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）、好ましくはＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ又はＥ３５７Ｋ、さらに好ましくはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）を含む。さらなる一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負電荷を持つアミノ酸によるＫ４０９又はＲ４０９のアミノ酸置換（例：グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、好ましくはＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）をさらに含む。さらなる実施態様では、第１のＣＨ３ドメインは、負の電荷を有するアミノ酸（例：グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））によるＫ４３９及び／又はＫ３７０のアミノ酸置換を、さらに又は代替的に含む（すべてＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
またさらなる実施態様では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されたヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一実施態様では、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ、及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ、及びＫ２９２Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらに別の実施態様では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されたヘテロ二量体化手法を代替的に使用することができる。
一実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットはアミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットはアミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメインの改変
Ｆｃドメインは、二重特異性抗原結合分子（又は抗体）に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期と好ましい組織－血液分配比とを含む好ましい薬物動態特性を付与する。しかし同時に、Ｆｃドメインは、二重特異性抗原結合分子（又は抗体）の、好ましい抗原保有細胞への標的化ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞への望ましくない標的化につながる可能性がある。さらには、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の共活性化はサイトカイン放出につながる可能性があり、これがＴ細胞活性化特性（例：第２の抗原結合部分が活性化Ｔ細胞抗原に結合する二重特異性抗原結合分子の実施態様において）及び二重特異性抗原結合分子の長い半減期と組み合わさって、全身投与時にサイトカイン受容体の過剰な活性化と重篤な副作用性を引き起こす。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体保有）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によってＴ細胞が破壊される可能性があるため、二重特異性抗原結合分子（特に第２の抗原結合部分が活性化Ｔ細胞抗原に結合する二重特異性抗原結合分子）の有効性をさらに低下させることすらある。
Ｆｃドメインは、二重特異性抗原結合分子（又は抗体）に、標的組織への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期と好ましい組織－血液分配比とを含む好ましい薬物動態特性を付与する。しかし同時に、Ｆｃドメインは、二重特異性抗原結合分子（又は抗体）の、好ましい抗原保有細胞への標的化ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞への望ましくない標的化につながる可能性がある。さらには、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の共活性化はサイトカイン放出につながる可能性があり、これがＴ細胞活性化特性（例：第２の抗原結合部分が活性化Ｔ細胞抗原に結合する二重特異性抗原結合分子の実施態様において）及び二重特異性抗原結合分子の長い半減期と組み合わさって、全身投与時にサイトカイン受容体の過剰な活性化と重篤な副作用性を引き起こす。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体保有）免疫細胞の活性化は、例えばＮＫ細胞によってＴ細胞が破壊される可能性があるため、二重特異性抗原結合分子（特に第２の抗原結合部分が活性化Ｔ細胞抗原に結合する二重特異性抗原結合分子）の有効性をさらに低下させることすらある。
したがって、特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、天然のＩｇＧ１のＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する。このような実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子のＦｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）は、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、さらに好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を呈し、且つ／又は天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、さらに好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を呈する。一実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子のＦｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、且つ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施態様において、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌の群から選択される１又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。一実施態様では、本発明による二重特異性抗原分子のＦｃドメインは、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して実質的に同様の、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を呈する。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合は、本発明による二重特異性抗原分子のＦｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）が天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又は天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）のＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％超、特に約８０％超、さらには特に約９０％超を呈するときに達成される。
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する低下した結合親和性及び／又は低下したエフェクター機能を有するように操作されている。特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ１又は複数のアミノ酸変異が前記Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様では、アミノ酸変異は、前記ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる。一実施態様では、アミノ酸変異は、前記ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１低下させる。前記ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性を低下させる複数のアミノ酸変異が存在する実施態様では、これらアミノ酸変異の組合せにより、前記ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性が、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１又は少なくとも５０分の１低下する。一実施態様では、操作されたＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、操作されていないＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子と比較して２０％未満、特に１０％未満、さらに特には５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を呈する。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体の各々への結合は、低下する。いくつかの実施態様では、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性も低下する。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は、低下しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち前記受容体に対するＦｃドメインの結合親和性の維持は、本発明による二重特異性抗原結合分子のＦｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）が非操作型のＦｃドメイン（又は前記非操作型のＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）のＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％超を呈するときに達成される。本発明による二重特異性抗原結合分子のＦｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％超、さらには約９０％超を呈しうる。特定の実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、非操作型Ｆｃドメインと比較してエフェクター機能が低下するように操作される。エフェクター機能の低下には、限定されないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体を介した抗原取り込みの減少、ＮＫ細胞に対する結合の低下、マクロファージに対する結合の低下、単球に対する結合の低下、多形核細胞に対する結合の低下、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の減少、標的結合抗体の架橋の低下、樹状細胞成熟の低下又はＴ細胞プライミングの低下のうちの１又は複数が含まれうる。一実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＣＤＣの低下、ＡＤＣＣの低下、ＡＤＣＰの低下、及びサイトカイン分泌の低下の群から選択される１又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能の低下は、ＡＤＣＣの低下である。一実施態様では、ＡＤＣＣの低下は、非操作型Ｆｃドメイン（又は非操作型Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子）によって誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
一実施態様では、ＦｃドメインのＦｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させるアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１、及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらに特定の実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。いくつかの実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。このような一実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。さらに特異的な実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。一実施態様において、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、及びＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらに特異的な実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９、Ｌ２３４、及びＬ２３５位にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらに特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。具体的には、特定の実施態様において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）を含み、すなわち前記Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの各々において、２３４位のロイシン残基はアラニン残基で置き換えられ（Ｌ２３４Ａ）、２３５位のロイシン残基はアラニン残基で置き換えられ（Ｌ２３５Ａ）、３２９位のプロリン残基はグリシン残基により置き換えられる（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
このような一実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、参照によりその全体が本明細書に援用される国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（及び補体）結合をほぼ完全に無効にする。国際公開第２０１２／１３０８３１号には、このような変異体Ｆｃドメインを調製する方法及びその特性（Ｆｃ受容体結合又はエフェクター機能など）を決定する方法も記載されている。
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を呈する。よって、いくつかの実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。Ｆｃ受容体に対するその結合親和性及び／又はそのエフェクター機能をさらに低下させるために、一実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｌ２３５位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。別の実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。特定の実施態様では、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、Ｓ２２８、Ｌ２３５、及びＰ３２９位におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、及びＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＩｇＧ４ Ｆｃドメインの変異体及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号（参照により全体が本明細書に援用される）に記載されている。
特定の実施態様では、天然のＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較してＦｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈するＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、場合によってＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインであるか、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、場合によってＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
特定の実施態様では、ＦｃドメインのＮグリコシル化は、除去されている。このような一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｎ２９７位におけるアミノ酸置換、特にアラニン（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸（Ｎ２９７Ｄ）によりアスパラギンを置き換えるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本明細書上記及び国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の低下を有するＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９の１又は複数の置換を有するものも含む（米国特許第６７３７０５６号）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体など、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの２つ以上において置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
変異体Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の削除、置換、挿入又は改変により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。正しいヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により確認することができる。
Ｆｃ受容体への結合は、例えば、ＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥヘルスケア）などの標準的な機器を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、このようなＦｃ受容体は組換え発現により得ることができる。代替的に、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を用いて評価してもよい。
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子のエフェクター機能は、当技術分野で既知の方法により測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの例が、米国特許第５５００３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３，７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２，１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載されている。或いは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（カリフォルニア州マウンテンビューのＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇ社）；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ））。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。
いくつかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低下する。したがって、Ｆｃドメインがエフェクター機能が低下するように操作されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイを実施して、本発明による二重抗原特異性分子のＦｃドメイン、又は該Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子がＣ１ｑに結合でき、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２，１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１，１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３，２７３８－２７４３（２００４）を参照）。
ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス／半減期の決定も、当分野で既知の方法を用いて行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照）。
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を提供する。いくつかの実施態様において、前記断片は、抗原結合断片である。
本発明はさらに、本明細書に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を提供する。いくつかの実施態様において、前記断片は、抗原結合断片である。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドは、抗体又は二重特異性抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数（例えば２つ以上）のポリヌクレオチドとして発現されうる。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段を介して結合し、機能性の抗体又は二重特異性抗原結合分子を形成することができる。例えば、抗体又は二重特異性抗原結合分子の軽鎖部分は、該抗体又は二重特異性抗原結合分子の重鎖を含む抗体又は二重特異性抗原結合分子の部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされうる。共発現されるとき、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと結合して抗体又は二重特異性抗原結合分子を形成することができる。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットの一方と、場合によって１又は複数のＦａｂ分子（の一部）とを含む抗体又は二重特異性抗原結合分子の部分は、２つのＦｃドメインサブユニットのもう一方と、場合によってＦａｂ分子（の一部）とを含む抗体又は二重特異性抗原結合分子の部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされうる。共発現されるとき、これらのＦｃドメインサブユニットは、結合してＦｃドメインを形成する。
いくつかの実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される、本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子全体をコードする。他の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される、本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。
特定の実施態様では、該ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。
組換え法
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成法（例：メリフィールド固相合成法）又は組換え生産によって得ることができる。組換え生産のために、例えば上述したように、抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）をコードする１又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために１又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用いて容易に単離され、配列決定されうる。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの１又は複数を含むベクタ－、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。このような方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載の技術を参照。発現ベクターは、プラスミドやウイルスの一部であっても、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチド（すなわちコード化領域）がプロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされている発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード化領域」とは、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないものの、コード化領域（存在する場合）の一部と考えられ、但し、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード化領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中（例えば単一のベクター上）に、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中（例えば別個の（異なる）ベクター上）に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断によって翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される１又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）又はそのバリアント若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合した又は融合していない異種コード化領域をコードしうる。異種コード領域には、限定されないが、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ドメインなどの特殊化したエレメント又はモチーフが含まれる。作動可能な結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、遺伝子産物の発現を制御配列（複数可）の影響下又は制御下に置くように、１又は複数の制御配列と結合している場合である。（ポリペプチドコード化領域及びそれと結合するプロモーターなどの）２つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を誘導する発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合」している。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に結合されている。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を誘導する細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーター以外に、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を誘導するポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば、イントロンＡと組み合わせた初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ－βグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン類を誘導可能なプロモーター）が含まれる。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来の要素（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットは、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端反転型配列（ＩＴＲ）などの染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成法（例：メリフィールド固相合成法）又は組換え生産によって得ることができる。組換え生産のために、例えば上述したように、抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）をコードする１又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために１又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を用いて容易に単離され、配列決定されうる。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドの１又は複数を含むベクタ－、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。このような方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載の技術を参照。発現ベクターは、プラスミドやウイルスの一部であっても、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチド（すなわちコード化領域）がプロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされている発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード化領域」とは、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないものの、コード化領域（存在する場合）の一部と考えられ、但し、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード化領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中（例えば単一のベクター上）に、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中（例えば別個の（異なる）ベクター上）に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断によって翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される１又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）又はそのバリアント若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合した又は融合していない異種コード化領域をコードしうる。異種コード領域には、限定されないが、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ドメインなどの特殊化したエレメント又はモチーフが含まれる。作動可能な結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、遺伝子産物の発現を制御配列（複数可）の影響下又は制御下に置くように、１又は複数の制御配列と結合している場合である。（ポリペプチドコード化領域及びそれと結合するプロモーターなどの）２つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を誘導する発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合」している。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に結合されている。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を誘導する細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーター以外に、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を誘導するポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば、イントロンＡと組み合わせた初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子由来のもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ－βグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン類を誘導可能なプロモーター）が含まれる。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来の要素（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットは、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端反転型配列（ＩＴＲ）などの染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を誘導する分泌又はシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と結合していてもよい。例えば、抗体又は二重特異性抗原結合分子の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡは、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする核酸の上流に配置されてもよい。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、成長中のタンパク質鎖の粗面小胞体を横切る排出輸送が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者であれば、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは、一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有し、これが翻訳されたポリペプチドから切断されて、分泌型又は「成熟」型のポリペプチドを生成することを知っている。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又はそれに作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を誘導する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用されうる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されていてもよい。
後の精製を容易にするために又は抗体若しくは二重特異性抗原結合分子の標識化を補助するために使用されうる、短タンパク質配列（例：ヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡは、抗体又は二重特異性抗原結合分子（断片）をコードするポリヌクレオチドの内部又は末端に含まれうる。
さらなる実施態様では、本発明の１又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の１又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。該ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載されている任意の特徴を、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。このような一実施態様において、宿主細胞は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードする１又は複数のポリヌクレオチドを含む１又は複数のベクターを含む（例えばそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、本発明の抗体若しくは二重特異性抗原結合分子又はその断片を産生するように操作することができる任意の種類の細胞系を指す。抗体又は二重特異性抗原結合分子の複製及び発現補助に適切な宿主細胞は、当分野でよく知られている。このような細胞は必要に応じて特定の発現ベクターでトランスフェクト又は形質導入することができ、ベクターを含有する大量の細胞を増殖させて大規模発酵槽に播種し、臨床応用に十分な量の抗体又は二重特異性抗原結合分子を得ることができる。適切な宿主細胞には、大腸菌などの原核生物微生物又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などの様々な真核生物細胞が含まれる。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現の後、ポリペプチドは細菌細胞のペーストから可溶性画分に単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌や酵母などの真核微生物も、ポリペプチドをコードするベクターのクローニングや発現のホストとして適しており、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌及び酵母株も含まれ、その結果、部分的又は完全にヒトのグリコシル化パターンを持つポリペプチドが生産される。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株が特定されており、これらは特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号、及び同第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生のためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は、有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児由来腎臓株（例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載の２９３又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載のＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ 細胞（例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載）、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。タンパク質生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐ．２５５－２６８（２００３）を参照。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞、及び植物細胞などが含まれ、さらには、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ系細胞（例：Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された産物が重鎖と軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖のもう一方も発現するように操作することができる。
一実施態様において、本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子を生産する方法が提供され、この方法は、抗体又は二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で、本明細書に提供されるような抗体又は二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、任意選択的に宿主細胞（又は宿主細胞培地）から本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を回収することとを含む。
本発明の二重特異性抗原結合分子（又は抗体）の成分は、遺伝的に互いに対して融合することができる。本発明の二重特異性抗原結合分子は、その成分が互いに直接的に、又はリンカー配列を介して間接的に融合するように設計することができる。リンカーの組成及び長さは当技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性を試験してもよい。二重特異性抗原結合分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書に提供されている。必要に応じて、融合体の個々の成分を切り離すための切断部位を取り込むために、追加的配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列も含めることができる。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は通常、抗原決定基に結合することのできる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域は、天然又は非天然の抗体及びその断片の一部を形成することができ、且つ、そのような抗体及び断片から得られる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生産する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８参照）。非天然抗体は、固相ペプチド合成を用いて構築することができ、（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）組換え生産することも、又は、例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることも可能である（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙに対する米国特許第５９６９１０８号を参照）。
あらゆる動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域を、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子に用いることができる。本発明において有用な非限定的な抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類又はヒト起源のものでありうる。抗体又は二重特異性抗原結合分子のヒトへの使用が意図されている場合、抗体の定常領域がヒトに由来する抗体のキメラ形態が使用されうる。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体も、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる（例えばＷｉｎｔｅｒに対する米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それらの方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例：ドナー抗体）のＣＤＲをヒト（例：レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域に、重要なフレームワーク残基（例：良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要な残基）の保持の有無にかかわらず移植すること、（ｂ）非ヒトの特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様部分で「クローキング」することが含まれる。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えばＡｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）にて総説されており、さらにＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号及び同第７０８７４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）の移植を記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）、並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「誘導選択」手法を記載）に詳述されている。ヒト化に用いることのできるヒトフレームワーク領域には、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒトの生殖細胞系列フレームワーク領域（例えばＡｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照）；及びＦＲライブラリースクリーニングから得られたフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照）が含まれる。
ヒト抗体は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５，３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０，４５０－４５９（２００８）に概して記載されている。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによって調製することができる。このような動物は、典型的には内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか又は染色体外に存在するか若しくは該動物の染色体にランダムに組み込まれているヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべて又は一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、通常は不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号及びＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。このような動物により生成されるインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに改変されうる。
ヒト抗体は、ハイブリドーマベースの方法によって作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記述されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照。）また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体もＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法には、例えば米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の作製について記載）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマについて記載）に記載されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）にも記載されている。
ヒト抗体は、本明細書に記載されるように、ヒト抗体ライブラリーからの単離によって生成されてもよい。
本発明に有用な抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法は、例えばＬｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：４９８－５０８（２０１６）に総説がある。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作成して所望の結合特性を有する抗体の当該ライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が、当技術分野で知られている。それらの方法は、例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ８：１１７７－１１９４（２０１６）；Ｂａｚａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：１８１７－１８２８（２０１２）及びＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６：２７６－２８９（２０１６）、並びにＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）及びＭａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）に総説がある。
特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリー内でランダムに組み換えられ、その後、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２：４３３－４５５（１９９４）に記載のように、抗原結合ファージについてスクリーニングされうる。ファージは通常、抗体断片を、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片のいずれかとして表示する。免疫化された供給源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に対する高親和性抗体を提供する。代替的に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １２： ７２５－７３４（１９９３）に記載されているように、ナイーブレパートリーを（例えばヒトから）クローニングして、免疫化なしで、広範囲の非自己及び自己抗原に対する抗体の単一の供給源を提供することができる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２７：３８１－３８８（１９９２）によって記載されているように、幹細胞由来の再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを用いて可変性に富むＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの再配列を達成することにより、ナイーブライブラリーを合成的に作成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載している特許刊行物には、例えば：米国特許第５７５０３７３号；同第７９８５８４０号；同第７７８５９０３号及び同第８６７９４９０号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０２３７７６４号及び同第２００７／０２９２９３６号が含まれる。コンビナトリアルライブラリーを所望の活性（複数可）を有する抗体についてスクリーニングするための当技術分野で既知の方法のさらなる例には、リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ、並びに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞での抗体のディスプレイ及び選択方法が含まれる。酵母表面ディスプレイのための方法は、例えば、Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５０３：１３５－５６（２０１２）及びＣｈｅｒｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １３１９：１５５－１７５（２０１５）、並びにＺｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８８９：７３－８４（２０１２）に総説がある。リボソームディスプレイの方法は、例えばＨｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：５１３２－５１３４（１９９７）及びＨａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：４９３７－４９４２（１９９７）に記載されている。
本明細書に記載のように調製される抗体又は二重特異性抗原結合分子は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、部分的には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存しており、当業者に明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製には、抗体又は二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子のアフィニティークロマトグラフィー精製には、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続したプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、基本的に実施例に記載されているように、抗体又は二重特異性抗原結合分子を単離することができる。抗体又は二重特異性抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定されうる。
アッセイ
当技術分野で既知の様々なアッセイにより、本明細書で提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子の物理的／化学的性質及び／又は生物活性を特定し、スクリーニングし、又は特性評価する。
アッセイ
当技術分野で既知の様々なアッセイにより、本明細書で提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子の物理的／化学的性質及び／又は生物活性を特定し、スクリーニングし、又は特性評価する。
親和性アッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対する抗体又は二重特異性抗原結合分子の親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥヘルスケア）などの標準機器と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対する抗体又は二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、評価することができる。以下では、結合親和性を測定するための具体的な例示的且つ代表的実施態様を説明する。
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対する抗体又は二重特異性抗原結合分子の親和性は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥヘルスケア）などの標準機器と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対する抗体又は二重特異性抗原結合分子の結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、評価することができる。以下では、結合親和性を測定するための具体的な例示的且つ代表的実施態様を説明する。
一実施態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機（ＧＥヘルスケア）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
Ｆｃ部分とＦｃ受容体との相互作用を解析するために、ＣＭ５チップ上に固定化された抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）でＨｉｓタグ付きの組換えＦｃ受容体を捕捉し、二重特異性コンストラクトをアナライトとして使用する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＧＥヘルスケア）が、供給業者の指示書に従ってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗ペンタＨｉｓ抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で４０μｇ／ｍｌに希釈した後、５μｌ／ｍｉｎの流量で注入し、約６５００レスポンスユニット（ＲＵ）の結合タンパク質を得る。リガンドの注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応群をブロックする。その後、Ｆｃ受容体を４又は１０ｎＭで６０秒間捕捉する。速度論的測定のために、抗体又は二重特異性抗原結合分子の４倍連続希釈液（５００ｎＭ‐４０００ｎＭの範囲）を、２５℃のＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥヘルスケア、１０ｍＭｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ｐＨ７．４）に流量３０μｌ／ｍｉｎで１２０秒間注入する。
標的抗原に対する親和性を決定するため、抗体又は二重特異性抗原結合分子を、抗ペンタＨｉｓ抗体について説明したように、活性化されたＣＭ５センサーチップ表面に固定化された抗ヒトＦａｂ特異的抗体（ＧＥヘルスケア）によって捕捉する。結合タンパク質の最終量は、約１２０００ＲＵである。抗体又は二重特異性抗原結合分子は、３００ｎＭで９０秒間捕捉される。標的抗原は、濃度範囲２５０‐１０００ｎＭで、３０μｌ／ｍｉｎの流量で１８０秒間フローセルを通過する。解離を１８０秒間モニターする。
バルク屈折率の差は、基準フローセルで取得されたレスポンスを差し引くことによって補正される。定常応答を使用して、ラングミュア結合等温線の非線形カーブフィッティングにより解離定数ＫＤを得た。結合センサーグラムと解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによる単純な一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．１．１）を用いて、結合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）が計算される。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照のこと。
活性アッセイ
本発明の二重特異性抗原結合分子（又は抗体）の生物活性は、実施例に記載されている様々なアッセイにより測定することができる。生物活性には、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞中のシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞中の活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、並びに腫瘍後退の誘導及び／又は生存率の改善が含まれうる。
本発明の二重特異性抗原結合分子（又は抗体）の生物活性は、実施例に記載されている様々なアッセイにより測定することができる。生物活性には、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞中のシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞中の活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、並びに腫瘍後退の誘導及び／又は生存率の改善が含まれうる。
組成物、製剤、及び投与経路
さらなる態様において、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の他の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれかと、例えば以下に記載されるような、少なくとも１種の追加の治療剤とを含む。
さらなる態様において、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の他の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供される抗体又は二重特異性抗原結合分子のいずれかと、例えば以下に記載されるような、少なくとも１種の追加の治療剤とを含む。
さらには、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に適した形態の、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を製造する方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子を得ることと、（ｂ）抗体又は二重特異性抗原結合分子を少なくとも１種の薬学的に許容される担体と共に製剤化することによって、抗体又は二重特異性抗原結合分子の調製物がｉｎ ｖｉｖｏでの投与のために製剤化されることとを含む。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解又は分散された抗体又は二重特異性抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的又は薬理学的に許容される」という語句は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒である、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギーその他の有害な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。抗体又は二重特異性抗原結合分子と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０（参照により本明細書に援用される）によって例示されているように、本開示に照らして、当業者に知られるであろう。さらに、動物（例：ヒト）への投与の場合、調製物は、ＦＤＡのＯｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ又は他の国の対応する当局が要求する無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度の基準を満たす必要がある。好ましい組成物は、凍結乾燥された製剤又は水溶液である。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」には、当業者に既知のように、あらゆる溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例：抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、分解剤、潤滑剤、甘味剤、香料、着色料、これらの類似物質及び組み合わせが含まれる（例えば、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９を参照）。いずれの従来の担体も、活性成分と不適合でない限り、治療的又は薬学的組成物におけるその使用が考慮される。
本発明のイムノコンジュゲート（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内を含む任意の適切な手段により投与することができ、また、局所処置のために望ましいのであれば、病巣内投与であってもよい。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。投薬は、短期間の投与か慢性的な投与かによって幾分異なるが、例えば、静脈内注射又は皮下注射などの注射によって、任意の適切な経路で行うことができる。
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、水溶液、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液又は生理食塩水バッファーなどの生理学的に適合するバッファー中に製剤化されうる。該溶液は、懸濁剤、安定剤、及び／又は分散剤などの調合剤を含有することができる。代替的には、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、使用前は、適切なビヒクル、例えば発熱性物質除去蒸留水で構成するための粉末形態であってもよい。滅菌注射用溶液は、必要量の本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を、必要に応じて以下に列挙する他の様々な成分を含む適切な溶媒中に取り込むことにより調製される。滅菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成することができる。通常、分散体は、基本的な分散媒及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に、滅菌された様々な活性成分を取り込むことにより調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液又は乳濁液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過した液体媒質から活性成分と任意の所望の追加成分との粉末を得る真空乾燥又は凍結乾燥技術である。必要に応じて該液体媒質を適切に緩衝し、注射前にまず、その液体希釈剤を十分な生理食塩水又はグルコースで等張にする必要がある。組成物は、製造及び保管の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全なレベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で、最小限に抑えられなければならない。薬学的に許容される適切な担体には、限定されないが、ホスフェート、シトレート、及びその他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなど）；グルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類その他の糖質；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例：Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなど、懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、該懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油又はオレイン酸エチル（ethyl cleat）若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル又はリポソームが含まれる。
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン－マイクロカプセル、ポリ－（メチルメタクリレート）（poly-(methylmethacylate））マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、そのマトリックスは、成形品（例えばフィルム）又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の吸収を、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はこれらの組合せといった吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することにより持続させることができる。
上記の組成物に加えて、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、デポ製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、植え込み（例えば皮下又は筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、適切なポリマー性若しくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又はやや難溶性の誘導体として、例えばやや難溶性の塩として製剤化することができる。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスによって製造することができる。薬学的組成物は、１又は複数の生理的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる従来の方法で製剤化することができる。適した製剤は、選択される投与経路に応じて決まる。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、遊離酸又は遊離塩基の、中性又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸などの有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄などの無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカインなどの有機塩基から得ることができる。水性溶媒及びその他のプロトン性溶媒には、薬学的塩が、対応する遊離塩基形態よりも溶け易い傾向にある。
治療方法及び組成物
本明細書で提供されるいずれの抗体又は二重特異性抗原結合分子も、治療方法に使用することができる。本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、例えばがんの処置において、免疫療法剤として使用されうる。
本明細書で提供されるいずれの抗体又は二重特異性抗原結合分子も、治療方法に使用することができる。本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、例えばがんの処置において、免疫療法剤として使用されうる。
治療方法における使用の場合、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、医学実施基準（good medical practice）に合致するように製剤化、投与、及び管理される。この観点において考慮すべき因子には、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程、及び医療従事者が知るその他の因子が含まれる。
一態様では、医薬としての使用のための本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子が提供される。さらなる態様では、疾患の処置における使用のための、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子が提供される。特定の実施態様では、処置の方法における使用のための、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子が提供される。一実施態様では、本発明は、必要とする個体の疾患の処置における使用のための、本明細書に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、治療的有効量の抗体又は二重特異性抗原結合分子を疾患を有する個体に投与することを含む、個体を処置する方法における使用のための抗体又は二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、処置される疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患は、がんである。特定の実施態様では、本方法は、少なくとも１種の追加の治療剤、例えば、処置される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を上記個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解の誘導における使用のための、本明細書に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、本発明は、標的細胞の溶解を誘導するために抗体又は二重特異性抗原結合分子の有効量を個体に投与することを含む、個体における標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用のための抗体又は二重特異性抗原結合分子を提供する。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。特定の実施態様では、処置される疾患は、自己免疫疾患、特に全身性紅斑性狼瘡及び／又は関節リウマチである。自己反応性形質細胞による病原性自己抗体の産生は、自己免疫疾患の特徴である。したがって、ＧＰＲＣ５Ｄは、自己免疫疾患において自己反応性形質細胞を標的とするために使用することができる。
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、それを必要とする個体における疾患の処置のためのものである。さらなる実施態様において、医薬は、治療的有効量の医薬を疾患を有する個体に投与することを含む、疾患を処置する方法における使用のためのものである。特定の実施態様では、処置される疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患は、がんである。一実施態様では、本方法は、少なくとも１種の追加の治療剤、例えば、処置される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。またさらなる実施態様では、医薬は、標的細胞の溶解を誘導するために有効量の医薬を個体に投与することを含む、個体における標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用のためのものである。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
さらなる態様において、本発明は、疾患を処置するための方法を提供する。一実施態様では、本方法は、そのような疾患を有する個体に対し、治療的有効量の本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を投与することを含む。一実施態様では、薬学的に許容される形態の本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む組成物が、前記個体に対して投与される。特定の実施態様では、処置される疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患は、がんである。特定の実施態様では、本方法は、少なくとも１種の追加の治療剤、例えば、処置される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を上記個体に投与することをさらに含む。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法を提供する。一実施態様では、本方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞を、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子と接触させることを含む。さらなる態様において、個体における標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法が提供される。このような一実施態様では、本方法は、標的細胞の溶解を誘導するために、有効量の抗体又は二重特異性抗原結合分子を個体に投与することを含む。一実施態様において、「個体」は、ヒトである。
特定の実施態様では、処置される疾患は、増殖性疾患、特にがんである。がんの非限定的な例には、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、及び腎臓がんが含まれる。本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を用いて処置されうる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する新生物が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎臓がん、膀胱がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がん、及び前立腺がんからなる群より選択される。一実施態様において、がんは、前立腺がんである。多くの場合、抗体又は二重特異性抗原結合分子は治癒をもたらすのではなく、部分的な恩恵しかもたらさない可能性があることは、当業者の容易に認識するところである。いくつかの実施態様では、何らかの恩恵を有する生理的変化もまた、治療上有益であると見なされる。したがって、いくつかの実施態様では、生理的変化をもたらす抗体又は二重特異性抗原結合分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と見なされる。処置を必要とする対象、患者又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
いくつかの実施態様では、有効量の本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子が細胞に投与される。他の実施態様では、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の治療的有効量が、疾患の処置のために個体に投与される。
疾患の予防又は処置の場合、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の（単独で使用されるか又は１種以上の他の追加の治療剤との組み合わせで使用されるときの）適切な投与量は、処置される疾患の種類、投与経路、患者の体重、抗体又は二重特異性抗原結合分子の種類、疾患の重症度及び経過、抗体又は二重特異性抗原結合分子が予防又は治療いずれの目的で投与されるか、治療介入の既往又は同時進行、患者の病歴及び抗体又は二重特異性抗原結合分子に対する応答、並びに主治医の裁量に応じて決まるであろう。いずれにしても、投与の責任者である医師が、組成物中の活性成分の濃度及び個々の対象にとって適切な用量を決定する。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが想定される。
本抗体又は二重特異性抗原結合分子は、一度に又は一連の処置にわたって、患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば単回又は複数回の別個の投与によるか持続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ‐１５ｍｇ／ｋｇ（例：０．１ｍｇ／ｋｇ‐１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体又は二重特異性抗原結合分子が患者への投与のための初期候補投与量となりうる。１つの典型的な１日投与量は、上記の因子に応じて約１μｇ／ｋｇ‐１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日以上にわたる反復投与に関しては、状態に応じて、処置は通常、疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続されるであろう。抗体又は二重特異性抗原結合分子の１つの例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ‐約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の非限定的な例では、用量は、１回の投与につき、約１マイクログラム／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ体重、約１０マイクログラム／ｋｇ体重、約５０マイクログラム／ｋｇ体重、約１００マイクログラム／ｋｇ体重、約２００マイクログラム／ｋｇ体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ体重、約５００マイクログラム／ｋｇ体重、約１ミリグラム／ｋｇ体重、約５ミリグラム／ｋｇ体重、約１０ミリグラム／ｋｇ体重、約５０ミリグラム／ｋｇ体重、約１００ミリグラム／ｋｇ体重、約２００ミリグラム／ｋｇ体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ体重、約５００ミリグラム／ｋｇ体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ体重又はそれ以上、及びその中で導出可能な任意の範囲も含む。本明細書に列挙した数字から導出可能な範囲の非限定的な例では、上記の数字に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ体重‐約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ体重‐約５００ミリグラム／ｋｇ体重などが投与されうる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）の１又は複数の用量を患者に投与することができる。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば、患者が約２‐約２０、又は例えば約６用量の抗体又は二重特異性抗原結合分子を受け取るように）投与してもよい。初期の高負荷用量の後、１又は複数の低用量を投与してもよい。しかしながら、他の投与量レジメンも有用でありうる。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、通常、意図された目的を達成するために有効な量で使用される。疾患状態を処置又は予防するための使用の場合、本発明の抗体若しくは二重特異性抗原結合分子又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供されている詳細な開示に照らせば、十分に当業者の能力の範囲内である。
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、まずは細胞培養アッセイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイから推定することができる。その後、細胞培養で決定したＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて用量を定式化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定するために使用することができる。
初期投与量は、ｉｎ ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから、当技術分野で周知の技術を用いて推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
投与の量及び間隔は、治療効果を維持するのに十分な抗体又は二重特異性抗原結合分子の血漿レベルを提供するために個々に調整することができる。注射による投与の場合の通常の患者投与量は、約０．１‐５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５‐１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数回投与を行うことにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
局所投与又は選択的取り込みの場合、抗体又は二重特異性抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
本明細書に記載の抗体又は二重特異性抗原結合分子の治療的有効用量は、通常、実質的な毒性を引き起こすことなく、治療的恩恵を提供する。抗体又は二重特異性抗原結合分子の毒性及び治療有効性は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物研究を使用して、ＬＤ５０（母集団の５０％を死に至らせる用量）及びＥＤ５０（母集団の５０％で治療的に有効な用量）を決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。大きな治療指数を呈する抗体又は二重特異性抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明による抗体又は二重特異性抗原結合分子、は高い治療指数を呈する。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した範囲の投与量の定式化において使用することができる。投与量は、好ましくは、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあり、ほとんど又は全く毒性を含まない。投与量は、様々な因子、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じて、この範囲内で変動しうる。正確な処方、投与経路、及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択することができる（例えば、本明細書に参照により全文が援用されるＦｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈ．１，ｐ．１参照）。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を用いて処置される患者の主治医には、毒性、臓器不全などのために投与を終了、中断又は調整すべき方法及び時期が分かるであろう。主治医は、逆に、万一臨床応答が十分でない場合には（毒性を除く）、処置をより高いレベルへ調整することも分かっているであろう。対象となる障害の管理における投与量の大きさは、処置される状態の重症度、投与経路などによって変動する。例えば、状態の重症度は、部分的には標準の予後評価方法により評価される。さらに、用量及び恐らくは投薬頻度も、個々の患者の年齢、体重、及び応答応じて変動するであろう。
その他の薬剤及び処置
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、療法において、１種以上の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、少なくとも１種の追加の治療剤と共投与されうる。用語「治療剤」は、処置を必要とする個体における症状又は疾患を処置するために投与される任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、処置される特定の適応症に適した活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含んでもよい。特定の実施態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘導剤に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。特定の実施態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤又は抗血管新生剤である。
本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、療法において、１種以上の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、少なくとも１種の追加の治療剤と共投与されうる。用語「治療剤」は、処置を必要とする個体における症状又は疾患を処置するために投与される任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、処置される特定の適応症に適した活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含んでもよい。特定の実施態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘導剤に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。特定の実施態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤又は抗血管新生剤である。
このような他の薬剤は、意図した目的に有効な量で組み合わされて適切に存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される抗体又は二重特異性抗原結合分子の量、障害又は処置の種類、及び上述したその他の因子によって決まる。抗体又は二重特異性抗原結合分子は、一般的に、本明細書に記載されているのと同じ投与量及び投与経路で使用されるか、又は本明細書に記載の投与量の約１％‐９９％で、又は経験的に／臨床的に適切であると認められる任意の投与量及び経路で使用される。
上記のこうした併用療法は、併用投与（２種以上の治療剤が同一又は別々の組成物に含まれている）及び分離投与を包含し、この場合、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子の投与は、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時に、及び／又は投与の後に行うことができる。本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子は、放射線療法と組み合わせて使用してもよい。
製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の処置、予防及び／又は診断に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。好適な容器には、例えば瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどが含まれる。該容器は、例えばガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。容器は、状態の処置、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又は別の組成物と併用の組成物を収容し、滅菌のアクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能な、ストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の処置のために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む組成物を中に収容する第１の容器と、（ｂ）さらなる細胞傷害性剤又はその他の治療剤を含む組成物を中に収容する第２の容器とを備えていてもよい。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を処置するために使用できることを示す添付文書をさらに備えていてもよい。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー（例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液）を含む第２（又は第３）の容器をさらに備えていてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的に及び使用者の立場から望ましい他の物質をさらに含んでもよい。
本発明の別の態様では、上述した障害の処置、予防及び／又は診断に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。好適な容器には、例えば瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどが含まれる。該容器は、例えばガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。容器は、状態の処置、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又は別の組成物と併用の組成物を収容し、滅菌のアクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能な、ストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の処置のために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明の抗体又は二重特異性抗原結合分子を含む組成物を中に収容する第１の容器と、（ｂ）さらなる細胞傷害性剤又はその他の治療剤を含む組成物を中に収容する第２の容器とを備えていてもよい。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を処置するために使用できることを示す添付文書をさらに備えていてもよい。代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー（例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液）を含む第２（又は第３）の容器をさらに備えていてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的に及び使用者の立場から望ましい他の物質をさらに含んでもよい。
診断及び検出のための方法及び組成物
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のいずれも、生物学的試料中のＧＰＲＣ５Ｄの存在を検出するために有用である。本明細書で使用する「検出（すること）」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。特定の実施態様では、生物学的試料は、細胞又は組織、例えば前立腺組織である。
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のいずれも、生物学的試料中のＧＰＲＣ５Ｄの存在を検出するために有用である。本明細書で使用する「検出（すること）」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。特定の実施態様では、生物学的試料は、細胞又は組織、例えば前立腺組織である。
一実施態様では、診断又は検出の方法における使用のための抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的試料中のＧＰＲＣ５Ｄの存在を検出する方法が提供される。特定の実施態様では、該方法は、生物学的試料を、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のＧＰＲＣ５Ｄへの結合を許容する条件下で本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体と接触させることと、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体とＧＰＲＣ５Ｄの間に複合体が形成されているかどうかを検出することとを含む。このような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法又はｉｎ ｖｉｖｏ法でありうる。一実施態様では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体を用いる療法に適した対象を選択するために使用され、例えばＧＰＲＣ５Ｄは患者の選択のためのバイオマーカーである。
本発明の抗体を用いて診断することができる例示的な障害には、がん、特に多発性骨髄腫が含まれる。
特定の実施態様では、標識化抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が提供される。標識には、限定されないが、（例えば蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識などの）直接検出される標識又は部分、及び、例えば酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドなどの部分が含まれる。例示的な標識には、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンオン類、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例：グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ）、色素前駆体（ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ又はマイクロペルオキシダーゼなど）を酸化させる過酸化水素を利用し、酵素とカップリングさせた複素環式オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなど）、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定な遊離ラジカルなどが含まれる。
本発明のさらなる態様は、可変重鎖領域（ＶＬ）を含む、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体（１０Ｂ１０）に関し、ここでＶＬは、配列番号８１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含みうる。該抗体は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでもよく、ここでＶＬは、配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。該抗体はＶＨとＶＬとを含んでもよく、ここでＶＬは、配列番号８１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、該抗体は、配列番号８１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号８２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
本発明のさらなる態様は、抗体（１０Ｂ１０－ＴＣＢ）に関する。該抗体は第１の軽鎖を含んでもよく、ここで第１の軽鎖は、配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。該抗体は第２の軽鎖を含んでもよく、ここで第２の軽鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。該抗体は第１の重鎖を含んでもよく、ここで第１の重鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。該抗体は第２の重鎖を含んでもよく、ここで第２の重鎖は、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施態様では、該抗体は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号６８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、配列番号６９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号７０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。
アミノ酸配列
実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施されうる。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施されうる。
実施例１
腫瘍標的の発現
正常な形質細胞上の多発性骨髄腫によって発現される示差遺伝子を特定するために、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者由来の１０個の試料と、健康なドナーの骨髄由来の１０個の形質細胞（ＰＣ）に対してＲＮＡｓｅｑを実施した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を、製造業者の指示書に従って使用し、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出の際には、ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して、ゲノムＤＮＡを除去した。抽出したＲＮＡの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡピコチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で管理した。ＳＭＡＲＴｅｒ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ ＲＮＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用して、製造業者の指示書に従って１．６ｎｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製及び増幅した。その後、１ｎｇの増幅されたｃＤＮＡを製造業者の指示書に従ってＮｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）に供した。シーケンスライブラリーは、Ｋａｐａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して定量し、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いるＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒでのキャピラリー電気泳動により品質管理した。ライブラリーは、ＨｉＳｅｑ２５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）で、バージョン４のクラスター生成キットとバージョン４のシーケンシング試薬（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）とを使用して、２ｘ５０サイクルで配列決定された。
腫瘍標的の発現
正常な形質細胞上の多発性骨髄腫によって発現される示差遺伝子を特定するために、多発性骨髄腫（ＭＭ）患者由来の１０個の試料と、健康なドナーの骨髄由来の１０個の形質細胞（ＰＣ）に対してＲＮＡｓｅｑを実施した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を、製造業者の指示書に従って使用し、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出の際には、ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して、ゲノムＤＮＡを除去した。抽出したＲＮＡの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡピコチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で管理した。ＳＭＡＲＴｅｒ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ ＲＮＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用して、製造業者の指示書に従って１．６ｎｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製及び増幅した。その後、１ｎｇの増幅されたｃＤＮＡを製造業者の指示書に従ってＮｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）に供した。シーケンスライブラリーは、Ｋａｐａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して定量し、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いるＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒでのキャピラリー電気泳動により品質管理した。ライブラリーは、ＨｉＳｅｑ２５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）で、バージョン４のクラスター生成キットとバージョン４のシーケンシング試薬（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）とを使用して、２ｘ５０サイクルで配列決定された。
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は細胞表面タンパク質であり、悪性形質細胞に発現しているため、多発性骨髄腫の標的として認識されている（Ｔａｉ ＹＴ ＆ Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＫＣ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｂ－ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１５ Ｎｏｖ；７（１１）：１１８７－１１９９）。ＲＮＡｓｅｑ技術を用いた詳細な解析により、多発性骨髄腫患者の形質細胞ではＧＰＲＣ５ＤがＢＣＭＡと同様に高発現していることが示された（図２）。さらに重要なことには、多発性骨髄腫患者の形質細胞と健康な形質細胞との間のＧＰＲＣ５Ｄの差次的発現は約２０倍である。対照的に、多発性骨髄腫患者の形質細胞と健康な形質細胞との間のＢＣＭＡの差次的発現はわずか２倍である。ＧＰＲＣ５Ｄの全体的な発現は、ＳＬＡＭ７、ＣＤ１３８、ＣＤ３８などの他の既知の多発性骨髄腫標的分子のそれよりもはるかに高い。さらに、ＧＰＲＣ５Ｄは健康なナイーブ細胞又はメモリーＢ細胞ではほとんど発現しない。
実施例２
ＧＰＲＣ５Ｄバインダーの生成とＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の調製
ＧＰＲＣ５Ｄバインダーは、ラットのＤＮＡ免疫化と、それに続くハイブリドーマの生成、スクリーニング、及びハイブリドーマの配列決定によって生成された。特異的結合のスクリーニングは、ＧＰＲＣ５Ｄを発現するトランスフェクタントへの結合をＥＬＩＳＡで測定した。２つのＧＰＲＣ５Ｄバインダーが特定され、以下、５Ｅ１１（配列番号１３及び１４）及び５Ｆ１１（配列番号１５及び１６）という。特異的なバインダーを特定した後、ＩｇＧをＴ細胞二重特異性抗体に変換した。バインダーをＴ細胞二重特異性抗体に変換する原理は、例えば国際公開第２０１４／１３１７１２号（その全体が参照により本明細書に援用される）など、当技術分野で例示され、記載されている。Ｔ細胞二重特異性抗体は、図３に示すように、２つのＧＰＲＣ５Ｄ結合部分と１つのＣＤ３結合部分（抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体）を含む。以下の抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体を調製した：ｉ）５Ｅ１１－ＴＣＢ（配列番号１７、１８、１９、２０）；ｉｉ）５Ｆ１１－ＴＣＢ（配列番号２１、２２、２３、２４）；ｉｉｉ）ＥＴ１５０－５－ＴＣＢ（配列番号２５、２６、２７、２８）；ｉｖ）Ｂ７２－ＴＣＢ（配列番号７３、７４、７５、７６）；及びｖ）ＢＣＭＡ－ＴＣＢ（配列番号７７、７８、７９、８０）。ＥＴ１５０－５ ＧＰＲＣ５Ｄ結合部分は、国際公開第２０１６／０９０３２９号に記載されている。「ＥＴ－１５０－５」という用語は、本明細書では「ＥＴ１５０－５」という用語と同義的に使用され、その逆も同様である。陰性コントロールとして、非標的ＤＰ４７－ＴＣＢを調製した。ＤＰ４７－ＴＣＢは非標的Ｔ細胞二重特異性抗体であり、ＣＤ３にのみ結合し、ＧＰＲＣ５Ｄには結合しない。ＤＰ４７－ＴＣＢは、国際公開第２０１４／１３１７１２号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。Ｂ７２－ＴＣＢは、国際公開第２０１８／０１１７７８６号の表２３に開示されているＧＣＤＢ７２抗体に由来し、ＧＣＤＢ７２のＧＰＲＣ５Ｄ結合部分を含む。Ｂ７２－ＴＣＢは、ｃｒｏｓｓｍａｂ １＋１フォーマット（配列番号７３、７４、７５、７６）で生成された。ＢＣＭＡ－ＴＣＢは、国際公開第２０１６／１６６６２９号に由来し、そこに開示されているＡ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０１のＧＰＲＣ５Ｄ結合部分を含む。ＢＣＭＡ－ＴＣＢは、ｃｒｏｓｓｍａｂ ２＋１フォーマット（配列番号７７、７８、７９、８０）で生成された。
ＧＰＲＣ５Ｄバインダーの生成とＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の調製
ＧＰＲＣ５Ｄバインダーは、ラットのＤＮＡ免疫化と、それに続くハイブリドーマの生成、スクリーニング、及びハイブリドーマの配列決定によって生成された。特異的結合のスクリーニングは、ＧＰＲＣ５Ｄを発現するトランスフェクタントへの結合をＥＬＩＳＡで測定した。２つのＧＰＲＣ５Ｄバインダーが特定され、以下、５Ｅ１１（配列番号１３及び１４）及び５Ｆ１１（配列番号１５及び１６）という。特異的なバインダーを特定した後、ＩｇＧをＴ細胞二重特異性抗体に変換した。バインダーをＴ細胞二重特異性抗体に変換する原理は、例えば国際公開第２０１４／１３１７１２号（その全体が参照により本明細書に援用される）など、当技術分野で例示され、記載されている。Ｔ細胞二重特異性抗体は、図３に示すように、２つのＧＰＲＣ５Ｄ結合部分と１つのＣＤ３結合部分（抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体）を含む。以下の抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体を調製した：ｉ）５Ｅ１１－ＴＣＢ（配列番号１７、１８、１９、２０）；ｉｉ）５Ｆ１１－ＴＣＢ（配列番号２１、２２、２３、２４）；ｉｉｉ）ＥＴ１５０－５－ＴＣＢ（配列番号２５、２６、２７、２８）；ｉｖ）Ｂ７２－ＴＣＢ（配列番号７３、７４、７５、７６）；及びｖ）ＢＣＭＡ－ＴＣＢ（配列番号７７、７８、７９、８０）。ＥＴ１５０－５ ＧＰＲＣ５Ｄ結合部分は、国際公開第２０１６／０９０３２９号に記載されている。「ＥＴ－１５０－５」という用語は、本明細書では「ＥＴ１５０－５」という用語と同義的に使用され、その逆も同様である。陰性コントロールとして、非標的ＤＰ４７－ＴＣＢを調製した。ＤＰ４７－ＴＣＢは非標的Ｔ細胞二重特異性抗体であり、ＣＤ３にのみ結合し、ＧＰＲＣ５Ｄには結合しない。ＤＰ４７－ＴＣＢは、国際公開第２０１４／１３１７１２号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。Ｂ７２－ＴＣＢは、国際公開第２０１８／０１１７７８６号の表２３に開示されているＧＣＤＢ７２抗体に由来し、ＧＣＤＢ７２のＧＰＲＣ５Ｄ結合部分を含む。Ｂ７２－ＴＣＢは、ｃｒｏｓｓｍａｂ １＋１フォーマット（配列番号７３、７４、７５、７６）で生成された。ＢＣＭＡ－ＴＣＢは、国際公開第２０１６／１６６６２９号に由来し、そこに開示されているＡ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０１のＧＰＲＣ５Ｄ結合部分を含む。ＢＣＭＡ－ＴＣＢは、ｃｒｏｓｓｍａｂ ２＋１フォーマット（配列番号７７、７８、７９、８０）で生成された。
実施例３
Ｔ細胞二重特異性抗体の多発性骨髄腫細胞株への結合
ＧＰＲＣ５Ｄへの結合を測定するために、本発明者らは、報告されている多発性骨髄腫細胞株（Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ；Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．２００７ Ｍａｒ；４６（３）：２２６－３８）でＦＡＣＳベースの結合アッセイを行った。細胞株ＡＭＯ－１、Ｌ３６３、ＯＰＭ－２を、２０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）と１％ペニシリン－ストレプトマイシン１００Ｘ（Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。細胞株ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（陰性コントロール）を、１０％ＦＢＳのみを補充した同じ培地で培養した。細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９及びＲＰＭＩ－８２２６も、５０μＭのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ社）と１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社）を補充した同じ培地で培養した。これらの細胞株を７５ｃｍ２のフラスコ（ＴＰＰ社）内で週２回継代培養した。
Ｔ細胞二重特異性抗体の多発性骨髄腫細胞株への結合
ＧＰＲＣ５Ｄへの結合を測定するために、本発明者らは、報告されている多発性骨髄腫細胞株（Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ；Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．２００７ Ｍａｒ；４６（３）：２２６－３８）でＦＡＣＳベースの結合アッセイを行った。細胞株ＡＭＯ－１、Ｌ３６３、ＯＰＭ－２を、２０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）と１％ペニシリン－ストレプトマイシン１００Ｘ（Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。細胞株ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（陰性コントロール）を、１０％ＦＢＳのみを補充した同じ培地で培養した。細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９及びＲＰＭＩ－８２２６も、５０μＭのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ社）と１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社）を補充した同じ培地で培養した。これらの細胞株を７５ｃｍ２のフラスコ（ＴＰＰ社）内で週２回継代培養した。
異なる抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ抗体（５Ｅ１１－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＴＣＢ、ＥＴ１５０－５ ＴＣＢ）の結合を、間接染色を使用して評価した。これらの細胞を、抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢコンストラクト５Ｅ１１－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＴＣＢ又はＥＴ１５０－５ ＴＣＢと共に１０μｇ／ｍｌから０．０００６４μｇ／ｍｌの範囲で０．２倍の段階希釈を用いて、又はコンストラクトなしで、１００μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）中で、４℃で１時間インキュベートした。これらの細胞を、ＰＢＳで１：８００に希釈したＬｉｖｅ ｂｌｕｅ色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で４℃で２０分間染色した後、フローサイトメトリー染色バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で１／３００に希釈したＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ，Ｆｃγフラグメント特異的（PE conjugated Goat anti-human IgG, Fcγ fragment specific）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で染色し、４℃で３０分間インキュベートした。フローサイトメトリーの取得は、特注のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆｏｒｔｅｓｓａで行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（オレゴン州アシュランドのＴｒｅｅ Ｓｔａｒ社）とＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。
図４Ａ－Ｃは、５Ｅ１１－ＴＣＢと５Ｆ１１－ＴＣＢの両方が、試験したすべての多発性骨髄腫細胞株に用量依存的に結合することを示している。対照的に、ＥＴ１５０－５－ＴＣＢは、試験した細胞株との結合がかなり弱い。ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞（非ホジキンリンパ腫のＧＰＲＣ５Ｄ－細胞株）に対しては、抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢによる結合は認められなかった。
実施例４
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢを介したＴ細胞の細胞傷害性
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ抗体の機能性を測定するために、Ｔ細胞のｉｎ－ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを行った。簡単に説明すると、ＡＭＯ－１、Ｌ３６３、及びＯＰＭ－２細胞株を、２０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）と１％ペニシリン－ストレプトマイシン１００Ｘ（ＰＳ；Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。細胞株ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２を、１０％ＦＢＳのみを補充した同じ培地で培養した。細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９及びＲＰＭＩ－８２２６を、５０μＭのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ社）と１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社）を補充した同じ培地で培養した。これらの細胞株を７５ｃｍ２のフラスコ（ＴＰＰ社）内で週２回継代培養した。
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢを介したＴ細胞の細胞傷害性
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ抗体の機能性を測定するために、Ｔ細胞のｉｎ－ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを行った。簡単に説明すると、ＡＭＯ－１、Ｌ３６３、及びＯＰＭ－２細胞株を、２０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）と１％ペニシリン－ストレプトマイシン１００Ｘ（ＰＳ；Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。細胞株ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２を、１０％ＦＢＳのみを補充した同じ培地で培養した。細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９及びＲＰＭＩ－８２２６を、５０μＭのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ社）と１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社）を補充した同じ培地で培養した。これらの細胞株を７５ｃｍ２のフラスコ（ＴＰＰ社）内で週２回継代培養した。
これらの細胞株を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）＋１％ＰＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）中で、ヒトＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌアイソレーションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ社のバッフィーコート）から単離された３．１０５同種異系Ｔ細胞と、１：１０の標的：エフェクター比で共培養した。抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ抗体（５Ｅ１１－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＴＣＢ、ＥＴ１５０－５ ＴＣＢ又はＤＰ４７－ＴＣＢ）を、異なる濃度、０．１倍の段階希釈で１μｇ／ｍｌから０．０００００１μｇ／ｍｌの範囲、又は０μｇ／ｍｌで共培養物に加えた。３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした後、１ウェルあたり７５μｌの上清を、ＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１ウェルあたり２５μｌ入れた９６ウェルホワイトプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ社）に移した。室温で１５分間のインキュベーションの後、発光取得をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎで行い、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍとＸＬｆｉｔソフトウェアを使用して分析した。データは、ＬＤＨ放出の発光シグナルとしてプロットされている。
図５Ａ－Ｅは、５Ｅ１１－ＴＣＢと５Ｆ１１－ＴＣＢの両方が多発性骨髄腫細胞株、特にＮＣＩ－Ｈ９２９（図５Ｂ）、ＲＰＭＩ－８２２６（図５Ｃ）、Ｌ３６３（図５Ｄ）ＡＭＯ－１（図５Ａ）で強いＴ細胞の細胞傷害性を媒介したが、陰性コントロール株ＷＳＵ－ＤＬＣＬ２（図５Ｅ）では殺傷は認められたかったことを示している。対照的に、ＥＴ１５０－５－ＴＣＢは、試験した多発性骨髄腫細胞株ではほとんど殺傷を媒介しなかったか、又は媒介した殺傷は著しく少なかった。表１は、図５Ａ－Ｅに示されているデータから得られたＥＣ５０値をまとめたものである。ＥＣ５０値は、ＥｘｃｅｌのＸＬｆｉｔアドオン機能を用い、滴定したＴＣＢに対してシグナルの生データをプロットすることにより計算された。
表１． 抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ媒介性殺傷のＥＣ５０
実施例５
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢを介したＴ細胞活性化
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢの作用機序を解明するために、抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢの存在下で標的となる多発性骨髄腫細胞株と共培養した後のＴ細胞の活性化を測定した。実施例４及び図５Ａ－Ｅに記載の実験と同様に、これらの細胞株を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）＋１％ＰＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）中で、ヒトＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌアイソレーションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いてＰＢＭＣ（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ社のバッフィーコート）から単離された３．１０５同種異系Ｔ細胞と、１：１０の標的：エフェクター比で共培養した。抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ抗体（５Ｅ１１－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＴＣＢ、ＥＴ１５０－５－ＴＣＢ ＴＣＢ又はＤＰ４７－ＴＣＢ）を、異なる濃度、０．１倍の段階希釈で１μｇ／ｍｌから０．０００００１μｇ／ｍｌの範囲、又は０μｇ／ｍｌで共培養物に加えた。３７℃、５％ＣＯ２で２０時間のインキュベーション後、Ｔ細胞活性化を評価するためにこれらの細胞を染色した。細胞を最初に、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で１：８００に希釈したＬｉｖｅ ｂｌｕｅ色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で４℃で２０分間染色した。その後、フローサイトメトリー染色バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に入れたＡＦ７００抗ヒトＣＤ４（クローンＯＫＴ４）、ＢＶ７１１抗ヒトＣＤ８（クローンＳＫ１）、ＢＶ６０５抗ヒトＣＤ２５（クローンＢＣ９６）、ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ヒトＣＤ６９（クローンＦＮ５０）（いずれもＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）及びＰＥ－Ｃｙ５．５抗ヒトＣＤ３（クローンＳＫ７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で、４℃で３０分間細胞を染色した。フローサイトメトリーの取得は、特注のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆｏｒｔｅｓｓａで行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（オレゴン州アシュランドのＴｒｅｅ Ｓｔａｒ社）とＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢを介したＴ細胞活性化
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢの作用機序を解明するために、抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢの存在下で標的となる多発性骨髄腫細胞株と共培養した後のＴ細胞の活性化を測定した。実施例４及び図５Ａ－Ｅに記載の実験と同様に、これらの細胞株を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）＋１％ＰＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）中で、ヒトＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌアイソレーションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いてＰＢＭＣ（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ社のバッフィーコート）から単離された３．１０５同種異系Ｔ細胞と、１：１０の標的：エフェクター比で共培養した。抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ抗体（５Ｅ１１－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＴＣＢ、ＥＴ１５０－５－ＴＣＢ ＴＣＢ又はＤＰ４７－ＴＣＢ）を、異なる濃度、０．１倍の段階希釈で１μｇ／ｍｌから０．０００００１μｇ／ｍｌの範囲、又は０μｇ／ｍｌで共培養物に加えた。３７℃、５％ＣＯ２で２０時間のインキュベーション後、Ｔ細胞活性化を評価するためにこれらの細胞を染色した。細胞を最初に、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で１：８００に希釈したＬｉｖｅ ｂｌｕｅ色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で４℃で２０分間染色した。その後、フローサイトメトリー染色バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に入れたＡＦ７００抗ヒトＣＤ４（クローンＯＫＴ４）、ＢＶ７１１抗ヒトＣＤ８（クローンＳＫ１）、ＢＶ６０５抗ヒトＣＤ２５（クローンＢＣ９６）、ＡＰＣ－Ｃｙ７抗ヒトＣＤ６９（クローンＦＮ５０）（いずれもＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）及びＰＥ－Ｃｙ５．５抗ヒトＣＤ３（クローンＳＫ７；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で、４℃で３０分間細胞を染色した。フローサイトメトリーの取得は、特注のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆｏｒｔｅｓｓａで行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（オレゴン州アシュランドのＴｒｅｅ Ｓｔａｒ社）とＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。
図６は、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞との共培養物中で活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９をアップレギュレートすることにより５Ｆ１１－ＴＣＢがＴ細胞の活性化を誘導する一方、コントロール（例えば非標的ＤＰ４７－ＴＣＢやＴＣＢを含まないもの）はＴ細胞活性化を誘導しなかったことを示している。別の陰性コントロールとして、５Ｆ１１－ＴＣＢで処理したＴ細胞をＷＳＵ－ＤＬＣＬ２細胞と共培養したが、こちらもＴ細胞は活性化されなかった。これらの活性化プロファイルは、ＡＭＯ－１、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＲＰＭＩ－８２２６、Ｌ３６３など、我々が研究した複数の細胞株で一貫していた（図７Ａ－Ｊ）。殺傷効力の低さと一致して、ＥＴ１５０－５－ＴＣＢは、最高濃度である１ｍｇ／ｋｇを除いてＴ細胞の活性化を誘導しなかった。
実施例６
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢの局在化と内在化
ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞をＣＭＦＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で染色し、２４ウェルプレートのポリ－Ｌ－リジン（Ｓｉｇｍａ社）コートカバーガラス上に播種した。抗体（５Ｅ１１－ＩｇＧ、５Ｅ１１－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＩｇＧ、５Ｆ１１－ＴＣＢ）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７スクシンイミジルエステル（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ＃Ａ２０１１０６）をモル比２．５で標識した。細胞を３７℃で一晩接着させた後、蛍光タグ付き抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識５Ｅ１１－ＩｇＧ、－５Ｅ１１－ＴＣＢ、－５Ｆ１１－ＩｇＧ、－５Ｆ１１－ＴＣＢ）を異なる時間と温度（氷上で３０分、３７℃で１時間、３７℃で３時間）で増殖培地に直接添加した。冷ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて反応をクエンチし、各時点の後に未結合の抗体を洗い流した。その後、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ社）で４℃で２０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、カバーガラスを移し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）と共にスライドガラスにマウントし、イメージングの前に４℃で一晩暗所に置いた。蛍光共焦点顕微鏡法を、６０倍のオイル対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ社の倒立ＬＳＭ７００を使用して実施した。顕微鏡に接続されたＺｅｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ社）を使用して画像を収集し、ＩＭＡＲＩＳソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社）で視覚化した。図８Ａは、すべての抗体が４℃又は３７℃で多発性骨髄腫細胞株の表面（原形質膜）を染色したことを示している。抗体が細胞に内在する場合は、３７℃で培養すると、蛍光染色が細胞質に現れる。ＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞株ＧＰＲＣ５Ｄ結合ＩｇＧ又はＧＰＲＣ５Ｄ結合ＴＣＢの内在化は観察されなかった。これは、膜と細胞質で定義された関心領域からの強度の合計を適用することによってさらに確認された（３時間で（at three hours））。ＩＭＡＲＩＳソフトウェアを使用して、膜と細胞質のシグナル比を解析し、定量化した。図８Ｂは、異なる抗体とのインキュベーションの３時間後、膜と細胞質の強度比が約４で変化しなかったことを示しており、これは、蛍光シグナルが細胞質ではなく表面に集中していることを意味する。
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢの局在化と内在化
ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞をＣＭＦＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で染色し、２４ウェルプレートのポリ－Ｌ－リジン（Ｓｉｇｍａ社）コートカバーガラス上に播種した。抗体（５Ｅ１１－ＩｇＧ、５Ｅ１１－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＩｇＧ、５Ｆ１１－ＴＣＢ）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７スクシンイミジルエステル（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ＃Ａ２０１１０６）をモル比２．５で標識した。細胞を３７℃で一晩接着させた後、蛍光タグ付き抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識５Ｅ１１－ＩｇＧ、－５Ｅ１１－ＴＣＢ、－５Ｆ１１－ＩｇＧ、－５Ｆ１１－ＴＣＢ）を異なる時間と温度（氷上で３０分、３７℃で１時間、３７℃で３時間）で増殖培地に直接添加した。冷ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて反応をクエンチし、各時点の後に未結合の抗体を洗い流した。その後、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ社）で４℃で２０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、カバーガラスを移し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）と共にスライドガラスにマウントし、イメージングの前に４℃で一晩暗所に置いた。蛍光共焦点顕微鏡法を、６０倍のオイル対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ社の倒立ＬＳＭ７００を使用して実施した。顕微鏡に接続されたＺｅｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ社）を使用して画像を収集し、ＩＭＡＲＩＳソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ社）で視覚化した。図８Ａは、すべての抗体が４℃又は３７℃で多発性骨髄腫細胞株の表面（原形質膜）を染色したことを示している。抗体が細胞に内在する場合は、３７℃で培養すると、蛍光染色が細胞質に現れる。ＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞株ＧＰＲＣ５Ｄ結合ＩｇＧ又はＧＰＲＣ５Ｄ結合ＴＣＢの内在化は観察されなかった。これは、膜と細胞質で定義された関心領域からの強度の合計を適用することによってさらに確認された（３時間で（at three hours））。ＩＭＡＲＩＳソフトウェアを使用して、膜と細胞質のシグナル比を解析し、定量化した。図８Ｂは、異なる抗体とのインキュベーションの３時間後、膜と細胞質の強度比が約４で変化しなかったことを示しており、これは、蛍光シグナルが細胞質ではなく表面に集中していることを意味する。
実施例７
ＧＰＲＣ５Ｄバインダーの特性評価：ＥＬＩＳＡによる組換え細胞結合
ヒトＧＰＲＣ５Ｄ又はカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ又はマウスＧＰＲＣ５Ｄ又はヒトＧＰＲＣ５Ａのいずれかを発現する安定したトランスフェクトＣＨＯクローンを使用して、ＩｇＧとしての潜在的な主力候補抗体の結合を解析した。詳細には、新鮮培地を使用して、１０４個の細胞（生存率９８％以上）を３８４ウェルマイクロタイタープレート（ＢＤ ポリ－Ｄ－リジン、＃３５６６６２、容量：１ウェルあたり２５μｌ）に播種した。３７℃で一晩インキュベートした後、２５μｌ／ウェルの抗体希釈液（１ｘＰＢＳで１５×１：３希釈、アッセイ濃度は３０μｇ／ｍｌから）を４℃で２時間かけて細胞に添加した。９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（１０ｘＰＢＳ、ロッシュ、＃１１６６６７８９００１＋０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）を使用して１回の洗浄工程を行った後、５０μｌ／ウェルの０．０５％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号：Ｇ５８８２、１ｘＰＢＳ中）を加えて、室温（ＲＴ）で１０分間細胞を固定した。９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴを使用してさらに３回の洗浄工程を行った後、検出のために二次抗体を追加した。ヒト抗体については、ブロッキングバッファー（１ｘＰＢＳ（ロッシュ ＃１１６６６７８９００１）＋２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン画分Ｖ、脂肪酸不含、ロッシュ、＃１０７３５０８６００１）＋０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１：２０００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇ κ鎖抗体ＨＲＰコンジュゲート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社 ＃ＡＰ５０２Ｐ）を使用した（２５μｌ／ウェル）。ラット抗体については、ヤギ抗ラットＩｇＧ１抗体ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ社 ＃Ａ１１０－１０６Ｐ）、ヤギ抗ラットＩｇＧ２ａ抗体ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ社 ＃Ａ１１０－１０９Ｐ）、及びヤギ抗ラットＩｇＧ２ｂ抗体ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ社 ＃Ａ１１０－１１１Ｐ）の混合物を、各抗体をブロッキングバッファーで１：１００００に希釈して使用した（２５μｌ／ｗｅｌｌ）。ＲＴで１時間インキュベートし、９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴを使用してさらに３回の洗浄工程を行った後、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（ロッシュ注文番号１１８３５０３３００１）を１０分間添加し、最終的なＯＤまでの発色が３７０ｎｍ／４９２ｎｍでの測定により決定された。
ＧＰＲＣ５Ｄバインダーの特性評価：ＥＬＩＳＡによる組換え細胞結合
ヒトＧＰＲＣ５Ｄ又はカニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ又はマウスＧＰＲＣ５Ｄ又はヒトＧＰＲＣ５Ａのいずれかを発現する安定したトランスフェクトＣＨＯクローンを使用して、ＩｇＧとしての潜在的な主力候補抗体の結合を解析した。詳細には、新鮮培地を使用して、１０４個の細胞（生存率９８％以上）を３８４ウェルマイクロタイタープレート（ＢＤ ポリ－Ｄ－リジン、＃３５６６６２、容量：１ウェルあたり２５μｌ）に播種した。３７℃で一晩インキュベートした後、２５μｌ／ウェルの抗体希釈液（１ｘＰＢＳで１５×１：３希釈、アッセイ濃度は３０μｇ／ｍｌから）を４℃で２時間かけて細胞に添加した。９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（１０ｘＰＢＳ、ロッシュ、＃１１６６６７８９００１＋０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）を使用して１回の洗浄工程を行った後、５０μｌ／ウェルの０．０５％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号：Ｇ５８８２、１ｘＰＢＳ中）を加えて、室温（ＲＴ）で１０分間細胞を固定した。９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴを使用してさらに３回の洗浄工程を行った後、検出のために二次抗体を追加した。ヒト抗体については、ブロッキングバッファー（１ｘＰＢＳ（ロッシュ ＃１１６６６７８９００１）＋２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン画分Ｖ、脂肪酸不含、ロッシュ、＃１０７３５０８６００１）＋０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１：２０００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇ κ鎖抗体ＨＲＰコンジュゲート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社 ＃ＡＰ５０２Ｐ）を使用した（２５μｌ／ウェル）。ラット抗体については、ヤギ抗ラットＩｇＧ１抗体ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ社 ＃Ａ１１０－１０６Ｐ）、ヤギ抗ラットＩｇＧ２ａ抗体ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ社 ＃Ａ１１０－１０９Ｐ）、及びヤギ抗ラットＩｇＧ２ｂ抗体ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ社 ＃Ａ１１０－１１１Ｐ）の混合物を、各抗体をブロッキングバッファーで１：１００００に希釈して使用した（２５μｌ／ｗｅｌｌ）。ＲＴで１時間インキュベートし、９０μｌ／ウェルのＰＢＳＴを使用してさらに３回の洗浄工程を行った後、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（ロッシュ注文番号１１８３５０３３００１）を１０分間添加し、最終的なＯＤまでの発色が３７０ｎｍ／４９２ｎｍでの測定により決定された。
試験したすべての抗体は、ｐＭの範囲のＥＣ５０値（アビディティを反映）でヒトＧＰＲＣ５Ｄへの正の結合を示した。ラットＩｇＧの１０Ｂ１０と０７Ａ０４のみが、ヒトバージョンの受容体に匹敵するＥＣ５０値でカニクイザルのＧＰＲＣ５Ｄを発現するＣＨＯ細胞に対して交差反応性を示した（図９）。カニクイザル交差反応性は、他のすべての抗体についても検出されたが、１０Ｂ１０及び０７Ａ０４と比較して低レベルであった（図９）。マウスＧＰＲＣ５Ｄを発現するＣＨＯ細胞への有意な結合はなく、ヒトバージョンのＧＰＲＣ５Ａを発現するＣＨＯ細胞への結合も検出されなかった（図９）。結合のＥＣ５０値を表２にまとめた。
表２． 種横断的なＧＰＲＣ５ＤへのＥＬＩＳＡベースの結合特性
実施例８
ＧＰＲＣ５Ｄバインダー：組換えＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢはＭＭ細胞株に対するＴ細胞の細胞傷害性を媒介する。
ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ又は他の標的ＴＣＢの機能性を比較するために、本発明者らは、複数のＭＭ細胞株：ＭＯＬＰ－２（図１０Ｂ）、ＡＭＯ－１（図１０Ｃ）、ＥＪＭ（図１０Ｄ）、及びＮＣＩ－Ｈ９２９（図１０Ｇ）でＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを実施した。簡単に説明すると、細胞株を、２０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）と１％ペニシリン－ストレプトマイシン１００Ｘ（ＰＳ；Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。ＭＯＬＰ－２を、ＧｌｕｔａＭａｘ １Ｘ（Ｇｉｂｃｏ社）を補充したこの培地で培養した。ＯＰＭ－２（図１０Ａ）、ＲＰＭＩ－８２２６（図１０Ｅ）及びＬ－３６３（図１０Ｆ）細胞株を、１０％ＦＢＳのみを補充したこの培地で培養した。ＮＣＩ－Ｈ９２９を、５０μＭのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ社）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社）及びＧｌｕｔａＭａｘ １Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したこの培地で培養した。ＥＪＭを、ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）及び１％ＰＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。すべての細胞株を７５ｃｍ２フラスコ（ＴＰＰ社）内で週２回継代培養した。
ＧＰＲＣ５Ｄバインダー：組換えＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢはＭＭ細胞株に対するＴ細胞の細胞傷害性を媒介する。
ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ又は他の標的ＴＣＢの機能性を比較するために、本発明者らは、複数のＭＭ細胞株：ＭＯＬＰ－２（図１０Ｂ）、ＡＭＯ－１（図１０Ｃ）、ＥＪＭ（図１０Ｄ）、及びＮＣＩ－Ｈ９２９（図１０Ｇ）でＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを実施した。簡単に説明すると、細胞株を、２０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）と１％ペニシリン－ストレプトマイシン１００Ｘ（ＰＳ；Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。ＭＯＬＰ－２を、ＧｌｕｔａＭａｘ １Ｘ（Ｇｉｂｃｏ社）を補充したこの培地で培養した。ＯＰＭ－２（図１０Ａ）、ＲＰＭＩ－８２２６（図１０Ｅ）及びＬ－３６３（図１０Ｆ）細胞株を、１０％ＦＢＳのみを補充したこの培地で培養した。ＮＣＩ－Ｈ９２９を、５０μＭのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ社）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社）及びＧｌｕｔａＭａｘ １Ｘ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したこの培地で培養した。ＥＪＭを、ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）及び１％ＰＳ（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。すべての細胞株を７５ｃｍ２フラスコ（ＴＰＰ社）内で週２回継代培養した。
細胞株を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）＋１％ＰＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ社）中で、ヒトＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌアイソレーションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いてＰＢＭＣ（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ社のバフィーコート）から単離された０．３百万個の同種異系Ｔ細胞を使用して、１０対１のエフェクター対標的比で共培養した。抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢコンストラクト（５Ｅ１１－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＴＣＢ、１０Ｂ１０－ＴＣＢ、Ｂ７２－ＴＣＢ、ＢＣＭＡ－ＴＣＢ、及びＤＰ４７－ＴＣＢ）を、段階希釈１／１０の１２．５ｎＭから０．００００１２５ｎＭまでの異なる濃度で該共培養物に加え、未処理試料と比較した。３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした後、１ウェルあたり７５μｌの上清を、ＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１ウェルあたり２５μｌ入れた９６ウェルホワイトプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ社）に移した。室温で１５分間のインキュベーションの後、発光取得をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎで行い、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰｒｉｓｍとＸＬｆｉｔソフトウェアを使用して解析した。データは、ＬＤＨ放出の発光シグナルとしてプロットされている（図１０）。図１０Ａ－Ｇは、５Ｅ１１－ＴＣＢと５Ｆ１１－ＴＣＢの両方がＢＣＭＡ－ＴＣＢ、１０Ｂ１０－ＴＣＢ、及びＢ７２－ＴＣＢによりもＭＭ細胞株に対してより強いＴ細胞の細胞傷害性を媒介したことを示すデータをまとめたものである。異なるドナーＴ細胞（ｎ＝２又はｎ＝３）での異なる実験からの平均として計算されている、ＴＣＢ媒介性殺傷のＥＣ５０を表３に示す。
表３． ｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷アッセイでのＥＣ５０値
実施例９
健康なヒト骨髄細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏＴ細胞活性化
４つの健康なドナーの新鮮な未処理の骨髄（Ｌｏｎｚａ ＃１Ｍ－１０５、ロット００００７３９２５４；００００７３９２５５；００００７３９２５６、００００７３４００８）を試料採取の１日又は２日後に処理した。ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｉｓバッファー（ＢＤ社 ＃５５５８９９；滅菌水中１Ｘ）を使用して室温で５分間迅速に赤血球を溶解した後、細胞を遠心分離とバッファー交換でそれぞれ１２６ｇ、４４３ｇで２回洗浄した。細胞をカウントし、ＲＰＭＩ １６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ ＋２０％ＨＩウシ胎児血清＋２％ヒト血清＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（いずれもＧｉｂｃｏ社製）に３０００００細胞／ｍＬで再懸濁させ、９６ウェルプレート丸底（ＴＰＰ社）に１ウェルあたり１００μＬの細胞懸濁液を播種した。培地又はＢ７２－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＴＣＢ、５Ｅ１１－ＴＣＢ、ＢＣＭＡ－ＴＣＢ、１０Ｂ１０－ＴＣＢ若しくはＤＰ４７－ＴＣＢを２００ｎＭ（４Ｘ）から２０ｐＭまで段階希釈１／１０で補充した培地を１ウェルあたり５０μＬ添加した。最後に、Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、＃１３０－０９６－５３５）を使用して健康なドナーのＰＢＭＣから単離した５０μＬの同種異系Ｔ細胞を６Ｍｉｏ／ｍＬ（エフェクターＴ対健康な骨髄標的細胞の比は１０：１）で添加した。加湿インキュベーター内で３７℃で一晩培養した後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳで１／８００に希釈したＬｉｖｅ ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃Ｌ２３１０５）５０μＬで４℃で２０分間染色した。洗浄後、細胞をＦＡＣバッファー（ＰＢＳ １Ｘ、２％ウシ胎児血清；１％０．５ｍ ＥＤＴＡ ＰＨ８；０．２５％ＮａＮ３アジ化ナトリウム（２０％））で希釈した以下のミックス抗体と４℃で３０分間インキュベートした：ＣＤ２５ ＢＶ６０５、ＣＤ６９ ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＢＣＭＡ ＢＶ４２１、ＣＤ３８ ＢＶ５１０、ＣＤ１３８ ＦＩＴＣ、ＦｃＲＨ５ ＰＥ（１／１００希釈）、ＣＤ８ ＢＶ７１１、ＣＤ３ ＰＥ－Ｃｙ５、ＣＨいずれもＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）と、ＧＰＲＣ５Ｄ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７（自社製、クローン５Ｅ１１ ＩｇＧ）。洗浄後、細胞を１００μＬのＦＡＣバッファーに再懸濁させ、Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で取得した。
健康なヒト骨髄細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏＴ細胞活性化
４つの健康なドナーの新鮮な未処理の骨髄（Ｌｏｎｚａ ＃１Ｍ－１０５、ロット００００７３９２５４；００００７３９２５５；００００７３９２５６、００００７３４００８）を試料採取の１日又は２日後に処理した。ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｉｓバッファー（ＢＤ社 ＃５５５８９９；滅菌水中１Ｘ）を使用して室温で５分間迅速に赤血球を溶解した後、細胞を遠心分離とバッファー交換でそれぞれ１２６ｇ、４４３ｇで２回洗浄した。細胞をカウントし、ＲＰＭＩ １６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ ＋２０％ＨＩウシ胎児血清＋２％ヒト血清＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（いずれもＧｉｂｃｏ社製）に３０００００細胞／ｍＬで再懸濁させ、９６ウェルプレート丸底（ＴＰＰ社）に１ウェルあたり１００μＬの細胞懸濁液を播種した。培地又はＢ７２－ＴＣＢ、５Ｆ１１－ＴＣＢ、５Ｅ１１－ＴＣＢ、ＢＣＭＡ－ＴＣＢ、１０Ｂ１０－ＴＣＢ若しくはＤＰ４７－ＴＣＢを２００ｎＭ（４Ｘ）から２０ｐＭまで段階希釈１／１０で補充した培地を１ウェルあたり５０μＬ添加した。最後に、Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、＃１３０－０９６－５３５）を使用して健康なドナーのＰＢＭＣから単離した５０μＬの同種異系Ｔ細胞を６Ｍｉｏ／ｍＬ（エフェクターＴ対健康な骨髄標的細胞の比は１０：１）で添加した。加湿インキュベーター内で３７℃で一晩培養した後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳで１／８００に希釈したＬｉｖｅ ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃Ｌ２３１０５）５０μＬで４℃で２０分間染色した。洗浄後、細胞をＦＡＣバッファー（ＰＢＳ １Ｘ、２％ウシ胎児血清；１％０．５ｍ ＥＤＴＡ ＰＨ８；０．２５％ＮａＮ３アジ化ナトリウム（２０％））で希釈した以下のミックス抗体と４℃で３０分間インキュベートした：ＣＤ２５ ＢＶ６０５、ＣＤ６９ ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＢＣＭＡ ＢＶ４２１、ＣＤ３８ ＢＶ５１０、ＣＤ１３８ ＦＩＴＣ、ＦｃＲＨ５ ＰＥ（１／１００希釈）、ＣＤ８ ＢＶ７１１、ＣＤ３ ＰＥ－Ｃｙ５、ＣＨいずれもＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）と、ＧＰＲＣ５Ｄ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７（自社製、クローン５Ｅ１１ ＩｇＧ）。洗浄後、細胞を１００μＬのＦＡＣバッファーに再懸濁させ、Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で取得した。
図１１Ａ－Ｆのデータは、Ｂ７２－ＴＣＢが健康な骨髄中のＴ細胞の非特異的な活性化（ＣＤ６９のアップレギュレーションで測定）を誘導したが、他の試験したＴＣＢでは誘導されなかったことを示している。示されているように、Ｂ７２－ＴＣＢによって誘発された非特異的な活性化は濃度依存的な効果であり、５ｎｍよりも５０ｎｍでより顕著であった（図１２Ａ及び１２Ｂ）。
実施例１０
ＴＣＢのｉｎ ｖｉｖｏ有効性
有効性研究では、完全にヒト化されたＮＳＧマウスを有する多発性骨髄腫における腫瘍縮小に関して、異なるＴＣＢコンストラクト（ＧＰＲＣ５Ｄ ５Ｆ１１０－ＴＣＢ、５Ｅ１１－ＴＣＢ、ＢＣＭＡ－ＴＣＢ、Ｂ７２－ＴＣＢ）が比較された。もともと、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞はＡＴＣＣから、ＯＰＭ－２細胞はＤＳＭＺから入手した。両方の細胞株を増殖させた。細胞を、１０％ＦＣＳと２ｍＭのＬ－グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有するＲＰＭＩで培養した。これらの細胞は、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気中３７℃で培養された。動物１頭あたり２．５ｘ１０６個のＮＣＩ－Ｈ９２９細胞及び５ｘ１０６個のＯＰＭ－２細胞をＲＰＭＩ細胞培地（Ｇｉｂｃｏ社）とＧＦＲマトリゲル（１：１、総量１００μｌ）に９５．０％を上回る生存率で入れ、動物の右脇腹に皮下注射した。
ＴＣＢのｉｎ ｖｉｖｏ有効性
有効性研究では、完全にヒト化されたＮＳＧマウスを有する多発性骨髄腫における腫瘍縮小に関して、異なるＴＣＢコンストラクト（ＧＰＲＣ５Ｄ ５Ｆ１１０－ＴＣＢ、５Ｅ１１－ＴＣＢ、ＢＣＭＡ－ＴＣＢ、Ｂ７２－ＴＣＢ）が比較された。もともと、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞はＡＴＣＣから、ＯＰＭ－２細胞はＤＳＭＺから入手した。両方の細胞株を増殖させた。細胞を、１０％ＦＣＳと２ｍＭのＬ－グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有するＲＰＭＩで培養した。これらの細胞は、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気中３７℃で培養された。動物１頭あたり２．５ｘ１０６個のＮＣＩ－Ｈ９２９細胞及び５ｘ１０６個のＯＰＭ－２細胞をＲＰＭＩ細胞培地（Ｇｉｂｃｏ社）とＧＦＲマトリゲル（１：１、総量１００μｌ）に９５．０％を上回る生存率で入れ、動物の右脇腹に皮下注射した。
メスＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（実験開始時に４－５週齢）（フランス、リオンのＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒにて飼育）を、約束されたガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、特定の病原体がない条件下、１２時間明所／１２時間暗所の日周期で維持した。実験研究プロトコールが地方自治体により審査及び承認された（ＲＯＢ－５５．２－２５３２．Ｖｅｔ＿０３－１６－１０）。動物は、到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。
プロトコールに従い、メスＮＯＧマウスに１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンをｉ．ｐ．（腹腔内）注射し、続いて翌日に臍帯血から単離された１ｘ１０５個のヒト造血幹細胞をｉ．ｖ．注射した。幹細胞の注射から１６－２０週で、マウスから採血し、血液を、ヒト化の成功についてフローサイトメトリーで分析した。効率的に移植されたマウスを、それらのヒトＴ細胞頻度に従って異なる処置群にランダム化した（ｎ＝１０／群）。その時点で、上述のようにマウスに腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍サイズが約２００ｍｍ３に到達したときに化合物又はＰＢＳ（ビヒクル）で週１回処置した。すべてのマウスに、異なる用量のＴＣＢ分子を静脈内注射した（図１３Ａ－Ｄ及び１４Ａ－Ｄ参照）。
適切な量の化合物を得るために、原液をヒスチジンバッファー（２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で希釈した。腫瘍増殖をノギスを使用して週に２回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した。
Ｔｖ：（Ｗ２／２）ｘＬ（Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
Ｔｖ：（Ｗ２／２）ｘＬ（Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
研究を終了して、化合物を４回注射した後にすべてのマウスを殺処分し、腫瘍を外植して重量を測定した。
図１３Ａ－Ｄは、ＮＣｌ－Ｈ９２９注射を受けたすべての動物における、処置後の腫瘍増殖動態を示している。５Ｆ１１－ＴＣＢは、１ｍｇ／ｋｇ又は０．１ｍｇ／ｋｇのいずれかで、すべての動物において完全な腫瘍寛解を誘導した（図１３Ａ）が、Ｂ７２－ＴＣＢは、１ｍｇ／ｋｇで使用した場合、部分的な腫瘍寛解を示すのみであり、０．１ｍｇ／ｋｇでは効果がなかった（図１３Ｃ）。ＢＣＭＡ－ＴＣＢも１ｍｇ／ｋｇで部分的な腫瘍寛解を誘導した（図１３Ｂ）。
図１４Ａ－Ｄは、ＯＰＭ－２注射を受けたすべての動物における、処置後の腫瘍増殖動態を示している。５Ｆ１１－ＴＣＢ（図１４Ａ、上段）及び５Ｅ１１－ＴＣＢ（図１４Ｂ、上段）は、０．１ｍｇ／ｋｇで大多数の動物において完全な腫瘍寛解を誘導したのに対し、０．１ｍｇ／ｋｇのＢ７２－ＴＣＢ（図１４Ｃ、上段）は、腫瘍増殖を抑制する力が弱かった。０．０１ｍｇ／ｋｇの５Ｆ１１－ＴＣＢ（図１４Ａ、下段）及び５Ｅ１１－ＴＣＢ（図１４Ｂ、下段）は、Ｂ７２－ＴＣＢ（図１４Ｃ、下段）と比べて、腫瘍増殖を阻害する力が強かった。
実施例１１
抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のヒト化
適切なヒトアクセプターフレームワークを、ヒトＶ領域配列及びＪ領域配列のＢＬＡＳＴｐデータべースにマウス入力配列（可変部分にクロッピング）をクエリすることによって特定した。ヒトアクセプターフレームワークの選択基準には、配列相同性、ＣＤＲの長さが同じか類似していること、及びヒト生殖細胞系列の予測度数だけではなく、ＶＨ－ＶＬドメイン界面における特定のアミノ酸の保存もあった。生殖細胞系列を同定する工程に続いて、マウスの入力配列のＣＤＲをヒトアクセプターフレームワーク領域に移植した。これらの初期ＣＤＲ移植片と親抗体との間の各アミノ酸の違いは、それぞれの可変領域の構造的完全性に対する影響の可能性について評価され、適切と思われる場合には親配列に対する「逆突然変異」が導入された。構造評価は、ＢＩＯＶＩＡ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔバージョン１７Ｒ２を使用して実装された自社の抗体構造ホモロジーモデリングプロトコールで作成した、親抗体とヒト化バリアントの両方のＦｖ領域ホモロジーモデルに基づいて行った。一部のヒト化バリアントには、「正突然変異」、すなわち、親のバインダーの所定のＣＤＲ位置で発生する元のアミノ酸をヒトのアクセプター生殖細胞系列の同等の位置で見られるアミノ酸に変更するアミノ酸交換が含まれていた。その目的は、ヒト化バリアントの全体的なヒトの特性を（フレームワーク領域を超えて）高め、免疫原性リスクをさらに低減することにある。
抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のヒト化
適切なヒトアクセプターフレームワークを、ヒトＶ領域配列及びＪ領域配列のＢＬＡＳＴｐデータべースにマウス入力配列（可変部分にクロッピング）をクエリすることによって特定した。ヒトアクセプターフレームワークの選択基準には、配列相同性、ＣＤＲの長さが同じか類似していること、及びヒト生殖細胞系列の予測度数だけではなく、ＶＨ－ＶＬドメイン界面における特定のアミノ酸の保存もあった。生殖細胞系列を同定する工程に続いて、マウスの入力配列のＣＤＲをヒトアクセプターフレームワーク領域に移植した。これらの初期ＣＤＲ移植片と親抗体との間の各アミノ酸の違いは、それぞれの可変領域の構造的完全性に対する影響の可能性について評価され、適切と思われる場合には親配列に対する「逆突然変異」が導入された。構造評価は、ＢＩＯＶＩＡ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔバージョン１７Ｒ２を使用して実装された自社の抗体構造ホモロジーモデリングプロトコールで作成した、親抗体とヒト化バリアントの両方のＦｖ領域ホモロジーモデルに基づいて行った。一部のヒト化バリアントには、「正突然変異」、すなわち、親のバインダーの所定のＣＤＲ位置で発生する元のアミノ酸をヒトのアクセプター生殖細胞系列の同等の位置で見られるアミノ酸に変更するアミノ酸交換が含まれていた。その目的は、ヒト化バリアントの全体的なヒトの特性を（フレームワーク領域を超えて）高め、免疫原性リスクをさらに低減することにある。
自社開発のｉｎ ｓｉｌｉｃｏツールを使用して、対になったＶＨヒト化バリアントとＶＬヒト化バリアントのＶＨ－ＶＬドメイン配向を（参照により全体が援用される国際公開第２０１６／０６２７３４号のように）予測した。その結果を、親バインダーの予測されたＶＨ－ＶＬドメイン配向と比較して、ジオメトリが元の抗体に近いフレームワークの組み合わせを選択した。合理的には、ＶＨ－ＶＬ界面領域で起こりうるアミノ酸の交換を検出することで、２つのドメインのペアリングに破壊的な変化をもたらし、ひいては結合特性に有害な影響を与える可能性がある。
アクセプターフレームワークの選択とＧＰＲＣ５Ｄバインダー５Ｅ１１へのその適合
以下の表４に従ってアクセプターフレームワークを選択した。
以下の表４に従ってアクセプターフレームワークを選択した。
表４． ＧＰＲＣ５Ｄバインダー５Ｅ１１のためのアクセプターフレームワーク
構造上の考慮事項に基づいて、５Ｅ１１ヒト化バリアントの特定の位置に、ヒトアクセプターフレームワークから親バインダーのアミノ酸への逆突然変異を導入した（表５及び６）。さらに、いくつかの位置が、親バインダーのＣＤＲ内のアミノ酸がヒトアクセプターの生殖細胞系列に見られるアミノ酸で置換されている正突然変異の有望な候補として特定された。その変化は、下の表に詳述されている。
注：逆突然変異の前にはｂが、正突然変異にはｆが付いている。例えばｂＳ４９Ａは、４９位におけるセリンからアラニンへの逆突然変異（ヒト生殖細胞系列アミノ酸から親抗体アミノ酸）を指す。残基インデックスはすべて、Ｋａｂａｔ番号付けで示されている。
表５． ＶＨ／ＶＬ ５Ｅ１１ヒト化バリアントのリスト
表６． ＶＨ／ＶＬ ５Ｅ１１ヒト化バリアントの配列
アクセプターフレームワークの選択とＧＰＲＣ５Ｄバインダー５Ｆ１１へのその適合
以下の表７に従ってアクセプターフレームワークを選択した。
以下の表７に従ってアクセプターフレームワークを選択した。
表７． ＧＰＲＣ５Ｄバインダー５Ｆ１１のためのアクセプターフレームワーク
構造上の考慮事項に基づいて、５Ｆ１１ヒト化バリアントの特定の位置に、ヒトアクセプターフレームワークから親バインダーのアミノ酸への逆突然変異を導入した（表８及び９）。さらに、いくつかの位置が、親バインダーのＣＤＲ内のアミノ酸がヒトアクセプターの生殖細胞系列に見られるアミノ酸で置換されている正突然変異の有望な候補として特定された。その変化は、下の表に詳述されている。
注：逆突然変異の前にはｂが、正突然変異にはｆが付いている。例えばｂＡ９３Ｔは、９３位におけるアラニンからスレオニンへの逆突然変異（ヒト生殖細胞系列アミノ酸から親抗体アミノ酸）を指す。残基インデックスはすべて、Ｋａｂａｔ番号付けで示されている。
表８． ＶＨ／ＶＬ ５Ｆ１１ヒト化バリアントのリスト
表９． ＶＨ／ＶＬ ５Ｆ１１ヒト化バリアントの配列
ＥＬＩＳＡによるヒト化バリアントの特性評価
ＧＰＲＣ５ＤバインダーのＶＨ及びＶＬドメインのヒト化バリアントの特性評価のために、上述のＥＬＩＳＡプロトコールを使用した（実施例７参照）。そのデータを、５Ｅ１１のヒト化バリアントについては表１０に、５Ｆ１１のヒト化バリアントについては表１１にまとめた。表１２は、親５Ｅ１１及び親５Ｅ１１のＣＤＲ配列、並びに選択されたヒト化バリアントのＣＤＲ配列を示す。
ＧＰＲＣ５ＤバインダーのＶＨ及びＶＬドメインのヒト化バリアントの特性評価のために、上述のＥＬＩＳＡプロトコールを使用した（実施例７参照）。そのデータを、５Ｅ１１のヒト化バリアントについては表１０に、５Ｆ１１のヒト化バリアントについては表１１にまとめた。表１２は、親５Ｅ１１及び親５Ｅ１１のＣＤＲ配列、並びに選択されたヒト化バリアントのＣＤＲ配列を示す。
表１０． ５Ｅ１１のヒト化バリアントの特性評価
表１０の続き
表１１． ５Ｆ１１ヒト化バリアントの特性評価
表１１の続き
表１２． 選択されたヒト化バリアントのＣＤＲ配列
実施例１２
選択された抗ＧＰＲＣ５Ｄ ＩｇＧの異なるヒト化バリアントの存在下でのＣＡＲ－Ｊ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化
ＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊエフェクター細胞を活性化するための異なるヒト化抗ＧＰＲＣ５ＤＩｇＧの能力を、以下に記載するように評価した。ＧＰＲＣ５Ｄを発現する多発性骨髄腫標的細胞Ｌ３６３（Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｕｔ ３６：３３１－３３８（１９７８））を、抗ＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊエフェクター細胞（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ第２０１８／０８６０３８号及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ第２０１８／０８６０６７号に開示されているように、ＩｇＧ分子のＦｃ部分にあるＰＧＬＡＬＡ（Ｐ３２９Ｇ Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ）変異に対してＴＣＲを発現し、ＮＦＡＴプロモーターを含むＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株）と共培養した。Ｌ３６３細胞とＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊ細胞のＧＰＲＣ５ＤにＩｇＧ分子が同時に結合すると、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、活性ホタルルシフェラーゼが発現するようになる。
選択された抗ＧＰＲＣ５Ｄ ＩｇＧの異なるヒト化バリアントの存在下でのＣＡＲ－Ｊ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化
ＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊエフェクター細胞を活性化するための異なるヒト化抗ＧＰＲＣ５ＤＩｇＧの能力を、以下に記載するように評価した。ＧＰＲＣ５Ｄを発現する多発性骨髄腫標的細胞Ｌ３６３（Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｕｔ ３６：３３１－３３８（１９７８））を、抗ＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊエフェクター細胞（ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ第２０１８／０８６０３８号及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ第２０１８／０８６０６７号に開示されているように、ＩｇＧ分子のＦｃ部分にあるＰＧＬＡＬＡ（Ｐ３２９Ｇ Ｌ２３４Ａ Ｌ２３５Ａ）変異に対してＴＣＲを発現し、ＮＦＡＴプロモーターを含むＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株）と共培養した。Ｌ３６３細胞とＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊ細胞のＧＰＲＣ５ＤにＩｇＧ分子が同時に結合すると、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、活性ホタルルシフェラーゼが発現するようになる。
アッセイのために、ヒト化ＩｇＧバリアントをＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｌｕｔａｍａｘ、１５％ＨＩウシ胎児血清、１％ペニシリン－ストレプトマイシン含有；いずれもＧＩＢＣＯ社製）で希釈し、丸底９６ウェルプレートに移した（最終濃度は０．２ｐｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌまで）。１ウェルあたり２００００個のＬ３６３細胞と抗ＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊエフェクター細胞を加え、エフェクター（抗ＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊ）対標的（Ｌ３６３）細胞の最終的な比を５：１とし、１ウェルあたりの最終的な容量を２００μｌとした。細胞を、加湿インキュベーター内でおよそ１６時間、３７℃でインキュベートした。インキュベーション時間の終了後、１００μｌ／ウェルの上清を白い平底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社）に移し、さらに１００μｌ／ウェルのＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ社）と５分間インキュベートした後、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＥｎｖｉｓｉｏｎを使用して発光を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して列データをＩｇＧ濃度に対する相対発光シグナル（ＲＬＵ）としてプロットし、ＸＬ－ｆｉｔソフトウェアを使用してＥＣ５０を計算した。
図１５Ａ－Ｂと表１３に示すように、評価したすべてのＧＰＲＣ５Ｄ ＩｇＧは、ＧＰＲＣ５Ｄを発現する標的細胞と抗ＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊ細胞に同時に結合すると、ＣＡＲ－Ｊの活性化を誘導する。抗ＧＰＲＣ５Ｄバインダー５Ｆ１１と５Ｅ１１の両方について、ヒト化バリアントは、ヒト化前の親抗体と比較して同等又は向上したＥＣ５０値で特定することができた。バインダー５Ｆ１１の場合、分子Ｐ１ＡＥ５７４１によって最も強い活性化が誘導された（図１５Ａ）。バインダー５Ｅ１１の場合、分子Ｐ１ＡＥ５７３０とＰ１ＡＥ５７２３によって最も強い活性化が誘導された（図１５Ｂ）。
表１３． ＣＡＲ－Ｊ活性化のＥＣ５０値
実施例１３
さらなるＴ細胞二重特異性抗体の調製
バインダーをＴ細胞二重特異性抗体に変換する原理は、例えば国際公開第２０１４／１３１７１２号（その全体が参照により本明細書に援用される）など、当技術分野で例示され、記載されている。Ｔ細胞二重特異性抗体は、図３に示すように、２つのＧＰＲＣ５Ｄ結合部分と１つのＣＤ３結合部分（抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体）を含む。以下の抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体を調製した：ｉ）６６２３（配列番号１１４、１１５、１１６、１１７）；ｉｉ）６６２４（配列番号１１８、１１９、１２０、１２１）；ｉｉｉ）６６２５（配列番号１２２、１２３、１２４、１２５）；ｉｖ）６６２６（配列番号１２６、１２７、１２８、１２９）。ＤＰ４７－ＴＣＢ（「非標的ＴＣＢ」）は、国際公開第２０１４／１３１７１２号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。Ｂ７２ ＴＣＢは、国際公開第２０１８／０１１７７８６号の表２３に開示されているＧＣＤＢ７２抗体に由来し、ＧＣＤＢ７２のＧＰＲＣ５Ｄ結合部分を含む（実施例７）。用語「Ｂ７２ ＴＣＢ」という用語は、本明細書では「Ｂ７２」という用語も指す。ＢＣＭＡ－ＴＣＢは、国際公開第２０１６／１６６６２９号に由来し、そこに開示されているＡ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０１のＧＰＲＣ５Ｄ結合部分を含む。ＢＣＭＡ－ＴＣＢは、実施例２に記載されているとおり、ｃｒｏｓｓｍａｂ ２＋１フォーマット（配列番号７７、７８、７９、８０）で生成された。「５Ｆ１１－ＴＣＢ」及び「５Ｆ１１ｐ－ＣＨ２５２７」という用語は、本明細書では互換的に使用される。「５Ｅ１１－ＴＣＢ」及び「５Ｅ１１ｐ－ＣＨ２５２７」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
さらなるＴ細胞二重特異性抗体の調製
バインダーをＴ細胞二重特異性抗体に変換する原理は、例えば国際公開第２０１４／１３１７１２号（その全体が参照により本明細書に援用される）など、当技術分野で例示され、記載されている。Ｔ細胞二重特異性抗体は、図３に示すように、２つのＧＰＲＣ５Ｄ結合部分と１つのＣＤ３結合部分（抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体）を含む。以下の抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体を調製した：ｉ）６６２３（配列番号１１４、１１５、１１６、１１７）；ｉｉ）６６２４（配列番号１１８、１１９、１２０、１２１）；ｉｉｉ）６６２５（配列番号１２２、１２３、１２４、１２５）；ｉｖ）６６２６（配列番号１２６、１２７、１２８、１２９）。ＤＰ４７－ＴＣＢ（「非標的ＴＣＢ」）は、国際公開第２０１４／１３１７１２号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。Ｂ７２ ＴＣＢは、国際公開第２０１８／０１１７７８６号の表２３に開示されているＧＣＤＢ７２抗体に由来し、ＧＣＤＢ７２のＧＰＲＣ５Ｄ結合部分を含む（実施例７）。用語「Ｂ７２ ＴＣＢ」という用語は、本明細書では「Ｂ７２」という用語も指す。ＢＣＭＡ－ＴＣＢは、国際公開第２０１６／１６６６２９号に由来し、そこに開示されているＡ０２＿Ｒｄ４＿６ｎＭ＿Ｃ０１のＧＰＲＣ５Ｄ結合部分を含む。ＢＣＭＡ－ＴＣＢは、実施例２に記載されているとおり、ｃｒｏｓｓｍａｂ ２＋１フォーマット（配列番号７７、７８、７９、８０）で生成された。「５Ｆ１１－ＴＣＢ」及び「５Ｆ１１ｐ－ＣＨ２５２７」という用語は、本明細書では互換的に使用される。「５Ｅ１１－ＴＣＢ」及び「５Ｅ１１ｐ－ＣＨ２５２７」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
実施例１４．１
Ｔ細胞二重特異性抗体の多発性骨髄腫細胞株及びＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞への結合
ＧＰＲＣ５Ｄへの結合を測定するために、本発明者らは、報告されている多発性骨髄腫細胞株（Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ；Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．２００７ Ｍａｒ；４６（３）：２２６－３８）でフローサイトメトリーベースの結合アッセイを行った。細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－９０６８）を、１０％ＦＢＳ、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）、１ｘピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社）、及び５０μＭのベータメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＧｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ社）を含むＲＰＭＩ １６４０で培養した。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞（ＮＦＡＴプロモーターを含み、ＣＤ３を発現するヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）を、２ｇ／ｌグルコース、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ＦＣＳ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１ｘＮＥＡＡ、１ｘピルビン酸ナトリウム、及び２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含有するＲＰＭＩ １６４０で培養した。
Ｔ細胞二重特異性抗体の多発性骨髄腫細胞株及びＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞への結合
ＧＰＲＣ５Ｄへの結合を測定するために、本発明者らは、報告されている多発性骨髄腫細胞株（Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ；Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．２００７ Ｍａｒ；４６（３）：２２６－３８）でフローサイトメトリーベースの結合アッセイを行った。細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－９０６８）を、１０％ＦＢＳ、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）、１ｘピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社）、及び５０μＭのベータメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＧｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ社）を含むＲＰＭＩ １６４０で培養した。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞（ＮＦＡＴプロモーターを含み、ＣＤ３を発現するヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）を、２ｇ／ｌグルコース、２ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ＦＣＳ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１ｘＮＥＡＡ、１ｘピルビン酸ナトリウム、及び２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含有するＲＰＭＩ １６４０で培養した。
９６丸底ウェルプレートの１ウェルあたり０．１Ｍｉｏ細胞を、１００ｎＭから１．３ｐＭ（１：５の段階希釈）の、示されているＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢコンストラクト５Ｅ１１ｐ－ＣＨ２５２７、６６２５、６６２６、５Ｆ１１ｐ－ＣＨ２５２７、６６２３若しくは６６２４又はコンストラクトなしと共に４℃で３０分間インキュベートした。これらの細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％ウシ胎児血清；１％０．５ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８；０．２５％ＮａＮ３アジ化ナトリウム（２０％））で２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファーで１／１００に希釈したＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ，Ｆｃγフラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、１０９－６０６－００８）で、さらに３０分、４℃で染色した。
特注のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｆｏｒｔｅｓｓａでフローサイトメトリーの取得を行い、ＢＤ Ｄｉｖａを使用して分析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、ＥＣ５０値を計算した。
図１６は、すべてのＴＣＢ分子が、ヒトＧＰＲＣ５ＤとヒトＣＤ３の両方に濃度依存的に結合できることを示している。簡単に説明すると、５Ｅ１１ｐ－ＣＨ２５２７の両方のヒト化バージョン、つまり６６２５と６６２６は、親ＴＣＢと比較してヒトＧＰＲＣ５Ｄへの結合が強化されているため、結合のＥＣ５０値も低くなっている（図１６Ａ及び表１４．１）。さらに、６６２４は、５Ｆ１１ｐ－ＣＨ２５２７及び６６２３と比較してヒトＧＰＲＣ５Ｄへの結合がわずかに強化されていることを示している（図１６Ｂ）。一般に、すべての５Ｆ１１ベースの分子は、ヒトＧＰＲＣ５Ｄに対して、５Ｅ１１ベースの分子よりも良好な結合を示す。すべての５Ｅ１１ベースのＴＣＢ分子はヒトＣＤ３への同等の濃度依存的結合を示す（図１６Ｃ）が、５Ｆ１１ｐ－ＣＨ２５２７の両方のヒト化バリアント、すなわち６６２３と６６２４は、ヒトＣＤ３を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞とインキュベートした場合、親のものと比較して、最高の抗体濃度でより強い全体的な結合シグナルを示す（図１６Ｄ）。
表１４．１：示されているＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ分子の、ＮＣＩ－Ｈ９２９で発現されたヒトＧＰＲＣ５Ｄ又はＪｕｒｋａｔ細胞で発現されたヒトＣＤ３への結合のＥＣ５０値（ｎＭ）
実施例１４．２
Ｔ細胞二重特異性抗体の多発性骨髄腫細胞株への結合
実施例１４．１で提示されたデータは誤って１０倍に計算されていたため、ＥＣ５０値が低すぎる。したがって、ＧＰＲＣ５Ｄ ａへの結合を再評価するために、本発明者らは、報告されている多発性骨髄腫細胞株（Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓ；Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．２００７ Ｍａｒ；４６（３）：２２６－３８．）で一連のＦＡＣＳベースの結合アッセイを行った。細胞株ＯＰＭ－２を、２０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）、５０μＭのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ社）及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養し、ＲＰＭＩ－８２２６を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。これらの細胞株を７５ｃｍ２のフラスコ（ＴＰＰ社）内で週２回継代培養した。
Ｔ細胞二重特異性抗体の多発性骨髄腫細胞株への結合
実施例１４．１で提示されたデータは誤って１０倍に計算されていたため、ＥＣ５０値が低すぎる。したがって、ＧＰＲＣ５Ｄ ａへの結合を再評価するために、本発明者らは、報告されている多発性骨髄腫細胞株（Ｌｏｍｂａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓ；Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．２００７ Ｍａｒ；４６（３）：２２６－３８．）で一連のＦＡＣＳベースの結合アッセイを行った。細胞株ＯＰＭ－２を、２０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）、５０μＭのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ社）及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養し、ＲＰＭＩ－８２２６を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。これらの細胞株を７５ｃｍ２のフラスコ（ＴＰＰ社）内で週２回継代培養した。
簡単に説明すると、浮遊細胞を回収し、カウントし、生存率を評価した。以降の工程はすべて、４℃で実施された。
細胞を、１ｍｌあたり０．５Ｍｉｏ細胞でＰＢＳに再懸濁させた。次に、０．０５Ｍｉｏ細胞を丸底９６ウェルプレートのウェルごとにプレーティングし、遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、Ｆｃ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社 ＃４２２３０２、前希釈１：４００）含有のＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｉｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社 ＃４２３１０２、前希釈１：４００）で、１ウェルあたり５０μｌの総量で２０分間染色した。細胞を、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、本明細書で６６２５とも呼ばれる５Ｅ１１（６６２５）－ＴＣＢの漸増濃度（０．７ｎＭ－５００ｎＭ、１ウェルあたり２５μｌの総量）で４℃で３０分間インキュベートした。アッセイプレートを遠心分離し、上清を廃棄した。
その後、細胞を、滑らかなボルテックスによって再懸濁させ、ＦＡＣＳバッファーに５００ｎＭの二次抗体（ａＰＧＬＡＬＡ ｍｕｌＧ２ｂ Ａｌｅｘａ ６４７、自社で製造）を含むウェルあたり２５μｌの総量で、４℃でさらに３０分インキュベートした。細胞を、１回洗浄し、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａを備えたＢＤフローサイトメーターで分析した。結合曲線とＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を用いて得た。アッセイ複製物１のＥＣ５０値は、図２５Ａ、図２５Ｂ、及び図２５Ｃに示したグラフに対応する。アッセイ複製物２のＥＣ５０値は、図２５Ｄ、図２５Ｅ、及び図２５Ｆに示したグラフに対応する。アッセイ複製物３のＥＣ５０値は、図２５Ｇ、図２５Ｈ、及び図２５Ｉに示したグラフに対応する。
図２５は、様々なレベルのＧＰＲＣ５Ｄを発現するＭＭ細胞株に対する５Ｅ１１（６６２５）－ＴＣＢの濃度依存的結合を示す。結合のＥＣ５０は２０ｎＭから１５８ｎＭの範囲であり、細胞上の標的発現レベルのばらつきによるアッセイの変動を示している。
表１４．２． 樹立した異なるＭＭ細胞株に発現されたヒトＧＰＲＣ５Ｄに対する５Ｅ１１（６６２５）－ＴＣＢの結合のＥＣ５０値
実施例１５
ヒトＣＤ３とヒトＧＰＲＣ５Ｄへの同時結合時にＣＤ３を介したＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴエフェクター細胞の活性化を誘導するＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢの能力を、ＲＰＭＩ－８２２６ （ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１５５）細胞とＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社 ＃ＣＳ１７６５０１）との共培養物を使用して評価した。ＲＰＭＩ－８２２６細胞上のヒトＧＰＲＣ５ＤとＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞上のヒトＣＤ３抗原にＴＣＢ分子が同時に結合すると、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、活性ホタルルシフェラーゼの発現につながる。発光シグナルの強度（ルシフェラーゼ基質の添加時に得られる）は、ＣＤ３の活性化及びシグナル伝達の強度に比例する。
ヒトＣＤ３とヒトＧＰＲＣ５Ｄへの同時結合時にＣＤ３を介したＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴエフェクター細胞の活性化を誘導するＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢの能力を、ＲＰＭＩ－８２２６ （ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１５５）細胞とＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社 ＃ＣＳ１７６５０１）との共培養物を使用して評価した。ＲＰＭＩ－８２２６細胞上のヒトＧＰＲＣ５ＤとＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞上のヒトＣＤ３抗原にＴＣＢ分子が同時に結合すると、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、活性ホタルルシフェラーゼの発現につながる。発光シグナルの強度（ルシフェラーゼ基質の添加時に得られる）は、ＣＤ３の活性化及びシグナル伝達の強度に比例する。
本アッセイでは、９６ウェルプレートのウェルごとに２００００個のＲＰＭＩ８２２６細胞をプレーティングし、２０％ＦＢＳ及び１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩで１：１０の段階希釈工程を行って、５０ｎＭから５ｆＭの最終濃度範囲になるように、示されているＴＣＢ分子を加えた。最終Ｅ：Ｔ比が２．５：１になるように、１ウェルあたり５００００個のＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞を加えた。３７℃５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、１００μｌのＯＮＥ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を同量のアッセイ上清に加え、光から保護して室温で５分間インキュベートした。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒプレートリーダーを使用して、発光を分析した。
図１７Ａに示すように、評価されたすべてのＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢ分子は用量依存的にＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴの活性化を誘導するが、２つの非標的ＤＰ４７ ＴＣＢコントロール分子の存在下では、有意なシグナルは得られなかった。非標的ＤＰ４７ ＴＣＢ １は、配列番号１０４のＶＨと配列番号１０５のＶＬとを含むＣＤバインダーを含む。非標的ＤＰ４７ ＴＣＢ ２は、配列番号３５のＶＨと配列番号３６のＶＬとを含むＣＤバインダーを含む。Ｊｕｒｋａｔ活性化に対応するＥＣ５０値をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を使用して計算し、表１５に示す。ＥＣ５０とＡＵＣ（表１５を参照）の両方を考慮すると、分子の順位は次のようになる：６６２４＞６６２３＞５Ｆ１１ｐ－ＣＨ２５２７＞６６２６－６６２５＞５Ｅ１１ｐ－ＣＨ２５２７。
同様のアッセイを、フロー（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ、Ｂａｎｇｓｌａｂｓ社）によって決定され、細胞株名の横の括弧内にＧＰＲＣ５Ｄ結合部位番号として示される様々なレベルのヒトＧＰＲＣ５Ｄを発現する追加の（多発性骨髄腫）細胞株の存在下で実施した。
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを使用してＥＣ５０とＡＵＣを計算し、ｘ軸とｙ軸にプロットした（図１７Ｂ－Ｇ）。
図１７Ｂ－Ｇに示したように、ＧＰＲＣ５Ｄの相対的な発現量が幅広い細胞株の存在下で、すべての分子が濃度依存的なＪｕｒｋａｔ活性化を示す。存在する標的細胞株に関係なく、分子の順位は同様である。
表１５：一晩のインキュベーション（約２０時間）後の発光によって測定された、ＲＰＭＩ－８２２６細胞の存在下でのＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢを介したＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞の活性化から計算されたＥＣ５０値（ｐＭ）又は曲線下面積（ＡＵＣ）
実施例１６
ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢを介したＴ細胞の細胞傷害性
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ抗体の機能性をさらに測定するために、腫瘍細胞のｉｎ－ｖｉｔｒｏ細胞溶解アッセイを行った。簡単に説明すると、ＡＭＯ－１（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ５３８）、ＮＣＩ－Ｈ９２９ ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－９０６８、ＬＰ－１（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ４１）、及びＩＭ－９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１５９）細胞株を、エフェクター細胞としてのヒト汎Ｔと、１０：１の最終的なエフェクター対標的比で共培養した。健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、ヒトＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌアイソレーションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いてヒト汎Ｔ細胞を単離した。示されているＧＰＲＣ５Ｄ（６６２５及びＢ７２）又はＢＣＭＡを標的とするＴ細胞結合二重特異性分子を、濃度を下げながら添加した（５０ｎＭから５ｐＭの範囲、１：１０の希釈工程）。陰性コントロールとして、非標的ＴＣＢが含まれていた。
ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢを介したＴ細胞の細胞傷害性
抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ抗体の機能性をさらに測定するために、腫瘍細胞のｉｎ－ｖｉｔｒｏ細胞溶解アッセイを行った。簡単に説明すると、ＡＭＯ－１（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ５３８）、ＮＣＩ－Ｈ９２９ ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－９０６８、ＬＰ－１（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ４１）、及びＩＭ－９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１５９）細胞株を、エフェクター細胞としてのヒト汎Ｔと、１０：１の最終的なエフェクター対標的比で共培養した。健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、ヒトＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌアイソレーションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いてヒト汎Ｔ細胞を単離した。示されているＧＰＲＣ５Ｄ（６６２５及びＢ７２）又はＢＣＭＡを標的とするＴ細胞結合二重特異性分子を、濃度を下げながら添加した（５０ｎＭから５ｐＭの範囲、１：１０の希釈工程）。陰性コントロールとして、非標的ＴＣＢが含まれていた。
３７℃、５％ＣＯ２で２０時間培養した後、製造業者のマニュアルに従って、発光シグナルの定量化（ＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ細胞傷害性アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）により細胞死を判定した。示されているのは、判定された細胞死の直接測定としての相対発光シグナル（ＲＬＵ）である。ＥＣ５０とＡＵＣは、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを使用して計算され、表１６にまとめられている。
図１８Ａ－Ｄは、すべてのＴＣＢ分子が、ヒトＧＰＲＣ５ＤとＢＣＭＡの相対的な発現レベルがそれぞれ異なる広範囲の腫瘍細胞株について、濃度依存的溶解を誘導できることを示している。６６２５とＢ７２を直接比較すると、６６２５分子の有効性と効力が向上していることがわかる。６６２５とＢＣＭＡ－ＴＣＢを比較すると、ＡＭＯ－１（図１８Ａ）、ＮＣＩ－Ｈ９２９（図１８Ｂ）、ＬＰ－１（図１８Ｃ）の存在下での６６２５の方がｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効性と効力が高いのに対し、ＢＣＭＡ－ＴＣＢは、ＧＰＲＣ５Ｄの発現量がやや少ないＩＭ－９（図１８Ｄ）の腫瘍細胞の溶解をより強く誘導している。試験した細胞株における６６２５とＢＣＭＡ－ＴＣＢの順位の違いは、これらの細胞株におけるＧＰＲＣ５ＤとＢＣＭＡの相対的な発現レベルの違いによっておそらく説明可能である。
表１６：示された細胞株の存在下でのＧＰＲＣ５Ｄ又はＢＣＭＡ－ＴＣＢを介した腫瘍細胞溶解から計算され、一晩のインキュベーション（約２０時間）後の発光によって決定されたＥＣ５０値（ｐＭ）。
表１７：示された細胞株の存在下でのＧＰＲＣ５Ｄ又はＢＣＭＡ－ＴＣＢを介した腫瘍細胞溶解から計算され、一晩のインキュベーション（約２０時間）後の発光によって決定された曲線下面積値。
実施例１７
初代ＭＭ試料の存在下での抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢを介したＴ細胞活性化
初代多発性骨髄腫試料に対するＧＰＲＣ５ＤＴＣＢ分子の活性を評価するために、凍結した未処理の骨髄試料（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ社）を解凍し、ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｉｓバッファー（＃５５５８９９）を使用して迅速な赤血球溶解を行った。その後、細胞を洗浄し、２０％熱不活化ウシ胎児血清、２％ヒト血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（いずれもＧｉｂｃｏ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘに再懸濁させ、９６ウェルプレート丸底（ＴＰＰ社製）に１ウェルあたり１００μＬの細胞懸濁液（３００００細胞）を播種した。自家Ｔ細胞を、混合ＢＭ試料の１細胞あたり１０Ｔ細胞の最終比になるように、添加した。５０ｎＭから０．０５ｎＭ（１：１０希釈工程）の最終濃度範囲になるように、９６ウェルプレートのウェルあたり２００μｌの総量で、示されている分子を添加した。
初代ＭＭ試料の存在下での抗ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢを介したＴ細胞活性化
初代多発性骨髄腫試料に対するＧＰＲＣ５ＤＴＣＢ分子の活性を評価するために、凍結した未処理の骨髄試料（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ社）を解凍し、ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｉｓバッファー（＃５５５８９９）を使用して迅速な赤血球溶解を行った。その後、細胞を洗浄し、２０％熱不活化ウシ胎児血清、２％ヒト血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（いずれもＧｉｂｃｏ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘに再懸濁させ、９６ウェルプレート丸底（ＴＰＰ社製）に１ウェルあたり１００μＬの細胞懸濁液（３００００細胞）を播種した。自家Ｔ細胞を、混合ＢＭ試料の１細胞あたり１０Ｔ細胞の最終比になるように、添加した。５０ｎＭから０．０５ｎＭ（１：１０希釈工程）の最終濃度範囲になるように、９６ウェルプレートのウェルあたり２００μｌの総量で、示されている分子を添加した。
加湿インキュベーター内で３７℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳで１回洗浄し、生細胞と死細胞を識別するために５０μＬのＬｉｖｅ ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃Ｌ２３１０５）で４℃で２０分間染色した。表面染色は、製造業者の提案に基づき、以下の抗体の混合物：ＣＤ２５ ＢＶ６０５、ＣＤ６９ ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＣＤ３８ ＢＶ５１０、ＣＤ１３８ ＦＩＴＣ、ＣＤ８ ＢＶ７１１、ＣＤ３ ＰＥ－Ｃｙ５、及びＣＤ４ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００（いずれもＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いて行った。最終的な解析のために、細胞を、１００μＬのＦＡＣバッファーに再懸濁させ、Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して取得した。図１９は、初期活性化マーカーＣＤ６９に陽性である生きたＣＤ８ Ｔ細胞の割合によって決定される、Ｔ細胞活性化の割合を示す。Ｔ細胞活性化のＥＣ５０は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍによって計算され、表１８にまとめられている。ＧＰＲＣ５Ｄを標的とする代表的な二重特異性分子である６６２４及び６６２５はいずれも、それぞれ１．０６ｐＭ、１４．８ｐＭのＥＣ５０で濃度依存的なＴ細胞活性化を誘導することができたが、非標的ＴＣＢコントロールの存在下ではＴ細胞活性化は誘導されなかった。図のケースでは、ＢＣＭＡ－ＴＣＢは、評価した両方のＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢ分子よりもＴ細胞を活性化した程度が低かった。その理由としては、ＧＰＲＣ５ＤとＢＣＭＡの相対的な発現レベルの違いが考えられる（未評価）。Ｂ７２分子は、６６２４及び６６２５で観察されたよりも、かなり高い濃度でのみ有意なＴ細胞活性化を誘導したが、測定した２つの最高濃度で全体的により高い活性化をもたらした。Ｂ７２は、健康なドナーの骨髄試料でも同様の濃度でＴ細胞の活性化が観察されたことから、初代ＭＭ試料の存在下で観察されたＢ７２の効果が純粋に標的依存性であるかどうかは不明である（図２１参照）。
表１８：自家Ｔ細胞のＧＰＲＣ５Ｄ又はＢＣＭＡ－ＴＣＢを介した活性化から計算され、初代ＭＭ試料とインキュベートされ、約２４時間後にＣＤ８Ｔ細胞上のＣＤ６９のフローサイトメトリー分析によって定量化されたＥＣ５０値（ｐＭ）
実施例１８
健康なドナーからのＰＢＭＣのインキュベーションによるＢ細胞の枯渇
健康なドナーの血液から、古典的な密度勾配遠心分離法によりヒトＰＢＭＣを単離した。１０％ＦＢＳと１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に、９６ウェルプレートのウェルあたり２０００００個のＰＢＭＣをプレーティングした。最終濃度が５０ｎＭ、５ｎＭ、０．５ｎＭ又は０．０５ｎＭになるように、示されている二重特異性分子を、ウェルあたり２００μｌの総量で加えた。加湿インキュベーター内で３７℃で４８時間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、製造業者のプロトコールに従って、Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎＦｃＸＴＭ（Ｆｃブロック、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）との細胞のインキュベーションによってＦｃ受容体をブロックした。Ｌｉｖｅ ｂｌｕｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃Ｌ２３１０５）を使用して、生細胞と死細胞を識別した（実施例１７参照）。以下のマーカー：ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ３８、ＣＤ８、ＣＤ１３８（いずれもＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）の表面発現を４℃で３０分間行った。ウェルあたりのＢ細胞の絶対定量化のために、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いるフローサイトメトリー分析の前に、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ絶対計数ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 ＃Ｃ３６９５０）をウェルあたり１０μｌ加えた。図２０Ａ－Ｄは、異なる抗体濃度、すなわち５０ｎＭ（図２０Ａ）、５ｎＭ（図２０Ｂ）、０．０５ｎＭ（図２０Ｃ）、０．０５ｎＭ（図２０Ｄ）で示されている二重特異性分子を用いて評価した、５つの異なる健康なドナーの概要を示している。描かれているのはＢ細胞数であり、未処理のコントロールに対して、（ドナーごとに）２回繰り返した計数値を元にＳＤで正規化したものである。健康なＢ細胞の有意な枯渇は、ＢＣＭＡ－ＴＣＢ及びＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ ６６２６の両方で観察されたが、Ｂ７２を含む他のＧＰＲＣ５Ｄ標的ＴＣＢはいずれも、大多数のドナーでＢ細胞を有意に枯渇させなかった。６６２６で観察されたＢ細胞枯渇効果は、約５ｎＭを超える濃度に限られていたが、ＢＣＭＡ－ＴＣＢでは、既に０．０５ｎＭの濃度で健康なＢ細胞が枯渇していた。要約すると、これは、ＧＰＲＣ５Ｄを標的とする分子は、健康なＢ細胞を枯渇させるリスクが非常に低いようであり、これは安全面での利点である可能性があることを示唆している。
健康なドナーからのＰＢＭＣのインキュベーションによるＢ細胞の枯渇
健康なドナーの血液から、古典的な密度勾配遠心分離法によりヒトＰＢＭＣを単離した。１０％ＦＢＳと１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に、９６ウェルプレートのウェルあたり２０００００個のＰＢＭＣをプレーティングした。最終濃度が５０ｎＭ、５ｎＭ、０．５ｎＭ又は０．０５ｎＭになるように、示されている二重特異性分子を、ウェルあたり２００μｌの総量で加えた。加湿インキュベーター内で３７℃で４８時間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、製造業者のプロトコールに従って、Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎＦｃＸＴＭ（Ｆｃブロック、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）との細胞のインキュベーションによってＦｃ受容体をブロックした。Ｌｉｖｅ ｂｌｕｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃Ｌ２３１０５）を使用して、生細胞と死細胞を識別した（実施例１７参照）。以下のマーカー：ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ３８、ＣＤ８、ＣＤ１３８（いずれもＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）の表面発現を４℃で３０分間行った。ウェルあたりのＢ細胞の絶対定量化のために、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いるフローサイトメトリー分析の前に、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ絶対計数ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 ＃Ｃ３６９５０）をウェルあたり１０μｌ加えた。図２０Ａ－Ｄは、異なる抗体濃度、すなわち５０ｎＭ（図２０Ａ）、５ｎＭ（図２０Ｂ）、０．０５ｎＭ（図２０Ｃ）、０．０５ｎＭ（図２０Ｄ）で示されている二重特異性分子を用いて評価した、５つの異なる健康なドナーの概要を示している。描かれているのはＢ細胞数であり、未処理のコントロールに対して、（ドナーごとに）２回繰り返した計数値を元にＳＤで正規化したものである。健康なＢ細胞の有意な枯渇は、ＢＣＭＡ－ＴＣＢ及びＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ ６６２６の両方で観察されたが、Ｂ７２を含む他のＧＰＲＣ５Ｄ標的ＴＣＢはいずれも、大多数のドナーでＢ細胞を有意に枯渇させなかった。６６２６で観察されたＢ細胞枯渇効果は、約５ｎＭを超える濃度に限られていたが、ＢＣＭＡ－ＴＣＢでは、既に０．０５ｎＭの濃度で健康なＢ細胞が枯渇していた。要約すると、これは、ＧＰＲＣ５Ｄを標的とする分子は、健康なＢ細胞を枯渇させるリスクが非常に低いようであり、これは安全面での利点である可能性があることを示唆している。
実施例１９
健康なドナーからの骨髄試料のインキュベーションによるＴ細胞の活性化への影響
健康なドナーの未処理の骨髄（Ｌｏｎｚａ社）を、試料採取の１日後に評価した。ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｉｓバッファー＃５５５８９９を使用して赤血球をすばやく溶解した後、細胞を洗浄し、２０％熱不活性化ウシ胎児血清、２％ヒト血清、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（いずれもＧｉｂｃｏ社製）を含むＲＰＭＩ １６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘに再懸濁させ、９６ウェルプレート丸底（ＴＰＰ社製）にウェルあたり１００μＬの細胞懸濁液（３００００細胞）を播種した。最終濃度範囲が５ｎＭから０．０５ｎＭ（１：１０希釈工程）になるように示されている分子を９６ウェルプレートの１ウェルあたり２００μｌの総量で添加した。
健康なドナーからの骨髄試料のインキュベーションによるＴ細胞の活性化への影響
健康なドナーの未処理の骨髄（Ｌｏｎｚａ社）を、試料採取の１日後に評価した。ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｉｓバッファー＃５５５８９９を使用して赤血球をすばやく溶解した後、細胞を洗浄し、２０％熱不活性化ウシ胎児血清、２％ヒト血清、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（いずれもＧｉｂｃｏ社製）を含むＲＰＭＩ １６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘに再懸濁させ、９６ウェルプレート丸底（ＴＰＰ社製）にウェルあたり１００μＬの細胞懸濁液（３００００細胞）を播種した。最終濃度範囲が５ｎＭから０．０５ｎＭ（１：１０希釈工程）になるように示されている分子を９６ウェルプレートの１ウェルあたり２００μｌの総量で添加した。
加湿インキュベーター内で３７℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳで１回洗浄し、生細胞と死細胞を識別するために５０μＬのＬｉｖｅ ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、＃Ｌ２３１０５）で４℃で２０分間染色した。表面染色は、製造業者の提案に基づき、以下の抗体の混合物：ＣＤ２５ ＢＶ６０５、ＣＤ６９ ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＣＤ３８ ＢＶ５１０、ＣＤ１３８ ＦＩＴＣ、ＣＤ８ ＢＶ７１１、ＣＤ３ ＰＥ－Ｃｙ５、及びＣＤ４ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００（いずれもＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いて行った。最終的な解析のために、細胞を、１００μＬのＦＡＣバッファーに再懸濁させ、Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して取得した。図２１は、示されている処理時のＣＤ６９陽性ＣＤ８＋ Ｔ細胞（Ａ）又はＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ｂ）のいずれかのパーセントとして決定されたＴ細胞の活性化を示している。
骨髄試料における明確な濃度依存性Ｔ細胞活性化は、ＢＣＭＡ－ＴＣＢ又はＢ７２で検出されたが、６６２４又は６６２５では検出されなかった。これは、高用量で使用した場合、ＢＣＭＡ－ＴＣＢ又はＢ７２と比較した６６２４及び６６２５などの分子の潜在的な安全面での利点を示している。
実施例２０
健康なドナーからのヒト全血におけるサイトカイン放出
６つの健康なドナーの全血をＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ Ｌｉｔｈｉｕｍ－Ｈｅｐａｒｉｎチューブに採取し、３時間以内にアッセイした。ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ６６２４及び６６２５、並びに非標的ＴＣＢコントロール分子をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社 ＃１４１９０）で希釈し、丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社 ＃Ｃｏｓｔａｒ３７９９）中の全血１９５μＬに５μＬを添加して、５０、０．５、０．００５ｎＭの最終濃度に達した。モノクローナル抗体のガザイバ（オビヌツズマブ）とＬｅｍｔｒａｄａ（アレムツズマブ）を同様に５０、０．５、０．００５ｎＭでアッセイし、アービタックス（セツキシマブ）を５０ｎＭで試験した。ＰＢＳのみをビヒクルコントロールとした。３７℃で２４時間のインキュベートの後、プレートを１８００ｇ（３０００ｒｐｍ）で５分間遠心分離した。血漿上清（約７０μｌ）を収集し、－８０℃で保存した後、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅキット（ＨＣＹＴＯＭＡＧ－６０Ｋ）とＬｕｍｉｎｅｘリーダーＬＸ ２００を使用して、製造業者の提案に従い、マルチプレックスサイトカイン検出を行った。図２２Ａ（ヒトＴＮＦａ）と図２２Ｂ（ヒトＩＬ－６）にまとめられているように、６６２４はガザイバと同様の範囲で低レベルのＴＮＦａ及びＩＬ－６の分泌を誘導したが、６６２５では、評価したサイトカインのを誘導はさらに低レベルであった。これは、サイトカイン放出に関しては、６６２４が好ましい安全性プロファイルを示しうることを示唆している。
健康なドナーからのヒト全血におけるサイトカイン放出
６つの健康なドナーの全血をＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ Ｌｉｔｈｉｕｍ－Ｈｅｐａｒｉｎチューブに採取し、３時間以内にアッセイした。ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ６６２４及び６６２５、並びに非標的ＴＣＢコントロール分子をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社 ＃１４１９０）で希釈し、丸底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社 ＃Ｃｏｓｔａｒ３７９９）中の全血１９５μＬに５μＬを添加して、５０、０．５、０．００５ｎＭの最終濃度に達した。モノクローナル抗体のガザイバ（オビヌツズマブ）とＬｅｍｔｒａｄａ（アレムツズマブ）を同様に５０、０．５、０．００５ｎＭでアッセイし、アービタックス（セツキシマブ）を５０ｎＭで試験した。ＰＢＳのみをビヒクルコントロールとした。３７℃で２４時間のインキュベートの後、プレートを１８００ｇ（３０００ｒｐｍ）で５分間遠心分離した。血漿上清（約７０μｌ）を収集し、－８０℃で保存した後、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅキット（ＨＣＹＴＯＭＡＧ－６０Ｋ）とＬｕｍｉｎｅｘリーダーＬＸ ２００を使用して、製造業者の提案に従い、マルチプレックスサイトカイン検出を行った。図２２Ａ（ヒトＴＮＦａ）と図２２Ｂ（ヒトＩＬ－６）にまとめられているように、６６２４はガザイバと同様の範囲で低レベルのＴＮＦａ及びＩＬ－６の分泌を誘導したが、６６２５では、評価したサイトカインのを誘導はさらに低レベルであった。これは、サイトカイン放出に関しては、６６２４が好ましい安全性プロファイルを示しうることを示唆している。
実施例２１
ＮＣＩ－Ｈ９２９（ｈＮＳＧマウス）における異なるＧＰＲＣ５ＤｘＣＤ３二重特異性ＴＣＢ分子のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢ分子６６２３、６６２４、６６２５、及び６６２６の有効性をさらに評価するために、これらが完全にヒト化されたＮＳＧマウスを有する多発性骨髄腫で腫瘍縮小を誘発する可能性を評価した。生存率が９５．０％を超える２．５ｘ１０６ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を、ＲＰＭＩ細胞培地（Ｇｉｂｃｏ社）及びＧＦＲマトリゲル（１：１、総量１００μｌ）に再懸濁させ、ヒト化メスＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスの右脇腹に皮下注射した。
ＮＣＩ－Ｈ９２９（ｈＮＳＧマウス）における異なるＧＰＲＣ５ＤｘＣＤ３二重特異性ＴＣＢ分子のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢ分子６６２３、６６２４、６６２５、及び６６２６の有効性をさらに評価するために、これらが完全にヒト化されたＮＳＧマウスを有する多発性骨髄腫で腫瘍縮小を誘発する可能性を評価した。生存率が９５．０％を超える２．５ｘ１０６ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を、ＲＰＭＩ細胞培地（Ｇｉｂｃｏ社）及びＧＦＲマトリゲル（１：１、総量１００μｌ）に再懸濁させ、ヒト化メスＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスの右脇腹に皮下注射した。
このマウスのヒト化は次のように行われた：実験開始時に４－５週齢（フランス、リオンのＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒにて飼育）のマウスを、約束されたガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、特定の病原体がない条件下、１２時間明所／１２時間暗所の日周期で維持した。実験研究プロトコールが地方自治体により審査及び承認された（ＲＯＢ－５５．２－２５３２．Ｖｅｔ＿０３－１６－１０）。動物は、到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために保持された。継続的な健康モニタリングが定期的に実施された。プロトコールに従い、メスＮＯＧマウスに１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンをｉ．ｐ．（腹腔内）注射し、続いて翌日に臍帯血から単離された１ｘ１０５個のヒト造血幹細胞をｉ．ｖ．注射した。幹細胞の注射から１６－２０週で、マウスから採血し、血液を、ヒト化の成功についてフローサイトメトリーで分析した。効率的に移植されたマウスを、それらのヒトＴ細胞頻度に従って異なる処置群にランダム化した（ｎ＝１０／群）。
その時点で、上述のようにマウスに腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍サイズがメジアン径３０８ｍｍ３（９２－８４１ｍｍ３の範囲）に到達したときに化合物又はＰＢＳ（ビヒクル）で週１回処置した。すべてのマウスに、０．０５ｍｇ／ｋｇと０．００５ｍｇ／ｋｇの示されているＴＣＢ分子を静脈内注射した（図２３Ａ及び２３Ｂ参照）。
適切な量の化合物を得るために、原液をヒスチジンバッファー（２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で希釈した。腫瘍増殖をノギスを使用して週に２回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した。
Ｔｖ：（Ｗ２／２）ｘＬ（Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
Ｔｖ：（Ｗ２／２）ｘＬ（Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
腫瘍細胞接種後４１日目に研究を終了して、化合物を３回注射した後にすべてのマウスを殺処分し、腫瘍を外植して重量を測定した。統計は、二元配置分散分析、テューキー検定に従って行われた。
図２３Ａと２３Ｂに示されるように、０．００５ｍｇ／ｋｇの低用量では、評価したＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＣＢ分子のいずれも、効率的な腫瘍増殖阻害を示さなかった。対照的に、０．０５ｍｇ／ｋｇでは、評価した４つのＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢ分子すべてが、ビヒクル群と比較して有意な抗腫瘍増殖反応を示した。図２３Ｃ－Ｇは、処置群ごとの単一マウスの腫瘍増殖阻害をさらに示している。しかし、評価した４つの分子の間に有意な差はなく、４つのＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢ分子の前臨床での高い有効性が検証された。
実施例２２
ｈＦｃＲｎ Ｔｇ及びＫＯマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ ＳＤＰＫ
ＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢ分子６６２３、６６２４、６６２５、６６２６のＰＫ特性を評価するために、それぞれの分子を－／－ｈｕＦｃＲｎ Ｔｇ株３２（Ｂ６．Ｃｇ－Ｆｃｇｒｔ＜ｔｍ１Ｄｃｒ＞Ｔｇ（ＦＣＧＲＴ）３２Ｄｃｒ）マウス又は－／－ｍｕＦｃＲｎ（Ｂ６．１２９Ｘ１－Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ／ＤｃｒＪ）（米国、バーハーバーのジャクソン研究所）のいずれかに１ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈かを通じて静脈内投与（ボーラス）した。すべての研究は、動物保護に関するスイス連邦規則及び国際実験動物管理評価認定協会（Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)（ＡＡＡＬＡＣ）の規則を厳守し、地域の獣医当局の承認を得て実施した。異なる時点で静脈穿刺(尾静脈)によって血液を収集し、投与後の示された時点：－／－ｈｕＦｃＲｎ Ｔｇ株では投与から０．０８３、７、２４、４８、７２、１６８、３３６、５０４、６７２時間、－／－ｍｕＦｃＲｎ株では投与から３２、０．０８３、２、７、２４、３１、４８、７２、９６時間での分析のための血清を得た。血液を室温で２０分間保存してコーティングを行い、４℃で１５０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で血清を得て、直ちに凍結した。すべての血清試料は、投与された抗体のヒトＦａｂ部位及びそのバリアントに特異的な方法である電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）で分析するまで、－２０℃で保存した。
ｈＦｃＲｎ Ｔｇ及びＫＯマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ ＳＤＰＫ
ＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢ分子６６２３、６６２４、６６２５、６６２６のＰＫ特性を評価するために、それぞれの分子を－／－ｈｕＦｃＲｎ Ｔｇ株３２（Ｂ６．Ｃｇ－Ｆｃｇｒｔ＜ｔｍ１Ｄｃｒ＞Ｔｇ（ＦＣＧＲＴ）３２Ｄｃｒ）マウス又は－／－ｍｕＦｃＲｎ（Ｂ６．１２９Ｘ１－Ｆｃｇｒｔｔｍ１Ｄｃｒ／ＤｃｒＪ）（米国、バーハーバーのジャクソン研究所）のいずれかに１ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈かを通じて静脈内投与（ボーラス）した。すべての研究は、動物保護に関するスイス連邦規則及び国際実験動物管理評価認定協会（Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)（ＡＡＡＬＡＣ）の規則を厳守し、地域の獣医当局の承認を得て実施した。異なる時点で静脈穿刺(尾静脈)によって血液を収集し、投与後の示された時点：－／－ｈｕＦｃＲｎ Ｔｇ株では投与から０．０８３、７、２４、４８、７２、１６８、３３６、５０４、６７２時間、－／－ｍｕＦｃＲｎ株では投与から３２、０．０８３、２、７、２４、３１、４８、７２、９６時間での分析のための血清を得た。血液を室温で２０分間保存してコーティングを行い、４℃で１５０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離で血清を得て、直ちに凍結した。すべての血清試料は、投与された抗体のヒトＦａｂ部位及びそのバリアントに特異的な方法である電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）で分析するまで、－２０℃で保存した。
簡単に説明すると、アッセイバッファーで前希釈した試料を、捕捉分子及び検出分子と共に３７℃で９分間インキュベートした。ビオチン化したｍＡｂ＜Ｈ－Ｆａｂ（カッパ）＞Ｍ－ＩｇＧ－Ｂｉを捕捉分子として使用し、検出にはルテニウム（ＩＩ）トリス（ビピリジル）３２＋で標識したｍＡｂ＜Ｈ－Ｆａｂ（ＣＨ１）＞Ｍ－１．１９．３１－ＩｇＧ－Ｓ－Ｒｕマウスモノクローナル抗体を使用した。ストレプトアビジンでコートされた磁性微粒子を添加し、３７℃でさらに９分間インキュベートし、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用により複合体形成させた。複合体は電極上に磁気的に捕捉され、共反応物質であるトリプロピルアミン（ＴＰＡ）を用いて生成された化学発光信号が光電子増倍管検出器で測定された。すべての血清試料及び陽性又は陰性コントロール試料を４連で分析し、投与された対応する抗体に対してキャリブレーションを行った。
図２４と表１９に示すように、ＧＰＲＣ５Ｄ ＴＣＢの４つの分子はすべて、ｈＦｃＲｎ ｔｇ３２マウスにおいて、従来のＩｇＧのものの範囲内で許容可能なＰＫプロファイルを示した。ＦｃＲｎ ｋｏマウスで生成されたデータは、免疫原性に関連する可能性のある非特異的な細胞取り込みを評価するのに適していると考えられる。図１０Ｂにまとめられているように、６６２５と６６２６は同等のクリアランス率を示しているが、６６２３と６６２４のクリアランス率は上昇しており、非特異的な細胞取り込みの可能性がやや高いことを示唆している。
表１９：ｈＦｃＲｎ Ｔｇ３２又はＦｃＲｎ ＫＯマウスで実施されたＳＤＰＫ研究から計算した、クリアランス、それぞれの半減期
前述の発明は、理解を明確にするために例示及び実施例を用いてある程度詳細に説明してきたが、説明及び例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。ここに引用したすべての特許文献及び科学文献の開示内容は、参照によりそれらの全体が明示的に援用される。
Claims (32)
- 二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分であって、第１の抗原がＧＰＲＣ５Ｄであり、第１の抗原結合部分が、
（ｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８４のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号８３の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号８５のＨＣＤＲ ２、及び配列番号８６のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号８７の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号８８のＬＣＤＲ ２、及び配列番号８９のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉｉ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９１のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９６のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は
（ｖ）配列番号９０の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９２のＨＣＤＲ ２、及び配列番号９３のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号９４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号９５のＬＣＤＲ ２、及び配列番号９７のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む第１の抗原結合部分と、
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分であって、第２の抗原がＣＤ３であり、第２の抗原結合部分が、
（ｉ）配列番号２９の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号３０のＨＣＤＲ ２、及び配列番号３１のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３２の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号３３のＬＣＤＲ ２、及び配列番号３４のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉ）配列番号９８の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号９９のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１００のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０１の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１０２のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１０３のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は
（ｉｉ）配列番号１０６の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号１０７のＨＣＤＲ ２、及び配列番号１０８のＨＣＤＲ ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号１０９の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１１０のＬＣＤＲ ２、及び配列番号１１１のＬＣＤＲ ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む第２の抗原結合部分とを含む、
二重特異性抗原結合分子。 - 請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子であって、
（ｉ）第１の抗原結合部分のＶＨが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み；又は
（ｉｉ）第１の抗原結合部分のＶＨが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み；又は
（ｉｉｉ）第１の抗原結合部分のＶＨが、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬが、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み；又は
（ｉｖ）第１の抗原結合部分のＶＨが、配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬが、配列番号５２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み；又は
（ｖ）第１の抗原結合部分のＶＨが、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬが、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み；又は
（ｖｉ）第１の抗原結合部分のＶＨが、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第１の抗原結合部分のＶＬが、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む、
二重特異性抗原結合分子。 - 請求項１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子であって、第２の抗原結合部分のＶＨが、
（ｉ）配列番号３５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合部分のＶＬが、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み；
（ｉｉ）第２の抗原結合部分のＶＨが、配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合部分のＶＬが、配列番号１０５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み；又は
（ｉｉｉ）第２の抗原結合部分のＶＨが、配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合部分のＶＬが、配列番号１１３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、
二重特異性抗原結合分子。 - 第１及び／又は第２の抗原結合部分がＦａｂ分子である、請求項１から３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ、又は定常ドメインＣＬとＣＨ１、特に可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、請求項１から４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第１の抗原結合部分が、定常ドメインにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、１２３位のアミノ酸が、独立してリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸が、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、２１３位のアミノ酸が、独立してグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）Ｆａｂ分子である、請求項１から５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第１及び第２の抗原結合部分が互いに融合しており、場合によってペプチドリンカーを介して融合している、請求項１から６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第１及び第２の抗原結合部分が各々Ｆａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第３の抗原結合部分を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第３の抗原部分が第１の抗原結合部分と同一である、請求項９に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 第１、第２、及び存在する場合は第３の抗原結合部分が各々Ｆａｂ分子であり、（ｉ）第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、且つ第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第１の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端において第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、且つ第２の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており；
存在する場合は、第３の抗原結合部分がＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している、請求項１１に記載の二重特異性抗原結合分子。 - ＦｃドメインがＩｇＧ Ｆｃドメインである、請求項１１又は１２に記載の二重特異性抗原結合分子。
- ＦｃドメインがＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項１３に記載の二重特異性抗原結合分子。
- ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生じ、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を中に配置可能な空洞が生じる、請求項１１から１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 請求項１から１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードする、１又は複数の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む、１又は複数のベクター、特に発現ベクター。
- 請求項１８に記載のポリヌクレオチド又は請求項１９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- ＧＰＲＣ５Ｄに結合する二重特異性抗原結合分子を製造する方法であって、ａ）二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で、請求項２０に記載の宿主細胞を培養する工程と、ｂ）任意選択的に二重特異性抗原結合分子を回収する工程とを含む、方法。
- 請求項２１に記載の方法によって製造される、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する二重特異性抗原結合分子。
- 請求項１から１７のいずれか一項又は２２に記載の二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
- 医薬としての使用のための、請求項１から１７のいずれか一項若しくは２２に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２３に記載の薬学的組成物。
- 疾患の処置における使用のための、請求項１から１７のいずれか一項若しくは２２に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２３に記載の薬学的組成物。
- 疾患ががん又は自己免疫疾患である、請求項２５に記載の二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物。
- 疾患が多発性骨髄腫である、請求項２５に記載の二重特異性抗原結合分子又は薬学的組成物。
- 疾患の処置のための医薬の製造における、請求項１から１７のいずれか一項又は２２に記載の二重特異性抗原結合分子の使用。
- 個体における疾患を処置する方法であって、請求項１から１７のいずれか一項又は２２に記載の二重特異性抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、方法。
- 前記疾患ががん又は自己免疫疾患である、請求項２８に記載の使用又は請求項２９に記載の方法。
- 前記疾患が多発性骨髄腫である、請求項２８に記載の使用又は請求項２９に記載の方法。
- 本明細書に記載されている発明。
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