KR20220107163A - 우선적으로 경쇄 페어링하도록 조작된 ch1 도메인 변이체 및 이를 포함하는 다중특이적 항체 - Google Patents

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아르빈드 시바수브라마니안
케빈 슈츠
미카엘라 헬블
에릭 크라우랜드
폴 위드붐
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아디맵 엘엘씨
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Abstract

카파 CL 도메인 또는 람다 CL 도메인 중 어느 하나에 우선적으로 결합하도록 조작된 CH1 도메인 변이체를 비롯하여, 이러한 조작된 CH1 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 항체), 및 이러한 CH1 도메인 변이체 및/또는 이러한 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물, 및 이러한 CH1 도메인 변이체를 제조하는 방법 및 사용하는 방법이 제공된다. CH1 도메인 변이체는 중쇄-경쇄의 미스페어링을 최소화하고 동족 중쇄-경쇄 페어링을 촉진함으로써, 다중특이적, 예를 들어 이중특이적 항체의 생성을 개선한다. 또한, CH1 도메인 변이체 라이브러리를 제작하는 방법 및 하나 이상의 CH1 도메인 변이체를 식별하는 방법이 제공된다.

Description

우선적으로 경쇄 페어링하도록 조작된 CH1 도메인 변이체 및 이를 포함하는 다중특이적 항체
관련 출원
본 출원은 2019년 9월 30일에 "CH1 DOMAIN VARIANTS ENGINEERED FOR PREFERENTIAL LIGHT CHAIN PAIRING AND MULTISPECIFIC ANTIBODIES COMPRISING THE SAME"이란 발명의 명칭으로 출원된 미국 특허 가출원 제62/908,367호에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
기술분야
본 발명은 적절한 중쇄-경쇄 페어링을 촉진하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 CH1 도메인 변이체 및 이를 포함하는 항체 중쇄 및 항체, 특히 다중특이적 항체에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 이러한 항체를 포함하는 조성물 및 이의 용도, 예를 들어 이의 치료적 또는 진단적 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 CH1 도메인 변이체 라이브러리를 제조하는 방법 및 하나 이상의 CH1 도메인 변이체를 식별하는 방법에 관한 것이다.
두 가지 이상의 항원 결합 특이성을 갖는 항체 치료제, 예를 들어 이중특이적 항체를 개발하기 위한 노력이 지속되고 있다. 이중특이적 항체는 암, 염증 과정, 또는 다른 질환 상태와 연관된 다수의 표면 수용체를 방해하는 데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 표적을 가깝게 위치시키고 단백질 복합체 형성을 조절하거나 세포 간의 접촉을 유도하는 데에도 사용될 수 있다. 이중특이적 항체의 생산은 1960년대 초에 처음 보고되었고(Nisonoff 등의 문헌[Arch Biochem Biophys 1961 93(2): 460-462), 첫 단클론 이중특이적 항체는 1980년대에 하이브리도마 기술을 사용하여 생성되었다(Milstein 등의 문헌[Nature 1983 305(5934): 537-540]). 이중특이적 항체에 대한 관심은 이중특이적 항체의 치료 능력으로 인해 지난 10년 동안 상당히 증가하였고, 이중특이적 항체는 현재 임상에서 사용되고 있으며, 예를 들어 블리나투모맙(binatumomab)과 에미시주맙(emicizumab)은 특정 암의 치료용으로 승인되었다(Sedykh 등의 문헌[Drug Des Devel Ther 12:195-208 (2018)] 및 Labrijn 등의 문헌[Nature Reviews Drug Discovery 18:585-608 (2019), for recent reviews of bispecific antibody production methods and features of bispecific antibodies approved for medical use]).
이중특이적 항체는 단일특이적 항체에 비해 상당한 이점을 나타낸 반면, 효율적/저비용 생산 방법의 부재, 이중특이적 항체의 미흡한 안정성, 및 인간에서 짧은 반감기로 인해 이중특이적 항체의 광범위한 상업적 적용은 큰 진전이 없었다. 최근 수십 년에 걸쳐 이중특이적 항체를 생산하기 위한 매우 다양한 방법이 개발되었다. 여기에는 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동-발현(Milstein과 Cuello의 문헌[Nature 305: 537 (1983)], WO 93/08829, 및 Traunecker 등의 문헌[EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조); “놉인홀(knob-in-hole)” 조작 (예를 들어 미국 특허 제5,731,168호 참조); 면역글로불린 크로스오버 기술(Fab 도메인 교환 또는 CrossMab 포맷으로도 알려짐) (예를 들어 WO2009/080253; Schaefer 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:11187-11192 (2011)] 참조); 항체 Fc-이종이량체분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작(WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 교차 결합(예를 들어 미국 특허 제4,676,980호, 및 Brennan 등의 문헌[Science, 229: 81 (1985)] 참조); 류신 지퍼(예를 들어 Kostelny 등의 문헌[J. Immunol, 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); “디아바디(diabody)” 기술(예를 들어 Hollinger 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 단쇄 (scFv) 이량체(예를 들어 Gruber 등의 문헌[J. Immunol, 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 Tutt 등의 문헌[J. Immunol 147: 60 (1991)]에 기술된 것과 같은 삼중특이적 항체가 포함된다.
이러한 개선에도 불구하고, 정확한 중쇄-경쇄 페어링을 갖는 이중특이적 항체를 생성하는 것은 여전히 어려운 과제이다. 이중특이적 항체는 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄의 공동 발현에 의해 형성될 수 있다. 이중특이적 항체를 원하는 포맷으로 적절히 형성하는 것은 여전히 어려운 과제인데, 이는 중쇄가 상대적으로 복잡한 방식으로 경쇄에 결합하도록 진화해 왔기 때문이다. 결과적으로, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 공동 발현은 중쇄-경쇄 페어링의 스크램블링으로 이어질 수 있는데, 이는 10개의 상이한 항체를 나타내는 16개의 가능한 조합으로 이루어진 복잡한 혼합물이며, 이 중 하나만이 바람직한 이중특이적 항체에 상응한다(완전히 뒤섞이는 경우, 혼합물에서의 최대 수율을 12.5%임). 균질한 페어링이 제조 가능성 및 효능에 필수적이기 때문에, 이러한 미스페어링(mispairing)(사슬 결합 문제라고도 함)는 이중특이성을 생성하는 데 있어서 주요한 과제로 남아 있다.
미스페어링을 완화하는 데 사용되는 하나의 전략은 공통 경쇄를 갖는 이중특이적 항체를 생성하는 것이다(예를 들어, Merchant 등의 문헌[Nat. Biotech. 16:677-681 (1998]) 참조). 대안적으로, 하나의 공통 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄(하나의 카파 및 하나의 람다 경쇄)가 사용될 수 있다(예를 들어, Fischer 등의 문헌[Nature Commun. 6:6113 (2015)] 참조). 그러나, 이러한 전략은 공통 경쇄를 갖는 항체를 식별하는 것을 필요로 하는데, 이는 어렵울 뿐만 아니라 각각의 결합 아암의 특이성을 손상시키는 경향이 있고, 다양성을 실질적으로 감소시킨다(예를 들어, Wang 등의 문헌 [MABS 10(8):1226-1235 (2018)] 참조).
정확한 중쇄-경쇄 페어링을 개선하기 위한 다른 접근법은, 하나의 단편 항원 결합(Fab) 아암의 경쇄 또는 그 내부의 하위 도메인 중 하나가 중쇄 Fd 영역의 상응하는 영역과 교환되는 CrossMab 기술(Roche); 및 하나의 Fab 아암에서의 천연 이황화 결합이 조작된 이황화 결합으로 대체되는 DuetMab 기술(MedImmune)을 포함한다. 그러나, 이러한 접근법들은 천연 IgG 포맷에 대한 상당한 변화를 필요로 하는데, 그 결과 천연 항체와 적당히 유사하지 않은 화합물이 생성될 수 있다.
또 다른 전략은 IgG 포맷내의 중쇄 및 경쇄의 불변 및/또는 가변 영역에서 아미노산 치환을 사용하여 중쇄-경쇄의 미스페어링을 감소시키거나 제거하는 것이다. 발명자가 알고 있는 한, CH1 도메인만을 변형시켜, 다중특이적 항체의 발현 중에 종종 관찰되는 사슬 결합 문제 또는 미스페어링 문제를 해결하는 것이 이전에 입증된 적이 없었다. 오히려, CH1 도메인 변이체를 포함하도록 조작된 다중특이적 항체의 경우, CL 도메인 및, 소정의 경우에 VH, CH2, CH3, 및/또는 VL 도메인과 같은 사슬 결합 문제를 해결하기 위해, CH1 도메인 외부에서의 변형도 추가로 필요로 하였다. 이의 예는 Lewis 등의 문헌[Nature Biotech. 32(2):191- 198 (2014)]을 포함하는데, Lewis 등은 변경된 중쇄 및 경쇄의 우선적 페어링을 유도하고, 야생형 불변 영역과 중쇄 및 경쇄 도메인의 페어링을 무시하게 하도록 시도하는 도중 돌연변이체 CH1 및 CL 도메인, CRD1 (중쇄가 D148K, F170T, V185F로 치환되고 경쇄가 K129D, L135F로 치환됨; EU 넘버링 기준) 및 CRD2 (중쇄가 H168A 및 F170T로 치환되고 경쇄가 L135Y, S176W로 치환됨)를 생성하였다. 그러나, 이들은 가변 도메인이 없는 상태에서 돌연변이체 CH1 및 CL 도메인으로 수득된 임의의 페어링 특이성이 VH-VL 계면 내에서의 추가적인 조작 없이 전장 IgG 포맷으로 번역되지 않는다는 것, 즉, 우선적인 중쇄-경쇄 페어링을 달성하기 위해서는 CL 및 CH1 도메인 치환과 함께 VH-VL 계면 내에서의 치환이 필요하다고 보고하였다. 하전된 아미노산 잔기를 함유하도록 CH1 및 CL 도메인을 조작하는 것 또한 우선적인 중쇄-경쇄 페어링을 촉진하는 것으로 알려져 왔다(예를 들어, 미국 특허 제10,047,163호 참조). CH1 및 CL 도메인이 상이한 적어도 2개의 Fab 단편을 갖는 이중특이적 항체로서, 하나의 Fab 단편은 우선적인 페어링을 유도하도록 CH1 및 Cκ 도메인 내에서 치환을 갖는 이중특이적 항체도 알려져 있다(CH1: T187E 및 Cκ: N137K + S114A; CH1: L145Q + S183V 및 Cκ: V133T + S176V; CH1: L128A + L145E 및 Cκ: V133W; CH1: V185A 및 Cκ: L135W + N137A를 개시하는 US20180022829 및 미국 특허 제9,631,031호 참조). 경쇄, 또는 일부 경우에 CH2, CH3, 및/또는 VH가 우선적인 페어링을 촉진하도록 적절하게 치환될 때, 우선적인 중쇄-경쇄 페어링을 촉진한다고 주장되는 특이적 CH1 도메인 치환의 추가 예는 다음을 포함한다: A141C/L, K147D, G166D, G166K, 또는 위치 128, 129, 162, 또는 171에서 시스테인과의 치환 (WO2019183406 (Invenra Inc.)); 위치 126 또는 220의 시스테인이 발린 또는 알라닌으로 치환되는 것, 또는 위치 128, 141, 또는 168에서 비-시스테인이 시스테인으로 치환되는 것, L145F, K147A, F170V, S183F, 또는 V185W/F (미국 특허 제9,527,927호 (MedImmune)); 172A 및 174G (WO2020060924 (Dualogics)); A172R 및 174G, 또는 잔기 190이 M 또는 I로 치환되는 것 (미국 특허 제10,047,167호 (University of North Carolina Chapel Hill and Eli Lilly)); L128F, A141I/M/T/L, F170S/A/Y/M, S181M/I/T, S183A/E/K/V, 및 V185A/L (US20180177873 (Genentech)); 131C/S, 133R/K, 137E/G, 138S/G 178S/Y, 192N/S, 및/또는 193F/L (미국 특허 제10,487,156호 (Argenx BVBA)); 145D/E/R/H/K (IMGT 위치 26) (WO2018141894 (Merck)); 124K/E/R/D (미국 특허 제10,392,438호 (Pfizer)); 133V, 150A, 150D, 152D, 173D, 또는 188W (US20190023810 (MIT)); 133S/W/A, 139W/V/G/I, 143K/E/A, 145E/T/L/Y, 146G, 147T/E, 174V, 175D/R/S, 179K/D/R, 181R, 186R, 188F/L, 및/또는 190S/A/G/Y (US20180179296 및 미국 특허 제9,914,785호 (Zymeworks)); 143A/E/R/K/D 및 145T/L (미국 특허 제10,077,298호 (Zymeworks)); 124A/R/E/W, 145M/T, 143E/R/D/F, 172R/T, 139W/G/C, 179E, 또는 186R (US20170204199 (Zymeworks)); 위치 126, 127, 128, 134, 141, 171, 또는 173에서 시스테인과의 치환 (Zenyaku Kogyo); L145Q, H168A, F170G, S183V, 및 T187E (WO2020127354 (Alligator Bioscience)); 143D/E, 145T, 190E/D, 및 124R (WO2017/059551 (Zymeworks)). 또한 미국 특허 제9,150,639호(Kyowa Hakko Kirin)는 화학적 조절을 허용하기 위해 시스테인을 도입할 목적으로 A140C, K147C, 또는 S183C를 포함하는 중쇄를 생성한 것으로 보고하였다. Kirin은 이러한 중쇄 돌연변이를 함유하는 항체 변이체가 야생형 경쇄를 포함할 수 있음을 시사하지만, 이것이 우선적인 중쇄-경쇄 페어링을 용이하게 할 것임을 나타내지는 않는다.
중쇄-경쇄 미스페어링을 최소화하기 위해 사용되는 또 다른 전략은 상이한 경쇄, 예를 들어 상이한 불변 도메인을 갖는 경쇄를 이용하는 것이다. 예를 들어, Loew 등은 카파 경쇄 및 람다 경쇄를 갖는 다중특이적 항체를 생성하고 최소한의 미스페어링을 관찰하였는데, 이는 소정의 자연 발생 카파 경쇄가 높은 충실도를 가지며 람다 항체 유래의 중쇄와 페어링되지 않고, 그 반대의 경우도 마찬가지이기 때문이다(WO2018057955). 불행하게도, 이러한 방법론의 적용 가능성은 높은 충실도를 갖는 경쇄로 제한된다. 다른 것들은 카파 및 람다 경쇄를 사용해 다중특이적 항체를 생성하였는데, 여기서는 중쇄 및 경쇄 모두에 아미노산 치환을 사용하여 우선적인 페어링을 정전기적으로 또는 입체적으로 유도한다(예를 들어, WO2017059551 (Zymeworks), US20140154254 (Amgen), 및 미국 특허 제10,047,163호 (AbbVie Stemcentrx) 참조). 그러나, 중쇄 및 경쇄 둘 다에 다수의 아미노산 치환을 도입하는 것은 추가적인 기술적 장애를 나타내고, 더 나아가 항체 기능 및/또는 면역원성에 유해한 영향을 미칠 수도 있다.
본 발명의 목적은 적절한 중쇄-경쇄 페어링을 갖는 조작된 이중특이적 항체를 제공하는 것이다. 일 양태에서, 특정 경쇄와 중쇄의 우선적인 페어링을 촉진하는 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드(본원에서 CH1 도메인 변이체로도 지칭됨) 및 이를 포함하는 폴리펩티드, 예컨대 항체가 본원에 제공된다. CH1 도메인 변이체는 (부모 서열, 예를 들어 야생형 서열에 비해) 적어도 하나의 아미노산 치환을 함유한다.
일부 구현예에서, CH1 도메인 변이체는 경쇄의 CL 도메인과 계면을 형성하는 CH1 도메인 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 함유하며, 상기 위치는 위치 140 및/또는 141 또는 147 및/또는 183(EU 넘버링)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 치환은 특이적 경쇄와 CH1 도메인 변이체-함유 중쇄의 우선적 페어링을 촉진하며, 예를 들어, CH1 도메인 변이체 141은 카파 CL 도메인과 반대로 람다 CL 도메인과 우선적으로 페어링되는 반면, CH1 도메인 변이체 147F 및/또는 183R, 183K, 또는 183Y는 람다 CL 도메인과 반대로 카파 CL 도메인과 우선적으로 페어링된다.
일부 구현예에서, CH1 도메인 변이체는 CH1 도메인과 VH 사이에서 계면을 형성하는 CH1 도메인 위치에서, 예컨대 CH1 위치 151(EU 넘버링 기준)에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 함유한다.
불변 도메인의 이러한 우선적인 페어링은 가변 도메인을 포함하는 전장 경쇄 및 중쇄의 페어링을 유도하여, 이중특이성을 위한 사슬 페어링 문제에 대한 해결책을 생성할 것으로 예상된다. 특히, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 다음 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함한다: 118, 119, 124, 126-134, 136, 138~143, 145, 147~154, 163, 168, 170~172, 175, 176, 181, 183~185, 187, 190, 191, 197, 201, 203~206, 208, 210~214, 216, 및 218. 임의로, 이러한 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 (i) 람다 CL 도메인과 비교해 카파 경쇄 불변 영역(“CL”) 도메인과 우선적으로 페어링되고/되거나 람다 경쇄 폴리펩티드와 비교해 카파 경쇄 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되며; (ii) 카파 CL 도메인과 비교해 람다 CL 도메인과 우선적으로 페어링되고/되거나 카파 경쇄 폴리펩티드와 비교해 람다 경쇄 폴리펩티드와 우선적으로 페어링된다.
임의로, 일부 구현예에서, 소정의 CH1 도메인 변이체가 배제될 수 있고, 본 발명에 따른 CH1 도메인 변이체는 다음을 충족할 수 있다:
(a) CH1 상의 잔기 141이 C 또는 L로 치환되고, 잔기 166이 D 또는 K로 치환되고, CH1 상의 잔기 128, 129, 162, 또는 171이 C로 치환되고/되거나, 잔기 147이 D로 치환되는 경우, CH1 도메인 변이체와 우선적으로 페어링되는 CL 도메인은 아미노산 치환을 포함하지 않음;
(b) CH1 상의 위치 126 또는 220이 발린 또는 알라닌으로 치환되거나, 위치 128, 141, 또는 168에서의 비-시스테인이 시스테인으로 치환되거나, CH1 치환이 L145F, K147A, F170V, S183F, 또는 V185W/F인 경우, CH1 도메인 변이체와 우선적으로 페어링되는 CL 도메인은 아미노산 치환을 포함하지 않음;
(c) CH1 상의 잔기 172가 172R로 치환되거나, 잔기 174가 174G로 돌연변이되거나, 잔기 190이 190M 또는 190I로 치환되는 경우, 이들은 CH1이 포함하는 유일한 치환(들)이 아님;
(d) CH1 치환이 L128F, A141I/M/T/L, F170S/A/Y/M, S181M/I/T, S183A/E/K/V, 및/또는 V185A/L로 이루어지는 경우, CH1 도메인 변이체와 우선적으로 페어링되는 CL 도메인은 변형되지 않음;
(e) CH1 치환이 131C/S, 133R/K, 137E/G, 138S/G, 178S/Y, 192N/S, 및/또는 193F/L로 이루어지는 경우, 이들은 유일한 CH1 치환이 아니고/아니거나, 이중특이적 항체에서 CH1 도메인은 동일한 인간 면역글로불린 아형 또는 동종형임;
(f) CH1 치환이 145D/E/R/H/K(IMGT 위치 26)로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환, 129D/E/R/H/K(IMGT 위치 18)가 없음;
(g) CH1 치환이 124K/E/R/D로 이루어지는 경우, CH1 도메인 변이체와 우선적으로 페어링되는 LC의 위치 176에서 상응하는 치환이 없음;
(h) CH1 치환이 133V, 150A, 150D, 152D, 173D, 및/또는 188W로 이루어지는 경우, CH1 도메인 변이체와 우선적으로 페어링되는 LC에서 상응하는 치환이 없음;
(i) CH1 치환이 133S/W/A, 139W/V/G/I, 143K/E/A, 145E/T/L/Y, 146G, 147T/E, 174V, 1175D/R/S, 179K/D/R, 181R, 186R, 188F/L, 및/또는 190S/A/G/Y로 이루어지는 경우, CH1 도메인 변이체와 우선적으로 페어링되는 LC에서 상응하는 치환이 없음;
(j) CH1 치환이 143A/E/R/K/D 및145T/L로 이루어지는 경우, CH1 도메인 변이체와 우선적으로 페어링되는 LC에서 상응하는 치환이 없음;
(k) CH1 치환이 124A/R/E/W, 145M/T, 143E/R/D/F, 172R/T, 및 139W/G/C, 179E, 및/또는 186R로 이루어지는 경우, CH1 도메인 변이체와 우선적으로 페어링되는 LC에서 상응하는 치환이 없음;
(l) CH1 치환이 위치 126, 127, 128, 134, 141, 171, 또는 173에서 시스테인과 치환되는 것으로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 위치는 이황화 결합을 형성하도록 변형되지 않음;
(m) CH1 치환이 L145Q, H168A, F170G, S183V, 및/또는 T187E로 이루어지는 경우, CH1 도메인 변이체와 우선적으로 페어링되는 카파 또는 람다 LC에서 상응하는 치환이 없음;
(n) CH1 치환이 143D/E, 145T, 190E/D, 및/또는 124R로 이루어지는 경우, CH1 도메인 변이체와 우선적으로 페어링되는 LC에서 상응하는 치환이 없음; 또는
(o) CH1 치환이 A140C, K147C, 및/또는 S183C로 이루어지는 경우, CH1 도메인 변이체와 우선적으로 페어링되는 LC에서 치환이 있음.
일부 구현예에서, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 다음 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함한다: 118, 124, 126~129, 131, 132, 134, 136, 139, 143, 145, 147~151, 153, 154, 170, 172, 175, 176, 181, 183, 185, 190, 191, 197, 201, 203-206, 210, 212~214, 및 218. 임의로, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 (i) 람다 CL 도메인(또는 람다 CL 함유 폴리펩티드)과 비교해 카파 CL 도메인(또는 카파 CL 함유 폴리펩티드)과 우선적으로 페어링되고/되거나; (ii) 람다 경쇄 폴리펩티드와 비교해 카파 경쇄 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되는 방식으로 페어링된다.
소정의 구현예에서, 이러한 CH1 도메인 변이체는 위치 147, 위치 183, 또는 위치 147과 183에서의 아미노산 치환을 포함한다.
소정의 구현예에서, 이러한 CH1 도메인 변이체는 다음 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: 위치 118이 G로 치환됨; 위치 124가 H, R, E, L, 또는 V로 치환됨; 위치 126이 A, T, 또는 L로 치환됨; 위치 127이 V 또는 L로 치환됨; 위치 128이 H로 치환됨; 위치 129가 P로 치환됨; 위치 131이 A로 치환됨; 위치 132가 P로 치환됨; 위치 134가 G로 치환됨; 위치 136이 E로 치환됨; 위치 139가 I로 치환됨; 위치 143이 V 또는 S로 치환됨; 위치 145가 F, I, N, 또는 T로 치환됨; 위치 147 F, I, L, R, T, S, M, V, N, E, H, Y, Q, A, 또는 G로 치환됨; 위치 148이 I, Q, Y, 또는 G로 치환됨; 위치 149가 C, S, 또는 H로 치환됨; 위치 150이 L 또는 S로 치환됨; 위치 151이 A 또는 L로 치환됨; 위치 153가 S로 치환됨; 위치 154가 M 또는 G로 치환됨; 위치 170이 G 또는 L로 치환됨; 위치 172가 V로 치환됨; 위치 175가 G, L, E, A로 치환됨; 위치 176이 P로 치환됨; 위치 181이 Y, Q, 또는 G로 치환됨; 위치 183이 I, W, F, E, Y, L, K, Q, N, R, 또는 H로 치환됨; 위치 185가 W로 치환됨; 위치 190이 P로 치환됨; 위치 191가 I로 치환됨; 위치 197이 A로 치환됨; 위치 201이 S로 치환됨; 위치 203이 S로 치환됨; 위치 204가 Y로 치환됨; 위치 205가 Q로 치환됨; 위치 206이 S로 치환됨; 위치 210이 R로 치환됨; 위치 212가 G로 치환됨; 위치 213이 E 또는 R로 치환됨; 위치 214가 R로 치환됨; 및 위치 208이 Q로 치환됨.
소정의 구현예에서, 카파-선호 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 (i) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F, I, L, R, T, S, M, V, N, E, H, Y, 또는 Q를 포함할 수 있고/있거나; (ii) 위치 183에서의 아미노산 잔기 I, W, F, E, Y, L, K, Q, N, 또는 R을 포함할 수 있다.
카파-선호 CH1 도메인 변이체의 일부 바람직한 구현예에서, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 (i) 위치 183에서의 아미노산 잔기 R, K, 또는 Y를 포함할 수 있고/있거나; (ii) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F를 포함할 수 있다.
추가의 구현예에서, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 다음을 포함한다: (i) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및 위치 183에서 아미노산 잔기 R; (ii) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및 위치 183에서의 아미노산 잔기 K; (iii) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및 위치 183에서의 아미노산 잔기 Y; (iv) 위치 183에서의 아미노산 잔기 R; (v) 위치 183에서의 아미노산 잔기 K; 또는 (vi) 위치 183에서의 아미노산 잔기 Y. 임의로, 이러한 CH1 도메인 변이체는 다음의 아미노산 서열을 포함할 수 있다: (i) 서열번호 137; (ii) 서열번호 138; (iii) 서열번호 139; (iv) 서열번호 60; (v) 서열번호 41; 또는 (vi) 서열번호 136.
일부 구현예에서, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 CH1과 VH 사이의 계면 내의 CH1 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 임의로, 이러한 계면 내의 CH1 아미노산 위치는 위치 151이다. 또한 임의로, 이러한 CH1 도메인 변이체는 위치 151에서 아미노산 잔기 A 또는 L을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 (i) 람다 CL 도메인과 비교해 카파 CL 도메인과 CH1 도메인의 페어링; 및/또는 (ii) 람다 경쇄 폴리펩티드와 비교해 카파 경쇄 폴리펩티드와 CH1 도메인의 페어링을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항의 CH1 도메인 변이체는 (i) 람다 CL 도메인과 비교해 카파 CL 도메인과의 페어링을; 및/또는 (ii) 람다 경쇄 폴리펩티드와 비교해 카파 경쇄 폴리펩티드와의 페어링을 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%만큼 증가시킨다. 카파 페어링의 증가는 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LCMS)에 의해 임의로 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항의 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 (i) 람다 CL 도메인과 비교해 카파 CL 도메인과의 페어링을; 및/또는 (ii) 람다 경쇄 폴리펩티드와 비교해 카파 경쇄 폴리펩티드와의 페어링을 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 21배, 적어도 22배, 적어도 23배, 적어도 24배, 또는 적어도 25배만큼 증가시킨다. 카파 페어링의 증가는 유세포 계측에 의해, 예를 들어 람다 CL 염색에 대한 카파 CL 염색의 평균 형광 강도(MFI) 비율을 비교함으로써 임의로 정량화될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 EU 넘버링에 따른 다음 위치 중 하나 이상에서의 아미노산 치환을 포함한다: 119, 124, 126, 127, 130, 131, 133, 134, 138~142, 152, 163, 168, 170, 171, 175, 176, 181, 183~185, 187, 197, 203, 208, 210~214, 216, 및 218. 임의로, CH1 도메인 변이체는 (i) 카파 CL 도메인과 비교해 람다 CL 도메인과 우선적으로 페어링되고/되거나; (ii) 카파 경쇄 폴리펩티드와 비교해 람다 경쇄 폴리펩티드와 우선적으로 페어링된다.
소정의 구현예에서, 람다-선호 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 위치 141, 170, 171, 175, 181, 184, 185, 187, 및 218 중 하나 이상에서의 아미노산 치환을 포함한다.
소정의 구현예에서, 람다-선호 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 다음 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: 위치 119가 R로 치환됨; 위치 124가 V로 치환됨; 위치 126이 V로 치환됨; 위치 127이 G로 치환됨; 위치 130이 H 또는 S로 치환됨; 위치 131이 Q, T, N, R, V, 또는 D로 치환됨; 위치 133이 D, T, L, E, S, 또는 P로 치환됨; 위치 134가 A, H, I, P, V, N, 또는 L로 치환됨; 위치 138이 R로 치환됨; 위치 139가 A로 치환됨; 위치 140이 I, V, D, Y, K, S, W, R, L, 또는 P로 치환됨; 위치 141이 D, K, E, T, R, Q, V, 또는 M으로 치환됨; 위치 142가 M으로 치환됨; 위치 152가 G로 치환됨; 위치 163이 M으로 치환됨; 위치 168이 F, I, 또는 V로 치환됨; 위치 170이 N, G, E, S, 또는 T로 치환됨; 위치 171이 N, E, G, S, A, 또는 D로 치환됨; 위치 175가 D 또는 M으로 치환됨; 위치 176이 R 또는 M으로 치환됨; 위치 181이 V, L, A, K, 또는 T로 치환됨; 위치 183이 L 또는 V로 치환됨; 위치 184가 R로 치환됨; 위치 185가 M, L, S, R, 또는 T로 치환됨; 위치 187이 R, D, E, Y, 또는 S로 치환됨; 위치 197이 S로 치환됨; 위치 203이 D로 치환됨; 위치 208이 I로 치환됨; 위치 210이 T로 치환됨; 위치 211이 A로 치환됨; 위치 212가 N으로 치환됨; 위치 213이 E로 치환됨; 위치 214가 R로 치환됨; 위치 216이 G로 치환됨; 및 위치 218이 L, E, D, P, A, H, S, Q, N, T, I, M, G, C, K, 또는 W로 치환됨.
또 다른 소정의 구현예에서, 람다-선호 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 (i) 내지 (xvii) 중 어느 하나 또는 그 이상을 포함한다: (i) 위치 126에서의 아미노산 잔기 V; (ii) 위치 127에서의 아미노산 잔기 G; (iii) 위치 131에서의 아미노산 잔기 V; (iv) 위치 133에서의 아미노산 잔기 S; (v) 위치 138에서의 아미노산 잔기 R; (vi) 위치 140에서의 아미노산 잔기 I 또는 V; (vii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, K, E, 또는 T; (viii) 위치 142에서의 아미노산 잔기 M; (ix) 위치 168에서의 아미노산 잔기 I; (x) 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, G, 또는 S; (xi) 위치 171에서의 아미노산 잔기 E, D, G, S, 또는 A; (xii) 위치 175에서의 아미노산 잔기 M; (xiii) 위치 176에서의 아미노산 잔기 R; (xiv) 위치 181에서의 아미노산 잔기 K, V, A, 또는 L; (xv) 위치 184에서의 아미노산 잔기 R; (xvi) 위치 185에서의 아미노산 잔기 R; (xvii) 위치 187에서의 아미노산 잔기 R; 및 (xviii) 위치 218에서의 아미노산 잔기 L, E, D, P, A, H, S, Q, N, T, I, M, G, C, 또는 W.
소정의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 람다-선호 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 다음 치환 중 하나 이상을 포함하거나 이로 구성된다: 141D, 141E, 171E, 170E, 185R, 및 187R.
소정의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 람다-선호 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 다음 치환 중 2개 이상을 포함하거나 이로 구성된다: 141D, 141E, 171E, 170E, 185R, 및 187R.
소정의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 람다-선호 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 다음 치환 중 3개 이상을 포함하거나 이로 구성된다: 141D, 141E, 171E, 170E, 185R, 및 187R.
소정의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 람다-선호 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 다음 치환을 포함하거나 이로 구성된다: (i) 141E 및 185R; (ii) 141E 및 187R; (iii) 141E, 170E 또는 171E, 및 185R; (iv) 141E, 170E 또는 171E, 및 187R; (v) 141D 및 185R; (vi) 141D 및 187R; (vii) 141D, 170E 또는 171E, 및 185R; (viii) 141D, 170E 또는 171E, 및 187R; (ix) 141E, 185R, 및 187R; 또는 (x) 141D, 185R, 및 187R.
또 다른 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 람다-선호 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는, 위치 181에서 K로의 치환과 임의로 페어링되고 추가로 위치 218에서 L, E, D, P, A, H, S, Q, N, T, I, M, G, C, 또는 W로의 치환과 임의로 페어링된, 하나 이상의 위치 141에서 D, K, 또는 E로의 치환을 포함한다.
또 다른 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 람다-선호 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는, 위치 181에서 K로의 치환과 페어링된, 위치 141에서 D, K, 또는 E로의 치환 및/또는 위치 218에서 L, E, D, P, A, H, S, Q, N, T, I, M, G, C, 또는 W로의 치환을 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명에 따른 람다-선호 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 (i) 내지 (xvii) 중 어느 하나 또는 그 이상을 포함한다: (i) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, E, 또는 K; (ii) 위치 170에서의 아미노산 잔기 E; (iii) 위치 171에서의 아미노산 잔기 E; (iv) 위치 175에서의 아미노산 잔기 M; (v) 위치 181에서의 아미노산 잔기 K; (vi) 위치 184에서의 아미노산 잔기 R; (vii) 위치 185에서의 아미노산 잔기 R; (viii) 위치 187에서의 아미노산 잔기 R; (ix) 위치 218에서의 아미노산 잔기 P, A, 또는 E.
추가의 구현예에서, 본 발명에 따른 람다-선호 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 다음을 포함한다: (i) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D; (ii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D 및 위치 181에서의 아미노산 잔기 K; (iii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 181에서의 아미노산 잔기 K, 및 위치 218에서의 아미노산 잔기 A; (iv) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 181에서의 아미노산 잔기 K, 및 위치 218에서의 아미노산 잔기 P; (v) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E; (vi) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E 및 위치 181에서의 아미노산 잔기 K; (vii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 K; (viii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 K 및 위치 181에서의 아미노산 잔기 K; (ix) 위치 141에서의 아미노산 잔기 K, 위치 181에서의 아미노산 잔기 K, 및 위치 218에서의 아미노산 잔기 E; (x) 위치 141에서의 아미노산 잔기 K, 위치 181에서의 아미노산 잔기 K, 및 위치 218에서의 아미노산 잔기 P; (xi) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, 위치 181에서의 아미노산 잔기 V, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R; (xii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 171에서의 아미노산 잔기 D, 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R; (xiii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 171에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R; (xiv) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 171에서의 아미노산 잔기 G, 위치 185에서의 아미노산 잔기 R, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R; (xv) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 185에서의 아미노산 잔기 R, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R; (xvi) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 171에서의 아미노산 잔기 S, 및 위치 181에서의 아미노산 잔기 K; (xvii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 170에서의 아미노산 잔기 G, 위치 175에서의 아미노산 잔기 M, 위치 181에서의 아미노산 잔기 V, 위치 184에서의 아미노산 잔기 R, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R; (xviii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R; (xix) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R; (xx) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R; (xxi) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R; (xxii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R; (xxiii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R; (xxiv) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 185에서의 아미노산 잔기 R, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R; (xxv) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R; (xxvi) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R; (xxvii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 171에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R; (xxiii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 171에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R; 또는 (xxix) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 171에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R.
임의로, 이러한 CH1 도메인 변이체는 다음의 아미노산 서열을 포함한다: (i) 서열번호 140; (ii) 서열번호 141; (iii) 서열번호 142; (iv) 서열번호 143; (v) 서열번호 144; (vi) 서열번호 145; (vii) 서열번호 146; (viii) 서열번호 147; (ix) 서열번호 148; (x) 서열번호 149; (xi) 서열번호 155; (xii) 서열번호 157; (xiii) 서열번호 159; (xiv) 서열번호 162; (xv) 서열번호 163; (xvi) 서열번호 164; (xvii) 서열번호 165; (xviii) 서열번호 178; (xix) 서열번호 179; (xx) 서열번호 180; (xxi) 서열번호 181; (xxii) 서열번호 182; (xxiii) 서열번호 183; (xxiv) 서열번호 184; (xxv) 서열번호 185; (xxvi) 서열번호 186; (xxvii) 서열번호 187; (xxviii) 서열번호 188; 또는 (xxix) 서열번호 189.
일부 바람직한 구현예에서, 람다-선호 CH1 도메인 변이체는 다음을 포함한다: (i) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 171에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R; 또는 (ii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R.
추가의 바람직한 구현예에서, 람다-선호 CH1 도메인 변이체는 다음으로 이루어진 아미노산 치환을 포함한다: (i) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 171에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R; 또는 (ii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R.
소정의 바람직한 구현예에서, 람다-선호 CH1 도메인 변이체는 다음으로 이루어진 아미노산 치환을 포함한다: (i) 서열번호 188; 또는 (ii) 서열번호 186.
일부 구현예에서, 람다-선호 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 (i) 카파 CL 도메인과 비교해 람다 CL 도메인과 CH1 도메인의 페어링; (ii) 카파 경쇄 폴리펩티드와 비교해 람다 경쇄 폴리펩티드와 CH1 도메인의 페어링을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 (i) 카파 CL 도메인과 비교해 람다 CL 도메인과의 페어링; 및/또는 (ii) 카파 경쇄 폴리펩티드와 비교해 람다 경쇄 폴리펩티드와의 페어링을 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%만큼 증가시킬 수 있다. 람다 페어링의 증가는 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LCMS)에 의해 임의로 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는 (i) 카파 CL 도메인과 비교해 람다 CL 도메인과의 페어링; 및/또는 (ii) 카파 경쇄 폴리펩티드와 비교해 람다 경쇄 폴리펩티드와의 페어링을 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 21배, 적어도 22배, 적어도 23배, 적어도 24배, 또는 적어도 25배만큼 증가시킬 수 있다. 람다 페어링의 증가는 유세포 계측에 의해, 예를 들어 카파 CL 염색에 대한 람다 CL 염색의 MFI 값 비율을 비교함으로써 임의로 측정될 수 있다.
또 다른 양태에서, 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 항체 중쇄 폴리펩티드가 본원에 추가로 제공되며, 여기서 불변 영역은 전술한 것들 중 어느 하나에 따른 CH1 도메인 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 이러한 항체 중쇄 폴리펩티드의 CH1 도메인 변이체는 다음으로 이루어진 아미노산 치환을 포함한다:
(I) (i) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및 위치 183에서의 아미노산 잔기 R; (ii) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및 위치 183에서의 아미노산 잔기 K; (iii) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및 위치 183에서의 아미노산 잔기 Y; (iv) 위치 183에서의 아미노산 잔기 R; (v) 위치 183에서의 아미노산 잔기 K; 또는 (vi) 위치 183에서의 아미노산 잔기 Y; 또는
(II) (i) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 171에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R; 또는 (ii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R.
또 다른 양태에서, 제1 중쇄 폴리펩티드 및 제1 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 항체 단편이 본원에 추가로 제공되며, 여기서 (a) 제1 중쇄 폴리펩티드 및 제1 경쇄 폴리펩티드는 제1 동족 쌍을 형성하고; (b) 제1 중쇄 폴리펩티드는, 제1 CH1 도메인 변이체가 제1 경쇄에 우선적으로 결합하도록, EU 넘버링에 따른 다음 위치 중 하나 이상에서의 아미노산 치환을 포함하는 제1 CH1 도메인 변이체를 포함한다: 118, 119, 124, 126~134, 136, 138~143, 145, 147~154, 163, 168, 170~172, 175, 176, 181, 183~185, 187, 190, 191, 197, 201, 203~206, 208, 210~214, 216, 및 218. 임의로, 제1 경쇄 폴리펩티드는 야생형 CL 도메인인 제1 CL 도메인을 포함한다. 또한 임의로, 소정의 CH1 도메인 변이체는 전술한 것과 같이 배제될 수 있고, 본 발명에 따른 CH1 도메인 변이체는 전술한 것과 같이 (a) 내지 (o) 항목 중 하나 이상을 충족시킬 수 있다. 또한, 제2 중쇄 폴리펩티드 및 제2 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함하는 이러한 항체 또는 항체 단편이 본원에 제공되며, 여기서 (a) 제2 중쇄 폴리펩티드 및 제2 경쇄 폴리펩티드는 제2 동족 쌍을 형성하고; (b) 제2 중쇄 폴리펩티드는, 제2 CH1 도메인 변이체가 제2 CL 도메인을 포함하는 제2 경쇄 폴리펩티드에 우선적으로 결합하도록, EU 넘버링에 따른 다음 위치 중 하나 이상에서의 아미노산 치환을 포함하는 제2 CH1 도메인 변이체를 포함한다: 118, 119, 124, 126~134, 136, 138~143, 145, 147~154, 163, 168, 170~172, 175, 176, 181, 183~185, 187, 190, 191, 197, 201, 203~206, 208, 210~214, 216, 및 218. 다시 임의로, 소정의 CH1 도메인 변이체는 전술한 것과 같이 배제될 수 있고, 본 발명에 따른 CH1 도메인 변이체는 전술한 것과 같이 (a) 내지 (o) 항목 중 하나 이상을 충족시킬 수 있다. 또한 임의로, 이러한 항체 또는 항체 단편은 특징 (i) 내지 (vii) 중 하나 이상을 포함한다: (i) 제1 CL 도메인은 야생형 CL 도메인임; (ii) 제2 CL 도메인은 야생형 CL 도메인임; (iii) 제1 CL 도메인은 카파 CL 도메인임; (iv) 제1 CL 도메인은 람다 CL 도메인임; (v) 제2 CL 도메인은 카파 CL 도메인임; (vi) 제2 CL 도메인은 람다 CL 도메인임; (vii) 제1 CH1 도메인 변이체는 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 CH1 도메인 변이체임; (viii) 제2 CH1 도메인 변이체는 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 CH1 도메인 변이체임; 및/또는 (ix) 제1 CH1 도메인 변이체에서의 아미노산 치환(들)은 제2 CH1 도메인 변이체에서의 아미노산 치환(들)과 상이함.
추가로, 제1 중쇄 폴리펩티드 및 제1 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 항체 단편이 본원에 제공되며, 여기서 (a) 제1 중쇄 폴리펩티드 및 제1 경쇄 폴리펩티드는 제1 동족 쌍을 형성하고; (b) 제1 중쇄 폴리펩티드는 전술한 카파-선호 CH1 도메인 변이체 중 어느 하나에 따른 제1 CH1 도메인 변이체를 포함하고; (c) 제1 경쇄 폴리펩티드는 카파 CL 도메인을 포함하고, 임의로 카파 경쇄 폴리펩티드이다. 임의로, (i) 카파 CL 도메인은 야생형 CL 도메인이고/이거나; (ii) 제1 경쇄 폴리펩티드는 야생형 경쇄 폴리펩티드이다. 소정의 구현예에서, 제1 중쇄 폴리펩티드는 (i) 람다 CL 도메인과 비교해 카파 CL 도메인과 중쇄의 우선적 페어링을 추가로 촉진하고/하거나; (ii) 람다 경쇄 폴리펩티드와 비교해 카파 경쇄 폴리펩티드와 중쇄의 우선적 페어링을 추가로 촉진하는 하나 이상의 아미노산 치환을 CH1 도메인 외부에서 임의로 포함한다. CH1 도메인 외부의 하나 이상의 아미노산 치환은, 예를 들어 VH에 있을 수 있다.
또한, 제2 중쇄 폴리펩티드 및 제2 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 항체 단편이 본원에 제공되며, 여기서 (a) 제2 중쇄 폴리펩티드 및 제2 경쇄 폴리펩티드는 제1 동족 쌍을 형성하고; (b) 제2 중쇄 폴리펩티드는 전술한 람다-선호 CH1 도메인 변이체 중 어느 하나에 따른 제2 CH1 도메인 변이체를 포함하고; (c) 제2 경쇄 폴리펩티드는 람다 CL 도메인을 포함하고, 임의로 람다 경쇄 폴리펩티드이다. 임의로, (i) 람다 CL 도메인은 야생형 CL 도메인이고/이거나; (ii) 제2 경쇄 폴리펩티드는 야생형 경쇄 폴리펩티드이다. 소정의 구현예에서, 제2 중쇄 폴리펩티드는 (i) 카파 CL 도메인과 비교해 람다 CL 도메인과 중쇄의 우선적 페어링을 추가로 촉진하고/하거나; (ii) 카파 경쇄 폴리펩티드와 비교해 람다 경쇄 폴리펩티드와 중쇄의 우선적 페어링을 추가로 촉진하는 하나 이상의 아미노산 치환을 CH1 도메인 외부에서 임의로 포함한다.
또한, 제1 중쇄 폴리펩티드, 제1 경쇄 폴리펩티드, 제2 중쇄 폴리펩티드, 및 제2 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 항체 단편이 본원에 제공되며, 여기서 (a) 제1 중쇄 폴리펩티드와 제1 경쇄 폴리펩티드는 제1 동족 쌍을 형성하고; (b) 제1 중쇄 폴리펩티드는 전술한 카파-선호 CH1 도메인 변이체 중 어느 하나에 따른 CH1 도메인 변이체를 포함하는 제1 CH1 도메인을 포함하고; (c) 제1 경쇄 폴리펩티드는 카파 CL 도메인을 포함하고, 임의로 카파 경쇄 폴리펩티드이며; (d) 제2 중쇄 폴리펩티드와 제2 경쇄 폴리펩티드는 제2 동족 쌍을 형성하고; (e) 제2 중쇄 폴리펩티드는 전술한 람다-선호 CH1 도메인 변이체 중 어느 하나에 따른 CH1 도메인 변이체를 포함하는 제2 CH2 도메인을 포함하고; (f) 제2 경쇄 폴리펩티드는 람다 CL 도메인을 포함하고, 임의로 람다 경쇄 폴리펩티드이다. 소정의 구현예에서, 제1 중쇄 폴리펩티드는 (i) 람다 CL 도메인과 비교해 카파 CL 도메인과 중쇄의 우선적 페어링을 추가로 촉진하고/하거나; (ii) 람다 경쇄 폴리펩티드와 비교해 카파 경쇄 폴리펩티드와 중쇄의 우선적 페어링을 추가로 촉진하는 하나 이상의 아미노산 치환을 CH1 도메인 외부에서 임의로 포함한다. CH1 도메인 외부의 하나 이상의 아미노산 치환은, 예를 들어 VH에 있을 수 있다. 소정의 구현예에서, 제2 중쇄 폴리펩티드는 (i) 카파 CL 도메인과 비교해 람다 CL 도메인과 중쇄의 우선적 페어링을 추가로 촉진하고/하거나; (ii) 카파 경쇄 폴리펩티드와 비교해 람다 경쇄 폴리펩티드와 중쇄의 우선적 페어링을 추가로 촉진하는 하나 이상의 아미노산 치환을 CH1 도메인 외부에서 임의로 포함한다.
항체 또는 항체 단편 중 어느 하나는 다중특이적일 수 있고, 임의로 이중특이적일 수 있다. 임의로, 이러한 항체 또는 항체 단편의 구조는 도 24~29 중 어느 하나에 도시된 것과 같다.
일부 구현예에서, 전술한 것과 같은 다중특이적 항체 또는 항체 단편에서, 제1 및 제2 CH1 도메인 변이체는 비-동족 중쇄-경쇄 쌍의 형성을 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 전술한 것과 같은 다중특이적 항체 또는 항체 단편에서, 제1 및 제2 CH1 도메인 변이체는 동족 중쇄-경쇄 쌍의 형성을 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%만큼 증가시킨다.
일부 구현예에서, 비-동족 중쇄-경쇄 페어링의 감소 및/또는 동족 중쇄-경쇄 페어링의 증가는, 관심 CH1를 포함하는 HC(또는 VH + CH1), 카파 LC, 및 람다 LC로(HC:카파 LC:람다 LC = 2:1:1과 같은 소정의 비율로) 세포를 형질감염시키고, 실시예 7 및 도 23, 30, 또는 31에서와 같이 LCMS에 의해 경쇄 종을 측정함으로써 정량화될 수 있다. 이러한 정량화 방법 또는 유사한 정량화 방법을 사용하는 소정의 구현예에서, 예시적인 WT CH1은 HC-LC 쌍을 생성할 수 있는데, 이중 60%는 동족 쌍이고 이중 40%는 비동족 쌍이며, 본 개시에 따른 CH1 변이체의 경우, 동족 쌍의 백분율은 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%까지 증가될 수 있고, 비-동족 쌍의 백분율은 적어도 35%, 적어도 30%, 적어도 25%, 적어도 20%, 적어도 15%, 적어도 10%, 적어도 5%, 또는 0%까지 감소될 수 있다. 이러한 정량화 방법 또는 유사한 정량화 방법을 사용하는 특정 구현예에서, 동족 쌍의 백분율은 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%까지 증가될 수 있는 반면, 비동족 쌍의 백분율은 적어도 15%, 적어도 10%, 적어도 5%, 또는 0%까지 감소될 수 있다.
일부 구현예에서, 전술한 것과 같은 다중특이적 항체 또는 항체 단편에서, 제1 및 제2 CH1 도메인 변이체는 비-동족 중쇄-경쇄 쌍의 형성을 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 21배, 적어도 22배, 적어도 23배, 적어도 24배, 또는 적어도 25배만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 전술한 것과 같은 다중특이적 항체 또는 항체 단편에서, 제1 및 제2 CH1 도메인 변이체는 동족 중쇄-경쇄 쌍의 형성을 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 21배, 적어도 22배, 적어도 23배, 적어도 24배, 또는 적어도 25배만큼 증가시킨다.
일부 구현예에서, 비-동족 중쇄-경쇄 쌍의 감소 및/또는 동족 중쇄-경쇄 쌍의 증가는 관심 CH1을 포함하는 HC(또는 VH + CH1), 카파 LC, 및 람다 LC를 소정의 비율로 동시에 발현시켜세포(예: 효모 세포) 상에서 중쇄-경쇄 쌍이 제시되도록 하고, 항-카파 및 항-람다 항체로 세포를 염색하고, 카파 및 람다의 존재를 FACS에 의해, 예를 들어 도 2~5, 8~13, 및 19~22에서와 같이 MFI 값을 비교하여 정량화함으로써 정량화될 수 있다. 소정의 CH1의 카파 선호도를 비교하기 위해, 항-카파로 염색한 세포의 MFI : 항-람다로 염색한 세포의 MFI의 비율을 계산하고, 이를 WT CH1에 대한 이러한 비율로 나누어서 부모-대비-배수(FOP) 값을 수득할 수 있다. 소정의 CH1의 람다 선호도를 비교하기 위해, 항-람다로 염색한 세포의 MFI : 항-카파로 염색한 세포의 MFI의 비율을 계산하고, 이를 WT CH1에 대한 이러한 비율로 나눌 수 있다.
이러한 정량화 방법 또는 유사한 정량화 방법의 소정의 구현예에서, 본 개시에 따른 카파-선호 CH1 변이체의 경우, (카파 선호도, 즉 카파:람다의 MFI에 대해 계산된) FOP 값은 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 21배, 적어도 22배, 적어도 23배, 적어도 24배, 또는 적어도 25배만큼 증가될 수 있다. 이러한 정량화 방법 또는 유사한 정량화 방법의 소정의 구현예에서, 본 개시에 따른 람다-선호 CH1 변이체의 경우, (람다 선호도, 즉 람다:카파의 MFI에 대해 계산된) FOP 값은 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 21배, 적어도 22배, 적어도 23배, 적어도 24배, 또는 적어도 25배만큼 증가될 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 CH1 도메인 변이체는 위치 141에서의 치환을 포함하고, 비-동족 중쇄-경쇄 쌍의 형성을 적어도 50%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 제2 CH1 도메인 변이체는 위치 141에서의 치환을 포함하고, 제1 CH1 도메인 변이체는 위치 183에서의 치환 및 임의로 위치 147에서의 치환을 포함하며(그 반대의 경우도 같음), 비-동족 중쇄-경쇄 쌍의 형성을 적어도 50% 내지 적어도 75%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 제2 CH1 도메인 변이체는 141D 또는 141E를 포함하고, 제2 CH1 도메인 변이체는 183R, 183K, 또는 183Y 및 임의로 147F를 포함하며(그 반대의 경우도 같음), 비-동족 중쇄-경쇄 쌍의 형성을 적어도 50% 내지 적어도 75%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 제2 CH1 도메인 변이체는 141D 또는 141E, 170E, 171E, 181K, 185R, 187R, 및 218P를 포함하고, 제1 CH1 도메인 변이체는 183R, 183K, 또는 183Y 및 임의로 147F를 포함하며(그 반대의 경우도 같음), 비-동족 중쇄-경쇄 쌍의 형성을 적어도 50% 내지 적어도 75%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 제2 CH1 도메인 변이체는 141D, 171E, 185R, 및 141D, 171E, 및 187R의 조합 또는 141D, 181K, 및 218P의 조합을 포함하고, 제2 CH1 도메인 변이체는 183R, 183K, 또는 183Y 및 임의로 147F를 포함하며(그 반대의 경우도 같음), 비-동족 중쇄-경쇄 쌍의 형성을 적어도 50% 내지 적어도 75%만큼 감소시킨다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 CH1 도메인 변이체는 원하는 제1 및 제2 동족 쌍의 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 형성한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 CH1 도메인 변이체는 원하는 제1 및 제2 동족 쌍의 약 85% 내지 약 95%를 형성한다. 일부 구현예에서, 제2 CH1 도메인 변이체는 위치 141에서의 치환을 포함하고, 제1 CH1 도메인 변이체는 위치 183에서의 치환 및 임의로 위치 147에서의 치환을 포함하며(그 반대의 경우도 같음), 원하는 제1 및 제2 동족 쌍의 약 85% 내지 적어도 약 95%를 형성한다. 일부 구현예에서, 제2 CH1 도메인 변이체는 141D 또는 141E를 포함하고, 제1 CH1 도메인 변이체는 183R, 183K, 또는 183Y 및 임의로 147F를 포함하며(그 반대의 경우도 같음), 원하는 제1 및 제2 동족 쌍의 약 85% 내지 적어도 약 95%를 형성한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 CH1 도메인 변이체는 비-동종 중쇄-경쇄 쌍 형성의 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 제2 CH1 도메인 변이체는 위치 141, 170, 171, 181, 185, 187, 및/또는 218에서의 치환을 포함하고, 제1 CH1 도메인 변이체는 위치 183에서의 치환 및 임의로 위치 147에서의 치환을 포함하며(그 반대의 경우도 같음), 비-동족 중쇄-경쇄 쌍 형성의 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 제2 CH1 도메인 변이체는 141D 또는 141E, 170E, 171E, 181K, 185R, 187R, 및 218P 중 하나 이상을 포함하고, 제1 CH1 도메인 변이체는 183R, 183K, 또는 183Y 및 임의로 147F를 포함하며(그 반대의 경우도 같음), 비-동족 중쇄-경쇄 쌍 형성의 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만을 감소시킨다.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 약학적 조성물 진단 조성물이 추가로 본원에 제공된다: (i) 전술한 것과 같은 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드; (ii) 기술된 것과 같은 항체 중쇄 폴리펩티드; 및/또는 (iii) 전술한 것과 같은 항체 또는 항체 단편.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 항체 및 약학적 조성물의 치료적 용도 및 진단적 용도가 추가로 본원에 제공된다: (i) 전술한 것과 같은 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드; (ii) 기술된 것과 같은 항체 중쇄 폴리펩티드; 및/또는 (iii) 전술한 것과 같은 항체 또는 항체 단편.
또 다른 양태에서, 다음을 암호화하는 핵산이 추가로 본원에 제공된다: (i) 전술한 것과 같은 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드; (ii) 기술된 것과 같은 항체 중쇄 폴리펩티드; 및/또는 (iii) 전술한 것과 같은 항체 또는 항체 단편.
또 다른 양태에서, 다음을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터 또는 이 핵산으로 형질감염된 세포, 및 전술한 것들을 제조하기 위한 이들의 용도가 추가로 본원에 제공된다: (i) 전술한 것과 같은 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드; (ii) 기술된 것과 같은 항체 중쇄 폴리펩티드; 및/또는 (iii) 전술한 것과 같은 항체 또는 항체 단편.
또 다른 양태에서, 본 개시는 CH1 변이체 도메인 라이브러리를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: (a) (i) 카파 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 페어링된, CH1 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 하나 이상의 세트(“Cκ 세트”); (ii) 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 페어링 된, CH1 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 하나 이상의 세트(“Cλ 세트”); 및/또는 (iii) Cκ 세트 및/또는 Cλ 세트 내의 VH를 제공하는 단계; (b) Cκ 세트 내의 카파 CL 도메인 및/또는 Cλ 세트 내의 람다 CL 도메인 내의 하나 이상의 아미노산 위치와 접촉하는 CH1 도메인의 하나 이상의 아미노산 위치를 선택하는 단계; 및 (c) CH1 도메인 변이체 폴리펩티드의 라이브러리 또는 CH1 도메인 변이체 암호화 작제물의 라이브러리를 생산하는 단계(단계 (a) 내지 단계 (c))를 포함하되, 단계 (b)에서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치 중 하나 이상은 임의의 비야생형 아미노산으로 치환된다. 임의로, CH1 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역(VH)을 추가로 포함하고, 추가로 임의로 카파 또는 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 경쇄 가변 영역(VL)을 추가로 포함한다.
임의로: 단계 (I) 단계 (a)에서, 상기 CH1 도메인, 상기 카파 CL 도메인, 및 상기 람다 CL 도메인은 야생형 및/또는 인간이고; (II) 단계 (a)에서, (i) 카파 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 페어링된 CH1 도메인을 포함하는 상기 폴리펩티드 및 (ii) 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 페어링된 CH1 도메인을 포함하는 상기 폴리펩티드는 온전한 항체이거나 단편 항원 결합(“Fab”)이고; (III) 단계 (b)에서, CH1 도메인의 하나 이상의 아미노산 위치는 다음 경우에 선택되고: CH1 도메인의 하나 이상의 아미노산 위치에 있는 아미노산 잔기가 (i) 카파 CL 도메인 내의 상기 하나 이상의 아미노산 위치에 있는 아미노산 잔기의 측쇄 원자, (ii) 람다 CL 도메인 내의 상기 하나 이상의 아미노산 위치에 있는 아미노산 잔기의 측쇄 원자, 및/또는 (iii) VH 내의 상기 하나 이상의 아미노산 위치에 있는 아미노산 잔기의 측쇄 원자의 5 Å의 거리 이내에서 측쇄 원자를 갖는 경우; 및/또는 (IV) 단계 (c)의 상기 생산하는 단계는 퇴화 코돈, 임의로 6개의 자연 발생 아미노산(D, T, A, E, K, 및 N)을 나타내는 퇴화 RMW 코돈, 또는 20개의 자연 발생 아미노산 잔기 모두를 나타내는 퇴화 NNK 코돈을 통해 이루어진다.
일부 구현예에서, 단계 (b)에서 선택된 하나 이상의 CH1 아미노산 위치는: (i) 대표적인 Cκ 세트의 적어도 10%에서 카파 CL 도메인과의 계면에 있고, 대표적인 Cκ 세트의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 용매 접근가능 표면적을 갖고; (ii) 대표적인 Cλ 세트의 적어도 10%에서 람다 CL 도메인과의 계면에 있고, 대표적인 Cλ 세트의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 용매 접근가능 표면적을 갖고/갖거나; (iii) 대표적인 Cκ 및/또는 Cλ 세트의 적어도 10%에서 VH와의 계면에 있고, 대표적인 Cκ 및/또는 Cλ 세트의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 용매 접근가능 표면적을 갖는다.
일부 구현예에서, 단계 (b)에서 선택된 아미노산 위치는 EU 넘버링에 따른 위치 118, 119, 124, 126~134, 136, 138~143, 145, 147~154, 163, 168, 170~172, 175, 176, 181, 183~185, 187, 190, 191, 197, 201, 203~206, 208, 210~214, 216, 및 218 중 하나 이상을 포함한다. 임의로, 소정의 CH1 도메인 변이체는 전술한 바와 같이 제외될 수 있고, 본 발명에 따른 CH1 도메인 변이체는 전술한 것과 같은 기준 (a) 내지 (o)를 충족할 수 있다.
일부 구현예에서, 단계 (c)에서의 CH1 변이체 도메인 또는 CH1 도메인 변이체의 라이브러리를 암호화하는 합성된 폴리펩티드는 효모 균주에서 발현된다. 일부 구현예에서, 효모 균주는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다. 일부 구현예에서, 효모 균주와 같은 세포 시스템은 (i) 카파 경쇄와 같은 카파 CL 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드, 및 (ii) 람다 경쇄와 같은 람다 CL 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 공발현한다. 임의로, 여기서 카파 및/또는 람다 CL 도메인은 야생형이다. 또한 임의로, 카파 및/또는 람다 CL 도메인은 인간이다.
일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 하나 이상의 치환된 CH1 아미노산 잔기가 카파 경쇄 또는 람다 경쇄에 대한 우선적 페어링을 유도하는지를 검증하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 치환된 CH1 아미노산 잔기가 카파 경쇄 또는 람다 경쇄에 대한 우선적 페어링을 유도하는지를 검증하기 위해 형광 활성화된 세포 분류가 사용된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 카파 불변(Cκ) 도메인, 하나 이상의 람다 불변(Cλ) 도메인, 및 하나 이상의 CH1 도메인은 야생형이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 카파 불변(Cκ) 도메인, 하나 이상의 람다 불변(Cλ) 도메인, 및 하나 이상의 CH1 도메인은 인간이다.
일부 구현예에서, CH1 도메인 라이브러리를 생성하는 방법은: (a) EU 넘버링에 따른 다음 CH1 아미노산 위치 중 하나 이상을 선택하는 단계: 118, 119, 124, 126~134, 136, 138~143, 145, 147~154, 163, 168, 170~172, 175, 176, 181, 183~185, 187, 190, 191, 197, 201, 203~206, 208, 210~214, 216, 및 218; (b) 단계 (a)에서 선택된 위치(들)와 상이한 하나 이상의 관심 CH1 아미노산 위치를 선택하는 단계; 및 (c) CH1 도메인 변이체 폴리펩티드의 라이브러리 또는 CH1 도메인 변이체 암호화 작제물의 라이브러리를 생산하는 단계(단계 (a) 내지 단계 (c))를 포함하되, 단계 (a) 및 (b)에서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치 중 하나 이상은 임의의 비야생형 아미노산으로 치환된다. 소정의 구현예에서, 단계 (a)에서 선택된 아미노산 위치(들)는 위치 141, 147, 151, 170, 171, 181, 183, 185, 187, 또는 218, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, 단계 (c)의 상기 생산하는 단계는 퇴화 코돈, 임의로 6개의 자연 발생 아미노산(D, T, A, E, K, 및 N)을 나타내는 퇴화 RMW 코돈, 또는 20개의 자연 발생 아미노산 잔기 모두를 나타내는 퇴화 NNK 코돈을 통해 이루어진다. 소정의 구현예에서, 단계 (c)에서, 단계 (a)에서 선택된 아미노산 위치(들)는 소정의 아미노산으로 치환될 수 있고, 단계 (b)에서 선택된 아미노산 위치(들)는 퇴화 코돈을 통해 치환된다. 임의로, 소정의 아미노산으로의 치환은 A141D, A141E, K147F, P151A, P151L, F170E, P171E, S181K, S183R, V185R, T187R, 또는 K218P, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 (A) 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 비교해 카파 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되거나; (B) 카파 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 비교해 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되는 하나 이상의 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드를 식별하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 단계 (a) 내지 (c)를 포함한다: (a) 하나 이상의 후보 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드를 (i) 카파 CL 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 및 (ii) 람다 CL 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드와 공발현하는 단계; (b) (i) 카파 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 페어링된 후보 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드의 양과 (ii) 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 페어링된 후보 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드의 양을 비교하는 단계; (c) 단계 (b)에서의 비교에 기초하여, (A) 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 비교해 카파 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되거나; (B) 카파 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 비교해 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되는 하나 이상의 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드를 선택하는 단계. 단계 (a)에서, 일반적으로, 발현된 후보 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드의 총량 및 발현된 (카파 및 람다) CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 총량은 대략 같을 수 있다. 임의로 단계 (a)에서, 후보 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드, 카파 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 및 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 대략 2:1:1의 비율로 발현된다.
일부 구현예에서, 단계 (a)에서, (i) 카파 CL 도메인을 포함하는 상기 하나 이상의 폴리펩티드 및 (ii) 람다 CL 도메인을 포함하는 상기 하나 이상의 폴리펩티드는 야생형 및/또는 인간이다.
일부 구현예에서, 단계 (b)에서, 양은 형광 활성화 세포 분류를 통해 결정되거나 액체 크로마토그래피-질량 분광 분석을 통해 결정된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 (d) 하나 이상의 대조군 CH1 도메인 변이체를 (i) 카파 CL 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 및 (ii) 람다 CL 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드와 공동-발현하는 단계(단계 (d))를 추가로 포함하며, 임의로 여기서 상기 하나 이상의 대조군 CH1 도메인 변이체 중 하나 이상은 전술한 것들 중 어느 하나의 CH1 도메인 변이체에 따른 것이다.
도 1a~c는 Cλ 도메인 또는 Cκ 도메인에 대한 CH1 도메인 변이체의 결합 개략도이다. 도 1a는 Cλ 및 Cκ와 야생형 CH1 도메인의 이종이량체화를 보여준다(야생형 또는 변형되지 않은 CH1 도메인은 CH1WT로 지칭됨). 도 1b는 Cκ와 우선적으로 페어링되는 CH1 도메인 변이체를 보여준다(Cκ에 우선적으로 페어링되는 이러한 CH1 도메인 변이체는 CH1κ로 지칭됨). 도 1c는 Cλ와 우선적으로 페어링되는 CH1 도메인 변이체를 보여준다(Cλ에 우선적으로 페어링되는 이러한 CH1 도메인 변이체는 CH1λ로 지칭됨).
도 2a 및 도 2b는 람다 CL 도메인 선호도를 갖는 CH1 도메인 변이체(도 2a) 또는 카파 CL 도메인 선호도를 갖는 CH1 도메인 변이체(도 2b)를 식별하기 위해 다수의 선택 라운드를 거치는 예시적인 FACS 플롯을 보여준다. R1 = 제1 선택 라운드, R2 = 제2 선택 라운드, R3 = 제3 선택 라운드. x-축은 PE로 표지된 람다 경쇄를 나타내고, y-축은 FITC로 표지된 카파 경쇄를 나타낸다.
도 3은 람다 CL 도메인 선호도 또는 카파 CL 도메인 선호도를 갖는 CH1 도메인 변이체를 발현하는 개별 고유 클론을 보여준다. 항-카파 중앙값 형광 강도(MFI) 대 항-람다 MFI의 비율(카파:람다 비율)에 대해 클론에 점수를 매겼다. 임의의 개별 클론에 대한 카파:람다 비율을 야생형 CH1 서열(“부모”)을 갖는 일치하는 균주와 비교하였다. FOP는 부모-대비-배수를 의미한다.
도 4는 위치 141, 147, 또는 183(EU 넘버링)에서 아미노산 치환을 갖는 CH1 도메인 변이체를 발현하는 개별 고유 클론을 보여준다. 항-카파 MFI 대 항-람다 MFI의 비율에 대해 클론에 점수를 매기고, 부모와 비교하여 FOP를 결정하였다. CH1 위치 147 및 183을 카파 CL 도메인 선호도를 제공하는 2개의 위치로서 식별하였다. CH1 위치 141을 람다 CL 도메인 선호도를 제공하는 위치로서 식별하였다.
도 5는 항-카파 MFI 대 항-람다 MFI의 비율에 의해 측정했을 때 CH1 도메인 내 위치 141, 147, 및/또는 183(EU 넘버링)에서 람다 CL 도메인 선호도를 갖는 특정 아미노산 치환(A141T, Q, D, 또는 R) 또는 카파 CL 도메인 선호도를 갖는 특정 아미노산 치환(K147V, A, F, Y, 또는 M; S183K, Y, E, R, W, Q)을 보여준다. 흰 점(V134; T141, V147; A151 및 K183)으로 도시된 아미노산 치환은 다양화된 라이브러리로부터 초기 선택 후에 다수의 위치에서 식별한 것이고, 검은 점으로 도시된 아미노산 치환은 다양화된 라이브러리로부터 141, 147, 및 183 위치를 표적으로 한 추가의 선택 라운드 후에 식별한 것이다. 부모 κ:λ 비율(야생형 신호): GAL1 Cκ; GAL10 Cλ: 3.58 및 GAL1 Cλ; GAL10 Cκ: 0.3. 부모 비율은 실험 반복에 대한 평균이다. 위치 147 및 183 모두에서 치환을 갖는 CH1 변이체의 경우, 열거된 제1 아미노산은 위치 147에서의 변이체이고, 열거된 제2 아미노산은 183에서의 변이체이다(예를 들어, Y x F는 치환 K147Y 및 S183F를 갖는 CH1 변이체를 의미함).
도 6a~e는 야생형 CH1 도메인(BsAb1 및 BsAb15)와 비교했을 때, CH1 도메인 변이체가 다중특이적 항체(BsAb2~BsAb14)의 표적 결합을 변경시키지 않았음을 입증하는 대표적인 결합 데이터를 보여준다. 도 6a는 BsAb1~3에 대한 IL12B 및 EGFR 결합 데이터를 보여준다. 도 6b는 BsAb 5, 7, 및 4에 대한 IL12B 및 EGFR 결합 데이터를 보여준다. 도 6c는 BsAb 9, 10, 및 6에 대한 IL12B 및 EGFR 결합 데이터를 보여준다. 도 6d는 BsAb 11, 12, 및 8에 대한 IL12B 및 EGFR 결합 데이터를 보여준다. 도 6e는 BsAb13~15에 대한 IL12B 및 EGFR 결합 데이터를 보여준다. Pani = 파니투무맙; Uste = 우스테키누맙.
도 7은 야생형 CH1 도메인을 함유하는 이중특이적 항체(BsAb1)와 비교해 CH1 도메인 변이체를 함유하는 이중특이적 항체(BsAb2~BsAb14)에서 정확한 중쇄-경쇄 페어링(HC1-LC1 또는 HC2-LC2)의 증가와 동시에 중쇄-경쇄 미스페어링(HC1-LC2 및 HC2-LC1)의 감소를 보여준다.
도 8은 야생형 클론, A141D 클론, 및 실시예 5에서 141x181x218 라이브러리 선택 출력으로부터 수득된 상이한 아미노산 치환을 CH1 도메인의 위치 141, 181, 및 218에서 갖는 개별 클론에 대한 람다 선호도 FOP 값을 보여준다. 직사각형 내에 표시된 13개의 데이터 포인트는 가장 높은 FOP 값을 갖는 클론에 상응하고, CH1 위치 141, 181, 및 218에서의 아미노산 잔기, 및 각 클론에 대한 FOP 값은 표 8에 제공되어 있다.
도 9는 야생형 클론, A141D 클론, 및 실시예 5에서 141x181x218 라이브러리 선택 출력으로부터 수득된 아미노산 치환 D를 위치 141에서 갖고, 아미노산 치환 K를 위치 181에서 갖고, 다양한 아미노산 치환을 위치 218에서 갖는 개별 클론에 대한 람다 선호도 FOP 값을 보여준다. 흰색 데이터 포인트는 동일한 CH1 서열을 갖는 개별 클론의 FOP를 나타내고, 검은색 데이터 포인트는 평균 FOP 값을 나타낸다.
도 10은 재-클로닝된 클론, WT, 및 A141D 클론으로 측정한 람다 선호도 FOP 값을 나타내며, 람다 선호도가 유지되고 있음을 확인할 수 있다.
도 11은 실시예 5에서 선택된 9개의 141x181x218 리드 중 하나의 CH1, 야생형 CH1, 및 A14D의 CH1을 갖는, HEK293에서 생산된 IgG의 예시적인 산포도로서, 카파 CL 및 람다 CL에 대해 염색한 것이다. 개별 클론의 산포도는 WT 플롯과 중첩시킨 것이다. x-축은 PE로 표지된 람다 경쇄를 나타내고, y-축은 FITC로 표지된 카파 경쇄를 나타낸다.
도 12는 실시예 5로부터의 9개의 리드에 대한 람다 선호도 FOP 값을 야생형 및 A141D의 람다 선호도 FOP 값과 함께 보여준다. HEK293을 대상으로 이어지는 2쇄(카파 또는 람다) 형질감염을 위해, FOP 값이 가장 높은 3개의 CH1 변이체(D_K_WT, D_K_P, 및 D_K_A)를 선택하였다.
도 13은 위치 141에서 동일한 아미노산을 갖는 CH1 변이체들 간의 람다 선호도 FOP 값을 비교한 것이다. 위치 141이 D인 경우, 위치 181 또는 위치 181과 218에서의 추가 아미노산 치환은 FOP 값을 추가로 증가시킨다.
도 14는 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(“LCMS”)에 의해 측정했을 때, HEK293에서 생산된 9개의 전장 리드 IgG의 경쇄 종 백분율(%)을 (카파와 람다를 비교하여) 보여준다. HEK293을 대상으로 이어지는 형질감염을 위해, FOP 값이 가장 높은 3개의 CH1 변이체(D_K_WT, D_K_P, 및 D_K_A)를 선택하였다.
도 15는 야생형 수율 대비 3개의 리드(D_K_WT, D_K_P, 및 D_K_A) 및 A141D의 예시적인 공정 수율을 도시한 것으로서, 부모-대비-배수(“FOP”) 값으로서 도시되어 있다.
도 16은 3개의 리드 CH1 변이체(D_K_WT, D_K_P, 및 D_K_A) 중 하나, 또는 A141D 또는 WT를 갖는 카파 페어링된 Fab 및 람다 페어링된 Fab의 Tm(℃)을 보여준다.
도 17은 [람다 페어링된 WT Fab 대비 람다 페어링된 변이체 Fab의 Tm 변화(“Δ람다 Tm”)] - [카파 페어링된 WT Fab 대비 카파 페어링된 변이체 Fab의 Tm 변화(“Δ카파 Tm”)]로서 정의했을 때, 상대 람다 Tm(℃)을 보여준다.
도 18은 실시예 6의 출력을 재-클로닝하고, 출력 클론 중에서 관찰된 빈번한 아미노산 치환을 시각화한 시퀀싱 결과를 제공한다.
도 19는 실시예 6의 출력을 재-클로닝하여 수득한 리드를 비롯하여 실시예 5의 141x181x218 리드 중 일부(DKP, DKA, KKE, KKP, 및 EKK)에 대한 람다 선호도 FOP 값(람다 MFI:카파 MFI)을 도시한 것으로서, 효모에서 IgG로서 발현시킨 것들에 대한 람다 선호도 FOB 값이다. 화살표로 표시된 적어도 7개의 리드는 시험된 141x181x218 리드의 값과 동등하거나 그보다 높은 FOP 값을 갖는다.
도 20은 실시예 7의 14개의 리드를 비롯하여 실시예 5에서 식별된 DKP, A141D, 및 야생형에 대한 람다 선호도 FOP 값을 보여준다. 화살표로 표시된 2개의 리드, “A414D_P171E_V185R” 및 “A141D_F170E_T187R”은 DKP보다 더 높은 FOP 값을 나타냈다. 14개의 리드 모두는 야생형보다 더 높은 FOP 값을 나타냈다.
도 21은 실시예 7에서의 14개의 CH1 도메인 변이체 및 3개의 대조군(실시예 5에서 식별된 DKP, A141D, 및 야생형)에 대한 람다 선호도를 비교하는 예시적인 FACS 플롯을 보여준다. x-축은 PE로 표지된 람다 경쇄를 나타내고, y-축은 FITC로 표지된 카파 경쇄를 나타낸다. 각 플롯에서의 넘버링은 표 14에 표시된 순위#이다. 예를 들어, “1” 및 “2”로 넘버링된 처음 2개의 플롯은 각각 “A414D_P171E_V185R” 및 “A141D_F170E_T187R”의 플롯이다.
도 22는 도 21의 개별 플롯(“a”로 표시됨), 야생형 플롯(“b”로 표시됨), 및 DKP 플롯(“c”로 표시됨)의 예시적인 FACS 플롯 오버레이를 보여준다.
도 23은 실시예 7에서 LCMS로 측정했을 때, HEK293에서 생산된 14개의 리드 및 3개의 대조군 전장 IgG의 (카파 및 람다와 비교하는) 경쇄 종 백분율(%)을 보여준다. 3개의 대조군은 흰색 화살표로 도시되어 있다. “A414D_P171E_V185R” 및 “A141D_F170E_T187R”(검은색 화살표)은 양성 대조군 “DKP”에 비해 더 높은 람다 경쇄 백분율(%) 및 더 낮은 카파 경쇄 백분율(%)을 나타냈다.
도 24 내지 도 29는 본원에 개시된 CH1 도메인 변이체가 사용될 수 있는 다양한 다중특이적 항체 구조의 예시적이고 비제한적인 구현예를 제공한다. 달리 명시되지 않는 한, 도 24 내지 도 29에는 다음이 적용된다: (1) 각각의 도메인은 직사각형으로서 제시되고, 그 안에 있는 텍스트는 도메인 이름(예를 들어, CH1, VH1 등)을 나타낸다; (2) 검은색 직사각형 및 점으로 채워진 직사각형은 카파 또는 람다 선호도를 갖는 CH1 도메인 변이체이고, 이는 본원에 개시된 CH1 도메인 변이체일 수 있다; (3) “CH1κ”는 카파 CL 선호도를 갖는 CH1 도메인 변이체이고, “CH1λ”는 람다 선호도를 갖는 CH1 도메인 변이체이고, “κ” 또는 “λ”의 표시가 없는 “CH1”은 경쇄 이소형 선호도를 갖거나 갖지 않는 임의의 CH1 도메인, 야생형, 또는 변이체이다; (4) “Cκ”는 카파 CL 도메인이고, “Cλ”는 람다 CL 도메인이고, “κ” 또는 “λ”의 표시가 없는 “CL”은(검은색 또는 점으로 채워진 CH1 도메인과 페어링된 것으로 나타날 때), 페어링된 검은색 또는 점으로 채워진 CH1 도메인이 선호도를 갖는 이소형의 CL 도메인(카파 또는 람다)을 나타낸다; (5) 둘 이상의 검은색 및/또는 점으로 채워진 CH1 도메인이 다중특이적 구조에 존재하는 경우, 적어도 하나는 본원에 개시된 CH1 도메인 변이체이고, 나머지는 본원에 개시된 CH1 도메인 변이체이거나 아닐 수 있다; (6) 검은색 CH1 도메인 및 점으로 채워진 CH1 도메인 둘 다가 다중특이적 구조에 존재하는 경우, 검은색 및 점으로 채워진 것들은 상이한 경쇄 이소형 선호도를 갖는 CH1 도메인을 나타낸다(즉, 검은색이 카파 선호도를 갖는 CH1 도메인을 나타내는 경우, 점으로 채워진 것은 람다 선호도를 갖는 CH1 도메인을 나타내고, 그 반대의 경우도 같음); (7) VH1 및 VL1은 제1 에피토프에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, VH2 및 VL2는 제2 에피토프에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, VH3 및 VL3은 제3 에피토프에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, VH4 및 VL4는 제4 에피토프에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, VH5 및 VL5는 제5 에피토프에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, VH6 및 VL6은 제6 에피토프에 대한 항원 결합 부위를 형성한다; (8) 전체적으로 특이성 조합이 제시된 구조에 다중특이성을 부여하는 한, 제1 내지 제6 에피토프는 모두 서로 상이하거나, 제1 내지 제6 에피토프의 모두가 서로 상이하지는 않을 수 있다; (9) 서로 연결된 다수의 도메인 세트는 폴리펩티드(예를 들어, 중쇄 폴리펩티드, 경쇄 폴리펩티드 등)를 나타낸다; (10) 폴리펩티드 내의 도메인의 방향은 N-말단에서 C-말단 방향으로 도메인 이름을 나타내는 텍스트의 방향을 따른다; (11) 도면에서 링커, 힌지, 또는 이황화 결합이 명시적으로 도시되지 않는 경우라도, 필요에 따라 도메인들 사이에 링커 또는 힌지가 사용되거나 폴리펩티드들 사이에 (및/또는 도메인 내에) 이황화 결합(들)이 존재하여 항원 결합 부위(들)의 정확한 형성을 가능하게 할 수 있다; (12) 도면에 도시된 CH2 및/또는 CH3 도메인(들)은 가능하면 언제든 생략될 수 있고, 경우에 따라 힌지로 교체될 수 있다; (13) CH1, CH2, 및 CH3 도메인은 개별적으로 야생형 또는 변이체일 수 있고, 개별적으로는 임의의 (중쇄) 이소형일 수 있다; 및 (14) 둘 이상의 CH1 도메인이 구조 내에 존재할 때, CH1 도메인은 동일한 이소형이거나 아닐 수 있고, 둘 이상의 CH2 도메인이 구조 내에 존재할 때, CH2 도메인은 동일한 이소형이거나 아닐 수 있으며, 둘 이상의 CH3 도메인이 구조 내에 존재할 때, CH3 도메인은 동일한 이소형이거나 아닐 수 있다.
도 24a 내지 도 24c는 본원에 개시된 CH1 도메인 변이체가 사용될 수 있는 다양한 다중특이적 항체 구조의 일부 예시적이고 비제한적인 구현예를 제공한다. 도 24a에서는 카파-선호 CH1 도메인(“CH1κ”)이 하나의 폴리펩티드에 사용된다. 다른 CH1 도메인은 람다 CL 도메인에 대한 선호도를 갖거나 갖지 않을 수 있고, 본원에 개시된 CH1 도메인 변이체이거나 아닐 수 있다. 도 24b에서는 람다-선호 CH1 도메인(“CH1λ”)이 하나의 폴리펩티드에 사용된다. 다른 CH1 도메인은 카파 CL 도메인에 대한 선호도를 갖거나 갖지 않을 수 있고, 본원에 개시된 CH1 도메인 변이체이거나 아닐 수 있다. 도 24c에서는 CH1κ가 하나의 폴리펩티드에 사용되고, CH1λ가 하나의 폴리펩티드에 사용된다. 이러한 일반적인 구조는 미스페어링된 화합물을 제거하기 위한 노력 없이 또는 최소의 노력으로 이중특이적 화합물의 제조를 가능하게 한다. CH1κ 및 CH1λ 도메인 중 적어도 하나는 본원에 개시된 CH1 도메인 변이체이다. 위의 (10)에서 기술된 바와 같이, 폴리펩티드 내의 도메인의 방향은 N-말단에서 C-말단 방향으로 도메인 이름을 나타내는 텍스트의 방향을 따른다. 따라서, 도 24a의 상단 좌측 화합물의 경우, N-말단에서 C-말단의 방향으로, 제1 폴리펩티드는 VH1-CH1k-CH2-CH3을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 VL1-Ck를 포함하고, 제3 폴리펩티드는 VH2-CH1-CH2-CH3을 포함하고, 제4 폴리펩티드는 VL2-CL을 포함한다. 도 24a~24c(및 모든 다른 적용 가능한 도면)의 상단 중앙 및 상단 우측에 있는 삼각형은 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드의 이종이량체화를 촉진하는 “노브-인-홀” 조작과 같은 메커니즘을 나타낸다. 도 24a~24c(및 모든 다른 적용 가능한 도면)의 하단 중앙에 있는 화합물은 CH1κ 함유 폴리펩티드와 CH1λ 함유 폴리펩티드를 연결하는 힌지 구조를 도시한다. 2개의 결합(예를 들어, 이황화 결합)이 2개의 폴리펩티드를 연결하는 것으로 명시적으로 도시되어 있지만, 결합의 수 및 결합의 정확한 장소/위치는 달라질 수 있고 적절하게 선택될 수 있다. 도 24c의 하단 좌측에 있는 “+”는 2개의 상이한 Fab 단편의 혼합물을 나타낸다.
도 25a 내지 도 25b는 본원에 개시된 CH1 도메인 변이체가 사용될 수 있는 다양한 다중특이적 항체 구조의 추가적인 예시적이고 비제한적인 구현예를 제공한다. 구조는 도 24a~23c에 있는 것들과 유사하지만, 도메인의 순서는 상이하다. 도 25a에서, CH1κ는 VL과 동일한 폴리펩티드에 있고, CH1λ는 VL과 동일한 폴리펩티드에 있다. 도 25b에서, Cλ는 CH2(상단 3개 및 하단 좌측)와 동일한 폴리펩티드에 있고, Cλ는 중쇄-유사 폴리펩티드(힌지-함유 폴리펩티드)(하단 우측)에 있다.
도 26a~26c는 2개의 항원 결합 부위 세트를 직렬로 포함함으로써 4가인, 다양한 다중특이적 항체 구조의 추가적인 예시적이고 비제한적인 구현예를 제공한다. 구조는 제1, 제2, 제3, 및 제4 에피토프가 무엇인지에 따라 이중특이적, 삼중특이적, 또는 사중특이적일 수 있다. 예를 들어, 제1, 제2 에피토프가 서로 상이하고, 제4 에피토프가 제1, 제2, 또는 제3 에피토프와 동일한 경우, 구조는 4가 삼중특이적 구조일 것이다.
도 27a~27c는 다양한 다중특이적 항체 구조의 추가적인 예시적으로 비제한적인 구현예를 제공하며, 이들은 도 26a~26c에 있는 것들과 동일하지만 도메인의 순서는 상이하다. 위의 (10)에서 기술된 바와 같이, 폴리펩티드 내의 도메인의 방향은 N-말단에서 C-말단 방향으로 도메인 이름을 나타내는 텍스트의 방향을 따른다. 따라서, 도 27a의 상단 좌측 구조의 경우, N-말단에서 C-말단의 방향으로, 제1 폴리펩티드는 VH3-VH1-CH1(검은색)-CH2-CH3을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 VL1-VL3-CL를 포함하고, 제3 폴리펩티드는 VH4-VH2-CH1(점으로 채워짐)-CH2-CH3을 포함하고, 제4 폴리펩티드는 VL2-VL4-CL을 포함한다. 도 27a~27c의 임의의 구조에서, 항원 결합 부위를 적절히 형성할 수 있도록 도메인들 사이에 적절한 것이 사용될 수 있다.
도 28a~28d는 적어도 하나의 scFv를 함유하는 다양한 다중특이적 항체 구조의 추가적인 예시적이고 비제한적인 구현예를 제공한다. 도 24 내지 도 29에 제공된 구조 중 어느 하나는 하나 이상의 scFv 함유 모이어티를 추가로 포함하거나 이를 포함하도록 변형될 수 있고, 예를 들어 중쇄 불변 도메인, 경쇄 불변 도메인, 및/또는 항원 결합 도메인 중 어느 하나에 접합될 수 있다. 예로서, 도 28a~28c는, 도 24a의 상단 좌측에 있는 구조차 2개의 scFv와 접합되어 최대 4개의 에피토프에 대한 특이성을 허용하는 구조를 제공한다. 도 28a에서, scFv는 CH3 도메인에 접합된다. 도 28b에서, scFv는 CL 도메인에 접합된다. 도 28c에서, scFv는 VH 도메인에 접합된다. 소정의 경우에, 2개 초과의 scFv가 접합될 수 있다. 예로서, 도 28a~28c는, 도 24a의 상단 좌측에 있는 구조차 4개의 scFv와 접합되어 최대 6개의 에피토프에 대한 특이성을 허용하는 구조를 제공한다.
도 29a~29d는 2개의 추가적인 Fab 단편을 함유하는 다양한 다중특이적 항체 구조의 추가적인 예시적이고 비제한적인 구현예를 제공한다. 2개의 Fab 단편이 CH3 도메인에 접합되어 있지만, Fab 단편은 구조의 임의의 다른 부분에 접합될 수 있고, 2개가 아니라 1개(또는 3개 이상)의 Fab 단편(들)도 접합될 수 있다는 것에 주목한다. 도 29a에서, 2개의 CH1 도메인은 CH2 및 CH3 도메인과 동일한 폴리펩티드 내에 있다. 중간에 있는 구조의 경우, 카파-선호 CH1 도메인 및 람다-선호 CH1 도메인은 (2개의 CH1 함유 폴리펩티드 둘 다에 대해) 동일한 폴리펩티드 내에 존재한다. 2개의 CH1 함유 폴리펩티드가 동일한 경우, 이러한 구조는 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드의 이종이량체화를 촉진하는 메커니즘(예를 들어, “노브-인-홀” 조작)을 필요로 하지 않고도, 예를 들어 실시예에서 사용되는 3쇄 형질감염 시스템을 단순히 사용함으로써, 4가 이중특이적 화합물의 생산을 용이하게 한다. 도 29b에서, 2개의 폴리펩티드는 CH1 도메인을 전혀 함유하지 않는다. 중간에 있는 구조에 있어서, 2개의 CH1 비함유 폴리펩티드가 동일한 경우, 이러한 구조는 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드의 이종이량체화를 촉진하는 메커니즘(예를 들어, “노브-인-홀” 조작)을 필요로 하지 않고도, 예를 들어 실시예에서 사용되는 3쇄 형질감염 시스템을 단순히 사용함으로써, 4가 이중특이적 화합물의 생산을 용이하게 한다. 도 29c 및 29d에서, 각각의 폴리펩티드는 CH1 도메인을 함유한다. 도 29c 및 29d의 중간에 있는 구조에 있어서, 제1 및 제3 에피토프가 동일한 에피토프이고, 제2 및 제4 에피토프가 동일한 에피토프이지만 제1 및 제3 에피토프와는 상이한 경우, 구조는 이중특이적이다. 이러한 구조에 있어서, 2개의 CH2/CH3 비함유 폴리펩티드가 동일한 경우, 이러한 구조는 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드의 이종이량체화를 촉진하는 메커니즘(예를 들어, “노브-인-홀” 조작)을 필요로 하지 않고도, 예를 들어 실시예에서 사용되는 3쇄 형질감염 시스템을 단순히 사용함으로써, 4가 이중특이적 화합물의 생산을 용이하게 한다.
도 30은 실시예 7에서 식별된 2개의 람다 선호 CH1 변이체(“A141D P171E V185R” 또는 “A141D F170E T187R”) 또는 실시예 4에서 식별된 카파 선호 CH1 변이체(“K147F S183R”) 중 하나를 함유하는 전장 IgG의 예시적인 공정 수율을 도시한 것으로서, WT의 공정 수율에 대해 정규화한 것이다. 줄무늬 막대(카파와 페어링됨) 및 검은색 막대(람다와 페어링됨)는 WT 상대측 수율에 대해 정규화된 공정 수율을 나타낸다. 흰색 마름모(카파와 페어링됨) 및 검은색 삼각형(람다와 페어링됨)은 원시 공정 수율(mg/L)을 나타낸다.
도 31은 실시예 7에서 식별된 상위 2개의 람다 선호 CH1 변이체(“A141D P171E V185R” 또는 “A141D F170E T187R”) 중 하나 또는 실시예 4 및 5에서 식별된 람다 선호 CH1 변이체(“A141D” 또는 “A141D S181K K218P”), 또는 실시예 4에서 식별된 카파 선호 CH1 변이체(“K147F S183R”), 또는 야생형 CH1을 함유하는 Fab의 예시적인 공정 수율을 도시한 것으로서, 야생형의 공정 수율에 대해 정규화한 것이다. 수율은 WT 상대측 수율에 대해 정규화된다. 줄무늬 막대는 카파 LC를 함유하는 Fab를 나타내고, 검은색 막대는 람다 LC를 함유하는 Fab를 나타낸다.
도 32는 야생형 CH1-Cλ 계면을 이의 전자 밀도로 도시한 것이다. 파니투무맙 가변 단편(Fv)의 Fab 결정 구조 및 야생형 람다 불변 도메인(Cλ)에 페어링된 야생형 IgG1-CH1의 Fab 결정 구조에 대한 관심 영역에서의 대표적인 전자 밀도. 중쇄(HC) 탄소 원자는 밝은 회색으로, 람다 경쇄(λLC) 탄소 원자는 흰색으로, 질소 원자는 짙은 회색으로, 산소 원자는 검은색으로 표시되어 있다. 단백질은 막대로 표현되어 있다. 2Fo-Fc 전자 밀도 맵은 1.6 Å의 조각으로 이루어진 1σ의 회색 메시 윤곽선으로 도시되어 있다. 이러한 결정 구조에 대한 데이터는 1.09 Å 원자 해상도까지 연장된다.
도 33은 A141D CH1-Cλ 계면을 이의 전자 밀도로 도시한 것이다. 파니투무맙 가변 단편(Fv)의 Fab 결정 구조 및 야생형 람다 불변 도메인(Cλ)에 페어링된 A141D IgG1-CH1의 Fab 결정 구조에 대한 관심 영역에서의 대표적인 전자 밀도. 중쇄(HC) 탄소 원자는 밝은 회색으로, 람다 경쇄(λLC) 탄소 원자는 흰색으로, 질소 원자는 짙은 회색으로, 산소 원자는 검은색으로 표시되어 있다. 단백질은 막대로 표현되어 있다. 2Fo-Fc 전자 밀도 맵은 2.0 Å의 조각으로 이루어진 1σ의 회색 메시 윤곽선으로 도시되어 있다. 이러한 결정 구조에 대한 데이터는 1.2 Å 원자 해상도까지 연장된다.
도 34는 야생형 CH1-Cκ 계면을 이의 전자 밀도로 도시한 것이다. 파니투무맙 가변 단편(Fv)의 Fab 결정 구조 및 야생형 카파 불변 도메인(Cκ)에 페어링된 야생형 IgG1-CH1의 Fab 결정 구조에 대한 관심 영역에서의 대표적인 전자 밀도. 중쇄(HC) 탄소 원자는 밝은 회색으로, 카파 경쇄(κLC) 탄소 원자는 흰색으로, 질소 원자는 짙은 회색으로, 산소 원자는 검은색으로 표시되어 있다. 단백질은 막대로 표현되어 있다. 2Fo-Fc 전자 밀도 맵은 1.6 Å의 조각으로 이루어진 0.9σ의 회색 메시 윤곽선으로 도시되어 있다. 이러한 결정 구조에 대한 데이터는 2.6 Å에 가까운 원자 해상도까지 연장된다.
도 35는 K147F-S183R CH1-Cκ 계면을 이의 전자 밀도로 도시한 것이다. 파니투무맙 가변 단편(Fv)의 결정 구조 및 야생형 카파 불변 도메인(Cκ)에 페어링된 K147F-S183R 치환된 IgG1-CH1의 결정 구조에 대한 관심 영역에서의 대표적인 전자 밀도. 중쇄(HC) 탄소 원자는 밝은 회색으로, 카파 경쇄(κLC) 탄소 원자는 흰색으로, 질소 원자는 짙은 회색으로, 산소 원자는 검은색으로 표시되어 있다. 단백질은 막대로 표현되어 있다. 2Fo-Fc 전자 밀도 맵은 1.6 Å의 조각으로 이루어진 0.9σ의 회색 메시 윤곽선으로 도시되어 있다. 이러한 결정 구조에 대한 데이터는 2.1 Å에 가까운 원자 해상도까지 연장된다.
도 36a 내지36d는 HC-A141D 치환이 κLC와의 입체 충돌을 통해 카파 페어링을 불안정하게 만들면서, 동시에 λLC에 대한 수소 결합을 가능하게 함을 보여준다. 도 36a 내지 36d는 야생형 CH1과 λLC 사이(도 36a), 야생형 CH1과 κLC 사이(도 36b), A141D CH1과 λLC 사이(도 36c), 또는 A141D CH1과 κLC 사이(도 36d)의 HC-Ala141 위치를 둘러싸는 페어링 계면의 도면을 제공한다. 카파 경쇄 불변 도메인(κLC) 계면은 도 36b에 예시된 3개의 소수성 잔기 Phe116, Phe118, 및 Leu135를 함유한다. 구조적으로 동등한 κLC-Phe116 위치에서 λLC 내에 Thr116이 존재하면, 검은색 점선으로 도시된, HC-Asp141의 카복실기에 수소 결합이 가능해진다(도 36c). 도 36d에서, A141D CH1 함유 람다(Cλ) 및 야생형 CH1-Cκ의 HC 정렬은 HC-Asp141 측쇄와 κLC-Phe116 측쇄의 입체 충돌을 보여준다. 중쇄(HC) 탄소 원자는 밝은 회색으로, 경쇄(LC) 탄소 원자는 흰색으로, 질소 원자는 짙은 회색으로, 산소 원자는 검은색으로 표시되어 있다. 측쇄는 투명한 분자 표면을 갖는 막대로 도시되어 있고, 주쇄 원자는 삽화적으로 표시되어 있다.
도 37a 및 37b는 야생형 CH1 서열이 HC-Gln175를 사슬 내 수소 결합 네트워크 내에 격리하는 것을 도시한 것으로서, 이러한 격리는 K147F의 치환에 의해 파괴되어 HC-Gln175가 κLC-Gln160과 자유롭게 상호작용하게 할 수 있다. 도 37a 및 37b는 파니투무맙 야생형 CH1-불변 카파(Cκ) 구조(도 37a) 및 파니투무맙 K147F-S183R-CH1-Cκ 구조(도 37b)에서 Lys147, Asp148, 및 Gln175를 포함하는 HC의 삼중 수소 결합 네트워크의 도면을 제공한다. 중쇄(HC) 탄소 원자는 밝은 회색으로, 카파 경쇄(κLC) 탄소 원자는 흰색으로, 질소 원자는 짙은 회색으로, 산소 원자는 검은색으로 표시되어 있다. 측쇄는 막대로 도시되어 있고, 주쇄 원자는 삽화적으로 표시되어 있다. 수소 결합은 점선으로 도시되어 있다.
도 38a~38d는 HC-Arg183과 κLC-Thr178 간의 수소 결합이 카파 페어링을 유도할 수 있지만, HC-Arg183과 λLC-Tyr178의 입체 충돌이 람다 페어링에 대한 선호도를 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 38a~38d는 IgG1-CH1에서 S183R 치환을 둘러싼 영역의 도면으로서, 파니투무맙 야생형 CH1-불변 람다(Cλ) 구조에서 HC-Ser183과 λLC-Thr178 사이가 수소 결합된 것(도 38b) 및 파니투무맙 K147F-S183R-CH1-불변 카파(Cκ) 구조에서 HC-Arg183과 κLC-Thr178 사이가 수소 결합된 것(도 38C)을 보여준다. 도 38a는 HC-Ser183과 κLC-Thr178이 너무 멀리 있어서 수소 결합이 발생할 수 없음을 보여준다. 중쇄(HC) 탄소 원자는 밝은 회색으로, 경쇄(LC) 탄소 원자는 흰색으로, 질소 원자는 짙은 회색으로, 산소 원자는 검은색으로 표시되어 있다. 측쇄는 막대표 도시되어 있다. λLC-Tyr178의 측쇄도 투명한 분자 표면으로서 도시되어 있다. 수소 결합은 검은색 점선으로 도시되어 있다. 도 38d는 파니투무맙 K147F-S183R-CH1-Cκ 구조의 HC가 파니투무맙 야생형 CH1-Cλ 구조의 HC와 중첩된 모델을 제공한다. 생성된 모델은 HC-Arg183과 λLC-Tyr178 간의 분명한 입체 충돌을 보여준다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 당 기술분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “약”은, 특정한 인용된 숫자 값과 관련하여 사용될 때, 상기 값이 인용된 값과 1% 이하만큼 가변될 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 바와 같이, 표현 “약 100”은 99 및 101 및 그 사이의 모든 값(예, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본원에 기술된 본 개시의 양태 및 구현예는 양태 및 구현예를 “포함하는”, “이로 이루어지는”, 및 “본질적으로 이로 이루어지는” 것을 포함하는 것으로 이해된다.
카파 CH1 도메인(또는 카파 경쇄) 또는 람다 CL 도메인(또는 람다 경쇄)과 CH1 도메인-함유 중쇄의 우선적 페어링을 촉진함으로써 중쇄-경쇄의 미스페어링을 방지하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 함유하는 조작된 CH1 도메인이 본원에 제공된다. 용어 “우선적 페어링”은 폴리펩티드, 예를 들어 이중특이적 항체와 같은 항체에서 중쇄(또는 CH1 도메인)와 경쇄(또는 CL 도메인)의 페어링을 지칭한다. 중쇄(H1)가 2개의 상이한 경쇄(L1 및 L2)와 함께 공발현될 때, H1은 L1 및 L2 각각과 페어링되어 H1:L1 및 H1:L2의 혼합물을 생성하게 된다. 일부 경우에, H1은 L1 및 L2 둘 모두와 동등하게 잘 페어링되어 H1:L1과 H1:L2가 대략 50:50인 혼합물을 생성할 수 있다. 예로서, H1이 L1 및 L2와 공발현될 때, H1:L1 이종이량체의 형성된 양이 H1:L2 이종이량체의 형성된 양보다 많는 경우, H1과 L1 사이에서 “우선적 페어링”이 발생할 것이다. 본 예에서, H1은 L2에 비해 L1과 우선적으로 페어링된다. H1이 L2에 비해 L1과 페어링되는 고유한 편향성을 갖는 경우(예컨대, H1:L1 대 H1:L2의 비가 50:50이 아니라, 예를 들어 H1:L2의 형성이 여전히 바람직하지 않은 60:40 또는 70:30인 경우), 원하는 쌍(H1:L1) 간의 우선적 페어링은, H1:L2와 비교해 H1:L1 간의 페어링 양이 개선(증가)될 때 발생할 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “우선적 페어링”은 (전술한 바와 같은) 중쇄와 경쇄의 페어링 뿐만 아니라 CH1 도메인과 CL 도메인의 페어링도 포함한다. 예로서, CH1이 Cκ 및 Cλ와 공발현될 때, CH1:Cκ의 형성된 양이 CH1:Cλ의 형성된 양보다 큰 경우, CH1 도메인과 카파 CL 도메인 사이에서 “우선적 페어링”이 발생할 것이다. 마찬가지로, CH1이 Cλ 및 Cκ와 공발현될 때, CH1:Cλ의 형성된 양이 CH1:Cκ의 형성된 양보다 큰 경우, CH1 도메인과 람다 CL 도메인 사이에서 “우선적 페어링”이 발생할 것이다.
(Cκ 및 Cλ 둘 다에 대해) CH1-CL 계면의 일부로서 식별된 CH1 도메인 내의 소정의 위치가 경쇄에 대한 중쇄의 결합에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 또한, CH1:VH 계면에 있는 CH1 도메인 내의 위치들도 경쇄에 대한 중쇄의 결합에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 중쇄는 두 세트의 도메인 계면(하나는 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 계면이고, 다른 하나는 CH1 도메인과 CL 도메인 사이의 계면임)을 통해 경쇄와 페어링되며, 사슬이 페어링되거나, 만나거나, 접촉하는 영역은 “계면”으로서 지칭된다. 또한, 중쇄 내에서는 CH1 도메인이 VH의 일부와도 접촉하게 되는데, CH1 도메인과 VH가 밀접하게 되는 이러한 공간 또난 “계면”이라는 용어에 포함된다. 계면은 중쇄 내의 아미노산 잔기 및 경쇄 내의 아미노산 잔기를 포함하거나, 대안적으로 3차원 공간에서 서로 접촉하는, CH1 도메인 내의 아미노산 잔기 및 VH 내의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 계면은 중쇄의 CH1 도메인 및 경쇄의 CL 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 계면은 중쇄의 CH1 도메인 및 VH 도메인을 포함한다. “계면”은 바람직하게는 IgG 항체 또는 이의 Fab로부터 유래된다.
본원에 기술된 CH1 변이체 도메인은 부모와 비교했을 때, 하나 이상의 CH1:CL 계면(CH1:카파 CL, 또는 CH1:람다 CL) 위치, 예를 들어 위치 141, 147, 170, 171, 175, 181, 183, 184, 185, 187, 및/또는 218에서, 또는 하나 이상의 CH1:VH 계면 위치, 예를 들어 위치 151에서 아미노산 치환을 함유한다. 용어 “부모”는 변이체를 생성하도록 후속하여 변형되는 폴리펩티드(및 이를 암호화하는 아미노산 서열)를 지칭한다. 부모 폴리펩티드는 야생형 또는 자연 발생 폴리펩티드이거나, 이의 변이체 또는 조작된 버전일 수 있다. 따라서, “부모 CH1 도메인”은 CH1 도메인 변이체를 생성하도록 후속하여 변형되는 CH1 도메인 폴리펩티드(및 CH1 도메인 폴리펩티드를 암호화하는 아미노산 서열)를 지칭한다. 이러한 부모 CH1 도메인은 야생형 또는 자연 발생 CH1 도메인이거너 이의 변이체 또는 조작된 버전, 예를 들어 독소 또는 소분자 약물에 접합하도록 변형된 야생형 CH1 도메인일 수 있다. 이러한 부모 CH1 도메인은 단리되거나 더 큰 작제물의 일부, 예를 들어 Fab, F(ab′)2, 또는 IgG일 수 있는데, 이는 임의로 추가의 변형, 예를 들어 이종이량체화를 촉진하기 위한 CH3 변형, Fc 수용체 결합을 변경시키거나, 반감기를 연장하고/하거나 추가의 결합 도메인을 연결하기 위한 CH2 및/또는 CH3 변형을 포함할 수 있다.
생성된 CH1 변이체 도메인은 카파 CL(Cκ) 도메인 또는 람다 CL(Cλ) 도메인과 우선적으로 페어링되는데, 여기서 Cκ 및 Cλ 도메인은 경쇄의 일부일 수 있다. CH1 도메인 위치 147 및 183(EU 넘버링) 중 하나 또는 둘 다에서의 아미노산 변이는 Cκ에 대한 결합을 촉진하는 (동시에 Cλ와의 페어링을 억제하는) 반면, CH1 도메인 위치 141에서의 아미노산 변이는 Cλ에 대한 결합을 촉진한다(동시에 Cκ와의 페어링을 억제함). 카파 및 람다 CL 도메인은 임의의 수의 포맷으로 존재할 수 있으며, 여기에는 Fab 또는 IgG, 야생형 또는 키메라, 예를 들어, Vκ와 Cκ, Vκ와 Cλ, Vλ와 Cκ, 또는 Vλ와 Cλ를 함유하는 Fab 또는 IgG가 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다. 이러한 CH1 변이체 도메인은, 긴 생체 내 반감기 및 효과기 기능을 유도하는 능력을 포함하여, 치료 분자로서 잘 확립된 특성으로 인해 유리한 이중특이적 항체의 고유 IgG 구조를 유지하면서 중쇄 경쇄 페어링의 충실도를 개선함으로써 다중특이적 항체를 조작하는 데 유용할 수 있다.
용어 “CH1 도메인”은 항체의 중쇄의 제1 불변 도메인, 중쇄의 가변 도메인의 C-말단, 및 힌지 영역의 N-말단을 지칭한다. IMGT에 따르면, CH1 도메인은 위치 118~215(EU 넘버링)의 아미노산 서열이고, 힌지 영역은 위치 216~230(EU 넘버링)의 아미노산 서열이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “CH1 도메인 변이체”는 전체 CH1 도메인(EU 넘버링에 따른 위치 118~215) 또는 CH1 잔기 118~215(EU 넘버링 기준) 중 적어도 7개를 포함하는 이의 단편(여기서 이러한 단편은 본원에 개시된 변형 중 적어도 하나 이상을 포함함)을 비롯하여 힌지 영역(위치 216~218)의 일부를 포함하는 아미노산 서열을 지칭한다. 전술한 CH1 도메인 변이체를 식별하기 위해 스크리닝한 라이브러리에는 힌지 영역, 예를 들어, 위치 216 및 218에서의 변형이 포함되어 있다.
CH1 도메인은 경쇄의 CL 도메인과 페어링된다. 일부 구현예에서, 경쇄는 카파 사슬이다. 일부 구현예에서, 경쇄는 람다 사슬이다. 용어 “카파 불변 도메인”, “카파 CL 도메인”, 또는 “Cκ”는 카파 경쇄의 불변 도메인을 지칭한다. 용어 “람다 불변 도메인”, “람다 CL 도메인”, 또는 “Cλ”는 람다 경쇄의 불변 도메인을 지칭한다. 단일 이황화 결합은 CH1과 CL 도메인을 공유 연결한다. 본원에 사용된 CH1 도메인은 모든 항체 이소형, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM, 및 IgE를 지칭한다.
용어 “항체”는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및/또는 항체 단편(바람직하게는 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 단편들로서, “항원 결합 항체 단편”으로도 지칭됨)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
“단클론 항체” 또는 “mAb”는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 이러한 집단을 포함하는 개별 항체들은, 가능한 변이체 항체(예를 들어, 자연 발생 돌연변이(들) 및/또는 치환(들)을 함유하거나, 단클론 항체 제제를 생산하는 중에 발생함)를 제외하고는, 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하며, 이러한 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다. 상이한 결정기(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 일반적으로 포함하는, 다클론 항체 제조와 대조적으로, 단일클론 항체 제조의 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 유도된다.
본원에서 “다중특이적 화합물”로도 지칭될 수 있는 “다중특이적 항체”는, 적어도 2개의 상이한 항원 또는 적어도 2개의 상이한 에피토프를 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 항체는 (1) 동족 쌍을 형성하고 제1 항원에 결합하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄, 및 (2) 동족 쌍을 형성하고 제2 항원에 결합하는 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 함유한다.
본원에서 “이중특이적 화합물”로도 지칭될 수 있는 “이중특이적 항체”는 일종의 다중특이적 항체이며, 적어도 2개의 상이한 항원 또는 적어도 2개의 에피토프를 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 2개의 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다. 적어도 2개의 에피토프는 동일한 항원 내에 있거나 그렇지 않을 수 있다. 이중특이적 항체는, 예를 들어, 동일하거나 상이한 세포(예를 들어, 면역 세포 및 암 세포) 상의 2개의 상이한 표면 수용체, 2개의 상이한 사이토카인/케모카인, 수용체, 및 리간드를 표적화할 수 있다. 이중특이적 항체에 의해 표적화될 수 있는 항원의 조합은 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: CD3 및 Her2; CD3 및 Her3; CD3 및 EGFR; CD3 및 CD19; CD3 및 CD20; CD3 및 EpCAM; CD3 및 CD33; CD3 및 PSMA; CD3 및 CEA; CD3 및 gp100; CD3 및 gpA33; CD3 및 B7-H3; CD64 및 EGFR; CEA 및 HSG; TRAIL-R2 및 LTbetaR; EGFR 및 IGFR; VEGFR2 및 VEGFR3; VEGFR2 및 PDGFR 알파; PDGFR알파 및 PDGFR 베타; EGFR 및 MET; EGFR 및 EDV-miR16; EGFR 및 CD64; EGFR 및 Her2; EGFR 및 Her3; Her2 도메인 ECD2 및 Her2 도메인 ECD4; Her2 및 Her3; IGF-1R 및 HER3; CD19 및 CD22; CD20 및 CD22; CD30 및 CD16A; FceRI 및 CD32B; CD32B 및 CD79B; MP65 및 SAP-2; IL-17A 및 IL-23; IL-1알파 및 IL-1베타; IL-12 및 IL-18; VEGF 및 오스테오폰틴; VEGF 및 Ang-2; VEGF 및 PDGFR베타; VEGF 및 Her2; VEGF 및 DLL4; FAP 및 DR5; FcgRII 및 IgE; CEA 및 DTPA; CEA 및 IMP288; 및 LukS-PV 및 LukF-PV.
“상이한 항원”은 상이한 및/또는 독특한 단백질, 폴리펩티드, 또는 분자; 상이한 및/또는 독특한 에피토프를 지칭할 수 있고, 상기 에피토프는 하나의 단백질, 폴리펩티드, 또는 다른 분자 내에 함유될 수 있다. 결과적으로, 이중특이적 항체는 동일한 폴리펩티드 상의 2개의 에피토프에 결합할 수 있다.
용어 “에피토프”는 파라토프로 알려진 항체 분자의 가변 영역에서 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원 결정기를 지칭한다. 단일 항원은 하나 보다 많은 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원 상의 상이한 구역에 결합할 수도 있고 상이한 생물학적 효과를 가질 수도 있다. 용어 “에피토프”는 또한 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 이는 또한 항체에 의해 결합되는 항원의 영역을 지칭한다. 에피토프는 구조적 또는 기능적으로서 정의될 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프의 하위세트이며, 상호작용의 친화도에 직접적으로 기여하는 잔기를 갖는다. 에피토프는 또한 입체적(conformational), 즉 비선형 아미노산으로 구성될 수 있다. 특정 구현예에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴기, 또는 설포닐기와 같은, 분자들의 화학적으로 활성인 표면 그룹인 결정기를 포함할 수 있고, 특정 구현예에서, 특이적인 3차원 구조적 특성 및/또는 특이적인 전하 특성을 가질 수 있다.
일부 경우에, 항체는 4개의 폴리펩티드 사슬: 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(“VH”)과 같은 가변 영역, 및 중쇄 불변 영역(“CH”)을 포함한다. 온전한 항체의 경우, CH는 CH1, CH2, 및 CH3 도메인을 포함한다. 항체 단편의 경우, CH는 CH1, CH2, 및/또는 CH3 도메인을 포함할 수 있고, 일부 바람직한 구현예에서, CH는 적어도 CH1 도메인을 포함한다. 본원에 개시된 CH1 도메인 변이체는 야생형 CH2 및/또는 CH3 도메인, 또는 예를 들어 항체의 안정성 및/또는 효과기 기능을 변경하거나 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 CH2 및/또는 CH3 도메인과 조합하여 사용될 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(“VL”)과 같은 가변 영역, 및 경쇄 불변 영역(“CL”)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재하는, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL는 아미노 말단에서 카복시 말단 방향으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다. 본 개시의 소정의 구현예에서, 항체(또는 이의 항원-결합 단편)의 FR은 인간 생식선 서열과 동일하거나 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 컨센서스 서열은 2개 이상의 CDR의 나란한 분석(side-by-side analysis)에 기초하여 정의될 수 있다. 따라서, 중쇄 내의 CDR은 각각 “CDRH1”, “CDRH2”, 및 “CDRH3”으로 지정되고, 경쇄 내의 CDR은 “CDRL1”, “CDRL2”, 및 “CDRL3”으로 지정된다. 다른 경우에, 항체는 이의 다량체(예를 들어, IgM) 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다.
소정의 경우에, VH 및 CL은 하나의 폴리펩티드에 존재할 수 있다. 소정의 경우에, VL 및 CH1, CH2, 및/또는 CH3 도메인(들)이 하나의 폴리펩티드에 존재할 수 있다. 예를 들어, 소정의 항체 또는 항체 단편에서, 제1 폴리펩티드는 VH1 및 CH1을 포함하고 제2 폴리펩티드는 VL1 및 CL을 포함하는 반면(VH1 및 VL은 제1 에피토프를 위한 항원 결합 부위를 형성함), 제3 폴리펩티드는 VH2 및 CL을 포함하고 제4 폴리펩티드는 VL2 및 CH1을 포함한다(VH2 및 VL2는 제2 에피토프를 위한 항원 결합 부위를 형성함). 또 다른 소정의 항체 또는 항체 단편에서, 제1 폴리펩티드는 VH1 및 CH1을 포함하고 제2 폴리펩티드는 VL1 및 CL을 포함하는 반면(VH1 및 VL은 제1 에피토프를 위한 항원 결합 부위를 형성함), 제3 폴리펩티드는 VL2, CL, 및 CH2 및/또는 CH3 도메인 중 하나 이상을 포함하고 제4 폴리펩티드는 VH 및 CH1을 포함한다. CH1 도메인이 중쇄에 있는지 또는 경쇄에 있는지 여부와 상관없이, 카파 CL과의 우선적으로 페어링하거나 람다 CL과 우선적으로 페어링하는, 본원에 개시된 CH1 변이체 중 어느 하나를 포함하는 임의의 항체 또는 항체 단편이 본 발명에 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 “동족 쌍” 또는 “동족 페어링”은, 조합되었을 때 에피토프 또는 항원에 대한 의도된 결합 특이성을 제공하는 가변 영역(예를 들어, 각각 VH 및 VL)을 각각 함유하는 2개의 항체 사슬(예를 들어, 중쇄 및 경쇄)의 쌍 또는 페어링을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 “비동족 쌍” 또는 “비동족 페어링”은, 조합되었을 때 에피토프 또는 항원에 대한 의도된 결합 특이성을 제공하지 않는 가변 영역(예를 들어, 각각 VH 및 VL)을 각각 함유하는 2개의 항체 사슬(예를 들어, 중쇄 및 경쇄)의 쌍 또는 페어링을 지칭한다.
항체에는 5개의 주요 부류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 및 이들 중 일부는 하위 부류(이소타입)로 추가로 나누어질 수 있는데, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2이다. 면역글로불린의 상이한 부류에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 α, δ, ε, γ, 및 μ로 각각 불린다.
달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 “항체”는 2개의 면역글로불린 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄를 포함하는 분자(종종 “전장 항체” 또는 “온전한 항체” 또는 “전체 항체” 등으로서 지칭되며, 모든 경우에 천연 항체와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭함) 뿐만 아니라 이의 항원 결합 항체 단편도 포함한다. “항원 결합 단편” 또는 “항원 결합 항체 단편”은 온전한 항체의 일부를 지칭하거나, 온전한 항체(들)로부터 유래된 부분의 조합으로서 온전한 항체(들)가 결합하는 항원(들)에 결합하는 부분의 조합을 지칭한다.
항체의 항원-결합 단편은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연적으로 발생하는, 효소적으로 수득 가능한, 합성, 또는 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 예시적인 항체 단편은 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: Fv; 단편 항원 결합(“Fab”) 단편; Fab’ 단편; 유리 설프하이드릴기를 함유하는 Fab’(“Fab'-SH”); F(ab’)2 단편; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예: 단쇄 가변 단편(“scFv”), 나노바디 또는 VHH, 또는 VH 또는 VL 도메인만); 및 전술한 것과 같은 항체 단편 중 하나 이상으로부터 형성된 단일특이적 또는 다중특이적 화합물. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 이중특이적 항체의 항원-결합 단편은 scFv이다. 바람직한 구현예에서, 항원 결합 단편은 카파 CL 또는 람다 CL과 우선적으로 페어링되는 CH1 도메인을 포함한다.
완전한 항체 분자와 마찬가지로, 항원-결합 단편은 단일특이적 또는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 등)일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원-결합 단편은 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 가변 도메인은 별도의 항원에 또는 동일한 항원의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 개시는 카파 경쇄 CL 도메인 또는 람다 경쇄 CL 도메인과 우선적으로 페어링되는 (또는 이에 결합하는) CH1 도메인 변이체를 제공한다. 일 구현예에서, CH1 도메인 변이체는 카파 부류 경쇄 또는 람다 부류 경쇄에 대한 감소된 결합을 나타내거나 결합을 나타내지 않으며, 동시에 다른 부류의 경쇄(본 예에서는 각각, 람다 또는 카파)에 대한 배타적인 선호도 또는 증가된 선호도를 나타낸다. 이들 CH1 도메인 변이체는 적절한 중쇄와 경쇄의 페어링을 촉진함으로써, 다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체를 생성할 때의 중쇄와 경쇄의 미스페어링 문제를 전체적으로 또는 부분적으로 해결하는 데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, CH1 도메인 변이체는 임의로 CH1 도메인의 외부에 있는 다른 변이체와 조합으로 사용되어 카파 경쇄 CL 도메인 또는 람다 경쇄 CL 도메인과의 우선적인 페어링을 추가로 촉진할 수 있다(예를 들어 Q39E/K:Q38K/E (Dillon 등의 문헌[MAbs 2017 9(2): 213-230]); 또는 Q39K + R62E:Q38D + D1R 또는 Q39Y + Q105R: Q38R + K42D (Brinkmann 등의 문헌[MAbs 2017 9(2): 182-212])와 같은 VH:VL 치환). 보다 구체적으로, 이들 CH1 변이체 도메인을 포함하는 이중특이적 항체는 원치 않는 산물과 관련된 오염물질, 즉 미스페어링된 도메인을 함유하는 분자를 거의 형성하지 않는데, 하류 공정에서 이를 제거하는 것은 어려운 일일 수 있다. 예를 들어, (i) 항체 A 유래의 중쇄 및 경쇄(여기서 경쇄는 카파 경쇄임) 및 (ii) 항체 B 유래의 중쇄 및 경쇄(여기서 경쇄는 람다 경쇄임)를 포함하는 이중특이적 항체는, 항체 A의 중쇄 CH1 도메인을 카파-선호 CH1 도메인 변이체(예를 들어 147 Phe 및/또는 183 Arg, Lys, Tyr과 같은 변이체)로 조작하고 항체 B의 중쇄 CH1 메인을 람다-선호 CH1 도메인 변이체(예를 들어 141 Asp와 같은 변이체)로 조작함으로써 보다 효율적으로, 즉 원치 않는 산물과 관련된 오염 물질이 거의 없는 상태로 생산될 수 있다. 그 결과, 항체 A의 중쇄는 항체 A의 경쇄에 결합하는 것을 선호하게 (항체 B의 경쇄에 결합하는 것을 싫어하게) 되는 반면, 항체 B의 중쇄는 항체 B의 경쇄에 결합하는 것을 선호하게 (항체 A의 경쇄에 결합하는 것을 싫어하게) 된다. 도 1 및 도 7, 및 표 6을 참조한다.
일부 구현예에서, CH1 도메인 변이체는 미스페어링, 즉 비동족 HC1-LC2 및/또는 HC2-LC1 쌍의 형성을 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 또는 적어도 80%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 위치 141에서의 치환을 함유하는, 예를 들어 141D를 단독으로 함유하거나 147F + 183R, 147F + 183K, 147F + 183Y와 같은 다른 치환과의 조합으로 함유하는 CH1 도메인 변이체는 미스페어링, 즉 비동족 HC1-LC2 및/또는 HC2-LC1 쌍의 형성을 적어도 25% 내지 적어도 80%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 위치 141에서의 치환을 함유하는, 예를 들어 141D를 단독으로 함유하거나 183R, 183K, 183Y, 147F + 183R, 147F + 183K, 147F + 183Y와 같은 다른 치환과의 조합으로 함유하는 CH1 도메인 변이체는 미스페어링, 즉 비동족 HC1-LC2 및/또는 HC2-LC1 쌍의 형성을 적어도 50%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 위치 141에서의 치환을 함유하는, 예를 들어 141D를 단독으로 함유하거나 183R, 183K, 183Y, 147F + 183R, 147F + 183K, 147F + 183Y와 같은 다른 치환과의 조합으로 함유하는 CH1 도메인 변이체는 미스페어링, 즉 비동족 HC1-LC2 및/또는 HC2-LC1 쌍의 형성을 적어도 75%만큼 감소시킨다.
일부 구현예에서, CH1 도메인 변이체는 동족 CL 도메인(Cκ 또는 Cλ 중 하나) 또는 상응하는 CL 도메인(Cκ 또는 Cλ 중 하나)을 함유하는 동족 경쇄와 우선적으로 페어링되어(결합되어) 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 원하는 제1 및 제2 동족 쌍, 즉 HC1-LC1 및/또는 HC2-LC2를 형성한다. 일부 구현예에서, CH1 도메인 변이체는 동족 CL 도메인(Cκ 또는 Cλ 중 하나) 또는 상응하는 CL 도메인(Cκ 또는 Cλ 중 하나)을 함유하는 동족 경쇄와 우선적으로 페어링되어(결합되어) 약 80% 내지 약 99%, 보다 구체적으로는, 적어도 약 85% 내지 적어도 약 95%의 원하는 제1 및 제2 동족 쌍, 즉 HC1-LC1 및/또는 HC2-LC2를 형성한다. 일부 구현예에서, 위치 141에서의 치환을 함유하는, 예를 들어 141D를 단독으로 함유하거나 183R, 183K, 183Y, 147F + 183R, 147F + 183K, 147F + 183Y와 같은 다른 치환과의 조합으로 함유하는 CH1 도메인 변이체는 약 85% 내지 약 95%의 원하는 제1 및 제2 동족 쌍, 즉 HC1-LC1 및/또는 HC2-LC2를 형성한다.
일부 구현예에서, CH1 도메인 변이체는 미스페어링된 중쇄-경쇄 이종이량체, 즉, HC1-LC2 및/또는 HC2-LC1 쌍의 형성을 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만까지 감소시킨다. 일부 구현예에서, 위치 141에서의 치환을 함유하는, 예를 들어 141D를 단독으로 함유하거나 183R, 183K, 183Y, 147F + 183R, 147F + 183K, 147F + 183Y와 같은 다른 치환과 조합으로 함유하는 CH1 도메인 변이체는 미스페어링된 중쇄-경쇄 이종이량체의 형성을 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만까지 감소시킨다.
위치 118, 119, 124, 126~134, 136, 138~143, 145, 147~154, 163, 168, 170~172, 175~176, 181, 183~185, 187, 190, 191, 197, 201, 203~206, 208, 210~214, 216, 및 218(EU 넘버링 기준)을 포함하여, 여러 CH1 도메인 위치가 경쇄 결합 선호도, 즉 카파 CL 도메인 또는 람다 CL 도메인과의 우선적 페어링에 영향을 미치는 것으로 식별되었다. CH1 도메인 내의 이들 위치 중 하나 이상에서 야생형 아미노산 잔기를 변이체(비야생형) 아미노산 잔기로 치환하면, 카파 CL 도메인 또는 람다 CL 도메인 중 하나를 함유하는 경쇄에 대해 우선 페어링하는 중쇄가 생성된다. 예를 들어, 위치 147 및 183 각각은 카파 CL 도메인에 대한 페어링 선호도를 갖는 것으로 식별되었고, 위치 141, 170, 171, 175, 181, 184, 185, 187, 및 218은 람다 CL 도메인에 대한 페어링 선호도를 갖는 것으로 식별되었다.
CH1 도메인 위치 141에 있는 야생형 아미노산 잔기(Ala)를 Thr, Asp, Lys, Glu, Arg, Met, Val, 또는 Gln로 치환하는 것은 람다 CL 도메인을 함유하는 경쇄에 대한 중쇄의 결합 선호도를 증가시키는 것으로 나타났다. CH1 도메인 위치 170에 있는 야생형 아미노산 잔기(Phe)를 Glu, Gly, Ser, Asn, 또는 Thr로 치환하는 것; CH1 도메인 위치 171에 있는 야생형 아미노산 잔기(Pro)를 Glu, Gly, Ser, Asn, Asp, 또는 Ala로 치환하는 것; CH1 도메인 위치 175에 있는 야생형 아미노산 잔기(Met)를 Asp 또는 Met로 치환하는 것; CH1 도메인 위치 181에 있는 야생형 아미노산 잔기(Ser)를 Val, Leu, Ala, Lys, 또는 Thr로 치환하는 것; CH1 도메인 위치 184에 있는 야생형 아미노산 잔기(Ser)를 Arg로 치환하는 것; CH1 도메인 위치 185에 있는 야생형 아미노산 잔기(Val)를 Met, Leu, Ser, Arg, Thr로 치환하는 것; CH1 도메인 위치 187에 있는 야생형 아미노산 잔기(Thr)를 Arg, Asp, Glu, Tyr, 또는 Ser로 치환하는 것; 및/또는 CH1 도메인 위치 218에 있는 야생형 아미노산 잔기(Lys)를 Leu, Glu, Asp, Pro, Ala, His, Ser, Gln, Asn, Thr, Ile, Met, Gly, Cys, Lys, 또는 Trp로 치환하는 것도 람다 CL 도메인을 함유하는 경쇄와 중쇄의 페어링을 증가시키는 데 기여한다.
CH1 도메인 위치 147에 있는 야생형 아미노산 잔기(Lys)를 Val, Ala, Phe, Ile, Thr, Ser, Tyr, Leu, Arg, Asn, Glu, His, Met, 또는 Gln으로 치환하는 것은 카파 CL 도메인을 함유하는 경쇄에 대한 중쇄의 결합 선호도를 증가시키는 것으로 나타났다. CH1 도메인 위치 183에 있는 야생형 아미노산 잔기(Ser)를 Arg, Lys, Tyr, Trp, Glu, Phe, Ile, Leu, Asn, 또는 Gln으로 치환하는 것은 카파 CL 도메인을 함유하는 경쇄에 대한 중쇄의 결합 선호도를 증가시키는 것으로 나타났다(도 5 참조). 특정 위치에서 주어진 변이체 아미노산 잔기의 영향은 다양할 수 있지만, 모든 변이체는 변이체 잔기를 포함하는 아미노산 위치에 기초하여 Cκ 또는 Cλ와의 개선된 우선적 페어링을 나타낸다. 또한, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 CH1 영역에 있어서의 높은 정도의 유사성을 감안하면, 본원에 기술된 CH1 도메인 변이체는 각각의 이소형에서 유사한 우선적 페어링 특성을 나타낼 것으로 예상된다.
초기의 선택 라운드를 통해서, 위치 141에 있는 Thr은 야생형 CH1 도메인 서열(위치 141에서의 Ala)과 비교해 Cλ와의 우선적 페어링을 촉진하는 것으로 식별되었지만, 추가의 선택 라운드를 통해서 Asp, Arg, 및 Gln이 Thr과 비교해 우선적 페어링을 증가시키는 것으로 식별되었다(도 5 참조). 추가의 스크리닝 전략을 통해 Lys 및 Glu도 람다 선호도를 증가시키는 것으로 식별하였다(실시예 5, 도 10~14 참조). 위치 170에서의 Glu; 위치 171에서의 Glu; 위치 175에서 Met; 위치 181에서 Lys; 위치 184에서 Arg; 위치 185에서 Arg; 위치 187에서 Arg; 및/또는 위치 218에서의 Pro, Ala, 또는 Glu도 람다 선호도를 증가시키는 것으로 밝혀졌다(실시예 5~7 참조). 또한, 본 출원에서 람다 선호도를 증가시키는 것으로 나타난 특정 치환 조합은 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: 위치 141에서의 Asp와 위치 181에서의 Lys; 위치 141에서의 Asp, 위치 181에서의 Lys, 및 위치 218에서의 Ala; 위치 141에서의 Asp, 위치 181에서의 Lys, 및 위치 218에서의 Pro; 위치 141에서의 Glu, 위치 170에서의 Glu, 위치 181에서의 Val, 및 위치 187에서의 Arg; 위치 141에서의 Glu, 위치 171에서의 Asp, 및 위치 185에서의 Arg; 위치 141에서의 Glu, 위치 171에서의 Glu, 및 위치 185에서의 Arg; 위치 141에서의 Glu, 위치 171에서의 Gly, 위치 185에서의 Arg, 및 위치 187에서의 Arg; 위치 141에서의 Glu, 위치 185에서의 Arg, 및 위치 187에서의 Arg; 위치 141에서의 Glu, 위치 171에서의 Ser, 및 위치 181에서의 Lys; 위치 141에서의 Glu, 위치 170에서의 Gly, 위치 175에서의 Met, 위치 181에서의 Val, 위치 184에서의 Arg, 및 위치 187에서의 Arg. 추가의 스크리닝 노력을 통해 “위치 141에서의 Asp, 위치 171에서의 Glu, 및 위치 185에서의 Arg” 및 “위치 141에서의 Asp, 위치 170에서의 Glu, 및 위치 187에서의 Arg”가 특히 람다-선호 CH1 도메인 치환 조합인 것으로 식별하였다(도 20, 23, 30, 및 31 참조).
유사하게, 초기 선택 라운드를 통해 위치 147에서의 Val 또는 Ala 및 위치 183에서의 Lys가 야생형 CH1 도메인 서열과 비교해 Cκ와의 우선적 페어링을 촉진하는 것으로 식별되었지만, 추가 선택 라운드를 통해 위치 147에서의 Phe, Ile, Thr, Tyr, Leu, Arg, Asn, Glu, His, Met, 또는 Gln 및/또는 위치 183에서의 Arg, Tyr, Trp, Glu, Phe, 또는 Gln이 147Val 또는 Ala 또는 183Lys 각각과 비교해 우선적 페어링을 증가시키는 것으로 식별되었다. 이들 CH1 도메인 변이체는 단독으로 또는 다른 아미노산 치환과 조합하여, Cκ 또는 Cλ를 함유하는 경쇄와 이러한 CH1 도메인 변이체를 함유하는 중쇄의 우선적인 페어링을 개선할 수 있다.
EU 넘버링에 따른 다음 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 변이체 CH1 도메인이 본원에 제공되며, 따라서, 상기 CH1 도메인 변이체는 Cκ 또는 Cλ(또는 이러한 도메인을 포함하는 경쇄)에 대한 우선적 페어링을 나타낸다: 118, 119, 124, 126~134, 136, 138~143, 145, 147~154, 163, 168, 170~172, 175~176, 181, 183~185, 187, 190, 191, 197, 201, 203~206, 208, 210~214, 216, 218. 본원에서 입증된 바와 같이, 이들 위치 중 하나 이상에서 상이한 아미노산 잔기 치환은 Cκ 또는 Cλ와 우선적으로 페어링되는 CH1 도메인을 생성할 수 있다(표 3 및 표 4참조). 일부 구현예에서, 위치 147(EU 넘버링)에서의 아미노산 치환은 시스테인이 아니다. 일부 구현예에서, 위치 183(EU 넘버링)에서의 아미노산 치환은 시스테인 또는 트레오닌이 아니다. 일부 구현예에서, 위치 147(EU 넘버링)에서의 아미노산 치환은 시스테인이 아니고, 위치 183(EU 넘버링)에서의 아미노산 치환은 시스테인 또는 트레오닌이 아니다.
일부 구현예에서, CH1 도메인 변이체는 다음 위치 중 하나 이상에서 Cκ(또는 이러한 도메인을 포함하는 경쇄)에 대한 CH1 도메인 변이체(또는 이러한 도메인을 포함하는 중쇄)의 우선적 페어링을 유도하기 위한 아미노산 치환을 포함한다: 118, 124, 126~129, 131~132, 134, 136, 139, 143, 145, 147~151, 153~154, 170, 172, 175~176, 181, 183, 185, 190~191, 197, 201, 203~206, 210, 212~214, 및 218 (EU 넘버링). 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 다음 중 하나 이상이다: 위치 118이 G로 치환됨; 위치 124가 H, R, E, L, 또는 V로 치환됨; 위치 126이 A, T, 또는 L로 치환됨; 위치 127이 V 또는 L로 치환됨; 위치 128이 H로 치환됨; 위치 129가 P로 치환됨; 위치 131이 A로 치환됨; 위치 132가 P로 치환됨; 위치 134가 G로 치환됨; 위치 136이 E로 치환됨; 위치 139가 I로 치환됨; 위치 143이 V 또는 S로 치환됨; 위치 145가 F, I, N, 또는 T로 치환됨; 위치 147이 F, I, L, R, T, S, M, V, E, H, Y, 또는 Q로 치환됨; 위치 148이 I, Q, Y, 또는 G로 치환됨; 위치 149가 C, S, 또는 H로 치환됨; 위치 150이 L 또는 S로 치환됨; 위치 151이 A 또는 L로 치환됨; 위치 153가 S로 치환됨; 위치 154가 M 또는 G로 치환됨; 위치 170이 G 또는 L로 치환됨; 위치 172가 V로 치환됨; 위치 175가 G, L, E, A로 치환됨; 위치 176이 P로 치환됨; 위치 181이 Y, Q, 또는 G로 치환됨; 위치 183이 I, W, F, E, Y, L, K, Q, N, 또는 R로 치환됨; 위치 185가 W로 치환됨; 위치 190이 P로 치환됨; 위치 191가 I로 치환됨; 위치 197이 A로 치환됨; 위치 201이 S로 치환됨; 위치 203이 S로 치환됨; 위치 204가 Y로 치환됨; 위치 205가 Q로 치환됨; 위치 206이 S로 치환됨; 위치 210이 R로 치환됨; 위치 212가 G로 치환됨; 위치 213이 E 또는 R로 치환됨; 위치 214가 R로 치환됨; 위치 218이 Q로 치환됨. 일부 구현예에서, CH1 도메인 변이체는 위치 147 및 183에서 카파 경쇄와의 우선적 페어링(결합)을 유도하기 위한 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 147에서 치환되는 아미노산은 F, I, L, R, T, S, M, V, E, H, Y, 및 Q로 이루어진 군으로부터 선택되고, 위치 183에서 치환되는 아미노산은 I, W, F, E, Y, L, K, Q, N, 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, CH1 도메인은 위치 183에서의 R 또는 K 또는 Y를 단독으로 포함하거나 위치 147에서의 F와 조합하여 포함한다. 카파-선호 CH1 도메인 변이체의 비제한적인 예는 서열번호 137, 138, 139, 60, 41, 또는 136의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, CH1 도메인 변이체는 다음 위치 중 하나 이상에서 Cλ(또는 이러한 도메인을 포함하는 경쇄)에 대한 CH1 도메인 변이체(또는 이러한 도메인을 포함하는 중쇄)의 우선적 페어링을 유도하기 위한 아미노산 치환을 포함한다: 119, 124, 126~127, 130~131, 133~134, 138~142, 152, 163, 170~171, 175, 181, 183~185, 187, 197, 203, 208, 210~214, 216, 및 218 (EU 넘버링). 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 다음 중 하나 이상이다: 위치 119가 R로 치환됨; 위치 124가 V로 치환됨; 위치 126이 V로 치환됨; 위치 127이 G로 치환됨; 위치 130이 H 또는 S로 치환됨; 위치 131이 Q, T, N, R, V, 또는 D로 치환됨; 위치 133이 D, T, L, E, S, 또는 P로 치환됨; 위치 134가 A, H, I, P, V, N, 또는 L로 치환됨; 위치 138이 R로 치환됨; 위치 139가 A로 치환됨; 위치 140이 I, V, D, Y, K, S, W, R, L, 또는 P로 치환됨; 위치 141이 D, T, R, E, K, Q, V, 또는 M으로, 바람직하게는 D, E, 또는 K로 치환됨; 위치 142가 M으로 치환됨; 위치 152가 G로 치환됨; 위치 163이 M으로 치환됨; 위치 168이 F, I, 또는 V로 치환됨; 위치 170이 N, G, E, S, 또는 T로, 바람직하게는 E 또는 G로 치환됨; 위치 171이 N, E, G, S, A, D로, 바람직하게는 D, E, G, 또는 S로 치환됨; 위치 175가 D 또는 M으로, 바람직하게는 M으로 치환됨; 위치 181이 V, L, A, K, 또는 T로, 바람직하게는 K 또는 V로 치환됨; 위치 183이 L 또는 V로 치환됨; 위치 184가 R로 치환됨; 위치 185가 M, L, S, R, 또는 T로, 바람직하게는 R로 치환됨; 위치 187이 R, D, E, Y, 또는 S로 치환됨; 위치 197이 S로 치환됨; 위치 203이 D로 치환됨; 위치 208이 I로 치환됨; 위치 210이 T로 치환됨; 위치 211이 A로 치환됨; 위치 212가 N으로 치환됨; 위치 213이 E로 치환됨; 위치 214가 R로 치환됨; 위치 216이 G로 치환됨; 및 위치 218이 P, A, L, E, D, H, S, Q, N, T, I, M, G, C, K, 또는 W로, 바람직하게는 P 또는 A로 치환됨. 일부 구현예에서, CH1 도메인은 람다 경쇄에 대한 우선적인 페어링을 유도하기 위해 잔기 141에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 잔기 141에서 치환되는 아미노산은 T, R, E, K, V, D, 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, CH1 도메인 변이체는 위치 141에서의 Asp 또는 Glu를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 141에서의 아미노산 치환은 CH1 내의 하나 이상의 치환, 예를 들어, 위치 181에서의 Lys, 또는 위치 181에서의 Lys와 위치 218에서의 Ala 또는 Pro와 조합될 수 있다. 위치 141에서의 Asp 또는 Glu는 위치 170, 171, 175, 181, 184, 185, 및/또는 187에서의 하나 이상의 치환, 예컨대 위치 170에서의 Glu 또는 Gly, 위치 171에서의 Asp, Glu, Gly, 또는 Ser, 위치 175에서의 Met, 위치 181에서의 Val 또는 Lys, 위치 184에서의 Arg, 위치 185에서의Arg, 및/또는 위치 187에서의 Arg와 조합될 수 있다. 람다-선호 CH1 도메인 변이체의 비제한적인 예는 서열번호 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 155, 157, 159, 162, 163, 164, 165, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 또는 189의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, CH1 도메인 변이체는 141D, 181K, 및 218P의 조합, 141D, 171E, 및 185R의 조합, 또는 141D, 170E, 및 187R의 조합을 포함한다. 추가의 구현예에서, CH1 도메인 변이체는 서열번호 188, 186, 또는 143의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시는 CH1 도메인 변이체를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 항체도 고려한다. 이러한 폴리펩티드는 제1 CH1 도메인 변이체를 함유하는 제1 중쇄 및 제2 CH1 도메인 변이체를 함유하는 제2 중쇄를 포함하는 다중특이적 항체일 수 있다. 제1 중쇄 및 제2 중쇄는 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 제1 CH1 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 제1 중쇄 CH1 도메인과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 제2 CH1 도메인을 포함하는 제2 중쇄를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 CH1 도메인 변이체는 Cκ와 우선적으로 페어링될 수(또는 이에 결합할 수) 있고, 제2 CH1 도메인 변이체는 Cλ에 우선적으로 결합할 수 있다. 이 경우, 제1 경쇄는 Cκ 도메인을 포함하고, 제2 경쇄는 Cλ 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 경쇄는 카파 경쇄(Cκ 및 Vκ) 또는 키메라 경쇄(Cκ 및 Vλ)이고, 제2 경쇄는 람다 경쇄(Cλ 및 Vλ) 또는 키메라 경쇄(Cλ 및 Vκ)이다.
일부 구현예에서, 제1 CH1 도메인 변이체는 Cλ와 우선적으로 페어링될 수(결합할 수) 있고, 제2 CH1 도메인 변이체는 Cκ와 우선적으로 페어링될 수(결합할 수) 있다. 이 경우, 제1 경쇄는 Cλ 도메인을 포함하고, 제2 경쇄는 Cκ 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 경쇄는 람다 경쇄(Cλ 및 Vλ) 또는 키메라 경쇄(Cλ 및 Vκ)이고, 제2 경쇄는 카파 경쇄(Cκ 및 Vκ) 또는 키메라 경쇄(Cκ 및 Vλ)이다.
제1 및 제2 경쇄는 CH1 도메인에 대한 우선적 페어링을 유도하는 아미노산 치환을 포함할 수 (또는 포함하지 않을 수) 있다. 일부 구현예에서, 경쇄의 CL 도메인은 중쇄, 예를 들어 CH1 도메인에 대한 결합을 변경하도록 변형되지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 경쇄는 야생형 CL 도메인, 예를 들어, 야생형 Cκ 도메인 또는 야생형 Cλ 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 제2 경쇄는 야생형 CL 도메인, 예를 들어, 야생형 Cκ 도메인 또는 야생형 Cλ 도메인을 함유한다. 야생형 카파 경쇄 또는 Cκ 도메인은 IGKC에 의해 암호화될 수 있다. 야생형 람다 경쇄 또는 Cλ 도메인은 IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6, 또는 IGLC7에 의해 암호화될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 다중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 이러한 다중특이적 및 이중특이적 항체는 CH1 도메인을 함유하는 임의의 포맷(예를 들어, 도 24 내지 도 29에 도시된 구조를 포함하되 이에 한정되지는 않음)을 포함할 수 있다. 또한, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 Brinkmann 및 Kontermann의 문헌[MAbs 9(2):182-212 (2017)]의 표 2를 참조한다.
다중특이적 항체는 표 3, 4, 7, 9, 12, 또는 13에 열거된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CH1 도메인 변이체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 제1 CH1 도메인 변이체 및 제1 경쇄를 함유하는 제1 중쇄를 포함하며, 제1 중쇄 및 제1 경쇄는 제1 동족 쌍을 형성한다. 제1 CH1 도메인 변이체는 EU 넘버링에 따른 다음 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다: 118, 119, 124, 126-134, 136, 138~143, 145, 147~154, 163, 168, 170~172, 175~176, 181, 183~185, 187, 190, 191, 197, 201, 203~206, 208, 210~214, 216, 218. 이러한 제1 CH1 도메인 변이체는 제1 경쇄에 우선적으로 결합한다. 제1 경쇄의 CL 도메인은 제1 중쇄에 대한 결합을 변경하도록 변형되거나 변형되지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 제2 CH1 도메인 변이체 및 제2 경쇄를 함유하는 제2 중쇄를 포함하며, 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 제2 동족 쌍을 형성한다. 제2 CH1 도메인 변이체는 EU 넘버링에 따른 다음 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다: 118, 119, 124, 126-134, 136, 138~143, 145, 147~154, 163, 168, 170~172, 175~176, 181, 183~185, 187, 190, 191, 197, 201, 203~206, 208, 210~214, 216, 218. 이러한 제2 CH1 도메인 변이체는 제2 경쇄에 우선적으로 결합한다. 제2 경쇄의 CL 도메인은 제2 중쇄에 대한 결합을 변경하도록 변형되거나 변형되지 않을 수 있다.
다중특이적 항체 또는 항체 단편의 소정의 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 카파-선호 CH1 도메인 변이체 및 람다-선호 CH1 도메인 변이체를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 카파-선호 CH1 도메인 변이체는 본원에 개시된 것과 같은 카파-선호 CH1 도메인 변이체일 수 있고, 람다-선호 CH1 도메인은 본원에 기술되거나 기술되지 않을 수 있는 람다-선호 CH1 도메인일 수 있다. 일부 경우에, 람다-선호 CH1 도메인 변이체는 본원에 개시된 것과 같은 람다-선호 CH1 도메인 변이체일 수 있고, 카파-선호 CH1 도메인은 본원에 기술되거나 기술되지 않을 수 있는 카파-선호 CH1 도메인일 수 있다. 소정의 경우에, 카파-선호 CH1 도메인 변이체 및 람다-선호 CH1 도메인 변이체 둘 다는 본원에 개시된 것과 같은 변이체이다.
본원에 개시된 CH1 도메인 변이체 중 어느 하나가 사용되어 카파 CL 도메인 또는 람다 CL 도메인에 대한 페어링 선호도를 제공할 수 있고, CL 도메인은 야생형 또는 비야생형일 수 있다. 또한, 본원에 개시된 CH1 도메인 변이체 중 어느 하나가 사용되어, 항체 구조의 나머지 부분(예를 들어 CH2, CH3, VH, VL, 또는 CL 도메인)에 추가적인 아미노산 변경을 도입하거나 도입하지 않고도, 항체 또는 항체 단편 구조에 카파/람다 페어링 선호도를 제공할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 CH1 도메인 변이체는 경쇄 페어링 선호도를 추가로 강화할 수 있는 VH 치환(예를 들어, VH:VL 치환, 예컨대 Q39E/K:Q38K/E (Dillon 등의 문헌[MAbs 2017 9(2): 213-230)]; 또는 Q39K + R62E:Q38D + D1R 또는 Q39Y + Q105R: Q38R + K42D (Brinkmann 등의 문헌[MAbs 2017 9(2): 182-212])과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 범주에 영향을 미치고자 함이 없이, 비록 이러한 비-CH1 변형이 본원의 발명자들에 의해 발견된 신규한 CH1 도메인 변이체와 조합하여 임의로 사용될 수 있지만, 본원에 제공된 CH1 도메인 변이체는 CH2, CH3, 또는 가변 도메인의 또 다른 변형을 필요로 하지 않고 야생형 경쇄(또는 야생형 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드)의 맥락에서 카파/람다 페어링 선호도를 제공한다는 것이 강조된다. 항체, 특히 다중특이적 항체를 생산함에 있어서 당업계에 보고된 많은 실패를 감안한다면, CH1 도메인의 변형만으로도 의미있는 카파 또는 람다 선호도를 제공할 수 있다는 것은 매우 예상 밖이다.
일부 구현예에서, 항체는 약학적 조성물의 일부이다. 이러한 조성물은 본원에 기술된 CH1 도메인 변이체를 포함하는 다수의 폴리펩티드, 예를 들어 항체를 함유할 수 있다.
또한, 이러한 CH1 도메인 변이체를 수득하기 위한 방법이 본 개시에 고려된다. 본원에 기술된 변이체 CH1 도메인은 합리적인 설계에 의해(가상 환경에서) 식별되거나, 예를 들어, ePCR 또는 당업계에 공지된 다른 돌연변이유발 기술을 사용하여 무작위로 식별될 수 있다. 일 구현예에서, 합리적인 설계 접근법이 변이체 CH1 도메인을 설계하는 데 사용된다. 이러한 접근법의 경우, 한 세트의 구조, 예를 들어, Fab 결정 구조와 같은 실험적으로 도출된 단백질 구조를 조립되고 분석하여 CH1-CL 도메인 계면(CH1-CL 도메인 계면 위치로도 지칭됨)에 걸쳐 접촉에 관여하는 용매 노출 위치를 식별할 수 있다. 상기 세트는 소정의 특성, 예를 들어, 기준(야생형) CH1, Cκ, 및 Cλ에 대한 높은 동일성 백분율을 갖는 구조를 선택함으로써 엄선할 수 있다. 일부 구현예에서, 한 쌍의 측쇄 원자가 5 Å의 컷오프 거리 이내에 있는 경우, 위치는 다른 잔기와 접촉하는 (또는 “접촉된 상태”인) 것으로 기술되거나 정의된다. “CH1 계면 잔기”는 Cκ 도메인 또는 Cλ 도메인의 잔기와 접촉하는 CH1 도메인의 잔기로서 정의될 수 있다. 용어 “잔기” 및 “위치”는 이러한 맥락에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명자들은 예상 밖으로, CH1-VH 계면 내의 CH1 위치(예: CH1 위치 151)에서의 아미노산 치환이 경쇄 이소형 선호도를 변경시킨다는 것도 발견하였다. 따라서, 일부 구현예에서, VH의 잔기와 접촉하는 CH1 위치(예를 들어, 한 쌍의 측쇄 원자가 5 Å의 컷오프 거리 이내에 있음)도 CH1 도메인 변이체를 합리적으로 식별하기 위해 선택될 수 있다.
어느 아미노산을 변화시킬 것인지, 단독으로 변화시킬 것인지 또는 조합하여 변화시킬 것인지(예를 들어, 단일항, 이중항, 삼중항 등)를 선택하는 것은 다음과 같은 다양한 상이한 파라미터에 따라 달라질 수 있다: 상이한 구조 내의 CH1과 CL 사이 또는 CH1과 VH 사이에서 계면을 형성하는 데 있어서의 위치의 일관된 역할; 전체 구조에서 위치(들)의 접근성; 하나의 위치와 항원 결합에 영향을 미치는 위치들과의 관계; 또는 잔기가 상기 계면에 걸쳐 분자간 접촉에 직접 참여하지 않고 CH1:CL 또는 CH1:VH 계면의 형성에 알로스테릭한 방식으로 영향을 미칠 가능성. 일부 구현예에서, CH1 도메인 내의 아미노산 잔기는 다음의 경우에 변이되도록 선택된다: 1) 잔기가 Cκ 세트 내의 구조의 적어도 10%에서 경쇄 불변 도메인과의 계면에 있고, Cκ 세트 내의 구조의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 용매 접근 가능 표면적(SASA)을 갖는 경우(실시예 1 참조), 또는 2) 잔기가 Cλ 세트 내의 구조의 적어도 10%에서 경쇄 불변 도메인과의 계면에 있고, Cλ 세트 내의 구조의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 SASA를 갖는 경우, 또는 3) 잔기가 Cκ 및/또는 Cλ 세트의 대표적인 세트의 적어도 10%에서 VH와의 계면에 있고, Cκ 및/또는 Cλ 세트의 대표적인 세트의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 용매 접근 가능 표면적을 갖는 경우.
또한, 카파-선호도 또는 람다-선호도를 부여하기 위해 본원에서 제공되는 CH1 도메인 내의 특이적 아미노산 치환의 각각에 경우, 치환의 결과로서 포함된 아미노산은 동등한 카파-선호도 또는 람다-선호도를 제공하는 또 다른 CH1 도메인 변이체를 수득하기 위해 보존적 아미노산 치환을 통해 추가로 치환될 수 있다. 대안적으로, 각각의 CH1 도메인 변이체의 경우, 야생형 서열에 비해 CH1 도메인 변이체에서 영향을 받지 않은 하나 이상의 아미노산 위치는 동등한 카파-선호도 또는 람다-선호도를 제공하는 또 다른 CH1 도메인 변이체를 수득하기 위해 보존적 치환을 통해 변경될 수 있다.
“보존적 아미노산 치환”은 당업계에 공지되어 있으며, 소정의 물리적 및/또는 화학적 특성을 갖는 하나의 아미노산이 동일하거나 유사한 화학적 또는 물리적 특성을 갖는 다른 아미노산과 교환되는 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 산성/음으로 하전된 극성 아미노산이 산성/음으로 하전된 또 다른 극성 아미노산(예를 들어, Asp 또는 Glu)으로 치환되는 것, 비극성 측쇄를 갖는 아미노산이 비극성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예를 들어, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val, 등)으로 치환되는 것, 염기성/양으로 하전된 극성 아미노산이 염기성/양으로 하전된 또 다른 극성 아미노산(예를 들어, Lys, His, Arg, 등)으로 치환되는 것, 극성 측쇄를 갖는 하전되지 않은 아미노산이 극성 측쇄를 갖는 하전되지 않은 또 다른 아미노산(예를 들어, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr, 등)으로 치환되는 것, β-분지형 측쇄를 갖는 아미노산이 β-분지형 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예를 들어, Ile, Thr, 및 Val)으로 치환되는 것, 방향족 측쇄를 갖는 아미노산이 방향족 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산(예를 들어, His, Phe, Trp, 및 Tyr)으로 치환되는 것 등일 수 있다.
다음으로, CH1 도메인 잔기가 변경되는 라이브러리를 생성할 수 있다. 하나 이상의 CH1 도메인 잔기는 라이브러리에서 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, 약 1 내지 6개의 CH1 도메인 잔기가 라이브러리에서 변경된다. 개별 잔기 위치에서의 아미노산 다양성은, 주어진 CH1 도메인 위치에서 적어도 20개의 자연 발생 아미노산을 모두를 나타낼 수 있도록, 퇴화 코돈, 예를 들어, NNK를 통해 생성될 수 있다. 선택된 CH1 도메인 위치는 개별적으로 변경되어 점 치환(단일항으로도 지칭됨)을 생성할 수 있거나, 위치 조합의 하위 집합이 조합하여 변경되어, 예를 들어, 이중 및 삼중 치환(이중항 및 삼중항으로도 지칭됨)을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 3D 공간에서 가깝게 이웃하는 CH1 도메인 위치, 예를 들어, 위치 147 x [124, 126, 145, 148, 175, 및 181]을 포함하는 변이체 조합이 생성된다.
일부 구현예에서, CH1 도메인 변이체 라이브러리를 제작하는 방법은: a) 하나 이상의 카파 불변(Cκ) 도메인, 하나 이상의 람다 불변(Cλ) 도메인, 및 하나 이상의 CH1 도메인을 함유하는 구조 세트를 제공하는 단계; b) 치환을 위해 하나 이상의 Cκ 도메인 위치 및/또는 하나 이상의 Cλ 도메인 위치와 접촉하는 하나 이상의 용매 노출 CH1 도메인 위치를 선택하는 단계; c) 단계 b)에서 식별된 하나 이상의 CH1 도메인 위치를 상기 부모 아미노산이 아닌 임의의 아미노산과 치환하는 단계; 및 d) 단계 c)의 CH1 변이체 도메인을 암호화하는 폴리펩티드를 합성하여 CH1 변이체 도메인 라이브러리를 조립하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 Cκ 도메인, 하나 이상의 Cλ 도메인, 및 하나 이상의 CH1 도메인은 야생형이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 Cκ 도메인, 하나 이상의 Cλ 도메인, 및 하나 이상의 CH1 도메인은 인간(모든 대립 유전자 기능적 변이체 포함)이다. 일부 구현예에서, 단계 a)에서의 Cκ 아미노산 서열은 IGKC에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 단계 a)에서의 Cλ 아미노산 서열은 IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6, 또는 IGLC7에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 단계 a)에서의 Cλ 아미노산 서열은 IGLC2에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 생성된 CH1 도메인 라이브러리는 CH1-CL 계면 또는 CH1-VH 계면에 걸쳐 상호 작용을 필요로 하도록 설계된다.
일부 구현예에서, 치환을 위해 선택된 하나 이상의 CH1 아미노산 잔기는 (i) CH1:Cκ 구조의 대표적인 세트의 적어도 10%에서 경쇄 불변 도메인과의 계면에 있고, CH1:Cκ 구조의 대표적인 세트의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 용매의 접근 가능 표면적을 갖고; (ii) CH1:Cλ 구조의 대표적인 세트의 적어도 10%에서 경쇄 불변 도메인과의 계면에 있고, CH1:Cλ 구조의 대표적인 세트의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 용매 접근 가능 표면적을 갖거나; (iii) Cκ 및/또는 Cλ 구조의 대표적인 세트의 적어도 10%에서 VH와의 계면에 있고, Cκ 및/또는 Cλ 구조의 대표적인 세트의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 용매 접근 가능 표면적을 갖는다.
일부 구현예에서, 라이브러리는 경쇄 이소형 선호도를 변경하는 것으로서 본원에 개시된 하나 이상의 CH1 위치(예를 들어, 위치 141, 147, 151, 170, 171, 181, 183, 185, 187, 또는 218, 또는 이들의 임의의 조합), 및 임의로 하나 이상의 추가 관심 CH1 위치를 변경함으로써 생성된다. 소정의 구현예에서, 라이브러리는 경쇄 이소형 선호도를 변경하는 것으로서 본원에 개시된 하나 이상의 CH1 위치(예를 들어, 위치 141, 147, 151, 170, 171, 181, 183, 185, 187, 또는 218, 또는 이들의 임의의 조합)에서 소정의 치환을 변경된 하나 이상의 추가 관심 CH1 위치와 조합함으로써 생성될 수 있다. 특정 예에서, 소정의 치환은 A141D, A141E, K147F, P151A, P151L, F170E, P171E, S181K, S183R, V185R, T187R, 또는 K218P, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 카파 경쇄 또는 람다 경쇄에 대한 우선적 결합을 나타내는 CH1 도메인 변이체를 식별하기 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 이러한 스크리닝은 적절한 숙주 세포, 예를 들어 진핵 세포, 예를 들어, 효모 세포, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애에서 라이브러리를 발현함으로써 시작될 수 있다. 숙주 세포에서 라이브러리에 포함된 CH1 변이체 도메인을 발현시킨 후, 예를 들어 FACS 또는 MACS를 통해 변이체의 라이브러리를 스크리닝하여 바람직한 결합 특성을 갖는 변이체를 식별할 수 있다.
일부 구현예에서, Cκ 또는 Cλ 도메인에 우선적으로 결합하는 CH1 도메인 변이체를 식별하는 방법은: a) 하나 이상의 카파 불변(Cκ) 도메인, 하나 이상의 람다 불변(Cλ) 도메인, 및 하나 이상의 CH1 도메인을 함유하는 구조 세트를 제공하는 단계; b) 치환을 위해 하나 이상의 Cκ 도메인 위치 및/또는 하나 이상의 Cλ 도메인 위치와 접촉하는 하나 이상의 용매 노출 CH1 도메인 위치를 선택하는 단계; c) 단계 b)에서 식별된 하나 이상의 CH1 도메인 위치를 상기 부모 아미노산이 아닌 임의의 아미노산과 치환하는 단계; d) 단계 c)의 CH1 변이체 도메인을 암호화하는 폴리펩티드를 합성하여 CH1 변이체 도메인 라이브러리를 조립하는 단계; 및 e) 단계 d)의 라이브러리를 스크리닝하여 Cκ 또는 Cλ 도메인에 우선적으로 결합하는 CH1 도메인 변이체를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 Cκ 도메인, 하나 이상의 Cλ 도메인, 및 하나 이상의 CH1 도메인은 야생형이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 Cκ 도메인, 하나 이상의 Cλ 도메인, 및 하나 이상의 CH1 도메인은 인간(모든 대립 유전자 기능적 변이체 포함)이다. 일부 구현예에서, 단계 a)에서의 Cκ 아미노산 서열은 IGKC에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 단계 a)에서의 Cλ 아미노산 서열은 IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6, 또는 IGLC7에 의해 암호화된다. 특정 구현예에서, 단계 a)에서의 Cλ 아미노산 서열은 IGLC2에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 생성된 CH1 도메인 라이브러리는 CH1-CL 계면 또는 CH1-VH 계면에 걸쳐 상호 작용을 필요로 하도록 설계된다.
일부 구현예에서, 치환을 위해 선택된 하나 이상의 CH1 아미노산 잔기는 (i) CH1:Cκ 구조의 대표적인 세트의 적어도 10%에서 경쇄 불변 도메인과의 계면에 있고, CH1:Cκ 구조의 대표적인 세트의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 용매의 접근 가능 표면적을 갖고; (ii) CH1:Cλ 구조의 대표적인 세트의 적어도 10%에서 경쇄 불변 도메인과의 계면에 있고, CH1:Cλ 구조의 대표적인 세트의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 용매 접근 가능 표면적을 갖거나; (iii) CH1:Cκ 및/또는 CH1:Cλ 구조의 대표적인 세트의 적어도 10%에서 VH와의 계면에 있고, CH1:Cκ 및/또는 CH1:Cλ 구조의 대표적인 세트의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 용매 접근 가능 표면적을 갖는다.
본원에 기술된 방법은, 하나 이상의 치환된 CH1 아미노산 잔기가 람다 CL 도메인(또는 람다 CL 도메인을 포함하는 경쇄)에 비해 카파 CL 도메인(또는 카파 CL 도메인을 포함하는 경쇄)에 대한 중쇄의 우선적 페어링을 유도하거나, 그 반대의 경우인지를 검증하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 우선적 경쇄 페어링을 평가하는 데에는 형광 활성화 세포 분류(FACS), LC-MS, AlphaLISA, 및 SDS-PAGE를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단계 c)에서 치환을 위해 선택된 하나 이상의 CH1 도메인 위치는, 선택된 CH1 도메인 위치가 구조의 적어도 10%에서 CL 도메인과 접촉하는 임의의 주어진 야생형 항체 구조 세트 내의 경쇄와의 계면에서 소정의 빈도로 발생한다. 일부 구현예에서, 단계 c)에서 치환을 위해 선택된 하나 이상의 CH1 도메인 위치는, 임의의 주어진 Cκ 또는 Cλ 세트 내의 구조의 적어도 약 90%에서 약 10%를 초과하는 분획 용매 접근 가능 표면적을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 c)에서 치환을 위해 선택된 하나 이상의 CH1 도메인 위치는, 선택된 CH1 도메인 위치가 구조의 적어도 10%에서 VH 도메인과 접촉하는 임의의 주어진 야생형 항체 구조 세트 내의 VH 영역과의 계면에서 소정의 빈도로 발생한다.
CH1 도메인 변이체를 식별하기 위해 본원에 기술된 방법을 사용함으로써, 치환을 위해 다음의 CH1 도메인 위치를 선택하였다: 114, 116, 118, 119, 121~124, 124~143, 147~154,160, 162~165, 167, 168, 170~172, 174, 175, 176, 178, 180, 181, 183~185, 187, 190, 191, 197, 201, 203~208, 210~214, 216, 및/또는 128 (EU 넘버링에 따름). 이들 CH1 도메인 위치 중 어느 하나 또는 이들 CH1 도메인 위치 조합을 치환하면 특정 CL 도메인에 대한 우선적으로 페어링되는 CH1 도메인이 생성될 수 있다. 결과적으로, 이러한 CH1 도메인 변이체를 포함하는 중쇄 및 특정 CL 도메인을 포함하는 경쇄는 동족 쌍을 형성할 가능성이 높으며, 동족 쌍을 형성하는 중쇄와 경쇄 상이에서 하나 이상의 CH1 도메인 치환에 의해 적어도 부분적으로 유도되는 우선적 페어링이 존재한다.
일 구현예에서, CH1 도메인 변이체는 Cκ와 우선적으로 페어링되어, 결과적으로 Cκ 도메인을 함유하는 경쇄와 CH1 도메인 변이체를 함유하는 중쇄에 대한 우선적 페어링을 유도한다. 또 다른 구현예에서, CH1 도메인 변이체는 Cλ 도메인과 우선적으로 페어링되어, 결과적으로 Cλ 도메인을 함유하는 경쇄와 CH1 도메인 변이체를 함유하는 중쇄에 대한 우선적 페어링을 유도한다. 소정의 예시적인 CH1 도메인 치환(예: 147F 및/또는 183R, 183K, 또는 183Y)은 카파 경쇄와 중쇄의 우선적 페어링을 촉진하는 것으로 식별된 반면, 다른 CH1 도메인 치환(예: 141D, 141E, 141K, 170E, 170G, 171E, 171D, 171G, 171S, 175M, 181K, 181B, 184R, 185R, 187R, 218A, 또는 218P)은 람다 경쇄와 중쇄의 우선적 페어링을 촉진하는 것으로 식별되었다. 따라서, 이러한 CH1 도메인 변이체를 포함하는 이중특이적 항체로서, 중쇄-경쇄 페어링에서의 충실도가 개선된 이중특이적 항체를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 CH1λ(예컨대, 170E, 170G, 171E, 171D, 171G, 171S, 또는 175M와 조합되고/조합되거나 181K, 181B, 184R, 185R, 187R, 218A, 및/또는 218P와 조합된 141D, 141E 또는 141K)를 포함하는 제1 중쇄 및 CH1κ(예컨대 147F 및/또는 183R, 183K, 또는 183Y)를 포함하는 제2 중쇄를 함유하며, 이들 각각은 이들의 동족 경쇄와 우선적으로 페어링된다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 CH1κ(예컨대, 147F 및/또는 183R, 183K, 또는 183Y)를 포함하는 제1 중쇄 및 CH1λ(예컨대, 170E, 170G, 171E, 171D, 171G, 171S, 또는 175M와 조합되고/조합되거나 181K, 181B, 184R, 185R, 187R, 218A, 및/또는 218P와 조합된 141D, 141E 또는 141K), 예를 들어 “141D, 171E, 및 185R” 또는 “141D, 170E, 및 187R”를 포함하는 제2 중쇄를 함유하며, 이들 각각은 이들의 동족 경쇄와 우선적으로 페어링된다.
본원에 기술된 방법을 사용함으로써 수득된 CH1 변이체 도메인을 암호화하는 폴리펩티드는 숙주 세포, 예를 들어 진핵 세포에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, CH1 변이체 도메인은 효모에서 발현된다. 일부 구현예에서, 효모 균주는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다. 일부 구현예에서, 효모 균주는 하나 이상의 야생형 카파 경쇄 및 하나 이상의 야생형 람다 경쇄를 공발현한다.
본 발명을 예시하기 위한 실시예가 아래에 제공된다. 이들 실시예는 본 발명을 임의의 특정 응용예 또는 작동 이론으로 한정하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 라이브러리에서의 다양화를 위한 CH1 도메인 위치의 가상 선택
단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank, PDB)로부터 Fab 결정 구조 세트를 조립하고, 다양화를 위해 CH1-CL 계면 잔기를 식별하기 위한 구조 기반 접근법(structure-guided approach)에 사용하였다.
기준(야생형) CH1, Cκ, 및 Cλ 서열(아래에 도시됨)에 대해 높은 동일성 백분율을 갖는 구조를 선택함으로써 2,367개의 Fab 결정 구조의 초기 세트의 범위를 좁혔다. CH1 정렬에 대한 기준 서열은 적절한 CH1(EU 잔기 118~215) + IgG1 힌지의 일부(EU 잔기 216~229)에 걸친다. Cκ 및 Cλ 기준 서열은 각각 EU 잔기 번호 108~214 및 107A~215에 걸쳐 있다.
CH1 (+ 상단 내지 중간 힌지) 기준: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC (서열번호 1).
Cκ 기준: RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 2).
Cλ 기준: GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (서열번호 3).
한 쌍의 측쇄 원자가 5 Å의 컷오프 거리 이내에 있는 경우 잔기가 “접촉된 상태”인 것으로 정의하였다. CH1 계면 잔기는 개별 구조에서 하나 이상의 Cκ 또는 Cλ 잔기와 접촉한 잔기들로서 정의하였다.
개별 중쇄 및 경쇄 잔기의 용매 접근 가능 표면적(SASA)은 “유리 상태(free state)”에서, 즉 경쇄 및 중쇄와 각각 페어링되지 않은 상태에서 계산하였다. 분획 SASA는 잔기와 동일한 아미노산(즉, X)을 포함하는 단리된 Gly-X-Gly 트리펩티드 모델의 SASA에 대한 잔기 SASA의 비율로서 정의하였다. 용매 노출 잔기는 분획 SASA가 10%를 초과하는 잔기로서 정의하였다.
높은 동일성 백분율을 기준으로 초기 결정 구조 세트의 범위를 좁힌 결과, 183개의 CH1:Cκ 구조 세트(“Cκ 세트”) 및 43개의 CH1:Cλ 구조 세트(“Cλ 세트”)를 식별하였다. 정렬의 갭이 구조에서 누락된 아미노산으로 인한 것임을 고려한 후, Cκ 세트의 모든 엔트리는 기준 CH1 및 Cκ 서열과 100% 동일한 반면, Cλ 세트의 엔트리는 기준 서열과 > 99% 동일하였다.
Cκ와 Cλ 사이의 구조 기반 서열 정렬이 아래에 도시되어 있다. CH1은 후자 도메인들 간의 낮은 서열 동일성에도 불구하고 Cκ 및 Cλ 둘 다와 안정한 계면을 형성한다. BLOSUM62 점수에 따른 보존적 및 반보존적 치환은 각각 “|” 및 “:”를 사용하여 도시되어 있다. 도메인들 간의 서열 동일성은 38.3%이다(107개의 Cκ 잔기에 걸쳐 41개가 동일함).
Cκ: -RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT
AAPSV |FPPS:E|L::: A::VCL|::FYP : V WK:D:: ::: | ::
Cλ: GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTP
Cκ: EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC- (서열번호 2)
:::S: : Y: SS L:L: :|::H| Y:C|VTH|G S|V K: EC
Cλ: SKQSN-NKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEG--STVEKTVAPTECS (서열번호 3)
밑줄 친 아미노산은 CH1 도메인과 접촉하는 Cκ 및 Cλ 잔기를 나타낸다. 이러한 결정은 Cκ 및 Cλ-세트의 Fab 구조에 대한 컨센서스에 기초한다. 25개의 Cκ 계면 잔기 및 26개의 Cλ 계면 잔기가 있다. Cκ 또는 Cλ 중 하나의 계면에 있는 위치(N=28)에 초점을 두고, (1) 주어진 위치에서의 잔기가 CH1과 접촉하는지 여부, 및 (2) 상기 위치에서의 아미노산이 Cκ와 Cλ 간에 동일한지에 따라 2 x 2 매트릭스를 구성하였다(표 1 참조).
CH1:CL 계면에서의 Cκ 및 Cλ 아미노산 위치
Cκ와 Cλ 둘 다에 대한 접촉 위치 Cκ와 Cλ 간에 동일한 아미노산
예 아니요
예 9 14
아니요 2 3
표 1은 구조적으로 보존되었지만(EU 잔기 넘버링과 동일함) 상이한 아미노산 동일성을 갖고, CH1 도메인과 접촉하는 14개의 Cκ 및 Cλ 위치 세트가 있음을 강조한 것이다. 표 2는 14개의 아미노산 위치(EU 넘버링)를 나열하고, 카파 및 람다 경쇄에 존재하는 아미노산을 보여준다. Cκ 및 Cλ 계면 잔기의 동일성에서의 이러한 차이는 Cκ 또는 Cλ에만 특이적으로 결합하지만 둘 다에는 결합하지 않는 돌연변이체 CH1 도메인을 생성하는 데 이용될 수 있다.
Cκ 및 Cλ에 대해 동일하지 않은 아미노산 잔기를 갖는 구조적으로 보존된 CH1-접촉 위치
위치
(EU 넘버링) 		Cκ Cλ
116 F T
122 D S
124 Q E
127 S A
129 T K
131 S T
137 N S
138 N D
160 Q E
162 S T
167 D Q
174 S A
178 T Y
180 T S
라이브러리에서의 변이를 위한 선택의 초기 임계값으로서, 개별 CH1 도메인 위치는 다음 기준을 충족해야 한다: 1) 위치는 Cκ 세트 내의 구조의 적어도 10%에서 경쇄 불변 도메인과의 계면에 있고, 해당 위치에서의 잔기는 Cκ 세트 내의 구조의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 SASA를 가질 것, 또는 2) 위치는 Cλ 세트 내의 구조의 적어도 10%에서 경쇄 불변 도메인과의 계면에 있고, 해당 위치에서의 잔기는 Cλ 세트 내의 구조의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 SASA를 가질 것, 또는 3) 위치는 CH1:Cκ 세트(Cκ 세트) 또는 CH1:Cλ 세트(Cλ 세트) 내의 구조의 적어도 10%에서 VH 영역과의 계면에 있고, 해당 위치에서의 잔기는 Cκ 및/또는 Cλ 세트 내의 구조의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 SASA를 가질 것. 계면 정의는 CH1 잔기가 임의의 CL 도메인 잔기(표 2에 열거된 14개의 CL 도메인 잔기로 이루어진 세트를 포함하지만 이에 한정되지는 않음)와 접촉하는 것 또는 CH1 잔기가 임의의 VH 잔기와 접촉하는 것을 고려한다.
이러한 임계 기준에 기초하여, (Cys220을 고려에서 배제한 후) 잠재적으로 포함시킬 30개의 CH1 아미노산 위치 세트를 식별하였다. 이러한 더 큰 세트로부터, 25개의 CH1 위치로 이루어진 그룹을 라이브러리에서 변경시킬 대상으로 선택하였다. 각 위치에서의 아미노산 다양성은 20개의 모든 천연 아미노산을 나타내는 퇴화 NNK 코돈을 통해 생성하였다(Stemmer 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci USA 1994 Oct 25;91(22): 10747-51] 참조). 아미노산 치환은 25개의 CH1 위치 각각에서 개별적으로 이루어졌고, 예를 들어, 이중 및 삼중 돌연변이체를 생성하기 위해 단일 치환의 하위 집합을 선택적으로 조합하였다. 최종 라이브러리 설계는 25개의 단일항(단일 CH1 위치에서의 NNK 코돈 다양성), 48개의 이중항 돌연변이체(2개의 CH1 위치에서의 NNK 코돈 다양성), 및 16개의 삼중항 돌연변이체(3개의 CH1 위치에서의 NNK 코돈 다양성)을 나타내는 89개의 CH1 올리고뉴클레오티드로 구성하였다.
실시예 2: Cκ 및 Cλ 경쇄를 공발현하는 효모에서의 CH1 도메인 변이체 라이브러리
인간 CH1 도메인 변이체의 라이브러리를 야생형 인간 IgG Cκ 및 Cλ 경쇄를 공발현하는 조작된 효모 균주에서 제작하고 (Cλ-우선적 CH1 치환 및 Cκ-우선적 CH1 치환의 후속 선택이 가능하도록 상이한 발현 수준으로) 발현시켰다.
양방향 발현 플라스미드(pAD7064 및 pAD4800)를 작제하였으며, 이들 각각은 야생형 인간 IgG 경쇄 카파 및 람다 불변 도메인 및 S. 세레비지애 URA3 유전자(선택 마커)가 측면에 위치한 사카로마이세스 세레비지애 Gal1/Gal10 프로모터 영역을 함유하였다. 플라스미드 pAD7064 및 pAD4800은 Gal1/10 프로모터 영역에 비해 카파 및 람다 불변 도메인의 배향이 상이하였다. 고유 제한 효소 부위(PME-I 및 SFI-I)를 각 플라스미드 내의 카파 및 람다 불변 도메인의 상류에 위치시켰다. pAD7064 및 pAD4800을 PME-I 및 SFI-I로 개별적으로 분해한 다음, PCR-증폭된 DNA 삽입체와 함께 조작된 효소 균주 내로 형질전환시켰다(ADI-26140 경쇄 영역; Gal1/10 프로모터 영역; 및 상동성 재죠합을 통해 조립체를 플라스미드로 안내하기 위한 5’ 및 3’ 말단이 포함된, 차별적으로 암호화된(“퇴행”) ADI-26140 경쇄 가변 영역(IDT gblock)). 형질전환된 효모를 URA3+가 없는 고형 한천 플레이트 상에 도말하고, 30℃에서 48시간 동안 성장시킨 후, 클론을 수확하고, DNA를 추출하여 정제하였다. 시퀀싱 후, 2개의 이중-경쇄 DNA 작제물을 식별하였다: (1) Gal10::ADI-26140-VL-Cκ Gal1::ADI-26140-VL-Cλ (Cκ 우선적 CH1 치환의 후속 선택이 가능하도록 우세 프로모터에 의해 조절되는 인간 Cλ); 및 (2) Gal10::ADI-26140-VL-Cλ Gal1::ADI-26140-VL-Cκ (Cλ 우선적 CH1 치환의 후속 선택이 가능하도록 우세 프로모터에 의해 조절되는 인간 Cκ). ADI-26140은 항-암탉 달걀 리소자임(HEL) IgG이다.
중쇄 발현을 위해, Gal1 프로모터, SFI-I 제한 부위, 인간 IgG 중쇄의 CH2-CH3 도메인(IgG1(N297A)), 및 TRP1(선택성 마커)을 함유하는 DNA 벡터(pAD4466)를 작제하였다.
병렬로, pAD4466에 삽입하기 위해 CH1 도메인 변이체 DNA 단편으로 이루어진 2개의 독립적인 풀을 생성하였다. 제1 풀은 실시예 1에 기술된 바와 같은 가상 설계 접근법을 사용하여 생성하였다. 제2 풀은 오류 유발 PCR(ePCR)을 통해 생성하였다. 간략하게, 돌연변이 유발성 뉴클레오티드 유사체 dPTP(0.01 mM) 및 8-옥소-DGTP(0.01 mM)를 (a) 각각 1:100 및 1:100으로 희석하거나, (b) 각각 1:100 및 1:10으로 희석하여 PCR 반응에 포함시켰다.
pAD4466을 SFI-I로 분해하고, ADI-26140 HC 가변 영역을 암호화하는 PCR-증폭 DNA, 및 합리적인 설계 노력 또는 ePCR에서 유래된 CH1 도메인 변이체 DNA와 함께 Cκ 및 Cλ를 발현하는 효모 균주에 도입하였다. 각각의 DNA 단편은, 분해된 플라스미드 또는 PCR 단편(ADI-26140 중쇄 가변 영역 또는 CH1 단백질 도메인)과의 조립체를 (상동성 재조합을 통해) 안내하는 5’ 및 3’ 말단에서 적절한 DNA 서열을 보유하였다.
개별 라이브러리의 조립은 천연 사카로마이세스 세레비지애 상동성 재조합 공정을 통해 수행하였다. 각 라이브러리에 대한 형질전환된 세포의 희석물을 우라실과 트립토판이 없는 배지에 도말하여 각 라이브러리의 구성원 수를 정량화하였다. 각 라이브러리의 구성원의 수는 107개를 초과하였다. 각각의 (HC 및 이중-LC) 플라스미드의 존재를 선택하기 위해, 형질전환된 세포의 나머지 부분을 우라실과 트립토판이 없는 액체 배지에서 배양하였다.
실시예 3: 경쇄 결합에 영향을 미치는 CH1 도메인 위치의 식별
라이브러리를 전술한 바와 같이 전파시켰다(예를 들어, WO2009036379;WO2010105256; WO2012009568; Xu 등의 문헌[Protein Eng Des Sel. 2013 Oct;26(10):663-70] 참조). 간략하게, IgG를 유도하고 제시한 후, 효모 세포(약 107 내지 108개)를 4℃의 PBSF에서, 1:100으로 희석된 염소 항-인간 F(ab’)2 카파-FITC(Southern Biotech, Birmingham, Alabama, Cat# 2062-02) 및 1:100으로 희석된 염소 항-인간 F(ab’)2 람다-PE(Alabama, Cat# 2072-09)로 15분 동안 염색하였다. 얼음처럼 차가운 세척 완충액으로 2회 세척한 후, 세포 펠릿을 0.4 mL PBSF에 재현탁하고 여과기로 캡핑된 분류관으로 옮겼다. FACS ARIA 분류기(BD Biosciences)를 사용하여 분류를 수행하고, (1) 카파 경쇄의 상응하는 상실로 람다 경쇄를 증가시키거나(도 2a), (2) 람다 경쇄의 상응하는 상실로 카파 경쇄를 증가시키기 위해(도 2b) 분류 게이트를 결정하였다. 3회의 선별 라운드 후, 효모를 우라실과 트립토판이 없는 배지에 도말하여 서열 식별을 위한 단일 단리물을 생성하였다.
고유 서열을 나타내는 개별 클론을 96-웰 플레이트에서 배양하였다. IgG를 유도하고 제시한 후, 약 2x106개의 효모 세포를 4℃의 PBSF에서, 1:100으로 희석된 염소 항-인간 F(ab’)2 카파-FITC(Southern Biotech, Birmingham, Alabama, Cat# 2062-02) 및 1:100으로 희석된 염소 항-인간 F(ab’)2 람다-PE(Alabama, Cat# 2072-09)로 15분 동안 염색하였다. 얼음처럼 차가운 세척 완충액으로 2회 세척한 후, 세포 펠릿을 0.1 mL 세척 완충액에 재현탁하고, 96-웰 플레이트 핸들러가 부착된 BD FACS Canto 기구를 이용해 평가하였다. 개별 고유 클론을 항-카파 중간 형광 강도(MFI) 대 항-람다 MFI의 비율(카파:람다 비율)에 대해 점수를 매긴 다음(도 3), 야생형 CH1 서열(“부모”)을 갖는 일치하는 균주와 비교하여 FOP를 계산하였다.
다음의 CH1 도메인 위치(EU 넘버링)는 경쇄 결합 선호도, 즉 카파 CL 도메인(또는 카파 CL 도메인을 함유하는 경쇄) 또는 람다 CL 도메인(또는 람다 CL 도메인을 함유하는 경쇄)에 대한 우선적 결합에 영향을 미치는 것으로 식별되었다: 118, 119, 124, 126~134, 136, 139~141, 143, 145, 147~154, 163, 168, 170~172, 175~176, 181, 183, 185, 187, 190, 191, 197, 201, 203~206, 208, 210~214, 216, 및 218. 표 3은 카파 경쇄에 대해 우선적인 선택으로부터 식별된 CH1 서열의 목록을 제공한다. 서열 컬럼 내의 굵은 글씨체의 아미노산 잔기는 치환된 위치, 즉 부모(서열번호 1)와 상이한 아미노산 치환을 나타낸다. 표 4는 람다 경쇄에 대해 우선적인 선택으로부터 식별된 CH1 서열의 목록을 제공한다. 서열 컬럼 내의 굵은 글씨체의 아미노산 잔기는 치환된 위치를 나타낸다.
Cκ에 우선적으로 결합하는 CH1 도메인 서열
서열번호 클론 아미노산 치환 서열
4 SAD9611_P01_B08 A118G; K147F GSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVFDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
5 SAD9611_P01_D09 S124H; K147I ASTKGPHVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVIDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
6 SAD9611_P01_H09 S124R; K147L ASTKGPRVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVLDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
7 SAD9611_P01_B09 F126A; S183I ASTKGPSVAPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLISVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
8 SAD9611_P01_E08 P127V; K213E ASTKGPSVFVLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPK
9 SAD9611_P01_H07 L128H; S183W ASTKGPSVFPHAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLWSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
10 SAD9611_P01_F08 L145F; K147I ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCFVIDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
11 SAD9611_P01_D07 L145I; K147T ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCIVTDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYQLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
12 SAD9611_P01_C07 K147L ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVLDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
13 SAD9611_P01_E09 K147S ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVSDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
14 SAD9611_P01_F09 K147L; S181Y ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVLDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYYLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
15 SAD9611_P01_A07 K147M; S181Q ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVMDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYQLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
16 SAD9611_P01_C09 K147V; Q175G ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVVDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLGSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
17 SAD9611_P01_B07 K147E; D148I ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEIYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLGSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
18 SAD9611_P01_G09 F170G; S183F ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTGPAVLQSSGLYSLFSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
19 SAD9611_P01_C08 S183E ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLESVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
20 SAD9611_P01_G08 S183Y; S191I ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLYSVVTVPSISLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
21 SAD9611_P01_G07 V185W ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
22 SAD9613_P02_D10 S124E; K147V ASTKGPEVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVVDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
23 SAD9613_P02_D12 S124L; K147F ASTKGPLVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVFDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
24 SAD9613_P02_B10 S124V; K147Y ASTKGPVVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVYDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
25 SAD9613_P02_A11 F126T ASTKGPSVTPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
26 SAD9613_P02_E12 P127L; S136E ASTKGPSVFLLAPSSKSTEGGTAALSCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
27 SAD9613_P02_F10 A129P; S183E ASTKGPSVFPLPPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLESVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
28 SAD9613_P02_A10 S131A; Q175L ASTKGPSVFPLAPASKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLLSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
29 SAD9613_P02_C12 L145I; S183Y ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCIVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLYSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
30 SAD9613_P02_H10 L145N; S183L ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCNVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLLSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
31 SAD9613_P02_G11 L145T; S183F ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCTVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLFSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
32 SAD9613_P02_D11 K147V ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVVDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
33 SAD9613_P02_E10 K147E; Q175E ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLESSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
34 SAD9613_P02_B12 K147L; Q175G ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVLDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLGSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
35 SAD9613_P02_F11 K147Q; Q175E ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVQDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLESSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
36 SAD9613_P02_G10 K147V; P151A ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVVDYFAEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
37 SAD9613_P02_A12 K147Y; S181G ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVYDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYGLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
38 SAD9613_P02_F12 K147M; D148Q ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVMQYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLGSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
39 SAD9613_P02_G12 K147Y; Q175A ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVYDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLASSGLYSLSSVVTVPYSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
40 SAD9613_P02_B11 K147Y; D148Y ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVYYYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLASSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
41 SAD9613_P02_H11 S183K ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLKSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
42 SAD9613_P02_C10 S183Q ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLQSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
43 SAD9613_P02_E11 S183Q; K210R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLQSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTRVDKKVEPK
44 SAD9610_P01_C03 T139I; F150L ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGIAALGCLVKDYLPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
45 SAD9610_P01_G03 G143V ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALVCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
46 SAD9610_P01_F03 K147E ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
47 SAD9610_P01_H01 K147E; T197A ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQAYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
48 SAD9610_P01_C01 K147E; P206S ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKSSNTKVDKKVEPK
49 SAD9610_P01_A01 K147E; K205Q ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHQPSNTKVDKKVEPK
50 SAD9610_P01_D02 Y149C ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDCFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
51 SAD9610_P01_H03 Y149S ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDSFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
52 SAD9610_P01_B03 Y149C; K218Q ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDCFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPQ
53 SAD9610_P01_H02 Y149H; K214R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDHFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
54 SAD9610_P01_E02 Y149H; F150L ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDHLPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
55 SAD9610_P01_B02 F150L; V154M ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYLPEPMTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
56 SAD9610_P01_A03 F150L; S190P ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYLPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPPSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
57 SAD9610_P01_E03 F150S; D212G ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYSPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVGKKVEPK
58 SAD9610_P01_D01 V154G ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPGTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
59 SAD9610_P01_C02 S183N ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLNSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
60 SAD9610_P01_B01 S183R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLRSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
61 SAD9610_P01_G01 N203S; H204Y ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVSYKPSNTRVDKKVEPK
62 SAD9612_P02_E05 F126L ASTKGPSVLPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
63 SAD9612_P02_C04 F126L; S134G ASTKGPSVLPLAPSSKGTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPK
64 SAD9612_P02_B06 S131A; Y149C ASTKGPSVFPLAPASKSTSGGTAALGCLVKDCFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
65 SAD9612_P02_F05 S132P; G143S ASTKGPSVFPLAPSPKSTSGGTAALSCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
66 SAD9612_P02_D05 K147E; A172V ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPVVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
67 SAD9612_P02_C06 D148G ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKGYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
68 SAD9612_P02_C05 F150L ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYLPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
69 SAD9612_P02_H06 F150L; K213R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYLPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDRKVEPK
70 SAD9612_P02_A06 P151L; N201S ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFLEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICSVNHKPSNTKVDKKVEPK
71 SAD9612_P02_F06 P153S ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPESVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
72 SAD9612_P02_E04 F170L ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTLPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
73 SAD9612_P02_B05 S176P ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQPSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
Cλ에 우선적으로 결합하는 CH1 도메인 서열
서열번호 클론 아미노산 치환 서열
74 SAD9611_P02_F12 S124V; F126V; A141D; T197S; N208I ASTKGPVVVPLAPSSKSTSGGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQSYICNVNHKPSITKVDKKVEPK
75 SAD9611_P02_D12 P127G; A141T ASTKGPSVFGLAPSSKSTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
76 SAD9611_P02_D11 P130H; A141R ASTKGPSVFPLAHSSKSTSGGTARLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
77 SAD9611_P02_C12 S131Q; A141E ASTKGPSVFPLAPQSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
78 SAD9611_P02_H12 S131T; A141R ASTKGPSVFPLAPTSKSTSGGTARLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
79 SAD9611_P02_C10 S131N; A141T; H168F; F170N ASTKGPSVFPLAPNSKSTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVFTNPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
80 SAD9611_P02_A11 K133D; A141E ASTKGPSVFPLAPSSDSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
81 SAD9611_P02_A10 K133T; A141T; K218P ASTKGPSVFPLAPSSTSTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPP
82 SAD9611_P02_B11 S134A; A141K ASTKGPSVFPLAPSSKATSGGTAKLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
83 SAD9611_P02_G12 S134H; A141R ASTKGPSVFPLAPSSKHTSGGTARLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
84 SAD9611_P02_F11 S134I; A141R ASTKGPSVFPLAPSSKITSGGTARLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
85 SAD9611_P02_E10 S134P; A141R ASTKGPSVFPLAPSSKPTSGGTARLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
86 SAD9611_P02_A12 S134V; A141T ASTKGPSVFPLAPSSKVTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
87 SAD9611_P02_B10 S134V; A141T ASTKGPSVFPLAPSSKVTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
88 SAD9611_P02_C11 A141E ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
89 SAD9611_P02_H10 A141R; V185M ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTARLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSMVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
90 SAD9611_P02_B12 A141T; T187R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVRVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
91 SAD9611_P02_G10 A141R; V185L; T187D ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTARLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSLVDVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
92 SAD9611_P02_E11 A141T; V185S; T187E ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSSVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
93 SAD9611_P02_D10 A141V; V185S; T187Y ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAVLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSSVYVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
94 SAD9613_P01_F07 S119R; A141K ARTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAKLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
95 SAD9613_P01_B07 P130S; A141T; V185T; T187S ASTKGPSVFPLASSSKSTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSTVSVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
96 SAD9613_P01_A09 S131N; A141D ASTKGPSVFPLAPNSKSTSGGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
97 SAD9613_P01_G08 S131R; A141M ASTKGPSVFPLAPRSKSTSGGTAMLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
98 SAD9613_P01_G07 S131T; A141E ASTKGPSVFPLAPTSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
99 SAD9613_P01_B09 S131D; K133L; S134N ASTKGPSVFPLAPDSLNTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
100 SAD9613_P01_E07 S131D; A141R; Q175D; S181V ASTKGPSVFPLAPDSKSTSGGTARLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLDSSGLYVLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
101 SAD9613_P01_A08 K133E; A141R ASTKGPSVFPLAPSSESTSGGTARLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
102 SAD9613_P01_H09 K133P; T139A; A141K ASTKGPSVFPLAPSSPSTSGGAAKLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
103 SAD9613_P01_D07 S134L; A141E ASTKGPSVFPLAPSSKLTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
104 SAD9613_P01_A07 S134N; A141T ASTKGPSVFPLAPSSKNTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
105 SAD9613_P01_H08 S134P; A141K ASTKGPSVFPLAPSSKPTSGGTAKLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
106 SAD9613_P01_F08 S134V; A141E ASTKGPSVFPLAPSSKVTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
107 SAD9613_P01_D08 A141K ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAKLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
108 SAD9613_P01_E09 A141K; V185T; T187E ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAKLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSTVEVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
109 SAD9613_P01_C09 H168V; F170T; P171N ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVVTTNAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
110 SAD9613_P01_H07 S183L ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLLSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
111 SAD9610_P02_F04 A140V ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTVALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
112 SAD9610_P02_B04 A141T ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
113 SAD9610_P02_G06 A141T; N203D ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVDHKPSNTKVDKKVEPK
114 SAD9610_P02_G04 A141T; V211A ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKADKKVEPK
115 SAD9610_P02_C06 A141T; E216G ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVGPK
116 SAD9610_P02_G05 A141T; L163M ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAMTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
117 SAD9610_P02_C04 A141V; D212N ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAVLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVNKKVEPK
118 SAD9610_P02_E05 S181T ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYTLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
119 SAD9612_P01_A01 A140P; A141T ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTPTLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
120 SAD9612_P01_G01 A140V; E216G ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTVALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVGPK
121 SAD9612_P01_H02 A141T; K213E ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPK
122 SAD9612_P01_D03 A141T; K214R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPK
123 SAD9612_P01_E01 A141T; E152G ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTATLGCLVKDYFPGPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
124 SAD9612_P01_H03 A141V; E152G ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAVLGCLVKDYFPGPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
125 SAD9612_P01_F02 E152G ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPGPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
126 SAD9612_P01_A02 S183V; V185T ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLVSTVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
127 SAD9612_P01_C01 K210T ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTTVDKKVEPK
128 SAD10791_P01_F07 A140Y; A141D ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTYDLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
129 SAD10791_P01_C07 A140K; A141D ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTKDLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSDVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
130 SAD10791_P01_A07 A140S; A141D ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTSDLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFSAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
131 SAD10791_P02_G08 A140W; A141D ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTWDLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
132 SAD10791_P02_D08 A140R; A141D; K218N; S219Δ ASTKGPSVFPLAPSSKTSGGTRDLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPN
133 SAD10791_P02_F07 A140L; A141D ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTLDLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
134 A140I; A141D ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTIDLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
135 A140V; A141D ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTVDLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
Δ는 아미노산 결실을 나타낸다.
CH1:경쇄 계면보다는 VH:CH1 계면에 위치한 일부 CH1 아미노산 치환이 3쇄 시스템에서 카파 결합 선호도를 증가시킨다는 것을 예기치 않게 발견하였다. 특히, 돌연변이 세트 K147V+P151A 및 P151L+N201S(서열번호 36 및 70, 표 3)는 각각 18.1 및 10.4의 카파 FOP 값을 반환하였다. 위치 CH1:147은 CH1:LC 계면에 있지만, CH1:201은 그렇지 않으며(완전한 용매-노출되고 임의의 인터도메인 계면의 일부가 아님); 따라서, 이들 고 FOP 클론 모두에서 P151 치환이 나타난 것은, 람다 선호도 대비 카파 선호도를 결정하는 데 있어서 이러한 위치에 대한 잠재적 역할을 시사한다. 이론에 구속되고자 함이 없이, 이러한 원위 돌연변이는 후술하는 이유로 HC:LC 페어링에 영향을 미치는 것으로 여겨지므로, 람다 페어링에 비해 우선적인 카파 페어링을 위해 VH:CH1 계면에서 돌연변이를 이용하는 것이 가능할 수 있다.
먼저, P151은 VH 도메인과 CH1 도메인 사이의 소위 “볼-앤드-소켓 조인트”의 일부이다(Lesk A. M. 등의 문헌[Nature. 1988 Sep 8;335(6186):188-90]; Landolfi N. F. 등의 문헌[J Immunol. 2001 Feb 1;166(3):1748-54]). 이러한 조인트는 항체 가변 도메인과 불변 도메인 사이에서 “팔꿈치 각도”에 미치는 영향을 통해 도메인 내 유연성을 조절하는 것으로 가정되어 왔다(Stanfield R. L. 등의 문헌[J Mol Biol. 2006 Apr 14;357(5):1566-74]). 볼-앤드-소켓 조인트에서의 치환은, 이 영역에서의 단일 아미노산 치환으로 인해 중화 활성이 감소된 항-IFN-감마 단클론 항체의 경우에서와 같이, 기능적 결과를 가질 수 있다(Landolfi N. F. 등의 [J Immunol. 2001 Feb 1;166(3):1748-54]). 이러한 효과는, 항원 결합 계면에서의 직접적인 변화에 의한 것이 아니라, 변경된 유연성 및 알로스테릭 메커니즘에 기인한 것이다. 둘째, 람다 불변 도메인을 갖는 Fab는 카파 도메인을 갖는 Fab에 비해 더 큰 범위의 팔꿈치 각도를 갖는 것으로도 알려져 있다(Stanfield R. L. 등의 문헌[J Mol Biol. 2006 Apr 14;357(5):1566-74. doi: 10.1016/j.jmb.2006.01.023. Epub 2006 Jan 25]). 이러한 초유연성은 VL 도메인과 CL 도메인 사이의 소위 스위치 영역에서의 단일 잔기 삽입에 기인하였다. 셋째, Fab 결정 구조(Adimab 미공개 데이터)의 추가 분석을 통해, 카파와 람다 Fab 사이에서, 볼-앤드-소켓 조인트의 영역에서 원자 충진의 차이를 알 수 있다. 따라서, 카파 및 람다 경쇄를 갖는 Fab들 간의 고유한 차이와 더불어, 볼-앤드-소켓 조인트에 의해 Fab 유연성을 조절하는 것은 VH:CH1 계면에서의 돌연변이를 통해 카파 대 람다 차등 선호도를 유도하기 위한 신규한 메커니즘을 시사한다.
실시예 4: 카파 경쇄와 우선적으로 페어링되거나 람다 경쇄와 우선적으로 페어링되는 CH1 도메인 변이체의 식별 및 특성 분석
Cκ 및 Cλ 선호도 증가에 대한 선택으로부터 유래된 클론을, 카파와 람다 사이의 MFI 비율에 기초하여 추가로 특성화하기 위해 선택하였다(도 4 참조). 20개 아미노산(NNK)의 각각에 대해 각각의 관심 위치(141, 147, 또는 183)에서 단독 돌연변이된 DNA 풀을 단리하고 증폭시켰다. 적절한 경쇄 염기 균주를 사용하여, 전술한 방식으로 이들 단일 위치 표적화 라이브러리를 작제하였다. CH1 도메인의 위치 141, 147, 183, 또는 147 + 183 각각에 변이가 존재하는 상태로 4개의 라이브러리를 작제하였다. 카파-선호도 또는 람다-선호도에 대한 선택은 전술한 바와 같이 수행하였다. 전술한 바와 같이 출력을 시퀀싱하고, 적절한 부모에 대한 카파 또는 람다 선호드의 FACS 기반 정량화를 수행하여 경쇄 카파- 또는 람다-우선적 페어링을 제공한 아미노산 치환을 결정하였다.
위치 141, 147, 및 183 각각에서 아미노산 잔기 치환을 갖는 여러 CH1 도메인 변이체를 카파 CL 도메인(또는 카파 CL 도메인을 함유하는 경쇄) 또는 람다 CL 도메인(또는 람다 CL 도메인을 함유하는 경쇄)에 대한 페어링 선호도를 갖는 것으로서 식별하였다. CH1 도메인 위치 141에서 (야생형 A와 비교하여) D, R, 또는 Q와의 치환은 람다 CL 도메인(또는 람다 CL 도메인을 함유하는 경쇄)과의 우선적 페어링을 증가시킨다(즉, 카파:람다 MFI 비율이 감소함)(도 5 참조). CH1 도메인 위치 147에서 (야생형 K와 비교하여) F, I, T, Y, L, R, N, E, H, M, 또는 Q와의 치환은 카파 CL 도메인(또는 카파 CL 도메인을 포함하는 경쇄)과의 우선적 페어링을 증가시킨다(즉, 카파:람다 MFI 비율이 증가함)(도 5 참조). CH1 도메인 위치 183에서 (야생형 S와 비교하여) R, K, Y, W, E, F, 또는 Q와의 치환은 카파 CL 도메인(또는 카파 CL 도메인을 포함하는 경쇄)과의 우선적 페어링을 증가시킨다(즉, 카파:람다 MFI 비율이 증가함)(도 5 참조). 표 5는 페어링 선호도를 유도하는 특이적 아미노산 치환을 갖는 것으로 관찰된 CH1 도메인 변이체의 수를 보여준다.
CH1 도메인 변이체에서 관찰된 경쇄 선호도를 갖는 아미노산 치환
아미노산 치환 관찰된 계수 경쇄 선호도
A141D 35 람다
A141R 7 람다
A141Q 5 람다
K147F 24 카파
K147I 5 카파
K147T 3 카파
K147Y 3 카파
K147L 2 카파
K147R 2 카파
K147N 2 카파
K147E 1 카파
K147H 1 카파
K147M 1 카파
K147Q 1 카파
S183R 19 카파
S183K 11 카파
S183Y 5 카파
S183W 3 카파
S183E 2 카파
S183F 1 카파
S183Q 1 카파
다음으로, IgG-유사 포맷(2개의 Fab 영역이 N-말단 방향으로 이량체 Fc 분자에 부착됨)인 대조군 표준 이중특이적 항체(2개의 중쇄 x 2개의 경쇄)에 식별된 CH1 도메인 변이체가 미치는 영향을 평가하였다. 2개의 승인된 임상 치료 항체인, 우스테키누맙(ustekinumab) 및 파니투무맙(panitumumba)으로부터 유래된 VH-CH1 서열을 사용하였다. 중쇄의 원하는 이종이량체 페어링을 촉진하기 위해 ‘노브’(S354C; T366W) 및 ‘홀’(Y349C; T366S; L368A; Y407V) 돌연변이를 도입하였다. 표준 프로토콜을 통해 HEK293 세포에 형질감염하기 전에 생어(Sanger) 시퀀싱을 통해 DNA 플라스미드를 확인하였다.
형질감염된 HEK 세포를 CD optiCHO 배지(Invitrogen)에서 배양하고, 형질감염 후 6일차에 상청액을 수집하고, 단백질 A-기반 친화도 정제를 수행하였다. 정제된 IgG를 GingisKHAN®(Genovis AB)로 처리하여 Fc 부분으로부터 Fab 영역을 효소적으로 절단하였다.
정제된 Fab에 대해 LCMS를 수행하여 각각의 IgG 성분(2 중쇄 x 2 경쇄)의 서열을 확인하고, 각각의 성분의 상대 백분율을 결정하였다(도 7 참조). 간략하게, 정제된 IgG를 GingisKHAN으로 분해하여 Fc 부분으로부터 Fab 영역을 효소적으로 절단하였다. 65℃를 유지하는 Applied Biosystems POROS® R2 10 μm 컬럼(2.1 x 30 mm, 0.1 mL)이 구비된 Agilent 1100 시리즈 HPLC 상에 Fab 샘플을 주입하였다. 주입 후, 2 mL/분의 유속으로 0.21분간 2~95% 아세토니트릴의 구배(이동상 A: H2O 중 0.1% 포름산; 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산)를 사용하여 컬럼으로부터 샘플을 용리시켰다. 전환 밸브를 사용하여, 150 μL/분의 속도로 총 유량을 Bruker maXis 4G 질량 분광계에 로딩하였다. 질량 분광계를 700 내지 2500 m/z 범위로 양의 이온 모드에서 실행시켰다. 나머지 소스 파라미터는 다음과 같이 설정하였다: 모세관은 5500 V, 분무기는 4.0 Bar, 건조 가스는 4.0 L/분, 건조 온도는 200℃로 설정하였다. 획득한 MS 스펙트럼은 Bruker Compass Data Analysis 버전 4.1을 사용하여 분석하였다. 온전한 Fab 종의 검출은 이론적 서열과 비교해 질량 측정에 기초하여 확인하였다. 각 종에 대한 상대 정량화는 모든 피크 강도의 합과 비교해 각 종의 피크 강도에 기초하여 계산하였다.
두 중쇄 모두가 야생형인 경우, 부정확한 페어링이 약 30%의 시간 동안 발생하지만; 중쇄가 본원에 기술된 바와 같은 CH1 변이체 도메인을 포함하는 경우, 중쇄 및 경쇄의 정확한 페어링은 상당히 개선된다(도 7 및 표 6참조). Pani 경쇄는 야생형이다. Uste 경쇄는 람다 융합체이다. HC1은 pani이고; LC1은 pani 카파이고; HC2는 uste이고; LC2는 uste 람다이다. 예를 들어, 제1 중쇄(HC1)가 K147F 및 S183R/K/Y를 함유하고 제2 중쇄가 A141D(각각 BsAbs 10, 12, 및 14)를 함유하는 경우, 미스페어링은 적어도 절반만큼 완화되며, 6.8, 10.5, 또는 11%의 시간 동안만 발생한다. 실제로, 위치 141에서의 단일 치환(141D)은 미스페어링을 50% 감소시킨다(즉, 6.1% 대 3.1% HC1-LC2 및 22.8% 대 9.9% HC2-LC1(BsAb2)). 이에 기초하여, 본 출원인은 표 7에서 카파 또는 람다 경쇄/CL 도메인 선호도를 갖는 예시적인 CH1 도메인 서열을 제공한다.
중쇄-경쇄 생성물 형성 백분율
HC1 HC2 HC1-LC1 HC1-LC2 HC2-LC1 HC2-LC2
BsAb1 Pani 야생형 X Uste 야생형 35.3% 6.1% 22.8% 35.8%
BsAb2 Pani 야생형 X Uste A141D 47.9% 3.1% 9.9% 39.0%
BsAb3 Pani S183R X Uste 야생형 48.5% 1.5% 17.5% 32.5%
BsAb4 Pani S183R X Uste A141D 53.0% 0.0% 12.9% 34.0%
BsAb5 Pani S183K X Uste 야생형 39.1% 1.5% 23.9% 35.6%
BsAb6 Pani S183K X Uste A141D 48.5% 0.0% 9.9% 41.6%
BsAb7 Pani S183Y X Uste 야생형 42.5% 4.5% 21.0% 32.0%
BsAb8 Pani S183Y X Uste A141D 45.1% 3.5% 9.9% 41.5%
BsAb9 Pani K147F S183R X Uste 야생형 47.7% 0.0% 15.4% 36.9%
BsAb10 Pani K147F S183R X Uste A141D 50.1% 0.0% 6.8% 43.1%
BsAb11 Pani K147F S183K X Uste 야생형 39.7% 0.0% 18.4% 41.9%
BsAb12 Pani K147F S183K X Uste A141D 49.7% 0.0% 10.5% 39.8%
BsAb13 Pani K147F S183Y X Uste 야생형 45.0% 0.0% 20.4% 34.6%
BsAb14 Pani K147F S183Y X Uste A141D 46.2% 0.0% 11.0% 42.8%
카파 또는 람다 사슬 선호도를 갖는 CH1 도메인
서열번호 아미노산 치환 서열 CL 도메인 선호도
60 S183R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLRSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK 카파
41 S183K ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLKSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK 카파
136 S183Y ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLYSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK 카파
137 K147F; S183R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVFDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLRSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK 카파
138 K147F; S183K ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVFDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLKSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK 카파
139 K147F S183Y ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVFDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLYSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK 카파
140 A141D ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK 람다
정제된 항체의 발현 및 품질은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 평가하였다. 간략하게, Agilent 1 100 HPLC를 사용해 컬럼 크로마토그래피(TSKgel Super SW3000 컬럼)를 모니터링하였다. 항체-컬럼 상호작용의 가능성을 최소화하기 위해 고도로 당화되고 응집된 IgG로 컬럼을 전처리하고, 사용 전에 세척 완충액(200 mM 인산나트륨, 250 mM 염화나트륨 pH 6.8)으로 평형화하였다. 대략 2 내지 5 μg의 단백질 샘플을 컬럼 상에 주입하고, 유속을 0.400 mL/분으로 조정하였다. 280 nm 파장에서 단백질 이동을 모니터링하였다. 총 검정 시간은 약 11분이었다. ChemStation 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. SEC 프로파일을 통해, CH1 도메인 치환이 야생형과 비교해 변이체 프로파일에 영향을 미치지 않았음을 확인하였다(데이터 미도시).
인간 IL-12B(Uste) 및 인간 EGFR(Pani)에 대한 정제된 이중특이적 항체의 결합에 대한 결합 친화도 및 동역학을 측정하여 CH1 변이체 도메인이 표적 결합에 영향을 미치지 않았음을 확인하였다(도 6a~6e 참조). 100 nM의 항원이 포함된 Octet® QKe 기기(ForteBio)를 사용하여, 이중특이적 IgG 샘플을 항-hIgG Fc 센서 팁 상에서 포획하고, IL12B 또는 EGFR에 대한 결합 동역학을 측정하였다(결합 속도: 180초 및 해리 속도: 180초). BLI 분석은 검정 완충액으로서 1× 동역학 완충액(ForteBio)을 사용해 29℃에서 수행하였다. 먼저 항-인간 IgG Fc 포획(AHC) 바이오센서(ForteBio)를 분석 완충액에 5분 이상 미리 침지하였다. 이중특이적 IgG 샘플(5 μg/mL)을 300초 동안 센서 상에서 포획하였다. 그런 다음, 센서를 검정 완충액에 120초 동안 디핑하여 베이스라인을 확립한 후, IL12B 또는 EGFR 단백질(100 nM 농도)에 대한 결합을 측정하였다. IL12B 또는 EGFR의 해리는 180초 동안 센서를 분석 완충액 내로 옮겨서 측정하였다. 모든 단계에서 교반은 1000 rpm이었다. 기준 차감, 해리 기반 단계 간 보정, 1 대 1 결합 모델, 및 전반적 적합도(Rmax는 센서에 연결되지 않음)를 사용해 Octet® Data Analysis Software 버전 8.2.0.7로 동역학 파라미터를 생성하였다. 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd), 및 평형 상수(KD) 값을 각각의 측정에 대해 개별적으로 할당하였다.
실시예 5: 141x181x218 라이브러리 빌드 및 선택
람다 CL 도메인과의 우선적 페어링을 제공하는 추가 CH1 아미노산 치환을 또한 식별하였다. 구조 분석뿐만 아니라 이전의 선택 데이터에 기초하여, 추가의 변화를 위해 3개의 CH1 위치(141, 181, 및 218) 세트를 선택하였다. 위치 141에서의 아미노산 다양성은 6개의 자연 발생 아미노산(D, T, A, E, K, 및 N)을 나타내는 퇴화 코돈 RMW를 통해 생성하였다. 위치 181 및 218에서의 아미노산 다양성은 20개의 자연 발생 아미노산 모두를 나타내는 퇴화 코돈 NNK를 통해 생성하였다. 라이브러리 설계에는 이들 3개의 위치에서 2,400의 다양성을 갖는 아미노산의 모든 가능한 조합을 포함시켰다. GAL10 프로모터(GAL1::ADI-26140 VL-Ck x GAL10::ADI-26140 VL - Cl)의 하에 람다 경쇄가 포함된 경쇄 계통을 사용하여, 이러한 라이브러리를 전술한 것과 같은 방식으로 작제하였다. 전술한 바와 같이, 항-인간 카파-FITC 및 항-인간 람다-PE 항체로 염색하여 람다 선호도에 대하 선택을 수행한 다음, 여러 번에 걸쳐 세포 분류를 수행하였다. 출력(96개의 클론)을 전술한 바와 같이 시퀀싱하고, 부모 계통 대비 람다-선호도의 정량화를 FACS-기반으로 수행하였다. 야생형(“WT”) 및 이전에 식별된 리드 클론 A141D를 분석에 포함시켰다. 이들 데이터에 기초하여, 부모 및 A141D에 비해 경쇄 람다 우선적 페어링을 가장 크게 개선한 아미노산 조합을 식별하였다.
도 8은, FOP 값에 의해 결정했을 때 대부분의 출력 클론이 람다 사슬과 페어링됨에 있어서 더 높은 선호도를 갖는다는 것을 보여준다. 표 8은 도 8에 표시된 상위 13개 클론을 대상으로 한 CH1 도메인 치환 및 람다:카파 MFI 비율의 FOP 값을 제공한다.
출력 클론에서 상위 13개 FOP 값
위치 141, 181, 및 218에서의 아미노산 잔기 FOP
EIL 7.34
KKE 6.84
EKP 6.44
KLD 5.76
KKP 5.54
KKA 5.49
KKE 5.25
KKP 5.03
KKH 4.99
EKD 4.98
KKP 4.96
분석 결과, 위치 141에서 D, K, 또는 E로의 치환은 위치 181에서 K로의 치환과 페어링되고, 위치 218에서 L, E, D, P, A, H, S, Q, N, T, I, M, G, C, 또는 W로의 치환이 출력 클론들 사이에서 빈번하게 이루어지고 A141D에 비해 람다 경쇄 선호도를 증가시키는 것으로 나타났다(람다:카파 MFI 비율의 증가). 도 9는 CH1의 위치 141에서 D, 위치 181에서 K, 및 위치 218에서 다양한 아미노산을 갖는 클론에서 측정된 개별 및 평균 FOP 값을 보여준다. 리드 CH1 서열을 LC 염색으로 다시 클로닝하고(이 공정은 후속하여 모든 검정에 사용됨), FOP 값을 3회 계산하여 클론 및 람다 선호도를 확인하였다(도 10).
추가 분석을 통해 포유류 IgG 생산을 위한 9개의 고유한 후보 CH1 서열을 생성하였다(표 9 참조).
카파 또는 람다 사슬 선호도를 갖는 CH1 도메인
서열번호 아미노산 치환 서열 본원에서의 명칭:
141 A141D; S181K ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYKLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK “DKK”; “DxKxWT”; 또는 “D_K_WT”
142 A141D; S181K; K218A ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYKLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPA “DKA”; “DxKxA”또는 “D_K_A”
143 A141D; S181K; K218P ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYKLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPP “DKP”; “DxKxP”; 또는 “D_K_P”
144 A141E ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK “ESK”; “ExWTxWT”또는 “E_WT_WT”
145 A141E; S181K ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYKLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK “EKK”; “ExKxWT”또는 “E_K_WT”
146 A141K ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAKLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK “KSK”; “KxWTxWT”또는 “K_WT_WT”
147 A141K; S181K; ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAKLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYKLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK “KKK”; “KxKxWT”또는 “K_K_WT”
148 A141K; S181K; K218E ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAKLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYKLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPE “KKE”; “KxKxE”또는 “K_K_E”
149 A141K; S181K; K218P ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAKLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYKLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPP “KKP”; “KxKxP”또는 “K_K_P”
WT(즉, “ASK”) 및 A141D(즉, “DSK”)와 함께 9개의 후보 CH1 서열을 표준 방법을 통해 포유류 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 람다 선호도를 결정하기 위해, 원하는 중쇄, 람다 경쇄, 및 카파 경쇄를 나타내는 플라스미드를 2:1:1 플라스미드 비율로 HEK293 세포 내로 형질감염시켰다. 형질감염된 HEK 세포를 배양하고, 이전에 기술된 프로토콜을 사용하여 IgG를 정제하였다. 이론에 구속되고자 함이 없이, 대략 동등한 양의 총 중쇄 및 총 경쇄 폴리펩티드를 발현함으로써 (여기서 HC:카파 LC:람다 LC = “2:1:1”은 총 HC:총 LC = 1:1을 생성함)(즉, 과량의 HC가 없고 과량의 LC가 없음) 본 발명자들은 다양한 편향을 피하고, CH1 도메인 변이체의 진정한 카파 또는 람다 선호도를 가시화할 수 있었던 것으로 여겨진다.
포유류 생산 IgG에 대해 람다-선호도의 FACS-기반 정량화를 수행하였다. 도 11은 FACS 플롯을 제공하고, 도 12 및 표 10은 9개의 CH1 변이체, 및 WT와 A141D(즉, “DSK”)에 대한 FOP 값(람다:카파 MFI)을 제공한다. 도 13은, CH1이 위치 141에서 D를 가질 때, 위치 181 또는 위치 181과 218에서의 추가 치환이 람다 선호도를 추가로 개선한다는 것을 보여준다(람다:카파 MFI 비율에 기초함) .
9개의 CH1 변이체에 대한 FOP 값
CH1 치환 (141, 181, 및 218 위치) FOP
D_K_P 4.33
D_K_A 3.83
D_K_WT 3.57
K_WT_WT 2.24
E_WT_WT 2.04
K_K_WT 1.82
E_K_WT 1.70
D_WT_WT 1.61
K_K_P 1.24
K_K_E 1.18
WT_WT_WT 1.00
또한, 감소된 전장 IgG의 LCMS 데이터를 사용해 정제된 IgG 샘플에서 람다 경쇄 및 카파 경쇄의 상대량을 결정하였다. 도 14는 카파 경쇄(LC)와 페어링된 종 백분율(%) 및 람다 경쇄와 페어링된 종 백분율(%)을 비교한 것이다.
이들 데이터를 분석하여 부모, 및 이전에 식별된 리드 A141D에 비해 람다 선호도가 개선된 3개의 CH1 서열(각각 DKP, DKA, 및 DKK 치환을 갖는 서열번호 143, 142, 및 141)을 생성하였다.
이들 CH1 서열이 카파 경쇄와 페어링되는지 여부를 결정하기 위해, 후보 CH1 중쇄 플라스미드를 1) 카파 경쇄 또는 2) 람다 경쇄로 HE293 세포 내로 형질감염시켰다. 카파 선호도를 갖는 CH1로서의 K147F S183R, 야생형, A141D도 대조군으로서 포함시켰다. 형질감염된 HEK 세포를 배양하고 표준 방법을 통해 정제하였다. 이전에 기술된 방법을 사용하여 정제된 IgG로부터 연결된 중쇄 및 경쇄 Fab를 생성하였다. 공정 수율은 표준 방법을 사용해 결정하고, WT 공정 수율에 대해 정규화하여 “FOP” 공정 수율을 계산하였다. 공정 수율에 기초하면, 카파 LC만이 존재할 때(람다 LC는 없음) FOP, A141D, A141D S181K, A141D S181K K218A, 및 A141D S181K K218P 모두가 카파 LC에 여전히 결합되어 있지만, 카파 LC보다는 람다 LC가 존재할 때 더 많은 결합이 발생하였다(도 15). BioRad CFX96 RT PCR을 사용하여 시차주사 형광분석법에 의해 카파- 및 람다-Fab의 Fab Tm을 측정하였다(도 16). 각각의 CH1 변이체에 대해, [람다-페어링된 야생형 Fab 대비 람다-페어링된 변이체 Fab의 Tm 변화(“Δ람다 Tm”)] - [카파-페어링된 야생형 Fab 대비 카파-페어링된 변이체 Fab의 Tm 변화(“Δ카파 Tm”)]로서 정의했을 때, 람다 페어링된 Fab의 상대 Tm 이득(“상대 람다 Tm 이득” 또는 “순 람다 Tm 이득”)을 계산하였다(FIG. 17). 도 17에 도시된 바와 같이, 상대 람다 Tm 이득은 S181 또는 S181과 K218에서의 추가 치환(들)과 함께 증가하였다. 이론에 구속되고자 함이 없이, 도 16 및 도 17에 기초하면, 카파 LC 페어링의 탈안정화는 상대 람다 Tm 이득 및 람다 CL과의 페어링 증가에 기인한 것으로 보인다.
실시예 6: 141xALL 라이브러리 빌드 및 선택
위치 141에서의 치환과 페어링될 때 람다 우선 결합을 유도하기 위해, CH1 내의 추가 잔기를 샘플링하기 위한 추가 라이브러리를 작제하였다. CH1의 3개의 영역(DOR1, DOR2, 및 DOR3)에 걸쳐 최대 3개의 치환을 갖도록 6개의 새로운 라이브러리(LAD11522-LAD11527)를 설계하였다(표 11). 6개의 라이브러리는 함께, 위치 141과 페어링된 3개의 관심 도메인 내에서 2개의 치환을 포함하는 모든 가능한 치환 세트를 나타낸다. 모든 라이브러리에서, 위치 141에서의 아미노산 다양성을 퇴화 코돈 RMW를 통해 생성하고, 다른 2개의 변이체 위치에서의 아미노산 다양성을 퇴화 코돈 NNK를 통해 생성하였다. 라이브러리는 전술한 방법을 사용하여 작제하였다. 람다-선호도에 대한 선택은 전술한 바와 같이 수행하였다.
Figure pct00001
FACS 선택의 두 번째 라운드 후에 시작하여, 선택 출력 CH1 다양성을 단리하고, 적절한 2쇄 경쇄 계통 내로 재-클로닝하여, 감소된 카파 경쇄 발현을 라이브러리에서 복구하였다. CH1 다양성은 적절한 프라이머를 사용하는 PCR 증폭 및 표준 DNA 정제를 사용하여 단리하였다. 그런 다음, 이러한 DNA 단편 풀을 ADI-26140 중쇄 가변 영역으로 전기천공하고, 플라스미드를 적절한 2쇄 경쇄 계통으로 분해하였다.
출력을 전술한 바와 같이 시퀀싱하고(도 18), 부모 계통 대비 람다-선호도의 정량화를 FACS-기반으로 수행하였다. 이전에 식별된 리드 클론 A141D S181K K218P를 분석에 포함시켰다. 이들 데이터에 기초하여, 부모에 비해 경쇄 람다 우선적 페어링을 가장 크게 개선한 아미노산 조합을 결정하였다.
28개의 고유 CH1 서열을 함유하는 상위 46개의 클론(표 12)을 효모에서 IgG로서 발현시켰다. WT, A141D(또는 “DSK”) 및 실시예 5에서의 141x181x218 시리즈 유래의 리드 중 일부(DKP, DKA, KKE, KKP, 및 EKK)와 함께 새로운 CH1 서열들을 결정된 FOP 값에 대해 유세포 계측법에 의해 비교하였다(람다 MFI:카파 MFI)(도 19). 도 19에서 화살표로 표시된 데이터 포인트에 상응하는 서열번호 155, 157, 159, 162, 163, 164, 또는 165의 CH1 서열을 갖는 적어도 7개는 시험된 141x181x218 리드의 값과 동등하거나 그보다 높은 FOP 값을 나타냈다.
람다 선호도를 갖는 141xALL 시리즈에서 28개의 고유한 CH1 서열
서열번호 아미노산 치환 CH1 서열
150 P127G; G138R; A141T; F170G; S176R; S181L ASTKGPSVFGLAPSSKSTSGRTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTGPAVLQRSGLYLLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
151 S131R; A141E; S181K ASTKGPSVFPLAPRSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYKLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
152 S134R; A141E; P171D; S181V; V185R ASTKGPSVFPLAPSSKRTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFDAVLQSSGLYVLSSRVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
153 A141D; H168I; F170G; T187R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVITGPAVLQSSGLYSLSSVVRVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
154 A141E; F170E; S181L; T187R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTEPAVLQSSGLYLLSSVVRVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
155 A141E; F170E; S181V; T187R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTEPAVLQSSGLYVLSSVVRVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
156 A141E; P171D; V185R; K218F ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFDAVLQSSGLYSLSSRVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPF
157 A141E; P171D; V185R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFDAVLQSSGLYSLSSRVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
158 A141E; P171E; S181A ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFEAVLQSSGLYALSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
159 A141E; P171E; V185R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFEAVLQSSGLYSLSSRVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
160 A141E; P171E; S181T; V185R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFEAVLQSSGLYTLSSRVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
161 A141E; P171E; S181V ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFEAVLQSSGLYVLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
162 A141E; P171G; V185R; T187R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFGAVLQSSGLYSLSSRVRVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
163 A141E; V185R; T187R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSRVRVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
164 A141E; P171S; S181K ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFSAVLQSSGLYKLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
165 A141E; F170G; Q175M; S181V; S184R; T187R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTGPAVLMSSGLYVLSRVVRVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
166 A141E; F170R; V173H; S181V ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTRPAHLQSSGLYVLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
167 A141E; F170S; P171A; S181V ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTSAAVLQSSGLYVLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
168 A141E; L142M; F170S; P171A; S181V ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAEMGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTSAAVLQSSGLYVLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
169 A141K; S181K; V185E ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAKLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYKLSSEVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
170 A141K; S181K; K218D ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAKLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYKLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPD
171 A141T; F170V; P171A; S181V ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTATLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTVAAVLQSSGLYVLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
172 G137R; A141E; P171E; S181V ASTKGPSVFPLAPSSKSTSRGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFEAVLQSSGLYVLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
173 F126R; S131V; T139V; A141E; K218E ASTKGPSVRPLAPVSKSTSGGVAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPE
174 F126V; S131V; S136P; A141D ASTKGPSVVPLAPVSKSTPGGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
175 F126V; S131V; S136P; G137R; A141D ASTKGPSVVPLAPVSKSTPRGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
176 F126V; S131V; A141D; K218S ASTKGPSVVPLAPVSKSTSGGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPSS
177 F126V; S131V; K133S; A141K; K218A ASTKGPSVVPLAPVSSSTSGGTAKLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPA
실시예 7: 141x(170/171)x(185/187) 시리즈의 작제 및 스크리닝
실시예 6에서의 결과 분석은 F170, P171, V185, 및 T187을 포함하여 4개의 새로운 관심 위치/잔기를 생성하였다. 이전 연구에서 높은 FOP 값을 생성한 141과 함께, 위치 170, 171, 185, 및 187에서 빈번하게 관찰된 아미노산에 기초하여(예를 들어, E와 D는 위치 141에서 빈번하고; E는141xALL 출력에서의 위치 170 또는 171에서 빈번하고; 위치 141이 위치 171로 독립적으로 치환될 때, R이 위치 185 및/또는 187에서 빈번함), CH1 도메인 당 최대 3개의 아미노산 치환을 갖는 14개의 고유한 CH1 도메인 변이체(표 13)를 리드 람다-우선 치환 세트에 대한 후보로서 합리적으로 설계하였다. 표 13의 14개의 리드는 “A141E; V185R; T187R” (서열번호 163) 및 “A141E; P171E; V185R (서열번호 159)”을 포함하며, 이들은 실시예 6에서 시험하였다.
141x(170/171)x(185x187) 시리즈에서 새로운 CH1 서열
서열번호 아미노산 치환 본원에서의 명칭: CH1 서열
178 A141E; V185R A141E_V185R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSRVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
179 A141E; T187R A141E_T187R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVRVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
163 A141E; V185R; T187R A141E_V185R_T187R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSRVRVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
180 A141E; F170E; V185R A141E_F170E_V185R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTEPAVLQSSGLYSLSSRVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
181 A141E; F170E; T187R A141E_F170E_T187R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTEPAVLQSSGLYSLSSVVRVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
182 A141D; V185R A141D_V185R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSRVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
183 A141D; T187R A141D_T187R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVRVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
184 A141D; V185R; T187R A141D_V185R_T187R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSRVRVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
185 A141D; F170E; V185R A141D_F170E_V185R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTEPAVLQSSGLYSLSSRVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
186 A141D; F170E; T187R A141D_F170E_T187R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTEPAVLQSSGLYSLSSVVRVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
159 A141E; P171E; V185R A141E_P171E_V185R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFEAVLQSSGLYSLSSRVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
187 A141E; P171E; T187R A141E_P171E_T187R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAELGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFEAVLQSSGLYSLSSVVRVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
188 A141D; P171E; V185R A141D_P171E_V185R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFEAVLQSSGLYSLSSRVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
189 A141D; P171E; T187R A141D_P171E_T187R ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTADLGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFEAVLQSSGLYSLSSVVRVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
전술한 바와 같이, 14개의 CH1 도메인 변이체 서열 중 하나를 함유하는 중쇄를 카파 및 람다 경쇄를 공발현하는 포유류(HEK) 세포 내에 클로닝하였다(중쇄(HC):람다 경쇄(LC):카파 LC = 2:1:1임, 즉 HC:LC 비율은 항상 1:1임). 야생형(ADI-26140 중쇄), “A141D” 변이체, 및 “A141D_S181K_K218P” 변이체도 대조군으로서 포함시켰다. 람다 선호도는 전술한 것과 동일한 검정을 사용하여 결정하였다.
람다 MFI 대 카파 MFI 비율은 유세포 계측법으로 평가하였다. 14개의 리드에 대한 FOP 값 및 개별 FACS 플롯은 표 14 및 도 20 내지 22에 제공되어 있다(각 플롯에서의 넘버링은 표 14에 표시된 순위#임). 14개의 리드 중, “A141D_P171E_V185R” 및 “A141D_F170E_T187R”은 실시예 5에서 식별된 리드인 “A141D_S181K_K218P”보다 훨씬 더 높은 FOP 값을 나타냈다. 14개의 리드 중 많은 다른 변이체도 “A141D”에 비해 더 높은 FOP 값을 나타냈고, 14개의 리드 모두는 야생형과 비교해 더 높은 FOP 값을 나타냈다.
14개의 CH1 변이체 리드 및 대조군의 FOP 값 (순위는 FOP 값에 기초함)
CH1에서의 치환 FOP 값
1 A141D_P171E_V185R 4.71
2 A141D_F170E_T187R 3.29
3 A141D_S181K_K218P 2.90 대조군 (실시예 6의 리드)
4 A141E_V185R_T187R 2.30
5 A141E_P171E_V185R 2.29
6 A141D_F170E_V185R 2.18
7 A141D_V185R_T187R 2.11
8 A141E_F170E_T187R 2.00
9 A141D_V185R 1.76
10 A141E_V185R 1.70
11 A141D_P171E_T187R 1.68
12 A141E_P171E_T187R 1.60
13 A141D 1.47 대조군
14 A141D_T187R 1.37
15 A141E_F170E_V185R 1.31
16 A141E_T187R 1.18
17 WT 1.00 대조군
샘플 당 카파 및 람다 LC의 양은 LCMS를 사용하여 정량화하였다(표 15 및 도 23). FACS 기반 람다 선호도 평가 소견과 유사하게, “A141D_P171E_V185R” 및 “A141D_F170E_T187R”은 실시예 6에서 식별된 리드인 “A141D_S181K_K218P”에 비해 훨씬 더 높은 람다 사슬(%) 및 훨씬 더 낮은 카파 사슬(%)을 나타냈다. 14개의 리드 중 많은 다른 변이체도 “A141D”와 비교하여 더 높은 람다(%) 및 더 낮은 카파(%)를 나타냈고, 14개의 리드 모두는 야생형과 비교하여 더 높은 람다(%) 및 더 낮은 카파(%)를 나타냈다.
LCMS로 측정한 람다 LC(%) 및 카파 LC(%)(표 14의 FOP 값 사용)
CH1에서의 치환 카파 LC (%) 람다 LC (%) 점수
A141D_P171E_V185R 4% 96% 4.71
A141D_F170E_T187R 6% 94% 3.29
A141D_S181K_K218P 9% 91% 2.90
A141E_V185R_T187R 10% 90% 2.30
A141E_P171E_V185R 10% 90% 2.29
A141D_F170E_V185R 15% 85% 2.18
A141D_V185R_T187R 15% 85% 2.11
A141E_F170E_T187R 12% 88% 2.00
A141D_V185R 18% 82% 1.76
A141E_V185R 20% 80% 1.70
A141D_P171E_T187R 19% 81% 1.68
A141E_P171E_T187R 20% 80% 1.60
A141D 28% 72% 1.47
A141D_T187R 31% 69% 1.37
A141E_F170E_V185R 24% 76% 1.31
A141E_T187R 27% 73% 1.18
WT 40% 60% 1.00
상위 2개의 람다-선호 CH1 변이체(“A141D_P171E_V185R” 및 “A141D_F170E_T187R”)가 카파 경쇄와 페어링되느지 여부를 결정하기 위해, CH1 변이체 중쇄 플라스미드를 1) 카파 경쇄 또는 2) 람다 경쇄로 HEK293 세포 내로 형질감염시켰다(중쇄:경쇄의 비율은 1:1임). 카파 선호도를 갖는 CH1로서의 K147F S183R, 및 야생형도 대조군으로서 포함시켰다. 형질감염된 HEK 세포를 배양하고, 단백질 A 컬럼을 사용하는 표준 방법을 통해 IgG를 정제하였다. 공정 수율(mg/L)은 표준 방법을 사용해 결정하고, WT 공정 수율에 대해 정규화하였다. 정규화된 공정 수율에 기초하면, 카파 LC만이 존재할 때(람다 LC는 없음) “A141D_P171E_V185R” 및 “A141D_F170E_T187R” 모두가 카파 LC에 여전히 결합되어 있지만, 카파 LC보다는 람다 LC가 존재할 때 더 많은 결합이 발생하였다 (FIG. 30).
Fab 포맷의 공정 수율도 평가하였다. CH1 변이체 중쇄를 갖는 IgG를 생산하고 동일한 방법을 사용하여 정제하였다. 카파 선호도를 갖는 CH1로서의 K147F S183R, 야생형, A141D, 및 A141D S181K K218P도 대조군으로서 포함시켰다. 연결된 중쇄 및 경쇄 Fab를 파파인 효소 분해를 통해 정제된 IgG로부터 생성하고, 표준 방법을 사용해 CH1을 컬럼 정제하였다. 정규화된 Fab 분해는, 각 경쇄에 대한 부모 회수율(%)에 대해 정규화한, IgG 분해로부터의 Fab 회수율(%)(분해에서 회수된 Fab의 양/IgG의 양)로서 계산하였다. 공정 수율은 표준 방법을 사용해 결정하고, WT 공정 수율에 대해 정규화하였다. 도 15의 데이터와 일관되게, “A141D” 및 “A141D S181K K218P”는 카파 LC에 비해 람다 LC가 존재할 때 공정 수율이 더 높았고, “K147F S183R”은 극단적으로 높은 카파 선호도를 나타냈다(도 31). 카파 CH1만이 존재할 때(람다 CH1은 없음), “A141D_P171E_V185R” 및 “A141D_F170E_T187R” 모두는 여전히 카파 CH1에 결합하였지만, 카파 LC보다 람다 LC가 존재할 때의 수율이 현저하게 더 높았다(도 31). “A141D” 돌연변이에 “P171E_V185R” 또는 “F170E_T187R”을 첨가한 경우 “A141D”의 람다 선호도가 더욱 향상되었다.
실시예 8: “A141D” 및 “K147F S183R” 변이체에 대한 구조 분석
방법
파니투무맙 야생형 CH1-Cλ의 결정화 및 구조 결정
6.5 mg/ml의 파니투무맙 야생형 CH1-불변 람다(Cλ) Fab 단백질을 4℃에서 14,000 × g로 5분 동안 원심분리하였다. 305 nL 단백질을 150 nL의 저장 용액(reservoir drop) 및 50 nL의 시드 용액과 혼합하고, 20℃의 MRC 3-웰 플레이트에서 40 ul의 저장 용액으로 평형화시켰다. BCS 스크리닝(Molecular Dimensions)으로부터 식별된 시드 결정을 마이크로시드 매트릭스 스크리닝(MMS)에 사용하고(D'Arcy, A., Villard, F., 및 Marsh, M.의 문헌[(2007) “An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization” Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 63, 550-554]), 결정화 실험을 통해 0.1 M 인산염/구연산염 pH 5.5 및 36% (v/v) PEG Smear Low에서 성장시킨 결정을 수득하고, 이를 0.1 M 인산염/구연산염 pH 5.5, 38% PEG Smear Low, 및 4% 글리세롤에 옮기고, 이어서 액체 질소로 동결 건조시켰다. Eiger2 XE 16M 검출기(DECTRIS)가 장착된 station I03(Diamond Light Source, Didcot, England)에서, 회절 데이터를 100 K에서 1.09 Å까지 수집하였다. XDS를 사용하여(Kabsch W.의 문헌[(2010) “XDS” Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 125-132]) 데이터 세트를 autoPROC에서 통합하고(Vonrhein, C. 등의 문헌[(2011) “Data processing and analysis with the autoPROC toolbox” Acta Cryst. D67, 293-302]), CCP4 소프트웨어 패키지(Winn M. D. 등의 문헌[(2011) “Overview of the CCP4 suite and current developments” Acta Crystallog. D Biol. Crystallogr. 67, 235-242. 235-242])의 Aimless(Evans P.R. 및 Murshudov, G.N.의 문헌[(2013) “How good are my data and what is the resolution” Acta Crystallogr D Biol. Crystallogr. 69, 1204-1214])를 사용해 조정하였다. 결정체는 P1211 공간기에서 비대칭 단위(ASU) 당 2개의 분자로 구성되었다. 이 구조를, 단백질 데이터 뱅크(Berman H.M. 등의 문헌[(2000) The “Protein Data Bank” Nucleic Acids Research, 28]) 엔트리 5N7W 및 5SX4를 최초 탐색 모델로서 선택한 자동화된 분자 치환 시스템 MoRDA(Vagin A. 및 Lebedev A.의 문헌[(2015) “MoRDa, an automatic molecular replacement pipeline” Acta Cryst A. A71, s19]) (MOLREP (Vagin A., Teplyakov A.의 문헌[(1997) “MOLREP: an automated program for molecular replacement” J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025]) 및 Refmac5 (Murshudov, G.N., Skubak, P., Lebedev, A.A., Pannu, N.S., Steiner, R.A., Nicholls, R.A., Winn, M.D. Long, F. 및 Vagin, A.A.의 문헌[(2011) REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 67, 355-367])이 통합된 것임)를 이용해 해석하였다. 자동화된 모델 구축은 BUCCANEER 소프트웨어(Cowtan K.의 문헌[(2006) “The Buccaneer software for automated model building. 1. Tracing protein chains” Acta Crystallographica D62, 1002-1011])를 사용해 수행하였다. 상기 모델을 Coot(Emsley P., Lohkamp, B., Scott, W.G. 및 Cowtan K.의 문헌[(2010) “Features and development of Coot” Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 486-501])에서의 수동 정제를 비롯하여 Refmac5(Murshudov, G.N., Skubak, P., Lebedev, A.A., Pannu, N.S., Steiner, R.A., Nicholls, R.A., Winn, M.D. Long, F. 및 Vagin, A.A.의 문헌[(2011) REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 67, 355-367]) 및 Buster(Bricogne G, Blanc E, Brandl M, Flensburg C, Keller P, Paciorek W, Roversi P, Sharff A, Smart O, Vonrhein C, Womack T.의 문헌[(2011). BUSTER version 2.11.7. Global Phasing Ltd, Cambridge, United Kingdom])에서의 정제를 통해 각각 14.5% 및 16.9%의 최종 R 및 R 유리 까지 개선하였다(도 32).
파니투무맙 A141D CH1-Cλ, 야생형 CH1-Cκ, 및 K147F-S183R CH1-Cκ의 결정화 및 구조 결정
파니투무맙 A141D CH1-Cλ, 파니투무맙 야생형 CH1-불변 카파(Cκ), 및 파니투무맙 K147F-S183R CH1-Cκ Fab를 4℃에서 14,000 × g로 5분 동안 원심분리하였다. 파니투무맙 A141D CH1-Cλ 및 K147F-S183R CH1-Cκ의 경우, 200 nL의 10.0 mg/ml Fab를 150 nL의 저장 용액 및 50 ul의 시드 용액과 혼합하고, 40 nL의 저장 용액으로 평형화하였다. BCS 스크리닝으로부터 식별된 시드 결정을 MMS 실험에 사용하여 최적의 결정화 조건을 찾았다. 파니투무맙 K147F-S183R CH1-Cκ의 경우, 0.1 M 인산염/구연산염 완충액 pH 5.5 및 36% (v/v) PEG Smear Low를 파니투무맙 A141D CH1-Cλ 및 0.1 M 아세트산나트륨 pH 4.5에 30% v/v PEG Smear Low와 함께 사용하였다. 150 nL의 19.2 mg/ml 야생형 CH1-Cκ를 150 nL의 저장 용액과 혼합하고 40 ul의 저장조 용액에 첨가하고, PACT Suite(Molecular Dimensions)를 사용하여 스크리닝하였다. 최종 결정화 조건은 20% w/v PEG 6000이 포함된 0.1 M MES pH 6.0 및 0.2 M 염화칼슘 이수화물로 구성하였다. 파니투무맙 A141D CH1-Cλ, 야생형 CH1-Cκ, 및 K147F-S183R CH1-Cκ 각각에 대해, 0.1 M 인산염/구연산염 완충액 pH 5.5, 38% PEG Smear Low, 4% 글리세롤; 0.07 M MES, pH 6.0, 21 % PEG 6000, 0.2 M CaCl2, 23,5% 글리세롤; 및 0.1 M NaAc pH 4.5, 32.5% PEG Smear Low, 25% 글리세롤로 이루어진 동결건조 용액에 결정을 옮겼다. 모든 결정을 액체 질소로 급속 냉동시키고, Eiger2 XE 16M 검출기(DECTRIS)가 장착된 station I03(Diamond Light Source, Didcot, England)에서 결정학적 데이터를 100 K에서 1.2~2.6 Å 해상도로 수집하였다. 데이터를 색인하고, iMOSFLM (Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., & Leslie, A. G.의 문헌[(2011). iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, 67(4), 271-281])에서 통합하고, CCP4 suite(Winn M. D. 등의 문헌[(2011) “Overview of the CCP4 suite and current developments” Acta Crystallog. D Biol. Crystallogr. 67, 235-242. 235-242])를 통해 AIMLESS(Evans P.R. 및 Murshudov, G.N.의 문헌[(2013) “How good are my data and what is the resolution” Acta Crystallogr D Biol. Crystallogr. 69, 1204-1214])로 조정하고 병합하였다.
파니투무맙 A141D-CH1-Cλ 구조는 야생형 CH1-Cλ의 결정 구조를 탐색 모델로서 사용하여 분자 치환에 의해 해석하였다. Refmac5(Murshudov, G.N., Skubak, P., Lebedev, A.A., Pannu, N.S., Steiner, R.A., Nicholls, R.A., Winn, M.D. Long, F. 및 Vagin, A.A.의 문헌[(2011) REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 67, 355-367])에서 여러 라운드에 걸쳐 이방성 B 인자와 단순 제한성 정제의 수행하였고, 블러 인자(blurring factor)는 정제의 최종 라운드에서 적용하였다. 야생형 CH1-Cλ의 점유도에 기초하여 A141D CH1-Cλ의 위치 점유도를 할당하고, 정제를 되풀이하는 동안 Coot(Emsley P., Lohkamp, B., Scott, W.G. 및 Cowtan K.의 문헌[(2010) “Features and development of Coot” Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 486-501])에서 수동으로 조정하였다. ASU 당 2개의 분자를 이용해 P1211로 해석된 최종 구조의 R 및 R 유리 값은 각각 15.2% 및 17.0%였다(도 33).
파니투무맙 야생형 CH1-Cκ 및 K147F-S183R-CH1-Cκ 구조는 EGFR (PDB 코드 5SX4) 및 해석된 야생형 CH1-Cκ 구조와 각각 복합체를 형성한 파니투무맙 Fab 단편의 좌표를 사용하는 Phaser(McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., & Read, R. J.의 문헌[(2007). Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography, 40(4), 658-674])를 이용해 분자 치환에 의해 해석하였고, 이어서 Coot(Emsley P., Lohkamp, B., Scott, W.G. 및 Cowtan K.의 문헌[(2010) “Features and development of Coot” Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 486-501])를 사용해 수동 모델 빌딩을 반복적으로 수행하고, Refmac5(Murshudov, G.N., Skubak, P., Lebedev, A.A., Pannu, N.S., Steiner, R.A., Nicholls, R.A., Winn, M.D. Long, F. 및 Vagin, A.A.의 문헌[(2011) REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 67, 355-367])에서 자동 정제를 수행하였다. 야생형 CH1-Cκ 구조에 대해 번역 비결정학적 대칭이 관찰되었으므로, 구조를 ASU에서 6개의 Fab 분자를 사용하는 더 낮은 공간기(P1211)에서 해석하였다. 구조를 각각 19.8% 및 23.2%의 최종 R 및 R 유리 값으로 정제하였다(도 34). K147F-S183R CH1-Cκ 구조는 ASU 당 1개의 분자를 사용하는 P31 공간기에서 각각 19.8% 및 23.3%의 최종 R 및 R 유리 값으로 해석하였다(도 35).
구조 분석 및 해석
HC-A141D에 의해 매개된 람다 LC 선호도
이론에 구속되고자 함이 없이, 파니투무맙 A141D CH1-Cλ의 강화된 람다 선호도는 HC-Asp141의 측쇄 카복실기와 λLC-Thr116의 측쇄 하이드록실기 사이에 형성된 사슬 간 수소 결합에 의해 잠재적으로 매개되는데(도 36c), 이는 파니투무맙 야생형 CH1-Cλ에서 HC-Ala141로 형성할 수 없다(도 36a). HC-Ala141을 둘러싸는 κLC 영역은 소수성 잔기 Phe116, Phe118, 및 Leu135로 이루어지는 반면, κLC-Phe116은 λLC에서 극성 잔기 Thr116으로 치환된다(도 36b). 따라서, A141D 돌연변이를 통한 전하 도입은, λLC-Thr116과의 수소 결합을 통해 CH1-λLC 페어링을 안정화하면서 CH1-κLC 계면 소수성을 파괴함으로써 카파 선호도를 낮출 수 있다. 또한, 이론에 구속되고자 함이 없이, 카파 선호도는, 파니투무맙 A141D CH1-Cλ 및 야생형 CH1-κLC의 정렬에 의해 도시된 바와 같이, κLC-Phe116과 HC-Asp141의 입체 충돌을 통해 추가로 감소될 수 있다(도 36d).
HC-Asp141과 λLC-Thr116 사이의 수소 결합에서, 결합은 Asp141의 측쇄 내의 수소 수용체 원자(O)와 Thr116의 측쇄의 수소 공여체 원자(H) 사이에 형성된다. 따라서, 측쇄에 수소 수용체 원자를 갖는 또 다른 아미노산도 λLC의 Thr116과 수소 결합을 형성하여, 람다 선호도를 제공할 수 있다. 글루타메이트의 측쇄도 수소 수용체 원자(O)를 갖고, 글루타메이트는 크기와 형상이 아스파르테이트와 유사하다는 사실에 기초하여, 글루타메이트는 도 36d에 도시된 바와 같이 κLC와 입체 충돌을 야기하면서 λLC의 Thr116과 수소 결합을 형성할 가능성이 있고, 이를 통해 전체적으로 람다 선호도를 제공할 수 있다. 실제로, A141E 치환은 상기 실시예에서 입증된 바와 같이 강한 람다 선호도를 제공하여, 출원인에 의한 구조 분석이 확인되었다.
HC-K147F-S183R에 의해 매개된 카파 LC 선호도
파니투무맙 K147F-S183R CH1-Cκ의 관찰된 카파 선호도는 CH1와 Cκ의 계면에 있는 2개의 새로운 수소 결합에 의해 매개될 수 있다. 파니투무맙 야생형 CH1-Cκ 구조에서, HC-Lys147 및 HC-Asp148에 의해 조정된 수소 결합 네트워크는 HC-Gln175를 격리하여, 베이스라인 카파 페어링 선호도에 기여한다(도 37a). 하나의 설명은, 이 위치에서 CH1 HC-Lys147을 페닐알라닌으로 치환하는 것이 이러한 네트워크를 파괴하고, κLC-Gln160의 포름아미드 산소에 대한 수소 결합을 통해 κLC와 상호작용하는 HC-Gln175 측쇄를 유리시켜, 카파 선호도를 증가시킨다는 것이다(도 37b). 또한, 이론에 구속되고자 함이 없이, HC-S183R 치환은 HC-Arg183 측쇄의 구아니디늄기와 κLC-Thr178의 하이드록실기 사이에서 추가의 수소 결합을 생성한다(도 37b, 도 38c). 역으로, 이론에 구속되고자 함이 없이, 파니투무맙 야생형 CH1-Cλ 내의 HC-Ser183과 λLC-Tyr178 사이의 HC 183 위치에서 관찰된 수소 결합은, K147F-S183R CH1과 λLC의 모델링된 페어링에서 HC-Arg183 측쇄와 λLC-Tyr178 측쇄의 심각한 입체 충돌에 의해 제거되어, κLC에 유리한 람다 페어링을 불안정하게 만든다.
HC-Arg183과 κLC-Thr178 사이의 수소 결합에서, 결합은 Arg183의 측쇄 내의 수소 공여제 원자(H)와 Thr178의 측쇄의 수소 수용체 원자(O) 사이에 형성된다. 따라서, 측쇄에 수소 공여체 원자를 갖는 또 다른 아미노산도 κLC의 Thr178과 수소 결합을 형성하여, 카파 선호도를 제공할 수 있다. Arg의 측쇄와 같은 더 큰 측쇄는 λLC의 Tyr178과의 입체 충돌을 생성하는 데 도움을 주어, 추가적인 카파 선호도를 제공할 수 있다. 예를 들어, 리신과 트립토판 모두의 측쇄는 수소 공여체 원자(H)를 함유하는 큰 측쇄를 갖는다. 따라서, 리신과 트립토판은 κLC의 Thr178과 수소 결합을 형성할 가능성이 있고, 도 38d에 도시된 바와 같이 λLC와 입체 충돌을 겪어, 전반적으로 카파 선호도를 제공할 가능성이 있다. 트레오닌의 측쇄 또한 -OH의 H 원자를 통해 수소 공여체로서 기능할 수 있다. 따라서, 본 출원인은 수소 수용체로서 기능할 수 있는 상대적으로 큰 측쇄를 갖는 아미노산 또한 κLC의 Thr178과 수소 결합을 형성하여 카파 선호도를 제공할 수 있다는 것을 추가로 고려한다. 예를 들어, 수소 수용체 원자를 가진 상대적으로 큰 측쇄를 갖는 글루타메이트, 글루타민, 히스티딘, 또는 티로신은, HC의 잔기 183에 위치할 때, 카파 선호도를 제공할 수도 있다. 실제로, 잔기 183에서 새롭게 제안된 이러한 아미노산 치환의 대부분은 실제로는 실시예 3에서 카파를 선호하는 것으로 식별되었다(표 3).
전술한 바와 같이, Lys147을 Phe로 치환하는 것은 Lys147과 Gln175 사이의 수소 결합을 파괴하여, Gln175를 유리시켜 κLC의 Gln160과 수소 결합을 형성함으로써, 카파 선호도에 기여하였다. 따라서, 알라닌, 글리신, 이소류신, 류신, 또는 발린과 같이 측쇄가 수소 공여체 또는 수용체 원자를 함유하지 않는 또 다른 아미노산으로 Lys147을 치환하는 것도 카파 선호도에 도움이 될 수 있다. 실제로, 잔기 147에서 새롭게 제안된 이러한 아미노산 치환의 대부분은 실제로는 실시예 3에서 카파를 선호하는 것으로 식별되었다(표 3).
<110> Adimab, LLC. <120> CH1 DOMAIN VARIANTS ENGINEERED FOR PREFERENTIAL LIGHT CHAIN PAIRING AND MULTISPECIFIC ANTIBODIES COMPRISING THE SAME <130> 1160430.002413 <150> 62/908,367 <151> 2019-09-30 <160> 189 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 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K133S; A141K; K218A <400> 177 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Val Pro Leu Ala Pro Val Ser Ser 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Lys Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Ala 100 <210> 178 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A141E; V185R <400> 178 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Glu Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Arg Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys 100 <210> 179 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A141E; T187R <400> 179 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Glu Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Arg Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys 100 <210> 180 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A141E; F170E; V185R <400> 180 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Glu Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Glu Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Arg Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys 100 <210> 181 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A141E; F170E; T187R <400> 181 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Glu Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Glu Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Arg Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys 100 <210> 182 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A141D; V185R <400> 182 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Arg Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys 100 <210> 183 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A141D; T187R <400> 183 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Arg Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys 100 <210> 184 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A141D; V185R; T187R <400> 184 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Arg Val Arg Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys 100 <210> 185 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A141D; F170E; V185R <400> 185 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Glu Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Arg Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys 100 <210> 186 <211> 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Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys 100 <210> 188 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A141D; P171E; V185R <400> 188 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Glu Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Arg Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys 100 <210> 189 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A141D; P171E; T187R <400> 189 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Asp Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Glu Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Arg Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys 100

Claims (53)

  1. EU 넘버링에 따른 위치 118, 119, 124, 126~134, 136, 138~143, 145, 147~154, 163, 168, 170~172, 175, 176, 181, 183~185, 187, 190, 191, 197, 201, 203~206, 208, 210~214, 216, 및 218 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 중쇄 불변 영역 1(“CH1”) 도메인 변이체 폴리펩티드로서,
    임의로 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는:
    (i) 람다 CL 도메인과 비교해 카파 경쇄 불변 영역(“CL”) 도메인과 우선적으로 페어링되고/되거나 람다 경쇄 폴리펩티드와 비교해 카파 경쇄 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되거나;
    (ii) 카파 CL 도메인과 비교해 람다 CL 도메인과 우선적으로 페어링되고/되거나 카파 경쇄 폴리펩티드와 비교해 람다 경쇄 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되도록 상기 아미노산 치환을 포함하고;
    다음 치환 조합 중 하나 이상은 임의로 제외되는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드:
    (a) CH1 상의 잔기 141이 C 또는 L로 치환되고, 잔기 166이 D 또는 K로 치환되고, CH1 상의 잔기 128, 129, 162, 또는 171이 C로 치환되고/되거나, 잔기 147이 D로 치환되는 경우, 상기 CL은 아미노산 치환을 포함하지 않고;
    (b) CH1 상의 위치 126 또는 220이 발린 또는 알라닌으로 치환되거나, 위치 128, 141, 또는 168에서의 비-시스테인이 시스테인으로 치환되거나, CH1 치환이 L145F, K147A, F170V, S183F, 또는 V185W/F인 경우, 상기 CL은 아미노산 치환을 포함하지 않고;
    (c) CH1 상의 잔기 172가 172R로 치환되거나, 잔기 174가 174G로 돌연변이되거나, 잔기 190이 190M 또는 190I로 치환되는 경우, 이들은 유일한 CH1 치환(들)이 아니고;
    (d) CH1 치환이 L128F, A141I/M/T/L, F170S/A/Y/M, S181M/I/T, S183A/E/K/V 및/또는 V185A/L로 이루어지는 경우, CL은 변형되지 않고;
    (e) CH1 치환이 131C/S, 133R/K, 137E/G, 138S/G, 178S/Y, 192N/S, 및/또는 193F/L로 이루어지는 경우, 이들은 유일한 CH1 치환이 아니고/아니거나 CH1 도메인을 함유하는 이중특이적 항체에서, 이들은 동일한 인간 면역글로불린 아형 또는 동종형이고;
    (f) CH1 치환이 145D/E/R/H/K(IMGT 위치 26)로 이루어지는 경우, 129D/E/R/H/K(IMGT 위치 18)에는 상응하는 LC 치환이 없고;
    (g) CH1 치환이 124K/E/R/D로 이루어지는 경우, 176에는 상응하는 LC 치환이 없고;
    (h) CH1 치환이 133V, 150A, 150D, 152D, 173D, 및/또는 188W로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환은 없고;
    (i) CH1 치환이 133S/W/A, 139W/V/G/I, 143K/E/A, 145E/T/L/Y, 146G, 147T/E, 174V, 175D/R/S, 179K/D/R, 181R, 186R, 188F/L, 및/또는 190S/A/G/Y로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환이 없고;
    (j) CH1 치환이 143A/E/R/K/D 및 145T/L로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환이 없고;
    (k) CH1 치환이 124A/R/E/W, 145M/T, 143E/R/D/F, 172R/T 및 139W/G/C, 179E, 및/또는 186R로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환이 없고;
    (l) CH1 치환이 위치 126, 127, 128, 134, 141, 171, 또는 173에서 시스테인으로 치환하는 것으로 구성되는 경우, 상응하는 LC 위치는 이황화 결합을 형성하도록 변형되지 않고;
    (m) CH1 치환이 L145Q, H168A, F170G, S183V, 및/또는 T187E로 구성되는 경우, 상응하는 카파 또는 람다 LC 치환이 없고;
    (n) CH1 치환이 143D/E, 145T, 190E/D, 및/또는 124R로 이루어지는 경우, 상응하는 CL 치환이 없고; 또는
    (o) CH1 치환이 A140C, K147C, 및/또는 S183C로 이루어지는 경우, 상응하는 CL 치환이 있음.
  2. 제1항에 있어서, EU 넘버링에 따른 위치 118, 124, 126~129, 131, 132, 134, 136, 139, 143, 145, 147~151, 153, 154, 170, 172, 175, 176, 181, 183, 185, 190, 191, 197, 201, 203~206, 210, 212~214, 및 218 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하되,
    임의로 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는:
    (i) 람다 CL 도메인과 비교해 카파 CL 도메인과 우선적으로 페어링되고/되거나;
    (ii) 람다 경쇄 폴리펩티드와 비교해 카파 경쇄 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되도록 상기 아미노산 치환을 포함하는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 위치 147, 위치 183, 또는 위치 147과 183에서 아미노산 치환을 포함하는 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 다음 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드:
    a. 위치 118이 G로 치환됨;
    b. 위치 124가 H, R, E, L, 또는 V로 치환됨;
    c. 위치 126이 A, T, 또는 L로 치환됨;
    d. 위치 127이 V 또는 L로 치환됨;
    e. 위치 128이 H로 치환됨;
    f. 위치 129가 P로 치환됨;
    g. 위치 131이 A로 치환됨;
    h. 위치 132가 P로 치환됨;
    i. 위치 134가 G로 치환됨;
    j. 위치 136이 E로 치환됨;
    k. 위치 139가 I로 치환됨;
    l. 위치 143이 V 또는 S로 치환됨;
    m. 위치 145가 F, I, N, 또는 T로 치환됨;
    n. 위치 147이 F, I, L, R, T, S, M, V, N, E, H, Y, Q, A 또는 G로 치환됨;
    o. 위치 148이 I, Q, Y, 또는 G로 치환됨;
    p. 위치 149가 C, S, 또는 H로 치환됨;
    q. 위치 150이 L 또는 S로 치환됨;
    r. 위치 151이 A 또는 L로 치환됨;
    s. 위치 153가 S로 치환됨;
    t. 위치 154가 M 또는 G로 치환됨;
    u. 위치 170이 G 또는 L로 치환됨;
    v. 위치 172가 V로 치환됨;
    w. 위치 175가 G, L, E, A로 치환됨;
    x. 위치 176이 P로 치환됨;
    y. 위치 181이 Y, Q, 또는 G로 치환됨;
    z. 위치 183이 I, W, F, E, Y, L, K, Q, N, R, 또는 H로 치환됨;
    aa. 위치 185가 W로 치환됨;
    bb. 위치 190이 P로 치환됨;
    cc. 위치 191가 I로 치환됨;
    dd. 위치 197이 A로 치환됨;
    ee. 위치 201이 S로 치환됨;
    ff. 위치 203이 S로 치환됨;
    gg. 위치 204가 Y로 치환됨;
    hh. 위치 205가 Q로 치환됨;
    ii. 위치 206이 S로 치환됨;
    jj. 위치 210이 R로 치환됨;
    kk. 위치 212가 G로 치환됨;
    ll. 위치 213이 E 또는 R로 치환됨;
    mm. 위치 214가 R로 치환됨; 및
    nn. 위치 218이 Q로 치환됨.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 다음을 포함하는 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드:
    (i) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F, I, L, R, T, S, M, V, N, E, H, Y, 또는 Q;
    (ii) 위치 183에서의 아미노산 잔기 I, W, F, E, Y, L, K, Q, N, 또는 R.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 다음을 포함하는 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드:
    (i) 위치 183에서의 아미노산 잔기 R, K, 또는 Y;
    (ii) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 다음을 포함하고:
    (i) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및 위치 183에서의 아미노산 잔기 R;
    (ii) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및 위치 183에서의 아미노산 잔기 K;
    (iii) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및 위치 183에서의 아미노산 잔기 Y;
    (iv) 위치 183에서의 아미노산 잔기 R;
    (v) 위치 183에서의 아미노산 잔기 K; 또는
    (vi) 위치 183에서 아미노산 잔기 Y,
    임의로, 다음의 아미노산 서열을 포함하는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드:
    (i) 서열번호 137;
    (ii) 서열번호 138;
    (iii) 서열번호 139;
    (iv) 서열번호 60;
    (v) 서열번호 41; 또는
    (vi) 서열번호 136.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, CH1과 VH 사이의 계면 내의 CH1 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함하되, 임의로 CH1 아미노산 위치는 위치 151이고, 추가로 위치 151에서 아미노산 잔기 A 또는 L을 임의로 포함하는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드.
  9. CH1 도메인 변이체 폴리펩티드로서, 다음을 포함하는 CH1 도메인 폴리펩티드 변이체:
    (i) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및 위치 183에서의 아미노산 잔기 R;
    (ii) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및 위치 183에서의 아미노산 잔기 K;
    (iii) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및 위치 183에서의 아미노산 잔기 Y;
    (iv) 위치 183에서의 아미노산 잔기 R;
    (v) 위치 183에서의 아미노산 잔기 K; 또는
    (vi) 위치 183에서 아미노산 잔기 Y.
  10. 제9항에 있어서, 다음으로 이루어지는 아미노산 치환을 포함하는 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드:
    (i) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및 위치 183에서의 아미노산 잔기 R;
    (ii) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및 위치 183에서의 아미노산 잔기 K;
    (iii) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및 위치 183에서의 아미노산 잔기 Y;
    (iv) 위치 183에서의 아미노산 잔기 R;
    (v) 위치 183에서의 아미노산 잔기 K; 또는
    (vi) 위치 183에서 아미노산 잔기 Y.
  11. 제10항에 있어서, 다음의 아미노산 서열을 포함하는 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드:
    (i) 서열번호 137;
    (ii) 서열번호 138;
    (iii) 서열번호 139;
    (iv) 서열번호 60;
    (v) 서열번호 41; 또는
    (vi) 서열번호 136.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, CH1 도메인이
    (i) 람다 CL 도메인과 비교해 카파 CL 도메인과 페어링되는 것;
    (ii) 람다 경쇄 폴리펩티드와 비교해 카파 경쇄 폴리펩티드와 페어링되는 것을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드.
  13. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 람다 CL 도메인과 비교해 카파 CL 도메인과의 페어링;
    (ii) 람다 경쇄 폴리펩티드와 비교해 카파 경쇄 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되는 것을 추가로 촉진하며,
    임의로 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LCMS)에 의해 측정했을 때, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%만큼 증가시키거나,
    임의로 유세포 계측법에 의해 측정하고, 임의로 람다 CL 염색에 대한 카파 CL 염색의 평균 형광 강도(MFI) 비율을 비교했을 때, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 21배, 적어도 22배, 적어도 23배, 적어도 24배, 또는 적어도 25배만큼 증가시키는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드.
  14. 제1항에 있어서, EU 넘버링에 따른 위치 119, 124, 126, 127, 130, 131, 133, 134, 138~142, 152, 163, 168, 170, 171, 175, 176, 181, 183~185, 187, 197, 203, 208, 210~214, 216, 및 218 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하되,
    임의로 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드는:
    (i) 카파 CL 도메인과 비교해 람다 CL 도메인과 우선적으로 페어링되고/되거나;
    (ii) 카파 경쇄 폴리펩티드와 비교해 람다 경쇄 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되도록 상기 아미노산 치환을 포함하는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드.
  15. 제14항에 있어서, 위치 141, 170, 171, 175, 181, 184, 185, 187, 및 218 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 다음 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드:
    a. 위치 119가 R로 치환됨;
    b. 위치 124가 V로 치환됨;
    c. 위치 126이 V로 치환됨;
    d. 위치 127이 G로 치환됨;
    e. 위치 130이 H 또는 S로 치환됨;
    f. 위치 131이 Q, T, N, R, V, 또는 D로 치환됨;
    g. 위치 133이 D, T, L, E, S, 또는 P로 치환됨;
    h. 위치 134가 A, H, I, P, V, N, 또는 L로 치환됨;
    i. 위치 138이 R로 치환됨;
    j. 위치 139가 A로 치환됨;
    k. 위치 140이 I, V, D, Y, K, S, W, R, L, 또는 P로 치환됨;
    l. 위치 141이 D, K, E, T, R, Q, V, 또는 M으로 치환됨;
    m. 위치 142가 M으로 치환됨;
    n. 위치 152가 G로 치환됨;
    o. 위치 163이 M으로 치환됨;
    p. 위치 168이 F, I, 또는 V로 치환됨;
    q. 위치 170이 N, G, E, S, 또는 T로 치환됨;
    r. 위치 171이 N, E, G, S, A, 또는 D로 치환됨;
    s. 위치 175가 D 또는 M으로 치환됨;
    t. 위치 176이 R 또는 M으로 치환됨;
    u. 위치 181이 V, L, A, K, 또는 T로 치환됨;
    v. 위치 183이 L 또는 V로 치환됨;
    w. 위치 184가 R로 치환됨;
    x. 위치 185가 M, L, S, R, 또는 T로 치환됨;
    y. 위치 187이 R, D, E, Y, 또는 S로 치환됨;
    z. 위치 197이 S로 치환됨;
    aa. 위치 203이 D로 치환됨;
    bb. 위치 208이 I로 치환됨;
    cc. 위치 210이 T로 치환됨;
    dd. 위치 211이 A로 치환됨;
    ee. 위치 212가 N으로 치환됨;
    ff. 위치 213이 E로 치환됨;
    gg. 위치 214가 R로 치환됨;
    hh. 위치 216이 G로 치환됨; 및
    ii. 위치 218이 L, E, D, P, A, H, S, Q, N, T, I, M, G, C, K, 또는 W로 치환됨.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 내지 (xvii) 중 하나 이상:
    (i) 위치 126에서의 아미노산 잔기 V;
    (ii) 위치 127에서의 아미노산 잔기 G;
    (iii) 위치 131에서의 아미노산 잔기 V;
    (iv) 위치 133에서의 아미노산 잔기 S;
    (v) 위치 138에서의 아미노산 잔기 R;
    (vi) 위치 140에서의 아미노산 잔기 I 또는 V;
    (vii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, K, E, 또는 T;
    (viii) 위치 142에서의 아미노산 잔기 M;
    (ix) 위치 168에서의 아미노산 잔기 I;
    (x) 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, G, 또는 S;
    (xi) 위치 171에서의 아미노산 잔기 E, D, G, S, 또는 A;
    (xii) 위치 175에서의 아미노산 잔기 M;
    (xiii) 위치 176에서의 아미노산 잔기 R;
    (xiv) 위치 181에서의 아미노산 잔기 K, V, A, 또는 L;
    (xv) 위치 184에서의 아미노산 잔기 R;
    (xvi) 위치 185에서의 아미노산 잔기 R;
    (xvii) 위치 187에서의 아미노산 잔기 R; 및
    (xviii) 위치 218에서의 아미노산 잔기 L, E, D, P, A, H, S, Q, N, T, I, M, G, C, 또는 W를 포함하는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, CH1 치환은 다음 치환 중 하나 이상을 포함하거나, 이로 이루어지는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드: 141D, 141E, 171E, 170E, 185R, 및 187R.
  19. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, CH1 치환은 다음 치환 중 2개 이상을 포함하거나, 이로 이루어지는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드: 141D, 141E, 171E, 170E, 185R, 및 187R.
  20. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, CH1 치환은 다음 치환 중 3개 이상을 포함하거나, 이로 이루어지는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드: 141D, 141E, 171E, 170E, 185R, 및 187R.
  21. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, CH1 치환은 다음 치환을 포함하거나, 이로 이루어지는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드: (i) 141E 및 185R; (ii) 141E 및 187R; (iii) 141E, 170E 또는 171E, 및 185R; (iv) 141E, 170E 또는 171E, 및 187R; (v) 141D 및 185R; (vi) 141D 및 187R; (vii) 141D, 170E 또는 171E, 및 185R; (viii) 141D, 170E 또는 171E, 및 187R; (ix) 141E, 185R, 및 187R; 또는 (x) 141D, 185R, 및 187R.
  22. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 141에서 D, K, 또는 E로의 치환을 포함하되, 상기 치환은 위치 181에서 K로의 치환과 임의로 페어링되고, 추가로 위치 218에서 L, E, D, P, A, H, S, Q, N, T, I, M, G, C, 또는 W로의 치환과 임의로 페어링되는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드.
  23. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 141에서 D, K, 또는 E로의 치환을 포함하되, 상기 치환은 위치 181에서 K로의 치환과 페어링되고/되거나 위치 218에서 L, E, D, P, A, H, S, Q, N, T, I, M, G, C, 또는 W로의 치환과 페어링되는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드.
  24. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 내지 (ix) 중 하나 이상을 포함하는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드:
    (i) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, E, 또는 K;
    (ii) 위치 170에서의 아미노산 잔기 E;
    (iii) 위치 171에서의 아미노산 잔기 E;
    (iv) 위치 175에서의 아미노산 잔기 M;
    (v) 위치 181에서의 아미노산 잔기 K;
    (vi) 위치 184에서의 아미노산 잔기 R;
    (vii) 위치 185에서의 아미노산 잔기 R;
    (viii) 위치 187에서의 아미노산 잔기 R;
    (ix) 위치 218에서의 아미노산 잔기 P, A, 또는 E.
  25. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 다음을 포함하고:
    (i) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D;
    (ii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D 및 위치 181에서의 아미노산 잔기 K;
    (iii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 181에서의 아미노산 잔기 K, 및 위치 218에서의 아미노산 잔기 A;
    (iv) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 181에서의 아미노산 잔기 K, 및 위치 218에서의 아미노산 잔기 P;
    (v) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E;
    (vi) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E 및 위치 181에서의 아미노산 잔기 K;
    (vii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 K;
    (viii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 K 및 위치 181에서의 아미노산 잔기 K;
    (ix) 위치 141에서의 아미노산 잔기 K, 위치 181에서의 아미노산 잔기 K, 및 위치 218에서의 아미노산 잔기 E;
    (x) 위치 141에서의 아미노산 잔기 K, 위치 181에서의 아미노산 잔기 K, 및 위치 218에서의 아미노산 잔기 P;
    (xi) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, 위치 181에서의 아미노산 잔기 V, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R;
    (xii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 171에서의 아미노산 잔기 D, 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R;
    (xiii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 171에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R;
    (xiv) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 171에서의 아미노산 잔기 G, 위치 185에서의 아미노산 잔기 R, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R;
    (xv) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 185에서의 아미노산 잔기 R, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R;
    (xvi) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 171에서의 아미노산 잔기 S, 및 위치 181에서의 아미노산 잔기 K;
    (xvii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 170에서의 아미노산 잔기 G, 위치 175에서의 아미노산 잔기 M, 위치 181에서의 아미노산 잔기 V, 위치 184에서의 아미노산 잔기 R, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R;
    (xviii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R;
    (xix) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R;
    (xx) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R;
    (xxi) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R;
    (xxii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R;
    (xxiii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R;
    (xxiv) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 185에서의 아미노산 잔기 R, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R;
    (xxv) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R;
    (xxvi) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R;
    (xxvii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E, 위치 171에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R;
    (xxiii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 171에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R; 또는
    (xxix) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 171에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R;
    임의로, 다음의 아미노산 서열을 포함하는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드:
    (i) 서열번호 140;
    (ii) 서열번호 141;
    (iii) 서열번호 142;
    (iv) 서열번호 143;
    (v) 서열번호 144;
    (vi) 서열번호 145;
    (vii) 서열번호 146;
    (viii) 서열번호 147;
    (ix) 서열번호 148;
    (x) 서열번호 149;
    (xi) 서열번호 155;
    (xii) 서열번호 157;
    (xiii) 서열번호 159;
    (xiv) 서열번호 162;
    (xv) 서열번호 163;
    (xvi) 서열번호 164;
    (xvii) 서열번호 165;
    (xviii) 서열번호 178;
    (xix) 서열번호 179;
    (xx) 서열번호 180;
    (xxi) 서열번호 181;
    (xxii) 서열번호 182;
    (xxiii) 서열번호 183;
    (xxiv) 서열번호 184;
    (xxv) 서열번호 185;
    (xxvi) 서열번호 186;
    (xxvii) 서열번호 187;
    (xxviii) 서열번호 188; 또는
    (xxix) 서열번호 189.
  26. 중쇄 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드로서, 다음을 포함하는 중쇄 CH1 도메인 폴리펩티드 변이체:
    (i) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 171에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R;
    (ii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R; 또는
    (iii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 181에서의 아미노산 잔기 K, 및 위치 218에서의 아미노산 잔기 P.
  27. 제26항에 있어서, 다음을 포함하는 중쇄 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드:
    (i) 서열번호 188;
    (ii) 서열번호 186; 또는
    (iii) 서열번호 143.
  28. 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, CH1 도메인이
    (i) 카파 CL 도메인과 비교해 람다 CL 도메인과 페어링되는 것;
    (ii) 카파 경쇄 폴리펩티드와 비교해 람다 경쇄 폴리펩티드와 페어링되는 것을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드.
  29. 제14항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 카파 CL 도메인과 비교해 람다 CL 도메인과의 페어링;
    (ii) 카파 경쇄 폴리펩티드와 비교해 람다 경쇄 폴리펩티드와의 페어링을,
    임의로 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LCMS)에 의해 측정했을 때, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%만큼 증가시키거나,
    임의로 유세포 계측법에 의해 측정하고, 임의로 카파 CL 염색에 대한 람다 CL 염색의 MFI 값을 비교했을 때, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 21배, 적어도 22배, 적어도 23배, 적어도 24배, 또는 적어도 25배만큼 증가시키는, CH1 도메인 변이체 폴리펩티드.
  30. 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 항체 중쇄 폴리펩티드로서, 불변 영역을 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 CH1 도메인 변이체를 포함하고, 상기 항체 중쇄 폴리펩티드는 임의로 CH1 도메인 외부에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함하되, 상기 아미노산 치환은 상기 중쇄가
    (I) (i) 람다 CL 도메인과 비교해 카파 CL 도메인과 우선적으로 페어링되는 것, 및/또는
    (ii) 람다 경쇄 폴리펩티드와 비교해 카파 경쇄 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되는 것을 추가로 촉진하거나;
    (II) (i) 카파 CL 도메인과 비교해 람다 CL 도메인과 우선적으로 페어링되는 것, 및/또는
    (ii) 카파 경쇄 폴리펩티드와 비교해 람다 경쇄 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되는 것을 추가로 촐진하는, 항체 중쇄 폴리펩티드.
  31. 제30항에 있어서, CH1 도메인 변이체는 제7항 내지 제11항 및 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 것인, 항체 중쇄 폴리펩티드.
  32. 제1 중쇄 폴리펩티드 및 제1 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 항체 단편으로서,
    (a) 제1 중쇄 폴리펩티드 및 제1 경쇄 폴리펩티드는 제1 동족 쌍을 형성하고; 및
    (b) 제1 중쇄 폴리펩티드는, 제1 CH1 도메인 변이체가 제1 경쇄에 우선적으로 결합하도록 EU 넘버링에 따른 다음 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 제1 CH1 도메인 변이체를 포함하고: 118, 119, 124, 126~134, 136, 138~143, 145, 147-154, 163, 168, 170~172, 175, 176, 181, 183~185, 187, 190, 191, 197, 201, 203~206, 208, 210~214, 216, 및 218;
    임의로 제1 경쇄 폴리펩티드는 야생형 CL 도메인인 제1 CL 도메인을 포함하되;
    상기 제1 CH1 도메인 내의 다음 치환 조합 중 하나 이상은 임의로 제외되는, 항체 또는 항체 단편:
    (a) CH1 상의 잔기 141이 C 또는 L로 치환되고, 잔기 166이 D 또는 K로 치환되고, CH1 상의 잔기 128, 129, 162, 또는 171이 C로 치환되고/되거나, 잔기 147이 D로 치환되는 경우, 상기 CL은 아미노산 치환을 포함하지 않고;
    (b) CH1 상의 위치 126 또는 220이 발린 또는 알라닌으로 치환되거나, 위치 128, 141, 또는 168에서의 비-시스테인이 시스테인으로 치환되거나, CH1 치환이 L145F, K147A, F170V, S183F, 또는 V185W/F인 경우, 상기 CL은 아미노산 치환을 포함하지 않고;
    (c) 잔기 172가 172R로 치환되거나, 잔기 174가 174G로 돌연변이되거나, 잔기 190이 190M 또는 190I로 치환되는 경우, 이들은 유일한 CH1 치환(들)이 아니고;
    (d) CH1 치환이 L128F, A141I/M/T/L, F170S/A/Y/M, S181M/I/T, S183A/E/K/V 및/또는 V185A/L로 이루어지는 경우, CL은 변형되지 않고;
    (e) CH1 치환이 131C/S, 133R/K, 137E/G, 138S/G, 178S/Y, 192N/S, 및/또는 193F/L로 이루어지는 경우, 이들은 유일한 CH1 치환이 아니고/아니거나 CH1 도메인을 함유하는 이중특이적 항체에서, 이들은 동일한 인간 면역글로불린 아형 또는 동종형이고;
    (f) CH1 치환이 145D/E/R/H/K(IMGT 위치 26)로 이루어지는 경우, 129D/E/R/H/K(IMGT 위치 18)에는 상응하는 LC 치환이 없고;
    (g) CH1 치환이 124K/E/R/D로 이루어지는 경우, 176에는 상응하는 LC 치환이 없고;
    (h) CH1 치환이 133V, 150A, 150D, 152D, 173D, 및/또는 188W로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환은 없고;
    (i) CH1 치환이 133S/W/A, 139W/V/G/I, 143K/E/A, 145E/T/L/Y, 146G, 147T/E, 174V, 175D/R/S, 179K/D/R, 181R, 186R, 188F/L, 및/또는 190S/A/G/Y로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환이 없고;
    (j) CH1 치환이 143A/E/R/K/D 및 145T/L로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환이 없고;
    (k) CH1 치환이 124A/R/E/W, 145M/T, 143E/R/D/F, 172R/T 및 139W/G/C, 179E, 및/또는 186R로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환이 없고;
    (l) CH1 치환이 위치 126, 127, 128, 134, 141, 171, 및/또는 173에서 시스테인으로 치환하는 것으로 구성되는 경우, 상응하는 LC 위치는 이황화 결합을 형성하도록 변형되지 않고;
    (m) CH1 치환이 L145Q, H168A, F170G, S183V, 및/또는 T187E로 구성되는 경우, 상응하는 카파 또는 람다 LC 치환이 없고;
    (n) CH1 치환이 143D/E, 145T, 190E/D, 및/또는 124R로 이루어지는 경우, 상응하는 CL 치환이 없고; 또는
    (o) CH1 치환이 A140C, K147C, 및/또는 S183C로 이루어지는 경우, 상응하는 CL 치환이 있음.
  33. 제32항에 있어서, 제2 중쇄 폴리펩티드 및 제2 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함하되,
    (a) 제2 중쇄 폴리펩티드 및 제2 경쇄 폴리펩티드는 제2 동족 쌍을 형성하고; 및
    (b) 제2 중쇄 폴리펩티드는, 제2 CH1 도메인 변이체가 제2 CL 도메인을 포함하는 제2 경쇄에 우선적으로 결합하도록 EU 넘버링에 따른 다음 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 제1 CH1 도메인 변이체를 포함하고: 118, 119, 124, 126~134, 136, 138~143, 145, 147-154, 163, 168, 170~172, 175, 176, 181, 183~185, 187, 190, 191, 197, 201, 203~206, 208, 210~214, 216, 및 218;
    상기 제2 CH1 도메인 내의 다음 치환 조합 중 하나 이상은 임의로 제외되며:
    (a) CH1 상의 잔기 141이 C 또는 L로 치환되고, 잔기 166이 D 또는 K로 치환되고, CH1 상의 잔기 128, 129, 162, 또는 171이 C로 치환되고/되거나, 잔기 147이 D로 치환되는 경우, 상기 CL은 아미노산 치환을 포함하지 않고;
    (b) CH1 상의 위치 126 또는 220이 발린 또는 알라닌으로 치환되거나, 위치 128, 141, 또는 168에서의 비-시스테인이 시스테인으로 치환되거나, CH1 치환이 L145F, K147A, F170V, S183F, 또는 V185W/F인 경우, 상기 CL은 아미노산 치환을 포함하지 않고;
    (c) 잔기 172가 172R로 치환되거나, 잔기 174가 174G로 돌연변이되거나, 잔기 190이 190M 또는 190I로 치환되는 경우, 이들은 유일한 CH1 치환이 아니고;
    (d) CH1 치환이 L128F, A141I/M/T/L, F170S/A/Y/M, S181M/I/T, S183A/E/K/V, 및/또는 V185A/L로 이루어지는 경우, CL은 변형되지 않고;
    (e) CH1 치환이 131C/S, 133R/K, 137E/G, 138S/G, 178S/Y, 192N/S, 및/또는 193F/L로 이루어지는 경우, 이들은 유일한 CH1 치환이 아니고/아니거나 CH1 도메인을 함유하는 이중특이적 항체에서, 이들은 동일한 인간 면역글로불린 아형 또는 동종형이고;
    (f) CH1 치환이 145D/E/R/H/K(IMGT 위치 26)로 이루어지는 경우, 129D/E/R/H/K(IMGT 위치 18)에는 상응하는 LC 치환이 없고;
    (g) CH1 치환이 124K/E/R/D로 이루어지는 경우, 176에는 상응하는 LC 치환이 없고;
    (h) CH1 치환이 133V, 150A, 150D, 152D, 173D, 및/또는 188W로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환은 없고;
    (i) CH1 치환이 133S/W/A, 139W/V/G/I, 143K/E/A, 145E/T/L/Y, 146G, 147T/E, 174V, 175D/R/S, 179K/D/R, 181R, 186R, 188F/L, 및/또는 190S/A/G/Y로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환이 없고;
    (j) CH1 치환이 143A/E/R/K/D 및 145T/L로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환이 없고;
    (k) CH1 치환이 124A/R/E/W, 145M/T, 143E/R/D/F, 172R/T 및 139W/G/C, 179E, 및/또는 186R로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환이 없고;
    (l) CH1 치환이 위치 126, 127, 128, 134, 141, 171, 또는 173에서 시스테인으로 치환하는 것으로 구성되는 경우, 상응하는 LC 위치는 이황화 결합을 형성하도록 변형되지 않고;
    (m) CH1 치환이 L145Q, H168A, F170G, S183V, 및 T187E로 구성되는 경우, 상응하는 카파 또는 람다 LC 치환이 없고;
    (n) CH1 치환이 143D/E, 145T, 190E/D, 및/또는 124R로 이루어지는 경우, 상응하는 CL 치환이 없고; 또는
    (o) CH1 치환이 A140C, K147C, 및/또는 S183C로 이루어지는 경우, 상응하는 CL 치환이 있음;
    추가로 임의로, 항체 또는 항체 단편은 (i) 내지 (ix)의 특징 중 하나 이상의 포함하는, 항체 또는 항체 단편:
    (i) 제1 CL 도메인은 야생형 CL 도메인임;
    (ii) 제2 CL 도메인은 야생형 CL 도메인임;
    (iii) 제1 CL 도메인은 카파 CL 도메인임;
    (iv) 제1 CL 도메인은 람다 CL 도메인임;
    (v) 제2 CL 도메인은 카파 CL 도메인임;
    (vi) 제2 CL 도메인은 람다 CL 도메인임;
    (vii) 제1 CH1 도메인 변이체는 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 CH1 도메인 변이체임;
    (viii) 제2 CH1 도메인 변이체는 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 CH1 도메인 변이체임;
    (ix) 제1 CH1 도메인 변이체에서의 아미노산 치환(들)은 제2 CH1 도메인 변이체에서의 아미노산 치환(들)과 상이함.
  34. 제1 중쇄 폴리펩티드 및 제1 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 항체 단편으로서,
    (a) 제1 중쇄 폴리펩티드 및 제1 경쇄 폴리펩티드는 제1 동족 쌍을 형성하고;
    (b) 제1 중쇄 폴리펩티드는 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 제1 CH1 도메인 변이체를 포함하고; 및
    (c) 제1 경쇄 폴리펩티드는 카파 CL 도메인을 포함하고, 임의로 이는 카파 경쇄 폴리펩티드이며,
    임의로,
    (i) 카파 CL 도메인은 야생형 CL 도메인이고;
    (ii) 제1 경쇄 폴리펩티드는 야생형 경쇄 폴리펩티드이며,
    추가로 임의로, 제1 중쇄 폴리펩티드는 CH1 도메인 외부에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 중쇄가
    (i) 람다 CL 도메인과 비교해 카파 CL 도메인과 우선적으로 페어링되는 것, 및/또는
    (ii) 람다 경쇄 폴리펩티드와 비교해 카파 경쇄 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되는 것을 추가로 촉진하는, 항체 및 항체 단편.
  35. 제2 중쇄 폴리펩티드 및 제2 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 항체 단편으로서,
    (a) 제2 중쇄 폴리펩티드 및 제2 경쇄 폴리펩티드는 제1 동족 쌍을 형성하고;
    (b) 제2 중쇄 폴리펩티드는 제14항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 제2 CH1 도메인 변이체를 포함하고; 및
    (c) 제2 경쇄 폴리펩티드는 람다 CL 도메인을 포함하고, 임의로 이는 람다 경쇄 폴리펩티드이며,
    임의로,
    (i) 람다 CL 도메인은 야생형 CL 도메인이고;
    (ii) 제2 경쇄 폴리펩티드는 야생형 경쇄 폴리펩티드이며,
    추가로 임의로, 제2 중쇄 폴리펩티드는 CH1 도메인 외부에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 중쇄가
    (i) 카파 CL 도메인과 비교해 람다 CL 도메인과 우선적으로 페어링되는 것, 및/또는
    (ii) 카파 경쇄 폴리펩티드와 비교해 람다 경쇄 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되는 것을 추가로 촉진하는, 항체 또는 항체 단편.
  36. 제1 중쇄 폴리펩티드, 제1 경쇄 폴리펩티드, 제2 중쇄 폴리펩티드, 및 제2 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 항체 단편으로서,
    (a) 제1 중쇄 폴리펩티드 및 제1 경쇄 폴리펩티드는 제1 동족 쌍을 형성하고;
    (b) 제1 중쇄 폴리펩티드는 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 제1 CH1 도메인 변이체를 포함하는 제1 CH1 도메인을 포함하고;
    (c) 제1 경쇄 폴리펩티드는 카파 CL 도메인을 포함하고, 임의로 이는 카파 경쇄 폴리펩티드이며;
    (d) 제2 중쇄 폴리펩티드 및 제2 경쇄 폴리펩티드는 제2 동족 쌍을 형성하고;
    (e) 제2 중쇄 폴리펩티드는 제14항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 CH1 도메인 변이체를 포함하는 제2 CH1 도메인을 포함하고; 및
    (f) 제2 경쇄 폴리펩티드는 람다 CL 도메인을 포함하고, 임의로 이는 람다 경쇄 폴리펩티드이며,
    추가로 임의로, 제1 중쇄 폴리펩티드는 CH1 도메인 외부에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 중쇄가
    (i) 람다 CL 도메인과 비교해 카파 CL 도메인과 우선적으로 페어링되는 것, 및/또는
    (ii) 람다 경쇄 폴리펩티드와 비교해 카파 경쇄 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되는 것을 추가로 촉진하며,
    추가로 임의로, 제2 중쇄 폴리펩티드는 CH1 도메인 외부에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 중쇄가
    (i) 카파 CL 도메인과 비교해 람다 CL 도메인과 우선적으로 페어링되는 것, 및/또는
    (ii) 카파 경쇄 폴리펩티드와 비교해 람다 경쇄 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되는 것을 추가로 촉진하는, 항체 또는 항체 단편.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적이고, 임의로 이중특이적이며,
    추가로 임의로, 상기 항체 또는 항체 단편의 구조는 도 24~29 중 어느 하나에 도시된 것과 같은, 항체 또는 항체 단편.
  38. 제32항 또는 제36항에 있어서, 다중특이적이며, 제1 및 제2 CH1 도메인 변이체는:
    (i) 비동족 중쇄-경쇄 쌍의 형성을 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 또는 적어도 80%만큼 감소시키거나, 적어도 1.2배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 적어도 11배, 적어도 12배, 적어도 13배, 적어도 14배, 적어도 15배, 적어도 16배, 적어도 17배, 적어도 18배, 적어도 19배, 적어도 20배, 적어도 21배, 적어도 22배, 적어도 23배, 적어도 24배, 또는 적어도 25배만큼 감소시키고;
    (ii) 원하는 제1 및 제2 동족 쌍의 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 형성하고;
    (iii) 원하는 제1 및 제2 동족 쌍의 약 85% 내지 약 95%를 형성하고;
    (iv) 비동종 중쇄-경쇄 쌍의 형성을 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 14% 미만, 13% 미만, 12% 미만, 11% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만으로 감소시키며,
    임의로, 동족 및/또는 비동족 쌍의 양은 LCMS 또는 유세포 계측법에 의해 결정되는, 항체 또는 항체 단편.
  39. 제33항, 제36항, 또는 제38항에 있어서, 다중특이적이며 (i) 내지 (iv)의 특징 중 하나 이상을 포함하는, 항체 또는 항체 단편:
    (i) 제1 CH1 도메인 변이체는 위치 147 및/또는 183에서 치환을 포함하고, 비동족 중쇄-경쇄 쌍의 형성을 적어도 50%만큼 감소시킴;
    (i) 제2 CH1 도메인 변이체는 위치 141, 170, 171, 175, 181, 184, 185, 187, 및 218 중 하나 이상에서 치환을 포함하고, 비동족 중쇄-경쇄 쌍의 형성을 적어도 50%만큼 감소시킴;
    (iii) 제1 CH1 도메인 변이체는 위치 147 및/또는 183에서 치환을 포함하고, 제2 CH1 도메인 변이체는 위치 141, 170, 171, 175, 181, 184, 185, 187, 및 218 중 하나 이상에서 치환을 포함하고, 비동족 중쇄-경쇄 쌍의 형성을 적어도 약 50% 내지 약 75%만큼 감소시킴; 또는
    (iv) 제1 CH1 도메인 변이체는 위치 147 및/또는 183에서 치환을 포함하고, 제2 CH1 도메인 변이체는 위치 141, 170, 171, 175, 181, 184, 185, 187, 및 218 중 하나 이상에서 치환을 포함하고 원하는 제1 및 제2 동족 쌍의 약 85% 내지 적어도 약 95%를 형성함.
  40. 제33항, 제36항, 제38항, 또는 제39항에 있어서, 다중특이적이며,
    (a) 제1 CH1 도메인 변이체가
    (i) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및/또는
    (ii) 위치 183에서의 아미노산 잔기 R, K, 또는 Y를 포함하고; 및
    (b) 제2 CH1 도메인 변이체가
    (i) 위치 141에서의 아미노산 잔기 E 또는 D;
    (ii) 위치 170에서의 아미노산 잔기 E;
    (iii) 위치 171에서의 아미노산 잔기 E;
    (iv) 위치 181에서의 아미노산 잔기 K;
    (v) 위치 185에서의 아미노산 잔기 R;
    (vi) 위치 187에서의 아미노산 잔기 R;
    (vii) 위치 218에서의 아미노산 잔기 P, A, E, 또는 K를 포함하는, 항체 또는 항체 단편.
  41. 제33항, 제36항, 제38항, 또는 제39항에 있어서, 다중특이적이며,
    (a) 제1 CH1 도메인 변이체는 다음으로 이루어진 아미노산 치환(들)을 포함하고:
    (i) 위치 147에서의 아미노산 잔기 F 및/또는
    (ii) 위치 183에서의 아미노산 잔기 R, K, 또는 Y; 및
    (b) 제2 CH1 도메인 변이체는 다음으로 이루어진 아미노산 치환(들)을 포함하는, 항체 또는 항체 단편:
    (i) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 171에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 185에서의 아미노산 잔기 R;
    (ii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 170에서의 아미노산 잔기 E, 및 위치 187에서의 아미노산 잔기 R; 또는
    (iii) 위치 141에서의 아미노산 잔기 D, 위치 181에서의 아미노산 잔기 K, 및 위치 218에서의 아미노산 잔기 P.
  42. 제33항 또는 제36항에 있어서,
    (a) 제1 CH1 도메인 변이체는 다음의 아미노산 서열을 포함하고:
    (i) 서열번호 137;
    (ii) 서열번호 138;
    (iii) 서열번호 139;
    (iv) 서열번호 60;
    (v) 서열번호 41; 또는
    (vi) 서열번호 136; 및
    (b) 제2 CH1 도메인 변이체는 다음의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항체 변이체:
    (i) 서열번호 188;
    (ii) 서열번호 186; 또는
    (iii) 서열번호 143.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 CH1 변이체 및 제2 CH1 변이체는:
    (i) 비동족 중쇄-경쇄 쌍의 형성을 적어도 50% 내지 적어도 75%만큼 감소시키고;
    (iii) 원하는 제1 및 제2 동족 쌍의 약 85% 내지 약 95%를 형성하는, 항체 또는 항체 단편.
  44. 약학적 조성물로서,
    (i) 제1항 내지 제29항의 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드;
    (ii) 제30항 또는 제31항의 항체 중쇄 폴리펩티드;
    (iii) 제32항 내지 제43항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편을 포함하는, 약학적 조성물.
  45. CH1 도메인 변이체 라이브러리를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) (i) 카파 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 페어링된, CH1 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 세트(“Cκ 세트”) 및/또는 (ii) 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 페어링된, CH1 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 세트(“Cλ 세트”)를 제공하는 단계로서, 임의로 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역(VH)을 추가로 포함하고, 또한 임의로, 카파 또는 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 경쇄 가변 영역(VL)을 추가로 포함하는, 단계;
    (b) (i) Cκ 세트의 카파 CL 도메인, (ii) Cλ 세트의 람다 CL 도메인, 및/또는 (iii) Cκ 세트 및/또는 Cλ 세트의 VH 내의 하나 이상의 아미노산 위치와 접촉하는, CH1 도메인의 하나 이상의 아미노산 위치를 선택하는 단계; 및
    (c) CH1 도메인 변이체 폴리펩티드의 라이브러리 또는 CH1 도메인 변이체 암호화 작제물의 라이브러리를 생산하는 단계로서, 단계 (b)에서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치 중 하나 이상은 임의의 비야생형 아미노산으로 치환되는, 단계를 포함하되,
    임의로,
    (I) 단계 (a)에서, 상기 CH1 도메인, 상기 카파 CL 도메인, 및 상기 람다 CL 도메인은 야생형 및/또는 인간이고;
    (II) 단계 (a)에서, (i) 카파 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 페어링된, CH1 도메인을 포함하는 상기 폴리펩티드 및 (ii) 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 페어링된, CH1 도메인을 포함하는 상기 폴리펩티드 모두는 온전한 항체이거나 단편 항원 결합(“Fab”)이고;
    (III) 단계 (b)에서, CH1 도메인의 하나 이상의 아미노산 위치에 있는 아미노산 잔기가 (i) 카파 CL 도메인 내의 상기 하나 이상의 아미노산 위치에 있는 아미노산 잔기의 측쇄 원자, (ii) 람다 CL 도메인 내의 상기 하나 이상의 아미노산 위치에 있는 아미노산 잔기의 측쇄 원자, 및/또는 (iii) VH 내의 상기 하나 이상의 아미노산 위치에 있는 아미노산 잔기의 측쇄 분자의 5 Å의 거리 이내에서 측쇄 원자를 갖는 경우, CH1 도메인의 상기 하나 이상의 아미노산 위치가 선택되고;
    (IV) (c)에서의 상기 생산하는 단계는 퇴화 코돈, 임의로 6개의 자연 발생 아미노산(D, T, A, E, K, 및 N)을 나타내는 퇴화 RMW 코돈, 또는 20개의 자연 발생 아미노산 잔기 모두를 나타내는 퇴화 NNK 코돈을 통해 이루어지는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 단계 (b)에서 선택된 하나 이상의 CH1 아미노산 위치는:
    (i) Cκ 세트의 대표적인 세트의 적어도 10%에서 카파 CL 도메인과의 계면에 있고, Cκ 세트의 대표적인 세트의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 용매 접근가능 표면적을 갖고;
    (ii) Cλ 세트의 대표적인 세트의 적어도 10%에서 람다 CL 도메인과의 계면에 있고, Cλ 세트의 대표적인 세트의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 용매 접근가능 표면적을 갖고/갖거나;
    (iii) Cκ 및/또는 Cλ 세트의 대표적인 세트의 적어도 10%에서 VH와의 계면에 있고, Cκ 및/또는 Cλ 세트의 대표적인 세트의 적어도 90%에서 10%를 초과하는 분획 용매 접근가능 표면적을 갖는, 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 단계 (b)에서 선택된 아미노산 위치는 EU 넘버링에 따른 위치 118, 119, 124, 126~134, 136, 138~143, 145, 147~154, 163, 168, 170~172, 175, 176, 181, 183~185, 187, 190, 191, 197, 201, 203~206, 208, 210~214, 216, 및 218 중 하나 이상을 포함하되;
    다음 치환 조합 중 하나 이상은 임의로 제외되는, 방법:
    (a) CH1 상의 잔기 141이 C 또는 L로 치환되고, 잔기 166이 D 또는 K로 치환되고, CH1 상의 잔기 128, 129, 162, 또는 171이 C로 치환되고/되거나, 잔기 147이 D로 치환되는 경우, 상기 CL은 아미노산 치환을 포함하지 않고;
    (b) CH1 상의 위치 126 또는 220이 발린 또는 알라닌으로 치환되거나, 위치 128, 141, 또는 168에서의 비-시스테인이 시스테인으로 치환되거나, CH1 치환이 L145F, K147A, F170V, S183F, 또는 V185W/F인 경우, 상기 CL 도메인은 아미노산 치환을 포함하지 않음;
    (c) 잔기 172가 172R로 치환되거나, 잔기 174가 174G로 돌연변이되거나, 잔기 190이 190M 또는 190I로 치환되는 경우, 이들은 유일한 CH1 치환이 아님;
    (d) CH1 치환이 L128F, A141I/M/T/L, F170S/A/Y/M, S181M/I/T, S183A/E/K/V 및/또는 V185A/L로 이루어지는 경우, CL은 변형되지 않고;
    (e) CH1 치환이 131C/S, 133R/K, 137E/G, 138S/G, 178S/Y, 192N/S, 및/또는 193F/L로 이루어지는 경우, 이들은 유일한 CH1 치환이 아니고/아니거나, CH1 도메인을 함유하는 이중특이적 항체에서 이들은 동일한 인간 면역글로불린 아형 또는 동종형임;
    (f) CH1 치환이 145D/E/R/H/K(IMGT 위치 26)로 이루어지는 경우, 129D/E/R/H/K(IMGT 위치 18)에는 상응하는 LC 치환이 없음;
    (g) CH1 치환이 124K/E/R/D로 이루어지는 경우, 176에는 상응하는 LC 치환이 없음;
    (h) CH1 치환이 133V, 150A, 150D, 152D, 173D, 및/또는 188W로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환이 없음;
    (i) CH1 치환이 133S/W/A, 139W/V/G/I, 143K/E/A, 145E/T/L/Y, 146G, 147T/E, 174V, 1175D/R/S, 179K/D/R, 181R, 186R, 188F/L, 및/또는 190S/A/G/Y로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환이 없음;
    (j) CH1 치환이 143A/E/R/K/D 및 145T/L로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환이 없음;
    (k) CH1 치환이 124A/R/E/W, 145M/T, 143E/R/D/F, 172R/T 및 139W/G/C, 179E, 및/또는 186R로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 치환이 없음;
    (l) CH1 치환이 126, 127, 128, 134, 141, 171, 또는 173에서 시스테인과 치환되는 것으로 이루어지는 경우, 상응하는 LC 위치는 이황화 결합을 형성하도록 변형되지 않음;
    (m) CH1 치환이 L145Q, H168A, F170G, S183V, 및 T187E로 이루어지는 경우, 상응하는 카파 또는 람다 LC 치환이 없음;
    (n) CH1 치환이 143D/E, 145T, 190E/D, 및/또는 124R로 이루어지는 경우, 상응하는 CL 치환이 없음; 또는
    (o) CH1 치환이 A140C, K147C, 및/또는 S183C로 이루어지는 경우, 상응하는 CL 치환이 있음.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 CH1 도메인 변이체의 라이브러리는
    (I) 효모 균주;
    (II) 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae);
    (III) (i) 카파 CL 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 및 (ii) 람다 CL 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 공발현하는 세포 시스템에서 발현되며, 임의로 카파 및/또는 람다 CL 도메인은 야생형이고,
    또한 임의로 카파 및/또는 람다 CL 도메인은 인간인, 방법.
  49. CH1 도메인 변이체 라이브러리를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) EU 넘버링에 따른 다음 CH1 아미노산 위치 중 하나 이상을 선택하는 단계: 118, 119, 124, 126~134, 136, 138~143, 145, 147~154 , 163, 168, 170~172, 175, 176, 181, 183~185, 187, 190, 191, 197, 201, 203~206, 208, 210~214, 216, 및 218,
    (b) (a) 단계에서 선택된 위치(들)와 상이한 하나 이상의 관심 CH1 아미노산 위치를 선택하는 단계; 및
    (c) CH1 도메인 변이체 폴리펩티드의 라이브러리 또는 CH1 도메인 변이체 암호화 작제물의 라이브러리를 생산하는 단계로서, 단계 (a) 및 (b)에서 선택된 하나 이상의 아미노산 위치 중 하나 이상은 임의의 비야생형 아미노산으로 치환되는, 단계를 포함하되,
    임의로,
    (I) (a)에서 선택된 아미노산 위치(들)는 위치 141, 147, 151, 170, 171, 181, 183, 185, 187, 또는 218, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하고;
    (II) (c)에서의 상기 생산하는 단계는 퇴화 코돈, 임의로 6개의 자연 발생 아미노산(D, T, A, E, K, 및 N)을 나타내는 퇴화 RMW 코돈, 또는 20개의 자연 발생 아미노산 잔기 모두를 나타내는 퇴화 NNK 코돈을 통해 이루어지고/지거나;
    (III) 단계 (c)에서, 단계 (a)에서 선택된 아미노산 위치(들)는 소정의 아미노산으로 치환되고, 단계 (b)에서 선택된 아미노산 위치(들)는 퇴화 코돈을 통해 치환되며, 임의로 단계 (a)에서 소정의 아미노산으로의 치환은 A141D, A141E, K147F, P151A, P151L, F170E, P171E, S181K, S183R, V185R, T187R, 또는 K218P, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  50. (A) 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 비교해 카파 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되거나;
    (B) 카파 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 비교해 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되는 하나 이상의 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드를 식별하는 방법으로서,
    상기 방법은:
    (a) 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항의 방법을 통해 생성된 CH1 도메인 변이체 라이브러리 유래의 하나 이상의 후보 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드를 (i) 카파 CL 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 및 (ii) 람다 CL 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드와 공발현하는 단계;
    (b) (i) 카파 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 페어링된 후보 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드의 양과 (ii) 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 페어링된 후보 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드의 양을 비교하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서의 비교에 기초하여,
    (A) 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 비교해 카파 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되거나;
    (B) 카파 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 비교해 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 우선적으로 페어링되는 하나 이상의 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드를 선택하는 단계를 포함하며,
    단계 (a)에서 임의로, 후보 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드의 발현된 총량 및 (카파 및 람다) CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 발현된 총량은 대략 동일하고,
    임의로, 단계 (a)에서, 후보 CH1 도메인 변이체 폴리펩티드, 카파 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 및 람다 CL 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 대략 2:1:1의 비율로 발현되는, 방법.
  51. 제50항에 있어서,
    단계 (a)에서, 상기 (i) 카파 CL 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 및 (ii) 람다 CL 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드는 야생형 및/또는 인간인, 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 단계 (b)에서, 양은 형광 활성화 세포 분류를 통하거나 액체 크로마토그래피-질량 분광분석을 통해 결정되는, 방법.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 (d) 하나 이상의 대조군 CH1 도메인 변이체를 (i) 카파 CL 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 및 (ii) 람다 CL 도메인을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드와 공발현하는 단계를 추가로 포함하되, 임의로, 상기 하나 이상의 대조군 CH1 도메인 변이체 중 하나 이상은 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 CH1 도메인 변이체에 따른 것인, 방법.
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