JP6904902B2 - ドメイン交換抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、軽鎖(LC)及び重鎖(HC)を含むドメイン交換抗体(domain-exchanged antibody)であって、LCがHCと二量体化している抗体に関する。
モノクロナール抗体は、治療用結合薬として幅広く用いられてきた。基本的な抗体構造について、天然のIgG1免疫グロブリンを例として用いて、本明細書で説明する。
2本の等しい重鎖(H)及び2本の等しい軽鎖(L)が結合して、Y字型の抗体分子を形成する。各重鎖は4つのドメインを有する。アミノ末端可変ドメイン(VH)は、Y字の先端にある。これらに3つの定常ドメイン:CH1、CH2、及びY字の柄の端部に当たるカルボキシ末端側のCH3が続く。短いストレッチであるスイッチ部分が、重鎖可変領域と定常領域を結びつける。ヒンジが、CH2及びCH3(Fcフラグメント)を残りの抗体(Fabフラグメント)と結びつける。天然の抗体分子内のヒンジ部分をタンパク質分解切断することにより、1つのFcと2つの等しいFabフラグメントが生成され得る。軽鎖は、スイッチにより分けられた2つのドメイン、可変ドメイン(VL)と定常ドメイン(CL)から構成される。
ヒンジ領域内のジスルフィド結合は、2本の重鎖を結びつける。軽鎖は、追加のジスルフィド結合により重鎖と連結している。Asn結合した炭水化物部分が、免疫グロブリンのクラスに応じて、定常ドメインの異なる位置で結合している。IgG1の場合、ヒンジ領域内の2つのジスルフィド結合が、Cys235とCys238の対の間で2本の重鎖を一体化している。軽鎖は、CH1ドメイン内のCys229とCLドメイン内のCys214の間で、2つの追加のジスルフィド結合により重鎖と連結している。炭水化物部分が、各CH2のAsn306に結合して、Y字の柄の部分に特徴的な膨らんだ部分を生成する。
このような特徴は、重要な機能的意義を有する。重鎖(VH)及び軽鎖(VL)の可変領域はいずれも、N末端領域、すなわちY字の「先端部分」にあり、抗原と反応するように配置されている。分子のこの先端部分は、アミノ酸配列のN末端が位置する側である。Y字の柄の部分は、エフェクター機能、例えば補体の活性化、及びFc受容体との相互作用、又はADCC及びADCP等に効果的に関与するように構成される。柄のCH2及びCH3ドメインは、エフェクタータンパク質との相互作用を促進するように膨らんでいる。アミノ酸配列のC末端は、先端部分とは反対側に位置し、Y字の「根元」と呼ばれる場合もある。
ラムダ(λ)及びカッパ(κ)と呼ばれる2種類の軽鎖が抗体中に見出される。所定の免疫グロブリンは、κ鎖又はλ鎖のいずれか一方を有し、それぞれ1つ有することはない。機能的な差異は、λ又はκの軽鎖を有する抗体の間で見出されない。
抗体分子内の各ドメインは、圧縮された逆平行βバレル内で、相互に緊密にパックされた2つのβシートからなる類似した構造を有する。この保存的構造は、免疫グロブリンフォールドと呼ばれる。定常ドメインの免疫グロブリンフォールドは、4本のストランドからなるシートに対向してパックされた3本のストランドからなるシートを含む。このフォールドは、各シートのβストランド間の水素結合により、内部の対向するシートの残基間の疎水結合により、及びシート間のジスルフィド結合により安定化している。3本のストランドからなるシートは、ストランドC、F、及びGを含み、また4本のストランドからなるシートは、ストランドA、B、E、及びDを有する。文字A〜Gは、免疫グロブリンフォールドのアミノ酸配列に沿って、βストランドの連続的な位置を表す。
可変ドメインのフォールドは、4本及び5本のストランドからなる2つのシート内に配置された9本のβストランドを有する。5本のストランドからなるシートは、定常ドメインの3本のストランドからなるシートと構造的に相同であるが、余分なストランドC’及びC’’を含む。残りのストランド(A、B、C、D、E、F、G)は、定常ドメインの免疫グロブリンフォールド内のカウンターパートと同一のトポロジー及び類似した構造を有する。ジスルフィド結合は、定常ドメインの場合と同様に、対向するシート内のストランドBとFとを結びつける。
免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖両方の可変ドメインは、3つの高頻度可変性ループ、又は相補性決定領域(CDR)を含む。Vドメインの3つのCDR(CDR1、CDR2、CDR3)は、βバレル構造の一方の端部に密集している。CDRは、免疫グロブリンフォールドのβストランドB−C、C’−C’’、及びF−Gを結びつけるループである。CDR内の残基は、免疫グロブリン分子毎に変化し、各抗体に抗原特異性を付与する。
抗体分子の先端部分に位置するVL及びVHドメインは、6個のCDR(ドメイン毎に3個)が、抗原と特異的結合するための表面(又はキャビティ)を構成する際に協力し合うように、緊密にパックされている。従って、抗体の天然の抗原結合部位は、軽鎖可変ドメインのストランドB−C、C’−C’’、及びF−G、並びに重鎖可変ドメインのストランドB−C、C’−C’’、及びF−Gを結びつけるループから構成される。
天然の免疫グロブリン内のCDRループではない、又はCDRループにより決定される抗原結合ポケットの一部分ではないループ、並びに任意選択的にCDRループ領域内の隣接したループは、抗原結合又はエピトープ結合特異性を有さないが、免疫グロブリン分子及び/又はそのエフェクター全体の正しいフォールディング、又はその他の機能に寄与し、従って構造的ループと呼ばれる。
先行技術文書では、既存の抗原結合部位を操作し、これにより新規の結合特性を導入するために、免疫グロブリン様スキャフォールドがこれまで採用されてきたことが示されている。ほとんどの場合、CDR領域が、抗原との結合を目的として改変されてきた、換言すれば、免疫グロブリンフォールドの場合、その結合アフィニティー又は特異性を変化させるために、天然の抗原結合部位のみが修飾された。操作がなされたそのような免疫グロブリンの異なるフォーマットについて記載する、膨大な量の文献が存在するが、該免疫グロブリンは、ファージ粒子表面上に提示された、又は様々な原核生物又は真核生物の発現系において可溶性に発現した一本鎖Fvフラグメント(scFv)又はFabフラグメントの形態で高頻度に発現する。
国際公開第2006/072620A1号は、免疫グロブリンを改変する方法について記載するが、該免疫グロブリンは、新規抗原結合部位を取得するための修飾を、構造的ループ領域内に含む。この方法は、免疫グロブリンに幅広く適用可能であり、また様々な抗原を標的とする免疫グロブリンのライブラリを作出するのに利用可能である。CH3ライブラリは、構造的ループを介して抗原と結合する能力を有する特異的ライブラリメンバーを選択するのに役立つことが明らかにされている。そのような構造的ループバインダーは、本明細書では「免疫性」CH3とも呼ばれる。実施例によれば、Fab様の構造が改変され、CH1及びCLドメインに置き換わる免疫性CH3ドメインを含む。
特別な二重特異性抗体である抗体構築物が、治療薬を改善するために現在開発中である。2価のIgGは、その重鎖の二量化に依存し、そのCH3ドメインのホモ二量体会合により媒介される。
Davisら(Protein Engineering、Design & Selection 2010年、第23巻(4)、195〜202頁)は、ストランド交換操作ドメイン(SEED)CH3ヘテロ二量体(heterodiomer)を用いて、二重特異性で非対称性の融合タンパク質の設計を支援するヘテロ二量体Fcプラットフォームについて記載する。このようなヒトIgG及びIgA CH3ドメインの誘導体は、ヒトIgA配列とIgG配列との交互に反復したセグメントから構成される相補的なヒトSEED CH3ヘテロ二量体を作り出す。SEED操作は、欧州特許第1999154B1号に更に記載されている。国際公開第2010/136172A1号は、抗体のFc部分のC末端に繋がった1つ又は2つの一本鎖Facを含む、トリ又はテトラ特異的抗体について開示する。
Peippら(2007年1月1日、Handbook of Therapeutic Antibodies、171〜196頁)は、Fcエンジニアリングに関する概説を提供する。
Beckら(Nature Reviews Immunology、第10巻、5号、2010年5月1日、345〜352頁)は、次世代治療用抗体について記載し、特に異なる種類の二重特異性抗体に言及している。
Ridgwayら(Protein Engineering、第9巻、7号、1996年、617〜621頁)は、重鎖をヘテロ二量体化させるための抗体CH3ドメインの「ノブ・イントゥ・ホール(knobs into-holes)」エンジニアリングについて記載する。
Atwellら(Journal Of Molecular Biology、第270巻、1号、1997年、26〜35頁)は、安定なCH3ヘテロ二量体の形成を促進する抗体CH3ドメインに関し、界面残基(interface residue)の組み合わせについて、「ノブ」及び「ホール」変異体を含め記載する。
Davisら(Protein Engineering Design And Selection、第23巻、4号、2010年、195〜202頁)、及び国際公開第2007/110205A2号は、ストランド交換操作ドメイン(SEED)CH3ヘテロ二量体及び二重特異性抗体に基づく融合タンパク質であるSEEDボディー(SEEDbody)について記載する。
Gunasekaranら(Journal Of Biological Chemistry、第285巻、25号、2010年、19637〜19646頁)は、静電ステアリング効果による抗体Fcヘテロ二量体形成の強化、及びFc二量体界面にまたがる極性を変化させる新規のFc変異について記載する。
Von Kreudensteinら(Landes Bioscience、第5巻、5号、2013年、646〜654頁)は、安定性を目的として改変されたヘテロ二量体Fcに基づく二重特異性抗体スキャフォールドについて記載する。
非対称分子を改変する、例えば二重特異性抗体を生成するなどして、構造が改善した抗体を提供することが、本発明の目的である。
本目的は、本発明の主題により解決される。
本発明によれば、VL−CH3から構成される軽鎖(LC)、及びVH−CH3−CH2−CH3を含む重鎖(HC)を含むドメイン交換抗体が提供され、この場合、LCのVL−CH3は、HCのVH−CH3と二量体化しており、これによりCH3LC/CH3HCドメイン対を含むドメイン交換LC/HC二量体が形成される。
特に、抗体は、少なくとも1つのC末端延長を含み、該延長は、別のCH3LC/CH3HCドメイン対を含む。上記別のCH3LC/CH3HCドメイン対は、特に末端部のドメインの対である。例えば、抗体は、Fabフラグメントを、リンカー配列を用いて、又は用いないで、Fc部分のCH3ドメイン(CH3HC/CH3HCドメイン対)の一方又は両方のC末端に融合させることにより延長される。特に、延長は、抗体が、2、3、又は4つのFabアームを含むように、1つ又は2つのFabフラグメントを含み得るが、この場合、Fabアームのうちの少なくとも1つは、ドメイン交換を含む。従って、少なくとも1つのFabアームは、CH3LC/CH3HCドメイン対を含む。特に、2、3、又は4つのFabアームは、CH3LC/CH3HCドメイン対を含み得る。
特に、複数あるCH3ドメインのいずれか又はそれぞれは、IgG1のCH3ドメインであり、特にヒトIgG1のCH3配列、又は1つ若しくは複数の点変異、好ましくは最大10個の点変異を含む、改変されたその変異体により特徴付けられる。
特に、CH2ドメインは、IgG2型のドメインであり、特にヒトIgG2のCH2配列、又は1つ若しくは複数の点変異、好ましくは最大10個の点変異を含む、改変されたその変異体により特徴付けられる。
あらゆる抗体は、抗体、例えばIgG抗体のC末端延長に1つ又は複数のドメイン交換Fabアームを含み得ることが十分理解されている。FabアームによりC末端側が延長した抗体が提供され得るが、この場合、FabアームのVL又はVHドメインのN末端は、リンカー配列を用いて、又は用いないで、抗体のFc部分のCH3のC末端に融合している。特に、抗体は、1、2、3、又は4つのFabアームを含み得るが、この場合、複数あるFabアームのうちの少なくとも1つは、ドメイン交換Fabアームである。従って、少なくとも1つのFabアームは、CH3LC/CH3HCドメイン対を含む。特に、2、3、又は4つのFabアームは、CH3LC/CH3HCドメイン対を含み得る。
特に、複数あるFabアームのそれぞれは、VH/VLドメイン対から構成される機能的抗原結合部位を含み、標的と結合する能力を有するが、その時のアフィニティーは高く、KDは、10−6M、10−7M、10−8M、10−9M、又は10−10Mのいずれよりも低い。特に、抗体は、2つの異なる抗原を標的とするドメイン交換の二重特異性又はヘテロ二量体抗体であり、この場合、各抗原は抗体により認識されるが、その時のKDは、10−6M、10−7M、10−8M、10−9M、又は10−10Mのいずれよりも低い。
特に、抗体は、ヒンジ領域、好ましくはヒトヒンジ領域、例えばヒトIgG1ヒンジ領域を含む。
特定の態様によれば、抗体は、CH3HC/CH3HC二量体により特徴付けられるFc領域を更に含む。Fc領域は、特にFc鎖の二量体により特徴付けられ、各Fc鎖は、CH2−CH3鎖を含むことにより特徴付けられるが、上記二量体は、ホモ二量体又はヘテロ二量体であり得、例えばこの場合、第1のFc鎖は、CH2及び/又はCH3ドメイン内に少なくとも1つの点変異を含む点で第2のFc鎖とは異なる。
特に、抗体は、ただ1つのLC/HC二量体を含み、この場合、HCは、CH2−CH3を含むFc鎖と更に二量体化し、これによりFc領域が得られる。そのような抗体は、特にただ1つのFabアーム及びFc領域により特徴付けられる。
特定の態様によれば、本発明は、軽鎖(LC)及び重鎖(HC)を含むドメイン交換抗体であって、HCが、別のHCと二量体化しており、これにより少なくとも1つのC末端延長を含むHC/HC二量体を形成し、この場合、該延長は、CH3LC/CH3HCドメイン対を含む、抗体を提供する。そのようなドメイン交換抗体は、特に2つのLC及び2つのHCを含む可能性があり、この場合、少なくとも1つのHCが、Fabアーム1つ又は2つ分延長している。抗体は、少なくとも1つのFabアーム、及び少なくとも1つのドメイン交換Fabアームを特に含み、この場合、
a)Fabアームは、VH−CH1ドメインと対をなすVL−CLドメインを含み、2つのドメイン鎖からなる二量体を形成し、
b)ドメイン交換Fabアームは、VH−CH3HCドメインと対をなすVL−CH3LCドメインを含み、これにより CH3LC/CH3HCドメイン対を形成する。
特に、抗体は、上記a)に基づくドメイン交換されていない1、2、又は3つのFabアームと、上記b)に基づく1、2、又は3つのドメイン交換Fabアームとを含む。
特定の実施形態を図21に示す。
例えば、抗体のHCは、VH1−CH1−CH2−CH3−VH2−CH3HET、VH1−CH1−CH2−CH3(AG_SEED)−VH2−CH3(ノブ)、VH1−CH1−CH2−CH3(AG_SEED)−VL2−CH3(ノブ)、VH2−CH3HET−VH1−CH1−CH2−CH3であり得た。
例えば、四価の二重特異性抗体は、ドメイン交換Fabを天然型抗体のC末端に付加することにより取得され得る。
或いは、1つの標的に対して2価、及び第2の標的に対して1価の抗体は、ヘテロ二量体HC/HCの対を組み合わせることにより取得され得るが、この場合、対のうちの一方のHCのみが、C末端に結合した第2のドメイン交換Fabを有する。
特定の態様によれば、抗体のC末端延長内にある上記1つ又は複数のドメイン交換Fabアームは、pH依存性のFcRn結合を変化させるために改変されたCH3ドメインを含む。例えば、CH3LC/CH3HCドメイン対に含まれるCH3ドメインの少なくとも一方は、pH依存性のFcRn結合を低下させるために、FcRn結合部位において少なくとも1つの変異を含むように改変され得る。
pH依存性のFcRn結合の低下は、FcRnとpH依存性に結合する結合アフィニティーが、生理学的pH(pH7.4)における同結合アフィニティーと比較して1対数を超えて低い、好ましくはpH5〜6のときとほぼ等しい、又はそれ以下であり得る。
pH依存性のFcRn結合が低下したCH3ドメインは、H433A及びH435A変異のうちの少なくとも1つ、又はH433A及びH435A変異の両方を特に含み得るが、この場合、ナンバリングは、KabatのEUインデックスに基づく。
天然型CH3ドメインのpH依存性FcRn結合部位を有さないCH3LC及びCH3HC変異体の特定の実施形態は、H433A及びH435A変異(ナンバリングはKabatのEUインデックスに基づく)の導入により得られ、同変異は、天然型CH3ドメイン配列[9]に起因するpH依存性のFcRn結合部位の一部分をなす、配列は図22−1〜10を参照。
本明細書に記載するCH3ドメインの変異したアミノ酸の番号は、Kabatナンバリングに対応する位置として記載される。Kabatナンバリングは、そもそも、天然起源の抗体のナンバリングを指す。ドメイン交換構造を含む本発明の抗体では、CH3ドメイン内のKabatのEUインデックスに基づくアミノ酸の番号は、天然起源の抗体内のCH3ドメイン構造により決定される位置と類似するものと特に理解される。
特に、CH3LC/CH3HCドメイン対に含まれるCH3ドメインは、特に、CH3ドメインが、分子にとって「外来」である位置にある抗体構造に組み込まれる場合には、異種である。これにより、ドメイン交換抗体が生成可能である。異種CH3は、本明細書ではCH3HETとも呼ばれる。従って、CH3LC/CH3HCドメイン対は、特に異種二量体(CH3HET/CH3HET)であり、この場合、CH3HETのそれぞれは、可変ドメインにN末端側で結合している、例えば第1のCH3HET抗体ドメインは、VLドメインとN末端側で結合し、これによりLCが生成する一方、第2のCH3HETはVHドメインと結合し、これによりHCの一部分が生成し、第1及び第2のCH3HETは、少なくとも、第1及び第2のCH3HETドメインのβシート領域の接触により二量体を形成する。特に、第1及び第2のCH3HETドメインは、非免疫性CH3ドメインであり、構造的ループ領域内に抗原結合部位、例えば非CDR結合部位等は組み込まれない。非免疫性CH3ドメインは、特に、抗原結合能力を有するCDR様結合部位を含まない。
特に、CH3HET/CH3HET二量体は、アミノ酸配列が相互に異なる2つのCH3ドメインからなるヘテロ二量体、又は同一のアミノ酸配列を有する2つのCH3ドメインからなるホモ二量体である。
特に、抗体、例えばIgGの完全長構造と同様な構造が生成され、これによりIgGの構造と同一の構造であるIgG様の構造が生成されるが、但し、特に、CH3HETドメインの対と交換されることとなるドメインのCH1/CLの対を置換するために、野生型の位置とは異なる位置にCH3HETドメインの追加の対を導入することによるドメイン交換を伴う。完全長抗体では、Fabアームの一方又は両方は、Fab様構造であり得る。従って、LC及びHCの対の一方又は両方は、CH3HET/CH3HET二量体を含め、ドメイン交換構造を含み得る。
特に、IgG様構造は、Fc部分の融合を通じて(Fab)様構造を延長することにより得られる。これにより、それぞれの重鎖は、C末端側においてCH2−CH3ドメイン配列が延長される。
特定の実施形態によれば、抗体はIgG抗体であり、この場合、LCは、VL−CH3から構成され、任意選択的にドメインは直接結合している、或いはLCは、抗体ドメイン間のジャンクションとして1つ又は複数のリンカー又はヒンジ領域を更に含む。
特定の実施形態によれば、抗体はIgG抗体であり、この場合、HCは、VH−CH3−CH2−CH3から構成され、任意選択的にドメインは直接結合している、或いはHCは、抗体ドメイン間のジャンクションとして1つ又は複数のリンカー又はヒンジ領域を更に含む。
特に、本発明の抗体は、ただ1つのFab様構造及び1つの野生型Fab構造を含むIgG様構造を有する。従って、特定の実施形態によれば、抗体は、
a)VL−CH3から構成される1つのLC及び、VH−CH3−CH2−CH3から構成されるHCを含む又はそれらからなり、LCのVL−CH3が、HCのVH−CH3と二量体化しており、これによりCH3LC/CH3HCドメイン対を含むドメイン交換LC/HC二量体である、第1のLC/HC二量体を形成し、
b)VL−CLから構成される1つのLC、及びVH−CH1−CH2−CH3から構成されるHCを含む又はそれらからなり、LCのVL−CH1が、HCのVH−CLと二量体化しており、これにより第2のLC/HC二量体を形成し、
第1のLC/HC二量体のHCが、例えばCH3HC/CH3HCドメイン対を含むFc部分を形成するように、第2のLC/HC二量体のHCと二量体化している。
特に、CH3LC/CH3HCドメイン対、及び/又はCH3HC/CH3HCドメイン対は、同族の対の生成を改善するために、例えば組み換え発現系により分子を生成する際に、CH3二量体がミスマッチする可能性を低減するために、1つ又は2つの改変されたCH3ドメインを含み得る。
特に、Fab様構造は、VH−CH3HETからなる重鎖を、VL−CH3HETからなる軽鎖と二量体化することにより得られる。
特に、(Fab)様構造は、2本の重鎖の結合を介して2つのFab構造を結合させることにより得られるが、この場合、Fab構造の一方又は両方はFab様構造である。
別の特定の実施形態によれば、抗体はIgM又はIgE抗体であり、この場合、HCは、VH−CH3−CH2−CH3−CH4から構成され、任意選択的に、ドメインは直接結合している、或いは、HCは、抗体ドメイン間のジャンクションとして1つ又は複数のリンカー又はヒンジ領域を更に含む。
特に、IgM様構造が、Fc部分の融合を通じて(Fab)様構造を延長することにより得られる。これにより、それぞれの重鎖は、C末端側においてCH2−CH3−CH4ドメイン配列により延長される。
特に、リンカー又はヒンジ領域は、HCのCH3HETのC末端領域とCH2ドメインのN末端領域の間にジャンクションを提供し、従って、抗体のHCは、構造VH−CH3−ジャンクション−CH2−CH3を含み得る又はそれから構成され得る。
ドメインの結合は、特に組み換え融合又は化学結合による。特定の結合は、1つのドメインのC末端と別のドメインのN末端との結合を介し得るが、この場合、例えば末端領域内の1つ又は複数のアミノ酸残基がドメインサイズを短縮するために除去される、又はドメインの可撓性を高めるために延長される。
特に、短縮したドメイン配列は、例えば少なくとも1、2、3、4、又は5、最大6、7、8、9、又は10個のアミノ酸を除去するなどして、C末端及び/又はN末端領域において欠損を含む。
特に、結合配列、例えばリンカー若しくはヒンジ領域、又は免疫グロブリンのヒンジ領域の少なくとも一部分等(結合配列は、本明細書では「ジャンクション」とも呼ばれる)が、例えば少なくとも1、2、3、4、又は5個のアミノ酸、最大10、15、又は20個のアミノ酸を含めるなどして利用可能である。リンカーによるドメイン延長は、例えばドメイン間に天然のジャンクションが含まれるように、ドメインに隣接して本来配置する免疫グロブリンドメインのN末端又はC末端領域に由来するアミノ酸配列を介し得る。或いは、リンカーは、ヒンジ領域に由来するアミノ酸配列を含み得る。但し、リンカーは、例えばGly又はSerアミノ酸からなる人工的な配列であってもよい。
特に、VH又はVLドメインのいずれかとCH3ドメインとの間のジャンクションは、
a)ヒトIgG抗体のCH2ドメインとCH3ドメインとの間のジャンクションの少なくとも一部分、及び/又は
b)ヒトIgG抗体のVLドメインとCLドメインとの間のジャンクションの少なくとも一部分、及び/又は
c)ヒトIgG抗体のVHドメインとCH1ドメインとの間のジャンクションの少なくとも一部分、及び/又は
d)長さがアミノ酸5〜20個、好ましくはアミノ酸8〜15個の人工的結合配列
であるアミノ酸配列を含む。
特定の態様によれば、CH3HETドメインのいずれも、ヒト又はヒト化抗体、好ましくはIgG1のドメインであり、また配列番号41として識別されるアミノ酸配列、又はそのようなCH3ドメインの機能的変異体を含み、好ましくは配列番号41と少なくとも60%の配列相同性、好ましくは少なくとも70%、80%、90%、若しくは95%の配列相同性を有する。
或いは、CH3HETドメインは、ヒト又はヒト化IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、又はIgD抗体のいずれかのドメインであり、又はそのようなCH3ドメインの機能的変異体であり、好ましくは配列番号42、43、44、45、46、47、若しくは48のいずれかと少なくとも60%の配列相同性、好ましくは少なくとも70%、80%、90%、若しくは95%の配列相同性を有する。
特に、抗体の定常ドメインのいずれか、例えば抗体ドメインの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個、若しくはすべては、ヒト起源若しくはヒト化のドメインである、又は例えば、ヒトIgGドメインのヒト抗体ドメインそれぞれと少なくとも60%の配列相同性を有するその機能的に活性な変異体である。
特定の実施形態によれば、抗体内に含まれるすべてのドメインは、ヒト起源のドメイン、又はヒト化ドメイン、或いは少なくとも60%の配列相同性、又は少なくとも70%、80%、90%、若しくは95%の配列相同性を有するその機能的に活性な変異体であり、この場合、免疫グロブリンドメインの起源は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、又はIgE抗体のいずれかであるのが好ましい。特に、すべての免疫グロブリンドメインは、免疫グロブリンの同一のタイプ又はサブタイプに由来する。
1つの態様によれば、第1及び/又は第2のCH3HETドメインは、IgG1抗体に由来する。
特に、第1及び/又は第2のCH3HETドメインは、配列番号41のいずれかとして識別されるアミノ酸配列を含み、任意選択的に、1つ又は複数の点変異、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の点変異を含む。
特に、抗体は、例えば1つのFab構造及び1つのFab様構造により、2つの異なる抗原結合部位を規定する可変ドメインを含み、これにより2つのFv構造を提供する。そのような構築物は、野生型構造を含む1つのFabアームを含み、この場合、VL−CLは、VH−CH1と二量体化しており、また第2のFab様アームは、VH−CH3HCと二量体化しているVL−CH3LCを含み、これによりCH3LC/CH3HCドメイン対が抗体に組み込まれる。
特に、抗体は、2つの異なる抗原又は抗原の2つの異なるエピトープを標的とする二重特異性抗体である。
特に、抗体は、第1のHCと対をなして、第1のエピトープを認識する第1の結合部位を含む第1のLC/HC二量体を形成する第1のLCと、第2のHCと対をなして、第1のエピトープとは異なる、又は異なる抗原に由来する第2のエピトープを認識する第2の結合部位を含む第2のLC/HC二量体を形成する第2のLCとを含む二重特異性抗体あり、第1のLC/HC二量体又は第2のLC/HC二量体は、ドメイン交換されている。
特に、CH3LC/CH3HCドメイン対のCH3ドメインの少なくとも一方は、CH3LC/CH3HCドメインの同族の対を生成することが可能な、改変されたCH3ドメインである。
従って、第1及び/又は第2のCH3HETドメインは、CH3HET/CH3HETの同族の対を選好的に生成することが可能な改変されたCH3ドメインであり得る。そのような同族の対は、天然型(野生型)CH3の対と比較して、それよりも高いレート、アフィニティー、又はアビディティーで特異的に二量体化する。特に、同族の対は、修飾されたCH3がマッチングする別の修飾されたCH3と選好的に二量体化し(対形成し)、そして別の(野生型又はマッチングしない)CH3ドメインについてはそれほど認識しないように改変される。
特定の態様によれば、抗体は、例えば、HC/HC二量体に含まれるようなCH3HC/CH3HCドメイン対を含み、この場合、CH3ドメインの少なくとも一方は、CH3HC/CH3HCドメインの同族の対を生成することが可能な、改変されたCH3ドメインである。
特に、CH3LC/CH3HCドメイン対は、配列番号41として識別されるアミノ酸配列又はその機能的変異体を含む野生型ヒトIgG1 CH3ドメインから構成され、またCH3HC/CH3HCドメイン対のCH3ドメインの少なくとも一方は、CH3HC/CH3HCドメインの同族の対を生成することが可能な、改変されたCH3ドメインである。
特定の実施形態によれば、
a)CH3LC/CH3HCドメイン対のCH3ドメインの少なくとも一方は、CH3LC/CH3HCドメインの同族の対を生成することが可能な、第1の改変されたCH3ドメインであり、
b)CH3HC/CH3HCドメイン対のCH3ドメインの少なくとも一方は、CH3HC/CH3HCドメインの同族の対を生成することが可能な、第2の改変されたCH3ドメインであり、
第1及び第2の改変されたCH3ドメインは、少なくとも1つの点変異において異なる。
特に、改変されたCH3ドメイン、例えばCH3LC/CH3HCドメイン、又はCH3HETドメイン、又はCH3HC/CH3HCドメインのいずれか、例えばCH3ドメインからなるヘテロ二量体の対又はホモ二量体の対のCH3ドメイン等は、配列番号41として識別されるアミノ酸配列、又は配列番号41と少なくとも60%の配列相同性を有するその機能的な変異体を含み、上記改変されたCH3ドメインは、
a)1つ若しくは複数のノブ若しくはホール変異、好ましくはT366Y/Y407’T、F405A/T394’W、T366Y:F405A/T394‘W:Y407’T、T366W/Y407’A及びS354C:T366W/Y349’C:T366’S:L368’A:Y407’Vのいずれか、
b)他方の同族のCH3ドメインのシステイン残基と共有結合し、これによりドメイン間ジスルフィド架橋を導入する、好ましくは両CH3ドメインのC末端を連結するシステイン残基、
c)ヒトIgA及びIgGのCH3配列の交互に反復するセグメントから構成されるSEED CH3ヘテロ二量体、並びに/又は
d)反発性の電荷がヘテロ二量体の形成を抑制する1つ若しくは複数の変異、好ましくはK409D/D399’K、K409D/D399’R、K409E/D399’K、K409E/D399’R、K409D:K392D/D399’K:E356’K又はK409D:K392D:K370D/D399’K:E356’K:E357’Kのいずれか、並びに/又は
e)ヘテロ二量体形成及び/若しくは熱安定性のために選択された1つ若しくは複数の変異、好ましくはT350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392L:T394W、
T350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392M:T394W、
L351Y:F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W、
F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W、又は
F405A:Y407V/T366L:T394Wのいずれか、
のうちの1つ又は複数を含み、
但し、ナンバリングはKabatのEUインデックスに基づく。
本明細書に記載する点変異を規定する際には、「スラッシュ」は、各対の一方の鎖又は一方のドメイン上の点変異を、他方の鎖又は他方のドメインに由来する点変異から区別する;アミノ酸位置のナンバリングにおける「アポストロフィー」は、ヘテロ二量体の第2の鎖又は二量体を意味する。「コロン」は、複数ある鎖又はドメインのうちの1つの鎖又はドメイン上の点変異の組み合わせを、それぞれ特定する。
上記のように、ヘテロ二量体形成及び/又は熱安定性のために選択された変異、又はVon Kreudensteinら[8]の開示による更なる変異のいずれも利用可能である。
好ましくは、(i)ノブ変異;又は(ii)ホール変異、又は(iii)ノブ及びホール変異が1つの鎖又はドメイン上に改変され、またカウンターパートの(i)ホール変異、又は(ii)ノブ変異、又は(iii)ホール及びノブ変異が、ヘテロ二量体の他方の鎖上で改変される。
特に、1つ又は2つの改変されたCH3ドメインを含むCH3ドメインの対は、2つのCH3ドメインの対を結びつける2以上の(追加)ドメイン間ジスルフィド架橋(briges)を、例えば2、又は3個含み得る。
特に、異なる変異(上記a)に基づく)が、CH3ドメインの各対の両CH3ドメインにおいて、マッチングする対を生成するために改変されるが、この場合、一方のドメインは、βシート領域内に接触表面の立体修飾を含むが、そのような接触表面は、相補的な立体修飾を通じて他方のドメインの各接触表面と選好的に結合する。そのような立体修飾は、例えば、「ノブ」又は「ホール」構造を生成するような、異なるアミノ酸残基及び側鎖に主に起因し、「ノブ・イントゥ・ホール」二量体を形成する相補性を有する。
特定の態様によれば、CH3ドメインの対、例えばCH3LC/CH3HCの第1及び第2のCH3ドメイン、又は第1及び第2のCH3HETドメイン、又はCH3HC/CH3HCドメインのそれぞれは、配列番号41、又は配列番号41の機能的な変異体として識別されるアミノ酸配列を有するIgGタイプのドメインであり、少なくともアミノ酸2個分の長さを有する少なくとも1つのβストランドIgAセグメントを組み込むことにより、ストランド交換体が得られるように改変され、また第1のCH3ドメインのIgAセグメントを第2のCH3ドメインのIgAセグメントと対形成させることにより、CH3ドメインの同族の対を含む。そのようなストランド交換CH3ドメインは、例えばそれぞれ異なる位置に配置し、そして非IgAセグメント、例えばIgGセグメントにより互いに分離している少なくとも1、2、3、4、又は5個の異なるIgAセグメントを組み込む、IgAアミノ酸配列及びIgGアミノ酸配列の交互に反復したセグメントを特に含み得る。
特定の態様によれば、抗体は、CH2ドメイン及び/又はCH3ドメインのいずれかに配置するFcγ受容体結合部位及び/又はC1q結合部位を含むエフェクター機能コンピテント抗体である。
特に、抗体はエフェクターコンピテントであり、HC内及び任意選択的にFc領域内にFcγ受容体結合部位を含む。
特に、抗体は、ADCC及び/又はCDC活性のいずれかにより特徴付けられる。
別の特定の態様によれば、抗体は、Fcγ受容体及び/又はC1qとの結合が欠損しているFc領域を含むエフェクター陰性(EN)抗体である。
特に、エフェクター陰性抗体は、ヒトIgG2のCH2配列、又は改変されたその変異体により特徴付けられ、例えば「VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2EN−CH3AG」(配列番号15)で用いられるような、C末端側CH3ドメインのN末端に融合した、米国特許第8562986号に記載の修飾型ヒトIgG2のCH2ドメイン(F296A、N297Q)を含む。
特に、1価のエフェクター陰性抗体内に1本の鎖を含めるのに用いられるような、結合ドメインを一切含まないエフェクター陰性Fc領域を形成するのに用いられるとき、エフェクター陰性Fc領域は、例えば「huFc_g1hingeEN−CH2EN−CH3GA」(配列番号16)で用いられるような、C末端側CH3ドメインのN末端に融合した、米国特許第8562986号に記載の修飾型ヒトIgG1ヒンジ(C220S)及び修飾型ヒトIgG2のCH2ドメイン(F296A、N297Q)を含んだ。
特に、抗体は、エフェクター欠損性であり(本明細書では、エフェクター陰性とも呼ばれる)、Fc領域を介したFcγ受容体又はCD16aとの結合は実質的に低下又は欠損している。
特に、抗体は、実質的に低下したADCC及び/若しくはCDCを有する、又は一切有さない。
特に、抗体は、CH2ドメインとCH3ドメインとのインタージャンクションのFcRn結合部位、及び/又はCH2ドメインのN末端領域内のFcγ受容体結合部位、及び/又はCH2ドメインのN末端領域内のC1q結合部位を含む抗体のFc部分を含む。
特定の態様によれば、抗体は、CH2ドメイン及び/又はCH3ドメインのいずれかに配置するpH依存性のFcRn結合部位を含む。特に、FcRn結合部位は、pH依存性にFcRnと結合するアフィニティーを有し、そのときのKdは10−4M未満、又は10−5M、10−6M、10−7M、若しくは10−8M未満である。
特に、pH依存性にFcRnと結合する結合アフィニティーは、生理学的pH(pH7.4)における同結合アフィニティーと比較して、pH5〜6において、少なくとも1対数、好ましくは少なくとも2対数、又は3対数増加している。
更なる態様によれば、抗体は、pH依存性のFcRn結合を変化させるために改変される。例えば、CH3LC/CH3HCドメイン対のCH3ドメインの少なくとも一方は、FcRn結合部位において少なくとも1つの変異、特にH433A若しくはH435A変異のうちの少なくとも1つ、又はH433A及びH435A変異の両方を含めて、pH依存性のFcRn結合が低下するように、改変され得るが、但しナンバリングは、KabatのEUインデックスに基づく。pH依存性のFcRn結合の低下は、pH依存性にFcRnと結合する結合アフィニティーが、生理学的pH(pH7.4)における同結合アフィニティーと比較して、pH5〜6において1対数を超えて低い、好ましくはほぼ同等又はそれ以下であり得る。
そのようにFcRn結合を調節することにより、C末端側のCH2ドメインとCH3ドメインとの界面の間に位置する、(野生型)FcフラグメントのFcRn結合部位のみを含む抗体が提供され得る。
天然型CH3ドメインのpH依存性FcRn結合部位を有さないCH3LC及びCH3HC変異体の特定の実施形態は、H433A及びH435A変異を導入することにより得られるが(KabatのEUインデックスに基づくナンバリング)、それは天然型CH3ドメイン配列[9]に起因するpH依存性のFcRn結合部位の一部分である、図22−1〜10の配列を参照。
特定の態様によれば、抗体は、
a)第1の標的を認識する結合部位が組み込まれた重鎖及び軽鎖(H1/L1)からなる第1の対、並びに第2の標的を認識する結合部位が組み込まれた重鎖及び軽鎖(H2/L2)からなる第2の対を含む、第1及び第2の標的を特異的に認識する二重特異性抗体、又は
b)標的を認識する結合部位が組み込まれた重鎖及び軽鎖(H1/L1)の対を含む、1価の結合部位により標的を特異的に認識するワンアームド抗体のいずれかであり、
この場合、重鎖(H1)は、定常領域から構成される別の重鎖(H2)に結合し、これによりFc領域を形成する。特に、ワンアームド抗体は、CH2−CH3抗体ドメインを含むFc鎖であるH2を含む。ワンアームド抗体は、CH2−CH3二量体(ホモ二量体又はヘテロ二量体)から構成されるFc領域により特に特徴付けられる。特に、Fc領域は、CH3HC/CH3HC二量体により特徴付けられる。
とりわけ、二重特異性抗体又はワンアームド抗体のいずれも、各標的との1価結合により特徴付けられる。従って、二重特異性抗体又はワンアームド抗体のそれぞれは、1つの標的に対して結合部位をただ1つ有することにより特に特徴付けられる。例えば、二重特異性抗体は、第1の標的を認識するただ1つの結合部位、及び第2の標的を認識するただ1つの結合部位を含む。特に、ワンアームド抗体は、標的を認識するただ1つの結合部位を含む。
特に、抗体は二重特異性抗体であり、第1の標的はCD3又はCD16、及び第2の標的はEGFRである。
特に、抗体はワンアームド抗体であり、標的はEGFRである。
特に、抗体はワンアームド抗体であり、標的はCD3である。
特に、抗体はワンアームド抗体であり、標的はCD16である。
特定の実施形態とは、本明細書に例示する抗体のいずれか、又は実施例セクションに記載する重鎖及び軽鎖のいずれか、若しくは重鎖及び軽鎖の対のいずれかを含む抗体のいずれかを意味する。特に、本明細書に記載する抗体は、実施例セクションに記載する重鎖及び軽鎖を含み得る、又はそれから構成され得る。
特に、抗体は、医療、診断、又は分析の用途で提供される。
本発明は、本発明の抗体を含む医薬製剤であって、好ましくは非経口又は粘膜製剤を含み、任意選択的に薬学的に許容される担体又は賦形剤を含有する、医薬製剤を更に提供する。
本発明は、本発明の抗体をコードする単離された核酸を更に提供する。
本発明は、本発明の核酸を含む発現カセット又はプラスミド、及び任意選択的に核酸配列によりコードされる抗体を発現するための更なる配列、例えば制御配列等を更に提供する。
特に、発現カセット又はプラスミドは、本発明の抗体のHC及び/又はLC、或いは2つ以上のHC及び/又は2つ以上のLCを発現させるためのコーディング配列を含む。例えば、抗体は、2つの異なるHC及び2つの異なるLCを含み得るが、また2つの異なるHC及び2つの異なるLCに関するコーディング配列が、ヘテロ二量体抗体を生成するのに利用される。
本発明は、少なくとも1つの発現カセット、又は本発明の抗体をコードする1つ若しくは複数の核酸分子が組み込まれたプラスミド、及び任意選択的に免疫グロブリンを発現させるための更なる配列を含む生成宿主細胞を更に提供する。
本発明は、本発明による抗体を生成する方法であって、本発明による宿主細胞が、上記抗体が生成する条件下で培養又は維持される、方法を更に提供する。
Fabアームの一方にCH3ドメイン交換を、及びC末端側CH3ドメイン(すなわち、CH3HC/CH3HCドメイン対)にSEED技術(GA/AG)を含むドメイン交換二重特異性抗体を示す概略図である。C末端側のGA SEEDドメインは、天然型Fabドメインに融合した状態で示し、またC末端側のAG SEEDドメインは、CH3ドメイン交換Fabに融合した状態で示す。但し、天然型又はCH3ドメイン交換Fabは、いずれのC末端SEEDドメインにも融合可能であり、従って、CH3HC/CH3HCドメイン対の間のFabの相対的な方向も、逆転し得る(ここでは図示しない)。1A−1:Fabの重鎖内ノブと軽鎖要素内ホールから構成されるCH3ノブ・イントゥ・ホールドメイン交換Fabと対をなすC末端側CH3ドメインにおけるSEED技術。1A−2:(1A−1)の例と同等であるが、Fabの重鎖内ホールと軽鎖要素内ノブから構成されるドメイン交換Fabを有する。1A−3:Fabの重鎖内「静電ステアリング」[7]正電荷変異体と軽鎖要素内負電荷変異体から構成されるCH3ドメイン交換Fabと対をなすC末端側CH3ドメインにおけるSEED技術。1A−4:(1A−3)の例と同等であるが、Fabの重鎖内「静電ステアリング」[7]負電荷変異体と軽鎖要素内の正電荷変異体から構成されるドメイン交換Fabを有する。1A−5:Fabの重鎖内「A鎖」[8]変異体と軽鎖要素内「B鎖」変異体から構成されるCH3ドメイン交換Fabと対をなすC末端側CH3ドメインにおけるSEED技術。1A−6:(1A−5)の例と同等であるが、Fabの重鎖内「B鎖」[8]変異体と軽鎖要素内「A鎖」変異体から構成されるドメイン交換Fabを有する。1A−7:Fabの重鎖内「AG」SEED[2]変異体と軽鎖要素内「GA」SEED変異体から構成されるCH3ドメイン交換Fabと対をなすC末端側CH3ドメインにおけるSEED技術。1A−8:(1A−7)の例と同等であるが、Fabの重鎖内「GA」SEED[2]変異体と軽鎖要素内「AG」SEED変異体から構成されるドメイン交換Fabを有する。 Fabアームの一方にCH3ドメイン交換を、及びC末端側CH3ドメイン(すなわち、CH3HC/CH3HCドメイン対)にノブ・イントゥ・ホール(KiH)技術を含むドメイン交換二重特異性抗体を示す概略図である。C末端側の「ノブ」ドメインは、天然型Fabドメインに融合した状態で示し、またC末端側の「ホール」ドメインは、CH3ドメイン交換Fabに融合した状態で示す。但し、天然型又はCH3ドメイン交換Fabは、C末端側の「ノブ」又は「ホール」ドメインと融合可能であり、従ってCH3HC/CH3HCドメイン対の間のFabの相対的な方向も逆転し得る(ここでは図示しない)。1B−1:Fabの重鎖内ノブと軽鎖要素内ホールから構成されるCH3ノブ・イントゥ・ホールドメイン交換Fabと対をなすC末端側CH3ドメインにおけるノブ・イントゥ・ホール技術。1B−2:(1B−1)の例と同等であるが、Fabの重鎖内ホールと軽鎖要素内ノブから構成されるドメイン交換Fabを有する。1B−3:Fabの重鎖内「静電ステアリング」[7]正電荷変異体と軽鎖要素内負電荷変異体から構成されるCH3ドメイン交換Fabと対をなすC末端側CH3ドメインにおけるノブ・イントゥ・ホール技術。1B−4:(1B−3)の例と同等であるが、Fabの重鎖内「静電ステアリング」[7]負電荷変異体と軽鎖要素内正電荷変異体から構成されるドメイン交換Fabを有する。1B−5:Fabの重鎖内「A鎖」[8]変異体と軽鎖要素内「B鎖」変異体から構成されるCH3ドメイン交換Fabと対をなすC末端側CH3ドメインにおけるノブ・イントゥ・ホール技術。1B−6:(1B−5)の例と同等であるが、Fabの重鎖内「B鎖」[8]変異体と軽鎖要素内「A鎖」変異体から構成されるドメイン交換Fabを有する。1B−7:Fabの重鎖内「AG」SEED[2]変異体と軽鎖要素内「GA」SEED変異体から構成されるCH3ドメイン交換Fabと対をなすC末端側CH3ドメイン内のノブ・イントゥ・ホール技術。1B−8:(1B−7)の例と同等であるが、Fabの重鎖内「GA」SEED[2]変異体と軽鎖要素内「AG」SEED変異体から構成されるドメイン交換Fabを有する。 Fabのアームの一方にCH3ドメイン交換を、及びC末端側CH3ドメイン(すなわち、CH3HC/CH3HCドメイン対)に静電ステアリング(Ref.7)技術を含むドメイン交換二重特異性抗体を示す概略図である。C末端側静電ステアリング[7]正電荷変異体ドメインは、天然型Fabドメインと融合した状態で示し、またC末端側負電荷変異体ドメインは、CH3ドメイン交換Fabと融合した状態で示す。但し、天然型又はCH3ドメイン交換Fabは、C末端側正電荷又は負電荷変異体ドメインと融合可能であり、従ってCH3HC/CH3HCドメイン対の間のFabの相対的な方向も逆転し得る(ここでは図示しない)。1C−1:Fabの重鎖内ノブと軽鎖要素内ホールから構成されるCH3ノブ・イントゥ・ホールドメイン交換Fabと対をなすC末端側CH3ドメインにおける静電ステアリング技術。1C−2:(1C−1)の例と同等であるが、Fabの重鎖内ホールと軽鎖要素内ノブから構成されるドメイン交換Fabを有する。1C−3:Fabの重鎖内「静電ステアリング」[7]正電荷変異体と軽鎖要素内負電荷変異体から構成されるCH3ドメイン交換Fabと対をなすC末端側CH3ドメインにおける静電ステアリング技術。1C−4:(1C−3)の例と同等であるが、Fabの重鎖内「静電ステアリング」[7]負電荷変異体と軽鎖要素内正電荷変異体から構成されるドメイン交換Fabを有する。1C−5:Fabの重鎖内「A鎖」[8]変異体と軽鎖要素内「B鎖」変異体から構成されるCH3ドメイン交換Fabと対をなすC末端側CH3ドメインにおける静電ステアリング技術。1C−6:(1C−5)の例と同等であるが、Fabの重鎖内「B鎖」[8]変異体と軽鎖要素内「A鎖」変異体から構成されるドメイン交換Fabを有する。1C−7:Fabの重鎖内「AG」SEED[2]変異体と軽鎖要素内「GA」SEED変異体から構成されるCH3ドメイン交換Fabと対をなすC末端側CH3ドメインにおける静電ステアリング技術。1C−8:(1C−7)の例と同等であるが、Fabの重鎖内「GA」SEED[2]変異体と軽鎖要素内「AG」SEED変異体から構成されるドメイン交換Fabを有する。 Fabのアームの一方にCH3ドメイン交換を、及びC末端側CH3ドメイン(すなわち、CH3HC/CH3HCドメイン対)内に改変された「A鎖」及び「B鎖」変異体ドメイン(Von Kreudenstein Ref.8)技術を含むドメイン交換二重特異性抗体を示す概略図である。C末端側A鎖[8]変異体ドメインは、天然型Fabドメインに融合した状態で示し、またC末端側B鎖[8]変異体ドメインは、CH3ドメイン交換Fabに融合した状態で示す。但し、天然型又はCH3ドメイン交換Fabは、C末端側A鎖又はB鎖変異体ドメインと融合可能であり、従ってCH3HC/CH3HCドメイン対の間のFabの相対的方向も逆転し得る(ここでは図示しない)。1D−1:Fabの重鎖内ノブと軽鎖要素内ホールから構成されるCH3ノブ・イントゥ・ホールドメイン交換Fabと対をなすC末端側CH3ドメインにおけるA鎖及びB鎖変異体ドメイン技術[8]1D−2:(1D−1)の例と同等であるが、Fabの重鎖内ホールと軽鎖要素内ノブから構成されるドメイン交換Fabを有する。1D−3:Fabの重鎖内「静電ステアリング」[7]正電荷変異体と軽鎖要素内負電荷変異体から構成されるCH3ドメイン交換Fabと対をなすC末端側CH3ドメインにおけるA鎖及びB鎖変異体ドメイン技術[8]。1D−4:(1D−3)の例と同等であるが、Fabの重鎖内「静電ステアリング」[7]負電荷変異体と軽鎖要素内正電荷変異体から構成されるドメイン交換Fabを有する。1D−5:Fabの重鎖内「A鎖」[8]変異体と軽鎖要素内「B鎖」変異体から構成されるCH3ドメイン交換Fabと対をなすC末端側CH3ドメインにおけるA鎖及びB鎖変異体ドメイン技術[8]。1D−6:(1D−5)の例と同等であるが、Fabの重鎖内「B鎖」(Ref.8)変異体と軽鎖要素内「A鎖」変異体から構成されるドメイン交換Fabを有する。1D−7:Fabの重鎖内「AG」SEED[2]変異体と軽鎖要素内「GA」SEED変異体から構成されるCH3ドメイン交換Fabと対をなすC末端側CH3ドメインにおけるA鎖及びB鎖変異体ドメイン技術[8]。1D−8:(1D−7)の例と同等であるが、Fabの重鎖内「GA」SEED[2]変異体と軽鎖要素内「AG」SEED変異体から構成されるドメイン交換Fabを有する。 非還元式SDS−PAGEによるドメイン交換ヘテロ二量体二重特異性抗体の特徴付けを示す図である。SDS−PAGEを、Colloidal Blue Stain Kit(Invitrogen社)で染色した。レーン1:非還元型ドメイン交換ヘテロ二量体二重特異性抗体1(CH3AG−重鎖上でFabドメイン交換)。レーン2:非還元型ドメイン交換ヘテロ二量体二重特異性抗体2(CH3GA−重鎖上でFabドメイン交換)。レーン3:非還元型ドメイン交換ヘテロ二量体二重特異性抗体3(CH3GA−重鎖上にドメイン交換Fabアームを有するCH3を含有する)。レーン4:タンパク質標準であるSeeBlue Plus2事前染色型分子量マーカー(Invitrogen社)。 ドメイン交換ヘテロ二量体二重特異性抗体1のSECプロファイルを示す図である(実施例1及び2を参照)。 ドメイン交換ヘテロ二量体二重特異性抗体2のSECプロファイルを示す図である(実施例1及び2を参照)。 ドメイン交換ヘテロ二量体二重特異性抗体3のSECプロファイルを示す図である(実施例1及び2を参照)。 還元条件又は非還元条件下でのSDS−PAGEによるドメイン交換二重特異性抗体1(BsAb1)の特徴付けを示す図である。SDS−PAGEを、Colloidal Blue Stain Kit(Invitrogen社)で染色した。レーン1:タンパク質標準であるSeeBlue Plus2事前染色型分子量マーカー(Invitrogen社)。レーン2:還元式SDS−PAGEプロファイルは、VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3AG(配列番号2)に対応するH1バンド、VH(2)−CH1−CH2−CH3GA(配列番号4)に対応するH2バンド、及びVL(1)−CH3_HOLE(Y407T)(配列番号1)及びVL(2)−CL(配列番号3)に対応するL1+L2バンドを示す。レーン3:非還元式SDS−PAGEプロファイルは、主要なバンドは、ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1に対応する二重特異性抗体であることを示す。 ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1のSECプロファイルを示す図である。 ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1のFACS分析結果を示す図である。 SEED AGドメインと融合したFabアーム内に、非改変Fabドメイン又はCH3ドメイン交換を含有するワンアームド抗体を示す概略図である。 非還元条件及び還元条件下でのSDS−PAGEによる、非改変Fabドメイン又はCH3ドメイン交換Fabを含有するワンアームド抗体の特徴付けを示す図である。SDS−PAGEを、Colloidal Blue Stain Kit(Invitrogen社)で染色した。レーン1:タンパク質標準であるSeeBlue Plus2事前染色型分子量マーカー(Invitrogen社)。レーン2:非還元式プロファイルは、主要なバンドは非改変抗体(CH1/CL Fab)に対応するワンアームド抗体であることを示す。レーン3:非還元型プロファイルは、主要なバンドは、ドメイン交換Fab抗体に対応するワンアームド抗体であることを示す。レーン4:還元式プロファイルは、VH(1)−CH1−CH2−CH3AG(配列番号11)に対応するH1バンド、huFc−GA SEED(配列番号9)に対応するH2バンド、及びVL(1)−CL(配列番号10)に対応するL1バンドを示す。レーン5:還元式プロファイルは、VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3AG(配列番号2)に対応するH1バンド、huFc−GA SEED(配列番号9)に対応するH2バンド、及びVL(1)−CH3_HOLE(Y407T)(配列番号1)に対応するL1バンドを示す。 Fab又はFabアーム内でCH3−KiHドメインの同族の対を用いたドメイン交換Fab内に、非改変CH1/CLドメインを含有するワンアームド抗体のSECプロファイルを示す図である(実施例6を参照)。 ワンアームド抗体(非改変Fab及びドメイン交換Fab)及びBsAb1のEGFR陽性細胞(A431細胞)に対する抗原結合を示す図である。細胞結合は、フローサイトメトリーによりを測定した。抗体を連続希釈(1:3)で試験し、また結合を、フィコエリトリンとコンジュゲートされた抗ヒトFc F(ab)2二次抗体を用いて検出した。測定を繰り返し実施した。 還元条件又は非還元条件下でのSDS−PAGEによるドメイン交換BsAb2(抗CD16×抗EGFR CH3−KiH)の特徴付けを示す図である。SDS−PAGEをColloidal Blue Stain Kit(Invitrogen社)で染色した。レーン1:タンパク質標準であるSeeBlue Plus2事前染色型分子量マーカー(Invitrogen社)。レーン2:還元式プロファイルは、VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3AG(配列番号2)に対応するH1バンド、VH(3)−CH1−CH2−CH3GA(配列番号13)に対応するH2バンド、VL(3)−CL(配列番号12)に対応するL1バンド、及びVL(1)−CH3_HOLE(Y407T)(配列番号1)に対応するL2バンドを示す。レーン3:非還元式プロファイルは、主要なバンドは、ドメイン交換BsAb2(抗CD16×抗EGFR CH3−KiH)に対応することを示す。 ドメイン交換BsAb2(抗CD16×抗EGFR CH3−KiH)のSECプロファイルを示す図である。 ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3−KiH)のLC−MS分析結果を示す図である。測定前に、サンプルをPNGaseにより脱グリコシル化した。デコンボリューションされたサムスペクトルより、正しく会合した二重特異性抗体の質量が得られる。 ドメイン交換二重特異性抗体BsAb2(抗CD16×抗EGFR CH3−KiH)のLC−MS分析結果を示す図である。測定前に、サンプルをPNGaseにより脱グリコシル化した。デコンボリューションされたサムスペクトルにより、正しく会合した二重特異性抗体の質量が得られる。 2つの競合する軽鎖を含め、同時発現させた非改変ワンアームド抗体の、LC−MSによる総質量測定を示す図である。正しく会合した抗体のみが見出された。ミスペアリングmAbは検出できなかった(ミスペアリングした場合のその質量の位置を矢印で示す)。 2つの競合する軽鎖を含め、同時発現させたドメイン交換ワンアームド抗体の、LC−MSによる総重量測定を示す図である。正しく会合した抗体のみが見出された。ミスペアリングmAbは検出できなかった(ミスペアリングした場合のその質量の位置を矢印で示す)。 ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1及びBsAb2のDSCプロファイルを示す図である。 抗体のCD16a受容体との結合を示す図である。CD16a HTRF細胞結合アッセイ法(CisBio社)を用いて結合を測定した。測定を繰り返し実施した。 ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1(A)及びBsAb2(B)存在下での、エフェクター細胞によるA431細胞のリダイレクト溶解を示す図である。 代替的に改変されたFab領域を有するドメイン交換抗体の、非還元式SDS−PAGEによる生物物理学的な特徴付け、並びにワンアームド抗EGFR SEED抗体(A及びC)、及びドメイン交換抗体(抗CD3×抗EGFR−CH3)(B及びD)のSECを示す図である。タンパク質をExpi293細胞内で生成し、プロテインAにより一段階精製した。SDS−PAGEゲルの各レーンに、5μgのタンパク質を負荷し、分離後、タンパク質を、Colloidal Blue Stain Kit(Invitrogen社)で染色した。変異体1及び変異体2を、SDS−PAGE内の1及び2として示す。変異体1のSECプロファイルを黒色の線で、変異体2を破線で示す(より詳細には実施例13を参照)。 変異体1(A)及び変異体2(B)の代替的ドメイン交換Fabアームを有するワンアームド抗体の、フローサイトメトリーにより測定したEGFR結合を示す図である。抗体を連続希釈(1:3)で試験し、そしてフィコエリトリンとコンジュゲートされた抗ヒトFc F(ab)2抗体を用いて結合を検出した。各データポイントを、二重反復測定値の平均値として表わす。 代替的に改変されたFabドメイン(変異体1)を有するドメイン交換二重特異性抗体存在下での、活性化T細胞による標的細胞のリダイレクト溶解を示す図である。T細胞を、IL−2及び抗CD3 IgGを用いて培養液中で24時間活性化した。刺激を受けたT細胞を、A431細胞と共に、E:T比が10:1、連続希釈(1:4)した試験抗体の存在下で、18時間同時培養した。細胞溶解(LDHの放出)を、CytoTox 96非放射性細胞毒性アッセイ法(Promega社)を用いて、上清内で測定した。各データポイントは、三重反復測定値の平均値±SDである。比較として、これまでの実施例に由来するドメイン交換BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3−KiH)を用いた。 ワンアームドドメイン交換KiH抗体の特徴付けを示す図である。模式図(A)に示すようなこれらの分子は、Expi293細胞内で生成され、プロテインA精製後に、SECにより分析した(B)。変異体1のSECプロファイルを黒色の線、及び変異体2のSECプロファイルを破線で示す。 変異体1(A)及び変異体2(B)の代替的に改変されたFab領域を有するワンアームドKiH抗体の、フローサイトメトリーにより測定したEGFR結合を示す図である。抗体を連続希釈(1:3)で試験し、A431細胞との抗原結合を、フィコエリトリンとコンジュゲートされた抗ヒトFc F(ab)2抗体を用いて検出した。各データポイントは、単回測定を表す。 CH3ドメイン交換Fabを抗体の異なる位置と結合させ、そして改変されたヘテロ二量体重鎖と組み合わせることにより形成される多様な抗体の数例を示す概略図である。CH3ドメイン交換Fabは、天然型抗体の異なる位置、又は改変されたヘテロ二量体重鎖の対と結合可能である。実施例に示すように、様々な改変されたCH3ドメインが、ヘテロ二量体重鎖を形成する、又はCH3ドメイン交換Fabを形成するのに利用可能である(すべてのオプションをここで図示するものではない)。21−1:VH2−CH3(ノブ)のN末端が天然型抗体のC末端と結合している、VH2−CH3(ノブ)とVL2−CH3(ホール)からなるCH3ノブ・イントゥ・ホール型のドメイン交換Fabと組み合わされた、VH1−CH1/VL1−CLドメイン対から構成されているN末端側Fabを有する天然型Ig抗体から構成される四価二重特異性抗体。21−2:VL2−CH3(ノブ)のN末端が天然型抗体のC末端と結合している、VH2−CH3(ホール)とVL2−CH3(ノブ)からなるCH3ノブ・イントゥ・ホール型のドメイン交換Fabと組み合わされた、VH1−CH1/VL1−CLドメイン対から構成されているN末端側Fabを有する天然型Ig抗体から構成される四価二重特異性抗体。21−3:VH2−CH3(ノブ)のN末端がSEED重鎖の一方のみのC末端と結合している、VH2−CH3(ノブ)及びVL2−CH3(ホール)からなるCH3ノブ・イントゥ・ホール型のドメイン交換Fabと組み合わされ、それぞれの重鎖と結合したVH1−CH1/VL1−CLドメイン対から構成されるN末端側Fabを用いて、SEED技術により組み立てられたヘテロ二量体重鎖から構成される、N末端側で2価及びC末端側で1価の二重特異性抗体。21−4:VH2−CH3(ノブ)のN末端がSEED重鎖の両方のC末端と結合している、VH2−CH3(ノブ)及びVL2−CH3(ホール)からなるCH3ノブ・イントゥ・ホール型のドメイン交換Fabと組み合わされ、SEED重鎖の一方のみと結合したVH1−CH1/VL1−CLドメイン対から構成されるN末端側Fabを用いて、SEED技術により組み立てられたヘテロ二量体重鎖から構成される、N末端側で1価及びC末端側で2価の二重特異性抗体。21−5:VH2−CH3(ノブ)のN末端がGA SEEDドメインのC末端と結合している、VH2−CH3(ノブ)とVL2−CH3(ホール)からなる1つのCH3ノブ・イントゥ・ホール型のドメイン交換Fab、及びVL3−CH3(ホール)のN末端がAG SEEDドメインのC末端と結合している、VH3−CH3(ノブ)とVL3−CH3(ホール)からなる異なるCH3ノブ・イントゥ・ホール型のドメイン交換Fabと組み合わされ、それぞれの重鎖と結合したVH1−CH1/VL1−CLドメイン対から構成されるN末端側Fabを用いてSEED技術により組立てられたヘテロ二量体重鎖から構成される、N末端側が2価であり、またC末端側で2つの異なる1価Fabドメインを有する三重特異性抗体。 ドメイン交換二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖のポリペプチド配列を示す図である:可変ドメインをイタリック体の文字で示す。CH3ドメイン交換配列に下線を付す。SEED CH3−GAドメイン及びSEED CH−AGドメインを太字で示す。ノブ、ホール、又はその他の変異体を形成する変異を、CH3ドメインのヘテロ二量体化を促進するように設計し、それを導入したが(有望な特定の実施形態の一部について、例示的に記載されている)、その変異をグレーで強調し、下線を付す。配列番号1:VL(1)−CH3_HOLE(Y407T);配列番号2:VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3AG;配列番号3:VL(2)−CL;配列番号4:VH(2)−CH1−CH2−CH3GA;配列番号5:VH(2)−CH1−CH2−CH3AG ドメイン交換二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖のポリペプチド配列を示す図である:可変ドメインをイタリック体の文字で示す。CH3ドメイン交換配列に下線を付す。SEED CH3−GAドメイン及びSEED CH−AGドメインを太字で示す。ノブ、ホール、又はその他の変異体を形成する変異を、CH3ドメインのヘテロ二量体化を促進するように設計し、それを導入したが(有望な特定の実施形態の一部について、例示的に記載されている)、その変異をグレーで強調し、下線を付す。配列番号6:VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3GA;配列番号7:VL(1)−CH3wt;配列番号8:VH(1)−CH3wt−CH2−CH3GA;配列番号9:huFc_GA SEED;配列番号10:VL(1)−CL ドメイン交換二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖のポリペプチド配列を示す図である:可変ドメインをイタリック体の文字で示す。CH3ドメイン交換配列に下線を付す。SEED CH3−GAドメイン及びSEED CH−AGドメインを太字で示す。ノブ、ホール、又はその他の変異体を形成する変異を、CH3ドメインのヘテロ二量体化を促進するように設計し、それを導入したが(有望な特定の実施形態の一部について、例示的に記載されている)、その変異をグレーで強調し、下線を付す。配列番号11:VH(1)−CH1−CH2−CH3AG;配列番号12:VL(3)−CL;配列番号13:VH(3)−CH1−CH2−CH3GA;配列番号14:VH(3)−CH1−CH2−CH3AG ドメイン交換二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖のポリペプチド配列を示す図である:可変ドメインをイタリック体の文字で示す。CH3ドメイン交換配列に下線を付す。SEED CH3−GAドメイン及びSEED CH−AGドメインを太字で示す。ノブ、ホール、又はその他の変異体を形成する変異を、CH3ドメインのヘテロ二量体化を促進するように設計し、それを導入したが(有望な特定の実施形態の一部について、例示的に記載されている)、その変異をグレーで強調し、下線を付す。配列番号15:VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2EN−CH3AG;配列番号16:huFc_g1hingeEN−CH2EN−CH3GA;配列番号17:VH(3)−CH1−CH2EN−CH3GA;配列番号18:VH(1)−CH3_KNOB(T366W)−CH2−CH3AG;配列番号19:VL(1)−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V) ドメイン交換二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖のポリペプチド配列を示す図である:可変ドメインをイタリック体の文字で示す。CH3ドメイン交換配列に下線を付す。SEED CH3−GAドメイン及びSEED CH−AGドメインを太字で示す。ノブ、ホール、又はその他の変異体を形成する変異を、CH3ドメインのヘテロ二量体化を促進するように設計し、それを導入したが(有望な特定の実施形態の一部について、例示的に記載されている)、その変異をグレーで強調し、下線を付す。配列番号20:VH(1)−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)−CH2−CH3AG;配列番号21:VL(1)−CH3_KNOB(T366W);配列番号22:VH(1)−CH3(E356K、D399K)−CH2−CH3AG;配列番号23:VL(1)−CH3(K392D、K409D);配列番号24:VH(1)−CH3(K392D、K409D)−CH2−CH3AG ドメイン交換二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖のポリペプチド配列を示す図である:可変ドメインをイタリック体の文字で示す。CH3ドメイン交換配列に下線を付す。SEED CH3−GAドメイン及びSEED CH−AGドメインを太字で示す。ノブ、ホール、又はその他の変異体を形成する変異を、CH3ドメインのヘテロ二量体化を促進するように設計し、それを導入したが(有望な特定の実施形態の一部について、例示的に記載されている)、その変異をグレーで強調し、下線を付す。;配列番号25:VL(1)−CH3(E356K、D399K);配列番号26:VH(1)−CH3(T350V、L351Y、F405A、Y407V)−CH2−CH3AG;配列番号27:VL(1)−CH3(T350V、T366L、K392L、T394W);配列番号28:VH(1)−CH3(T350V、T366L、K392L、T394W)−CH2−CH3AG;配列番号29:VL(1)−CH3(T350V、L351Y、F405A、Y407V) ドメイン交換二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖のポリペプチド配列を示す図である:可変ドメインをイタリック体の文字で示す。CH3ドメイン交換配列に下線を付す。SEED CH3−GAドメイン及びSEED CH−AGドメインを太字で示す。ノブ、ホール、又はその他の変異体を形成する変異を、CH3ドメインのヘテロ二量体化を促進するように設計し、それを導入したが(有望な特定の実施形態の一部について、例示的に記載されている)、その変異をグレーで強調し、下線を付す。配列番号30:VH(1)−CH3_SEED(AG)−CH2−CH3AG;配列番号31:VL(1)−CH3_SEED(GA);配列番号32:VH(1)−CH3_SEED(GA)−CH2−CH3AG;配列番号33:VL(1)−CH3_SEED(AG);配列番号34:VH(1)−CH3(E356K、D399K)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V) ドメイン交換二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖のポリペプチド配列を示す図である:可変ドメインをイタリック体の文字で示す。CH3ドメイン交換配列に下線を付す。SEED CH3−GAドメイン及びSEED CH−AGドメインを太字で示す。ノブ、ホール、又はその他の変異体を形成する変異を、CH3ドメインのヘテロ二量体化を促進するように設計し、それを導入したが(有望な特定の実施形態の一部について、例示的に記載されている)、その変異をグレーで強調し、下線を付す。配列番号35:VH(1)−CH3(K392D、K409D)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V);配列番号36:VH(1)−CH3(T350V、L351Y、F405A、Y407V)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V);配列番号37:VH(1)−CH3(T350V、T366L、K392L、T394W)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V);配列番号38:VH(1)−CH3_SEED(AG)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V) ドメイン交換二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖のポリペプチド配列を示す図である:可変ドメインをイタリック体の文字で示す。CH3ドメイン交換配列に下線を付す。SEED CH3−GAドメイン及びSEED CH−AGドメインを太字で示す。ノブ、ホール、又はその他の変異体を形成する変異を、CH3ドメインのヘテロ二量体化を促進するように設計し、それを導入したが(有望な特定の実施形態の一部について、例示的に記載されている)、その変異をグレーで強調し、下線を付す。配列番号39:VH(1)−CH3_SEED(GA)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V);配列番号40:huFc_KNOB(T366W);ヒトCH3ドメインのアミノ酸配列 配列番号41:ヒトIgG1のCH3;配列番号42:ヒトIgG2のCH3;配列番号43:ヒトIgG3のCH3;配列番号44:ヒトIgG4のCH3;配列番号45:ヒトIgAのCH3;配列番号46:ヒトIgMのCH3 ヒトCH3ドメインのアミノ酸配列 配列番号47:ヒトIgEのCH3;配列番号48:ヒトIgDのCH3;ドメイン交換Fab重鎖及び軽鎖要素内の交換ドメインのN末端及びC末端に隣接する転移配列の例として用いられるアミノ酸配列 配列番号49:ヒトCκ鎖 108〜111(Kabat EUナンバリング);配列番号50:ヒトIgG1重鎖 345〜348(Kabat EUナンバリング);配列番号51:ヒトIgG1重鎖 438〜444(Kabat EUナンバリング);配列番号52:ヒトVH J領域 109〜113(Kabat EUナンバリング);配列番号53:ヒトCH1ドメイン 118〜122(Kabat EUナンバリング)
用語「抗体」は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン若しくは免疫グロブリン様分子である抗原結合ポリペプチド、或いは例えば1つ若しくは複数の抗体ドメインから構成され、また免疫グロブリン又は抗体と類似した抗原結合特性を担持する、モジュラー抗体フォーマットを提示するその他のタンパク質、特に、単一、又は二重、又は多重特異性の結合特性、或いは1価、2価、又は多価の結合特性を示し得るタンパク質、例えば、特に細胞関連のタンパク質若しくは血清タンパク質を含む自己抗原等の病原体起源又はヒト構造物の、例えば抗原、エフェクター分子、又は構造物のエピトープに対応する少なくとも2つの特異的結合部位を示し得るタンパク質として定義される。用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書では交換可能に用いられる。
抗体は、リンカー配列を有する、又は有さない免疫グロブリンの重鎖及び/又は軽鎖の定常ドメイン及び/又は可変ドメインとして理解される抗体ドメインから一般的に構成される又はそれを含む。抗体は、可変抗体ドメインの対、例えば1つ若しくは2つのVH/VLの対等を含む、結合配列又はヒンジ領域を有する、又は有さない可変及び/又は定常抗体ドメインの組み合わせから構成される又はそれを含むものと特に理解される。ポリペプチドは、ループ配列により連結した抗体ドメイン構造の少なくとも2つのβストランドからなるβバレル構造を含む場合には、抗体ドメインとして理解される。抗体ドメインは、天然型構造のドメインであり得る、或いは、例えば、抗原結合特性又はその他の任意の特性、例えば安定性又は機能的特性、例えばFc受容体FcRn及び/又はFcγ受容体との結合等を修飾するために、変異誘発又は誘導体生成により修飾され得る。
用語「抗体」には、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン様構造の抗体、例えばドメイン交換抗体等を含む、完全長抗体が特に含まれる。特に、抗体は、完全長抗体、例えばIgGタイプ(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4サブタイプ)、IgA1、IgA2、IgD、IgE、又はIgM抗体の完全長抗体であり得る。
該用語には、抗体の誘導体、又は抗体ドメインと組み合わされた抗体、又は抗体フラグメントが更に含まれる。
用語「完全長抗体」は、特に重鎖の二量体を含め、少なくともFcドメインの大半を含み、これにより少なくともCH3HC/CH3HCの対、及び天然由来の抗体構造に一般的に見出されるその他のドメインを生成するあらゆる抗体分子を意味するのに利用可能である。この用語「完全長抗体」は、本明細書では、特定の抗体分子が抗体フラグメントではないことを強調するのに用いられる。
本明細書によれば、抗体は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的にコードされる1つ若しくは複数のポリペプチドを含むタンパク質(又はタンパク質複合体)として一般的に理解される。よく知られた免疫グロブリン遺伝子として、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子、並びに免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖(LC)は、κ又はλとして分類される。重鎖(HC)は、γ、μ、α、δ、又はεとして分類されるが、それは次に免疫グロブリンクラスであるIgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEをそれぞれ定義する。
HC又はLCは、相互に結合してドメインの鎖を生成する少なくとも2つのドメインからそれぞれ構成される。抗体HCは、VH抗体ドメイン、及びC末端側でVHと結合した少なくとも1つの抗体ドメインを含むものと特に理解される。抗体LCは、VL抗体ドメイン及びC末端側でVLに結合した少なくとも1つの抗体ドメインを含む。
定義には、可変領域(例えば、dAb、Fd、Vl、Vk、Vh、VHH等)及び定常領域の重鎖及び軽鎖のドメイン、又は天然抗体の個々のドメイン、例えばCH1、CH2、CH3、CH4、Cl、及びCk等、並びに構造的ループにより連結した免疫グロブリンドメインの少なくとも2本のβストランドからなるミニドメインが更に含まれる。一般的に、特異的CDR構造を通じて抗原結合部位を有する免疫グロブリンは、VH/VLドメイン対のCDRループを通じて標的抗原と結合することができる。
用語「抗体」には、異なる標的抗原に対する及び/又は立体配置が異なる抗体ドメインを含むその他の抗体又は免疫グロブリンを実質的に含まない単離された形態の抗体又は免疫グロブリンが特に含まれるものとする。更に、単離された抗体は、単離された抗体と、例えば少なくとも1つのその他の抗体、例えばモノクロナール抗体又は異なる特異性を有する抗体フラグメント等との組み合わせを含有する組み合わせ調製物に含まれ得る。
用語「抗体」は、人類を含む動物、例えばヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、ラマ、ウシ、及びウマを含む哺乳動物等、又はメンドリ等のトリに由来する抗体又は免疫グロブリンに適用されるものとし、同用語は、動物由来の配列、例えばヒト配列に基づく組み換え免疫グロブリンを特に含むものとする。
用語「抗体」は、ヒト抗体に特に適用される。
用語「ヒト」には、抗体又は免疫グロブリンにおいて用いられる場合、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体が含まれるものと理解される。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基(例えば、ランダム又は部位特異的in vitro変異誘発性により又はin vivo体細胞変異により導入された変異)を、例えばCDR内に含み得る。ヒト抗体として、ヒト免疫グロブリンライブラリから、又は1つ若しくは複数のヒト免疫グロブリンについて遺伝子導入された動物から単離された抗体が挙げられる。
ヒト抗体は、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、及びIgMからなる群より選択される、又はそれに由来するのが好ましい。
マウス抗体は、IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3、及びIgMからなる群より選択される、又はそれに由来するのが好ましい。
用語「抗体」は、キメラの抗体又は免疫グロブリン、例えば異なる種を起源とする配列、例えばマウス及びヒトを起源とする配列等を有するキメラ抗体に更に適用される。
用語「キメラ」とは、免疫グロブリン又は抗体において用いられる場合、重鎖及び軽鎖の各アミノ酸配列の一部分が、特定の種に由来する、又は特定のクラスに属する免疫グロブリン内の対応する配列と相同である一方、鎖の残りのセグメントは別の種又はクラスの対応する配列と相同である分子を意味する。一般的に、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物の1つの種に由来する免疫グロブリンの可変領域を模倣する一方、定常部分は、他方に由来する免疫グロブリンの配列と相同である。例えば、可変領域は、容易に入手可能なB細胞又はヒト以外の宿主生物に由来するハイブリドーマを、例えばヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせて利用する現在知られているソースに由来し得る。
用語「抗体」は、ヒト化した抗体又は免疫グロブリンに更に適用され得る。
用語「ヒト化」とは、抗体又は免疫グロブリンにおいて用いられる場合、ヒト以外の種から得られた免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子を意味し、分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造及び/又は配列に基づく。抗原結合部位は、定常ドメインと融合した完全な可変ドメイン、又は可変ドメイン内の該当するフレームワーク領域とグラフト結合した相補性決定領域(CDR)のみを含み得る。抗原結合部位は、野生型であり得る、又は例えば1つ若しくは複数のアミノ酸置換により修飾され得る、好ましくはヒト免疫グロブリンとより密接に類似するように修飾され得る。ヒト化免疫グロブリンのいくつかの形態は、すべてのCDR配列を保存する(例えば、6つすべてのCDRを含有するマウス抗体由来のヒト化マウス抗体)。その他の形態は、オリジナルの抗体に関して変更が加えられた1つ又は複数のCDRを有する。
用語「抗体」は、モノクロナール抗体又はポリクロナール抗体、特に組み換え抗体に更に適用され、該用語には、組み換え手段により調製、発現、作製、又は単離されるすべての抗体及び抗体構造が含まれ、例えば異なる起源に由来する遺伝子又は配列を含む、動物、例えばヒトを含む哺乳動物に由来する抗体、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、又はハイブリドーマ由来の抗体等が挙げられる。更なる事例として、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、又は組み換え体から単離された抗体、抗体若しくは抗体ドメインのコンビナトリアルライブラリ、又は抗体遺伝子配列をその他のDNA配列にスプライシングする工程と関係する任意のその他の手段により調製、発現、作製、又は単離された抗体が挙げられる。
用語「抗体」には、新規の抗体、又は既存の、例えば天然由来の抗体の機能的に活性な変異体が含まれるものと理解される。抗体の変異体、特に抗体様分子の変異体、又は抗体変異体という用語は、そのような分子の誘導体もやはり含むべきものと更に理解される。誘導体とは、1つ若しくは複数の抗体の任意の組み合わせ、及び/又は抗体の任意のドメイン若しくはミニドメインが、任意の位置で、1つ若しくは複数のその他のタンパク質、例えばその他の抗体若しくは抗体フラグメント等のほか、リガンド、酵素、毒素等と融合し得る融合タンパク質である。本発明の抗体は、例えばその他のペプチド又はポリペプチドを用いた組み換え、融合、又はコンジュゲーション技法を通じて、単離されたポリペプチド又は組み合わせ分子として特に利用可能である。ペプチドは、免疫グロブリンドメイン配列と相同であるのが好ましく、また少なくともアミノ酸5個分の長さであるのが好ましく、少なくとも10個分、又は更に少なくともアミノ酸50個分若しくは100個分の長さであるのがより好ましく、また免疫グロブリンドメインのループ領域を少なくとも部分的に構成する。
抗体の誘導体は、様々な化学的技法、例えば共有結合カップリング、静電相互作用、ジスルフィド結合等により、その他の物質との会合又は結合によっても取得可能である。免疫グロブリンに結合したその他の物質は、脂質、炭水化物、核酸、有機分子及び無機分子、又は任意のこれらの組み合わせであり得る(例えば、PEG、プロドラッグ、又は薬物)。誘導体は、同一のアミノ酸配列を有するが、全体的に若しくは部分的に非天然の又は化学的に修飾されたアミノ酸からなる抗体も含む。特定の実施形態では、抗体は、生物学的に許容される化合物との特異的相互作用を可能にする追加タグを含む誘導体である。本発明で使用可能なタグに関して、免疫グロブリンがその標的と結合する際に、その結合に対して悪影響を有さない又は悪影響が許容可能である限り、特別な制限は存在しない。適するタグの例として、His−タグ、Myc−タグ、FLAG−タグ、ストレップ−タグ、カルモジュリン−タグ、GST−タグ、MBP−タグ、及びS−タグが挙げられる。別の特定の実施形態では、免疫グロブリンは、標識を含む誘導体である。用語「標識」とは、本明細書で用いる場合、検出可能な化合物又は組成物を意味し、「標識」抗体が生成するように免疫グロブリンと直接又は間接的にコンジュゲートされしている。標識は、そのものが検出可能、例えば放射性同位体標識若しくは蛍光標識であり得る、又は酵素標識の場合は、基質化合物若しくは組成物の検出可能な化学変化を触媒し得る。
抗体の誘導体は、例えば、親抗原結合(例えば、CDR)又はフレームワーク(FR)配列等の親抗体又は親抗体配列に由来し、例えば、in silico若しくは組み換えエンジニアリングにより取得された変異体又は変異体、又は化学的誘導体生成若しくは合成によるそれ以外のものである。
用語「変異体」は、本明細書で用いる場合、本明細書に記載するような、任意の「変異体」、「同族体」、又は「誘導体」を特に含むものとする。用語「変異体」は、機能的に活性な変異体を特に含むものとする。本発明による抗体の機能的な変異体は、抗原結合、並びにLC及びHCの二量化に関して特に機能的であり、これによりCH3LC/CH3HCドメイン対を形成する。
用語「変異体」は、ミュータント抗体又は抗体のフラグメント等の抗体を特に意味するものとし、例えば、特にインサートを除去、交換し、特定の抗体アミノ酸配列又は領域に導入する、或いは例えば、抗体安定性、エフェクター機能、若しくは半減期を改変するために定常ドメインにおいて、又は、例えば当技術分野において利用可能なアフィニティー成熟技法により、抗原結合特性を改善するために、可変ドメインにおいて、アミノ酸配列を化学的に誘導化する変異誘発法により取得される。任意の公知の変異誘発法が採用され得るが、これには、例えばランダム化技法により取得されるような、所望の位置での点変異が含まれる。場合によっては、位置は、例えば任意の可能性のあるアミノ酸を用いて、又は抗体配列をランダム化するのに好ましいアミノ酸を選択することによりランダムに選択される。用語「変異誘発」とは、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を変化させるための、当技術分野でよく知られた任意の技法を意味する。好ましい種類の変異誘発として、エラープローンPCR変異誘発、飽和変異誘発、又はその他の部位特異的変異誘発が挙げられる。
用語「機能的変異体」は、本明細書では「機能的に活性な変異体」とも呼ばれ、例えば、1つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、除去、又は置換、或いはアミノ酸配列内の1つ若しくは複数のアミノ酸残基の化学的誘導体生成、或いはヌクレオチド配列内の、又は例えば、CDR若しくはFR配列内の配列の遠位末端部のいずれか若しくは両方におけるヌクレオチドの化学的誘導体生成による親配列の修飾に起因する配列(例えば、親抗体に由来する)を含み得るが、その修飾は、この配列の活性に影響を及ぼさない、特に損なわない。選択された標的抗原に対して特異性を有する結合部位の場合、抗体の機能的に活性な変異体は、事前に決定された結合特異性をなおも有するが、但し、例えば、特定のエピトープに対する微細特異性、アフィニティー、アビディティー、Kon又はKoffレート等を変化させるために変更され得る。例えば、アフィニティー成熟型抗体は、機能的に活性な変異体抗体として特に理解される。従って、アフィニティー成熟型抗体内の修飾されたCDR配列は、機能的に活性な変異体として理解される。
機能的活性は、例えば、標的抗原との結合特異性、及び/又は分子に求められるin vivo半減期、及び/又はpH依存性のFcRn結合を測定するアッセイ法において、親分子と対比しながら変異体の構造及び機能により決定されるのが好ましく、例えば、免疫グロブリンの機能性測定による標準アッセイ法において決定される。
抗原が細胞表面上で発現する場合、抗体の機能的な活性は、抗原結合に関して、ELISAアッセイ法、BIAcoreアッセイ法、Octet BLIアッセイ法、又はFACSに基づくアッセイ法で一般的に測定される。
機能的に活性な変異体は、例えば、親抗体、例えば、IgG1構造等の免疫グロブリンの特異的天然構造を有するモノクロナール抗体の配列を変化させて、標的抗原の認識において同一の特異性を有するが、親構造とは異なる構造を有する変異体を取得する、例えば、免疫グロブリンドメインのいずれかを改変して特異的変異を導入する、二重特異性構築物を生成する、又は親分子のフラグメントを生成すること等により取得可能である。
一般的に、親の免疫グロブリン又は配列は、抗原結合部位近傍の配列領域内又は結合部位内に、抗原結合を損なわない変異が組み込まれた変異体であって、好ましくは抗原結合能力を含め、親抗体と類似した生物活性を有する、例えば抗原を標的とする特異的結合アッセイ法又は機能的試験により測定したときに、実質的に同一の生物活性を有する変異体を生成するように改変可能である。
用語「実質的に同一の生物活性」とは、本明細書で用いる場合、実質的に同一の活性、すなわち同等の抗体又は親抗体について測定したときの活性の少なくとも20%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、例えば、少なくとも100%、又は少なくとも125%、又は少なくとも150%、又は少なくとも175%、又は例えば、最大200%として表わされる活性を意味する。
本明細書に記載する好ましい変異体は、抗原結合に関して機能的に活性であり、好ましくは個々の抗原と特異的に結合するが、標的抗原ではないその他の抗原と有意に結合しない能力を有するが、例えば、そのときのKd値の差異は、少なくとも2対数、好ましくは少なくとも3対数である。機能的に活性な変異体による抗原結合は、一般的に損なわれず、親の抗体若しくは配列、又は例えば、Kd値の差異が2対数未満、好ましくは3対数未満の配列変異体を含む抗体の結合アフィニティーと実質的にほぼ等しい結合アフィニティーに対応するが、但し、アフィニティーが改善しさえする、例えばKd値の差異が少なくとも1対数、好ましくは少なくとも2対数となる可能性も有する。
本明細書に記載するような特定の機能的変異体は、ドメイン交換抗体、特に1つ又は複数の改変されたCH3HETドメインを含む機能的変異体であり、CH3HET/CH3HET二量体形成を改善する1つ又は複数の点変異を含む。
好ましい実施形態では、親抗体の機能的に活性な変異体は、
a)抗体の生物学的に活性なフラグメントであり、該フラグメントは、分子の配列のうちの少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、又は少なくとも95%、及び最も好ましくは少なくとも97%、98%、又は99%を含み、
b)少なくとも1つのアミノ酸が置換、付加、及び/又は除去された抗体に由来し、機能的に活性な変異体は、分子又はその一部分に対して配列相同性を有し、例えば、少なくとも50%の配列相同性、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、なおもより好ましくは少なくとも90%、なおいっそうより好ましくは少なくとも95%、及び最も好ましくは少なくとも97%、98%、又は99%の配列相同性を有する抗体等であり、並びに/或いは
c)抗体又はその機能的に活性な変異体、及びポリペプチド又はヌクレオチド配列とは異種の少なくとも1つの更なるアミノ酸又はヌクレオチドから構成される。
本発明の1つの好ましい実施形態では、本発明による抗体の機能的に活性な変異体は、上記変異体と本質的に同一であるが、異なる種の相同的配列に由来するという点において、そのポリペプチド又はヌクレオチド配列はそれぞれ異なる。これらは、天然由来の変異体又は類似体と呼ばれる。
用語「機能的に活性な変異体」には、天然由来の対立遺伝子変異体、並びに変異体、又は任意のその他の非天然由来の変異体も含まれる。当技術分野において公知なように、対立遺伝子変異体は、ポリペプチドの生物学的機能を本質的に変化させない1つ又は複数のアミノ酸の置換、欠損、又は付加を有するものとして特徴づけられる、交互に入れ替わった形態の(ポリ)ペプチドである。
機能的に活性な変異体は、ポリペプチド又はヌクレオチド配列内の配列変更により、例えば、1つ又は複数の点変異により取得され得るが、該配列変更は、本発明と組み合わせて用いられる場合、変更前のポリペプチド又はヌクレオチド配列の機能を保持又は改善する。そのような配列変更として、(保存的な)置換、付加、除去、変異、及び挿入を挙げることができるが、但しこれらに限定されない。
特定の機能的に活性な変異体は、CDR変異体である。CDR変異体には、CDR領域内の少なくとも1つのアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列が含まれ、上記修飾は、アミノ酸配列の化学的又は部分的な変更であり得るが、そのように修飾しても、変異体は、修飾前の配列の生物学的特徴を保持することが可能である。CDRアミノ酸配列の部分的な変更は、1つから数個のアミノ酸、例えば、1、2、3、4、若しくは5個のアミノ酸の除去又は置換による、又は1つから数個のアミノ酸、例えば、1、2、3、4、若しくは5個のアミノ酸の付加又は挿入による、又は1つから数個のアミノ酸、例えば、1、2、3、4、若しくは5個のアミノ酸の化学的誘導体生成による、又はその組み合わせによる可能性がある。アミノ酸残基内の置換は、保存的な置換、例えば1つの疏水性アミノ酸と代替的疏水性アミノ酸との置換であり得る。
保存的な置換は、アミノ酸の側鎖及び化学的特性に関連するアミノ酸のファミリー内で生ずる置換である。そのようなファミリーの例として、塩基性側鎖、酸性側鎖、非極性脂肪族側鎖、非極性芳香族側鎖、非荷電極性側鎖、小型の側鎖、大型の側鎖を有するアミノ酸等が挙げられる。
点変異とは、異なるアミノ酸に関する1つ又は複数の一重(非連続的)又は二重のアミノ酸の置換若しくは交換、欠失又は挿入において、非改変アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列の発現を引き起こすポリヌクレオチドの改変と特に理解される。
好ましい点変異とは、極性及び/又は電荷が同一のアミノ酸の交換を指す。こうしたことから、アミノ酸とは、64種類の三重コドンによりコードされる20種類の天然由来のアミノ酸を指す。これら20種類のアミノ酸は、中性電荷、正電荷、及び負電荷を有するアミノ酸に分類可能であり、
「中性」アミノ酸を、それぞれの3文字コードと1文字コード及び極性と共に以下の通り示す:
アラニン:(Ala、A)非極性、中性;
アスパラギン:(Asn、N)極性、中性;
システイン:(Cys、C)非極性、中性;
グルタミン:(Gln、Q)極性、中性;
グリシン:(Gly、G)非極性、中性;
イソロイシン:(Ile、I)非極性、中性;
ロイシン:(Leu、L)非極性、中性;
メチオニン:(Met、M)非極性、中性;
フェニルアラニン:(Phe、F)非極性、中性;
プロリン:(Pro、P)非極性、中性;
セリン:(Ser、S)極性、中性;
トレオニン:(Thr、T)極性、中性;
トリプトファン:(Trp、W)非極性、中性;
チロシン:(Tyr、Y)極性、中性;
バリン:(Val、V)非極性、中性;及び
ヒスチジン:(His、H)極性、正電性(10%)、中性(90%)。
「正に」荷電したアミノ酸は:
アルギニン:(Arg、R)極性、正;及び
リジン:(Lys、K)極性、正
である。
「負に」荷電したアミノ酸は:
アスパラギン酸:(Asp、D)極性、負;及び
グルタミン酸:(Glu、E)極性、負
である。
抗体配列に関する「アミノ酸配列の同一性のパーセント(%)」は、配列相同性の最大パーセントを達成するように、また配列相同性の一部として保存的置換を一切考慮せずに配列の位置合わせを行い、そして必要な場合にはギャップを導入した後に、所定のポリペプチド配列内のアミノ酸残基と一致する候補配列内のアミノ酸残基の百分率(%)として定義される。当業者は、比較の対象となる配列の全長にわたり、一致性が最大となるのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、一致性を測定するしかるべきパラメーターを決定することができる。
抗体変異体には、例えば、糖鎖工学により生成される特定のグリコシル化パターンを有する同族体、類似体、フラグメント、修飾体、又は変異体が含まれるものと特に理解され、抗体変異体は機能的であり、例えば、特定の標的に結合し、機能的特性を有するなど、また機能的同等物として役に立つ可能性がある。抗体又はCH3抗体ドメインは、グリコシル化されても、またグリコシル化されなくてもよい。例えば、本明細書に記載するような組み換え抗体は、免疫グロブリンを発現する宿主細胞により決定される分子の特異的グリコシル化が可能となるように、適する哺乳動物細胞内で発現され得る。
抗体ドメイン、特にCH3ドメイン等の定常抗体ドメインの「βシート」又は「βストランド」という用語は、本明細書では以下のように理解される。抗体ドメインは、少なくとも2つ又は3つのバックボーン水素結合により横方向に連結した少なくとも2本のβストランドから一般的に構成され、一般的に捻じられた、ひだ状のシートを形成する。βストランドは、一般的に長さが3〜10個のアミノ酸からなる単一の連続的なアミノ酸のストレッチであり、そのように延長型の立体構造を採るが、また少なくとももう一方のストランドとのバックボーン水素結合に関与してβシートを形成する。βシート内では、βストランドの大部分は、他方のストランドに隣接して配置し、そして広範な水素結合ネットワークをその近傍のストランドと形成し、その場合、一方のストランドのバックボーン内のN−H基が、隣接したストランドのバックボーン内のC=O基と水素結合を形成する。
抗体定常ドメイン、例えばCH2又はCH3ドメイン等の構造は、ループにより連結したβストランドからなる可変ドメインの構造と類似しており、その一部は、短いαヘリックス型ストレッチを含む。様々なFc結晶構造のb因子から理解されるように、フレームワークは、おおむね剛性であり、またループは比較的柔軟性である。抗体CH3ドメインは、βシート(A−B−C−D−E−F−G)を形成する7本のβストランドを一般的に有し、この場合、βストランドは、複数のループ、すなわちCH3ドメインのN末端側先端部分に位置する3つのループ(A−B、C−D、E−F)、及びCH3ドメインのN末端側先端部分に位置する更なる3つのループ(B−C、D−E、F−G)を介して結合している。CH3ドメインの「ループ領域」とは、βストランドの領域間に位置するタンパク質の部分を意味する(例えば、各CH3ドメインは、N末端からC末端に向かってA〜Gの7つのβシートを含む)。
好ましくはCH3ドメインの対、例えばCH3HET/CH3HET二量体等は、A、B、及びEストランドを含む結合表面を連結することにより生成されるが、その結合表面は、本明細書では、第2のCH3のβシート領域と接触状態となって二量体を生成する第1のCH3のβシート領域とも呼ばれる。
「CH3ドメイン」は、本明細書では、抗体CH3ドメインから、例えば抗体のFcフラグメント等から得られたポリペプチドとして特に理解される。Fcフラグメントは、IgG、IgA、IgD、IgE、又はIgMに由来し得る。特に、本明細書に記載するようなCH3ドメインは、ヒトIgG1抗体(配列番号41として識別される)、ヒトIgG2抗体(配列番号42として識別される)、ヒトIgG3抗体(配列番号43として識別される)、又はヒトIgG4抗体(配列番号44として識別される)、又はヒトIgA抗体(配列番号45として識別される)、又はヒトIgM抗体(配列番号46として識別される)、又はヒトIgE抗体(配列番号47として識別される)、又はヒトIgD抗体(配列番号48として識別される)のアミノ酸配列、或いは、例えばしかるべき配列相同性を有するその機能的な変異体を含み得る。
本明細書に記載する1つの実施形態では、CH3ドメインは、変異を含み得る、例えば1つ又は複数の点変異、例えばノブ又はホール変異を含める等して、異種配列と置き換わった1つ又は複数のβストランドの少なくとも一部分を有し得る。
特異的ノブ変異は、βストランド構造の追加の突起を提供する1つ又は複数のアミノ酸を組み込むことにより2つのドメイン間で接触表面を増加させる1つ又は複数のアミノ酸置換、例えばT366Y、T366W、T394W、F405Aからなる群より選択されるCH3ノブ変異のうちの1つ又は複数である。特異的ノブ修飾とは、抗体のCH3ドメイン内の変異T366Wを指す(ナンバリングはKabatのEUインデックスに基づく)。ノブ変異は、例えばホール変異を組み込むように修飾された別の抗体ドメインに結合するためのマッチング(同族)表面を特に提供する。
特異的ホール変異は、βストランド構造の追加の陥凹部を提供する1つ又は複数のアミノ酸を組み込むことにより、2つのドメイン間で接触表面を増加させる1つ又は複数のアミノ酸置換、例えばT366S、L368A、及びY407Vからなる群より選択されるCH3ホール変異のうちの1つ又は複数である。特異的ホール修飾とは、抗体のCH3ドメイン内の変異T366S、L368A、Y407V、Y407Tのいずれかを指す(ナンバリングはKabatのEUインデックスに基づく)。ホール変異は、例えばノブ変異を組み込むように修飾された別の抗体ドメインに結合するためのマッチング(同族)表面を特に提供する。
マッチングするノブ・イントゥ・ホール変異として、例えばCH3ドメインの対の一方のCH3ドメイン上のT366Yと、これにマッチングする第2のCH3ドメイン上のY407’Tが挙げられ、本明細書ではT366Y/Y407’Tと呼ばれる。更なるマッチング変異として
T366Y/Y407’T、
F405A/T394’W、
T366Y:F405A/T394‘W:Y407’T、
T366W/Y407’A、及び/又は
S354C:T366W/Y349’C:T366’S:L368’A:Y407’V
が挙げられる。
特異的CH3変異には、例えばCH3βストランド内の1つ又は複数のセグメント又は配列が変異しており、オリジナルのCH3ドメインとは異なる抗体ドメイン、例えば異なるタイプ又はサブタイプの抗体ドメインのセグメント又は配列が組み込まれている場合、分子間のβストランドスワップが含まれる。特異的変異体は、ストランド交換により取得されるが、この場合、IgGタイプのCH3ドメインにIgAタイプのCH3ドメインの1つ又は複数のセグメント又は配列が組み込まれる。2つのストランド交換CH3ドメインが変異して同族の対を形成する場合、CH3ドメインそれぞれのIgAセグメント又は配列は、変異したCH3ドメインが、野生型CH3ドメインよりも選好的に相互に対をなすように、同族のドメイン間接触表面を生成する。セグメントスワップを組み込んだ抗体ドメインのそのような修飾の具体例として、ストランド交換操作ドメイン(SEED)を挙げることができる。そのような修飾は、非対称性及び二重特異性免疫グロブリン、特に重鎖のSEED修飾型CH3ドメインを選好的に対形成させることによって二重特異性抗体を生成するのに利用可能である。これは、保存されたCH3ドメイン内の免疫グロブリンの構造的に関連した配列の交換に基づく。SEED CH3ドメイン内のヒトIgA及びIgGに由来の交互に反復する配列は、AG及びGAと表される非対称性であるが相補的な2つのドメインを生成する。SEEDデザインは、AG及びGA SEED CH3ドメインのホモ二量体化を回避しつつ、AG/GAヘテロ二量体の効率的な生成を可能にする。
特異的CH3変異には、ジスルフィド架橋を形成して、追加されたドメイン内ジスルフィド架橋により抗体ドメインを安定化させる、又は追加されたドメイン間ジスルフィド架橋により抗体ドメインの対を安定化させる能力を有するシステイン残基の組み込みが含まれる。ジスルフィド結合は、2つのシステインのチオール基の酸化により通常形成され、これによりS原子が結合して2つのシステイン残基の間でジスルフィド架橋が形成される。特に、システインは、CH3ドメインのC末端領域内又はC末端に挿入され得る(アミノ酸付加又はアミノ酸置換による)。追加のシステイン修飾を担持するCH3の対は、CH3の対間でジスルフィド結合を形成することにより安定化し得るが、これによりCH3/CH3二量体を生成する。いくつかの実施形態では、ジスルフィド結合した免疫グロブリン又は免疫グロブリンドメインは、ホモ二量体又はヘテロ二量体を含み、従って同一の又は異なるドメイン対を含む。
免疫グロブリン鎖又はドメインの正しい対形成を可能にするために、任意のCH3変異法が、特に利用可能であり、例えばノブ・イントゥ・ホール技術、SEED技術、電荷反発技術、ジスルフィド結合、又はクロス−mAb技術が、正しく会合しない分子の量を低減するために利用可能である。
抗体ドメインの「対」、例えばCH3ドメインの対は、2つの抗体ドメイン一式として理解され、この場合、一方は、その表面上又はキャビティ内に、他方のドメイン上の部位と特異的に結合する、従って相補的な部位を有する。免疫グロブリンドメイン、特に抗体ドメインは、βシート領域が接触することにより会合し、免疫グロブリンドメインの対を形成し得る。そのようなドメインの対は二量体とも呼ばれ、例えば静電相互作用、組み換え融合、又は共有結合により会合するが、例えば固体形態及び液状形態の両方において、2つのドメインを物理的に直接会合させる。本明細書に特に記載されることとして、CH3/CH3二量体が挙げられるが、この二量体は、同一の一次、二次、及び三次構造、例えば同一のアミノ酸配列からなるCH3ドメインの対、すなわち「ホモ二量体」であり得る、又は一次、二次、及び三次構造のいずれかが異なる、例えばβストランド若しくはループ領域のいずれかのアミノ酸配列が異なるCH3ドメインの対であり得る。特定のヘテロ二量体は、CH3/CH3ドメインの同族の対を形成するように生成され得る。
用語「同族」とは、ドメインの対又はドメイン二量体に関して、各ドメイン上で、そのようなドメインの対を選好的に形成する接触表面が得られるようにする、マッチング結合ポイント又は構造を有するドメインとして理解される。特定のCH3ドメインは、CH3ドメインの少なくとも一方がその同族のCH3結合パートナーと選好的に結合して、CH3/CH3の対を生成するように修飾される場合には、「同族」又はCH3/CH3ドメインの同族の対として理解される。特に、両方のCH3ドメインは、マッチング変異、例えばノブ・イントゥ・ホール変異、SEED変異、ジスルフィド架橋を形成するための追加のシステイン残基、又は電荷反発技術を利用する修飾により修飾され得る。
用語「異種」は、免疫グロブリンに組み込まれる抗体ドメイン、例えば本明細書ではCH3HETとも呼ばれる異種CH3ドメインに関して、抗体又は抗体のHC若しくはLCに組み込まれる外来のCH3ドメインを含むものと理解される。既存又は自然起源の免疫グロブリンドメイン、例えば親免疫グロブリン構造のCL、CH1、又はCH2ドメインを置換することにより、CH3HETドメインが組み込まれるように改変された免疫グロブリンは、本明細書では「ドメイン交換」免疫グロブリンとして理解される。そのようなドメイン交換免疫グロブリンは、機能的変異体、例えばフラグメント、変異体、又はアミノ酸が延長したもの、例えばドメインが付加したものが生成するように更に修飾され得る。
用語「外来の」は、アミノ酸、アミノ酸配列、又は免疫グロブリンドメイン等の分子の部分という文脈では、天然由来であるが、修飾部位にとって外来であり得る新規導入部分、又はそのような天然由来の部分の(機能的)変異体を意味するものとし、或いは天然由来部分の置換体であり得る。
CH3ドメインに関する「外来の」とは、CH3ドメインが、起源が異なるドメイン、及び/又は起源が同一(例えば、タイプ若しくはサブタイプが同一、及び/又は種が同一)であるが、免疫グロブリン分子内のその位置が異なるドメインであることを意味する。例えば、種及び免疫グロブリンのタイプ又はサブタイプが同一の追加のCH3HETは、FcのC末端抗体ドメイン以外の位置に配置される。抗体のFab部分に配置されるCH3ドメインは、いずれもCH3HETであると理解される。一般的に、そのようなFabとして、CH3HET/CH3HETの対が挙げられ、各CH3HETは、N末端側で可変ドメインと結合する。HC内のCH3HETの具体的な事例は、任意の更なる抗体ドメイン、例えば、好ましくはCH2、CH3、及びCH4からなる群より選択される定常ドメインとC末端側で結合している。これにより、新規のHC及び/又はLCが、CH3HETドメインを組み込みながら生成され得る。特に、CH3HET/CH3HETの対、好ましくはCH3HET/CH3HETの同族の対を含む新規のHC/HC及び/又はHC/LCの対が生成され得る。
本明細書で特に記載されることとして、本発明の抗体で採用されるCH3HETドメインは、非免疫性ドメインであることが挙げられる。そのような非免疫性CH3ドメインは、ループ領域内に抗原結合部位を含まないものと特に理解される。CH3ドメインは、天然の状態ではCDRループ領域又は抗原結合部位を一切含まず、従って野生型CH3ドメインは、非免疫性ドメインと理解される。いくつかの抗体エンジニアリング技法が、抗原結合部位を、CH3ドメイン等の定常ドメインのループ領域内に組み込むことができる。定常ドメインのそのようなループ領域は、「構造的ループ領域」と呼ばれ、定常ドメインの1つ又は複数のループによる抗原との結合に関与する。構造的ループ領域による相互作用を通じて抗原と結合することができる、そのような「免疫性」CH3ドメインとは対照的に、CH3HETドメインは、本明細書で用いる場合、非免疫性ドメインであり、従って、構造的ループ領域内にそのような抗原結合部位を含まない。
抗体、特にドメイン交換免疫グロブリンのFc部分のCH2−CH3部以外の位置にCH3HETを含む抗体は、別のドメインとの新種の結合、少なくとも新規のN末端結合を特に含み、これにより2つのドメインの界面において新規構造を提供する。好ましいリンカー配列は、天然のリンカー配列、天然由来のドメイン結合配列から得られる末端配列、例えばヒンジ配列、又は天然由来の免疫グロブリン構造の天然に結合したドメイン、例えばCH3HETドメインのN末端に天然に結合した抗体ドメインから得られる、長さがアミノ酸1〜20個分、若しくは2〜10個分、若しくは3〜8個分のC末端アミノ酸領域、例えばCH2ドメインのC末端領域であり、N末端、又はN末端側が短縮したCH3配列を提供するために、長さがアミノ酸1〜20個分、若しくは2〜10個分、若しくは3〜8個分だけN末端領域が除去されたCH3ドメインと結びつけるリンカーとして利用可能である。或いは、機能的に適する人工的配列が、リンカーとして利用可能である。特に、CH3HETドメインのN末端は、天然型のN末端、又はN末端側で短縮若しくは延長したCH3配列のN末端であり得るが、この場合、上記N末端は、C末端側で短縮若しくは延長した第2のドメインのC末端と結合している。
用語「多価」とは、本明細書に記載する抗体に関して、同一の標的抗原に結合する、特にそのような標的抗原の同一の又は異なるエピトープと結合する少なくとも2つの結合部位を有する分子を指すものとする。該用語には、2価の抗体、又は例えば少なくとも2、3、4個、若しくはそれより多くの結合部位を通じて標的抗原と結合する2以上の結合価を有する分子が含まれるものとする。例えば、2価の抗体は、2つの対からなり、その両方とも同一の標的抗原と結合するVH/VLドメインを介した2つの抗原結合部位を有し得る。
用語「多重特異性」とは、本明細書に記載する抗体に関して、少なくとも2つの異なる標的抗原と特異的に結合する少なくとも2つの結合部位を有する分子を指すものとする。該用語には、二重特異性抗体、又は2つ以上の標的抗原と、例えば少なくとも2、3、4個、若しくはそれより多くの結合部位を通じて結合する2つ以上の特異性を有する分子が含まれるものとする。例えば、二重特異性抗体は、VH/VLドメインの一方の対(Fv領域)を通じて1つの標的抗原と結合し、またVH/VLドメイン(Fv領域)の第2の対により別の標的抗原と結合し得る。
本発明に基づき用いられる場合、用語「抗原」又は「標的」には、抗体の結合部位による被認識能力を有するすべての抗原及び標的分子が特に含まれるものとする。本発明に基づく分子により標的対象とされる特に好ましい抗原は、免疫学的に又は治療上関連する又はそうした能力を有することがすでに証明された、特に臨床的有効性が試験済みの抗原又は分子である。用語「標的」又は「抗原」は、本明細書で用いる場合、(ヒト又はその他の動物の)、自己抗原である腫瘍関連受容体及び可溶性の腫瘍関連抗原、例えば、腫瘍細胞上に位置する受容体、又はそのような腫瘍と関連して癌患者の循環系内に豊富に存在すサイトカイン若しくは又は増殖因子からなる群より選択される分子を特に含むものとする。更なる抗原は、病原体起源、例えば微生物又はウイルス性の病原体の抗原であり得る。
標的抗原は、標的分子全体、又はそのような分子のフラグメント、特に下部構造、例えば免疫学的に関連し、すなわち、天然抗体又はモノクロナール抗体によって認識可能でもある、「エピトープ」(例えばB細胞エピトープ、T細胞エピトープ)と一般的に呼ばれる標的のポリペプチド又は炭水化物構造として認識される。用語「エピトープ」は、本発明に基づき本明細書で用いる場合、本発明の免疫グロブリンの結合部位に対する特異的結合パートナーを完全に作り上げることができる、又は特異的結合パートナーの一部分となり得る分子構造を特に意味するものとする。用語「エピトープ」は、ハプテンも意味する。化学的には、エピトープは、炭水化物、ペプチド、脂肪酸、有機物質、生体物質、又は無機物質、又はその誘導体及び任意のその組み合わせから構成され得る。エピトープがポリペプチドの場合、少なくとも3個のアミノ酸、好ましくは8〜50個のアミノ酸、及びより好ましくは約10〜20個のアミノ酸が、ペプチド内に通常含まれる。ペプチドの長さに重大な上限はなく、タンパク質のほぼ完全長ポリペプチド配列を含む場合もある。エピトープは、直鎖状又は高次構造エピトープであり得る。直鎖状エピトープは、ポリペプチドの一次配列又は炭水化物鎖からなる単一のセグメントから構成される。直鎖状エピトープは、連続性又は重複性であり得る。高次構造エピトープは、アミノ酸又は炭水化物から構成され、ポリペプチドのフォールディングにより一体化して三次構造を形成し、またアミノ酸は、直鎖状配列において必ずしも相互に隣接していない。特に、エピトープは、診断上関連する分子の少なくとも一部分である、すなわちサンプル中のエピトープの有無は、患者の疾患若しくは健康状態、又は製造におけるプロセスの状態、又は環境及び食物の状態と定性的又は定量的に相関する。エピトープは、治療上関連する分子、すなわち疾患の経過に変化をもたらす、特異的結合ドメインの標的対象となり得る分子の少なくとも一部分に相当し得る。
本明細書で用いる場合、用語「特異性」又は「特異的結合」とは、不均質な分子集団内で目的の同族リガンドを判別する結合反応を意味する。従って、指定条件(例えば、免疫測定条件)下で、免疫グロブリンは、その特定の標的と結合するが、サンプル中に存在するその他の分子とは有意な量で結合しない。特異的結合とは、結合はターゲットアイデンティティーに関して選択的であることを意味し、選択に応じて結合アフィニティー又はアビディティーは高、中、又は低となる。選択的結合は、結合定数又は結合動力学が少なくとも10倍異なる場合に通常実現し、好ましくは、差異は少なくとも100倍、より好ましくは少なくとも1000倍である。
用語「可変結合領域」は「CDR領域」とも呼ばれるが、本明細書で用いる場合、抗原との結合相互作用能力のある可変構造を有する分子を意味する。そのような分子は、そのまま利用可能、又はより大きなタンパク質に組み入れ可能であり、従って結合機能を備えたそのようなタンパク質の特異的領域を形成する。可変構造は、結合タンパク質の天然のレパートリー、例えば免疫グロブリン又は抗体等に由来し得る。可変構造は、ランダム化技法、特に本明細書に記載する技法によっても生成可能である。これには、変異が誘発されたCDR又は非CDR領域(例えば、定常抗体ドメインの構造的ループ領域)、免疫グロブリンの可変ドメイン又は定常ドメインのループ領域、特に免疫グロブリンのCDRループが含まれる。一般的に、本発明による免疫グロブリンの結合構造は、そのような可変結合領域により形成される。
用語「細胞傷害性」又は「細胞傷害活性」は、本発明のために用いられる場合、細胞の抗原に対する任意の特異的分子を指すものとし、抗原と結合した際には、プログラム細胞死を活性化させ、そしてアポトーシスを引き起こすきっかけとなる。特異的免疫グロブリンは、エフェクター細胞に対するその活性により効果を有し、その結果、細胞傷害性T細胞、又は抗体依存性細胞毒性(ADCC)、補体依存性細胞毒性(CDC)、及び/又は細胞食作用(ADCP)に関与する細胞の活性化を引き起こす。特異的抗体は、アポトーシス誘発性のプログラム細胞死により、並びに/或いはADCC及び/又はCDC活性に関与するエフェクター細胞がFc受容体と結合することにより、抗体で被覆された標的細胞を殺傷する。
本発明の抗体は、Fcエフェクター機能を示す場合もあれば、示さない場合もある。Fcは、補体を導入することができ、また免疫複合体の形成による表面抗原の結合を通じて、標的抗原又は標的細胞の除去を支援する。
特定の抗体は、活性なFc部分又はFcエフェクター機能を欠損している場合もあり、従って抗体のFc部分を含まない、又はFcγ受容体結合部位を含まない抗体ドメインから構成され得る、或いは例えばFcエフェクター機能を低減する、特にADCC及び/又はCDC活性を無効にする又は低減する修飾により、Fcエフェクター機能を欠いている抗体ドメインを含み得る。修飾を組み込んで、Fcエフェクター機能を高める、特にADCC及び/又はCDC活性が増強するように、代替的抗体が改変され得る。
そのような修飾は、変異誘発、例えばFcγ受容体結合部位内の変異により、又は抗体フォーマットのADCC及び/又はCDC活性を阻害する誘導体又は薬剤により影響を受ける可能性があり、その結果、Fcエフェクター機能が低下又は増加する。
用語「抗原結合部位」又は「結合部位」とは、抗原結合に関与する抗体の部分を意味する。抗原結合部位は、重鎖(「H」)及び/又は軽鎖(「L」)のN末端可変(「V」)領域、或いはその可変ドメインのアミノ酸残基により形成される。重鎖及び軽鎖のV領域内の3つの高度に多様なストレッチは、「高度可変領域」と呼ばれ、フレームワーク領域として知られているより保存されたフランキングストレッチの間に挿入されている。抗原結合部位は、結合したエピトープ又は抗原の三次元表面に相補的な表面を提供するが、また高度可変領域は、「相補性決定領域」又は「CDR」と呼ばれる。CDR内に組み込まれた結合部位は、本明細書では「CDR結合部位」とも呼ばれる。
用語「発現」とは、次のように理解される。発現産物、例えば本明細書に記載するような抗体等の所望のコーディング配列、及び制御配列、例えば作動可能な結合内のプロモーター等を含有する核酸分子が、発現を目的として利用可能である。このような配列で形質転換又はトランスフェクトされた宿主は、コードされたタンパク質を生成する能力を有する。形質転換を有効にするために、ベクターに発現系を含めることができる;但し、関連するDNAも宿主染色体に組み込むことができる。特に該用語は、例えば、ベクターに担持され、宿主細胞に導入された外来DNAによりコードされるタンパク質発現用の、適する条件に置かれた宿主細胞及び適合するベクターを意味する。
コーディングDNAは、特定のポリペプチド又はタンパク質、例えば抗体等に対応する特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列である。プロモーターDNAは、コーディングDNAの発現を開始、規制、さもなければ媒介、又は制御するDNA配列である。プロモーターDNA及びコーディングDNAは、同一の遺伝子又は異なる遺伝子に由来し得るが、また、同一の又は異なる生物に由来し得る。組み換えクローニングベクターには、多くの場合、クローニング又は発現用の1つ若しくは複数の複製系、宿主内で選択するための1つ若しくは複数のマーカー、例えば抗生物質耐性、及び1つ若しくは複数の発現カセットが含まれる。
本明細書で用いられる「ベクター」は、クローン化された組み換えヌクレオチド配列、すなわち組み換え遺伝子の転写、及び適する宿主生物内でのそのmRNAの翻訳に必要とされるDNA配列として定義される。
「発現カセット」とは、定義された制限部位においてベクターに挿入可能な発現産物をコードするDNAのDNAコーディング配列又はセグメントを意味する。カセット制限部位は、正しいリーディングフレーム内へのカセットの挿入を保証するように設計される。一般的に、外来DNAは、ベクターDNAの1つ又は複数の制限部位に挿入され、次にベクターにより伝染性ベクターDNAと共に宿主細胞に搬送される。発現ベクター等の、挿入又は付加されたDNAを有するDNAのセグメント又は配列は、「DNA構築物」とも呼ばれる場合がある。
発現ベクターは、発現カセットを含み、また宿主細胞における自律複製のための起点又はゲノム組み込み部位、1つ又は複数の選択マーカー(例えば、抗生物質、例えばゼオシン(zeocin)、カナマイシン、G418、又はハイグロマイシン等に対する耐性を付与するアミノ酸合成遺伝子又は遺伝子)、いくつかの制限酵素切断部位、適するプロモーター配列、及び転写終結因子を通常更に含むが、これらの成分は作動可能に共に結合している。用語「ベクター」には、本明細書で用いる場合、自律複製ヌクレオチド配列、並びにゲノム組み込み用ヌクレオチド配列が含まれる。一般的な種類のベクターは「プラスミド」であり、それは一般的に、追加(外来)のDNAを容易に受け入れ可能な二本鎖DNAの自己完結型分子であるが、また適する宿主細胞に容易に導入可能である。プラスミドベクターは、多くの場合、コーディングDNA及びプロモーターDNAを含有し、また外来DNAの挿入に適する1つ又は複数の制限部位を有する。特に、用語「ベクター」又は「プラスミド」は、DNA又はRNA配列(例えば、外来遺伝子)を宿主細胞に導入可能であり、その結果宿主を形質転換させ、そして導入された配列の発現(例えば、転写及び翻訳)を促進する媒体を意味する。
用語「宿主細胞」とは、本明細書で用いる場合、特定の組み換えタンパク質、例えば本明細書に記載するような抗体等を生成するように形質転換された初代対象細胞、及び子孫を指すものとする。すべての子孫が親細胞とまったく同一とは限らないが(計画的若しくは偶然の変異、又は環境の差異に起因して)、但し、該子孫が、当初形質転換された細胞の機能と同一の機能を保持する限り、そのように変化した子孫もその用語に含まれるものと理解すべきである。用語「宿主細胞株」とは、組み換え遺伝子を発現させて、組み換えポリペプチド、例えば組み換え抗体等を生成するのに用いられるような宿主細胞の細胞株を意味する。用語「細胞株」とは、本明細書で用いる場合、長期間にわたり増殖能力を獲得した特定の細胞型の確立されたクローンを意味する。そのような宿主細胞又は宿主細胞株は、細胞培養内で維持可能、及び/又は組み換えポリペプチドを生成するために培養可能である。
用語「単離された」又は「単離」とは、核酸、抗体、又はその他の化合物に関して本明細書で用いる場合、「実質的に純粋な」形態で存在するように、それが本来関連する環境から十分に分離された化合物を指すものとする。「単離された」とは、その他の化合物又は材料との人工的又は合成混合物、或いは基本的な活性を妨害しない、そして例えば、不完全な精製に起因して存在し得る不純物の存在の除外を必ずしも意味しない。特に、本発明の単離された核酸分子は、化学的合成物も含まれるように意図される。
本発明の核酸を参照しながら、用語「単離された核酸」が時に用いられる。この用語は、DNAに適用される場合、配列から分離したDNA分子を意味するが、その場合、該DNA分子の起源となる生物の天然由来のゲノム内では、該DNA分子は該配列と隣接する。例えば、「単離された核酸」は、ベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクター等に挿入された、或いは原核細胞若しくは真核細胞又は宿主生物のゲノムDNAに組み込まれたDNA分子を含み得る。RNAに適用される場合、用語「単離された核酸」は、上記で定義した単離されたDNA分子によりコードされるRNA分子を主に意味する。或いは、該用語は、天然の状態(すなわち、細胞又は組織内)ではその他の核酸と関連するRNA分子であるが、そのような核酸から十分に分離した該RNA分子を意味し得る。「単離された核酸」(DNA又はRNA)は、生物学的手段又は合成手段により直接生成し、そして生成期間中に存在するその他の成分から分離した分子を更に表す場合もある。
ポリペプチド又はタンパク質、例えば単離された免疫グロブリン等を参照する際に、用語「単離された」とは、化合物が本来関連する物質、例えば天然の環境、又は化合物が調製される場合(例えば、細胞培養)であって、そのような調製が組み換えDNA技術によりin vitro若しくはin vivoで実施される場合、その環境において見出されるその他の化合物等を含まない、若しくは実質的に含まない該化合物を特に指すものとする。単離された化合物は、希釈剤、又はアジュバントと共に処方化され得るが、またなおも実用的な目的で単離され得る−例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、診断又は治療で用いられる場合、薬学的に許容される担体又は賦形剤と混合され得る。
用語「組み換え」とは、本明細書で用いる場合、「遺伝子工学により調製される、又は遺伝子工学の結果」を意味するものとする。或いは、用語「改変された」が用いられる。例えば、修飾型免疫グロブリン又は免疫グロブリンドメインは、各親配列を改変して改変された免疫グロブリン又はドメインを生成させることによって、変異体が生成するように修飾され得る。組み換え宿主は、発現ベクター又はクローニングベクターを特に含む、又は組み換え核酸配列を含むように、特に宿主にとって外来のヌクレオチド配列を利用して遺伝子改変されている。組み換えタンパク質は、宿主内で各組み換え核酸を発現することにより産生される。用語「組み換え抗体」には、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン、及び特に組み換え手段により調製、発現、作製、又は単離される抗体、例えば(a)ヒト免疫グロブリン遺伝子が遺伝子導入された若しくは染色体導入された動物(例えば、マウス)から単離された抗体、又はそれから調製されたハイブリドーマ、(b)抗体を発現するように形質転換した宿主細胞から単離された、例えばトランスフェクトーマ由来の抗体、(c)組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、及び(d)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を、その他のDNA配列にスプライシングする工程と関係する任意のその他の手段により調製、発現、作製、又は単離される抗体等が含まれる。そのような組み換え抗体は、例えば抗体成熟期間中に生ずる再配列及び変異を含めるように改変された抗体を含む。
所望の構造を有する抗体が識別されたら、そのような抗体は、例えばハイブリドーマ技法又は組み換えDNA技術を含む、当技術分野において周知の方法により生成可能である。
ハイブリドーマ法では、マウス又はハムスター等のその他の適する宿主動物が、免疫化で用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生する能力を有するリンパ球を誘発するように免疫化される。或いは、リンパ球は、in vitroで免疫化され得る。次に、適する融合剤、例えばポリエチレングリコール等を用いてリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する。
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は、抗原に対するモノクロナール抗体の産生について分析される。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクロナール抗体の結合特異性は、免疫沈降法により、又はin vitro結合アッセイ法、例えばラジオイムノアッセイ法(RIA)又は酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)等により測定される。
組み換えモノクロナール抗体は、例えば、必要とされる抗体鎖をコードするDNAを単離し、そして発現用のコーディング配列で組み換え宿主細胞をトランスフェクトすることにより、周知の組み換え発現ベクター、例えば本発明のプラスミド又は抗体配列をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセット(複数可)を用いて生成可能である。組み換え宿主細胞は、原核細胞及び真核細胞、例えば上記の細胞等であり得る。
特定の態様によれば、ヌクレオチド配列は、抗体をヒト化する、又は抗体のアフィニティー若しくはその他の特徴を改善する遺伝子操作で利用可能である。例えば、抗体がヒトを対象とした臨床トライアル及び治療で用いられる場合には、定常領域は、ヒト定常領域とより密接に類似させて免疫反応を避けるように改変され得る。標的抗原に対するアフィニティーがより高まるように抗体配列を遺伝子操作するのが望ましいと考えられる。標的抗原に対する抗体の結合能力をなおも維持しつつ、抗体に1つ又は複数のポリヌクレオチドの変化を生じさせ得ることは、当業者にとって明白である。
様々な手段による抗体分子の生成は、一般的によく理解されている。例えば、米国特許第6331415号(Cabillyら)は、抗体の組み換え生成の方法について記載するが、この場合、重鎖及び軽鎖は、単一のベクターから又は単一の細胞中の2つの別個のベクターから同時に発現される。Wibbenmeyerら、(1999年、Biochim Biophys Acta、第1430巻(2):191〜202頁)、並びにLee及びKwak(2003年、J. Biotechnology、第101巻:189〜198頁)は、大腸菌(E.coli)の分離培養物中に発現したプラスミドを用いて個別に生成した重鎖及び軽鎖からのモノクロナール抗体の製造について記載する。抗体の生成に関連する様々なその他の技法が、例えばHarlowら、ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、(1988年)に提示されている。
モノクロナール抗体は、培養物中の連続細胞系により抗体分子を生成する任意の方法を用いて生成される。モノクロナール抗体を調製するのに適する方法の例として、Kohlerら(1975年、Nature、第256巻:495〜497頁)のハイブリドーマ法、及びヒトB細胞ハイブリドーマ法(Kozbor、1984年、J.Immunol.、第133巻:3001頁;及びBrodeurら、1987、monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、(Marcel Dekker、Inc.、New York)、51〜63頁)が挙げられる。
本明細書に記載する抗体は、治療を必要としている対象への治療投与において利用可能である。
用語「対象」は、本明細書で用いる場合、温血哺乳動物、特にヒト又はヒト以外の動物を指すものとする。従って、用語「対象」は、特にイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、及び家禽を含む動物も指す場合がある。特に、本発明の抗体は、疾患状態の予防又は治療を必要とする対象又は患者を治療するために、医学的用途で提供される。用語「患者」には、予防上又は治療上の処置を受けるヒト及びその他の哺乳動物対象が含まれる。用語「処置」は、従って、予防上の処置と治療上の処置の両方が含まれるように意図される。
特に、本発明の抗体は、実質的に純粋な形態で提供される。用語「実質的に純粋な」又は「精製された」とは、本明細書で用いる場合、少なくとも50%(w/w)、好ましくは少なくとも60%、70%、80%、90%、又は95%の化合物、例えば核酸分子又は抗体等を含む調製物を指すものとする。純度は、化合物に適する方法により測定される(例えば、クロマトグラフィー法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、HPLC分析法等)。
化合物、例えば本発明の免疫グロブリンの「治療上有効な量」という用語は、本明細書では、「有効な量」又は「十分な量」のいずれかの用語と交換可能に用いられるが、同用語は、対象に投与したとき、臨床結果を含む有益な結果又は所望の結果が有効となるのに十分な量又は活性であり、従って有効な量又はその類義語は、その用語が適用される文脈に依存する。
有効な量とは、そのような疾患又は障害を治療、予防、又は阻止するのに十分な化合物の量を意味するように意図されている。疾患という文脈において、本明細書に記載する免疫グロブリンの治療上有効な量は、抗体とその標的抗原の相互作用から利益を得る疾患又は状態を治療、調節、軽減する、逆転させる、又はそれに影響を及ぼすのに特に用いられる。
そのような有効な量に対応する化合物の量は、様々な要因、例えば投与される薬物又は化合物、医薬製剤、投与経路、疾患又は障害の種類、治療される対象又は宿主の同一性等に応じて変化するものの、当業者によりルーチン的に決定可能である。
本発明の抗体は、医薬組成物で特に利用され得る。従って、本明細書に記載する抗体及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。このような医薬組成物は、本発明に基づきボーラス注射若しくは輸液として、又は連続輸液により投与され得る。そのような投与手段を円滑にするのに適する医薬担体は、当技術分野において周知されている。
薬学的に許容される担体として、本発明により提供される抗体と生理学的に適合するあらゆるすべての適する溶媒、分散媒、コーティング物、等張性吸収遅延剤等が一般的に挙げられる。薬学的に許容される担体の更なる例として、無菌の水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、並びにその任意の組み合わせが挙げられる。
1つのそのような態様では、抗体は、所望の投与経路に適する1つ又は複数の担体と併用可能であり、抗体は、例えば、ラクトース、スクロース、スターチ、アルカノン酸、ステアリン酸のセルロースエステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム塩及びカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン(polyvinylpyrrolidine)、ポリビニルアルコールのいずれかと混合され得るが、また任意選択的に、従来方式での投与用として更に錠剤化又はカプセル化される。或いは、免疫グロブリンは、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースのコロイド溶液、エタノール、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、トラガカントガム、及び/又は様々なバッファーに溶解し得る。その他の担体、アジュバント、及び投与様式は、医薬品技術分野で周知されている。担体は、制御放出型材料又は時間遅延材料、例えばグリセリルモノステアレート若しくはグリセリルジステアレート等を単独で、又はワックス若しくは当技術分野において周知のその他の材料と共に含み得る。
追加の薬学的に許容される担体は、当技術分野において公知であり、また例えば、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCESに記載されている。液状製剤は、液剤、乳剤又は懸濁剤であり得、また賦形剤、例えば懸濁剤、可溶化剤、界面活性剤、防腐剤、及びキレート剤等を含み得る。
本発明の抗体、及び1つ又は複数の治療上活性な薬剤が処方化される場合、医薬組成物が検討される。所望の純度を有する上記抗体を任意選択的な薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤と混合することにより、本発明の抗体の安定な製剤が、凍結乾燥された製剤又は水溶液の形態で保存用に調製される。In vivo投与用として用いられる製剤は、特に無菌状態であり、好ましくは無菌の水溶液の形態である。これは、滅菌濾過メンブレンを通過する濾過又はその他の方法により容易に実現される。本明細書に開示の免疫グロブリン及びその他の治療上活性な薬剤は、イムノリポソームとしても処方化され得る、及び/又はマイクロカプセル中に捕捉され得る。
本発明の抗体を含む医薬組成物の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳内(intraotically)、経皮、粘膜、局所的、例えばゲル、軟膏、ローション、クリーム等、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、非経口、直腸、又は眼内を含む様々な方法において実施可能である。
非経口投与で用いられる代表的な製剤として、皮下、筋肉内、又は静脈内注射に適する製剤、例えば無菌の液体、乳剤又は懸濁剤が挙げられる。
本発明は、本明細書で提示する実施例に詳記するような代表的な抗体を特に提供する。例えば、分子の構造及び機能を改善するために、Fcを更に改変する場合、又は異なるCDR結合部位を含む、若しくは異なる特異性を有する抗体を生成する場合、特に2つの異なるFv領域を取得する場合、更なる抗体変異体が、例えば例示した免疫グロブリンの機能的変異体を含め可能性を有する。
上記説明は、下記の実施例を参照しながらより十分に理解される。但し、そのような実施例は、本発明の1つ又は複数の実施形態を実践する方法を代表するに過ぎず、発明の範囲を制限するものと読み取るべきでない。
[実施例1]
CH3ドメイン交換抗体の構築、発現、精製、及び特徴付け
CH3ドメイン交換抗体は、野生型CH3ドメイン、或いは抗体のドメイン交換Fabアーム内のCH1及び/又はCLドメインを置換するために改変された様々なCH3ドメインを用いて形成可能であり、次に図1で一部示すような様々な形態に会合する。
実施例1では、下記のアミノ酸の特徴を有する3つの異なるドメイン交換ヘテロ二量体抗体の軽鎖及び重鎖をコードする合成DNAを生成した。
ドメイン交換ヘテロ二量体抗体1:
Fabアーム1及び対応する改変された軽鎖及び重鎖:
完全な抗体の一方のFabアーム内のCH1及びCLドメインをCH3ドメインと置換して、VL(1)−CH3_HOLE(Y407T)軽鎖(配列番号1)及びVH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3AG重鎖(配列番号2)を作製した。VL(1)及びVH(1)ドメインは、EGFR特異的抗体hu425(Matuzumab)のFvを共同して形成する。
VL(1)−CH3鎖におけるVL(1)ドメインからCH3ドメインへの転移を、Cκ配列の4つのアミノ酸残基RTVA(配列番号49、Rはヒトκ鎖の108番残基である(Kabat EU ナンバリング))の直後に、CH3ドメインのA−ストランドに属するEPQVで始まるアミノ酸配列(配列番号50、EはヒトIgG1重鎖の345番残基である(Kabat EUナンバリング))を繋げることにより形成した。CH3ドメイン配列はQKSLSLSで終了し(配列番号51、Qは、ヒトIgG1重鎖の438番残基である(Kabat EU ナンバリング))、その後に 残基GECが続く(Cκ鎖のC末端212〜214番残基(Kabat EUナンバリング)を表す)。
VH(1)−CH3−CH2−CH3鎖におけるVH(1)ドメインからCH3ドメインへの転移は次の通り、すなわちJ領域(アミノ酸配列VTVSS(配列番号52、最初のVはヒトVH領域の109番残基)で終わる)に、ヒトCH1ドメインに属する5個の残基ASTKG(配列番号53、AはヒトIgG1重鎖の118番残基(Kabat EUナンバリング))が続き、その直後にCH3ドメインのA−ストランドに属する、EPQV(配列番号50、EはヒトIgG1重鎖の345番残基(Kabat EUナンバリング))で始まるアミノ酸配列が続いた。CH3ドメイン配列はQKSLSLS(配列番号51、QはヒトIgG1重鎖の438番残基(Kabat EUナンバリング))で終わり、その後にヒト重鎖ヒンジ領域の一部分に該当する残基KSC(KはヒトIgG1重鎖の218番残基(Kabat EUナンバリング))が続いた。
VH(1)−CH3−CH2−CH3鎖内のVH(1)ドメインに対してC末端側に位置するCH3ドメインを有する同族の対を選好的に生成するために、VL(1)−CH3鎖のCH3ドメインを改変したが、特にこれには、Ridgwayら、1996年に基づく「ホール」変異Y407T(Kabat EUナンバリング)が含まれ、従って、この鎖は、より正確にはVL(1)−CH3_HOLE(Y407T)(配列番号1)と命名される。
VL(1)−CH3鎖のCH3ドメインを有する同族の対を選好的に生成するために、VH(1)−CH3−CH2−CH3鎖内のVH(1)ドメインに対してC末端側に位置するCH3ドメインを改変したが、特にこれには、Ridgwayら、1996年に基づく「ノブ」変異T366Y(Kabat EUナンバリング)が含まれた。
抗体の第2の重鎖のC末端側CH3ドメインを有する同族の対を選好的に生成するために、この抗体のVH(1)−CH3−CH2−CH3重鎖のC末端側CH3ドメインを改変した。このCH3ドメインの特異的エンジニアリングは、Davisら、2010年に基づく「AG」CH3ドメインのエンジニアリングに該当し、従って、この鎖は、より正確にはVH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3AG(配列番号2)と命名される。
得られた二重特異性抗体1(BsAb1)は、両方の標的CD3×EGFRを認識し、また下記の重鎖及び軽鎖により特に特徴付けられる:H1(配列番号2)、H2(配列番号4)、L1(配列番号1)、及びL2(配列番号3)。
Fabアーム2及び改変重鎖
ヘテロ二量体抗体の後半部分を、下記の鎖により形成した:
軽鎖(配列番号3)は、CD3特異的抗体OKT3(VL2)のVL配列をコードし、またVL(2)−CLドメインをコードする配列から構成された。
重鎖(配列番号4)は、CD3特異的抗体OKT3(VH2)のVH配列をコードし、またVH(2)−CH1−CH2−CH3GAドメインをコードする配列から構成された。抗体の第1の重鎖(VH(1)−CH3−CH2−CH3AG)のC末端側CH3ドメインを有する同族の対を選好的に生成するために、このVH(2)−CH1−CH2−CH3GA鎖のC末端側CH3ドメインを改変した。このCH3ドメインの特異的エンジニアリングは、Davisら、2010年に基づく「GA」CH3ドメインのエンジニアリングに該当し、従って、この鎖はVH(2)−CH1−CH2−CH3GA(配列番号4)と命名される。
ドメイン交換ヘテロ二量体抗体2
この抗体を、ドメイン交換ヘテロ二量体抗体1内のFabアームと同様に改変した。但し、ドメイン交換ヘテロ二量体抗体2では、OKT3 Fabアームは、C末端側CH3AGドメイン(VH(2)−CH1−CH2−CH3AG(配列番号5))を含有する重鎖と融合しており、一方改変されたドメイン交換hu425 Fabアームは、C末端側CH3GAドメインを含有する重鎖と融合している(VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3GA(配列番号6))。
その結果、この二重特異性抗体は、両方の標的CD3×EGFRを認識し、また下記の重鎖及び軽鎖:H1(配列番号6)、H2(配列番号5)、L1(配列番号1)、及びL2(配列番号3)により特に特徴付けられる。
ドメイン交換ヘテロ二量体抗体3
この抗体を、ドメイン交換ヘテロ二量体抗体2としてFabアームと同様に改変した。ドメイン交換ヘテロ二量体抗体3では、OKT3 Fabアームは、C末端側CH3AGドメインを含有する重鎖と融合しており、また改変されたドメイン交換hu425 Fabアームは、C末端側CH3GAドメインを含有する重鎖と融合している。但し、ドメイン交換ヘテロ二量体抗体3では、野生型(wt)CH3ドメインは、ドメイン交換ヘテロ二量体抗体1及び2で用いた改変された「ノブ」及び「ホール」CH3ドメインの同族の対の代わりに、改変されたhu425 FabアームのVL1及びVH1の両方とC末端側で交換した。ドメイン交換ヘテロ二量体抗体3では、hu425 Fabアームについて、配列VL(1)−CH3wt(配列番号7)、及びVH(1)−CH3wt−CH2−CH3GA(配列番号8)が用いられた。
その結果、この二重特異性抗体は、標的CD3×EGFRの両方を認識し、また下記の重鎖及び軽鎖:H1(配列番号8)、H2(配列番号5)、L1(配列番号7)、及びL2(配列番号3)により特に特徴付けられる。
記載した抗体鎖をコードする合成DNAは、pTT5哺乳動物発現ベクターへのクローニング用制限酵素に対応する配列と隣接する。
[実施例2]
ヒトIg様の二重特異性抗体を発現するためのベクターの構築
実施例1に記載する3つのヒトドメイン交換ヘテロ二量体抗体を、下記の表で定義する遺伝子配列の所定の組み合わせに従い、1つの細胞内で4つの異なる遺伝子を組み合わせて発現させて生成する。ドメイン交換ヘテロ二量体抗体1の生成は、配列番号1、2、3、及び4の同時発現による。ドメイン交換ヘテロ二量体抗体2の生成は、配列番号1、3、5、及び6の同時発現による。ドメイン交換ヘテロ二量体抗体3の生成は、配列番号3、5、7、及び8の同時発現による。
Figure 0006904902
これらの配列を発現させるために、8つの異なる哺乳動物pTT5(Shiら、2005年)に基づく発現ベクターを構築したが、各ベクターは、下記の配列をコードする遺伝子の1つを含有した:
配列番号1:VL(1)−CH3_HOLE(Y407T)
配列番号2:VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3AG
配列番号3:VL(2)−CL
配列番号4:VH(2)−CH1−CH2−CH3GA
配列番号5:VH(2)−CH1−CH2−CH3AG
配列番号6:VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3GA
配列番号7:VL(1)−CH3wt
配列番号8:VH(1)−CH3wt−CH2−CH3GA
VL1及びVH1では、抗EGFR抗体のMatuzumab(hu425)(Kim、2004年)の可変ドメインを用いた。
VL2及びVH2では、抗CD3抗体OKT3(Van Wauweら、1980年)の可変ドメインを用いた。
図1Aは、CH3ドメイン(Davisら、2010年、及び米国特許第20070287170A1号を参照)のAG及びGAバージョンを用いて、ストランド交換操作ドメイン(SEED)CH3ヘテロ二量体技術により、2つの異なる重鎖のヘテロ二量体化を実現する、有望なドメイン交換二重特異性抗体のうち、そのいくつかの構造を概略的に図示する。図1A−1は、実施例1のドメイン交換ヘテロ二量体抗体1の構造を特に図示する。
[実施例3]
二重特異性抗体の発現及び特徴付け
実施例1及び2に記載のドメイン交換ヘテロ二量体抗体1、2、及び3を、標準技法に基づき、哺乳動物細胞内で小規模に発現させた。得られたタンパク質をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、そして非還元式SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)及び粒径排除クロマトグラフィー分析法(SEC)により特徴付けを行った(図2)。非還元式のゲルは、主に単一のバンドを示し、その分子量はドメイン交換抗体1及び2の両方について期待されるサイズに対応した(図2A)。ドメイン交換抗体3では、SDS−PAGEは、期待されるサイズのバンドを示し、またより高分子量のタンパク質複合体に対応する追加のバンドも示した(図2A)。
これらの精製されたタンパク質について、SEC分析法により更に特徴付けを行い、ドメイン交換抗体1、2、及び3について、約7.5分(標準IgG抗体について期待される溶出時間と類似)後にSECカラムからの主要なピークの溶出を示したが、ドメイン交換抗体1及び2(図2B及び2C)について、その他のタンパク質種による軽微な汚染、及び抗体3について追加のピークを示した(図2D)。従って、ドメイン交換Fabアームを使用することにより、二重特異性抗体について期待されるサイズのタンパク質が生成した。次に、ドメイン交換Fabアームにより形成した様々な二重特異性抗体を用いて広範な生化学的及び機能的特徴付け、並びに試験の実施を進めた。
[実施例4]
ドメイン交換二重特異性抗体1の大スケール発現及び特徴付け
ドメイン交換ヘテロ二量体二重特異性抗体1及び2は、類似した生物物理学的特徴、例えば類似した非還元式SDS−PAGEパターン及びSECプロファイルを有した。ドメイン交換ヘテロ二量体二重特異性抗体1の発現は、より高い発現レベルを実現し、これを更なる特徴付け用として選択した。
標準技法に基づき、より大スケール(培養培地00mL)で配列番号1、2、3、及び4遺伝子を同時発現させることにより、ドメイン交換ヘテロ二量体二重特異性抗体1を哺乳動物細胞内で発現させた。得られたタンパク質を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、以後この特別なドメイン交換ヘテロ二量体二重特異性抗体をBsAb1と呼ぶが、先行する実施例から理解されるように、これは、配列番号1、2、3、及び4の同時発現により構成されたドメイン交換抗体である。精製後のBsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3−KiH)について、非還元式及び還元式SDS−PAGE、並びにSEC分析法により特徴付けを行った(図3)。
非還元式SDS−PAGEは、主に単一バンドを示し、その分子量は、BsAb1の期待されるサイズに対応した。サンプルをSDS−PAGE前に還元した場合、プロファイルは、VH(1)−CH3_Knob(T366Y)−CH2−CH3AG(配列番号2)に対応するH1バンドと表示されるバンド、VH(2)−CH1−CH2−CH3GA(配列番号4)に対応するH2バンドと表示されるバンド、及びVL(1)−CH3_Hole(Y407T)(配列番号1)とVL(2)−CL(配列番号3)に対応するL1+L2バンドと表示されるバンド(図3A)を示した。
更に、精製後のタンパク質についてSEC分析法による特徴付を行うと、約7.5分後にカラムから溶出した>90%の主要なピークを示したが、その溶出は標準IgG抗体の溶出に匹敵する(図3B)。
[実施例5]
二重特異性結合アッセイ
BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3−KiH)と2つの抗原CD3及びEGFRとの同時結合を試験するために、CD3+ジャーカット細胞を、BsAb1又は対照の抗CD3抗EGFR二重特異性抗体で最初に染色し、その後に、EGFRとのインキュベーションステップが続いた。二重特異性結合を、フルオレセインイソチオシアネートでラベリングした抗EGFR検出抗体を用いて検出し、そしてフローサイトメトリーにより分析した(図4)。
[実施例6]
Fabアーム内にCH3ドメインを含有するワンアームド抗体の生成及び特徴付け
CH3ドメイン交換(KiH同族の対)Fab領域又は非改変Fab領域を含有するワンアームド抗体を、3つの異なる遺伝子の同時発現により生成した。図5は、ワンアームド抗体の構造を概略的に図示する(非改変及びドメイン交換)。各抗体鎖をコードする遺伝子を含有する、異なる哺乳動物pTT5に基づく発現ベクターを、これまでの記載に従い構築した。
配列番号1、配列番号2、及び配列番号9に示すアミノ酸配列をコードする3つの異なる遺伝子を、1つの細胞内で同時発現させることにより、ヒトドメイン交換ワンアームド抗体を生成した(huFc_GA SEED)。非改変ワンアームド抗体を、配列番号9、配列番号10(VL(1)−CL)、及び配列番号11(VH(1)−CH1−CH2−CH3AG)に示すアミノ酸配列をコードする3つの異なる遺伝子の同時発現により生成した。
VL1及びVH1の場合、抗EGFR抗体であるMatuzumab(hu425)(Kim、2004年)の可変ドメインを用いた。
得られたワンアームド抗体は、EGFRを認識し、また下記の軽鎖及び重鎖により特に特徴付けられる。ドメイン交換ワンアームド抗EGFR:H1(配列番号2)、H2(配列番号9)、及びL1(配列番号1)。非改変ワンアームド抗EGFR:H1(配列番号11)、H2(配列番号9)、及びL1(配列番号10)。
両方の抗体は、標準技法に基づき、哺乳動物細胞内で発現させた。得られたタンパク質を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、そして非還元式及び還元式SDS−PAGE並びにSEC分析法により特徴付けを行った(図6)。非還元式のゲルは、ワンアームド抗体に対応する分子量を有する単一のバンドを主に示した。SDS−PAGEの前にサンプルを還元した場合、ワンアームド抗体(CH1/CL)のプロファイルは、VH(1)−CH1−CH2−CH3AG(配列番号11)に対応するH1バンド、huFc_GASEED(配列番号9)に対応するH2バンド、及びVL(1)−CL(配列番号10)に対応するL1バンドを示す(図6A)。ドメイン置換型抗体の還元式のプロファイルは、VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3AG(配列番号2)に対応するH1バンド、huFc_GA SEED(配列番号9)に対応するH2バンド、及びVL(1)−CH3_HOLE(Y407T)(配列番号1)に対応するL1バンドを示す(図6A)。精製後のタンパク質について、SEC分析法により特徴づけを行ったとき、両方共に、約8分後にカラムから溶出する90%>の主要なピークを示した(図6B)。
[実施例7]
フローサイトメトリーによるEGFR陽性細胞への1価の結合
CH3ドメイン交換抗EGFR Fabドメインを利用するワンアームド抗体を標的結合について試験し、また非改変抗EGFR Fab(CH1/CL)を有するワンアームド抗体と比較した(実施例6を参照)。更に、BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3−KiH)を、EGFR標的結合について試験した。抗体とEGFR発現性A431細胞との結合をフローサイトメトリーにより測定した(図7)。細胞に結合した抗体を、フィコエリトリンとコンジュゲートされた抗ヒトFc F(ab)2二次抗体により検出し、そしてフローサイトメトリーを用いて細胞を分析した。細胞結合に関する50%有効濃度(EC50)を、プログラムGraphPad PRISMを用いて結合曲線から計算した。
ワンアームドCH3ドメイン交換抗EGFR抗体及びBsAb1抗体は、EGFR陽性細胞との用量依存性の結合を示し、対照抗体(非改変Fabワンアームド抗EGFR)と類似した結合特性を有した(図7)。ワンアームド抗体のEC50は、5〜8nMの範囲であった。BsAb1はEGFR陽性細胞に結合したが、そのEC50は約7nMであり、対照抗体に匹敵した(図7)。
これらの結果は、CH1/CLを改変CH3ドメインに交換しても、各Fabフラグメントの抗原結合は変化しなかったことを示す。
[実施例8]
ドメイン交換二重特異性抗体2「BsAb2」(抗CD16×抗EGFR)の構築、発現、精製、及び特徴付け
先行する実施例に記載され、またBsAb1で用いられたCH3ドメイン交換抗EGFR Fabを、マウス抗CD16抗体3G8(Fleitら、1982年)と組み合わせて、以後BsAb2(抗CD16×抗EGFR CH3−KiH)と呼ぶ新規のドメイン交換二重特異性抗体を生成した。哺乳動物pTT5に基づく発現ベクターを更に2つ構築したが、各ベクターは下記の配列をコードする遺伝子の1つを含有した:
配列番号12:VL(3)−CL
配列番号13:VH(3)−CH1−CH2−CH3GA
VL(3)及びVH(3)の場合、抗CD16抗体3G8(Fleitら、1982年)の可変ドメインを用いた。
得られたBsAb2は、標的CD16×EGFRの両方を認識し、また下記の重鎖及び軽鎖により特に特徴付けられる:H1(配列番号2)、H2(配列番号13)、L1(配列番号1)、及びL2(配列番号12)。
配列番号1、配列番号2、配列番号12、及び配列番号13に示すアミノ酸配列をコードする4つの異なる遺伝子を1つの細胞内で発現させることにより、ドメイン交換二重特異性抗体BsAb2(抗CD16×抗EGFR CH3−KiH)を生成した。2つの異なる重鎖のヘテロ二量体化を、BsAb1について記載するSEED技術より実現した。
BsAb2を、標準技法に基づき、哺乳動物細胞内で発現させた。得られたタンパク質をプロテインA精製法により精製したが、単回ステッププロテインA精製後のBsAb1について示された場合と類似した均質性を示し、そのサイズ及び純度は期待される通りであった。
質量分析法により、BsAb1及びBsAb2の正しい会合について最終的な生化学的検証を行う準備として(次のセクションの実施例9を参照)、BsAb1及びBsAb2を、SEC調製法を用いた第2の精製ステップで更に精製した。この調製用SEC精製ステップ後のタンパク質純度の例として、SEC調製法によるこの第2の精製後のBsAb2タンパク質について、非還元式及び還元式SDS−PAGE、並びにSEC分析法により特徴付けを行った(図8)。非還元式のゲルは、単一のバンドを主に示し、その分子量はドメイン交換BsAb2に対応した。サンプルをSDS−PAGE前に還元した場合、プロファイルは、VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3AG(配列番号2)に対応するH1バンド、VH(3)−CH1−CH2−CH3GA(配列番号13)に対応するH2バンド、VL(3)−CL(配列番号12)に対応するL2バンド、及びVL(1)−CH3_HOLE(Y407T)(配列番号1)に対応するL1バンドを示す(図8A)。この精製後のタンパク質について、SEC分析法により更に特徴付けを行い、ドメイン交換BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3−KiH)の溶出時間、及び標準IgG抗体の溶出時間とも類似した約7.5分後に、カラムから溶出する>90%の主要なピークを示した(図8B)。
[実施例9]
マススペクトロメトリーによる正しい会合の検証
ドメイン交換二重特異性抗体を分析する直接的なアプローチ
ドメイン交換二重特異性抗体内で鎖が正しく対を形成しているか確認するために、精製後のドメイン交換二重特異性抗体BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3−KiH)、及びBsAb2(抗CD16×抗EGFR CH3−KiH)を、液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー(LC−MS)分析法により測定した。MS分析前に、サンプルをPNGaseFにより脱グリコシル化した。図9及び図10に示す通り、ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1及びBsAb2について、148.284kDa及び148.050kDaの単一のピークがそれぞれ検出された。これらの検出された質量は、4つの異なる抗体鎖の合計に対応する。これらの鎖が会合する期間中に、ジスルフィド架橋形成、C末端リジン切断、及びN末端ピログルタミン酸形成に起因して、更に質量が失われる可能性がある。約322kDaのこのような質量損失を考慮すると、検出される平均質量は、ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1の場合、<3Daだけ、またドメイン交換二重特異性抗体BsAb2の場合、約12Da、計算した平均質量から相違する。GA−ホモ二量体は、いずれの抗体サンプルにおいても検出されなかった(計算による分子質量は、ホモ二量体OKT3−GAの場合:146.465kDa、及びホモ二量体3G8−GAの場合:145.980kDa)。
これらの結果は、ドメイン交換二重特異性抗体を生成するために、同一の細胞内で同時発現させた4つ異なるタンパク質鎖は、化学量論的に正しく会合していることを実証する。
軽鎖の競合による間接的アプローチ
適用したLC−MS方法は、正しく会合したドメイン交換抗体と、軽鎖が交換した抗体とを区別することができないので、競合アッセイ法を実施した。このアッセイでは、ドメイン交換二重特異性抗体に由来する軽鎖と重鎖の一方の両方を、1つの細胞内で、huFc_GA SEED鎖(ヒンジ−CH2−CH3GA)と共に同時発現させ、ワンアームド抗体を形成した。ワンアームド重鎖と正しい軽鎖との特異的な対形成のみが生じた場合には、正しい軽鎖が対形成したFabのみが形成される。ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1の抗体鎖をモデルとして選択した。
競合アッセイI(図11)では、Fab領域内にCH1/CLドメインを含有するワンアームド抗体を、VL(1)−CH3_HOLE (Y407T)(配列番号1)、VL(2)−CL(配列番号3)、VH(2)−CH1−CH2−CH3AG(配列番号5)、及びhuFc_GA SEED(配列番号9)をコードする4つの異なる遺伝子を同時発現させることにより生成した。競合アッセイII(図12)では、CH3ドメイン交換Fab領域を含有するワンアームド抗体を、VL(1)−CH3_HOLE(Y407T)(配列番号1)、VL(2)−CL(配列番号3)、VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3AG)(配列番号2)、及びhuFc_GA Seed(配列番号9)をコードする4つの異なる遺伝子を同時発現させることにより生成した。標準技法に基づき、抗体を哺乳動物細胞内で発現した。プロテインA精製後、タンパク質をPNGaseFにより脱グリコシル化し、その後、LC−MSにより分析した。主要なピーク99.521kDa(図11)、及び101.387kDa(図12)を、競合アッセイI及びIIでそれぞれ検出した。これらの検出された質量は、競合アッセイIでは正しく会合した非改変ワンアームド抗体、及び競合アッセイIIではドメイン交換ワンアームド抗体に対応する。誤対形成した変異体に対応する追加ピークを見出すことはできなかった。
これらの結果は、CH3ドメイン交換エンジニアリングによる、軽鎖と重鎖の正しい対形成の実施を示す。
[実施例10]
ドメイン交換抗体の熱安定性
ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1及び2の安定性を、異なる走査熱量測定法(DSC)により更に分析し、また見かけの転移の融解温度を測定した(図13を参照)。
ドメイン交換二重特異性抗体はいずれも、アンフォールドする際に見かけ上3回転移する。ドメイン交換二重特異性抗体1及び2の第1の転移は、Tm1=61.3℃及びTm1=61.9℃においてそれぞれ認められた。この転移は、ドメイン交換抗EGFR Fabドメインの熱的アンフォールディングに対応する。ドメイン交換二重特異性抗体1のTm2=67.3℃における、及びドメイン交換二重特異性抗体2のTm2=67.4℃における第2のピークは、AG/GA SEED Fcフラグメントのアンフォールディングに対応する。ドメイン交換二重特異性抗体1のTm3=71.8℃における、及びドメイン交換二重特異性抗体2のTm3=71.1℃における第3の転移は、天然型Fabドメイン(抗CD3又は抗CD16)のアンフォールディングに対応する。
[実施例11]
エフェクター陰性抗体の生成及び特徴付け
これまでの実施例で記載した二重特異性、及びワンアームド抗体に付加して、以下に列挙する新規の抗体を、抗体生成について上記実施例で記載したタンパク質の発現、精製、及び特徴付けの手順と同一の手順に従い、次の一連の実験で用いるために生成した。
・SEED AG重鎖と融合した非改変OKT3 Fabを有するワンアームド抗CD3。
・SEED AG重鎖と融合した非改変3G8 Fabを有するワンアームド抗CD16。
・エフェクター陰性(EN)アイソタイプSEED AG重鎖と融合し、ENアイソタイプ huFc_GA SEED鎖と対をなすCH3ドメイン交換(KiH同族の対)hu425 Fabを有するENアイソタイプワンアームド抗EGFR。
・実施例8と同様に、但しエフェクター陰性(EN)アイソタイプSEED AG、及びENアイソタイプSEED GA重鎖を用いて生成したENアイソタイプドメイン交換二重特異性抗体BsAb2(抗CD16×抗−EGFR CH3−KiH)。
エフェクター陰性(EN)アイソタイプSEED鎖を米国特許第8562986に記載されているENヒトIgG2変異体配列に基づき生成し、及びSEED重鎖と共に使用されるように以下の通り改造した。
EN IgG2変異体配列(米国特許第8562986号)からEN huFc_SEED鎖(huFcが、所定のヒトヒンジ−CH2−CH3配列から構成される場合)を生成するために、修飾されたヒトIgG1ヒンジ(C220S)、及び修飾されたヒトIgG2 CH2ドメイン(F296A、N297Q)を、SEED「AG」又は「GA」CH3ドメイン(Davisら、2010年)のN末端と融合させて、ENアイソタイプhuFc_AG SEED、又はENアイソタイプhuFc_GA SEED鎖を生成させた。例えば、huFc_g1hingeEN−CH2EN−CH3GA(配列番号16)。
ドメイン交換Fabは、CH1配列を有さないので、IgG2 CH1は、ENドメイン交換重鎖で用いることはできず、また野生型IgG2 CH1に本来存在する軽鎖共有結合部位は存在しなかった。従って、VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2EN−CH3AG(配列番号15)で示したように、ENドメイン交換抗EGFR「AG」SEED重鎖を生成するために、野生型ヒトIgG1ヒンジ配列を、米国特許第8562986号に記載されている修飾されたヒトIgG2 CH2ドメイン(F296A、N297Q)と共に用いた。このデザインは、VH(3)−CH1−CH2EN−CH3GA(配列番号17)で示したように、二重特異性抗体「BsAb2 EN」(下記参照)で用いられるEN非改変3G8 Fab GA SEED重鎖を生成するのにも用いられた。
哺乳動物pTT5に基づく発現ベクターを更に構築したが、各ベクターは下記の配列をコードする遺伝子の1つを含有した:
配列番号14:VH(3)−CH1−CH2−CH3AG
配列番号15:VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2EN−CH3AG
配列番号16:huFc_g1hingeEN−CH2EN−CH3GA
配列番号17:VH(3)−CH1−CH2EN−CH3GA
VL1及びVH1の場合、抗EGFR抗体のMatuzumab(hu425)(Kim、2004年)の可変ドメインを用いた。
VL2及びVH2の場合、抗CD3抗体OKT3(Van Wauweら、1980年)の可変ドメインを用いた。
VL(3)及びVH(3)の場合、抗CD16抗体3G8(Fleitら、1982年)の可変ドメインを用いた。
アミノ酸配列をコードする異なる遺伝子を1つの細胞内で発現させることにより、抗体を生成した。これまでの実施例においてBsAb1について記載したように、2つの異なる重鎖のヘテロ二量体化を、SEED技術により実現した。
SEED AG重鎖と融合した、非改変OKT3 Fabを有するワンアームド抗CD3を、VL(2)−CL(配列番号3)、VH(2)−CH1−CH2−CH3AG(配列番号5)、及びhuFc_GA SEED(配列番号9)をコードする3つの異なる遺伝子を同時発現させることにより生成した。
SEED AG重鎖と融合した、非改変3G8 Fabを有するワンアームド抗CD16を、VL(3)−CL(配列番号12)、VH(3)−CH1−CH2−CH3AG(配列番号14)、及びhuFc_GA SEED(配列番号9)をコードする3つの異なる遺伝子を同時発現させることにより生成した。
ワンアームドエフェクター陰性(EN)ドメイン交換抗EGFRを、VL(1)−CH3_HOLE (Y407T)(配列番号1)、VH(1)−CH3_KNOB (T366Y)−CH2EN−CH3AG(配列番号15)、及びhuFc_g1hingeEN−CH2EN−CH3GA(配列番号16)をコードする3つの異なる遺伝子を、1つの細胞内で同時発現させることにより生成した。
得られたワンアームドEN抗体は、EGFRを認識し、また下記の軽鎖及び重鎖により特に特徴付けられる:H1(配列番号15)、H2(配列番号16)、及びL1(配列番号1)。
エフェクター陰性(EN)アイソタイプドメイン交換二重特異性抗体BsAb2(抗CD16×抗EGFR CH3−KiH)は、以後「BsAb2 EN」と呼ぶが、これを、VL(1)−CH3_HOLE(Y407T)(配列番号1)、VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2EN−CH3AG(配列番号15)、VL(3)−CL(配列番号12)、及びVH(3)−CH1−CH2EN−CH3GA(配列番号17)をコードする4つの異なる遺伝子を1つの細胞内で同時発現させることにより生成した。
得られたEN BsAb2は、標的CD16×EGFRの両方を認識し、また下記の重鎖及び軽鎖により特に特徴付けられる:H1(配列番号15)、H2(配列番号17)、L1(配列番号1)、及びL2(配列番号12)。
多くの抗体エフェクター機能は、抗体のFc部分にある結合部位を通じて、免疫細胞上のFcγ受容体に結合する抗体により媒介される。エフェクター機能の具体例として、抗体依存性細胞毒性(ADCC)が挙げられ、これは抗体のFc部分にあるFcγ受容体結合部位を介して、抗体が免疫エフェクター細胞上のCD16a(FcγIIIa)に結合することにより媒介される。エフェクター陰性アイソタイプ抗体は、そのFcを介したCD16aとの結合が欠損している。
抗体とCD16a受容体(FcγIIIa)との結合を、CD16a細胞結合アッセイキット(CisBio社)により測定した(図14)。このアッセイ法では、蛍光標識されたヒトIgGがCD16aと結合する際に、その結合と競合する抗体の能力について試験される。未標識試験抗体がCD16aと結合する場合、未標識試験抗体は、標識されたIgGの結合と競合し、この競合により、測定される結合シグナルが低下する。
抗CD16 Fabアームを有するエフェクターコンピテント抗体は、抗CD16 Fabアーム及びこの抗体のFc部分にあるFcγ受容体結合部位の両方により、CD16a受容体に結合すると期待される。エフェクター陰性アイソタイプ抗体は、Fc部分にあるFcγ受容体結合部位を通じてCD16aに結合しない。
期待されるように、ワンアームドドメイン交換EN抗EGFR抗体では、CD16a受容体との結合は検出されず、その結果、測定されたシグナルの低下は認められなかった(図14、逆三角形)。その他の抗体は、CD16a受容体との用量依存性の結合を示し、その結果、測定されたシグナルの阻害が認められ、50%抑制濃度(IC50)も異なった。非改変CH1/CL Fab又はドメイン交換CH3−KiH Fabのいずれかを有するワンアームド抗EGFR抗体において、最も弱いCD16結合が認められた(図14、菱形)。その結合は23〜71nMの範囲であった。期待されるように、BsAb2及びワンアームド抗CD16抗体は、CD16aとの最強の結合を示した(図14、それぞれ円及び三角形)。結合は、BsAb2の場合0.3nM、及びワンアームド抗CD16抗体の場合0.1nMの範囲であった。BsAb2のエフェクター陰性IgG2変異体、「BsAb2 EN」(図14、四角形)は、BsAb2と比較して、それより弱いCD16との結合(IC50は約3.6nM)を示したが、1価の抗EGFR抗体と比較して、それより強い結合を示した。
これらの結果は、BsAb2は、抗CD16 Fabアーム及び抗体のFc部分にあるFcγ受容体の結合部位の両方を介してCD16a受容体に結合することができるが、一方、BsAb2 ENは、CD16aとなおも結合可能であるが、抗CD16 Fabアームを通じてのみ媒介され、その結合はより弱いことを示唆する。更に、BsAb2 ENの場合、この単一の抗CD16 FabアームとCD16aとの結合は、1価の抗EGFR抗体のFcにあるFcγ受容体結合部位を通じてのみ生ずるCD16aとの結合よりも強かった。
[実施例12]
ドメイン交換抗体の機能的な活性
ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1及びBsAb2の機能的細胞毒性を試験するために、連続希釈で適用した抗体の存在下で、活性化した一次T細胞又はNK細胞をEGFR過剰発現性A431細胞と共にインキュベーションした。E:T比を10:1として、エフェクターと標的細胞を同時培養した後、CytoTox96非放射性細胞毒性アッセイ法(CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)(Promega社)を用いて、細胞溶解を、細胞が溶解した際に上清に放出される細胞死の指標である乳酸脱水素酵素(LDH)の放出により測定した。活性化T細胞の場合は18時間、及びNK細胞の場合は4時間、同時培養を実施した。
活性化T細胞による、標的細胞A431の用量依存性のリダイレクトされた細胞溶解が、ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1の存在下で検出された(図15Aに示す通り)。期待されるように、ワンアームド抗CD3抗体、ワンアームドドメイン交換抗EGFR抗体、及び陰性対照ワンアームド抗CD16抗体は、標的細胞のリダイレクトされたT細胞溶解を示さなかった。ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1のみが、最大50%の細胞溶解を示し、EC50値を計算すると0.1〜0.3nMであった。
このリダイレクトされたT細胞溶解により、ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3−KiH)の両方のアームが機能的であること、並びに両アームが、2つの標的、CD3及びEGFRを同時に関与させて、T細胞をリダイレクトさせてA431標的細胞を溶解させることが実証される。
ドメイン交換二重特異性抗体BsAb2(抗CD16×抗EGFR CH3−KiH)及びそのエフェクター陰性(EN)変異体BsAb2 ENの両方が、リダイレクトされたNK細胞によるA431細胞の用量依存性細胞溶解を示した(図15B)。両変異体は、最大50%の標的細胞を溶解することが可能であった。BsAb2 ENのドメイン交換二重特異性EN変異体のEC50計算値は37pMであり、エフェクター陽性BsAb2変異体のEC50値は、10pMであった。
それと比較して、ワンアームドドメイン交換抗EGFR抗体では、このワンアームド抗体のFc部分にあるFcγ受容体結合部位を通じてNK細胞が本来関与することから、抗CD16アームを有さなくても、やはり同抗体も用量依存性の標的細胞溶解を示した。ワンアームドエフェクター陰性抗EGFR抗体は、エフェクター陰性IgG2変異体アイソタイプFcによるFcγ受容体結合、及び抗CD16アームの両方を欠くため、細胞溶解を示さなかった。期待されるように、陰性対照抗CD3抗体も細胞溶解を示さなかった。
エフェクター陰性変異体ドメイン交換二重特異性抗体BsAb2 EN(抗CD16×抗EGFR CH3−KiH)による、A431細胞のリダイレクトされたNK細胞溶解から、BsAb2の両方のアームが機能的であること、並びに両アームが、2つの標的、CD16及びEGFRを同時に関与させて、NK細胞をリダイレクトさせてA431標的細胞を溶解させることが示された。
総じて、これらの結果より、ドメイン交換二重特異性抗体フォーマットは、各Fabアームを用いて両方の標的に同時に関与可能な二重特異性抗体を生成することが示され、またこれらの抗体の生物学的機能は、2つの異なる標的との結合に依存することが実証される。
[実施例13]
改変されたCH3ドメインの組み合わせの例
図1で一部示すように、改変された異なるCH3ドメインを利用して、ドメイン交換二重特異性抗体を形成するための多くの組み合わせ及び変形形態が存在する。下記は、改変されたFc内のCH3ドメイン(すなわち、CH3HC/CH3HCドメイン対)と、CH3ドメイン交換Fab(すなわち、CH3LC/CH3HCドメイン)との組み合わせについて、そのいくつかの有望な例をリスト化する要約表である、図1A〜1Dを参照。
Figure 0006904902
ワンアームド抗体の一方のFabアーム内のCH1/CLドメインを、改変された代替的CH3ドメインと置換した。この改変された代替的CH3ドメインは、ヘテロ二量体Fc分子における重鎖ヘテロ二量体化の実施に通常用いられる。モデルとして、抗EGFR hu425 Fabドメインを選択し、VH(1)及びVL(1)で用いた。代替的CH3ドメインをコードするDNA配列を合成し、異なる哺乳動物pTT5に基づく発現ベクターを構築したが、各ベクターは、下記の配列をコードする遺伝子の1つを含有する:
「KiH2」CH3ドメイン(Ridgwayら(1996年)、Atwellら(1997年))
変異体1:
配列番号18:VH(1)−CH3_KNOB(T366W)−CH2−CH3AG
配列番号19:VL(1)−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V
変異体2:
配列番号20:VH(1)−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)−CH2−CH3AG
配列番号21:VL(1)−CH3_KNOB(T366W)
「電荷対」CH3ドメイン(Gunasekaranら(2010年))
変異体1:
配列番号22:VH(1)−CH3(E356K、D399K)−CH2−CH3AG
配列番号23:VL(1)−CH3(K392D、K409D)
変異体2:
配列番号24:VH(1)−CH3(K392D、K409D)−CH2−CH3AG
配列番号25:VL(1)−CH3(E356K、D399K)
「Azymmetric」CH3ドメイン(Von Kreudensteinら(2013年))
変異体1:
配列番号26:VH(1)−CH3(T350V、L351Y、F405A、Y407V)−CH2−CH3AG
配列番号27:VL(1)−CH3(T350V、T366L、K392L、T394W)
変異体2:
配列番号28:VH(1)−CH3(T350V、T366L、K392L、T394W)−CH2−CH3AG
配列番号29:VL(1)−CH3(T350V、L351Y、F405A、Y407V
「SEED」CH3ドメイン(Davisら(2010年))
変異体1:
配列番号30:VH(1)−CH3_SEED(AG)−CH2−CH3AG
配列番号31:VL(1)−CH3_SEED(GA)
変異体2:
配列番号32:VH(1)−CH3_SEED(GA)−CH2−CH3AG
配列番号33:VL(1)−CH3_SEED(AG)
ワンアームド抗体及び二重特異性抗体(抗CD3×抗EGFR)を、哺乳動物細胞内で生成した。代替的CH3ドメインを有するワンアームドドメイン交換Fab抗体の場合、huFc_GA(配列番号9)に付加して、上記リスト内に記載する2つのアミノ酸配列をコードする3つの遺伝子を発現させた。これらの代替的CH3交換ドメインを含有するドメイン交換二重特異性抗体を、配列番号3及び配列番号4に示す2つのアミノ酸配列に付加して、上記リスト内に記載する2つのアミノ酸配列をコードする4つの遺伝子を発現させることにより生成した。標準法により、プロテインAを用いて、タンパク質を細胞培養培地から精製し、そしてSDS−PAGE及びSEC分析法により特徴付けを行った。
代替的CH3ドメインを有するワンアームド抗体
非還元式SDS−PAGEは、主に単一のバンドを示し、その分子量はドメイン交換ワンアームド抗体に対応した(図16A)。変異体1及び変異体2の間で有意差は認められなかった。hu425 CH3−Azymmetric変異体は、約90kDaの主要なバンドに認められる完全会合したワンアームド抗体について異なる移動性を示した。SEC分析は、すべての変異体においてリテンションタイムが約7.9分の主要なピーク、及び程度に差はあるが追加ピークを示した(図16C)。抗体のFabアーム及びFc領域の両方において、CH3−SEEDドメインを含有するワンアームド抗体では、高分子量種の追加ピーク(リテンションタイム、6.7分)が最も支配的であった。これは、抗体のドメイン交換Fabアーム及びFc領域の両方について、同一の改変されたCH3ドメインを用いると、ミスペアリングとなる確率がより高いことを示唆し得る。
代替的ドメイン交換二重特異性抗体
非還元式SDS−PAGEは、代替的CH3ドメイン交換二重特異性抗体について、主に1つの主要なバンドを示したが、程度に差はあるがマイナーなバンドも存在した(図16B)。SEC分析では、すべてのサンプルは、リテンションタイムが約7.5分の主要なピーク、及びリテンションタイムが約8分のサイドピークを示した(図16D)。追加の高分子量種も程度に差はあるが存在した。
代替的CH3ドメインを含有するワンアームドドメイン交換抗体の結合アッセイ法
代替的にドメイン交換したFabドメイン(変異体1及び2)を含むワンアームド抗体を、フローサイトメトリーを用いて、抗原結合について試験した。EGFR過剰発現性A431細胞を、試験対象抗体を連続希釈(1:3)してインキュベーションし、そして抗原との結合を、フィコエリトリンとコンジュゲートされた抗ヒトFc F(ab)2二次抗体を用いて検出した。代替的にドメイン交換したFabドメイン(変異体1及び2)を含むワンアームド抗体は、抗体を含有する非改変Fabと類似した抗原結合特性を示した(図17A及びB)。すべてのサンプルのEGFR結合は、EC50として2〜4nMの範囲であった。
ドメイン交換二重特異性抗体の機能的活性
変異体1及び2のタンパク質の特徴は同等であることから、ドメイン交換二重特異性抗体の変異体1を、機能的活性の試験用として選択した。連続希釈(1:4)した試験対象抗体の存在下で、活性化T細胞をEGFR過剰発現性A431細胞と共に同時培養した。E:T比を10:1として、エフェクター細胞と標的細胞を18時間同時培養した後に、CytoTox96非放射性細胞毒性アッセイ法(Promega社)を用いて、細胞溶解をLDHの放出により測定した。代替的CH3ドメイン(抗CD3×抗EGFR)を有するドメイン交換二重特異性抗体は、事前刺激されたT細胞によるEGFR過剰発現性細胞の溶解をリダイレクトした(図18)。これまでの実施例と比較するために、ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3−KiH)も含まれた。
このリダイレクトされたT細胞溶解により、代替的CH3ドメインを有するドメイン交換二重特異性抗体の両方のアームが機能的であること、並びに両アームが、2つの標的、CD3及びEGFRを同時に関与させて、T細胞をリダイレクトさせてA431標的細胞を溶解させることが実証される。
[実施例14]
ヘテロ二量体KiH抗体内のドメイン交換Fabに用いられる改変のCH3ドメインの組み合わせの例
ワンアームドKiH抗体内のCH1/CLドメインを代替的CH3ドメインと置換した。この代替的CH3ドメインは、KiHドメイン交換を除き、実施例13で用いたものと同一であった。図19Aは、Fabアーム内にドメイン交換を含むワンアームドKiH抗体の構造について概略的に図示する。モデルとして、抗EGFR hu425 Fabドメインを選択し、VH(1)及びVL(1)で用いた。代替的CH3ドメインをコードするDNA配列を合成し、そして6つの異なる哺乳動物pTT5に基づく発現ベクターを構築したが、各ベクターは下記の配列をコードする遺伝子の1つを含有する:
配列番号34:VH(1)−CH3(E356K、D399K)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号35:VH(1)−CH3(K392D、K409D)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号36:VH(1)−CH3(T350V、L351Y、F405A、Y407V)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V
配列番号37:VH(1)−CH3(T350V、T366L、K392L、T394W)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号38:VH(1)−CH3_SEED(AG)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号39:VH(1)−CH3_SEED(GA)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
3つの異なる抗体鎖をコードする3つの異なる遺伝子の同時発現により、ワンアームドドメイン交換KiH抗体を生成した。huFc_KNOB(T366W)(配列番号40)を、これら2つの遺伝子と共に同時発現した:
例示するワンアームド抗体は、配列番号40として識別される重鎖H2と以下に示すH1/L1鎖のいずれかの対により特に特徴付けられる:
電荷対CH3ドメイン(Gunasekaranら、(2010年))
変異体1:
配列番号34:VH(1)−CH3(E356K、D399K)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号23:VL(1)−CH3(K392D、K409D)
変異体2:
配列番号35:VH(1)−CH3(K392D、K409D)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号25:VL(1)−CH3(E356K、D399K)
Azymmetric CH3ドメイン(Von Kreudensteinら(2013年))
変異体1:
配列番号36:VH(1)−CH3(T350V、L351Y、F405A、Y407V)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号27:VL(1)−CH3(T350V、T366L、K392L、T394W)
変異体2:
配列番号37:VH(1)−CH3(T350V、T366L、K392L、T394W)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号29:VL(1)−CH3(T350V、L351Y、F405A、Y407V)
SEED CH3ドメイン(Davisら、(2010年))
変異体1:
配列番号38:VH(1)−CH3_SEED(AG)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号31:VL(1)−CH3_SEED(GA)
変異体2:
配列番号39:VH(1)−CH3_SEED(GA)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号33:VL(1)−CH3_SEED(AG)
ワンアームドドメイン交換KiH抗体を哺乳動物細胞内で生成した。標準法により、プロテインAを用いて、タンパク質を細胞培養培地から精製し、そしてSECにより特徴付けを行った。
SEC分析法は、リテンションタイムが約7.9分の主要なピーク、及びリテンションタイムが約8.3分の追加ピークを示した(図19B)。更に、高分子量種の追加ピーク(リテンションタイム、7.4分)が、CH3−Azymmetricを含有するワンアームドドメイン交換抗体について認められた。更に、CH3−SEEDを含有するワンアームドドメイン交換抗体は、高分子量種の追加ピークを5.7分及び6.8分に示した。
これらのタンパク質を、これまでの実施例の記載に従い、フローサイトメトリーを用いて、EGFR陽性細胞との細胞結合について更に試験した(図20A及びB)。異なるワンアームドドメイン交換KiH抗体について、異なるSECプロファイルが得られたが、実施例6及び7に記載するワンアームドドメイン交換抗体と比較して、類似した抗原結合が認められ、すべての抗体について、EC50計算値は3〜5nMの範囲であった。
総じて、実施例13及び14より、改変のCH3ドメインの組み合わせが異なっても、ドメイン交換抗体の形成に利用可能であることが実証される。
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Claims (12)

  1. それぞれがFc領域を含む2つの重鎖(HC)、及びさらにそれぞれが軽鎖(LC)Fab領域を含む2つのLCを含む、二重特異性ドメイン交換抗体であって、ここで、
    A)第1の軽鎖(LC)が、第1の重鎖(HC)と対をなし、第1のCDR結合部位を含む第1のLC/HC二量体を形成し、ここで、前記第1のCDR結合部位は前記第1のLC/HC二量体の可変ドメインによって形成され、第1のエピトープを認識するものであり、
    B)第2のLCが、第2のHCと対をなし、第2のCDR結合部位を含む第2のLC/HC二量体を形成し、ここで、前記第2のCDR結合部位は前記第2のLC/HC二量体の可変ドメインによって形成され、前記第1のエピトープとは異なる第2のエピトープ又は前記第1のエピトープとは異なる抗原に由来する第2のエピトープを認識するものであり、
    ここで、前記第1及び第2のLC/HC二量体の一方が、CH3LC/CH3HCドメイン対を含むドメイン交換LC/HC二量体であり、ここで前記CH3LCはLCのものであり、前記CH3HCはHCのものであり、
    ここで、
    i)前記CH3LCのN末端がLC可変ドメイン(VL)のC末端に融合し、それによりVL−CH3LCが連結され、
    ii)前記CH3HCのN末端がHC可変ドメイン(VH)のC末端に融合し、それによりVH−CH3HCが連結され、及びCH3HCのC末端がHC Fc領域のN末端に融合し、
    ここで、前記CH3 LC /CH3 HC ドメイン対のCH3ドメインが、改変されたCH3ドメインであり、それぞれが以下の変異のいずれかによって修飾された配列番号41として識別されるアミノ酸配列を含み:
    a)前記CH3 LC ドメイン及びCH3 HC ドメインが、T366Y/Y407’T、F405A/T394’W、T366Y:F405A/T394’W:Y407’T、T366W/Y407’A及びS354C:T366W/Y349’C:T366’S:L368’A:Y407’Vからなる群から選択されるノブ及びホール変異を含む、
    b)前記CH3 LC ドメイン及びCH3 HC ドメインが、付加的なCH3 LC /CH3 HC ドメイン間ジスルフィド架橋を含む、
    c)前記CH3 LC ドメイン及びCH3 HC ドメインが、ヒトIgA及びIgGのCH3配列の交互に反復するセグメントから構成されるストランド交換操作ドメイン(SEED CH3)ヘテロ二量体である、
    d)前記CH3 LC ドメイン及びCH3 HC ドメインが、K409D/D399’K、K409D/D399’R、K409E/D399’K、K409E/D399’R、K409D:K392D/D399’K:E356’K及びK409D:K392D:K370D/D399’K:E356’K:E357’Kからなる群から選択される変異を含む、
    e)前記CH3 LC ドメイン及びCH3 HC ドメインが、以下からなる群から選択される変異を含む:
    T350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392L:T394W、
    T350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392M:T394W、
    L351Y:F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W、
    F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W、及び、
    F405A:Y407V/T366L:T394W、
    ここで、ナンバリングが、KabatのEUインデックスに基づくものである、
    前記抗体。
  2. ドメイン交換LC/HC二量体のHCが、VH−CH3−CH2−CH3を含む、請求項1に記載の抗体。
  3. 1つ又は複数のリンカー又はヒンジ領域を更に含む、請求項2に記載の抗体。
  4. ドメイン交換LC/HC二量体のVHドメイン又はVLドメインのいずれかとCH3ドメインとの間のジャンクションが、
    a)ヒトIgG抗体のCH2ドメインとCH3ドメインとの間のジャンクションの少なくとも一部分、及び/又は
    b)ヒトIgG抗体のVLドメインとCLドメインとの間のジャンクションの少なくとも一部分、及び/又は
    c)ヒトIgG抗体のVHドメインとCH1ドメインとの間のジャンクションの少なくとも一部分、及び/又は
    d)長さがアミノ酸5〜20個の人工的結合配列、
    であるアミノ酸配列を含む、請求項1〜のいずれか一項に記載の抗体。
  5. CH2ドメイン及び/又はCH3ドメインのいずれかに位置するFcγ受容体結合部位及び/又はC1q結合部位を含むエフェクター機能コンピテント抗体である、請求項1〜のいずれか一項に記載の抗体。
  6. Fcγ受容体及び/又はC1qとの結合が欠損しているFc領域を含むエフェクター陰性抗体である、請求項1〜のいずれか一項に記載の抗体。
  7. CH2ドメイン及び/又はCH3ドメインのいずれかに位置するpH依存性FcRn結合部位を含む、請求項1〜のいずれか一項に記載の抗体。
  8. 第1のCDR結合部位が、CD3又はCD16を認識し、及び第2のCDR結合部位がEGFRを認識する、請求項1〜のいずれか一項に記載の抗体。
  9. CH3LC/CH3HCドメイン対のCH3ドメインの少なくとも一方が、FcRn結合部位において、pH依存性FcRn結合を低減させる少なくとも1つの変異を含む、請求項1〜のいずれか一項に記載の抗体。
  10. CH3LC/CH3HCドメイン対のCH3ドメインの少なくとも一方が、H433A又はH435A変異のうちの少なくとも1つを含み、ナンバリングが、KabatのEUインデックスに基づく、請求項に記載の抗体。
  11. 抗体の定常ドメインが、ヒト起源又はヒト化IgG1抗体ドメインである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体。
  12. 請求項1〜11のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸分子。
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