CN108601830B - 双特异性抗体平台 - Google Patents

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Abstract

本文提供了双特异性抗体中重链和轻链错配问题的解决方案。所述解决方案的一部分涉及Fc区，所述Fc区通过赖氨酸重新定位而在其CH3结构域中进行工程改造以驱动所述双特异性抗体的两条重链的异源二聚化。所述解决方案的第二部分涉及所述双特异性抗体的两个Fab臂中的一个的修饰，以便防止所述双特异性抗体中轻链的错配。具体而言，所述双特异性抗体的所述Fab臂中的一个的CH1和CL结构域被IgE CH2结构域或IgM CH2结构域取代。

Description

双特异性抗体平台
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年12月18日提交的美国临时申请号62/269,664的优先权权益，该申请的内容以引用方式整体并入本文。
背景
人们越来越关注双特异性抗体作为生物制剂药物的用途，这在很大程度上归因于实现用两种常规单特异性抗体的组合无法实现的新型作用机制的可能性。因此寻求用于产生双特异性抗体的有效方法。产生作为生物制剂药物的双特异性抗体的初始尝试涉及单特异性抗体的化学缀合和mAb表达细胞的融合，但是效率低以及从大量的副产物中纯化的必要性是这些策略的缺点。蛋白质工程和分子生物学中的先进方法已经使得能够产生多种新的双特异性抗体形式。然而，这些工程改造的双特异性抗体形式的改变的生物化学/生物物理特性、血清半衰期、或稳定性可能是不利的。因此，用于生成可克服这些问题中的一些的双特异性抗体的有效平台将是有用的。
发明内容
本申请涉及一种可以将结合不同表位的任何两种抗体转化成双特异性抗体的抗体平台技术。此平台技术部分涉及Fc区，所述Fc区通过赖氨酸重新定位而在其CH3结构域中进行工程改造以驱动双特异性抗体的两条重链的异源二聚化。此外，此技术涉及双特异性抗体的两个Fab臂中的一个的修饰，以便防止双特异性抗体中轻链的错配。具体而言，双特异性抗体的Fab臂中的一个的CH1和CL结构域被IgE CH2结构域或IgM CH2结构域取代。在一些情况下，双特异性抗体的Fab臂中的一个的CH1和CL结构域被IgE CH2结构域(或IgM CH2结构域)的片段取代，其中所述片段仍然可以与IgE CH2结构域(或IgM CH2结构域)二聚化。
在一个方面，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，其包含第一重链可变结构域(第一VH)和第一轻链可变结构域(第一VL)，其中第一VH和第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一表位的第一可变区。第一VH直接连接或通过接头连接至第一多肽，所述第一多肽包含与人免疫球蛋白E(IgE)的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸9-107具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一VL直接连接或通过接头连接至第二多肽，所述第二多肽包含与人IgE的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸9-107具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一多肽和第二多肽配对形成二聚体。
在该方面的某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽直接连接至Fc结构域。在某些情况下，Fc结构域包含IgG1抗体的CH2和CH3结构域。在某些情况下，Fc结构域包含IgG4抗体的CH2和CH3结构域。在某些情况下，Fc结构域包含IgG4抗体的CH2结构域和IgG1抗体的CH3结构域。在所有这些实施方案中的一些中，Fc结构域包含IgG4抗体的铰链区(例如，IgG4P-即具有S228P突变的IgG4铰链区)。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含与SEQID NO:1中列出的氨基酸序列的氨基酸9-107具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列的氨基酸9-107。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽在12个或更少个氨基酸残基处不同于SEQ ID NO:1的氨基酸9-107中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽在不形成链内二硫键的SEQ ID NO:1的两个半胱氨酸残基中的至少一个处含有不是半胱氨酸的氨基酸。在某些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自含有IgE CH2结构域或其片段中N-连接糖基化位点的突变，使得N-连接糖基化位点不被糖基化(例如，天冬酰胺和/或苏氨酸残基被另一种氨基酸取代)。在某些实施方案中，第一多肽或第二多肽含有IgE CH2结构域或其片段中N-连接糖基化位点的突变，使得N-连接糖基化位点不被糖基化。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含第二重链可变结构域(第二VH)和第二轻链可变结构域(第二VL)，其中第二VH和第二VL配对以形成特异性结合第一抗原的第二表位或第二抗原的第二可变区。在某些实施方案中，第二VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CH1结构域，并且第二VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CL结构域。在某些实施方案中，本公开提供了编码上述抗体或抗原结合片段的一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，提供了包含上述一种或多种多核苷酸的表达载体。在其他实施方案中，提供了包含一种或多种多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在其他实施方案中，提供了制备上述抗体或抗原结合片段的方法，其包括在引起上述抗体或抗原结合片段表达的条件下培养上述宿主细胞，以及从细胞培养物中分离抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，将分离的抗体或抗原结合片段配制为用于向有需要的人受试者施用的无菌组合物。
在第二方面，本公开提供了一种包含第一VH和第一VL的抗体或其抗原结合片段，其中第一VH和第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一表位的第一可变区。第一VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第一多肽，所述第一多肽包含与人免疫球蛋白M(IgM)的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸7-112具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第二多肽，所述第二多肽包含与人IgM的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸7-112具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一多肽和第二多肽配对形成二聚体。
在该方面的某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽直接连接至Fc结构域。在某些情况下，Fc结构域包含IgG1抗体的CH2和CH3结构域。在某些情况下，Fc结构域包含IgG4抗体的CH2和CH3结构域。在某些情况下，Fc结构域包含IgG4抗体的CH2结构域和IgG1抗体的CH3结构域。在所有这些实施方案中的一些中，Fc结构域包含IgG4抗体的铰链区(例如，IgG4P-即具有S228P突变的IgG4铰链区)。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含与SEQID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽在12个或更少个氨基酸残基处不同于SEQ IDNO:2的氨基酸7-112中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽在不形成链内二硫键的SEQ ID NO:2的半胱氨酸残基处含有不是半胱氨酸的氨基酸。在某些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自含有IgM CH2结构域或其片段中N-连接糖基化位点的突变，使得N-连接糖基化位点不被糖基化(例如，天冬酰胺和/或丝氨酸残基被另一种氨基酸取代)。在某些实施方案中，第一多肽或第二多肽含有IgM CH2结构域或其片段中N-连接糖基化位点的突变，使得N-连接糖基化位点不被糖基化。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含第二重链可变结构域(第二VH)和第二轻链可变结构域(第二VL)，其中第二VH和第二VL配对以形成特异性结合第一抗原的第二表位或第二抗原的第二可变区。在某些实施方案中，第二VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CH1结构域，并且第二VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CL结构域。在某些实施方案中，本公开提供了编码上述抗体或抗原结合片段的一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，提供了包含上述一种或多种多核苷酸的表达载体。在其他实施方案中，提供了包含一种或多种多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在其他实施方案中，提供了制备上述抗体或抗原结合片段的方法，其包括在引起上述抗体或抗原结合片段表达的条件下培养上述宿主细胞，以及从细胞培养物中分离抗体或抗原结合片段。在某些实施方案中，将分离的抗体或抗原结合片段配制为用于向有需要的人受试者施用的无菌组合物。
在另一方面，本公开提供了一种双特异性抗体，其包含含有第一VH和第一VL的第一抗原结合片段(第一Fab)，其中第一VH和第一VL配对形成第一可变区。第一VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第一多肽，所述第一多肽包含与人免疫球蛋白E(IgE)的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸9-107具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第二多肽，所述第二多肽包含与人IgE的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸9-107具有至少80％同一性的氨基酸序列。双特异性抗体还包含含有第二VH和第二VL的第二Fab，其中第二VH和第二VL配对形成第二可变区，并且其中第二VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CH1结构域，并且第二VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CL结构域。第一Fab和第二Fab特异性结合不同抗原或相同抗原的不同表位，并且第一Fab连接至第二Fab。
在此方面的一些实施方案中，第一Fab通过接头连接至第二Fab。在某些实施方案中，第一Fab通过异源多肽连接至第二Fab。在一些实施方案中，异源多肽是人血清白蛋白。在一些实施方案中，异源多肽是XTEN(例如，AE144、AE288)。在一些实施方案中，第一Fab通过聚乙二醇(PEG)连接至第二Fab。在某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽各自包含SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含与SEQID NO:1中列出的氨基酸序列的氨基酸9-107具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列的氨基酸9-107。在一些实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二多肽包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽在12个或更少个氨基酸残基处不同于SEQ ID NO:1的氨基酸9-107中列出的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一多肽和/或第二多肽在可形成链间二硫键的SEQ ID NO:1的两个半胱氨酸残基中的至少一个处含有不是半胱氨酸的氨基酸。在某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽含有IgE CH2结构域或其片段中N-连接糖基化位点的突变，使得N-连接糖基化位点不被糖基化。例如，IgE CH2结构域N-连接糖基化位点的天冬酰胺和/或苏氨酸可以被另一种氨基酸取代，以防止该基序的糖基化。在某些实施方案中，本公开提供了编码上述双特异性抗体的一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，提供了包含上述双特异性抗体的表达载体。在其他实施方案中，提供了包含双特异性抗体或表达载体的宿主细胞。在其他实施方案中，提供了制备双特异性抗体的方法，其包括在引起双特异性抗体表达的条件下培养上述宿主细胞，以及从细胞培养物中分离双特异性抗体。在某些实施方案中，将分离的双特异性抗体配制为用于向有需要的人受试者施用的无菌组合物。
在另一方面，本公开提供了一种双特异性抗体，其包含含有第一VH和第一VL的第一抗原结合片段(第一Fab)，其中第一VH和第一VL配对形成第一可变区。第一VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第一多肽，所述第一多肽包含与人免疫球蛋白M(IgM)的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸7-112具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第二多肽，所述第二多肽包含与人IgM的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸7-112具有至少80％同一性的氨基酸序列。双特异性抗体还包含含有第二VH和第二VL的第二Fab。第二VH和第二VL配对形成第二可变区，并且其中第二VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CH1结构域，并且第二VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CL结构域。第一Fab和第二Fab特异性结合不同抗原或相同抗原的不同表位。第一Fab连接至第二Fab。
在此方面的一些实施方案中，第一Fab通过接头连接至第二Fab。在某些实施方案中，第一Fab通过异源多肽连接至第二Fab。在一些实施方案中，异源多肽是人血清白蛋白。在一些实施方案中，异源多肽是XTEN(例如，AE144、AE288)。在一些实施方案中，第一Fab通过聚乙二醇(PEG)连接至第二Fab。在某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽各自包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含与SEQID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112。在某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽在12个或更少个氨基酸残基处不同于SEQ IDNO:2的氨基酸7-112中列出的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一多肽和/或第二多肽在可形成链间二硫键的SEQ ID NO:2的半胱氨酸残基处含有不是半胱氨酸的氨基酸。在某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽含有IgM CH2结构域或其片段中N-连接糖基化位点的突变，使得N-连接糖基化位点不被糖基化。例如，IgM CH2结构域N-连接糖基化位点的天冬酰胺和/或丝氨酸可以被另一种氨基酸取代，以防止该基序的糖基化。在某些实施方案中，本公开提供了编码上述双特异性抗体的一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，提供了包含上述双特异性抗体的表达载体。在其他实施方案中，提供了包含双特异性抗体或表达载体的宿主细胞。在其他实施方案中，提供了制备双特异性抗体的方法，其包括在引起双特异性抗体表达的条件下培养上述宿主细胞，以及从细胞培养物中分离双特异性抗体。在某些实施方案中，将分离的双特异性抗体配制为用于向有需要的人受试者施用的无菌组合物。
在另一方面，本公开提供了一种四价双特异性抗体，其包含：特异性结合第一抗原的第一表位的完整IgG抗体，完整IgG抗体包含第一CH3结构域和第二CH3结构域；以及第一Fab和第二Fab。第一Fab包含第一重链可变结构域(第一VH)和第一轻链可变结构域(第一VL)，其中第一VH和第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第二表位或第二抗原的第一可变区。第二Fab包含第二重链可变结构域(第二VH)和第二轻链可变结构域(第二VL)，其中第二VH和第二VL配对以形成特异性结合与第一Fab相同的表位的第二可变区。第一VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第一多肽，所述第一多肽包含与人免疫球蛋白E(IgE)的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸9-107具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第二多肽，所述第二多肽包含与人IgE的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸9-107具有至少80％同一性的氨基酸序列。第二VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第三多肽，所述第三多肽包含与人IgE的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸9-107具有至少80％同一性的氨基酸序列。第二VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第四多肽，所述第四多肽包含与人IgE的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸9-107具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一Fab连接至完整IgG抗体的第一CH3结构域的C-末端，并且第二Fab连接至完整IgG抗体的第二CH3结构域的C-末端。
在此方面的一些实施方案中，第一Fab通过第一接头连接至完整抗体的第一CH3结构域的C-末端，并且第二Fab通过第二接头连接至完整抗体的第二CH3结构域的C-末端。在某些实施方案中，第一接头连接完整抗体的第一CH3结构域的C-末端和第一VH的N-末端。在某些实施方案中，第一接头连接完整抗体的第一CH3结构域的C-末端和第一VL的N-末端。在某些实施方案中，第一接头连接完整抗体的第一CH3结构域的C-末端和第一多肽的N-末端。在某些实施方案中，第一接头连接完整抗体的第一CH3结构域的C-末端和第二多肽的N-末端。在某些实施方案中，第二接头连接完整抗体的第一CH3结构域的C-末端和第二VH的N-末端。在某些实施方案中，第二接头连接完整抗体的第一CH3结构域的C-末端和第二VL的N-末端。在某些实施方案中，第二接头连接完整抗体的第一CH3结构域的C-末端和第三多肽的N-末端。在某些实施方案中，第二接头连接完整抗体的第一CH3结构域的C-末端和第四多肽的N-末端。在某些实施方案中，第一和第二接头是肽接头。在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和/或第四多肽包含SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和/或第四多肽包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列的氨基酸9-107具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和/或第四多肽包含SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列的氨基酸9-107。在一些实施方案中，第一多肽和第三多肽各自包含与SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽和第三多肽各自包含SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，第二多肽和第四多肽各自包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二多肽和第四多肽各自包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和/或第四多肽在至少12个氨基酸残基处不同于SEQ ID NO:1的氨基酸9-107中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开提供了编码上述双特异性抗体的一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，提供了包含上述双特异性抗体的表达载体。在其他实施方案中，提供了包含双特异性抗体或表达载体的宿主细胞。在其他实施方案中，提供了制备双特异性抗体的方法，其包括在引起双特异性抗体表达的条件下培养上述宿主细胞，以及从细胞培养物中分离双特异性抗体。在某些实施方案中，将分离的双特异性抗体配制为用于向有需要的人受试者施用的无菌组合物。
在另一方面，本公开提供了一种四价双特异性抗体，其包含：特异性结合第一抗原的第一表位的完整IgG抗体，完整IgG抗体包含第一CH3结构域和第二CH3结构域；以及第一Fab和第二Fab。第一Fab包含第一重链可变结构域(第一VH)和第一轻链可变结构域(第一VL)，其中第一VH和第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第二表位或第二抗原的第一可变区。第二Fab包含第二重链可变结构域(第二VH)和第二轻链可变结构域(第二VL)，其中第二VH和第二VL配对以形成特异性结合与第一Fab相同的表位的第二可变区。第一VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第一多肽，所述第一多肽包含与人免疫球蛋白M(IgM)的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸7-112具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第二多肽，所述第二多肽包含与人IgM的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸7-112具有至少80％同一性的氨基酸序列。第二VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第三多肽，所述第三多肽包含与人IgM的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸7-112具有至少80％同一性的氨基酸序列。第二VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第四多肽，所述第四多肽包含与人IgM的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸7-112具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一Fab连接至完整IgG抗体的第一CH3结构域的C-末端，并且第二Fab连接至完整IgG抗体的第二CH3结构域的C-末端。
在此方面的一些实施方案中，第一Fab通过第一接头连接至完整抗体的第一CH3结构域的C-末端，并且第二Fab通过第二接头连接至完整抗体的第二CH3结构域的C-末端。在某些实施方案中，第一接头连接完整抗体的第一CH3结构域的C-末端和第一VH的N-末端。在某些实施方案中，第一接头连接完整抗体的第一CH3结构域的C-末端和第一VL的N-末端。在某些实施方案中，第一接头连接完整抗体的第一CH3结构域的C-末端和第一多肽的N-末端。在某些实施方案中，第一接头连接完整抗体的第一CH3结构域的C-末端和第二多肽的N-末端。在某些实施方案中，第二接头连接完整抗体的第一CH3结构域的C-末端和第二VH的N-末端。在某些实施方案中，第二接头连接完整抗体的第一CH3结构域的C-末端和第二VL的N-末端。在某些实施方案中，第二接头连接完整抗体的第一CH3结构域的C-末端和第三多肽的N-末端。在某些实施方案中，第二接头连接完整抗体的第一CH3结构域的C-末端和第四多肽的N-末端。在某些实施方案中，第一和第二接头是肽接头。在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和/或第四多肽包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和/或第四多肽包含与SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和/或第四多肽包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112。在某些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和/或第四多肽在至少12个氨基酸残基处不同于SEQ ID NO:2的氨基酸7-112中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开提供了编码上述双特异性抗体的一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，提供了包含上述双特异性抗体的表达载体。在其他实施方案中，提供了包含双特异性抗体或表达载体的宿主细胞。在其他实施方案中，提供了制备双特异性抗体的方法，其包括在引起双特异性抗体表达的条件下培养上述宿主细胞，以及从细胞培养物中分离双特异性抗体。在某些实施方案中，将分离的双特异性抗体配制为用于向有需要的人受试者施用的无菌组合物。
在另一方面，本公开涉及一种包含第一Fab和第二Fab的四价双特异性抗体，其中第一Fab包含第一重链可变结构域(第一VH)和第一轻链可变结构域(第一VL)，其中第一VH和第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一表位的第一可变区，并且其中第二Fab包含第二重链可变结构域(第二VH)和第二轻链可变结构域(第二VL)，其中第二VH和第二VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一表位的第二可变区。四价双特异性抗体还包括完整抗体，所述完整抗体包含含有第一IgG CH2结构域和第一IgG CH3结构域的第一重链、含有第二IgG CH2结构域和第二IgG CH3结构域的第二重链、第一轻链、以及第二轻链，其中抗体包含第三VH和第三VL以及第四VH和第四VL，其中第三VH和第三VL配对以形成特异性结合第二抗原的表位的第三可变区，并且其中第四VH和第四VL配对以形成特异性结合第二抗原的相同表位的第四可变区。第三VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第一多肽，所述第一多肽包含与人免疫球蛋白E(IgE)的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸9-107具有至少80％同一性的氨基酸序列。第三VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第二多肽，所述第二多肽包含与人IgE的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸9-107具有至少80％同一性的氨基酸序列。第四VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第三多肽，所述第三多肽包含与人IgE的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸9-107具有至少80％同一性的氨基酸序列。第四VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第四多肽，所述第四多肽包含与人IgE的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸9-107具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一多肽连接至第一IgG CH2结构域的N-末端，并且第三多肽连接至第二IgG CH2结构域的N-末端。第一Fab连接至第一IgG CH3结构域的C-末端，并且第二Fab连接至第二IgG CH3结构域的C-末端。
在此方面的一些实施方案中，第一Fab通过第一接头连接至完整抗体的第一CH3结构域的C-末端，并且第二Fab通过第二接头连接至完整抗体的第二CH3结构域的C-末端。在某些实施方案中，第一和第二接头是肽接头。在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和/或第四多肽包含SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和/或第四多肽包含与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列的氨基酸9-107具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和/或第四多肽包含SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列的氨基酸9-107。在一些实施方案中，第一多肽和第三多肽各自包含与SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽和第三多肽各自包含SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，第二多肽和第四多肽各自包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二多肽和第四多肽各自包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和/或第四多肽在至少12个氨基酸残基处不同于SEQ ID NO:1的氨基酸9-107中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开提供了编码上述双特异性抗体的一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，提供了包含上述双特异性抗体的表达载体。在其他实施方案中，提供了包含双特异性抗体或表达载体的宿主细胞。在其他实施方案中，提供了制备双特异性抗体的方法，其包括在引起双特异性抗体表达的条件下培养上述宿主细胞，以及从细胞培养物中分离双特异性抗体。在某些实施方案中，将分离的双特异性抗体配制为用于向有需要的人受试者施用的无菌组合物。
在另一方面，本公开涉及一种包含第一Fab和第二Fab的四价双特异性抗体，其中第一Fab包含第一重链可变结构域(第一VH)和第一轻链可变结构域(第一VL)，其中第一VH和第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一表位的第一可变区，并且其中第二Fab包含第二重链可变结构域(第二VH)和第二轻链可变结构域(第二VL)，其中第二VH和第二VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一表位的第二可变区。四价双特异性抗体还包括完整抗体，所述完整抗体包含含有第一IgG CH2结构域和第一IgG CH3结构域的第一重链、包含第二IgG CH2结构域和第二IgG CH3结构域的第二重链、第一轻链、以及第二轻链，其中抗体包含第三VH和第三VL以及第四VH和第四VL，其中第三VH和第三VL配对以形成特异性结合第二抗原的表位的第三可变区，并且其中第四VH和第四VL配对以形成特异性结合第二抗原的相同表位的第四可变区。第三VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第一多肽，所述第一多肽包含与人免疫球蛋白M(IgM)的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸7-112具有至少80％同一性的氨基酸序列。第三VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第二多肽，所述第二多肽包含与人IgM的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸7-112具有至少80％同一性的氨基酸序列。第四VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第三多肽，所述第三多肽包含与人IgM的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸7-112具有至少80％同一性的氨基酸序列。第四VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第四多肽，所述第四多肽包含与人IgM的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸7-112具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一多肽连接至第一IgG CH2结构域的N-末端，并且第三多肽连接至第二IgG CH2结构域的N-末端。第一Fab连接至第一IgG CH3结构域的C-末端，并且第二Fab连接至第二IgG CH3结构域的C-末端。
在此方面的一些实施方案中，第一Fab通过第一接头连接至完整抗体的第一CH3结构域的C-末端，并且第二Fab通过第二接头连接至完整抗体的第二CH3结构域的C-末端。在某些实施方案中，第一和第二接头是肽接头。在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和/或第四多肽包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和/或第四多肽包含与SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和/或第四多肽包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112。在某些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽和/或第四多肽在至少12个氨基酸残基处不同于SEQ ID NO:2的氨基酸7-112中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开提供了编码上述双特异性抗体的一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，提供了包含上述双特异性抗体的表达载体。在其他实施方案中，提供了包含双特异性抗体或表达载体的宿主细胞。在其他实施方案中，提供了制备双特异性抗体的方法，其包括在引起双特异性抗体表达的条件下培养上述宿主细胞，以及从细胞培养物中分离双特异性抗体。在某些实施方案中，将分离的双特异性抗体配制为用于向有需要的人受试者施用的无菌组合物。
在另一方面，本公开提供了一种异源二聚化模块，其包含：第一IgG1 CH3结构域，其具有与SEQ ID NO:11中列出的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中第364位和第370位氨基酸为赖氨酸并且第409位氨基酸为丝氨酸；以及第二IgG1 CH3结构域，其具有与SEQ ID NO:11中列出的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中第370位氨基酸为丝氨酸并且第405位和第409位氨基酸为赖氨酸。氨基酸位置基于EU编号系统。第一IgG1CH3结构域和第二IgG1 CH3配对形成异二聚体。
在此方面的某些实施方案中，异源二聚化模块包含第一IgG1 CH2结构域和第二IgG1 CH2结构域，其中第一IgG1 CH2结构域(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第一IgG1CH3结构域的N-末端并且第二IgG1 CH2结构域(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第二IgG1 CH3结构域的N-末端。
在一些实施方案中，异源二聚化模块包括包含两条多肽链的第一Fab，其中Fab的两条多肽链中的一条的C-末端连接至第一铰链区的N-末端，并且其中第一铰链区连接至第一IgG1 CH2结构域的N-末端。
在其他实施方案中，异源二聚化模块包含将第一IgG1 CH3结构域的C-末端连接至与第二IgG1 CH2结构域的N-末端相连接的第二铰链区的N-末端的接头。在某些实施方案中，异源二聚化模块包括通过第二铰链区连接至第二IgG1 CH2结构域的N-末端的第二Fab。
在某些实施方案中，异源二聚化模块包含VH结构域、CH1结构域、VL结构域以及CL结构域。VH结构域的C-末端连接至CH1结构域的N-末端，CH1结构域的C-末端连接至第一铰链区的N-末端，并且第一铰链区的C-末端连接至与第一IgG1 CH3结构域直接连接的第一IgG1 CH2结构域的N-末端。VL结构域的C-末端连接至CL结构域的N-末端，CL结构域的C-末端连接至第二铰链区的N-末端，并且第二铰链区的C-末端连接至与第二IgG1 CH3结构域直接连接的第二IgG1 CH2结构域的N-末端。VH结构域和VL结构域配对形成特异性结合抗原的可变区。
在某些实施方案中，异源二聚化模块包含第一VH和第一VL以及第二VH和第二VL。第一VH和第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一可变区。第二VH和第二VL配对以形成特异性结合第一抗原的不同表位或第二抗原的第二可变区。在一些情况下，第一VL的氨基酸序列与第二VL的氨基酸序列相同。
在某些实施方案中，异源二聚化模块包含第一IgG4 CH2结构域和第二IgG4 CH2结构域，其中第一IgG4 CH2结构域(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第一IgG1 CH3结构域的N-末端并且第二IgG4 CH2结构域(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第二IgG1 CH3结构域的N-末端。在一些情况下，异源二聚化模块包括包含两条多肽链的第一Fab，其中Fab的两条多肽链中的一条的C-末端连接至第一IgG4铰链区的N-末端，并且其中第一IgG4铰链区连接至第一IgG4 CH2结构域的N-末端。在一些情况下，第一IgG4铰链区包含S228P突变(EU编号)。在一些情况下，异源二聚化模块包含将第一IgG1 CH3结构域的C-末端连接至与第二IgG4 CH2结构域的N-末端相连接的第二IgG4铰链区的N-末端的接头。在某些情况下，第二IgG4铰链区包含S228P突变(EU编号)。在一些情况下，异源二聚化模块包括通过第二IgG4铰链区连接至第二IgG4 CH2结构域的N-末端的第二Fab。在某些情况下，第二IgG4铰链区包含S228P突变(EU编号)。
在一些实施方案中，异源二聚化模块包含VH结构域、CH1结构域、VL结构域以及CL结构域。VH结构域的C-末端连接至CH1结构域的N-末端，CH1结构域的C-末端连接至第一IgG4铰链区的N-末端，并且第一IgG4铰链区的C-末端连接至与第一IgG1 CH3结构域直接连接的第一IgG4 CH2结构域的N-末端。VL结构域的C-末端连接至CL结构域的N-末端，CL结构域的C-末端连接至第二IgG4铰链区的N-末端，并且第二IgG4铰链区的C-末端连接至与第二IgG1 CH3结构域直接连接的第二IgG4 CH2结构域的N-末端。VH结构域和VL结构域配对形成特异性结合抗原的可变区。在一些情况下，第一IgG4铰链区和第二IgG4铰链区各自包含S228P突变(EU编号)。
在一些实施方案中，异源二聚化模块包含第一VH和第一VL以及第二VH和第二VL。第一VH和第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一可变区。第二VH和第二VL配对以形成特异性结合第一抗原的不同表位或第二抗原的第二可变区。在一些情况下，第一VL的氨基酸序列与第二VL的氨基酸序列相同。
在某些实施方案中，本公开的特征在于编码上述异源二聚化模块的一种或多种多核苷酸。在一些情况下，其特征在于包含一种或多种多核苷酸的一种或多种表达载体。在其他情况下，提供了包含一种或多种多核苷酸或一种或多种表达载体的宿主细胞。在一些情况下，涵盖了产生异源二聚化模块的方法。该方法包括在引起异源二聚化模块表达的条件下培养宿主细胞以及其分离。
在另一方面，本公开涉及一种异源二聚化模块，其包含：第一IgG1 CH3结构域，其具有与SEQ ID NO:11中列出的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中第364位和第370位氨基酸为赖氨酸并且第409位氨基酸为亮氨酸；以及第二IgG1 CH3结构域，其具有与SEQ ID NO:11中列出的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中第370位氨基酸为丝氨酸，第397位氨基酸为异亮氨酸，并且第405位和第409位氨基酸为赖氨酸。氨基酸位置基于EU编号系统。第一IgG1 CH3结构域和第二IgG1 CH3配对形成异二聚体。
在此方面的某些实施方案中，异源二聚化模块包含第一IgG1 CH2结构域和第二IgG1 CH2结构域，其中第一IgG1 CH2结构域(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第一IgG1CH3结构域的N-末端并且第二IgG1 CH2结构域(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第二IgG1 CH3结构域的N-末端。
在一些实施方案中，异源二聚化模块包括包含两条多肽链的第一Fab，其中Fab的两条多肽链中的一条的C-末端连接至第一铰链区的N-末端，并且其中第一铰链区连接至第一IgG1 CH2结构域的N-末端。
在其他实施方案中，异源二聚化模块包含将第一IgG1 CH3结构域的C-末端连接至与第二IgG1 CH2结构域的N-末端相连接的第二铰链区的N-末端的接头。在某些实施方案中，异源二聚化模块包含通过第二铰链区连接至第二IgG1 CH2结构域的N-末端的第二Fab。
在某些实施方案中，异源二聚化模块包含VH结构域、CH1结构域、VL结构域以及CL结构域。VH结构域的C-末端连接至CH1结构域的N-末端，CH1结构域的C-末端连接至第一铰链区的N-末端，并且第一铰链区的C-末端连接至与第一IgG1 CH3结构域直接连接的第一IgG1 CH2结构域的N-末端。VL结构域的C-末端连接至CL结构域的N-末端，CL结构域的C-末端连接至第二铰链区的N-末端，并且第二铰链区的C-末端连接至与第二IgG1 CH3结构域直接连接的第二IgG1 CH2结构域的N-末端。VH结构域和VL结构域配对形成特异性结合抗原的可变区。
在某些实施方案中，异源二聚化模块包含第一VH和第一VL以及第二VH和第二VL。第一VH和第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一可变区。第二VH和第二VL配对以形成特异性结合第一抗原的不同表位或第二抗原的第二可变区。在一些情况下，第一VL的氨基酸序列与第二VL的氨基酸序列相同。
在某些实施方案中，异源二聚化模块包含第一IgG4 CH2结构域和第二IgG4 CH2结构域，其中第一IgG4 CH2结构域(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第一IgG1 CH3结构域的N-末端并且第二IgG4 CH2结构域(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第二IgG1 CH3结构域的N-末端。在一些情况下，异源二聚化模块包括包含两条多肽链的第一Fab，其中Fab的两条多肽链中的一条的C-末端连接至第一IgG4铰链区的N-末端，并且其中第一IgG4铰链区连接至第一IgG4 CH2结构域的N-末端。在一些情况下，第一IgG4铰链区包含S228P突变(EU编号)。在一些情况下，异源二聚化模块包含将第一IgG1 CH3结构域的C-末端连接至与第二IgG4 CH2结构域的N-末端相连接的第二IgG4铰链区的N-末端的接头。在某些情况下，第二IgG4铰链区包含S228P突变(EU编号)。在一些情况下，异源二聚化模块包括通过第二IgG4铰链区连接至第二IgG4 CH2结构域的N-末端的第二Fab。在某些情况下，第二IgG4铰链区包含S228P突变(EU编号)。
在一些实施方案中，异源二聚化模块包含VH结构域、CH1结构域、VL结构域以及CL结构域。VH结构域的C-末端连接至CH1结构域的N-末端，CH1结构域的C-末端连接至第一IgG4铰链区的N-末端，并且第一IgG4铰链区的C-末端连接至与第一IgG1 CH3结构域直接连接的第一IgG4 CH2结构域的N-末端。VL结构域的C-末端连接至CL结构域的N-末端，CL结构域的C-末端连接至第二IgG4铰链区的N-末端，并且第二IgG4铰链区的C-末端连接至与第二IgG1 CH3结构域直接连接的第二IgG4 CH2结构域的N-末端。VH结构域和VL结构域配对形成特异性结合抗原的可变区。在一些情况下，第一IgG4铰链区和第二IgG4铰链区各自包含S228P突变(EU编号)。
在一些实施方案中，异源二聚化模块包含第一VH和第一VL以及第二VH和第二VL。第一VH和第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一可变区。第二VH和第二VL配对以形成特异性结合第一抗原的不同表位或第二抗原的第二可变区。在一些情况下，第一VL的氨基酸序列与第二VL的氨基酸序列相同。
在某些实施方案中，本公开的特征在于编码上述异源二聚化模块的一种或多种多核苷酸。在一些情况下，其特征在于包含一种或多种多核苷酸的一种或多种表达载体。在其他情况下，提供了包含一种或多种多核苷酸或一种或多种表达载体的宿主细胞。在一些情况下，涵盖了产生异源二聚化模块的方法。该方法包括在引起异源二聚化模块表达的条件下培养宿主细胞以及其分离。
在另一方面，本公开提供了一种包含第一VH和第一VL的双特异性抗体，其中第一VH和第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一表位的第一可变区。第一VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第一多肽，所述第一多肽包含与人免疫球蛋白E(IgE)的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸9-107具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第二多肽，所述第二多肽包含与人IgE的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸9-107具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一多肽和第二多肽配对形成二聚体。双特异性抗体还包含第二VH和第二VL，其中第二VH和第二VL配对以形成特异性结合第一抗原的第二表位或第二抗原的第二可变区。第二VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CH1结构域。第二VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CL结构域。CH1结构域和CL结构域配对形成二聚体。双特异性抗体还包括异源二聚化模块，其包含具有与SEQ ID NO:11中列出的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的第一IgG1 CH3结构域，其中第364位和第370位氨基酸为赖氨酸并且第409位氨基酸为丝氨酸。异源二聚化模块还包含具有与SEQ ID NO:11中列出的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的第二IgG1CH3结构域，其中第370位氨基酸为丝氨酸并且第405位和第409位氨基酸为赖氨酸。以上氨基酸位置全部基于EU编号系统。(重要的是要注意，IgE CH2结构域可以是包含第一IgG1CH3结构域或第二IgG1 CH3结构域的多肽的一部分。)
在另一方面，本公开提供了一种包含第一VH和第一VL的双特异性抗体，其中第一VH和第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一表位的第一可变区。第一VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第一多肽，所述第一多肽包含与人免疫球蛋白E(IgE)的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸9-107具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第二多肽，所述第二多肽包含与人IgE的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸9-107具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一多肽和第二多肽配对形成二聚体。双特异性抗体还包含第二VH和第二VL，其中第二VH和第二VL配对以形成特异性结合第一抗原的第二表位或第二抗原的第二可变区。第二VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CH1结构域。第二VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CL结构域。CH1结构域和CL结构域配对形成二聚体。双特异性抗体还包括异源二聚化模块，其包含具有与SEQ ID NO:11中列出的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的第一IgG1 CH3结构域，其中第364位和第370位氨基酸为赖氨酸并且第409位氨基酸为亮氨酸。异源二聚化模块还包具有与SEQ ID NO:11中列出的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的第二IgG1 CH3结构域，其中第370位氨基酸为丝氨酸，第397位氨基酸为异亮氨酸，并且第405位和第409位氨基酸为赖氨酸。以上氨基酸位置全部基于EU编号系统。(重要的是要注意，IgE CH2结构域可以是包含第一IgG1 CH3结构域或第二IgG1 CH3结构域的多肽的一部分。)
在以上两个方面的一些实施方案中，双特异性抗体包含两个IgG1 CH2结构域。在以上两个方面的一些实施方案中，双特异性抗体包含两个IgG4 CH2结构域。在一些实施方案中，单个多肽链包含第一VH、第一多肽、以及第一IgG1 CH3结构域。在一些实施方案中，单个多肽链包含第一VH、第一多肽、以及第二IgG1 CH3结构域。在其他实施方案中，单个多肽链包含第一VL、第二多肽、以及第一IgG1 CH3结构域。在其他实施方案中，单个多肽链包含第一VL、第二多肽、以及第二IgG1 CH3结构域。在一些实施方案中，第二单个多肽链包含第二VH、CH1结构域、以及第二IgG1 CH3结构域。在一些实施方案中，第二单个多肽链包含第二VH、CH1结构域、以及第一IgG1 CH3结构域。在一些实施方案中，第二单个多肽链包含第二VL、CL结构域、以及第二IgG1 CH3结构域。在一些实施方案中，第二单个多肽链包含第二VL、CL结构域、以及第一IgG1 CH3结构域。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含SEQID NO:1中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含与SEQ IDNO:1中列出的氨基酸序列的氨基酸9-107具有至少90％同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列的氨基酸9-107。在其他实施方案中，第一多肽包含与SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，第二多肽包含与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二多肽包含SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽在至少12个氨基酸残基处不同于SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自在不形成链内二硫键的SEQID NO:1的两个半胱氨酸残基中的至少一个处含有不是半胱氨酸的氨基酸。在某些实施方案中，第一多肽和第二多肽在N-连接糖基化位点处具有一个或多个突变，使得第一多肽和第二多肽在N-连接糖基化位点处不被糖基化。在其他实施方案中，第一多肽或第二多肽在N-连接糖基化位点处具有一个或多个突变，使得第一多肽和第二多肽在N-连接糖基化位点处不被糖基化。这些突变可以是N连接糖基化位点的天冬酰胺或苏氨酸或丝氨酸突变成其他一个或多个氨基酸。
在另一方面，本公开提供了一种包含第一VH和第一VL的双特异性抗体，其中第一VH和第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一表位的第一可变区。第一VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第一多肽，所述第一多肽包含与人免疫球蛋白M(IgM)的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸7-112具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第二多肽，所述第二多肽包含与人IgM的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸7-112具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一多肽和第二多肽配对形成二聚体。双特异性抗体还包含第二VH和第二VL，其中第二VH和第二VL配对以形成特异性结合第一抗原的第二表位或第二抗原的第二可变区。第二VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CH1结构域。第二VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CL结构域，并且其中CH1结构域和CL结构域配对形成二聚体。双特异性抗体还包括异源二聚化模块，其包含：第一IgG1 CH3结构域，其具有与SEQ ID NO:11中列出的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中第364位和第370位氨基酸为赖氨酸并且第409位氨基酸为丝氨酸；以及第二IgG1 CH3结构域，其具有与SEQ ID NO:11中列出的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中第370位氨基酸为丝氨酸并且第405位和第409位氨基酸为赖氨酸。以上氨基酸位置基于EU编号系统。
在另一方面，本公开涉及一种包含第一VH和第一VL的双特异性抗体，其中第一VH和第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一表位的第一可变区。第一VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第一多肽，所述第一多肽包含与人免疫球蛋白M(IgM)的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸7-112具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至第二多肽，所述第二多肽包含与人IgM的CH2结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的氨基酸7-112具有至少80％同一性的氨基酸序列。第一多肽和第二多肽配对形成二聚体。双特异性抗体还包含第二VH和第二VL，其中第二VH和第二VL配对以形成特异性结合第一抗原的第二表位或第二抗原的第二可变区。第二VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CH1结构域。第二VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CL结构域，并且其中CH1结构域和CL结构域配对形成二聚体。双特异性抗体还包括异源二聚化模块，其包含：第一IgG1 CH3结构域，其具有与SEQ ID NO:11中列出的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中第364位和第370位氨基酸为赖氨酸并且第409位氨基酸为亮氨酸；以及第二IgG1 CH3结构域，其具有与SEQ ID NO:11中列出的序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中第370位氨基酸为丝氨酸，第397位氨基酸为异亮氨酸，并且第405位和第409位氨基酸为赖氨酸。以上氨基酸位置基于EU编号系统。
在以上两个方面的一些实施方案中，双特异性抗体包含两个IgG1 CH2结构域。在以上两个方面的一些实施方案中，双特异性抗体包含两个IgG4 CH2结构域。在一些实施方案中，单个多肽链包含第一VH和第一IgG1 CH3结构域。在一些实施方案中，单个多肽链包含第一VH和第二IgG1 CH3结构域。在其他实施方案中，单个多肽链包含第一VL和第一IgG1CH3结构域。在其他实施方案中，单个多肽链包含第一VL和第二IgG1 CH3结构域。在一些实施方案中，单个多肽链包含第二VH和第二IgG1 CH3结构域。在一些实施方案中，单个多肽链包含第二VH和第一IgG1 CH3结构域。在一些实施方案中，单个多肽链包含第二VH和第二IgG1 CH3结构域。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含与SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112具有至少90％同一性的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一多肽和/或第二多肽包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112。在某些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽在至少12个氨基酸残基处不同于SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自在不形成链内二硫键的SEQ ID NO:2的半胱氨酸残基处含有不是半胱氨酸的氨基酸。在某些实施方案中，第一多肽和第二多肽在N-连接糖基化位点处具有一个或多个突变，使得第一多肽和第二多肽在N-连接糖基化位点处不被糖基化。在其他实施方案中，第一多肽或第二多肽在N-连接糖基化位点处具有一个或多个突变，使得第一多肽和第二多肽在N-连接糖基化位点处不被糖基化。这些突变可以是N连接糖基化位点的天冬酰胺或苏氨酸或丝氨酸突变成其他一个或多个氨基酸。在某些实施方案中，本公开提供了编码上述双特异性抗体的一种或多种多核苷酸。在一些实施方案中，提供了包含上述双特异性抗体的表达载体。在其他实施方案中，提供了包含双特异性抗体或表达载体的宿主细胞。在其他实施方案中，提供了制备双特异性抗体的方法，其包括在引起双特异性抗体表达的条件下培养上述宿主细胞，以及从细胞培养物中分离双特异性抗体。在某些实施方案中，将分离的双特异性抗体配制为用于向有需要的人受试者施用的无菌组合物。
除非另外定义，本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可用于实践或测试本发明，下文描述示例性方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容通过引用并入。如发生矛盾，以包括定义的本专利申请为准。材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在是限制性的。
根据以下详细描述并且根据权利要求书，本发明的其他特征和优点将显而易见。
附图简述
图1是由不对称抗体中的错配产生的不想要的副产物的图解表示。该图示出，当两种抗体共表达时，可通过轻链和/或重链的错配形成若干不想要的副产物。期望的不对称抗体可能占据极小分数，并且该期望抗体的纯化可能存在困难。
图2是由赖氨酸重新定位引起的CH3异源二聚化的图解表示。赖氨酸370和赖氨酸409堆叠在人IgG1的野生型CH3结构域的正常头-尾同二聚体中。单体A中的S364K/K409S突变和单体B中的K370S/F405K突变使堆叠在赖氨酸上的取向颠倒，从而使得形成A/B异二聚体，但导致同二聚体(底部)中的冲突。因此，赖氨酸重新定位提供了重链异源二聚化的有效策略。上文提到的氨基酸位置基于EU编号。
图3A是IgG/Fc异二聚体的SDS-PAGE分析的描绘。通过SDS page分析蛋白A纯化的异二聚体的等分试样。IgG1与Fc之间的异二聚体是主要物类。加载杵-臼(Knobs-into-Holes)的两个级分。半设计MP1显示出大量的异二聚体，但缺乏防止形成Fc二聚体的突变，因此不含Fc单体。
图3B是示出通过LC-MS估算的组分的摩尔比和相对量的柱状图。
图3C是通过DSC测定的纯化异二聚体的熔解温度(melting temperature)的描绘。
图4A示出异源二聚化突变体的表达和半抗体形成。用含有相同Fab(M60-A02抗EGFR)的各种比例的mp4a和mp4b重链转染CHO细胞。通过SDS PAGE分析表达蛋白质中的半抗体形成
图4B示出用于定量半抗体形成的一系列质谱。样品的MS谱显示，在1:1的转染比下存在最大量的异二聚体和最少的同二聚体。
图5A是轻链配对问题(即E-fab的产生)的应用解决方案之一的图解表示。在E-fab中，CH1和CL结构域被IgE CH2(Cε2)结构域取代，其形成天然二聚体。
图5B是人Cε2结构域(白色)和人IgG1 CH1/κ恒定结构域(黑色)的结构的叠加，其示出Ig-折叠的总体相似性。Cε2结构域在界面上部以不同的角度且以较大的距离配对，但在下部界面中进行更紧密的填充。在β-链A(以球体表示)开始处的Pro在CH1/CL和Cε2结构域中处于非常相似的位置和取向。
图5C是人IgG1 CH1和κ恒定区与Cε2结构域和E-Fab重链和轻链的序列比对。利用上方所示的IMGT编号将序列对齐，Ig-折叠的7条β-链由箭头指示，β-链A起始处的保守Pro为粗体并加下划线。E-Fab和链间二硫键半胱氨酸中的agly突变(N38Q)也为粗体并加下划线。
图5D是来自人、黑猩猩(chimpanzee)、小鼠、大鼠和兔的IgE CH2结构域的序列比对。相同的残基示出为点。
图6A是测试轻链配对的策略的示意图。Fab A的重链(HCA)与HSA融合，而Fab B的轻链(LCB)在N-末端用GFP标记。链的正确配对可以通过Fab的分子量来检查。
图6B是通过SDS-page进行的Fab配对的分析。所示的HSA标记的抗EGFR M60-A02Fab或E-Fab与GFP-标记的Fab抗IGF-1R C06共表达(还参见表3)。重链和轻链的正确配对在非还原条件下产生114和74kDa处的条带，而47或140kDa处的条带指示错配。
图6C是通过SDS-page进行的Fab配对的分析。将抗IGF-1R Fab C06构建为E-fab并且与另一抗IGF-1R Fab(G11)的配对的轻链如图6B中那样进行测试。
图6D是描绘抗IGF-1R E-Fab的结合的图，如通过Octet所测试的。Fab单独表达，在蛋白A离心柱上纯化，并在Octet结合(300nM、100nM和30nM)中用于加载到His-tips上的可溶性IGF1-R。
图7是具有E-Fab和赖氨酸重新定位的不对称IgG的示意图。一个Fab臂的恒定结构域被替换为E-Fab，而另一个Fab臂含有野生型IgG CH1/CL结构域以解决轻链配对问题。赖氨酸重新定位突变被包括在两条重链的CH3结构域中以加强异源二聚化。
图8A是通过SDS-PAGE进行的在CHO-S细胞和上清液中表达的EGFR/IGF-1R双特异性抗体的分析。E体(E-body)E0和E2含有抗EGFR作为E-Fab，而IgG1-异二聚体对照不含轻链解决方案。
图8B是来自图8A的不对称IgG的质谱分析的表示，其示出在E体中没有轻链错配，但在对照中具有显著量的具有错配LC的抗体。在任一样品中均不可检测到重链同二聚体。
图8C是描绘双特异性抗体与His标记的EGFR的结合的图。在加载his标记的配体(5μg/mL)之后，在Octet结合中使用来自CHO-S细胞的未稀释的上清液。
图8D是描绘双特异性抗体与His标记的IGF-1R的结合的图。在加载his标记的配体(5μg/mL)之后，在Octet结合中使用来自CHO-S细胞的未稀释的上清液。
图9A是描绘曲妥珠单抗/西妥昔单抗双特异性抗体与两种抗原的同时结合的图。将His标记的可溶性HER2(5μg/ml)加载到Octet tips上，从而允许在下一步骤中双特异性抗体(200nM)的捕获。EGFR(15μg/ml)的随后结合表明双特异性物质与两种配体的同时结合。
图9B是描绘图9A中所示实验的逆实验的结果的图。首先加载EGFR，然后是双特异性抗体和HER2的结合。
图10A示出具有各种弯曲(elbow)接头序列的Efab构建体。抗HER2抗体曲妥珠单抗被工程改造为Efab。表中列出了包括在轻链中的各种弯曲接头序列。除了弯曲序列(粗体)之外，序列还包括可变结构域的最后5个氨基酸以及IgE CH2结构域的前5个氨基酸。
图10B是Octet结合研究的图。Efab在CHO细胞中表达为具有西妥昔单抗的不对称IgG(如图9中所示)、纯化并用于Octet结合研究(100nM)，其中将His标记的HER2(5μg/ml)加载到抗His tips上。
图10C是通过SDS-page进行的Fab配对的分析。为了评估IgM CH2结构域是否可以像IgE CH2结构域一样很好地解决轻链配对，将两种Fab(抗EGFR M60和抗IGF-1R C06)共表达：其中一种Fab与HSA融合并且另一种Fab与GFP融合。Fab的κ和CH1恒定结构域被替换为IgM CH2结构域(所得分子命名为M-Fab)。通过SDS-PAGE进行的链配对的分析显示，M-Fab解决了在对照中突出观察到的M60与C06之间的轻链错配。
图10D是Octet结合研究的图。Efab和M-Fab在CHO-S中表达为Fab(不具有Fc)，并且上清液用于通过Octet测试与HER2的结合。
图11A示出在CHO细胞中表达且通过蛋白A纯化的包含抗EGFR M60-A02Efab和作为正常Fab的抗IGF1R M13.C06以及含有mp3异二聚体突变的IgG1agly(T299A)恒定区的双特异性抗体的凝胶照片。
图11B示出其中测试双特异性物质的同时结合的Octet研究的结果。在上图中，His标记的可溶性IGF1R(5μg/ml)与Octet tips结合，然后是双特异性抗体或相应mAb的结合。在第三步骤中，第二抗原(EGFR)与抗体-抗原复合物结合，如图所示。第三步骤中与无EGFR对照相比的阳性信号证实了同时结合。在下图中，His标记的可溶性EGFR(5μg/ml)与Octettips结合，然后是双特异性抗体或相应mAb的结合。在第三步骤中，第二抗原(IGF1R)与抗体-抗原复合物结合，如图所示。第三步骤中与无IGF1R对照相比的阳性信号证实了同时结合。
图12A是具有Efab和含有mp4异二聚体的IgG4P/IgG1恒定区的双特异性抗体的示意图。该抗体还包含在恒定结构域(IgG4P/IgG1 agly)中的N297Q取代。
图12B是如(A)中所示的双特异性抗体的凝胶的照片，所述双特异性抗体由处于两个取向上的抗HER2抗体帕妥珠单抗和抗IGF1R抗体C06产生，其中首先命名的抗体总是Efab。通过SDS-PAGE分析来自CHO细胞的蛋白-A纯化材料的等分试样。
图12C示出当使用可溶性IGF1R和HER2蛋白质由Octet测试时的结合结果。在上图中，His标记的可溶性IGF1R(5μg/ml)与Octet tips结合，然后是双特异性抗体或相应mAb的结合。在第三步骤中，第二抗原(HER2)与抗体-抗原复合物结合，如图所示。第三步骤中与无HER2对照相比的阳性信号证实了同时结合。在下图中，His标记的可溶性HER2(5μg/ml)与Octet tips结合，然后是双特异性抗体或相应mAb的结合。在第三步骤中，第二抗原(IGF1R)与抗体-抗原复合物结合，如图所示。第三步骤中与无IGF1R对照相比的阳性信号证实了同时结合。
图13A是具有与重链的C-末端融合的Efab的IgG(“Mab-Fab”)的示意图。
图13B是曲妥珠单抗和抗IGF-1R抗体C06的Mab-Fab的凝胶的照片。曲妥珠单抗和抗IGF-1R抗体C06的Mab-Fab在CHO细胞中瞬时表达并通过蛋白A纯化。SDS-PAGE显示蛋白质正确组装，形成约240kDa的Mab-Fab。
图13C示出当通过Octet测试时的结合的结果。将His标记的可溶性IGF1R或HER2(5μg/ml)加载到Octet tips上，从而允许在下一步骤中捕获双特异性抗体(200nM)。第二配体(15μg/ml)的随后结合表明双特异性抗体与两种配体的同时结合。
图14A是含有LC-Fc融合和Fc异二聚体突变的单价抗体的示意图。
图14B是使用由CHO细胞产生的LC-Fc单价抗体和相对应的二价IgG1(抗EGFR M60-A02)的凝胶的照片。蛋白-A纯化材料的SDS-PAGE显示了单价LC-Fc抗体的干净组装。
图14C是描绘在各种浓度下Octet结合研究中的单价LC-Fc和二价IgG的图。单价LC-Fc缺乏亲和结合并且观察到抗原-抗体复合物的解离。
图15A提供了具有通过HAS(左)肽接头(右)与常规Fab连接的Efab的双特异性抗体的示意图。
图15B是如图15A所示的双特异性物质的两个实例的凝胶的照片，所述双特异性物质在CHO细胞中表达，经蛋白A-纯化，并通过SDS-PAGE进行分析。抗EGFR和抗IGF1R抗体M60-A02和M13.C06分别作为Efab或常规Fab以两种取向使用。
图15C是Octet结合研究中使用的经纯化的双特异性物质的图。只有当双特异性物质先结合EGFR，然后再结合IGF-1R时，才能观察到这些双特异性物质与两种抗原的同时结合。
图15D是Octet结合研究中使用的经纯化的双特异性物质的图。当双特异性物质先结合IGF-1R，然后再结合EGFR时，未观察到这些双特异性物质与两种抗原的同时结合。
具体实施方式
双特异性抗体是一类新兴的生物制剂药物，其具有实现新的治疗作用机制的潜力。然而，存在与表达和正确形成双特异性抗体相关联的若干挑战。具体而言，必须解决两个问题以有效表达由四条不同的链组成的不对称IgG形式的双特异性抗体：所谓的重链错配问题和轻链错配问题。当有两条不同的重链和两条不同的轻链时，它们可能以几种不同的排列错配(参见图1)。因此，为了形成适当配对的双特异性抗体，两条重链必须形成异二聚体，并且每条重链必须与其同源轻链配对。本公开提供了一种双特异性抗体平台，其可以将各自结合不同表位的任何两种抗体转化成不对称IgG形式的双特异性抗体。该平台基于被称为赖氨酸重新定位的重链异源二聚化策略，以及不需要抗体可变结构域的工程改造的轻链错配问题的解决方案。在一个实施方案中，平台含有Fc区，其通过赖氨酸重新定位而在CH3结构域中被工程改造以驱动双特异性抗体的两条重链的异源二聚化。在另一个实施方案中，Fab臂中的一个的CH1和CL结构域被IgE CH2结构域(或IgM CH2结构域)或仍可与IgECH2结构域(或IgM CH2结构域)配对的其片段取代。Fab的这种工程改造可以减少或防止双特异性抗体中的轻链错配。本公开描述双特异性抗体平台的设计、工程改造和测试，其可通过共表达有效地由2种抗体生成不对称IgG。
轻链错配问题的解决方案
为了实现如图1所示的双特异性抗体中轻链(LC):重链(HC)对的正确组装，本文公开的解决方案是修饰轻链和重链的氨基酸序列，以使这些链的恒定结构域(即，CL和CH1结构域)替换为Ig-折叠结构域(或仍可在轻链和重链的Ig-折叠结构域之间形成稳定的二硫键连接的二聚体的其片段)。
在一个例子中，替换CH1和CL结构域的Ig-折叠结构域是IgE的CH2结构域(“CH2E”)、或可以与另一个CH2E形成稳定的二硫键连接的二聚体的其片段。示例性CH2E结构域的氨基酸序列提供如下：
Figure BDA0001756979290000321
在上文所示的序列中，可参与形成链间二硫键的两个半胱氨酸加粗；可形成结构域内二硫键的两个半胱氨酸加粗并为斜体；并且N连接糖基化位点加下划线。
在另一个例子中，替换重链和轻链的CH1和CL结构域的Ig-折叠结构域是IgM的CH2结构域(“CH2M”)、或可形成稳定的二硫键连接的二聚体的其片段。示例性CH2M结构域的氨基酸序列提供如下：
Figure BDA0001756979290000322
在上文所示的序列中，可参与形成链间二硫键的半胱氨酸加粗；可形成结构域内二硫键的两个半胱氨酸为斜体；并且N连接糖基化位点加下划线。
本公开提供了利用轻链配对问题的解决方案的抗体的几个实例。在一个实施方案中，抗体的特征在于具有下式的氨基酸序列：
VH1构建体：VH1-L-X-CH2E(或CH2M)；以及
VL1构建体：VL1-L-X-CH2E(或CH2M)，
其中“VH1”和“VL1”是配对形成针对第一表位的第一抗原结合位点的重链可变结构域和轻链可变结构域；其中“L”是任选接头(下文进一步描述)；其中“X”是任选的弯曲区(下文进一步描述)；并且其中“CH2E”是指SEQ ID NO:1或可与SEQ ID NO:1形成稳定的二硫键连接的二聚体的其片段(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸9-107)，并且其中“CH2M“是指SEQID NO:2或可与SEQ ID NO:2形成稳定的二硫键连接的二聚体的其片段(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸7-112)。在某些实施方案中，VH1和VL1构建体中不存在“L”和“X”中的一者或两者。
在另一个实施方案中，抗体的特征在于具有下式的氨基酸序列：
VH1构建体：VH1-X-L-CH2E(或CH2M)，以及
VL1构建体：VL1-X-L-CH2E(或CH2M)。
在又一个实施方案中，抗体的特征在于具有下式的氨基酸序列：
VH1构建体：VH1-L-X-L-CH2E(或CH2M)，以及
VL1构建体：VL1-L-X-L-CH2E(或CH2M)。
应当理解，当CH2E用于上述VH1构建体时，CH2E也用于相应的VL1构建体中。类似地，当CH2M用于上述VH1构建体时，CH2M也用于相应的VL1构建体中。上述配对的VH1和VL1构建体中的CH2E和CH2M结构域在氨基酸序列上可以是相同的；然而，它们不必相同。它们可以例如在12个或更少、11个或更少、10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸处是不同的。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，上述VH1和VL1构建体的CH2E结构域在12个或更少、11个或更少、10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、或1个氨基酸位置处是不同的。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:2相比，上述VH1和VL1构建体的CH2M结构域在12个或更少、11个或更少、10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、或1个氨基酸位置处是不同的。这些差异可以是氨基酸取代、缺失和/或插入的结果。例如，SEQ ID NO.:1或2中的N-糖基化位点可以修饰(例如，在SEQ ID NO:1的NIT序列中，可以将N残基改变为Q或将T残基改变为A或C；在SEQ ID NO:2中的NAS序列中，可以将N残基改变为Q或将S残基改变为A或C)。另选地或除此之外，形成结构域内二硫键的一个或多个半胱氨酸可仅在VH1和VL1构建体中的一个的CH2E(或CH2M)结构域中发生突变。在某些情况下，参与VH1和VL1构建体的CH2E结构域(或CH2M结构域)中链间二硫键形成的一个或多个半胱氨酸被取代(例如，取代为保守氨基酸)。此外，可以进行用于防止CH2E结构域(或CH2M结构域)的同源二聚化的突变(例如，用例如异亮氨酸或苏氨酸替换SEQ ID NO:1的第17位的丝氨酸；并且用例如甘氨酸或丝氨酸替换SEQ ID NO:1的第103位的苏氨酸)。来自人、黑猩猩、小鼠、大鼠和兔的IgE CH2结构域的比对(图5D)鉴定出在所有物种之间不保守并且可能在不消除生物活性的情况下被取代的氨基酸残基。
在一些情况下，CH2E结构域的氨基酸取代可以是保守的。保守取代是将一个氨基酸取代为具有相似特征的另一个氨基酸。保守取代包括以下组内的取代：缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。非极性疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上述极性、碱性或酸性组的一个成员被相同组的另一个成员任意取代可被认为是保守取代。
在一些情况下，CH2E结构域的氨基酸取代可以是非保守的。非保守取代包括以下那些，其中(i)具有正电性侧链的残基(例如，Arg、His或Lys)取代负电性残基(例如，Glu或Asp)或被其取代；(ii)亲水性残基(例如，Ser或Thr)取代疏水性残基(例如，Ala、Leu、Ile、Phe或Val)或被其取代；(iii)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其他残基或被其取代；或(iv)具有大体积疏水性或芳族侧链的残基(例如，Val、Ile、Phe或Trp)取代具有较小侧链(例如，Ala、Ser)或没有侧链(例如，Gly)的残基或被其取代。
在某些实施方案中，上述VH1和VL1构建体的CH2E结构域与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性，并且VH1和VL1构建体的CH2E结构域仍然可以配对在一起。在某些实施方案中，上述VH1和VL1构建体的CH2E结构域与SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性，并且VH1和VL1构建体的CH2E结构域仍然可以配对在一起。
在某些实施方案中，如果上述VH1和VL1构建体中采用CH2M结构域，那么CH2M结构域与SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性，并且VH1和VL1构建体的CH2M结构域仍然可以配对在一起。
氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用BLAST 2.0程序确定。序列比较可以使用无空位比对并使用默认参数(Blossom 62 matrix，空位存在罚分为11，每个残基的空位罚分为1，并且λ比为0.85)进行。在Altschul等人,Nucleic Acids Research,25:3389-3402(1997)中描述了BLAST程序中所用的数学算法。
在某些实施方案中，在上述VH1和VL1构建体中使用的CH2E结构域与SEQ ID NO:1具有100％同一性。在一些实施方案中，在上述VH1和VL1构建体中使用的CH2E结构域是SEQID NO:1的片段，所述片段例如，失去SEQ ID NO:1的N-末端和/或C-末端处的氨基酸，并且可以与由SEQ ID NO:1编码的多肽形成稳定的二硫键连接的二聚体。例如，SEQ ID NO:1的片段可失去在SEQ ID NO:1的N-末端和/或C-末端处的20、19、18、17、16、15、14、13、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。在某些实施方案中，在上述VH1和VL1构建体中使用的CH2E结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸2-107、3-107、4-107、5-107、6-107、7-107、8-107、9-107、10-107、11-107、12-107、13-107、14-107、15-107、16-107、17-107、18-107、19-107、或20-107或由其组成。在其他实施方案中，在上述VH1和VL1构建体中使用的CH2E结构域包含SEQID NO:1的氨基酸2-106、3-106、4-106、5-106、6-106、7-106、8-106、9-106、10-106、11-106、12-106、13-106、14-106、15-106、16-106、17-106、18-106、19-106、或20-106或由其组成。在其他实施方案中，在上述VH1和VL1构建体中使用的CH2E结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸2-105、3-105、4-105、5-105、6-105、7-105、8-105、9-105、10-105、11-105、12-105、13-105、14-105、15-105、16-105、17-105、18-105、19-105、或20-105或由其组成。在某些实施方案中，在上述VH1和VL1构建体中使用的CH2E结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸9-107、9-106、9-105、9-104、9-103、9-102、9-101、9-100、9-99、9-98、或9-97或由其组成。在所有这些实施方案中，与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列相比，在上述VH1和VL1构建体中所用的一个或两个CH2E结构域中可存在1至12个(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)取代。例如，N-连接糖基化位点可以突变(例如，NIT位点的天冬酰胺可被谷氨酰胺取代或NIT位点的苏氨酸可被丙氨酸或半胱氨酸取代)；参与链间二硫键形成的一个或两个半胱氨酸可用另一个氨基酸(例如，保守氨基酸)取代；或可向CH2E中引入防止形成重链:重链或轻链:轻链二聚体的突变(当CH2E结构域为重链和轻链的一部分时)。
在某些实施方案中，在上述VH1和VL1构建体中使用的CH2M结构域与SEQ ID NO:2具有100％同一性。在一些实施方案中，在上述VH1和VL1构建体中使用的CH2M结构域是SEQID NO:2的片段，所述片段例如，失去SEQ ID NO:2的N-末端和/或C-末端处的氨基酸，并且可以与由SEQ ID NO:2编码的多肽形成稳定的二硫键连接的二聚体。例如，SEQ ID NO:2的片段可失去在SEQ ID NO:1的N-末端和/或C-末端处的20、19、18、17、16、15、14、13、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或2个氨基酸。在某些实施方案中，在上述VH1和VL1构建体中使用的CH2M结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸2-112、3-112、4-112、5-112、6-112、7-112、8-112、9-112、10-112、11-112、12-112、13-112、14-112、15-112、16-112、17-112、18-112、19-112、或20-112或由其组成。在其他实施方案中，在上述VH1和VL1构建体中使用的CH2M结构域包含SEQID NO:2的氨基酸2-111、3-106、4-111、5-111、6-111、7-111、8-111、9-111、10-111、11-111、12-111、13-111、14-111、15-111、16-111、17-111、18-111、19-111、或20-111或由其组成。在其他实施方案中，在上述VH1和VL1构建体中使用的CH2M结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸2-110、3-110、4-110、5-110、6-110、7-110、8-110、9-110、10-110、11-110、12-110、13-110、14-110、15-110、16-110、17-110、18-110、19-110、或20-110或由其组成。在某些实施方案中，在上述VH1和VL1构建体中使用的CH2M结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸7-112、7-111、7-110、7-109、7-108、7-107、7-105、7-104、7-103、7-102、7-101、7-100、或7-99或由其组成。在所有这些实施方案中，与SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列相比，在上述VH1和VL1构建体中所用的一个或两个CH2M结构域中可存在1至12个(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)取代。例如，N-连接糖基化位点可以突变(例如，NAS位点的天冬酰胺可被谷氨酰胺取代或NAS位点的丝氨酸可被丙氨酸或半胱氨酸取代)；参与链间二硫键形成的一个或两个半胱氨酸可用另一个氨基酸(例如，保守氨基酸)取代；或可向CH2M中引入防止形成重链:重链或轻链:轻链二聚体的突变(当CH2M结构域为重链和轻链的一部分时)。
在一个实施方案中，在上述VH1构建体中使用的CH2结构域是人免疫球蛋白E的CH2结构域，其中N-糖基化位点突变为谷氨酰胺，并且前8个氨基酸被替换为人IgG1 CH1结构域的前5个氨基酸。该CH2E结构域的氨基酸序列提供如下：
Figure BDA0001756979290000381
在一个实施方案中，在上述VL1构建体中使用的CH2结构域是人免疫球蛋白E的CH2结构域，其中N-糖基化位点突变为谷氨酰胺，并且前8个氨基酸被替换为人κ结构域的前5个氨基酸。该CH2E结构域的氨基酸序列提供如下：
Figure BDA0001756979290000382
在另一个实施方案中，将在上述VH1构建体中使用的人免疫球蛋白E的示例性CH2结构域的氨基酸序列通过将SEQ ID NO:1的第17位丝氨酸替换为异亮氨酸进行制备，并且所述VH1构建体被工程改造以与上述VL1构建体形成异二聚体。下文提供了该CH2E结构域的氨基酸序列(注意，在该序列中，N-连接糖基化位点也发生了突变，并且SEQ ID NO:1的前8个氨基酸替换为IgG1 CH1的前5个氨基酸)：
Figure BDA0001756979290000391
将与上述VL1构建体的VL结构域连接的人免疫球蛋白E的示例性CH2结构域的氨基酸序列通过将SEQ ID NO:1的第103位苏氨酸替换为甘氨酸进行制备，并且所述VL1构建体被工程改造以与上述VH1构建体形成异二聚体。下文提供了该CH2E结构域的氨基酸序列(注意，在该序列中，N-连接糖基化位点也发生了突变，并且SEQ ID NO:1的前8个氨基酸替换为κ链的前5个氨基酸)：
Figure BDA0001756979290000392
在某些实施方案中，在上述VH1和VL1构建体中使用的CH2E结构域包括SEQ IDNO.:5和/或6的C-末端截短。在某些情况下，SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6的最C-末端9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸缺失。在一个具体实施方案中，在上述VH1构建体中使用的CH2E结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸1-103、1-102、1-101、1-100、1-99、1-98、1-97、1-96或1-95或由其组成。在另一个具体实施方案中，在上述VL1构建体中使用的CH2E结构域包含SEQID NO:6的氨基酸1-103、1-102、1-101、1-100、1-99、1-98、1-97、1-96或1-95或由其组成。在其他实施方案中，在上述VH1构建体中使用的CH2E结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸6-103、7-103、8-103、9-103或10-103或由其组成。在其他实施方案中，在上述VL1构建体中使用的CH2E结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸6-103、7-103、8-103、9-103或10-103或由其组成。在某些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1，上述SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6或其片段可以另外包含5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、或1个另外的突变。
在某些实施方案中，上述抗体还包含重链可变结构域“VH2”和轻链可变结构域“VL2”，其中VH2连接至CH1结构域并且VL2结构域连接至CL结构域，并且其中VH2和VL2配对以形成针对第二表位的第二抗原结合位点。在一些实施方案中，上述抗体还包含两个Fc结构域。Fc结构域包含抗体的铰链区、CH2结构域以及CH3结构域。在某些情况下，铰链、CH2和CH3结构域来自IgG1。在某些情况下，铰链和CH3结构域来自IgG4并且CH2结构域来自IgG1。在具体实施方案中，当铰链区来自IgG4时，它包括S228P(EU编号)突变。抗体的两个Fc结构域中的一个可以与抗体的两个Fab中的一个的CH2E结构域中的一个(或CH2M结构域)直接连接，或可以通过接头连接。Fc区可连接至VH1构建体或VL1构建体。Fc区可包含相对于没有突变的相同Fc区增加双特异性抗体的重链之间的异源二聚化的任何一个或多个突变。例如，Fc区可包含杵-臼突变、电转向(electrosteering)突变、或本申请的实施例1的表2中所述的其他突变。在一个具体实施方案中，双特异性抗体的Fc区包括本文所述的赖氨酸重新定位突变。
在某些实施方案中，上述抗体还包含重链可变结构域“VH2”和轻链可变结构域“VL2”，其中VH2连接至CH1结构域并且VL2结构域连接至CL结构域，并且其中VH2和VL2配对以形成针对第二表位的第二抗原结合位点，但是抗体缺乏一个或多个Fc结构域。连接至上述构建体的VH1或VL1结构域的CH2E结构域(或CH2M结构域)可以连接至包含VH2和VL2结构域的抗体。例如，VH1构建体的CH2E结构域(或CH2M结构域)的C-末端可连接至与VH2相连的CH1结构域的C-末端，或VH1构建体的CH2E结构域(或CH2M结构域)的C-末端可连接至VH2结构域的N-末端。其他示例性构型为VL1构建体的CH2E结构域(或CH2M结构域)的C-末端可连接至与VH2相连的CH1结构域的C-末端，或VL1构建体的CH2E结构域(或CH2M结构域)的C-末端可连接至VH2结构域的N-末端。其他示例性构型包括VH1构建体的CH2E结构域(或CH2M结构域)的C-末端连接至与VL2相连的CL结构域的C-末端，或VH1构建体的CH2E结构域(或CH2M结构域)的C-末端连接至VL2结构域的N-末端。另外的示例性构型为VL1构建体的CH2E结构域(或CH2M结构域)的C-末端连接至与VL2相连的CL结构域的C-末端，或VL1构建体的CH2E结构域(或CH2M结构域)的C-末端连接至VL2结构域的N-末端。在一些情况下，VH1或VL1构建体的CH2E结构域(或CH2M结构域)与第二Fab之间的接头是肽接头。在其他情况下，VH1或VL1构建体的CH2E结构域(或CH2M结构域)与第二Fab之间的接头是人血清白蛋白(HSA)。在一些情况下，VH1或VL1构建体的CH2E结构域(或CH2M结构域)与第二Fab之间的接头是聚乙二醇。在其他情况下，VH1或VL1构建体的CH2E结构域与第二Fab之间的接头是XTEN分子(例如，AE-144、AE-288)。
在某些情况下，VH1和VL1构建体是四价双特异性抗体的一部分。这些四价抗体包括(i)完整抗体，其可变结构域结合抗原的一个表位，以及(ii)各自结合相同抗原的另一个表位或不同抗原的两个Fab。在一些实施方案中，完整抗体是IgG1。在其他实施方案中，完整抗体是IgG4(G1)-即，包含IgG4的铰链和CH2区，但不包含IgG1的CH3结构域的抗体。在某些实施方案中，完整抗体是IgG4(G1)P-即，其中除了铰链区具有S228P(EU编号)突变之外，抗体是IgG4(G1)。两个Fab连接至完整抗体的CH3结构域的C-末端。两个Fab可以通过每个Fab的两个可变结构域中的一个(即，VH或VL)的N-末端或通过两个Fab中的每一个的恒定结构域的C-末端连接至完整抗体的CH3结构域。如果Fab恒定结构域不被CH2E或CH2M结构域替换，那么可以连接至CH1结构域的C-末端或CL结构域的C-末端。如果Fab恒定结构域替换为CH2E结构域(或CH2M结构域)，那么可以连接至CH2E结构域(或CH2M结构域))的C-末端。四价双特异性抗体可包括在完整抗体的两个臂中或在两个Fab中的以上详述的CH2E结构域(或CH2M结构域)。注意，在这种情况下，术语“完整抗体”的使用与其通常含义(即，包含四条链的抗体：VL1-CL、VH1-CH1-铰链-CH2-CH3、VL2-CL、以及VH2-CH1-铰链-CH2-CH3)不同，还包括包含以下四条链的抗体：VL1-CH2E(或CH2M)、VH1-CH2E(或CH2M)-铰链-CH2-CH3、VL2-CH2E(或CH2M)、以及VH2-CH2E(或CH2M)-铰链-CH2-CH3。
对可用于上述构建体的接头没有特别的限制。在一些实施方案中，接头是肽接头。包含约1至25个残基(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个氨基酸)的任何任意单链肽可以用作接头。在某些情况下，接头仅含有甘氨酸和/或丝氨酸残基。此类肽接头的实例包括：Gly，Ser；Gly Ser；Gly Gly Ser；Ser Gly Gly；Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:10)；Ser Gly Gly Gly(SEQ ID NO:55)；Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:56)；Ser Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:57)；Gly Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:58)；Ser Gly Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:59)；Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO:60)；Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(SEQ ID NO:61)；(Gly Gly Gly Gly Ser)n(SEQ IDNO:56)n，其中n为1或更大的整数；以及(Ser Gly Gly Gly Gly)n(SEQ ID NO:57)n，其中n为1或更大的整数。在其他实施方案中，对接头肽进行修饰，以使不存在氨基酸序列GSG(其存在于传统Gly/Ser接头肽重复的接合部处)。例如，肽接头包含选自由以下项构成的组的氨基酸序列：(GGGXX)nGGGGS(SEQ ID NO:62)和GGGGS(XGGGS)n(SEQ ID NO:63)，其中X是可插入序列中且不产生包含序列GSG的多肽的任何氨基酸，并且n为0至4。在一个实施方案中，接头肽的序列为(GGGX1X2)nGGGGS，并且X1为P且X2为S，并且n为0至4(SEQ ID NO:64)。在另一个实施方案中，接头肽的序列为(GGGX1X2)nGGGGS，并且X1为G且X2为Q，并且n为0至4(SEQ IDNO:65)。在另一个实施方案中，接头肽的序列为(GGGX1X2)nGGGGS，并且X1为G且X2为A，并且n为0至4(SEQ ID NO:66)。在另一个实施方案中，接头肽的序列为GGGGS(XGGGS)n，并且X为P且n为0至4(SEQ ID NO:67)。在一个实施方案中，本发明的接头肽包含氨基酸序列(GGGGA)2GGGGS(SEQ ID NO:68)或由其组成。在另一个实施方案中，接头肽包含氨基酸序列(GGGGQ)2GGGGS(SEQ ID NO:69)或由其组成。在另一个实施方案中，接头肽包含氨基酸序列(GGGPS)2GGGGS(SEQ ID NO:70)或由其组成。在另一个实施方案中，接头肽包含氨基酸序列GGGGS(PGGGS)2(SEQ ID NO:71)或由其组成。
在某些实施方案中，接头是合成化合物接头(化学交联剂)。市场上可买到的交联剂的实例包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(磺基-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚氨基氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、以及双[2-(磺基琥珀酰亚氨基氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)。
VH1构建体的弯曲区可以是例如IgG CH1结构域的片段(例如，1至10个、1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、或1至2个来自IgG CH1结构域的连续氨基酸)。在一个实施方案中，弯曲结构域来自IgG1并且包含1至10个、1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、或1至2个来自IgG1 CH1结构域的N或C-末端的连续氨基酸，或由其组成。IgG1 CH1结构域的氨基酸序列提供如下：
Figure BDA0001756979290000441
上述VH1构建体的弯曲区的非限制性实例为ASTKG(SEQ ID NO:7)。在一个实施方案中，VH1构建体包含以下氨基酸序列：
Figure BDA0001756979290000442
其中CH2E的前8个氨基酸(VCSRDFTP(SEQ ID NO:8)替换为人IgG1 CH2结构域的前5个氨基酸(弯曲区ASTKG(SEQ ID NO:7))。在另一个实施方案中，上述VH1构建体的弯曲区为SRDFT(SEQ ID NO:77)。在某些实施方案中，VH1构建体具有接头，但不具有弯曲区。在此类情况下，接头可以是，例如，SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:58。
VL1构建体的弯曲区可以是，例如，κ或λCL结构域的片段(例如，1至10个、1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1至2个来自κ或λ结构域的连续氨基酸)。在一个实施方案中，弯曲结构域来自κ结构域并且包含1至10个、1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、或1至2个来自κ结构域的N或C-末端的连续氨基酸，或由其组成。人κCL结构域的氨基酸序列提供如下：
Figure BDA0001756979290000443
人λCL结构域的氨基酸序列提供如下(弯曲区是前六个氨基酸，示出为粗体/加下划线)：
Figure BDA0001756979290000444
上述VL1构建体的弯曲区的非限制性实例为RTVAA(SEQ ID NO:9)。在一个实施方案中，VL1构建体包含以下氨基酸序列：
Figure BDA0001756979290000451
其中CH2E的前8个氨基酸(VCSRDFTP(SEQ ID NO:8))替换为人κ结构域的前5个氨基酸(弯曲区RTVAA(SEQ ID NO:9))。在另一个实施方案中，上述VL1构建体的弯曲区为GQPKAA(SEQ ID NO:78)。在某些实施方案中，VL1构建体具有接头，但不具有弯曲区。在此类情况下，接头可以是，例如，SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:58。
重链错配问题的解决方案
本申请还公开了赖氨酸重新定位作为重链异源二聚化的有效策略。基于CH3结构域的结构分析、建模、以及潜在界面突变的分析，设计了赖氨酸重新定位的策略来工程改造不对称的互补CH3界面(参见图2)。具体地讲，在CH3单体A中用Ser取代Lys409(EU编号)和用Lys取代Ser364(EU编号)将赖氨酸从β链E重新定位到邻近的反平行β链B。相反，在CH3单体B中用Ser取代Lys370(EU编号)和用Lys取代Phe405(EU编号)将赖氨酸从β-链B重新定位到β-链E。在其他实施方案中，赖氨酸重新定位涉及表2的MP4的突变。重新定位的赖氨酸堆叠在异二聚体中，但是在同二聚体中施加空间和电荷冲突，这防止了它们的形成，并因此驱动CH3结构域的异源二聚化。因此，通过将这些改变并入抗体的CH3结构域(例如，IgG1抗体的CH3)，可以相对于没有这些突变的抗体增加抗体重链的异源二聚化。发现该策略是用于重链异源二聚化的高效策略，其具有优于所公开的Fc异源二聚化突变或可与之相当的效率。
野生型人IgG1 CH3结构域的氨基酸序列提供如下：
Figure BDA0001756979290000461
野生型人IgG4 CH3结构域的氨基酸序列提供如下：
Figure BDA0001756979290000462
在一个实施方案中，抗体的Fc区的两个CH3结构域中的一个包含以下列出的氨基酸序列：
Figure BDA0001756979290000463
在该实施方案中，抗体的Fc区的两个CH3结构域中的第二个包含以下列出的氨基酸序列：
Figure BDA0001756979290000464
在一些实施方案中，上述两个CH3结构域可以在一个或两个CH3结构域中包含5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、或1个氨基酸取代。例如，CH3结构域可被突变以改变抗体的一种或多种效应功能。在CH3结构域中可以修饰以改变一种或多种效应功能的位置(根据EU编号)的非限制性实例包括位置342、344、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、398、414、416、419、428、430、433、434、435、437、438、以及439。还参见美国专利：US 8,586,713 B2第10栏第32-64行中的可能取代位点的实例和突变的实例。可以在CH3结构域中进行以改变一种或多种效应功能的取代(根据EU编号列出)的其他非限制性实例包括E345R、H433A、N434A、H435A、Y436D、Q438D、K439E、S440K和/或K439E/S440K(参见Diebolder CA等人,Science,343(6176):1260–1263(2014))。可以对CH3结构域进行的其他取代包括影响与蛋白A结合的那些。此类取代的非限制性实例包括H435R、H435R、和/或Y436F(美国专利号：US 8,586,713 B2)(所有均为EU编号)。还可以进行取代以引入人工二硫键。此类取代的非限制性实例包括P445G、G446E和K447C；P343C和A431C；以及S375C和P396C(WO2011/003811 A1)(所有均为EU编号)。CH3结构域可发生突变以改变表面残基。这可以例如用于改变抗体的等电点(pI)。此类取代的非限制性实例包括E345K、Q347E/K/R、R355E、R355Q、K392E、K392N、Q419E(US 2014/0294835 A1)(所有均为EU编号)。在一些情况下，CH3结构域的C-末端可以被截短和/或修饰。例如，可以缺失K447(EU编号)和/或将肽DEDE或其他氨基酸添加至CH3结构域的C-末端。在某些情况下，CH3结构域可发生突变以影响结构域的糖基化。这种突变的非限制性实例是Y407E(EU编号)(Rose等人,MAbs,5(2):219-28(2013))。
上述CH3结构域可以是Fc结构域的一部分。抗体重链的Fc结构域包括铰链区、CH2结构域以及CH3结构域。CH3结构域可包括除上文讨论的赖氨酸重新定位突变之外的突变。
Fc结构域中的铰链区可以是任何抗体类别的铰链区。IgG1、IgG2和IgG4抗体的铰链区通常从第216位的氨基酸延伸至第230位的氨基酸(根据EU编号的位置编号)。在某些实施方案中，铰链区是来自IgG1抗体的铰链。在其他实施方案中，铰链区是来自IgG4抗体的铰链。当铰链区来自IgG4类时，它可含有S228P(EU编号)突变。以下是可以全部或部分使用的示例性铰链区(例如，可以存在N-和/或C-末端截短)。
人IgG1铰链：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:15)
人IgG4铰链：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:16)
突变型人IgG4(S228P)铰链：ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:17)
在某些情况下，在以上铰链序列的N-和/或C-末端可缺失1、2、3、4、或5个氨基酸。在某些情况下，在铰链序列或其N-和/或C-末端截短中可存在4个或更少、3个或更少、2个或更少、1、2、3或4个氨基酸取代、缺失和/或插入。
CH2结构域可来自任何类别的抗体。在某些实施方案中，CH2结构域来自IgG1抗体。在其他实施方案中，CH2结构域来自IgG4抗体。CH2结构域可含有一个或多个突变。例如，CH2结构域可具有N-连接糖基化位点的突变，使得该位点不被糖基化。在某些实施方案中，CH2结构域的N-连接糖基化位点中的天冬酰胺突变为谷氨酰胺(例如，Asn297Gln)。在其他实施方案中，CH2结构域的N-连接糖基化位点中的苏氨酸突变为丙氨酸或半胱氨酸(例如，Thr299Ala或Thr299Cys)。在其他实例中，CH2结构域可突变以改变效应功能，例如，Leu234Ala/Leu235Ala、Pro329Gly、和/或Pro331Ser。CH2结构域也可突变以改变与FcRn的结合。
在某些实施方案中，恒定结构域是IgG4P/IgG1杂合体。在某些情况下，恒定结构域是IgG4P/IgG1(agly)杂合体。这些杂合体包括IgG4的铰链区和CH2结构域以及IgG1的CH3结构域。IgG4的铰链区具有S228P突变。在agly构建体中，它还包括N297Q、T299A或T299C突变中的一个。
在一个实施方案中，两个Fc区中的一个包含以下列出的氨基酸序列(铰链区为斜体；N-连接糖基化位点加下划线；CH2区为常规字体；CH3结构域加粗)：
Figure BDA0001756979290000481
在该实施方案中，两个Fc区中的第二个包含以下列出的氨基酸序列(铰链区为斜体；N-连接糖基化位点加下划线；CH2区为常规字体；CH3结构域加粗)：
Figure BDA0001756979290000491
在另一个实施方案中，两个Fc区中的一个包含以下列出的氨基酸序列(铰链区为斜体；突变的N-连接糖基化位点加下划线；CH2区为常规字体；CH3结构域加粗)：
Figure BDA0001756979290000492
在该实施方案中，两个Fc区中的第二个包含以下列出的氨基酸序列(铰链区为斜体；CH2区为常规字体，并且CH2结构域的突变的N-连接糖基化位点加下划线；CH3结构域为粗体)：
Figure BDA0001756979290000493
这些Fc区可包括9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、1、2、3、4、5、6、7、8、或9个氨基酸取代、插入和/或缺失，只要Fc结构域可以异源二聚化即可。氨基酸取代可以是保守或非保守氨基酸取代。
上述CH3结构域和Fc结构域中的任一个可以是与其CL结构域替换为CH2E结构域(或CH2M结构域)的上述轻链配对的重链的一部分。具体而言，重链可包括直接连接或通过间插序列连接至VH结构域的第二CH2结构域，其中第二CH2结构域为CH2E结构域、或可与CH2E结构域二聚化的其片段。在某些情况下，重链可包括直接连接或通过间插序列连接至VH结构域的第二CH2结构域，其中第二CH2结构域为CH2M结构域、或可与CH2M结构域二聚化的其片段。上述CH3结构域和Fc结构域中的任一个还可以是与具有CH1和CL结构域的上述轻链配对的重链的一部分。在某些情况下，上述CH3结构域和Fc结构域中的任一个是与其CL结构域替换为CH2E结构域(或CH2M结构域)的上述轻链配对的第一重链的一部分，并且上述CH3结构域和Fc结构域中的任一个是与包括CH1和CL结构域的上述轻链配对的第二重链的一部分。
在一个实施方案中，重链包含以下氨基酸序列：
Figure BDA0001756979290000501
在一个实施方案中，该重链与包含以下氨基酸序列的轻链异源二聚化：
Figure BDA0001756979290000502
这些重链和轻链序列可各自包含9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、1、2、3、4、5、6、7、8、或9个氨基酸取代、插入和/或缺失，只要重链和轻链可以异源二聚化即可。氨基酸取代可以是保守或非保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，异源二聚化的上述CH3结构域和Fc结构域可以是单价抗体的一部分。单价抗体包含直接连接或通过间插接头序列连接至抗体的两个Fc区中的一个的Fab；另一个Fc区不具有与其连接的Fab区。
在其他实施方案中，异源二聚化的上述CH3结构域和Fc结构域可以是单链Fc(scFc)的一部分。在某些情况下，Fab的CH1或CL结构域直接连接或通过间插接头连接至第一Fc区，并且Fc区连接至第二Fc区(例如，第一Fc区的CH3结构域的C-末端连接至第二Fc区的铰链区的N-末端)。
在某些实施方案中，异源二聚化的上述Fc结构域直接连接或通过接头连接至Fab。也就是说，Fab的含有VH/CH1的部分通过其C-末端连接至第一Fc的铰链区的N-末端，并且Fab的含有VL/CL的部分通过其C-末端连接至第二Fc区的铰链区的N-末端。
在其他实施方案中，异源二聚化的上述CH3结构域和Fc结构域是包含第一重链和第二重链的抗体的一部分，其中第一重链和第二重链与共同轻链配对。
核酸
本公开还涵盖编码本文所述的异源二聚化双特异性且单价的抗体的重链和轻链的核酸。编码包括VH、VL、铰链、CH1、CH2、CH3和CH4区的免疫球蛋白区域的许多核酸序列在本领域中是已知的。参见，例如，Kabat等人，在SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,Public Health Service N.I.H.,Bethesda,Md.,1991中。使用本文提供的指导，本领域技术人员可以将此类核酸序列和/或本领域已知的其他核酸序列组合，以产生编码本文所述的异源二聚化双特异性抗体的核酸序列。
此外，编码本文所述的异源二聚化双特异性抗体的核酸序列可由本领域技术人员基于本文提供的氨基酸序列和本领域的知识确定。除了生产编码特定氨基酸序列的克隆DNA片段的更传统方法之外，诸多公司现在常规地生产订购的任何期望序列的化学合成的基因大小经过设定的DNA，从而使生产此类DNA的过程流水线化。
制备双特异性抗体的方法
本文所述的双特异性且单价的抗体可以使用本领域公知的方法制备。例如，编码双特异性抗体的四条多肽链的核酸可以通过多种已知方法引入宿主细胞，所述方法例如转化、转染、电穿孔、用核酸包被的微弹(microprojectile)轰击等。在一些情况下，在引入宿主细胞之前，可将编码双特异性抗体的核酸插入适于在宿主细胞中表达的载体中。通常，此类载体可含有能够实现插入核酸在RNA和蛋白质水平上的表达的序列元件。此类载体在本领域中是众所周知的，并且许多是可商购获得的。含有核酸的宿主细胞可以在能够使细胞表达核酸的条件下进行培养。所得异源二聚化双特异性抗体可从细胞团块或培养基中收集。另选地，异源二聚化双特异性抗体可以体内产生，例如在植物叶片(参见，例如，Scheller等人,Nature Biotechnol.,19:573-577(2001)以及其中引用的参考文献)、鸟蛋(参见，例如，Zhu等人(2005),Nature Biotechnol.,23:1159-1169(2005)以及其中引用的参考文献)或哺乳动物乳汁(参见，例如，Laible等人,Reprod.Fertil.Dev.25(1):315(2012))中产生。分离的抗体可被配制为用于向人受试者施用的无菌组合物。
可以使用几种类型的宿主细胞，包括，例如，细菌细胞，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)或嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)；真菌细胞，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；昆虫细胞，诸如鳞翅目昆虫细胞，包括草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞；或哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴子肾细胞、HeLa细胞、人肝细胞癌细胞、或293细胞等。
以下是本发明的实践的实例。它们不被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
提供以下实施例以更好地说明要求保护的发明，并且不应解释为限制本发明的范围。就提及具体材料而言，其仅仅是出于说明的目的，而不旨在限制本发明。本领域技术人员无需施展创造能力即可开发等价的手段或反应物而不脱离本发明的范围。
实施例1：工程改造重链异源二聚化
CH3结构域是IgG的两条重链之间的主要接触点之一。两个CH3结构域以头-尾取向彼此结合，并且在界面处紧密填充接触残基。重链异源二聚化可以通过工程改造两个CH3结构域之间的接触部的核心处的疏水性表面或通过改变接触表面周边的带电残基来实现。为了保持疏水性接触残基的紧密填充，选择CH3界面的周边用于工程改造不对称。CH3结构域的突变的另外设计标准包括：(i)异源二聚化的有效驱动物；(ii)很少突变；以及(iii)总体电荷中性变化。使用人IgG1 Fc的晶体结构进行CH3结构域的结构分析和突变的设计(PDB码3AVE)。比较分析已经显示了人Fc结构域的多个公开结构之间的高度同一性，这表明结构的选择对于工程改造CH3而言可能并不重要。基于建模和潜在界面突变的分析，设计了赖氨酸重新定位的策略来工程改造不对称的互补CH3界面(参见图2)。在单体A中用Ser取代Lys409(EU编号)和用Lys取代Ser364(EU编号)将赖氨酸从β链E重新定位到邻近的反平行β链B。相反，在单体B中用Ser取代Lys370(EU编号)和用Lys取代Phe405(EU编号)将赖氨酸从β-链B重新定位到β-链E。重新定位的赖氨酸堆叠在异二聚体中，但是在同二聚体中施加空间和电荷冲突，这应防止它们的形成，并且因此驱动异源二聚化。
为了以实验方式测试通过赖氨酸重新定位进行的异源二聚化的有效性，将测试抗体构建为单-mAb，其中一侧是全长人IgG1重链并且另一侧是没有Fab的游离Fc。由于分子量的显著差异，所得的异二聚体可以容易地与同二聚体区分开来，并且可以通过在SDS-PAGE上分离来评价异源二聚化。在这些测试构建体中使用抗EGFR抗体M60-A02。使用表1中列出的引物，通过基于PCR的诱变生成CH3结构域中的突变。
表1：用于通过重叠PCR在人IgG1中生成CH3突变S364K/K409S和K370S/F405K的引物。
Figure BDA0001756979290000541
使用Q5热启动高保真DNA聚合酶(NEB#M0493L)进行扩增，并且PCR产物与HiFiGibson组装试剂盒(SGI#GA1100-50)一起使用以构建构建体。
为了了解重新定位的赖氨酸的个体效应，还构建了具有单个突变的构建体。这些半设计分别命名为MP1和MP2(表2)。
表2：用于测试Fc异源二聚化的构建体。
Figure BDA0001756979290000542
Figure BDA0001756979290000551
完整设计将两个赖氨酸重新定位(pMP237具有突变S364K/K409S，并且pMP238具有K370S/F405K)，并且在驱动异源二聚化方面应该是最有效的。该设计被命名为MP3。MP3的CH3结构域的肽序列如下所示：
CH3结构域MP3单体A的氨基酸序列(突变为粗体并加下划线)
Figure BDA0001756979290000552
CH3结构域MP3单体B的氨基酸序列(突变为粗体并加下划线)
Figure BDA0001756979290000553
另外，生成了若干所公布的CH3异源二聚化突变以用于比较(Atwell等人,J.Mol.Biol.,270:26-35,1997；Gunasekaran等人,J.Biol.Chem.,285:19637-19646,2010；Von Kreudenstein等人,mAbs 5:646-654,2013)。此外，构建了构建体pMP221和pMP222以代表野生型IgG1对照。表2汇总了针对异源二聚化的该初始测试所生成的所有构建体，并且通过DNA测序验证所有质粒。
通过瞬时转染在CHO细胞中表达抗体。所有抗体均良好表达，从而在使用CHO细胞表达9天后产生在100与200mg/L之间的滴度，所述CHO细胞以6X106个细胞/ml进行转染，其中Fectopro与DNA的比率为2:1，并且在第二天温度转变为28℃。在蛋白A柱上纯化上清液，并通过SDS-PAGE分析等分试样(图3A)。IgG1重链和游离Fc的异二聚体显著存在于所有样品中。另外，野生型IgG1和Fc的共转染还产生了与两个同二聚体相对应的强条带。这些条带在所公布的突变体和所有赖氨酸重新定位突变体中均显著较弱。因此，赖氨酸重新定位和所公布的突变驱动重链异二聚体的形成并减少同源二聚化。通过质谱进一步分析经蛋白A纯化的材料并估计主要组分的相对量。样品中异二聚体的量在35％至80％的范围内，在赖氨酸重新定位突变体MP1、MP2和MP3中略高于所公布的设计(图3B)。然而，各个链的不同表达水平可能会影响这些结果，从而使直接比较变得困难。重要的是，设计MP2和MP3以及ZW1和杵-臼突变均含有单体Fc。单体Fc的存在表明Fc二聚体由于CH3中的突变而变得不稳定，因此较不易形成。总之，这些结果表明，赖氨酸重新定位是有效的重链异源二聚化策略，其像几个所公布的突变一样有效地防止同源二聚化。
在此初始测试之后，进行了另外的结构建模，以鉴定可改善界面残基填充的突变。此类突变可能会增大异源二聚化的效率或二聚体的稳定性，因此将是有益的。鉴定了可改进原始赖氨酸重新定位设计MP3的两项变化。此新设计被命名为MP4并且氨基酸变化在表2中示出。具有MP4突变的IgG1/Fc异二聚体在如上所述的CHO细胞中表达并且通过蛋白A由上清液纯化。质谱分析证明，MP4与MP3一样有效地在IgG1重链与游离Fc之间产生异二聚体(图3B)。
所有异二聚体蛋白在KappaSelect柱上进一步纯化以去除Fc二聚体和单体，然后在Tandem Superdex S200上进行抛光步骤。该三步纯化产生相对纯的异二聚体，所述异二聚体用于差示扫描量热法(DSC)以确定熔解温度。野生型IgG1对照显示出约83℃的CH3结构域的预期Tm(图3C)。ZW1设计具有类似的CH3熔解温度(图3C)，因为它在迭代过程中被充分工程改造以重新获得野生型IgG1的热稳定性(Von Kreudenstein等人,mAbs 5:646-654,2013)。杵-臼和静电转向比较物分子在DSC谱中仅显示一个峰，表明CH3结构域的Tm下降至约70℃，并且该结构域与CH2和Fab结构域熔解，从而在DSC上产生单峰(图3C)。MP3分子在DSC曲线中也仅在约70℃下显示出一个峰，这表明CH3的Tm类似地下降(图3C)。蛋白质MP4和MP4a3b(MP4单体A和MP3单体B)在CH2/Fab峰的右侧显示出肩(图3C)，这表明突变K409L赋予比原始突变K409S略增加的稳定性，并且可以通过进一步工程改造改善Tm。然而，与野生型IgG1 CH3结构域相比，设计MP4具有降低的Tm。
MP4的CH3结构域的肽序列如下所示：
CH3结构域MP4单体A的序列(突变为粗体并加下划线)
Figure BDA0001756979290000571
CH3结构域MP4单体B的序列(突变为粗体并加下划线)
Figure BDA0001756979290000572
编码MP4的质粒(pMP254和pMP259)的DNA序列提供如下：
pMP254，具有MP4A突变(S634K、K409L)的抗EGFR M60-A02IgG1重链的DNA序列：
Figure BDA0001756979290000573
Figure BDA0001756979290000581
Figure BDA0001756979290000591
pMP259，具有MP4B突变(K370S、V397I、F405K)的IgG1Fc的DNA序列：
Figure BDA0001756979290000601
Figure BDA0001756979290000611
实施例2：重链异源二聚化突变体的测试
为了进一步表征赖氨酸重新定位设计，将突变并入全长IgG1重链中。这些构建体在两条重链上含有相同的Fab(抗EGFR M60-A02)以限制潜在影响并避免轻链配对问题。在CHO瞬时物中表达M60-A02的等量的两条重链和轻链，并通过SDS-PAGE分析上清液。所有上清液均含有相当大量的由1条重链和1条轻链组成的半抗体，但设计MP4产生的半抗体量低于MP3，如LC-MS峰的定量所示(数据未示出)。质谱分析还揭示，在这些样品中，半抗体仅由重链B形成(数据未示出)。这表明半抗体的形成可能是重链B过表达的结果，这通过优化两条重链之间的比例开辟了降低半抗体水平的可能性。因此，将具有相同Fab的设计MP4(质粒pMP254和pMP399)的重链以1:5至5:1的各种比率转染到CHO-S细胞中。在这些转染中，重链的总量(14μg)和轻链的量保持恒定。链A的过表达减少了半抗体的形成并增加了上清液中全长IgG的量，证实了半抗体形成受链之间差异表达的影响(图4A)。由于这些实验中的两条重链均含有相同的Fab(抗EGFR M60)，因此两条重链的差异表达可能归因于CH3突变。然而，质谱分析还表明任一链的过表达导致相应同二聚体的形成增加(图4B)。因此，两条重链之间的相等比率是使不想要的副产物最少的良好折衷方案。
实施例3：开发轻链配对问题的解决方案
为了驱动双特异性抗体中轻链:重链(LC:HC)对的正确组装，如图1所示，链之间的界面可以被工程改造以使得空间冲突或排斥电荷防止不正确的组装。抗体的轻链与重链在可变结构域和恒定结构域中发生接触，并且两个接触部(VL:VH和CL:CH1)均有助于识别和接合。因此，恒定结构域中的点突变可能不足以将每条轻链引导向正确配对，并且可变结构域的工程改造可变得必要。因此，寻求解决轻链配对的替代策略。
抗体的可变结构域可以在不存在恒定区的情况下或当它们与异源蛋白融合时保持它们的结合特性。我们假设可以使用Ig折叠结构域代替CH1/CL作为防止轻链错配的策略，并选择IgE(Cε2)的CH2结构域作为候选Ig折叠结构域来取代CH1:CL结构域(图5A)。IgE的CH2结构域(Cε2)形成通过两个链间二硫键连接的同二聚体。该结构域充当IgE重链之间的二聚化界面，而不是IgE中不存在的铰链区。另外，不同于IgG的CH2结构域，Cε2结构域不参与效应功能并且不与FcεRIα发生接触(Holdom等人,Nature Struct.&Mol.Biol.,18:571-576,2011)。
Cε2结构域的结构类似于其他Ig折叠结构域诸如CL和CH1结构域，但二聚体单元之间的界面和角度是不同的(图5B)。二聚体中的两个Cε2结构域与其他Ig折叠二聚体相比具有较不充分的相互作用，并且该相互作用受极性而不是通常的非极性残基控制。因此，Cε2和CH1:CL总体上如此不同以至于不可能发生Ig折叠结构域的交叉配对。然而，标记Ig折叠的第一β链的起始的两个脯氨酸(在图5C中用粗体和下划线突出显示)在Cε2和CH1/κ恒定结构域中处于相似的位置。因此，似乎可以将抗体的可变结构域融合到Cε2结构域上，并维持VH:VL对的几何形状并且因此维持其结合特性。由与Cε2结构域融合的抗体的可变结构域组成的这一杂合Fab构建体被命名为“E-Fab”(图5C)。人免疫球蛋白E(IgE)的CH2结构域的氨基酸序列提供如下(N-连接糖基化位点加下划线)：
Figure BDA0001756979290000631
为了将VH结构域与Cε2结构域融合，将IgG1 CH1恒定区的连接子序列(ASTKG(SEQID NO:7))接合至以Pro2起始的Cε2结构域的第一β链(C结构域的IMGT唯一编号，图5C)。人免疫球蛋白E(IgE)的CH2结构域的氨基酸序列提供如下，其中前8个氨基酸(VCSRDFTP(SEQID NO:8))替换为人IgG1 CH1结构域的前5个氨基酸(弯曲区ASTKG(SEQ ID NO:7)加下划线)：
Figure BDA0001756979290000632
使用相同的策略，用来自κ恒定区的连接子(RTVAA(SEQ ID NO:9))将VL与Cε2结构域融合。人免疫球蛋白E的CH2结构域的氨基酸序列提供如下，其中前8个氨基酸(VCSRDFTP(SEQ ID NO:8))替换为人κ结构域的前5个氨基酸(弯曲区RTVAA(SEQ ID NO:9)加下划线)：
Figure BDA0001756979290000641
人Cε2结构域在Asn38(IMGT编号)处具有一个N-连接糖基化位点，其突变为Gln以防止E-Fab中该位点的糖基化。在这一初始设计中，将可变结构域移植到Cε2结构域上，其除了agly突变之外没有改变并且在重链与轻链之间是相同的。此第一设计被命名为E-FabE0。E-Fab的重链的E0设计的氨基酸序列提供如下(N-糖基化位点突变为谷氨酰胺)：
Figure BDA0001756979290000642
E-Fab的轻链的E0设计的氨基酸序列提供如下(N-糖基化位点突变为谷氨酰胺)：
Figure BDA0001756979290000643
然而，由于Cε2结构域通常同源二聚化，因此在结构域中引入另外的突变以防止形成HC:HC或LC:LC二聚体，并且这些设计被命名为E-Fab E1至E3(表3；位置根据IMGT编号系统)。
表3：用于E-Fab测试的构建体。
Figure BDA0001756979290000644
Figure BDA0001756979290000651
E-Fab的重链的E1设计的氨基酸序列提供如下：
Figure BDA0001756979290000652
E-Fab的轻链的E1设计的氨基酸序列提供如下：
Figure BDA0001756979290000653
本实施例的末尾提供了E-Fab的重链和轻链的E2设计的氨基酸序列。
E-Fab的重链的E3设计的氨基酸序列提供如下：
Figure BDA0001756979290000654
E-Fab的轻链的E3设计的氨基酸序列提供如下：
Figure BDA0001756979290000655
为了在控制轻链配对方面对E-Fab设计进行评价，使用两种Fab M60-A02抗EGFR和M13.C06抗IGF1R构建测试构建体。两条重链均属于亚组HV3，因此可以使用蛋白A纯化。用GFP(30kDa，Fab B抗IGF-1R的LC)或HSA(66kDa，Fab A或E-Fab、抗EGFR的HC)标记测试分子，以能够通过SDS page上的迁移实现正确与不正确配对的简单区分(图6A)。E-Fab构建体是由gBlocks构建的。通过基于PCR的诱变将另外的突变引入Cε2结构域，并且通过基于限制性酶的方法将产物克隆到来源于pV90/pV100的CHO表达载体中(表3)。通过瞬时转染以40ml的规模在CHO-S细胞中共表达Fab。转染后24小时将细胞转移到28℃以进行表达，8天后收获上清液并通过离心和过滤(0.22μm)使其澄清。
通过SDS-PAGE进行的表达蛋白质的分析显示，由与Cε2结构域融合的常规抗体的可变结构域组成的E-Fab在控制轻链配对方面是高度有效的。当两个Fab M60-A02和M13-C036共表达为野生型IgG1/κFab时，容易地检测到M60-A02轻链与M13-C06重链的错配(图6B)。然而，当将M60-A02制备为E-Fab时，没有看到错配。相比之下，CH1/CL结构域中的点突变在该实验中未能消除轻链错配(数据未示出)。类似地，当抗IGF-1R M13-C06被构建为E-Fab时，当其与另一Fab(抗IGF-1R G11)共表达时未检测到错配(图6C)。重要的是，当Fab单独表达并与抗原结合时(通过Octet测试)，E-fab和野生型Fab类似地结合到His标记的IGF-1R上，将其加载到抗His tips上(图6D)。
因此，基于以上数据，E-Fab是解决双特异性抗体中轻链配对问题的极佳策略，因为它严格加强正确的链配对并且Fab的结合特性得以保持。有趣的是，Cε2结构域并不强烈诱导E-Fab的链之间同二聚体的形成。尽管如此，被工程改造以在重链与轻链之间形成异二聚体的设计E2和E3在全长双特异性物质的背景下进行并测试。只有似乎诱导重链之间的一些二聚化的设计E1(图6B)未进一步测试。E-Fab设计E2的恒定结构域的肽序列如下所示：
E-Fab轻链恒定区的氨基酸序列，agly N38Q(设计E2，T121G，pMP463)
Figure BDA0001756979290000671
E-Fab重链恒定区的氨基酸序列，agly N38Q(设计E2，S10I，pMP392)
Figure BDA0001756979290000672
实施例4：构建和测试双特异性不对称IgG
将E-Fab和赖氨酸重新定位构建体组合以产生全长IgG样双特异性抗体。这一双特异性抗体由4条不同的链组成，并且含有轻链配对和重链异源二聚化解决方案(图7)。再次使用抗EGFR抗体M60-A02和抗IGF1R M13.C06或G11，利用异源二聚化突变MP3构建两条不同的IgG1重链。
成熟M60-A02E体重链(EFab E2，mp3a异源二聚化，pMP401))的氨基酸序列(CH2结构域加下划线；CH3结构域加粗)
Figure BDA0001756979290000673
成熟M60-A02E体轻链(EFab E2，pMP463)的氨基酸序列(CH2结构域加下划线)
Figure BDA0001756979290000674
成熟M13.C06IgG1重链(mp3b异源二聚化，pMP404)的氨基酸序列(CH3结构域加粗)
Figure BDA0001756979290000681
成熟M13.C06κ轻链(pMP407)的氨基酸序列
Figure BDA0001756979290000682
为了控制不同轻链的配对，将抗EGFR Fab构建为Efab(图7)。用赖氨酸重新定位突变构建对照抗体，以生成缺乏轻链配对解决方案的IgG1重链异二聚体。
再次通过瞬时转染在CHO-S细胞中表达抗体，并且培养8天后收集上清液并使其澄清。通过SDS-PAGE进行的分离显示出迁移于全长IgG的大小处的条带和对应于半抗体的另一条带(图8A)。质谱分析表明，在这些实验中再次由重链B形成半抗体。重要的是，通过LC-MS在E-Fab中没有检测到轻链错配。IgG1异二聚体显示出重链与它们的轻链的一些正确配对，但也可检测到具有两条抗EGFR轻链的重链异二聚体的强峰(图8B)。这些结果再次证实E-Fab解决了轻链配对问题。
重要的是，重链之间的同二聚体在质谱曲线中是不可检测的，表明当与E-Fab组合时，通过赖氨酸重新定位的重链异源二聚化是高度有效的(图8B)。然而，质谱还揭示了在Efab双特异性物质上存在少量O-聚糖，但在IgG1对照上不存在。
接下来，将粗上清液用于利用可溶性His标记的EGFR(图8C)和IGF-1R(图8D)的Octet结合实验中。IgG1对照以及双特异性E体与EGFR和IGF-1R结合，但在E体与对照之间，结合似乎有些不同。然而，由于这些粗样品中的不同表达、半抗体量以及轻链错配，这些结果的解释是复杂的。
总而言之，通过质谱进行的分析与结合数据一起证实了E体正确组装成不对称IgG。这简单地通过四条不同的链(2条HC和2条LC)在CHO细胞中的共表达实现。在这些实验中，E-fab完全解决了轻链配对，并且赖氨酸重新定位严格加强了重链异源二聚化。
实施例5：双特异性平台的进一步测试
为了使用Efab和Fc异源二聚化进一步测试双特异性平台，由被批准用于治疗各种癌症的两种治疗性抗体曲妥珠单抗和西妥昔单抗产生另一种IgG样双特异性抗体。为了产生双特异性物质，使用轻链配对解决方案Efab克隆抗HER抗体曲妥珠单抗，然后使用mp4重链异源二聚化突变(S364K/K409L和K370S/V397I/F405K)将其与抗EGFR抗体西妥昔单抗组合。然后通过瞬时转染使编码抗体的两条重链和两条轻链的四种质粒(pMP521、pMP526、pMP528和pMP530)在CHO-S细胞中共表达，并且通过蛋白A纯化所得的双特异性抗体。然后将此抗体用于与可溶型式的两种抗原HER2和EGFR的Octet结合研究中(参见图9A和9B)。如图9A和9B所示，双特异性抗体能够同时结合两种其抗原。
pMP530曲妥珠单抗Efab IgG1 mp4a
Figure BDA0001756979290000691
pMP528曲妥珠单抗Efab轻链
Figure BDA0001756979290000701
pMP521西妥昔单抗IgG1 mp4b
Figure BDA0001756979290000702
pMP526西妥昔单抗κ
Figure BDA0001756979290000703
实施例6：轻链配对解决方案的进一步测试
为了进一步优化Efab的构建，对IgE的可变结构域与CH2结构域之间的接头进一步研究。在先前的实施例中，来自人κ和CH1结构域的弯曲区用作可变结构域与IgE CH2之间的接头。然而，其他接头序列可能会改变几何形状或提供不同程度的灵活性，从而影响链的正确组装或抗原与Efab的结合。为了测试这一点，将抗HER2抗体曲妥珠单抗工程改造为Efab并在轻链内包括各种弯曲序列。所用的接头来自λ轻链或来自人IgE CH2结构域，或不同长度的柔性Gly-Ser接头(图10)。通过瞬时转染在CHO细胞中将Efab表达为具有西妥昔单抗的不对称IgG(如图9)。材料通过蛋白A纯化并在Octet结合研究中测试。有趣的是，各种弯曲接头序列对曲妥珠单抗结合HER2的能力几乎没有影响，并且与野生型曲妥珠单抗Fab相比，所有构建体均显示出相似的结合。
IgM类抗体类似于IgE含有CH2结构域，其代替绞链区用以通过二硫桥将两条重链配对。因此，测试了使用IgM CH2结构域是否可以像IgE CH2结构域一样解决轻链配对。为了测试这一点，两个Fab(M60和C06)再次共表达，如图6A所示，其中一个Fab与HSA融合，另一个Fab与GFP融合。然而，在这种情况下，一个Fab的κ和CH1恒定结构域替换为IgM CH2结构域，并且所得分子被命名为M-Fab(图10C)。通过SDS-PAGE进行的链配对的分析显示，M-Fab解决了在对照中突出观察到的M60与C06之间的轻链错配(图10C)。因此，M-Fab在解决轻链配对问题方面似乎与Efab一样有效。
接下来，将M-Fab结合抗原的能力与轻链中具有各种弯曲区的Efab进行比较。这些Efab和M-Fab再次使用抗HER2抗体曲妥珠单抗的可变结构域构建。M-Fab构建体的重链和轻链的成熟肽序列如下所示。
具有6x His标签的曲妥珠单抗M-fab重链的氨基酸序列(pMP623)(弯曲区加粗；IgM CH2结构域加下划线；6xHis为斜体)
Figure BDA0001756979290000711
曲妥珠单抗M-fab轻链的氨基酸序列(pMP596)(弯曲区加粗；IgM CH2结构域加下划线
Figure BDA0001756979290000712
Efab和M-Fab在CHO-S中表达为Fab(不具有Fc)，并且上清液用于通过Octet测试与HER2的结合。在该结合测定中，Mfab和各种Efab构建体显示出非常相似的结合(图10D)。
这些结果一起表明，使用IgM CH2结构域作为Fab(M-fab)的恒定结构域解决了轻链配对问题并保持了Fab的结合特征。因此，M-Fab是另一种有用的轻链配对解决方案。
实施例7：重链和轻链配对技术的另外应用
接下来，在各种其他双特异性和单特异性形式的背景下进一步测试重链和轻链配对解决方案，以探索这些技术的通用性和功能性。
首先，将Fc异源二聚化突变引入其他Fc区的CH3结构域中，并在结合研究中测试此类双特异性抗体的功能性。为此，将mp3异二聚体突变(S364K/K409S和K370S/F405K)克隆到IgG1agly T299A支架中，其在Asn297处缺乏N-连接糖基化且因此与糖基化IgG1相比具有减小的效应功能。通过在CHO细胞中瞬时表达产生了具有抗EGFR抗体M60-A02的Efab和抗IGF-1R抗体M13.C06的常规Fab的不对称IgG形式的具有该Fc区的双特异性抗体(图11A)。所得的双特异性抗体在夹心形式的Octet结合测定中显示出对两种配体的稳健的同时结合(图11B)，表明由四条共表达链(质粒pMP463、pMP402、pMP405、pMP407)有效形成双特异性抗体。因此，通过赖氨酸重新定位实现的Fc异源二聚化策略似乎不依赖于Fc糖基化发挥作用。
pMP402 M60 Efab IgG1 agly T299A mp3a S364K/K409S
Figure BDA0001756979290000731
pMP405 C06 IgG1 agly T299A mp3b K370S/F405K
Figure BDA0001756979290000732
其次，为了测试另一Fc形式的重链异源二聚化，将mp4异二聚体突变(S364K/K409L和K370S/V397I/F405K)克隆到IgG4P/IgG1 agly(N297Q)杂合体恒定结构域中，这将无糖基化IgG4 CH2结构域的最小效应功能与IgG1 CH3结构域的稳定性配对(图12)。该Fc还含有铰链稳定化突变S228P。因此，生成了具有该杂合体IgG4P/IgG1恒定结构域和抗HER2抗体帕妥珠单抗和抗IGF-1R抗体C06的可变结构域的双特异性抗体。分别在作为Efab的链A上或作为常规Fab的链B上在两个取向上使用可变结构域。在CHO细胞中再次产生抗体，并且在Octet结合研究中使用蛋白A-纯化的材料(图12)。有趣的是，经纯化的双特异性抗体仅在首先加载IGF1R，然后加载抗体和HER2时才显示出同时结合两种抗原(图12C)，但是当以相反顺序测试时不显示出同时结合两种抗原，这不可能是由于标签在可溶性抗原上的不同位置。
第三，在Mab-Fab的背景下考虑双特异性技术。构建双特异性抗体的不同方式是Mab-Fab，其含有具有与重链的C-末端融合的Fab的IgG(图13A)。这种形式类似于具有两条相同重链的对称分子，使得Fc异二聚体技术变得不必要。然而，两种不同Fab的存在(各自含有其独特的轻链)需要轻链配对解决方案。为了测试Efab在这种背景下是否起作用以促进正确的轻链组装，用抗HER2抗体曲妥珠单抗作为IgG1与融合至其C-末端的抗IGF-1R抗体C06的Efab一起构建Mab-Fab(图13)。此外，还产生了作为具有与C-末端融合的曲妥珠单抗的Efab的IgG1的C06的逆构建体。在两种情况下，Efab在其重链的N-末端处利用单个G4S(SEQ ID NO:56)-接头连接IgG重链的C-末端。再次通过三种质粒(一条重链和两条轻链，pMP759/pMP519/pMP511或pMP760/pMP528/pMP407)的共表达在CHO转染物中产生Mab-Fab，并通过蛋白A纯化。通过SDS-PAGE进行的纯化材料的分析显示，Mab-Fab的三条链正确组装成250kDa蛋白质(图13B)。此外，双特异性抗体在夹心Octet结合测定中显示出一定程度的同时结合(图13C)。然而，这种同时结合仅在首先结合Efab时观察到，无论C06还是曲妥珠单抗为Efab，表明这种形式中的某种形式的空间位阻可能影响两种抗原的同时结合。
pMP759曲妥珠单抗IgG1-C06 EFab
Figure BDA0001756979290000741
pMP511 C06 Efab轻链
Figure BDA0001756979290000751
pMP519曲妥珠单抗κ轻链
Figure BDA0001756979290000752
pMP760 C06-IgG1-曲妥珠单抗Efab
Figure BDA0001756979290000753
第四，除了生成双特异性物质方面的各种应用之外，Fc-异源二聚化技术还可用于生成单特异性单价抗体。如图3所示的半抗体与游离Fc之间的异二聚体是单特异性单价体的一个这样的实例。另一个实例是LC与Fc的直接融合，然后与匹配重链共表达(图14A)。在这种形式中需要Fc异源二聚化策略来防止轻链或重链的同二聚体的形成。为了测试mp4Fc异二聚体是否也适于构建这种类型的单价单特异性抗体，用抗EGFR抗体M60-A02的可变结构域生成LC-Fc融合构建体。该质粒(pMP533)与含有相对应的Fc异二聚体突变的M60-A02的重链(质粒pMP254)在CHO细胞中的一起表达产生单一蛋白质物类(图14B)。当在Octet结合中对此蛋白质进行分析时，它显示出单价结合的特征(图14C)。总之，该数据显示，通过赖氨酸重新定位实现的Fc异源二聚化似乎是生成单价单特异性抗体的通用且有效的方式。
最后，在缺乏IgG的Fc部分的双特异性抗体中也测试了Efab轻链配对解决方案的使用。这样的双特异性物质可以例如通过两个Fab与肽接头的直接融合生成(图15A，右图)。另选地，连接两个Fab的肽可以是异源蛋白质，诸如人血清白蛋白(HSA)(图15A，左图)。在任一种情况下，两个Fab的轻链和重链的配对必须是正确的，以使双特异性物质起作用。因此，Efab轻链配对解决方案可以使两种Fab融合成双特异性分子。为了测试这一点，再次使用M60-A02和M13.C06抗体，并且以处于两个取向的两个Fab再次生成双特异性物质。当这些双特异性物质在CHO细胞中表达时，它们产生单一蛋白质，再次表明抗体链已经正确组装(图15B)。当在Octet结合研究中测试抗体时，仅在一个特定取向上再次观察到同时结合(图15C)。尽管如此，本数据显示，Efab轻链配对解决方案可以用于由处于缺乏正常IgG的Fc的各种形式的两个Fab有效生成双特异性物质。
其他实施方案
虽然已经结合其详细说明描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
Figure IDA0001756979350000011
Figure IDA0001756979350000021
Figure IDA0001756979350000031
Figure IDA0001756979350000041
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Claims (122)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其包含第一重链可变结构域（第一VH）和第一轻链可变结构域（第一VL），其中所述第一VH和所述第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一表位的第一可变区，其中
所述第一VH通过接头或弯曲区连接至第一多肽，其中所述第一VL通过接头或弯曲区连接至第二多肽，其中所述第一多肽和所述第二多肽配对形成二聚体，
且其中
(a)所述第一多肽由与SEQ ID NO:3的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成，所述第二多肽由与SEQ ID NO:4的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成；
(b) 所述第一多肽由与SEQ ID NO:47的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成，所述第二多肽由与SEQ ID NO:48的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成；
(c) 所述第一多肽由与SEQ ID NO:49的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成，所述第二多肽由与SEQ ID NO:50的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成；或者
(d) 所述第一多肽由与SEQ ID NO:5的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成，所述第二多肽由与SEQ ID NO:6的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成；
其中所述第一多肽直接连接至Fc结构域；或者其中所述第二多肽直接连接至Fc结构域。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述接头选自由Gly；Ser；GlySer；Gly Gly Ser；Ser Gly Gly；SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 55-71的序列组成的组；并且所述弯曲区选自由SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9和 SEQ ID NO: 77-78的序列组成的组。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一多肽由与SEQ ID NO:5中列出的序列的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成。
4.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一VH通过弯曲区连接至所述第一多肽，其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:5中列出的序列的氨基酸1-5相同的氨基酸序列组成。
5.如权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二多肽由与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成。
6.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一VL通过弯曲区连接至所述第二多肽，其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5相同的氨基酸序列组成。
7.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一多肽由与SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成。
8.如权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一VH通过弯曲区连接至所述第一多肽，其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5相同的氨基酸序列组成。
9.如权利要求1、2、7和8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二多肽由与SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成。
10.如权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一VL通过弯曲区连接至所述第二多肽，其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5相同的氨基酸序列组成。
11.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一多肽由与SEQ IDNO:47中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成。
12.如权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一VH通过弯曲区连接至所述第一多肽，其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:47中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5相同的氨基酸序列组成。
13.如权利要求1、2、11和12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二多肽由与SEQ ID NO:48中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成。
14.如权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一VL通过弯曲区连接至所述第二多肽，其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:48中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5相同的氨基酸序列组成。
15.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一多肽由与SEQ IDNO:49中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成。
16.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一VH通过弯曲区连接至所述第一多肽，其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:49中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5相同的氨基酸序列组成。
17.如权利要求1、2、15和16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二多肽由与SEQ ID NO:50中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成。
18.根据权利要求17所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一VL通过弯曲区连接至所述第二多肽，其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:50中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5相同的氨基酸序列组成。
19.如权利要求1至18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含第二重链可变结构域（第二VH）和第二轻链可变结构域（第二VL），其中所述第二VH和所述第二VL配对以形成特异性结合所述第一抗原的第二表位或第二抗原的第二可变区。
20.如权利要求19所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CH1结构域，并且所述第二VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CL结构域。
21.一种抗体或其抗原结合片段，其包含第一重链可变结构域（第一VH）和第一轻链可变结构域（第一VL），
其中所述第一VH和所述第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一表位的第一可变区，其中所述第一VH通过接头或弯曲区连接至第一多肽，其中所述第一VL通过接头或弯曲区连接至第二多肽，其中所述第一多肽和所述第二多肽配对形成二聚体，并且
其中所述第一和第二多肽各自由以下氨基酸序列组成
(a)与SEQ ID NO:2中列出的人免疫球蛋白M的CH2结构域的氨基酸序列的氨基酸7-112相同的氨基酸序列；
(b)与具有N105Q突变的SEQ ID NO:2的氨基酸7-112相同的氨基酸序列；
(c)与具有S107A或S107C突变的SEQ ID NO:2的氨基酸7-112相同的氨基酸序列；
(d)与SEQ ID NO:2的氨基酸7-110相同的氨基酸序列；
(e)与具有N105Q突变的SEQ ID NO:2的氨基酸7-110相同的氨基酸序列；或者
(f)与具有S107A或S107C突变的SEQ ID NO:2的氨基酸7-110相同的氨基酸序列，
其中(a)至(f)中氨基酸位置的编号取决于SEQ ID NO:2；
其中所述第一多肽直接连接至Fc结构域；或者其中所述第二多肽直接连接至Fc结构域。
22.如权利要求21所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述接头选自由Gly；Ser；GlySer；Gly Gly Ser；Ser Gly Gly；SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 55-71的序列组成的组；所述弯曲区选自由SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 77-78的序列组成的组。
23.如权利要求21至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自由具有N105Q突变的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112组成。
24.根据权利要求21至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自由具有S107A或S107C突变的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112组成。
25.如权利要求21至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自由SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112组成。
26.如权利要求21至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自由SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-110组成。
27.如权利要求21至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自由具有N105Q突变的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-110组成。
28.如权利要求21至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自由具有S107A或S107C突变的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-110组成。
29.如权利要求21至28中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含第二重链可变结构域（第二VH）和第二轻链可变结构域（第二VL），其中所述第二VH和所述第二VL配对以形成特异性结合所述第一抗原的第二表位或第二抗原的第二可变区。
30.如权利要求29所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述第二VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CH1结构域，并且所述第二VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CL结构域。
31.如权利要求1或21所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc结构域具有
(i)第一IgGl CH3结构域，其具有与SEQ ID NO:11中列出的序列相同的氨基酸序列，其中第364位和第370位的氨基酸为赖氨酸并且第409位的氨基酸为丝氨酸；以及
(ii)第二IgGl CH3结构域，其具有与SEQ ID NO:11中列出的序列相同的氨基酸序列，其中第370位的氨基酸为丝氨酸并且第405位和第409位的氨基酸为赖氨酸；或者
(iii)第一IgGl CH3结构域，其具有与SEQ ID NO:11中列出的序列相同的氨基酸序列，其中第364位和第370位的氨基酸为赖氨酸并且第409位的氨基酸为亮氨酸；
(iv)第二IgGl CH3结构域，其具有与SEQ ID NO:11中列出的序列相同的氨基酸序列，其中第370位的氨基酸是丝氨酸，第397位的氨基酸是异亮氨酸，并且第405位和第409位的氨基酸是赖氨酸；
其中(i)至(iv)中的氨基酸位置基于EU编号系统，并且其中所述第一IgG1 CH3结构域和所述第二IgG1 CH3配对形成异二聚体。
32.一种双特异性抗体，其包含：
(I)第一抗原结合片段（第一Fab），其包含第一重链可变结构域（第一VH）和第一轻链可变结构域（第一VL），其中所述第一VH和所述第一VL配对形成第一可变区，其中所述第一VH通过接头或弯曲区连接至第一多肽，其中所述第一VL通过接头或弯曲区连接至第二多肽，其中所述第一多肽和所述第二多肽配对形成二聚体；以及
其中：
(a)第一多肽由与SEQ ID NO:3的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成，第二多肽由与SEQ ID NO:4的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成；
(b)第一多肽由与SEQ ID NO:47的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成，第二多肽由与SEQ ID NO:48的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成；
(c)第一多肽由与SEQ ID NO:49的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成，第二多肽由与SEQ ID NO:50的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成；或者
(d)第一多肽由与SEQ ID NO:5的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成，第二多肽由与SEQ ID NO:6的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成；
以及
(II)第二Fab，其包含第二VH和第二VL，其中所述第二VH和所述第二VL配对形成第二可变区，并且其中所述第二VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CH1结构域，并且所述第二VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CL结构域，
其中所述第一Fab和所述第二Fab特异性结合不同的抗原或相同抗原的不同表位，并且
其中所述第一Fab连接至所述第二Fab。
33.如权利要求32所述的双特异性抗体，其中所述接头选自由Gly；Ser；Gly Ser；GlyGly Ser；Ser Gly Gly；SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 55-71的序列组成的组；所述弯曲区选自由SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 77-78的序列组成的组。
34.如权利要求32所述的双特异性抗体，其中所述第一Fab通过接头连接至所述第二Fab。
35.如权利要求32所述的双特异性抗体，其中所述第一Fab通过异源多肽连接至所述第二Fab。
36.如权利要求35所述的双特异性抗体，其中所述异源多肽是人血清白蛋白。
37.如权利要求35所述的双特异性抗体，其中所述异源多肽是XTEN。
38.如权利要求32所述的双特异性抗体，其中所述第一Fab通过聚乙二醇(PEG)连接至所述第二Fab。
39.如权利要求32至38中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽由与SEQ IDNO:5中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成。
40.如权利要求39所述的双特异性抗体，其中所述第一VH通过弯曲区连接至所述第一多肽，其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
41.如权利要求32至40中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二多肽由与SEQ IDNO:6中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104具有同一性的氨基酸组成。
42.如权利要求41所述的双特异性抗体，其中所述第一VL通过弯曲区连接至所述第二多肽，其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
43.如权利要求32至38中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽由SEQ IDNO:3中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
44.如权利要求43所述的双特异性抗体，其中所述第一VH通过弯曲区连接至所述第一多肽，其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
45.如权利要求32至38、43和44中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二多肽由SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
46.如权利要求45所述的双特异性抗体，其中所述第一VL通过弯曲区连接至所述第二多肽，其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
47.如权利要求32至38中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽由SEQ IDNO:47中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
48.如权利要求47所述的双特异性抗体，其中所述第一VH通过弯曲区连接至所述第一多肽，其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:47中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
49.如权利要求32至38、47和48中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二多肽由SEQ ID NO:48中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
50.如权利要求49所述的双特异性抗体，其中所述第一VL通过弯曲区连接至所述第二多肽，其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:48中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
51.如权利要求32至38中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽由SEQ IDNO:49中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
52.如权利要求51所述的双特异性抗体，其中所述第一VH通过弯曲区连接至所述第一多肽，其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:49中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
53.如权利要求32至38、51和52中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二多肽由SEQ ID NO:50中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
54.如权利要求53所述的双特异性抗体，其中所述第一VL通过弯曲区连接至所述第二多肽，其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:50中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
55.一种双特异性抗体，其包含：
(I)第一抗原结合片段（第一Fab），其包含第一重链可变结构域（第一VH）和第一轻链可变结构域（第一VL），其中所述第一VH和所述第一VL配对形成第一可变区，其中所述第一VH通过接头或弯曲区连接至第一多肽，并且其中所述第一VL通过接头或弯曲区连接至第二多肽；并且其中所述第一多肽和所述第二多肽配对形成二聚体，以及
其中所述第一和第二多肽各自由以下氨基酸序列组成
(a)与SEQ ID NO:2中列出的人免疫球蛋白M的CH2结构域的氨基酸序列的氨基酸7-112相同的氨基酸序列；
(b)与具有N105Q突变的SEQ ID NO:2的氨基酸7-112相同的氨基酸序列；
(c)与具有S107A或S107C突变的SEQ ID NO:2的氨基酸7-112相同的氨基酸序列；
(d)与SEQ ID NO:2的氨基酸7-110相同的氨基酸序列；
(e)与具有N105Q突变的SEQ ID NO:2的氨基酸7-110相同的氨基酸序列；或者
(f)与具有S107A或S107C突变的SEQ ID NO:2的氨基酸7-110相同的氨基酸序列，
其中(a)至(f)中氨基酸位置的编号取决于SEQ ID NO:2；以及
(II)第二Fab，其包含第二VH和第二VL，其中所述第二VH和所述第二VL配对形成第二可变区，并且其中所述第二VH(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CH1结构域，并且所述第二VL(i)直接连接或(ii)通过接头连接至CL结构域，
其中所述第一Fab和所述第二Fab特异性结合不同的抗原或相同抗原的不同表位，
并且其中所述第一Fab连接至所述第二Fab。
56.如权利要求55所述的双特异性抗体，其中所述接头选自由Gly；Ser；Gly Ser；GlyGly Ser；Ser Gly Gly；SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 55-71的序列组成的组；并且所述弯曲区选自由SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 77-78的序列组成的组。
57.如权利要求55所述的双特异性抗体，其中所述第一Fab通过接头连接至所述第二Fab。
58.如权利要求57所述的双特异性抗体，其中所述接头是肽接头。
59.如权利要求55所述的双特异性抗体，其中所述第一Fab通过异源多肽连接至所述第二Fab。
60.如权利要求59所述的双特异性抗体，其中所述异源多肽是人血清白蛋白。
61.如权利要求59所述的双特异性抗体，其中所述异源多肽是XTEN。
62.如权利要求55所述的双特异性抗体，其中所述第一Fab通过聚乙二醇(PEG)连接至所述第二Fab。
63.如权利要求55至62中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自由SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112组成。
64.如权利要求55至62中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自由具有N105Q突变的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112组成。
65.如权利要求55至62中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自由具有S107A或S107C突变的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112组成。
66.如权利要求55至62中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自由SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-110组成。
67.如权利要求55至62中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自由具有N105Q突变的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-110组成。
68.如权利要求55至62中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一多肽和所述第二多肽各自由具有S107A或S107C突变的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-110组成。
69.根据权利要求32或55所述的双特异性抗体，其中所述第一Fab的第一多肽和所述第二Fab的CH1结构域直接连接或通过接头连接至Fc结构域，所述Fc结构域包含
(i)第一IgGl CH3结构域，其具有与SEQ ID NO:11中列出的序列相同的氨基酸序列，其中第364位和第370位的氨基酸为赖氨酸并且第409位的氨基酸是丝氨酸；(ii)第二IgGlCH3结构域，其具有与SEQ ID NO:11中所示的序列具有相同的氨基酸序列，其中第370位的氨基酸是丝氨酸并且第405位和第409位的氨基酸是赖氨酸；或者
(iii)第一IgGl CH3结构域，其具有与SEQ ID NO:11中列出的序列相同的氨基酸序列，其中第364位和第370位的氨基酸是赖氨酸并且第409位的氨基酸是亮氨酸；(iv)第二IgGlCH3结构域，其具有与SEQ ID NO:11所示的序列相同的氨基酸序列，其中第370位的氨基酸是丝氨酸，第397位的氨基酸是异亮氨酸，第405位和第409位的氨基酸是赖氨酸；
其中(i)至(iv)中的氨基酸位置基于EU编号系统，并且
其中所述第一IgG1 CH3结构域和所述第二IgG1 CH3配对形成异二聚体。
70.根据权利要求69所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域进一步包含来自IgG1的第一和第二CH2结构域。
71.根据权利要求69所述的双特异性抗体，其中所述Fc结构域还包含来自IgG4的第一和第二CH2结构域。
72.一种四价双特异性抗体，其包含：
(i)特异性结合第一抗原的第一表位的完整IgG抗体，所述完整IgG抗体包含第一CH3结构域和第二CH3结构域；以及
(ii)第一Fab和第二Fab，
其中所述第一Fab包含第一重链可变结构域（第一VH）和第一轻链可变结构域（第一VL），其中所述第一VH和所述第一VL配对以形成特异性结合所述第一抗原的第二表位或第二抗原的第一可变区，并且
其中所述第二Fab包含第二重链可变结构域（第二VH）和第二轻链可变结构域（第二VL），其中所述第二VH和所述第二VL配对以形成特异性结合与所述第一Fab相同的表位或相同的第二抗原的第二可变区；
其中所述第一VH通过接头或弯曲区连接至第一多肽，所述第一VL通过接头或弯曲区连接至第二多肽，所述第二VH通过接头或弯曲区连接至第三多肽，并且所述第二VL通过接头或弯曲区连接至第四多肽；其中所述第一多肽和所述第二多肽配对形成二聚体，所述第三多肽和所述第四多肽配对形成二聚体；其中：
(a)第一和第三多肽各自由与SEQ ID NO:3的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成，并且第二和第四多肽各自由与SEQ ID NO:4的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成；
(b)第一和第三多肽各自由与SEQ ID NO:47的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成，并且第二和第四多肽各自由与SEQ ID NO:48的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成；
(c)第一和第三多肽各自由与SEQ ID NO:49的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成，并且第二和第四多肽各自由与SEQ ID NO:50的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成；或者
(d)第一和第三多肽各自由与SEQ ID NO:5的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成，并且第二和第四多肽各自由与SEQ ID NO:6的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成；并且
其中所述第一Fab连接至所述完整IgG抗体的所述第一CH3结构域的C-末端，并且所述第二Fab连接至所述完整IgG抗体的所述第二CH3结构域的C-末端。
73.如权利要求72所述的四价双特异性抗体，其中所述接头选自由Gly；Ser；Gly Ser；Gly Gly Ser；Ser Gly Gly；SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 55-71的序列组成的组；并且所述弯曲区选自由SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 77-78的序列组成的组。
74.如权利要求72或73所述的四价双特异性抗体，其中所述第一Fab通过第一接头连接至所述完整IgG抗体的所述第一CH3结构域的C-末端，并且所述第二Fab通过第二接头连接至所述完整IgG抗体的所述第二CH3结构域的C-末端。
75.如权利要求74所述的四价双特异性抗体，其中所述第一接头和所述第二接头是肽接头。
76.如权利要求72至75中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一多肽和所述第三多肽各自由SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
77.如权利要求76所述的四价双特异性抗体，其中所述第一VH通过弯曲区连接至所述第一多肽，并且所述第二VH通过弯曲区连接至所述第三多肽，并且其中所述弯曲区由与SEQID NO:5中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
78.如权利要求72至77中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第二多肽和所述第四多肽各自由SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
79.如权利要求78所述的四价双特异性抗体，其中所述第一VL通过弯曲区连接至所述第二多肽，并且所述第二VL通过弯曲区连接至所述第四多肽，并且其中所述弯曲区由与SEQID NO:6中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
80.如权利要求72至75中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一和第三多肽各自由SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成，并且第二多肽和第四多肽各自由SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
81.如权利要求72至75中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一和第三多肽各自由SEQ ID NO:47中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成，并且所述第二和第四多肽各自由SEQ ID NO:48中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
82.如权利要求72至75中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一和第三多肽各自由SEQ ID NO:49的氨基酸6-104组成，并且所述第二和第四多肽各自由SEQ ID NO:50中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
83.一种四价双特异性抗体，其包含：
(i)特异性结合第一抗原的第一表位的完整IgG抗体，所述完整IgG抗体包含第一CH3结构域和第二CH3结构域；以及
(ii)第一Fab和第二Fab，
其中所述第一Fab包含第一重链可变结构域（第一VH）和第一轻链可变结构域（第一VL），其中所述第一VH和所述第一VL配对以形成特异性结合所述第一抗原的第二表位或第二抗原的第一可变区，并且
其中所述第二Fab包含第二重链可变结构域（第二VH）和第二轻链可变结构域（第二VL），其中所述第二VH和所述第二VL配对以形成特异性结合与所述第一Fab相同的表位或相同的第二抗原的第二可变区；
其中所述第一VH通过接头或弯曲区连接至第一多肽，所述第一VL通过接头或弯曲区连接至第二多肽，所述第二VH通过接头或弯曲区连接至第三多肽，并且所述第二VL通过接头或弯曲区连接至第四多肽；其中所述第一多肽和所述第二多肽配对形成二聚体，所述第三多肽和所述第四多肽配对形成二聚体；并且其中所述第一、第二、第三和第四多肽各自由以下氨基酸序列组成：
(a)与SEQ ID NO:2中列出的人免疫球蛋白M的CH2结构域的氨基酸序列的氨基酸7-112相同的氨基酸序列；
(b)与具有N105Q突变的SEQ ID NO:2的氨基酸7-112相同的氨基酸序列；
(c)与具有S107A或S107C突变的SEQ ID NO:2的氨基酸7-112相同的氨基酸序列；
(d)与SEQ ID NO:2的氨基酸7-110相同的氨基酸序列；
(e)与具有N105Q突变的SEQ ID NO:2的氨基酸7-110相同的氨基酸序列；或者
(f)与具有S107A或S107C突变的SEQ ID NO:2的氨基酸7-110相同的氨基酸序列，
其中(a)至(f)中氨基酸位置的编号取决于SEQ ID NO:2；并且
其中所述第一Fab连接至所述完整IgG抗体的所述第一CH3结构域的C-末端，并且所述第二Fab连接至所述完整IgG抗体的所述第二CH3结构域的C-末端。
84.如权利要求83所述的四价双特异性抗体，其中所述接头选自由Gly；Ser；Gly Ser；Gly Gly Ser；Ser Gly Gly；SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 55-71的序列组成的组；并且所述弯曲区选自由SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 77-78的序列组成的组。
85.如权利要求83或84所述的四价双特异性抗体，其中所述第一Fab通过第一接头连接至所述完整IgG抗体的所述第一CH3结构域的C-末端，并且所述第二Fab通过第二接头连接至所述完整IgG抗体的所述第二CH3结构域的C-末端。
86.如权利要求83至85中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽和所述第四多肽各自由具有N105Q突变的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112组成。
87.如权利要求83至85中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽和所述第四多肽各自由具有S107A或S107C突变的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112组成。
88.如权利要求83至85中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽和所述第四多肽各自由SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112组成。
89.如权利要求83至85中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽和所述第四多肽各自由SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-110组成。
90.如权利要求83至85中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽和所述第四多肽各自由具有N105Q突变的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-110组成。
91.如权利要求83至85中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽和所述第四多肽各自由具有S107A或S107C突变的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-110组成。
92.一种四价双特异性抗体，其包含：
(i)第一Fab和第二Fab，
其中所述第一Fab包含第一重链可变结构域（第一VH）和第一轻链可变结构域（第一VL），其中所述第一VH和所述第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一表位的第一可变区，并且
其中所述第二Fab包含第二重链可变结构域（第二VH）和第二轻链可变结构域（第二VL），其中所述第二VH和所述第二VL配对以形成特异性结合所述第一抗原的所述第一表位的第二可变区；以及
(ii)完整抗体，其包含含有第一IgG CH2结构域和第一IgG CH3结构域的第一重链、含有第二IgG CH2结构域和第二IgG CH3结构域的第二重链、第一轻链、以及第二轻链，其中所述抗体包含第三VH和第三VL以及第四VH和第四VL，其中所述第三VH和所述第三VL配对以形成特异性结合第二抗原的表位的第三可变区，并且其中所述第四VH和所述第四VL配对以形成特异性结合所述第二抗原的所述相同表位的第四可变区，
其中所述第三VH通过接头或弯曲区连接至第一多肽，所述第三VL通过接头或弯曲区连接至第二多肽，所述第四VH通过接头或弯曲区连接至第三多肽，并且所述第四VL通过接头或弯曲区连接至第四多肽；其中所述第一多肽连接至所述第一IgG CH2结构域的N-末端并且所述第三多肽连接至所述第二IgG CH2结构域的N-末端；其中所述第一多肽和所述第二多肽配对形成二聚体，所述第三多肽和所述第四多肽配对形成二聚体；
其中：
(a)第一和第三多肽各自由与SEQ ID NO:3的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成，第二和第四多肽各自由与SEQ ID NO:4的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成；
(b)第一和第三多肽各自由与SEQ ID NO:47的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成，第二和第四多肽各自由与SEQ ID NO:48的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成；
(c)第一和第三多肽各自由与SEQ ID NO:49的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成，第二和第四多肽各自由与SEQ ID NO:50的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成；或者
(d)第一和第三多肽各自由与SEQ ID NO:5的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成，第二和第四多肽各自由与SEQ ID NO:6的氨基酸6-104相同的氨基酸序列组成；并且
其中所述第一Fab连接至所述第一IgG CH3结构域的C-末端，并且所述第二Fab连接至所述第二IgG CH3结构域的C-末端。
93.如权利要求92所述的四价双特异性抗体，其中所述接头选自由Gly；Ser；Gly Ser；Gly Gly Ser；Ser Gly Gly；SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 55-71的序列组成的组；并且所述弯曲区选自由SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 77-78的序列组成的组。
94.如权利要求92或93所述的四价双特异性抗体，其中所述第一Fab通过第一接头连接至所述第一IgG CH3结构域的C-末端，并且所述第二Fab通过第二接头连接至所述第二IgGCH3结构域的C-末端。
95.如权利要求94所述的四价双特异性抗体，其中所述第一接头和所述第二接头是肽接头。
96.如权利要求92至95中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一多肽和所述第三多肽各自由SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
97.如权利要求96所述的四价双特异性抗体，其中所述第三VH通过弯曲区连接至所述第一多肽，并且所述第四VH通过弯曲区连接至所述第三多肽，并且其中所述弯曲区由与SEQID NO:5中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
98.如权利要求92至97中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第二多肽和所述第四多肽各自由SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
99.如权利要求98所述的四价双特异性抗体，其中所述第三VL通过弯曲区连接至所述第二多肽，并且所述第四VL通过弯曲区连接至所述第四多肽，并且其中所述弯曲区由与SEQID NO:6中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
100.如权利要求92至95中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一和所述第三多肽各自由SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
101.如权利要求100所述的四价双特异性抗体，其中所述第三VH通过弯曲区连接至所述第一多肽，并且所述第四VH通过弯曲区连接至所述第三多肽，并且其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
102.如权利要求92至95、100和101中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第二和第四多肽各自由SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
103.如权利要求102所述的四价双特异性抗体，其中所述第三VL通过弯曲区连接至所述第二多肽，并且所述第四VL通过弯曲区连接至所述第四多肽，并且其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
104.如权利要求92至95中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一和第三多肽各自由SEQ ID NO:47中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
105.如权利要求104所述的四价双特异性抗体，其中所述第三VH通过弯曲区连接至所述第一多肽，并且所述第四VH通过弯曲区连接至所述第三多肽，并且其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:47中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
106.如权利要求92至95、104和105中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第二和第四多肽各自由SEQ ID NO:48中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
107.如权利要求106所述的四价双特异性抗体，其中所述第三VL通过弯曲区连接至所述第二多肽，并且所述第四VL通过弯曲区连接至所述第四多肽，并且其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:48中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
108.如权利要求92至95中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一和第三多肽各自由SEQ ID NO:49中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
109.如权利要求108所述的四价双特异性抗体，其中所述第三VH通过弯曲区连接至所述第一多肽，并且所述第四VH通过弯曲区连接至所述第三多肽，并且其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:49中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
110.如权利要求92至95、108和109中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第二和第四多肽各自由SEQ ID NO:50中列出的氨基酸序列的氨基酸6-104组成。
111.如权利要求110所述的四价双特异性抗体，其中所述第三VL通过弯曲区连接至所述第二多肽，并且所述第四VL通过弯曲区连接至所述第四多肽，并且其中所述弯曲区由与SEQ ID NO:50中列出的氨基酸序列的氨基酸1-5具有同一性的氨基酸序列组成。
112.一种四价双特异性抗体，其包含：
(i)第一Fab和第二Fab，
其中所述第一Fab包含第一重链可变结构域（第一VH）和第一轻链可变结构域（第一VL），其中所述第一VH和所述第一VL配对以形成特异性结合第一抗原的第一表位的第一可变区，并且
其中所述第二Fab包含第二重链可变结构域（第二VH）和第二轻链可变结构域（第二VL），其中所述第二VH和所述第二VL配对以形成特异性结合所述第一抗原的所述第一表位的第二可变区；以及
(ii)完整抗体，其包含含有第一IgG CH2结构域和第一IgG CH3结构域的第一重链、含有第二IgG CH2结构域和第二IgG CH3结构域的第二重链、第一轻链、以及第二轻链，其中所述抗体包含第三VH和第三VL以及第四VH和第四VL，其中所述第三VH和所述第三VL配对以形成特异性结合第二抗原的表位的第三可变区，并且其中所述第四VH和所述第四VL配对以形成特异性结合所述第二抗原的所述相同表位的第四可变区，
其中所述第三VH通过接头或弯曲区连接至第一多肽，所述第三VL通过接头或弯曲区连接至第二多肽，所述第四VH通过接头或弯曲区连接至第三多肽，并且所述第四VL通过接头或弯曲区连接至第四多肽；其中所述第一多肽连接至所述第一IgG CH2结构域的N-末端并且所述第三多肽连接至所述第二IgG CH2结构域的N-末端；其中所述第一多肽和所述第二多肽配对形成二聚体，所述第三多肽和所述第四多肽配对形成二聚体；并且其中所述第一、第二、第三和第四多肽各自由以下氨基酸序列组成：
(a)与SEQ ID NO:2中列出的人免疫球蛋白M的CH2结构域的氨基酸序列的氨基酸7-112相同的氨基酸序列；
(b)与具有N105Q突变的SEQ ID NO:2的氨基酸7-112相同的氨基酸序列；
(c)与具有S107A或S107C突变的SEQ ID NO:2的氨基酸7-112相同的氨基酸序列；
(d)与SEQ ID NO:2的氨基酸7-110相同的氨基酸序列；
(e)与具有N105Q突变的SEQ ID NO:2的氨基酸7-110相同的氨基酸序列；或者
(f)与具有S107A或S107C突变的SEQ ID NO:2的氨基酸7-110相同的氨基酸序列，
其中(a)至(f)中氨基酸位置的编号取决于SEQ ID NO:2；并且
其中所述第一Fab连接至所述第一IgG CH3结构域的C-末端，并且所述第二Fab连接至所述第二IgG CH3结构域的C-末端。
113.如权利要求112所述的四价双特异性抗体，其中所述接头选自由Gly；Ser；GlySer；Gly Gly Ser；Ser Gly Gly；SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 55-71的序列组成的组；并且所述弯曲区选自由SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 77-78的序列组成的组。
114.如权利要求112或113所述的四价双特异性抗体，其中所述第一Fab通过第一接头连接至所述第一IgG CH3结构域的C-末端，并且所述第二Fab通过第二接头连接至所述第二IgG CH3结构域的C-末端。
115.如权利要求114所述的四价双特异性抗体，其中所述第一接头和所述第二接头是肽接头。
116.如权利要求112至115中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽和所述第四多肽各自由与具有N105Q突变的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112具有同一性的氨基酸序列组成。
117.如权利要求112至115中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽和所述第四多肽由具有S107A或S107C突变的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112组成。
118.如权利要求112至115中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽和所述第四多肽各自由SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-112组成。
119.如权利要求112至115中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽和所述第四多肽各自由SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-110组成。
120.如权利要求112至115中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽和所述第四多肽各自由具有N105Q突变的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-110组成。
121.如权利要求112至115中任一项所述的四价双特异性抗体，其中所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽和所述第四多肽各自由具有S107A或S107C突变的SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的氨基酸7-110组成。
122.如权利要求72、83、92和112中任一项所述的四价双特异性抗体，其中
(i)第一CH3结构域包含与SEQ ID NO:11中列出的序列相同的氨基酸序列，其中第364位和第370位的氨基酸是赖氨酸并且第409位的氨基酸是丝氨酸；(ii)第二IgGl CH3结构域包含与SEQ ID NO:11中列出的序列相同的氨基酸序列，其中第370位的氨基酸是丝氨酸并且第405位和第409位的氨基酸是赖氨酸；或者
(iii)第一IgGl CH3结构域包含与SEQ ID NO:11中列出的序列相同的氨基酸序列，其中第364位和第370位的氨基酸是赖氨酸并且第409位的氨基酸是亮氨酸；(iv)第二IgGlCH3结构域包含与SEQ ID NO:11中列出的序列相同的氨基酸序列，其中第370位的氨基酸是丝氨酸，第397位的氨基酸是异亮氨酸，第405位和第409位的氨基酸是赖氨酸；
其中(i)至(iv)中的氨基酸位置基于EU编号系统，并且
其中所述第一IgG1 CH3结构域和所述第二IgG1 CH3配对形成异二聚体。
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