JP2022550172A

JP2022550172A - 優先的な軽鎖の対合のために操作されたｃｈ１ドメインバリアント、およびそれを含む多重特異性抗体

Info

Publication number: JP2022550172A
Application number: JP2022519793A
Authority: JP
Inventors: シバスブラマニアン，アルビンド; シュッツ，ケビン; ヘルブレ，ミカエラ; クローランド，エリック; ウィドブーム，ポール
Original assignee: Adimab LLC
Current assignee: Adimab LLC
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2022-11-30
Also published as: MX2022003744A; EP4021939A2; CN114846027A; EP4021939A4; US20230265134A1; IL291728A; WO2021067404A2; BR112022005995A2; CA3152460A1; KR20220107163A; AU2020357944A1; WO2021067404A3

Abstract

カッパＣＬドメインまたはラムダＣＬドメインのいずれかへの優先的な結合のために操作されたＣＨ１ドメインバリアント、ならびにかかる操作されたＣＨ１ドメインバリアントを含む、例えば抗体重鎖または抗体などのポリペプチド、ならびにかかるＣＨ１ドメインバリアントおよび／またはかかるポリペプチドを含む医薬組成物、ならびにかかるＣＨ１ドメインバリアントを作製および使用する方法を、提供する。このＣＨ１ドメインバリアントは、重鎖－軽鎖の誤対合を最小化し、そして同族の重鎖－軽鎖の対合を促進し、それによって多重特異性、例えば二重特異性の、抗体の生成を向上させる。また、ＣＨ１ドメインバリアントライブラリーを作製する方法、および一つまたは複数のＣＨ１ドメインバリアントを特定する方法もまた提供する。【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、２０１９年９月３０日に出願された、発明の名称を「優先的な軽鎖の対合のために操作されたＣＨ１ドメインバリアント、およびそれを含む多重特異性抗体（ＣＨ１ＤＯＭＡＩＮＶＡＲＩＡＮＴＳＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤＦＯＲＰＲＥＦＥＲＥＮＴＩＡＬＬＩＧＨＴＣＨＡＩＮＰＡＩＲＩＮＧＡＮＤＭＵＬＴＩＳＰＥＣＩＦＩＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＣＯＭＰＲＩＳＩＮＧＴＨＥＳＡＭＥ）」とする米国仮特許出願第６２／９０８，３６７号に対する優先権を主張するものであり、当該内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。

本発明は、適切な重鎖－軽鎖対合を促進する少なくとも一つのアミノ酸置換を含有するＣＨ１ドメインバリアント、およびそれを含む抗体重鎖および抗体、特に多重特異性抗体、に関する。本発明はさらに、かかる抗体を含む組成物およびその使用、例えば、治療薬または診断法に関する。本発明はさらに、ＣＨ１ドメインバリアントライブラリーを作製する方法、および一つ以上のＣＨ１ドメインバリアントを特定する方法に関する。

複数の抗原結合特異性、例えば二重特異性の抗体を有する抗体治療薬を開発するための継続的な努力がある。二重特異性抗体は、がん、炎症過程、または他の疾患状態に関連する複数の表面受容体に干渉するために使用することができる。二重特異性抗体を使用して、標的を近接に配置し、タンパク質複合体形成を調節するか、または細胞間の接触を駆動することもできる。二重特異性抗体の産生は、１９６０年代初頭に初めて報告され（Ｎｉｓｏｎｏｆｆｅｔａｌ．，ＡｒｃｈＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ１９６１９３（２）：４６０－４６２）、最初のモノクローナル二重特異性抗体は、１９８０年代にハイブリドーマ技術を使用して生成された（Ｍｉｌｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ１９８３３０５（５９３４）：５３７－５４０）。二重特異性抗体に対する関心は、その治療能力のために過去十年間で著しく増大し、現在臨床で二重特異性抗体が使用されている。例えば、ブリナツモマブおよびエミシズマブは、特定のがんの治療のために承認されている（二重特異性抗体産生方法および医薬用途で承認された二重特性抗体の特徴の近年のレビューに関して、Ｓｅｄｙｋｈｅｔａｌ．，ＤｒｕｇＤｅｓＤｅｖｅｌＴｈｅｒ１２：１９５－２０８（２０１８）およびＬａｂｒｉｊｎｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ１８：５８５－６０８（２０１９）を参照されたい）。

二重特異性抗体は、単一特異性抗体を大幅に超える利益を示している一方で、二重特異性抗体の広範な商業的応用は、効率的／低コストである産生方法がないこと、二重特異性抗体の安定性の欠落、およびヒトにおいて半減期が短いことにより阻害されている。二重特異性抗体の産生を改善するための多岐にわたる方法が、過去数十年にわたり開発されている。これらには、異なる特異性を有する二つの免疫グロブリンの重鎖－軽鎖対の組換え共発現（ＭｉｌｓｔｅｉｎａｎｄＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ３０５：５３７（１９８３））、国際公開第９３／０８８２９号、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．１０：３６５５（１９９１）を参照）、「ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ」エンジニアリング（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号）、免疫グロブリンクロスオーバー技術（Ｆａｂドメイン交換またはＣｒｏｓｓＭａｂ形式としても知られている）（例えば、国際公開第２００９／０８０２５３号；Ｓｃｈａｅｆｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０８：１１１８７－１１１９２（２０１１）を参照）、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子の作製に関する静電ステアリング効果のエンジニアリング（国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号）、二つ以上の抗体または断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、およびＢｒｅｎｎａｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）、ロイシンジッパー（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）を参照）、「ダイアボディ」技術（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体（例えば、Ｇｒｕｂｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５３６８（１９９４）を参照）、ならびに例えば、Ｔｕｔｔｅｔａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１４７：６０（１９９１）に記載される三重特異性抗体、が含まれる。

これらの改善にもかかわらず、正確な重鎖－軽鎖対合である二重特異性抗体の生成は依然として課題である。二重特異性抗体は、二つの異なる重鎖および二つの異なる軽鎖の共発現によって形成され得る。重鎖は、比較的無差別な様式で軽鎖に結合するように進化してきたため、所望の形式の二重特異性抗体を適切に形成することは依然として課題である。結果として、二つの重鎖と二つの軽鎖の共発現は、重鎖－軽鎖対合のスクランブル－十六種の可能な組み合わせの複雑な混合物、をもたらし得、それは十種の異なる抗体を表し、そのうち一種のみが所望の二重特異性抗体に相当する（完全な乱雑性がある場合、混合物中の最大収率１２．５％）。均質な対合は、製造可能性および有効性に不可欠であるため、この誤対合（鎖対合問題とも呼ぶ）は、二重特異性抗体の生成に関する主要な課題のままである。

誤対合を軽減するために使用される一つの戦略は、共通の軽鎖を有する二重特異性抗体を生成することである（例えば、Ｍｅｒｃｈａｎｔｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７－６８１（１９９８）を参照）。あるいは、単一の共通の重鎖と二つの異なる軽鎖（一つのカッパおよび一つのラムダ）とを使用してもよい（例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎ．６：６１１３（２０１５）を参照）。しかしながら、この戦略は、共通鎖を有する抗体を特定することを必要とし、これは困難であり、また各結合アームの特異性を損なう傾向があり、実質的に多様性が低減する（例えば、Ｗａｎｇｅｔａｌ．，ＭＡＢＳ１０（８）：１２２６－１２３５（２０１８）を参照）。

正確な重鎖－軽鎖の対合を改善するための他のアプローチとしては、一つの抗原結合断片（Ｆａｂ）アームの軽鎖またはその中のサブドメインの一つが、重鎖Ｆｄ領域の対応する領域と交換されるＣｒｏｓｓＭａｂ技術（Ｒｏｃｈｅ社）、および一つのＦａｂアームの本来のジスルフィド結合が、操作されたジスルフィド結合で置換されるＤｕｅｔＭａｂ技術（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ社）が挙げられる。しかしながら、これらのアプローチは、天然の抗体に適切に類似しない化合物をもたらし得る、本来のＩｇＧ形式への大幅な変更を必要とする。

別の戦略は、重鎖および軽鎖の誤対合を低減または除去するために、ＩｇＧ形式の重鎖および軽鎖の定常領域および／または可変領域内のアミノ酸置換を利用することである。発明者らの知る限り、ＣＨ１ドメインのみを改変することは、多重特異性抗体の発現中にしばしば観察される鎖対合または誤対合の問題を解決することがこれまでに実証されていない。むしろ、ＣＨ１ドメインバリアントを含むように操作された多重特異性抗体は、ＣＬドメインならびに特定の例ではＶＨ、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＶＬドメインなどの鎖対合問題に対処するために、ＣＨ１ドメインの外側での改変もさらに必要とされた。その例としては、Ｌｅｗｉｓｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．３２（２）：１９１－１９８（２０１４）が挙げられ、Ｌｅｗｉｓらは、改変された重鎖および軽鎖の優先的な対合を駆動し、そして野生型定常ドメインを有する重鎖および軽鎖ドメインの対合を妨げる試みにおいて、変異ＣＨ１およびＣＬドメイン、ＣＲＤ１（Ｄ１４８Ｋ、Ｆ１７０Ｔ、Ｖ１８５Ｆでの重鎖置換、および軽鎖置換Ｋ１２９Ｄ、Ｌ１３５Ｆによる；ＥＵ番号付け）およびＣＲＤ２（重鎖置換Ｈ１６８ＡおよびＦ１７０Ｔ、ならびに軽鎖置換Ｌ１３５Ｙ、Ｓ１７６Ｗによる）を生成した。しかしながら、Ｌｅｗｉｓらは、可変ドメインの不存下での変異ＣＨ１およびＣＬドメインにより得られたあらゆる対合特異性を、ＶＨ－ＶＬ界面内のさらなる操作なしには全長ＩｇＧ形式に翻訳しなかった、すなわち優先的な重鎖－軽鎖対合を達成するために、ＶＨ－ＶＬ界面内の置換が、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメイン置換と共に必要であったことを報告した。電荷をもつアミノ酸残基を含有するようにＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインを操作することも、優先的な重鎖－軽鎖対合を促進するとされている（例えば、米国特許第１０，０４７，１６３号を参照）。一つのＦａｂ断片が、優先的な対合を駆動するようにＣＨ１ドメインおよびＣκドメイン内の置換を有しているものである、異なるＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインをもつ少なくとも二つのＦａｂ断片を有する二重特異性抗体も知られている（ＣＨ１：Ｔ１８７ＥおよびＣκ：Ｎ１３７Ｋ＋Ｓ１１４Ａ、ＣＨ１：Ｌ１４５Ｑ＋Ｓ１８３ＶおよびＣκ：Ｖ１３３Ｔ＋Ｓ１７６Ｖ、ＣＨ１：Ｌ１２８Ａ＋Ｌ１４５ＥおよびＣκ：Ｖ１３３Ｗ、ＣＨ１：Ｖ１８５ＡおよびＣκ：Ｌ１３５Ｗ＋Ｎ１３７Ａを開示する、米国特許出願公開第２０１８００２２８２９号および米国特許第９，６３１，０３１号を参照）。軽鎖、または場合によってはＣＨ２、ＣＨ３、および／もしくはＶＨが優先的な重鎖－軽鎖対合を促進するように適切に置換される場合、優先的な重鎖－軽鎖対合を促進すると主張される特定のＣＨ１ドメイン置換のさらなる例としては、以下が挙げられる：Ａ１４１Ｃ／Ｌ、Ｋ１４７Ｄ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｋ、または１２８、１２９、１６２、もしくは１７１位におけるシステインでの置換（国際公開第２０１９１８３４０６号（ＩｎｖｅｎｒａＩｎｃ．社））；１２６位もしくは２２０位におけるシステインの置換はバリンもしくはアラニンで置換され、または１２８位、１４１位、もしくは１６８位における非システインの置換はシステインで、Ｌ１４５Ｆ、Ｋ１４７Ａ、Ｆ１７０Ｖ、Ｓ１８３Ｆ、もしくはＶ１８５Ｗ／Ｆで置換されている（米国特許第９，５２７，９２７号（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ社））；１７２Ａおよび１７４Ｇ（国際公開第２０２００６０９２４号（Ｄｕａｌｏｇｉｃｓ社））；Ａ１７２Ｒおよび１７４Ｇ、または残基１９０のＭまたはＩへの置換（米国特許第１０，０４７，１６７号（ノースカロライナ大学ＣｈａｐｅｌＨｉｌｌおよびＥｌｉＬｉｌｌｙ））；Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｉ／Ｍ／Ｔ／Ｌ、Ｆ１７０Ｓ／Ａ／Ｙ／Ｍ、Ｓ１８１Ｍ／Ｉ／Ｔ、Ｓ１８３Ａ／Ｅ／Ｋ／ＶおよびＶ１８５Ａ／Ｌ（米国特許出願公開第２０１８０１７７８７３号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社））；１３１Ｃ／Ｓ、１３３Ｒ／Ｋ、１３７Ｅ／Ｇ、１３８Ｓ／Ｇ１７８Ｓ／Ｙ、１９２Ｎ／Ｓ、および／または１９３Ｆ／Ｌ（米国特許第１０，４８７，１５６号（ＡｒｇｅｎｘＢＶＢＡ社））；１４５Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ｈ／Ｋ（ＩＭＧＴ位置２６）（国際公開第２０１８１４１８９４号（Ｍｅｒｃｋ社））；１２４Ｋ／Ｅ／Ｒ／Ｄ（米国特許第１０，３９２，４３８号（Ｐｆｉｚｅｒ社））；１３３Ｖ、１５０Ａ、１５０Ｄ、１５２Ｄ、１７３Ｄ、または１８８Ｗ（米国特許出願公開第２０１９００２３８１０号（ＭＩＴ））；１３３Ｓ／Ｗ／Ａ、１３９Ｗ／Ｖ／Ｇ／Ｉ、１４３Ｋ／Ｅ／Ａ、１４５Ｅ／Ｔ／Ｌ／Ｙ、１４６Ｇ、１４７Ｔ／Ｅ、１７４Ｖ、１７５Ｄ／Ｒ／Ｓ、１７９Ｋ／Ｄ／Ｒ、１８１Ｒ、１８６Ｒ、１８８Ｆ／Ｌ、および／または１９０Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｙ（米国特許出願公開第２０１８０１７９２９６号および米国特許第９，９１４，７８５（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ社））；１４３Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｋ／Ｄおよび１４５Ｔ／Ｌ（米国特許第１０，０７７，２９８号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ社））；１２４Ａ／Ｒ／Ｅ／Ｗ、１４５Ｍ／Ｔ、１４３Ｅ／Ｒ／Ｄ／Ｆ、１７２Ｒ／Ｔ、１３９Ｗ／Ｇ／Ｃ、１７９Ｅ、または１８６Ｒ（米国特許出願公開第２０１７０２０４１９９号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ社））；１２６、１２７、１２８、１３４、１４１、１７１、または１７３位におけるシステインでの置換（全薬工業社）；Ｌ１４５Ｑ、Ｈ１６８Ａ、Ｆ１７０Ｇ、Ｓ１８３Ｖ、およびＴ１８７Ｅ（国際公開第２０２０１２７３５４号（ＡｌｌｉｇａｔｏｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社））；１４３Ｄ／Ｅ、１４５Ｔ、１９０Ｅ／Ｄおよび１２４Ｒ（国際公開第２０１７／０５９５５１号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ社））が挙げられる。また、米国特許第９，１５０，６３９号、協和発酵キリン社は、化学調節を可能にするシステインを導入する目的で、Ａ１４０Ｃ、Ｋ１４７Ｃ、またはＳ１８３Ｃを含む重鎖を生成したと報告している。協和発酵キリン社は、これらの重鎖変異を含有する抗体バリアントは、野生型軽鎖を含む可能性があることを示唆しているが、このことが優先的な重鎖－軽鎖対合を促進するだろうという指摘はない。

重鎖－軽鎖の誤対合を最小化するために使用されるさらに別の戦略は、異なる軽鎖、例えば異なる定常ドメインを有する軽鎖、を利用することである。例えば、Ｌｏｅｗらは、カッパ軽鎖とラムダ軽鎖とを有する多重特異性抗体を生成して、最小限の誤対合が観察されたが、これはある一定の天然由来のカッパ軽鎖が高い正確性（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）を有し、またラムダ抗体由来の重鎖と対合せず、そしてその逆も同じであるためである（国際公開第２０１８０５７９５５号）。残念ながら、この方法論の適用可能性は、高い正確性を有する当該軽鎖に限定される。他の者は、重鎖および軽鎖の両方でアミノ酸置換を利用して優先的な対合を静電気的または立体構造的に駆動するものであるカッパおよびラムダ軽鎖を使用して、多重特異性抗体を生成してきた（例えば、国際公開第２０１７０５９５５１号（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ社）、米国特許出願公開第２０１４０１５４２５４号（Ａｍｇｅｎ社）および米国特許第１０，０４７，１６３号（ＡｂｂＶｉｅＳｔｅｍｃｅｎｔｒｘ社）を参照）。しかしながら、重鎖および軽鎖の両方に多数のアミノ酸置換を導入することは、さらなる技術的ハードルとなり、さらに、抗体の機能および／または免疫原性に有害な影響を有し得る。

本発明の目的は、適切な重鎖－軽鎖対合を有する操作された二重特異性抗体を提供することである。一態様では、重鎖と、特定の軽鎖との優先的な対合を促進するＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド（本明細書ではＣＨ１ドメインバリアントとも呼ぶ）、およびそれを含む、抗体などのポリペプチドが本明細書において提供される。当該ＣＨ１ドメインバリアントは、少なくとも一つのアミノ酸置換（例えば、野生型などの親の配列に対して）を含有する。

一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントは、軽鎖のＣＬドメインとの界面を形成するＣＨ１ドメイン位置に少なくとも一つのアミノ酸置換を含有するが、それには、１４０位および／または１４１位または１４７位および／または１８３位（ＥＵ番号付け）が含まれるがこれに限定されない。この置換は、特定の軽鎖とのＣＨ１ドメインバリアント含有重鎖の優先的な対合を促進し、例えば、ＣＨ１ドメインバリアントの１４１が、カッパＣＬドメインとは対照的にラムダＣＬドメインと優先的に対合するのに対し、ＣＨ１ドメインバリアントの１４７Ｆおよび／または１８３Ｒ、１８３Ｋまたは１８３Ｙは、ラムダＣＬドメインとは対照的にカッパＣＬドメインと優先的に対合する。

一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントは、ＣＨ１ドメインとＶＨとの界面を形成するＣＨ１ドメイン位置に、例えばＣＨ１の１５１位（ＥＵ番号付け）等に少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する。

定常ドメインのこの優先的な対合は、例えば可変ドメインである全長の軽鎖と重鎖との対合を駆動し、それによって二重特異性に対する鎖対合問題の解決策を生じることが期待される。特に、ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って、１１８、１１９、１２４、１２６～１３４、１３６、１３８～１４３、１４５、１４７～１５４、１６３、１６８、１７０～１７２、１７５、１７６、１８１、１８３～１８５、１８７、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２０８、２１０～２１４、２１６、および２１８位のうちの一つまたは複数の位置にアミノ酸置換を含む。任意で、こうしたＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、（ｉ）ラムダＣＬドメインと比較して、カッパ軽鎖定常領域（「ＣＬ」）ドメインと、および／またはラムダ軽鎖ポリペプチドと比較して、カッパ軽鎖ポリペプチドと、（ｉｉ）カッパＣＬドメインと比較して、ラムダＣＬドメインと、および／またはカッパ軽鎖ポリペプチドと比較して、ラムダ軽鎖ポリペプチドと、優先的に対合する。

任意で、一部の実施形態では、特定のＣＨ１ドメインバリアントは除外されてもよく、また本発明によるＣＨ１ドメインバリアントは、以下を満たすことができる：

（ａ）ＣＨ１上の残基１４１がＣもしくはＬで置換される場合、残基１６６がＤもしくはＫで置換される場合、ＣＨ１上の残基１２８、１２９、１６２、もしくは１７１がＣで置換される場合、および／もしくは残基１４７がＤで置換される場合、当該ＣＨ１ドメインバリアントにより優先的に対合される当該ＣＬドメインは、アミノ酸置換を含まない；

（ｂ）ＣＨ１上の１２６もしくは２２０位がバリンもしくはアラニンで置換される場合、１２８、１４１、もしくは１６８位における非システインがシステインで置換される場合、もしくはＣＨ１置換がＬ１４５Ｆ、Ｋ１４７Ａ、Ｆ１７０Ｖ、Ｓ１８３Ｆ、もしくはＶ１８５Ｗ／Ｆである場合、当該ＣＨ１ドメインバリアントにより優先的に対合される当該ＣＬドメインは、アミノ酸置換を含まない；

（ｃ）ＣＨ１上の残基１７２が１７２Ｒに置換される場合、残基１７４が１７４Ｇに変異される場合、もしくは残基１９０が１９０Ｍもしくは１９０Ｉに置換される場合、これらは、上記ＣＨ１が含む唯一の置換ではない；

（ｄ）ＣＨ１置換が、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｉ／Ｍ／Ｔ／Ｌ、Ｆ１７０Ｓ／Ａ／Ｙ／Ｍ、Ｓ１８１Ｍ／Ｉ／Ｔ、Ｓ１８３Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｖ、および／もしくはＶ１８５Ａ／Ｌからなる場合、当該ＣＨ１ドメインバリアントにより優先的に対合される当該ＣＬドメインは、改変されていない；

（ｅ）ＣＨ１置換が、１３１Ｃ／Ｓ、１３３Ｒ／Ｋ、１３７Ｅ／Ｇ、１３８Ｓ／Ｇ、１７８Ｓ／Ｙ、１９２Ｎ／Ｓ、および／もしくは１９３Ｆ／Ｌからなる場合、これらは、唯一のＣＨ１置換ではなく、および／もしくは二重特異性抗体において、ＣＨ１ドメインが、同一のヒト免疫グロブリンのサブタイプもしくはアロタイプのものである；

（ｆ）ＣＨ１置換が、１４５Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ｈ／Ｋ（ＩＭＧＴ位置２６）からなる場合、対応するＬＣ置換、１２９Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ｈ／Ｋ（ＩＭＧＴ位置１８）は存在しない；

（ｇ）ＣＨ１置換が、１２４Ｋ／Ｅ／Ｒ／Ｄからなる場合、当該ＣＨ１ドメインバリアントにより優先的に対合されるＬＣの１７６位において対応する置換は存在しない；

（ｈ）ＣＨ１置換が、１３３Ｖ、１５０Ａ、１５０Ｄ、１５２Ｄ、１７３Ｄ、および／もしくは１８８Ｗからなる場合、当該ＣＨ１ドメインバリアントにより優先的に対合されるＬＣ内に対応する置換は存在しない；

（ｉ）ＣＨ１置換が、１３３Ｓ／Ｗ／Ａ、１３９Ｗ／Ｖ／Ｇ／Ｉ、１４３Ｋ／Ｅ／Ａ、１４５Ｅ／Ｔ／Ｌ／Ｙ、１４６Ｇ、１４７Ｔ／Ｅ、１７４Ｖ、１７５Ｄ／Ｒ／Ｓ、１７９Ｋ／Ｄ／Ｒ、１８１Ｒ、１８６Ｒ、１８８Ｆ／Ｌ、および／もしくは１９０Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｙからなる場合、当該ＣＨ１ドメインバリアントにより優先的に対合されるＬＣ内に対応する置換は存在しない；

（ｊ）ＣＨ１置換が、１４３Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｋ／Ｄおよび１４５Ｔ／Ｌからなる場合、当該ＣＨ１ドメインバリアントにより優先的に対合されるＬＣ内に対応する置換は存在しない；

（ｋ）ＣＨ１置換が、１２４Ａ／Ｒ／Ｅ／Ｗ、１４５Ｍ／Ｔ、１４３Ｅ／Ｒ／Ｄ／Ｆ、１７２Ｒ／Ｔおよび１３９Ｗ／Ｇ／Ｃ、１７９Ｅおよび／もしくは１８６Ｒからなる場合、当該ＣＨ１ドメインバリアントにより優先的に対合されるＬＣ内に対応する置換は存在しない；

（ｌ）ＣＨ１置換が、１２６位、１２７位、１２８位、１３４位、１４１位、１７１位、もしくは１７３位においてシステインで置換することからなる場合、対応するＬＣ位置は、ジスルフィド結合を形成するように改変されていない；

（ｍ）ＣＨ１置換が、Ｌ１４５Ｑ、Ｈ１６８Ａ、Ｆ１７０Ｇ、Ｓ１８３Ｖおよび／もしくはＴ１８７Ｅからなる場合、当該ＣＨ１ドメインバリアントにより優先的に対合されるカッパＬＣまたはラムダＬＣ内に対応する置換は存在しない；

（ｎ）ＣＨ１置換が、１４３Ｄ／Ｅ、１４５Ｔ、１９０Ｅ／Ｄ、および／もしくは１２４Ｒからなる場合、当該ＣＨ１ドメインバリアントにより優先的に対合されるＬＣ内に対応する置換は存在しない；または

（ｏ）ＣＨ１置換が、Ａ１４０Ｃ、Ｋ１４７Ｃおよび／もしくはＳ１８３Ｃからなる場合、当該ＣＨ１ドメインバリアントにより優先的に対合されるＬＣ内に置換が存在する。

一部の実施形態においては、ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って、１１８、１２４、１２６～１２９、１３１、１３２、１３４、１３６、１３９、１４３、１４５、１４７～１５１、１５３、１５４、１７０、１７２、１７５、１７６、１８１、１８３、１８５、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２１０、２１２～２１４、および２１８位のうちの一つまたは複数の位置にアミノ酸置換を含む。任意でそれによってＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドが、（ｉ）ラムダＣＬドメイン（またはラムダＣＬ含有ポリペプチド）と比較して、カッパＣＬドメイン（またはカッパＣＬ含有ポリペプチド）と；および／または（ｉｉ）ラムダ軽鎖ポリペプチドと比較して、カッパ軽鎖ポリペプチドと、優先的に対合する。

ある実施形態では、こうしたＣＨ１ドメインバリアントは、１４７位、１８３位、または１４７位および１８３位においてアミノ酸置換を含む。

ある実施形態では、こうしたＣＨ１ドメインバリアントは、以下のアミノ酸置換のうちの一つまたは複数を含む：１１８位は、Ｇで置換される、１２４位は、Ｈ、Ｒ、Ｅ、Ｌ、またはＶで置換される、１２６位は、Ａ、Ｔ、またはＬで置換される、１２７位は、Ｖ、またはＬで置換される、１２８位は、Ｈで置換される、１２９位は、Ｐで置換される、１３１位は、Ａで置換される、１３２位は、Ｐで置換される、１３４位は、Ｇで置換される、１３６位は、Ｅで置換される、１３９位は、Ｉで置換される、１４３位は、Ｖ、またはＳで置換される、１４５位は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、またはＴで置換される、１４７位は、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｙ、Ｑ、Ａ、またはＧで置換される、１４８位は、Ｉ、Ｑ、Ｙ、またはＧで置換される、１４９位は、Ｃ、Ｓ、またはＨで置換される、１５０位は、Ｌ、またはＳで置換される、１５１位は、Ａ、またはＬで置換される、１５３位は、Ｓで置換される、１５４位は、Ｍ、またはＧで置換される、１７０位は、Ｇ、またはＬで置換される、１７２位は、Ｖで置換される、１７５位は、Ｇ、Ｌ、Ｅ、Ａで置換される、１７６位は、Ｐで置換される、１８１位は、Ｙ、Ｑ、またはＧで置換される、１８３位は、Ｉ、Ｗ、Ｆ、Ｅ、Ｙ、Ｌ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、Ｒ、またはＨで置換される、１８５位は、Ｗで置換される、１９０位は、Ｐで置換される、１９１位は、Ｉで置換される、１９７位は、Ａで置換される、２０１位は、Ｓで置換される、２０３位は、Ｓで置換される、２０４位は、Ｙで置換される、２０５位は、Ｑで置換される、２０６位は、Ｓで置換される、２１０位は、Ｒで置換される、２１２位は、Ｇで置換される、２１３位は、Ｅ、またはＲで置換される、２１４位は、Ｒで置換される、および、２１８位は、Ｑで置換される。
ある実施形態では、カッパ優先的なＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、（ｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｙ、もしくはＱを；および／または（ｉｉ）１８３位においてアミノ酸残基Ｉ、Ｗ、Ｆ、Ｅ、Ｙ、Ｌ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、もしくはＲを含み得る。

カッパ優先的なＣＨ１ドメインバリアントの一部の好ましい実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、（ｉ）１８３位においてアミノ酸残基Ｒ、Ｋ、もしくはＹを、および／または（ｉｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆを含み得る。

さらなる実施形態において、ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、（ｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆおよび１８３位においてアミノ酸残基Ｒ、（ｉｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆおよび１８３位においてアミノ酸残基Ｋ、（ｉｉｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆおよび１８３位においてアミノ酸残基Ｙ、（ｉｖ）１８３位においてアミノ酸残基Ｒ、（ｖ）１８３位においてアミノ酸残基Ｋ、または（ｖｉ）１８３位においてアミノ酸残基Ｙを含む。任意で、こうしたＣＨ１ドメインバリアントは、（ｉ）配列番号１３７、（ｉｉ）配列番号１３８、（ｉｉｉ）配列番号１３９、（ｉｖ）配列番号６０、（ｖ）配列番号４１、または（ｖｉ）配列番号１３６、のアミノ酸配列を含み得る。

一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、ＣＨ１とＶＨとの間の界面内のＣＨ１アミノ酸位置においてアミノ酸置換を含む。任意で、こうした界面内のＣＨ１アミノ酸位置は、１５１位である。さらに任意で、こうしたＣＨ１ドメインバリアントは、１５１位にアミノ酸残基ＡまたはＬを含み得る。

一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、（ｉ）ラムダＣＬドメインと比較して、カッパＣＬドメインとの、および／または（ｉｉ）ラムダ軽鎖ポリペプチドと比較して、カッパ軽鎖ポリペプチドとの、ＣＨ１ドメインの対合を増加させる一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む。

いくつかの実施形態では、請求項２～１０のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドであり、（ｉ）ラムダＣＬドメインと比較して、カッパＣＬドメインとの対合の、および／または（ｉｉ）ラムダ軽鎖ポリペプチドと比較して、カッパ軽鎖ポリペプチドとの対合の、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の増加をもたらす。カッパ対合の増加は、任意で、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣＭＳ）によって測定されてもよい。

いくつかの実施形態では、請求項２～１０のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドであり、（ｉ）ラムダＣＬドメインと比較して、カッパＣＬドメインとの対合の、および／または（ｉｉ）ラムダ軽鎖ポリペプチドと比較して、カッパ軽鎖ポリペプチドとの対合の、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２１倍、少なくとも２２倍、少なくとも２３倍、少なくとも２４倍、または少なくとも２５倍の増加をもたらす。カッパ対合の増加は、例えば、カッパＣＬ染色のラムダＣＬ染色に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比を比較することによって、フローサイトメトリーによって任意に定量化されてもよい。

一部の実施形態においては、本発明によるＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、ＥＵ番号付けに従って、１１９、１２４、１２６、１２７、１３０、１３１、１３３、１３４、１３８～１４２、１５２、１６３、１６８、１７０、１７１、１７５、１７６、１８１、１８３～１８５、１８７、１９７、２０３、２０８、２１０～２１４、２１６、および２１８位のうちの一つまたは複数の位置にアミノ酸置換を含む。任意で、ＣＨ１ドメインバリアントは、（ｉ）カッパＣＬドメインと比較して、ラムダＣＬドメインと、および／または（ｉｉ）カッパ軽鎖ポリペプチドと比較して、ラムダ軽鎖ポリペプチドと、優先的に対合する。

ある実施形態では、ラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、１４１、１７０、１７１、１７５、１８１、１８４、１８５、１８７、および２１８位のうちの一つまたは複数の位置においてアミノ酸置換を含む。

ある実施形態では、ラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、以下のアミノ酸置換のうちの一つまたは複数を含む：１１９位は、Ｒで置換される、１２４位は、Ｖで置換される、１２６位は、Ｖで置換される、１２７位は、Ｇで置換される、１３０位は、Ｈ、またはＳで置換される、１３１位は、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、またはＤで置換される、１３３位は、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｅ、Ｓ、またはＰで置換される、１３４位は、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｖ、Ｎ、またはＬで置換される、１３８位は、Ｒで置換される、１３９位は、Ａで置換される、１４０位は、Ｉ、Ｖ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、Ｓ、Ｗ、Ｒ、Ｌ、またはＰで置換される、１４１位は、Ｄ、Ｋ、Ｅ、Ｔ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、またはＭで置換される、１４２位は、Ｍで置換される、１５２位は、Ｇで置換される、１６３位は、Ｍで置換される、１６８位は、Ｆ、Ｉ、またはＶで置換される、１７０位は、Ｎ、Ｇ、Ｅ、Ｓ、またはＴで置換される、１７１位は、Ｎ、Ｅ、Ｇ、Ｓ、Ａ、またはＤで置換される、１７５位は、Ｄ、またはＭで置換される、１７６位は、Ｒ、またはＭで置換される、１８１位は、Ｖ、Ｌ、Ａ、Ｋ、またはＴで置換される、１８３位は、Ｌ、またはＶで置換される、１８４位は、Ｒで置換される、１８５位は、Ｍ、Ｌ、Ｓ、Ｒ、またはＴで置換される、１８７位は、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、またはＳで置換される、１９７位は、Ｓで置換される、２０３位は、Ｄで置換される、２０８位は、Ｉで置換される、２１０位は、Ｔで置換される、２１１位は、Ａで置換される、２１２位は、Ｎで置換される、２１３位は、Ｅで置換される、２１４位は、Ｒで置換される、２１６位は、Ｇで置換される、および、２１８位は、Ｌ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｉ、Ｍ、Ｇ、Ｃ、Ｋ、またはＷで置換される。

さらにある実施形態では、ラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、以下の（ｉ）～（ｘｖｉｉ）のうちのいずれか一つまたは複数を含む：（ｉ）１２６位にアミノ酸残基Ｖ；（ｉｉ）１２７位にアミノ酸残基Ｇ、（ｉｉｉ）１３１位にアミノ酸残基Ｖ、（ｉｖ）１３３位にアミノ酸残基Ｓ、（ｖ）１３８位にアミノ酸残基Ｒ、（ｖｉ）１４０位にアミノ酸残基ＩまたはＶ、（ｖｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、Ｋ、Ｅ、またはＴ、（ｖｉｉｉ）１４２位にアミノ酸残基Ｍ、（ｉｘ）１６８位にアミノ酸残基Ｉ、（ｘ）１７０位にアミノ酸残基Ｅ、Ｇ、またはＳ、（ｘｉ）１７１位にアミノ酸残基Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｓ、またはＡ、（ｘｉｉ）１７５位にアミノ酸残基Ｍ、（ｘｉｉｉ）１７６位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｉｖ）１８１位にアミノ酸残基Ｋ、Ｖ、Ａ、またはＬ、（ｘｖ）１８４位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｖｉ）１８５位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｖｉｉ）１８７位にアミノ酸残基Ｒ、および（ｘｖｉｉｉ）２１８位にアミノ酸残基Ｌ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｉ、Ｍ、Ｇ、Ｃ、またはＷ。

ある好ましい実施形態では、本発明によるラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、１４１Ｄ、１４１Ｅ、１７１Ｅ、１７０Ｅ、１８５Ｒおよび１８７Ｒの置換のうちの一つもしくは複数を含むか、またはこれら置換のうちの一つもしくは複数からなる。

ある好ましい実施形態では、本発明によるラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、１４１Ｄ、１４１Ｅ、１７１Ｅ、１７０Ｅ、１８５Ｒおよび１８７Ｒの置換のうちの二以上を含むか、またはこれら置換のうちの二以上からなる。

ある好ましい実施形態では、本発明によるラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、１４１Ｄ、１４１Ｅ、１７１Ｅ、１７０Ｅ、１８５Ｒおよび１８７Ｒの置換のうちの三以上を含むか、またはこれら置換のうちの三以上からなる。

ある好ましい実施形態では、本発明によるラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、（ｉ）１４１Ｅおよび１８５Ｒ、（ｉｉ）１４１Ｅおよび１８７Ｒ、（ｉｉｉ）１４１Ｅ、１７０Ｅまたは１７１Ｅ、および１８５Ｒ、（ｉｖ）１４１Ｅ、１７０Ｅまたは１７１Ｅ、および１８７Ｒ、（ｖ）１４１Ｄおよび１８５Ｒ、（ｖｉ）１４１Ｄおよび１８７Ｒ、（ｖｉｉ）１４１Ｄ、１７０Ｅまたは１７１Ｅ、および１８５Ｒ、（ｖｉｉｉ）１４１Ｄ、１７０Ｅまたは１７１Ｅ、および１８７Ｒ、（ｉｘ）１４１Ｅ、１８５Ｒ、および１８７Ｒ、または（ｘ）１４１Ｄ、１８５Ｒ、および１８７Ｒ、の置換を含むまたはこれらからなる。

さらに一部の実施形態では、本発明によるラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、一つまたは複数の１４１位におけるＤ、Ｋ、またはＥへの置換を含み、これは任意で、１８１位におけるＫへの置換とペアであり、またさらに任意で、２１８位におけるＬ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｉ、Ｍ、Ｇ、Ｃ、またはＷへの置換とペアである。

さらに一部の実施形態では、本発明によるラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、１４１位におけるＤ、Ｋ、もしくはＥへの置換を含み、これは１８１位におけるＫへの置換および／または２１８位におけるＬ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｉ、Ｍ、Ｇ、Ｃ、もしくはＷへの置換とペアである。

さらなる実施形態では、本発明によるラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、以下の（ｉ）～（ｘｖｉｉ）のうちのいずれか一つまたは複数を含む：（ｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、Ｅ、またはＫ；（ｉｉ）１７０位にアミノ酸残基Ｅ、（ｉｉｉ）１７１位にアミノ酸残基Ｅ、（ｉｖ）１７５位にアミノ酸残基Ｍ、（ｖ）１８１位にアミノ酸残基Ｋ、（ｖｉ）１８４位にアミノ酸残基Ｒ、（ｖｉｉ）１８５位にアミノ酸残基Ｒ、（ｖｉｉｉ）１８７位にアミノ酸残基Ｒ、（ｉｘ）２１８位にアミノ酸残基Ｐ、Ａ、またはＥ。

さらなる実施形態では、本発明によるラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、（ｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、（ｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄおよび１８１位にアミノ酸残基Ｋ、（ｉｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１８１位にアミノ酸残基Ｋ、および２１８位にアミノ酸残基Ａ、（ｉｖ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１８１位にアミノ酸残基Ｋ、および２１８位にアミノ酸残基Ｐ、（ｖ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、（ｖｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８１位にアミノ酸残基Ｋ、（ｖｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｋ、（ｖｉｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｋおよび１８１位にアミノ酸残基Ｋ、（ｉｘ）１４１位にアミノ酸残基Ｋ、１８１位にアミノ酸残基Ｋ、および２１８位にアミノ酸残基Ｅ、（ｘ）１４１位にアミノ酸残基Ｋ、１８１位にアミノ酸残基Ｋ、および２１８位にアミノ酸残基Ｐ、（ｘｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７０位にアミノ酸残基Ｅ、１８１位にアミノ酸残基Ｖ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７１位にアミノ酸残基Ｄ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｉｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｉｖ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７１位にアミノ酸残基Ｇ、１８５位にアミノ酸残基Ｒ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｖ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１８５位にアミノ酸残基Ｒ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｖｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７１位にアミノ酸残基Ｓ、および１８１位にアミノ酸残基Ｋ、（ｘｖｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７０位にアミノ酸残基Ｇ、１７５位にアミノ酸残基Ｍ、１８１位にアミノ酸残基Ｖ、１８４位にアミノ酸残基Ｒ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｖｉｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｉｘ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｘ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７０位にアミノ酸残基Ｅ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｘｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７０位にアミノ酸残基Ｅ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｘｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｘｉｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｘｉｖ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１８５位にアミノ酸残基Ｒ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｘｖ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１７０位にアミノ酸残基Ｅ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｘｖｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１７０位にアミノ酸残基Ｅ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｘｖｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、（ｘｘｉｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１７１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、または（ｘｘｉｘ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１７１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒを含む。

任意で、こうしたＣＨ１ドメインバリアントは、（ｉ）配列番号１４０、（ｉｉ）配列番号１４１、（ｉｉｉ）配列番号１４２、（ｉｖ）配列番号１４３、（ｖ）配列番号１４４、（ｖｉ）配列番号１４５、（ｖｉｉ）配列番号１４６、（ｖｉｉｉ）配列番号１４７、（ｉｘ）配列番号１４８、（ｘ）配列番号１４９、（ｘｉ）配列番号１５５、（ｘｉｉ）配列番号１５７、（ｘｉｉｉ）配列番号１５９、（ｘｉｖ）配列番号１６２、（ｘｖ）配列番号１６３、（ｘｖｉ）配列番号１６４、（ｘｖｉｉ）配列番号１６５、（ｘｖｉｉｉ）配列番号１７８、（ｘｉｘ）配列番号１７９、（ｘｘ）配列番号１８０、（ｘｘｉ）配列番号１８１、（ｘｘｉｉ）配列番号１８２、（ｘｘｉｉｉ）配列番号１８３、（ｘｘｉｖ）配列番号１８４、（ｘｘｖ）配列番号１８５、（ｘｘｖｉ）配列番号１８６、（ｘｘｖｉｉ）配列番号１８７、（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１８８、または（ｘｘｉｘ）配列番号１８９、のアミノ酸配列を含む。

一部の好ましい実施形態では、ラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントは、（ｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１７１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、または（ｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１７０位にアミノ酸残基Ｅ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、を含む。

さらに好ましい実施形態では、ラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントは、（ｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１７１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、または（ｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１７０位にアミノ酸残基Ｅ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、からなるアミノ酸置換を含む。

特定の好ましい実施形態では、ラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントは、（ｉ）配列番号１８８、または（ｉｉ）配列番号１８６、からなるアミノ酸置換を含む。

一部の実施形態では、ラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、（ｉ）カッパＣＬドメインと比較して、ラムダＣＬドメインとの、および／または（ｉｉ）カッパ軽鎖ポリペプチドと比較して、ラムダ軽鎖ポリペプチドとの、ＣＨ１ドメインの対合を増加させる一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含み得る。

一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、（ｉ）カッパＣＬドメインと比較して、ラムダＣＬドメインとの、および／または（ｉｉ）カッパ軽鎖ポリペプチドと比較して、ラムダ軽鎖ポリペプチドとの対合の、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の増加をもたらし得る。ラムダ対合の増加は、任意で、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣＭＳ）によって測定されてもよい。

一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドは、（ｉ）カッパＣＬドメインと比較して、ラムダＣＬドメインとの、および／または（ｉｉ）カッパ軽鎖ポリペプチドと比較して、ラムダ軽鎖ポリペプチドとの対合の、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２１倍、少なくとも２２倍、少なくとも２３倍、少なくとも２４倍、または少なくとも２５倍の増加をもたらし得る。ラムダの対合の増加は、任意でフローサイトメトリーによって、任意でラムダＣＬ染色のカッパＣＬ染色に対するＭＦＩ値の比を比較することによって、測定されてもよい。

別の態様では、可変領域および定常領域を含む抗体重鎖ポリペプチドであって、定常領域が、上述のもののいずれかによるＣＨ１ドメインバリアントを含むものである、当該抗体重鎖ポリペプチドが本明細書においてさらに提供される。

一部の実施形態では、かかる抗体重鎖ポリペプチドのＣＨ１ドメインバリアントは、
（Ｉ）（ｉ）１４７位のアミノ酸残基Ｆおよび１８３位のアミノ酸残基Ｒ、（ｉｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆおよび１８３位においてアミノ酸残基Ｋ、（ｉｉｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆおよび１８３位においてアミノ酸残基Ｙ、（ｉｖ）１８３位においてアミノ酸残基Ｒ、（ｖ）１８３位においてアミノ酸残基Ｋ、もしくは（ｖｉ）１８３位においてアミノ酸残基Ｙ、または
（ＩＩ）（ｉ）１４１位においてアミノ酸残基Ｄ、１７１位においてアミノ酸残基Ｅ、および１８５位においてアミノ酸残基Ｒ、もしくは（ｉｉ）１４１位においてアミノ酸残基Ｄ、１７０位においてアミノ酸残基Ｅ、および１８７位においてアミノ酸残基Ｒ、からなるアミノ酸置換を含むことによる。

別の態様では、第一の重鎖ポリペプチドおよび第一の軽鎖ポリペプチドを含む抗体または抗体断片であって、（ａ）第一の重鎖ポリペプチドおよび第一の軽鎖ポリペプチドが、第一の同族対を形成し、および（ｂ）第一の重鎖ポリペプチドが、ＥＵ番号付けに従って、１１８、１１９、１２４、１２６～１３４、１３６、１３８～１４３、１４５、１４７～１５４、１６３、１６８、１７０～１７２、１７５、１７６、１８１、１８３～１８５、１８７、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２０８、２１０～２１４、２１６、および２１８位のうちの一つまたは複数の位置にアミノ酸置換を含む第一のＣＨ１ドメインバリアントを含むことで、第一のＣＨ１ドメインバリアントが、第一の軽鎖に優先的に結合するようになる、当該抗体または抗体断片が本明細書においてさらに提供される。任意で、第一の軽鎖ポリペプチドは、野生型ＣＬドメインである第一のＣＬドメインを含む。さらに任意で、特定のＣＨ１ドメインバリアントは、上述のように除外されてもよく、また本発明によるＣＨ１ドメインバリアントは、上述の項目（ａ）～（ｏ）のうちの一つまたは複数を満たすことができる。また、かかる抗体または抗体断片であって、第二の重鎖ポリペプチドおよび第二の軽鎖ポリペプチドをさらに含む当該抗体または抗体断片であって、（ａ）第二の重鎖ポリペプチドおよび第二の軽鎖ポリペプチドが、第二の同族対を形成し、および（ｂ）第二の重鎖ポリペプチドが、ＥＵ番号付けに従って、１１８、１１９、１２４、１２６～１３４、１３６、１３８～１４３、１４５、１４７～１５４、１６３、１６８、１７０～１７２、１７５、１７６、１８１、１８３～１８５、１８７、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２０８、２１０～２１４、２１６、および２１８位のうちの一つまたは複数の位置にアミノ酸置換を含む第二のＣＨ１ドメインバリアントを含むことで、第二のＣＨ１ドメインバリアントが、第二のＣＬドメインを含む第二の軽鎖ポリペプチドに優先的に結合するようになる、上記抗体または抗体断片が本明細書において提供される。再び任意で、特定のＣＨ１ドメインバリアントは、上述のように除外されてもよく、また本発明によるＣＨ１ドメインバリアントは、上述の項目（ａ）～（ｏ）のうちの一つまたは複数を満たすことができる。さらに任意で、かかる抗体または抗体断片は、以下の特徴（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちの一つまたは複数を含む：（ｉ）第一のＣＬドメインが、野生型ＣＬドメインである、（ｉｉ）第二のＣＬドメインが、野生型ＣＬドメインである、（ｉｉｉ）第一のＣＬドメインが、カッパＣＬドメインである、（ｉｖ）第一のＣＬドメインが、ラムダＣＬドメインである、（ｖ）第二のＣＬドメインが、カッパＣＬドメインである、（ｖｉ）第二のＣＬドメインが、ラムダＣＬドメインである、（ｖｉｉ）第一のＣＨ１ドメインバリアントが、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントである、（ｖｉｉｉ）第二のＣＨ１ドメインバリアントが、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントである、および／または（ｉｘ）第一のＣＨ１ドメインバリアント内のアミノ酸置換は、第二のＣＨ１ドメインバリアント内のアミノ酸置換とは異なる。

第一の重鎖ポリペプチドおよび第一の軽鎖ポリペプチドを含む抗体または抗体断片であって、（ａ）第一の重鎖ポリペプチドおよび第一の軽鎖ポリペプチドが、第一の同族対を形成し、（ｂ）第一の重鎖ポリペプチドが、上述のカッパ優先的なＣＨ１ドメインバリアントのいずれか一つによる第一のＣＨ１ドメインバリアントを含み、および（ｃ）第一の軽鎖ポリペプチドが、カッパＣＬドメインを含み、任意でカッパ軽鎖ポリペプチドである、当該抗体または抗体断片が本明細書においてさらに提供される。任意で、（ｉ）カッパＣＬドメインが、野生型ＣＬドメインであり、および／または（ｉｉ）第一の軽鎖ポリペプチドが、野生型軽鎖ポリペプチドである。特定の実施形態では、第一の重鎖ポリペプチドが、任意で、（ｉ）ラムダＣＬドメインと比較して、カッパＣＬドメインと、および／または（ｉｉ）ラムダ軽鎖ポリペプチドと比較して、カッパ軽鎖ポリペプチドとの、重鎖の優先的な対合をさらに促進する、ＣＨ１ドメインの外側の一つまたは複数のアミノ酸置換を含む。ＣＨ１ドメインの外側の一つまたは複数のアミノ酸置換は、例えばＶＨ内にあり得る。

また、第二の重鎖ポリペプチドおよび第二の軽鎖ポリペプチドを含む抗体または抗体断片であって、（ａ）第二の重鎖ポリペプチドおよび第二の軽鎖ポリペプチドが、第一の同族対を形成し、（ｂ）第二の重鎖ポリペプチドが、上述のラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントのいずれか一つによる第二のＣＨ１ドメインバリアントを含み、および（ｃ）第二の軽鎖ポリペプチドが、ラムダＣＬドメインを含み、任意でラムダ軽鎖ポリペプチドである、当該抗体または抗体断片が本明細書においてさらに提供される。任意で、（ｉ）ラムダＣＬドメインが、野生型ＣＬドメインであり、および／または（ｉｉ）第二の軽鎖ポリペプチドが、野生型軽鎖ポリペプチドである。ある実施形態では、第二の重鎖ポリペプチドが、任意で、（ｉ）カッパＣＬドメインと比較して、ラムダＣＬドメインとの、および／または（ｉｉ）カッパ軽鎖ポリペプチドと比較して、ラムダ軽鎖ポリペプチドとの、重鎖の優先的な対合をさらに促進する、ＣＨ１ドメインの外側の一つまたは複数のアミノ酸置換を含む。

また第一の重鎖ポリペプチド、第一の軽鎖ポリペプチド、第二の重鎖ポリペプチド、および第二の軽鎖ポリペプチドを含む抗体または抗体断片であって、（ａ）第一の重鎖ポリペプチドおよび第一の軽鎖ポリペプチドが、第一の同族対を形成し、（ｂ）第一の重鎖ポリペプチドが、上述のカッパ優先的なＣＨ１ドメインバリアントのいずれか一つによるＣＨ１ドメインバリアントを含む第一のＣＨ１ドメインを含み、（ｃ）第一の軽鎖ポリペプチドが、カッパＣＬドメインを含み、任意でカッパ軽鎖ポリペプチドであり、（ｄ）第二の重鎖ポリペプチドおよび第二の軽鎖ポリペプチドが、第二の同族対を形成し、（ｅ）第二の重鎖ポリペプチドが、上述のラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントのいずれか一つによるＣＨ１ドメインバリアントを含む第二のＣＨ１ドメインを含み、および（ｆ）第二の軽鎖ポリペプチドが、ラムダＣＬドメインを含み、任意でラムダ軽鎖ポリペプチドである、当該抗体または抗体断片が本明細書において提供される。ある実施形態では、第一の重鎖ポリペプチドが、任意で、（ｉ）ラムダＣＬドメインと比較して、カッパＣＬドメインとの、および／または（ｉｉ）ラムダ軽鎖ポリペプチドと比較して、カッパ軽鎖ポリペプチドとの、重鎖の優先的な対合をさらに促進する、ＣＨ１ドメインの外側の一つまたは複数のアミノ酸置換を含む。ＣＨ１ドメインの外側の一つまたは複数のアミノ酸置換は、例えばＶＨ内にあり得る。ある実施形態では、第二の重鎖ポリペプチドが、任意で、（ｉ）カッパＣＬドメインと比較して、ラムダＣＬドメインとの、および／または（ｉｉ）カッパ軽鎖ポリペプチドと比較して、ラムダ軽鎖ポリペプチドとの、重鎖の優先的な対合をさらに促進する、ＣＨ１ドメインの外側の一つまたは複数のアミノ酸置換を含む。

抗体または抗体断片のいずれも、多重特異性であり得、任意で二重特異性であり得る。任意で、こうした抗体または抗体断片の構造は、図２４～２９のいずれか一つに図示されるとおりである。

一部の実施形態では、上述の多重特異性抗体または抗体断片において、第一および第二のＣＨ１ドメインバリアントは、非同族の重鎖－軽鎖の対の形成を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％減少させる。一部の実施形態では、上述の多重特異性抗体または抗体断片において、第一および第二のＣＨ１ドメインバリアントは、同族の重鎖－軽鎖の対の形成を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％増加させる。

いくつかの実施形態では、実施例７および図２３、３０、または３１のように、非同族の重鎖－軽鎖の対合の減少および／または同族の重鎖－軽鎖の対合の増加は、対象とするＣＨ１を含むＨＣ（またはＶＨプラスＣＨ１）、カッパＬＣおよびラムダを、ＨＣ：カッパＬＣ：ラムダＬＣ＝２：１：１などの所定の比で用いて細胞をトランスフェクトし、そしてＬＣＭＳによって軽鎖種を測定することによって、定量化することができる。そのような、または類似の定量方法を使用する特定の実施形態では、例示的な野生型（ＷＴ）ＣＨ１が、ＨＣ－ＬＣ対をもたらし得るが、その６０％が同族対であり、４０％が非同族対であり、そして本開示によるＣＨ１バリアントでは、同族対の割合が、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％に増加し得、また非同族対の割合が、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、少なくとも１５％、少なくとも１０％、少なくとも５％、または０％に減少し得る。そのような、または類似の定量方法を使用する特定の実施形態では、同族対の割合は、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％に増加し得、一方で非同族対の割合は、少なくとも１５％、少なくとも１０％、少なくとも５％、または０％に減少し得る。

一部の実施形態においては、上述の多重特異性抗体または抗体断片において、第一および第二のＣＨ１ドメインバリアントが、非同族の重鎖－軽鎖の対の形成を、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２１倍、少なくとも２２倍、少なくとも２３倍、少なくとも２４倍、または少なくとも２５倍減少させる。一部の実施形態においては、上述の多重特異性抗体または抗体断片において、第一および第二のＣＨ１ドメインバリアントが、同族の重鎖－軽鎖の対の形成を、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２１倍、少なくとも２２倍、少なくとも２３倍、少なくとも２４倍、または少なくとも２５倍増加させる。

一部の実施形態では、図２～５、８～１３、および１９～２２のように、非同族の重鎖－軽鎖の対の減少および／または同族の重鎖－軽鎖の対の増加は、対象とするＣＨ１を含むＨＣ（またはＶＨプラスＣＨ１）、カッパＬＣ、およびラムダＬＣを、細胞（例えば、酵母細胞）において重鎖－軽鎖対の提示を可能にする所定の比で同時に発現し、該細胞を抗カッパ抗体および抗ラムダ抗体で染色し、そしてＦＡＣＳによりカッパおよびラムダの存在を定量化、例えばＭＦＩ値を比較することによって、定量化することができる。あるＣＨ１のカッパ選択性を比較するため、抗カッパ抗体で染色した細胞のＭＦＩ：抗ラムダ抗体で染色した細胞のＭＦＩの比を計算し、野生型（ＷＴ）ＣＨ１についてのかかる比で除算し、親に対する倍率（ＦＯＰ（ｆｏｌｄ－ｏｖｅｒ－ｐａｒｅｎｔ））値を得ることができる。あるＣＨ１のラムダ選択性を比較するため、抗ラムダ抗体で染色した細胞のＭＦＩ：抗カッパ抗体で染色した細胞のＭＦＩの比を計算して、野生型（ＷＴ）ＣＨ１についてのかかる比で除算することができる。

そのような、または類似の定量方法を使用する特定の実施形態では、本開示のカッパ優先的なＣＨ１バリアントを用いて、ＦＯＰ値（カッパ選択性に関して計算、すなわちカッパ：ラムダのＭＦＩ）が、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２１倍、少なくとも２２倍、少なくとも２３倍、少なくとも２４倍、または少なくとも２５倍増加し得る。そのような、または類似の定量方法を使用する特定の実施形態では、本開示のラムダ優先的なＣＨ１バリアントを用いて、ＦＯＰ値（ラムダ選択性に関して計算、すなわちラムダ：カッパのＭＦＩ）が、少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２１倍、少なくとも２２倍、少なくとも２３倍、少なくとも２４倍、または少なくとも２５倍増加し得る。

一部の実施形態では、第二のＣＨ１ドメインバリアントが、１４１位に置換を含み、そして非同族の重鎖－軽鎖の対の形成を少なくとも５０％減少させる。一部の実施形態では、第二のＣＨ１ドメインバリアントが、１４１位に置換を含み、かつ、第一のＣＨ１ドメインバリアントが、１８３位および任意で１４７位に置換を含み、またはその逆であり、そして非同族の重鎖－軽鎖の対の形成を少なくとも５０％～少なくとも７５％減少させる。一部の実施形態では、第二のＣＨ１ドメインバリアントが、１４１Ｄまたは１４１Ｅを含み、かつ、第二のＣＨ１ドメインバリアントが、１８３Ｒ、１８３Ｋまたは１８３Ｙおよび任意で１４７Ｆを含み、またはその逆であり、そして非同族の重鎖－軽鎖の対の形成を少なくとも５０％～少なくとも７５％減少させる。一部の実施形態では、第二のＣＨ１ドメインバリアントが、１４１Ｄまたは１４１Ｅ、１７０Ｅ、１７１Ｅ、１８１Ｋ、１８５Ｒ、１８７Ｒおよび２１８Ｐのうちの一つまたは複数を含み、かつ、第一のＣＨ１ドメインバリアントが、１８３Ｒ、１８３Ｋまたは１８３Ｙおよび任意で１４７Ｆを含み、またはその逆であり、そして非同族の重鎖－軽鎖の対の形成を少なくとも５０％～少なくとも７５％減少させる。一部の実施形態では、第二のＣＨ１ドメインバリアントが、１４１Ｄ、１７１Ｅおよび１８５Ｒの組み合わせ、１４１Ｄ、１７１Ｅおよび１８７Ｒの組み合わせ、または１４１Ｄ、１８１Ｋおよび２１８Ｐの組み合わせを含み、かつ、第二のＣＨ１ドメインバリアントが、１８３Ｒ、１８３Ｋまたは１８３Ｙおよび任意で１４７Ｆを含み、またはその逆であり、そして非同族の重鎖－軽鎖の対の形成を少なくとも５０％～少なくとも７５％減少させる。

一部の実施形態では、第一および第二のＣＨ１ドメインバリアントは、所望の第一および第二の同族対の、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の形成を提供する。一部の実施形態では、第一および第二のＣＨ１ドメインバリアントは、所望の第一および第二の同族対の約８５％～約９５％の形成を提供する。一部の実施形態では、第二のＣＨ１ドメインバリアントが、１４１位に置換を含み、かつ、第一のＣＨ１ドメインバリアントが、１８３位および任意で１４７位に置換を含み、そして所望の第一および第二の同族対の約８５％～少なくとも約９５％の形成を提供する。一部の実施形態では、第二のＣＨ１ドメインバリアントが、１４１Ｄまたは１４１Ｅを含み、かつ、第一のＣＨ１ドメインバリアントが、１８３Ｒ、１８３Ｋまたは１８３Ｙおよび任意で１４７Ｆを含み、またはその逆であり、そして所望の第一および第二の同族対の約８５％～少なくとも約９５％の形成を提供する。一部の実施形態では、第一および第二のＣＨ１ドメインバリアントは、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満の非同族の重鎖－軽鎖の対の形成の減少を提供する。一部の実施形態では、第二のＣＨ１ドメインバリアントが、１４１、１７０、１７１、１８１、１８５、１８７および／または２１８位に置換を含み、かつ、第一のＣＨ１ドメインバリアントが、１８３位におよび任意で１４７位に置換を含み、またはその逆であり、そして約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満の非同族の重鎖－軽鎖の対の形成の減少を提供する。一部の実施形態では、第二のＣＨ１ドメインバリアントが、１４１Ｄまたは１４１Ｅ、１７０Ｅ、１７１Ｅ、１８１Ｋ、１８５Ｒ、１８７Ｒおよび２１８Ｐのうちの一つまたは複数を含み、かつ、第一のＣＨ１ドメインバリアントが、１８３Ｒ、１８３Ｋまたは１８３Ｙおよび任意で１４７Ｆを含み、またはその逆であり、そして約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満の非同族の重鎖－軽鎖の対の形成の減少を提供する。

さらに別の態様では、（ｉ）上述のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド、（ｉｉ）記載される抗体重鎖ポリペプチド、および／または（ｉｉｉ）上述の抗体または抗体断片、を含む医薬組成物および診断組成物が、本明細書においてさらに提供される。

別の態様では、（ｉ）上述のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド、（ｉｉ）記載される抗体重鎖ポリペプチド、および／または（ｉｉｉ）上述の抗体または抗体断片、を含む抗体および医薬組成物の治療的使用および診断的使用が、本明細書においてさらに提供される。

さらに別の態様では、（ｉ）上述のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド、（ｉｉ）記載される抗体重鎖ポリペプチド、および／または（ｉｉｉ）上述の抗体または抗体断片、をコードする核酸が、本明細書においてさらに提供される。

さらに別の態様では、（ｉ）上述のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド、（ｉｉ）記載される抗体重鎖ポリペプチド、および／または（ｉｉｉ）上述の抗体または抗体断片、をコードする核酸を含むベクター、または当該核酸によりトランスフェクトした細胞、および前述のものを産生するためのその使用が、本明細書においてさらに提供される。

別の態様では、本開示は、ＣＨ１バリアントドメインライブラリーを生成する方法を提供し、当該方法は、以下のステップ（ａ）～（ｃ）を含む：（ａ）（ｉ）カッパＣＬドメインを含むポリペプチドと対合したＣＨ１ドメインを含むポリペプチドの一つもしくは複数のセット（「Ｃκセット」）、（ｉｉ）ラムダＣＬドメインを含むポリペプチドと対合したＣＨ１ドメインを含むポリペプチドの一つもしくは複数のセット（「Ｃλセット」）、および／または（ｉｉｉ）Ｃ_κセットおよび／もしくはＣ_λセットにおけるＶＨ内、を提供すること、（ｂ）ＣＨ１ドメインの一つまたは複数のアミノ酸位置であって、ＣκセットにおけるカッパＣＬドメイン内、および／またはＣλセットにおけるラムダＣＬドメイン内の一つまたは複数のアミノ酸位置と接触しているものである、当該一つまたは複数のアミノ酸位置を選択すること、ならびに（ｃ）ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドのライブラリーまたはＣＨ１ドメインバリアントをコードする構築物のライブラリーを作製することであって、ステップ（ｂ）で選択される一つまたは複数のアミノ酸位置のうちの一つまたは複数が、任意の非野生型アミノ酸で置換されているものである、ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドのライブラリーまたはＣＨ１ドメインバリアントをコードする構築物のライブラリーを作製すること。任意で、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチドは、重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含み、さらに任意でカッパまたはラムダＣＬドメインを含むポリペプチドが、軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む。

任意で：（Ｉ）ステップ（ａ）において、前述のＣＨ１ドメイン、前述のカッパＣＬドメイン、および前述のラムダＣＬドメインは、野生型および／もしくはヒトであり、（ＩＩ）ステップ（ａ）において、（ｉ）カッパＣＬドメインを含むポリペプチドと対合したＣＨ１ドメインを含む前述のポリペプチド、および（ｉｉ）ラムダＣＬドメインを含むポリペプチドと対合したＣＨ１ドメインを含む前述のポリペプチドの両方が、インタクト抗体であるか、もしくは抗原結合する断片（「Ｆａｂ」）であり、（ＩＩＩ）ステップ（ｂ）において、ＣＨ１ドメインの前述の一つもしくは複数のアミノ酸位置におけるアミノ酸残基が、（ｉ）カッパＣＬドメイン内の前述の一つもしくは複数のアミノ酸位置におけるアミノ酸残基の側鎖原子、（ｉｉ）ラムダＣＬドメイン内の前述の一つもしくは複数のアミノ酸位置におけるアミノ酸残基の側鎖原子、および／もしくは（ｉｉｉ）ＶＨ内の前述の一つもしくは複数のアミノ酸位置におけるアミノ酸残基の側鎖原子の、５Åの距離の範囲内に側鎖原子を有しているならば、ＣＨ１ドメインの一つまたは複数のアミノ酸位置を選択し、ならびに／または（ＩＶ）ステップ（ｃ）における前述の作製することは、縮重コドンを経由し、任意で、六種の天然アミノ酸（Ｄ、Ｔ、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＮ）を表す縮重ＲＭＷコドン、もしくは２０種の天然アミノ酸残基すべてを表す縮重ＮＮＫコドンを介している。

一部の実施形態では、ステップ（ｂ）において選択される一つまたは複数のＣＨ１アミノ酸位置は、（ｉ）Ｃκセットの代表的セットの少なくとも１０％においてカッパＣＬドメインとの界面にあり、かつＣκセットの代表的セットの少なくとも９０％において１０％超の溶媒接触表面積率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌｓｏｌｖｅｎｔａｃｃｅｓｓｉｂｌｅｓｕｒｆａｃｅａｒｅａ）を有する、（ｉｉ）Ｃλセットの代表的セットの少なくとも１０％においてラムダＣＬドメインとの界面にあり、かつＣλセットの代表的セットの少なくとも９０％において１０％超の溶媒接触表面積率を有し、ならびに／または（ｉｉｉ）Ｃ_κおよび／もしくはＣ_λセットの代表的セットの少なくとも１０％においてＶＨとの界面にあり、かつＣ_κおよび／またはＣ_λセットの代表的セットの少なくとも９０％において１０％超の溶媒接触表面積率を有する。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）で選択されるアミノ酸位置は、ＥＵ番号付けに従って、１１８、１１９、１２４、１２６～１３４、１３６、１３８～１４３、１４５、１４７～１５４、１６３、１６８、１７０～１７２、１７５、１７６、１８１、１８３～１８５、１８７、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２０８、２１０～２１４、２１６、および２１８位のうちの一つまたは複数を含む。任意で、特定のＣＨ１ドメインバリアントは、上述のように除外されてもよく、また本発明によるＣＨ１ドメインバリアントは、上述の基準（ａ）～（ｏ）を満たすことができる。

一部の実施形態では、ステップ（ｃ）におけるＣＨ１バリアントドメインまたはＣＨ１ドメインバリアントのライブラリーをコードする合成ポリペプチドは、酵母菌株で発現される。一部の実施形態では、酵母菌株は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。一部の実施形態では、酵母菌株などの細胞系は、（ｉ）カッパ軽鎖などのカッパＣＬドメインを含む一つまたは複数のポリペプチド、および（ｉｉ）ラムダ軽鎖などのラムダＣＬドメインを含む一つまたは複数のポリペプチドを、共発現する。任意で、カッパおよび／またはラムダＣＬドメインが野生型である。さらに任意で、カッパおよび／またはラムダＣＬドメインはヒトである。

一部の実施形態では、本開示の方法は、一つまたは複数の置換されたＣＨ１アミノ酸残基が、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖に対する優先的な対合を駆動することを検証することをさらに含む。一部の実施形態では、一つまたは複数の置換されたＣＨ１アミノ酸残基が、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖に対する優先的な対合を駆動することを検証するために、蛍光標識細胞分取が使用される。

一部の実施形態では、一つまたは複数のカッパ定常（Ｃκ）ドメイン、一つまたは複数のラムダ定常（Ｃλ）ドメイン、および一つまたは複数のＣＨ１ドメインが、野生型である。一部の実施形態では、一つまたは複数のカッパ定常（Ｃκ）ドメイン、一つまたは複数のラムダ定常（Ｃλ）ドメイン、および一つまたは複数のＣＨ１ドメインが、ヒトである。

一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインライブラリーを生成する方法は、以下のステップ（ａ）～（ｃ）を含む：（ａ）以下のＣＨ１アミノ酸位置のうちの一つまたは複数を選択すること：ＥＵ番号付けに従って、１１８、１１９、１２４、１２６～１３４、１３６、１３８～１４３、１４５、１４７～１５４、１６３、１６８、１７０～１７２、１７５、１７６、１８１、１８３～１８５、１８７、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２０８、２１０～２１４、２１６、および２１８位、（ｂ）ステップ（ａ）において選択された位置とは異なる、対象とする一つまたは複数のＣＨ１アミノ酸位置を選択すること、ならびに（ｃ）ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドのライブラリーまたはＣＨ１ドメインバリアントをコードする構築物のライブラリーを作製することであって、ステップ（ａ）および（ｂ）で選択される一つまたは複数のアミノ酸位置のうちの一つまたは複数が、任意の非野生型アミノ酸で置換されているものである、ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドのライブラリーまたはＣＨ１ドメインバリアントをコードする構築物のライブラリーを作製すること。特定の実施形態では、（ａ）で選択されるアミノ酸位置は、１４１、１４７、１５１、１７０、１７１、１８１、１８３、１８５、１８７、または２１８位、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。特定の実施形態では、ステップ（ｃ）における前述の作製することは、縮重コドンを介し、任意で、六種の天然アミノ酸（Ｄ、Ｔ、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＮ）を表す縮重ＲＭＷコドン、または２０種の天然アミノ酸残基すべてを表す縮重ＮＮＫコドンを介している。特定の実施形態では、ステップ（ｃ）において、ステップ（ａ）で選択されたアミノ酸位置が、所定のアミノ酸に置換されてもよく、また（ｂ）で選択されたアミノ酸位置が、縮重コドンを介して置換される。任意で、所定のアミノ酸への置換は、Ａ１４１Ｄ、Ａ１４１Ｅ、Ｋ１４７Ｆ、Ｐ１５１Ａ、Ｐ１５１Ｌ、Ｆ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ｅ、Ｓ１８１Ｋ、Ｓ１８３Ｒ、Ｖ１８５Ｒ、Ｔ１８７Ｒ、またはＫ２１８Ｐ、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。

さらに別の態様では、本開示は、（Ａ）ラムダＣＬドメインを含むポリペプチドと比較して、カッパＣＬドメインを含むポリペプチドと、または（Ｂ）カッパＣＬドメインを含むポリペプチドと比較して、ラムダＣＬドメインを含むポリペプチドと、優先的に対合する、一つまたは複数のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドを特定する方法を提供する。こうした方法は、以下のステップ（ａ）～（ｃ）を含む：（ａ）一つまたは複数の候補ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドを、（ｉ）カッパＣＬドメインを含む一つまたは複数のポリペプチド、および（ｉｉ）ラムダＣＬドメインを含む一つまたは複数のポリペプチドと共発現すること、（ｂ）（ｉ）カッパＣＬドメインを含むポリペプチドと対合した候補ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドの量と、（ｉｉ）ラムダＣＬドメインを含むポリペプチドと対合した候補ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドの量とを、比較すること、（ｃ）ステップ（ｂ）における比較に基づいて、（Ａ）ラムダＣＬドメインを含むポリペプチドと比較して、カッパＣＬドメインを含むポリペプチドとの、または（Ｂ）カッパＣＬドメインを含むポリペプチドと比較して、ラムダＣＬドメインを含むポリペプチドとの、優先的な対合を提供する一つまたは複数のＣＨ１ドメインバリアントを選択すること。ステップ（ａ）において、概して、発現された候補ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドの総量と、発現された（カッパおよびラムダ）ＣＬドメインを含むポリペプチドの総量とが、ほぼ同じであってもよい。任意で、ステップ（ａ）において、候補ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド、カッパＣＬドメインを含むポリペプチド、およびラムダＣＬドメインを含むポリペプチドが、ほぼ２：１：１の比で発現される。

一部の実施形態では、ステップ（ａ）において、前述の（ｉ）カッパＣＬドメインを含む一つまたは複数のポリペプチド、および（ｉｉ）ラムダＣＬドメインを含む一つまたは複数のポリペプチドは、野生型および／またはヒトである。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）においては、上記量は、蛍光標識細胞分取を介して、または液体クロマトグラフィー－質量分析法を介して決定される。

一部の実施形態では、方法は、以下のステップ（ｄ）をさらに含む：（ｄ）一つまたは複数の対照のＣＨ１ドメインバリアントを、（ｉ）カッパＣＬドメインを含む一つまたは複数のポリペプチド、および（ｉｉ）ラムダＣＬドメインを含む一つまたは複数のポリペプチドと共発現することであって、任意で、該一つまたは複数の対照のＣＨ１ドメインバリアントのうちの一つまたは複数が、上述の任意のＣＨ１ドメインバリアントに従うものである。

図１Ａ～Ｃは、ＣＨ１ドメインバリアントの、ＣλドメインまたはＣκドメインへの結合の概略図である。図１Ａは、野生型ＣＨ１ドメインの、ＣλおよびＣκとのヘテロ二量体形成を示す（野生型または非改変のＣＨ１ドメインは、ＣＨ１_ＷＴと呼ぶ）。図１Ｂは、Ｃκと優先的に対合するＣＨ１ドメインバリアントを示す（Ｃκと優先的に対合する当該ＣＨ１ドメインバリアントは、ＣＨ１κと呼ぶ）。図１Ｃは、Ｃλと優先的に対合するＣＨ１ドメインバリアントを示す（Ｃλと優先的に対合する当該ＣＨ１ドメインバリアントは、ＣＨ１λと呼ぶ）。

図２Ａおよび２Ｂは、ラムダＣＬドメイン選択性（図２Ａ）またはカッパＣＬドメイン選択性（図２Ｂ）をもつＣＨ１ドメインバリアントを特定する選択の複数回のラウンドにわたる例示的なＦＡＣＳプロットを示す。Ｒ１＝選択の第一ラウンド、Ｒ２＝選択の第二ラウンド、Ｒ３＝選択の第三ラウンド。ｘ軸はＰＥで標識されたラムダ軽鎖を示し、ｙ軸はＦＩＴＣで標識されたカッパ軽鎖を示す。

図３は、ラムダＣＬドメイン選択性またはカッパＣＬドメイン選択性をもつＣＨ１ドメインバリアントを発現する個々の固有のクローンを示す。クローンを、抗カッパ蛍光強度中央値（ＭＦＩ）の抗ラムダＭＦＩに対する比（カッパ：ラムダ比）についてスコア付けした。任意の個々のクローンに対するカッパ：ラムダ比を、野生型ＣＨ１配列（「親」）を有する対応する株と比較した。ＦＯＰは、親に対する倍率（ｆｏｌｄ－ｏｖｅｒ－ｐａｒｅｎｔ）を意味する。

図４は、１４１位、１４７位、または１８３位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を有するＣＨ１ドメインバリアントを発現する個々の固有のクローンを示す。クローンを、抗カッパＭＦＩの抗ラムダＭＦＩに対する比についてスコア付けし、親と比較して、ＦＯＰを決定した。ＣＨ１の１４７位および１８３位が、カッパＣＬドメイン選択性をもたらす二つの位置として特定された。ＣＨ１の１４１位が、ラムダＣＬドメイン選択性をもたらす位置として特定された。

図５は、抗カッパＭＦＩの抗ラムダＭＦＩに対する比によって測定された、ラムダＣＬドメイン選択性（Ａ１４１Ｔ、Ｑ、Ｄ、またはＲ）またはカッパＣＬドメイン選択性（Ｋ１４７Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｙ、またはＭ；Ｓ１８３Ｋ、Ｙ、Ｅ、Ｒ、Ｗ、Ｑ）をもつＣＨ１ドメイン内の１４１位、１４７位および／または１８３位（ＥＵ番号付け）における特定のアミノ酸置換を示す。白色ドットとして示したアミノ酸置換（Ｖ１３４、Ｔ１４１、Ｖ１４７、Ａ１５１、およびＫ１８３）は、複数の位置が多様化したライブラリーからの初回の選択後に特定され、また黒色ドットとして示したアミノ酸置換は、１４１位、１４７位および１８３位を標的として多様化したライブラリーからの選択のさらなるラウンドの後に特定された。親のκ：λ比（野生型シグナル）：ＧＡＬ１Ｃκ；ＧＡＬ１０Ｃλ：３．５８、およびＧＡＬ１Ｃλ；ＧＡＬ１０Ｃκ：０．３。親の比は、実験的反復に対する平均である。１４７位および１８３位両方に置換を有するＣＨ１バリアントについては、列挙された第一のアミノ酸は、１４７位におけるバリアントであり、列挙された第二のアミノ酸は、１８３位におけるバリアントである（例えば、Ｙ×Ｆは、Ｋ１４７ＹおよびＳ１８３Ｆの置換をもつＣＨ１バリアントを意味する）。

図６Ａ～Ｅは、ＣＨ１ドメインバリアントが、野生型ＣＨ１ドメイン（ＢｓＡｂ１およびＢｓＡｂ１５）と比較して、多重特異性抗体（ＢｓＡｂ２～ＢｓＡｂ１４）の標的結合を変化させなかったことを実証する代表的な結合データを示す。図６Ａは、ＢｓＡｂ１～３に関するＩＬ１２ＢおよびＥＧＦＲの結合データを示す。図６Ｂは、ＢｓＡｂ５、７および４に関するＩＬ１２ＢおよびＥＧＦＲの結合データを示す。図６Ｃは、ＢｓＡｂ９、１０および６に関するＩＬ１２ＢおよびＥＧＦＲの結合データを示す。図６Ｄは、ＢｓＡｂ１１、１２および８に関するＩＬ１２ＢおよびＥＧＦＲの結合データを示す。図６Ｅは、ＢｓＡｂ１３～１５に関するＩＬ１２ＢおよびＥＧＦＲの結合データを示す。Ｐａｎｉ＝パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）；Ｕｓｔｅ＝ウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）。

図７は、野生型ＣＨ１ドメインを含有する二重特異性抗体（ＢｓＡｂ１）と比較して、ＣＨ１ドメインバリアントを含有する二重特異性抗体（ＢｓＡｂ２～ＢｓＡｂ１４）における、正確な重鎖－軽鎖対合（ＨＣ１－ＬＣ１またはＨＣ２－ＬＣ２）の増加、および重鎖－軽鎖の誤対合（ＨＣ１－ＬＣ２およびＨＣ２－ＬＣ１）の同時発生的な減少を示す。

図８は、野生型（ＷＴ）クローン、Ａ１４１Ｄクローン、ならびに実施例５の１４１×１８１×２１８ライブラリー選択の結果物から得られたＣＨ１ドメインの１４１位、１８１位および２１８位において異なるアミノ酸置換を有する個々のクローンの、ラムダ選択性のＦＯＰ値を示す。長方形内に印された１３個のデータ点は、最も高いＦＯＰ値を有するクローンに相当し、またＣＨ１の１４１位、１８１位および２１８位におけるアミノ酸残基、ならびに各クローンのＦＯＰ値が表８に提供される。

図９は、野生型（ＷＴ）クローン、Ａ１４１Ｄクローン、ならびに実施例５の１４１×１８１×２１８ライブラリー選択の結果物におけるＣＨ１ドメインの、１４１位にＤ、１８１位にＫ、および２１８位に様々なアミノ酸を有する個々のクローンの、ラムダ選択性のＦＯＰ値を示す。白丸のデータ点は、同じＣＨ１配列を有する個々のクローンのＦＯＰを表し、黒丸のデータ点は、平均ＦＯＰ値を表す。

図１０は、再クローニングされたクローンおよび野生型（ＷＴ）クローンおよびＡ１４１Ｄクローンで測定されたラムダ選択性のＦＯＰ値を示し、これによりラムダ選択性の維持が確認される。

図１１は、実施例５で選択された九種の１４１×１８１×２１８リードのうちの一の、および野生型（ＷＴ）の、およびＡ１４Ｄの、ＣＨ１を有するＨＥＫ２９３で産生されるＩｇＧの例示的散乱プロットを示し、カッパＣＬおよびラムダＣＬに対して染色された。個々のクローンの散乱プロットを、ＷＴプロットと重ね合わせている。ｘ軸はＰＥで標識されたラムダ軽鎖を示し、ｙ軸はＦＩＴＣで標識されたカッパ軽鎖を示す。

図１２は、実施例５からの九種のリードに関するラムダ選択性のＦＯＰ値を、野生型（ＷＴ）およびＡ１４１Ｄと共に示す。最も高いＦＯＰ値を有する三種のＣＨ１バリアント（Ｄ＿Ｋ＿ＷＴ、Ｄ＿Ｋ＿Ｐ、およびＤ＿Ｋ＿Ａ）を、ＨＥＫ２９３におけるその後の二鎖（カッパまたはラムダ）のトランスフェクションのために選択した。

図１３は、１４１位に同じアミノ酸を有するＣＨ１バリアントの間でラムダ選択性のＦＯＰ値を比較する。１４１位がＤである場合、１８１位における、または１８１位および２１８位における、追加のアミノ酸置換が、ＦＯＰ値をさらに増加させる。

図１４は、液体クロマトグラフィー－質量分析法（「ＬＣＭＳ」）によって測定された、九種のリードのＨＥＫ２９３において産生された全長ＩｇＧの軽鎖種の％（カッパおよびラムダを比較する）を示す。最も高いＦＯＰ値を有する三種のＣＨ１バリアント（Ｄ＿Ｋ＿ＷＴ、Ｄ＿Ｋ＿Ｐ、およびＤ＿Ｋ＿Ａ）を、ＨＥＫ２９３におけるその後のトランスフェクションのために選択した。

図１５は、野生型（ＷＴ）のプロセス収率に相対的に、三種のリード（Ｄ＿Ｋ＿ＷＴ、Ｄ＿Ｋ＿Ｐ、およびＤ＿Ｋ＿Ａ）およびＡ１４１Ｄの例示的プロセス収率を示しており、これは親に対する倍率（「ＦＯＰ（ｆｏｌｄ－ｏｖｅｒ－ｐａｒｅｎｔ）」）値として示している。

図１６は、三種のリードＣＨ１バリアント（Ｄ＿Ｋ＿ＷＴ、Ｄ＿Ｋ＿Ｐ、およびＤ＿Ｋ＿Ａ）のうちの一、またはＡ１４１Ｄ、または野生型（ＷＴ）を有するカッパ対合Ｆａｂおよびラムダ対合ＦａｂのＴｍ（℃）を示す。

図１７は、以下のように規定される相対的なラムダＴｍ（℃）を示す：［ラムダ対合ＷＴＦａｂに相対的なラムダ対合バリアントＦａｂのＴｍ変化（「ΔｌａｍｂｄａＴｍ」）］－［カッパ対合ＷＴＦａｂに相対的なカッパ対合バリアントＦａｂのＴｍ変化（「ΔｋａｐｐａＴｍ」）］。

図１８は、実施例６における再クローニングの結果物からの配列決定結果を提供するものであり、結果物であるクローン間で観察された高頻繁のアミノ酸置換を可視化している。

図１９は、酵母中でＩｇＧとして発現される、実施例６の再クローニングの結果物からのリード、ならびに実施例５からの１４１×１８１×２１８のリードの一部（ＤＫＰ、ＤＫＡ、ＫＫＥ、ＫＫＰ、およびＥＫＫ）に関するラムダ選択性のＦＯＰ値（ラムダＭＦＩ：カッパＭＦＩ）を示す。少なくとも七種のリードが、矢印で印しているが、テストされた１４１×１８１×２１８のリードの値と同等またはそれより高いＦＯＰ値を有する。

図２０は、実施例７からの１４種のリードのみならず、実施例５において特定されたＤＫＰ、Ａ１４１Ｄ、および野生型に関するラムダ選択性のＦＯＰ値を示す。矢印で印された二種のリード「Ａ４１４Ｄ＿Ｐ１７１Ｅ＿Ｖ１８５Ｒ」および「Ａ１４１Ｄ＿Ｆ１７０Ｅ＿Ｔ１８７Ｒ」は、ＤＫＰよりも高いＦＯＰ値を示した。１４種のリードはすべて、野生型よりも高いＦＯＰ値を示した。

図２１は、実施例７における１４種のＣＨ１ドメインバリアント、および三種の対照（実施例５において特定されたＤＫＰ、Ａ１４１Ｄ、および野生型）に関するラムダ選択性を比較する、例示的なＦＡＣＳプロットを示す。ｘ軸はＰＥで標識されたラムダ軽鎖を示し、ｙ軸はＦＩＴＣで標識されたカッパ軽鎖を示す。各プロットの番号付けは、表１４に示されるＲａｎｋ番号である。例えば、最初の二つの「１」および「２」で番号付けされたプロットは、それぞれ「Ａ４１４Ｄ＿Ｐ１７１Ｅ＿Ｖ１８５Ｒ」および「Ａ１４１Ｄ＿Ｆ１７０Ｅ＿Ｔ１８７Ｒ」のプロットである。

図２２は、図２１からの個々のプロット（「ａ」として印した）、野生型プロット（「ｂ」として印した）、およびＤＫＰプロット（「ｃ」として印した）のＦＡＣＳプロットの例示的な重ね合わせを示す。

図２３は、実施例７においてＬＣＭＳによって測定された、ＨＥＫ２９３で産生された１４種のリードおよび三種の対照の全長ＩｇＧの軽鎖種の％（カッパおよびラムダを比較）を示す。三種の対照が、白い矢印で示されている。「Ａ４１４Ｄ＿Ｐ１７１Ｅ＿Ｖ１８５Ｒ」および「Ａ１４１Ｄ＿Ｆ１７０Ｅ＿Ｔ１８７Ｒ」（塗りつぶされた矢印）は、陽性対照である「ＤＫＰ」と比較して、ラムダ鎖％が高く、またカッパ鎖％が低いことを示した。

図２４～２９は、本明細書に開示されるＣＨ１ドメインバリアントが使用され得る、様々な多重特異性抗体構造の例示的かつ非限定的な実施形態を提供する。図２４～２９では、別段の示唆がない限り、以下が適用される：（１）各ドメインは、その中にドメイン名を示すテキスト（例えば、ＣＨ１、ＶＨ１など）を含む長方形として提示されている、（２）黒い長方形およびドット柄の長方形は、カッパまたはラムダ選択性をもつＣＨ１ドメインバリアントであり、これらは本明細書に開示されるＣＨ１ドメインバリアントであり得る、（３）「ＣＨ１κ」は、カッパＣＬ選択性をもつＣＨ１ドメインバリアントであり、「ＣＨ１λ」はラムダ選択性をもつＣＨ１ドメインバリアントであり、また「κ」または「λ」の表示のない「ＣＨ１」は、軽鎖アイソタイプ選択性をもつまたは軽鎖アイソタイプ選択性がない任意のＣＨ１ドメイン、野生型、またはバリアントである、（４）「Ｃκ」はカッパＣＬドメインであり、「Ｃλ」はラムダＣＬドメインであり、また「κ」または「λ」の表示のない「ＣＬ」は、黒またはドット柄のＣＨ１ドメインとペアで示されている場合には、ペアの黒またはドット柄のＣＨ１ドメインがそれに対する選択性を有するアイソタイプ（カッパまたはラムダ）のＣＬドメインを表す、（５）複数の黒および／またはドット柄のＣＨ１ドメインが多重特異性構造内に存在する場合、少なくとも一つは本明細書に開示されるＣＨ１ドメインバリアントであり、その他は本明細書に開示されるＣＨ１ドメインバリアントであってもなくてもよい、（６）黒およびドット柄のＣＨ１ドメインの両方が多重特異性構造内に存在する場合、黒およびドット柄のものは、異なる軽鎖アイソタイプ選択性をもつＣＨ１ドメインを表す（すなわち、黒がカッパ選択性をもつＣＨ１ドメインを表す場合、ドット柄はラムダ選択性をもつＣＨ１ドメインを表し、そして逆も同様である）、（７）ＶＨ１およびＶＬ１は第一のエピトープのための抗原結合部位を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は第二のエピトープのための抗原結合部位を形成し、ＶＨ３およびＶＬ３は第三のエピトープのための抗原結合部位を形成し、ＶＨ４およびＶＬ４は第四のエピトープのための抗原結合部位を形成し、ＶＨ５およびＶＬ５は第五のエピトープのための抗原結合部位を形成し、またＶＨ６およびＶＬ６は第六のエピトープのための抗原結合部位を形成する、（８）特異性の組み合わせの全体が提示の構造に多重特異性をもたらしている限り、第一のエピトープから第六のエピトープの全てが互いに異なってもよく、または第一のエピトープから第六のエピトープの全てが互いに異なっていなくてもよい、（９）互いに結合された複数のドメインのセットは、ポリペプチド（例えば、重鎖ポリペプチド、軽鎖ポリペプチドなど）を表す、（１０）ポリペプチド内のドメインの方向は、Ｎ末端からＣ末端への、ドメイン名を示すテキストの方向に従う、（１１）リンカー、ヒンジまたはジスルフィド結合が図に明示されていない場合であっても、リンカーまたはヒンジは、必要に応じてドメイン間で使用することができ、またジスルフィド結合は、おそらく抗原結合部位の正確な形成を可能にするために、ポリペプチド間（および／またはドメイン内）に存在し得る、（１２）図に示されるＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、可能な限り省略されてもよく、適切な場合にはヒンジで置換されてもよい、（１３）ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインは、独立して野生型またはバリアントであってもよく、また独立して任意の（重鎖）アイソタイプのものであってもよい、ならびに（１４）複数のＣＨ１ドメインが構造内に存在する場合、ＣＨ１ドメインは同じアイソタイプのものであっても同じアイソタイプのものでなくてもよく、複数のＣＨ２ドメインが構造内に存在する場合、ＣＨ２ドメインは同じアイソタイプのものであっても同じアイソタイプのものでなくてもよく、また複数のＣＨ３ドメインが構造内に存在する場合、ＣＨ３ドメインは同じアイソタイプのものであっても同じアイソタイプのものでなくてもよい。

図２４Ａ～２４Ｃは、本明細書に開示されるＣＨ１ドメインバリアントが使用され得る、様々な多重特異性抗体構造の例示的かつ非限定的な実施形態を提供する。図２４Ａにおいては、カッパ優先的なＣＨ１ドメイン（「ＣＨ１κ」）を一つのポリペプチド内で使用する。他のＣＨ１ドメインは、ラムダＣＬドメインに対する選択性を有していてもよく、または有していなくてもよく、また本明細書に開示されるＣＨ１ドメインバリアントであってもよく、またはそうでなくてもよい。図２４Ｂにおいては、ラムダ優先的なＣＨ１ドメイン（「ＣＨ１λ」）を一つのポリペプチド内で使用する。他のＣＨ１ドメインは、カッパＣＬドメインに対する選択性を有していてもよく、または有していなくてもよく、また本明細書に開示されるＣＨ１ドメインバリアントであってもよく、またはそうでなくてもよい。図２４Ｃにおいては、ＣＨ１κが一つのポリペプチド内で使用され、またＣＨ１λが一つのポリペプチド内で使用される。この全般的な構造が、誤対合の化合物を除去するための労力なしに、または当該除去のための最小限のもしくはより少ない労力で、二重特異性化合物の製造を可能にする。ＣＨ１κドメインおよびＣＨ１λドメインのうちの少なくとも一つは、本明細書に開示されるＣＨ１ドメインバリアントである。（１０）において上述するように、ポリペプチド内のドメインの方向は、Ｎ末端からＣ末端への、ドメイン名を示すテキストの方向に従う。したがって、図２４Ａの上方左の化合物の場合、Ｎ末端からＣ末端へ向かう方向に、第一のポリペプチドはＶＨ１－ＣＨ１ｋ－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、第二のポリペプチドはＶＬ１－Ｃｋを含み、第三のポリペプチドはＶＨ２－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、そして第四のポリペプチドはＶＬ２－ＣＬを含む。図２４Ａ～２４Ｃ（および他の該当する図のすべて）における上方中央および上方右の化合物の三角形は、二つの非同一のポリペプチドのヘテロ二量体形成を促進する機構を表し、例えば「ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ」エンジニアリングなどである。図２４Ａ～２４Ｃ（および他の該当する図のすべて）の下方中央の化合物は、ＣＨ１κ含有ポリペプチドおよびＣＨ１λ含有ポリペプチドを接続するヒンジ構造を示す。二つの結合（例えば、ジスルフィド結合）は、二つのポリペプチドを接続するように明示しているが、結合の数および結合の正確な場所／位置は変動してもよく、適切に選択されてもよい。図２４Ｃの下方右における「＋」は、二つの異なるＦａｂ断片の混合物を示す。
同上。同上。

図２５Ａ～２５Ｂは、本明細書に開示されるＣＨ１ドメインバリアントが使用され得る、様々な多重特異性抗体構造の例示的かつ非限定的な実施形態を提供する。構造は、図２４Ａ～２３Ｃにおける構造と類似であるが、ドメインの順序は異なる。図２５Ａにおいては、ＣＨ１κはＶＬを有する同じポリペプチド内にあり、またＣＨ１λはＶＬを有する同じポリペプチド内にある。図２５Ｂにおいては、ＣλはＣＨ２を有する同じポリペプチド内にあり（上方の三つおよび下方左）、またＣλは重鎖様ポリペプチド（ヒンジ含有ポリペプチド）内にある（下方右）。同上。

図２６Ａ～２６Ｃは、様々な多重特異性抗体構造のさらなる例示的かつ非限定的な実施形態を提供するものであり、当該構造はタンデムで二つの抗原結合部位の二つのセットを含み、したがって四価である。構造は、第一、第二、第三、および第四のエピトープが何であるかに応じて、二重特異性、三重特異性、または四重特異性であり得る。例えば、第一、第二、およびエピトープが互いに異なっている場合、および第四のエピトープが第一、第二、または第三のエピトープと同一である場合には、構造は四価の三重特異性構造となる。同上。同上。

図２７Ａ～２７Ｃは様々な多重特異性抗体構造のさらなる例示的かつ非限定的な実施形態を提供するものであり、当該構造は図２６Ａ～２６Ｃにおける構造と類似であるが、ドメインの順序は異なる。（１０）において上述するように、ポリペプチド内のドメインの方向は、Ｎ末端からＣ末端への、ドメイン名を示すテキストの方向に従う。したがって、図２７Ａの上方左の構造の場合、Ｎ末端からＣ末端へ向かう方向に、第一のポリペプチドはＶＨ３－ＶＨ１－ＣＨ１（黒）－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、第二のポリペプチドはＶＬ１－ＶＬ３－ＣＬを含み、第三のポリペプチドはＶＨ４－ＶＨ２－ＣＨ１（ドット柄）－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、そして第四のポリペプチドはＶＬ２－ＶＬ４－ＣＬを含む。図２７Ａ～２７Ｃにおける任意の構造においては、抗原結合部位の適切な形成を可能にするために、ドメイン間に適切なものを使用してもよい。同上。同上。

図２８Ａ～２８Ｄは、様々な多重特異性抗体構造のさらなる例示的かつ非限定的な実施形態を提供するものであり、当該構造は少なくとも一つのｓｃＦｖを含有する。図２４～図２９に提供される構造のいずれかは、例えば重鎖定常ドメイン、軽鎖定常ドメイン、および／または抗原結合ドメインのいずれかにコンジュゲートされた、一つまたは複数のｓｃＦｖ含有部分を追加的に含み得る、または当該ｓｃＦｖ含有部分を含むように改変され得る。例として、図２８Ａ～２８Ｃは、図２４Ａの上方左の構造が二つのｓｃＦｖとコンジュゲートされて、最大四つのエピトープに対する特異性を可能にする構造を提供する。図２８Ａでは、ｓｃＦｖはＣＨ３ドメインにコンジュゲートされる。図２８Ｂでは、ｓｃＦｖはＣＬドメインにコンジュゲートされる。図２８Ｃでは、ｓｃＦｖはＶＨドメインにコンジュゲートされる。特定の例では、二つ以上のｓｃＦｖがコンジュゲートされてもよい。例として、図２８Ａ～２８Ｃは、図２４Ａの上方左の構造が四つのｓｃＦｖとコンジュゲートされて、最大六つのエピトープに対する特異性を可能にする構造を提供する。同上。同上。同上。

図２９Ａ～２９Ｄは、様々な多重特異性抗体構造のさらなる例示的かつ非限定的な実施形態を提供するものであり、当該構造は二つのさらなるＦａｂ断片を含有する。二つのＦａｂ断片がＣＨ３ドメインにコンジュゲートされるが、Ｆａｂ断片が構造のその他の部分にコンジュゲートされていてもよく、また二つではなく一つ（または三つ以上）のＦａｂ断片がコンジュゲートされていてもよいことに留意されたい。図２９Ａでは、二つのＣＨ１ドメインは、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する同じポリペプチド内にある。中央の構造では、カッパ優先的なＣＨ１ドメインとラムダ優先的なＣＨ１ドメインとが、同じポリペプチド内に存在する（二つのＣＨ１含有ポリペプチドの両方に関して）。二つのＣＨ１含有ポリペプチドが同じである場合、この構造は、例えば実施例で利用される３鎖のトランスフェクション系を使用するだけで、二つの非同一のポリペプチドのヘテロ二量体形成を促進する機構（例えば、「ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ」エンジニアリング等）を必要とせずに四価の二重特異性化合物の産生を促進する。図２９Ｂにおいて、二つのポリペプチドは、いかなるＣＨ１ドメインも含有しない。中央の構造では、二つのＣＨ１非含有ポリペプチドが同じである場合、この構造は、例えば実施例で利用される３鎖トランスフェクション系を使用するだけで、二つの非同一のポリペプチドのヘテロ二量体形成を促進する機構（例えば、「ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ」エンジニアリング）を必要とせずに四価の二重特異性化合物の産生を促進する。図２９Ｃおよび２９Ｄにおいて、各ポリペプチドはＣＨ１ドメインを含有する。図２９Ｃおよび２９Ｄの中央の構造では、第一のエピトープおよび第三のエピトープが同じエピトープであり、かつ、第二のエピトープおよび第四のエピトープが同じエピトープであるが第一のエピトープおよび第三のエピトープとは異なる場合、構造は二重特異性である。かかる構造において、二つのＣＨ２／ＣＨ３含有ポリペプチドが同じである場合、この構造は、例えば実施例で利用される３鎖トランスフェクション系を使用するだけで、二つの非同一のポリペプチドのヘテロ二量体形成を促進する機構（例えば、「ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ」エンジニアリング）を必要とせずに四価の二重特異性化合物の産生を促進する。同上。同上。同上。

図３０は、実施例７で特定された上位二つのラムダ優先的なＣＨ１バリアント（「Ａ１４１ＤＰ１７１ＥＶ１８５Ｒ」または「Ａ１４１ＤＦ１７０ＥＴ１８７Ｒ」）、または実施例４で特定されたカッパ優先的なＣＨ１バリアント（「Ｋ１４７ＦＳ１８３Ｒ」）、または野生型（ＷＴ）ＣＨ１のうちの一つを含有する各完全ＩｇＧの例示的なプロセス収率を示す。野生型（ＷＴ）のプロセス収率に対して正規化した。斜線のバー（カッパと対合）および黒のバー（ラムダと対合）は、野生型（ＷＴ）の対応する収率に対して正規化されたプロセス収率を表す。白色ひし形（カッパと対合）および黒の三角形（ラムダと対合）は、そのままのプロセス収率（ｍｇ／Ｌ）を表す。

図３１は、実施例７で特定された上位二つのラムダ優先的なＣＨ１バリアント（「Ａ１４１ＤＰ１７１ＥＶ１８５Ｒ」または「Ａ１４１ＤＦ１７０ＥＴ１８７Ｒ」）、または実施例４および５で特定されたラムダ優先的なＣＨ１バリアント（「Ａ１４１Ｄ」または「Ａ１４１ＤＳ１８１ＫＫ２１８Ｐ」）、または実施例４で特定されたカッパ優先的なＣＨ１バリアント（「Ｋ１４７ＦＳ１８３Ｒ」）、または野生型（ＷＴ）ＣＨ１のうちの一つを含有する各Ｆａｂの例示的プロセス収率を示す。野生型（ＷＴ）のプロセス収率に対して正規化した。収率は、野生型（ＷＴ）の対応する収率に対して正規化される。斜線のバーはカッパＬＣを含有するＦａｂを表し、また黒のバーはラムダＬＣを含有するＦａｂを表す。

図３２は、その電子密度での野生型ＣＨ１－Ｃλ界面を示す。野生型ラムダ定常ドメイン（Ｃλ）と対合した、パニツムマブ可変断片（Ｆｖ）および野生型ＩｇＧ１－ＣＨ１のＦａｂ結晶構造に関する、対象とする領域の代表的な電子密度である。重鎖（ＨＣ）の炭素原子は淡灰色に、ラムダ軽鎖（λＬＣ）の炭素原子は白色に、窒素原子は暗灰色に、また酸素原子は黒色に、着色されている。タンパク質は棒で表される。２Ｆｏ－Ｆｃの電子密度マップは、１．６Åの分解能で１σで描画した灰色のメッシュとして示している。この結晶構造に関するデータは、１．０９Åの原子分解能まで拡大される。

図３３は、その電子密度でのＡ１４１ＤＣＨ１－Ｃλ界面を示す。野生型ラムダ定常ドメイン（Ｃλ）と対合した、パニツムマブ可変断片（Ｆｖ）およびＡ１４１Ｄ置換ＩｇＧ１－ＣＨ１のＦａｂ結晶構造に関する、対象とする領域の代表的な電子密度である。重鎖（ＨＣ）の炭素原子は淡灰色に、ラムダ軽鎖（λＬＣ）の炭素原子は白色に、窒素原子は暗灰色に、また酸素原子は黒色に、着色されている。タンパク質は棒で表される。２Ｆｏ－Ｆｃの電子密度マップは、２．０Åの分解能で１σで描画した灰色のメッシュとして示している。この結晶構造に関するデータは、１．２Åの原子分解能まで拡大される。

図３４は、その電子密度での野生型ＣＨ１－Ｃκ界面を示す。野生型カッパ定常ドメイン（Ｃκ）と対合した、パニツムマブ可変断片（Ｆｖ）および野生型ＩｇＧ１－ＣＨ１のＦａｂ結晶構造に関する、対象とする領域の代表的な電子密度である。重鎖（ＨＣ）の炭素原子は淡灰色に、カッパ軽鎖（κＬＣ）の炭素原子は白色に、窒素原子は暗灰色に、また酸素原子は黒色に、着色されている。タンパク質は棒で表される。２Ｆｏ－Ｆｃの電子密度マップは、１．６Åの分解能で０．９σで描画した灰色のメッシュとして示している。この結晶構造に関するデータは、２．６Åの原子分解能まで拡大される。

図３５は、その電子密度でのＫ１４７Ｆ－Ｓ１８３ＲＣＨ１－Ｃκ界面を示す。野生型カッパ定常ドメイン（Ｃκ）と対合した、パニツムマブ可変断片（Ｆｖ）およびＫ１４７Ｆ－Ｓ１８３Ｒ置換ＩｇＧ１－ＣＨ１の結晶構造に関する、対象とする領域の代表的な電子密度である。重鎖（ＨＣ）の炭素原子は淡灰色に、カッパ軽鎖（κＬＣ）の炭素原子は白色に、窒素原子は暗灰色に、また酸素原子は黒色に、着色されている。タンパク質は棒で表される。２Ｆｏ－Ｆｃの電子密度マップは、１．６Åの分解能で０．９σで描画した灰色のメッシュとして示している。この結晶構造に関するデータは、２．１Åの近原子分解能まで拡大される。

図３６Ａ～３６ＤはＨＣ－Ａ１４１Ｄ置換を示し、当該置換がλＬＣとの水素結合を可能にする一方で、同時に、カッパの対合をκＬＣによる立体衝突により不安定化させる。図３６Ａ～３６Ｄは、野生型（ＷＴ）ＣＨ１とλＬＣとの間（図３６Ａ）、野生型（ＷＴ）ＣＨ１とκＬＣとの間（図３６Ｂ）、Ａ１４１ＤＣＨ１とλＬＣとの間（図３６Ｃ）、またはＡ１４１ＤＣＨ１とκＬＣとの間（図３６Ｄ）のＨＣ－Ａｌａ１４１位置を囲む対合界面の図を提供する。カッパ軽鎖定常ドメイン（κＬＣ）の界面は、三つの疎水性残基Ｐｈｅ１１６、Ｐｈｅ１１８およびＬｅｕ１３５を含有し、図３６Ｂにおいて例示される。構造的に等価なκＬＣ－Ｐｈｅ１１６位置におけるλＬＣ内のＴｈｒ１１６の存在が、黒色の点線として示されるＨＣ－Ａｓｐ１４１のカルボキシル基への水素結合を可能にする（図３６Ｃ）。図３６Ｄにおいて、Ａ１４１ＤＣＨ１定常ラムダ（Ｃλ）および野生型（ＷＴ）ＣＨ１－ＣκのＨＣアラインメントにより、ＨＣ－Ａｓｐ１４１側鎖のκＬＣ－Ｐｈｅ１１６の側鎖との立体衝突が見られる。重鎖（ＨＣ）の炭素原子は淡灰色に、軽鎖（ＬＣ）の炭素原子は白色に、窒素原子は暗灰色に、また酸素原子は黒色に、着色されている。側鎖は、透明な分子表面をもつ棒で表現され、主鎖の原子は、マンガで表現されている。

図３７Ａおよび３７Ｂは、鎖内水素結合ネットワークにおいて野生型ＣＨ１配列がＨＣ－Ｇｌｎ１７５を捕捉するものであり、これはＫ１４７Ｆの置換によって破壊される可能性があり、κＬＣ－Ｇｌｎ１６０と相互作用するＨＣ－Ｇｌｎ１７５の自由度が許容されることを示す。図３７Ａおよび３７Ｂは、パニツムマブ野生型ＣＨ１定常カッパ（Ｃκ）構造におけるＬｙｓ１４７、Ａｓｐ１４８およびＧｌｎ１７５に関与するＨＣ内の三者の水素結合（図３７Ａ）、およびパニツムマブＫ１４７Ｆ－Ｓ１８３Ｒ－ＣＨ１－Ｃκ構造（図３７Ｂ）の図を提供する。重鎖（ＨＣ）の炭素原子は淡灰色に、カッパ軽鎖（κＬＣ）の炭素原子は白色に、窒素原子は暗灰色に、また酸素原子は黒色に、着色されている。側鎖は、棒で表現され、主鎖の原子は、マンガで表現されている。水素結合は点線で示されている。

図３８Ａ～３８Ｄは、ＨＣ－Ａｒｇ１８３およびκＬＣ－Ｔｈｒ１７８間の水素結合がカッパ対合を駆動できる一方で、ＨＣ－Ａｒｇ１８３のλＬＣ－Ｔｙｒ１７８との立体衝突がラムダ対合に対する選択性を減少させることを示す。図３８Ａ～３８Ｄは、パニツムマブ野生型ＣＨ１定常ラムダ（Ｃλ）構造におけるＨＣ－Ｓｅｒ１８３とλＬＣ－Ｔｈｒ１７８との間（図３８Ｂ）、およびパニツムマブＫ１４７Ｆ－Ｓ１８３Ｒ－ＣＨ１定常カッパ（Ｃκ）構造におけるＨＣ－Ａｒｇ１８３とκＬＣ－Ｔｈｒ１７８との間（図３８Ｃ）の水素結合と共に、ＩｇＧ１－ＣＨ１におけるＳ１８３Ｒ置換を囲む領域の図を提供する。図３８Ａは、ＨＣ－Ｓｅｒ１８３とκＬＣ－Ｔｈｒ１７８は、水素結合が起こるには遠すぎることを示す。重鎖（ＨＣ）の炭素原子は淡灰色に、軽鎖（ＬＣ）の炭素原子は白色に、窒素原子は暗灰色に、また酸素原子は黒色に、着色されている。側鎖は棒で表現されている。また、透明な分子表面として、λＬＣ－Ｔｙｒ１７８の側鎖も示されている。水素結合は黒い点線で示されている。図３８Ｄは、パニツムマブＫ１４７Ｆ－Ｓ１８３Ｒ－ＣＨ１－Ｃκ構造のＨＣを、パニツムマブ野生型ＣＨ１－Ｃλ構造のＨＣと重ね合わせたモデルを提供する。得られたモデルは、ＨＣ－Ａｒｇ１８３およびλＬＣ－Ｔｙｒ１７８間の明らかな立体衝突を示す。

別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙される数値に関して使用される場合、当該値が、列挙される値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば本明細書で使用される場合、「約１００」という表現には、９９および１０１、ならびにその間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）が含まれる。

本明細書に記載される本開示の態様および実施形態は、態様および実施形態を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、態様および実施形態「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、および「本質的に」態様および実施形態「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）を含むことを理解されたい。

本明細書では、カッパＣＬドメイン（またはカッパ軽鎖）またはラムダＣＬドメイン（またはラムダ軽鎖）のいずれかとのＣＨ１ドメイン含有重鎖の優先的な対合を促進することによって、重鎖－軽鎖の誤対合を防止する少なくとも一つのアミノ酸置換を含有する操作されたＣＨ１ドメインが提供される。用語「優先的な対合」は、ポリペプチド、例えば抗体、例えば二重特異性抗体における、軽鎖（またはＣＬドメイン）との重鎖（またはＣＨ１ドメイン）の対合を指す。重鎖（Ｈ１）が二つの異なる軽鎖（Ｌ１およびＬ２）と共発現される場合、Ｈ１は、Ｌ１およびＬ２のそれぞれと対合することとなり、結果的にＨ１：Ｌ１およびＨ１：Ｌ２の混合物をもたらす。一部の例では、Ｈ１はＬ１およびＬ２の両方と同程度に対合することができ、結果的にＨ１：Ｌ２に対するＨ１：Ｌ１がおよそ５０：５０である混合物をもたらす。例として、Ｈ１がＬ１とＬ２と共発現したときに形成されたＨ１：Ｌ２ヘテロ二量体の量よりも、形成されたＨ１：Ｌ１ヘテロ二量体の量が超えるならば、Ｈ１とＬ１との間で「優先的な対合」が生じていることとなる。この例では、Ｈ１は、Ｌ２と比べてＬ１と優先的に対合する。Ｈ１がＬ２よりもＬ１と対合するという固有の傾向を有するならば（Ｈ１：Ｌ１のＨ１：Ｌ２に対する比が５０：５０ではなく、例えば６０：４０または７０：３０であり、この場合においてＨ１：Ｌ２の形成は依然として望ましくない）、所望の対間での優先的な対合、すなわちＨ１：Ｌ１は、Ｈ１：Ｌ２と比較してＨ１：Ｌ１間での対合の量が向上（増加）している場合に生じていることとなる。本明細書で使用される場合、用語「優先的な対合」は、重鎖と軽鎖との対合（上述したような）のみならず、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの対合も包含する。例として、ＣＨ１がＣκおよびＣλと共発現した場合に形成されたＣＨ１：Ｃλの量よりも、形成されたＣＨ１：Ｃκの量が超えるならば、ＣＨ１ドメインとカッパＣＬドメインとの間で「優先的な対合」が生じていることとなる。同様に、ＣＨ１がＣλおよびＣκと共発現した場合に形成されたＣＨ１：Ｃκの量よりも、形成されたＣＨ１：Ｃλの量が超えるならば、ＣＨ１ドメインとラムダＣＬドメインとの間で「優先的な対合」が生じていることとなる。

ＣＨ１－ＣＬ界面の一部として（ＣκおよびＣλの両方に関して）特定される、ＣＨ１ドメイン内の特定の位置は、重鎖の軽鎖との結合に影響を及ぼすことが発見された。さらに、ＣＨ１：ＶＨ界面におけるＣＨ１ドメイン内の位置が、重鎖の軽鎖との結合に影響を及ぼすことも示された。重鎖は、二組のドメイン界面、すなわち一方はＶＨドメインとＶＬドメインとの間、もう一方はＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間である二組のドメイン界面を介して軽鎖と対合し、そして当該鎖同士が対合する場所、または面する場所もしくは接触する場所を、「界面」と呼ぶ。さらに、重鎖内では、ＣＨ１ドメインはまた、ＶＨの一部と接触し、そしてＣＨ１ドメインおよびＶＨが近接する当該空間も、用語「界面」に包含される。ある界面は、三次元空間で互いに接触する、重鎖内のアミノ酸残基および軽鎖内のアミノ酸残基を、または代替的にＣＨ１ドメイン内のアミノ酸残基およびＶＨ内のアミノ酸残基、を含む。一部の実施形態では、界面は、重鎖のＣＨ１ドメインと軽鎖のＣＬドメインとを含む。他の実施形態では、界面は、重鎖のＣＨ１ドメインおよびＶＨドメインを含む。「界面」は、ＩｇＧ抗体またはそのＦａｂに由来することが好ましい。

本明細書に記載されるＣＨ１バリアントドメインは、親と比較して、一つもしくは複数のＣＨ１：ＣＬ界面（ＣＨ１：カッパＣＬ、またはＣＨ１：ラムダＣＬ）位置、例えば１４１、１４７、１７０、１７１、１７５、１８１、１８３、１８４、１８５、１８７、および／もしくは２１８位、または一つもしくは複数のＣＨ１：ＶＨ界面位置、例えば１５１位において、アミノ酸置換を含有する。用語「親」は、バリアントを生成するようにその後に改変されるポリペプチド（およびそれをコードするアミノ酸配列）を指す。親ポリペプチドは、野生型もしくは天然由来のポリペプチドまたはそのバリアントもしくは操作されたバージョンであってもよい。したがって、「親ＣＨ１ドメイン」は、ＣＨ１ドメインポリペプチド（およびＣＨ１ドメインポリペプチドをコードするアミノ酸配列）を指し、これはＣＨ１ドメインバリアントを生成するようにその後に改変される。こうした親ＣＨ１ドメインは、野生型もしくは天然由来のＣＨ１ドメイン、またはそのバリアントもしくは操作されたバージョンであり得、例えば毒素または低分子薬剤をコンジュゲートするように改変された野生型ＣＨ１ドメインであり得る。こうした親ＣＨ１ドメインは、より大きな構築物、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、またはＩｇＧから単離されるかまたはその一部であり得、これは任意で、例えばヘテロ二量体形成を促進するＣＨ３改変、Ｆｃ受容体結合を変化させる、半減期を延長する、および／または追加の結合ドメインを連結するＣＨ２および／またはＣＨ３改変、などのさらなる改変を含有してもよい。

結果として得られるＣＨ１バリアントドメインは、カッパＣＬ（Ｃκ）ドメインまたはラムダＣＬ（Ｃλ）ドメインのいずれかと優先的に対合するものであり、そのＣκおよびＣλドメインは軽鎖の一部であってもよい。ＣＨ１ドメインの１４７および１８３位（ＥＵ番号付け）の一方または両方におけるアミノ酸の変異は、Ｃκへの結合を促進（および同時に、Ｃλとの対合を阻害）する一方で、ＣＨ１ドメインの１４１位におけるアミノ酸の変異は、Ｃλへの結合を促進（および同時にＣκとの対合を阻害）する。カッパおよびラムダのＣＬドメインは、限定されるものではないが、ＦａｂまたはＩｇＧ、野生型またはキメラの、例えばＶκおよびＣκ、ＶκおよびＣλ、ＶλおよびＣκまたはＶλおよびＣλを含有するＦａｂまたはＩｇＧなどを含む、任意の数の形式で存在し得る。こうしたＣＨ１バリアントドメインは、二重特異性抗体の天然ＩｇＧ構造を維持しながら重鎖－軽鎖対合の正確性を向上させることによって多重特異性抗体を操作する際に有用であり得るが、これは、インビボでの長い半減期およびエフェクター機能を引き出す能力をはじめとする、その治療用分子としての十分に確立された特性に基づいて好ましいものである。

用語「ＣＨ１ドメイン」は、抗体の重鎖の第一の定常ドメイン、重鎖の可変ドメインのＣ末端、およびヒンジ領域のＮ末端を指す。ＩＭＧＴに従うと、ＣＨ１ドメインは、１１８～２１５位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸配列であり、またヒンジ領域は、２１６～２３０位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸配列である。本明細書で使用される場合、用語「ＣＨ１ドメインバリアント」は、ＣＨ１ドメイン全体（ＥＵ番号付けに従って１１８～２１５位）、またはＣＨ１残基の１１８～２１５（ＥＵ番号付けに従って）のうちの少なくとも７つを含むその断片を含むアミノ酸配列を指すものであり、かかる断片は、本明細書に開示される改変のうちの１以上、ならびにヒンジ領域の一部分（２１６～２１８位）を含む。記載したＣＨ１ドメインバリアントを特定するためにスクリーニングされるライブラリーは、ヒンジ領域内に、例えば２１６および２１８位に、多様化（ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ）を含んだ。

ＣＨ１ドメインは、軽鎖のＣＬドメインと対合する。一部の実施形態では、軽鎖はカッパ鎖である。一部の実施形態では、軽鎖はラムダ鎖である。「カッパ定常ドメイン」、「カッパＣＬドメイン」、または「Ｃκ」という用語は、カッパ軽鎖の定常ドメインを指す。「ラムダ定常ドメイン」、「ラムダＣＬドメイン」、または「Ｃλ」という用語は、ラムダ軽鎖の定常ドメインを指す。単一のジスルフィド結合は、ＣＨ１をＣＬドメインと共有結合する。本明細書で使用される場合、ＣＨ１ドメインは、すべての抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＭおよびＩｇＥ、を指す。

本明細書において「抗体」という用語は、最も広範な意味で使用され、様々な抗体構造を包含するものであり、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および／または抗体断片（所望の抗原結合活性を呈する断片が好ましく、これは「抗原結合抗体断片」とも呼ばれる）が挙げられるがこれに限定されない。

「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」とは、実質的に均質な抗体の集団から取得される抗体を指す。すなわち、当該集団を含む個々の抗体は同一であるか、および／または同じエピトープに結合する。ただし、潜在的なバリアント抗体（例えば、天然の突然変異および／もしくは置換を含有する、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる）は除く。そのようなバリアントは概して少量存在する。異なる決定基（エピトープ）に指向する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に指向する。

「多重特異性抗体」は、本明細書中において「多重特異性化合物」とも呼ばれ得るが、少なくとも二つの異なる抗原または少なくとも二つの異なるエピトープを認識して特異的に結合する少なくとも二つの異なる抗原結合ドメインを含む抗体を指す。一部の実施形態では、多重特異性抗体は、（１）同族対を形成して第一の抗原に結合する、第一の重鎖と第一の軽鎖、および（２）同族対を形成して第二の抗原に結合する、第二の重鎖と第二の軽鎖を含有する。

「二重特異性抗体」は、本明細書中において「二重特異性化合物」とも呼ばれ得るが、多重特異性抗体の一種であり、また少なくとも二つの異なる抗原または少なくとも二つのエピトープを認識して特異的に結合する二つの異なる抗原結合ドメインを含む抗体を指す。少なくとも二つのエピトープは、同じ抗原内にあってもよく、またはそうでなくてもよい。二重特異性抗体は、例えば、同一または異なる（例えば、免疫細胞およびがん細胞）細胞上の二つの異なる表面受容体、二つの異なるサイトカイン／ケモカイン、受容体およびリガンドを標的とし得る。二重特異性抗体によって標的にされ得る抗原の組み合わせとしては、ＣＤ３およびＨｅｒ２、ＣＤ３およびＨｅｒ３、ＣＤ３およびＥＧＦＲ、ＣＤ３およびＣＤ１９、ＣＤ３およびＣＤ２０、ＣＤ３およびＥｐＣＡＭ、ＣＤ３およびＣＤ３３、ＣＤ３およびＰＳＭＡ、ＣＤ３およびＣＥＡ、ＣＤ３およびｇｐ１００、ＣＤ３およびｇｐＡ３３、ＣＤ３およびＢ７－Ｈ３、ＣＤ６４およびＥＧＦＲ、ＣＥＡおよびＨＳＧ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２およびＬＴｂｅｔａＲ、ＥＧＦＲおよびＩＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３、ＶＥＧＦＲ２およびＰＤＧＦＲａｌｐｈａ、ＰＤＧＦＲａｌｐｈａおよびＰＤＧＦＲｂｅｔａ、ＥＧＦＲおよびＭＥＴ、ＥＧＦＲおよびＥＤＶ－ｍｉＲ１６、ＥＧＦＲおよびＣＤ６４、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ２、ＥＧＦＲおよびＨｅｒ３、Ｈｅｒ２ドメインＥＣＤ２およびＨｅｒ２ドメインＥＣＤ４、Ｈｅｒ２およびＨｅｒ３、ＩＧＦ－１ＲおよびＨＥＲ３、ＣＤ１９およびＣＤ２２、ＣＤ２０およびＣＤ２２、ＣＤ３０およびＣＤ１６Ａ、ＦｃｅＲＩおよびＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ７９Ｂ、ＭＰ６５およびＳＡＰ－２、ＩＬ－１７ＡおよびＩＬ－２３、ＩＬ－１ａｌｐｈａおよびＩＬ－１ｂｅｔａ、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８、ＶＥＧＦおよびオステオポンチン、ＶＥＧＦおよびＡｎｇ－２、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦＲｂｅｔａ、ＶＥＧＦおよびＨｅｒ２、ＶＥＧＦおよびＤＬＬ４、ＦＡＰおよびＤＲ５、ＦｃｇＲＩＩおよびＩｇＥ、ＣＥＡおよびＤＴＰＡ、ＣＥＡおよびＩＭＰ２８８、ならびにＬｕｋＳ－ＰＶおよびＬｕｋＦ－ＰＶ、が挙げられ得るがこれらに限定されない。

「異なる抗原」とは、異なる、および／または別個のタンパク質、ポリペプチド、または分子、のみならず、異なる、および／または別個のエピトープを指し得るものであり、当該エピトープは、一つのタンパク質、ポリペプチド、または他の分子内に含有されてもよい。結果として、二重特異性抗体は、同じポリペプチド上の二つのエピトープに結合し得る。

「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域内の特定の抗原結合部位と相互作用する抗原性決定基を指す。一つの抗原が、複数のエピトープを有する場合もある。したがって、異なる抗体が、抗原上の異なる領域に結合し、異なる生物効果を有する場合もある。「エピトープ」という用語はまた、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が反応する抗原上の部位も指す。さらに、抗体に結合される抗原の領域も指す。エピトープは構造的または機能的に定義される場合もある。機能的エピトープは概して構造的エピトープのサブセットであり、相互作用のアフィニティに直接的に寄与する残基を有する。またエピトープは立体構造であってもよい。すなわち、非直線のアミノ酸から構成されてもよい。ある実施形態では、エピトープは、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面の基である決定基を含んでもよく、ある実施形態では、エピトープは、特定の三次元構造特性および／または特定の電荷特性を有してもよい。

一部の例では、抗体は、四つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続される二つの重（Ｈ）鎖と二つの軽（Ｌ）鎖とを含む。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＶＨ」）などの可変領域および重鎖定常領域（「ＣＨ」）を含む。インタクトな抗体の場合、ＣＨは、ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。抗体断片の場合、ＣＨは、ＣＨ１、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメインを含んでもよく、一部の好ましい実施形態では、ＣＨは少なくともＣＨ１ドメインを含む。本明細書に開示されるＣＨ１ドメインバリアントは、野生型ＣＨ２および／もしくはＣＨ３ドメインと、または例えば抗体の安定性および／もしくはエフェクター機能を変化もしくは改善させるものなどである、一つもしくは複数のアミノ酸置換を含むＣＨ２および／もしくはＣＨ３ドメインと、組み合わせて使用され得る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＶＬ」）などの可変領域および軽鎖定常領域（「ＣＬ」）を含む。ＶＨとＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられたより保存的な領域が分散した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた超可変性の領域にさらに再分割することができる。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された三つのＣＤＲと四つのＦＲとを含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本開示のある実施形態では、抗体（またはその抗原結合断片）のＦＲは、ヒト生殖細胞系列の配列と同一であってもよく、または天然であってもよく、もしくは人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸のコンセンサス配列は、二つ以上のＣＤＲを並べて解析した結果に基づき規定されてもよい。したがって重鎖内のＣＤＲはそれぞれ、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、および「ＣＤＲＨ３」と示され、また軽鎖内のＣＤＲは、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、および「ＣＤＲＬ３」と示される。他の例では、抗体は、その多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合断片を含んでもよい。

ある例では、ＶＨおよびＣＬは、一つのポリペプチド内に存在し得る。ある例では、ＶＬドメインおよびＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、および／またはＣＨ３ドメインが、一つのポリペプチド内に存在し得る。例えば、一定の抗体または抗体断片において、第一のポリペプチドはＶＨ１およびＣＨ１を含み、また第二のポリペプチドはＶＬ１およびＣＬを含み（ＶＨ１およびＶＬは第一のエピトープのための抗原結合部位を形成する）、第三のポリペプチドはＶＨ２およびＣＬを含み、また第四のポリペプチドはＶＬ２およびＣＨ１を含む（ＶＨ２およびＶＬ２は第二のエピトープのための抗原結合部位を形成する）。別の一定の抗体または抗体断片において、第一のポリペプチドはＶＨ１およびＣＨ１を含み、また第二のポリペプチドはＶＬ１およびＣＬを含む（ＶＨ１およびＶＬは第一のエピトープのための抗原結合部位を形成する）一方で、第三のポリペプチドはＶＬ２、ＣＬ、ならびにＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインのうちの一つまたは複数を含み、また第四のポリペプチドはＶＨおよびＣＨ１を含む。本明細書に開示されるＣＨ１バリアントのいずれかを含むあらゆる抗体または抗体断片であって、ＣＨ１ドメインが重鎖内であるか軽鎖内であるかに関わらず、カッパＣＬとの優先的な対合またはラムダＣＬとの優先的な対合を提供する当該抗体または抗体断片は、本発明によって包含される。

本明細書で使用される用語「同族対（ｃｏｇｎａｔｅｐａｉｒ）」または「同族の対合」は、二つの抗体鎖（例えば、重鎖および軽鎖）であって、各々が可変領域（例えば、それぞれＶＨおよびＶＬ）を含有し、該可変領域の組み合わせが、あるエピトープまたは抗原に対する意図された結合特異性を提供するものである、当該二つの抗体鎖（例えば、重鎖および軽鎖）の対または対合を指す。本明細書で使用される用語「非同族対」または「非同族の対合」は、二つの抗体鎖（例えば、重鎖および軽鎖）であって、各々が可変領域（例えば、それぞれＶＨおよびＶＬ）を含有し、該可変領域の組み合わせが、あるエピトープまたは抗原に対する意図された結合特異性を提供しないものである、当該二つの抗体鎖（例えば、重鎖および軽鎖）の対または対合を指す。

抗体には以下の五つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、そしてこれらのうちのいくつかは例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２などのサブクラス（アイソタイプ）へとさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。

特に別段の示唆が無い限り、本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、二つの免疫グロブリンの重鎖と二つの免疫グロブリンの軽鎖とを含む分子（「全長抗体」または「インタクトな抗体」または「全抗体」等と呼ぶこともあり、全ての例において、天然の抗体と実質的に同様の構造を有する抗体を指す）、ならびにその抗原結合抗体断片を包含する。「抗原結合断片」または「抗原結合抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、またはインタクトな抗体に由来する部分の組み合わせを指すものであり、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する。

抗体の抗原結合断片には、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、天然の、酵素処理により取得可能な、合成の、もしくは遺伝子操作された、任意のポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。例示的な抗体断片としては、Ｆｖ、抗原結合断片（「Ｆａｂ」）の断片、Ｆａｂ’断片、遊離スルフヒドリル基を含有するＦａｂ’（「Ｆａｂ’－ＳＨ」）、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ダイアボディ、直線状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、一本鎖可変断片（「ｓｃＦｖ」）、ナノボディもしくはＶＨＨ、またはＶＨもしくはＶＬドメインのみ）、および前述のような抗体断片のうちの一つまたは複数から形成される単一特異性または多重特異性の化合物、が挙げられるがこれに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に記載される二重特異性抗体の抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。好ましい実施形態では、抗原結合断片は、カッパＣＬとまたはラムダＣＬと優先的に対合するＣＨ１ドメインを含む。

完全抗体分子と同様に、抗原結合性断片は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性、四重特異性等）であってもよい。抗体の多重特異性の抗原結合断片は、少なくとも二つの異なる可変ドメインを含有してもよく、この場合において各可変ドメインは、別個の抗原に特異的に結合することができるか、または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。

本開示は、カッパ軽鎖ＣＬドメインまたはラムダ軽鎖ＣＬドメインと優先的に対合する（または結合する）ＣＨ１ドメインバリアントを提供する。一実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントは、カッパクラス軽鎖またはラムダクラス軽鎖への結合を全く示さないかまたは当該結合を低減させ、同時に、もう一方のクラスの軽鎖（この例では、それぞれ、ラムダまたはカッパ）との結合に関する排他性を示すかまたは選択性を増加させる。これらのＣＨ１ドメインバリアントは、例えば二重特異性抗体などの多重特異性抗体を適切な重鎖と軽鎖との対合を促進することによって生成する際の重鎖と軽鎖との誤対合を全体的または部分的に解決するために、使用され得る。一実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントを、任意で、カッパ軽鎖ＣＬドメインまたはラムダ軽鎖ＣＬドメインとの優先的な対合をさらに促進するために、ＣＨ１ドメインの外側の他のバリアントと組み合わせて使用してもよい（例えばＶＨ：ＶＬの置換、例えばＱ３９Ｅ／Ｋ：Ｑ３８Ｋ／Ｅ（Ｄｉｌｌｏｎｅｔａｌ．，ＭＡｂｓ２０１７９（２）：２１３－２３０）、またはＱ３９Ｋ＋Ｒ６２Ｅ：Ｑ３８Ｄ＋Ｄ１ＲもしくはＱ３９Ｙ＋Ｑ１０５Ｒ：Ｑ３８Ｒ＋Ｋ４２Ｄ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎｅｔａｌ．，ＭＡｂｓ２０１７９（２）：１８２－２１２等））。より具体的には、これらのＣＨ１バリアントドメインを含む二重特異性抗体は、以降の処理中でそれらを除去することは困難であり得るような望ましくない産物関連汚染物、すなわち誤対合したドメインを含有する分子、をほとんど形成しないものとなる。例えば、（ｉ）抗体Ａからの重鎖および軽鎖（軽鎖はカッパ軽鎖である）ならびに（ｉｉ）抗体Ｂからの重鎖および軽鎖（軽鎖はラムダ軽鎖である）を含む二重特異性抗体は、抗体Ａの重鎖ＣＨ１ドメインをカッパ優先的であるＣＨ１ドメインバリアントに操作すること（例えば、１４７のＰｈｅおよび／または１８３のＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ等）、および抗体Ｂの重鎖ＣＨ１ドメインをラムダ優先的であるＣＨ１ドメインバリアントに操作すること（例えば、１４１のＡｓｐ等）によって、より効率的に産生され得、すなわち望ましくない産生関連汚染物がほとんどない。結果として、抗体Ａの重鎖は、抗体Ａの軽鎖への結合が容易となり（かつ抗体Ｂの軽鎖への結合を嫌う）、一方で抗体Ｂの重鎖は、抗体Ｂの軽鎖への結合が容易となる（かつ抗体Ａの軽鎖への結合を嫌う）。図１および７、ならびに表６を参照のこと。

一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントは、誤対合、すなわち非同族のＨＣ１－ＬＣ２および／またはＨＣ２－ＬＣ１の対の形成を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％減少させる。一部の実施形態では、１４１位の置換、例えば１４１Ｄを、それ単独で、または他の置換、例えば１４７Ｆ＋１８３Ｒ、１４７Ｆ＋１８３Ｋ、１４７Ｆ＋１８３Ｙとの組み合わせで含有するＣＨ１ドメインバリアントは、誤対合、すなわち非同族のＨＣ１－ＬＣ２および／またはＨＣ２－ＬＣ１の対の形成を、少なくとも２５％から少なくとも８０％減少させる。一部の実施形態では、１４１位の置換、例えば１４１Ｄを、それ単独で、または他の置換、例えば１８３Ｒ、１８３Ｋ、１８３Ｙ、１４７Ｆ＋１８３Ｒ、１４７Ｆ＋１８３Ｋ、１４７Ｆ＋１８３Ｙとの組み合わせで含有するＣＨ１ドメインバリアントは、誤対合、すなわち非同族のＨＣ１－ＬＣ２および／またはＨＣ２－ＬＣ１の対の形成を、少なくとも５０％減少させる。一部の実施形態では、１４１位の置換、例えば１４１Ｄを、それ単独で、または他の置換、例えば１８３Ｒ、１８３Ｋ、１８３Ｙ、１４７Ｆ＋１８３Ｒ、１４７Ｆ＋１８３Ｋ、１４７Ｆ＋１８３Ｙとの組み合わせで含有するＣＨ１ドメインバリアントは、誤対合、すなわち非同族のＨＣ１－ＬＣ２および／またはＨＣ２－ＬＣ１の対の形成を、少なくとも７５％減少させる。

一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントが、同族のＣＬドメイン（ＣκまたはＣλのいずれか）と、または対応するＣＬドメイン（ＣκまたはＣλのいずれか）を含有する同族の軽鎖と、優先的に対合（結合）して、結果的に所望の第一および第二の同族の対の、すなわちＨＣ１－ＬＣ１および／またはＨＣ２－ＬＣ２の、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の形成を生じる。一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントは、同族のＣＬドメイン（ＣκまたはＣλのいずれか）と、または対応するＣＬドメイン（ＣκまたはＣλのいずれか）を含有する同族の軽鎖と、優先的に対合（結合）して、結果的に所望の第一および第二の同族の対の、すなわちＨＣ１－ＬＣ１および／またはＨＣ２－ＬＣ２の、約８０％～約９９％、またはより具体的には少なくとも約８５％～少なくとも約９５％の形成を生じる。一部の実施形態では、１４１位の置換、例えば１４１Ｄを、それ単独で、または他の置換、例えば１８３Ｒ、１８３Ｋ、１８３Ｙ、１４７Ｆ＋１８３Ｒ、１４７Ｆ＋１８３Ｋ、１４７Ｆ＋１８３Ｙとの組み合わせで含有するＣＨ１ドメインバリアントは、所望の第一および第二の同族の対の、すなわちＨＣ１－ＬＣ１および／またはＨＣ２－ＬＣ２の、約８５％～少なくとも約９５％の形成を提供する。

一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントは、誤対合した重鎖－軽鎖のヘテロ二量体の、すなわちＨＣ１－ＬＣ２および／またはＨＣ２－ＬＣ１の対の形成を、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満に、減少させる。一部の実施形態では、１４１位の置換、例えば１４１Ｄを、それ単独で、または他の置換、例えば１８３Ｒ、１８３Ｋ、１８３Ｙ、１４７Ｆ＋１８３Ｒ、１４７Ｆ＋１８３Ｋ、１４７Ｆ＋１８３Ｙとの組み合わせで含有するＣＨ１ドメインバリアントは、誤対合した重鎖－軽鎖のヘテロ二量体の形成を、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満に、減少させる。

軽鎖の結合の選択性に、すなわちカッパＣＬドメインまたはラムダＣＬドメインと優先的な対合に、影響を与えるものとして、いくつかのＣＨ１ドメインの位置が特定され、これには１１８、１１９、１２４、１２６～１３４、１３６、１３８～１４３、１４５、１４７～１５４、１６３、１６８、１７０～１７２、１７５～１７６、１８１、１８３～１８５、１８７、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２０８、２１０～２１４、２１６および２１８位（ＥＵ番号付け）が含まれた。ＣＨ１ドメイン内のこれらの位置の任意の一つまたは複数における野生型アミノ酸残基を、あるバリアント（非野生型）アミノ酸残基で置換すると、カッパＣＬドメインまたはラムダＣＬドメインのいずれかを含有する軽鎖に対して優先的に対合する重鎖が得られる。例えば、１４７および１８３位の各々が、カッパＣＬドメインに対する対合の選択性を有するものとして特定され、また１４１、１７０、１７１、１７５、１８１、１８４、１８５、１８７、および２１８位が、ラムダＣＬドメインに対する対合の選択性を有するものとして特定された。

ＣＨ１ドメインの１４１位における野生型アミノ酸残基（Ａｌａ）を、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＧｌｎで置換すると、ラムダＣＬドメインを含有する軽鎖との結合に対する重鎖の選択性の増加が示された。ＣＨ１ドメインの１７０位における野生型アミノ酸残基（Ｐｈｅ）の、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、もしくはＴｈｒでの置換；ＣＨ１ドメインの１７１位における野生型アミノ酸残基（Ｐｒｏ）の、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、もしくはＡｌａでの置換；ＣＨ１ドメインの１７５位における野生型アミノ酸残基（Ｍｅｔ）の、Ａｓｐ、もしくはＭｅｔでの置換；ＣＨ１ドメインの１８１位における野生型アミノ酸残基（Ｓｅｒ）の、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、もしくはＴｈｒでの置換；ＣＨ１ドメインの１８４位における野生型アミノ酸残基（Ｓｅｒ）の、Ａｒｇでの置換；ＣＨ１ドメインの１８５位における野生型アミノ酸残基（Ｖａｌ）の、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒでの置換；ＣＨ１ドメインの１８７位における野生型アミノ酸残基（Ｔｈｒ）の、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、もしくはＳｅｒでの置換；および／またはＣＨ１ドメインの２１８位における野生型アミノ酸残基（Ｌｙｓ）の、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、もしくはＴｒｐでの置換もまた、ラムダＣＬドメインを含有する軽鎖との重鎖の対合の増加に寄与する。

ＣＨ１ドメインの１４７位における野生型アミノ酸残基（Ｌｙｓ）を、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、またはＧｌｎで置換すると、カッパＣＬドメインを含有する軽鎖との結合に関する重鎖の選択性の増加が示された。ＣＨ１ドメインの１８３位における野生型アミノ酸残基（Ｓｅｒ）を、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、またはＧｌｎで置換すると、カッパＣＬドメインを含有する軽鎖との結合に関する重鎖の選択性の増加が示された（図５を参照）。特定の位置における所与のバリアントアミノ酸残基の影響は、変化し得るが、全てのバリアントが、バリアント残基を含むアミノ酸位置に基づいて、ＣκまたはＣλとの優先的な対合の改善を示す。さらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のＣＨ１領域において類似性が高度であることを考慮すると、本明細書に記載されるＣＨ１ドメインバリアントは、各アイソタイプにおいて同様の優先的対合特性を示すこととなることが予期される。

選択の最初のラウンドで、野生型ＣＨ１ドメイン配列（１４１位がＡｌａ）と比較して、Ｃλとの優先的な対合を促進するものとして１４１位におけるＴｈｒが特定されたが、選択のさらなるラウンドで、Ｔｈｒと比較して、優先的な対合の増加をもたらすものとして、Ａｓｐ、Ａｒｇ、およびＧｌｎが特定された（図５を参照）。さらなるスクリーニング戦略により、ラムダ選択性の増加ももたらすものとして、ＬｙｓおよびＧｌｕが特定された（実施例５、図１０～１４を参照）。１７０位のＧｌｕ、１７１位のＧｌｕ、１７５位のＭｅｔ、１８１位のＬｙｓ、１８４位のＡｒｇ、１８５位のＡｒｇ、１８７位のＡｒｇ、および／または２１８位のＰｒｏ、Ａｌａ、もしくはＧｌｕもまた、ラムダ選択性を増加させることが見出された（実施例５～７を参照）。さらに、出願人が示す、ラムダ選択性を増加させる特定の置換の組み合わせとしては、１４１位のＡｓｐおよび１８１位のＬｙｓ、１４１位のＡｓｐ、１８１位のＬｙｓ、および２１８位のＡｌａ、１４１位のＡｓｐ、１８１位のＬｙｓ、および２１８位のＰｒｏ、１４１位のＧｌｕ、１７０位のＧｌｕ、１８１位のＶａｌ、および１８７位のＡｒｇ、１４１位のＧｌｕ、１７１位のＡｓｐ、および１８５位のＡｒｇ、１４１位のＧｌｕ、１７１位のＧｌｕ、および１８５位のＡｒｇ、１４１位のＧｌｕ、１７１位のＧｌｙ、１８５位のＡｒｇ、および１８７位のＡｒｇ、１４１位のＧｌｕ、１８５位のＡｒｇ、および１８７位のＡｒｇ、１４１位のＧｌｕ、１７１位のＳｅｒ、および１８１位のＬｙｓ、１４１位のＧｌｕ、１７０位のＧｌｙ、１７５位のＭｅｔ、１８１位のＶａｌ、１８４位のＡｒｇ、および１８７位のＡｒｇ、が挙げられるがこれらに限定されない。さらなるスクリーニングの成果では、特にラムダ優先的なＣＨ１ドメイン置換の組み合わせとして、「１４１位のＡｓｐ、１７１位のＧｌｕ、および１８５位のＡｒｇ」および「１４１位のＡｓｐ、１７０位のＧｌｕ、および１８７位のＡｒｇ」が特定された（図２０、２３、３０および３１を参照）。

同様に、選択の最初のラウンドでは、野生型ＣＨ１ドメイン配列と比較して、１４７位のＶａｌまたはＡｌａおよび１８３位のＬｙｓがＣκとの優先的な対合を促進するものとして特定されたが、選択のさらなるラウンドでは、それぞれ１４７ＶａｌもしくはＡｌａまたは１８３Ｌｙｓと比較して、優先的な対合を増加させるものとして、１４７位におけるＰｈｅ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、もしくはＧｌｎおよび／または１８３位におけるＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、もしくはＧｌｎが特定された。これらＣＨ１ドメインバリアントは、単独で、または他のアミノ酸置換と組み合わせて、かかるＣＨ１ドメインバリアントを含有する重鎖と、ＣκまたはＣλを含有する軽鎖との優先的な対合を向上させることができる。

本明細書においては、以下の位置のうちの一つまたは複数においてアミノ酸置換を含むバリアントＣＨ１ドメインが提供され、したがって、当該ＣＨ１ドメインバリアントは、ＣκまたはＣλのいずれか（またはかかるドメインを含む軽鎖）に対して優先的な対合を示す：ＥＵ番号付けに従って、１１８、１１９、１２４、１２６～１３４、１３６、１３８～１４３、１４５、１４７～１５４、１６３、１６８、１７０～１７２、１７５～１７６、１８１、１８３～１８５、１８７、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２０８、２１０～２１４、２１６、２１８位。本明細書において実証されるように、これら位置のうちの一つまたは複数における異なるアミノ酸残基の置換が、ＣκまたはＣλのいずれかと優先的に対合するＣＨ１ドメインをもたらし得る（表３および表４を参照）。いくつかの実施形態では、１４７位（ＥＵ番号付け）におけるアミノ酸置換は、システインではない。いくつかの実施形態では、１８３位（ＥＵ番号付け）におけるアミノ酸置換は、システインまたはトレオニンではない。一部の実施形態では、１４７位（ＥＵ番号付け）におけるアミノ酸置換は、システインではなく、かつ１８３位（ＥＵ番号付け）におけるアミノ酸置換は、システインまたはトレオニンではない。

一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントは、以下の位置のうちの一つまたは複数においてアミノ酸置換を含み、ＣＨ１ドメインバリアント（またはかかるドメインを含む重鎖）のＣκ（またはかかるドメインを含む軽鎖）に対する優先的な対合を駆動する：１１８、１２４、１２６～１２９、１３１～１３２、１３４、１３６、１３９、１４３、１４５、１４７～１５１、１５３～１５４、１７０、１７２、１７５～１７６、１８１、１８３、１８５、１９０～１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２１０、２１２～２１４および２１８位（ＥＵ番号付け）。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、以下のうちの一つまたは複数である：１１８位は、Ｇで置換される、１２４位は、Ｈ、Ｒ、Ｅ、Ｌ、またはＶで置換される、１２６位は、Ａ、Ｔ、またはＬで置換される、１２７位は、Ｖ、またはＬで置換される、１２８位は、Ｈで置換される、１２９位は、Ｐで置換される、１３１位は、Ａで置換される、１３２位は、Ｐで置換される、１３４位は、Ｇで置換される、１３６位は、Ｅで置換される、１３９位は、Ｉで置換される、１４３位は、Ｖ、またはＳで置換される、１４５位は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、またはＴで置換される、１４７位は、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、Ｖ、Ｅ、Ｈ、Ｙ、またはＱで置換される、１４８位は、Ｉ、Ｑ、Ｙ、またはＧで置換される、１４９位は、Ｃ、Ｓ、またはＨで置換される、１５０位は、Ｌ、またはＳで置換される、１５１位は、Ａ、またはＬで置換される、１５３位は、Ｓで置換される、１５４位は、Ｍ、またはＧで置換される、１７０位は、Ｇ、またはＬで置換される、１７２位は、Ｖで置換される、１７５位は、Ｇ、Ｌ、Ｅ、Ａで置換される、１７６位は、Ｐで置換される、１８１位は、Ｙ、Ｑ、またはＧで置換される、１８３位は、Ｉ、Ｗ、Ｆ、Ｅ、Ｙ、Ｌ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、またはＲで置換される、１８５位は、Ｗで置換される、１９０位は、Ｐで置換される、１９１位は、Ｉで置換される、１９７位は、Ａで置換される、２０１位は、Ｓで置換される、２０３位は、Ｓで置換される、２０４位は、Ｙで置換される、２０５位は、Ｑで置換される、２０６位は、Ｓで置換される、２１０位は、Ｒで置換される、２１２位は、Ｇで置換される、２１３位は、Ｅ、またはＲで置換される、２１４位は、Ｒで置換される、および２１８位は、Ｑで置換される。一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントは、１４７および１８３位におけるアミノ酸置換を含み、カッパ軽鎖との優先的な対合（結合）が駆動される。一部の実施形態では、１４７位において置換されるアミノ酸は、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、Ｖ、Ｅ、Ｈ、Ｙ、およびＱからなる群から選択され、ここで１８３位において置換されるアミノ酸は、Ｉ、Ｗ、Ｆ、Ｅ、Ｙ、Ｌ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、およびＲからなる群から選択される。特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントは、単独で、または１４７位におけるＦとの組み合わせで、１８３位においてＲまたはＫまたはＹを含む。カッパ優先的なＣＨ１ドメインバリアントの非限定的な例は、配列番号１３７、１３８、１３９、６０、４１、または１３６のアミノ酸配列を含んでもよい。

一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントは、以下の位置のうちの一つまたは複数においてアミノ酸置換を含み、ＣＨ１ドメインバリアント（またはかかるドメインを含む重鎖）のＣλ（またはかかるドメインを含む軽鎖）に対する優先的な対合を駆動する：１１９、１２４、１２６～１２７、１３０～１３１、１３３～１３４、１３８～１４２、１５２、１６３、１７０～１７１、１７５、１８１、１８３～１８５、１８７、１９７、２０３、２０８、２１０～２１４、２１６および２１８位（ＥＵ番号付け）。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、以下のうちの一つまたは複数である：１１９位は、Ｒで置換される、１２４位は、Ｖで置換される、１２６位は、Ｖで置換される、１２７位は、Ｇで置換される、１３０位は、Ｈ、またはＳで置換される、１３１位は、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、またはＤで置換される、１３３位は、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｅ、Ｓ、またはＰで置換される、１３４位は、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｖ、Ｎ、またはＬで置換される、１３８位は、Ｒで置換される、１３９位は、Ａで置換される、１４０位は、Ｉ、Ｖ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、Ｓ、Ｗ、Ｒ、Ｌ、またはＰで置換される、１４１位は、Ｄ、Ｔ、Ｒ、Ｅ、Ｋ、Ｑ、Ｖ、またはＭ、好ましくはＤ、Ｅ、またはＫで置換される、１４２位は、Ｍで置換される、１５２位は、Ｇで置換される、１６３位は、Ｍで置換される、１６８位は、Ｆ、Ｉ、またはＶで置換される、１７０位は、Ｎ、Ｇ、Ｅ、Ｓ、またはＴ、好ましくはＥ、またはＧで置換される、１７１位は、Ｎ、Ｅ、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｄ、好ましくはＤ、Ｅ、Ｇ、またはＳで置換される、１７５位は、Ｄ、またはＭ、好ましくはＭで置換される、１８１位は、Ｖ、Ｌ、Ａ、Ｋ、またはＴ、好ましくはＫ、またはＶで置換される、１８３位は、Ｌ、またはＶで置換される、１８４位は、Ｒで置換される、１８５位は、Ｍ、Ｌ、Ｓ、Ｒ、またはＴ、好ましくはＲで置換される、１８７位は、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、またはＳで置換される、１９７位は、Ｓで置換される、２０３位は、Ｄで置換される、２０８位は、Ｉで置換される、２１０位は、Ｔで置換される、２１１位は、Ａで置換される、２１２位は、Ｎで置換される、２１３位は、Ｅで置換される、２１４位は、Ｒで置換される、２１６位は、Ｇで置換される、および２１８位は、Ｐ、Ａ、Ｌ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｉ、Ｍ、Ｇ、Ｃ、Ｋ、またはＷ、好ましくはＰ、またはＡで置換される。一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインは、残基１４１にアミノ酸置換を含み、ラムダ軽鎖への優先的な対合を駆動する。一部の実施形態では、残基１４１において置換されるアミノ酸は、Ｔ、Ｒ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ｄ、およびＭからなる群から選択される。特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントは、１４１位にＡｓｐまたはＧｌｕを含む。いくつかの実施形態では、１４１位におけるアミノ酸置換は、ＣＨ１内の一つまたは複数の置換と、例えば１８１位のＬｙｓ、または１８１位のＬｙｓ、および２１８位のＡｌａまたはＰｒｏと、組み合わせてもよい。１４１位におけるＡｓｐまたはＧｌｕは、１７０、１７１、１７５、１８１、１８４、１８５、および／または１８７位における一つまたは複数の置換と、例えば１７０位におけるＧｌｕもしくはＧｌｙ、１７１位におけるＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、もしくはＳｅｒ、１７５位におけるｍｅｔ、１８１位におけるＶａｌ、もしくはＬｙｓ、１８４位におけるＡｒｇ、１８５位におけるＡｒｇ、および／または１８７位におけるＡｒｇなどと、組み合わせてもよい。ラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントの非限定的な例は、配列番号１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５５、１５７、１５９、１６２、１６３、１６４、１６５、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、または１８９のアミノ酸配列を含み得る。

特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントは、１４１Ｄ、１８１Ｋ、および２１８Ｐの組み合わせ、１４１Ｄ、１７１Ｅ、および１８５Ｒの組み合わせ、または１４１Ｄ、１７０Ｅ、および１８７Ｒの組み合わせを含む。さらなる実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントは、配列番号１８８、１８６、または１４３のアミノ酸配列を含む。

本開示はまた、ＣＨ１ドメインバリアントを含むポリペプチド、例えば抗体も企図する。かかるポリペプチドは、第一のＣＨ１ドメインバリアントを含有する第一の重鎖と、第二のＣＨ１ドメインバリアントを含有する第二の重鎖とを含む多重特異性抗体であってもよい。第一の重鎖および第二の重鎖は、異なるエピトープに結合することができる。一部の実施形態では、抗体は、第一のＣＨ１ドメインを含む第一の重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、第一の重鎖ＣＨ１ドメインとは異なるアミノ酸配列を含む第二のＣＨ１ドメインを含む第二の重鎖をさらに含む。

一部の実施形態では、第一のＣＨ１ドメインバリアントは、Ｃκと優先的に対合（または結合）することができ、また第二のＣＨ１ドメインバリアントは、Ｃλと優先的に結合することができる。この場合、第一の軽鎖は、Ｃκドメインを含み、また第二の軽鎖は、Ｃλドメインを含む。一部の実施形態では、第一の軽鎖は、カッパ軽鎖（ＣκとＶκ）またはキメラ軽鎖（ＣκとＶλ）であり、また第二の軽鎖は、ラムダ軽鎖（ＣλとＶλ）またはキメラ軽鎖（ＣλとＶκ）である。

一部の実施形態では、第一のＣＨ１ドメインバリアントは、Ｃλと優先的に対合（結合）することができ、また第二のＣＨ１ドメインは、Ｃκと優先的に対合（結合）することができる。この場合、第一の軽鎖は、Ｃλドメインを含み、また第二の軽鎖は、Ｃκドメインを含む。一部の実施形態では、第一の軽鎖は、ラムダ軽鎖（ＣλとＶλ）またはキメラ軽鎖（ＣλとＶκ）であり、また第二の軽鎖は、カッパ軽鎖（ＣκとＶκ）またはキメラ軽鎖（ＣκとＶλ）である。

第一の軽鎖および第二の軽鎖は、ＣＨ１ドメインへの優先的な対合を駆動するアミノ酸置換を含んでもよい（または含まなくてもよい）。一部の実施形態では、軽鎖のＣＬドメインは、重鎖への、例えばＣＨ１ドメインへの結合を変化させるようには改変されない。一部の実施形態において、第一の軽鎖は、野生型ＣＬドメイン、例えば野生型Ｃκドメインまたは野生型Ｃλドメイン、を含有する。一部の実施形態において、第二の軽鎖は、野生型ＣＬドメイン、例えば野生型Ｃκドメインまたは野生型Ｃλドメイン、を含有する。野生型カッパ軽鎖またはＣκドメインは、ＩＧＫＣによってコードされてもよい。野生型ラムダ軽鎖またはＣλドメインは、ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、またはＩＧＬＣ７によってコードされてもよい。

一部の実施形態では、抗体は多重特異性抗体である。一部の実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。こうした多重特異性抗体および二重特異性抗体は、ＣＨ１ドメインを含有する任意の形式を含み得、例えば図２４～図２９に示す構造などであるがこれに限定されない。例えば、表２においてＢｒｉｎｋｍａｎｎａｎｄＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ＭＡｂｓ９（２）：１８２－２１２（２０１７）も参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

多重特異性抗体は、表３、４、７、９、１２、または１３に列挙されるアミノ酸配列を有するＣＨ１ドメインバリアントのうちの一つまたは複数を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、第一のＣＨ１ドメインバリアントを含有する第一の重鎖と第一の軽鎖とを含むものであり、第一の重鎖および第一の軽鎖が、第一の同族対を形成する。第一のＣＨ１ドメインバリアントは、ＥＵ番号付けに従って、１１８、１１９、１２４、１２６～１３４、１３６、１３８～１４３、１４５、１４７～１５４、１６３、１６８、１７０～１７２、１７５～１７６、１８１、１８３～１８５、１８７、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２０８、２１０～２１４、２１６、２１８位のうちの一つまたは複数の位置にアミノ酸置換を含み得る。こうした第一のＣＨ１ドメインバリアントは、第一の軽鎖に優先的に結合する。第一の軽鎖のＣＬドメインは、第一の重鎖への結合を変化させるように改変されてもよく、または改変されなくてもよい。

一部の実施形態では、抗体は、第二のＣＨ１ドメインバリアントを含有する第二の重鎖と第二の軽鎖とを含むものであり、第二の重鎖および第二の軽鎖が、第二の同族対を形成する。第二のＣＨ１ドメインバリアントは、ＥＵ番号付けに従って、１１８、１１９、１２４、１２６～１３４、１３６、１３８～１４３、１４５、１４７～１５４、１６３、１６８、１７０～１７２、１７５～１７６、１８１、１８３～１８５、１８７、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２０８、２１０～２１４、２１６、２１８位のうちの一つまたは複数の位置にアミノ酸置換を含み得る。こうした第二のＣＨ１ドメインバリアントは、第二の軽鎖に優先的に結合する。第二の軽鎖のＣＬドメインは、第二の重鎖への結合を変化させるように改変されてもよく、または改変されなくてもよい。

多重特異性抗体または抗体断片のある実施形態では、抗体または抗体断片は、カッパ優先的なＣＨ１ドメインバリアントおよびラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントを含み得る。一部の例では、カッパ優先的なＣＨ１ドメインバリアントは、本明細書に開示されるカッパ優先的なＣＨ１ドメインバリアントであり得、またラムダ優先的なＣＨ１ドメインは、本明細書に記載されていても記載されていなくてもよいラムダ優先的なＣＨ１ドメインであり得る。一部の例では、ラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントは、本明細書に開示されるラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントであり得、またカッパ優先的なＣＨ１ドメインは、本明細書に記載されていても記載されていなくてもよいカッパ優先的なＣＨ１ドメインであり得る。ある例では、カッパ優先的なＣＨ１ドメインバリアントおよびラムダ優先的なＣＨ１ドメインバリアントのいずれも、本明細書に開示されるバリアントである。

本明細書に開示されるＣＨ１ドメインバリアントのいずれかを使用して、カッパＣＬドメインまたはラムダＣＬドメインに対する対合の選択性を提供することができ、またＣＬドメインは、野生型または非野生型であり得る。さらに、本明細書に開示されるＣＨ１ドメインバリアントのいずれかを使用して、抗体または抗体断片の構造内にカッパ／ラムダ対合の選択性を提供してもよく、これは抗体構造の残りの部分への、例えばＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨ、ＶＬ、またはＣＬドメインへの、さらなるアミノ酸改変の導入を伴うか、または当該導入を伴わない。例えば、本明細書に開示されるＣＨ１ドメインバリアントは、軽鎖の対合の選択性をさらに増強し得るＶＨ置換と共に用いられ得る（例えばＶＨ：ＶＬ置換、例えばＱ３９Ｅ／Ｋ：Ｑ３８Ｋ／Ｅ（Ｄｉｌｌｏｎｅｔａｌ．，ＭＡｂｓ２０１７９（２）：２１３－２３０）、またはＱ３９Ｋ＋Ｒ６２Ｅ：Ｑ３８Ｄ＋Ｄ１ＲまたはＱ３９Ｙ＋Ｑ１０５Ｒ：Ｑ３８Ｒ＋Ｋ４２Ｄ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎｅｔａｌ．，ＭＡｂｓ２０１７９（２）：１８２－２１２等））。

本発明の範囲に影響を与えることを意図するものではないが、本明細書に提供されるＣＨ１ドメインバリアントは、ＣＨ２、ＣＨ３、または可変ドメインにおける別の改変を必要とせずに、野生型軽鎖（または野生型ＣＬドメインを含むポリペプチド）の文脈においてカッパ／ラムダ対合の選択性を提供したが、こうした非ＣＨ１改変は、任意で、本明細書の発明者によって発見された新規のＣＨ１ドメインバリアントと組み合わせて使用されてもよいということを強調する。これは、抗体の産生の分野において、特に多重特異性抗体で、ＣＨ１ドメインのみを改変することが有意なカッパまたはラムダの選択性をもたらすという、多くの報告された失敗を考慮すると、特に予想外である。

一部の実施形態では、抗体は医薬組成物の一部である。かかる組成物は、本明細書に記載されるＣＨ１ドメインバリアントを含む複数のポリペプチド、例えば抗体を含有してもよい。

また、本開示は、こうしたＣＨ１ドメインバリアントを取得する方法も企図している。本明細書に記載されるバリアントＣＨ１ドメインは、合理的な設計（インシリコで）によって、または無作為に、例えばｅＰＣＲもしくは当技術分野で公知の他の変異原性技術を使用して、特定されてもよい。一実施形態では、合理的な設計アプローチを使用して、バリアントＣＨ１ドメインを設計する。こうしたアプローチのために、構造のセット、例えば実験に由来したタンパク質構造、例えばＦａｂ結晶構造、を構築し、分析して、ＣＨ１－ＣＬドメイン界面（ＣＨ１－ＣＬドメイン界面位置とも呼ぶ）にわたる接触に関与する溶媒露出位置を特定してもよい。当該セットは、例えば参照（野生型）のＣＨ１、Ｃκ、およびＣλに対して一致率が高いというような一定の特性を有する構造を選択することによって監督され得る。一部の実施形態では、一対の側鎖原子が、５Åのカットオフ距離の範囲内にあるならば、別の残基と接触している（または「接触状態」にある）として位置が記述または規定される。「ＣＨ１界面残基」は、ＣＨ１ドメイン内の残基であって、ＣκドメインまたはＣλドメイン内の残基と接触する残基として規定されて得る。用語「残基」および「位置」は、この文脈で区別なく使用され得る。また、ＣＨ１－ＶＨ界面内のＣＨ１位置（例えば、ＣＨ１の１５１位）におけるアミノ酸置換が、軽鎖のアイソタイプの選択性を変化させることも、発明者の予想外の発見である。したがって、一部の実施形態では、ＶＨの残基と接触するＣＨ１位置（例えば、一対の側鎖原子が、５Åのカットオフ距離の範囲内にある）も、合理的なＣＨ１ドメインバリアントの同定のために選択され得る。

単独か組み合わせかによらず（例えば、シングレット、ダブレット、トリプレットなど）、どのアミノ酸位置を変化させるかの選択は、例えば異なる構造中のＣＨ１とＣＬとの間またはＣＨ１とＶＨとの間の界面を形成する際の当該位置の一貫した役割、構造全体における当該位置の接触性、当該位置と、抗原結合に影響を与える位置との関係、またはＣＨ１：ＣＬもしくはＣＨ１：ＶＨの界面の形成に、該界面にわたる分子間接触に直接関与することなくアロステリックな様式で影響を与える残基がもつ可能性などの、様々な異なるパラメータに依存し得る。一部の実施形態では、ＣＨ１ドメイン内のアミノ酸残基は、１）残基が、Ｃκセット内の構造の少なくとも１０％において、軽鎖定常ドメインとの界面にあり、かつＣκセット内の構造の少なくとも９０％において、１０％超の溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）率を有する場合（実施例１を参照）、または２）残基が、Ｃλセット内の構造の少なくとも１０％において軽鎖定常ドメインとの界面にあり、かつＣλセット内の構造の少なくとも９０％において１０％超のＳＡＳＡ率を有する場合、または３）Ｃ_κセットおよび／もしくはＣ_λセットの代表的セットの少なくとも１０％のＶＨとの界面における残基が、Ｃ_κセットおよび／もしくはＣ_λのセットの代表的セットの少なくとも９０％において１０％超の溶媒接触表面積率を有するならば、変異のために選択される。

さらに、本明細書で提供される、カッパまたはラムダへの選択性を与えるＣＨ１ドメインにおける特有のアミノ酸置換の各々について、置換の結果として含まれるアミノ酸は、保存的アミノ酸置換によりさらに置換されて、同等のカッパまたはラムダへの選択性を提供する別のＣＨ１ドメインバリアントを得ることができる。あるいは、ＣＨ１ドメインバリアントの各々について、野生型配列と比べてＣＨ１ドメインバリアントに影響しなかった一つまたは複数のアミノ酸位置を、保存的置換により改変して、同等のカッパまたはラムダの選択性を提供する別のＣＨ１ドメインバリアントを得ることができる。

「保存的アミノ酸置換」は、当技術分野で公知であり、そして一定の物理的および／または化学的特性を有する一つのアミノ酸が同じまたは類似の化学的または物理的特性を有する別のアミノ酸と交換されるようなアミノ酸置換を含む。例えば、保存的アミノ酸置換は、ある酸性／負電荷をもつ極性アミノ酸の別の酸性／負電荷をもつ極性アミノ酸での置換（例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕ）、ある非極性側鎖をもつアミノ酸の別の非極性側鎖をもつアミノ酸での置換（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｖａｌなど）、ある塩基性／正電荷をもつ極性アミノ酸の別の塩基性／正電荷をもつ極性アミノ酸での置換（例えば、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇなど）、ある極性側鎖をもつ無電荷のアミノ酸の別の極性側鎖をもつ無電荷のアミノ酸での置換（例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）、あるβ－分枝側鎖をもつアミノ酸の別のβ－分枝側鎖をもつアミノ酸での置換（例えば、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、およびＶａｌ）、ある芳香族側鎖をもつアミノ酸での別の芳香族側鎖をもつアミノ酸での置換（例えば、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒ）などであり得る。

次に、ＣＨ１ドメイン残基が変動するライブラリーを生成してもよい。一つまたは複数のＣＨ１ドメイン残基は、ライブラリー内で変動してもよい。一部の実施形態では、約一～六のＣＨ１ドメイン残基が、ライブラリー内で変動している。個々の残基位置におけるアミノ酸の多様性は、縮重コドン、例えばＮＮＫを介して生成されて、所与のＣＨ１ドメイン位置における少なくとも２０種の天然アミノ酸のすべてを表すことが可能になり得る。選択されたＣＨ１ドメイン位置は、点置換（シングレットとも呼ばれる）を生成するように個別に変動させてもよく、または位置の組み合わせのサブセットは、例えば、二重置換および三重置換（ダブレットおよびトリプレットとも呼ばれる）を生成するように組み合わせて変動させてもよい。一部の実施形態では、３Ｄ空間の近傍にあるＣＨ１ドメイン位置を含むバリアントの組み合わせが生成され、例えば位置１４７×［１２４、１２６、１４５、１４８、１７５および１８１］である。

一部の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントライブラリーを作製する方法は、ａ）一つまたは複数のカッパ定常（Ｃκ）ドメイン、一つまたは複数のラムダ定常（Ｃλ）ドメイン、および一つまたは複数のＣＨ１ドメインを含有する構造のセットを提供すること、ｂ）一つもしくは複数のＣκドメイン位置および／または一つもしくは複数のＣλドメイン位置と接触する一つもしくは複数の溶媒露出ＣＨ１ドメイン位置を、置換のために選択すること、ｃ）ステップｂ）で特定された一つまたは複数のＣＨ１ドメイン位置を、親のアミノ酸以外の任意のアミノ酸で置換すること、ならびにｄ）ステップｃ）のＣＨ１バリアントドメインをコードするポリペプチドを合成して、ＣＨ１バリアントドメインライブラリーを構築すること、を含む。

一部の実施形態では、一つまたは複数のＣκドメイン、一つまたは複数のＣλドメイン、および一つまたは複数のＣＨ１ドメインが、野生型である。一部の実施形態では、一つまたは複数のＣκドメイン、一つまたは複数のＣλドメイン、および一つまたは複数のＣＨ１ドメインが、ヒト（すべての対立遺伝子機能性バリアントを含む）である。一部の実施形態では、ステップａ）のＣκアミノ酸配列は、ＩＧＫＣによってコードされる。一部の実施形態では、ステップａ）のＣλアミノ酸配列は、ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、またはＩＧＬＣ７によってコードされる。特定の実施形態では、ステップａ）のＣλアミノ酸配列は、ＩＧＬＣ２によってコードされる。一部の実施形態では、結果として得られるＣＨ１ドメインライブラリーは、ＣＨ１－ＣＬ界面またはＣＨ１－ＶＨ界面にわたる相互作用を必要とするように設計される。

一部の実施形態では、置換のために選択される一つまたは複数のＣＨ１アミノ酸残基が、（ｉ）ＣＨ１：Ｃκ構造の代表的セットの少なくとも１０％において軽鎖定常ドメインとの界面にあり、かつＣＨ１：Ｃκ構造の代表的セットの少なくとも９０％において１０％超の溶媒接触表面積率を有する、（ｉｉ）ＣＨ１：Ｃλ構造の代表的セットの少なくとも１０％において軽鎖定常ドメインとの界面にあり、かつＣＨ１：Ｃλ構造の代表的セットの少なくとも９０％において１０％超の溶媒接触表面積率を有する、または（ｉｉｉ）Ｃ_κおよび／もしくはＣ_λ構造の代表的セットの少なくとも１０％においてＶＨとの界面にあり、かつＣ_κおよび／もしくはＣ_λ構造の代表的セットの少なくとも９０％において１０％超の溶媒接触表面積率を有する。

一部の実施形態では、ライブラリーは、軽鎖のアイソタイプの選択性を改変させるような本明細書に開示される一つまたは複数のＣＨ１の位置（例えば、１４１、１４７、１５１、１７０、１７１、１８１、１８３、１８５、１８７、もしくは２１８位、またはそれらの任意の組み合わせ）、および任意で一つまたは複数の対象とするさらなるＣＨ１の位置を変化させることによって生成される。ある実施形態では、ライブラリーは、軽鎖のアイソタイプの選択性を改変させるような本明細書に開示される一つまたは複数のＣＨ１の位置（例えば、１４１、１４７、１５１、１７０、１７１、１８１、１８３、１８５、１８７、または２１８位、またはそれらの任意の組み合わせ）における所定の置換を、変化させた一つまたは複数の対象とするさらなるＣＨ１の位置と組み合わせることによって生成され得る。特定の実施例では、所定の置換は、Ａ１４１Ｄ、Ａ１４１Ｅ、Ｋ１４７Ｆ、Ｐ１５１Ａ、Ｐ１５１Ｌ、Ｆ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ｅ、Ｓ１８１Ｋ、Ｓ１８３Ｒ、Ｖ１８５Ｒ、Ｔ１８７Ｒ、またはＫ２１８Ｐ、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。

一部の実施形態では、ライブラリーは、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖への優先的な結合を示すＣＨ１ドメインバリアントを特定するためにスクリーニングされる。こうしたスクリーニングは、例えば真核細胞、例えば酵母細胞、例えば酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの適切な宿主細胞においてライブラリーを発現することによって開始され得る。宿主細胞においてライブラリー中に含まれるＣＨ１バリアントドメインを発現した後、バリアントのライブラリーをスクリーニングして、例えばＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを介して、所望の結合特性を有するそれらのバリアントを特定することができる。

一部の実施形態では、ＣκまたはＣλドメインと優先的に結合するＣＨ１ドメインバリアントを特定する方法は、ａ）一つまたは複数のカッパ定常（Ｃκ）ドメイン、一つまたは複数のラムダ定常（Ｃλ）ドメイン、および一つまたは複数のＣＨ１ドメインを含有する構造のセットを提供すること、ｂ）一つもしくは複数のＣκドメイン位置および／または一つもしくは複数のＣλドメイン位置と接触する一つもしくは複数の溶媒露出ＣＨ１ドメイン位置を、置換のために選択すること、ｃ）ステップｂ）で特定された一つまたは複数のＣＨ１ドメイン位置を、親のアミノ酸以外の任意のアミノ酸で置換すること、ｄ）ステップｃ）のＣＨ１バリアントドメインをコードするポリペプチドを合成して、ＣＨ１バリアントドメインライブラリーを構築すること、ならびにｅ）ｄ）のライブラリーをスクリーニングして、ＣκまたはＣλドメインに優先的に結合するＣＨ１ドメインバリアントを特定することを含む。

一部の実施形態では、一つまたは複数のＣκドメイン、一つまたは複数のＣλドメイン、および一つまたは複数のＣＨ１ドメインが、野生型である。一部の実施形態では、一つまたは複数のＣκドメイン、一つまたは複数のＣλドメイン、および一つまたは複数のＣＨ１ドメインが、ヒト（すべての対立遺伝子機能性バリアントを含む）である。一部の実施形態では、ステップａ）のＣκアミノ酸配列は、ＩＧＫＣによってコードされる。一部の実施形態では、ステップａ）のＣλアミノ酸配列は、ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、またはＩＧＬＣ７によってコードされる。特定の実施形態では、ステップａ）のＣλアミノ酸配列は、ＩＧＬＣ２によってコードされる。一部の実施形態では、結果として得られるＣＨ１ドメインライブラリーは、ＣＨ１－ＣＬ界面にわたるまたはＣＨ１－ＶＨ界面における相互作用を必要とするように設計される。

一部の実施形態では、置換のために選択される一つまたは複数のＣＨ１アミノ酸残基が、（ｉ）ＣＨ１：Ｃκ構造の代表的セットの少なくとも１０％において軽鎖定常ドメインとの界面にあり、かつＣＨ１：Ｃκ構造の代表的セットの少なくとも９０％において１０％超の溶媒接触表面積率を有する、（ｉｉ）ＣＨ１：Ｃλ構造の代表的セットの少なくとも１０％において軽鎖定常ドメインとの界面にあり、かつＣＨ１：Ｃλ構造の代表的セットの少なくとも９０％において１０％超の溶媒接触表面積率を有する、または（ｉｉｉ）ＣＨ１：Ｃ_κおよび／またはＣＨ１：Ｃ_λ構造の代表的セットの少なくとも１０％においてＶＨとの界面にあり、かつＣＨ１：Ｃ_κおよび／またはＣＨ１：Ｃ_λ構造の代表的セットの少なくとも９０％において１０％超の溶媒接触表面積率を有する。

本明細書に記載される方法は、一つまたは複数の置換されたＣＨ１アミノ酸残基が、ラムダＣＬドメイン（またはラムダＣＬドメインを含む軽鎖）と比較してカッパＣＬドメイン（またはカッパＣＬドメインを含む軽鎖）に対して優先的な重鎖の対合を駆動すること、またはその逆を検証することをさらに含んでもよい。蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＬＣ－ＭＳ、アルファＬＩＳＡ、およびＳＤＳ－ＰＡＧＥを含むがこれに限定されない、様々な方法を使用して、優先的な軽鎖対合を評価することができる。一部の実施形態では、ステップｃ）で置換のために選択される一つまたは複数のＣＨ１ドメイン位置は、所定の頻度で軽鎖との界面において生じ、例えば、任意の所与の野生型抗体構造のセットにおいて、選択されたＣＨ１ドメイン位置が、構造の少なくとも１０％においてＣＬドメインと接触する。一部の実施形態では、ステップｃ）で置換のために選択される一つまたは複数のＣＨ１ドメイン位置は、任意の所与のＣκまたはＣλのセットの構造の少なくとも約９０％以上において、約１０％超の溶媒接触表面積率を有する。一部の実施形態では、ステップｃ）で置換のために選択される一つまたは複数のＣＨ１ドメイン位置は、所定の頻度でＶＨ領域との界面において生じ、例えば、任意の所与の野生型抗体構造のセットにおいて、選択されたＣＨ１ドメイン位置が、構造の少なくとも１０％においてＶＨと接触する。

ＣＨ１ドメインバリアントを特定するために本明細書に記載の方法を採用することにより、以下のＣＨ１ドメイン位置を、置換のために選択した：１１４、１１６、１１８、１１９、１２１～１２４、１２４～１４３、１４７～１５４、１６０、１６２～１６５、１６７、１６８、１７０～１７２、１７４、１７５、１７６、１７８、１８０、１８１、１８３～１８５、１８７、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０８、２１０～２１４、２１６、および／または１２８位（ＥＵ番号付けに従って）。これらＣＨ１ドメイン位置の任意の一つまたは組み合わせを置換することによって、特定のＣＬドメインに対して優先的に対合するＣＨ１ドメインを生じ得る。結果として、こうしたＣＨ１ドメインバリアントを含む重鎖と、特定のＣＬドメインを含む軽鎖とは、同族対を形成する可能性がより高く、すなわち、一つまたは複数のＣＨ１ドメイン置換によって少なくとも部分的に駆動される同族対を形成する、重鎖および軽鎖間の優先的な対合が存在する。

一実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントは、Ｃκと優先的に対合し、結果として、Ｃκドメインを含有する軽鎖と、ＣＨ１ドメインバリアントを含有する重鎖との優先的な対合が駆動される。別の実施形態では、ＣＨ１ドメインバリアントは、Ｃλドメインと優先的に対合し、結果として、Ｃλドメインを含有する軽鎖と、ＣＨ１ドメインバリアントを含有する重鎖との優先的な対合が駆動される。ある例示的なＣＨ１ドメイン置換は、カッパ軽鎖との優先的な重鎖対合を促進するものとして特定され、例えば１４７Ｆおよび／または１８３Ｒ、１８３Ｋまたは１８３Ｙであり、一方で、他のＣＨ１ドメイン置換は、ラムダ軽鎖との優先的な重鎖対合を促進するものとして特定され、例えば１４１Ｄ、１４１Ｅ、１４１Ｋ、１７０Ｅ、１７０Ｇ、１７１Ｅ、１７１Ｄ、１７１Ｇ、１７１Ｓ、１７５Ｍ、１８１Ｋ、１８１Ｂ、１８４Ｒ、１８５Ｒ、１８７Ｒ、２１８Ａまたは２１８Ｐである。したがって、かかるＣＨ１ドメインバリアントを含む二重特異性抗体は、重鎖－軽鎖対合において、向上した正確性でもって生成され得る。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＨ１λ（例えば、１７０Ｅ、１７０Ｇ、１７１Ｅ、１７１Ｄ、１７１Ｇ、１７１Ｓ、または１７５Ｍおよび／または１８１Ｋ、１８１Ｂ、１８４Ｒ、１８５Ｒ、１８７Ｒ、２１８Ａおよび／または２１８Ｐと組み合わせた、１４１Ｄ、１４１Ｅまたは１４１Ｋなど）を含む第一の重鎖と、ＣＨ１κ（例えば１４７Ｆおよび／または１８３Ｒ、１８３Ｋ、または１８３Ｙ）を含む第二の重鎖とを含有し、そのそれぞれが、その同族の軽鎖に対して優先的に対合する。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＨ１κ（例えば、１４７Ｆおよび／または１８３Ｒ、１８３Ｋまたは１８３Ｙなど）を含む第一の重鎖と、ＣＨ１λ（例えば１７０Ｅ、１７０Ｇ、１７１Ｅ、１７１Ｄ、１７１Ｇ、１７１Ｓまたは１７５Ｍおよび／または１８１Ｋ、１８１Ｂ、１８４Ｒ、１８５Ｒ、１８７Ｒ、２１８Ａおよび／または２１８Ｐと組み合わせた、１４１Ｄ、１４１Ｅまたは１４１Ｋなど）を含む第二の重鎖とを含有し、例えば「１４１Ｄ、１７１Ｅおよび１８５Ｒ」または「１４１Ｄ、１７０Ｅおよび１８７Ｒ」であり、そのそれぞれが、その同族の軽鎖に対して優先的に対合する。

本明細書に記載される方法を用いることによって得られたＣＨ１バリアントドメインをコードするポリペプチドは、宿主細胞、例えば真核細胞において組換えで発現されてもよい。一部の実施形態では、ＣＨ１バリアントドメインは、酵母において発現される。一部の実施形態では、酵母菌株は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。一部の実施形態では、酵母菌株は、一つまたは複数の野生型カッパ軽鎖および一つまたは複数の野生型ラムダ軽鎖を共発現する。

本発明を実証するために、実施例を以下に提供する。これらの実施例は、本発明を任意の特定の用途または動作理論に制限することを意図するものではない。

実施例１：ライブラリーにおける多様化のためのＣＨ１ドメイン位置のインシリコ選択
Ｆａｂ結晶構造のセットを、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）から構築し、そして構造が誘導するアプローチに使用して、多様化のためのＣＨ１－ＣＬ界面残基を特定した。

２，３６７種のＦａｂ結晶構造である最初のセットを、参照（野生型）のＣＨ１、ＣκおよびＣλの配列（以下に示す）に対して高い一致率を有する構造を選択することによって狭めた。ＣＨ１のアライメントのための参照配列は、ＣＨ１固有のもの（ＥＵ残基１１８～２１５）にＩｇＧ１ヒンジの一部（ＥＵ残基２１６～２２９）を合わせたものに及ぶ。ＣκおよびＣλの参照配列は、それぞれＥＵ残基番号１０８～２１４および１０７Ａ～２１５に及ぶ。

ＣＨ１（プラス上方から中央のヒンジ）の参照：ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号１）。

Ｃκの参照：ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２）。

Ｃλの参照：ＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ（配列番号３）。

残基は、一対の側鎖原子が、５Åのカットオフ距離の範囲内にあるならば、「接触している」状態にあるとして規定した。ＣＨ１界面の残基を、個々の構造において一つまたは複数のＣκまたはＣλ残基と接触した残基として規定した。

個々の重鎖残基および軽鎖残基の溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）は、「遊離状態」で、すなわちそれぞれ軽鎖および重鎖と対合していない状態で、計算した。このＳＡＳＡ率は、当該残基のＳＡＳＡの、残基と同じアミノ酸（すなわちＸ）を組み込んでいる単離Ｇｌｙ－Ｘ－Ｇｌｙトリペプチドモデルの残基のＳＡＳＡに対する比として規定した。溶媒に露出する残基は、１０％超のＳＡＳＡ率を有する残基として規定した。

高い一致率によって結晶構造の最初のセットを狭めることで、結果的に、１８３種のＣＨ１：Ｃκ構造（「Ｃκセット」）および４３種のＣＨ１：Ｃλ構造（「Ｃλセット」）であるセットの同定がされた。構造において欠損しているアミノ酸に起因するアラインメント内のギャップを考慮した後で、Ｃκセット内のすべてのエントリーは、ＣＨ１およびＣκの参照配列と１００％一致であったが、一方でＣλセット内のエントリーは、参照配列と＞９９％の一致であった。

ＣκおよびＣλ間の構造に基づく配列アラインメントを以下に示す。ＣＨ１は、ＣκおよびＣλの両方と、後者のドメイン間では配列同一性が低いにもかかわらず、安定した界面を形成する。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアによる保存的置換および半保存的置換は、それぞれ「｜」および「：」を用いて示される。ドメイン間の配列同一性は３８．３％である（１０７個のＣκ残基に対して４１個の一致）。

下線を引いたアミノ酸は、ＣＨ１ドメインと接触するＣκおよびＣλ残基を表す。この決定は、ＣκおよびＣλのセットにおけるＦａｂ構造に対するコンセンサスに基づく。２５個のＣκ界面残基と２６個のＣλ界面残基が存在する。２×２のマトリックスを、ＣκまたはＣλ（Ｎ＝２８）のいずれかで界面にある位置に焦点を当てて、かつ（１）所与の位置にある残基がＣＨ１と接触するかどうか、および（２）その位置にあるアミノ酸がＣκとＣλとの間で同一であるかどうかに応じて構築した（表１を参照）。

表１は、構造的に保存される、すなわちＥＵ残基番号付けが同一であるが、アミノ酸同一性は異なる、ＣＨ１ドメインと接触する１４のＣκおよびＣλの位置であるセットが存在することを強調している。表２は、１４のアミノ酸位置（ＥＵ番号付け）を列挙し、カッパおよびラムダ軽鎖中に存在するアミノ酸を示す。ＣκおよびＣλの界面残基の同一性におけるこのような差異は、ＣκまたはＣλにのみ特異的に結合するが、両方には特異的に結合しない変異型ＣＨ１ドメインを生成するために利用され得る。

ライブラリー内の変異の選択のための最初の閾値として、個々のＣＨ１ドメイン位置が、以下の基準を満たす必要があった：１）当該位置が、Ｃκセット内の構造の少なくとも１０％において軽鎖定常ドメインとの界面にあり、かつその位置における残基が、Ｃκセット内の構造の少なくとも９０％において１０％超のＳＡＳＡ率を有すること、または２）当該位置が、Ｃλセット内の構造の少なくとも１０％において軽鎖定常ドメインとの界面にあり、かつその位置における残基が、Ｃλセット内の構造の少なくとも９０％において１０％超のＳＡＳＡ率を有すること、または３）当該位置が、ＣＨ１：Ｃκセット（Ｃκセット）もしくはＣＨ１：Ｃλセット（Ｃλセット）内の構造の少なくとも１０％におけるＶＨ領域との界面にあり、かつＣκおよび／またはＣλセット内の構造の少なくとも９０％において、１０％超のＳＡＳＡ率を有すること。界面の規定は、任意のＣＬドメイン残基、すなわち表２に列挙された十四個のＣＬドメイン残基であるセットを含むがこれに限定されない当該残基とのＣＨ１残基の接触、または任意のＶＨ残基とのＣＨ１残基の接触、を考慮する。

この閾値基準に基づいて、三十のＣＨ１アミノ酸位置であるセットを、（Ｃｙｓ２２０を考慮から除外した後）潜在的な包含のために特定した。このより大きなセットから、２５のＣＨ１位置の一群を、ライブラリー内で変動させるために選択した。各位置におけるアミノ酸の多様性は、２０種すべての天然アミノ酸を表す縮重ＮＮＫコドンを介して生成された（Ｓｔｅｍｍｅｒｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１９９４Ｏｃｔ２５；９１（２２）：１０７４７－５１）。アミノ酸置換を、２５のＣＨ１位置の各々で個別になし、そして単一置換のサブセットを選択的に組み合わせ、例えば、二重変異体および三重変異体を生成した。最終的なライブラリーの設計は、２５のシングレット（単一のＣＨ１位置でのＮＮＫコドンの多様化）、４８のダブレット変異体（二のＣＨ１位置でのＮＮＫコドンの多様化）、および１６のトリプレット変異体（三のＣＨ１位置でのＮＮＫコドンの多様化）を表す８９種のＣＨ１オリゴヌクレオチドからなった。
実施例２：酵母で共発現するＣκおよびＣλ軽鎖のＣＨ１ドメインバリアントライブラリー

ヒトＣＨ１ドメインバリアントのライブラリーを構築し、野生型ヒトＩｇＧＣκおよびＣλ軽鎖を共発現する操作された酵母菌株中で発現させた（Ｃλに優先的なＣＨ１置換およびＣκに優先的なＣＨ１置換のその後の選択を可能にさせる、様々な発現レベルで）。

二方向性の発現プラスミド（ｐＡＤ７０６４およびｐＡＤ４８００）が構築されたが、その各々が、野生型ヒトＩｇＧ軽鎖カッパおよびラムダ定常ドメイン、および酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＵＲＡ３遺伝子（選択マーカー）に隣接した、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧａｌ１／Ｇａｌ１０プロモーター領域を含有した。プラスミドｐＡＤ７０６４およびｐＡＤ４８００は、Ｇａｌ１／１０プロモーター領域に対して、カッパ定常ドメインおよびラムダ定常ドメインの配向が異なっていた。固有の制限酵素部位（ＰＭＥ－ＩおよびＳＦＩ－Ｉ）が、各プラスミド内のカッパ定常ドメインおよびラムダ定常ドメインの上流に配置された。ｐＡＤ７０６４およびｐＡＤ４８００は、別個にＰＭＥ－ＩおよびＳＦＩ－Ｉで消化され、その後、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ挿入物（ＡＤＩ－２６１４０軽鎖領域；Ｇａｌ１／１０プロモーター領域；および、各プラスミドへの相同組み換えを介してアセンブリを誘導する５’末端および３’末端を伴う、異なるようにコードされる（「変性される」）ＡＤＩ－２６１４０軽鎖可変領域（ＩＤＴ社ｇｂｌｏｃｋ））とともに、操作された酵母菌株に形質転換された。形質転換された酵母を、ＵＲＡ３＋を欠く固体寒天プレート上に播種し、３０℃で４８時間増殖させた後、クローンを採取し、ＤＮＡを抽出して精製した。配列決定後、以下の二つの二重軽鎖ＤＮＡ構築物が特定された：（１）Ｇａｌ１０：：ＡＤＩ－２６１４０－ＶＬ－Ｃκ Ｇａｌ１：：ＡＤＩ－２６１４０－ＶＬ－Ｃλ（ヒトＣλ、この支配的なプロモーターの制御下でその後のＣκに優先的なＣＨ１置換の選択を可能にする）；および（２）Ｇａｌ１０：：ＡＤＩ－２６１４０－ＶＬ－Ｃλ Ｇａｌ１：：ＡＤＩ－２６１４０－ＶＬ－Ｃκ（ヒトＣκ、この支配的なプロモーターの制御下でその後のＣλに優先的なＣＨ１置換の選択を可能にする）。ＡＤＩ－２６１４０は、抗鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）ＩｇＧである。

重鎖発現については、Ｇａｌ１プロモーター、ＳＦＩ－Ｉ制限部位、ヒトＩｇＧ重鎖のＣＨ２－ＣＨ３ドメイン（ＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ））、およびＴＲＰ１（選択マーカー）を含有するＤＮＡベクター（ｐＡＤ４４６６）を構築した。

並行して、ＣＨ１ドメインバリアントＤＮＡ断片の二つの独立したプールを、ｐＡＤ４４６６への挿入のために生成した。第一のプールは、実施例１に記載されるインシリコ設計アプローチを使用して生成された。第二のプールは、誤りがちのＰＣＲ（ｅＰＣＲ）を介して生成された。簡潔に述べると、変異原性ヌクレオチド類似体ｄＰＴＰ（０．０１ｍＭ）および８－オキソ－ＤＧＴＰ（０．０１ｍＭ）が、（ａ）それぞれ１：１００および１：１００の希釈、または（ｂ）それぞれ１：１００および１：１０の希釈で、ＰＣＲ反応に含まれた。

ｐＡＤ４４６６をＳＦＩ－Ｉで消化し、ＡＤＩ－２６１４０ＨＣ可変領域をコードするＰＣＲ増幅ＤＮＡ、および合理的な設計努力またはｅＰＣＲからのＣＨ１ドメインバリアントＤＮＡと共に、ＣκおよびＣλを発現する酵母菌株に導入した。各ＤＮＡ断片は、消化したプラスミドまたはＰＣＲ断片（ＡＤＩ－２６１４０重鎖可変領域またはＣＨ１タンパク質ドメイン）とのアセンブリを誘導する（相同組み換えを介して）５’末端および３’末端において適切なＤＮＡ配列を保有していた。

個々のライブラリーのアセンブリを、天然の酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の相同組み換えプロセスを介して行った。各ライブラリーの形質転換細胞の希釈物を、ウラシルおよびトリプトファンを欠いた培地に播種し、各ライブラリーのメンバー数を定量した。各ライブラリーで、１０^７を超えるメンバーに達した。各（ＨＣおよび二重ＬＣ）プラスミドの存在を選択するために、形質転換細胞の残りの部分を、ウラシルおよびトリプトファンを欠いた液体培地中で培養した。
実施例３：軽鎖結合に影響を与えるＣＨ１ドメイン位置の特定

ライブラリーは、先に記載されるように増殖させた（例えば、国際公開第２００９０３６３７９合；国際公開第２０１０１０５２５６号；国際公開第２０１２００９５６８号；Ｘｕｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ．２０１３Ｏｃｔ；２６（１０）：６６３－７０を参照）。簡潔に述べると、ＩｇＧの誘導および提示後、酵母細胞（約１０＾７～１０＾８）を、ＰＢＳＦ中で、１：１００希釈したヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２のカッパ－ＦＩＴＣ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社、アラバマ州バーミンガム、カタログ番号２０６２－０２）および１：１００希釈したヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）_２のラムダ－ＰＥ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社、アラバマ州バーミンガム、カタログ番号２０７２－０９）で、４℃で１５分間染色した。氷冷洗浄緩衝液で２回洗浄した後、細胞ペレットを０．４ｍＬのＰＢＳＦ中で再懸濁し、ストレーナーキャップ付き分取チューブに移した。ＦＡＣＳＡＲＩＡソーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して分取を行い、（１）カッパ軽鎖の相応な欠如を伴ってラムダ軽鎖を増加させるために（図２Ａ）、または（２）ラムダ軽鎖の相応な欠如を伴ってカッパ軽鎖を増加させるために（図２Ｂ）、分取ゲートを決定した。選択の三ラウンド後、ウラシルおよびトリプトファンを欠いた培地に酵母を播種し、配列同定用に単一の単離株を生成した。

固有の配列を表す個々のクローンを、９６ウェルプレート中で培養した。ＩｇＧの誘導および提示後、約２×１０^６の酵母細胞を、ＰＢＳＦ中で、１：１００希釈したヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２のカッパ－ＦＩＴＣ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社、アラバマ州バーミンガム、カタログ番号２０６２－０２）および１：１００希釈したヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）_２のラムダ－ＰＥ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社、アラバマ州バーミンガム、カタログ番号２０７２－０９）で、４℃で１５分間染色した。氷冷洗浄緩衝液で２回洗浄した後、細胞ペレットを０．１ｍＬの洗浄緩衝液中に再懸濁し、９６ウェルプレートハンドラーを備えたＢＤＦＡＣＳＣａｎｔｏ機器で評価した。個々の固有クローンを、抗カッパ蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）の抗ラムダＭＦＩに対する比（カッパ：ラムダ比）（図３）についてスコア付けし、次いで野生型ＣＨ１配列（「親」）を有する対応する株と比較して、ＦＯＰを計算した。

以下のＣＨ１ドメイン位置（ＥＵ番号付け）が、軽鎖の結合の選択性、すなわちカッパＣＬドメイン（またはカッパＣＬドメインを含有する軽鎖）またはラムダＣＬドメイン（またはラムダＣＬドメインを含有する軽鎖）のいずれかに対する優先的な結合、に影響を与えるものとして特定された：１１８、１１９、１２４、１２６～１３４、１３６、１３９～１４１、１４３、１４５、１４７～１５４、１６３、１６８、１７０～１７２、１７５～１７６、１８１、１８３、１８５、１８７、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２０８、２１０～２１４、２１６、および２１８位。表３は、カッパ軽鎖に対して優先的である、選択から特定されたＣＨ１配列の一覧を提供する。配列の欄内の太字のアミノ酸残基は、置換された位置、すなわち親とは異なるアミノ酸置換を示す（配列番号１）。表４は、ラムダ軽鎖に対して優先的である、選択から特定されたＣＨ１配列の一覧を提供する。配列の欄内の太字のアミノ酸残基は、置換された位置を示す。

予想外に、ＣＨ１：軽鎖界面ではなく、ＶＨ：ＣＨ１界面に位置するいくつかのＣＨ１アミノ酸置換が、３鎖系においてカッパ結合の選択性を生じさせることが見出された。特に、変異セットＫ１４７Ｖ＋Ｐ１５１ＡおよびＰ１５１Ｌ＋Ｎ２０１Ｓ（配列番号３６および７０、表３）より、それぞれ１８．１および１０．４のカッパＦＯＰ値が得られた。位置ＣＨ１：１４７がＣＨ１：ＬＣ界面にあるが、ＣＨ１：２０１はそうではない（完全に溶媒に露出しており、いかなるドメイン間の界面の一部でもない）。したがって、これら高ＦＯＰのクローンの両方におけるＰ１５１置換の出現が、ラムダに対するカッパ選択性を決定する際に、この位置の潜在的な役割を示唆している。理論に拘束されることを意図するものではないが、このような遠位の変異は、以下に論じる理由によりＨＣ：ＬＣの対合に影響を与えると考えられており、そのためラムダよりも優先的なカッパの対合のためにＶＨ：ＣＨ１界面における変異を利用することが可能であり得る。

第一に、Ｐ１５１は、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとの間のいわゆる「ボールソケットジョイント（ｂａｌｌ－ａｎｄ－ｓｏｃｋｅｔｊｏｉｎｔ）」の一部である（ＬｅｓｋＡ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９８８Ｓｅｐ８；３３５（６１８６）：１８８－９０；ＬａｎｄｏｌｆｉＮ．Ｆ．ｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ．２００１Ｆｅｂ１；１６６（３）：１７４８－５４）。このジョイントは、その抗体の可変ドメインと定常ドメインとの間にある「エルボ角度」への影響によりドメイン内柔軟性を調節すると仮定されている（ＳｔａｎｆｉｅｌｄＲ．Ｌ．ｅｔａｌ．，ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２００６Ａｐｒ１４；３５７（５）：１５６６－７４）。ボールソケットジョイント内の置換は、この領域における単一のアミノ酸置換に起因して中和活性が低下した抗ＩＦＮ－ガンマモノクローナル抗体の場合のように、機能的結果を有する可能性がある（ＬａｎｄｏｌｆｉＮ．Ｆ．ｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ．２００１Ｆｅｂ１；１６６（３）：１７４８－５４）。この効果は、抗原結合界面における直接的な変化によるものではなく、変化した柔軟性およびアロステリックな機構に起因する。第二に、ラムダ定常ドメインをもつＦａｂは、カッパドメインをもつＦａｂと比較して、より大きな範囲のエルボ角度を有することも知られている（ＳｔａｎｆｉｅｌｄＲ．Ｌ．ｅｔａｌ．，ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２００６Ａｐｒ１４；３５７（５）：１５６６－７４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２００６．０１．０２３．Ｅｐｕｂ２００６Ｊａｎ２５．）。この高い柔軟性は、ＶＬドメインとＣＬドメインとの間のいわゆるスイッチ領域における単一の残基の挿入に起因している。第三に、Ｆａｂ結晶構造のさらなる分析（Ａｄｉｍａｂ社の未発表データ）により、ボールソケットジョイント領域における原子パッキングの、カッパＦａｂとラムダＦａｂとの間の違いが明らかにされている。すなわち、ボールソケットジョイントによるＦａｂの柔軟性の調節が、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖を有するＦａｂ間の固有の違いと一緒になって、ＶＨ：ＣＨ１界面における変異による、ラムダと比較したカッパの選択性の差異を導出する新規の機構を示唆する。
実施例４：カッパ優先的またはラムダ優先的な軽鎖の対合を伴うＣＨ１ドメインバリアントの特定および特徴解析

ＣκおよびＣλの選択性の増加のための選択から導出されたクローンを、カッパおよびラムダ間のＭＦＩ比に基づいて、さらなる特徴解析のために選択した（図４を参照）。２０種のアミノ酸（ＮＮＫ）の各々に対して、対象とする各位置（１４１、１４７、または１８３）において単一の変異をもつＤＮＡのプールを、単離して、増幅した。適切な軽鎖塩基株を使用して、これらの単一の位置を標的とするライブラリーを、前述した様式で構築した。四つのライブラリーを、ＣＨ１ドメインのそれぞれ１４１、１４７、１８３、または１４７＋１８３位に存在する変異を含めて構築した。カッパ選択性またはラムダ選択性のための選択は、上述のように実施した。前述のように結果物を配列決定し、適切な親と比較したカッパまたはラムダの選択性についてのＦＡＣＳに基づく定量を実施して、軽鎖のカッパまたはラムダに優先的な対合をもたらしたアミノ酸置換を決定した。

１４１、１４７、および１８３位の各々においてアミノ酸残基置換を有するいくつかのＣＨ１ドメインバリアントが、カッパＣＬドメイン（またはカッパＣＬドメインを含有する軽鎖）またはラムダＣＬドメイン（またはラムダＣＬドメインを含有する軽鎖）のいずれかに対して対合の選択性を有するものとして特定された。ＣＨ１ドメインの１４１位における、Ｄ、Ｒ、またはＱでの置換（野生型のＡと比較して）で、ラムダＣＬドメイン（またはラムダＣＬドメインを含有する軽鎖）との優先的な対合が増加する（すなわち、カッパ：ラムダのＭＦＩ比が減少）（図５を参照）。ＣＨ１ドメインの１４７位における、Ｆ、Ｉ、Ｔ、Ｙ、Ｌ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、ＭまたはＱでの置換（野生型のＫと比較して）で、カッパＣＬドメイン（またはカッパＣＬドメインを含む軽鎖）との優先的な対合が増加する（すなわち、カッパ：ラムダのＭＦＩ比が増加）（図５を参照）。ＣＨ１ドメインの１８３位における、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｗ、Ｅ、ＦまたはＱへの置換（野生型のＳと比較して）で、カッパＣＬドメイン（またはカッパＣＬドメインを含有する軽鎖）との優先的な対合が増加する（すなわち、カッパ：ラムダのＭＦＩ比が増加）（図５を参照）。表５は、対合の選択性を駆動する特定のアミノ酸置換を有する観察されたＣＨ１ドメインバリアントの数を示す。

次に、ＩｇＧ様形式（２つのＦａｂ領域が二量体Ｆｃ分子にＮ末端で結合した）の対照標準二重特異性抗体（２重鎖×２軽鎖）に対する、特定したＣＨ１ドメインバリアントの影響を評価した。二つの承認された臨床治療抗体ウステキヌマブおよびパニツムマブに由来するＶＨ－ＣＨ１配列を使用した。重鎖の所望されるヘテロ二量体対合を促進するために、「ｋｎｏｂ」変異（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）および「ｈｏｌｅ」変異（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を導入した。標準プロトコルによりＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションする前に、ＤＮＡプラスミドを、サンガー法シーケンシングにより確認した。

トランスフェクトされたＨＥＫ細胞をＣＤｏｐｔｉＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で培養し、トランスフェクション後６日目に上清を回収し、プロテインＡ系のアフィニティ精製を行った。精製したＩｇＧをＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ（登録商標）（ＧｅｎｏｖｉｓＡＢ社）で処理し、Ｆａｂ領域をＦｃ部分から酵素的に切断した。

精製したＦａｂに対してＬＣＭＳを実行し、各ＩｇＧ成分の配列（２重鎖×２軽鎖）を確認し、各成分の相対割合を決定した（図７を参照）。簡潔には、精製したＩｇＧをＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮで消化し、Ｆａｂ領域をＦｃ部分から酵素的に切断した。Ｆａｂサンプルを、６５℃で維持されたＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｒ２１０μｍカラム（２．１×３０ｍｍ、０．１ｍＬ）を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣに注入した。注入後、２ｍＬ／分の流量で、２～９５％アセトニトリルの０．２１分のグラジエントにより、カラムからサンプルを溶出した（移動相Ａ：Ｈ_２Ｏ中０．１％のギ酸、移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％のギ酸）。分流弁を使用して、１５０μＬ／分の総流量をＢｒｕｋｅｒ社ｍａＸｉｓ４Ｇ質量分析計にロードした。質量分析計は、陽イオンモードで、７００～２５００ｍ／ｚの範囲で実行した。その他のソースパラメーターは、以下のように設定した：キャピラリーを５５００Ｖに、ネブライザーを４．０Ｂａｒに、乾燥ガスを４．０Ｌ／分に、および乾燥温度を２００℃に設定した。取得したＭＳスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ社ＣｏｍｐａｓｓＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓバージョン４．１を使用して分析した。理論上の配列と比較して、マス測定に基づいて、インタクトなＦａｂ種の検出を確認した。種それぞれの相対的な定量を、種ごとのピークの強度を全てのピーク強度の総和と比較して計算した。

両方の重鎖が野生型である場合、不正確な対合が約３０％の確率で発生する。しかしながら、重鎖が本明細書に記載されるＣＨ１バリアントドメインを含む場合、重鎖と軽鎖との正しい対合が有意に向上する（図７および表６を参照）。ｐａｎｉ軽鎖は野生型である。ｕｓｔｅ軽鎖はラムダ融合である。ＨＣ１はｐａｎｉであり、ＬＣ１はｐａｎｉカッパであり、ＨＣ２はｕｓｔｅであり、ＬＣ２はｕｓｔｅラムダである。例えば、第一の重鎖（ＨＣ１）がＫ１４７ＦおよびＳ１８３Ｒ／Ｋ／Ｙを含有し、第二の重鎖がＡ１４１Ｄを含有する（それぞれＢｓＡｂ１０、１２、および１４）場合、誤対合は、少なくとも半分に緩和され、すなわち６．８％、１０．５％、または１１％のみの確率で生じる。実際に、１４１位における単一の置換（１４１Ｄ）は、誤対合の５０％の減少、すなわち６．１％対３．１％のＨＣ１－ＬＣ２および２２．８％対９．９％のＨＣ２－ＬＣ１（ＢｓＡｂ２）、をもたらす。それに基づいて、出願人は、表７に、カッパまたはラムダの軽鎖／ＣＬドメインの選択性を有する例示的なＣＨ１ドメイン配列を提供する。

精製された抗体の発現および質を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により評価した。簡潔に述べると、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣを使用して、カラムクロマトグラフィー（ＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム）を観察した。使用前に、抗体－カラム相互作用の可能性を最小化するために、高グリコシル化して凝集したＩｇＧでカラムを予め馴化し、洗浄緩衝液（２００ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ６．８）で平衡化した。約２～５μｇのタンパク質サンプルをカラムに注入し、流量を０．４００ｍＬ／分に調整した。タンパク質の遊走を波長２８０ｎｍで観察した。合計アッセイ時間は、約１１分であった。ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用してデータを分析した。ＳＥＣプロファイルは、ＣＨ１ドメイン置換が、野生型と比較してバリアントプロファイルに影響を与えないことを確認した（データは示さず）。
精製した二重特異性抗体のヒトＩＬ－１２Ｂ（Ｕｓｔｅ）およびヒトＥＧＦＲ（Ｐａｎｉ）への結合についての結合親和性および結合動態を測定し、ＣＨ１バリアントドメインが標的結合に影響を与えなかったことを確認した（図６Ａ～６Ｅを参照）。１００ｎＭの抗原を含んだＯｃｔｅｔ（登録商標）ＱＫｅ機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）を使用して、二重特異性ＩｇＧサンプルを抗ｈＩｇＧＦｃセンサーチップ上で捕捉し、ＩＬ１２ＢまたはＥＧＦＲへの結合動態を測定した（結合速度：１８０秒および解離速度：１８０秒）。ＢＬＩ分析は、アッセイ緩衝液として１×キネティクス緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）を使用して、２９℃で実施した。まず抗ヒトＩｇＧＦｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）を、アッセイ緩衝液中に五分間以上予浸した。二重特異性ＩｇＧサンプル（５μｇ／ｍＬ）を、センサー上で３００秒間捕捉した。次いで、センサーをアッセイ緩衝液中に１２０秒間浸漬し、ベースラインを確立してから、ＩＬ１２ＢまたはＥＧＦＲタンパク質（１００ｎＭ濃度）への結合を測定した。ＩＬ１２ＢまたはＥＧＦＲの解離は、センサーをアッセイ緩衝液中で１８０秒間動かすことによって測定した。全てのステップにおいて攪拌は１０００ｒｐｍであった。Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェアバージョン８．２．０．７を用いて、参照サブトラクション、解離に基づく工程間補正、１対１結合モデル、および全体的適合（ｇｌｏｂａｌｆｉｔ）（センサーによって非結合のＲｍａｘ）を使用して、動態パラメータを生成した。結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および平衡定数（Ｋ_Ｄ）の値を、各測定に対して個別に割り当てた。
実施例５：１４１×１８１×２１８ライブラリーの構築物および選択

ラムダＣＬドメインとの優先的な対合をもたらすさらなるＣＨ１アミノ酸置換も特定された。従前の選択データならびに構造解析に基づいて、三つのＣＨ１位置のセット（１４１、１８１、および２１８）を、さらなる多様化（ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ）のために選択した。１４１位におけるアミノ酸多様性は、六種の天然アミノ酸（Ｄ、Ｔ、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＮ）を表す縮重コドンＲＭＷを介して生成された。１８１および２１８位におけるアミノ酸の多様性は、２０種の天然アミノ酸のすべてを表す縮重コドンＮＮＫを介して生成された。ライブラリー設計には、これら三つの位置におけるアミノ酸の可能な組み合わせがすべて含まれ、多様性は２，４００種類であった。ＧＡＬ１０プロモーター（ＧＡＬ１：：ＡＤＩ－２６１４０ＶＬ－ＣｋｘＧＡＬ１０：：ＡＤＩ－２６１４０ＶＬ－Ｃｌ）下でラムダ軽鎖を有する軽鎖株を使用して、このライブラリーを、前述のように構築した。ラムダ選択性のための選択は、抗ヒトカッパ－ＦＩＴＣ抗体および抗ヒトラムダ－ＰＥ抗体を用いた染色と、その後の前述のような複数ラウンドの細胞分取を介して行われた。結果物（９６のクローン）を前述のように配列決定し、親株に対するラムダ選択性についてのＦＡＣＳに基づく定量化を定量した。野生型（「ＷＴ」）および以前に特定されたリードクローンＡ１４１Ｄを解析に含めた。これらのデータに基づいて、親およびＡ１４１Ｄよりも、軽鎖ラムダの優先的な対合において最も大きな改善をもたらしたアミノ酸の組み合わせが特定された。

図８は、結果物であるクローンの大部分が、ＦＯＰ値によって決定されるように、ラムダ鎖と対合する際により高い選択性を有することを示す。表８は、図８において印した上位１３種のクローンに関する、ＣＨ１ドメイン置換およびラムダ：カッパのＭＦＩ比のＦＯＰ値を提供する。

分析は、１８１位におけるＫへの置換および２１８位におけるＬ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｉ、Ｍ、Ｇ、Ｃ、またはＷへの置換とペアの、１４１位におけるＤ、ＫまたはＥへの置換が、結果物であるクローン間で高頻度であり、Ａ１４１Ｄよりもラムダ軽鎖の選択性を増加させる（ラムダ：カッパＭＦＩ比の増加）ことを示した。図９は、ＣＨ１の１４１位におけるＤ、１８１位におけるＫ、および２１８位における様々なアミノ酸を有するクローン内で測定された、個々のおよび平均のＦＯＰ値を示す。リードＣＨ１配列を、ＬＣ染色（このプロセスはその後すべてのアッセイで採用される）およびクローンに戻すようにクローニングし、そしてラムダ選択性を、三つ組でＦＯＰ値を計算することによって確認した（図１０）。

追加の分析により、哺乳類ＩｇＧ産生用の９種の固有の候補ＣＨ１配列が生成された（表９を参照）。

この９種の候補ＣＨ１配列を、野生型（ＷＴ）（すなわち、「ＡＳＫ」）およびＡ１４１Ｄ（すなわち、「ＤＳＫ」）と共に、標準的な方法を介して哺乳類発現ベクターにクローニングした。ラムダ選択性を決定するために、所望の重鎖、ラムダ軽鎖、およびカッパ軽鎖を表すプラスミドを、２：１：１のプラスミド比でＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされたＨＥＫ細胞を培養し、ＩｇＧを前述のプロトコルを使用して精製した。理論に拘束されることを意図するものではないが、およそ等しい量の総重鎖ポリペプチドおよび総軽鎖ポリペプチドを発現することにより（ＨＣ：カッパＬＣ：ラムダＬＣ＝「２：１：１」、ここでは総ＨＣ：総ＬＣ＝１：１が得られる）（すなわち、過剰でないＨＣおよび過剰でないＬＣ）、発明者が様々なバイアスを回避することができることは明らかであり、それにより、ＣＨ１ドメインバリアントの真のカッパまたはラムダ選択性が可視化された。

ラムダ選択性のＦＡＣＳに基づく定量化を、この哺乳類産生ＩｇＧに対して行った。図１１は、ＦＡＣＳプロットを提供し、また図１２および表１０は、９種のＣＨ１バリアントおよび野生型（ＷＴ）およびＡ１４１Ｄ（すなわち、「ＤＳＫ」）に関するＦＯＰ値（ラムダ：カッパのＭＦＩ）を提供する。図１３は、ＣＨ１が１４１位においてＤである場合に、１８１位または１８１および２１８位におけるさらなる置換が、ラムダ選択性をさらに向上させることを示す（ラムダ：カッパのＭＦＩ比に基づく）。

さらに、還元された全長ＩｇＧのＬＣＭＳデータを使用して、精製されたＩｇＧサンプル中のラムダ軽鎖およびカッパ軽鎖の相対量を決定した。図１４は、カッパ軽鎖（ＬＣ）と対合した種の％とラムダ軽鎖と対合した種の％とを比較する。

これらデータの解析により、三種のＣＨ１配列（それぞれＤＫＰ、ＤＫＡ、およびＤＫＫ置換を有する配列番号１４３、１４２、および１４１）が、親および以前に特定されたリードＡ１４１Ｄよりもラムダ選択性が向上していることが得られた。

これらＣＨ１配列がカッパ軽鎖と対合するか否かを判定するために、候補ＣＨ１重鎖プラスミドを、ＨＥ２９３細胞に、１）カッパ軽鎖、または２）ラムダ軽鎖、のいずれかとともにトランスフェクトした。カッパ選択性をもつＣＨ１としてのＫ１４７ＦＳ１８３Ｒと、野生型（ＷＴ）、Ａ１４１Ｄもまた、対照として含めた。トランスフェクトされたＨＥＫ細胞を培養し、標準的な方法により精製した。連結された重鎖および軽鎖のＦａｂを、前述の方法を使用して精製されたＩｇＧから生成した。標準方法を使用してプロセス収率を決定し、野生型（ＷＴ）のプロセス収率に対して正規化して、「ＦＯＰ」プロセス収率を計算した。プロセス収率ＦＯＰに基づくと、カッパＬＣのみが存在する（しかしラムダＬＣはない）場合で、Ａ１４１Ｄ、Ａ１４１ＤＳ１８１Ｋ、Ａ１４１ＤＳ１８１ＫＫ２１８Ａ、およびＡ１４１ＤＳ１８１ＫＫ２１８Ｐのすべてが、依然としてカッパＬＣに結合したが、カッパＬＣとよりもラムダＬＣとでより多くの結合が生じた（図１５）。カッパ－Ｆａｂおよびラムダ－ＦａｂのＦａｂＴｍを、ＢｉｏＲａｄ社ＣＦＸ９６ＲＴＰＣＲを用いて示差走査型蛍光分析法により測定した（図１６）。各ＣＨ１バリアントについて、ラムダ対合ＦａｂのＴｍの相対的ゲイン（「相対的ラムダＴｍゲイン」または「正味ラムダＴｍゲイン」）は、［ラムダ対合ＷＴＦａｂに対するラムダ対合バリアントＦａｂのＴｍ変化（「ΔラムダＴｍ」）］－［カッパ対合ＷＴＦａｂに対するカッパ対合バリアントＦａｂのＴｍ変化（「ΔカッパＴｍ」）］として規定されるが、これを計算した（図１７）。図１７に示すように、相対的ラムダＴｍゲインは、Ｓ１８１またはＳ１８１およびＫ２１８におけるさらなる置換で増加した。理論に拘束されることを意図するものではないが、図１６および図１７に基づいて、カッパＬＣ対合の不安定化が、相対的ラムダＴｍゲインおよびラムダＣＬとの対合増加に寄与したようである。
実施例６：１４１×ＡＬＬライブラリーの構築物および選択

さらなるライブラリーを構築して、１４１位における置換とペアにしたときにラムダ優先的な結合を駆動するＣＨ１内の追加の残基をサンプリングした。六つの新しいライブラリー（ＬＡＤ１１５２２～ＬＡＤ１１５２７）を、ＣＨ１の三つの領域（ＤＯＲ１、ＤＯＲ２、およびＤＯＲ３）にわたって最大三つの置換を有するように設計した（表１１）。合わせて、六つのライブラリーは、１４１位とペアにした対象とする三つのドメイン内に二つの置換を含む、全ての可能性のある置換のセットを表す。全てのライブラリーにおいて、１４１位におけるアミノ酸多様性は、縮重コドンＲＭＷを介して生成され、また他の二つの変化させた位置におけるアミノ酸多様性は、縮重コドンＮＮＫを介して生成された。ライブラリーは、前述の方法を使用して構築した。ラムダ選択性のための選択は、先に記載したように実施した。

ＦＡＣＳ選択の第二ラウンド後、選択の結果物の多様性ＣＨ１を単離し、適切な二鎖の軽鎖株に再クローニングして、ライブラリー内の減少したカッパ軽鎖発現を回収した。この多様性ＣＨ１を、適切なプライマーを用いたＰＣＲ増幅および標準ＤＮＡ精製を使用して単離した。次いで、このＤＮＡ断片のプールを、ＡＤＩ－２６１４０重鎖可変領域を用いてエレクトロポレーションし、そしてプラスミドを、適切な二鎖軽鎖株に消化した。

結果物を前述のように配列決定し（図１８）、親株に対するラムダ選択性についてのＦＡＣＳに基づく定量化を定量した。以前に特定されたリードクローンＡ１４１ＤＳ１８１ＫＫ２１８Ｐを、解析に含めた。これらデータに基づいて、親よりも、軽鎖ラムダ優先的な対合において最も大きな改善をもたらしたアミノ酸の組み合わせを特定した。

２８種の固有のＣＨ１配列を含有する上位４６種のクローン（表１２）を、酵母中でＩｇＧとして発現した。野生型（ＷＴ）、Ａ１４１Ｄ（または「ＤＳＫ」）、および実施例５の１４１×１８１×２１８シリーズからのリードの一部（ＤＫＰ、ＤＫＡ、ＫＫＥ、ＫＫＰ、およびＥＫＫ）と共に、新規ＣＨ１配列を、フローサイトメトリーによって決定されたＦＯＰ値で比較した（ラムダＭＦＩ：カッパＭＦＩ）（図１９）。図１９の矢印で印されたデータ点に対応する配列番号１５５、１５７、１５９、１６２、１６３、１６４、または１６５のＣＨ１配列を有する少なくとも七種が、試験された１４１×１８１×２１８のリードの値と同等またはそれよりも高いＦＯＰ値を示した。

実施例７：１４１×（１７０／１７１）×（１８５／１８７）シリーズの構築物およびスクリーニング

実施例６の結果の分析により、Ｆ１７０、Ｐ１７１、Ｖ１８５、およびＴ１８７を含む対象とする四つの新しい位置／残基が得られた。１７０、１７１、１８５、および１８７位において高頻度で観察されるアミノ酸に基づいて、以前の試験で高いＦＯＰ値を生じた１４１と共に（例えば、１４１位において高頻度のＥおよびＤ、１４１×ＡＬＬの結果物の１７０または１７１位において高頻度のＥ、ならびに１４１位が置換され１７１位と独立している場合に１８５および／または１８７位において高頻度のＲ）、ＣＨ１ドメイン当たり最大三つのアミノ酸置換を有する１４種の固有のＣＨ１ドメインバリアント（表１３）を、リードのラムダ優先的な置換のセットの候補として合理的に設計した。表１３の１４種のリードは、「Ａ１４１Ｅ；Ｖ１８５Ｒ；Ｔ１８７Ｒ」（配列番号１６３）および「Ａ１４１Ｅ；Ｐ１７１Ｅ；Ｖ１８５Ｒ（配列番号１５９）」を含み、これらは実施例６で試験した。

１４種のＣＨ１ドメインバリアント配列のうちの一つを含有する重鎖を、上述のように、カッパ軽鎖軽鎖とラムダ軽鎖を共発現する哺乳類（ＨＥＫ）細胞にクローニングした（重鎖（ＨＣ）：ラムダ軽鎖（ＬＣ）：カッパＬＣの比＝２：１：１で、すなわちＨＣ：ＬＣの比は常に１：１）。野生型（ＡＤＩ－２６１４０重鎖）、「Ａ１４１Ｄ」バリアント、および「Ａ１４１Ｄ＿Ｓ１８１Ｋ＿Ｋ２１８Ｐ」バリアントもまた、対照として含めた。ラムダ選択性は、上述のように同一のアッセイを使用して決定した。

ラムダＭＦＩ対カッパＭＦＩの比を、フローサイトメトリーによって評価した。１４種のリードのＦＯＰ値および個々のＦＡＣＳプロットを、表１４および図２０～２２に提供する（各プロットの番号は、表１４に示すＲａｎｋ番号である）。１４種のリードのうち、「Ａ１４１Ｄ＿Ｐ１７１Ｅ＿Ｖ１８５Ｒ」および「Ａ１４１Ｄ＿Ｆ１７０Ｅ＿Ｔ１８７Ｒ」が、実施例５で特定されたリードである「Ａ１４１Ｄ＿Ｓ１８１Ｋ＿Ｋ２１８Ｐ」よりもさらに高いＦＯＰ値を示した。１４種のリードのうち他の多くのバリアントも、「Ａ１４１Ｄ」と比較して高いＦＯＰ値を示し、１４種のリードすべてが野生型と比較して高いＦＯＰ値を示した。

サンプル当たりのカッパおよびラムダＬＣの量を、ＬＣＭＳを使用して定量した（表１５および図２３）。ＦＡＣＳに基づくラムダ選択性の評価からの所見と同様に、「Ａ１４１Ｄ＿Ｐ１７１Ｅ＿Ｖ１８５Ｒ」および「Ａ１４１Ｄ＿Ｆ１７０Ｅ＿Ｔ１８７Ｒ」が、実施例６で特定されたリードである「Ａ１４１Ｄ＿Ｓ１８１Ｋ＿Ｋ２１８Ｐ」と比較して、さらに高いラムダ鎖％およびさらに低いカッパ鎖％を示した。１４種のリードのうち他の多くのバリアントも、「Ａ１４１Ｄ」と比較して高いラムダ％および低いカッパ％を示し、また１４種のリードすべてが野生型と比較して高いラムダ％および低いカッパ％を示した。

上位二つのラムダ優先的なＣＨ１バリアント（「Ａ１４１Ｄ＿Ｐ１７１Ｅ＿Ｖ１８５Ｒ」および「Ａ１４１Ｄ＿Ｆ１７０Ｅ＿Ｔ１８７Ｒ」）がカッパ軽鎖と対合するか否かを判定するために、ＣＨ１バリアント重鎖プラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞に、１）カッパ軽鎖、または２）ラムダ軽鎖、のいずれかと共にトランスフェクトした（重鎖：軽鎖の比＝１：１で）。カッパ選択性をもつＣＨ１としてのＫ１４７ＦＳ１８３Ｒと、野生型（ＷＴ）もまた、対照として含めた。トランスフェクトされたＨＥＫ細胞を培養し、プロテインＡカラムを用いた標準方法により精製した。標準方法を使用してプロセス収率（ｍｇ／Ｌ）を決定し、野生型（ＷＴ）のプロセス収率に対して正規化した。正規化したプロセス収率に基づくと、カッパＬＣのみが存在する（しかしラムダＬＣはない）場合で、「Ａ１４１Ｄ＿Ｐ１７１Ｅ＿Ｖ１８５Ｒ」および「Ａ１４１Ｄ＿Ｆ１７０Ｅ＿Ｔ１８７Ｒ」の両方が、依然としてカッパＬＣに結合したが、カッパＬＣとよりもラムダＬＣとでより多くの結合が生じた（図３０）。

Ｆａｂ形式のプロセス収率も評価した。ＣＨ１バリアント重鎖を有するＩｇＧを産生し、同じ方法を使用して精製した。カッパ選択性をもつＣＨ１としてのＫ１４７ＦＳ１８３Ｒと、野生型（ＷＴ）、Ａ１４１Ｄ、およびＡ１４１ＤＳ１８１ＫＫ２１８Ｐもまた、対照として含めた。連結された重鎖および軽鎖のＦａｂを、標準的な方法を使用してパパイン酵素消化およびＣＨ１カラム精製を介して精製されたＩｇＧから生成した。正規化されたＦａｂ消化物は、軽鎖ごとに、親の回収率％に対して正規化されたＩｇＧ消化物からのＦａｂの回収率％（回収されたＦａｂの量／消化中のＩｇＧ量）として計算された。標準方法を使用してプロセス収率を決定し、野生型（ＷＴ）のプロセス収率に対して正規化した。図１５のデータと一致して、「Ａ１４１Ｄ」および「Ａ１４１ＤＳ１８１ＫＫ２１８Ｐ」は、カッパＬＣよりもラムダＬＣで高いプロセス収率を有し、また「Ｋ１４７ＦＳ１８３Ｒ」は、カッパ選択性が非常に高いことを示した（図３１）。カッパＣＨ１のみが存在する（しかしラムダＣＨ１ではない）場合で、「Ａ１４１Ｄ＿Ｐ１７１Ｅ＿Ｖ１８５Ｒ」および「Ａ１４１Ｄ＿Ｆ１７０Ｅ＿Ｔ１８７Ｒ」の両方が、依然としてカッパＣＨ１に結合したが、カッパＬＣとよりもラムダＬＣとで著しく高い収率が得られた（図３１）。「Ｐ１７１Ｅ＿Ｖ１８５Ｒ」または「Ｆ１７０Ｅ＿Ｔ１８７Ｒ」の「Ａ１４１Ｄ」への付加の変異は、「Ａ１４１Ｄ」のラムダ選択性をさらに増強した。
実施例８：「Ａ１４１Ｄ」および「Ｋ１４７ＦＳ１８３Ｒ」バリアントに対する構造解析
方法

パニツムマブ野生型ＣＨ１－Ｃλの結晶化および構造決定

６．５ｍｇ／ｍｌのパニツムマブ野生型ＣＨ１－定常ラムダ（Ｃλ）Ｆａｂタンパク質を、１４，０００×ｇで、４℃、５分間遠心分離した。３０５ｎＬのタンパク質を、１５０ｎＬのリザーバ液滴および５０ｎＬのシード溶液と混合して、ＭＲＣ３ウェルプレート中で２０℃で４０ｕｌのリザーバ溶液で平衡化した。ＢＣＳスクリーン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉｍｅｎｓｉｏｎｓ社）から同定されたシード結晶を、マイクロシード・マトリックス・スクリーニング（ＭＭＳ）（Ｄ’Ａｒｃｙ，Ａ．，Ｖｉｌｌａｒｄ，Ｆ．，ａｎｄＭａｒｓｈ，Ｍ．（２００７）“Ａｎａｕｔｏｍａｔｅｄｍｉｃｒｏｓｅｅｄｍａｔｒｉｘ－ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ” ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＤＢｉｏｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ６３，５５０－５５４．）の結晶化実験に用い、０．１Ｍのリン酸／クエン酸ｐＨ５．５および３６％（ｖ／ｖ）のＰＥＧＳｍｅａｒＬｏｗで成長させて、０．１Ｍのリン酸／クエン酸ｐＨ５．５、３８％のＰＥＧＳｍｅａｒＬｏｗおよび４％グリセリンに移して結晶を得て、その後液体窒素中でフラッシュ凍結した。回折データは、Ｅｉｇｅｒ２ＸＥ１６Ｍ検出器（ＤＥＣＴＲＩＳ社）を装備した英国ジドコット、ＤｉａｍｏｎｄＬｉｇｈｔＳｏｕｒｃｅ社のＩ０３ステーションで、１００Ｋで１．０９Åで収集された。データセットは、ＸＤＳ（ＫａｂｓｃｈＷ．（２０１０）“ＸＤＳ” Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．ＤＢｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６６，１２５－１３２．）を用いてａｕｔｏＰＲＯＣ（Ｖｏｎｒｈｅｉｎ，Ｃ．ｅｔａｌ．（２０１１）“ＤａｔａｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｗｉｔｈｔｈｅａｕｔｏＰＲＯＣｔｏｏｌｂｏｘ” ＡｃｔａＣｒｙｓｔ．Ｄ６７，２９３－３０２．）において積分し、ＣＣＰ４ソフトウェアパッケージ（ＷｉｎｎＭ．Ｄ．ｅｔａｌ．（２０１１）“ＯｖｅｒｖｉｅｗｏｆｔｈｅＣＣＰ４ｓｕｉｔｅａｎｄｃｕｒｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ” ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇ．ＤＢｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６７，２３５－２４２．２３５－２４２．）のＡｉｍｌｅｓｓ（ＥｖａｎｓＰ．Ｒ．ａｎｄＭｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．（２０１３）“Ｈｏｗｇｏｏｄａｒｅｍｙｄａｔａａｎｄｗｈａｔｉｓｔｈｅｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ” ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＤＢｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６９，１２０４－１２１４．）を用いてスケーリングした。結晶は、Ｐ１２_１１の空間群において、非対称ユニット（ＡＳＵ）当たり２つの分子から構成された。構造は、自動化された分子置換システムＭｏＲＤＡ（ＶａｇｉｎＡ．ａｎｄＬｅｂｅｄｅｖＡ．（２０１５）“ＭｏＲＤａ，ａｎａｕｔｏｍａｔｉｃｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｐｉｐｅｌｉｎｅ” ＡｃｔａＣｒｙｓｔＡ．Ａ７１，ｓ１９．）（ＭＯＬＲＥＰ（ＶａｇｉｎＡ．，ＴｅｐｌｙａｋｏｖＡ．（１９９７）“ＭＯＬＲＥＰ：ａｎａｕｔｏｍａｔｅｄｐｒｏｇｒａｍｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ” Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．３０，１０２２－１０２５．）とＲｅｆｍａｃ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．，Ｓｋｕｂａｋ，Ｐ．，Ｌｅｂｅｄｅｖ，Ａ．Ａ．，Ｐａｎｎｕ，Ｎ．Ｓ．，Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ｒ．Ａ．，Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．Ｌｏｎｇ，Ｆ．ａｎｄＶａｇｉｎ，Ａ．Ａ．（２０１１）ＲＥＦＭＡＣ５ｆｏｒｔｈｅｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔｏｆｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．ＤＢｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６７，３５５－３６７．）とを組み込んだ）により解明したが、これは最初の検索モデルとして蛋白質構造データバンク（ＢｅｒｍａｎＨ．Ｍ．ｅｔａｌ．（２０００）Ｔｈｅ “ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ” ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２８．）のエントリー５Ｎ７Ｗおよび５ＳＸ４を選択した。自動化モデルの構築は、ＢＵＣＣＡＮＥＥＲソフトウェア（ＣｏｗｔａｎＫ．（２００６）“ＴｈｅＢｕｃｃａｎｅｅｒｓｏｆｔｗａｒｅｆｏｒａｕｔｏｍａｔｅｄｍｏｄｅｌｂｕｉｌｄｉｎｇ．１．Ｔｒａｃｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｃｈａｉｎｓ” ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａＤ６２，１００２－１０１１．）を用いて行った。このモデルは、Ｃｏｏｔ（ＥｍｓｌｅｙＰ．，Ｌｏｈｋａｍｐ，Ｂ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｗ．Ｇ．ａｎｄＣｏｗｔａｎＫ．（２０１０）“ＦｅａｔｕｒｅｓａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＣｏｏｔ” ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．ＤＢｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６６，４８６－５０１．）における手動による調整、ならびにＲｅｆｍａｃ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．，Ｓｋｕｂａｋ，Ｐ．，Ｌｅｂｅｄｅｖ，Ａ．Ａ．，Ｐａｎｎｕ，Ｎ．Ｓ．，Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ｒ．Ａ．，Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．Ｌｏｎｇ，Ｆ．ａｎｄＶａｇｉｎ，Ａ．Ａ．（２０１１）ＲＥＦＭＡＣ５ｆｏｒｔｈｅｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔｏｆｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．ＤＢｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６７，３５５－３６７．）およびＢｕｓｔｅｒ（ＢｒｉｃｏｇｎｅＧ，ＢｌａｎｃＥ，ＢｒａｎｄｌＭ，ＦｌｅｎｓｂｕｒｇＣ，ＫｅｌｌｅｒＰ，ＰａｃｉｏｒｅｋＷ，ＲｏｖｅｒｓｉＰ，ＳｈａｒｆｆＡ，ＳｍａｒｔＯ，ＶｏｎｒｈｅｉｎＣ，ＷｏｍａｃｋＴ．（２０１１）．ＢＵＳＴＥＲｖｅｒｓｉｏｎ２．１１．７．ＧｌｏｂａｌＰｈａｓｉｎｇＬｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍ．）において調整することによって、最終ＲおよびＲ_ｆｒｅｅがそれぞれ１４．５％および１６．９％にさらに改善される（図３２）。

パニツムマブＡ１４１ＤＣＨ１－Ｃλ、野生型ＣＨ１－ＣκおよびＫ１４７Ｆ－Ｓ１８３ＲＣＨ１－Ｃκの結晶化および構造決定

パニツムマブＡ１４１ＤＣＨ１－Ｃλ、パニツムマブ野生型ＣＨ１－定常カッパ（Ｃκ）、およびパニツムマブＫ１４７Ｆ－Ｓ１８３ＲＣＨ１－ＣκのＦａｂを、１４，０００×ｇで、４℃、５分間遠心分離した。パニツムマブＡ１４１ＤＣＨ１－ＣλおよびＫ１４７Ｆ－Ｓ１８３ＲＣＨ１－Ｃκについては、１０．０ｍｇ／ｍＬのＦａｂの２００ｎＬを、１５０ｎＬのリザーバ液滴および５０ｎＬのシード溶液と混合し、４０ｕｌのリザーバ溶液で平衡化した。ＢＣＳスクリーンから同定されたシード結晶を、ＭＭＳ実験で使用して、最適な結晶化条件を検索した。０．１Ｍのリン酸／クエン酸緩衝液ｐＨ５．５および３６％（ｖ／ｖ）のＰＥＧＳｍｅａｒＬｏｗを、パニツムマブＡ１４１ＤＣＨ１－Ｃλに使用し、また３０％ｖ／ｖのＰＥＧＳｍｅａｒＬｏｗを含む０．１Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ４．５を、パニツムマブＫ１４７Ｆ－Ｓ１８３ＲＣＨ１－Ｃκに使用した。１９．２ｍｇ／ｍｌ野生型ＣＨ１－Ｃκの１５０ｎＬを、１５０ｎＬのリザーバ液滴と混合し、４０ｕｌのリザーバ溶液に添加し、ＰＡＣＴＳｕｉｔｅ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｉｍｅｎｓｉｏｎｓ社）を使用してスクリーニングした。最終結晶化条件は、２０％ｗ／ｖのＰＥＧ６０００および０．２Ｍの塩化カルシウム二水和物を含む０．１ＭのＭＥＳｐＨ６．０からなった。結晶を、それぞれパニツムマブＡ１４１ＤＣＨ１－Ｃλ、野生型ＣＨ１－Ｃκ、およびＫ１４７Ｆ－Ｓ１８３ＲＣＨ１－Ｃκに対して、０．１Ｍのリン酸／クエン酸緩衝液ｐＨ５．５、３８％のＰＥＧＳｍｅａｒＬｏｗ、４％のグリセリン；０．０７ＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、２１％のＰＥＧ６０００、０．２ＭのＣａＣｌ２、２３．５％のグリセリン；および０．１ＭのＮａＡｃｐＨ４．５、３２．５％のＰＥＧＳｍｅａｒＬｏｗ、２５％のグリセリン、からなるクライオ溶液に移した。すべての結晶は、液体窒素中でフラッシュ凍結されて、そして結晶データを、Ｅｉｇｅｒ２ＸＥ１６Ｍ検出器（ＤＥＣＴＲＩＳ社）を装備した英国ジドコット、ＤｉａｍｏｎｄＬｉｇｈｔＳｏｕｒｃｅ社のＩ０３ステーションで、１００Ｋで、１．２～２．６Åの解像度で収集された。データは、ｉＭＯＳＦＬＭ（Ｂａｔｔｙｅ，Ｔ．Ｇ．Ｇ．，Ｋｏｎｔｏｇｉａｎｎｉｓ，Ｌ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｏ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｈ．Ｒ．，＆Ｌｅｓｌｉｅ，Ａ．Ｇ．（２０１１）．ｉＭＯＳＦＬＭ：ａｎｅｗｇｒａｐｈｉｃａｌｉｎｔｅｒｆａｃｅｆｏｒｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ－ｉｍａｇｅｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｗｉｔｈＭＯＳＦＬＭ．ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａＳｅｃｔｉｏｎＤ：ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，６７（４），２７１－２８１．）においてインデックス付けおよび積分し、そしてＣＣＰ４一式（ＷｉｎｎＭ．Ｄ．ｅｔａｌ．（２０１１）“ＯｖｅｒｖｉｅｗｏｆｔｈｅＣＣＰ４ｓｕｉｔｅａｎｄｃｕｒｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ” ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇ．ＤＢｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６７，２３５－２４２．２３５－２４２．）によりＡＩＭＬＥＳＳ（ＥｖａｎｓＰ．Ｒ．ａｎｄＭｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．（２０１３）“Ｈｏｗｇｏｏｄａｒｅｍｙｄａｔａａｎｄｗｈａｔｉｓｔｈｅｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ” ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＤＢｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６９，１２０４－１２１４．）を用いてスケーリングおよびマージした。

野生型ＣＨ１－Ｃλの結晶構造を検索モデルとして使用した分子置換によって、パニツムマブＡ１４１Ｄ－ＣＨ１－Ｃλの構造を解明した。異方性Ｂファクターおよび簡単な制限された調整のいくつかのラウンドを、調整の最終ラウンドにおいて不鮮明ファクター（ｂｌｕｒｒｉｎｇｆａｃｔｏｒ）を適用して、Ｒｅｆｍａｃ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．，Ｓｋｕｂａｋ，Ｐ．，Ｌｅｂｅｄｅｖ，Ａ．Ａ．，Ｐａｎｎｕ，Ｎ．Ｓ．，Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ｒ．Ａ．，Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．Ｌｏｎｇ，Ｆ．ａｎｄＶａｇｉｎ，Ａ．Ａ．（２０１１）ＲＥＦＭＡＣ５ｆｏｒｔｈｅｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔｏｆｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．ＤＢｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６７，３５５－３６７．）において実施した。Ａ１４１ＤＣＨ１－Ｃλの位置占有率は、野生型ＣＨ１－Ｃλの占有率に基づいて割り当てられ、また反復調整中にＣｏｏｔ（ＥｍｓｌｅｙＰ．，Ｌｏｈｋａｍｐ，Ｂ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｗ．Ｇ．ａｎｄＣｏｗｔａｎＫ．（２０１０）“ＦｅａｔｕｒｅｓａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＣｏｏｔ” ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．ＤＢｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６６，４８６－５０１．）において手動で調節された。最終構造は、ＡＳＵ当たり２つの分子を用いてＰ１２_１１において解明されるが、ＲおよびＲ_ｆｒｅｅの値はそれぞれ１５．２％および１７．０％であった（図３３）。

パニツムマブ野生型ＣＨ１－ＣκおよびＫ１４７Ｆ－Ｓ１８３Ｒ－ＣＨ１－Ｃκの構造は、それぞれＥＧＦＲ（ＰＤＢコード５ＳＸ４）との複合体、および解明される野生型ＣＨ１－Ｃκ構造との複合体におけるパニツムマブＦａｂ断片の座標を用いて、Ｐｈａｓｅｒ（ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．，Ｇｒｏｓｓｅ－Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ｒ．Ｗ．，Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｓｔｏｒｏｎｉ，Ｌ．Ｃ．，＆Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．（２００７）．Ｐｈａｓｅｒｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃｓｏｆｔｗａｒｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，４０（４），６５８－６７４．）での分子置換と、それに続く、Ｃｏｏｔ（ＥｍｓｌｅｙＰ．，Ｌｏｈｋａｍｐ，Ｂ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｗ．Ｇ．ａｎｄＣｏｗｔａｎＫ．（２０１０）“ＦｅａｔｕｒｅｓａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＣｏｏｔ” ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．ＤＢｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６６，４８６－５０１．）を用いた手動によるモデル構築およびＲｅｆｍａｃ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．，Ｓｋｕｂａｋ，Ｐ．，Ｌｅｂｅｄｅｖ，Ａ．Ａ．，Ｐａｎｎｕ，Ｎ．Ｓ．，Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｒ．Ａ．，Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ｒ．Ａ．，Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．Ｌｏｎｇ，Ｆ．ａｎｄＶａｇｉｎ，Ａ．Ａ．（２０１１）ＲＥＦＭＡＣ５ｆｏｒｔｈｅｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔｏｆｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．ＤＢｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６７，３５５－３６７．）における自動化調整の反復ラウンド、によって解明した。野生型ＣＨ１－Ｃκ構造については、非結晶学的な並進対称性が観察されたため、その構造は、ＡＳＵにおいて６種のＦａｂ分子を用いて、より低い空間群（Ｐ１２_１１）で解明した。当該構造は、それぞれ１９．８％および２３．２％の最終ＲおよびＲ_ｆｒｅｅ値に調整した（図３４）。Ｋ１４７Ｆ－Ｓ１８３ＲＣＨ１－Ｃκ構造を、ＡＳＵ当たり１分子を用いて、Ｐ３_１空間群で、それぞれ１９．８％および２３．３％の最終ＲおよびＲ_ｆｒｅｅ値で、解明した（図３５）。

構造解析および解釈

ＨＣ－Ａ１４１Ｄに媒介されるラムダＬＣ選択性

理論に拘束されることを意図するものではないが、パニツムマブＡ１４１ＤＣＨ１－Ｃλのラムダ選択性の増強は、ＨＣ－Ａｓｐ１４１の側鎖のカルボキシル基と、λＬＣ－Ｔｈｒ１１６の側鎖のヒドロキシル基との間に形成された鎖間水素結合が潜在的に媒介するが（図３６Ｃ）、これはパニツムマブ野生型ＣＨ１－ＣλにおけるＨＣ－Ａｌａ１４１では形成することができない（図３６Ａ）。ＨＣ－Ａｌａ１４１を取り囲むκＬＣ領域は、疎水性残基Ｐｈｅ１１６、Ｐｈｅ１１８およびＬｅｕ１３５からなり、一方でκＬＣ－Ｐｈｅ１１６はλＬＣ内の極性残基Ｔｈｒ１１６により置換される（図３６Ｂ）。したがって、Ａ１４１Ｄ変異を介した電荷導入により、λＬＣ－Ｔｈｒ１１６との水素結合を介してＣＨ１－λＬＣの対合を安定化させながら、ＣＨ１－κＬＣ界面の疎水性を破壊することによって、カッパ選択性が低下され得る。さらに、理論に拘束されることを意図するものではないが、パニツムマブＡ１４１ＤＣＨ１－Ｃλおよび野生型ＣＨ１－κＬＣのアラインメントにより示されるとおり、ＨＣ－Ａｓｐ１４１のκＬＣ－Ｐｈｅ１１６との立体衝突により、カッパ選択性がさらに低下し得る（図３６Ｄ）。

ＨＣ－Ａｓｐ１４１およびλＬＣ－Ｔｈｒ１１６間の水素結合では、Ａｓｐ１４１の側鎖内の水素受容体原子（Ｏ）とＴｈｒ１１６の側鎖内の水素供与体原子（Ｈ）との間に、結合が形成される。したがって、側鎖内に水素受容体原子を有する別のアミノ酸もまた、λＬＣのＴｈｒ１１６との水素結合を形成し、ラムダ選択性を提供し得る。グルタミン酸の側鎖もまた水素受容体原子（Ｏ）を有し、かつグルタミン酸がアスパラギン酸とサイズおよび形状が類似しているという事実に基づくと、グルタミン酸は、おそらくλＬＣのＴｈｒ１１６と水素結合を形成する一方で、図３６Ｄに示すようにκＬＣとの立体衝突を引き起こし、全体としてはラムダ選択性を提供するだろう。実際に、Ａ１４１Ｅ置換は、上記の実施例で実証されるように強いラムダ選択性を提供し、出願人により構造解析が確認された。

ＨＣ－Ｋ１４７Ｆ－Ｓ１８３Ｒが媒介するカッパＬＣ選択性

観察されたパニツムマブＫ１４７Ｆ－Ｓ１８３ＲＣＨ１－Ｃκのカッパ選択性は、ＣＨ１およびＣκの界面における二つの新しい水素結合が媒介し得る。パニツムマブ野生型ＣＨ１－Ｃκ構造において、ＨＣ－Ｌｙｓ１４７およびＨＣ－Ａｓｐ１４８により協調される水素結合ネットワークが、ＨＣ－Ｇｌｎ１７５を捕捉し、これがベースラインのカッパ対合の選択性に寄与する（図３７Ａ）。一つの説明としては、この位置におけるＣＨ１ＨＣ－Ｌｙｓ１４７のフェニルアラニンでの置換が、このネットワークを破壊し、ＨＣ－Ｇｌｎ１７５側鎖が遊離し、これがκＬＣ－Ｇｌｎ１６０のホルムアミドの酸素との水素結合を介してκＬＣと相互作用し、それによってカッパ選択性が増加するということである（図３７Ｂ）。さらに、理論に拘束されることを意図するものではないが、ＨＣ－Ｓ１８３Ｒ置換により、ＨＣ－Ａｒｇ１８３側鎖のグアニジニウム基とκＬＣ－Ｔｈｒ１７８のヒドロキシル基との間のさらなる水素結合がもたらされる（図３７Ｂ、図３８Ｃ）。反対に、理論に拘束されることを意図するものではないが、パニツムマブ野生型ＣＨ１－ＣλにおけるＨＣ－Ｓｅｒ１８３およびλＬＣ－Ｔｙｒ１７８間で、ＨＣの１８３位で観察された水素結合は、Ｋ１４７Ｆ－Ｓ１８３ＲＣＨ１とλＬＣとのモデル対合においてＨＣ－Ａｒｇ１８３およびλＬＣ－Ｔｙｒ１７８の側鎖の重度の立体衝突によって無効化されて、κＬＣに優先的なラムダ対合が不安定化する（図３８Ｂおよび３８Ｄ）。

ＨＣ－Ａｒｇ１８３およびκＬＣ－Ｔｈｒ１７８間の水素結合では、Ａｒｇ１８３の側鎖内の水素供与体原子（Ｈ）とＴｈｒ１７８の側鎖内の水素受容体原子（Ｏ）との間に、結合が形成される。したがって、側鎖に水素供与体原子を有する別のアミノ酸もまた、κＬＣのＴｈｒ１７８との水素結合を形成し、カッパ選択性を提供し得る。Ａｒｇの側鎖などのより大きい側鎖では、λＬＣのＴｙｒ１７８との立体衝突を生じさせ、さらなるカッパ選択性を提供するのに役立ち得る。例えば、リシンおよびトリプトファンの両方の側鎖は、水素供与体原子（Ｈ）を含有する大きい側鎖を有する。したがって、リシンおよびトリプトファンは、おそらくκＬＣのＴｈｒ１７８と水素結合を形成し、また図３８Ｄに示すようにおそらくλＬＣとの立体衝突をもたらし、全体としてはカッパ選択性を提供する。トレオニンの側鎖はまた、－ＯＨのＨ原子により水素供与体として機能することもできる。したがって、出願人は、水素受容体として機能することができる比較的大きい側鎖を有するアミノ酸が、κＬＣのＴｈｒ１７８と水素結合を形成して、カッパ選択性を提供し得るということをさらに想定する。例えば、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、またはチロシンもまた、水素受容体原子を有する比較的大きい側鎖を有するが、ＨＣの残基１８３に置かれたときに、カッパ選択性を提供し得る。実際、新たに提案した残基１８３におけるこれらのアミノ酸置換の大部分が、実際には実施例３でカッパ優先的であるとして特定された（表３を参照）。

上述のように、Ｌｙｓ１４７のＰｈｅでの置換は、Ｌｙｓ１４７およびＧｌｎ１７５間の水素結合を破壊し、それによって、Ｇｌｎ１７５が解放されて、κＬＣのＧｌｎ１６０との水素結合を形成し、それによってカッパ選択性に寄与した。したがって、水素供与体原子または水素受容体原子を含有しない側鎖をもつ別のアミノ酸を用いた、例えばアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、またはバリン等を用いた、Ｌｙｓ１４７の置換もまた、カッパ選択性に役立ち得る。実際、新たに提案した残基１４７におけるこれらのアミノ酸置換の大部分が、実際には実施例３でカッパ優先的であるとして特定された（表３を参照）。

Claims

重鎖定常領域１（「ＣＨ１」）ドメインバリアントポリペプチドであって、ＥＵ番号付けに従って、１１８、１１９、１２４、１２６～１３４、１３６、１３８～１４３、１４５、１４７～１５４、１６３、１６８、１７０～１７２、１７５、１７６、１８１、１８３～１８５、１８７、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２０８、２１０～２１４、２１６、および２１８位のうちの一つまたは複数の位置にアミノ酸置換を含み、
任意でそれによって当該ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドが、
（ｉ）ラムダＣＬドメインと比較して、カッパ軽鎖定常領域（「ＣＬ」）ドメインと、および／もしくはラムダ軽鎖ポリペプチドと比較して、カッパ軽鎖ポリペプチドと、または
（ｉｉ）カッパＣＬドメインと比較して、ラムダＣＬドメインと、および／もしくはカッパ軽鎖ポリペプチドと比較して、ラムダ軽鎖ポリペプチドと、優先的に対合し、
ただし、任意で、以下の置換の組み合わせのうちの一つまたは複数が除外される、重鎖定常領域１（「ＣＨ１」）ドメインバリアントポリペプチド：
（ａ）ＣＨ１上の残基１４１がＣもしくはＬで置換される場合、残基１６６がＤもしくはＫで置換される場合、ＣＨ１上の残基１２８、１２９、１６２、もしくは１７１がＣで置換される場合、および／もしくは残基１４７がＤで置換される場合、当該ＣＬは、アミノ酸置換を含まない；
（ｂ）ＣＨ１上の１２６もしくは２２０位がバリンもしくはアラニンで置換される場合、１２８、１４１、もしくは１６８位における非システインがシステインで置換される場合、もしくはＣＨ１置換がＬ１４５Ｆ、Ｋ１４７Ａ、Ｆ１７０Ｖ、Ｓ１８３Ｆ、もしくはＶ１８５Ｗ／Ｆである場合、当該ＣＬは、アミノ酸置換を含まない；
（ｃ）ＣＨ１上の残基１７２が１７２Ｒに置換される場合、残基１７４が１７４Ｇに変異される場合、もしくは残基１９０が１９０Ｍもしくは１９０Ｉに置換される場合、これらは、唯一のＣＨ１置換ではない；
（ｄ）前記ＣＨ１置換が、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｉ／Ｍ／Ｔ／Ｌ、Ｆ１７０Ｓ／Ａ／Ｙ／Ｍ、Ｓ１８１Ｍ／Ｉ／Ｔ、Ｓ１８３Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｖおよび／もしくはＶ１８５Ａ／Ｌからなる場合、ＣＬは改変されていない；
（ｅ）前記ＣＨ１置換が、１３１Ｃ／Ｓ、１３３Ｒ／Ｋ、１３７Ｅ／Ｇ、１３８Ｓ／Ｇ、１７８Ｓ／Ｙ、１９２Ｎ／Ｓおよび／もしくは１９３Ｆ／Ｌからなる場合、これらは、唯一のＣＨ１置換ではなく、および／もしくはＣＨ１ドメインを含有する二重特異性抗体において、同一のヒト免疫グロブリンのサブタイプまたはアロタイプのものである；
（ｆ）前記ＣＨ１置換が、１４５Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ｈ／Ｋ（ＩＭＧＴ位置２６）からなる場合、１２９Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ｈ／Ｋ（ＩＭＧＴ位置１８）に対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｇ）前記ＣＨ１置換が、１２４Ｋ／Ｅ／Ｒ／Ｄからなる場合、１７６において対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｈ）前記ＣＨ１置換が、１３３Ｖ、１５０Ａ、１５０Ｄ、１５２Ｄ、１７３Ｄおよび／もしくは１８８Ｗからなる場合、対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｉ）前記ＣＨ１置換が、１３３Ｓ／Ｗ／Ａ、１３９Ｗ／Ｖ／Ｇ／Ｉ、１４３Ｋ／Ｅ／Ａ、１４５Ｅ／Ｔ／Ｌ／Ｙ、１４６Ｇ、１４７Ｔ／Ｅ、１７４Ｖ、１７５Ｄ／Ｒ／Ｓ、１７９Ｋ／Ｄ／Ｒ、１８１Ｒ、１８６Ｒ、１８８Ｆ／Ｌおよび／もしくは１９０Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｙからなる場合、対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｊ）前記ＣＨ１置換が、１４３Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｋ／Ｄおよび１４５Ｔ／Ｌからなる場合、対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｋ）前記ＣＨ１置換が、１２４Ａ／Ｒ／Ｅ／Ｗ、１４５Ｍ／Ｔ、１４３Ｅ／Ｒ／Ｄ／Ｆ、１７２Ｒ／Ｔおよび１３９Ｗ／Ｇ／Ｃ、１７９Ｅおよび／もしくは１８６Ｒからなる場合、対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｌ）前記ＣＨ１置換が、１２６位、１２７位、１２８位、１３４位、１４１位、１７１位、もしくは１７３位でシステインで置換することからなる場合、対応するＬＣ位置は、ジスルフィド結合を形成するように改変されていない；
（ｍ）前記ＣＨ１置換が、Ｌ１４５Ｑ、Ｈ１６８Ａ、Ｆ１７０Ｇ、Ｓ１８３Ｖおよび／もしくはＴ１８７Ｅからなる場合、対応するカッパＬＣ置換もしくはラムダＬＣ置換は存在しない；
（ｎ）前記ＣＨ１置換が１４３Ｄ／Ｅ、１４５Ｔ、１９０Ｅ／Ｄおよび／もしくは１２４Ｒからなる場合、対応するＣＬ置換は存在しない；または
（ｏ）ＣＨ１置換がＡ１４０Ｃ、Ｋ１４７Ｃおよび／もしくはＳ１８３Ｃからなり、対応するＣＬ置換が存在する。
当該ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドが、ＥＵ番号付けに従って、１１８、１２４、１２６～１２９、１３１、１３２、１３４、１３６、１３９、１４３、１４５、１４７～１５１、１５３、１５４、１７０、１７２、１７５、１７６、１８１、１８３、１８５、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２１０、２１２～２１４、および２１８位のうちの一つまたは複数の位置にアミノ酸置換を含み、
任意でそれによって前記ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドが、
（ｉ）ラムダＣＬドメインと比較して、カッパＣＬドメインと、および／または
（ｉｉ）ラムダ軽鎖ポリペプチドと比較して、カッパ軽鎖ポリペプチドと、優先的に対合する、請求項１に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
１４７位、１８３位または１４７位および１８３位においてアミノ酸置換を含む、請求項２に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
以下のアミノ酸置換のうちの一つまたは複数を含む、請求項２または３に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド：
ａ．１１８位は、Ｇで置換される；
ｂ．１２４位は、Ｈ、Ｒ、Ｅ、Ｌ、またはＶで置換される、
ｃ．１２６位は、Ａ、Ｔ、またはＬで置換される、
ｄ．１２７位は、Ｖ、またはＬで置換される、
ｅ．１２８位は、Ｈで置換される、
ｆ．１２９位は、Ｐで置換される、
ｇ．１３１位は、Ａで置換される、
ｈ．１３２位は、Ｐで置換される、
ｉ．１３４位は、Ｇで置換される、
ｊ．１３６位は、Ｅで置換される、
ｋ．１３９位は、Ｉで置換される、
ｌ．１４３位は、Ｖ、またはＳで置換される、
ｍ．１４５位は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、またはＴで置換される、
ｎ．１４７位は、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｙ、Ｑ、Ａ、またはＧで置換される、
ｏ．１４８位は、Ｉ、Ｑ、Ｙ、またはＧで置換される、
ｐ．１４９位は、Ｃ、Ｓ、またはＨで置換される、
ｑ．１５０位は、Ｌ、またはＳで置換される、
ｒ．１５１位は、Ａ、またはＬで置換される、
ｓ．１５３位は、Ｓで置換される、
ｔ．１５４位は、Ｍ、またはＧで置換される、
ｕ．１７０位は、Ｇ、またはＬで置換される、
ｖ．１７２位は、Ｖで置換される、
ｗ．１７５位は、Ｇ、Ｌ、Ｅ、Ａで置換される、
ｘ．１７６位は、Ｐで置換される、
ｙ．１８１位は、Ｙ、Ｑ、またはＧで置換される、
ｚ．１８３位は、Ｉ、Ｗ、Ｆ、Ｅ、Ｙ、Ｌ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、Ｒ、またはＨで置換される、
ａａ．１８５位は、Ｗで置換される、
ｂｂ．１９０位は、Ｐで置換される、
ｃｃ．１９１位は、Ｉで置換される、
ｄｄ．１９７位は、Ａで置換される、
ｅｅ．２０１位は、Ｓで置換される、
ｆｆ．２０３位は、Ｓで置換される、
ｇｇ．２０４位は、Ｙで置換される、
ｈｈ．２０５位は、Ｑで置換される、
ｉｉ．２０６位は、Ｓで置換される、
ｊｊ．２１０位は、Ｒで置換される、
ｋｋ．２１２位は、Ｇで置換される、
ｌｌ．２１３位は、Ｅ、またはＲで置換される、
ｍｍ．２１４位は、Ｒで置換される、および
ｎｎ．２１８位は、Ｑで置換される。
（ｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｙ、もしくはＱを、および／または
（ｉｉ）１８３位においてアミノ酸残基Ｉ、Ｗ、Ｆ、Ｅ、Ｙ、Ｌ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、もしくはＲを含む、請求項２～４のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
（ｉ）１８３位においてアミノ酸残基Ｒ、Ｋ、もしくはＹを、および／または
（ｉｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆを含む、請求項２～５のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
（ｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆおよび１８３位においてアミノ酸残基Ｒ、
（ｉｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆおよび１８３位においてアミノ酸残基Ｋ、
（ｉｉｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆおよび１８３位においてアミノ酸残基Ｙ、
（ｉｖ）１８３位においてアミノ酸残基Ｒ、
（ｖ）１８３位においてアミノ酸残基Ｋ、または
（ｖｉ）１８３位においてアミノ酸残基Ｙを含み、
任意で、
（ｉ）配列番号１３７、
（ｉｉ）配列番号１３８、
（ｉｉｉ）配列番号１３９、
（ｉｖ）配列番号６０、
（ｖ）配列番号４１、または
（ｖｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
ＣＨ１とＶＨとの間の界面内のＣＨ１アミノ酸位置においてアミノ酸置換を含むものであって、任意で、前記ＣＨ１アミノ酸位置が１５１位であり、さらに任意で、１５１位にアミノ酸残基ＡまたはＬを含む、請求項２～７のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
（ｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆおよび１８３位においてアミノ酸残基Ｒ、
（ｉｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆおよび１８３位においてアミノ酸残基Ｋ、
（ｉｉｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆおよび１８３位においてアミノ酸残基Ｙ、
（ｉｖ）１８３位においてアミノ酸残基Ｒ、
（ｖ）１８３位においてアミノ酸残基Ｋ、または
（ｖｉ）１８３位においてアミノ酸残基Ｙを含む、ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
（ｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆおよび１８３位においてアミノ酸残基Ｒ、
（ｉｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆおよび１８３位においてアミノ酸残基Ｋ、
（ｉｉｉ）１４７位においてアミノ酸残基Ｆおよび１８３位においてアミノ酸残基Ｙ、
（ｉｖ）１８３位においてアミノ酸残基Ｒ、
（ｖ）１８３位においてアミノ酸残基Ｋ、または
（ｖｉ）１８３位においてアミノ酸残基Ｙ、からなるアミノ酸置換を含む、請求項９に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
（ｉ）配列番号１３７、
（ｉｉ）配列番号１３８、
（ｉｉｉ）配列番号１３９、
（ｉｖ）配列番号６０、
（ｖ）配列番号４１、または
（ｖｉ）配列番号１３６からなるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
（ｉ）ラムダＣＬドメインと比較して、カッパＣＬドメインとの、および／または
（ｉｉ）ラムダ軽鎖ポリペプチドと比較して、カッパ軽鎖ポリペプチドとの、ＣＨ１ドメインの対合を増加させる一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、請求項２～１１のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
（ｉ）ラムダＣＬドメインと比較して、カッパＣＬドメインとの対合の、および／または
（ｉｉ）ラムダ軽鎖ポリペプチドと比較して、カッパ軽鎖ポリペプチドとの対合の、
少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％の増加をもたらし、これは任意で液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣＭＳ）によって測定されて、または
少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２１倍、少なくとも２２倍、少なくとも２３倍、少なくとも２４倍、もしくは少なくとも２５倍の増加をもたらし、これは任意でフローサイトメトリーによって測定されて、任意でカッパＣＬ染色のラムダＣＬ染色に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比を比較することによる、請求項２～１１のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
当該ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドが、ＥＵ番号付けに従って、１１９、１２４、１２６、１２７、１３０、１３１、１３３、１３４、１３８～１４２、１５２、１６３、１６８、１７０、１７１、１７５、１７６、１８１、１８３～１８５、１８７、１９７、２０３、２０８、２１０～２１４、２１６および２１８位のうちの一つまたは複数の位置にアミノ酸置換を含み、
任意でそれによってＣＨ１ドメインバリアントが、
（ｉ）カッパＣＬドメインと比較して、ラムダＣＬドメインと、および／または
（ｉｉ）カッパ軽鎖ポリペプチドと比較して、ラムダ軽鎖ポリペプチドと、優先的に対合する、請求項１に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
１４１、１７０、１７１、１７５、１８１、１８４、１８５、１８７、および２１８位のうちの一つまたは複数の位置においてアミノ酸置換を含む、請求項１４に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
以下のアミノ酸置換のうちの一つまたは複数を含む、請求項１４または１５に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド：
ａ．１１９位は、Ｒで置換される、
ｂ．１２４位は、Ｖで置換される、
ｃ．１２６位は、Ｖで置換される、
ｄ．１２７位は、Ｇで置換される、
ｅ．１３０位は、Ｈ、またはＳで置換される、
ｆ．１３１位は、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、またはＤで置換される、
ｇ．１３３位は、Ｄ、Ｔ、Ｌ、Ｅ、Ｓ、またはＰで置換される、
ｈ．１３４位は、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｖ、Ｎ、またはＬで置換される、
ｉ．１３８位は、Ｒで置換される、
ｊ．１３９位は、Ａで置換される、
ｋ．１４０位は、Ｉ、Ｖ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、Ｓ、Ｗ、Ｒ、Ｌ、またはＰで置換される、
ｌ．１４１位は、Ｄ、Ｋ、Ｅ、Ｔ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、またはＭで置換される、
ｍ．１４２位は、Ｍで置換される、
ｎ．１５２位は、Ｇで置換される、
ｏ．１６３位は、Ｍで置換される、
ｐ．１６８位は、Ｆ、Ｉ、またはＶで置換される、
ｑ．１７０位は、Ｎ、Ｇ、Ｅ、Ｓ、またはＴで置換される、
ｒ．１７１位は、Ｎ、Ｅ、Ｇ、Ｓ、Ａ、またはＤで置換される、
ｓ．１７５位は、Ｄ、またはＭで置換される、
ｔ．１７６位は、Ｒ、またはＭで置換される、
ｕ．１８１位は、Ｖ、Ｌ、Ａ、Ｋ、またはＴで置換される、
ｖ．１８３位は、Ｌ、またはＶで置換される、
ｗ．１８４位は、Ｒで置換される、
ｘ．１８５位は、Ｍ、Ｌ、Ｓ、Ｒ、またはＴで置換される、
ｙ．１８７位は、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、またはＳで置換される、
ｚ．１９７位は、Ｓで置換される、
ａａ．２０３位は、Ｄで置換される、
ｂｂ．２０８位は、Ｉで置換される、
ｃｃ．２１０位は、Ｔで置換される、
ｄｄ．２１１位は、Ａで置換される、
ｅｅ．２１２位は、Ｎで置換される、
ｆｆ．２１３位は、Ｅで置換される、
ｇｇ．２１４位は、Ｒで置換される、
ｈｈ．２１６位は、Ｇで置換される、および
ｉｉ．２１８位は、Ｌ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｉ、Ｍ、Ｇ、Ｃ、Ｋ、またはＷで置換される。
以下の（ｉ）～（ｘｖｉｉ）のうちのいずれか一つまたは複数を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド：
（ｉ）１２６位にアミノ酸残基Ｖ、
（ｉｉ）１２７位にアミノ酸残基Ｇ、
（ｉｉｉ）１３１位にアミノ酸残基Ｖ、
（ｉｖ）１３３位にアミノ酸残基Ｓ、
（ｖ）１３８位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｖｉ）１４０位にアミノ酸残基ＩまたはＶ、
（ｖｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、Ｋ、Ｅ、またはＴ、
（ｖｉｉｉ）１４２位にアミノ酸残基Ｍ、
（ｉｘ）１６８位にアミノ酸残基Ｉ、
（ｘ）１７０位にアミノ酸残基Ｅ、Ｇ、またはＳ、
（ｘｉ）１７１位にアミノ酸残基Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｓ、またはＡ、
（ｘｉｉ）１７５位にアミノ酸残基Ｍ、
（ｘｉｉｉ）１７６位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｉｖ）１８１位にアミノ酸残基Ｋ、Ｖ、Ａ、またはＬ、
（ｘｖ）１８４位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｖｉ）１８５位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｖｉｉ）１８７位にアミノ酸残基Ｒ、および
（ｘｖｉｉｉ）２１８位にアミノ酸残基Ｌ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｉ、Ｍ、Ｇ、Ｃ、またはＷ。
ＣＨ１置換が、１４１Ｄ、１４１Ｅ、１７１Ｅ、１７０Ｅ、１８５Ｒおよび１８７Ｒの置換のうちの一つもしくは複数を含むか、またはこれら置換のうちの一つもしくは複数からなる、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
ＣＨ１置換が、１４１Ｄ、１４１Ｅ、１７１Ｅ、１７０Ｅ、１８５Ｒおよび１８７Ｒの置換のうちの二以上を含むか、またはこれら置換のうちの二以上からなる、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
ＣＨ１置換が、１４１Ｄ、１４１Ｅ、１７１Ｅ、１７０Ｅ、１８５Ｒおよび１８７Ｒの置換のうちの三以上を含むか、またはこれら置換のうちの三以上からなる、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
ＣＨ１置換が、以下の置換を含むか、または以下の置換からなる、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド：（ｉ）１４１Ｅおよび１８５Ｒ、（ｉｉ）１４１Ｅおよび１８７Ｒ、（ｉｉｉ）１４１Ｅ、１７０Ｅまたは１７１Ｅ、および１８５Ｒ、（ｉｖ）１４１Ｅ、１７０Ｅまたは１７１Ｅ、および１８７Ｒ、（ｖ）１４１Ｄおよび１８５Ｒ、（ｖｉ）１４１Ｄおよび１８７Ｒ、（ｖｉｉ）１４１Ｄ、１７０Ｅまたは１７１Ｅ、および１８５Ｒ、（ｖｉｉｉ）１４１Ｄ、１７０Ｅまたは１７１Ｅ、および１８７Ｒ、（ｉｘ）１４１Ｅ、１８５Ｒ、および１８７Ｒ、または（ｘ）１４１Ｄ、１８５Ｒ、および１８７Ｒ。
１４１位におけるＤ、Ｋ、またはＥへの置換を含み、これは任意で、１８１位におけるＫへの置換とペアであり、またさらに任意で、２１８位におけるＬ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｉ、Ｍ、Ｇ、Ｃ、またはＷへの置換とペアである、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
１４１位におけるＤ、Ｋ、もしくはＥへの置換を含み、これは１８１位におけるＫへの置換および／または２１８位におけるＬ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｔ、Ｉ、Ｍ、Ｇ、Ｃ、もしくはＷへの置換とペアである、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
以下の（ｉ）～（ｉｘ）のうちのいずれか一つまたは複数を含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド：
（ｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、Ｅ、もしくはＫ、
（ｉｉ）１７０位にアミノ酸残基Ｅ、
（ｉｉｉ）１７１位にアミノ酸残基Ｅ、
（ｉｖ）１７５位にアミノ酸残基Ｍ、
（ｖ）１８１位にアミノ酸残基Ｋ、
（ｖｉ）１８４位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｖｉｉ）１８５位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｖｉｉｉ）１８７位にアミノ酸残基Ｒ、および／または
（ｉｘ）２１８位にアミノ酸残基Ｐ、Ａ、またはＥ。
（ｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、
（ｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄおよび１８１位にアミノ酸残基Ｋ、
（ｉｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１８１位にアミノ酸残基Ｋ、および２１８位にアミノ酸残基Ａ、
（ｉｖ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１８１位にアミノ酸残基Ｋ、および２１８位にアミノ酸残基Ｐ、
（ｖ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、
（ｖｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８１位にアミノ酸残基Ｋ、
（ｖｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｋ、
（ｖｉｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｋおよび１８１位にアミノ酸残基Ｋ、
（ｉｘ）１４１位にアミノ酸残基Ｋ、１８１位にアミノ酸残基Ｋ、および２１８位にアミノ酸残基Ｅ、
（ｘ）１４１位にアミノ酸残基Ｋ、１８１位にアミノ酸残基Ｋ、および２１８位にアミノ酸残基Ｐ、
（ｘｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７０位にアミノ酸残基Ｅ、１８１位にアミノ酸残基Ｖ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７１位にアミノ酸残基Ｄ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｉｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｉｖ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７１位にアミノ酸残基Ｇ、１８５位にアミノ酸残基Ｒ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｖ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１８５位にアミノ酸残基Ｒ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｖｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７１位にアミノ酸残基Ｓ、および１８１位にアミノ酸残基Ｋ、
（ｘｖｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７０位にアミノ酸残基Ｇ、１７５位にアミノ酸残基Ｍ、１８１位にアミノ酸残基Ｖ、１８４位にアミノ酸残基Ｒ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｖｉｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｉｘ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｘ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７０位にアミノ酸残基Ｅ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｘｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７０位にアミノ酸残基Ｅ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｘｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｘｉｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｘｉｖ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１８５位にアミノ酸残基Ｒ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｘｖ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１７０位にアミノ酸残基Ｅ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｘｖｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１７０位にアミノ酸残基Ｅ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｘｖｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｅ、１７１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｘｘｉｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１７１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、または
（ｘｘｉｘ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１７１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒを含み、
任意で、
（ｉ）配列番号１４０、
（ｉｉ）配列番号１４１、
（ｉｉｉ）配列番号１４２、
（ｉｖ）配列番号１４３、
（ｖ）配列番号１４４、
（ｖｉ）配列番号１４５、
（ｖｉｉ）配列番号１４６、
（ｖｉｉｉ）配列番号１４７、
（ｉｘ）配列番号１４８、
（ｘ）配列番号１４９、
（ｘｉ）配列番号１５５、
（ｘｉｉ）配列番号１５７、
（ｘｉｉｉ）配列番号１５９、
（ｘｉｖ）配列番号１６２、
（ｘｖ）配列番号１６３、
（ｘｖｉ）配列番号１６４、
（ｘｖｉｉ）配列番号１６５、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１７８、
（ｘｉｘ）配列番号１７９、
（ｘｘ）配列番号１８０、
（ｘｘｉ）配列番号１８１、
（ｘｘｉｉ）配列番号１８２、
（ｘｘｉｉｉ）配列番号１８３、
（ｘｘｉｖ）配列番号１８４、
（ｘｘｖ）配列番号１８５、
（ｘｘｖｉ）配列番号１８６、
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１８７、
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１８８、または
（ｘｘｉｘ）配列番号１８９のアミノ酸配列を含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
（ｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１７１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１７０位にアミノ酸残基Ｅ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、または
（ｉｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１８１位にアミノ酸残基Ｋ、および２１８位にアミノ酸残基Ｐを含む、重鎖ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
（ｉ）配列番号１８８、
（ｉｉ）配列番号１８６、または
（ｉｉｉ）配列番号１４３を含む、請求項２６に記載の重鎖ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
（ｉ）カッパＣＬドメインと比較して、ラムダＣＬドメインとの、および／または
（ｉｉ）カッパ軽鎖ポリペプチドと比較して、ラムダ軽鎖ポリペプチドとの、ＣＨ１ドメインの対合を増加させる一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、請求項１４～２７のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
（ｉ）カッパＣＬドメインと比較して、ラムダＣＬドメインとの対合の、および／または
（ｉｉ）カッパ軽鎖ポリペプチドと比較して、ラムダ軽鎖ポリペプチドとの対合の、
少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％の増加をもたらし、これは任意で液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣＭＳ）によって測定されて、または
少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２１倍、少なくとも２２倍、少なくとも２３倍、少なくとも２４倍、もしくは少なくとも２５倍の増加をもたらし、これは任意でフローサイトメトリーによって測定されて、任意でラムダＣＬ染色のカッパＣＬ染色に対するＭＦＩ値の比を比較することによる、請求項１４～２８のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド。
可変領域および定常領域を含む抗体重鎖ポリペプチドであって、前記定常領域が、請求項１～２９のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントを含み、任意で、
（Ｉ）（ｉ）ラムダＣＬドメインと比較して、カッパＣＬドメインとの、および／もしくは
（ｉｉ）ラムダ軽鎖ポリペプチドと比較して、カッパ軽鎖ポリペプチドとの、または
（ＩＩ）（ｉ）カッパＣＬドメインと比較して、ラムダＣＬドメインとの、および／もしくは
（ｉｉ）カッパ軽鎖ポリペプチドと比較して、ラムダ軽鎖ポリペプチドとの、当該重鎖の優先的な対合をさらに促進させる、当該ＣＨ１ドメインの外側の一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含む、抗体重鎖ポリペプチド。
前記ＣＨ１ドメインバリアントが、請求項７～１１および２５～２７のいずれか一項に記載のものである、請求項３０に記載の抗体重鎖ポリペプチド。
第一の重鎖ポリペプチドおよび第一の軽鎖ポリペプチドを含む抗体または抗体断片であって、
（ａ）前記第一の重鎖ポリペプチドおよび前記第一の軽鎖ポリペプチドが、第一の同族対を形成し、および
（ｂ）前記第一の重鎖ポリペプチドが、ＥＵ番号付けに従って、１１８、１１９、１２４、１２６～１３４、１３６、１３８～１４３、１４５、１４７～１５４、１６３、１６８、１７０～１７２、１７５、１７６、１８１、１８３～１８５、１８７、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２０８、２１０～２１４、２１６、および２１８位のうちの一つまたは複数の位置にアミノ酸置換を含む第一のＣＨ１ドメインバリアントを含むことで、前記第一のＣＨ１ドメインバリアントが、当該第一の軽鎖に優先的に結合し、
任意で、前記第一の軽鎖ポリペプチドは、野生型ＣＬドメインである第一のＣＬドメインを含み、
ただし、任意で、当該第一のＣＨ｀ドメイン内において以下の置換の組み合わせのうちの一つまたは複数が除外される、抗体または抗体断片：
（ａ）ＣＨ１上の残基１４１がＣもしくはＬで置換される場合、残基１６６がＤもしくはＫで置換される場合、ＣＨ１上の残基１２８、１２９、１６２、もしくは１７１がＣで置換される場合、および／もしくは残基１４７がＤで置換される場合、当該ＣＬは、アミノ酸置換を含まない；
（ｂ）ＣＨ１上の１２６もしくは２２０位がバリンもしくはアラニンで置換される場合、１２８、１４１、もしくは１６８位における非システインがシステインで置換される場合、もしくはＣＨ１置換がＬ１４５Ｆ、Ｋ１４７Ａ、Ｆ１７０Ｖ、Ｓ１８３Ｆ、もしくはＶ１８５Ｗ／Ｆである場合、当該ＣＬは、アミノ酸置換を含まない；
（ｃ）残基１７２が１７２Ｒに置換される場合、残基１７４が１７４Ｇに変異される場合、もしくは残基１９０が１９０Ｍもしくは１９０Ｉに置換される場合、これらは、唯一のＣＨ１置換ではない；
（ｄ）前記ＣＨ１置換が、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｉ／Ｍ／Ｔ／Ｌ、Ｆ１７０Ｓ／Ａ／Ｙ／Ｍ、Ｓ１８１Ｍ／Ｉ／Ｔ、Ｓ１８３Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｖおよび／もしくはＶ１８５Ａ／Ｌからなる場合、ＣＬは改変されていない；
（ｅ）前記ＣＨ１置換が、１３１Ｃ／Ｓ、１３３Ｒ／Ｋ、１３７Ｅ／Ｇ、１３８Ｓ／Ｇ、１７８Ｓ／Ｙ、１９２Ｎ／Ｓおよび／もしくは１９３Ｆ／Ｌからなる場合、これらは、唯一のＣＨ１置換ではなく、および／もしくはＣＨ１ドメインを含有する二重特異性抗体において、同一のヒト免疫グロブリンのサブタイプまたはアロタイプのものである；
（ｆ）前記ＣＨ１置換が、１４５Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ｈ／Ｋ（ＩＭＧＴ位置２６）からなる場合、１２９Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ｈ／Ｋ（ＩＭＧＴ位置１８）に対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｇ）前記ＣＨ１置換が、１２４Ｋ／Ｅ／Ｒ／Ｄからなる場合、１７６において対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｈ）前記ＣＨ１置換が、１３３Ｖ、１５０Ａ、１５０Ｄ、１５２Ｄ、１７３Ｄおよび／もしくは１８８Ｗからなる場合、対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｉ）前記ＣＨ１置換が、１３３Ｓ／Ｗ／Ａ、１３９Ｗ／Ｖ／Ｇ／Ｉ、１４３Ｋ／Ｅ／Ａ、１４５Ｅ／Ｔ／Ｌ／Ｙ、１４６Ｇ、１４７Ｔ／Ｅ、１７４Ｖ、１７５Ｄ／Ｒ／Ｓ、１７９Ｋ／Ｄ／Ｒ、１８１Ｒ、１８６Ｒ、１８８Ｆ／Ｌおよび／もしくは１９０Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｙからなる場合、対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｊ）前記ＣＨ１置換が、１４３Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｋ／Ｄおよび１４５Ｔ／Ｌからなる場合、対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｋ）前記ＣＨ１置換が、１２４Ａ／Ｒ／Ｅ／Ｗ、１４５Ｍ／Ｔ、１４３Ｅ／Ｒ／Ｄ／Ｆ、１７２Ｒ／Ｔおよび１３９Ｗ／Ｇ／Ｃ、１７９Ｅおよび／もしくは１８６Ｒからなる場合、対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｌ）前記ＣＨ１置換が、１２６位、１２７位、１２８位、１３４位、１４１位、１７１位、および／もしくは１７３位でシステインで置換することからなる場合、対応するＬＣ位置は、ジスルフィド結合を形成するように改変されていない；
（ｍ）前記ＣＨ１置換が、Ｌ１４５Ｑ、Ｈ１６８Ａ、Ｆ１７０Ｇ、Ｓ１８３Ｖおよび／もしくはＴ１８７Ｅからなる場合、対応するカッパＬＣ置換もしくはラムダＬＣ置換は存在しない；
（ｎ）前記ＣＨ１置換が、１４３Ｄ／Ｅ、１４５Ｔ、１９０Ｅ／Ｄおよび／もしくは１２４Ｒからなる場合、対応するＣＬ置換は存在しない；または
（ｏ）ＣＨ１置換が、Ａ１４０Ｃ、Ｋ１４７Ｃおよび／もしくはＳ１８３Ｃからなり、対応するＣＬ置換が存在する。
第二の重鎖ポリペプチドおよび第二の軽鎖ポリペプチドをさらに含む、当該抗体または抗体断片であって、
（ａ）前記第二の重鎖ポリペプチドおよび前記第二の軽鎖ポリペプチドが、第二の同族対を形成し、ならびに
（ｂ）前記第二の重鎖ポリペプチドが、ＥＵ番号付けに従って、１１８、１１９、１２４、１２６～１３４、１３６、１３８～１４３、１４５、１４７～１５４、１６３、１６８、１７０～１７２、１７５、１７６、１８１、１８３～１８５、１８７、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２０８、２１０～２１４、２１６、および２１８位のうちの一つまたは複数の位置にアミノ酸置換を含む第二のＣＨ１ドメインバリアントを含むことで、前記第二のＣＨ１ドメインバリアントが、第二のＣＬドメインを含む前記第二の軽鎖ポリペプチドに優先的に結合し、
ただし、任意で、当該第二のＣＨ１ドメイン内において以下の置換の組み合わせのうちの一つまたは複数が除外され：
（ａ）ＣＨ１上の残基１４１がＣもしくはＬで置換される場合、残基１６６がＤもしくはＫで置換される場合、ＣＨ１上の残基１２８、１２９、１６２、もしくは１７１がＣで置換される場合、および／もしくは残基１４７がＤで置換される場合、当該ＣＬは、アミノ酸置換を含まない；
（ｂ）ＣＨ１上の１２６もしくは２２０位がバリンもしくはアラニンで置換される場合、１２８、１４１、もしくは１６８位における非システインがシステインで置換される場合、もしくはＣＨ１置換がＬ１４５Ｆ、Ｋ１４７Ａ、Ｆ１７０Ｖ、Ｓ１８３Ｆ、もしくはＶ１８５Ｗ／Ｆである場合、当該ＣＬは、アミノ酸置換を含まない；
（ｃ）残基１７２が１７２Ｒに置換される場合、残基１７４が１７４Ｇに変異される場合、もしくは残基１９０が１９０Ｍもしくは１９０Ｉに置換される場合、これらは、唯一のＣＨ１置換ではない；
（ｄ）前記ＣＨ１置換が、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｉ／Ｍ／Ｔ／Ｌ、Ｆ１７０Ｓ／Ａ／Ｙ／Ｍ、Ｓ１８１Ｍ／Ｉ／Ｔ、Ｓ１８３Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｖおよび／もしくはＶ１８５Ａ／Ｌからなる場合、ＣＬは改変されていない；
（ｅ）前記ＣＨ１置換が、１３１Ｃ／Ｓ、１３３Ｒ／Ｋ、１３７Ｅ／Ｇ、１３８Ｓ／Ｇ、１７８Ｓ／Ｙ、１９２Ｎ／Ｓおよび／もしくは１９３Ｆ／Ｌからなる場合、これらは、唯一のＣＨ１置換ではなく、および／もしくはＣＨ１ドメインを含有する二重特異性抗体において、同一のヒト免疫グロブリンのサブタイプまたはアロタイプのものである；
（ｆ）前記ＣＨ１置換が、１４５Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ｈ／Ｋ（ＩＭＧＴ位置２６）からなる場合、１２９Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ｈ／Ｋ（ＩＭＧＴ位置１８）に対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｇ）前記ＣＨ１置換が、１２４Ｋ／Ｅ／Ｒ／Ｄからなる場合、１７６において対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｈ）前記ＣＨ１置換が、１３３Ｖ、１５０Ａ、１５０Ｄ、１５２Ｄ、１７３Ｄおよび／もしくは１８８Ｗからなる場合、対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｉ）前記ＣＨ１置換が、１３３Ｓ／Ｗ／Ａ、１３９Ｗ／Ｖ／Ｇ／Ｉ、１４３Ｋ／Ｅ／Ａ、１４５Ｅ／Ｔ／Ｌ／Ｙ、１４６Ｇ、１４７Ｔ／Ｅ、１７４Ｖ、１７５Ｄ／Ｒ／Ｓ、１７９Ｋ／Ｄ／Ｒ、１８１Ｒ、１８６Ｒ、１８８Ｆ／Ｌおよび／もしくは１９０Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｙからなる場合、対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｊ）前記ＣＨ１置換が、１４３Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｋ／Ｄおよび１４５Ｔ／Ｌからなる場合、対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｋ）前記ＣＨ１置換が、１２４Ａ／Ｒ／Ｅ／Ｗ、１４５Ｍ／Ｔ、１４３Ｅ／Ｒ／Ｄ／Ｆ、１７２Ｒ／Ｔおよび１３９Ｗ／Ｇ／Ｃ、１７９Ｅおよび／もしくは１８６Ｒからなる場合、対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｌ）前記ＣＨ１置換が、１２６位、１２７位、１２８位、１３４位、１４１位、１７１位、もしくは１７３位でシステインで置換することからなる場合、対応するＬＣ位置は、ジスルフィド結合を形成するように改変されていない；
（ｍ）前記ＣＨ１置換が、Ｌ１４５Ｑ、Ｈ１６８Ａ、Ｆ１７０Ｇ、Ｓ１８３ＶおよびＴ１８７Ｅからなる場合、対応するカッパＬＣ置換もしくはラムダＬＣ置換は存在しない；
（ｎ）前記ＣＨ１置換が１４３Ｄ／Ｅ、１４５Ｔ、１９０Ｅ／Ｄおよび／もしくは１２４Ｒからなる場合、対応するＣＬ置換は存在しない；または
（ｏ）ＣＨ１置換がＡ１４０Ｃ、Ｋ１４７Ｃおよび／もしくはＳ１８３Ｃからなり、対応するＣＬ置換が存在し、
さらに任意で、前記抗体または抗体断片が、
（ｉ）第一のＣＬドメインが、野生型ＣＬドメインである、
（ｉｉ）第二のＣＬドメインが、野生型ＣＬドメインである、
（ｉｉｉ）第一のＣＬドメインが、カッパＣＬドメインである、
（ｉｖ）第一のＣＬドメインが、ラムダＣＬドメインである、
（ｖ）第二のＣＬドメインが、カッパＣＬドメインである、
（ｖｉ）第二のＣＬドメインが、ラムダＣＬドメインである、
（ｖｉｉ）前記第一のＣＨ１ドメインバリアントが、請求項１～２９のいずれか一項に記載の前記ＣＨ１ドメインバリアントである、
（ｖｉｉｉ）前記第二のＣＨ１ドメインバリアントが、請求項１～２９のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントである、および／または
（ｉｘ）前記第一のＣＨ１ドメインバリアントにおけるアミノ酸置換は、前記第二のＣＨ１ドメインバリアントにおけるアミノ酸置換とは異なる、という特徴（ｉ）～（ｉｘ）のうちの一つまたは複数を含む、請求項３２に記載の抗体または抗体断片。
第一の重鎖ポリペプチドおよび第一の軽鎖ポリペプチドを含む抗体または抗体断片であって、
（ａ）前記第一の重鎖ポリペプチドおよび前記第一の軽鎖ポリペプチドが、第一の同族対を形成し、
（ｂ）前記第一の重鎖ポリペプチドが、請求項２～１３のいずれか一項に記載の第一のＣＨ１ドメインバリアントを含み、ならびに
（ｃ）前記第一の軽鎖ポリペプチドが、カッパＣＬドメインを含み、任意でカッパ軽鎖ポリペプチドであり、
任意で、
（ｉ）前記カッパＣＬドメインが、野生型ＣＬドメインであり、および／または
（ｉｉ）前記第一の軽鎖ポリペプチドが、野生型軽鎖ポリペプチドであり、
さらに任意で、前記第一の重鎖ポリペプチドが、
（ｉ）ラムダＣＬドメインと比較して、カッパＣＬドメインとの、および／または
（ｉｉ）ラムダ軽鎖ポリペプチドと比較して、カッパ軽鎖ポリペプチドとの、当該重鎖の優先的な対合をさらに促進させる、当該ＣＨ１ドメインの外側の一つまたは複数のアミノ酸置換を含むものである、抗体または抗体断片。
第二の重鎖ポリペプチドおよび第二の軽鎖ポリペプチドを含む抗体または抗体断片であって、
（ａ）前記第二の重鎖ポリペプチドおよび前記第二の軽鎖ポリペプチドが、第一の同族対を形成し、
（ｂ）前記第二の重鎖ポリペプチドが、請求項１４～２９のいずれか一項に記載の第二のＣＨ１ドメインバリアントを含み、ならびに
（ｃ）前記第二の軽鎖ポリペプチドが、ラムダＣＬドメインを含み、任意でラムダ軽鎖ポリペプチドであり、
任意で、
（ｉ）前記ラムダＣＬドメインが、野生型ＣＬドメインであり、および／または
（ｉｉ）前記第二の軽鎖ポリペプチドが、野生型軽鎖ポリペプチドであり、
さらに任意で、前記第二の重鎖ポリペプチドが、
（ｉ）カッパＣＬドメインと比較して、ラムダＣＬドメインとの、および／もしくは
（ｉｉ）カッパ軽鎖ポリペプチドと比較して、ラムダ軽鎖ポリペプチドとの、当該重鎖の優先的な対合をさらに促進させる、当該ＣＨ１ドメインの外側の一つまたは複数のアミノ酸置換を含むものである、抗体または抗体断片。
第一の重鎖ポリペプチド、第一の軽鎖ポリペプチド、第二の重鎖ポリペプチド、および第二の軽鎖ポリペプチドを含む抗体または抗体断片であって、
（ａ）前記第一の重鎖ポリペプチドおよび前記第一の軽鎖ポリペプチドが、第一の同族対を形成し、
（ｂ）前記第一の重鎖ポリペプチドが、請求項２～１３のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントを含む第一のＣＨ１ドメインを含み、
（ｃ）前記第一の軽鎖ポリペプチドが、カッパＣＬドメインを含み、任意でカッパ軽鎖ポリペプチドであり、
（ｄ）前記第二の重鎖ポリペプチドおよび前記第二の軽鎖ポリペプチドが、第二の同族対を形成し、
（ｅ）前記第二の重鎖ポリペプチドが、請求項１４～２９のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントを含む第二のＣＨ１ドメインを含み、ならびに
（ｆ）第二の軽鎖ポリペプチドが、ラムダＣＬドメインを含み、任意でラムダ軽鎖ポリペプチドであり、
さらに任意で、前記第一の重鎖ポリペプチドが、
（ｉ）ラムダＣＬドメインと比較して、カッパＣＬドメインとの、および／または
（ｉｉ）ラムダ軽鎖ポリペプチドと比較して、カッパ軽鎖ポリペプチドとの、当該重鎖の優先的な対合をさらに促進させる、当該ＣＨ１ドメインの外側の一つまたは複数のアミノ酸置換を含み、
またさらに任意で、前記第二の重鎖ポリペプチドが、
（ｉ）カッパＣＬドメインと比較して、ラムダＣＬドメインとの、および／または
（ｉｉ）カッパ軽鎖ポリペプチドと比較して、ラムダ軽鎖ポリペプチドとの、当該重鎖の優先的な対合をさらに促進させる、当該ＣＨ１ドメインの外側の一つまたは複数のアミノ酸置換を含む、抗体または抗体断片。
多重特異性であり、任意で二重特異性であり、
さらに任意で、前記抗体または抗体断片の構造は、図２４～２９のいずれか一つに図示されるとおりである、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
多重特異性であり、第一のＣＨ１ドメインバリアントおよび第二のＣＨ１ドメインバリアントが、
（ｉ）非同族の重鎖－軽鎖の対の形成を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、もしくは少なくとも８０％、または少なくとも１．２倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２１倍、少なくとも２２倍、少なくとも２３倍、少なくとも２４倍、もしくは少なくとも２５倍減少させる、
（ｉｉ）所望の第一の同族対および第二の同族対の、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の形成を提供する、
（ｉｉｉ）前記所望の第一の同族対および第二の同族対の約８５％～約９５％の形成を提供する、ならびに／または
（ｉｖ）２５％未満、２０％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、もしくは１％未満の非同族の重鎖－軽鎖の対の形成の減少を提供し、
任意で、当該同族対および／または非同族対の量が、ＬＣＭＳまたはフローサイトメトリーによって決定される、請求項３２または３６に記載の抗体または抗体断片。
多重特異性であり、以下の一つまたは複数の特徴（ｉ）～（ｉｖ）を含む、請求項３３、３６または３８に記載の抗体または抗体断片：
（ｉ）第一のＣＨ１ドメインバリアントが、１４７および／もしくは１８３位に置換を含み、そして非同族の重鎖－軽鎖の対の形成を少なくとも約５０％減少させる、
（ｉｉ）第二のＣＨ１ドメインバリアントが、１４１、１７０、１７１、１７５、１８１、１８４、１８５、１８７、および２１８位のうちの一つもしくは複数の位置に置換を含み、そして非同族の重鎖－軽鎖の対の形成を少なくとも約５０％減少させる、
（ｉｉｉ）第一のＣＨ１ドメインバリアントが、１４７および／もしくは１８３位に置換を含み、また第二のＣＨ１ドメインバリアントが、１４１、１７０、１７１、１７５、１８１、１８４、１８５、１８７、および２１８位のうちの一つもしくは複数の位置に置換を含み、そして非同族の重鎖－軽鎖の対の形成を少なくとも約５０％から少なくとも約７５％減少させる、または
（ｉｖ）第一のＣＨ１ドメインバリアントが、１４７および／もしくは１８３位に置換を含み、また第二のＣＨ１ドメインバリアントが、１４１、１７０、１７１、１７５、１８１、１８４、１８５、１８７、および２１８位のうちの一つもしくは複数の位置に置換を含み、そして所望の第一の同族対および第二の同族対の少なくとも約８５％から少なくとも約９５％の形成を提供する。
多重特異性であり、また
（ａ）第一のＣＨ１ドメインバリアントが、
（ｉ）１４７位にアミノ酸残基Ｆ、および／または
（ｉｉ）１８３位にアミノ酸残基Ｒ、Ｋ、もしくはＹを含み、ならびに
（ｂ）第二のＣＨ１ドメインバリアントが、
（ｉ）１４１位にアミノ酸残基ＥまたはＤ、
（ｉｉ）１７０位にアミノ酸残基Ｅ、
（ｉｉｉ）１７１位にアミノ酸残基Ｅ、
（ｉｖ）１８１位にアミノ酸残基Ｋ、
（ｖ）１８５位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｖｉ）１８７位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｖｉｉ）２１８位にアミノ酸残基Ｐ、Ａ、ＥまたはＫを含む、請求項３３、３６、３８、または３９に記載の抗体または抗体断片。
多重特異性であり、また
（ａ）第一のＣＨ１ドメインバリアントが、
（ｉ）１４７位にアミノ酸残基Ｆ、および／または
（ｉｉ）１８３位にアミノ酸残基Ｒ、Ｋ、もしくはＹからなるアミノ酸置換を含み、ならびに
（ｂ）第二のＣＨ１ドメインバリアントが、
（ｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１７１位にアミノ酸残基Ｅ、および１８５位にアミノ酸残基Ｒ、
（ｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１７０位にアミノ酸残基Ｅ、および１８７位にアミノ酸残基Ｒ、または
（ｉｉｉ）１４１位にアミノ酸残基Ｄ、１８１位にアミノ酸残基Ｋ、および２１８位にアミノ酸残基Ｐからなるアミノ酸置換を含む、請求項３３、３６、３８、または３９に記載の抗体または抗体断片。
（ａ）第一のＣＨ１ドメインバリアントが、
（ｉ）配列番号１３７、
（ｉｉ）配列番号１３８、
（ｉｉｉ）配列番号１３９、
（ｉｖ）配列番号６０、
（ｖ）配列番号４１、または
（ｖｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含み、ならびに
（ｂ）第二のＣＨ１ドメインバリアントが、
（ｉ）配列番号１８８、
（ｉｉ）配列番号１８６、または
（ｉｉｉ）配列番号１４３のアミノ酸配列を含む、請求項３３または３６に記載の抗体または抗体断片。
当該第一のＣＨ１バリアントおよび当該第二のＣＨ１バリアントが、
（ｉ）非同族の重鎖－軽鎖の対の形成を少なくとも５０％～少なくとも７５％減少させる、ならびに／または
（ｉｉ）所望の第一の同族対および第二の同族対の約８５％～少なくとも約９５％の形成を提供する、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
（ｉ）請求項１～２９に記載のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド、
（ｉｉ）請求項３０もしくは３１に記載の抗体重鎖ポリペプチド、および／または
（ｉｉｉ）請求項３２～４３のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片を含む、医薬組成物。
ＣＨ１ドメインバリアントライブラリーを生成する方法であって、
（ａ）（ｉ）カッパＣＬドメインを含むポリペプチドと対合したＣＨ１ドメインを含むポリペプチドの一つまたは複数のセット（「Ｃ_κセット」）、および／または（ｉｉ）ラムダＣＬドメインを含むポリペプチドと対合したＣＨ１ドメインを含むポリペプチドの一つまたは複数のセット（「Ｃ_λセット」）を提供することであって、任意で、ＣＨ１ドメインを含む前記ポリペプチドが、重鎖可変領域（ＶＨ）をさらに含み、さらに任意で、カッパＣＬドメインまたはラムダＣＬドメインを含む前記ポリペプチドが、軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含むものである、当該提供することと、
（ｂ）（ｉ）前記Ｃ_κセット中の前記カッパＣＬドメイン内の、（ｉｉ）前記Ｃ_λセット中の前記ラムダＣＬドメイン内の、ならびに／または（ｉｉｉ）前記Ｃ_κセット中および／もしくは前記Ｃ_λセット中の前記ＶＨ内の、一つまたは複数のアミノ酸位置と接触している当該ＣＨ１ドメインの一つまたは複数のアミノ酸位置を選択することと、
（ｃ）ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドのライブラリー、またはＣＨ１ドメインバリアントをコードする構築物のライブラリーを作製することであって、ステップ（ｂ）で選択される前記一つまたは複数のアミノ酸位置のうちの一つまたは複数が、任意の非野生型アミノ酸で置換されているものである、当該作製することとを含み、
任意で、
（Ｉ）ステップ（ａ）において、前記ＣＨ１ドメイン、前記カッパＣＬドメイン、および前記ラムダＣＬドメインが、野生型および／もしくはヒトであり、
（ＩＩ）ステップ（ａ）において、（ｉ）カッパＣＬドメインを含むポリペプチドと対合するＣＨ１ドメインを含む前記ポリペプチド、および（ｉｉ）ラムダＣＬドメインを含むポリペプチドと対合するＣＨ１ドメインを含む前記ポリペプチドが、インタクトな抗体であるか、もしくは抗原結合断片（「Ｆａｂ」）であり、
（ＩＩＩ）ステップ（ｂ）において、前記ＣＨ１ドメインの前記一つもしくは複数のアミノ酸位置における前記アミノ酸残基が、（ｉ）前記カッパＣＬドメイン内の前記一つもしくは複数のアミノ酸位置における前記アミノ酸残基の側鎖原子、（ｉｉ）前記ラムダＣＬドメイン内の前記一つもしくは複数のアミノ酸位置における前記アミノ酸残基の側鎖原子、および／もしくは（ｉｉｉ）前記ＶＨ内の前記一つもしくは複数のアミノ酸位置における前記アミノ酸残基の側鎖原子の、５Åの距離の範囲内に側鎖原子を有しているならば、前記ＣＨ１ドメインの一つもしくは複数のアミノ酸位置を選択し、ならびに／または
（ＩＶ）ステップ（ｃ）における前記作製することは、縮重コドン、任意で六種の天然アミノ酸（Ｄ、Ｔ、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＮ）を表す縮重ＲＭＷコドンまたは２０種の天然アミノ酸残基すべてを表す縮重ＮＮＫコドン、を介しているものである、方法。
ステップ（ｂ）において選択される前記一つまたは複数のＣＨ１アミノ酸位置が、
（ｉ）前記Ｃ_κセットの代表的セットの少なくとも１０％において前記カッパＣＬドメインとの界面にあり、かつ前記Ｃ_κセットの代表的セットの少なくとも９０％において１０％超の溶媒接触表面積率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌｓｏｌｖｅｎｔａｃｃｅｓｓｉｂｌｅｓｕｒｆａｃｅａｒｅａ）を有し、
（ｉｉ）前記Ｃ_λセットの代表的セットの少なくとも１０％において前記ラムダＣＬドメインとの界面にあり、かつ前記Ｃ_λセットの代表的セットの少なくとも９０％において１０％超の溶媒接触表面積率を有し、ならびに／または
（ｉｉｉ）前記Ｃ_κセットおよび／もしくはＣ_λセットの代表的セットの少なくとも１０％において前記ＶＨとの界面にあり、かつ前記Ｃ_κセットおよび／もしくはＣ_λセットの代表的セットの少なくとも９０％において１０％超の溶媒接触表面積率を有する、請求項４５に記載の方法。
ステップ（ｂ）において選択される前記アミノ酸位置が、ＥＵ番号付けに従って、１１８、１１９、１２４、１２６～１３４、１３６、１３８～１４３、１４５、１４７～１５４、１６３、１６８、１７０～１７２、１７５、１７６、１８１、１８３～１８５、１８７、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２０８、２１０～２１４、２１６、および２１８位のうちの一つまたは複数の位置を含み、
ただし、任意で、以下の置換の組み合わせのうちの一つまたは複数が除外される、請求項４５または４６に記載の方法：
（ａ）ＣＨ１上の残基１４１がＣもしくはＬで置換される場合、残基１６６がＤもしくはＫで置換される場合、ＣＨ１上の残基１２８、１２９、１６２、もしくは１７１がＣで置換される場合、および／もしくは残基１４７がＤで置換される場合、当該ＣＬは、アミノ酸置換を含まない；
（ｂ）ＣＨ１上の１２６もしくは２２０位がバリンもしくはアラニンで置換される場合、１２８、１４１、もしくは１６８位における非システインがシステインで置換される場合、もしくはＣＨ１置換がＬ１４５Ｆ、Ｋ１４７Ａ、Ｆ１７０Ｖ、Ｓ１８３Ｆ、もしくはＶ１８５Ｗ／Ｆである場合、当該ＣＬは、アミノ酸置換を含まない；
（ｃ）残基１７２が１７２Ｒに置換される場合、残基１７４が１７４Ｇに変異される場合、もしくは残基１９０が１９０Ｍもしくは１９０Ｉに置換される場合、これらは唯一のＣＨ１置換ではない；
（ｄ）前記ＣＨ１置換が、Ｌ１２８Ｆ、Ａ１４１Ｉ／Ｍ／Ｔ／Ｌ、Ｆ１７０Ｓ／Ａ／Ｙ／Ｍ、Ｓ１８１Ｍ／Ｉ／Ｔ、Ｓ１８３Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｖおよび／もしくはＶ１８５Ａ／Ｌからなる場合、ＣＬは改変されていない；
（ｅ）前記ＣＨ１置換が、１３１Ｃ／Ｓ、１３３Ｒ／Ｋ、１３７Ｅ／Ｇ、１３８Ｓ／Ｇ、１７８Ｓ／Ｙ、１９２Ｎ／Ｓ、および／もしくは１９３Ｆ／Ｌからなる場合、これらは、唯一のＣＨ１置換ではなく、および／もしくはＣＨ１ドメインを含有する二重特異性抗体において、同一のヒト免疫グロブリンのサブタイプまたはアロタイプのものである；
（ｆ）前記ＣＨ１置換が、１４５Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ｈ／Ｋ（ＩＭＧＴ位置２６）からなる場合、１２９Ｄ／Ｅ／Ｒ／Ｈ／Ｋ（ＩＭＧＴ位置１８）に対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｇ）前記ＣＨ１置換が、１２４Ｋ／Ｅ／Ｒ／Ｄからなる場合、１７６において対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｈ）前記ＣＨ１置換が、１３３Ｖ、１５０Ａ、１５０Ｄ、１５２Ｄ、１７３Ｄ、および／もしくは１８８Ｗからなる場合、対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｉ）前記ＣＨ１置換が、１３３Ｓ／Ｗ／Ａ、１３９Ｗ／Ｖ／Ｇ／Ｉ、１４３Ｋ／Ｅ／Ａ、１４５Ｅ／Ｔ／Ｌ／Ｙ、１４６Ｇ、１４７Ｔ／Ｅ、１７４Ｖ、１７５Ｄ／Ｒ／Ｓ、１７９Ｋ／Ｄ／Ｒ、１８１Ｒ、１８６Ｒ、１８８Ｆ／Ｌ、および／もしくは１９０Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｙからなる場合、対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｊ）前記ＣＨ１置換が、１４３Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｋ／Ｄおよび１４５Ｔ／Ｌからなる場合、対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｋ）前記ＣＨ１置換が、１２４Ａ／Ｒ／Ｅ／Ｗ、１４５Ｍ／Ｔ、１４３Ｅ／Ｒ／Ｄ／Ｆ、１７２Ｒ／Ｔおよび１３９Ｗ／Ｇ／Ｃ、１７９Ｅおよび／もしくは１８６Ｒからなる場合、対応するＬＣ置換は存在しない；
（ｌ）前記ＣＨ１置換が、１２６、１２７、１２８、１３４、１４１、１７１、もしくは１７３においてシステインで置換することからなる場合、対応するＬＣ位置は、ジスルフィド結合を形成するように改変されていない；
（ｍ）前記ＣＨ１置換が、Ｌ１４５Ｑ、Ｈ１６８Ａ、Ｆ１７０Ｇ、Ｓ１８３Ｖ、およびＴ１８７Ｅからなる場合、対応するカッパＬＣ置換またはラムダＬＣ置換は存在しない；
（ｎ）前記ＣＨ１置換が、１４３Ｄ／Ｅ、１４５Ｔ、１９０Ｅ／Ｄおよび／もしくは１２４Ｒからなる場合、対応するＣＬ置換は存在しない；または
（ｏ）ＣＨ１置換が、Ａ１４０Ｃ、Ｋ１４７Ｃおよび／もしくはＳ１８３Ｃからなり、対応するＣＬ置換が存在する。
ステップ（ｃ）におけるＣＨ１ドメインバリアントのライブラリーが、
（Ｉ）酵母菌株、
（ＩＩ）酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ならびに／または
（ＩＩＩ）（ｉ）カッパＣＬドメインを含む一つもしくは複数のポリペプチド、および（ｉｉ）ラムダＣＬドメインを含む一つもしくは複数のポリペプチドを共発現する細胞系であって、任意で、前記カッパＣＬドメインおよび／もしくはラムダＣＬドメインが野生型であり、
さらに任意で前記カッパＣＬドメインおよび／もしくはラムダＣＬドメインがヒトである、当該細胞系、において発現する、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。
ＣＨ１ドメインバリアントライブラリーを生成する方法であって、
（ａ）ＥＵナンバリングに従って、１１８、１１９、１２４、１２６～１３４、１３６、１３８～１４３、１４５、１４７～１５４、１６３、１６８、１７０～１７２、１７５、１７６、１８１、１８３～１８５、１８７、１９０、１９１、１９７、２０１、２０３～２０６、２０８、２１０～２１４、２１６、および２１８位のＣＨ１アミノ酸位置のうちの一つまたは複数を選択することと、
（ｂ）ステップ（ａ）において選択される位置とは異なる、対象とする一つまたは複数のＣＨ１アミノ酸位置を選択することと、
（ｃ）ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドのライブラリー、またはＣＨ１ドメインバリアントをコードする構築物のライブラリーを作製することであって、ステップ（ａ）および（ｂ）で選択される前記一つまたは複数のアミノ酸位置のうちの一つまたは複数が、任意の非野生型アミノ酸で置換されるものである、当該作製することとを含み、
任意で、
（Ｉ）（ａ）において選択されるアミノ酸位置が、１４１、１４７、１５１、１７０、１７１、１８１、１８３、１８５、１８７、もしくは２１８位、もしくはそれらの任意の組み合わせを含み、
（ＩＩ）ステップ（ｃ）における前記作製することは、縮重コドン、任意で六種の天然アミノ酸（Ｄ、Ｔ、Ａ、Ｅ、Ｋ、およびＮ）を表す縮重ＲＭＷコドンもしくは２０種の天然アミノ酸残基すべてを表す縮重ＮＮＫコドン、を介しているものであり、ならびに／または
（ＩＩＩ）ステップ（ｃ）において、ステップ（ａ）において選択されたアミノ酸位置が、所定のアミノ酸に置換され、また（ｂ）において選択されたアミノ酸位置が、縮重コドンを介し置換されているものであり、任意で、ステップ（ａ）における所定のアミノ酸への置換が、Ａ１４１Ｄ、Ａ１４１Ｅ、Ｋ１４７Ｆ、Ｐ１５１Ａ、Ｐ１５１Ｌ、Ｆ１７０Ｅ、Ｐ１７１Ｅ、Ｓ１８１Ｋ、Ｓ１８３Ｒ、Ｖ１８５Ｒ、Ｔ１８７ＲもしくはＫ２１８Ｐもしくはそれらの任意の組み合わせを含む、方法。
一つまたは複数のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドを特定する方法であって、該一つまたは複数のＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドが、
（Ａ）ラムダＣＬドメインを含むポリペプチドと比較して、カッパＣＬドメインを含むポリペプチドと、または
（Ｂ）カッパＣＬドメインを含むポリペプチドと比較して、ラムダＣＬドメインを含むポリペプチドと、優先的に対合するものであり、
当該方法が、
（ａ）請求項４４～４９のいずれか一項に記載の方法により生成されたＣＨ１ドメインバリアントライブラリーからの一つまたは複数の候補ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドを、（ｉ）カッパＣＬドメインを含む一つまたは複数のポリペプチド、および（ｉｉ）ラムダＣＬドメインを含む一つまたは複数のポリペプチドと、共発現することと、
（ｂ）（ｉ）カッパＣＬドメインを含むポリペプチドと対合した候補ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドの量と、（ｉｉ）ラムダＣＬドメインを含むポリペプチドと対合した候補ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドの量とを、比較することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）における前記比較することに基づいて、
（Ａ）ラムダＣＬドメインを含むポリペプチドと比較して、カッパＣＬドメインを含むポリペプチドとの、または
（Ｂ）カッパＣＬドメインを含むポリペプチドと比較して、ラムダＣＬドメインを含むポリペプチドとの、優先的な対合をもたらす一つまたは複数のＣＨ１ドメインバリアントを選択することとを含み、
ステップ（ａ）において、任意で、発現される前記候補ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチドの総量と、発現される（カッパおよびラムダ）ＣＬドメインを含む前記ポリペプチドの総量とがほぼ同一であり、
任意で、ステップ（ａ）において、前記候補ＣＨ１ドメインバリアントポリペプチド、カッパＣＬドメインを含む前記ポリペプチド、およびラムダＣＬドメインを含む前記ポリペプチドが、ほぼ２：１：１の比で発現される、方法。
ステップ（ａ）において、前記（ｉ）カッパＣＬドメインを含む一つまたは複数のポリペプチド、および（ｉｉ）ラムダＣＬドメインを含む一つまたは複数のポリペプチドが、野生型および／またはヒトである、請求項５０に記載の方法。
ステップ（ｂ）において、当該量が、蛍光標識細胞分取を介して、または液体クロマトグラフィー－質量分析法を介して決定される、請求項５０または５１に記載の方法。
前記方法が、（ｄ）一つまたは複数の対照のＣＨ１ドメインバリアントを、（ｉ）カッパＣＬドメインを含む一つまたは複数のポリペプチド、および（ｉｉ）ラムダＣＬドメインを含む一つまたは複数のポリペプチドと共発現することをさらに含み、任意で、前記一つまたは複数の対照のＣＨ１ドメインバリアントのうちの一つまたは複数が、請求項１～２９のいずれか一項に記載のＣＨ１ドメインバリアントに従うものである、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の方法。