JP6904902B2 - ドメイン交換抗体 - Google Patents
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Description
2本の等しい重鎖(H)及び2本の等しい軽鎖(L)が結合して、Y字型の抗体分子を形成する。各重鎖は4つのドメインを有する。アミノ末端可変ドメイン(VH)は、Y字の先端にある。これらに3つの定常ドメイン:CH1、CH2、及びY字の柄の端部に当たるカルボキシ末端側のCH3が続く。短いストレッチであるスイッチ部分が、重鎖可変領域と定常領域を結びつける。ヒンジが、CH2及びCH3(Fcフラグメント)を残りの抗体(Fabフラグメント)と結びつける。天然の抗体分子内のヒンジ部分をタンパク質分解切断することにより、1つのFcと2つの等しいFabフラグメントが生成され得る。軽鎖は、スイッチにより分けられた2つのドメイン、可変ドメイン(VL)と定常ドメイン(CL)から構成される。
本目的は、本発明の主題により解決される。
特定の態様によれば、抗体は、CH3HC/CH3HC二量体により特徴付けられるFc領域を更に含む。Fc領域は、特にFc鎖の二量体により特徴付けられ、各Fc鎖は、CH2−CH3鎖を含むことにより特徴付けられるが、上記二量体は、ホモ二量体又はヘテロ二量体であり得、例えばこの場合、第1のFc鎖は、CH2及び/又はCH3ドメイン内に少なくとも1つの点変異を含む点で第2のFc鎖とは異なる。
a)Fabアームは、VH−CH1ドメインと対をなすVL−CLドメインを含み、2つのドメイン鎖からなる二量体を形成し、
b)ドメイン交換Fabアームは、VH−CH3HCドメインと対をなすVL−CH3LCドメインを含み、これにより CH3LC/CH3HCドメイン対を形成する。
特定の実施形態を図21に示す。
或いは、1つの標的に対して2価、及び第2の標的に対して1価の抗体は、ヘテロ二量体HC/HCの対を組み合わせることにより取得され得るが、この場合、対のうちの一方のHCのみが、C末端に結合した第2のドメイン交換Fabを有する。
a)VL−CH3から構成される1つのLC及び、VH−CH3−CH2−CH3から構成されるHCを含む又はそれらからなり、LCのVL−CH3が、HCのVH−CH3と二量体化しており、これによりCH3LC/CH3HCドメイン対を含むドメイン交換LC/HC二量体である、第1のLC/HC二量体を形成し、
b)VL−CLから構成される1つのLC、及びVH−CH1−CH2−CH3から構成されるHCを含む又はそれらからなり、LCのVL−CH1が、HCのVH−CLと二量体化しており、これにより第2のLC/HC二量体を形成し、
第1のLC/HC二量体のHCが、例えばCH3HC/CH3HCドメイン対を含むFc部分を形成するように、第2のLC/HC二量体のHCと二量体化している。
特に、(Fab)2様構造は、2本の重鎖の結合を介して2つのFab構造を結合させることにより得られるが、この場合、Fab構造の一方又は両方はFab様構造である。
a)ヒトIgG抗体のCH2ドメインとCH3ドメインとの間のジャンクションの少なくとも一部分、及び/又は
b)ヒトIgG抗体のVLドメインとCLドメインとの間のジャンクションの少なくとも一部分、及び/又は
c)ヒトIgG抗体のVHドメインとCH1ドメインとの間のジャンクションの少なくとも一部分、及び/又は
d)長さがアミノ酸5〜20個、好ましくはアミノ酸8〜15個の人工的結合配列
であるアミノ酸配列を含む。
特に、第1及び/又は第2のCH3HETドメインは、配列番号41のいずれかとして識別されるアミノ酸配列を含み、任意選択的に、1つ又は複数の点変異、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の点変異を含む。
特に、抗体は、第1のHCと対をなして、第1のエピトープを認識する第1の結合部位を含む第1のLC/HC二量体を形成する第1のLCと、第2のHCと対をなして、第1のエピトープとは異なる、又は異なる抗原に由来する第2のエピトープを認識する第2の結合部位を含む第2のLC/HC二量体を形成する第2のLCとを含む二重特異性抗体あり、第1のLC/HC二量体又は第2のLC/HC二量体は、ドメイン交換されている。
a)CH3LC/CH3HCドメイン対のCH3ドメインの少なくとも一方は、CH3LC/CH3HCドメインの同族の対を生成することが可能な、第1の改変されたCH3ドメインであり、
b)CH3HC/CH3HCドメイン対のCH3ドメインの少なくとも一方は、CH3HC/CH3HCドメインの同族の対を生成することが可能な、第2の改変されたCH3ドメインであり、
第1及び第2の改変されたCH3ドメインは、少なくとも1つの点変異において異なる。
a)1つ若しくは複数のノブ若しくはホール変異、好ましくはT366Y/Y407’T、F405A/T394’W、T366Y:F405A/T394‘W:Y407’T、T366W/Y407’A及びS354C:T366W/Y349’C:T366’S:L368’A:Y407’Vのいずれか、
b)他方の同族のCH3ドメインのシステイン残基と共有結合し、これによりドメイン間ジスルフィド架橋を導入する、好ましくは両CH3ドメインのC末端を連結するシステイン残基、
c)ヒトIgA及びIgGのCH3配列の交互に反復するセグメントから構成されるSEED CH3ヘテロ二量体、並びに/又は
d)反発性の電荷がヘテロ二量体の形成を抑制する1つ若しくは複数の変異、好ましくはK409D/D399’K、K409D/D399’R、K409E/D399’K、K409E/D399’R、K409D:K392D/D399’K:E356’K又はK409D:K392D:K370D/D399’K:E356’K:E357’Kのいずれか、並びに/又は
e)ヘテロ二量体形成及び/若しくは熱安定性のために選択された1つ若しくは複数の変異、好ましくはT350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392L:T394W、
T350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392M:T394W、
L351Y:F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W、
F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W、又は
F405A:Y407V/T366L:T394Wのいずれか、
のうちの1つ又は複数を含み、
但し、ナンバリングはKabatのEUインデックスに基づく。
特に、抗体は、ADCC及び/又はCDC活性のいずれかにより特徴付けられる。
特に、エフェクター陰性抗体は、ヒトIgG2のCH2配列、又は改変されたその変異体により特徴付けられ、例えば「VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2EN−CH3AG」(配列番号15)で用いられるような、C末端側CH3ドメインのN末端に融合した、米国特許第8562986号に記載の修飾型ヒトIgG2のCH2ドメイン(F296A、N297Q)を含む。
特に、抗体は、CH2ドメインとCH3ドメインとのインタージャンクションのFcRn結合部位、及び/又はCH2ドメインのN末端領域内のFcγ受容体結合部位、及び/又はCH2ドメインのN末端領域内のC1q結合部位を含む抗体のFc部分を含む。
a)第1の標的を認識する結合部位が組み込まれた重鎖及び軽鎖(H1/L1)からなる第1の対、並びに第2の標的を認識する結合部位が組み込まれた重鎖及び軽鎖(H2/L2)からなる第2の対を含む、第1及び第2の標的を特異的に認識する二重特異性抗体、又は
b)標的を認識する結合部位が組み込まれた重鎖及び軽鎖(H1/L1)の対を含む、1価の結合部位により標的を特異的に認識するワンアームド抗体のいずれかであり、
この場合、重鎖(H1)は、定常領域から構成される別の重鎖(H2)に結合し、これによりFc領域を形成する。特に、ワンアームド抗体は、CH2−CH3抗体ドメインを含むFc鎖であるH2を含む。ワンアームド抗体は、CH2−CH3二量体(ホモ二量体又はヘテロ二量体)から構成されるFc領域により特に特徴付けられる。特に、Fc領域は、CH3HC/CH3HC二量体により特徴付けられる。
特に、抗体はワンアームド抗体であり、標的はEGFRである。
特に、抗体はワンアームド抗体であり、標的はCD16である。
特定の実施形態とは、本明細書に例示する抗体のいずれか、又は実施例セクションに記載する重鎖及び軽鎖のいずれか、若しくは重鎖及び軽鎖の対のいずれかを含む抗体のいずれかを意味する。特に、本明細書に記載する抗体は、実施例セクションに記載する重鎖及び軽鎖を含み得る、又はそれから構成され得る。
本発明は、本発明の抗体を含む医薬製剤であって、好ましくは非経口又は粘膜製剤を含み、任意選択的に薬学的に許容される担体又は賦形剤を含有する、医薬製剤を更に提供する。
本発明は、本発明の核酸を含む発現カセット又はプラスミド、及び任意選択的に核酸配列によりコードされる抗体を発現するための更なる配列、例えば制御配列等を更に提供する。
用語「完全長抗体」は、特に重鎖の二量体を含め、少なくともFcドメインの大半を含み、これにより少なくともCH3HC/CH3HCの対、及び天然由来の抗体構造に一般的に見出されるその他のドメインを生成するあらゆる抗体分子を意味するのに利用可能である。この用語「完全長抗体」は、本明細書では、特定の抗体分子が抗体フラグメントではないことを強調するのに用いられる。
用語「ヒト」には、抗体又は免疫グロブリンにおいて用いられる場合、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体が含まれるものと理解される。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基(例えば、ランダム又は部位特異的in vitro変異誘発性により又はin vivo体細胞変異により導入された変異)を、例えばCDR内に含み得る。ヒト抗体として、ヒト免疫グロブリンライブラリから、又は1つ若しくは複数のヒト免疫グロブリンについて遺伝子導入された動物から単離された抗体が挙げられる。
マウス抗体は、IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3、及びIgMからなる群より選択される、又はそれに由来するのが好ましい。
用語「キメラ」とは、免疫グロブリン又は抗体において用いられる場合、重鎖及び軽鎖の各アミノ酸配列の一部分が、特定の種に由来する、又は特定のクラスに属する免疫グロブリン内の対応する配列と相同である一方、鎖の残りのセグメントは別の種又はクラスの対応する配列と相同である分子を意味する。一般的に、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物の1つの種に由来する免疫グロブリンの可変領域を模倣する一方、定常部分は、他方に由来する免疫グロブリンの配列と相同である。例えば、可変領域は、容易に入手可能なB細胞又はヒト以外の宿主生物に由来するハイブリドーマを、例えばヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせて利用する現在知られているソースに由来し得る。
用語「ヒト化」とは、抗体又は免疫グロブリンにおいて用いられる場合、ヒト以外の種から得られた免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子を意味し、分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造及び/又は配列に基づく。抗原結合部位は、定常ドメインと融合した完全な可変ドメイン、又は可変ドメイン内の該当するフレームワーク領域とグラフト結合した相補性決定領域(CDR)のみを含み得る。抗原結合部位は、野生型であり得る、又は例えば1つ若しくは複数のアミノ酸置換により修飾され得る、好ましくはヒト免疫グロブリンとより密接に類似するように修飾され得る。ヒト化免疫グロブリンのいくつかの形態は、すべてのCDR配列を保存する(例えば、6つすべてのCDRを含有するマウス抗体由来のヒト化マウス抗体)。その他の形態は、オリジナルの抗体に関して変更が加えられた1つ又は複数のCDRを有する。
a)抗体の生物学的に活性なフラグメントであり、該フラグメントは、分子の配列のうちの少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、又は少なくとも95%、及び最も好ましくは少なくとも97%、98%、又は99%を含み、
b)少なくとも1つのアミノ酸が置換、付加、及び/又は除去された抗体に由来し、機能的に活性な変異体は、分子又はその一部分に対して配列相同性を有し、例えば、少なくとも50%の配列相同性、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、なおもより好ましくは少なくとも90%、なおいっそうより好ましくは少なくとも95%、及び最も好ましくは少なくとも97%、98%、又は99%の配列相同性を有する抗体等であり、並びに/或いは
c)抗体又はその機能的に活性な変異体、及びポリペプチド又はヌクレオチド配列とは異種の少なくとも1つの更なるアミノ酸又はヌクレオチドから構成される。
「中性」アミノ酸を、それぞれの3文字コードと1文字コード及び極性と共に以下の通り示す:
アラニン:(Ala、A)非極性、中性;
アスパラギン:(Asn、N)極性、中性;
システイン:(Cys、C)非極性、中性;
グルタミン:(Gln、Q)極性、中性;
グリシン:(Gly、G)非極性、中性;
イソロイシン:(Ile、I)非極性、中性;
ロイシン:(Leu、L)非極性、中性;
メチオニン:(Met、M)非極性、中性;
フェニルアラニン:(Phe、F)非極性、中性;
プロリン:(Pro、P)非極性、中性;
セリン:(Ser、S)極性、中性;
トレオニン:(Thr、T)極性、中性;
トリプトファン:(Trp、W)非極性、中性;
チロシン:(Tyr、Y)極性、中性;
バリン:(Val、V)非極性、中性;及び
ヒスチジン:(His、H)極性、正電性(10%)、中性(90%)。
「正に」荷電したアミノ酸は:
アルギニン:(Arg、R)極性、正;及び
リジン:(Lys、K)極性、正
である。
「負に」荷電したアミノ酸は:
アスパラギン酸:(Asp、D)極性、負;及び
グルタミン酸:(Glu、E)極性、負
である。
T366Y/Y407’T、
F405A/T394’W、
T366Y:F405A/T394‘W:Y407’T、
T366W/Y407’A、及び/又は
S354C:T366W/Y349’C:T366’S:L368’A:Y407’V
が挙げられる。
用語「対象」は、本明細書で用いる場合、温血哺乳動物、特にヒト又はヒト以外の動物を指すものとする。従って、用語「対象」は、特にイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ウシ、ブタ、及び家禽を含む動物も指す場合がある。特に、本発明の抗体は、疾患状態の予防又は治療を必要とする対象又は患者を治療するために、医学的用途で提供される。用語「患者」には、予防上又は治療上の処置を受けるヒト及びその他の哺乳動物対象が含まれる。用語「処置」は、従って、予防上の処置と治療上の処置の両方が含まれるように意図される。
本発明は、本明細書で提示する実施例に詳記するような代表的な抗体を特に提供する。例えば、分子の構造及び機能を改善するために、Fcを更に改変する場合、又は異なるCDR結合部位を含む、若しくは異なる特異性を有する抗体を生成する場合、特に2つの異なるFv領域を取得する場合、更なる抗体変異体が、例えば例示した免疫グロブリンの機能的変異体を含め可能性を有する。
CH3ドメイン交換抗体の構築、発現、精製、及び特徴付け
CH3ドメイン交換抗体は、野生型CH3ドメイン、或いは抗体のドメイン交換Fabアーム内のCH1及び/又はCLドメインを置換するために改変された様々なCH3ドメインを用いて形成可能であり、次に図1で一部示すような様々な形態に会合する。
ドメイン交換ヘテロ二量体抗体1:
Fabアーム1及び対応する改変された軽鎖及び重鎖:
完全な抗体の一方のFabアーム内のCH1及びCLドメインをCH3ドメインと置換して、VL(1)−CH3_HOLE(Y407T)軽鎖(配列番号1)及びVH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3AG重鎖(配列番号2)を作製した。VL(1)及びVH(1)ドメインは、EGFR特異的抗体hu425(Matuzumab)1のFvを共同して形成する。
Fabアーム2及び改変重鎖
ヘテロ二量体抗体の後半部分を、下記の鎖により形成した:
軽鎖(配列番号3)は、CD3特異的抗体OKT3(VL2)のVL配列をコードし、またVL(2)−CLドメインをコードする配列から構成された。
ドメイン交換ヘテロ二量体抗体2
この抗体を、ドメイン交換ヘテロ二量体抗体1内のFabアームと同様に改変した。但し、ドメイン交換ヘテロ二量体抗体2では、OKT3 Fabアームは、C末端側CH3AGドメイン(VH(2)−CH1−CH2−CH3AG(配列番号5))を含有する重鎖と融合しており、一方改変されたドメイン交換hu425 Fabアームは、C末端側CH3GAドメインを含有する重鎖と融合している(VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3GA(配列番号6))。
ドメイン交換ヘテロ二量体抗体3
この抗体を、ドメイン交換ヘテロ二量体抗体2としてFabアームと同様に改変した。ドメイン交換ヘテロ二量体抗体3では、OKT3 Fabアームは、C末端側CH3AGドメインを含有する重鎖と融合しており、また改変されたドメイン交換hu425 Fabアームは、C末端側CH3GAドメインを含有する重鎖と融合している。但し、ドメイン交換ヘテロ二量体抗体3では、野生型(wt)CH3ドメインは、ドメイン交換ヘテロ二量体抗体1及び2で用いた改変された「ノブ」及び「ホール」CH3ドメインの同族の対の代わりに、改変されたhu425 FabアームのVL1及びVH1の両方とC末端側で交換した。ドメイン交換ヘテロ二量体抗体3では、hu425 Fabアームについて、配列VL(1)−CH3wt(配列番号7)、及びVH(1)−CH3wt−CH2−CH3GA(配列番号8)が用いられた。
[実施例2]
ヒトIg様の二重特異性抗体を発現するためのベクターの構築
実施例1に記載する3つのヒトドメイン交換ヘテロ二量体抗体を、下記の表で定義する遺伝子配列の所定の組み合わせに従い、1つの細胞内で4つの異なる遺伝子を組み合わせて発現させて生成する。ドメイン交換ヘテロ二量体抗体1の生成は、配列番号1、2、3、及び4の同時発現による。ドメイン交換ヘテロ二量体抗体2の生成は、配列番号1、3、5、及び6の同時発現による。ドメイン交換ヘテロ二量体抗体3の生成は、配列番号3、5、7、及び8の同時発現による。
配列番号1:VL(1)−CH3_HOLE(Y407T)
配列番号2:VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3AG
配列番号3:VL(2)−CL
配列番号4:VH(2)−CH1−CH2−CH3GA
配列番号5:VH(2)−CH1−CH2−CH3AG
配列番号6:VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2−CH3GA
配列番号7:VL(1)−CH3wt
配列番号8:VH(1)−CH3wt−CH2−CH3GA
VL1及びVH1では、抗EGFR抗体のMatuzumab(hu425)(Kim、2004年)の可変ドメインを用いた。
図1Aは、CH3ドメイン(Davisら、2010年、及び米国特許第20070287170A1号を参照)のAG及びGAバージョンを用いて、ストランド交換操作ドメイン(SEED)CH3ヘテロ二量体技術により、2つの異なる重鎖のヘテロ二量体化を実現する、有望なドメイン交換二重特異性抗体のうち、そのいくつかの構造を概略的に図示する。図1A−1は、実施例1のドメイン交換ヘテロ二量体抗体1の構造を特に図示する。
[実施例3]
二重特異性抗体の発現及び特徴付け
実施例1及び2に記載のドメイン交換ヘテロ二量体抗体1、2、及び3を、標準技法に基づき、哺乳動物細胞内で小規模に発現させた。得られたタンパク質をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、そして非還元式SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)及び粒径排除クロマトグラフィー分析法(SEC)により特徴付けを行った(図2)。非還元式のゲルは、主に単一のバンドを示し、その分子量はドメイン交換抗体1及び2の両方について期待されるサイズに対応した(図2A)。ドメイン交換抗体3では、SDS−PAGEは、期待されるサイズのバンドを示し、またより高分子量のタンパク質複合体に対応する追加のバンドも示した(図2A)。
[実施例4]
ドメイン交換二重特異性抗体1の大スケール発現及び特徴付け
ドメイン交換ヘテロ二量体二重特異性抗体1及び2は、類似した生物物理学的特徴、例えば類似した非還元式SDS−PAGEパターン及びSECプロファイルを有した。ドメイン交換ヘテロ二量体二重特異性抗体1の発現は、より高い発現レベルを実現し、これを更なる特徴付け用として選択した。
[実施例5]
二重特異性結合アッセイ
BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3−KiH)と2つの抗原CD3及びEGFRとの同時結合を試験するために、CD3+ジャーカット細胞を、BsAb1又は対照の抗CD3抗EGFR二重特異性抗体で最初に染色し、その後に、EGFRとのインキュベーションステップが続いた。二重特異性結合を、フルオレセインイソチオシアネートでラベリングした抗EGFR検出抗体を用いて検出し、そしてフローサイトメトリーにより分析した(図4)。
[実施例6]
Fabアーム内にCH3ドメインを含有するワンアームド抗体の生成及び特徴付け
CH3ドメイン交換(KiH同族の対)Fab領域又は非改変Fab領域を含有するワンアームド抗体を、3つの異なる遺伝子の同時発現により生成した。図5は、ワンアームド抗体の構造を概略的に図示する(非改変及びドメイン交換)。各抗体鎖をコードする遺伝子を含有する、異なる哺乳動物pTT5に基づく発現ベクターを、これまでの記載に従い構築した。
得られたワンアームド抗体は、EGFRを認識し、また下記の軽鎖及び重鎖により特に特徴付けられる。ドメイン交換ワンアームド抗EGFR:H1(配列番号2)、H2(配列番号9)、及びL1(配列番号1)。非改変ワンアームド抗EGFR:H1(配列番号11)、H2(配列番号9)、及びL1(配列番号10)。
[実施例7]
フローサイトメトリーによるEGFR陽性細胞への1価の結合
CH3ドメイン交換抗EGFR Fabドメインを利用するワンアームド抗体を標的結合について試験し、また非改変抗EGFR Fab(CH1/CL)を有するワンアームド抗体と比較した(実施例6を参照)。更に、BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3−KiH)を、EGFR標的結合について試験した。抗体とEGFR発現性A431細胞との結合をフローサイトメトリーにより測定した(図7)。細胞に結合した抗体を、フィコエリトリンとコンジュゲートされた抗ヒトFc F(ab)2二次抗体により検出し、そしてフローサイトメトリーを用いて細胞を分析した。細胞結合に関する50%有効濃度(EC50)を、プログラムGraphPad PRISMを用いて結合曲線から計算した。
[実施例8]
ドメイン交換二重特異性抗体2「BsAb2」(抗CD16×抗EGFR)の構築、発現、精製、及び特徴付け
先行する実施例に記載され、またBsAb1で用いられたCH3ドメイン交換抗EGFR Fabを、マウス抗CD16抗体3G8(Fleitら、1982年)と組み合わせて、以後BsAb2(抗CD16×抗EGFR CH3−KiH)と呼ぶ新規のドメイン交換二重特異性抗体を生成した。哺乳動物pTT5に基づく発現ベクターを更に2つ構築したが、各ベクターは下記の配列をコードする遺伝子の1つを含有した:
配列番号12:VL(3)−CL
配列番号13:VH(3)−CH1−CH2−CH3GA
VL(3)及びVH(3)の場合、抗CD16抗体3G8(Fleitら、1982年)の可変ドメインを用いた。
[実施例9]
マススペクトロメトリーによる正しい会合の検証
ドメイン交換二重特異性抗体を分析する直接的なアプローチ
ドメイン交換二重特異性抗体内で鎖が正しく対を形成しているか確認するために、精製後のドメイン交換二重特異性抗体BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3−KiH)、及びBsAb2(抗CD16×抗EGFR CH3−KiH)を、液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー(LC−MS)分析法により測定した。MS分析前に、サンプルをPNGaseFにより脱グリコシル化した。図9及び図10に示す通り、ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1及びBsAb2について、148.284kDa及び148.050kDaの単一のピークがそれぞれ検出された。これらの検出された質量は、4つの異なる抗体鎖の合計に対応する。これらの鎖が会合する期間中に、ジスルフィド架橋形成、C末端リジン切断、及びN末端ピログルタミン酸形成に起因して、更に質量が失われる可能性がある。約322kDaのこのような質量損失を考慮すると、検出される平均質量は、ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1の場合、<3Daだけ、またドメイン交換二重特異性抗体BsAb2の場合、約12Da、計算した平均質量から相違する。GA−ホモ二量体は、いずれの抗体サンプルにおいても検出されなかった(計算による分子質量は、ホモ二量体OKT3−GAの場合:146.465kDa、及びホモ二量体3G8−GAの場合:145.980kDa)。
軽鎖の競合による間接的アプローチ
適用したLC−MS方法は、正しく会合したドメイン交換抗体と、軽鎖が交換した抗体とを区別することができないので、競合アッセイ法を実施した。このアッセイでは、ドメイン交換二重特異性抗体に由来する軽鎖と重鎖の一方の両方を、1つの細胞内で、huFc_GA SEED鎖(ヒンジ−CH2−CH3GA)と共に同時発現させ、ワンアームド抗体を形成した。ワンアームド重鎖と正しい軽鎖との特異的な対形成のみが生じた場合には、正しい軽鎖が対形成したFabのみが形成される。ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1の抗体鎖をモデルとして選択した。
[実施例10]
ドメイン交換抗体の熱安定性
ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1及び2の安定性を、異なる走査熱量測定法(DSC)により更に分析し、また見かけの転移の融解温度を測定した(図13を参照)。
[実施例11]
エフェクター陰性抗体の生成及び特徴付け
これまでの実施例で記載した二重特異性、及びワンアームド抗体に付加して、以下に列挙する新規の抗体を、抗体生成について上記実施例で記載したタンパク質の発現、精製、及び特徴付けの手順と同一の手順に従い、次の一連の実験で用いるために生成した。
・SEED AG重鎖と融合した非改変OKT3 Fabを有するワンアームド抗CD3。
・SEED AG重鎖と融合した非改変3G8 Fabを有するワンアームド抗CD16。
・エフェクター陰性(EN)アイソタイプSEED AG重鎖と融合し、ENアイソタイプ huFc_GA SEED鎖と対をなすCH3ドメイン交換(KiH同族の対)hu425 Fabを有するENアイソタイプワンアームド抗EGFR。
・実施例8と同様に、但しエフェクター陰性(EN)アイソタイプSEED AG、及びENアイソタイプSEED GA重鎖を用いて生成したENアイソタイプドメイン交換二重特異性抗体BsAb2(抗CD16×抗−EGFR CH3−KiH)。
配列番号14:VH(3)−CH1−CH2−CH3AG
配列番号15:VH(1)−CH3_KNOB(T366Y)−CH2EN−CH3AG
配列番号16:huFc_g1hingeEN−CH2EN−CH3GA
配列番号17:VH(3)−CH1−CH2EN−CH3GA
VL1及びVH1の場合、抗EGFR抗体のMatuzumab(hu425)(Kim、2004年)の可変ドメインを用いた。
VL(3)及びVH(3)の場合、抗CD16抗体3G8(Fleitら、1982年)の可変ドメインを用いた。
[実施例12]
ドメイン交換抗体の機能的な活性
ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1及びBsAb2の機能的細胞毒性を試験するために、連続希釈で適用した抗体の存在下で、活性化した一次T細胞又はNK細胞をEGFR過剰発現性A431細胞と共にインキュベーションした。E:T比を10:1として、エフェクターと標的細胞を同時培養した後、CytoTox96非放射性細胞毒性アッセイ法(CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)(Promega社)を用いて、細胞溶解を、細胞が溶解した際に上清に放出される細胞死の指標である乳酸脱水素酵素(LDH)の放出により測定した。活性化T細胞の場合は18時間、及びNK細胞の場合は4時間、同時培養を実施した。
[実施例13]
改変されたCH3ドメインの組み合わせの例
図1で一部示すように、改変された異なるCH3ドメインを利用して、ドメイン交換二重特異性抗体を形成するための多くの組み合わせ及び変形形態が存在する。下記は、改変されたFc内のCH3ドメイン(すなわち、CH3HC/CH3HCドメイン対)と、CH3ドメイン交換Fab(すなわち、CH3LC/CH3HCドメイン)との組み合わせについて、そのいくつかの有望な例をリスト化する要約表である、図1A〜1Dを参照。
「KiH2」CH3ドメイン(Ridgwayら(1996年)、Atwellら(1997年))
変異体1:
配列番号18:VH(1)−CH3_KNOB(T366W)−CH2−CH3AG
配列番号19:VL(1)−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V
変異体2:
配列番号20:VH(1)−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)−CH2−CH3AG
配列番号21:VL(1)−CH3_KNOB(T366W)
「電荷対」CH3ドメイン(Gunasekaranら(2010年))
変異体1:
配列番号22:VH(1)−CH3(E356K、D399K)−CH2−CH3AG
配列番号23:VL(1)−CH3(K392D、K409D)
変異体2:
配列番号24:VH(1)−CH3(K392D、K409D)−CH2−CH3AG
配列番号25:VL(1)−CH3(E356K、D399K)
「Azymmetric」CH3ドメイン(Von Kreudensteinら(2013年))
変異体1:
配列番号26:VH(1)−CH3(T350V、L351Y、F405A、Y407V)−CH2−CH3AG
配列番号27:VL(1)−CH3(T350V、T366L、K392L、T394W)
変異体2:
配列番号28:VH(1)−CH3(T350V、T366L、K392L、T394W)−CH2−CH3AG
配列番号29:VL(1)−CH3(T350V、L351Y、F405A、Y407V
「SEED」CH3ドメイン(Davisら(2010年))
変異体1:
配列番号30:VH(1)−CH3_SEED(AG)−CH2−CH3AG
配列番号31:VL(1)−CH3_SEED(GA)
変異体2:
配列番号32:VH(1)−CH3_SEED(GA)−CH2−CH3AG
配列番号33:VL(1)−CH3_SEED(AG)
ワンアームド抗体及び二重特異性抗体(抗CD3×抗EGFR)を、哺乳動物細胞内で生成した。代替的CH3ドメインを有するワンアームドドメイン交換Fab抗体の場合、huFc_GA(配列番号9)に付加して、上記リスト内に記載する2つのアミノ酸配列をコードする3つの遺伝子を発現させた。これらの代替的CH3交換ドメインを含有するドメイン交換二重特異性抗体を、配列番号3及び配列番号4に示す2つのアミノ酸配列に付加して、上記リスト内に記載する2つのアミノ酸配列をコードする4つの遺伝子を発現させることにより生成した。標準法により、プロテインAを用いて、タンパク質を細胞培養培地から精製し、そしてSDS−PAGE及びSEC分析法により特徴付けを行った。
代替的CH3ドメインを有するワンアームド抗体
非還元式SDS−PAGEは、主に単一のバンドを示し、その分子量はドメイン交換ワンアームド抗体に対応した(図16A)。変異体1及び変異体2の間で有意差は認められなかった。hu425 CH3−Azymmetric変異体は、約90kDaの主要なバンドに認められる完全会合したワンアームド抗体について異なる移動性を示した。SEC分析は、すべての変異体においてリテンションタイムが約7.9分の主要なピーク、及び程度に差はあるが追加ピークを示した(図16C)。抗体のFabアーム及びFc領域の両方において、CH3−SEEDドメインを含有するワンアームド抗体では、高分子量種の追加ピーク(リテンションタイム、6.7分)が最も支配的であった。これは、抗体のドメイン交換Fabアーム及びFc領域の両方について、同一の改変されたCH3ドメインを用いると、ミスペアリングとなる確率がより高いことを示唆し得る。
代替的ドメイン交換二重特異性抗体
非還元式SDS−PAGEは、代替的CH3ドメイン交換二重特異性抗体について、主に1つの主要なバンドを示したが、程度に差はあるがマイナーなバンドも存在した(図16B)。SEC分析では、すべてのサンプルは、リテンションタイムが約7.5分の主要なピーク、及びリテンションタイムが約8分のサイドピークを示した(図16D)。追加の高分子量種も程度に差はあるが存在した。
代替的CH3ドメインを含有するワンアームドドメイン交換抗体の結合アッセイ法
代替的にドメイン交換したFabドメイン(変異体1及び2)を含むワンアームド抗体を、フローサイトメトリーを用いて、抗原結合について試験した。EGFR過剰発現性A431細胞を、試験対象抗体を連続希釈(1:3)してインキュベーションし、そして抗原との結合を、フィコエリトリンとコンジュゲートされた抗ヒトFc F(ab)2二次抗体を用いて検出した。代替的にドメイン交換したFabドメイン(変異体1及び2)を含むワンアームド抗体は、抗体を含有する非改変Fabと類似した抗原結合特性を示した(図17A及びB)。すべてのサンプルのEGFR結合は、EC50として2〜4nMの範囲であった。
ドメイン交換二重特異性抗体の機能的活性
変異体1及び2のタンパク質の特徴は同等であることから、ドメイン交換二重特異性抗体の変異体1を、機能的活性の試験用として選択した。連続希釈(1:4)した試験対象抗体の存在下で、活性化T細胞をEGFR過剰発現性A431細胞と共に同時培養した。E:T比を10:1として、エフェクター細胞と標的細胞を18時間同時培養した後に、CytoTox96非放射性細胞毒性アッセイ法(Promega社)を用いて、細胞溶解をLDHの放出により測定した。代替的CH3ドメイン(抗CD3×抗EGFR)を有するドメイン交換二重特異性抗体は、事前刺激されたT細胞によるEGFR過剰発現性細胞の溶解をリダイレクトした(図18)。これまでの実施例と比較するために、ドメイン交換二重特異性抗体BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3−KiH)も含まれた。
[実施例14]
ヘテロ二量体KiH抗体内のドメイン交換Fabに用いられる改変のCH3ドメインの組み合わせの例
ワンアームドKiH抗体内のCH1/CLドメインを代替的CH3ドメインと置換した。この代替的CH3ドメインは、KiHドメイン交換を除き、実施例13で用いたものと同一であった。図19Aは、Fabアーム内にドメイン交換を含むワンアームドKiH抗体の構造について概略的に図示する。モデルとして、抗EGFR hu425 Fabドメインを選択し、VH(1)及びVL(1)で用いた。代替的CH3ドメインをコードするDNA配列を合成し、そして6つの異なる哺乳動物pTT5に基づく発現ベクターを構築したが、各ベクターは下記の配列をコードする遺伝子の1つを含有する:
配列番号34:VH(1)−CH3(E356K、D399K)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号35:VH(1)−CH3(K392D、K409D)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号36:VH(1)−CH3(T350V、L351Y、F405A、Y407V)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V
配列番号37:VH(1)−CH3(T350V、T366L、K392L、T394W)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号38:VH(1)−CH3_SEED(AG)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号39:VH(1)−CH3_SEED(GA)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
3つの異なる抗体鎖をコードする3つの異なる遺伝子の同時発現により、ワンアームドドメイン交換KiH抗体を生成した。huFc_KNOB(T366W)(配列番号40)を、これら2つの遺伝子と共に同時発現した:
例示するワンアームド抗体は、配列番号40として識別される重鎖H2と以下に示すH1/L1鎖のいずれかの対により特に特徴付けられる:
電荷対CH3ドメイン(Gunasekaranら、(2010年))
変異体1:
配列番号34:VH(1)−CH3(E356K、D399K)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号23:VL(1)−CH3(K392D、K409D)
変異体2:
配列番号35:VH(1)−CH3(K392D、K409D)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号25:VL(1)−CH3(E356K、D399K)
Azymmetric CH3ドメイン(Von Kreudensteinら(2013年))
変異体1:
配列番号36:VH(1)−CH3(T350V、L351Y、F405A、Y407V)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号27:VL(1)−CH3(T350V、T366L、K392L、T394W)
変異体2:
配列番号37:VH(1)−CH3(T350V、T366L、K392L、T394W)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号29:VL(1)−CH3(T350V、L351Y、F405A、Y407V)
SEED CH3ドメイン(Davisら、(2010年))
変異体1:
配列番号38:VH(1)−CH3_SEED(AG)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号31:VL(1)−CH3_SEED(GA)
変異体2:
配列番号39:VH(1)−CH3_SEED(GA)−CH2−CH3_HOLE(T366S、L368A、Y407V)
配列番号33:VL(1)−CH3_SEED(AG)
ワンアームドドメイン交換KiH抗体を哺乳動物細胞内で生成した。標準法により、プロテインAを用いて、タンパク質を細胞培養培地から精製し、そしてSECにより特徴付けを行った。
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Claims (12)
- それぞれがFc領域を含む2つの重鎖(HC)、及びさらにそれぞれが軽鎖(LC)Fab領域を含む2つのLCを含む、二重特異性ドメイン交換抗体であって、ここで、
A)第1の軽鎖(LC)が、第1の重鎖(HC)と対をなし、第1のCDR結合部位を含む第1のLC/HC二量体を形成し、ここで、前記第1のCDR結合部位は前記第1のLC/HC二量体の可変ドメインによって形成され、第1のエピトープを認識するものであり、
B)第2のLCが、第2のHCと対をなし、第2のCDR結合部位を含む第2のLC/HC二量体を形成し、ここで、前記第2のCDR結合部位は前記第2のLC/HC二量体の可変ドメインによって形成され、前記第1のエピトープとは異なる第2のエピトープ又は前記第1のエピトープとは異なる抗原に由来する第2のエピトープを認識するものであり、
ここで、前記第1及び第2のLC/HC二量体の一方が、CH3LC/CH3HCドメイン対を含むドメイン交換LC/HC二量体であり、ここで前記CH3LCはLCのものであり、前記CH3HCはHCのものであり、
ここで、
i)前記CH3LCのN末端がLC可変ドメイン(VL)のC末端に融合し、それによりVL−CH3LCが連結され、
ii)前記CH3HCのN末端がHC可変ドメイン(VH)のC末端に融合し、それによりVH−CH3HCが連結され、及びCH3HCのC末端がHC Fc領域のN末端に融合し、
ここで、前記CH3 LC /CH3 HC ドメイン対のCH3ドメインが、改変されたCH3ドメインであり、それぞれが以下の変異のいずれかによって修飾された配列番号41として識別されるアミノ酸配列を含み:
a)前記CH3 LC ドメイン及びCH3 HC ドメインが、T366Y/Y407’T、F405A/T394’W、T366Y:F405A/T394’W:Y407’T、T366W/Y407’A及びS354C:T366W/Y349’C:T366’S:L368’A:Y407’Vからなる群から選択されるノブ及びホール変異を含む、
b)前記CH3 LC ドメイン及びCH3 HC ドメインが、付加的なCH3 LC /CH3 HC ドメイン間ジスルフィド架橋を含む、
c)前記CH3 LC ドメイン及びCH3 HC ドメインが、ヒトIgA及びIgGのCH3配列の交互に反復するセグメントから構成されるストランド交換操作ドメイン(SEED CH3)ヘテロ二量体である、
d)前記CH3 LC ドメイン及びCH3 HC ドメインが、K409D/D399’K、K409D/D399’R、K409E/D399’K、K409E/D399’R、K409D:K392D/D399’K:E356’K及びK409D:K392D:K370D/D399’K:E356’K:E357’Kからなる群から選択される変異を含む、
e)前記CH3 LC ドメイン及びCH3 HC ドメインが、以下からなる群から選択される変異を含む:
T350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392L:T394W、
T350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392M:T394W、
L351Y:F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W、
F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W、及び、
F405A:Y407V/T366L:T394W、
ここで、ナンバリングが、KabatのEUインデックスに基づくものである、
前記抗体。 - ドメイン交換LC/HC二量体のHCが、VH−CH3−CH2−CH3を含む、請求項1に記載の抗体。
- 1つ又は複数のリンカー又はヒンジ領域を更に含む、請求項2に記載の抗体。
- ドメイン交換LC/HC二量体のVHドメイン又はVLドメインのいずれかとCH3ドメインとの間のジャンクションが、
a)ヒトIgG抗体のCH2ドメインとCH3ドメインとの間のジャンクションの少なくとも一部分、及び/又は
b)ヒトIgG抗体のVLドメインとCLドメインとの間のジャンクションの少なくとも一部分、及び/又は
c)ヒトIgG抗体のVHドメインとCH1ドメインとの間のジャンクションの少なくとも一部分、及び/又は
d)長さがアミノ酸5〜20個の人工的結合配列、
であるアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体。 - CH2ドメイン及び/又はCH3ドメインのいずれかに位置するFcγ受容体結合部位及び/又はC1q結合部位を含むエフェクター機能コンピテント抗体である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体。
- Fcγ受容体及び/又はC1qとの結合が欠損しているFc領域を含むエフェクター陰性抗体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
- CH2ドメイン及び/又はCH3ドメインのいずれかに位置するpH依存性FcRn結合部位を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体。
- 第1のCDR結合部位が、CD3又はCD16を認識し、及び第2のCDR結合部位がEGFRを認識する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体。
- CH3LC/CH3HCドメイン対のCH3ドメインの少なくとも一方が、FcRn結合部位において、pH依存性FcRn結合を低減させる少なくとも1つの変異を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体。
- CH3LC/CH3HCドメイン対のCH3ドメインの少なくとも一方が、H433A又はH435A変異のうちの少なくとも1つを含み、ナンバリングが、KabatのEUインデックスに基づく、請求項9に記載の抗体。
- 抗体の定常ドメインが、ヒト起源又はヒト化IgG1抗体ドメインである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸分子。
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