JP6952605B2

JP6952605B2 - 多特異性抗原結合タンパク質

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Publication number: JP6952605B2
Application number: JP2017555244A
Authority: JP
Inventors: ポールカーター，; クリストフシュピース，; イーユアンイン，; チエンホイチョウ，; ウェンディサンドヴァル，; ジェイコブコーン，; マイケルディロン，
Original assignee: ジェネンテック，インコーポレイテッド
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2016-04-22
Publication date: 2021-10-20
Anticipated expiration: 2036-04-22
Also published as: WO2016172485A2; KR20170140331A; AU2016252773A1; JP7228545B2; EP3286227A2; CN107787332A; AU2016252773B2; JP2018516546A; JP2023002538A; MX2017013482A; AU2022224860A1; IL254738A0; IL285366A; JP2020184996A; US11116840B2; IL254738B; US20220409725A1; HK1250722A1; CA2980189A1; WO2016172485A3

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月２４日出願の米国仮出願第６２／１５２，７３５号、２０１５年１２月７日出願の同第６２／２６４，２９１号、及び２０１６年３月１８日出願の同第６２／３１０，５５５号の優先権を主張するものであり、これらは全て、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

配列表
本出願には、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に援用される配列表が含まれる。２０１６年４月２２日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ０５８４１ＷＯ＿ＰＣＴＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、１３１，１３４バイトのサイズである。

ヒト疾患用の治療剤としての二重特異性抗体の開発は、大きな臨床的可能性を有する。しかしながら、抗体重鎖は比較的無差別な様式で抗体軽鎖に結合するように進化してきたため、ＩｇＧ形式での二重特異性抗体の産生は困難であった。この無差別な対合の結果として、例えば、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖との同時発現は、重鎖のホモ二量体化及び重鎖／軽鎖対合のスクランブリングを自然と引き起こす。

「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」として知られる重鎖ホモ二量体化の問題を回避するための１つの手法は、ＣＨ３ドメインに変異を導入して接触界面を修飾することにより、２つの異なる抗体重鎖の対合を強制することを目標とする。一方の重鎖上では、短い側鎖を有するアミノ酸で元々のアミノ酸が置き換えられて、「ホール」が作り出された。反対に、長い側鎖を有するアミノ酸が他方のＣＨ３ドメインに導入されて、「ノブ」が作り出された。これら２つの重鎖（そして両方の重鎖に対して適切でなければならない２つの同一の軽鎖）を共発現することにより、ホモ二量体形成（「ホール−ホール」または「ノブ−ノブ」）に対して高い収率のヘテロ二量体形成（「ノブ−ホール」）が観察された（Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．９（１９９６）６１７−６２１、及びＷＯ９６／０２７０１１）。

重鎖／軽鎖のスクランブリングを最小限に抑えることは、抗体Ｆａｂ内における複雑な多ドメインのヘテロ二量体相互作用のためにより困難であった。重鎖／軽鎖スクランブリングに対処することを目標とする二重特異性抗体形式には、ＤＶＤ−Ｉｇ（二重可変ドメインＩｇ）（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２５，１２９０−１２９７（２００７））、交差（Ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ）Ｉｇ（ＳｃｈａｅｆｅｒＷｅｔａｌ（２０１１）ＰＮＡＳ１０８（２７）：１１１８７−１１１９２）、ツー・イン・ワン（Ｔｗｏ−ｉｎ−Ｏｎｅ）Ｉｇ（Ｓｃｉｅｎｃｅ２００９，３２３，１６１０）、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体（ＰＮＡＳ９２（１５）：７０２１−７０２５；１９９５）、ならびに、Ｌｅｗｉｓｅｔａｌ．（２０１４）“ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄｄｅｓｉｇｎｏｆａｎｏｒｔｈｏｇｏｎａｌＦａｂｉｎｔｅｒｆａｃｅ．”ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３２，１９１−８、Ｌｉｕｅｔａｌ．（２０１５）“ＡＮｏｖｅｌＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＳｔｒａｔｅｇｙｆｏｒＭａｋｉｎｇＭｏｎｏｖａｌｅｎｔＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃＨｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃＩｇＧＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｙＥｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃＳｔｅｅｒｉｎｇＭｅｃｈａｎｉｓｍ．”ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．（２０１５年１月１２日オンライン公開、ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１４．６２０２６０）、Ｍａｚｏｒｅｔａｌ．２０１５．“ＩｍｐｒｏｖｉｎｇｔａｒｇｅｔｃｅｌｌｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｕｓｉｎｇａｎｏｖｅｌｍｏｎｏｖａｌｅｎｔｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃＩｇＧｄｅｓｉｇｎ．”Ｍａｂｓ．（２０１５年１月２６日オンライン公開、ｄｏｉ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１５．１００７８１６）、ＷＯ２０１４／０８１９５５、ＷＯ２０１４／０８２１７９、及びＷＯ２０１４／１５０９７３に記載の方略が含まれる。

誤対合した重鎖／軽鎖の副産物を低減させ、二重特異性抗体の収率を増加させる必要性が、引き続き存在する。

以下により詳細に記載されるように、かかる非対称変異を含むように改変されている多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など）は、修飾を有しない配列を有する多特異性抗原結合タンパク質と比較した場合に、とりわけ、改善された正確な重鎖／軽鎖対合及び／または多特異性抗原結合タンパク質の改善された収率をもって、単一細胞内で産生される。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、正確な重鎖／軽鎖対合を促進する、ＶＨ／ＶＬ及び／またはＣＨ１／ＣＬ領域内の修飾（複数可）を含む。特定の他の実施形態では、多特異性抗原結合タンパク質は、多特異性抗原結合タンパク質の２つのアームのヘテロ二量体化を促進するＦｃ領域内の修飾（複数可）をさらに含む。

本明細書では、ａ）第１の重鎖ポリペプチド（Ｈ１）及び第１の軽鎖ポリペプチド（Ｌ１）を含む第１の抗原に結合する第１の重鎖／軽鎖対と、ｂ）第２の重鎖ポリペプチド（Ｈ２）及び第２の軽鎖ポリペプチド（Ｌ２）を含む第２の抗原に結合する第２の重鎖／軽鎖対と、を含み、各Ｈ１及びＨ２が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）を含み、各Ｌ１及びＬ２が、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインが、Ｓ１８３（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換を含み、Ｌ１のＣＬドメインが、Ｖ１３３（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換を含む、多特異性抗原結合タンパク質、またはその抗原結合断片が、提供される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、Ｌ１は、カッパ鎖である。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、Ｌ２は、カッパ鎖である。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、カッパ鎖である。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｓ１８３置換は、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｙ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｎ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｒ、及びＳ１８３Ｋから成る群から選択され、Ｖ１３３置換は、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｓ、Ｖ１３３Ｌ、Ｖ１３３Ｗ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３Ｒ、及びＶ１３３Ｄから成る群から選択される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＥＵ位置Ｓ１８３におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられ、Ｌ１のＣＬドメイン上のＶ１３３におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられる。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＥＵ位置Ｓ１８３におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられ、Ｌ１のＣＬドメイン上のＶ１３３におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられる。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、正荷電残基は、Ｒ及びＫから成る群から選択される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、負荷電残基は、Ｄ及びＥから成る群から選択される。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換から成り、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換から成る。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｄ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｓ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｌ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｗ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｒ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｄ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｔ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｔ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｓ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｔ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｌ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｔ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｗ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｔ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｔ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｒ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｔ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｄ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｖ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｖ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｓ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｖ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｌ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｖ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｗ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｖ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｖ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｒ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｖ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｄ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｙ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｙ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｓ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｙ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｌ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｙ変異を含み、Ｌ１ドメインのＣＬは、Ｖ１３３Ｗ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｙ変異を含み、Ｌ１ドメインのＣＬは、Ｖ１３３Ｋ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｙ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｒ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｙ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｄ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｆ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｆ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｓ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｆ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｌ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｆ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｗ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｆ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｆ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｒ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｆ変異を含み、Ｌ１ドメインのＣＬは、Ｖ１３３Ｄ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｈ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｓ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｈ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｌ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｈ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｗ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｎ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｌ変異を含むか、または、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｌ変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｄ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｔ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含むか、または、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｖ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ変異を含む。

特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｄ変異から成り、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異から成るか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ変異から成り、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異から成るか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｔ変異から成り、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異から成るか、または、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｖ変異から成り、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ変異から成る。特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ変異から成り、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ変異から成る。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ２のＣＨ１ドメイン及び／またはＬ２のＣＬドメインは、アミノ酸置換を含まない。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３における置換を含まず、Ｌ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３における置換を含まない。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含み、Ｌ１及び／またはＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ＶＨドメイン内のＱ３９におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられ、ＶＬドメイン内のＱ３８におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられる。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ＶＨドメイン内のＱ３９におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられ、ＶＬドメイン内のＱ３８におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられる。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、正荷電残基は、Ｒ及びＫから成る群から選択される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、負荷電残基は、Ｄ及びＥから成る群から選択される。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＥＵ位置Ｓ１８３におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられ、ＶＨドメイン内のＱ３９位におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられ、Ｌ１のＣＬドメイン上のＶ１３３位におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられ、ＶＬドメイン内のＱ３８におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられる（Ｋａｂａｔ付番）。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＥＵ位置Ｓ１８３におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられ、ＶＨドメイン内のＱ３９におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられ、Ｌ１のＣＬドメイン上のＶ１３３におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられ、ＶＬドメイン内のＱ３８におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられる（Ｋａｂａｔ付番）。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＥＵ位置Ｓ１８３におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられ、ＶＨドメイン内のＱ３９におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられ、Ｌ１のＣＬドメイン上のＶ１３３におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられ、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられる（Ｋａｂａｔ付番）。さらなる実施形態において、Ｈ２のＣＨ１ドメイン上のＥＵ位置Ｓ１８３におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられ、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられ、Ｌ２のＣＬドメイン上のＶ１３３におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられ、ＶＬドメイン内のＱ３８におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられる（Ｋａｂａｔ付番）。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（全てＫａｂａｔ付番）を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（全てＫａｂａｔ付番）を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（全てＫａｂａｔ付番）を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、２つの置換アミノ酸間の相互作用は、水素結合によるものである。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、２つの置換アミノ酸間の相互作用は、静電相互作用によるものである。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｔ置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｙ置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｆ置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２のそれぞれは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４Ｆｃである。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２のＦｃ領域は、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２、またはマウスＩｇＧ４Ｆｃである。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１及びＨ２のＣＨ３ドメインはそれぞれ界面で交わり、ＣＨ３ドメインのそれぞれは、Ｈ１のＦｃ領域がＨ１と比較してＨ２のＦｃ領域と優先的に対合するようなアミノ酸置換を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ＣＨ３ドメイン内のアミノ酸置換は、より高い静電的相補性をもたらす。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ＣＨ３ドメイン内のアミノ酸置換は、より高い立体的相補性をもたらす。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ＣＨ３／ＣＨ３界面内で、１個以上のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有する１個以上のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ２のＣＨ３ドメインと相互作用するＨ１のＣＨ３ドメインの表面上に隆起が生成されるように、Ｈ１のＣＨ３ドメインが変更され、かつ、ＣＨ３／ＣＨ３界面内で、１個以上のアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ１のＣＨ３ドメインと相互作用するＨ２のＣＨ３ドメインの表面上に空洞が生成されるように、Ｈ２のＣＨ３ドメインが変更される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ＣＨ３／ＣＨ３界面内で、１個以上のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有する１個以上のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ１のＣＨ３ドメインと相互作用するＨ２のＣＨ３ドメインの表面上に隆起が生成されるように、Ｈ２のＣＨ３ドメインが変更され、かつ、ＣＨ３／ＣＨ３界面内で、１個以上のアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ２のＣＨ３ドメインと相互作用するＨ１のＣＨ３ドメインの表面上に空洞が生成されるように、Ｈ１のＣＨ３ドメインが変更される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、隆起は、ノブ変異である。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ノブを生成するための変更は、Ｔ３６６Ｗ（ＥＵ付番）である。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、空洞は、ホール変異（ＥＵ付番）である。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ホールを生成するための変更は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖのうちの少なくとも１つである。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ノブは、Ｔ３６６Ｗ（ＥＵ付番）を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てを含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ＣＨ１／ＣＬ界面内で、２個以上のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有する同等数のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｌ１のＣＬドメインと相互作用するＨ１のＣＨ１ドメインの表面上に隆起が生成されるように、Ｈ１のＣＨ１ドメインがさらに変更され、かつ、ＣＨ１／ＣＬ界面内で、２個以上のアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有する同等数のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ１のＣＨ１ドメインと相互作用するＬ１のＣＬドメインの表面上に空洞が生成されるように、Ｌ１のＣＬドメインがさらに変更される。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ＣＨ１／ＣＬ界面内で、２個以上のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有する同等数のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ１のＣＨ１ドメインと相互作用するＣＬドメインの表面上に隆起が生成されるように、ＣＬドメインがさらに変更され、かつ、ＣＨ１／ＣＬ界面内で、２個以上のアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有する同等数のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、ＣＬドメインと相互作用するＨ１のＣＨ１ドメインの表面上に空洞が生成されるように、Ｈ１のＣＨ１ドメインがさらに変更される。

また、本明細書では、ａ）第１の重鎖ポリペプチド（Ｈ１）及び第１の軽鎖ポリペプチド（Ｌ１）を含む第１の重鎖／軽鎖対と、ｂ）第２の重鎖ポリペプチド（Ｈ２）及び第２の軽鎖ポリペプチド（Ｌ２）を含む第２の重鎖／軽鎖対と、を含み、各Ｈ１及びＨ２が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）を含み、各Ｌ１及びＬ２が、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインが、Ｆ１７０（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換を含み、Ｌ１のＣＬドメインが、Ｓ１７６（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換を含む、多特異性抗原結合タンパク質、またはその抗原結合断片が、提供される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、Ｌ１は、カッパ鎖である。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、Ｌ２は、カッパ鎖である。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、カッパ鎖である。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１、Ｓ１８１、Ｓ１８３、及びＶ１８５（ＥＵ付番）から成る群から選択される位置における１個以上のアミノ酸置換をさらに含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｓ１６２、Ｓ１７４、及びＴ１７８（ＥＵ付番）から成る群から選択される位置における１個以上のアミノ酸置換をさらに含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、立体的相補性をもたらす。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ＣＨ１のＡ１４１、Ｆ１７０、Ｓ１８１、Ｓ１８３、及びＶ１８５（ＥＵ付番）から成る群から選択される位置における１個以上のアミノ酸置換、及び／またはＣＬのＦ１１６、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｓ１６２、Ｓ１７４、Ｓ１７６、及びＴ１７８（ＥＵ付番）から成る群から選択される位置における１個以上のアミノ酸置換は、荷電アミノ酸残基で置換されない。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ及びＦ１７０Ａから成る群から選択されるアミノ酸置換を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｓ１７６Ｆのアミノ酸置換を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｓ１７６Ｆ変異を含むか、または、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｓ１７６Ｆ変異を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｓ１７６Ｆ変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ｖ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｖ１３３Ｉ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１３１Ｄ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｉ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、または、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ａ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ｖ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含む。
上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、アミノ酸置換変異Ｖ１３３Ｋ（ＥＵ付番）を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、アミノ酸置換変異Ｖ１３３（ＥＵ付番）を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３位におけるアミノ酸は、正荷電アミノ酸に置き換えられ、Ｌ２のＣＬドメイン内のＶ１３３位におけるアミノ酸は、負荷電アミノ酸に置き換えられる。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３位におけるアミノ酸は、負荷電アミノ酸に置き換えられ、Ｌ２のＣＬドメイン内のＶ１３３位におけるアミノ酸は、正荷電アミノ酸に置き換えられる。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異（ＥＵ付番）を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異（ＥＵ付番）を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、及びＳ１８３Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、及びＳ１７６Ｆ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、及びＳ１８３Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、及びＳ１７６Ｆ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ及びＳ１７６Ｆ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、及びＳ１８３Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ及びＳ１７６Ｆ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、及びＳ１８１Ｍ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ及びＳ１７６Ｆ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、及びＳ１７６Ｆ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、及びＳ１７６Ｆ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、及びＳ１７６Ｆ変異を含むか、または、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、及びＳ１７６Ｆ変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、及びＳ１８３Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、及びＳ１７６Ｆ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、及びＳ１８３Ａ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、及びＳ１７６Ｆ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、及びＳ１７６Ｆ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、及びＳ１７６Ｆ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、及びＳ１７６Ｆ変異を含むか、または、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、及びＳ１７６Ｆ変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、及びＳ１８１Ｍ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、及びＳ１７６Ｆ変異を含む。

本明細書では、ａ）第１の重鎖配列（Ｈ１）及び第１の軽鎖配列（Ｌ１）を含む第１の重鎖／軽鎖対と、ｂ）第２の重鎖配列（Ｈ２）及び第２の軽鎖配列（Ｌ２）を含む第２の重鎖／軽鎖対と、を含み、各Ｈ１及びＨ２が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）を含み、各Ｌ１及びＬ２が、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインが、Ｌ１２８及びＶ１８５（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換を含み、Ｃ１のＣＬドメインが、Ｆ１１８及びＬ１３５（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換を含む、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合断片が、提供される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、Ｌ１は、カッパ鎖である。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、Ｌ２は、カッパ鎖である。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、カッパ鎖である。

また、本明細書では、ａ）第１の重鎖配列（Ｈ１）及び第１の軽鎖配列（Ｌ１）を含む第１の重鎖／軽鎖対と、ｂ）第２の重鎖配列（Ｈ２）及び第２の軽鎖配列（Ｌ２）を含む第２の重鎖／軽鎖対と、を含み、各Ｈ１及びＨ２が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）を含み、各Ｌ１及びＬ２が、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインが、Ｌ１２８（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換を含み、Ｃ１のＣＬドメインが、Ｆ１１８及びＬ１３５（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換を含む、抗原結合タンパク質、またはその抗原結合断片が、提供される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、Ｌ１は、カッパ鎖である。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、Ｌ２は、カッパ鎖である。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、Ｌ１及びＬ２はそれぞれ、カッパ鎖である。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｖ１８５（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換をさらに含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１、Ｆ１７０、Ｓ１８１、及びＳ１８３（ＥＵ付番）から成る群から選択される位置における１個以上のアミノ酸置換をさらに含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｓ１６２、Ｔ１６４、Ｓ１７６、及びＴ１７８（ＥＵ付番）から成る群から選択される位置における１個以上のアミノ酸置換をさらに含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、より高い立体的相補性をもたらす。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１、Ｆ１７０、Ｓ１８１、及びＳ１８３から成る群から選択される位置におけるアミノ酸置換を含み、ＣＬドメインは、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｓ１６２、Ｔ１６４、Ｓ１７６及びＴ１７８から成る群から選択される位置におけるアミノ酸置換を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ＣＨ１のＬ１２８Ａ１４１、Ｆ１７０、Ｓ１８１、Ｓ１８３、Ｖ１８５（ＥＵ付番）から成る群から選択される位置における１個以上のアミノ酸置換、及び／またはＣＬのＦ１１８、Ｓ１３１、Ｖ１３３、及びＬ１３５Ｓ１６２、Ｔ１６４、Ｓ１７６、及びＴ１７８（ＥＵ付番）から成る群から選択される位置における１個以上のアミノ酸置換は、荷電アミノ酸残基で置換されない。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｉ、及びＳ１８３Ａ変異を含み、ＣＬドメインは、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｙ、Ｓ１６２Ａ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｍ、及びＴ１７８Ｌ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、ＣＬドメインは、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ変異を含むか、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｔ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｔ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ｌ変異を含み、ＣＬドメインは、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｔ、及びＴ１７８Ｌ変異を含むか、または、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｔ、及びＳ１８３Ａ変異を含み、ＣＬドメインは、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ｍ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｍ、及びＴ１７８Ｌ変異を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、ＣＬドメインは、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ変異を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３におけるアミノ酸置換を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３におけるアミノ酸置換を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ２のＣＨ１ドメイン上のＥＵ位置Ｓ１８３におけるアミノ酸置換と、Ｌ２のＣＬドメイン上のＥＵ位置Ｖ１３３におけるアミノ酸置換との間の相互作用は、静電相互作用によるものである。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ２のＣＨ１ドメイン上のＥＵ位置Ｓ１８３におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられ、Ｌ２のＣＬドメイン上のＥＵ位置Ｖ１３３におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられる。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ２のＣＨ１ドメイン上のＥＵ位置Ｓ１８３におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられ、Ｌ２のＣＬドメイン上のＥＵ位置Ｖ１３３におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられる。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｙ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｎ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｒ、及びＳ１８３Ｋから成る群から選択される位置におけるアミノ酸置換を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｓ、Ｖ１３３Ｌ、Ｖ１３３Ｗ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３Ｒ、及びＶ１３３Ｄから成る群から選択される位置におけるアミノ酸置換を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｄの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｋの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｅの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｋの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ａの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｅの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ａの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｓの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ａの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｌの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ａの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｗの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ａの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｋの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ａの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｒの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ａの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｄの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｔの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｅの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｔの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｓの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｔの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｌの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｔの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｗの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｔの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｋの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｔの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｒの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｔの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｄの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｖの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｅの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｖの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｓの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｖの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｌの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｖの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｗの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｖの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｋの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｖの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｒの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｖの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｄの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｙの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｅの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｙの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｓの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｙの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｌの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｙの変異を含み、Ｌ２ドメインのＣＬは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｗの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｙの変異を含み、Ｌ２ドメインのＣＬは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｋの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｙの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｒの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｙの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｄの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｆの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｅの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｆの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｓの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｆの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｌの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｆの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｗの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｆの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｋの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｆの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｒの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｆの変異を含み、Ｌ２ドメインのＣＬは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｄの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｈの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｓの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｈの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｌの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｈの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｗの変異を含むか、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｎの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｌの変異を含むか、または、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｅの変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｌの変異を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ２のＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置Ｓ１８３Ｄの置換を含み、Ｌ２のＣＬドメインは、ＥＵ位置Ｖ１３３Ｋの置換を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ２のＣＨ１ドメイン及びＬ２のＶＬドメインは、アミノ酸置換を含まない。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３９におけるアミノ酸置換を含み、Ｖ１のＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３８におけるアミノ酸置換を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメイン上のＫａｂａｔ位置Ｑ３９におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられ、Ｌ１のＶＬドメイン上のＫａｂａｔ位置Ｑ３８におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられる。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメイン上のＫａｂａｔ位置Ｑ３９におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられ、Ｌ１のＶＬドメイン上のＫａｂａｔ位置Ｑ３８におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられる。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、正荷電残基は、Ｒ及びＫから成る群から選択される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、負荷電残基は、Ｄ及びＥから成る群から選択される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３９Ｅの置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３８Ｋの置換を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３９Ｋの置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３８Ｅの置換変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３９Ｅの置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３８Ｋの置換を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３９Ｅの置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３８Ｋの置換を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３９Ｋの置換変異を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３９Ｅの置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３８Ｋの置換を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３９Ｋの置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３８Ｅの置換変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３９Ｋの置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３８Ｅの置換を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３９Ｋの置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３８Ｅの置換を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３９Ｅの置換変異を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１のＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３９Ｋの置換変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３８Ｅの置換を含み、Ｈ２のＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３９Ｅの置換変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインは、Ｋａｂａｔ位置Ｑ３８Ｋの置換変異を含む。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１は、Ｌ２と比較してＬ１と優先的に対合し、Ｈ２は、Ｌ１と比較してＬ２と優先的に対合する。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２のＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４Ｆｃである。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２のＦｃ領域は、マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２、またはマウスＩｇＧ４Ｆｃである。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１及びＨ２のＣＨ３ドメインはそれぞれ界面で交わり、ＣＨ３ドメインのそれぞれは、Ｈ１のＦｃ領域がＨ１と比較してＨ２のＦｃ領域と優先的に対合するようなアミノ酸置換を含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ＣＨ３ドメイン内のアミノ酸置換は、より高い静電的相補性をもたらす。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ＣＨ３ドメイン内のアミノ酸置換は、より高い立体的相補性をもたらす。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ＣＨ３／ＣＨ３界面内で、１個以上のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有する１個以上のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ２のＣＨ３ドメインと相互作用するＨ１のＣＨ３ドメインの表面上に隆起が生成されるように、Ｈ１のＣＨ３ドメインが変更され、かつ、ＣＨ３／ＣＨ３界面内で、１個以上のアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ１のＣＨ３ドメインと相互作用するＨ２のＣＨ３ドメインの表面上に空洞が生成されるように、Ｈ２のＣＨ３ドメインが変更される。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ＣＨ３／ＣＨ３界面内で、１個以上のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有する１個以上のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ１のＣＨ３ドメインと相互作用するＨ２のＣＨ３ドメインの表面上に隆起が生成されるように、Ｈ２のＣＨ３ドメインが変更され、かつ、ＣＨ３／ＣＨ３界面内で、１個以上のアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ２のＣＨ３ドメインと相互作用するＨ１のＣＨ３ドメインの表面上に空洞が生成されるように、Ｈ１のＣＨ３ドメインが変更される。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、隆起は、ノブである。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ノブを生成するための変更は、Ｔ３６６Ｗである。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、空洞は、ホールである。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、ホールを生成するための変更は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖのうちの少なくとも１つである。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、第１の抗原及び第２の抗原は同じである。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、第１の重鎖／軽鎖対及び第２の重鎖／軽鎖対はそれぞれ、同じ抗原上の異なるエピトープに結合する。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、第１の抗原及び第２の抗原は異なる。

また、本明細書では、上記の実施形態のいずれかに記載の多特異性抗原結合タンパク質と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物が提供される。本明細書ではさらに、個体における疾患の治療方法であって、上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）薬学的組成物を有効量で個体に投与することを含む方法が提供される。

上記の実施形態のいずれか１つに記載の多特異性抗原結合タンパク質の少なくとも１つのポリペプチド配列をコードする、単離された核酸（複数可）が提供される。また、上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）核酸（複数可）を含むベクターが提供される。また、上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）核酸（複数可）または上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）ベクターを含む、単離された宿主細胞が提供される。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、宿主細胞は、原核宿主細胞、及びＥ．ｃｏｌｉ細胞、真核宿主細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、またはＣＨＯ細胞である。

本明細書では、上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）多特異性抗原結合タンパク質の産生方法であって、（ａ）Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、及びＬ２ポリペプチドを得ることと、（ｂ）多特異性抗原結合タンパク質を形成するように、Ｈ１に、Ｌ２と比較してＬ１と優先的に対合させ、Ｈ２に、Ｌ１と比較してＬ２と優先的に対合させることと、を含む方法が、提供される。

また、上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）多特異性抗原結合タンパク質の産生方法であって、（ａ）Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、及びＬ２をコードする一式のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することと、（ｂ）宿主細胞を培養して多特異性抗原結合タンパク質を産生することと、を含む方法が、提供される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、及びＬ２をコードする一式のポリヌクレオチドは、同じ宿主細胞に導入される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、及びＬ２をコードする一式のポリヌクレオチドは、細胞株に導入される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、細胞株は、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、及びＬ２を安定に共発現する安定細胞株である。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、細胞株は、多特異性抗原結合タンパク質を安定に発現する安定細胞株である。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、及びＬ２をコードする一式のポリヌクレオチドは、既定の比率で宿主細胞に導入される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、本方法は、宿主細胞への導入のためのポリヌクレオチドの最適な比率を決定することをさらに含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、６０％以上の相対収率で産生される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または約９９％超の相対収率で産生される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または約９９％超の相対収率で産生される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または約９９％超の相対収率で産生される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９９％、または約９９％超の相対収率で産生される。

上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）宿主細胞を培養することと、多特異性抗原結合タンパク質を産生することと、を含む、多特異性抗原結合タンパク質の産生方法も提供される。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、本方法は、多特異性抗原結合タンパク質を回収することをさらに含む。上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）方法によって産生された多特異性抗原結合タンパク質も提供される。

本明細書では、上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）複数の多特異性抗原結合タンパク質をコードする複数のポリヌクレオチドを含むライブラリが提供される。また、第１の抗原及び第２の抗原に結合する多特異性抗原結合タンパク質のスクリーニング方法であって、（ａ）上記の実施形態のいずれかに従う（またはそれに適用される）ライブラリから複数の多特異性抗原結合タンパク質を得ることと、（ｂ）第１及び第２の抗原に対する複数の多特異性抗原結合タンパク質の結合についてアッセイすることと、（ｃ）第１及び第２の抗原に結合する多特異性抗原結合タンパク質を特定することと、を含む方法が、提供される。

また、１）第１の重鎖配列（Ｈ１）及び第１の軽鎖配列（Ｌ１）を含む第１の抗原に結合する第１の重鎖／軽鎖対と、２）第２の重鎖配列（Ｈ２）及び第２の軽鎖配列（Ｌ２）を含む第２の抗原に結合する第２の重鎖／軽鎖対と、を含み、各Ｈ１及びＨ２が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）を含み、各Ｌ１及びＬ２が、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む、多特異性抗原結合タンパク質を評価するための、コンピュータ可読媒体であって、ａ）Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、及びＬ２内のアミノ酸置換を表すデータを含むデータセットであって、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つが、ＥＵ位置Ｆ１７０もしくはＬ１２８及びＶ１８５におけるアミノ酸置換を含み、ＣＬドメインが、ＥＵ位置Ｓ１７６もしくはＦ１１８及びＬ１３５におけるアミノ酸置換を含む、データセット、及び／または、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、及びＬ２内のアミノ酸置換を表すデータを含むデータセットであって、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つが、ＥＵ位置Ｓ１８３におけるアミノ酸置換を含み、Ｃ１が、ＥＵ位置Ｖ１３３におけるアミノ酸置換を含む、データセット、ならびに、（ｂ）Ｈ１がＬ２と比較してＬ１と優先的に対合する尤度及び／またはＨ２がＬ１と比較してＬ２と優先的に対合する尤度を決定するためのコンピュータ実行可能コード、を含むコンピュータ可読媒体が、提供される。

また、１）第１の重鎖配列（Ｈ１）及び第１の軽鎖配列（Ｌ１）を含む第１の抗原に結合する第１の重鎖／軽鎖対と、２）第２の重鎖配列（Ｈ２）及び第２の軽鎖配列（Ｌ２）を含む第２の抗原に結合する第２の重鎖／軽鎖対と、を含み、各Ｈ１及びＨ２が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）を含み、各Ｌ１及びＬ２が、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む、多特異性抗原結合タンパク質を評価するための、コンピュータ可読媒体であって、ａ）Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、及びＬ２内のアミノ酸置換を表すデータを含むデータセットであって、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つが、ＥＵ位置Ｆ１７０もしくはＬ１２８におけるアミノ酸置換を含み、ＣＬドメインが、ＥＵ位置Ｓ１７６もしくはＦ１１８及びＬ１３５におけるアミノ酸置換を含む、データセット、及び／または、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、及びＬ２内のアミノ酸置換を表すデータを含むデータセットであって、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つが、ＥＵ位置Ｓ１８３におけるアミノ酸置換を含み、Ｃ１が、ＥＵ位置Ｖ１３３におけるアミノ酸置換を含む、データセット、ならびに、（ｂ）Ｈ１がＬ２と比較してＬ１と優先的に対合する尤度及び／またはＨ２がＬ１と比較してＬ２と優先的に対合する尤度を決定するためのコンピュータ実行可能コード、を含むコンピュータ可読媒体が、提供される。特定の実施形態では、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、及びＬ２内のアミノ酸置換を表すデータを含むデータセットにおいて、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つは、ＥＵ位置Ｆ１７０またはＬ１２８及びＶ１８５におけるアミノ酸置換を含む。

（図１Ａ及び図１Ｂ）Ｌ１２８位、Ｇ１４３位、Ｌ１４５位、Ｓ１８３位、またはＶ１８５位における置換変異を有する重鎖と、Ｆ１１８、Ｖ１３３、またはＬ１３５における置換を有する軽鎖とを含む抗体の、１ｍｌの２９３Ｔ培養物からのタンパク質Ａの回収を示す。（図１Ａ及び図１Ｂ）Ｌ１２８位、Ｇ１４３位、Ｌ１４５位、Ｓ１８３位、またはＶ１８５位における置換変異を有する重鎖と、Ｆ１１８、Ｖ１３３、またはＬ１３５における置換を有する軽鎖とを含む抗体の、１ｍｌの２９３Ｔ培養物からのタンパク質Ａの回収を示す。Ｆ１１８、Ｖ１３３、またはＬ１３５置換変異を有するＣＬと共発現されたときに抗体発現を回復させるＣＨ１内のアミノ酸変異を特定するために行われた、哺乳動物培養発現アッセイの結果を提供する。軽鎖定常領域（ＣＬ）と重鎖ＣＨ１ドメインとの界面の内側の概略図を提供する。Ｖ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ置換変異を有する軽鎖／重鎖対を発現する培養物中での抗体発現を分析するために行われた、哺乳動物培養発現アッセイの結果を提供する。ＶＨＱ３９もしくはＶＬＱ３８、またはその両方のいずれかにアミノ酸置換を有する様々な変異体抗体の抗原ＩＬ−１３に対する結合のＦＡＣＳ分析の結果を示す。ＶＨ／ＶＬ対合を優先するＱ３９Ｘ−ＶＨ／Ｑ３８Ｘ−ＶＬ変異体対を特定するために行われた、追加のＦＡＣＳ分析の結果。ＶＨ／ＶＬ対合を優先するＱ３９Ｘ−ＶＨ／Ｑ３８Ｘ−ＶＬ変異体対を特定するために行われた、哺乳動物培養発現アッセイの結果を示す。哺乳動物で共発現された抗体からＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析によって測定された、正確な重鎖−軽鎖対合を有する二重特異性抗体変異形の存在％の例示的な結果を示す。試験した変異体がＸ軸上に示されている。変異の各セットにおける４文字は、それぞれ、Ｑ３９Ｘ_ＨＣ１／Ｑ３８Ｘ_ＬＣ１ノブ／Ｑ３９Ｘ_ＨＣ２／Ｑ３８Ｘ_ＬＣ２ホールにおけるアミノ酸置換を指す。４Ｄ５／ＵＣＨＴ１二重特異性抗体における重鎖／軽鎖対合を査定するために行われた、ＱＴＯＦアッセイの結果を示す。４Ｄ５アームが、Ｑ３８Ｋ変異を有するＶＬ及びＱ３９Ｅ変異を有するＶＨを含むように、かつ、ＵＣＨＴ１アームが、Ｑ３８Ｅ変異を有するＶＬ及びＱ３９Ｋ変異を有するＶＨを含むように修飾された（「ＥＫＫＥ」）、４Ｄ５／ＵＣＨＴ１二重特異性抗体における重鎖／軽鎖対合を査定するために行われた、ＱＴＯＦアッセイの結果を示す。図１０Ｂの拡大図を示す。ＵＣＨＴ１アームがＶＬ−Ｑ３８Ｅ変異、ＣＬ−Ｖ１３３Ｋ変異、ＶＨ−Ｑ３９Ｋ変異、及びＣＨ−１−Ｓ１８３Ｅ変異を含むように修飾され、かつ４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体の４Ｄ５アームがＶＬ−Ｑ３８Ｋ変異及びＶＨ−Ｑ３９Ｅ変異を含むように修飾された、二重特異性４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体における重鎖／軽鎖対合を査定するために行われた、高分解能質量分析の結果を示す。図１０Ｄの拡大図を示す。ＵＣＨＴ１アームがＣＬ−Ｖ１３３Ｋ変異及びＣＨ−１−Ｓ１８３Ｅ変異を含むように修飾された二重特異性４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体における重鎖／軽鎖対合を査定するために行われた、高分解能質量分析の結果を示す。野生型（ＷＴ）二重特異性４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体における重鎖／軽鎖対合を査定するために行われた、高分解能質量分析の結果を示す。野生型４Ｄ５Ｆａｂと、ＶＬ−Ｑ３８Ｋ変異、ＣＬ−Ｖ１３３Ｅ変異、ＶＨ−Ｑ３９Ｅ変異、及びＣＨ１−Ｓ１８３Ｋ変異を有するように修飾された４Ｄ５Ｆａｂとの、結晶構造の重なりを示す。修飾された４Ｄ５ＦａｂのＶＬ−Ｑ３８Ｋ及びＶＨ−Ｑ３９Ｅによって形成された結合（例えば、塩橋及び水素結合）を示す。修飾された４Ｄ５ＦａｂのＣＬ−Ｖ１３３Ｅ及びＣＨ１−Ｓ１８３Ｋによって形成された結合（例えば、塩橋及び水素結合）を示す。野生型４Ｄ５Ｆａｂと、ＶＬ−Ｑ３８Ｅ変異、ＣＬ−Ｖ１３３Ｋ変異、ＶＨ−Ｑ３９Ｋ変異、及びＣＨ１−Ｓ１８３Ｅ変異を有するように修飾された４Ｄ５Ｆａｂとの、結晶構造の重なりを示す。修飾された４Ｄ５ＦａｂのＶＬ−Ｑ３８Ｅ及びＶＨ−Ｑ３９Ｋによって形成された結合を示す。修飾された４Ｄ５ＦａｂのＣＬ−Ｖ１３３Ｋ及びＣＨ１−Ｓ１８３Ｅによって形成された結合を示す。変異体ＣＨ１／ＣＬ対を生成するための１つの設計手法（すなわち、「手法Ａ」）を図示する。４Ｄ５／ＵＣＨＴ１二重特異性抗体（抗ＨＥＲ２／抗ＣＤ３）の変異体ＣＨ１／ＣＬ対を生成するための第２の設計手法（すなわち、「手法Ｂ」）を図示する。単一細胞共発現からの二重特異性ＩｇＧ含有量を判定するために使用された、サンドイッチＥＬＩＳＡ実験の概略図を示す。ＪＳ２０、ＪＳ７８、ＹＳ１８、及びＹＴ６５変異形に行われたサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す。ＪＳ２０（配列番号４９）、ＪＳ７８（配列番号５０）、ＪＴ２０（配列番号５１）、ＪＴ２５（配列番号５２）、ＹＳ０８（配列番号２８）、ＹＳ１８（配列番号２９）、ＹＴ６５（配列番号２９）、及びＹＴ３４変異形（配列番号４４）の重鎖の一部分のアミノ酸配列を提供する。図１６Ａは、４Ｄ５野生型重鎖「４Ｄ５ｗｔ−Ｈｃ」（配列番号６７）の一部分のアミノ酸配列も提供する。ＪＳ２０（配列番号６９）、ＪＳ７８（配列番号７０）、ＪＴ２０（配列番号７１）、ＪＴ２５（配列番号７２）、ＹＳ０８（配列番号７３）、ＹＳ１８（配列番号７４）、ＹＴ６５（配列番号７５）、及びＹＴ３４変異形（配列番号７６）の軽鎖の一部分のアミノ酸配列を提供する。図１６Ｂは、４Ｄ５野生型軽鎖「４Ｄ５ｗｔ−Ｌｃ」（配列番号６８）の一部分のアミノ酸配列も提供する。野生型４Ｄ５／ＵＣＨＴ１共発現二重特異性抗体に行われた質量分析の結果を示す。４Ｄ５アーム上のＹＴ６５ＣＨ１／ＣＬ変異ならびにＶＨ−Ｑ３９Ｅ変異及びＶＬ−Ｑ３８Ｋ変異と、ＵＣＨＴ１アーム上のＶＬ−Ｑ３８Ｅ変異及びＶＨ−Ｑ３９Ｋ変異とを含む４Ｄ５／ＵＣＨＴ１共発現抗体に行われた、質量分析の結果を示す。野生型４Ｄ５／ＵＣＨＴ１二重特異性抗体に行われた質量分析の結果を示す。４Ｄ５アーム上のＹＴ６５ＣＨ１／ＣＬ変異ならびにＶＨ−Ｑ３９Ｅ変異及びＶＬ−Ｑ３８Ｋ変異と、ＵＣＨＴ１アーム上のＶＬ−Ｑ３８Ｅ変異及びＶＨ−Ｑ３９Ｋ変異とを含む４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体に行われた、質量分析の結果を示す。ＹＴ６５（配列番号７８）、ＹＴ６５．１（配列番号７９）、ＹＴ６５．２（配列番号８０）、ＹＴ６５．３（配列番号８１）、ＹＴ６５．４（配列番号８２）、ＹＴ６５．５（配列番号８３）、ＹＴ６５．６（配列番号８４）、ＹＴ６５．７（配列番号８５）、ＹＴ６５．８（配列番号８６）、ＹＴ６５．９（配列番号８７）、ＹＴ６５．１０（配列番号８８）、ＹＴ６５．１１（配列番号８９）、ＹＴ６５．１２（配列番号９０）、及びＹＴ６５．１３変異形（配列番号９１）の重鎖の一部分のアミノ酸配列を提供する。４Ｄ５野生型重鎖配列「４Ｄ５ｗｔ−Ｈｃ」の一部分を配列番号７７として開示する。図１９Ｂは、ＹＴ６５（配列番号９３）、ＹＴ６５．１（配列番号９４）、ＹＴ６５．２（配列番号９５）、ＹＴ６５．３（配列番号９６）、ＹＴ６５．４（配列番号９７）、ＹＴ６５．５（配列番号９８）、ＹＴ６５．６（配列番号９９）、及びＹＴ６５．７変異形（配列番号１００）の軽鎖の一部分のアミノ酸配列を提供する。図１９Ｂは、４Ｄ５野生型軽鎖配列「４Ｄ５ｗｔ−Ｌｃ」の一部分を配列番号９２として開示する。４Ｄ５アーム上のＹＴ６５ＣＨ１／ＣＬ変異ならびにＶＨ−Ｑ３９Ｅ変異及びＶＬ−Ｑ３８Ｋ変異と、ＵＣＨＴ１アーム上のＶＨ−Ｑ３９Ｋ変異及びＶＬ−Ｑ３８Ｅ変異とを含む４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体に行われた、ｐＨ中性未変性質量分析の結果を示す。図２０Ａのデータを得るために使用された分析の検出感度を確認するために行われた実験の結果を示す。抗ＩＬ４／ＩＬ１３、抗ＥＧＦＲ／ＭＥＴ、抗ＶＥＧＦＡ／ＡＮＧ２抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣ、及び抗ＨＥＲ２／ＣＤ３（すなわち、４Ｄ５／ＵＣＨＴ１）二重特異性抗体における重鎖／軽鎖対合に対するＹＴ６５、ＥＫＫＥ、及びＹＴ６５とＥＫＫＥとの両方の効果を査定するために行われた、高分解能質量分析実験の定量的結果を示す。ＶＬ−Ｑ３８Ｋ変異、ＶＨ−Ｑ３９Ｅ変異、及びＹＴ６５変異を有するように修飾された４Ｄ５Ｆａｂの結晶構造を示す。野生型４Ｄ５ＦａｂのＣＨ１ドメインと、ＹＴ６５変異を有するように修飾された４Ｄ５ＦａｂのＣＨ１ドメインとの、結晶構造の重なりを示す。インビトロＴ細胞媒介性Ｂ細胞細胞傷害アッセイにおける、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３＋ＥＫＫＥ＋Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ_ホール、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３＋ＥＫＫＥ＋ＹＴ６５_ノブ、及び未修飾の抗ＨＥＲ２／ＣＤ３の生物活性を示す。Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスへの抗体の５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与後の様々な時点における、（ｉ）抗ＨＥＲ２、（ｉｉ）抗ｇＤ／ＣＤ３、（ｉｉｉ）抗ＨＥＲ２／ＣＤ３、（ｉｖ）抗ＨＥＲ２／ＣＤ３＋ＥＫＫＥ＋ＹＴ６５_ノブ、及び（ｉｖ）抗ＨＥＲ２／ＣＤ３＋ＥＫＫＥ＋Ｖ１３３Ｅ／Ｓ１８３Ｋ_ノブ＋Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ_ホールの平均血清レベルを示す。

本明細書に別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹＯＦＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，２ＤＥｄ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９４）、及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｇｈａｍ，ＴＨＥＨＡＲＰＥＲＣＯＬＬＩＮＳＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹＯＦＢＩＯＬＯＧＹ，ＨａｒｐｅｒＰｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）は、本発明で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法及び材料を本発明の実践または試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を記載する。数値範囲は、その範囲を定義する数の境界値を含む。別段の記載がない限り、それぞれ、核酸は５’から３’への配向で左から右に書かれ、アミノ酸配列はアミノからカルボキシへの配向で左から右に書かれる。当該技術分野の定義及び用語について、実践者は特にＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９、及びＡｕｓｕｂｅｌＦＭｅｔａｌ．，１９９３を参照されたい。方法論、プロトコル、及び試薬は異なり得るため、本発明は、記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬に限定されないものと理解されたい。

数値範囲は、その範囲を定義する数の境界値を含む。

別段の記載がない限り、それぞれ、核酸は５’から３’への配向で左から右に書かれ、アミノ酸配列はアミノからカルボキシへの配向で左から右に書かれる。

本明細書において提供される見出しは、本明細書全体を参照することにより得ることのできる様々な態様または実施形態の限定ではない。したがって、直下に定義される用語は、本明細書全体を参照することによって、より十分に定義される。

定義
本明細書における「多特異性抗原結合タンパク質」という用語は、２つ以上の抗原に結合することのできる結合タンパク質を指すよう最も広義に使用される。特定の態様において、多特異性結合タンパク質は、二重特異性抗体、例えば、ヒト二重特異性抗体、ヒト化二重特異性抗体、キメラ二重特異性抗体、またはマウス二重特異性抗体を指す。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質、例えば二重特異性抗体などは、２つの異なる抗原に結合する。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質、例えば二重特異性抗体などは、１つの抗原上の異なるエピトープに結合する。

本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、ならびにその任意の断片、変異体、変異形、または派生物が所望の生物活性（例えば、エピトープ結合活性）を示す限り、それらを指す。抗体の例としては、本明細書に記載されるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片が挙げられる。抗体は、マウス型、キメラ型、ヒト型、ヒト化型、及び／または親和性成熟型であり得る。

基準枠として、本明細書において使用される場合、抗体は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の構造を指す。しかしながら、任意の免疫グロブリンクラスの抗体が本明細書に記載の発明的な方法に利用され得ることは、当業者には理解／認識されよう。明確にするために述べると、ＩｇＧ分子は、一対の重鎖（ＨＣ）及び一対の軽鎖（ＬＣ）を含む。各ＬＣは、１つの可変ドメイン（ＶＬ）及び１つの定常ドメイン（ＣＬ）を有し、各ＨＣは、１つの可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとは、ヒンジ領域で接続されている。この構造は当該技術分野において周知である。

簡潔に述べると、基本的な４本鎖抗体ユニットは、２つの軽（Ｌ）鎖及び２つの重（Ｈ）鎖から構成されたヘテロ四量体糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれるさらなるポリペプチドと併せて、５つの基本的なヘテロ四量体ユニットから成り、したがって１０個の抗原結合部位を含み、一方で、分泌型ＩｇＡ抗体は、Ｊ鎖と併せて２〜５つの基本的な４本鎖ユニットを含む多価集合体を形成するように重合することができる）。ＩｇＧの場合、４本鎖ユニットは、概して約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つのジスルフィド共有結合によってＨ鎖に連結されており、一方で、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて、１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結されている。各Ｈ鎖及びＬ鎖は、規則的に離隔した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有し、続いてα鎖及びγ鎖のそれぞれについては３つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）、そしてμ及びεアイソタイプについては４つのＣ_Ｈドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を有し、続いてその他方の端部に定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を有する。Ｖ_ＬはＶ_Ｈと並び、Ｃ_Ｌは、重鎖の第１の定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）と並んでいる。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。Ｖ_ＨとＶ_Ｌとが一緒に対合することにより、単一の抗原結合部位が形成される。異なるクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，ＤａｎｉｅｌＰ．Ｓｔｉｔｅｓ，ＡｂｂａＩ．ＴｅｒｒａｎｄＴｒｉｓｔｒａｍＧ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，ｐａｇｅ７１ａｎｄＣｈａｐｔｅｒ６を参照されたい。

いかなる脊椎動物種由来のＬ鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に異なる種類のうちの一方に割り当てられ得る。それらの重鎖の定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンが、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てられ得る。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つのクラスが存在し、それぞれ、α、δ、γ、ε、及びμと称される重鎖を有する。γ及びαクラスは、Ｃ_Ｈ配列及び機能の比較的わずかな差異に基づいてサブクラスにさらに分割され、例えば、ヒトは、次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２を発現する。

「ＶＬ」ドメインという用語には、免疫グロブリン軽鎖のアミノ末端可変ドメインが含まれる。

「ＶＨドメイン」という用語には、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインが含まれる。

「ＣＬドメイン」という用語には、例えばＫａｂａｔ位置でおよそ１０７Ａ〜２１６（ＥＵ位置１０８〜２１４（カッパ））に伸びる免疫グロブリン軽鎖の定常領域ドメインが含まれる。カッパＣドメインのＥｕ／Ｋａｂａｔ変換表が、以下に提供される。ＣＬドメインはＶＬドメインに隣接しており、免疫グロブリン軽鎖のカルボキシ末端を含む。遺伝子スプライシングの結果として成熟ＣＬドメイン内に存在するＮ末端のＲ残基を含む、ヒトカッパ軽鎖のＣＬドメインの例示的なアミノ酸配列が、下記の配列番号３０に示されている。

本明細書において使用される場合、ヒトＩｇＧの「ＣＨ１ドメイン」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔ付番方式でおよそ１１４位〜２２３位（ＥＵ位置１１８〜２１５）に伸びる免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端側の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接しており、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側にあり、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の一部を形成せず、かつ、免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（すなわち、「ＣＬ」）と二量体化することができる。

ＩｇＧ１重鎖（配列番号６５）のＥＵ／Ｋａｂａｔ変換表が、以下に提供される。例示的なＣＨ１配列は配列番号５３に示され、ヒンジ配列は配列番号１２９に示され、ＣＨ２配列は配列番号１３０に示され、ＣＨ３配列は配列番号１３１に示されている。

本明細書において使用される場合、「相補性」という用語は、例えば本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質の重鎖のＣＨ１と軽鎖のＣＬとの界面における、重鎖／軽鎖対合に影響を及ぼす相互作用の組み合わせを指す。「立体的相補性」または「立体構造相補性」は、例えば、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣＬドメインとの相互作用表面における、三次元構造の適合性を指す。「静電的相補性」は、例えば、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣＬドメイン、及び／または重鎖のＶＨドメインと軽鎖のＶＬドメインとの相互作用表面における、負荷電原子及び／または正荷電原子の配置の適合性を指す。

ヒトＩｇＧＦｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」という用語は、通常、ＥＵ付番方式によるＩｇＧの残基およそ２３１〜およそ３４０を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合しないという点で独特である。そうではなく、２つのＮ結合分岐状炭水化物鎖が、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に介在している。この炭水化物は、ドメイン−ドメイン対合の代替を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化に役立ち得ると推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌ．ｌｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５）。

「ＣＨ３ドメイン」という用語は、Ｆｃ領域内のＣＨ２ドメインに対してＣ末端側の残基（すなわち、ＥＵ付番方式によるとＩｇＧのおよそアミノ酸残基３４１〜およそアミノ酸残基４４７）を含む。

本明細書において使用される「Ｆｃ領域」という用語は、概して、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含む二量体複合体を指し、ここでＣ末端ポリペプチド配列は、インタクト抗体のパパイン消化によって得ることのできるものである。Ｆｃ領域は、天然または変異形のＦｃ配列を含み得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ配列の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ配列は、およそＣｙｓ２２６位から、またはおよそＰｒｏ２３０位から、Ｆｃ配列のカルボキシル末端までを含む。本明細書で別段の指定がない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されている、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ付番方式に従う。免疫グロブリンのＦｃ配列は、概して、２つの定常ドメイン、１つのＣＨ２ドメイン、及び１つのＣＨ３ドメインを含み、場合によりＣＨ４ドメインを含む。本明細書における「Ｆｃポリペプチド」とは、Ｆｃ領域を構成するポリペプチドのうちの１つ、例えば単量体Ｆｃを意味する。Ｆｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭなどの、任意の好適な免疫グロブリンから得ることができる。Ｆｃポリペプチドは、マウス、例えばマウスＩｇＧ２ａから得てもよい。Ｆｃ領域は、ジスルフィドによって互いに結び付けられたＨ鎖両方のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域内の配列によって決定され、この領域はまた、特定の型の細胞に見られるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分である。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、野生型ヒンジ配列（一般にそのＮ末端にある）の一部または全てを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、機能的または野生型のヒンジ配列を含まない。

「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を保有する。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが挙げられる。このようなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域と結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）との結合を必要とし、例えば、本明細書における定義に開示される様々なアッセイを使用して査定することができる。

「天然配列Ｆｃ領域」は、自然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域には、天然配列ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、天然配列ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域、天然配列ヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域、及び天然配列ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域、ならびにそれらの自然発生変異形が含まれる。天然配列Ｆｃ領域には、天然配列マウスＩｇＧ２ａも含まれる。

「変異形Ｆｃ領域」は、少なくとも１個のアミノ酸修飾、好ましくは１個以上のアミノ酸置換（複数可）によって天然配列Ｆｃ領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異形Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１個のアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域内または親ポリペプチドのＦｃ領域内に約１個〜約１０個のアミノ酸置換、好ましくは約１個〜約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書における変異形Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域及び／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくはそれらと少なくとも約９０％の相同性、より好ましくはそれらと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の相同性を保有する。

本明細書において使用される「Ｆｃ構成要素」は、ヒンジ領域、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン、またはＣＨ３ドメインを指す。

特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、好ましくは野生型ヒトＩｇＧＦｃ領域に由来する、ＩｇＧＦｃ領域を含む。特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、マウスＩｇＧ２ａなどの「野生型」マウスＩｇＧに由来する。「野生型」ヒトＩｇＧＦｃまたは「野生型」マウスＩｇＧＦｃとは、それぞれ、ヒト集団またはマウス集団内で自然に発生するアミノ酸の配列を意味する。当然ながら、Ｆｃ配列が個体間でわずかに異なり得るのと全く同じように、野生型配列に１つ以上の変更を行っても依然として本発明の範囲内のままであり得る。例えば、Ｆｃ領域は、グリコシル化部位の変異または非天然アミノ酸の包含などの変更を含んでもよい。

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般に、各ドメインが４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む同様の構造を有する。（例えば、Ｋｉｎｄｔｅｔａｌ．ＫｕｂｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６１ｓｔｅｄ．，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．，ｐａｇｅ９１（２００７）を参照されたい。）抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインで十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、それぞれ、相補的なＶＬドメインまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングするために、その抗原に結合する抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを使用して単離することができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい。

本明細書において使用される「抗原結合アーム」、「標的分子結合アーム」、「標的結合アーム」という表現、及びそれらの変化形は、目的の標的に特異的に結合する能力を有する、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の構成部分を指す。概して、また好ましくは、抗原結合アームは、免疫グロブリンポリペプチド配列、例えば、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のＣＤＲ及び／または可変ドメイン配列の複合体である。

「標的」または「標的分子」は、多特異性抗原結合タンパク質の結合アームによって認識される部分を指す。例えば、多特異性抗原結合タンパク質が抗体である場合、標的は、文脈に応じて、単一の分子上もしくは異なる分子上のエピトープ、または病原体もしくは腫瘍細胞であり得る。同様に、多特異性抗原結合タンパク質が受容体−Ｆｃ融合タンパク質である場合、標的は、その受容体に対する同族の結合パートナーである。標的が標的結合アームの結合特異性によって決定されること、及び異なる標的結合アームが異なる標的を認識し得ることは、当業者には理解されよう。標的は、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質と、１μＭＫｄ（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析による）よりも高い親和性で結合することが好ましい。標的分子の例としては、サイトカイン及び／またはサイトカイン受容体、アドヘシン、成長因子及び／またはそれらの受容体、ホルモン、ウイルス粒子（例えば、ＲＳＶＦタンパク質、ＣＭＶ、ＳｔａｐｈＡ、インフルエンザ、Ｃ型肝炎ウイルス）、微生物（例えば、細菌細胞タンパク質、真菌細胞）、アドヘシン、ＣＤタンパク質及びそれらの受容体などの血清可溶性タンパク質及び／またはそれらの受容体が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において使用される「界面」という用語は、第１の抗体ドメイン内の１つ以上のアミノ酸と、第２の抗体ドメインの１つ以上のアミノ酸との相互作用から生じる、会合表面を指す。例示的な界面としては、例えば、ＣＨ１／ＣＬ、ＶＨ／ＶＬ、及びＣＨ３／ＣＨ３が挙げられる。いくつかの実施形態では、界面は、例えば、界面を形成するアミノ酸間の水素結合、静電相互作用、または塩橋を含む。

「インタクト」または「全長」の抗体の一例は、抗原結合アーム、ならびにＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異形であり得る。

本明細書において使用される「カップリング」という用語は、第１及び第２の重鎖ポリペプチド（すなわち、Ｈ１及びＨ２）を互いに連結させるために必要なステップ、例えば、共有結合の形成を指す。そのようなステップには、鎖間ジスルフィド結合を形成するための、第１及び第２の重鎖ポリペプチド（すなわち、Ｈ１及びＨ２）内のシステイン残基の還元、アニーリング、及び／または酸化が含まれる。カップリングは、化学的な架橋またはレドックス系の使用によって実現され得る。例えば、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓｅｔａｌ．，Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９８）２１７：１−１０、及びＺｈｕｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．，（１９９４）８６：１２７−１３４を参照されたい。

「単一特異性」抗原結合タンパク質は、抗体などの抗原結合タンパク質が１つのエピトープのみに結合する能力を指す。「二重特異性」抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質が２つの異なるエピトープに結合する能力を指す。「多特異性」抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質が１つより多くのエピトープに結合する能力を指す。特定の実施形態において、多特異性抗体などの多特異性抗原結合タンパク質は、二重特異性抗原結合タンパク質または二重特異性抗体を包含する。本明細書において提供される二重特異性及び多特異性の抗原結合タンパク質については、エピトープは同じ抗原上に存在してもよく、各エピトープが異なる抗原上に存在してもよい。したがって、特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質、例えば二重特異性抗体などは、２つの異なる抗原に結合する。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質、例えば二重特異性抗体などは、１つの抗原上の異なるエピトープに結合する。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、約≦１μＭ、約≦１００ｎＭ、約≦１０ｎＭ、約≦１ｎＭ、約≦０．１ｎＭ、約≦０．０１ｎＭ、または約≦０．００１ｎＭ（例えば、約１０^−８Ｍ以下、例えば、約１０^−８Ｍ〜約１０^−１３Ｍ、例えば、約１０^−９Ｍ〜約１０^−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）で、各エピトープに結合する。

「抗体断片」は、インタクト抗体の一部分、好ましくはインタクト抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及びＦｖ断片；ダイアボディ（Ｄｂ）；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、線状抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号、Ｚａｐａｔａｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；一アーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ、一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多特異性抗体（例えば、Ｄｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−ＣＨ３、及び（ｓｃＦＶ）４−Ｆｃを含むがこれらに限定されない）が挙げられる。

本明細書において提供される抗体は、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖（複数可）の残部が、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに、そのような抗体の断片とすることができるが、ただし、それらが所望の生物活性を示すことを条件とする（米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書における目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）由来の可変ドメイン抗原結合配列と、ヒト定常領域配列とを含む、霊長類化抗体が含まれる。

非ヒト（例えば、齧歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する配列を最小限に含んだキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の抗体特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基に置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、ここで、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むことになる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。

本明細書において使用される「複合体」または「複合された」は、ペプチド結合ではない結合及び／または力（例えば、ファンデルワールス力、疎水性力、親水性力）によって互いに相互作用する２個以上の分子の会合を指す。一実施形態において、複合体は、ヘテロ多量体である。本明細書において使用される「タンパク質複合体」または「ポリペプチド複合体」という用語には、タンパク質複合体中のタンパク質に非タンパク質要素（例えば、毒素または検出剤などの化学分子を含むがこれらに限定されない）が共役した複合体が含まれることを理解されたい。

本明細書において提供される、「目的の抗原に結合する」多特異性抗原結合タンパク質は、多特異性抗原結合タンパク質が、タンパク質またはそのタンパク質を発現する細胞もしくは組織の標的化において診断剤及び／または治療剤として有用であり、かつ他のタンパク質と著しく交差反応しないような十分な親和性で、抗原、例えばタンパク質と結合するものである。そのような実施形態では、「非標的」タンパク質に対する抗原結合タンパク質の結合の程度は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）またはＥＬＩＳＡによって判定した場合の、抗体のその特定の標的タンパク質に対する結合の約１０％未満となる。標的分子に対する多特異性抗原結合タンパク質の結合に関して、特定のポリペプチド標的上の特定のポリペプチドもしくはエピトープの「特異的結合」、またはそれに「特異的に結合する」、またはそれに「特異的な」という用語は、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する（例えば、非特異的相互作用は、ウシ血清アルブミンまたはカゼインへの結合であり得る）。特異的結合は、例えば、ある分子の結合を対照分子の結合と比較して判定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的と同様の対照分子、例えば、過剰な非標識標的との競合によって判定することができる。この事例では、プローブに対する標識標的の結合が、過剰な非標識標的によって競合的に阻害される場合に、特異的結合が示される。本明細書において使用される特定のポリペプチド標的上の特定のポリペプチドまたはエピトープの「特異的結合」、またはそれに「特異的に結合する」、またはそれに「特異的な」という用語は、例えば、少なくとも約２００ｎＭ、あるいは少なくとも約１５０ｎＭ、あるいは少なくとも約１００ｎＭ、あるいは少なくとも約６０ｎＭ、あるいは少なくとも約５０ｎＭ、あるいは少なくとも約４０ｎＭ、あるいは少なくとも約３０ｎＭ、あるいは少なくとも約２０ｎＭ、あるいは少なくとも約１０ｎＭ、あるいは少なくとも約８ｎＭ、あるいは少なくとも約６ｎＭ、あるいは少なくとも約４ｎＭ、あるいは少なくとも約２ｎＭ、あるいは少なくとも約１ｎＭ、またはより高い親和性の標的に対するＫｄを有する分子によって示され得る。一実施形態において、「特異的結合」という用語は、多特異性抗原結合タンパク質が、特定のポリペプチド上の特定のポリペプチドまたはエピトープに結合し、いかなる他のポリペプチドまたはポリペプチドのエピトープにも実質的に結合しないことを指す。

「結合親和性」は、一般に、分子（例えば、抗体または多特異性抗原結合タンパク質）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との非共有結合的相互作用の合計の強度を指す。別段の記載がない限り、本明細書において使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。例えば、Ｋｄは、約２００ｎＭ以下、約１５０ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約６０ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約８ｎＭ以下、約６ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下であり得る。親和性は、本明細書に記載の方法を含め、当該技術分野で知られる一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、概して、抗原にゆっくり結合し、容易に解離する傾向があり、一方で高親和性抗体は、概して、抗原により速く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性の多様な測定方法が当該技術分野で知られており、それらのいずれも、本発明において使用することができる。

一実施形態において、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、−１０応答単位（ＲＵ）において、固定化された標的（例えば、抗原）ＣＭ５チップを用い、２５℃でＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用した、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって測定される。簡潔に述べると、カルボキシメチル化デキストリンバイオセンサチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅＩｎｃ．）を、供給業者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で作動させる。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）まで希釈した後、カップリングされたタンパク質のおよそ１０応答単位（ＲＵ）を実現するように、５μｌ／分の流量で注入する。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロッキングする。動態測定については、Ｆａｂの２倍段階希釈（例えば、０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流量で注入する。会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、単純な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅＥｖａｌｕａｔｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合センサグラムと解離センサグラムとを同時に当てはめることによって計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによるオン速度が１０^６Ｍ^−１ｓ^−１を超える場合、このオン速度は、撹拌されたキュベットを備えるストップフロー装着分光光度計（ＡｖｉｖＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の上昇または減少を測定する、蛍光消光技法を使用することによって、判定することができる。

本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質、例えば抗体（例えば、二重特異性抗体）、断片、またはそれらの誘導体などに関する、「生物学的に活性な」及び「生物活性」及び「生物学的特徴」は、別段の指定がある場合を除いて、生体分子に結合する能力を有することを意味する。

「単離された」とは、様々なヘテロ多量体ポリペプチドを説明するために使用される場合、ヘテロ多量体が、それが発現された細胞もしくは細胞培養物から分離及び／または回収されていることを意味する。その自然環境の混入成分は、ヘテロ多量体の診断上または治療上の使用を妨げる材料であり、これには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれ得る。特定の実施形態において、ヘテロ多量体は、（１）ローリー法により判定した場合にタンパク質の９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップ配列決定装置（ｓｐｉｎｎｉｎｇｃｕｐｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用によってＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染料を使用して、還元条件もしくは非還元条件下でＳＤＳＰＡＧＥにより均質になるまで、精製される。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。

本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、概して、実質的な均質性が得られるまで精製される。「実質的に均質な」、「実質的に均質な形態」」、及び「実質的な均質性」という表現は、望ましくないポリペプチドの組み合わせから生じる副産物を実質的に欠いている生成物（例えば、ホモ多量体）を示すために使用される。

純度に関して表現される、実質的な均質性とは、副産物の量が、１０重量％、９重量％、８重量％、７重量％、６重量％、４重量％、３重量％、２重量％、もしくは１重量％を超えないこと、または１重量％未満であることを意味する。一実施形態において、副産物は５％未満である。

「生体分子」は、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、及びそれらの組み合わせを指す。一実施形態において、生体分子は、天然に存在する。

抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異形Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプに応じて異なる。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。

「抗体依存性細胞媒介細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌型Ｉｇにより、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原を有する標的細胞に特異的に結合し、その後、細胞傷害剤で標的細胞を殺滅することが可能になる、細胞傷害の形態を指す。抗体は細胞傷害性細胞を「備えて」おり、このような殺滅には絶対的に必要である。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方で単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈａｎｄＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を査定するためには、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載のものなどのインビトロＡＤＣＣアッセイを行うことができる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているものなどの動物モデルにおいて査定することができる。

「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表す。好ましいＦｃＲは、ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、これには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が、これらの受容体の対立遺伝子変異形及び選択的スプライシング形態を含めて含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれ、これらは、それらの細胞質側ドメインが主に異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質側ドメイン内に免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質側ドメイン内に免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（概説Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）を参照されたい）。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈａｎｄＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２５−３４（１９９４）、及びｄｅＨａａｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）において概説されている。他のＦｃＲは、将来特定されるものも含め、本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。この用語には、胎児への母体ＩｇＧの移入に関与する、新生児型受容体であるＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。

「ヒトエフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現し、かつエフェクター機能を行う白血球である。好ましくは、この細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を行う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球が挙げられ、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、天然の源、例えば血液から単離することができる。

「体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、同族抗原に結合している（適切なサブクラスの）抗体に補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分が結合することにより開始される。補体活性化を査定するためには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏｅｔａｌ．，Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）に記載のＣＤＣアッセイを行うことができる。

「治療有効量」という用語は、対象における疾患もしくは障害を治療するための抗体（多特異性抗体を含む）、その抗原結合抗体断片、またはその誘導体の量を指す。腫瘍（例えば、がん性腫瘍）の場合、治療有効量の抗体または抗体断片（例えば、多特異性抗体または抗体断片は、がん細胞の数の低減、原発腫瘍サイズの低減、がん細胞が末梢器官に浸潤することの阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）、腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）、腫瘍成長のある程度の阻害、及び／または障害に関連する症状のうちの１つ以上のある程度の緩和を行うことができる。抗体またはその抗体断片またはその誘導体が、成長の防止及び／または既存のがん細胞の殺滅を行うことができる限り、それは、細胞増殖抑制性及び／または細胞傷害性であり得る。がん療法に関して、インビボでの有効性は、例えば、生存期間、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）、奏効率（ＲＲ）、奏効期間、及び／または生活の質を査定することによって測定することができる。

ここで「低減または阻害」とは、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。低減または阻害は、治療されている障害の症状、転移の存在もしくはサイズ、原発腫瘍のサイズ、または血管形成障害における血管のサイズもしくは数に言及する場合がある。

「がん」及び「がん性」という用語は、未制御の細胞成長／増殖によって典型的に特徴付けられる哺乳動物の生理的状態を指すか、またはそれを表す。この定義には、良性及び悪性のがんが含まれる。がんの例としては、細胞腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。そのようながんのより具体的な例としては、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜のがん、肝細胞がん、消化管がんを含む胃がん、膵臓がん、膠芽腫、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞腫、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓がん（例えば、腎細胞癌）、肝臓がん、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、及び様々な種類の頭頸部がんが挙げられる。ここで「早期がん」とは、浸潤性もしくは転移性ではないがん、または０期、Ｉ期、もしくはＩＩ期のがんとして分類されるがんを意味する。「前がん性」という用語は、典型的にがんに先行するかもしくはがんに発達する病態または成長を指す。ここで「非転移性」とは、良性であるがん、あるいは、原発部位に留まり、リンパ管もしくは血管系または原発部位以外の組織に浸透していないがんを意味する。一般に、非転移性がんは、０期、Ｉ期、またはＩＩ期のがんであるあらゆるがん、そして時としてＩＩＩ期がんである。

本明細書における「自己免疫疾患」は、個体自体の組織から生じ、かつそれを対象とする疾患もしくは障害、またはその共分離もしくは顕在化、またはそれから生じる状態である。自己免疫疾患もしくは障害の例としては、リウマチ性関節炎、自己免疫性溶血性貧血（例えば、免疫汎血球減少症、発作性夜間ヘモグロビン尿症）、自己免疫性血小板減少症（例えば、特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症）、甲状腺炎（例えば、グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病Ｉ型またはインスリン依存性糖尿病、中枢神経系及び末梢神経系の脱髄性疾患（例えば、多発性硬化症、特発性脱髄性多発ニューロパチー、またはギラン・バレー症候群）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、水疱性皮膚症、多形性紅斑、接触性皮膚炎、ならびに自己免疫性慢性活動性肝炎が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において使用される「細胞傷害剤」という用語は、細胞の機能を阻害もしくは防止する物質、及び／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性アイソトープ（例えば、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｒａ^２２３、Ｐ^３２、及びＬｕの放射性アイソトープ）、化学療法剤、例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、もしくは他の挿入剤、核酸分解酵素などの酵素及びその断片、抗生物質、及び細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の小分子毒素または酵素活性毒素などの毒素（その断片及び／または変異形を含む）、ならびに本明細書に開示される様々な抗腫瘍剤、抗がん剤、及び化学療法剤を含むことを意図する。他の細胞傷害剤が本明細書に記載される。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。

本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される」または「薬学的に適合性の」とは、生物学的または他の理由で望ましくないことのない材料を意味し、例えば、この材料は、いかなる著しい望ましくない生物学的効果をも引き起こすことなく、またはそれが含有されている組成物の他の成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、患者に投与される薬学的組成物に組み込まれ得る。薬学的に許容される担体または賦形剤は、毒性学的及び製造的な試験の必要基準を満たしていること、及び／または米国食品医薬品局により作成されたＩｎａｃｔｉｖｅＩｎｇｒｅｄｉｅｎｔＧｕｉｄｅに含まれていることが好ましい。

本明細書において使用される「抗がん療法」は、対象のがんを低減または阻害する治療を指す。抗がん療法の例には、細胞傷害性放射線療法、ならびに、治療有効量の細胞傷害剤、化学療法剤、成長阻害剤、がんワクチン、血管形成阻害薬、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカイン拮抗薬、副腎皮質ステロイド、免疫抑制剤、制吐薬、抗体もしくは抗体断片、または鎮痛薬を対象に投与することが含まれる。

本出願に使用される「プロドラッグ」という用語は、親薬物と比較すると腫瘍細胞に対する細胞傷害性が低く、より活性な親形態に酵素的に活性化または変換されることのできる、薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態を指す。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，“ＰｒｏｄｒｕｇｓｉｎＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈＭｅｅｔｉｎｇＢｅｌｆａｓｔ（１９８６）、及びＳｔｅｌｌａｅｔａｌ．，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：ＡＣｈｅｍｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈｔｏＴａｒｇｅｔｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ，”ＤｉｒｅｃｔｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔｅｔａｌ．，（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ（１９８５）を参照されたい。プロドラッグとしては、より活性な細胞傷害性遊離薬物へと変換され得る、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、ベータ−ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されているフェノキシアセトアミドを含有するプロドラッグ、または任意に置換されているフェニルアセトアミドを含有するプロドラッグ、５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書における使用のためにプロドラッグ形態に誘導体化することのできる細胞傷害薬の例には、上述の化学療法剤が含まれるが、これらに限定されない。

「対象」は、哺乳動物などの脊椎動物、例えばヒトである。哺乳動物には、家畜（例えばウシなど）、競技用動物、愛玩動物（例えばネコ、イヌ、及びウマなど）、霊長類、マウス、及びラットが含まれるが、これらに限定されない。

文脈による別段の記載がある場合を除いて、「第１の」ポリペプチド（例えば重鎖（Ｈ１）または軽鎖（Ｌ１）など）、及び「第２の」ポリペプチド（例えば重鎖（Ｈ２）または軽鎖（Ｌ２）など）という用語、ならびにそれらの変化形は、単なる総称識別子であり、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の特定のもしくは具体的なポリペプチドまたは成分を特定するものと解釈されないものとする。

実施例で言及される市販の試薬は、別段の記載がない限り、製造業者の指示に従って使用した。以下の実施例及び本明細書全体においてＡＴＣＣ受入番号により特定される細胞の供給元は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡである。別段の注記がない限り、本発明は、本明細書上文、及び次の教本：Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（上記）、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＧｒｅｅｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９８９）、Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ．，ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９９０）、Ｈａｒｌｏｗｅｔａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，１９８８）、Ｇａｉｔ，ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ，１９８７、Ｃｏｌｉｇａｎｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９１に記載されるものなどの、組換えＤＮＡ技術の標準的手順を使用する。

本明細書における「約」の値またはパラメータへの言及は、本技術分野の当業者であれば容易に分かるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」の値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体に関する態様を含む（そして表す）。例えば、「約Ｘ」に言及する説明は、「Ｘ」の説明を含む。

本明細書に記載される本発明の態様及び実施形態には、態様及び実施形態を「含む」、それらから「成る」、及びそれらから「本質的に成る」が含まれることが理解される。

特許出願及び公報を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

変異体または修飾された重鎖／軽鎖対を含む多特異性抗原結合タンパク質
本出願は、重鎖／軽鎖対合選択性を改善させる、ＣＨ１／ＣＬ界面及び／またはＶＨ／ＶＬ界面における新規の変異の特定に基づく。

本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、重鎖ならびに軽鎖ポリペプチドの可変ドメイン及び／または定常ドメイン内にある特定の残基におけるアミノ酸修飾を含む。当業者には理解されるように、様々な付番の慣例が、ＩｇＧ可変領域配列内の特定のアミノ酸残基を指定するために用いられ得る。一般的に使用される付番の慣例には、Ｋａｂａｔ及びＥＵインデックスの付番が含まれる（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ，ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）を参照されたい）。可変ドメインの補正または代替的な付番方式を含む他の慣例には、Ｃｈｏｔｈｉａ（ＣｈｏｔｈｉａＣ，ＬｅｓｋＡＭ（１９８７），ＪＭａｌＢｉｏｌ１９６：９０１−９１７、Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔａｌ．（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７７−８８３）、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ，ｅｔａｌ．（２００３），ＤｅｖＣｏｍｐＩｍｍｕｎｏｌ２７：５５−７７）、及びＡＨｏ（ＨｏｎｅｇｇｅｒＡ，ＰｌｕｃｋｔｈｕｎＡ（２００１）ＪＭｏｌＢｉｏｌ３０９：６５７−６７０）が含まれる。これらの参考文献は、抗体配列の可変領域アミノ酸残基の位置を定義する、免疫グロブリン可変領域のアミノ酸配列付番スキームを提供する。

本明細書に別段の明示的な記載がない限り、実施例及び特許請求の範囲に記載される免疫グロブリン重鎖可変領域（すなわち、ＶＨ）アミノ酸残基（すなわち番号）への全ての言及は、Ｋａｂａｔ付番方式に基づくものであり、ＶＬ残基への全ての言及も同様である。実施例及び特許請求の範囲に記載される免疫グロブリン重鎖定常領域ＣＨ１残基（すなわち番号）への全ての言及は、ＥＵ方式に基づくものであり、ＣＬ残基への全ての言及も同様である。ＫａｂａｔまたはＥＵインデックス付番に従う残基番号の知識を用いて、当業者は、一般的に使用される付番の慣例のいずれかに従って、本明細書に記載されるアミノ酸配列修飾を特定することができる。

本明細書における実施例及び特許請求の範囲は、ＫａｂａｔまたはＥＵインデックスを用いて特定のアミノ酸残基を特定するが、本明細書に全体が援用される配列表に記載される配列番号は、所与のポリペプチド内のアミノ酸の連続的付番を行うものであり、したがって、ＫａｂａｔまたはＥＵインデックスにより提供される対応するアミノ酸番号と一致しないことが理解される。例えば、配列番号５３のセリン残基番号６６は、ＥＵ付番方式におけるＣＨ１のＳ１８３に対応する。

本明細書において提供される項目、成分、または要素（例えば「多特異性抗原結合タンパク質」）は、単数形で記載または特許請求され得るが、単数形への限定が明確に述べられている場合を除いて、複数形もその範囲内であることが想定される。

以下により詳細に記載されるように、本明細書では、修飾を有しない配列を有する多特異性抗原結合タンパク質と比較した場合に、改善された正確な重鎖／軽鎖対合及び／または改善された収率を有する、単一細胞内で産生され得る修飾された多特異性抗原結合タンパク質が提供される。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、正確な重鎖／軽鎖対合（すなわち、第１のエピトープに結合することのできる第１の重鎖／軽鎖対（すなわち、Ｈ１／Ｌ１）を形成するための第１の重鎖Ｈ１（またはその断片）と第１の軽鎖Ｌ１との対合、及び、第２の（例えば異なる）エピトープに結合することのできる第２の重鎖／軽鎖対（すなわち、Ｈ２／Ｌ２）を形成するための第２の重鎖Ｈ２（またはその断片）と第２の軽鎖Ｌ２との対合）を促進する、ＶＨ／ＶＬ及び／またはＣＨ１／ＣＬ領域内の修飾（複数可）を含む。「Ｈ１」及び「Ｈ２」という用語が独断的名称であり、上記の実施形態のいずれにおける「Ｈ１」及び「Ｈ２」も反転できることは、当業者には明らかであろう。すなわち、Ｈ１のＣＨ１ドメイン及びＬ１のＣＬドメイン内にあるものとして上述された変異のいずれも、代替的に、Ｈ２のＣＨ１ドメイン及びＬ２のＣＬドメイン内に存在することができる。

特定の他の実施形態では、多特異性抗原結合タンパク質は、多特異性抗原結合タンパク質の２つのアームのヘテロ二量体化を促進するＦｃ領域内の修飾（複数可）をさらに含む。

方略番号１
一態様において、驚くべきことに、重鎖のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３位（ＥＵ付番）に対する単一のアミノ酸修飾、及び軽鎖のＣＬドメイン内のＶ１３３（ＥＵ付番）位に対する単一のアミノ酸修飾が、修飾された重鎖と修飾された軽鎖との間の優先的対合、及び、例えば修飾された重鎖と修飾されていない軽鎖との間、または例えば修飾されていない重鎖と修飾された軽鎖との間の対合の低減を示すことが見出された。これらの残基は発現データから選択され、重鎖ＣＨ１ドメインならびに軽鎖ＣＬドメインの構造及び機能の知識ならびに研究によって確認された。図１〜３、１１Ｃ、及び１２Ｃを参照されたい。

したがって、特定の実施形態において、（ａ）第１の抗原に結合することができ、第１の重鎖ポリペプチド（Ｈ１）及び第１の軽鎖ポリペプチド（Ｌ１）を含む、第１の重鎖／軽鎖対と、（ｂ）第２の抗原に結合することができ、第２の重鎖ポリペプチド（Ｈ２）及び第２の軽鎖ポリペプチド（Ｌ２）を含む、第２の重鎖／軽鎖対と、を含み、各Ｈ１及びＨ２が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）を含み、各Ｌ１及びＬ２が、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインが、Ｓ１８３位（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換を含み、ＣＬドメインが、Ｖ１３３位（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換変異を含む、多特異性抗原結合タンパク質が提供される。特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３位（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換から成り（例えばそれから本質的に成り）、ＣＬドメインは、Ｖ１３３位（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換変異から成る（例えばそれから本質的に成る）。特定の実施形態において、第１の抗原及び第２の抗原は同じである。特定の実施形態において、第１の重鎖／軽鎖対及び第２の重鎖／軽鎖対はそれぞれ、同じ抗原上の異なるエピトープに結合する。特定の実施形態において、第１の抗原及び第２の抗原は異なる。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、２つの異なる抗原に結合する二重特異性抗体である。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、拮抗薬または作動薬抗体である。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、一方または両方の抗原に対する拮抗薬であり、一方で他の実施形態では、二重特異性抗体は、一方または両方の抗原に対する作動薬である。本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など）の抗原結合断片もまた想定される。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメイン上のＳ１８３位（ＥＵ付番）におけるアミノ酸は、正荷電アミノ酸残基に置き換えられ、多特異性抗原結合タンパク質のＣＬドメイン上のＶ１３３位（ＥＵ付番）におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられる。特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＳ１８３位（ＥＵ付番）におけるアミノ酸は、負荷電アミノ酸残基に置き換えられ、ＣＬドメイン上のＶ１３３位（ＥＵ付番）におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられる。特定の実施形態において、正荷電残基は、ＲまたはＫから成る群から選択される。特定の実施形態において、負荷電残基は、Ｄ及びＥから成る群から選択される。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｙ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｎ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｒ、及びＳ１８３Ｋ（ＥＵ付番）から成る群から選択されるアミノ酸置換を含み、ＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｓ、Ｖ１３３Ｌ、Ｖ１３３Ｗ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３Ｒ、及びＶ１３３Ｄ（ＥＵ付番）から成る群から選択されるアミノ酸置換を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｙ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｎ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｒ、及びＳ１８３Ｋ（ＥＵ付番）から成る群から選択されるアミノ酸置換から成り（例えばそれから本質的に成り）、ＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｓ、Ｖ１３３Ｌ、Ｖ１３３Ｗ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３Ｒ、及びＶ１３３Ｄ（ＥＵ付番）から成る群から選択されるアミノ酸置換から成る（例えばそれから本質的に成る）。

「Ｈ１」及び「Ｈ２」という用語が独断的名称であり、上記の実施形態のいずれにおける「Ｈ１」及び「Ｈ２」も反転できることは、当業者には明らかであろう。すなわち、Ｈ１のＣＨ１ドメイン及びＬ１のＣＬドメイン内にあるものとして上述された変異のいずれも、代替的に、Ｈ２のＣＨ１ドメイン及びＬ２のＣＬドメイン内に存在することができる。

したがって、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＳ１８３位（ＥＵ付番）における置換変異と、Ｌ１のＣＬドメイン上のＶ１３３位（ＥＵ付番）における置換変異との対の組み合わせのあらゆる可能性が想定される。特定の実施形態では、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＳ１８３位（ＥＵ付番）における置換変異と、Ｌ１のＣＬドメイン上のＶ１３３位（ＥＵ付番）における置換変異との特定の組み合わせが想定される。そのような組み合わせとしては、以下の表１に提供されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｓ１８３ＤまたはＳ１８３Ｅ変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｖ１３３Ｋ変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインとを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｈ１のＣＨ１ドメイン及びＬ１のＣＬドメインを含み、ＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３ＤまたはＳ１８３Ｅ変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ変異（ＥＵ付番）から成る。

２つの例示的なＩｇＧ１ＣＨ１ドメインアミノ酸配列（配列番号５３及び配列番号１０９）、例示的なＩｇＧ２ＣＨ１ドメインアミノ酸配列（配列番号１０９）、例示的なＩｇＧ２ＣＨ１ドメイン配列（配列番号１１０）、例示的なＩｇＧ３ＣＨ１ドメインアミノ酸配列（配列番号１１１）、例示的なＩｇＧ４ＣＨ１ドメインアミノ酸配列（配列番号１１２）、例示的なラムダＣＬドメインアミノ酸配列（配列番号１１３）、及び例示的なカッパＣＬドメインアミノ酸配列（配列番号５４）が、以下に提供される。

全長４Ｄ５ＩｇＧ１重鎖（配列番号５５）及び軽鎖（配列番号５６）のアミノ酸配列が、以下に提供される。
４Ｄ５ＨＣ（ヒトＩｇＧ１）：

４Ｄ５ＬＣ（ヒトカッパ）：

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、カッパ軽鎖を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、または配列番号１に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列、または配列番号２に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列、または配列番号３に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号４に記載のアミノ酸配列、または配列番号４に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号５に記載のアミノ酸配列、または配列番号５に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号６に記載のアミノ酸配列、または配列番号６に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号７に記載のアミノ酸配列、または配列番号７に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。

配列番号１〜７のアミノ酸配列が、以下の表２Ａに提供される。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、これらの配列のいずれかに記載されるＣＬドメインを含む、第１の軽鎖ポリペプチドＬ１を含む。配列番号５４に記載のＣＬドメインは、配列番号１〜７のアミノ酸１１〜１１６に対応する。したがって、Ｌ１は、配列番号１〜７のいずれかに記載のアミノ酸１１〜１１６を含む、ＣＬドメインを含み得る。

カッパ軽鎖のＣＬドメイン内のアミノ酸１３３位（ＥＵ付番）は、配列番号１〜７のアミノ酸３５位に対応する。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、ラムダ軽鎖を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１１４に記載のアミノ酸配列を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１１５に記載のアミノ酸配列を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１１６に記載のアミノ酸配列を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１１７に記載のアミノ酸配列を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１１８に記載のアミノ酸配列を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１１９に記載のアミノ酸配列を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１２０に記載のアミノ酸配列を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。

配列番号１１４〜１２０のアミノ酸配列が、以下の表２Ｂに提供される。

カッパ軽鎖のＣＬドメイン内のアミノ酸１３３位（ＥＵ付番）は、ラムダ軽鎖のＣＬドメイン内のアミノ酸１３３位（Ｋａｂａｔ付番）に対応し、これは、配列番号１１４〜１２０のアミノ酸２７位に対応する。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１重鎖、ＩｇＧ２重鎖、ＩｇＧ３重鎖、またはＩｇＧ４重鎖を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１０１に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１０２に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１２１に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１２２に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１２３に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１２４に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１２５に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１２６に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。

配列番号８〜１６、１０１〜１０２、及び１２１〜１２６のアミノ酸配列が、以下の表３に提供される。

ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＣＨ１ドメイン内のアミノ酸１８３位は、配列番号８〜１６、１０１〜１０２、及び１２１〜１２６のアミノ酸６４位に対応する。

配列番号１〜７または配列番号１〜７及び１１４〜１２０のアミノ酸１１〜１１６と、配列番号８〜１５、１０１〜１０２、及び１２１〜１２６との、あらゆる対の組み合わせの可能性が想定される。特定の実施形態では、配列番号１〜７または配列番号１〜７及び１１４〜１２０のアミノ酸１１〜１１６と、配列番号８〜１５及び１０１及び１０２との、特定の組み合わせが想定される。そのような組み合わせとしては、以下の表４に提供されるものが挙げられるが、これらに限定されない（別段の記載がない限り、ＨＣはＩｇＧ１ＨＣである）。

表４中の各対における第１の配列番号はＣＨ１ドメイン配列を指し、表４中の各対における第２の配列番号はＣＬドメイン配列を指す。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、ＣＨ１／ＣＬ変異を含み、変異を有しない多特異性抗原結合タンパク質もしくは変異を有しない各親の単一特異性抗原結合タンパク質と比較可能であるかまたはそれよりも優れている、正確なタンパク質フォールディング及び／または発現レベルを示す。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメイン及びＬ２のＣＬドメインは、アミノ酸置換を含まない。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１は、Ｓ１８３（ＥＵ付番）における置換を含まず、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬは、Ｖ１３３（ＥＵ付番）における置換を含まない。

特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のＨ１が由来する親のＨ１は、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のＬ１が由来する親のＬ１に対する著しい優先度を示さない。特定の実施形態において。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のＨ１が由来する親のＨ１は、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のＬ１が由来する親のＬ１に対する優先度を示す。

方略番号２
本出願人らは、コンピュータの誘導による設計及びヒトの誘導による設計に補助された第２の方略を使用し、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣＬドメインとの相互作用表面を再設計して、互いと立体的に適合性（例えば立体構造的に適合性）であるＣＨ１／ＣＬ変異体対を生成した。各ＣＨ１／ＣＬ変異体対における修飾されたＣＨ１ドメインは、野生型ＣＬとさほど立体的に適合性（例えば立体構造的に適合性）ではなく、野生型ＣＬとの対合の減少を示す。それに応じて、各ＣＨ１／ＣＬ変異体対における修飾されたＣＬドメインは、野生型ＣＨ１とさほど立体的に適合性（例えば立体構造的に適合性）ではなく、野生型ＣＨ１との対合の減少を示す。驚くべきことに、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの界面に修飾を含むＦａｂのＴｍが、ＣＨ１／ＣＬドメインに対応する変異を有しないＦａｂのＴｍと同じまたは実質的に同じであったことが発見された。

後述の設計方略を使用して特定される変異は、上記（すなわち、方略番号１）に詳解したＳ１８３／Ｖ１３３変異から独立して使用されてもよく、それに加えて使用されてもよい。

第１の手法（すなわち、「手法Ａ」）では、１個以上のアミノ酸置換変異を軽鎖のＣＬドメインに導入して、ＣＨ１ドメインと相互作用するＣＬドメインの表面上に「ノブ」（または隆起）を作り出した。それに応じて、１個以上のアミノ酸置換変異を重鎖のＣＨ１ドメインに導入して、ＣＬドメインと相互作用するＣＨ１ドメインの表面上に「ホール」（または空洞）を作り出した。例えば、図１１Ａを参照されたい。特定の実施形態において、修飾されたＣＨ１／ＣＬ配列を含む多特異性抗原結合タンパク質は、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメイン内にアミノ酸置換変異を有する重鎖と軽鎖との優先的対合をもたらす。特定の実施形態において、修飾されたＣＨ１／ＣＬ配列を含む多特異性抗原結合タンパク質は、対応するＣＨ１／ＣＬ変異を有しない多特異性抗原結合タンパク質と比較して上昇したタンパク質発現レベルを示す。特定の実施形態において、置換アミノ酸（複数可）は、荷電残基（複数可）に置き換えられない。

第２の手法（すなわち、「手法Ｂ」）では、２個以上のアミノ酸置換変異を軽鎖のＣＬドメインに導入して、ＣＨ１ドメインと相互作用するＣＬドメインの表面上に「ノブ」（または隆起）及び「ホール」（または空洞）を作り出した。それに応じて、２個以上の変異を重鎖のＣＨ１ドメインに導入して、ＣＬドメインと相互作用するＣＨ１ドメインの表面に「ホール」及び「ノブ」を作り出した。例えば、図１１Ｂを参照されたい。特定の実施形態において、修飾されたＣＨ１／ＣＬ配列を含む多特異性抗原結合タンパク質は、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメイン内にアミノ酸置換変異を有する重鎖と軽鎖との優先的対合を示す。特定の実施形態において、修飾されたＣＨ１／ＣＬ配列を含む多特異性抗原結合タンパク質は、対応するＣＨ１／ＣＬ変異を有しない多特異性抗原結合タンパク質と比較して増加したタンパク質発現を示す。特定の実施形態において、置換アミノ酸（複数可）は、荷電残基（複数可）に置き換えられない。

Ｈ１の修飾されたＣＨ１ドメイン及びＬ１の修飾されたＣＬドメインを含む多特異性抗原結合タンパク質は、重鎖／軽鎖対合に関する改善された安定性及び改善された特異性を示す。本明細書では、ａ）第１の抗原に結合することができ、第１の重鎖ポリペプチド（Ｈ１）及び第１の軽鎖ポリペプチド（Ｌ１）を含む、第１の重鎖／軽鎖対と、ｂ）第２の抗原に結合することができ、第２の重鎖ポリペプチド（Ｈ２）及び第２の軽鎖ポリペプチド（Ｌ２）を含む、第２の重鎖／軽鎖対と、を含み、各Ｈ１及びＨ２が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）を含み、各Ｌ１及びＬ２が、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインが、Ｆ１７０位（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換を含み、ＣＬドメインが、Ｓ１７６位（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換を含む、多特異性抗原結合タンパク質が提供される。特定の実施形態において、第１の抗原及び第２の抗原は同じである。特定の実施形態において、第１の重鎖／軽鎖対及び第２の重鎖／軽鎖対はそれぞれ、同じ抗原上の異なるエピトープに結合する。特定の実施形態において、第１の抗原及び第２の抗原は異なる。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１、Ｓ１８１、Ｓ１８３、及びＶ１８５（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｓ１６２、Ｓ１７４、及びＴ１７８（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｓ１６２、Ｓ１７４、及びＴ１７８（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６、Ｓ１３１、Ｌ１３５、Ｓ１６２、Ｓ１７４、及びＴ１７８（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６、Ｌ１３５、Ｓ１７４、及びＴ１７８（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６、Ｌ１３５、Ｓ１６２、Ｓ１７４、及びＴ１７８（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体的相補性をもたらす。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体構造相補性をもたらす。特定の実施形態において、置換アミノ酸（複数可）は、荷電残基（複数可）に置き換えられない。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１及びＦ１７０（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６、Ｌ１３５、Ｓ１７６、及びＴ１７８（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体的相補性をもたらす。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体構造相補性をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０、Ｓ１８１、及びＳ１８３（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６及びＳ１７６（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体的相補性をもたらす。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体構造相補性をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、アミノ酸置換Ｆ１７０（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６、Ｌ１３５、Ｓ１７４、Ｓ１７６、及びＴ１７８（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体的相補性をもたらす。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体構造相補性をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０、Ｓ１８３、及びＶ１８５（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６、Ｓ１７６、及びＴ１７８（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体的相補性をもたらす。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体構造相補性をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０、Ｓ１８１、及びＶ１８５（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６、Ｌ１３５、及びＳ１７６（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体的相補性をもたらす。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体構造相補性をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１及びＦ１７０（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６、Ｌ１３５、Ｓ１７４、Ｓ１７６、及びＴ１７８（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体的相補性をもたらす。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体構造相補性をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１、Ｆ１７０、及びＳ１８１（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６、Ｌ１３５、Ｓ１７４、Ｓ１７６、及びＴ１７８（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体的相補性をもたらす。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体構造相補性をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０、Ｓ１８１、Ｓ１８３、及びＶ１８５（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｌ１３５、Ｓ１７４、Ｓ１７６、及びＴ１７８（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体的相補性をもたらす。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体構造相補性をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１、Ｆ１７０、Ｓ１８３、及びＶ１８５（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６、Ｓ１７４、Ｓ１７６、及びＴ１７８（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体的相補性をもたらす。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体構造相補性をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１、Ｆ１７０、Ｓ１８１、及びＶ１８５（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６、Ｌ１３５、Ｓ１７６、及びＴ１７８（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体的相補性をもたらす。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体構造相補性をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１、Ｆ１７０、Ｓ１８１、及びＳ１８３（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６、Ｌ１３５、Ｓ１７４、及びＳ１７６（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体的相補性をもたらす。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体構造相補性をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、アミノ酸置換Ｆ１７０（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６、Ｌ１３５、Ｓ１７６、及びＴ１７８（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体的相補性をもたらす。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体構造相補性をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｆ１７０、及びＶ１８５（ＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６及びＳ１７６変異（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体構造相補性をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１、Ｆ１７０、及びＳ１８３（ＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６及びＳ１７６変異（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体構造相補性をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０及びＶ１８５（ＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６及びＳ１７６変異（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、立体構造相補性をもたらす。

特定の実施形態において、ＣＨ１／ＣＬ界面内で、ＣＨ１ドメインの１個以上のアミノ酸残基が、一部または全てがより大きな側鎖体積を有する同等数のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、ＣＨ１ドメインの表面上に隆起が生成されるように、かつ、ＣＬドメインの１個以上のアミノ酸残基が、一部または全てがより小さな側鎖体積を有する同等数のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、ＣＬドメインの表面上に空洞が生成されるように、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメイン及びＬ１のＣＬドメインが変更される。特定の実施形態において、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメイン上の修飾は、ＣＨ１／ＣＬ界面における立体的相補性を提供する。特定の実施形態において、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメイン上の修飾は、ＣＨ１／ＣＬ界面における立体構造相補性を提供する。

特定の実施形態において、ＣＨ１／Ｃｌ界面内で、ＣＬドメインの１個以上のアミノ酸残基が、一部または全てがより大きな側鎖体積を有する同等数のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、ＣＬドメインの表面上に隆起が生成されるように、かつ、ＣＨ１ドメインの１個以上のアミノ酸残基が、一部または全てがより小さな側鎖体積を有する同等数のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、ＣＨ１ドメインの表面上に空洞が生成されるように、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメイン及びＬ１のＣＬドメインが変更される。特定の実施形態において、ＣＬドメインの１個以上の置換アミノ酸残基は、Ｓ１７６を含む。特定の実施形態において、ＣＨ１ドメインの１個以上の置換アミノ酸残基は、Ｆ１７０を含む。特定の実施形態において、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメイン上の修飾は、界面における立体的相補性を提供する。特定の実施形態において、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメイン上の修飾は、界面における立体構造相補性を提供する。

特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ及びＦ１７０Ａ（ＥＵ付番）から成る群から選択されるアミノ酸置換を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｓ１７６Ｆ（ＥＵ付番）から成る群から選択されるアミノ酸置換を含む。

特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｓ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む。特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｆ１７０Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｓ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ｖ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｖ１３３Ｉ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１３１Ｄ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｉ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成る（例えばそれらから本質的に成る）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成る（例えばそれらから本質的に成る）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ａ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ｖ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、及びＳ１８３Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、及びＳ１８３Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ及びＳ１７６Ｆ変異を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、及びＳ１８３Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ及びＳ１７６Ｆ変異を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、及びＳ１８１Ｍ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ及びＳ１７６Ｆ変異を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それから成るもの、及びそれから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それから成るもの、及びそれから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それから成るもの、及びそれから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それから成るもの、及びそれから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それから成るもの、及びそれから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それから成るもの、及びそれから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ｖ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のアミノ酸変異を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のアミノ酸変異を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のアミノ酸変異から成る、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ａ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ｖ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のアミノ酸変異を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１１６Ａ、Ｖ１３３Ｉ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、または７個以下のアミノ酸変異を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１３１Ｄ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｉ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、または７個以下のアミノ酸変異を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のアミノ酸変異を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のアミノ酸変異から成る、Ｌ１のＣＬドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、または６個以下のアミノ酸変異を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。

上述のＣＨ１ドメインとＬ１ドメインとの対の組み合わせのあらゆる可能性が想定される。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、カッパ軽鎖を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１７〜２７のいずれかに記載のＣＬドメインを含む、第１の軽鎖ポリペプチドＬ１を含む。配列番号５４に記載のＣＬドメインは、配列番号１７〜２７のアミノ酸１１〜１１６に対応する。したがって、Ｌ１は、配列番号１７〜２７のいずれかに記載のアミノ酸１１〜１１６を含む、ＣＬドメインを含み得る。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、または配列番号１７に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、または配列番号１８に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、または配列番号１９に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、または配列番号２０に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号２１に記載のアミノ酸配列、または配列番号２１に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列、または配列番号２２に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号２３に記載のアミノ酸配列、または配列番号２３に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列、または配列番号２４に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列、または配列番号２５に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列、または配列番号２６に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列、または配列番号２７に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、ラムダ軽鎖を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１２７に記載のアミノ酸配列を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。

配列番号１７〜２７及び１２７のアミノ酸配列が、以下の表５に提供される（別段の記載がない限り、ＬＣはカッパＬＣである）。

ＣＬ内のアミノ酸１１６位、１１８位、１３１位、１３３位、１３５位、１６２位、１６４位、１７４位、１７６位、及び１７８位（ＥＵ付番）は、それぞれ、配列番号１７〜２７におけるアミノ酸１８位、２０位、３３位、３５位、３７位、６４位、６６位、７６位、７８位、及び８０位に対応する。カッパ鎖のＣＬドメイン内のアミノ酸１１６位、１１８位、１３１位、１３３位、１３５位、１６２位、１６４位、１７４位、１７６位、及び１７８位（ＥＵ付番）は、ラムダ軽鎖のＣＬドメイン内のアミノ酸１１６位、１１８位、１３１位、１３３位、１３５位、１６２位、１６４位、１７４位、１７６位、及び１７８位（Ｋａｂａｔ付番）に対応する。ラムダ軽鎖のＣＬドメイン内のアミノ酸１１６位、１１８位、１３１位、１３３位、１３５位、１６２位、１６４位、１７４位、１７６位、及び１７８位（Ｋａｂａｔ付番）は、それぞれ、配列番号１２７におけるアミノ酸１０位、１２位、２５位、２７位、２９位、５６位、５９位、６７，６９位、及び７１位に対応する。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４重鎖を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１０３に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１０４に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１０５に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。
配列番号２８〜４４のアミノ酸配列が、以下の表６に提供される（別段の記載がない限り、ＨＣはＩｇＧ１アイソタイプのものである）。

ＣＨ１内のアミノ酸１４１、１７０、１８１、１８３、及び１８５位（ＥＵ付番）は、それぞれ、配列番号２８〜４４及び１０３〜１０５のアミノ酸２２、５１、６２、６４、及び６６位に対応する。

配列番号１７〜２７または配列番号１７〜２７及び１２７のアミノ酸１１〜１１６と、上述の配列番号２８〜４４及び１０３〜１０５との対の組み合わせのあらゆる可能性が想定される。特定の実施形態では、配列番号１７〜２７または配列番号１７〜２７及び１２７のアミノ酸１１〜１１６と、配列番号２８〜４４及び１０３〜１０５との、特定の組み合わせが想定される。そのような組み合わせとしては、以下の表７に提供されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

表７中の各対における第１の配列番号はＣＨ１ドメイン配列を指し、表７中の各対における第２の配列番号はＣＬドメイン配列を指す。

関連する態様では、ａ）第１の抗原に結合することができ、第１の重鎖配列（Ｈ１）及び第１の軽鎖配列（Ｌ１）を含む、第１の重鎖／軽鎖対と、ｂ）第２の重鎖配列（Ｈ２）及び第２の軽鎖配列（Ｌ２）を含む第２の重鎖／軽鎖対と、を含み、各Ｈ１及びＨ２が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）を含み、各Ｌ１及びＬ２が、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む、多特異性抗原結合タンパク質が提供され、ＣＨ１／ＣＬ界面内で、ＣＨ１ドメインの１個以上のアミノ酸残基が、一部はより大きな側鎖体積を有し、一部はより小さな側鎖体積を有する、同等数のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、ＣＨ１ドメインの表面上に隆起及び空洞が生成されるように、かつ、ＣＬドメインの１個以上のアミノ酸残基が、一部はより小さな側鎖体積を有し、一部はより大きな側鎖体積を有する、同等数のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、ＣＬドメインの表面上に空洞及び隆起が生成されるように、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメイン及びＬ１のＣＬドメインが変更される。特定の実施形態において、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメイン上の修飾は、界面における立体的相補性（例えば立体構造相補性など）を提供する。

特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｌ１２８位におけるアミノ酸置換を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１８位及びＬ１３５位（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、第１の抗原及び第２の抗原は同じである。特定の実施形態において、第１の重鎖／軽鎖対及び第２の重鎖／軽鎖対はそれぞれ、同じ抗原上の異なるエピトープに結合する。特定の実施形態において、第１の抗原及び第２の抗原は異なる。特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、Ｌ１２８位及びＶ１８５位（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換を含み、Ｌ１のＣＬドメインは、Ｆ１１８位及びＬ１３５位（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、第１の抗原及び第２の抗原は同じである。特定の実施形態において、第１の重鎖／軽鎖対及び第２の重鎖／軽鎖対はそれぞれ、同じ抗原上の異なるエピトープに結合する。特定の実施形態において、第１の抗原及び第２の抗原は異なる。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１、Ｆ１７０、Ｓ１８１、及びＳ１８３（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｓ１６２、Ｓ１７６、及びＴ１７８（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換をさらに含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、野生型配列のものと比較可能であるかまたはそれを上回る立体的相補性（例えば立体構造相補性など）をもたらす。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｓ１６２、Ｔ１６４、Ｓ１７６、及びＴ１７８（全てＥＵ付番）から成る群から選択される１個以上のアミノ酸置換をさらに含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１２８、Ａ１４１、Ｆ１７０、Ｓ１８１、及びＳ１８３（ＥＵ付番）から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｖ１１８、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｓ１３５、Ｓ１６２、Ｔ１６４、Ｓ１７６、及びＴ１７８（ＥＵ付番）から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、野生型配列のものと比較可能であるかまたはそれを上回る立体的相補性（例えば立体構造相補性など）をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１２８、Ａ１４１、Ｆ１７０、Ｓ１８１、Ｓ１８３、及びＶ１８５（ＥＵ付番）から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｖ１１８、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｓ１３５、Ｓ１６２、Ｔ１６４、Ｓ１７６、及びＴ１７８（ＥＵ付番）から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、野生型配列のものと比較可能であるかまたはそれを上回る立体的相補性（例えば立体構造相補性など）をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１２８、Ａ１４１、Ｆ１７０、Ｓ１８１、Ｓ１８３、及びＶ１８５（ＥＵ付番）から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｖ１１８、Ｓ１３１、Ｖ１３３、Ｓ１３５、Ｓ１６２、Ｓ１７６、及びＴ１７８（ＥＵ付番）から選択される１個以上のアミノ酸置換を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換は、野生型配列のものと比較可能であるかまたはそれを上回る立体的相補性（例えば立体構造相補性など）をもたらす。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｉ、及びＳ１８３Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｙ、Ｓ１６２Ａ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｍ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｔ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｔ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ｌ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｔ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｔ、及びＳ１８３Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ｍ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｍ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｉ、及びＳ１８３Ａ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のアミノ酸変異を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、または６個以下のアミノ酸変異を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｔ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｔ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ｌ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、または６個以下のアミノ酸変異を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｔ、及びＳ１８３Ａ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、または５個以下のアミノ酸変異を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｙ、Ｓ１６２Ａ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｍ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、または８個以下のアミノ酸変異を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、または７個以下のアミノ酸変異を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｔ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、または８個以下のアミノ酸変異を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ｍ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｍ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）から成る群から選択される、１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、または８個以下のアミノ酸変異を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、カッパ軽鎖を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号４５〜４８のいずれかに記載のＣＬドメインを含む、第１の軽鎖ポリペプチドＬ１を含む。配列番号５４に記載のＣＬドメインは、配列番号４５〜４８のアミノ酸１１〜１１６に対応する。したがって、Ｌ１は、配列番号４５〜４８のいずれかに記載のアミノ酸１１〜１１６を含む、ＣＬドメインを含み得る。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号４５に記載のアミノ酸配列、または配列番号４５に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号４６に記載のアミノ酸配列、または配列番号４６に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号４７に記載のアミノ酸配列、または配列番号４７に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号４８に記載のアミノ酸配列、または配列番号４８に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、ラムダ軽鎖を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１２８に記載のアミノ酸配列を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４重鎖を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１０６に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１０７に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号１０８に記載のアミノ酸配列を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。配列番号４５〜５２及び１０６〜１０８のアミノ酸配列が、以下の表８に提供される（別段の記載がない限り、ＬＣはカッパＬＣであり、別段の記載がない限り、ＨＣは、ＩｇＧ１アイソタイプのものである）。

ＣＬ内のアミノ酸１１６位、１１８位、１３１位、１３３位、１３５位、１６２位、１６４位、１７４位、１７６位、及び１７８位（ＥＵ付番）は、それぞれ、配列番号４５〜４８におけるアミノ酸１８位、２０位、３３位、３５位、３７位、６４位、６６位、７６位、７８位、及び８０位に対応する。カッパ鎖のＣＬドメイン内のアミノ酸１１６位、１１８位、１３１位、１３３位、１３５位、１６２位、１６４位、１７４位、１７６位、及び１７８位（ＥＵ付番）は、ラムダ軽鎖のＣＬドメイン内のアミノ酸１１６位、１１８位、１３１位、１３３位、１３５位、１６２位、１６４位、１７４位、１７６位、及び１７８位（Ｋａｂａｔ付番）に対応する。ラムダ軽鎖のＣＬドメイン内のアミノ酸１１６位、１１８位、１３１位、１３３位、１３５位、１６２位、１６４位、１７４位、１７６位、及び１７８位（Ｋａｂａｔ付番）は、それぞれ、配列番号１２８におけるアミノ酸１０位、１２位、２５位、２７位、２９位、５６位、５９位、６７位、６９位、及び７１位に対応する。

ＣＨ１内のアミノ酸１２８位、１４１位、１７０位、１８１位、１８３位、及び１８５位（ＥＵ付番）は、それぞれ、配列番号４９〜５２及び１０６〜１０８のアミノ酸９位、２２位、５１位、６２位、６４位、及び６６位に対応する。

配列番号４５〜４８または配列番号４５〜４８のアミノ酸１１〜１１６と、配列番号４９〜５２との対の組み合わせのあらゆる可能性が想定される。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号４５〜４８のいずれかに記載のＣＬドメインを含む、第１の軽鎖ポリペプチドＬ１を含む。配列番号５４に記載のＣＬドメインは、配列番号４５〜４８のアミノ酸１１〜１１６に対応する。したがって、Ｌ１は、配列番号４５〜４８のいずれかに記載のアミノ酸１１〜１１６を含む、ＣＬドメインを含み得る。特定の実施形態では、配列番号４５〜４８または配列番号４５〜４８及び１２８のアミノ酸１１〜１１６と、配列番号４９〜５２及び１０６〜１０８との、特定の組み合わせが想定される。そのような組み合わせとしては、配列番号４９／配列番号４５または配列番号４５のアミノ酸１１〜１１６、配列番号５０／配列番号４６または配列番号４６のアミノ酸１１〜１１６、配列番号１０６／配列番号４６または配列番号４６のアミノ酸１１〜１１６、配列番号１０７／配列番号４６または配列番号４６のアミノ酸１１〜１１６、配列番号１０８／配列番号４６または配列番号４６のアミノ酸１１〜１１６、配列番号５１／配列番号４７または配列番号４７のアミノ酸１１〜１１６、配列番号５０／配列番号１２８、配列番号１０６／配列番号１２８、配列番号１０７／配列番号１２８、配列番号１０８／配列番号１２８、及び配列番号５２／配列番号４８または配列番号４８のアミノ酸１１〜１１６が挙げられるが、これらに限定されない。

上記のように、方略番号２により特定されるＣＨ１／ＣＬ界面内の変異は、方略番号１により特定されるＣＨ１／ＣＬ界面内の変異から独立して使用されてもよく、それに加えて使用されてもよい。

したがって、例えば、本明細書では、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む、多特異性抗原結合タンパク質が提供される。追加的に、特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成るＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成るＬ２のＣＬドメインと、を含む。追加的に、特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）から成るＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）から成るＬ１のＣＬドメインと、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成るＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成るＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。追加的に、特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む（またはそれから成るか、もしくはそれから本質的に成る）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、配列番号１９または配列番号１９に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む（またはそれから成るか、もしくはそれから本質的に成る）Ｌ１のＣＬドメインと、配列番号１５のアミノ酸配列を含む（またはそれから成るか、もしくはそれから本質的に成る）Ｈ２のＣＨ１ドメインと、配列番号５または配列番号５に記載の配列におけるアミノ酸１１〜１１６を含む（またはそれから成るか、もしくはそれから本質的に成る）Ｌ２のＣＬドメインと、を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成るＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成るＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）から成るＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）から成るＬ１のＣＬドメインと、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成るＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成るＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｉ、及びＳ１８３Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｙ、Ｓ１６２Ａ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｍ、及びＳ１７８Ｌ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｔ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｔ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ｌ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｔ、及びＴ１７８Ｌ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｔ、及びＳ１８３Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ｍ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｍ、及びＴ１７８Ｌ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ｖ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｖ１３３Ｉ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１３１Ｄ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｉ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ａ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ｖ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｉ、及びＳ１８３Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｙ、Ｓ１６２Ａ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｍ、及びＳ１７８Ｌ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｔ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｔ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ｌ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｔ、及びＴ１７８Ｌ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｔ、及びＳ１８３Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ｍ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｍ、及びＴ１７８Ｌ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ｖ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｖ１３３Ｉ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

「Ｈ１」及び「Ｈ２」という用語が独断的名称であり、上記の実施形態のいずれにおける「Ｈ１」及び「Ｈ２」も反転できることは、当業者には明らかであろう。すなわち、Ｈ１のＣＨ１ドメイン及び／またはＶＨドメインならびにＬ１のＣＬドメイン及び／またはＶＬドメイン内にあるものとして上述された変異のいずれも、代替的に、Ｈ２のＣＨ１ドメイン及び／またはＶＨドメインならびにＬ２のＣＬドメイン及び／またはＶＬドメイン内に存在することができる。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１３１Ｄ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｉ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ１のＣＬドメインと、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ａ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ｖ、及びＶ１８５Ａ置換変異（ＥＵ付番）を含むＨ２のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ置換変異（ＥＵ付番）を含むＬ２のＣＬドメインと、を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、１個以下のアミノ酸置換変異、２個以下のアミノ酸置換変異、３個以下のアミノ酸置換変異、５個以下のアミノ酸置換変異、または６個以下のアミノ酸置換、７個以下のアミノ酸置換、８個以下のアミノ酸置換、９個以下のアミノ酸置換、１０個以下のアミノ酸置換、１１個以下のアミノ酸置換、もしくは１２個以下のアミノ酸置換を含む、Ｈ１のＣＨ１ドメインを含む。

特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、１個以下のアミノ酸置換変異、２個以下のアミノ酸置換変異、３個以下のアミノ酸置換変異、５個以下のアミノ酸置換変異、または６個以下のアミノ酸置換、７個以下のアミノ酸置換、８個以下のアミノ酸置換、９個以下のアミノ酸置換、１０個以下のアミノ酸置換、１１個以下のアミノ酸置換、もしくは１２個以下のアミノ酸置換を含む、Ｌ１のＣＬドメインを含む。
特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメインは、ヒト生殖系列またはアロタイプ重鎖ＣＨ１ドメインと、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である。Ｊｅｆｆｅｒｉｓｅｔａｌ．（２００９）Ｍａｂｓ１：３３２−３３８を参照されたい。以下には、ヒトＩｇＧ１ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列（すなわち、配列番号５７）及びヒトＩｇＧ４Ｓ２２８ＰＣＨ１ドメインのアミノ酸配列（すなわち、配列番号５８）が提供される。

いくつかの実施形態では、ＬＣ１はカッパ軽鎖である。いくつかの実施形態では、ＬＣ１のＣＬドメインは、ヒト生殖系列またはアロタイプカッパ鎖ＣＬドメインと、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である。以下には、ヒトカッパ軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列（すなわち、配列番号５９）が提供される。

いくつかの実施形態では、ＬＣ１はラムダ軽鎖である。いくつかの実施形態では、ＬＣ１のＣＬドメインは、ヒト生殖系列またはアロタイプラムダＣＬドメインと、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である。以下には、ヒトラムダ軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列（すなわち、配列番号１１３）が提供される。

ＶＨドメイン及びＶＬドメインへの修飾
特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質、またはその抗原結合断片は、ＶＨ及びＶＬドメイン（複数可）内のアミノ酸修飾、すなわち、本明細書に記載のＣＨ１及びＣＬドメイン内の修飾から独立したものを含む。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、ＶＨ及びＶＬドメイン（複数可）内のアミノ酸修飾を追加的に、すなわち、方略番号１により特定されるＣＨ１／ＣＬ界面内の変異及び／または方略番号１により特定されるＣＨ１／ＣＬ界面内の変異と組み合わせて含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられ、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられる。特定の実施形態において、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられ、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられる。特定の実施形態において、正荷電残基は、Ｒ、Ｈ、及びＫから成る群から選択される。特定の実施形態において、負荷電残基は、Ｄ及びＥから成る群から選択される。

追加的または代替的に、特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられ、Ｌ２のＶＬドメイン内のＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられる。特定の実施形態において、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸は、負荷電残基に置き換えられ、Ｌ２のＶＬドメイン内のＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸は、正荷電残基に置き換えられる。特定の実施形態において、正荷電残基は、Ｒ、Ｈ、及びＫから成る群から選択される。特定の実施形態において、負荷電残基は、Ｄ及びＥから成る群から選択される。

特定の実施形態では、Ｈ１のＶＨドメイン上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）における置換変異と、Ｌ１のＶＬドメイン上のＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）における置換変異、及び／または、Ｈ２のＶＨドメイン上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）における置換変異と、Ｌ２のＶＬドメイン上のＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）における置換変異との、特定の組み合わせが想定される。そのような組み合わせとしては、以下の表９Ａ及び９Ｂに示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

表９Ａ中の各対における第１の変異はＶＨドメイン配列内の修飾を指し、表９Ａ中の各対における第２の変異はＶＬドメイン配列内の修飾を指す。

表９Ｂ中の４文字の変異は、Ｑ３９Ｘ_ＶＨ１／Ｑ３８Ｘ_ＶＬ１／Ｑ３９Ｘ_ＶＨ２／Ｑ３８Ｘ_ＶＬ２におけるアミノ酸置換を指し、ここで「ＶＨ１」はＨ１のＶＨドメインを指し、「ＶＬ」はＬ１のＶＬドメインを指し、「ＶＨ２」はＨ２のＶＨドメインを指し、「ＶＬ２」はＬ２のＶＬドメインを指す。「Ｈ１」／「Ｌ１」及び「Ｈ２」／「Ｌ２」という用語が独断的名称であり、上記の実施形態のいずれにおける「Ｈ１」及び「Ｌ１」も、それぞれ「Ｈ２」及び「Ｌ２」と反転できることは、当業者には明らかであろう。すなわち、Ｈ１のＶＨドメイン及びＬ１のＶＬドメイン内にあるものとして上述された変異のいずれも、代替的に、Ｈ２のＶＨドメイン及びＬ２のＶＬドメイン内に存在することができる。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、置換変異Ｑ３９Ｄ（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｒ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｈ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｈ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｈ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｈ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｈ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｈ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｄ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｈ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｈ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

「Ｈ１」／「Ｌ１」及び「Ｈ２」／「Ｌ２」という用語が独断的名称であり、上記の実施形態のいずれにおける「Ｈ１」及び「Ｌ１」も、それぞれ「Ｈ２」及び「Ｌ２」と反転できることは、当業者には明らかであろう。すなわち、Ｈ１のＶＨドメイン及びＬ１のＶＬドメイン内にあるものとして上述された変異のいずれも、代替的に、Ｈ２のＶＨドメイン及びＬ２のＶＬドメイン内に存在することができる。

本明細書の他の箇所に注記されているように、いくつかの実施形態における本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、ＶＨ及びＶＬドメイン（複数可）内のアミノ酸修飾、すなわち、例えば上述のアミノ酸修飾などを、方略番号１により特定されるＣＨ１／ＣＬ界面内の変異及び／または方略番号２により特定されるＣＨ１／ＣＬ界面内の変異と組み合わせて含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｆ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｆ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｔ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｔ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｙ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｙ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含む（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成る）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み（例えばそれから成るか、またはそれから本質的に成り）、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｆ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｔ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｙ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｆ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｔ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｙ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｔ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｔ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｔ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｔ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインは、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＶＨドメインは、Ｑ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＨ２のＣＨ１ドメインは、Ｓ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＶＬドメインは、Ｑ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、多特異性抗原結合タンパク質のＬ２のＣＬドメインは、Ｖ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

方略番号２により特定されるＣＨ１／ＣＬ界面内の変異、方略番号１により特定されるＣＨ１／ＣＬ界面内の変異、ならびにＶＨドメイン及びＶＬドメイン内の変異の追加の組み合わせ、すなわち、上述のものに限定されないものも想定される。

Ｆｃ変異
特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＨ１及びＨ２のそれぞれは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域を含む。特定の実施形態において、Ｈ１及び／またはＨ２のＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４Ｆｃである。特定の実施形態において、Ｈ１及びＨ２のＣＨ３ドメインはそれぞれ界面で交わり、ＣＨ３ドメインのそれぞれは、Ｈ１のＦｃ領域がＨ１と比較してＨ２のＦｃ領域と優先的に対合するようなアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ＣＨ３ドメイン内のアミノ酸置換は、ＣＨ３ドメイン内の置換を有しない野生型よりも高い静電的相補性をもたらす。タンパク質／タンパク質界面における静電的相補性の測定方法は、当該技術分野で知られており、例えば、ＭｃＣｏｙｅｔａｌ．（１９９７）ＪＭｏｌＢｉｏｌ２６８，５７０−５８４、Ｌｅｅｅｔａｌ．，（２００１）ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．１０，３６２−３７７、及びＣｈａｕｅｔａｌ．（１９９４）ＪＣｏｍｐＭｏｌＤｅｓ８，５１３２５に記載されている。特定の実施形態において、ＣＨ３ドメイン内のアミノ酸置換は、ＣＨ３ドメイン内の置換を有しない野生型よりも高い立体的相補性をもたらす。タンパク質／タンパク質界面における静電的相補性の測定方法は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｌａｗｒｅｎｃｅｅｔａｌ．（１９９３）ＪＭｏｌＢｉｏｌ２３４，９４６−９５０、Ｗａｌｌｓｅｔａｌ．（１９９２）ＪＭｏｌＢｉｏｌ２２８，２７７−２９７、及びＳｃｈｕｅｌｅｒ−Ｆｕｒｍａｎｅｔａｌ．（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ６０，１８７−１９４に記載されている。

特定の実施形態では、ＣＨ３／ＣＨ３界面内で、Ｈ１のＣＨ３ドメイン内の１個以上のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有する１個以上のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ１のＣＨ３ドメインの表面上に隆起（またはノブ）が生成されるように、かつ、Ｈ１のＣＨ３ドメインと相互作用するＨ２のＣＨ３ドメイン内の１個以上、好ましくは２個または３個のアミノ酸残基が修飾され、小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ１のＣＨ３ドメインと相互作用するＨ２のＣＨ３ドメインの表面上に空洞（またはホール）が生成されるように、Ｈ１及びＨ２（例えば、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＨ１及びＨ２）のＣＨ３ドメインが変更される。特定の実施形態では、界面内で、Ｈ２のＣＨ３ドメイン内の１個または２個のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有する同等数のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ２のＣＨ３ドメインの界面内に、Ｈ１のＣＨ３ドメインの表面内の空洞（またはホール）内に配置可能な隆起（またはノブ）が生成されるように、Ｈ１及びＨ２（例えば、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＨ１及びＨ２）のＣＨ３ドメインが変更され、かつ、Ｈ２のＣＨ３ドメインの界面と交わるＨ２のＣＨ３ドメインの表面内で、２個または３個のアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有する同等数のアミノ酸残基と置き換えられ、それにより、Ｈ１のＣＨ３ドメインの界面内に空洞が生成されるように、Ｈ１のＣＨ３ドメインが変更され、この空洞内に、Ｈ２のＣＨ３ドメインの界面内の隆起が配置可能である。特定の実施形態において、より大きな側鎖体積を有する移入残基（ｉｍｐｏｒｔｒｅｓｉｄｕｅ）は、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、アルギニン（Ｒ）、またはトリプトファン（Ｗ）である。特定の実施形態において、隆起またはノブ変異は、３６６位におけるスレオニンのトリプトファンとの置換を含み、アミノ酸付番は、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．（ｐｐ．６８８−６９６ｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈｅｄ．，Ｖｏｌ．１（１９９１；ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ））のＥＵ付番スキームに従う。特定の実施形態において、より小さな側鎖体積を有する移入残基は、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、またはスレオニン（Ｔ）である。特定の実施形態において、元の残基は、スレオニンである。特定の実施形態において、元の残基は、ロイシンである。特定の実施形態において、元の残基は、チロシンである。特定の実施形態において、移入残基は、システイン（Ｃ）ではない。一実施形態において、移入残基は、アラニン（Ａ）である。空洞は、ＣＨ３ドメインの１個以上の元の残基を置き換えることによって生成することができる。例えば、一実施形態において、空洞を含むＣＨ３ドメインは、スレオニン、ロイシン、及びチロシンから成る群から選択される２つ以上の元のアミノ酸の置換を含む。特定の実施形態において、空洞を含むＣＨ３ドメインは、アラニン、セリン、スレオニン、及びバリンから成る群から選択される２個以上の移入残基を含む。特定の実施形態において、ノブ変異のための修飾はＴ３６６Ｗであり、ホール変異のための修飾は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖのうちの少なくとも１つ、または少なくとも２つである。特定の実施形態において、ノブ変異のための修飾はＴ３６６Ｗであり、ホール変異のための修飾は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖである。例えば、それぞれ参照により全体が本明細書に援用される、ＵＳ５，７３１，１６８、ＵＳ５，８０７，７０６、ＵＳ７，１８３，０７６を参照されたい。

移行性（Ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ）
上記のＨ１のＣＨ１ドメイン及びＬ１のＣＬドメインに対する特定のアミノ酸修飾は、ＥＵ付番方式を参照して記載されているが、下記の内容を考慮すると、これらのアミノ酸修飾は、他の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能であり、１つの免疫グロブリン重鎖の、２つの免疫グロブリン軽鎖のうちの一方との優先的対合の同様のパターンがもたらされることが想定される。

免疫グロブリンの重鎖と軽鎖との界面内にあるＣＨ１／ＣＬ界面残基は、比較的良好に保存されている（Ｐａｄｌａｎｅｔａｌ．，１９８６，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３（９）：９５１−９６０）。進化抑制の結果であるこの配列保存は、軽鎖と重鎖との組み合わせの対合中に機能的に活性な抗体結合ドメインが形成される尤度を増加させる。この配列保存の結果として、優先的対合を推進する上記の配列修飾は、この領域が抗体間で高い配列保存を示すことから、他の重鎖及び軽鎖の対に移行し得るということになる。

特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１／κに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ２／κに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ３／κに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ４／κに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＡ１／κに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＡ２／κに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＤ／κに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＥ／κに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ／κに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＭ／κに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。

特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１／λに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ２／λに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ３／λに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ４／λに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＡ１／λに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＡ２／λに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＤ／λに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＥ／λに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ／λに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、ヒトまたはヒト化ＩｇＭ／λに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、生殖系列に近いフレームワークを有する抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、基準ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインを有する抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に移行可能である。

特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、マウス抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に導入される。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、マウスＩｇＧ２ａ／λに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に導入される。特定の実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸修飾は、マウスＩｇＧ２ａ／κに基づく抗体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖に導入される。

マウスＩｇＧ２ａ定常領域のアミノ酸配列は、以下の配列番号６０に記載される。

マウスカッパ軽鎖のアミノ酸配列は、以下の配列番号６１に記載される。

マウスラムダ１軽鎖のアミノ酸配列は、以下の配列番号６２に記載される。

マウスラムダ２軽鎖のアミノ酸配列は、以下の配列番号６３に記載される。

マウスラムダ３軽鎖のアミノ酸配列は、以下の配列番号６４に記載される。

特定の実施形態において、（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかに）移行可能であるアミノ酸修飾は、次の組み合わせの置換変異を含む：Ｈ１のＶＨドメイン上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）；Ｌ１のＶＬドメイン上のＱ３８位；Ｈ２のＶＨドメイン上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）；Ｈ２のＣＨ１ドメイン上のＳ１８３位（ＥＵ付番）；Ｌ２のＶＬドメイン上のＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）；及びＬ２のＣＬドメイン上のＶ１３３位（ＥＵ付番）。

特定の実施形態において、（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかに）移行可能であるアミノ酸修飾は、次の組み合わせの置換変異を含む：Ｈ１のＶＨドメイン上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）；Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＳ１８３位（ＥＵ付番）；Ｌ１のＶＬドメイン上のＱ３８位；Ｌ１のＣＬドメイン上のＶ１３３位（ＥＵ付番）；Ｈ２のＶＨドメイン上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）；Ｈ２のＣＨ１ドメイン上のＳ１８３位（ＥＵ付番）；Ｌ２のＶＬドメイン上のＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）；及びＬ２のＣＬドメイン上のＶ１３３位（ＥＵ付番）。

特定の実施形態において、（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかに）移行可能であるアミノ酸修飾は、次の組み合わせの置換変異を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）：Ｈ１のＶＨドメイン上のＱ３９Ｅ位（Ｋａｂａｔ付番）；Ｌ１のＶＬドメイン上のＱ３８Ｋ位；Ｈ２のＶＨドメイン上のＱ３９Ｋ位（Ｋａｂａｔ付番）；Ｈ２のＣＨ１ドメイン上のＳ１８３Ｋ位（ＥＵ付番）；Ｌ１のＶＬドメイン上のＱ３８Ｅ位（Ｋａｂａｔ付番）；及びＬ２のＣＬドメイン上のＶ１３３Ｅ（ＥＵ付番）。

特定の実施形態において、（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかに）移行可能であるアミノ酸修飾は、次の組み合わせの置換変異を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）：Ｈ１のＶＨドメイン上のＱ３９Ｋ位（Ｋａｂａｔ付番）；Ｌ１のＶＬドメイン上のＱ３８Ｅ位；Ｈ２のＶＨドメイン上のＱ３９Ｅ位（Ｋａｂａｔ付番）；Ｈ２のＣＨ１ドメイン上のＳ１８３Ｋ位（ＥＵ付番）；Ｌ１のＶＬドメイン上のＱ３８Ｋ位（Ｋａｂａｔ付番）；及びＬ２のＣＬドメイン上のＶ１３３Ｅ（ＥＵ付番）。

特定の実施形態において、（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかに）移行可能であるアミノ酸修飾は、次の組み合わせの置換変異を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）：Ｈ１のＶＨドメイン上のＱ３９Ｅ位（Ｋａｂａｔ付番）；Ｌ１のＶＬドメイン上のＱ３８Ｋ位；Ｈ２のＶＨドメイン上のＱ３９Ｋ位（Ｋａｂａｔ付番）；Ｈ２のＣＨ１ドメイン上のＳ１８３Ｅ位（ＥＵ付番）；Ｌ１のＶＬドメイン上のＱ３８Ｅ位（Ｋａｂａｔ付番）；及びＬ２のＣＬドメイン上のＶ１３３Ｋ（ＥＵ付番）。

特定の実施形態において、（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかに）移行可能であるアミノ酸修飾は、次の組み合わせの置換変異を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）：Ｈ１のＶＨドメイン上のＱ３９Ｋ位（Ｋａｂａｔ付番）；Ｌ１のＶＬドメイン上のＱ３８Ｅ位；Ｈ２のＶＨドメイン上のＱ３９Ｅ位（Ｋａｂａｔ付番）；Ｈ２のＣＨ１ドメイン上のＳ１８３Ｅ位（ＥＵ付番）；Ｌ１のＶＬドメイン上のＱ３８Ｋ位（Ｋａｂａｔ付番）；及びＬ２のＣＬドメイン上のＶ１３３Ｋ（ＥＵ付番）。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、ならびにＬ２のＶＬドメイン内のＱ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成り、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ２のＶＬドメイン内のＱ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、ならびにＬ２のＶＬドメイン内のＱ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成り、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ２のＶＬドメイン内のＱ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含む。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）、ならびにＬ２のＣＬドメイン内のＶ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ２のＣＬドメイン内のＶ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）、ならびにＬ２のＣＬドメイン内のＶ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、Ｈ１のＣＨ１内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）、Ｈ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、Ｈ２のＣＨ１内のＳ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）、Ｌ２のＶＬドメイン内のＱ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、ならびにＬ２のＣＬドメイン内のＶ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ１のＣＨ１内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｈ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ２のＣＨ１内のＳ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ２のＶＬドメイン内のＱ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ２のＣＬドメイン内のＶ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ１のＣＨ１内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成り、Ｈ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成り、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ２のＣＨ１内のＳ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ２のＶＬドメイン内のＱ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ２のＣＬドメイン内のＶ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）、Ｌ２のＶＬドメイン内のＱ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、ならびにＬ２のＣＬ内のＶ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ２のＶＬドメイン内のＱ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ２のＣＬ内のＶ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成り、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ２のＶＬドメイン内のＱ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ２のＣＬ内のＶ１３３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）、ならびにＬ２のＣＬドメイン内のＶ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ２のＣＬドメイン内のＶ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成り、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ２のＣＬドメイン内のＶ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）、Ｌ２のＶＬドメイン内のＱ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、ならびにＬ２のＣＬドメイン内のＶ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ２のＶＬドメイン内のＱ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ２のＣＬドメイン内のＶ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成り、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ２のＶＬドメイン内のＱ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ２のＣＬドメイン内のＶ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）、Ｌ２のＶＬドメイン内のＱ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）、ならびにＬ２のＣＬドメイン内のＶ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）を含む。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含み、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ２のＶＬドメイン内のＱ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ２のＣＬドメイン内のＶ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、Ｈ１のＶＨドメイン内のＱ３９Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ１のＶＬドメイン内のＱ３８Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ１のＣＬドメイン内のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）から成り、Ｈ２のＶＨドメイン内のＱ３９Ｅ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｈ２のＣＨ１ドメイン内のＳ１８３Ｋ置換変異（ＥＵ付番）から成り、Ｌ２のＶＬドメイン内のＱ３８Ｋ置換変異（Ｋａｂａｔ付番）を含み、Ｌ２のＣＬドメイン内のＶ１３３Ｅ置換変異（ＥＵ付番）から成る。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、次の組み合わせの置換変異を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）：Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＬ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｉ、及びＳ１８３Ａ変異（ＥＵ付番）、ならびにＬ１のＣＬドメイン上のＦ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｙ、Ｓ１６２Ａ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｍ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、次の組み合わせの置換変異を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）：Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＬ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）、ならびにＬ１のＣＬドメイン上のＦ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、次の組み合わせの置換変異を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）：Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＬ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｔ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｔ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ｌ変異（ＥＵ付番）、ならびにＬ１のＣＬドメイン上のＦ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｔ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、次の組み合わせの置換変異を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）：Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＬ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｔ、及びＳ１８３Ａ変異（ＥＵ付番）、ならびにＬ１のＣＬドメイン上のＦ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ｍ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｍ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、次の組み合わせの置換変異を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）：Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ｖ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）、ならびにＬ１のＣＬドメイン上のＦ１１６Ａ、Ｖ１３３Ｉ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、次の組み合わせの置換変異を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）：Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）、ならびにＬ１のＣＬドメイン上のＦ１１６Ａ、Ｓ１３１Ｄ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｉ変異（ＥＵ付番）。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、次の組み合わせの置換変異を含む：Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）、ならびにＬ１のＣＬドメイン上のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、次の組み合わせの置換変異から成る：Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）、ならびにＬ１のＣＬドメイン上のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）。

特定の実施形態において、異なるＩｇＧ分子（例えば上述の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のいずれかなど）に導入されるアミノ酸修飾は、次の組み合わせの置換変異を含む（例えばそれらから成るか、またはそれらから本質的に成る）：Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ａ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ｖ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）、ならびにＬ１のＣＬドメイン上のＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）。

方略番号２により特定されるＣＨ１／ＣＬ界面内の変異、方略番号１により特定されるＣＨ１／ＣＬ界面内の変異、ならびにＶＨドメイン及びＶＬドメイン内の変異の追加の組み合わせ、すなわち、上述のものに限定されないものも想定される。そのような組み合わせとしては、以下に記載されるものが挙げられるが、それらに限定されない。

特性
優先的対合／優先的アセンブリ
「優先的対合」とは、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間で対合が起こるのと同時に１つ以上の追加の明確に異なるポリペプチドが存在するときの、第１のポリペプチド（例えばＨ１など）と第２のポリペプチド（例えばＬ１など）との対合パターンを表す。優先的対合は、例えば、Ｈ１が少なくともＬ１、及びＬ２と共発現されるとき、Ｈ１−Ｌ１重鎖−軽鎖対合の量がＨ１−Ｌ２対合の量よりも大きい場合に、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のＨ１とＬ１との間で起こる。同様に、優先的対合は、例えば、Ｈ２が少なくともＬ１、及びＬ２と共発現されるとき、Ｈ２−Ｌ２重鎖−軽鎖対合の量がＨ２−Ｌ１対合の量よりも大きい場合に、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のＨ２とＬ２との間で起こる。特定の実施形態において、優先的対合は、ＶＨ／ＶＬドメイン及び／またはＣＨ１／ＣＬドメインのアミノ酸修飾から生じる。

特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のＨ１は、Ｌ１と優先的に対合する。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のＨ２は、Ｌ２と優先的に対合する。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のＨ１は、Ｌ１と優先的に対合し、本明細書における多特異性抗原結合タンパク質のＨ２は、Ｌ２と優先的に対合する。特定の実施形態において、本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質のＨ１が、Ｈ２、Ｌ１、及びＬ２と共発現される場合、所望の対合（例えば、Ｈ１−Ｌ１及びＨ２−Ｌ２）を含む多特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約９９％超（これらの値間の任意の範囲を含む）の相対収率で産生される。所望の対合（例えば、Ｈ１−Ｌ１及びＨ２−Ｌ２）を含む多特異性抗原結合タンパク質の相対収率は、例えば、実施例に記載されるように、質量分析を使用して判定することができる。

特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の発現されたポリペプチドは、誤対合した重鎖及び軽鎖の生成を低減させるように改善された特異性でアセンブルする。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のＨ１のＣＨ１ドメインは、産生中にＬ１のＣＬドメインとアセンブルする。

優先的対合／優先的アセンブリの査定方法
多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインとのＨ１のＣＨ１ドメインの優先的対合及び／または優先的アセンブリは、当業者に周知の多様な方法のうちの任意のものを使用して判定することができる。例えば、多特異性抗原結合タンパク質中のＬ１のＣＬドメインとのＨ１のＣＨ１ドメインの優先的対合の度合いは、軽鎖競合アッセイ（ＬＣＣＡ）によって判定することができる。２０１３年１０月３日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６３３０６号は、ＬＣＣＡの様々な実施形態を記載し、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に援用される。この方法は、共発現されたタンパク質の混合物中における重鎖と特異的な軽鎖との対合の定量分析を可能にし、これを使用して、重鎖及び軽鎖が共発現されるときに、１つの特定の免疫グロブリン重鎖が、２つの免疫グロブリン軽鎖のいずれか一方と選択的に会合するかどうかを判定することができる。この方法は、次のように簡単に説明される：重鎖が制限的な対合反応体となるような比率で、少なくとも１つの重鎖及び２つの異なる軽鎖を細胞内で共発現し、任意に、分泌タンパク質を細胞から分離させ、重鎖に結合した免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドを分泌タンパク質の残りから分離させて、単離された重鎖対合画分を生成し、単離された重鎖画分中の異なる各軽鎖の量を検出し、単離された重鎖画分中の異なる各軽鎖の相対量を分析して、少なくとも１つの重鎖が軽鎖のうちの１つと選択的に対合する能力を判定する。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインとのＨ１のＣＨ１ドメインの優先的対合は、質量分析（例えば液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ−ＭＳ）未変性質量分析、酸性質量分析など）によって判定される。質量分析は、分子量の差を使用し、各軽鎖を含む相対的なヘテロ二量体集団を数量化して、明確に異なる各種を特定するために使用される。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインとのＨ１のＣＨ１ドメインの優先的対合は、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の重鎖／軽鎖対の熱的安定性をアッセイすることによって判定される。多特異性抗原結合タンパク質における重鎖／軽鎖対の熱的安定性は、当該技術分野で知られる方法に従って判定することができる。多特異性抗原結合タンパク質における重鎖／軽鎖対の溶融温度は、その熱的安定性を示す。重鎖／軽鎖対の融点は、示差走査熱量測定などの技術を使用して測定され得る（Ｃｈｅｎｅｔａｌ（２００３）ＰｈａｒｍＲｅｓ２０：１９５２−６０、Ｇｈｉｒｌａｎｄｏｅｔａｌ（１９９９）ＩｍｍｕｎｏｌＬｅｔｔ６８：４７−５２）。あるいは、重鎖／軽鎖対の熱的安定性は、円二色性を使用して測定されてもよい（Ｍｕｒｒａｙｅｔａｌ．（２００２）Ｊ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＳｃｉ４０：３４３−９）。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインとのＨ１のＣＨ１ドメインの優先的対合は、重鎖／軽鎖対のそれらそれぞれの標的に対する結合親和性によって判定される。相互作用のオン速度及びオフ速度は、当該技術分野で周知の方法に従う競合結合アッセイによって判定することができる。特定の実施形態において、競合結合アッセイは、標識された標的（例えば、^３Ｈまたは^１２５Ｉ）を、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質と共に、増加する量の非標識標的の存在下でインキュベーションすることと、標識された標的に結合した多特異性抗原結合タンパク質を検出することとを含む、ラジオイムノアッセイである。特定の実施形態において、標的に対する多特異性抗原結合タンパク質の親和性及び結合オフ速度は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析による飽和データから判定することができる。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のＬ１のＣＬドメインとのＨ１のＣＨ１ドメインの優先的対合は、Ｋ_Ｄ、ｋ_ｏｆｆ、ｋ_ｏｎ、Ｒ_ｍａｘなどの動態パラメータを測定することによって判定される。特定の実施形態において、動態パラメータは、当該技術分野で知られる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくアッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析）によって判定される。ＳＰＲに基づく技術の概説については、Ｍｕｌｌｅｔｅｔａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ２２：７７−９１、Ｄｏｎｇｅｔａｌ．，２００２，ＲｅｖｉｅｗｉｎＭｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，８２：３０３−２３、Ｆｉｖａｓｈｅｔａｌ．，１９９８，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：９７−１０１、Ｒｉｃｈｅｔａｌ．，２０００，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎＩｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１：５４−６１を参照されたい。さらに、米国特許第６，３７３，５７７号、同第６，２８９，２８６号、同第５，３２２，７９８号、同第５，３４１，２１５号、同第６，２６８，１２５号に記載されている、タンパク質−タンパク質相互作用を測定するためのＳＰＲ計器及びＳＰＲに基づく方法のいずれもが想定される。

特定の実施形態において、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）が、当該技術分野で周知の方法に従って、多特異性抗原結合タンパク質のその標的（複数可）に対する親和性を測定するために使用される。Ｌ１のＣＬドメインとのＨ１のＣＨ１ドメインの優先的対合をアッセイする他の方法は、例えば、ＷＯ２０１４／０８１９５５、ＷＯ２０１４／０８２１７９、及びＷＯ２０１４／１５０９７３に記載されており、これらは、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために本明細書に援用される。

安定性
特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上に存在する１個以上のアミノ酸置換（複数可）及びＬ１のＣＬ上に存在する１個以上のアミノ酸置換変異（複数可）は、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の安定性を減少させない。特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上に存在する１個以上のアミノ酸置換（複数可）、Ｌ１のＣＬ上に存在する１個以上のアミノ酸置換変異（複数可）、Ｈ１のＶＨ上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異、及びＬ１のＶＬのＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異は、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の安定性を減少させない。特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上に存在する１個以上のアミノ酸置換（複数可）、Ｌ１のＣＬ上に存在する１個以上のアミノ酸置換変異（複数可）、Ｈ１のＶＨ上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異、Ｌ１のＶＬのＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異、Ｈ２のＶＨ上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異、及びＬ２のＶＬのＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異は、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の安定性を減少させない。

特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の安定性は、アミノ酸置換変異を有しない多特異性抗原結合タンパク質の安定性の少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約９９％超である。

多特異性抗原結合タンパク質の安定性は、当業者に知られるタンパク質安定性を査定するための多様な技術のうちの任意のものを使用して判定することができる。例えば、円二色性（ＣＤ）は、広範に、円偏光の吸収を測定する分光学的技術である。アルファヘリックス及びベータシートなどの構造は不斉であるため、円偏光の吸収は、タンパク質集団の折り畳みの度合いのマーカーとして働く。この技術は、この吸収の変化を温度の関数として測定することによってタンパク質の平衡アンフォールディングを測定するために使用されている。未変性状態及び変性状態の濃度が１である遷移中間点における温度は、タンパク質の溶融温度（Ｔｍ）として知られている。ＣＤに関するさらなる詳細は、例えば、Ｋｅｌｌｙｅｔａｌ．（２０００）ＣｕｒｒＰｒｏｔａｎｄＰｅｐｔｉｄｅＳｃｉ１，３４９−３８４、Ｃｏｒｒｅａｅｔａｌ．（２００９）ＡｆｒｉｃａｎＪＢｉｏｃｈｅｍＲｅｓ３，１６４−１７３、及びＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（２００６）ＮａｔＰｒｏｔｏｃ．１，２５２７−２５３５に記載されている。

特定の実施形態において、本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に記載のＣＨ１／ＣＬ修飾及び／またはＶＨ／ＶＬ修飾を含むもの）は、ＣＨ１／ＣＬドメイン及び／またはＶＨ／ＶＬドメイン内にアミノ酸置換変異を含まない野生型多特異性抗原結合タンパク質のＴｍよりも約１０℃以下、約９．５℃以下、約９℃以下、約８．５℃以下、約８℃以下、約７．５℃以下、約７．０℃以下、約６．５℃以下、約６．０℃以下、約５．５℃以下、約５．０℃以下、約４．５℃以下、約４℃以下、約３．５℃以下、約３℃以下、約２．５℃以下、約２℃以下、約１．５℃以下、約１℃以下、約０．５℃以下、または約０．５℃未満低い溶融温度を有する。特定の実施形態において、本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質のＦａｂ（例えば、本明細書に記載のＣＨ１／ＣＬ修飾及び／またはＶＨ／ＶＬ修飾を含むもの）は、ＣＨ１／ＣＬドメイン及び／またはＶＨ／ＶＬドメイン内にアミノ酸置換変異を含まない多特異性抗原結合タンパク質の野生型親抗体のＦａｂのＴｍよりも約１０℃以下、約９．５℃以下、約９℃以下、約８．５℃以下、約８℃以下、約７．５℃以下、約７．０℃以下、約６．５℃以下、約６．０℃以下、約５．５℃以下、約５．０℃以下、約４．５℃以下、約４℃以下、約３．５℃以下、約３℃以下、約２．５℃以下、約２℃以下、約１．５℃以下、約１℃以下、約０．５℃以下、または約０．５℃未満低い溶融温度を有する。

あるいは、多特異性抗原結合タンパク質の安定性は、例えば、タンパク質中の非共有結合形成を制御する熱力学的パラメータを測定する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して判定してもよい。ＤＳＣに関するさらなる詳細は、例えば、Ｉｏｎｅｓｃｕｅｔａｌ．（２００８）ＪＰｈａｒｍＳｃｉ９７，１４１４−１４２６に記載されている。多特異性抗原結合タンパク質の安定性は、例えば、タンパク質が例えばリガンドまたは第２のタンパク質に結合する際の標的タンパク質の熱的安定性及びタンパク質の溶融温度の変化を測定する、示差走査蛍光定量（ＤＳＦまたは熱的シフトアッセイ）を使用して判定することもできる。ＤＳＦに関するさらなる詳細は、例えば、Ｎｉｅｓｅｎ，ｅｔａｌ．（２００７）ＮａｔＰｒｏｔｏｃ２，２２１２−２２２１に記載されている。

結合親和性
特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上に存在する１個以上のアミノ酸置換（複数可）及びＬ１のＣＬ上に存在する１個以上のアミノ酸置換変異（複数可）は、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の抗原に対する結合親和性を減少させない。特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上に存在する１個以上のアミノ酸置換（複数可）、Ｌ１のＣＬ上に存在する１個以上のアミノ酸置換変異（複数可）、Ｈ１のＶＨ上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異、及びＬ１のＶＬのＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異は、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の抗原に対する結合親和性を減少させない。特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上に存在する１個以上のアミノ酸置換（複数可）、Ｌ１のＣＬ上に存在する１個以上のアミノ酸置換変異（複数可）、Ｈ１のＶＨ上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異、Ｌ１のＶＬのＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異、Ｈ２のＶＨ上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異、及びＬ２のＶＬのＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異は、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の抗原に対する結合親和性を減少させない。

結合親和性の測定方法
本明細書の他の箇所に注記されているように、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の抗原結合は、Ｋｄ、ｋ_ｏｎ、及び／またはｋ_ｏｆｆを含む多様な結合動態パラメータのいずれか１つを測定することによって査定することができる。Ｋｄは、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−Ｔ１００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−Ｔ２００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、２５℃で、１００応答単位（ＲＵ）で固定化された標的（例えば、抗原）ＣＭ５チップを用いて測定することができる。簡潔に述べると、カルボキシメチル化デキストリンバイオセンサチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅＩｎｃ．）を、供給業者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で作動させる。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）まで希釈した後、カップリングされたタンパク質のおよそ１００応答単位（ＲＵ）を実現するように、５μｌ／分の流量で注入する。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロッキングする。動態測定については、Ｆａｂの２倍段階希釈（例えば、０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流量で注入する。会合速度（ｋ_ｏｎ）及び解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、単純な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅＥｖａｌｕａｔｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、会合センサグラムと解離センサグラムとを同時に当てはめることによって計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによるオン速度が１０^６Ｍ^−１ｓ^−１を超える場合、このオン速度は、撹拌されたキュベットを備えるストップフロー装着分光光度計（ＡｖｉｖＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃における蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の上昇または減少を測定する、蛍光消光技法を使用することによって、判定することができる。

特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のＫｄは、ＣＨ１／ＣＬ界面に変異を含まない野生型結合タンパク質のＫｄの少なくとも約１０％以上、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、または約５０％超である。

免疫原性
特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、ヒトにおいて非免疫原性または実質的に非免疫原性である。特定の実施形態において、ＣＨ１領域の修飾（例えば１個以上のアミノ酸置換など）は、ヒトにおいて非免疫原性または実質的に非免疫原性である。特定の実施形態において、ＣＬ領域の修飾（例えば１個以上のアミノ酸置換など）は、ヒトにおいて非免疫原性または実質的に非免疫原性である。特定の実施形態において、ＣＨ１領域の修飾（例えば１個以上のアミノ酸置換など）は、ヒトＴ細胞エピトープをもたらさない。特定の実施形態において、ＣＬ領域の修飾（例えば１個以上のアミノ酸置換など）は、ヒトＴ細胞エピトープをもたらさない。本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の免疫原性は、当業者に周知の方法を使用して評価することができる。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の免疫原性は、ＥＬＩＳＡによって査定される（例えば、Ｙｉｎｅｔａｌ．（２０１５）ＣｅｌｌＩｍｍｕｎｏｌ．２９５，１１８−１２６を参照されたい）。また、例えば、Ｈａｒｔｍａｎｎｅｔａｌ．（２００１）ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７，１８７３−１８８１を参照されたい。

薬物動態特性
特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上に存在する１個以上のアミノ酸置換（複数可）及びＬ１のＣＬ上に存在する１個以上のアミノ酸置換変異（複数可）は、かかるアミノ酸置換を含まない多特異性抗原結合タンパク質と比較して、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の薬物動態特性に著しく影響しない。特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上に存在する１個以上のアミノ酸置換（複数可）、Ｌ１のＣＬ上に存在する１個以上のアミノ酸置換変異（複数可）、Ｈ１のＶＨ上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異、及びＬ１のＶＬのＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異は、かかるアミノ酸置換を含まない多特異性抗原結合タンパク質と比較して、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の薬物動態特性に著しく影響しない。特定の実施形態において、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上に存在する１個以上のアミノ酸置換（複数可）、Ｌ１のＣＬ上に存在する１個以上のアミノ酸置換変異（複数可）、Ｈ１のＶＨ上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異、Ｌ１のＶＬのＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異、Ｈ２のＶＨ上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異、及びＬ２のＶＬのＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異は、かかるアミノ酸置換を含まない多特異性抗原結合タンパク質と比較して、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の薬物動態特性に著しく影響しない。そのような薬物動態特性としては、例えば、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、ＣＬ（すなわち、薬物クリアランス）、ｔ_{１／２，β}、Ｖ_１、及びＶ_ｓｓが挙げられる。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のＣｍａｘは、Ｈ１のＣＨ１、Ｈ１のＶＨ、Ｌ１のＣＬ、Ｌ１のＶＬ、Ｈ２のＣＨ１、Ｈ２のＶＨ、Ｌ２のＣＬ、及び／またはＬ２のＶＬ内にアミノ酸置換を含まない多特異性抗原結合タンパク質の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、または１６０％のいずれか１つである（これらの値間の任意の範囲を含む）。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のＡＵＣは、Ｈ１のＣＨ１、Ｈ１のＶＨ、Ｌ１のＣＬ、Ｌ１のＶＬ、Ｈ２のＣＨ１、Ｈ２のＶＨ、Ｌ２のＣＬ、及び／またはＬ２のＶＬ内にアミノ酸置換を含まない多特異性抗原結合タンパク質の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、または１６０％のいずれか１つである（これらの値間の任意の範囲を含む）。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のＣＬ（すなわち薬物クリアランス）は、Ｈ１のＣＨ１、Ｈ１のＶＨ、Ｌ１のＣＬ、Ｌ１のＶＬ、Ｈ２のＣＨ１、Ｈ２のＶＨ、Ｌ２のＣＬ、及び／またはＬ２のＶＬ内にアミノ酸置換を含まない多特異性抗原結合タンパク質の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、または１６０％のいずれか１つである（これらの値間の任意の範囲を含む）。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のｔ_{１／２，β}は、Ｈ１のＣＨ１、Ｈ１のＶＨ、Ｌ１のＣＬ、Ｌ１のＶＬ、Ｈ２のＣＨ１、Ｈ２のＶＨ、Ｌ２のＣＬ、及び／またはＬ２のＶＬ内にアミノ酸置換を含まない多特異性抗原結合タンパク質の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、または１６０％のいずれか１つである（これらの値間の任意の範囲を含む）。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のＶ_１は、Ｈ１のＣＨ１、Ｈ１のＶＨ、Ｌ１のＣＬ、Ｌ１のＶＬ、Ｈ２のＣＨ１、Ｈ２のＶＨ、Ｌ２のＣＬ、及び／またはＬ２のＶＬ内にアミノ酸置換を含まない多特異性抗原結合タンパク質の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、または１６０％のいずれか１つである（これらの値間の任意の範囲を含む）。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質のＶ_ｓｓは、Ｈ１のＣＨ１、Ｈ１のＶＨ、Ｌ１のＣＬ、Ｌ１のＶＬ、Ｈ２のＣＨ１、Ｈ２のＶＨ、Ｌ２のＣＬ、及び／またはＬ２のＶＬ内にアミノ酸置換を含まない多特異性抗原結合タンパク質の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、または１６０％のいずれか１つである（これらの値間の任意の範囲を含む）。

多特異性抗体形式
本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、当該技術分野で知られる多様な二重特異性または多特異性の抗体形式のうちの任意のものと共に使用することができる。複数の結合特異性を有する分子によって得られる治療機会に取り組むために、多数の形式が当該技術分野において開発されてきた。特異的な抗体軽鎖または断片が特異的な抗体重鎖または断片と対合する二重特異性抗体を調製するためのいくつかの手法が説明されている。

例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５６３８８号（ＷＯ２０１１／１３１７４６）は、還元条件下でのインキュベーションに際し、２つの単一特異性ＩｇＧ４またはＩｇＧ４様抗体間での指向性「Ｆａｂアーム」または「半分子」交換を推進するために、２つの単一特異性出発タンパク質のＣＨ３領域に非対称変異が導入される、ヘテロ二量体タンパク質を生成するためのインビトロ法を記載する。

Ｓｃｈａｅｆｅｒら（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ）は、人工的なリンカーを使用することなく、２つの既存の抗体に由来する２つの重鎖及び２つの軽鎖をヒト二価二重特異性ＩｇＧ抗体にアセンブルする方法を説明する（ＰＮＡＳ（２０１１）１０８（２７）：１１１８７−１１１９２及びＵＳ２００９／０２３２８１１）。この方法は、二重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ）の半分の抗原結合断片（Ｆａｂ）内で１つ以上の重鎖ドメインと軽鎖ドメインとを交換することを伴う。重鎖のヘテロ二量体化を可能にするノブ・イントゥ・ホール技術に基づいて、二重特異性抗体の半分の抗原結合断片（Ｆａｂ）内における重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの交換によって、軽鎖とそれらの同族の重鎖との正確な会合が実現される。この「クロスオーバー」は、抗原結合親和性を保持するが、軽鎖誤対合がもはや起こり得ないほど２つのアームを異なるものにする。それぞれ参照により全体が本明細書に援用される、ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２００９／０８０２５２、ＷＯ２００９／０８０２５３、及びＷＯ２００９／０８０２５４を参照されたい。

ノブ・イントゥ・ホールは、抗体のＣＨ３ドメインのためのヘテロ二量体化技術である。これまで、ノブ・イントゥ・ホール技術は、単一の共通軽鎖（ＬＣ）を有するヒト全長二重特異性抗体の産生に適用されてきた（Ｍｅｒｃｈａｎｔｅｔａｌ．“ＡｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｒｏｕｔｅｔｏｈｕｍａｎｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃＩｇＧ．”ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８；１６：６７７−８１、Ｊａｃｋｍａｎｅｔａｌ．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｔｗｏ−ｐａｒｔｓｔｒａｔｅｇｙｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙａｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｈｕｍａｎｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙｔｈａｔｉｎｈｉｂｉｔｓＩｇＥｒｅｃｅｐｔｏｒｓｉｇｎａｌｉｎｇ．”ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２０１０；２８５：２０８５０−９。）また、参照により全体があらゆる目的のために本明細書に援用される、ＷＯ１９９６０２７０１１を参照されたい。

Ｓｔｒｏｐら（Ｒｉｎａｔ−ＰｆｉｚｅｒＩｎｃ．）は、２つの目的の抗体を別々に発現させ精製し、その後指定されたレドックス条件下でそれらを一緒に混合することによる、安定な二重特異性抗体の産生方法を説明する（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２）４２０：２０４−１９）。

ホモ二量体と比べてヘテロ二量体の形成に対して強い優先度を有する他のヘテロ二量体化ドメインが、本多特異性抗原結合タンパク質に組み込まれてもよい。例証となる例には、例えば、ＷＯ２００７１４７９０１（Ｋｊaeｒｇａａｒｄら−ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ：イオン相互作用を説明する）、ＷＯ２００９０８９００４（Ｋａｎｎａｎら−Ａｍｇｅｎ：静電気的ステアリング効果を説明する）、ＷＯ２０１０／０３４６０５（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら−Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；コイルドコイルを説明する）が含まれるが、これらに限定されない。また、例えば、ロイシンジッパーを説明するＰａｃｋ，Ｐ．＆Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１，１５７９−１５８４（１９９２）、またはヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフを説明するＰａｃｋｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１，１２７１−１２７７（１９９３）を参照されたい。「ヘテロ多量体化ドメイン」及び「ヘテロ二量体化ドメイン」という表現は、本明細書では互換的に使用される。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、１つ以上のヘテロ二量体化ドメインを含む。

Ｚｈｕら（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、定常ドメインを完全に欠いている変異形ドメイン抗体断片から成るダイアボディ構築物のＶＬ／ＶＨ界面内の変異を設計し、ヘテロ二量体ダイアボディを生成した（ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ（１９９７）６：７８１−７８８）。同様に、Ｉｇａｗａら（Ｃｈｕｇａｉ）も、ダイアボディの選択的発現を促進し、かつ立体構造異性化を阻害する、一本鎖ダイアボディのＶＬ／ＶＨ界面内の変異を設計した（ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（２０１０）２３：６６７−６７７）。

米国特許公開第２００９／０１８２１２７号（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ，Ｉｎｃ．）は、一方の対の軽鎖が他方の対の重鎖と相互作用する能力を低減させる、軽鎖−重鎖対のＦｃ界面及びＣＨ１：ＣＬ界面におけるアミノ酸残基を修飾することによる二重特異性抗体の生成を記載する。

二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子（例えば、Ｗｏｌｆｅｔａｌ．（２００５）ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴｏｄａｙ１０：１２３７−１２４４）を参照されたい）に使用される別の形式は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）モジュールに基づく。ｓｃＦｖは、可動性リンカーを介して融合した、抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域から成り、これは、概して適切に折り畳むことができ、その結果、これらの領域は同族の抗原に結合することができる。ＢｉＴＥは、異なる特異性の２つのｓｃＦｖを一本鎖上で直列に連結させる。この構成は、同じ重鎖可変領域の２つのコピーを有する分子の産生を妨げる。加えて、このリンカー構成は、それぞれの軽鎖及び重鎖の正確な対合を確実にするように設計されている。

様々な二重特異性及び多特異性の抗体形式の概説が、Ｋｌｅｉｎｅｔａｌ．，（２０１２）ｍＡｂｓ４：６，６５３−６６３及びＳｐｉｅｓｓｅｔａｌ．（２０１５）“Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｏｒｍａｔｓａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５年１月２７日オンライン公開、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｉｍｍ．２０１５．０１．００３）に提供されている。
本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質は、上述の形式のうちの任意のものに組み込むことができる。特定の実施形態において、本明細書に記載のＣＨ１／ＣＬ変異及びＶＨ／ＶＬ変異をＣｒｏｓｓＭａｂ技術と組み合わせて、正確な重鎖／軽鎖対合をさらに確実にすることができる。

ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
ポリヌクレオチド
本明細書では、本明細書に記載の重鎖及び／または軽鎖の定常ドメイン及び／または可変ドメインをコードする核酸が提供される。特定の実施形態において、本明細書において提供される単離された核酸は、本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質の少なくとも１つのポリペプチド配列をコードする。特定の実施形態において、本明細書において提供される単離された核酸は、本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質の少なくとも２つのポリペプチド配列をコードする。特定の実施形態において、本明細書において提供される単離された核酸は、本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質の少なくとも３つのポリペプチド配列をコードする。特定の実施形態において、本明細書において提供される単離された核酸は、本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質の少なくとも４つのポリペプチド配列をコードする。特定の実施形態において、本明細書において提供される単離された核酸は、本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質の４つより多くのポリペプチド配列をコードする。

本明細書において提供される核酸分子は、一本鎖形態と二本鎖形態との両方におけるＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびに対応する相補的な配列を含む。ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、キメラ合成ＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせを含む。本明細書において提供される核酸分子は、全長遺伝子またはｃＤＮＡ分子、ならびにそれらの断片の組み合わせを含む。特定の実施形態において、本明細書において提供される核酸は、ヒト源に由来する。特定の実施形態において、本明細書において提供される核酸は、マウス源に由来する。

本明細書の他の箇所に注記されているように、「単離された」核酸は、自然発生源から単離された核酸の場合、その核酸が単離された生物のゲノム内に存在する隣接する遺伝子配列から分離されている核酸である。例えばＰＣＲ生成物、ｃＤＮＡ分子、またはオリゴヌクレオチドなどの、鋳型から酵素的に合成された核酸または化学的に合成された核酸の場合、そのようなプロセスから生じる核酸は、単離された核酸であると理解される。単離された核酸分子は、別々の断片の形態にある、またはより大きな核酸構築物の構成要素としての核酸分子を指す。

特定の実施形態において、核酸は、内在性汚染物質を実質的に含まない。核酸分子は、標準的な生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に概説されているものなど）によって、実質的に純粋な形態で、かつその構成ヌクレオチド配列の特定、操作、及び回収を可能にする量または濃度で少なくとも１回単離されている、ＤＮＡまたはＲＮＡから得られたものであることが好ましい。そのような配列は、真核生物の遺伝子中に典型的に存在する内部非翻訳配列、すなわちイントロンによって中断されていない、オープンリーディングフレームの形態で提供及び／または構築されることが好ましい。翻訳されないＤＮＡの配列は、それがコード領域の操作または発現に干渉しないオープンリーディングフレームの５’側または３’側に存在し得る。

核酸変異形は通常、カセットもしくはＰＣＲ変異誘発または当該技術分野で周知の他の技術を使用して、変異形をコードするＤＮＡを産生し、その後、本明細書に概説される細胞培養物中で組換えＤＮＡを発現させる、ポリペプチドをコードするＤＮＡ内のヌクレオチドの部位特異性変異誘発によって調製される。しかしながら、最大約１００〜１５０個の残基を有する変異形ＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合断片は、確立された技術を使用するインビトロ合成によって調製されてもよい。変異形は典型的に、自然発生類似体と同じ定性的生物活性、例えば抗原への結合を示すが、改変された特徴を有する変異形が選択されてもよい。

当業者には理解されるように、遺伝コードの縮重のために、極端に多数の核酸が作製され得、その全てが、本明細書に記載の多量体抗原結合タンパク質のＣＤＲならびに重鎖及び軽鎖または他の構成要素をコードする。したがって、特定のアミノ酸配列を特定したら、当業者は単に、コードされる多量体抗原結合タンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で１つ以上のコドンの配列を修飾することによって、任意の数の異なる核酸を作製することができる。

ベクター
少なくとも１つの本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む、プラスミド、発現ベクター、転写カセット、または発現カセットの形態の発現系及び構築物が提供される。特定の実施形態において、本明細書において提供されるプラスミド、発現ベクター、転写カセット、または発現カセットは、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の少なくとも１つのポリペプチド（例えば、第１の重鎖、第１の軽鎖、第２の重鎖、または第２の軽鎖）をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、本明細書において提供されるプラスミド、発現ベクター、転写カセット、または発現カセットは、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の少なくとも２つのポリペプチド（例えば、第１の重鎖及び第１の軽鎖、または第２の重鎖及び第２の軽鎖）をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、本明細書において提供されるプラスミド、発現ベクター、転写カセット、または発現カセットは、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の少なくとも４つのポリペプチド（例えば、第１の重鎖、第１の軽鎖、第２の重鎖、及び第２の軽鎖）をコードするポリヌクレオチドを含む。

典型的に、宿主細胞内で使用される発現ベクターは、プラスミド維持用ならびに外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現用の配列を含む。かかる配列は、特定の実施形態では集合的に「フランキング配列」と呼ばれ、典型的に、次のヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれを以下に詳解する。

任意に、ベクターは、「タグ」コード配列、すなわち、ポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に典型的に位置するオリゴヌクレオチド分子を含んでもよく、オリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（例えばヘキサＨｉｓ（配列番号６６）など）、またはＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、もしくはｍｙｃなどの別の「タグ」をコードし、これらに対しては市販の抗体が存在する。このタグは典型的に、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合し、宿主細胞からのポリペプチドの親和性精製または検出のための手段として役立ち得る。親和性精製は、例えば、タグに対する抗体を親和性マトリクスとして使用するカラムクロマトグラフィによって達成することができる。任意に、タグはその後、切断のための特定のペプチダーゼの使用などの様々な手段によって、精製されたポリペプチドから除去されてもよい。

フランキング配列は、相同性（すなわち、宿主細胞と同じ種及び／または株由来）、異種性（すなわち、宿主細胞種または株以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの源由来のフランキング配列の組み合わせ）、合成、または天然であってもよい。したがって、フランキング配列の源は、フランキング配列が宿主細胞機構内で機能的であり、かつそれによって活性化され得る限り、任意の原核生物もしくは真核生物、任意の脊椎生物もしくは無脊椎生物、または任意の植物であってよい。

本明細書において提供されるベクターにおいて有用なフランキング配列は、当該技術分野で周知のいくつかの方法のうちのいずれによって得られてもよい。典型的に、本明細書において有用なフランキング配列は、マッピング及び／または制限エンドヌクレアーゼ消化によってこれまでに特定されているものであり、したがって、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して適当な組織源から単離することができる。一部の事例では、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列が既知である場合がある。ここで、フランキング配列は、本明細書に記載される核酸合成またはクローニングのための方法を使用して合成され得る。

フランキング配列の全てが既知であるか一部分のみが既知であるかに関わらず、それは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、及び／または同じ種もしくは別の種由来のオリゴヌクレオチド及び／またはフランキング配列断片などの好適なプローブを使用したゲノムライブラリのスクリーニングによって得ることができる。フランキング配列が既知でない場合、フランキング配列を含むＤＮＡの断片は、例えば、コード配列またはさらには別の遺伝子（複数可）を含み得る、より大きな一片のＤＮＡから単離され得る。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適当なＤＮＡ断片を産生し、続いて、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、または当業者に知られる他の方法を使用して単離を行うことによって達成され得る。この目的を達成するために好適な酵素の選択は、当業者には容易に明らかになるであろう。

複製起点は典型的に、商業的に購入される原核生物の発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞内のベクターの増幅を補助する。選ばれたベクターが複製起点部位を含まない場合、既知の配列に基づいて化学合成し、ベクターに連結してもよい。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点が、ほとんどのグラム陰性菌に好適であり、様々なウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）が、哺乳動物細胞内でベクターをクローニングするのに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターには必要とされない（例えば、ＳＶ４０起点は、単にそれがウイルスの初期プロモーターも含むことから使用されることが多い）。

転写終結配列は典型的にポリペプチドコード領域の末端の３’側に位置し、転写を終結させる働きをする。通常、原核細胞内の転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチ断片にポリＴ配列が続いたものである。この配列は容易にライブラリからクローニングされ、またはさらにはベクターの一部として商業的に購入されるが、本明細書に記載のものなどの核酸合成方法を使用して容易に合成することもできる。

選択可能マーカー遺伝子は、選択的培養培地中で成長する宿主細胞の生存及び成長に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、もしくはカナマイシンに対する耐性を原核宿主細胞に付与するタンパク質、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完するタンパク質、または（ｃ）複合培地もしくは限定培地から入手不可能な必須栄養素を供給するタンパク質をコードする。具体的な選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利なことに、ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物と真核生物との両方の宿主細胞における選択に使用され得る。

他の選択可能遺伝子を使用して、発現される遺伝子を増幅してもよい。増幅とは、成長または細胞生存に必須のタンパク質の産生に必要とされる遺伝子が、組換え細胞の連続的世代の染色体内で直列反復されるプロセスである。哺乳動物細胞の好適な選択可能マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びプロモーターレスチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体が淘汰圧下に置かれ、ここで、形質転換体のみが、ベクター内に存在する選択可能遺伝子によって生存するように独特に適合される。淘汰圧は、培地中の選択剤の濃度が連続的に上昇する条件下で形質転換細胞を培養することによって課され、それにより、選択可能遺伝子と、抗体軽鎖または重鎖などの別の遺伝子をコードするＤＮＡとの両方が増幅される。結果として、増加した量のポリペプチドが、増幅したＤＮＡから合成される。

リボソーム結合部位は、ｍＲＮＡの翻訳開始に通常必要であり、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核生物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは典型的に、発現されるポリペプチドのプロモーターの３’側、そしてコード配列の５’側に位置する。特定の実施形態において、１つ以上のコード領域が内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結されてもよく、これにより、単一のＲＮＡ転写物から２つのオープンリーディングフレームを翻訳することが可能になる。

真核宿主細胞発現系でグリコシル化が所望される場合などの一部の事例では、様々なプレ配列またはプロ配列を操作して、グリコシル化または収率を改善してもよい。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更するか、またはプロ配列を追加してもよく、これもグリコシル化に影響を与え得る。最終的なタンパク質生成物は、完全に除去されていない場合がある、発現に付随する１つ以上の追加のアミノ酸を、（成熟タンパク質の第１のアミノ酸に対して）−１位に有し得る。例えば、最終的なタンパク質生成物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位に見出される１個または２個のアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、その酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域で切断する場合、所望のポリペプチドのわずかに切断された形態をもたらし得る。

本明細書において提供される発現ベクター及びクローニングベクターは、典型的に、宿主生物によって認識され、かつポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子の開始コドンの上流（すなわち、５’側）（概して約１００〜１０００ｂｐ以内）に位置する未転写配列である。プロモーターは、慣習的に、２つのクラス：誘導性プロモーター及び構成的プロモーターのうちの１つに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば栄養素の存在もしくは非存在、または温度の変化などに応答して、それらの制御下のＤＮＡの上昇したレベルの転写を開始する。一方で、構成的プロモーターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子を均一に、すなわち、遺伝子発現の制御をほとんどまたは全く行わずに転写する。多様な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。好適なプロモーターは、制限酵素消化によりソースＤＮＡからプロモーターを除去し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、例えば、重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。

酵母宿主で使用するのに好適なプロモーターも、当該技術分野で周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞で使用するのに好適なプロモーターが周知であり、これには、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）といったウイルスのゲノムから得られるものが含まれるが、これらに限定されない。他の好適な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが含まれる。

関心の対象となり得る追加のプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター（ＢｅｎｏｉｓｔａｎｄＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ２９０：３０４−３１０）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｍｓｅｎｅｔａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９−６６３）；ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏｅｔａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ２２：７８７−７９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−１４４５）；メタロチオネイン遺伝子由来のプロモーター及び制御配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒｅｔａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ２９６：３９−４２）；ならびにベータ−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物プロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆｅｔａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒｅｔａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）が含まれるが、これらに限定されない。組織特異性を示し、かつトランスジェニック動物で用いられている、次の動物の転写制御領域も関心の対象である：膵腺房細胞内で活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔｅｔａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ３８：６３９−６４６、Ｏｍｉｔｚｅｔａｌ．，１９８６，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９、ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ７：４２５−５１５）；膵ベータ細胞内で活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１５：１１５−１２２）；リンパ系細胞内で活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌｅｔａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ３８：６４７−６５８、Ａｄａｍｅｓｅｔａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１８：５３３−５３８、Ａｌｅｘａｎｄｅｒｅｔａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞、及びマスト細胞内で活性であるマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒｅｔａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ４５：４８５−４９５）；肝臓内で活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔｅｔａｌ．，１９８７，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）；肝臓内で活性であるアルファ−フェトタンパク質（ａｌｐｈａ−ｆｅｔａ−ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆｅｔａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８、Ｈａｍｍｅｒｅｔａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５３：５３−５８）；肝臓内で活性であるアルファ１アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙｅｔａｌ．，１９８７，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）；骨髄系細胞内で活性であるベータグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍｅｔａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１５：３３８−３４０、Ｋｏｌｌｉａｓｅｔａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ４６：８９−９４）；脳内のオリゴデンドロサイト細胞内で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄｅｔａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ４８：７０３−７１２）；骨格筋内で活性であるミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１４：２８３−２８６）；ならびに視床下部内で活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎｅｔａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４：１３７２−１３７８）。

高等真核生物による本明細書において提供される軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡの転写を増加させるために、エンハンサー配列をベクターに挿入してもよい。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増加させる、通常約１０〜３００ｂｐの長さのＤＮＡのシスエレメントである。エンハンサーは、比較的配向及び位置依存性であり、転写ユニットの５’側と３’側との両方の位置で見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファフェトタンパク質、及びインスリン）。しかしながら、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当該技術分野で知られるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーはベクター内のコード配列の５’側または３’側のいずれに位置付けられてもよいが、典型的には、プロモーターから５’側の部位に位置する。適切な天然または異種のシグナル配列（リーダー配列またはシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクターに組み込んで、多特異性抗原結合タンパク質の細胞外分泌を促進することができる。シグナルペプチドすなわちリーダーの選択は、中で多特異性抗原結合タンパク質が産生される宿主細胞の型に左右され、異種シグナル配列は、天然シグナル配列を置き換えることができる。哺乳動物宿主細胞において機能的なシグナルペプチドの例としては、次のものが挙げられる：米国特許第４，９６５，１９５号に記載のインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎｅｔａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ３１２：７６８に記載のインターロイキン−２受容体のシグナル配列；欧州特許第０３６７５６６号に記載のインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載のＩ型インターロイキン−Ｉ受容体シグナルペプチド；欧州特許第０４６０８４６号に記載のＩＩ型インターロイキン−Ｉ受容体シグナルペプチド。

ベクターは、ベクターが宿主細胞ゲノムに組み込まれたときに発現を促進する１つ以上のエレメントを含有してもよい。例としては、ＥＡＳＥエレメント（Ａｌｄｒｉｃｈｅｔａｌ．２００３ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ．１９：１４３３−３８）及びマトリクス結合領域（ＭＡＲ）が挙げられる。ＭＡＲは、染色質の構造組織化を媒介し、組み込まれたベクターを「位置」効果から遮蔽する場合がある。したがってＭＡＲは、安定なトランスフェクタントを作り出すためにベクターが使用される場合に特に有用である。いくつかの天然及び合成のＭＡＲ含有核酸が、当該技術分野、例えば、米国特許第６，２３９，３２８号、同第７，３２６，５６７号、同第６，１７７，６１２号、同第６，３８８，０６６号、同第６，２４５，９７４号、同第７，２５９，０１０号、同第６，０３７，５２５号、同第７，４２２，８７４号、同第７，１２９，０６２号で知られている。

本明細書において提供される発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築されてもよい。そのようなベクターは、所望のフランキング配列の全てを含有していても含有していなくてもよい。本明細書に記載のフランキング配列のうちの１つ以上がベクター内に既に存在していない場合、それらは個別に得られベクターに連結されてもよい。フランキング配列のそれぞれを得るために使用される方法は、当業者に周知である。

ベクターが構築され、軽鎖、重鎖、または軽鎖及び重鎖の配列をコードする核酸分子がベクターの適当な部位に挿入された後、完成したベクターは、増幅及び／またはポリペプチド発現のために好適な宿主細胞に挿入され得る。発現ベクターを選択された宿主細胞に形質転換することは、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔、微量注入、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、または他の既知の技術を含む周知の方法によって達成され得る。選択された方法は、部分的に、使用される宿主細胞の型の機能となる。これらの方法及び他の好適な方法は当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，２００１（上記）に記載されている。特定の実施形態において、第１の重鎖、第１の軽鎖、第２の重鎖、及び第１の軽鎖を発現することのできる１つ以上のベクターが、宿主細胞に導入される。

宿主細胞
加えて、上述の発現系または構築物を含む宿主細胞が提供される。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、単一の宿主細胞から発現される。宿主細胞は、適切な条件下で培養された場合、多特異性抗原結合タンパク質を合成し、このタンパク質はその後、培養培地から（宿主細胞がそれを培地に分泌する場合）、またはそれを産生する宿主細胞から直接（それが分泌されない場合）収集することができる。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいまたは必要なポリペプチド修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化など）、及び生物活性分子に折り畳むことの容易さといった様々な要素に左右される。宿主細胞は、真核細胞であっても原核細胞であってもよい。

発現の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当該技術分野で周知であり、これには、限定されないが、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株が含まれ、当該技術分野で知られる発現系において使用されるあらゆる細胞株が、本明細書において提供される組換えポリペプチドを作製するために使用され得る。概して、宿主細胞は、所望の多特異性抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターを用いて形質転換される。用いられ得る宿主細胞には、原核細胞、酵母細胞、または高等真核細胞がある。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性の生物、例えばＥ．ｃｏｌｉまたはｂａｃｉｌｌｉが含まれる。高等真核細胞には、昆虫細胞及び哺乳動物起源の樹立細胞株が含まれる。好適な哺乳動物宿主細胞株の例としては、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎｅｔａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ２３：１７５）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはＶｅｇｇｉｅＣＨＯなどのそれらの誘導体、及び血清不含培地で成長する関連細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎｅｔａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２８：３１）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣＣＲＬ１０）細胞株、ならびにＭｃＭａｈａｎｅｔａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯＪ．１０：２８２１に記載のアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶＩ（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）に由来するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株、２９３、２９３ＥＢＮＡ、またはＭＳＲ２９３などのヒト胚性腎臓細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常な二倍体細胞、一次組織、一次外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、またはＪｕｒｋａｔ細胞のインビトロ培養に由来する細胞株が挙げられる。任意に、例えばＨｅｐＧ２／３Ｂ、ＫＢ、ＮＩＨ３Ｔ３、またはＳ４９などの哺乳動物細胞株は、様々なシグナル形質導入またはレポーターアッセイにおいてポリペプチドを使用することが望ましい場合に、ポリペプチドの発現のために使用され得る。あるいは、酵母などの下等真核生物または細菌などの原核生物においてポリペプチドを産生することが可能である。好適な酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株、Ｃａｎｄｉｄａ株、Ｐｉｃｈｉａ株、または異種ポリペプチドを発現することのできる任意の酵母株が挙げられる。好適な細菌株としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、または異種ポリペプチドを発現することの任意の細菌株が挙げられる。

特定の実施形態において、本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質を発現する細胞株が提供される。特定の実施形態において、細胞株は、原核細胞株である。特定の実施形態において、細胞株は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞株である。特定の実施形態において、ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、及びＬＣ２は、同じ原核細胞で共発現される。特定の実施形態において、ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、及びＬＣ２は、同じＥ．ｃｏｌｉ細胞で共発現される。特定の実施形態において、ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、及びＬＣ２は、同じ真核細胞で共発現される。特定の実施形態において、細胞株は、真核細胞株である。特定の実施形態において、細胞株は、安定細胞株である。特定の実施形態において、安定細胞株は、哺乳動物細胞株である。特定の実施形態において、安定細胞株は、ＣＨＯ細胞株である。特定の実施形態において、安定細胞株により発現される多特異性抗原結合タンパク質の少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超が、正確にアセンブルされる（すなわち、ＬＣ１がＨＣ１と対合し、ＬＣ２がＨＣ２と対合する）。安定細胞株は、当該技術分野で知られる方法によって生成することができる。特定の実施形態において、安定細胞株は、ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、及びＬＣ２を発現するポリヌクレオチド（複数可）を、ランダムに、または標的を定めて、宿主細胞ゲノムに組み込むことによって生成される。

多特異性抗原結合タンパク質が酵母または細菌内で作製される場合、機能的な生成物を得るために、その中で産生された生成物を、例えば適切な部位のリン酸化またはグリコシル化によって修飾することが望ましい場合がある。そのような共有結合は、既知の化学的または酵素的な方法を使用して達成することができる。ポリペプチドは、本明細書において提供される単離された核酸を、１つ以上の昆虫発現ベクター内の好適な制御配列に作動可能に連結し、昆虫発現系を用いることによって産生することもできる。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に関する材料及び方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．からキット形態で市販されており（ＭａｘＢａｃキット）、かかる方法は、ＳｕｍｍｅｒｓａｎｄＳｍｉｔｈ，ＴｅｘａｓＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＳｔａｔｉｏｎＢｕｌｌｅｔｉｎＮｏ．１５５５（１９８７）、及びＬｕｃｋｏｗａｎｄＳｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７（１９８８）に記載されるように、当該技術分野で周知である。本明細書に開示される核酸構築物に由来するＲＮＡを使用して抗体または断片などのポリペプチドを産生するために、細胞不含翻訳系が用いられてもよい。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞の宿主で使用するのに適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓら（ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８５）によって説明されている。好ましくは、少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、本明細書において提供される単離された核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。

特定の実施形態において、細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有し、所望の結合特性を有する多特異性抗原結合タンパク質を恒常的に産生するかを判定することによって、選択されてもよい。別の実施形態では、それ自体の抗体は作製しないが、異種の多特異性抗原結合タンパク質を作製し分泌する能力を有する、Ｂ細胞系譜由来の細胞株を選択することができる。

多特異性抗原結合タンパク質の産生及び精製
宿主細胞の培養
特定の実施形態において、（ａ）Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、及びＬ２をコードする一式のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することと、（ｂ）宿主細胞を培養して多特異性抗原結合タンパク質を産生することとを含む、本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質の産生方法が提供される。特定の実施形態において、Ｌ１及びＬ２をコードするポリヌクレオチドは、既定の比率（例えば、モル比または重量比）で宿主細胞に導入される。特定の実施形態において、Ｌ１及びＬ２をコードするポリヌクレオチドは、Ｌ１：Ｌ２の比率（例えば、モル比または重量比）が、約１：１、約１：１．５、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４、約１：４．５、約１：５、約１：５．５、約１．５：１、約２：１、約２．５：１、約３：１、約３．５：１、約４：１、約４．５：１、約５：１、または約５．５：１（これらの値間の任意の範囲を含む）になるように、宿主細胞に導入される。特定の実施形態において、この比率はモル比である。特定の実施形態において、この割当は重量比である。特定の実施形態において、Ｈ１及びＨ１をコードするポリヌクレオチドは、既定の比率（例えば、モル比または重量比）で宿主細胞に導入される。特定の実施形態において、Ｈ１及びＨ２をコードするポリヌクレオチドは、Ｈ１：Ｈ２の比率（例えば、モル比または重量比）が、約１：１、約１：１．５、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４、約１：４．５、約１：５、約１：５．５、約１．５：１、約２：１、約２．５：１、約３：１、約３．５：１、約４：１、約４．５：１、約５：１、または約５．５：１（これらの値間の任意の範囲を含む）になるように、宿主細胞に導入される。特定の実施形態において、この比率はモル比である。特定の実施形態において、この割当は重量比である。特定の実施形態において、Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、及びＬ２をコードするポリヌクレオチドは、既定の比率（例えば、モル比または重量比）で宿主細胞に導入される。特定の実施形態において、Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、及びＬ２をコードするポリヌクレオチドは、Ｈ１＋Ｈ２：Ｌ１＋Ｌ２の比率（例えば、モル比または重量比）が、約５：１、約５：２、約５：３、約５：４、約１：１、約４：５、約３：５、約２：５、または約１：５（これらの値間の任意の範囲を含む）になるように、宿主細胞に導入される。特定の実施形態において、ＬＣ１、ＬＣ２、ＨＣ１、及びＨＣ２をコードするポリヌクレオチドは、ＬＣ１：ＬＣ２：ＨＣ１：ＨＣ２の比率（例えば、モル比または重量比）が、約１：１：１：１、約２．８：１：１：１、約１．４：１：１：１、約１：１．４：１：１、約１：２．８：１：１、約１：１：２．８：１、約１：１：１．４：１、約１：１：１：２．８、または約１：１：１：１．４（これらの値間の任意の範囲を含む）になるように、宿主細胞に導入される。特定の実施形態において、この比率はモル比である。特定の実施形態において、この割当は重量比である。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質の産生方法は、細胞への導入のためのポリヌクレオチドの最適な比率を決定することをさらに含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質の収率（例えば二重特異性抗体の収率など）を判定するために質量分析が使用され、多特異性抗原結合タンパク質の収率（例えば二重特異性抗体の収率）を最大化させるように最適な鎖比が調節される。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質の収率（例えば二重特異性抗体の収率など）を判定するために二重抗原ＥＬＩＳＡが使用され、収率を最大化させるように最適な鎖比が調節される。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質の産生方法は、多特異性抗原結合タンパク質を細胞培養物から採取または回収することをさらに含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質の産生方法は、採取または回収された多特異性抗原結合タンパク質を精製することをさらに含む。

本明細書において提供される所望の多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など）を産生するために使用される宿主細胞は、多様な培地で培養され得る。Ｈａｍ’ｓＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ｈａｍｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、もしくは同第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国特許Ｒｅ．３０，９８５号に記載の培地のうちのいずれも、宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモン及び／または他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物と定義される）、及びグルコースまたは同等のエネルギー源が補充され得る。任意の他の必要な補充物が、当業者には分かるであろう適切な濃度で含まれてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞にこれまでに使用されているものであり、当業者には明らかであろう。

多特異性抗原結合タンパク質の採取または回収及び精製
関連する態様において、多特異性抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下で上述の宿主細胞を培養することと、多特異性抗原結合タンパク質を回収（例えば採取）することとを含む、本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質の産生方法が提供される。特定の実施形態において、本方法は、回収された多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など）を精製して、例えばさらなるアッセイ及び使用のために、実質的に均質である調製物を得ることをさらに含む。

本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、細胞内で産生されてもよく、培地に直接分泌されてもよい。多特異性抗原結合タンパク質が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、宿主細胞あるいは溶解断片である微粒子状の残骸が、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。多特異性抗原結合タンパク質が培地に分泌される場合、概して、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して、かかる発現系からの上清をまず濃縮する。タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害薬が前述のステップのいずれかに含まれてもよく、外来性混入物の成長を防止するために、抗生物質が含まれてもよい。

当該技術分野で知られる標準的なタンパク質精製方法を用いて、細胞から多特異性抗原結合タンパク質の実質的に均質な調製物を得ることができる。次の手順は、好適な精製手順の例示である：免疫親和性カラムまたはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカまたはＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及び例えばＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５を使用したゲル濾過。

追加的または代替的に、調製された多特異性抗原結合タンパク質は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィを使用して精製することができ、親和性クロマトグラフィが好ましい精製技術である。

特定の態様では、上述の細胞培養培地から得られた調製物が、タンパク質Ａ固定化固相に適用されて、タンパク質Ａに対する目的の多特異性抗原結合タンパク質の特異的結合が可能になる。その後、固相が洗浄されて、固相に非特異的に結合した混入物が除去される。多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など）は、カオトロピック剤または穏やかな洗剤を含有する溶液への溶出によって、固相から回収される。例示的なカオトロピック剤及び穏やかな洗剤としては、グアニジン−ＨＣｌ、尿素、過塩素酸リチウム、アルギニン、ヒスチジン、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、及びＮＰ−４０が挙げられるがこれらに限定されず、これらは全て市販されている。

親和性リガンドとしてのタンパク質Ａの好適性は、多特異性抗原結合タンパク質中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに左右される。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリクスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリクスも利用可能である。孔制御ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリクスにより、アガロースで実現され得るものよりも速い流速及び短い処理時間が可能となる。多特異性抗原結合タンパク質がＣ_Ｈ３ドメインを含む場合、ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えばイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィ、ヘパリンでのクロマトグラフィ、アニオンもしくはカチオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラムなど）でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿なども、回収される多特異性抗原結合タンパク質に応じて利用可能である。

任意の予備精製ステップ（複数可）の後、目的の多特異性抗原結合タンパク質及び混入物を含む混合物は、約２．５〜４．５のｐＨ溶出緩衝液を使用した、好ましくは低い塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で行われる低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィに供され得る。多特異性抗原結合タンパク質の産生は、（前述の特定の方法のいずれかに対して）代替的または追加的に、ポリペプチドの混合物を含む溶液を透析することを含む。

多特異性抗原結合タンパク質のライブラリ
本明細書では、本明細書に記載される複数の多特異性抗原結合タンパク質を含むライブラリが提供される。特定の実施形態において、本ライブラリは、ポリヌクレオチドライブラリ（例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかの複数）である。特定の実施形態において、本ライブラリは、ポリペプチドライブラリ（例えば、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかの複数）である。特定の実施形態において、本明細書において提供されるポリペプチドライブラリは、ポリペプチドディスプレイライブラリである。そのようなポリペプチドディスプレイライブラリをスクリーニングして、治療、予防、獣医学、診断、試薬、または材料に関する用途を含むがこれらに限定されない、多様な用役のための所望される特定を有する結合タンパク質を選択及び／または進化させることができる。

特定の実施形態において、少なくとも２個、３個、４個、５個、１０個、３０個、１００個、２５０個、５００個、７５０個、１０００個、２５００個、５０００個、７５００個、１００００個、２５０００個、５００００個、７５０００個、１０００００個、２５００００個、５０００００個、７５００００個、１００００００個、２５０００００個、５００００００個、７５０００００個、１０００００００個、または１０００００００個超の異なる多特異性抗原結合タンパク質を含むライブラリが提供され、これらの多特異性抗原結合タンパク質はそれぞれ、Ｈ１のＣＨ１ドメイン上のＳ１８３位（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換変異、及びＬ１のＣＬドメイン上のＶ１３３位（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換変異を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ｖ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｖ１３３Ｉ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１３１Ｄ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｉ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ａ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ｖ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｉ、及びＳ１８３Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｙ、Ｓ１６２Ａ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｍ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｔ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｔ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ｌ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｔ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｔ、及びＳ１８３Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ｍ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｍ、及びＴ１７８Ｌ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、及びＳ１８３Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、及びＳ１８３Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ及びＳ１７６Ｆ変異を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、及びＳ１８３Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ及びＳ１７６Ｆ変異を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、及びＳ１８１Ｍ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ及びＶ１８５Ａ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ及びＳ１７６Ｆ変異を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それから成るもの、及びそれから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それから成るもの、及びそれから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それから成るもの、及びそれから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それから成るもの、及びそれから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それから成るもの、及びそれから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それから成るもの、及びそれから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６ＡおよびＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ａ１４１Ｉ及びＦ１７０Ｓ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、及びそれらから本質的に成るものを含む）Ｈ１のＣＨ１ドメインと、Ｆ１１６Ａ及びＳ１７６Ｆ変異（ＥＵ付番）を含む（それらから成るもの、またはそれらから本質的に成るものを含む）Ｌ１のＣＬドメインと、を含む。

追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｈ１のＶＨドメイン上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異と、Ｌ１のＶＬドメイン上のＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異とを含む。追加的または代替的に、ライブラリ内の多特異性抗原結合タンパク質は、Ｈ２のＶＨドメイン上のＱ３９位（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換変異と、Ｌ２のＶＬドメイン上のＱ３８位（Ｋａｂａｔ付番におけるアミノ酸置換変異とを含む。

特定の実施形態において、相補性決定領域（ＣＤＲ）に特有の配列を有する本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質を、少なくとも２個、３個、４個、５個、１０個、３０個、１００個、２５０個、５００個、７５０個、１０００個、２５００個、５０００個、７５００個、１００００個、２５０００個、５００００個、７５０００個、１０００００個、２５００００個、５０００００個、７５００００個、１００００００個、２５０００００個、５００００００個、７５０００００個、１０００００００個、または１０００００００個超含む（これらの値間の任意の範囲を含む）、ライブラリが提供される。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質ライブラリは、約２、約５、約１０、約５０、約１００、約２５０、約５００、約７５０、約１０^３、約１０^４、約１０^５、約１０^６、約１０^７、約１０^８、約１０^９、約１０^１０、約１０^１１、約１０^１２、約１０^１３、約１０^１４、または約１０^１４超（例えば約１０^１５または約１０^１６など）（これらの値間の任意の範囲を含む）の配列多様性を有する。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質ライブラリは、遺伝子操作によって生成される。変異誘発そしてその後のライブラリ構築のための多様な方法が、（スクリーニングまたは選択のための適切な方法と併せて）これまでに説明されている。そのような変異誘発方法としては、例えば、エラープローンＰＣＲ、ループシャフリング、もしくはオリゴヌクレオチド指向性変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または組換え前の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。これらの方法に関するさらなる詳細は、例えば、Ａｂｏｕ−Ｎａｄｌｅｒｅｔａｌ．（２０１０）ＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＢｕｇｓ１，３３７−３４０、Ｆｉｒｔｈｅｔａｌ．（２００５）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２１，３３１４−３３１５、Ｃｉｒｉｎｏｅｔａｌ．（２００３）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ２３１，３−９、Ｐｉｒａｋｉｔｉｋｕｌｒ（２０１０）ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ１９，２３３６−２３４６、Ｓｔｅｆｆｅｎｓｅｔａｌ．（２００７）Ｊ．ＢｉｏｍｏｌＴｅｃｈ１８，１４７−１４９などに記載されている。したがって、特定の実施形態において、遺伝子操作技術によって生成された多特異性抗原結合タンパク質ライブラリが提供される。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質ライブラリは、インビトロ翻訳によって生成される。簡潔に述べると、インビトロ翻訳は、プロモーターを含有するベクターにタンパク質コード配列（複数可）をクローニングし、クローニングされた配列（複数可）をＲＮＡポリメラーゼで転写することによってｍＲＮＡを産生し、例えば、細胞不含抽出物を使用して、このｍＲＮＡのインビトロでの翻訳によってタンパク質を合成することを伴う。所望の変異体タンパク質は、単純に、クローニングされたタンパク質コード配列を変更することによって生成することができる。多くのｍＲＮＡが、コムギ胚芽抽出物またはウサギ網状赤血球ライセート中で効率的に翻訳され得る。インビトロ翻訳に関するさらなる詳細は、例えば、Ｈｏｐｅｅｔａｌ．（１９８５）Ｃｅｌｌ４３，１７７−１８８、Ｈｏｐｅｅｔａｌ．（１９８６）Ｃｅｌｌ４６，８８５−８９４、Ｈｏｐｅｅｔａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６，２７８１−２７８４、Ｈｏｐｅｅｔａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３３，６３５−６４０、及びＭｅｌｔｏｎｅｔａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２，７０５７−７０７０に記載されている。

したがって、本明細書に記載のポリペプチドディスプレイライブラリをコードする複数の核酸分子が提供される。複数の核酸分子に作動可能に連結された発現ベクターも、本明細書において提供される。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質ライブラリは、化学合成によって生成される。固相及び液相ペプチド合成の方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，３５，ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，（Ｍ．Ｗ．ＰｅｎｎｉｎｇｔｏｎａｎｄＢ．Ｍ．ＤｕｎｎＥｄｓ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９４、Ｗｅｌｓｃｈｅｔａｌ．（２０１０）ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｈｅｍＢｉｏｌ１４，１−１５、ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２８９，ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｇ．Ｂ．ＦｉｅｌｄｓＥｄ．），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９９７、ＣｈｅｍｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏｔｈｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，ａｎｄＥ．ＧｉｒａｌｔＥｄｓ），ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９９７、ＦｍｏｃＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ，Ｐ．Ｄ．ＷｈｉｔｅＥｄｓ），ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，２０００、ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅ，（Ｓ．Ｆ．Ｋａｔｅｓ，ＦＡｌｂｅｒｉｃｉｏＥｄｓ），ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，２０００、Ｐ．Ｓｅｎｅｃｉ，Ｓｏｌｉｄ−ＰｈａｓｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２０００、ＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＰｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ（Ｍ．Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｅｄｉｔｏｒ−ｉｎ−ｃｈｉｅｆ，Ａ．Ｆｅｌｉｘ，Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ，Ｃ．ＴｍｉｏｌｏＥｄｓ），Ｔｈｉｅｍｅ，２００２、Ｎ．Ｌ．Ｂｅｎｏｉｔｏｎ，ＣｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，２００５、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２９８，ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｊ．ＨｏｗｌＥｄ）ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，２００５、及びＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ，ＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ３，ＢｕｉｌｄｉｎｇＢｌｏｃｋｓ，ＣａｔａｌｙｓｔｓａｎｄＣｏｕｐｌｉｎｇＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，（Ａ．Ｂ．Ｈｕｇｈｓ，Ｅｄ．）Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２０１１に詳細に記載されている。したがって、特定の実施形態において、化学合成技術によって生成された多特異性抗原結合タンパク質ライブラリが提供される。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質ライブラリは、ディスプレイライブラリを含む。特定の実施形態において、ディスプレイライブラリは、ファージディスプレイライブラリ、ファージミドディスプレイライブラリ、ウイルスディスプレイライブラリ、細菌ディスプレイライブラリ、酵母ディスプレイライブラリ、λｇｔ１１ライブラリ、ＣＩＳディスプレイライブラリ、及びインビトロ区画化ライブラリ、またはリボソームディスプレイライブラリである。かかるディスプレイライブラリの作製方法及びスクリーニング方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｋｅｔａｌ．（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ１６，８５７−８８７、Ｂｏｄｅｒｅｔａｌ．，（１９９７）ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１５，５５３−５５７、Ｓｃｏｔｔｅｔａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９，３８６−３９０、Ｂｒｉｓｅｔｔｅｅｔａｌ．（２００７）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ３８３，２０３−２１３、Ｋｅｎｒｉｃｋｅｔａｌ．（２０１０）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ２３，９−１７、Ｆｒｅｕｄｌｅｔａｌ．（１９８６）ＪＭｏｌＢｉｏｌ１８８，４９１−４９４、Ｇｅｔｚｅｔａｌ．（２０１２）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ５０３，７５−９７、Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．（２０１４）ＣｕｒｒＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖＴｅｃｈｎｏｌ１１，４８−５５、Ｈａｎｅｓ，ｅｔａｌ．（１９９７）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９４，４９３７−４９４２、Ｌｉｐｏｖｓｅｋｅｔａｌ．，（２００４）ＪＩｍｍＭｅｔｈｏｄｓ２９０，５１−６７、Ｕｌｌｍａｎｅｔａｌ．（２０１１）Ｂｒｉｅｆ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１０，１２５−１３４、Ｏｄｅｇｒｉｐｅｔａｌ．（２００４）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０１，２８０６−２８１０、及びＭｉｌｌｅｒｅｔａｌ．（２００６）ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ３，５６１−５７０に記載されている。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質ライブラリは、例えば、Ｓｚｏｓｔａｋら、ＵＳ６２５８５５８、ＵＳ６２６１８０４、ＵＳ５６４３７６８、及びＵＳ５６５８７５４に記載の技術によって生成されたＲＮＡ−タンパク質融合ライブラリを含む。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質ライブラリは、例えば、ＵＳ６４１６９５０に記載のＤＮＡ−タンパク質ライブラリを含む。

多特異性抗原結合タンパク質ライブラリの定向進化
本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質をスクリーニングして、例えば、２つ以上の目的の標的リガンドに対して改善された結合親和性を有する多価抗原結合タンパク質を特定することができる。したがって、本明細書では、少なくとも２つの目的の標的リガンド（例えば、本明細書の他の箇所に記載される２つ以上の目的の標的リガンド）に特異的に結合する多特異性抗原結合タンパク質を得る方法が提供される。

特定の実施形態において、本方法は、ａ）多特異性抗原結合タンパク質：第１の標的リガンド複合体の形成を可能にする条件下で、多特異性抗原結合タンパク質のライブラリ（例えば本明細書に記載のライブラリなど）と、第１の標的リガンドを接触させることと、（ｂ）多特異性抗原結合タンパク質：第１の標的リガンド複合体の形成を検出することと、（ｃ）第１の標的リガンドに特異的に結合する多特異性抗原結合タンパク質を複合体から得ることと、を含む。

追加的または代替的に、特定の実施形態において、本方法は、ａ）多特異性抗原結合タンパク質：第２の標的リガンド複合体の形成を可能にする条件下で、多特異性抗原結合タンパク質のライブラリ（例えば本明細書に記載のライブラリなど）と、第２の標的リガンドを接触させることと、（ｂ）多特異性抗原結合タンパク質：第２の標的リガンド複合体の形成を検出することと、（ｃ）第２の標的リガンドに特異的に結合する多特異性抗原結合タンパク質を複合体から得ることと、を含む。

特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質と、第１の標的リガンドとを含む複合体（すなわち、多特異性抗原結合タンパク質：標的リガンド複合体）が提供される。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質と、第２の標的リガンドとを含む複合体が提供される。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質と、第１の標的リガンドと、第２の標的リガンドとを含む複合体が提供される。特定の実施形態において、２つ以上の標的リガンドに結合することのできる多特異性抗原結合タンパク質が提供される。特定の実施形態において、本方法は、（ｄ）２つ以上の標的リガンドに特異的に結合する多特異性抗原結合タンパク質の核酸配列を決定することをさらに含む。

特定の実施形態において、２つ以上の標的リガンドに特異的に結合する多特異性抗原結合タンパク質は、親和性成熟を受ける。このプロセスにおいて、多特異性抗原結合タンパク質は、第１の標的及び／または第２の標的に対する増加した親和性を選択するスキームにかけられる（Ｗｕｅｔａｌ．（１９９８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．９５，６０３７−４２を参照されたい）。特定の実施形態において、第１の標的リガンドに特異的に結合する多特異性抗原結合タンパク質は、ライブラリスクリーンからの特定後にさらにランダム化される。例えば、特定の実施形態において、第１の標的リガンドに特異的に結合する多特異性抗原結合タンパク質を得る方法は、（ｅ）さらなる多特異性抗原結合タンパク質を生成するために、事前に特定された多特異性抗原結合タンパク質：第１の標的リガンド複合体から得られた多特異性抗原結合タンパク質のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及び／またはＣＤＲ−Ｌ３をランダム化することと、（ｆ）ランダム化されたさらなる多特異性抗原結合タンパク質と第１の標的リガンドを接触させることと、（ｇ）ランダム化されたさらなる多特異性抗原結合タンパク質：第１の標的リガンド複合体の形成を検出することと、（ｈ）第１の標的リガンドに特異的に結合するランダム化されたさらなる多特異性抗原結合タンパク質を複合体から得ることと、をさらに含む。追加的または代替的に、特定の実施形態において、ステップ（ｅ）〜（ｈ）は、第２の標的リガンドを用いて繰り返される。

特定の実施形態において、本方法は、（ｉ）第１（及び／または第２）の標的リガンドに特異的に結合する多特異性抗原結合タンパク質の核酸配列を決定することをさらに含む。

特定の実施形態において、ランダム化されたさらなる多特異性抗原結合タンパク質は、第１のライブラリにおいて以前にランダム化されなかった、少なくとも１つまたは少なくとも２つのランダム化ＣＤＲを含む。第１及び／または第２の標的リガンドに対する十分な親和性を有するｎ個の多特異性抗原結合タンパク質（複数可）が得られるまで、複数ラウンドのランダム化、スクリーニング、及び選択を行うことができる。したがって、特定の実施形態において、ステップ（ｅ）〜（ｈ）またはステップ（ｅ）〜（ｉ）は、第１の標的リガンドに特異的に結合する多特異性抗原結合タンパク質を特定するために、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、または１０回より多く繰り返される。追加的または代替的に、特定の実施形態において、ステップ（ｅ）〜（ｈ）またはステップ（ｅ）〜（ｉ）は、第２の標的リガンドに特異的に結合する多特異性抗原結合タンパク質を特定するために、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、または１０回より多く繰り返される。

特定の実施形態において、少なくとも２ラウンド、３ラウンド、４ラウンド、５ラウンド、６ラウンド、７ラウンド、８ラウンド、９ラウンド、１０ラウンド、または１０ラウンドより多くのランダム化、スクリーニング、及び選択を受けた多特異性抗原結合タンパク質は、１ラウンドのランダム化、スクリーニング、及び選択を受けた多特異性抗原結合タンパク質の親和性と少なくとも同じ高さの親和性で標的リガンドに結合する。特定の実施形態において、少なくとも２ラウンド、３ラウンド、４ラウンド、５ラウンド、６ラウンド、７ラウンド、８ラウンド、９ラウンド、１０ラウンド、または１０ラウンドより多くのランダム化、スクリーニング、及び選択を受けた多特異性抗原結合タンパク質は、１ラウンドのランダム化、スクリーニング、及び選択を受けた多特異性抗原結合タンパク質の親和性よりも高い親和性で第１の標的リガンドに結合する。追加的または代替的に、特定の実施形態において、少なくとも２ラウンド、３ラウンド、４ラウンド、５ラウンド、６ラウンド、７ラウンド、８ラウンド、９ラウンド、１０ラウンド、または１０ラウンドより多くのランダム化、スクリーニング、及び選択を受けた多特異性抗原結合タンパク質は、１ラウンドのランダム化、スクリーニング、及び選択を受けた多特異性抗原結合タンパク質の親和性よりも高い親和性で第２の標的リガンドに結合する。

上述の方法が、３つの目的の標的リガンド、４つの目的の標的リガンド、５つの目的の標的リガンド、または５つより多くの目的の標的リガンドに特異的に結合する多特異性抗原結合タンパク質を特定するために繰り返され得ることは、当業者には容易に明らかになるであろう。

本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質のライブラリは、標的リガンドに特異的に結合する新たなまたは改善された結合タンパク質を進化させるための、当該技術分野で知られる任意の技術によってスクリーニングされ得る。特定の実施形態において、標的リガンドは、固体支持体（例えばカラム樹脂またはマイクロタイタープレートウェルなど）に固定化し、標的リガンドは、候補多特異性抗原結合タンパク質のライブラリ（例えば本明細書に記載の任意のライブラリなど）と接触させる。選択技術は、例えば、ファージディスプレイ（Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８，１３１５−１３１７）、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．（２００１）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９８：３７５０−３７５５）、細菌ディスプレイ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，ｅｔａｌ．（１９９７）ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１５：２９−３４．）、酵母ディスプレイ（ＢｏｄｅｒａｎｄＷｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−５５７７）、またはリボソームディスプレイ（ＨａｎｅｓａｎｄＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９７）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９４：４９３７−４９４２及びＷＯ２００８／０６８６３７）とすることができる。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質のライブラリは、ファージディスプレイライブラリである。特定の実施形態において、本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質を提示するファージ粒子が提供される。特定の実施形態において、標的リガンドに結合することのできる本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質を提示するファージ粒子が提供される。

ファージディスプレイとは、複数の多特異性抗原結合タンパク質変異形が、バクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に融合タンパク質として提示される技術である（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１３１５−７、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６、Ｓｅｒｇｅｅｖａ，Ａ．，ｅｔａｌ．（２００６）Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５８：１６２２−５４）。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異形（またはランダムにクローニングされたｃＤＮＡ）の大きなライブラリが、高い親和性で標的分子に結合する配列に関して高速かつ効率的に分取され得るという事実にある。

ファージ上でのペプチドライブラリ（Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ｅｔａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８）またはタンパク質ライブラリの提示（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ｅｔａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４、Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１、Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６３）は、特異的結合特性を有するものに関して数百万のポリペプチドまたはオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８、Ｗｕｅｔａｌ．（１９９８）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．Ｍａｙ９５，６０３７−４２）。多価ファージディスプレイ法は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかとの融合によって小型のランダムペプチド及び小タンパク質を提示するために使用されている。（ＷｅｌｌｓａｎｄＬｏｗｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３：３５５−３６２（１９９２）、及びその中に引用されている参考文献）。一価ファージディスプレイでは、タンパク質またはペプチドライブラリを遺伝子ＩＩＩまたはその一部分に融合し、ファージ粒子が融合タンパク質の１つのコピーを提示するかまたはそれを提示しないように、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で低レベルで発現させる。多価ファージと比べて親和作用が低下しているため、分取は固有のリガンド親和性に基づき、ファージミドベクターが使用されることで、ＤＮＡ操作が単純化される。（ＬｏｗｍａｎａｎｄＷｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＡｃｏｍｐａｎｉｏｎｔｏＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３：２０５−０２１６（１９９１）。）

多特異性抗原結合タンパク質のファージライブラリの分取は、多数の変異形の構築及び増殖、標的リガンドを使用した親和性精製の手順、ならびに結合強化（ｂｉｎｄｉｎｇｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）の結果を評価する手段を伴う（例えば、ＵＳ５２２３４０９、ＵＳ５４０３４８４、ＵＳ５５７１６８９、及びＵＳ５６６３１４３を参照されたい）。

ほとんどのファージディスプレイ法は、繊維状ファージ（例えばＭ１３ファージなど）を使用する。ラムドイドファージディスプレイ系（ＷＯ１９９５／３４６８３、ＵＳ５６２７０２４参照）、Ｔ４ファージディスプレイ系（Ｒｅｎｅｔａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ２１５：４３９、Ｚｈｕｅｔａｌ．（１９９８）ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，５８：３２０９−３２１４、Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．，（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６５：４７７０−４７７７、Ｒｅｎｅｔａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅ，１９５：３０３−３１１、Ｒｅｎ（１９９６）ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．，５：１８３３、Ｅｆｉｍｏｖｅｔａｌ．（１９９５）ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ，１０：１７３）、及びＴ７ファージディスプレイ系（ＳｍｉｔｈａｎｄＳｃｏｔｔ（１９９３）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７：２２８−２５７、ＵＳ．５７６６９０５）も知られている。

現在では、ファージディスプレイの基本概念の改善形態及び変化形が、他にも多く開発されている。これらの改善形態は、ディスプレイ系が選択された標的分子への結合についてペプチドライブラリをスクリーニングする能力、及び機能タンパク質を提示する能力を、これらのタンパク質を所望の特性についてスクリーニングする潜在性と共に向上させる。ファージディスプレイ反応のためのコンビナトリアル反応デバイスが開発されており（ＷＯ１９９８／１４２７７）、ファージディスプレイライブラリは、二分子相互作用（ＷＯ１９９８／２０１６９、ＷＯ１９９８／２０１５９）及び制約されたヘリックスペプチドの特性（ＷＯ１９９８／２００３６）を分析し制御するために使用されている。ＷＯ１９９７／３５１９６は、親和性リガンドの単離方法を記載しており、この方法では、ファージディスプレイライブラリを１つの溶液（この中ではリガンドは標的分子に結合する）及び第２の溶液（この中では親和性リガンドは標的分子に結合しない）と接触させて、結合リガンドを選択的に単離させる。ＷＯ１９９７／４６２５１は、親和性精製抗体を用いてランダムファージディスプレイライブラリのバイオパニングを行い、次に結合ファージを単離させ、続いて高親和性結合ファージを単離させるためにマイクロプレートウェルを使用したマイクロパニングプロセスを行う方法を記載している。かかる方法は、本明細書に開示される多特異性抗原結合タンパク質に適用することができる。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓタンパク質Ａを親和性タグとして使用することも報告されている（Ｌｉｅｔａｌ．（１９９８）ＭｏｌＢｉｏｔｅｃｈ．９：１８７）。ＷＯ１９９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリであってもよいコンビナトリアルライブラリを使用して酵素特異性を区別するための基質減算ライブラリの使用を記載している。特異性結合タンパク質を選択する追加の方法が、ＵＳ５４９８５３８、ＵＳ５４３２０１８、及びＷＯ１９９８／１５８３３に記載されている。また、ペプチドライブラリの生成方法及びこれらのライブラリのスクリーニング方法が、ＵＳ５７２３２８６、ＵＳ５４３２０１８、ＵＳ５５８０７１７、ＵＳ５４２７９０８、ＵＳ５４９８５３０、ＵＳ５７７０４３４、ＵＳ５７３４０１８、ＵＳ５６９８４２６、ＵＳ５７６３１９２、及びＵＳ５７２３３２３に開示されている。

抗原／標的分子
本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質によって標的とされ得る分子の例としては、可溶性血清タンパク質及びそれらの受容体、ならびに他の膜結合タンパク質（例えば、アドヘシン）が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、８ＭＰＩ、８ＭＰ２、８ＭＰ３８（ＧＤＦＩＯ）、８ＭＰ４、８ＭＰ６、８ＭＰ８、ＣＳＦＩ（Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦ１（αＦＧＦ）、ＦＧＦ２（βＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮ８１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷＩ、ＦＥＬ１、ＦＥＬ１（ＥＰＳＥＬＯＮ）、ＦＥＬ１（ＺＥＴＡ）、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢｂ３、ＬＴＡ（ＴＮＦ−β）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−α）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦ１、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、及びＴＨＰＯから成る群から選択される１つ、２つ、またはより多くのサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、ならびにサイトカイン受容体に結合することができる。

別の実施形態では、標的分子は、ＣＣＬＩ（１−３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−Ｉα）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−Ｉβ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−Ｉδ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＤＰ−３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３α）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス（ｅｘｏｄｕｓ）−２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬＩ（ＧＲＯＩ）、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）、ＣＸＣＬ１１（１−ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦＩ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）、ＳＣＹＥＩ、ＸＣＬＩ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ−Ｉβ）、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲＩ（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ＩＲＢＩＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩＩ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ−Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒα）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒβ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＤＦ１、ＨＤＦ１α、ＤＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、及びＶＨＬから成る群から選択されるケモカイン、ケモカイン受容体、またはケモカイン関連タンパク質である。

別の実施形態では、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、ＡＢＣＦ１；ＡＣＶＲ１；ＡＣＶＲ１Ｂ；ＡＣＶＲ２；ＡＣＶＲ２Ｂ；ＡＣＶＲＬ１；ＡＤＯＲＡ２Ａ；アグリカン；ＡＧＲ２；ＡＩＣＤＡ；ＡＩＦ１；ＡＩＧ１；ＡＫＡＰ１；ＡＫＡＰ２；ＡＭＨ；ＡＭＨＲ２；ＡＮＧＰＴＬ；ＡＮＧＰＴ２；ＡＮＧＰＴＬ３；ＡＮＧＰＴＬ４；ＡＮＰＥＰ；ＡＰＣ；ＡＰＯＣ１；ＡＲ；ＡＺＧＰ１（亜鉛−ａ−糖タンパク質）；Ｂ７．１；Ｂ７．２；ＢＡＤ；ＢＡＦＦ（ＢＬｙｓ）；ＢＡＧ１；ＢＡＩ１；ＢＣＬ２；ＢＣＬ６；ＢＤＮＦ；ＢＬＮＫ；ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）；ＢＭＰ１；ＢＭＰ２；ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦ１０）；ＢＭＰ４；ＢＭＰ６；ＢＭＰ８；ＢＭＰＲ１Ａ；ＢＭＰＲ１Ｂ；ＢＭＰＲ２；ＢＰＡＧ１（プレクチン）；ＢＲＣＡ１；Ｃ１９ｏｒｆ１０（ＩＬ２７ｗ）；Ｃ３；Ｃ４Ａ；Ｃ５；Ｃ５Ｒ１；ＣＡＮＴ１；ＣＡＳＰ１；ＣＡＳＰ４；ＣＡＶ１；ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）；ＣＣＬ１（１−３０９）；ＣＣＬ１１（エオタキシン）；ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）；ＣＣＬ１５（ＭＩＰ１δ）；ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）；ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）；ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）；ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３β）；ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）；ＭＣＡＦ；ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３α）；ＣＣＬ２１（ＭＴＰ−２）；ＳＬＣ；エクソダス−２；ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−１）；ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−１）；ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）；ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）；ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）；ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）；ＣＣＬ２８；ＣＣＬ３（ＭＴＰ−Ｉα）；ＣＣＬ４（ＭＤＰ−Ｉβ）；ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）；ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）；ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）；ＣＣＮＡ１；ＣＣＮＡ２；ＣＣＮＤ１；ＣＣＮＥ１；ＣＣＮＥ２；ＣＣＲ１（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）；ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ＩＲβ／ＲＡ）；ＣＣＲ３（ＣＫＲ／ＣＭＫＢＲ３）；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）；ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）；ＣＣＲ７（ＣＫＢＲ７／ＥＢＩ１）；ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ−Ｌ１）；ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）；ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）；ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）；ＣＤ１６４；ＣＤ１９；ＣＤ１Ｃ；ＣＤ２０；ＣＤ２００；ＣＤ２２；ＣＤ２４；ＣＤ２８；ＣＤ３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ３Ｅ；ＣＤ３Ｇ；ＣＤ３Ｚ；ＣＤ４；ＣＤ４０；ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ４４；ＣＤ４５ＲＢ；ＣＤ５２；ＣＤ６９；ＣＤ７２；ＣＤ７４；ＣＤ７９Ａ；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤＳ；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８３；ＣＤ８６；ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリン）；ＣＤＨ１０；ＣＤＨ１２；ＣＤＨ１３；ＣＤＨ１８；ＣＤＨ１９；ＣＤＨ２０；ＣＤＨ５；ＣＤＨ７；ＣＤＨ８；ＣＤＨ９；ＣＤＫ２；ＣＤＫ３；ＣＤＫ４；ＣＤＫ５；ＣＤＫ６；ＣＤＫ７；ＣＤＫ９；ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７／Ｋｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｃ；ＣＤＫＮ２Ａ（Ｐ１６ＩＮＫ４ａ）；ＣＤＫＮ２Ｂ；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＤＫＮ３；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＲ１；ＣＨＧＡ；ＣＨＧＢ；キチナーゼ；ＣＨＳＴ１０；ＣＫＬＦＳＦ２；ＣＫＬＦＳＦ３；ＣＫＬＦＳＦ４；ＣＫＬＦＳＦ５；ＣＫＬＦＳＦ６；ＣＫＬＦＳＦ７；ＣＫＬＦＳＦ８；ＣＬＤＮ３；ＣＬＤＮ７（クローディン−７）；ＣＬＮ３；ＣＬＵ（クラスタリン）；ＣＭＫＬＲ１；ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）；ＣＮＲ１；ＣＯＬ１８Ａ１；ＣＯＬ１Ａ１；ＣＯＬ４Ａ３；ＣＯＬ６Ａ１；ＣＲ２；ＣＲＰ；ＣＳＦＩ（Ｍ−ＣＳＦ）；ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）；ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）；ＣＴＬＡ４；ＣＴＮＮＢ１（ｂ−カテニン）；ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）；ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）；ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）；ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）；ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）；ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ／ＩＰ−９）；ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）；ＣＸＣＬ１３；ＣＸＣＬ１４；ＣＸＣＬ１６；ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）；ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）；ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ）；ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）；ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）；ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）；ＣＹＢ５；ＣＹＣ１；ＣＹＳＬＴＲ１；ＤＡＢ２ＩＰ；ＤＥＳ；ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８；ＤＮＣＬＩ；ＤＰＰ４；Ｅ２Ｆ１；ＥＣＧＦ１；ＥＤＧ１；ＥＦＮＡ１；ＥＦＮＡ３；ＥＦＮＢ２；ＥＧＦ；ＥＧＦＲ；ＥＬＡＣ２；ＥＮＧ；ＥＮＯ１；ＥＮＯ２；ＥＮＯ３；ＥＰＨＢ４；ＥＰＯ；ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ−２）；ＥＲＥＧ；ＥＲＫ８；ＥＳＲ１；ＥＳＲ２；Ｆ３（ＴＦ）；ＦＡＤＤ；ＦａｓＬ；ＦＡＳＮ；ＦＣＥＲ１Ａ；ＦＣＥＲ２；ＦＣＧＲ３Ａ；ＦＧＦ；ＦＧＦ１（αＦＧＦ）；ＦＧＦ１０；ＦＧＦ１１；ＦＧＦ１２；ＦＧＦ１２Ｂ；ＦＧＦ１３；ＦＧＦ１４；ＦＧＦ１６；ＦＧＦ１７；ＦＧＦ１８；ＦＧＦ１９；ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）；ＦＧＦ２０；ＦＧＦ２１；ＦＧＦ２２；ＦＧＦ２３；ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）；ＦＧＦ４（ＨＳＴ）；ＦＧＦ５；ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）；ＦＧＦ７（ＫＧＦ）；ＦＧＦ８；ＦＧＦ９；ＦＧＦＲ３；ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）；ＦＥＬｌ（ＥＰＳＩＬＯＮ）；ＦＩＬｌ（ＺＥＴＡ）；ＦＬＪ１２５８４；ＦＬＪ２５５３０；ＦＬＲＴＩ（フィブロネクチン）；ＦＬＴ１；ＦＯＳ；ＦＯＳＬ１（ＦＲＡ−１）；ＦＹ（ＤＡＲＣ）；ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）；ＧＡＧＥＢ１；ＧＡＧＥＣ１；ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ−６ＳＴ；ＧＡＴＡ３；ＧＤＦ５；ＧＦＩ１；ＧＧＴ１；ＧＭ−ＣＳＦ；ＧＮＡＳＩ；ＧＮＲＨＩ；ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）；ＧＰＲ３１；ＧＰＲ４４；ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）；ＧＲＣＣＩＯ（Ｃ１０）；ＧＲＰ；ＧＳＮ（ゲルゾリン）；ＧＳＴＰ１；ＨＡＶＣＲ２；ＨＤＡＣ４；ＨＤＡＣ５；ＨＤＡＣ７Ａ；ＨＤＡＣ９；ＨＧＦ；ＨＩＦ１Ａ；ＨＯＰ１；ヒスタミン及びヒスタミン受容体；ＨＬＡ−Ａ；ＨＬＡ−ＤＲＡ；ＨＭ７４；ＨＭＯＸＩ；ＨＵＭＣＹＴ２Ａ；ＩＣＥＢＥＲＧ；ＩＣＯＳＬ；１Ｄ２；ＩＦＮ−ａ；ＩＦＮＡ１；ＩＦＮＡ２；ＩＦＮＡ４；ＩＦＮＡ５；ＩＦＮＡ６；ＩＦＮＡ７；ＩＦＮＢ１；ＩＦＮガンマ；ＤＦＮＷ１；ＩＧＢＰ１；ＩＧＦ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＧＦ２；ＩＧＦＢＰ２；ＩＧＦＢＰ３；ＩＧＦＢＰ６；ＩＬ−ｌ；ＩＬ１０；ＩＬ１０ＲＡ；ＩＬ１０ＲＢ；ＩＬ１１；ＩＬ１１ＲＡ；ＩＬ−１２；ＩＬ１２Ａ；ＩＬ１２Ｂ；ＩＬ１２ＲＢ１；ＩＬ１２ＲＢ２；ＩＬ１３；ＩＬ１３ＲＡ１；ＩＬ１３ＲＡ２；ＩＬ１４；ＩＬ１５；ＩＬ１５ＲＡ；ＩＬ１６；ＩＬ１７；ＩＬ１７Ｂ；ＩＬ１７Ｃ；ＩＬ１７Ｒ；ＩＬ１８；ＩＬ１８ＢＰ；ＩＬ１８Ｒ１；ＩＬ１８ＲＡＰ；ＩＬ１９；ＩＬ１Ａ；ＩＬ１Ｂ；ＩＬＩＦ１０；ＩＬ１Ｆ５；ＩＬ１Ｆ６；ＩＬ１Ｆ７；ＩＬ１Ｆ８；ＩＬ１Ｆ９；ＩＬ１ＨＹ１；ＩＬ１Ｒ１；ＩＬ１Ｒ２；ＩＬ１ＲＡＰ；ＩＬ１ＲＡＰＬ１；ＩＬ１ＲＡＰＬ２；ＩＬ１ＲＬ１；ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬＩＲＮ；ＩＬ２；ＩＬ２０；ＩＬ２０ＲＡ；ＩＬ２１Ｒ；ＩＬ２２；ＩＬ２２Ｒ；ＩＬ２２ＲＡ２；ＩＬ２３；ＩＬ２４；ＩＬ２５；ＩＬ２６；ＩＬ２７；ＩＬ２８Ａ；ＩＬ２８Ｂ；ＩＬ２９；ＩＬ２ＲＡ；ＩＬ２ＲＢ；ＩＬ２ＲＧ；ＩＬ３；ＩＬ３０；ＩＬ３ＲＡ；ＩＬ４；ＩＬ４Ｒ；ＩＬ５；ＩＬ５ＲＡ；ＩＬ６；ＩＬ６Ｒ；ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）；ＥＬ７；ＥＬ７Ｒ；ＥＬ８；ＩＬ８ＲＡ；ＤＬ８ＲＢ；ＩＬ８ＲＢ；ＤＬ９；ＤＬ９Ｒ；ＤＬＫ；ＩＮＨＡ；ＩＮＨＢＡ；ＩＮＳＬ３；ＩＮＳＬ４；ＩＲＡＫ１；ＥＲＡＫ２；ＩＴＧＡ１；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ３；ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）；ＩＴＧＡＶ；ＩＴＧＢ３；ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）；ＪＡＧ１；ＪＡＫ１；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；Ｋ６ＨＦ；ＫＡＩ１；ＫＤＲ；ＫＩＴＬＧ；ＫＬＦ５（ＧＣＢｏｘＢＰ）；ＫＬＦ６；ＫＬＫＩＯ；ＫＬＫ１２；ＫＬＫ１３；ＫＬＫ１４；ＫＬＫ１５；ＫＬＫ３；ＫＬＫ４；ＫＬＫ５；ＫＬＫ６；ＫＬＫ９；ＫＲＴ１；ＫＲＴ１９（ケラチン１９）；ＫＲＴ２Ａ；ＫＨＴＨＢ６（毛髪特異型Ｈケラチン）；ＬＡＭＡＳ；ＬＥＰ（レプチン）；Ｌｉｎｇｏ−ｐ７５；Ｌｉｎｇｏ−Ｔｒｏｙ；ＬＰＳ；ＬＴＡ（ＴＮＦ−ｂ）；ＬＴＢ；ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）；ＬＴＢ４Ｒ２；ＬＴＢＲ；ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ；ＭＡＧまたはＯＭｇｐ；ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ−Ｊｕｎ）；ＭＤＫ；ＭＩＢ１；ミッドカイン；ＭＥＦ；ＭＩＰ−２；ＭＫＩ６７；（Ｋｉ−６７）；ＭＭＰ２；ＭＭＰ９；ＭＳ４Ａ１；ＭＳＭＢ；ＭＴ３（メタロチオネクチン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｃｔｉｎ）−１１１）；ＭＴＳＳ１；ＭＵＣ１（ムチン）；ＭＹＣ；ＭＹ０８８；ＮＣＫ２；ニューロカン；ＮＦＫＢ１；ＮＦＫＢ２；ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）；ＮＧＦＲ；ＮｇＲ−Ｌｉｎｇｏ；ＮｇＲ−Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）；ＮｇＲ−ｐ７５；ＮｇＲ−Ｔｒｏｙ；ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）；ＮＯＸ５；ＮＰＰＢ；ＮＲ０Ｂ１；ＮＲ０Ｂ２；ＮＲ１Ｄ１；ＮＲ１Ｄ２；ＮＲ１Ｈ２；ＮＲ１Ｈ３；ＮＲ１Ｈ４；ＮＲ１１２；ＮＲ１１３；ＮＲ２Ｃ１；ＮＲ２Ｃ２；ＮＲ２Ｅ１；ＮＲ２Ｅ３；ＮＲ２Ｆ１；ＮＲ２Ｆ２；ＮＲ２Ｆ６；ＮＲ３Ｃ１；ＮＲ３Ｃ２；ＮＲ４Ａ１；ＮＲ４Ａ２；ＮＲ４Ａ３；ＮＲ５Ａ１；ＮＲ５Ａ２；ＮＲ６Ａ１；ＮＲＰ１；ＮＲＰ２；ＮＴ５Ｅ；ＮＴＮ４；ＯＤＺＩ；ＯＰＲＤ１；Ｐ２ＲＸ７；ＰＡＰ；ＰＡＲＴ１；ＰＡＴＥ；ＰＡＷＲ；ＰＣＡ３；ＰＣＮＡ；ＰＯＧＦＡ；ＰＯＧＦＢ；ＰＥＣＡＭ１；ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）；ＰＧＦ；ＰＧＲ；ホスファカン；ＰＩＡＳ２；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）；ＰＬＧ；ＰＬＸＤＣ１；ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）；ＰＰＩＤ；ＰＲＩ；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＫＤＩ；ＰＲＬ；ＰＲＯＣ；ＰＲＯＫ２；ＰＳＡＰ；ＰＳＣＡ；
ＰＴＡＦＲ；ＰＴＥＮ；ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）；ＰＴＮ；ＲＡＣ２（ｐ２１Ｒａｃ２）；ＲＡＲＢ；ＲＧＳＩ；ＲＧＳ１３；ＲＧＳ３；ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）；ＲＯＢＯ２；Ｓ１００Ａ２；ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）；ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）；ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）；ＳＣＹＥＩ（内皮単球活性化サイトカイン）；ＳＤＦ２；ＳＥＲＰＩＮＡ１；ＳＥＲＰＩＮＡ３；ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン）；ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＩ−１）；ＳＥＲＰＤＭＦ１；ＳＨＢＧ；ＳＬＡ２；ＳＬＣ２Ａ２；ＳＬＣ３３Ａ１；ＳＬＣ４３Ａ１；ＳＬＩＴ２；ＳＰＰＩ；ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒｌ）；ＳＴ６ＧＡＬ１；ＳＴＡＢＩ；ＳＴＡＴ６；ＳＴＥＡＰ；ＳＴＥＡＰ２；ＴＢ４Ｒ２；ＴＢＸ２１；ＴＣＰＩＯ；ＴＯＧＦＩ；ＴＥＫ；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢ１ＩＩ；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢ３；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＲＩ；ＴＧＦＢＲ２；ＴＧＦＢＲ３；ＴＨＩＬ；ＴＨＢＳＩ（トロンボスポンジン−１）；ＴＨＢＳ２；ＴＨＢＳ４；ＴＨＰＯ；ＴＩＥ（Ｔｉｅ−１）；ＴＭＰ３；組織因子；ＴＬＲ１；ＴＬＲ２；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＴＬＲ５；ＴＬＲ６；ＴＬＲ７；ＴＬＲ８；ＴＬＲ９；ＴＬＲ１０；ＴＮＦ；ＴＮＦ−ａ；ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４）；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦＩＩＡ；ＴＮＦＲＳＦ１Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ５；ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）；ＴＮＦＲＳＦ７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）；ＴＮＦＳＦ１８；ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）；ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）；ＴＮＦＳＦＳ（ＣＤ３０リガンド）；ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）；ＴＯＬＬＩＰ；Ｔｏｌｌ様受容体；ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＥａ）；ＴＰ５３；ＴＰＭ１；ＴＰＭ２；ＴＲＡＤＤ；ＴＲＡＦ１；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＲＡＦ４；ＴＲＡＦ５；ＴＲＡＦ６；ＴＲＥＭ１；ＴＲＥＭ２；ＴＲＰＣ６；ＴＳＬＰ；ＴＷＥＡＫ；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＢ；ＶＥＧＦＣ；バーシカン；ＶＨＬＣ５；ＶＬＡ−４；ＸＣＬ１（リンホタクチン）；ＸＣＬ２（ＳＣＭ−１ｂ）；ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲＩ）；ＹＹ１；及びＺＦＰＭ２から成る群から選択される、１つ以上の標的に結合することができる。

本明細書において提供される抗体のための好ましい分子標的分子としては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４などのＣＤタンパク質；ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体などのＥｒｂＢ受容体ファミリーのＣＤ６４、ＣＤ２００メンバー；ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、アルファ４／ベータ７インテグリン、及びアルファあるいはベータサブユニットを含むアルファｖ／ベータ３インテグリンなどの細胞接着分子（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、または抗ＣＤ１１ｂ抗体）；ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃなどの成長因子；組織因子（ＴＦ）；アルファインターフェロン（アルファＩＦＮ）；ＴＮＦアルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−Ｓ、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ１７ＡＦ、ＩＬ−１Ｓ、ＩＬ−１３Ｒアルファ１、ＩＬ１３Ｒアルファ２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩｇＥなどのインターロイキン；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＲＳＶＦタンパク質、タンパク質Ｃなどが挙げられる。

一実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）−１もしくはＬＲＰ−８、またはトランスフェリン受容体、ならびに１）ベータ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１またはＢＡＣＥ２）、２）アルファ−セクレターゼ、３）ガンマ−セクレターゼ、４）タウ−セクレターゼ、５）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、６）細胞死受容体６（ＤＲ６）、７）アミロイドベータペプチド、８）アルファ−シヌクレイン、９）パーキン、１０）ハンチンチン、１１）ｐ７５ＮＴＲ、及び１２）カスパーゼ−６から成る群から選択される少なくとも１つの標的に結合する。

一実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、ＩＬ−１アルファ及びＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１２及びＩＬ−１Ｓ；ＩＬ−１３及びＩＬ−９；ＩＬ−１３及びＩＬ−４；ＩＬ−１３及びＩＬ−５；ＩＬ−５及びＩＬ−４；ＩＬ−１３及びＩＬ−１ベータ；ＩＬ−１３及びＩＬ−２５；ＩＬ−１３及びＴＡＲＣ；ＩＬ−１３及びＭＤＣ；ＩＬ−１３及びＭＥＦ；ＩＬ−１３及びＴＧＦ−〜；ＩＬ−１３及びＬＨＲ作動薬；ＩＬ−１２及びＴＷＥＡＫ、ＩＬ−１３及びＣＬ２５；ＩＬ−１３及びＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ−１３及びＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ−１３及びＡＤＡＭＳ、ＩＬ−１３及びＰＥＤ２、ＩＬ１７Ａ及びＩＬ１７Ｆ、ＣＤ３及びＣＤ１９、ＣＤ１３８及びＣＤ２０；ＣＤ１３８及びＣＤ４０；ＣＤ１９及びＣＤ２０；ＣＤ２０及びＣＤ３；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ１３Ｓ；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ２０；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ４０；ＣＤ４０及びＣＤ２０；ＣＤ−Ｓ及びＩＬ−６；ＣＤ２０及びＢＲ３、ＴＮＦアルファ及びＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１ベータ；ＴＮＦアルファ及びＩＬ−２、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−３、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−４、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−５、ＴＮＦアルファ及びＩＬ６、ＴＮＦアルファ及びＩＬ８、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−９、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１０、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１１、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１２、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１３、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１４、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１５、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１６、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１７、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１８、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１９、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−２０、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−２３、ＴＮＦアルファ及びＩＦＮアルファ、ＴＮＦアルファ及びＣＤ４、ＴＮＦアルファ及びＶＥＧＦ、ＴＮＦアルファ及びＭＩＦ、ＴＮＦアルファ及びＩＣＡＭ−１、ＴＮＦアルファ及びＰＧＥ４、ＴＮＦアルファ及びＰＥＧ２、ＴＮＦアルファ及びＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦアルファ及びＴｅ３８、ＴＮＦアルファ及びＢＡＦＦ、ＴＮＦアルファ及びＣＤ２２、ＴＮＦアルファ及びＣＴＬＡ−４、ＴＮＦアルファ及びＧＰ１３０、ＴＮＦａ及びＩＬ−１２ｐ４０、ＶＥＧＦ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−Ａ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦ、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦＡ及びＡＮＧ２、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄ、ＨＥＲ２及びＤＲ５、ＶＥＧＦ及びＩＬ−８、ＶＥＧＦ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＭＥＴ受容体、ＥＧＦＲ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＣＤ６４、ＨＥＲ２及びＣＤ３、ＨＥＲ２及びＣＤ１６、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３；ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）及びＨＥＲ２、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４、ＩＬ−１４及びＩＬ−１３、ＩＬ−１３及びＣＤ４０Ｌ、ＩＬ４及びＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ−１Ｒ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ−６Ｒ及びＴＮＦＲ１及びＩＬ−１８Ｒ、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３、ＭＡＰＧ及びＣＤ２８、ＥＧＦＲ及びＣＤ６４、ＣＳＰＧｓ及びＲＧＭＡ；ＣＴＬＡ−４及びＢＴＮ０２；ＩＧＦ１及びＩＧＦ２；ＩＧＦ１／２及びＥｒｂ２Ｂ；ＭＡＧ及びＲＧＭＡ；ＮｇＲ及びＲＧＭＡ；ＮｏｇｏＡ及びＲＧＭＡ；ＯＭＧｐ及びＲＧＭＡ；ＰＯＬ−ｌ及びＣＴＬＡ−４；ならびにＲＧＭＡ及びＲＧＭＢから成る群から選択される、少なくとも２個の標的分子に結合する。

場合により他の分子と共役している可溶性抗原またはその断片は、抗体を生成するための免疫原として使用することができる。受容体などの膜貫通分子の場合、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）を免疫原として使用することができる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として使用してもよい。かかる細胞は、天然源（例えば、がん細胞株）由来であってもよいし、膜貫通分子を発現するように組換え技術によって形質転換されている細胞であってもよい。抗体の調製に有用な他の抗原及びその形態は、当業者には明らかであろう。

活性アッセイ
本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、当該技術分野で知られる様々なアッセイによって、それらの物理／化学特性及び生物学的機能について特徴付けることができる。

精製された多特異性抗原結合タンパク質は、Ｎ末端配列決定、アミノ酸分析、未変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィ、及びパパイン消化を含むがこれらに限定されない、一連のアッセイによってさらに特徴付けることができる。

特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、それらの生物活性について分析される。いくつかの実施形態では、多特異性抗原結合タンパク質は、それらの抗原結合活性について試験される。当該技術分野で知られており、本明細書において使用され得る抗原結合アッセイとしては、限定されないが、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びタンパク質Ａイムノアッセイなどの技術を使用した、任意の直接結合アッセイまたは競合結合アッセイが挙げられる。例示的な抗原結合アッセイは、以下の実施例において提供される。

一実施形態において、本明細書では、全てではなく一部のエフェクター機能を有し、そのため、多特異性抗原結合タンパク質のインビボの半減期は重要であるが特定のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）は不必要または有害である多くの用途に関して望ましい候補となる、提供される改変された多特異性抗原結合タンパク質が提供される。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、減少したＦｃγＲ結合活性を示す。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ（ＥＵ付番）から成る群から選択される、少なくとも１個、少なくとも２個、または３個の変異をＦｃ領域に含む。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆｃ領域内にＮ２９７Ａ置換変異を含む非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）多特異性抗原結合タンパク質である。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、Ｆｃ領域内に例えばＮ２９７Ｇ置換変異を含む非グリコシル化多特異性抗原結合タンパク質である。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、Ｈ１及びＨ２のＣ末端リジンにおける欠失（ΔＫ４４７）を含む。特定の実施形態において、産生された多特異性抗原結合タンパク質のＦｃ活性は、所望の特性のみが確実に維持されるように測定される。インビトロ及び／またはインビボの細胞傷害アッセイを行って、ＣＤＣ活性及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、多特異性抗原結合タンパク質がＦｃγＲ結合性を欠いている（したがってＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確かめることができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方で単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈａｎｄＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を査定するためのインビトロアッセイの一例は、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的に、または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓｅｔａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているものなどの動物モデルにおいて査定されてもよい。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、多特異性抗原結合タンパク質がＣ１ｑに結合することができず、したがってＣＤＣ活性を欠いていることを確認してもよい。補体活性化を査定するためには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）に記載のＣＤＣアッセイを行ってもよい。当該技術分野で知られる方法を使用して、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の決定を行うこともできる。

共役タンパク質
本明細書では、本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に記載の方法に従って作製された多特異性抗原結合タンパク質）のいずれかを含む、共役多特異性抗原結合タンパク質または免疫共役体（例えば、「抗体−薬物共役体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」すなわち「ＡＤＣ」）などの共役タンパク質も提供され、ここで、軽鎖または重鎖の定常領域のうちの１つは、染料または細胞傷害剤、例えば化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細胞、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはその断片）、または放射性アイソトープなどの化学分子と共役している（すなわち、放射性共役体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））。特に、本明細書に記載されるように、ヘテロ多量体化ドメインの使用により、２つの異なる重鎖（ＨＣ１及びＨＣ２）ならびに２つの異なる軽鎖（ＬＣ１及びＬＣ２）を含有する抗体の構築が可能となる。本明細書に記載の方法を使用して構築された免疫共役体は、重鎖のいずれか１つのみ（ＨＣ１もしくはＨＣ２）または軽鎖のいずれか１つのみ（ＬＣ１もしくはＬＣ２）の定常領域と共役した細胞傷害剤を含有し得る。また、免疫共役体は１つの重鎖または軽鎖のみに結合した細胞傷害剤を有し得るため、対象に投与される細胞傷害剤の量は、重鎖及び／または軽鎖に結合した細胞傷害剤を有する多特異性抗原結合タンパク質の投与と比べて低減する。対象に投与される細胞傷害剤の量を低減することで、細胞傷害剤に関連する有害な副作用が限定される。

がん治療において、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤、すなわち、腫瘍細胞を殺滅または抑制するための薬物の局所送達のために、多特異性抗原結合タンパク質−薬物共役体を使用すること（ＳｙｒｉｇｏｓａｎｄＥｐｅｎｅｔｏｓ，ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ１９：６０５−６１４（１９９９）、Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−ＤｕｖａｚａｎｄＳｐｒｉｎｇｅｒ，Ａｄｖ．Ｄｒｇ．Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２（１９９７）、米国特許第４，９７５，２７８号）により、腫瘍を標的とした薬物部分の送達及びそこでの細胞内蓄積が可能になる。共役されていないこれらの薬剤の全身投与は、排除が求められる正常細胞ならびに腫瘍細胞に対する許容不可能なレベルの毒性をもたらし得る（Ｂａｌｄｗｉｎｅｔａｌ．Ｌａｎｃｅｔ（Ｍａｒ．１５，１９８６）：６０３−６０５（１９８６）、Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）“ＡｎｔｉｂｏｄｙＣａｒｒｉｅｒｓＯｆＣｙｔｏｔｏｘｉｃＡｇｅｎｔｓＩｎＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ：ＡＲｅｖｉｅｗ，”ｉｎＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ‘８４：ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａｅｔａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６）。最小限の毒性を伴う最大限の有効性が求められる。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との両方が、これらの方略で有用であると報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２１：１８３−１８７（１９８６））。これらの方法で使用される薬物としては、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、及びビンデシン（Ｒｏｗｌａｎｄｅｔａｌ．（１９８６）（上記））が挙げられる。抗体−毒素共役体に使用される毒素としては、ジフテリア毒素などの細胞毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒｅｔａｌ．Ｊｏｕｒ．ｏｆｔｈｅＮａｔ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１（２０００）、Ｍａｎｄｌｅｒｅｔａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ１０：１０２５−１０２８（２０００）、Ｍａｎｄｌｅｒｅｔａｌ．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．１３：７８６−７９１（２００２））、マイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３、Ｌｉｕｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３（１９９６））、及びカリチアマイシン（Ｌｏｄｅｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５８：２９２８（１９９８）、Ｈｉｎｍａｎｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５３：３３３６−３３４２（１９９３））などの小分子毒素が挙げられる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機序によって、それらの細胞傷害性及び細胞増殖抑制性の作用を及ぼし得る。一部の細胞傷害薬は、大型抗体またはタンパク質受容体リガンドと共役したときに不活性になるか、または活性が低下する傾向がある。

免疫共役体の生成に有用な化学療法剤は、本明細書（例えば上記）に記載されている。使用することのできる酵素活性毒素及びその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａｃｈａｒａｎｔｉａ阻害薬、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害薬、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが挙げられる。例えば、１９９３年１０月２８日公開のＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。多様な放射性核種が、放射性共役抗体の産生に利用可能である。例としては、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ、及び^１８６Ｒｅが挙げられる。多特異性抗原結合タンパク質と細胞傷害剤との共役体は、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル（例えばスベリン酸ジサクシニミジルなど）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（例えばビス（パジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）といった、多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１０９８（１９８７）に記載のように調製することができる。炭素１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種を抗体と共役させるための例示的なキレート剤である。例えば、ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。

多特異性抗原結合タンパク質と、１つ以上の小分子毒素、例えばカリチアマイシン、マイタンシノイド、ドラスタチン、オーロスタチン（ａｕｒｏｓｔａｔｉｎｓ）、トリコテセン、及びＣＣ１０６５など、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体との共役体も、本明細書において想定される。

マイタンシン及びマイタンシノイド
いくつかの実施形態では、免疫共役体は、１個以上のマイタンシノイド分子と共役した、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質（全長または断片）を含む。マイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。マイタンシンは、東アフリカの低木であるＭａｙｔｅｎｕｓｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、特定の微生物もマイタンシノール及びＣ−３マイタンシノールエステルなどのマイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノールならびにその誘導体及び類似体は、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号、同第４，２４８，８７０号、同第４，２５６，７４６号、同第４，２６０，６０８号、同第４，２６５，８１４号、同第４，２９４，７５７号、同第４，３０７，０１６号、同第４，３０８，２６８号、同第４，３０８，２６９号、同第４，３０９，４２８号、同第４，３１３，９４６号、同第４，３１５，９２９号、同第４，３１７，８２１号、同第４，３２２，３４８号、同第４，３３１，５９８号、同第４，３６１，６５０号、同第４，３６４，８６６号、同第４，４２４，２１９号、同第４，４５０，２５４号、同第４，３６２，６６３号、及び同第４，３７１，５３３号に開示されている。

マイタンシノイド薬物部分は、（ｉ）発酵または化学修飾、発酵産物の誘導体化により比較的調製しやすく、（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーによる抗体との共役に好適な官能基を用いた誘導体化に適しており、（ｉｉｉ）血漿中で安定であり、かつ（ｉｖ）多様な腫瘍細胞株に対して有効であることから、抗体薬物共役体中の薬物部分として魅力的である。

マイタンシノイドを含有する免疫共役体、その作製方法、及びそれらの治療的使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号、及び欧州特許第ＥＰ０４２５２３５８１号に開示されており、これらの開示内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。Ｌｉｕｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３（１９９６）は、ヒト結腸直腸がんに対する、モノクローナル抗体Ｃ２４２に連結したＤＭ１と称されるマイタンシノイドを含む、免疫共役体を記載した。この共役体は、培養された結腸がん細胞に対して高度に細胞傷害性であることが見出され、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Ｃｈａｒｉｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）は、マイタンシノイドが、ジスルフィドリンカーを介して、ヒト結腸がん細胞株上の抗原に結合するマウス抗体Ａ７と、またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合する別のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１と共役された、免疫共役体を記載している。ＴＡ．１−マイタンシノイド共役体の細胞傷害性は、細胞１個当たり３×１０^５個のＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳がん細胞株ＳＫ−ＢＲ−３において、インビトロで試験された。この薬物共役体は、遊離マイタンシノイド薬と同様の度合いの細胞傷害性を達成し、この度合いは、抗体分子１個当たりのマイタンシノイド分子の数を増加させることによって上昇させることができる。Ａ７−マイタンシノイド共役体は、マウスにおいて低い全身細胞傷害性を示した。

多特異性抗原結合タンパク質−マイタンシノイド共役体は、多特異性抗原結合タンパク質とマイタンシノイド分子とのいずれの生物活性も著しく減弱させることなく、多特異性抗原結合タンパク質をマイタンシノイド分子に化学結合させることによって調製される。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号を参照されたい（その開示内容は、参照により本明細書に明示的に援用される）。毒素／抗体の１個の分子でさえ、ネイキッド抗体の使用と比べて細胞傷害を向上させることが予想されるが、抗体分子１個当たり平均３〜４個のマイタンシノイド分子の共役は、抗体の機能または可溶性に負の影響を及ぼすことなく、標的細胞の細胞傷害性を向上させることにおいて有効性を示した。マイタンシノイドは当該技術分野で周知であり、既知の技術により合成することも、天然源から単離することもできる。好適なマイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号ならびに本明細書上文で参照されている他の特許及び非特許公報に開示されている。好ましいマイタンシノイドは、マイタンシノール、及びマイタンシノール分子の芳香環内または他の位置で修飾されているマイタンシノール類似体、例えば様々なマイタンシノールエステルなどである。

例えば、米国特許第５，２０８，０２０号または欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、Ｃｈａｒｉｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）、及び米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３号に開示されているものを含む、多特異性抗原結合タンパク質マイタンシノイド共役体を作製するための当該技術分野で知られる多くの連結基が存在し、これらの開示内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３号に開示されているように、リンカー成分ＳＭＣＣを含む抗体−マイタンシノイド共役体が調製され得る。連結基としては、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、感光性基、ペプチダーゼ不安定基、または上記に特定した特許において開示されるエステラーゼ不安定基が挙げられ、ジスルフィド基及びチオエーテル基が好ましい。追加の連結基が、本明細書に記載及び例示される。

多特異性抗原結合タンパク質とマイタンシノイドとの共役体は、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣＩなど）、活性エステル（例えばスベリン酸ジサクシニミジルなど）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）といった、多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製され得る。ジスルフィド結合をもたらすために特に好ましいカップリング剤としては、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７（１９７８））及びＮ−サクシニミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が挙げられる。

リンカーは、結合の種類に応じて様々な位置でマイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来のカップリング技術を使用したヒドロキシル基との反応によって、エステル結合が形成されてもよい。この反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位で起こり得る。好ましい実施形態では、マイタンシノールまたはマイタンシノール類似体のＣ−３位で結合が形成される。

オーリスタチン及びドラスタチン
いくつかの実施形態では、免疫共役体は、ドラスタチンまたはドラスタチンペプチド類似体及び誘導体、オーリスタチンと共役した本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質を含む（米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号）。ドラスタチン及びオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、ならびに核及び細胞の分裂に干渉し（Ｗｏｙｋｅｅｔａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓａｎｄＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４（２００１））、抗がん活性（米国特許第５，６６３，１４９号）及び抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔｅｔａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５（１９９８））を有することが示されている。ドラスタチンまたはオーリスタチン薬物部分は、多特異性抗原結合タンパク質に、ペプチド薬物部分のＮ−（アミノ）末端を通じて結合していても、Ｃ−（カルボキシル）末端を通じて結合していてもよい（ＷＯ０２／０８８１７２）。

例示的なオーリスタチンの実施形態としては、米国出願公開第２００５／０２３８６４９号の「ＭｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅＣｏｍｐｏｕｎｄｓＣａｐａｂｌｅｏｆＣｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｔｏＬｉｇａｎｄｓ」に開示されているＮ末端結合型モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦが挙げられ、この開示内容は、参照によりその全体が本明細書に明示的に援用される。

典型的に、ペプチド系薬物部分は、２つ以上のアミノ酸及び／またはペプチド断片間にペプチド結合を形成することによって調製することができる。かかるペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野では周知である液相合成法に従って調製することができる（Ｅ．ＳｃｈｒｏｄｅｒａｎｄＫ．Ｌｕｂｋｅ，“ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ，”ｖｏｌｕｍｅ１，ｐｐ．７６−１３６，１９６５，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓを参照されたい）。オーリスタチン／ドラスタチン薬物部分は、米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号、Ｐｅｔｔｉｔｅｔａｌ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．４４：４８２−４８５（１９８１）、Ｐｅｔｔｉｔｅｔａｌ．Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ１３：４７−６６（１９９８）、Ｐｏｎｃｅｔ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．５：１３９−１６２（１９９９）、ならびにＰｅｔｔｉｔ，Ｆｏｒｔｓｃｈｒ．Ｃｈｅｍ．Ｏｒｇ．Ｎａｔｕｒｓｔ．７０：１−７９（１９９７）の方法に従って調製され得る。また、Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（７）：７７８−７８４（２００３）、及び、参照によりその全体が本明細書に援用される米国出願公開第２００５／０２３８６４９号の「ＭｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅＣｏｍｐｏｕｎｄｓＣａｐａｂｌｅｏｆＣｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｔｏＬｉｇａｎｄｓ」（例えば、リンカー、ならびにリンカーと共役したＭＭＡＥ及びＭＭＡＦなどのモノメチルバリン化合物の調製方法を開示している）も参照されたい。

カリチアマイシン
他の実施形態において、免疫共役体は、１個以上のカリチアマイシン分子と共役した、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質を含む。カリチアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモルを下回る濃度で二本鎖ＤＮＡの切断をもたらすことができる。カリチアマイシンファミリーの共役体の調製については、米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、及び同第５，８７７，２９６号（全てＡｍｅｒｉｃａｎＣｙａｎａｍｉｄＣｏｍｐａｎｙ）を参照されたい。使用され得るカリチアマイシンの構造類似体としては、γ_１ ^Ｉ、α_２ ^Ｉ、α_３ ^Ｉ、Ｎ−アセチル−γ_１ ^Ｉ、ＰＳＡＧ、及びθ^Ι _１が挙げられるが、これらに限定されない（Ｈｉｎｍａｎｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５８：２９２５−２９２８（１９９８）、及び前述のＡｍｅｒｉｃａｎＣｙａｎａｍｉｄの米国特許）。多特異性抗原結合タンパク質を共役させることのできる別の抗腫瘍薬は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリチアマイシンとＱＦＡとの両方が細胞内作用部位を有し、細胞膜を容易に横断しない。したがって、抗体媒介性内部移行によるこれらの薬剤の細胞取り込みは、それらの細胞傷害作用を大幅に向上させる。

他の細胞傷害剤
本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質と共役することのできる他の抗腫瘍薬としては、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｉｃｉｎ）、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号及び同第５，７７０，７１０号に記載のＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として集合的に知られる薬剤のファミリー、ならびにエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号）が挙げられる。

使用することのできる酵素活性毒素及びその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、ＰｈｙｔｏｌａｃａＡｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａｃｈａｒａｎｔｉａ阻害薬、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害薬、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが挙げられる（例えば、１９９３年１０月２８日公開のＷＯ９３／２１２３２を参照されたい）。

本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質と、核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼ、またはデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼ）との間に形成された、免疫共役体も提供される。

腫瘍の選択的破壊のために、多特異性抗原結合タンパク質は、高放射性原子を含んでもよい。多様な放射性アイソトープが、放射性共役抗体の産生に利用可能である。例としては、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２、及びＬｕの放射性アイソトープが挙げられる。共役体が検出のために使用される場合、これは、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても知られる）のためのスピン標識、例えば、繰り返しになるがヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガン、もしくは鉄などを含んでもよい。

放射標識または他の標識が、既知の方法で共役体に組み込まれてもよい。例えば、ペプチドは、生合成されてもよいし、例えば、水素の代わりにフッ素１９を用いる、好適なアミノ酸前駆体を使用した化学的なアミノ酸合成によって合成されてもよい。ｔｃ^９９ｍまたはＩ^１２３、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、及びＩｎ^１１１などの標識は、ペプチド内のシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム−９０は、リジン残基を介して結合することができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒｅｔａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７（１９７８））を使用して、ヨウ素１２３を組み込むことができる。「ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎＩｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ１９８９）は、他の方法を詳細に記載している。

多特異性抗原結合タンパク質と細胞傷害剤との共役体は、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣＩなど）、活性エステル（例えばスベリン酸ジサクシニミジルなど）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）といった、多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製され得る。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：１０９８（１９８７）に記載のように調製することができる。炭素１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種を多特異性抗原結合タンパク質と共役させるための例示的なキレート剤である。例えば、ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞傷害薬の放出を促進する「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１（１９９２）、米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。

そのような化合物としては、限定されないが、架橋試薬：ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（サクシニミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を用いて調製されたＡＤＣが挙げられ、これらは、（例えば、ＰｉｅｒｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されている。２００３−２００４ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＨａｎｄｂｏｏｋａｎｄＣａｔａｌｏｇの４６７〜４９８頁を参照されたい。

共役多特異性抗原結合タンパク質の調製
特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、多特異性抗原結合タンパク質１個当たり１個以上の部分（例えば薬物部分）、例えば、約１個〜約２０個の部分と、任意にリンカーを介して共役する。共役抗体は、（１）多特異性抗原結合タンパク質の求核基を共有結合によって二価リンカー試薬と反応させ、続いて目的の部分と反応させること、及び（２）ある部分の求核基を共有結合によって二価リンカー試薬と反応させ、続いて多特異性抗原結合タンパク質の求核基と反応させることを含む、当業者に知られる有機化学反応、条件、及び試薬を用いた、いくつかの経路によって調製され得る。共役抗体を調製するための追加の方法が、本明細書に記載される。

リンカー試薬は、１つ以上のリンカー成分から構成されてもよい。例示的なリンカー成分としては、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ−サクシニミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ−サクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、及びＮ−サクシニミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート（「ＳＩＡＢ」）が挙げられる。追加のリンカー成分が当該技術分野で知られており、いくつかが本明細書に記載される。内容が参照によりその全体において本明細書に援用される、米国出願公開第２００５／０２３８６４９号の「ＭｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅＣｏｍｐｏｕｎｄｓＣａｐａｂｌｅｏｆＣｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｔｏＬｉｇａｎｄｓ」も参照されたい。

いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸残基を含み得る。例示的なアミノ酸リンカー成分としては、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、またはペンタペプチドが挙げられる。例示的なジペプチドとしては、バリン−シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆまたはａｌａ−ｐｈｅ）が挙げられる。例示的なトリペプチドとしては、グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）及びグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）が挙げられる。アミノ酸リンカー成分を含むアミノ酸残基には、自然発生するもの、ならびに微量アミノ酸及び自然に発生しないアミノ酸類似体、例えばシトルリンなどが含まれる。アミノ酸リンカー成分は、特定の酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ、及びＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断に対するそれらの選択性について設計し、最適化することができる。

抗体上の求核基としては、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）多特異性抗原結合タンパク質がグリコシル化される糖ヒドロキシル基またはアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない。アミン、チオール、及びヒドロキシル基は、求核性であり、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物などの活性エステル、（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのハロゲン化アルキル及びハロゲン化ベンジル、（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含むリンカー部分及びリンカー試薬の求電子基と反応して、共有結合を形成することができる。特定の抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有する。抗体は、ＯＴＴ（ジチオスレイトール）などの還元剤での処理によって、リンカー試薬との共役に対して反応性にすることができる。したがって各システイン架橋は、理論上、２つの反応性チオール求核剤を形成することになる。リジンと２−イミノチオラン（トラウト（Ｔｒａｕｔ’ｓ）試薬）との反応によって追加の求核基を抗体に導入し、アミンをチオールに変換させることができる。１個、２個、３個、４個、またはそれより多くのシステイン残基を導入すること（例えば、１個以上の非天然システインアミノ酸残基を含む変異体抗体を調製すること）によって、反応性チオール基を多特異性抗原結合タンパク質（またはその断片）に導入してもよい。

共役多特異性抗原結合タンパク質は、多特異性抗原結合タンパク質を修飾して、リンカー試薬もしくは薬物または他の部分の求核性置換基と反応することのできる求電子性部分を導入することによって、産生されてもよい。グリコシル化抗体の糖を、例えば、過ヨウ素酸酸化試薬で酸化させて、リンカー試薬もしくは薬物または他の部分のアミン基と反応し得るアルデヒドまたはケトン基を形成してもよい。結果として得られるイミンシッフ塩基群は、安定な結合を形成してもよいし、例えば、水素化ホウ素試薬によって還元されて、安定なアミン結合を形成してもよい。一実施形態において、グリコシル化された多特異性抗原結合タンパク質の炭水化物部分を、ガラクトースオキシダーゼ（ｇｌａｃｔｏｓｅｏｘｉｄａｓｅ）またはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかと反応させると、タンパク質中で、薬物または他の部分の適切な基と反応することのできるカルボニル（アルデヒド及びケトン）基がもたらされ得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施形態では、Ｎ末端セリンまたはスレオニン残基を含有するタンパク質がメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応して、第１のアミノ酸の代わりにアルデヒドの産生がもたらされてもよい（ＧｅｏｇｈｅｇａｎａｎｄＳｔｒｏｈ，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）、米国特許第５，３６２，８５２号）。かかるアルデヒドは、薬物部分またはリンカー求核剤と反応させることができる。

同様に、（薬物部分などの）部分の求核基としては、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物などの活性エステル、（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのハロゲン化アルキル及びハロゲン化ベンジル、ならびに（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、及びマレイミド基を含むリンカー部分及びリンカー試薬の求電子基と反応して共有結合を形成することのできる、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基が挙げられるが、これらに限定されない。

あるいは、多特異性抗原結合タンパク質及び細胞傷害剤を含む融合タンパク質は、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって作製されてもよい。ＤＮＡの長さは、互いに隣接しているか、あるいは共役体の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により隔てられている、共役体の２つの部分をコードするそれぞれの領域を含み得る。さらに別の実施形態では、多特異性抗原結合タンパク質は、腫瘍の事前標的化（ｐｒｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）において利用するために、「受容体」（例えばストレプトアビジンなど）と共役してもよく、ここでは、多特異性抗原結合タンパク質−受容体共役体が個体に投与され、続いて、清澄剤を使用して、未結合の共役体が循環から除去され、次に、細胞傷害剤（例えば、ラジオヌクレオチド）と共役している「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。

有用性
本明細書において提供される本方法には、多特異性抗原結合タンパク質の産生における産業上の利用可能性がある。本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質は、例えば、インビトロ、エクスビボ、及びインビボでの治療法において役立つ。本明細書では、これらの分子のうちの１個以上を使用することに基づく様々な方法が提供される。特定の病理学的条件において、多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など）を利用することが必要である及び／または望ましい。本明細書では、多様な目的のために、例えば治療薬、予防薬、及び診断薬として使用され得る、多特異性抗原結合タンパク質が提供される。例えば、疾患の治療方法が提供され、該方法は、治療を必要とする対象に、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質を投与することを含み、それにより、疾患が治療される。本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質のうちのいずれも、本明細書に記載の治療法（または予防法もしくは診断法）に使用することができる。

例えば、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の価値ある利益の１つは、それらがその抗原に対して提示する親和力の向上である。抗原基盤に対する結合ユニット（すなわち、Ｆａｂ）に固有の高い親和性を有することに加えて、正常なＩｇＧ抗体はまた、親和作用を活用して、標的に対するそれらの二価結合の結果としての抗原とのそれらの会合を増加させる。

特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、２個以上の抗原分子上のエピトープに結合する。特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質は、同じ抗原分子上の２つ以上のエピトープに結合する。同じ抗原分子上の２つの別個のエピトープに対する多特異性抗原結合タンパク質は、（二価結合による）結合親和力の向上の利益を提供し得るだけでなく、親抗体のいずれにも関連していない新規の特性を獲得する場合もある。特定の実施形態において、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、例えば、受容体−リガンド相互作用の遮断に役立つ。

本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質は、１個の分子で２つの標的のシグナル伝達経路を同時に遮断する用途においても役立つ。

治療的使用
多特異性抗原結合タンパク質（例えば本明細書に記載の抗体及び抗体断片など）は、治療用途に使用され得る。特定の実施形態において、本明細書に記載の多特異性抗原結合タンパク質を有効量で対象に投与することを含む、対象における疾患の治療方法が提供される。特定の実施形態において、疾患を治療するための薬物の製造における、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質の使用が提供される。特定の実施形態において、対象における疾患の治療に使用するための多特異性抗原結合タンパク質が提供される。

例えば、かかる多特異性抗原結合タンパク質は、前がん性、非転移性、転移性、及びがん性の腫瘍を含む腫瘍（例えば、早期がん）の治療、アレルギー性障害もしくは炎症性障害の治療、または自己免疫疾患の治療、またはがん（例えば、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、腎細胞癌、神経膠腫、もしくは卵巣がん）、アレルギー性障害もしくは炎症性障害、または自己免疫疾患を発症するリスクがある対象の治療のために使用することができる。

がんという用語は、前がん性成長、良性腫瘍、及び悪性腫瘍を含むがこれらに限定されない、増殖性障害の集合を包含する。良性は、遠隔部位に浸潤または転移する。悪性腫瘍は、それらの周りの他の組織に浸潤し損傷する。悪性腫瘍はまた、それらが始まった場所から離脱し、通常は血流を通して、またはリンパ節が位置するリンパ系を通して、身体の他の部分に伝播（転移）する能力を得る場合がある。原発腫瘍は、それらが生じる組織の型によって分類され、転移性腫瘍は、がん細胞が由来する組織型によって分類される。経時的に、悪性腫瘍の細胞はより異常になり、正常細胞のようには見えなくなる。がん細胞の外観のこの変化は腫瘍悪性度と呼ばれ、がん細胞は、高分化型、中分化型、低分化型、または未分化型と説明される。高分化細胞はかなり正常な外観であり、それらが起源とする正常細胞に似ている。未分化細胞は、細胞の起源を判定するのがもはや不可能であるほど異常になった細胞である。

腫瘍は、固形腫瘍である場合も、非固形腫瘍もしくは軟組織腫瘍である場合もある。軟組織腫瘍の例としては、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、成熟Ｂ細胞急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、前リンパ球性白血病、または有毛細胞性白血病）、またはリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、またはホジキン病）が挙げられる。固形腫瘍には、血液、骨髄、またはリンパ系以外の体組織のあらゆるがんが含まれる。固形腫瘍は、上皮細胞起源のものと非上皮細胞起源のものとにさらに分別することができる。上皮細胞固形腫瘍の例としては、消化管、結腸、乳房、前立腺、肺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、頭頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、口唇、上咽頭、皮膚、子宮、男性生殖器、泌尿器、膀胱、及び皮膚の腫瘍が挙げられる。非上皮起源の固形腫瘍としては、肉腫、脳腫瘍、及び骨腫瘍が挙げられる。

上皮がんは一般に、良性腫瘍から前浸潤期（例えば、上皮内癌）に、そして基底膜を透過し上皮下間質に浸潤した悪性がんに発達する。多特異性抗原結合タンパク質複合体は、こうした治療用途にも使用することができ、ＨＥＲ２に結合する抗体は、特に、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、腎細胞癌、神経膠腫、または卵巣がんの治療に使用することができる。

本明細書において提供される組成物を受ける候補である他の対象は、線維性血管性組織の異常増殖、酒さ性ざ瘡、後天性免疫不全症候群、動脈閉塞、アトピー性角膜炎、細菌性潰瘍、ベーチェット病、血液由来腫瘍、頸動脈閉塞性疾患、脈絡膜新血管新生、慢性炎症、慢性網膜剥離、慢性ぶどう膜炎、慢性硝子体炎、コンタクトレンズ過度装用、角膜移植後拒絶反応、角膜新血管新生、角膜移植新血管新生、クローン病、イールズ病、流行性角結膜炎、真菌性潰瘍、単純疱疹感染症、帯状疱疹感染症、過粘稠度症候群、カポジ肉腫、白血病、脂質変性、ライム病、辺縁角質溶解、モーレン潰瘍、ハンセン病以外のマイコバクテリア感染症、近視、眼性新生血管疾患、視窩、オスラー・ウェーバー症候群（オスラー・ウェーバー・ランデュ）、骨関節炎、パジェット病、毛様体扁平部炎、類天疱瘡、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、多発動脈炎、レーザー後合併症、原虫感染症、弾性線維性仮性黄色腫、翼状片乾燥角膜炎、放射状角膜切開、網膜新血管新生、未熟児網膜症、後水晶体線維増殖症、サルコイド、強膜炎、鎌状赤血球貧血、Ｓｏｇｒｅｎ症候群、固形腫瘍、シュタルガルト病、スティーブンス・ジョンソン症候群、上輪部角膜炎、梅毒、全身性狼瘡、テリエン辺縁変性、トキソプラズマ症、ユーイング肉腫の腫瘍、神経芽細胞腫の腫瘍、骨肉腫の腫瘍、網膜芽細胞腫の腫瘍、横紋筋肉腫の腫瘍、潰瘍性大腸炎、静脈閉塞、ビタミンＡ欠乏症、ウェゲナーサルコイドーシス、糖尿病に関連する望ましくない血管形成、寄生虫症、創傷治癒異常、手術後の肥大、傷害または外傷（例えば、急性肺傷害／ＡＲＤＳ）、発毛阻害、排卵及び黄体形成の阻害、着床の阻害、ならびに子宮内の胚発生の阻害を有するか、またはそれらを発症するリスクがある。

本明細書に記載の方法に従って作製される多特異性抗原結合タンパク質を使用して治療され得るアレルギー性もしくは炎症性障害または自己免疫疾患もしくは障害の例としては、関節炎（急性関節炎、慢性リウマチ性関節炎、痛風関節炎、急性痛風関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、椎骨関節炎、及び若年発症型リウマチ性関節炎、骨関節炎、進行性慢性関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓｃｈｒｏｎｉｃａｐｒｏｇｒｅｄｉｅｎｔｅ）、変形関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓｄｅｆｏｒｍａｎｓ）、原発性慢性多発性関節炎（ｐｏｌｙａｒｔｈｒｉｔｉｓｃｈｒｏｎｉｃａｐｒｉｍａｒｉａ）、反応性関節炎、ならびに強直性脊椎炎などのリウマチ性関節炎）、炎症性過剰増殖性皮膚病、尋常性乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬、及び爪の乾癬などの乾癬、接触性皮膚炎、慢性接触性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、及びアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、ｘ連鎖性高ＩｇＭ症候群、慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性自己免疫性蕁麻疹を含む慢性特発性蕁麻疹などの蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、強皮症（全身性強皮症を含む）、硬化症、例えば全身性硬化症、視神経脊髄型（ｓｐｉｎａ−ｏｐｔｉｃａｌ）ＭＳ、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）、及び再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）などの多発性硬化症（ＭＳ）、進行性全身性硬化症、粥状動脈硬化、動脈硬化症、播種性硬化症（ｓｃｌｅｒｏｓｉｓｄｉｓｓｅｍｉｎａｔａ）、及び失調性硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病、自己免疫媒介性胃腸疾患、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅｃｏｌｉｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎（ｃｏｌｉｔｉｓｕｌｃｅｒｏｓａ）、顕微鏡的大腸炎、コラーゲン大腸炎、ポリープ性大腸炎（ｃｏｌｉｔｉｓｐｏｌｙｐｏｓａ）、壊死性腸炎、及び貫壁性大腸炎などの大腸炎、ならびに自己免疫性炎症性腸疾患）、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、成人性または急性の呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む呼吸促迫症候群、髄膜炎、ぶどう膜の全てまたは一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液疾患、リウマチ性脊椎炎、突発性難聴、アナフィラキシーならびにアレルギー性及びアトピー性の鼻炎などのＩｇＥ媒介性疾患、ラスムッセン脳炎ならびに辺縁系脳炎及び／または脳幹脳炎などの脳炎、前部ぶどう膜炎、急性前部ぶどう膜炎、肉芽腫性ぶどう膜炎、非肉芽腫性ぶどう膜炎、水晶体抗原性ぶどう膜炎（ｐｈａｃｏａｎｔｉｇｅｎｉｃｕｖｅｉｔｉｓ）、後部ぶどう膜炎、または自己免疫性ぶどう膜炎などのぶどう膜炎、ネフローゼ症候群ありなし両方の糸球体腎炎（ＧＮ）、例えば慢性もしくは急性の糸球体腎炎、例えば原発性ＧＮ、免疫媒介性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性腎症）、特発性膜性ＧＮまたは特発性膜性腎症、Ｉ型及びＩＩ型を含む膜増殖性または膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）、ならびに急速進行性ＧＮ、アレルギー状態、アレルギー反応、アレルギー性またはアトピー性の湿疹を含む湿疹、気管支喘息（ａｓｔｈｍａｂｒｏｎｃｈｉａｌｅ）、気管支喘息（ｂｒｏｎｃｈｉａｌａｓｔｈｍａ）、及び自己免疫喘息などの喘息、Ｔ細胞の浸潤及び慢性炎症性応答を伴う状態、慢性肺炎症性疾患、自己免疫性心筋炎、白血球粘着不全症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または全身性紅斑性狼瘡、例えば皮膚ＳＬＥ、亜急性皮膚エリテマトーデス、新生児ループス症候群（ＮＬＥ）、播種性紅斑性狼瘡、狼瘡（腎炎、脳炎、小児性、非腎性、腎外、円板状、脱毛症を含む）、小児インスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）を含む若年発症型（Ｉ型）真性糖尿病、成人発症真性糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、自己免疫性糖尿病、特発性尿崩症、サイトカイン及びＴリンパ球により媒介される急性及び遅延型の過敏症に関連する免疫応答、結核、サルコイドーシス、リンパ腫様肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症を含む肉芽腫症、無顆粒球症、血管炎（大型血管炎（リウマチ性多発筋痛症及び巨細胞性（高安）動脈炎を含む）、中型血管炎（川崎病及び結節性多発動脈炎を含む）、顕微鏡的多発動脈炎、ＣＮＳ血管炎、壊死性、皮膚性、もしくは過敏性の血管炎、全身性壊死性血管炎、及びチャーグ・ストラウス血管炎もしくは症候群（ＣＳＳ）などのＡＮＣＡ関連血管炎を含む）を含む脈管炎、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームス陽性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む溶血性貧血または免疫性溶血性貧血、悪性貧血（ａｎｅｍｉａｐｅｒｎｉｃｉｏｓａ）、アジソン病、真正赤血球性貧血もしくは形成不全（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性障害、敗血症、外傷、もしくは出血に続発するものなどの多臓器障害症候群、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット（ＢｅｃｈｅｔまたはＢｅｈｃｅｔ）病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー（Ｒｅｙｎａｕｄ）症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、水疱性類天疱瘡及び皮膚類天疱瘡などの類天疱瘡、天疱瘡（尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、天疱瘡粘膜類天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｕｓｍｕｃｕｓ−ｍｅｍｂｒａｎｅｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、及び紅斑性天疱瘡を含む）、自己免疫性多腺性内分泌不全症、ライター病または症候群、免疫複合体性腎炎、抗体媒介性腎炎、視神経脊髄炎、多発ニューロパチー、慢性ニューロパチー、例えばＩｇＭ多発ニューロパチーまたはＩｇＭ媒介性ニューロパチーなど、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）及び自己免疫性または免疫媒介性の血小板減少症を含む血小板減少症（例えば心筋梗塞患者が発症するもの）、例えば特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）（慢性または急性のＩＴＰを含む）、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、または亜急性甲状腺炎などの甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブス病、自己免疫性多腺性症候群（または多腺性内分泌異常症候群）などの多腺性症候群を含む、自己免疫性内分泌疾患、神経学的腫瘍随伴症候群を含む腫瘍随伴症候群、例えばランバート・イートン筋無力症候群またはイートン・ランバート症候群、全身強直症候群または全身硬直症候群、アレルギー性脳脊髄炎（ａｌｌｅｒｇｉｃｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）またはアレルギー性脳脊髄炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓａｌｌｅｒｇｉｃａ）及び実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）などの脳脊髄炎、重症筋無力症、例えば胸腺腫関連重症筋無力症、小脳変性症、神経性筋強直症、眼球クローヌス症候群または眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、及び感覚性ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞性肝炎、慢性活動性肝炎または自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ球様間質性肺炎、ＮＳＩＰに対する閉塞性細気管支炎（非移植）、ギラン・バレー症候群、ベルジェ病（ＩｇＡ腎症）、特発性ＩｇＡ腎症、線状ＩｇＡ皮膚症、原発性胆汁性肝硬変、肺線維症、自己免疫性腸疾患症候群、セリアック病、小児脂肪便症、セリアックスプルー（グルテン腸症）、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリック病）、冠動脈疾患、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性難聴などの自己免疫性耳疾患、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群（ＯＭＳ）、難治性または再発性の多発性軟骨炎などの多発性軟骨炎、肺胞蛋白症、アミロイドーシス、強膜炎、非がん性リンパ球増加症、モノクローナルＢ細胞リンパ球増加症（例えば、良性モノクローナル免疫グロブリン血症及び意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症、ＭＧＵＳ）を含む原発性リンパ球増加症、末梢性ニューロパチー、腫瘍随伴症候群、てんかん、片頭痛、不整脈、筋障害、聴覚消失、盲目、周期性麻痺、及びＣＮＳのチャネル病などのチャネル病、自閉症、炎症性筋症、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼疾患、網膜ぶどう膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病学的障害、線維筋痛症、多発性内分泌不全、シュミット症候群、副腎炎、胃の萎縮、初老期認知症、自己免疫性脱髄性疾患などの脱髄性疾患、糖尿病性腎症、Ｄｒｅｓｓｉｅｒ症候群、円形脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、レイノー現象、食道蠕動低下、強指症、及び毛細血管拡張症）、男性及び女性の自己免疫性不妊症、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、反復流産、農夫肺、多形性紅斑、開心術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ球性血管炎、アルポート症候群、アレルギー性肺胞炎及び線維性肺胞炎などの肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス（ｋｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ）、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症、Ｓａｍｐｔｅｒ症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａｅｌｅｖａｔｕｍｅｔｄｉｕｔｉｎｕｍ）、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、Ｓｈｕｌｍａｎ症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、虹彩毛様体炎、またはフックス毛様体炎などの毛様体炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、エコーウイルス感染症、心筋症、アルツハイマー病、パルボウイルス感染症、風疹ウイルス感染症、予防接種後症候群、先天性風疹感染症、エプスタイン・バーウイルス感染症、流行性耳下腺炎、エヴァンス症候群、
自己免疫性性腺機能不全、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓｕｂｉｔｅｒａｎｓ）、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎（ｃｈｏｒｉｏｉｄｉｔｉｓ）、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼疾患、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎炎症候群、微小変化型腎症、良性家族性及び虚血再灌流傷害、網膜自己免疫、関節の炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化性障害、精子形成欠如、自己免疫性溶血、Ｂｏｅｃｋ病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、アレルギー性腸炎（ｅｎｔｅｒｉｔｉｓａｌｌｅｒｇｉｃａ）、癩性結節性紅斑、特発性顔面麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱（ｆｅｂｒｉｓｒｈｅｕｍａｔｉｃａ）、Ｈａｍｍａｎ−Ｒｉｃｈ病、感覚神経性難聴、発作性ヘモグロビン尿症（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａｐａｒｏｘｉｓｔｉｃａ）、性腺機能低下症、限局性回腸炎（ｉｌｅｉｔｉｓｒｅｇｉｏｎａｌｉｓ）、白血球減少、伝染性単核症（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｓａ）、横断性脊髄炎（ｔｒａｖｅｒｓｅｍｙｅｌｉｔｉｓ）、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感性眼炎（ｏｐｈｔｈａｌｍｉａｓｉｍｐａｔｉｃａ）、肉芽腫性精巣炎、膵炎、急性多発神経根炎、壊疽性膿皮症、Ｑｕｅｒｖａｉｎ甲状腺炎、後天性膵臓萎縮（ａｃｑｕｉｒｅｄｓｐｅｎｉｃａｔｒｏｐｈｙ）、抗精子抗体（ａｎｔｉｓｐｅｒｍａｔｏｚｏａｎａｎｔｏｂｏｄｉｅｓ）に起因する不妊症、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤ及びエプスタイン・バーウイルスに関連する疾患、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａなどの寄生虫症、毒素性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う状態、白血球粘着不全症、サイトカイン及びＴリンパ球により媒介される急性及び遅延型の過敏症に関連する免疫応答、白血球漏出を伴う疾患、多臓器障害症候群、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫性多腺性内分泌不全症、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎（ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃｏｐｈｔｈａｌｍｉａ）、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌不全、末梢性ニューロパチー、自己免疫性多腺性症候群Ｉ型、成人発症特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、全頭脱毛症、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、血色素症、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性または非化膿性の副鼻腔炎、急性または慢性の副鼻腔炎、篩骨洞炎、前頭洞炎、上顎洞炎、または蝶形骨洞炎、好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増多筋痛症候群、Ｌｏｆｆｌｅｒ症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増多症、気管支肺アスペルギルス症、アスペルギルス腫、または好酸球を含む肉芽腫などの好酸球関連障害、アナフィラキシー、血清陰性脊椎関節炎、多内分泌自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブルトン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、コラーゲン病に関連する自己免疫障害、リウマチ、神経疾患、虚血再灌流障害、血圧応答の低減、血管機能不全、血管拡張、組織損傷、心血管虚血、痛覚過敏、脳虚血、及び血管新生に付随する疾患、アレルギー性過敏性障害、糸球体腎炎、再灌流傷害、心筋または他の組織の再灌流傷害、急性炎症性要素を伴う皮膚疾患、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症性障害、眼及び眼窩の炎症性障害、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、急性の重篤な炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺硬変、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈障害、動脈内の過形成（ｅｎｄａｒｔｅｒｉａｌｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、消化性潰瘍、弁膜炎、ならびに子宮内膜症が挙げられるが、これらに限定されない。

治療的使用に加えて、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の疾患及び状態の診断法などの診断法を含む他の目的に使用されてもよい。

薬用量、製剤、及び持続期間
本明細書において提供されるタンパク質は、適正な医療行為と一致した様式で製剤化され、投薬され、投与される。この文脈における検討要素には、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳動物、個々の対象の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与の予定、及び医療施術者に知られる他の要素が含まれる。投与されるタンパク質の「治療有効量」は、このような検討事項によって左右され、特定の障害（例えば、がん、アレルギー性もしくは炎症性の障害、または自己免疫障害）の防止、寛解、または治療に必要な最小量である。タンパク質は、場合により、その障害を防止または治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤と共に製剤化されるが、その必要はない。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するタンパク質の量、障害または治療の種類、及び上記に詳解した他の要素に左右される。これらは概して、これまでに使用されたものと同じ薬用量及び投与経路で、またはこれまでに用いられた薬用量の約１〜９９％で使用される。一般に、がんの緩和または治療は、がんに関連する１つ以上の症状または医学的問題の軽減を伴う。薬物の治療有効量は、以下のうちの１つまたはそれらの組み合わせを達成することができる：がん細胞の数の（少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上の）低減；腫瘍サイズまたは腫瘍負荷の低減もしくは抑制；がん細胞が末梢器官に浸潤することの阻害（すなわち、ある程度の減少及び／または停止）；腺腫の場合はホルモン分泌の低減；血管密度の低減；腫瘍転移の阻害；腫瘍成長の低減または阻害；及び／またはがんに関連する症状のうちの１つ以上のある程度の緩和。いくつかの実施形態では、タンパク質は、対象におけるがんまたは自己免疫障害の発症もしくは再発を防止するために使用される。

一実施形態において、本明細書において提供される組成物は、がんもしくは自己免疫障害になりやすいか、またはそうと診断されたヒト対象の生存期間を延長するために使用される。生存期間は、薬物の第１の投与から死亡までの時間と定義される。生存期間は、治療中の対象の死亡リスクを表す、処置群対対照群の層別化ハザード比（ｓｔｒａｔｉｆｉｅｄｈａｚａｒｄｒａｔｉｏ）（ＨＲ）によって測定されてもよい。

特定の実施形態において、治療は、がんになりやすいか、またはがんと診断された、様々な抗がん療法で治療されているヒト対象の群における奏効率を、著しく上昇させる。奏効率は、治療された対象のうち治療に応答したものの割合と定義される。一態様において、併用療法には、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質と、手術、放射線療法、または１つ以上の化学療法剤との使用であり、治療対象群における奏効率を、手術、放射線療法、または化学療法単独で治療された群と比較して有意に上昇させ、この上昇が０．００５未満のカイ二乗ｐ値を有するものが含まれる。がん治療における治療有効性の追加の測定は、米国特許出願公開第２００５０１８６２０８号に記載されている。

薬学的組成物及び製剤
本明細書に開示される多特異性抗原結合タンパク質は、投与に好適となるように、好適な担体または賦形剤と共に製剤化され得る。本明細書に開示される多特異性抗原結合タンパク質の好適な製剤は、所望の純度を有する本明細書に開示される多特異性抗原結合タンパク質を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で得られる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる薬用量及び濃度において受容者にとって無毒であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；及び／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質に適用することのできる例示的な抗体製剤は、参照により本明細書に明示的に援用されるＷＯ９８／５６４１８に記載されている。皮下投与のために適合された凍結乾燥製剤は、ＷＯ９７／０４８０１に記載されている。かかる凍結乾燥製剤は、好適な希釈剤で高いタンパク質含有率まで再構成されてもよく、再構成された製剤は、本明細書において処置される哺乳動物に皮下投与されてもよい。

本明細書における製剤は、治療されている特定の適応症のために必要な場合、１つより多くの活性化合物、好ましくは互いに有害作用を及ぼさない相補的な活性を有するものを含んでもよい。例えば、抗悪性腫瘍薬、成長阻害剤、細胞傷害剤、または化学療法剤をさらに提供することが望ましい場合がある。そのような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わさって存在することが好適である。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する多特異性抗原結合タンパク質の量、疾患もしくは障害または治療の種類、及び詳解した他の要素に左右される。これらは概して、本明細書に記載のものと同じ薬用量及び投与経路で、またはこれまでに用いられた薬用量の約１〜９９％で使用される。活性成分はまた、例えばコアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル内、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンのマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル）内、またはマクロ乳濁液中に、封入されてもよい。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例としては、拮抗薬を含有する固体の疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態にある。徐放性マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及びリュープロリド酢酸塩から構成された注射用マイクロスフェア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。

リポフェクチンまたはリポソームは、本明細書に開示される多特異性抗原結合タンパク質または本明細書において提供される組成物を細胞内に送達するために使用することができる。

任意だが好ましくは、本製剤は、薬学的に許容される塩、好ましくは塩化ナトリウムを、好ましくはおよそ生理的な濃度で含有する。任意に、本製剤は、薬学的に許容される防腐剤を含有してもよい。いくつかの実施形態では、防腐剤の濃度は、典型的には体積／体積（ｖ／ｖ）で０．１〜２．０％の範囲である。好適な防腐剤としては、薬学の技術分野で知られるものが挙げられる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、及びプロピルパラベンが、好ましい防腐剤である。任意に、本製剤は、薬学的に許容される界面活性剤を０．００５〜０．０２％の濃度で含んでもよい。

徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例としては、多特異性抗原結合タンパク質を含有する固体の疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態にある。徐放性マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及びリュープロリド酢酸塩から構成された注射用マイクロスフェア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーが１００日間にわたる分子の放出を可能にする一方で、特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。カプセル化された多特異性抗原結合タンパク質（複数可）は、長期間にわたって体内に残存する場合、３７℃における水分への曝露の結果として変性または凝集し、生物活性の損失、及び免疫原性の変化の可能性をもたらし得る。関与する機序に応じて、安定化のための合理的な方略を考案することができる。例えば、凝集機序がチオ−ジスルフィド相互交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると見出されたならば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を制御し、適切な添加剤を使用し、特定のポリマーマトリクス組成物を開発することにより実現されてもよい。

本明細書に記載のタンパク質（例えば、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など））は、ボーラスとしての静脈内投与などの既知の方法に従って、または筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、もしくは吸入経路による一定期間にわたる持続注入によって、ヒト対象に投与される。タンパク質により認識される標的分子に対する拮抗作用に甚大な副作用または毒性が関連付けられる場合、局所投与が特に所望される場合がある。エクスビボの方略を治療用途に使用することもできる。エクスビボ方略は、対象から得られた細胞に、本明細書において提供されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトまたは形質導入することを伴う。トランスフェクトまたは形質導入された細胞はその後、対象に戻される。これらの細胞は、限定されないが、造血細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、または筋細胞を含む広範な種類のうちのいずれであってもよい。

一例において、多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など）は、障害または腫瘍の位置が許容すれば、例えば、直接注射によって局所投与され、注射は周期的に繰り返されてもよい。タンパク質複合体は、対象に全身的に送達されてもよいし、局所的再発または転移を防止もしくは低減させるために、腫瘍細胞に、例えば、腫瘍または腫瘍の外科切除後の腫瘍母地に直接送達されてもよい。

診断及び撮像
本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など）は、当業者に知られる古典的な免疫組織学的方法を使用して生体試料中のタンパク質レベルをアッセイするために使用することができる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）、Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照されたい）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体ベースの方法としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などのイムノアッセイが挙げられ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など）での使用のために適合させることができる。好適なアッセイ標識は当該技術分野で知られており、これには、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識；ヨウ素（^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^１２１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１１５ｍＩｎ、^１１３ｍＩｎ、^１１２Ｉｎ、^１１１Ｉｎ）、及びテクネチウム（^９９Ｔｃ、^９９ｍＴｃ）、タリウム（^２０１Ｔｉ）、ガリウム（^６８Ｇａ、^６７Ｇａ）、パラジウム（^１０３Ｐｄ）、モリブデン（^９９Ｍｏ）、キセノン（^１３３Ｘｅ）、フッ素（^１８Ｆ）、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、^１５９Ｇｄ、^１４９Ｐｍ、^１４０Ｌａ、^１７５Ｙｂ、^１６６Ｈｏ、^９０Ｙ、^４７Ｓｃ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１４２Ｐｒ、^１０５Ｒｈ、^９７Ｒｕなどのラジオアイソトープ；ルミノール；ならびにフルオレセイン及びローダミン、及びビオチンなどの蛍光標識が含まれる。

当該技術分野で知られる技術を、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など）に適用することができる。かかる技術としては、二機能性共役剤の使用が挙げられるが、これに限定されない（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号、同第５，７１４，６３１号、同第５，６９６，２３９号、同第５，６５２，３６１号、同第５，５０５，９３１号、同第５，４８９，４２５号、同第５，４３５，９９０号、同第５，４２８，１３９号、同第５，３４２，６０４号、同第５，２７４，１１９号、同第４，９９４，５６０号、及び同第５，８０８，００３号を参照されたい）。また、例えば、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など）での使用のために適合された抗体ベースアッセイ（例えば、１９９０年６月１２日に発行された米国特許第４，９３３，２９４号、１９９１年４月１８日に公開されたＷＯ９１／０５２６４、１９９５年３月２８日に発行された米国特許５，４０１，６３８号、及びＳｉａｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１３２：７３−８０（１９９０）も参照されたい）を使用し、血清などの生体液中の脱落した（ｓｈｅｄ）抗原（複数可）を測定することによって、１つ以上の目的の抗原の過剰発現を研究することができる。上記のアッセイの他に、様々なインビボアッセイ及びエクスビボアッセイが、熟練した施術者には利用可能である。例えば、検出可能な標識、例えば放射性アイソトープで任意に標識されている、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など）に、哺乳動物の体内の細胞を曝露することができ、例えば、放射活性の外部走査によって、または多特異性抗原結合タンパク質に事前に曝露された哺乳動物から採取された試料（例えば生検または他の生体試料）を分析することによって、１つ以上の目的の抗原（複数可）に対する多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など）の結合を評価することができる。

製品及びキット
本明細書に記載の１つ以上の多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など）と障害（例えば、自己免疫疾患またはがん）の治療または診断に有用な材料とを含む製品も提供される。特定の実施形態において、本製品は、容器と、容器に接するまたは容器に関連付けられたラベルもしくは添付文書とを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成され得る。容器は、状態を治療するのに有効な組成物を保持するものであり、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静注溶液バッグ、または皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本明細書において提供される多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など）である。ラベルまたは添付文書は、その組成物が特定の状態を治療するために使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、多特異性抗原結合タンパク質組成物を対象に投与するための指示をさらに含む。本明細書に記載の併用治療薬を含む製品及びキットも想定される。

「添付文書」は、適応症、使用法、薬用量、投与、禁忌症、及び／または治療用生成物の使用に関する警告に関する情報を含む、かかる治療用生成物の商用パッケージに通例含まれる指示書を指す。特定の実施形態において、添付文書は、その組成物が乳がん、結腸直腸がん、肺がん、腎細胞癌、神経膠腫、または卵巣がんを治療するために使用されることを示す。

追加的に、本製品は、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む、第２の容器をさらに含んでもよい。本製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的観点及び使用者の観点から考慮される他の材料をさらに含んでもよい。

様々な目的のため、例えば、細胞から２つ以上の標的抗原を精製または免疫沈降するために有用なキットがまた、提供される。２つ以上の標的抗原の単離及び精製に関して、本キットは、ビーズ（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ）にカップリングされた多特異性抗原結合タンパク質（例えば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２抗体）を含むことができる。インビトロで、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットで抗原を検出及び定量化するための、多特異性抗原結合タンパク質（複数可）を含むキットが提供され得る。製品と同様に、本キットは、容器と、容器に接するまたは容器に関連付けられたラベルもしくは添付文書とを含む。容器は、本明細書において提供される少なくとも１つの多特異性抗原結合タンパク質（例えば二重特異性抗体など）を含む組成物を保持する。例えば、希釈剤及び緩衝液または対照抗体を含む、追加の容器が含まれてもよい。ラベルまたは添付文書は、組成物の説明ならびに意図されるインビトロまたは診断上の使用に関する指示を提供してもよい。

コンピュータ実装
本明細書では、１）第１の重鎖配列（Ｈ１）及び第１の軽鎖配列（Ｌ１）を含む第１の抗原に結合する第１の重鎖／軽鎖対と、２）第２の重鎖配列（Ｈ２）及び第２の軽鎖配列（Ｌ２）を含む第２の抗原に結合する第２の重鎖／軽鎖対と、を含み、各Ｈ１及びＨ２が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）を含み、各Ｌ１及びＬ２が、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む、多特異性抗原結合タンパク質を評価するための、コンピュータ可読媒体が提供される。

特定の実施形態において、コンピュータ可読媒体は、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、及びＬ２内のアミノ酸置換を表すデータを含むデータセットを含み、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つは、配列番号１を参照してＳ１８３位におけるアミノ酸置換を含み、ＣＬドメインは、配列番号２を参照してＶ１３３位におけるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、コンピュータ可読媒体は、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、及びＬ２内のアミノ酸置換を表すデータを含むデータセットを含み、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つは、配列番号１を参照してＦ１７０位またはＬ１２８位及びＶ１８５位におけるアミノ酸置換を含み、ＣＬドメインは、配列番号２を参照してＳ１７６位またはＦ１１８位及びＬ１３５位におけるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、コンピュータ可読媒体は、Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、及びＬ２内のアミノ酸置換を表すデータを含むデータセットを含み、Ｈ１のＣＨ１ドメイン内のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つは、配列番号１を参照してＳ１８２位、Ｆ１７０位、またはＬ１２８位、及びＶ１８５位におけるアミノ酸置換を含み、ＣＬドメインは、配列番号２を参照してＶ１３位、Ｓ１７６位、またはＦ１１８位、及びＬ１３５位におけるアミノ酸置換を含む。

特定の実施形態において、多特異性抗原結合タンパク質を評価するためのコンピュータ可読媒体は、Ｈ１がＬ２と比較してＬ１と優先的に対合する尤度及び／またはＨ２がＬ１と比較してＬ２と優先的に対合する尤度を決定するためのコンピュータ実行可能コードを含む。

特定の実施形態において、コンピュータは、チップセットに連結された少なくとも１つのプロセッサを備える。チップセットには、メモリ、記憶デバイス、キーボード、グラフィックスアダプタ、ポインティングデバイス、及びネットワークアダプタも連結されている。グラフィックアダプタには、ディスプレイが連結されている。一実施形態において、チップセットの機能は、メモリコントローラハブ及びＩ／Ｏコントローラハブによって提供される。別の実施形態では、メモリは、チップセットの代わりにプロセッサに直接連結される。

記憶デバイスは、ハードドライブ、コンパクトディスク読み取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、ＤＶＤ、または固体メモリデバイスのような、データを保持することのできる任意のデバイスである。メモリは、プロセッサにより使用される命令及びデータを保持する。ポインティングデバイスは、マウス、トラックボール、または他の種類のポインティングデバイスであってもよく、コンピュータシステムにデータを入力するためにキーボードと組み合わせて使用される。グラフィックスアダプタは、画像及び他の情報をディスプレイ上に表示する。ネットワークアダプタは、コンピュータシステムをローカルまたは広域ネットワークに連結する。

当該技術分野で知られているように、コンピュータは、これまでに記載したものと異なる構成要素及び／または他の構成要素を有してもよい。加えて、コンピュータは、特定の構成要素を欠いていてもよい。さらに、記憶デバイスは、コンピュータからローカル及び／またはリモートであっても（例えばストレージエリアネットワーク（ＳＡＮ）内に統合されていても）よい。

当該技術分野で知られているように、コンピュータは、本明細書に記載の機能を提供するためのコンピュータプログラムモジュールを実行するように適合される。本明細書において使用される場合、「モジュール」という用語は、指定された機能を提供するために利用されるコンピュータプログラム論理を指す。したがって、モジュールは、ハードウェア、ファームウェア、及び／またはソフトウェアに実装することができる。一実施形態において、プログラムモジュールは、記憶デバイスに記憶され、メモリにロードされ、プロセッサによって実行される。

前述の説明は、当業者が本発明を実践することを可能にするのに十分であると考えられる。以下の実施例は例証目的のためだけに提示されるものであり、本発明の範囲をいかようにも限定することを意図しない。実際、本明細書に示され記載されたものに加えて、様々な修飾が前述の説明から当業者には明らかになり、それらは添付の特許請求の範囲に含まれる。

実施例１：方略番号１を使用した抗体重鎖／軽鎖対の操作
Ｆａｂアセンブリは、独立して、ＶＨ／ＶＬ及びＣＨ１／ＣＬドメインの相互作用によって推進される。ＣＬ不安定化変異は、抗原結合に対して中等度の効果しか有しない場合があるが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の相互作用の途絶は、哺乳動物細胞内での抗体のフォールディング及び分泌に干渉し得る（データ図示せず）。特異的かつ正確なＨＣとＬＣとの対合を誘導し、ＨＣ／ＬＣの誤対合を最低限に抑えるために、ＣＨ１／ＣＬ変異対のパネルを生成した。正確な対合を誘導するＣＨ１／ＣＬ変異対の能力は、以下にさら詳細に記載されるように検査した。

ＣＬドメイン内のＦ１１８、Ｖ１３３、またはＬ１３５における変異は、ＣＨ１とのアセンブリを撹乱させることが見出された（データ図示せず）。変異したＣＬドメインとのアセンブリを回復させるＣＨ１ドメイン内のアミノ酸位置を特定するために、ＰｙＭｏｌを使用して抗体定常ドメインＰＤＢＩＤ１ＣＺ８を調製した。重鎖ＣＨ１ドメインならびに軽鎖ＣＬドメインの構造及び機能の詳細な知識に基づいたヒトの誘導による設計を使用して、ＣＨ１ドメインのＬ１２８位、Ｇ１４３位、Ｌ１４５位、Ｓ１８３位、及びＶ１８５位における置換を、単独または組み合わせで試験した。Ｓ１８３位に荷電アミノ酸置換変異を有する重鎖は、逆電荷のＣＬ置換変異との関連で抗体発現を改善させることが示された（図１Ａ及び１Ｂ参照）。図１Ａ及び１Ｂは、１ｍｌの２９３Ｔ培養物からのタンパク質Ａ回収を示す（Ａ２８０吸光度単位（Ａ．Ｕ．））。したがって、Ｓ１８３変異体をさらなる分析のために選択した。

変異ＣＨ１及び変異ＣＬドメインをスクリーニングして、抗体発現を回復させる変異対を初めに特定した。初回スクリーニングとして、標準的な分子生物学技術を使用して、Ｆ１１８、Ｖ１３３、またはＬ１３５が正荷電アミノ酸（すなわち、ＫまたはＲ）に置き換えられたＣＬを有する抗体軽鎖を生成し、Ｓ１８３が負荷電アミノ酸（すなわち、ＥまたはＤ）に置き換えられたＣＨ１を有する重鎖を生成し、哺乳動物の発現ベクターにクローニングした。以前に説明されているように（例えば、Ｂｏｓｅｔａｌ．（２０１４）“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｓｅｍｉ−ａｕｔｏｍａｔｅｄｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｔｒａｎｓｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．”ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１８０，１０−１６を参照されたい）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクション培養物１ｍＬを使用して、Ｓ１８３ＥまたはＳ１８３Ｄ変異を有する重鎖ＣＨ１ドメイン及びＦ１１８Ｋ、Ｆ１１８Ｒ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３Ｒ、Ｖ１３５Ｋ、またはＬ１３５Ｒ置換変異を有する軽鎖ＣＬドメインをコードするプラスミドを、等濃度でコトランスフェクトした。ＣＨ１変異体及びＣＬ変異体のあらゆる対の組み合わせについて、この手順を繰り返した。

ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）により、製造業者のプロトコルに従って、哺乳動物培養上清からヒトＩｇＧ１を精製し、精製されたＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ溶離液のＯＤ２８０測定によって、抗体発現を計算した。図２に示されるように、抗体発現は、Ｖ１３３Ｋを野生型ＣＨ１と対合させた場合と比較して、Ｖ１３３ＫＣＬ変異をＳ１８３ＤＣＨ１変異またはＳ１８３ＥＣＨ１変異と対合させたときに改善した。１５０μＬ体積のＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ精製溶離液から得られた全抗体収量（μｇ）が、図２のｙ軸に示されている。

図３に提供されたＸ線結晶構造に示されるように、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）内のＶ１３３及び重鎖ＣＨ１ドメイン内のＳ１８３は、ＩｇＧの軽鎖ＣＬドメイン及び重鎖ＣＨ１ドメインの界面の内側に存在する。この構造はＩｇＧ４において同様である。ＣＨ１のＳ１８３（ＥＵ付番、Ｋａｂａｔ付番のＳ１８８と同等）はヒト及びマウスの生殖系列で保存されており、Ｖ１３３はヒト及びマウスのカッパ及びラムダ軽鎖内に存在する。いかなる１つの理論にも限定されるものではないが、Ｖ１３３における荷電アミノ酸の置換、及びＳ１８３における反対の電荷を有するアミノ酸の置換は、未修飾のＣＨ１／ＣＬ界面内には存在しない周囲のアミノ酸残基（例えばＣＬドメイン内のＳ１７６及びＳ１７８など）との新たな安定化相互作用を作り出し得る。

さらなる実験を行って、良好なレベルの抗体発現を示したさらなる特異的Ｖ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ変異体対を特定した。上述の抗体発現アッセイを使用して、ＣＨ１−ＣＬ対合を優先するＶ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ変異体対を特定した。簡潔に述べると、ＣＨ１Ｓ１８３Ｘ置換変異（例えば、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｙ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｎ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｒ、またはＳ１８３Ｋ）を有する抗体重鎖と、Ｖ１３３Ｘ置換変異（例えば、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｓ、Ｖ１３３Ｌ、Ｖ１３３Ｗ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３Ｒ、またはＶ１３３Ｄ）を有する軽鎖とを、上述のように生成した。上述のようにＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクション培養物３０ｍＬを使用して、上記の変異ＣＨ１及びＣＬ変異のそれぞれを有する重鎖及び軽鎖を発現するプラスミドを、等濃度でコトランスフェクトした。Ｖ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ変異体対のあらゆる組み合わせについて、この手順を繰り返した。全抗体収量（μｇ）は、上述のように決定した。各Ｖ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ変異体対の発現結果が、図４に提供されている。簡潔に述べると、図４は、各Ｖ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ変異体対に関する、３０ｍｌの２９３Ｔ培養物からの精製タンパク質のｍｇにおける全収量を示す。精製されたＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ溶離液のＯＤ２８０測定から、抗体タンパク質レベルを計算した。良好なレベルの抗体発現を示した、Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｔ、Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｖ、Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｙ、及びＶ１３３Ｋ／Ｓ１８３ＦなどのＶ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ変異体対を、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体の１つのアームに導入した。Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ発現の初期結果は高くなかったが、Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅもまた、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性抗体との関連で試験した。抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）抗体及び抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）抗体は、次の基準に基づいて選択した：ａ）重鎖と軽鎖との両方が抗原結合に必要とされること；ｂ）成分抗体が十分に発現され、凝集しにくいこと；及びｃ）親抗体が非同族の重鎖／軽鎖対合と比べて同族に対する著しい優先度を示さないこと。「４Ｄ５」は、Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，４２８５−９に記載のヒト化４Ｄ５ｖ８を指す。「ＵＣＨＴ１」は、ＺｈｕａｎｄＣａｒｔｅｒ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５，１９０３−１０に記載のヒト化ＵＣＨＴ１ｖ９を指す。

この実験において、ＵＣＨＴ１重鎖は、ＣＨ３ドメイン内にホール変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を含み、４Ｄ５重鎖は、ＣＨ３ドメイン内にノブ変異（Ｔ３６６Ｗ）を含む。ＵＣＨＴ１アーム内にＶ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ変異を有する４Ｄ５／ＵＣＨＴ１二重特異性抗体を発現させ、精製し、四重極飛行時間型（ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ、ＱＴＯＦ）質量分析によって分析して、精製試料中に存在する抗体種のそれぞれの相対的存在量を数量化した。野生型配列の正確な重鎖／軽鎖対合とスクランブル型重鎖／軽鎖対合（すなわち、ＨＣ１／ＬＣ２及びＨＣ２／ＬＣ１）の不偏期待量は５０％である。以下の表１４Ｃの第１及び第３の横列に示されるように、正確な重鎖／軽鎖対合は、ＵＣＨＴ１アーム内にＶ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅを有する４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体変異形において改善される。

Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｔ、Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｖ、Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｙ、Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ、もしくはＶ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｆ変異対を４Ｄ５アームまたはＵＣＨＴ１アームのいずれかに有する４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体を発現させ、精製し、四重極飛行時間型（ＱＴＯＦ）質量分析によって分析して、精製試料中に存在する抗体種のそれぞれの相対的存在量を数量化した。

４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体の発現、精製、及び分析の前に、以前に説明されている方法を使用して（例えば、Ｂｏｓｅｔａｌ．（２０１４）、上記参照）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクション培養物３０ｍｌを用い、軽鎖比最適化を実施した。２つの抗体重鎖をコードするプラスミドＤＮＡの量は、全トランスフェクションを通じて一定のままであったが、軽鎖ＤＮＡのトランスフェクトされた量は、ある範囲のＬＣ１（ノブ）：ＬＣ２（ホール）ＤＮＡ比にわたって異なった。軽鎖発現のバランスが最適な条件、すなわち、適切にアセンブルされた二重特異性抗体が最も高い割合で産生される条件を特定するために、一過性にトランスフェクトされた培養物の生成物を、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析によって分析した。

高分解能質量分析からの３つのピークの数量化に基づいて、正確に対合した軽鎖を有するＢｓＩｇＧ（すなわち、ＬＣ−１がＨＣ−１と対合しており、ＬＣ−２がＨＣ−２と対合している二重特異性抗体）の量を、２ｘＬＣスクランブル型種（すなわち、ＬＣ−２がＨＣ−１と対合しており、ＬＣ−１がＨＣ−２と対合している二重特異性抗体）と区別するために、数式を展開した。ノブ重鎖（ＨＣ_ノブ）及びホール重鎖（ＨＣ_ホール）のＬＣ対合は完全に独立した事象であると仮定する。正確に対合したＢｓＩｇＧの割合、すなわち％［ＢｓＩｇＧ］は、次のように計算することができる：
％［ＢｓＩｇＧ］＝％［ＢｓＩｇＧと２ｘＬＣスクランブル型との合計］／２＋ＳＱＲＴ（（％［ＢｓＩｇＧと２ｘＬＣスクランブル型との合計］／２）^２−％［２ｘＬＣ_ノブ］^＊％［２ｘＬＣ_ホール］）

（（％［ＢｓＩｇＧと２ｘＬＣスクランブル型との合計］／２）^２−％［２ｘＬＣ_ノブ］^＊％［２ｘＬＣ_ホール］）が負の数である場合、それは強制的にゼロにされ、
％［ＢｓＩｇＧ］＝％［ＢｓＩｇＧと２ｘスクランブル型との合計］／２

したがって、２ｘＬＣスクランブル型種の割合は、次のように計算される：
％［２ｘＬＣスクランブル型］＝％［ＢｓＩｇＧと２ｘＬＣスクランブル型との合計］−％［ＢｓＩｇＧ］

この数学的手法を実験的に確認するため、精製された二重特異性抗体の２つの試料を、質量分析によって分析した。試料１中のＢｓＩｇＧと２ｘＬＣスクランブル型との合計分率は５１．３％であり、試料２中のＢｓＩｇＧと２ｘＬＣスクランブル型との合計分率は７０．６％であった。上記の式を使用して、％［ＢｓＩｇＧ］、％［２ｘＬＣ_ノブ］、％［２ｘＬＣ_ホール］、及び％［２ｘＬＣスクランブル型］の数を決定し（表１０参照）、それらから、各Ｆａｂ種の分率、すなわち％［Ｆａｂ_ノブ］、％［Ｆａｂ_ホール］、％［ＬＣ_ノブ／ＨＣ_ホール］、及び％［ＬＣ_ホール／ＨＣ_ノブ］も計算した（表１１参照）。質量分析による分析の前に、両試料をリジルエンドペプチダーゼで処理した。次に、消化されたＦａｂ種の測定分率を、それらの計算値と比較した。両試料の測定された割合と計算された割合とが厳密に一致したことから、正確に対合したＢｓＩｇＧ種を数量化するための数学的手法が立証された。

表１２中の例示的な結果に示されるように、二重特異性アセンブリの％は、Ｖ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ変異を有しない野生型配列と比較して増加した。二重特異性アセンブリの割合は、Ｖ１３３／Ｓ１８３変異体がＵＣＨＴ１アーム内に存在するときと比較して、Ｖ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ変異体対が４Ｄ５アーム内に存在するときで比較可能であった。このような結果は、適当な二重特異性抗体のアセンブリが、Ｖ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ変異体対が導入されるアームによる著しい影響を受けないことを示唆する。

異なる二重特異性抗体を使用して、上述の実験を繰り返した。異なる二重特異性抗体を使用した結果も、二重特異性抗体のアセンブリが、Ｖ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ変異体対が導入されるアームによる著しい影響を受けないことを示唆する。親抗体が強い優先的な重鎖／軽鎖対合を既に示す場合、さらなる改善は実現または検出が困難であることも観察された。

次に、ＶＨ及びＶＬの非ＣＤＲ領域内のさらなる変異がＨＣとＬＣとの対合をさらに改善させ得るかどうかを検査した。水素結合を形成するフレームワーク領域内のＶＬ−Ｑ３８及びＶＨ−Ｑ３９は、ほとんどの生殖系列で高度に保存されている。荷電残基を、ＩＬ１３抗体のＶＬ−Ｑ３８もしくはＶＨ−Ｑ３９のいずれか、または両方の位置に導入した。ＶＨ／ＶＬ対合を優先するＱ３９Ｘ変異体、Ｑ３８Ｘ変異体、またはＱ３９Ｘ／Ｑ３８Ｘ変異体対を、抗ＩＬ１３抗体における細菌表面提示によって特定した。簡潔に述べると、カナマイシン耐性を治癒させたＥ．ｃｏｌｉ列３３Ｄ３のΔｌｐｐ誘導体において、変異抗体を発現させた（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓｅｔａｌ．（２００２）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ：ｒａｐｉｄａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ．２６３，１３３−１４７を参照されたい）。個々のフレームワーク変異形を３０℃で一晩培養物として成長させ、等しい体積で合わせ、１：１００の希釈度で使用して、５０ｍＬのＣＲＡＰ培養物を播種した。３０℃で２４時間後、１ＯＤのアリコートを採取し、遠心分離（４分、６５００ｒｃｆ）によりペレット化した。２％のＢＳＡ及び５ｍＭのＥＤＴＡを含む１００μＬのＰＢＳ中に細胞を再懸濁させ、４℃で３０分間インキュベートした。初回インキュベーション後、ＳＹＴＯ４１または９の核酸染料（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）を１：１００の最終希釈度まで添加し、Ａｌｅｘａ^４８８またはＡｌｅｘａ^６４７標識抗原を１〜２μＭの最終濃度まで添加した。暗所で１時間にわたり４℃でインキュベーションを継続し、１時間の時点でＭｇＣｌ_２を１０〜２０ｍＭの最終濃度まで添加した。１ｍＬ体積のＰＢＳ＋２０ｍＭＭｇＣｌ_２で３回洗浄することによって、未結合のタンパク質を除去した。染色された細胞をＳＯＣ培地（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）に再懸濁させ、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｅｎｓｏｎＦＡＣＳＡｒｉａＩＩフローサイトメーターを使用した分析のために１×１０^７細胞／ｍｌの最終濃度にした。このＦＡＣＳゲーティング方略には、ＳＹＴＯ染料陽性の細胞が含まれた。二重項弁別ゲート（Ｄｏｕｂｌｅｔｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎｇａｔｅｓ）を使用して二重項を除去し、最後に、抗原に結合する単一細胞の割合を決定するようにゲートを設定した。図５に示されるように、ＶＬ−Ｑ３８置換とＶＨ−Ｑ３９置換との両方を有する変異形の中でも、ＶＬ−Ｑ３８Ｋ／ＶＨ−Ｑ３９Ｅ変異体対が、ＶＬ−Ｑ３８Ｋ／ＶＨ−Ｑ３９Ｋ変異体対よりも高い、最も高いＦＡＣＳシグナルをもたらした（図６参照）。さらに、抗体は、Ｑ３８ＫＶＬ変異をＱ３９ＥＶＨ変異と対合させたときに、野生型と同等かまたはそれよりも良好なレベルまで発現された。図７を参照されたい。Ｑ３８Ｋ／Ｑ３９Ｋの発現がＱ３８Ｋ／野生型対に劣ったことから、正確なＬＣ／ＨＣ対合のための最大の推進力を得るために、ＥＫＫＥ変異（ここでこの４文字は、それぞれ、Ｑ３９Ｘ_ＨＣ１／Ｑ３８Ｘ_ＬＣ１ノブ／Ｑ３９Ｘ_ＨＣ２／Ｑ３８Ｘ_ＬＣ２ホールにおけるアミノ酸置換を指す）を両方のアームに導入することにした。

次に、両重鎖及び両軽鎖内にＱ３９Ｘ／Ｑ３８Ｘ変異を含むように、４Ｄ５／ＵＣＨＴ１二重特異性抗体変異形を構築した。修飾された二重特異性抗体を発現させ、精製し、高分解能質量分析によって分析した。高分解能質量分析は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ技術の向上した検出能力をＥＭＲＥｘａｃｔｉｖｅＰｌｕｓ質量分析器で利用する。定量化のために、マイクロスピンカラム（Ｓｐｉｎ−６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）または逆相オフラインＨＰＬＣを使用して、ＰＢＳ中の抗体生成物を０．１％トリフルオロ酢酸中に緩衝液交換した。結果として得られた試料画分を質量分析器に直接注いだ。電荷内状態（ｉｎｔｒａ−ｃｈａｒｇｅｓｔａｔｅ）の部分の基線分解能を可能にするように、パラメータをＴｕｎｅモードで最適化した。ＰｒｏｔｅｉｎＤｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ、スコアカットオフ５０）を使用して、質量包絡線（Ｍａｓｓｅｎｖｅｌｏｐｅ）をデコンボリュートした。結果として得られるデコンボリュートされたピークの強度を記録し、これを使用して、「正確な」配列、誤対合、半抗体、及びホモ二量体の存在％を判定した。図８の例示的な結果は、適当な重鎖−軽鎖対合を有する「正確な」二重特異性抗体変異形の存在％を示す。試験した変異体がＸ軸上に示されている。変異の各セットにおける４文字は、それぞれ、Ｑ３９Ｘ_ＨＣ１／Ｑ３８Ｘ_ＬＣ１ノブ／Ｑ３９Ｘ_ＨＣ２／Ｑ３８Ｘ_ＬＣ２ホールにおけるアミノ酸置換を指す。図８に示される数量化結果が、以下の表１３に提供される。これらの実験において、４Ｄ５抗体はノブ変異を保有し、ＵＣＨＴ１抗体はホール変異を保有した。これらの結果は、ＥＫＫＥに加えて、Ｑ３９／Ｑ３８における他の変異も、正確な重鎖／軽鎖対合を改善させたことを示す。

ＶＬ−Ｑ３８ＶＨ−Ｑ３９変異を４Ｄ５／ＵＣＨＴ１二重特異性抗体に導入した。４Ｄ５アームが、Ｑ３９Ｅ変異を有するＶＨ及びＱ３８Ｋ変異を有するＶＬを含むように、かつ、ＵＣＨＴ１アームが、Ｑ３９Ｋ変異を有するＶＨ及びＱ３８Ｅ変異を有するＶＬを含むように（すなわち、ＥＫＫＥ）、４Ｄ５／ＵＣＨＴ１二重特異性抗体を修飾した。この実験において、４Ｄ５抗体は、ＣＨ３ドメイン内にノブ変異を含み、ＵＣＨＴ１抗体は、ＣＨ３ドメイン内にホール変異を含む。図９に示されるＱＴＯＦ分析において、重鎖−軽鎖の誤対合は、野生型二重特異性抗体（図９Ａ参照）と比較して、修飾抗体で著しく低減した（図９Ｂ参照）。以下の表１５により提供される例示的な結果にさらに示されるように、Ｑ３８／Ｑ３９変異は、単一細胞で産生された二重特異性ＩｇＧの％を改善させた。

ＶＬ−Ｑ３８Ｅ変異及びＶＨ−Ｑ３９Ｋ変異を既に含んでいた二重特異性４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体のＵＣＨＴ１アームを、ＣＬ−Ｖ１３３Ｋ変異及びＣＨ−１−Ｓ１８３Ｅ変異を含むようにさらに修飾した。４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体の４Ｄ５アームは、ＶＬ−Ｑ３８Ｋ変異及びＶＨ−Ｑ３９Ｅ変異を含むように修飾した。修飾された二重特異性抗体を発現させ、精製し、高分解能質量分析によって分析した。高分解能質量分析は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ技術の向上した検出能力をＥＭＲＥｘａｃｔｉｖｅＰｌｕｓ質量分析器で利用する。定量化のために、マイクロスピンカラム（Ｓｐｉｎ−６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）または逆相オフラインＨＰＬＣを使用して、ＰＢＳ中の抗体生成物を０．１％トリフルオロ酢酸中に緩衝液交換した。結果として得られた試料画分を質量分析器に直接注いだ。電荷内状態の部分の基線分解能を可能にするように、パラメータをＴｕｎｅモードで最適化した。ＰｒｏｔｅｉｎＤｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ、スコアカットオフ５０）を使用して、質量包絡線をデコンボリュートした。結果として得られるデコンボリュートされたピークの強度を記録し、これを使用して、「正確な」配列、誤対合、半抗体、及びホモ二量体の例示的な存在％を判定した。図１０Ｂの拡大版を示す図１０Ａに示されるように、正確に対合した重鎖／軽鎖アームを含んだ抗体種が、試料中の主集団であった。（数量化結果については、以下の表１４Ｃ中の第４の横列を参照されたい。）ＥＫＫＥ変異を有せずにＵＣＨＴ１アーム内にＣＬ−Ｖ１３３Ｋ変異及びＣＨ−１−Ｓ１８３Ｅ変異を含むように修飾された二重特異性４Ｄ５／ＵＣＨＴ１を使用して、同じ実験を行った。図１０Ｄの拡大版を示す図１０Ｃに示されるように、２つの４Ｄ５軽鎖または２つのＵＣＨＴ１軽鎖を含む種（すなわち、誤対合した二重特異性抗体）が、試料中の主集団であった。（数量化結果については、以下の表１４Ｃ中の第３の横列を参照されたい。）図１０Ｅは、未修飾の野生型４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体の高分解能質量分析結果を提供し、同様に、２つの４Ｄ５軽鎖または２つのＵＣＨＴ１軽鎖を含む種（すなわち、誤対合した二重特異性抗体）が、試料中の主集団であったことを示す。これらの結果は、二重特異性抗体のホールアーム上のＶ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ変異対が重鎖／軽鎖の誤対合を低減させ、ＥＫＫＥ変異の追加が二重特異性アセンブリをさらに改善させたことを示す。

両方のアームにＱ３９Ｘ／Ｑ３８Ｘ変異及び／またはＶ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ変異を有する変異形を含め、さらなる二重特異性抗体を生成し、発現させ、精製し、上述のように高分解能質量分析によって分析して、かかる二重特異性抗体が優先的な重鎖／軽鎖対合の増加を示すかどうかを判定した。高分解能質量分析の例示的な結果が、以下の表１４Ａ及び１４Ｂに提供される。

ノブアーム及び／またはホールアームへのＱ３９Ｘ／Ｑ３８Ｘの導入、及び／またはホールアームへのＶ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ変異の導入を、様々な二重特異性抗体で行った。４文字の変異は、それぞれ、Ｑ３９Ｘ_ＨＣ１／Ｑ３８Ｘ_ＬＣ１ノブ／Ｑ３９Ｘ_ＨＣ２／Ｑ３８Ｘ_ＬＣ２ホールにおけるアミノ酸置換を指す。代表的な結果は、ＥＫＫＥ及びＶ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ変異（Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅを使用して表１４Ｃに例示されている）が、単独または組み合わせで、異なる抗体における二重特異性アセンブリを概して改善させたことを示す。親抗体が強い優先的な重鎖／軽鎖対合を既に示す実施例では、さらなる改善は実現または検出が困難である。Ｖ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ変異も二重特異性抗体のノブアームに導入したところ、比較可能な結果が示された。

^＃抗ＶＥＧＦＡ／ＡＮＧ２試料において、正確にアセンブルされた二重特異性抗体（Ａｂ）、「２ｘホールＬＣ」抗体、及び「２Ｘノブ」抗体の分子量は酷似している。「正確な」集団を「２ｘホールＬＣ」集団及び「２Ｘノブ」集団と区別するために、Ｏｒｂｉｔｒａｐ分解能を増加させ、したがって感度をわずかに減少させた。したがって、１００％正確な対合は＞９５％に近くなると考えられる。
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Ｑ３９Ｅ_ＨＣ１／Ｑ３８Ｋ_ＬＣ１ノブ／Ｑ３９Ｋ_ＨＣ２／Ｑ３８Ｅ_ＬＣ２ホール及びＶ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅホール変異を含む抗ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体を、Ｖ１３３Ｅ／Ｓ１８３Ｋノブ変異を含むようにさらに修飾した。この抗体を発現させ、精製し、上述のように高分解能質量分析によって分析して、かかる二重特異性抗体が優先的な重鎖／軽鎖対合の増加を示すかどうかを判定した。高分解能質量分析の例示的な結果が、以下の表１４Ｄに提供される。

表１４Ｄ中の例示的な結果は、ＥＫＫＥ及びＶ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅホール変異と組み合わせたＶ１３３Ｅ／Ｓ１８３Ｋノブ変異が、二重特異性アセンブリをほぼ１００％まで改善させたことを示す。

インビトロ細胞傷害アッセイにおいて、ＥＫＫＥ及びＶ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅホール変異を有する抗ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体の活性を、未修飾の抗ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体の活性と比較した。簡潔に述べると、リンパ球分離培地（ＭＰｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）を使用して、健康な献血者の血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離させた。ＭｉｌｔｅｎｙｉのヒトＣＤ８＋単離キット（＃１３０−０９４−１５６）を使用し、ＣＤ８＋細胞を負の選択によってＰＢＭＣから抽出した。１×１０^４個のＰＢＭＣ細胞を９６ウェルプレート上にプレーティングし、一晩インキュベートした。５×１０^４個のＣＤ８＋Ｔ細胞を、（ａ）ＥＫＫＥ及びＶ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅホール変異を有する抗ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体あり、（ｂ）ＥＫＫＥ及びＶ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅホール変異を有する抗ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体なし、（ｃ）未修飾の抗ＨＥＲ２／ＣＤ３あり、及び（ｄ）未修飾の抗ＨＥＲ２／ＣＤ３なしで添加した。これらの混合物を、４８時間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄することによって、Ｔ細胞を除去した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、ＰＢＭＣの生存率を測定した。図２３に示されるように、修飾された抗ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体と未修飾の抗ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体との活性は、比較可能であった。

示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）を行って、（ａ）ＶＬ−Ｑ３８Ｋ及びＶＨ−Ｑ３９Ｅ変異を含むように修飾された４Ｄ５Ｆａｂ、（ｂ）ＶＬ−Ｑ３８Ｅ、ＣＬ−Ｖ１３３Ｋ、ＶＨ−Ｑ３９Ｋ、及びＣＨ−１Ｓ１８３Ｅ変異を含むように修飾されたＵＣＨＴ１Ｆａｂ、ならびに（ｃ）ＶＬ−Ｑ３８Ｅ、ＣＬ−Ｖ１３３Ｋ、ＶＨ−Ｑ３９Ｋ、及びＣＨ−１Ｓ１８３Ｔ変異を含むように修飾されたＵＣＨＴ１アームの溶融温度を判定した（例えば、Ｎｉｅｓｅｎｅｔａｌ．（２００７）ＮａｔＰｒｏｔｏｃ２，２２１２−２２２１を参照されたい。）１：５００の最終希釈度のＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅ染料ストック（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）を用い、ＢｉｏｒａｄＣＦＸ９６リアルタイムシステム（Ｂｉｏｒａｄ，ＵＳＡ）において、タンパク質安定性を判定した。ＰＢＳ中の２５μＬのＦａｂ試料の蛍光を２０〜１００℃で記録した（０．２℃の増分、ステップごとに１０秒の保持）。以下の表１５に示される結果は、本明細書に記載の可変領域及び／または定常領域に導入された変異が、抗体のＴｍに大きく影響しないことを示す。

表１５に示される結果に基づくと、試験した変異形の熱安定性は、主にＨＣの安定性によって推進されているようである。安定性は二重特異性対合の改善の説明となり得るが、このデータは、予想外なことに、最大の二重特異性対合を示す変異形が最大の熱安定性と必ずしも相関するとは限らないこと、例えば、適切に対合したＦａｂが、誤対合したＦａｂと比較して低いかまたはそれと同様の熱安定性を示す場合があることを示す。特定の機序（複数可）に束縛されるものではないが、変異は、代替的または追加的に、適当な対のアセンブリ動態に影響する場合があり、例えば、適当な対がより速くアセンブルし、重鎖と軽鎖との間のジスルフィド形成が続く場合がある。これは、鎖比最適化が二重特異性形成をさらに改善させたという観察によってさらに支持される。

Ｑ３９Ｅ_ＨＣ１／Ｑ３８Ｋ_ＬＣ１ノブ／Ｑ３９Ｋ_ＨＣ２／Ｑ３８Ｅ_ＬＣ２ホール変異及びＶ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅホール変異を、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ、ヒトＩｇＧ２アイソタイプ、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ、及びマウスＩｇＧ２ａアイソタイプの二重特異性抗４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体に導入した。ヒトＩｇＧ２アイソタイプの抗体は、インビトロでのアセンブリに成功することが観察されていない。以下の表１６中の例示的な結果は、軽鎖及び重鎖の可変ドメイン内の変異が、マウス二重特異性抗体においてだけではなく、異なるアイソタイプのヒト二重特異性抗体においても、二重特異性アセンブリを概して改善させたことを示す。

^＊結果は、最適化されたＬＣ１：ＬＣ２比を使用して得られた
†全ピークに関する期待値から−１１０Ｄａの性質不明の質量差。
^＃全ピークに関する期待値から＋１６０Ｄａの性質不明の質量差。

ＶＬ−Ｑ３８Ｋ変異、ＣＬ−Ｖ１３３Ｅ変異、ＶＨ−Ｑ３９Ｅ変異、及びＣＨ１−Ｓ１８３Ｋ変異を含むように修飾された４Ｄ５Ｆａｂの結晶構造を、１．６３Åの分解能まで判定した。変異体の全体構造は野生型４Ｄ５Ｆａｂと比較した有意差を示さず、４つのドメインの全てに導入された電荷変異が構造的整合性を撹乱させないことが示される。図１１Ａを参照されたい。しかしながら、変異残基ＶＬ−Ｑ３８ＫとＶＨ−Ｑ３９Ｅとの間の塩橋に加えて、ＶＬ−Ｑ３８ＫとＶＨ−Ｑ３９Ｅとの両方が、２個の溶媒水分子と余分な水素結合を形成することが見出された。ＶＬ−Ｑ３８Ｋはまた、それぞれ、水素結合でＶＨ−Ｙ９５及びＶＬ−Ｋ３９と相互作用することが見出された。大規模な水素結合ネットワークは、変異したＶＬとＶＨとの間の対合を安定化させる。図１１Ｂを参照されたい。ＣＬ−Ｖ１３３Ｅ変異及びＣＨ１−Ｓ１８３Ｋ変異を含む定常ドメインにおいて、変異残基ＣＬ−Ｖ１３３ＥとＣＨ１−Ｓ１８３Ｋとの間の塩橋に加えて、ＣＬ−Ｖ１３３ＥとＣＨ１−Ｓ１８３Ｋとの両方が、３個の溶媒水分子と余分な水素結合を形成する。ＣＬ−Ｖ１３３Ｅ及びＣＨ１−Ｓ１８３Ｋはまた、それぞれ、水素結合でＶＬ−Ｔ１７８と相互作用する。予想外の大規模な水素結合ネットワークは、変異したＣＬとＣＨ１との間の対合を安定化させ、これが、正確に対合したＢｓＩｇＧの産生を促進する。図１１Ｃを参照されたい。

ＶＬ−Ｑ３８Ｅ変異、ＣＬ−Ｖ１３３Ｋ変異、ＶＨ−Ｑ３９Ｋ変異、及びＣＨ１−Ｓ１８３Ｅ変異を含むように修正された４Ｄ５の結晶構造を、１．６１Åの分解能まで判定した。変異体の全体構造は野生型４Ｄ５Ｆａｂと比較した有意差を示さず、４つのドメインの全てに導入された電荷変異が構造的整合性を撹乱させないことが示される。図１２Ａを参照されたい。ＶＬ−Ｑ３８Ｅ及びＶＨ−Ｑ３９Ｋは水素結合を形成しないことが見出された。しかしながら、ＶＬ−Ｑ３８Ｅは、２個の溶媒水分子と水素結合を形成する。図１２Ｂを参照されたい。ＣＬ−Ｖ１３３Ｋ変異及びＣＨ１−Ｓ１８３Ｅ変異を含む定常ドメインにおいて、変異残基ＣＬ−Ｖ１３３ＫとＣＨ１−Ｓ１８３Ｅとの間の塩橋に加えて、ＣＬ−Ｖ１３３ＫとＣＨ１−Ｓ１８３Ｅとの両方が、それぞれ、２個の溶媒水分子と余分な水素結合を形成する。ＣＬ−Ｖ１３３Ｋはまた、ＣＬ−Ｔ１７８と水素結合を形成し、ＣＨ１−Ｓ１８３Ｅは、ＶＬ−Ｔ７６と水素結合を形成する。予想外の大規模な水素結合ネットワークは、変異したＣＬとＣＨ１との間の対合を安定化させ、これが、正確に対合したＢｓＩｇＧの産生を促進する。図１２Ｃを参照されたい。

要約すると、ＣＬのＶ１３３における変異が、野生型重鎖と対合した場合に、抗体アセンブリを低減させたことが見出された。しかしながら、ＣＨ１のＳ１８３位におけるアミノ酸置換は、ＣＬのＶ１３３位における変異と対合した場合に、抗体変異形のアセンブリを回復させた。したがって、Ｖ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ変異対は、単一細胞内で発現されたときに、特異的なＬＣとＨＣとの対合を誘導することができる。ＶＨのＱ３９位及びＶＬのＱ３８位における変異は、単独またはＣＨ１／ＣＬ変異との組み合わせで、二重特異性抗体との関連でＬＣとＨＣとの対合をさらに改善させ、ひいてはそれに対応して、２つの半抗体が単一細胞内で発現されたときに正確な二重特異性形成を改善させた。経験的に決定された、最適化された軽鎖比は、二重特異性アセンブリをさらに改善させた。ＶＨのＱ３９位及びＶＬのＱ３８位における変異は、単独またはＣＨ１／ＣＬ変異との組み合わせで、試験したヒト及びマウス抗体アイソタイプの全てにおいて、二重特異性アセンブリをさらに改善させた。予想外なことに、重鎖または軽鎖の可変領域及び定常領域内の変異は、単独または組み合わせで、抗体の熱安定性に大きく影響しない。

実施例２：方略番号２を使用した抗体重鎖／軽鎖対の操作
加えて、分子モデリングプログラムＲＯＳＥＴＴＡ（Ｌｅａｖｅｒ−Ｆａｙｅｔａｌ．（２０１１）“ＲＯＳＥＴＴＡ３：ａｎｏｂｊｅｃｔ−ｏｒｉｅｎｔｅｄｓｏｆｔｗａｒｅｓｕｉｔｅｆｏｒｔｈｅｓｉｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄｄｅｓｉｇｎｏｆｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．”ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．４８７，５４５−７４）を使用して、例示的な二重特異性抗体４Ｄ５のＣＨ１−ＣＬ界面を計算的に再設計した。ＲＯＳＥＴＴＡプログラムは、活発に開発されており、絶えず更新されている。簡潔に述べると、ＲＯＳＥＴＴＡプログラムは、所与の設計手法に合わせて指定されたユーザ入力によるレパートリーからランダム配列を生成する。以下に詳細に記載されるように、２つの設計手法を行った。

第１の設計手法（すなわち、手法Ａ、図１３Ａ参照）では、ＣＬドメインのＳ１７６アミノ酸残基を、Ｆ、Ｙ、またはＷのいずれか１つに制限し、ＣＨ１ドメインのＦ１７０アミノ酸残基を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶのいずれか１つに制限した。残基同一性を保存しつつ最適化するために、ＣＬドメインのＦ１１８アミノ酸残基を、Ｆ、Ｙ、またはＷのいずれか１つに制限し、ＣＨ１ドメインのＦ１２６アミノ酸残基を、Ｆ、Ｙ、またはＷのいずれか１つに制限し、ＣＨ１のＳ１８３アミノ酸残基を、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶのいずれか１つに制限した。ＣＬドメインのＦ１１６、Ｖ１３３、Ｌ１３５、Ｓ１７４アミノ酸残基、及びＣＨ１ドメインのＬ１２８、Ｇ１４３、Ｌ１４５、Ｓ１８１アミノ酸残基は、非極性アミノ酸に制限した。ＣＬドメインのＳ１３１、Ｓ１６２、Ｔ１６４、Ｔ１７８、及びＣＨ１ドメインのＡ１４１、Ｖ１８５などの他の残基は、システイン以外の任意のアミノ酸として再設計されることを許可した。

第２の設計手法（すなわち、手法Ｂ、図１３Ｂ参照）では、ＣＬドメインのＬ１３５アミノ酸残基及びＣＨ１ドメインのＬ１２８アミノ酸残基を、Ｆ、Ｙ、またはＷのいずれか１つに制限し、ＣＬドメインのＦ１１８アミノ酸残基及びＣＨ１ドメインのＬ１４５アミノ酸残基を、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶのいずれか１つに制限した。ＣＨ１ドメインのＳ１８１アミノ酸残基も、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、またはＶのいずれか１つに制限した。加えて、ＣＬドメインのＦ１１６アミノ酸残基を、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹのうちの１つに制限し、ＣＬドメインのＶ１３３アミノ酸残基を、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹのいずれか１つに制限し、ＣＨ１ドメインのＶ１８５アミノ酸残基を、非極性アミノ酸に制限した。ＣＬドメインのＳ１３１、Ｓ１６２、Ｔ１６４、Ｓ１７６、及びＴ１７８アミノ酸残基、ならびにＣＨ１ドメインのＡ１４１及びＦ１７０アミノ酸残基は、システイン以外の任意のアミノ酸として再設計されることを許可した。

ＲＯＳＥＴＴＡは、再設計されたＣＨ１ドメイン及び再設計されたＣＬドメイン（Ｈ’Ｌ’）、野生型ＣＨ１ドメイン及び再設計されたＣＬドメイン（ＨＬ’）、ならびに再設計されたＣＨ１ドメイン及び野生型ＣＬドメイン（Ｈ’Ｌ）を含むモデル化構造の、複数の結合エネルギースコアを計算した。その後、Ｈ’Ｌ’と、ＨＬ’とＨ’Ｌとの間のより安定な対との間のエネルギー差として、コントラストスコアを計算する。次に、好ましくない結合エネルギースコア及びコントラストスコアを有する配列を破棄するために、設計された配列全てを定義済みフィルタにかけた。

Ｓｃｏｒｅ１２及びＴａｌａｒｉｓは、ＲＯＳＥＴＴＡにより採用されている２つのスコアリング関数である。両方を使用して、上述の設計手法を分析した。ｓｃｏｒｅ１２については、１，０００個のＣＰＵコアを用いて１０週間にわたり、手法Ａ及び手法Ｂを行った。以下の表１７に示されるように、手法Ａは、２７５個のユニーク配列を含む３６，８３１個の全アウトプットを返し、手法Ｂは、１８４個のユニーク配列を含む３，４６４個の全アウトプットを返した。Ｔａｌａｒｉｓについては、１，０００個のＣＰＵコアを用いて５週間にわたり、両方の設計手法を行った。手法Ａは、１１０個のユニーク配列を含む３３，２８６個の全アウトプットを返し、手法Ｂは、４７個のユニーク配列を含む１，２５３個の全アウトプットを返した。以下の表１７を参照されたい。遺伝子の合成及び評価のために、１８２個の配列を選択した。

^＊１０００個のＣＰＵコア

配列のエネルギースコアに基づいて候補配列を選択したことに加えて、全６１６個のユニークアウトプット配列の系統樹を生成した。系統樹の各枝は、ＣＨ１／ＣＬ対合解（ｐａｉｒｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ）の種類を表すものと見なした。この計算プログラムは、コントラストエネルギー（誤対合に対する正確な対合の選択性）を予測するほど十分に的確ではない可能性があるため、各系統の枝から少なくとも１つの配列を選択することにより、全てのアウトプットの良好なサンプリングを行うことができた。実際、以下により詳細に記載されるＹＴ６５及びＪＳ７８などの最終候補は、それらの比較的弱いコントラストエネルギーにも関わらず、系統学的分析によるとそれらの配列がその他と明確に異なったために選ばれた。

方略番号２を使用して生成された、４Ｄ５ＣＬ／ＣＨ１変異形の選ばれたアウトプット配列を合成した。軽鎖変異形は、ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片として発現ベクターｐＲＫ５ｈｕ４Ｄ５−８Ｌ鎖（Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．（１９９２）“Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎａｎｔｉ−ｐ１８５ＨＥＲ２ａｎｔｉｂｏｄｙｆｏｒｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，４２８５−９）にクローニングし、重鎖変異形は、ＡｐａＩ／ＮｄｅＩ断片として発現ベクターｐＲＫ５ｈｕ４Ｄ５−８Ｈ鎖にクローニングした。重鎖のＦｃ領域は、哺乳動物細胞内での非グリコシル化ＩｇＧ産生のためのグリコシル化部位（Ｎ２９７Ｇ）における変異、及びＣ末端リジンにおける欠失（ΔＫ４４７）を保有した。これらの２個の変異は、精製後の酵素的処理を伴わない容易な質量分析に基づく数量化のための均一なＩｇＧの質量をもたらした。試験対の軽鎖または重鎖遺伝子をそれぞれが保有する４つのプラスミドを、ＨＥＫ２３９Ｔ細胞（１ｍｌの培養物、９６ウェルのディープウェルプレート）にコトランスフェクトすることによって、パートナー抗体であるＵＣＨＴ１．ｖ９を用いた、方略番号２の変異形のＢｓＩｇＧの単一細胞での産生を実施した。抗体発現は、３７℃で勢いよく振盪しながら７日間にわたって実施した。培養上清を収集し、３００μｌ（５０：５０スラリー）のＭａｂｓｅｌｅｃｔＳｕｒｅ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に一晩インキュベートした。次にこの樹脂をフィルタプレートに移し、２０倍体積の樹脂ベッドで洗浄した。結合した材料を５０ｍＭのリン酸（ｐＨ３．０）で溶離させ、２０×ＰＢＳ（ｐＨ１１．０）で中和した（１：２０）。ＩｇＧタンパク質をフィルタ（０．２２μｍ）滅菌した。試験した方略番号２の変異形それぞれのＩｇＧ収率は、野生型と比較可能であった。

図１４に図示されるサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを行って、単一細胞共発現からの二重特異性ＩｇＧ含有量を決定した。まず、方略番号２の変異形に対するベンチマークとしてサンドイッチＥＬＩＳＡに使用した二重特異性ＩｇＧ（ＢｓＩｇＧ）標準は、「ノブ」アームとしてのヒト化抗ＨＥＲ２（４Ｄ５）と、「ホール」アームとしての抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１．ｖ９）とから構成されていた（Ｚｈｕｅｔａｌ．（１９９５）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｈｅａｖｙｃｈａｉｎｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎａｈｕｍａｎｉｚｅｄａｎｔｉ−ＣＤ３ａｎｔｉｂｏｄｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｔｉｇｅｎｂｉｎｄｉｎｇａｎｄＴｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５，１９０３−１０）。このＢｓＩｇＧ標準は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で各アームを別々に発現させ、次にそれらをインビトロでアニーリングすることによって生成した（Ｓｃｈａｔｚｅｔａｌ．（２０１３）“Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｌｉｎｅｓｒｅｖｅａｌｓｔｈａｔａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｓｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｆｏｒｆｕｌｌａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．”ＭＡｂｓ５，８７２−８８１）。図１４に示されるように、両方の抗原に対する二重特異性抗体の結合が、サンドイッチＥＬＩＳＡシグナルの生成に必要とされる。次に、ＥＬＩＳＡシグナル強度を、ＢｓＩｇＧ標準（インビトロでアセンブルされたもの）のシグナル強度に対するベンチマークテストにかけ（ｂｅｎｃｈｍａｒｋｅｄ）、混合物中のＢｓＩｇＧ含有量を決定した。

簡潔に述べると、ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）をＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのＨＥＲ２−ＥＣＤ抗原でコーティングし、一晩４℃に保った。次に、抗原でコーティングされたプレートを、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴ（１×ＰＢＳに加えて０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で１時間ブロッキングした。被験試料を別々の９６ウェルプレート内で同じブロッキング緩衝液中に希釈し、１時間室温に保った。ブロッキングされた試料を、ＨＥＲ２でコーティングされた（ブロッキングされた）プレートに移し（１００μｌ／ウェル）、２時間室温でインキュベートした。このプレートをＰＢＳＴで１５回洗浄した。次に、第２の抗原であるＣＤ３−ビオチンを、１００μｌ／ウェル（ブロッキング緩衝液中０．５μｇ／ｍｌのＣＤ３−ビオチン）でプレートに加え、２時間室温でインキュベートした。このプレートをＰＢＳＴで１５回洗浄した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を、１００μｌ／ウェル（０．１μｇ／ｍｌ）で添加し、３０分間室温でインキュベートした。このプレートをＰＢＳＴで１５回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ基質、ＳｕｒｅｂｌｕｅＲｅｓｅｒｖｅＴＭＢ溶液（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を、１００μｌ／ウェルで添加した。等体積の１．０Ｍリン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）の添加によって、発色を停止させた。次に、このプレートをＯＤ_４５０で読み取った。図１５に示されるように、４Ｄ５アーム内にＪＳ２０変異、ＪＳ７８変異、ＹＳ１８変異、及びＹＴ６５変異を有する変異形は、配列修飾による影響を受けていない野生型配列の正確な重鎖／軽鎖対合の不偏期待量である２５％の二重特異性アセンブリ標準を超える、優先的な重鎖／軽鎖対合の増加を示した。

４Ｄ５．ＵＣＨＴ１二重特異性抗体について上述のように、軽鎖ＤＮＡ比及び重鎖ＤＮＡ比を最適化した。以下の表１８に提供される例示的な結果に示されるように、軽鎖比及び重鎖比の最適化は、４Ｄ５．ＵＣＨＴ１抗体の二重特異性抗体形成を改善させた。ＬＣ_ノブ：ＬＣ_ホール：ＨＣ_ノブ：ＨＣ_ホールについて１：１．４：１：１のＤＮＡ比を、後述のさらなる実験で使用した。

^＊ＬＣ_ノブ：ＬＣ_ホール：ＨＣ_ノブ：ＨＣ_ホール
次の変異形抗体を発現させ、軽鎖比の最適化及び重鎖比の最適化の後に精製した：全てＥＫＫＥ（４Ｄ５ノブ、Ｑ３９Ｅ／Ｑ３８Ｋ；ＵＣＨＴ１ホール、Ｑ３９Ｋ／Ｑ３８Ｅ）との関連での、４Ｄ５．ＵＣＨＴ１二重特異性と比較した場合の４Ｄ５．ＵＣＨＴ１．ＪＳ２０、４Ｄ５．ＵＣＨＴ１．ＪＳ７８、４Ｄ５．ＵＣＨＴ１．ＪＴ２５、４Ｄ５．ＵＣＨＴ１．ＹＳ０８、４Ｄ５．ＵＣＨＴ１．ＹＳ１８、及び４Ｄ５．ＵＣＨＴ１．ＹＴ６５。ＪＳ７８、ＪＴ２５、ＹＳ０８、ＹＳ１８、及びＹＴ６５変異は、各変異形の４Ｄ５アームに存在した。各変異形により産生された二重特異性抗体の割合を質量分析によって数量化した。これを以下の表１９に示す。

Ｓ２０、ＪＳ７８、ＹＳ１８、ならびにＹＴ６５重鎖のＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインの部分配列が図１６Ａに示され、Ｓ２０、ＪＳ７８、ＹＳ１８、ならびにＹＴ６５軽鎖のＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインの部分配列が図１６Ｂに示されている。

サンドイッチＥＬＩＳＡの結果を、高分解能質量分析によって確認した。高分解能質量分析は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ技術の向上した検出能力をＥＭＲＥｘａｃｔｉｖｅＰｌｕｓ質量分析器で利用する。定量化のために、マイクロスピンカラム（Ｓｐｉｎ−６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）または逆相オフラインＨＰＬＣを使用して、ＰＢＳ中の抗体生成物を０．１％トリフルオロ酢酸中に緩衝液交換した。結果として得られた試料画分を質量分析器に直接注いだ。電荷内状態の部分の基線分解能を可能にするように、パラメータをＴｕｎｅモードで最適化した。ＰｒｏｔｅｉｎＤｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ、スコアカットオフ５０）を使用して、質量包絡線をデコンボリュートした。結果として得られるデコンボリュートされたピークの強度を記録し、これを使用して、「正確な」配列、誤対合、半抗体、及びホモ二量体の存在％を判定した。図１７及び１８の例示的な結果を参照されたい。図１７Ａ及び１８Ａは、野生型４Ｄ５／ＵＣＨＴ１二重特異性抗体に行った質量分析の結果を示し、図１７Ｂ及び１８Ｂは、４Ｄ５アーム上のＹＴ６５ＣＨ１／ＣＬ変異及びＶＨ−Ｑ３９Ｅ／ＶＬ−Ｑ３８Ｋ変異、ならびにＵＣＨＴ１アーム上のＶＨ−Ｑ３９Ｋ／ＶＬ−Ｑ３８Ｅ変異（「ＥＫＫＥ」）を含む、４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体に行った質量分析の結果を示す。これらの例示的な結果は以下の表２０に数量化されており、ＶＨ／ＶＬ変異及びＣＨ１／ＣＬ変異は、単独または組み合わせで、４Ｄ５／ＵＣＨＴ１ｖ．９二重特異性における正確な重鎖／軽鎖対合をさらに改善させた。

図１６Ａ及び１６Ｂに示されるように、ＹＴ６５重鎖配列及び軽鎖配列のそれぞれは、５個のアミノ酸置換を含む。ＹＴ６５重鎖及び軽鎖を、１つ以上の位置における野生型アミノ酸を回復させるようにさらに修飾して、正確な重鎖／軽鎖対合を推進するのに必要とされる変異の最小数を決定した。「復帰変異した（ｂａｃｋ−ｍｕｔａｔｅｄ）」ＹＴ６５重鎖及び軽鎖変異形のアミノ酸配列が、図１９Ａ及び１９Ｂに提供されている。高分解能質量分析をＹＴ６５復帰変異変異形にも行って、かかる変異形が優先的な重鎖／軽鎖対合の増加を同様に示すかどうかを判定した。以下の表２１に提供される例示的な結果に示されるように、試験した全ての復帰変異変異形が、二重特異性抗体との関連でＬＣとＨＣとの対合の改善を示し、ひいてはそれに従って、２つの半抗体が単一細胞内で発現されたときに正確な二重特異性形成を改善させた。

中性ｐＨ条件下での修飾された二重特異性試料の複雑性の定性的検査を、未変性質量分析によって行った。未変性ＭＳは、抗体多量体及び他の形態の凝集物（すなわち、半抗体−単量体相互作用）に関する情報を提供する。ＳＥＣＨＰＬＣまたはスピンカラムを使用して、試料を１０ｍＭ酢酸アンモニウム中に緩衝液交換し、直接注入によってＥＭＲＭＳ内に電離させた。１０のスコアカットオフでＰｒｏｔｅｉｎＤｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎソフトウェアを使用し、分析を行った。図２０Ａに示されるように、４Ｄ５アーム上のＹＴ６５ＣＨ１／ＣＬ変異ならびにＶＬ−Ｑ３８Ｋ変異及びＶＨ−Ｑ３９Ｅ変異と、ＵＣＨＴ１アーム上のＶＬ−Ｑ３８Ｅ変異及びＶＨ−Ｑ３９Ｋ変異とを含む４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体は、正確な重鎖／軽鎖対合の増加を示した。アッセイの感度及び検出限界を決定するため、かつ二重特異性抗体、２ｘＬＣノブ抗体、及び２ＸＬＣホール抗体種の数量化を補助するために、ＵＣＨＴ１抗体を試料中に混ぜた。図２０Ａは、２ｘＬＣノブ抗体及び２ＸＬＣホール抗体種の数量化限界が２．８％未満であることを示す。

図２０Ｂは、図２０Ａのデータを得るために使用した分析の検出感度を確認する。図２０Ｂ中、１００％正確に対合したＨＥＲ２／ＵＣＨＴ１を含む試料（すなわち、ＨＥＲ２ＬＣ／ＨＥＲ２ＨＣ／ＵＣＨＴ１ＨＣ／ＵＣＨＴ１ＬＣ、中央のピーク）に、２つのＨＥＲ２ＬＣを含む誤対合ＨＥＲ２／ＵＣＨＴ１（すなわち、ＨＥＲ２ＬＣ／ＨＥＲ２ＨＣ／ＵＣＨＴ１ＨＣ／ＨＥＲ２ＬＣ、左のピーク）と、２つのＵＣＨＴ１ＬＣを含む誤対合ＨＥＲ２／ＵＣＨＴ１（すなわち、ＵＣＨＴ１ＬＣ／ＨＥＲ２ＨＣ／ＵＣＨＴ１ＨＣ／ＵＣＨＴ１ＬＣ、右のピーク）との両方を、図２０Ｂの左に示されるように、減少する比で混ぜた。図２０Ｂの右に示される測定比は、試料中の種のそれぞれの実際の比と測定比との間に非常にわずかな差しかないことを示す。
実施例３：抗体変異形と野生型抗体とのＴｍ及びＫ_Ｄの比較
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を行って、（ａ）ＶＨ内のＱ３９Ｅ及びＶＬ内のＱ３８Ｋ、（ｂ）ＣＨ１内のＳ１８３Ｋ及びＣＬ内のＶ１３３Ｅ、（ｃ）ＶＨ内のＱ３９Ｅ、ＶＬ内のＱ３８Ｋ、ＣＨ１内のＳ１８３Ｋ、及びＣＬ内のＶ１３３Ｅ、（ｄ）ＶＨ内のＱ３９Ｋ及びＶＬ内のＱ３８Ｅ、（ｅ）ＣＨ１内のＳ１８３Ｅ及びＣＬ内のＶ１３３Ｋ、（ｆ）ＶＨ内のＱ３９Ｋ、ＶＬ内のＱ３８Ｅ、ＣＨ１内のＳ１８３Ｅ、及びＣＬ内のＶ１３３Ｋ、（ｇ）ＣＨ１及びＣＬ内のＹＴ６５変異、または（ｈ）ＶＨ内のＱ３９Ｅ及びＶＬ内のＱ３８ＫならびにＣＨ１及びＣＬ内のＹＴ６５変異を含むように修飾された、４Ｄ５Ｆａｂの溶融温度を判定した（ｓｅｅＩｏｎｅｓｃｕｅｔａｌ．（２００８）ＪＰｈａｒｍＳｃｉ９７，１４１４−１４２６）。並行して、変異を含まない４Ｄ５にＤＳＣを行った。以下の表２２−１に示される例示的な結果は、本明細書に記載の可変領域及び／または定常領域に導入された変異が、抗体のＴｍに大きく影響しないことを示す。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を行って、ＨＥＲ２に対する上述の４Ｄ５変異形の結合親和性を計算した。以下の表２２−２に示される結果は、本明細書に記載の可変領域及び／または定常領域に導入された変異が、抗体のＫ_Ｄに大きく影響しないことを示す。

実施例４：他の二重特異性対へのＶＨ／ＶＬ変異及びＣＨ１／ＣＬ変異の適用
次に、４Ｄ５／ＵＣＨＴ１以外の二重特異性抗体における重鎖／軽鎖対合に対するＹＴ６５変異、ＥＫＫＥ変異、またはＹＴ６５変異及びＥＫＫＥ変異の効果を分析した。簡潔に述べると、ＹＴ６５ＣＨ１／ＣＬ変異、ＥＫＫＥＶＨ／ＶＬ変異、またはＹＴ６５変異とＥＫＫＥ変異との両方を、次の二重特異性抗体：抗ＩＬ４／ＩＬ１３、抗ＥＧＦＲ／ＭＥＴ、抗ＶＥＧＦＡ／ＡＮＧ２、及び抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣのそれぞれに導入した。ＹＴ６５ＣＨ１／ＣＬ変異は、各二重特異性抗体のノブアームに導入した。未修飾の二重特異性抗体と修飾された二重特異性抗体とを、上述の高分解能質量分析によって分析した。表２３及び図２１に提供される例示的な結果に示されるように、ＥＫＫＥ変異及びＹＴ．６５変異は、単独または組み合わせで、異なる抗体における二重特異性アセンブリを概して改善させた。親抗体が強い優先的な重鎖／軽鎖対合を既に示す実施例では、さらなる改善は実現または検出が困難である。

上述のように、インビトロ細胞傷害アッセイにおいて、ＥＫＫＥ変異及びＹＴ６５ノブ変異を有する抗ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体の活性を、未修飾の抗ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体の活性と比較した。図２３に示されるように、修飾された抗ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体と未修飾の抗ＨＥＲ２／ＣＤ３抗体との活性は、比較可能であった。

異なるアイソタイプの二重特異性４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体における重鎖／軽鎖対合に対するＹＴ６５変異及びＥＫＫＥ変異の効果を分析した。Ｑ３９Ｅ_ＨＣ１／Ｑ３８Ｋ_ＬＣ１ノブ／Ｑ３９Ｋ_ＨＣ２／Ｑ３８Ｅ_ＬＣ２ホール及びＹＴ６５ノブ変異を、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ、ヒトＩｇＧ２アイソタイプ、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ、及びマウスＩｇＧ２ａアイソタイプの二重特異性抗４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体に導入した。ヒトＩｇＧ２アイソタイプの抗体は、インビトロでのアセンブリに成功することが観察されていない。以下の表２４中の例示的な結果は、軽鎖及び重鎖の可変ドメイン内の変異が、異なるアイソタイプのヒト二重特異性抗体において、二重特異性アセンブリを著しく改善させたことを示す。

次に、Ｑ３９Ｅ_ＨＣ１／Ｑ３８Ｋ_ＬＣ１ノブ／Ｑ３９Ｋ_ＨＣ２／Ｑ３８Ｅ_ＬＣ２ホール変異及びＹＴ６５ノブ変異を有する二重特異性４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体を発現する、安定細胞株を構築した。電気穿孔によってＣＨＯ細胞をトランスフェクトし、ＭＳＸ（メチオニンスルホキシミン）の存在下で形質転換体を選択した。数週間後に単離物を選び、抗体の力価、及び正確にアセンブルされた二重特異性抗体の割合についてスクリーニングした。１４日間のフェドバッチ培養プロセスを用いて、上位のクローンを評価した。二重特異性抗体を採取し、精製し、上述の高分解能質量分析によって分析した。以下の表２５に提供される例示的な結果に示されるように、この細胞株から発現された二重特異性抗体の９７％超が、正確にアセンブルされた。Ｑ３９Ｅ_ＨＣ１／Ｑ３８Ｋ_ＬＣ１ノブ／Ｑ３９Ｋ_ＨＣ２／Ｑ３８Ｅ_ＬＣ２ホール変異及びＹＴ６５ノブ変異を有する４Ｄ５／ＵＣＨＴ１抗体を発現する、一過性にトランスフェクトされた細胞株は、９０％正確にアセンブルされた二重特異性抗体を発現することが見出された。このような結果は、この安定細胞株によって発現される正確にアセンブルされた二重特異性抗体の割合が、一過性にトランスフェクトされた細胞によって発現されるものと比較可能であることを示す。Ｑ３９Ｅ_ＨＣ１／Ｑ３８Ｋ_ＬＣ１ノブ／Ｑ３９Ｋ_ＨＣ２／Ｑ３８Ｅ_ＬＣ２ホール変異及びＶ１３３Ｅ／Ｓ１８３Ｋノブ／Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅホール変異または抗ＩＬ１３／ＩＬ４Ｑ３９Ｅ_ＨＣ１／Ｑ３８Ｋ_ＬＣ１ノブ／Ｑ３９Ｋ_ＨＣ２／Ｑ３８Ｅ_ＬＣ２Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅホール変異を有する４Ｄ５／ＵＣＨＴ１二重特異性抗体を発現する、安定細胞株を構築した。例示的な結果は、この細胞株から発現された二重特異性抗体の９８％または９１％超が、正確にアセンブルされたことを示す（表２５）。

次に、４Ｄ５／ＵＣＨＴ１における重鎖／軽鎖対合に対するＹＴ６５変異、ＥＫＫＥ変異、及びＶ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ変異の組み合わせの効果を分析した。簡潔に述べると、ＥＫＫＥ変異、ノブアーム（すなわち、４Ｄ５アーム）上のＹＴ６５変異、及びホールアーム（すなわち、ＵＣＨＴ１アーム）上のＶ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ変異を含む４Ｄ５／ＵＣＨＴ１二重特異性抗体を構築し、産生し、精製し、上述の高分解能質量分析によって分析した。４Ｄ５／ＵＣＨＴ１．ＹＴ６５_ノブ．Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ_ホール．ＥＫＫＥの二重特異性アセンブリを、４Ｄ５／ＵＣＨＴ１．Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ_ホール．ＥＫＫＥの二重特異性アセンブリと比較した。以下の表２６中の例示的な結果は、Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ_ホール変異及びＥＫＫＥ変異を有する４Ｄ５／ＵＣＨＴ１二重特異性抗体のノブアームへのＹＴ６５変異の導入が、正確な重鎖／軽鎖対合をおよそ９５％から１００％に改善させたことを示す。

さらなる実験を行って、表２６中の試験した変異の、他の二重特異性抗体への移行性を査定した。以下の表２７中の例示的な結果は、ＥＫＫＥ変異及びＹＴ６５_ノブ変異を有する５つの異なる二重特異性抗体のホールアームへのＶ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ変異の導入が、正確な重鎖／軽鎖対合をおよそ７９〜９５％から９５〜１００％に改善させたことを示す。

追加の実験を行って、表２６及び２７中の試験した変異の、他のヒトＩｇＧサブクラスの抗ＨＥＲ２／ＣＤ３（４Ｄ５／ＵＣＨＴ１）二重特異性抗体への移行性を査定した。以下の表２８中の例示的な結果は、ＥＫＫＥ変異及びＹＴ６５_ノブ変異を有する３つの異なるヒトＩｇＧサブタイプのホールアームへのＶ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ変異の導入が、正確な重鎖／軽鎖対合をおよそ７７〜８５％から９８〜１００％に改善させたことを示す。

ＶＬ−Ｑ３８Ｋ変異、ＶＨ−Ｑ３９Ｅ変異、及びＹＴ６５変異を含む４Ｄ５Ｆａｂの結晶構造を、１．７２Åの分解能まで判定した。変異体の全体構造は野生型４Ｄ５Ｆａｂと比較した有意差を示さず、ＣＨ１／ＣＬ界面に導入された変異が構造的整合性を撹乱させないことが示される。図２２Ａを参照されたい。ＣＬ−Ｓ１７６Ｆ変異及びＣＨ１−Ｆ１７０Ｓ変異は、良好な立体構造相補性を示し、十分に充填されたＣＬ／ＣＨ１界面をもたらした。これは、表２２−１に記載されたＹＴ６５変異を含む４Ｄ５Ｆａｂの高い熱安定性の観察と一致している。

変異残基ＣＬ−Ｓ１７６Ｆと野生型ＣＨ１−Ｆ１７０とは立体構造的に適合性でないため、構造に従って、ＣＬ−Ｓ１７６Ｆ変異は、変異体ＬＣと野生型ＨＣとの対合を嫌う。ＣＨ１−Ｆ１７０Ｓ変異が変異体ＨＣと野生型ＬＣとの対合を嫌うのは、そのような対合が、エネルギー的に不安定な疎水性コアにおける空孔を生成するからである。図２２Ｂを参照されたい。したがって、ＣＬ−Ｓ１７６ＦとＣＨ１−Ｆ１７０Ｓとの間の選択的対合は、正確に対合したＢｓＩｇＧ産生の収量の増加に寄与する。

以下の表２９は、異なる組み合わせのＥＫ_ノブ、ＥＫ_ホール、ＫＥ_ノブ、ＫＥ_ホール、ＥＫＫＥ、ＫＥＥＫ、Ｓ１８３Ｅ／Ｖ１３３Ｋ_ノブ、Ｓ１８３／Ｖ１３３Ｋ_ホール、Ｓ１８３Ｋ／Ｖ１３３_ノブ、Ｓ１８３Ｋ／Ｖ１３３Ｅ_ホール、ＹＴ６５_ノブ、及びＹＴ６５_ホールの、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ＩｇＧ１、抗ＩＬ４／ＩＬ１３ＩｇＧ１、抗ＥＧＦＲ／ＭＥＴＩｇＧ１、抗ＶＥＧＦＡ／ＡＮＧ２ＩｇＧ１、抗ＶＥＧＦＡ／ＶＥＧＦＣＩｇＧ１、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ＩｇＧ２、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ＩｇＧ４、及び抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ｍＩｇＧ２ａへの移行性を査定するために行った実験の結果を提供する。以下の表２９中の例示的な結果は、変異が正確な重鎖／軽鎖対合を改善させたことを示す。

実施例５：単一細胞で産生した二重特異性抗体の薬物動態研究
ＥＫＫＥ変異、ＹＴ６５変異、及び／またはＶ１３３Ｘ／Ｓ１８３Ｘ（ＣＬ／ＣＨ１）変異を含む、単一細胞で産生した抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ、ＫＩＨ）二重特異性抗体の薬物動態（ＰＫ）特性（例えば非特異性クリアランスなど）を評価し、（ａ）ＶＨ／ＶＬ及びＣＨ１／ＣＬに変異を有しない、インビトロでアセンブルされた抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール（ＫＩＨ）二重特異性抗体、ならびに（ｂ）Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウスにおけるトラスツズマブ（すなわち、二価単一特異性抗ＨＥＲ２）と比較するために、追加の研究を設計した。

Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウス（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）を、５つの群（ｎ＝９）に組織化した。第１群の各マウスには、インビトロでアセンブルされた抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体５ｍｇ／ｋｇを、静脈内（ＩＶ）に単回投薬した。第２群の各マウスには、インビトロでアセンブルされた抗ｇＤ／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体５ｍｇ／ｋｇを、静脈内（ＩＶ）に単回投薬した。第３群の各マウスには、ＥＫＫＥ＋ＹＴ６５_ノブ変異を有する、単一細胞で産生した抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体５ｍｇ／ｋｇを、静脈内（ＩＶ）に単回投薬した。第４群の各マウスには、ＥＫＫＥ＋Ｖ１３３Ｅ／Ｓ１８３Ｋ_ノブ＋Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ_ホール変異を有する、単一細胞で産生した抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体５ｍｇ／ｋｇを、静脈内（ＩＶ）に単回投薬した。第５群の各マウスには、トラスツズマブ（すなわち、抗ＨＥＲ２単一特異性二価抗体）５ｍｇ／ｋｇを、静脈内（ＩＶ）に単回投薬した。これらの動物は、研究の開始時に６〜８週齢であり、およそ１６．６〜２１．４ｇの重さであった。血液試料を、２８日までの様々な時点で大腿静脈から収集した。血清中の全抗体濃度をＥＬＩＳＡによって判定し、ＰＫ評価に使用した。ＰＫパラメータは、ＩＶボーラス入力モデルを備えた２コンパートメントモデル（モデル８）（Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）、バージョン６．４、ＰｈａｒｓｉｇｈｔＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）を使用して推定した。公称試料収集時間及び公称用量濃度をデータ分析に使用した。全てのＰＫ分析は、個別の動物の未処理のデータプールに基づいた。

（ｉ）抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体、（ｉｉ）ＥＫＫＥ＋ＹＴ６５_ノブ変異を有する抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体、及び（ｉｉｉ）ＥＫＫＥ＋Ｖ１３３Ｅ／Ｓ１８３Ｋ_ノブ＋Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ_ホール変異を有する抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体の血清中濃度を、特異的ＥＬＩＳＡ（図１４に例示されるように、ＨＥＲ２細胞外ドメインでコーティングされ、ビオチン化ＣＤ３で検出される）を使用して分析し、定量下限は０．０８μｇ／ｍＬであった。（ｉｖ）抗ｇＤ／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体及び（ｖ）トラスツズマブの血清中濃度は、一般的ＥＬＩＳＡを使用して判定した。このアッセイでは、捕捉試薬としてのヒツジ抗ヒトＩｇＧ、及び検出試薬としての西洋ワサビペルオキシダーゼと接合したヤギ抗ヒトＩｇＧを使用し、定量下限は０．０３μｇ／ｍＬであった。

全ての抗体が、初期の分布が速くその後の排除が遅い、ＩｇＧ抗体に典型的な二相性体内動態を示した（図２４）。ＥＫＫＥ＋ＹＴ６５_ノブ変異を有する単一細胞で産生した抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体、及びＥＫＫＥ＋Ｖ１３３Ｅ／Ｓ１８３Ｋ_ノブ＋Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ_ホール変異を有する抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体の薬物動態は、従来のインビトロでアセンブルされた抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体と同様であった（以下の表３０を参照されたい）。ＥＫＫＥ＋ＹＴ６５_ノブ変異を有する単一細胞で産生した抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体、及びＥＫＫＥ＋Ｖ１３３Ｅ／Ｓ１８３Ｋ_ノブ＋Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ_ホール変異を有する抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体の薬物クリアランス（ＣＬ）は、７．１４〜８．０８ｍＬ／日／ｋｇの範囲であり、ｔ_{１／２，β}は、９．３４〜９．３８日の範囲であった。インビトロでアセンブルされた抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体は、８．２３ｍＬ／日／ｋｇのＣＬ、及び１１．４日のｔ_{１／２，β}を有する。インビトロでアセンブルされた抗ｇＤ／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体は、インビトロでアセンブルされた抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体と比較してわずかに遅いＣＬ及び長い終末相半減期を有するようであった。この実験では、抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体、ＥＫＫＥ＋ＹＴ６５_ノブを有する抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体、及びＥＫＫＥ＋Ｖ１３３Ｅ／Ｓ１８３Ｋ_ノブ＋Ｖ１３３Ｋ／Ｓ１８３Ｅ_ホールを有する抗ＨＥＲ２／ＣＤ３ノブ・イン・ホール二重特異性抗体は、トラスツズマブと比較しておよそ２倍速いクリアランス及び２倍短い半減期を有した。

ＡＵＣ＝血清濃度対時間曲線下面積；
ＣＬ＝クリアランス；
Ｃ_ｍａｘ＝最大濃度；ＩＶ＝静脈内；
ＰＫ＝薬物動態；
ｔ_{１／２，β}＝ベータ相半減期；
Ｖ_１＝中央コンパートメントの分布容積；
Ｖ_ｓｓ＝定常状態の分布容積。

先行の実施例は例証目的のためだけに提示されるものであり、本発明の範囲をいかようにも限定することを意図しない。本明細書に示され記載されたものに加えて、本発明の様々な変更形態が前述の説明から当業者には明らかになり、それらは添付の特許請求の範囲に含まれる。

Claims

ａ）第１の重鎖ポリペプチド（Ｈ１）及び第１の軽鎖ポリペプチド（Ｌ１）を含む第１の抗原に結合する第１の重鎖／軽鎖対と、ｂ）第２の重鎖ポリペプチド（Ｈ２）及び第２の軽鎖ポリペプチド（Ｌ２）を含む第２の抗原に結合する第２の重鎖／軽鎖対と、を含み、各Ｈ１及びＨ２が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）を含み、各Ｌ１及びＬ２が、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含み；
Ｌ１及びＬ２は、カッパ軽鎖であり、
Ｈ１のＣＨ１ドメインが、Ｓ１８３（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換を含み、Ｌ１のＣＬドメインが、Ｖ１３３（ＥＵ付番）におけるアミノ酸置換を含み；
（ｉ）Ｈ１のＣＨ１ドメインにおけるＳ１８３でのアミノ酸置換はＳ１８３Ｋであり、
Ｌ１のＣＬドメインにおけるＶ１３３でのアミノ酸置換は、Ｖ１３３Ｅであるか：又は、
（ｉｉ）Ｈ１のＣＨ１ドメインにおけるＳ１８３でのアミノ酸置換はＳ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｆ又はＳ１８３Ｙであり、Ｌ１のＣＬドメインにおけるＶ１３３でのアミノ酸置換はＶ１３３Ｋであり；
Ｈ１のＶＨドメインが、Ｑ３９の位置におけるアミノ酸置換を含み、Ｌ１のＶＬドメインが、Ｑ３８の位置（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含み、かつＨ２のＶＨドメインが、Ｑ３９の位置におけるアミノ酸置換を含み、Ｌ２のＶＬドメインが、Ｑ３８の位置（Ｋａｂａｔ付番）におけるアミノ酸置換を含み、
（ａ）Ｈ１のＶＨドメイン中のＱ３９におけるアミノ酸が正荷電残基に置き換えられ、Ｌ１のＶＬドメイン中のＱ３８におけるアミノ酸が負荷電残基に置き換えられ、かつＨ２のＶＨドメイン中のＱ３９におけるアミノ酸が負荷電残基に置き換えられ、Ｌ２のＶＬドメイン中のＱ３８におけるアミノ酸が正荷電残基に置き換えられるか；または
（ｂ）Ｈ１のＶＨドメイン中のＱ３９におけるアミノ酸が負荷電残基に置き換えられ、Ｌ１のＶＬドメイン中のＱ３８におけるアミノ酸が正荷電残基に置き換えられ、かつＨ２のＶＨドメイン中のＱ３９におけるアミノ酸が正荷電残基に置き換えられ、Ｌ２のＶＬドメイン中のＱ３８におけるアミノ酸が負荷電残基に置き換えられる、
多重特異性抗原結合タンパク質。
正荷電残基が、Ｒ及びＫから成る群から選択され、負荷電残基が、Ｄ及びＥから成る群から選択される、請求項１に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
Ｈ１のＣＨ１ドメインにおける唯一のアミノ酸置換が、Ｓ１８３（ＥＵ付番）にあり、Ｌ１のＣＬドメインにおける唯一のアミノ酸置換が、Ｖ１３３（ＥＵ付番）にある、請求項１又は２に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
（ｉ）Ｈ２のＣＨ１ドメインにおけるＳ１８３でのアミノ酸置換はＳ１８３Ｋであり、
Ｌ２のＣＬドメインにおけるＶ１３３でのアミノ酸置換は、Ｖ１３３Ｅである：又は、
（ｉｉ）Ｈ２のＣＨ１ドメインにおけるＳ１８３でのアミノ酸置換はＳ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｆ又はＳ１８３Ｙであり、Ｌ２のＣＬドメインにおけるＶ１３３でのアミノ酸置換はＶ１３３Ｋであり；
Ｈ２のＣＨ１ドメインにおけるＳ１８３でのアミノ酸置換は、Ｈ１のＣＨ１ドメインにおけるＳ１８３でのアミノ酸置換と異なり、
Ｌ２のＣＬドメインにおけるＶ１３３でのアミノ酸置換は、Ｌ１のＣＬドメインにおけるＶ１３３でのアミノ酸置換と異なる、
請求項１から３のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
（ｉ）Ｈ１のＣＨ１ドメインにおけるＳ１８３（ＥＵ付番）のアミノ酸がＫに置き換えられており、Ｈ１のＶＨドメインにおけるＱ３９（Ｋａｂａｔ付番）のアミノ酸が負荷電残基に置き換えられており、Ｌ１のＣＬドメインにおけるＶ１３３（ＥＵ付番）のアミノ酸がＥに置き換えられており、Ｌ１のＶＬドメインにおけるＱ３８（Ｋａｂａｔ付番）のアミノ酸が正荷電残基に置き換えられており、Ｈ２のＶＨドメインにおけるＱ３９（Ｋａｂａｔ付番）のアミノ酸が正荷電残基に置き換えられており、Ｌ２のＶＬドメインにおけるＱ３８（Ｋａｂａｔ付番）のアミノ酸が負荷電残基に置き換えられており；又は
（ｉｉ）Ｈ１のＣＨ１ドメインにおけるＳ１８３（ＥＵ付番）のアミノ酸が、Ｅに置き換えられており、Ｈ１のＶＨドメインにおけるＱ３９（Ｋａｂａｔ付番）のアミノ酸が正荷電残基に置き換えられており、Ｌ１のＣＬドメインにおけるＶ１３３（ＥＵ付番）のアミノ酸がＫに置き換えられており、且つ、Ｌ１のＶＬドメインにおけるＱ３８（Ｋａｂａｔ付番）のアミノ酸が負荷電残基に置き換えられており、Ｈ２のＶＨドメインにおけるＱ３９（Ｋａｂａｔ付番）のアミノ酸が負荷電残基に置き換えられており、Ｌ２のＶＬドメインにおけるＱ３８（Ｋａｂａｔ付番）のアミノ酸が正荷電残基で置き換えられており；
正荷電残基は、Ｒ及びＫからなる群より選択され、負荷電残基は、Ｄ及びＥからなる群より選択される、
請求項１から３のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
Ｈ２のＣＨ１ドメインにおける唯一のアミノ酸置換は、Ｓ１８３（ＥＵ付番）にあり、Ｌ２のＣＬドメインにおける唯一のアミノ酸置換は、Ｖ１３３（ＥＵ付番）にある、請求項４又は５に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
（ａ）Ｈ２のＣＨ１ドメインが、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ｖ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインが、Ｆ１１６Ａ、Ｖ１３３Ｉ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、
（ｂ）Ｈ２のＣＨ１ドメインが、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインが、Ｆ１１６Ａ、Ｓ１３１Ｄ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｉ変異を含むか、
（ｃ）Ｈ２のＣＨ１ドメインが、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインが、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、
（ｄ）Ｈ２のＣＨ１ドメインが、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ａ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ｖ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインが、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１６２Ｍ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含むか、
（ｅ）Ｈ２のＣＨ１ドメインが、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆｌ７０Ｍ、Ｓ１８１１、及びＳ１８３Ａ変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインが、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｙ、Ｓ１６２Ａ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｍ、及びＴ１７８Ｌ変異を含むか、
（ｆ）Ｈ２のＣＨ１ドメインが、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｍ、Ｆ１７０Ｙ、Ｓ１８１Ｉ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインが、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｓ１７６Ａ、及びＴ１７８Ｌ変異を含むか、
（ｇ）Ｈ２のＣＨ１ドメインが、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｔ、Ｆ１７０Ｍ、Ｓ１８１Ｔ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ｌ変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインが、Ｆ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ａ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｔ、及びＴ１７８Ｌ変異を含むか、または、
（ｈ）Ｈ２のＣＨ１ドメインがＬ１２８Ｆ、Ａｌ４１Ｍ、Ｆｌ７０Ｍ、Ｓ１８１Ｔ、及びＳ１８３Ａ変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインがＦ１１８Ｖ、Ｓ１３１Ｔ、Ｖ１３３Ａ、Ｌ１３５Ｆ、Ｓ１６２Ｍ、Ｔ１６４Ｓ、Ｓ１７６Ｍ、及びＴ１７８Ｌ変異を含む、
請求項１から３のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
Ｈ１のＶＨドメインがＱ３９Ｋ変異を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインがＳ１８３Ｅ変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインがＱ３８Ｅ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインがＶ１３３Ｋ変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインがＱ３９Ｅ変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインがＱ３８Ｋ変異を含む、請求項１に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
Ｈ２のＣＨ１ドメインがＳ１８３Ｋ変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインがＶ１３３Ｅ変異を含む、請求項８に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
Ｈ２のＣＨ１ドメインが、Ａ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ、及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインが、Ｆ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含む、請求項８に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
Ｈ１のＶＨドメインがＱ３９Ｅ変異を含み、Ｈ１のＣＨ１ドメインがＳ１８３Ｋ変異を含み、Ｌ１のＶＬドメインがＱ３８Ｋ変異を含み、Ｌ１のＣＬドメインがＶ１３３Ｅ変異を含み、Ｈ２のＶＨドメインがＱ３９Ｋ変異を含み、Ｌ２のＶＬドメインがＱ３８Ｅ変異を含む、請求項１に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
Ｈ２のＣＨ１ドメインがＳ１８３Ｅ変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインがＶ１３３Ｋ変異を含む、請求項１１に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
Ｈ２のＣＨ１ドメインがＡ１４１Ｉ、Ｆ１７０Ｓ、Ｓ１８１Ｍ、Ｓ１８３Ａ及びＶ１８５Ａ変異を含み、Ｌ２のＣＬドメインがＦ１１６Ａ、Ｌ１３５Ｖ、Ｓ１７４Ａ、Ｓ１７６Ｆ、及びＴ１７８Ｖ変異を含む、請求項１１に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
Ｈ１及びＨ２のそれぞれがＦｃ領域を含み、Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域、またはヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
Ｈ１及びＨ２のそれぞれが、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域を含み、
ＣＨ３／ＣＨ３界面内で、１個以上のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有する１個以上のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ２のＣＨ３ドメインと相互作用するＨ１のＣＨ３ドメインの表面上にノブが生成されるように、Ｈ１のＣＨ３ドメインが変更され、かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で、１個以上のアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ１のＣＨ３ドメインと相互作用するＨ２のＣＨ３ドメインの表面上にホールが生成されるように、Ｈ２のＣＨ３ドメインが変更されるか；または
ＣＨ３／ＣＨ３界面内で、１個以上のアミノ酸残基が、より大きな側鎖体積を有する１個以上のアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ１のＣＨ３ドメインと相互作用するＨ２のＣＨ３ドメインの表面上にノブが生成されるように、Ｈ２のＣＨ３ドメインが変更され、かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で、１個以上のアミノ酸残基が、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基に置き換えられ、それにより、Ｈ２のＣＨ３ドメインと相互作用するＨ１のＣＨ３ドメインの表面上にホールが生成されるように、Ｈ１のＣＨ３ドメインが変更される、
請求項１から１４のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
ノブ変異が、Ｔ３６６Ｗ（ＥＵ付番）を含み、かつホール変異が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ付番）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てを含む、請求項１５に記載の多重特異性抗原結合タンパク質。
請求項１から１６のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
個体における疾患を治療するための、有効量の請求項１７に記載の薬学的組成物を含む医薬。
請求項１から１６のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質のＨ１、Ｈ２、Ｌ１及びＬ２をコードする１又は複数の核酸。
請求項１９に記載の１又は複数の核酸を含むベクター。
請求項１９に記載の１又は複数の核酸を含む、単離された宿主細胞。
原核宿主細胞、及びＥ．ｃｏｌｉ細胞、真核宿主細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、またはＣＨＯ細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。
請求項１から１６のいずれか一項に記載の多重特異性抗原結合タンパク質を産生する、ｉｎｖｉｔｒｏでの方法であって、
（ａ）Ｈ１、Ｌ１、Ｈ２、及びＬ２をコードする１又は複数の核酸を宿主細胞に導入することと、
（ｂ）宿主細胞を培養して多重特異性抗原結合タンパク質を産生することと
を含む、方法。
多重特異性抗原結合タンパク質を回収することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
請求項２３又は２４に記載の方法によって産生される多重特異性抗原結合タンパク質。