CN116867800A - 双特异性或多特异性抗体 - Google Patents

双特异性或多特异性抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种新形式的双特异性或多特异性抗体，其包括其中CH3二聚体已被引入Fab区的一部分的多肽。新形式的双特异性或多特异性抗体尽管在重链和轻链之间几乎不表现出非特异性结合并且几乎不产生同源二聚体，但能够形成异源二聚体，并且因此可以通过动物细胞高度表达。另外，双特异性或多特异性抗体可以通过现有的单克隆抗体的纯化过程获得，并且具有等同于或高于单克隆抗体的稳定性。

Description

双特异性或多特异性抗体
技术领域
本发明涉及一种新型双特异性或多特异性抗体，并且涉及一种包括具有引入Fab区的一部分的CH3二聚体的多肽的双特异性或多特异性抗体。
背景技术
由于最近已经确定了一种适应症的各种原因和机制，在治疗剂开发中出现了从一种类型的靶标到多种类型的靶标的方法。因此，在使用抗体的治疗剂的开发中，几十年来已经进行了各种研究，以将单特异性抗体的特征赋予能特异性结合两种或更多种抗原性蛋白质的双特异性或多特异性机制。
大多数生物抗体药物由单一靶抗体骨架诸如IgG1或IgG4组成。然而，由于多种靶标的机制作用于疾病，这种生物抗体药物作为针对单一靶标的抗体治疗剂具有诸如功效、便利性和副作用的局限性。
目前，各种临床阶段集中于两种单克隆抗体的联合疗法。因此，需要开发使一种蛋白质结合两种或更多种靶标的抗体。
在过去20年左右的时间里，已经发表了几篇与此相关的研究论文。目前，在临床阶段中，研究/开发了少量经许可的双特异性抗体和大量的候选材料，并且经许可的双特异性抗体的实例包括卡妥索单抗(Removab)、博纳吐单抗(Blincyto)(BiTETM)和艾美赛珠单抗(Hemlibra)。
然而，仍然需要改进所开发的双靶或多靶抗体的产量、生产率、溶解性、聚集性和稳定性。
在这一技术背景下，作为开发新型双特异性或多特异性抗体的长期努力的结果，本发明人开发出了包括具有引入Fab区的CH3二聚体的多肽的双特异性或多特异性抗体。基于此，完成了本发明。
发明内容
技术问题
因此，鉴于上述问题完成了本发明，并且本发明的目的是提供新型双特异性或多特异性抗体平台。
技术方案
根据本发明的一个方面，上述和其他目的可以通过提供双特异性抗体来实现，该双特异性抗体包括与第一抗原结合且包括VH1-CHa-Fc1和VL1-CLb的第一臂，以及与第二抗原结合且包括VH2-CH1-Fc2和VL2-CL的第二臂，
其中，VH1和VH2各自是包括相同或不同抗原结合区的重链可变区，
VL1和VL2各自是包括相同或不同抗原结合区的轻链可变区，
CHa包括i)IgG重链恒定区或IgD重链恒定区CH1，和IgG重链恒定区CH2或CH3，或ii)IgM重链恒定区CH3，
CLb包括i)含有IgG轻链恒定区λ或κ的CL1，和选自由IgG重链恒定区CH1、CH2和CH3组成的组的至少一个，或ii)IgM重链恒定区CH3，
CHa和CLb相互连接形成二聚体，
CH1是IgG重链恒定区CH1，以及CL是IgG轻链恒定区CL，并且
第一臂的Fc1与第二臂的Fc2连接，以形成重链恒定区二聚体。
根据本发明的另一方面，提供双特异性抗体，该双特异性抗体包括与第一抗原结合且包括VH1-CHa-Fc1和VL1-CLb的第一臂，以及与第二抗原结合且包括VH2-CH1-Fc2和VL2-CL的第二臂，
其中，VH1和VH2各自是包括相同或不同抗原结合区的重链可变区，
VL1和VL2各自是包括相同或不同抗原结合区的轻链可变区，
CHa包括IgG重链恒定区CH3和IgG重链恒定区CH1，
CLb包括含有IgG轻链恒定区λ或κ的CL1，和含有IgG重链恒定区的CH3，
CHa和CLb相互连接形成二聚体，
CH1是IgG重链恒定区CH1，以及CL是IgG轻链恒定区CL，并且
第一臂的Fc1与第二臂的Fc2连接，以形成重链恒定区二聚体。
根据本发明的另一方面，提供了包括双特异性抗体的多特异性抗体。
附图说明
图1示出了第一双特异性抗体候选物的结构。
图2示出了第二双特异性抗体候选物的结构。
图3示出了第三双特异性抗体候选物的结构。
图4示出了第四双特异性抗体候选物的结构。
图5示出了第五双特异性抗体候选物的结构。
图6示出了第六双特异性抗体候选物的结构。
图7示出了第七双特异性抗体候选物的结构。
图8示出了结合三种靶标的多特异性抗体的结构。
图9示出了结合四种靶标的多特异性抗体的结构。
图10示出了示例性二价双特异性抗体形式。
图11是分别示出Q-SBL1和R-SBL1构建体的双特异性抗体形式的示意图。
图12A至12B是示出根据接头数量的Q-SBL1(图12A)和R-SBL1(图12B)的各种双特异性抗体形式的示意图。
图13A至13B是示出根据铰链区的Q-SBL1(图13A)和R-SBL1(图13B)的各种双特异性抗体形式的示意图。
图14是示出在杵(knob)-CH3/臼(hole)-CH3结构域互换时Q-SBL1的各种双特异性抗体形式的示意图。
图15是示出每个Q-SBL9的双特异性抗体形式的示意图。
图16示出了示例性三价双特异性抗体形式。
图17示出了示例性四价双特异性抗体形式。
图18示出了通过瞬时生产ExpiCHO-S培养上清液获得的双特异性抗体候选物的非还原SDS-PAGE，其中，(A)是Q-SBL-1、2、3、4和R-SBL-1、2、3、4的SDS-PAGE凝胶图像(S：大小标记(kDa)，泳道1：Q-SBL-2，泳道2：Q-SBL-1，泳道3：Q-SBL-3，泳道4：Q-SBL-4，泳道5：R-SBL-2，泳道6：R-SBL-1，泳道7：R-SBL-3，泳道8：R-SBL-4)，(B)是Q-SBL-1、Q-SBL-5、R-SBL-1、R-SBL-5和R-SBL-6的SDS-PAGE凝胶图像(S：大小标记(kDa)，泳道1：Q-SBL-1，泳道2：Q-SBL-5，泳道3：R-SBL-1，泳道4：R-SBL-5，泳道5：R-SBL-6，(C)是Q-SBL-1、Q-SBL-6、Q-SBL-7、Q-SBL-8的SDS-PAGE凝胶图像(S：大小标记(kDa)，泳道1：Q-SBL-1，泳道2：Q-SBL-6，泳道3：Q-SBL-7，泳道4：Q-SBL-8)，以及(D)是Q-SBL9的SDS-PAGE凝胶图像(S：大小标记(kDa)，泳道1：Q-SBL9)。
图19示出了通过三步纯化获得的双特异性抗体产物的非还原SDS-PAGE分析结果。
图20A至20D示出了在每个纯化步骤中获得的双特异性抗体产物的SEC-HPLC图谱(图20A：Q-SBL1、2、3和4，图20B：R-SBL1、2、3和4，图20C：Q-SBL5、R-SBL5和6，以及图20D：Q-SBL6、7、8和9)。
图21示出了在非还原条件下通过三步纯化获得的抗体的CE-SDS的分析结果。
图22示出了通过三步纯化获得的Q-SBL2(A)和Q-SBL9(B)的差示扫描量热法(DSC)热谱图。
图23A和23B示出了双特异性抗体与VEGF和HER2的同时双重结合(图23A-A)：◆：Q-SBL1，●：Q-SBL2，▲：Q-SBL3，(图23A-B)●：Q-SBL1，■：R-SBL1，▲：R-SBL2，◆：R-SBL3，(图23A-C)●：Q-SBL1，■：Q-SBL5，▲：R-SBL5，◆：R-SBL6，(图23A-D)●：Q-SBL1，■：Q-SBL6，◆：Q-SBL7，▲：Q-SBL8，(图23B)◆：Q-SBL9。
图24示出了使用Q-SBL9的双特异性抗体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的抑制作用，其中将不同浓度的双特异性抗体温孵3天，并且然后用CCK-8溶液处理，并且每个样品重复三次进行。
图25示出了双特异性抗体与C1q蛋白质结合的测定结果；■：曲司珠单抗(Trastuzumab)，●：Q-SBL2，▲：Q-SBL9。
最佳实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解的相同含义。通常，本文所用的术语是本领域公知的，并且是通常使用的。
一方面，本发明涉及一种双特异性抗体，该双特异性抗体包括与第一抗原结合且包括VH1-CHa-Fc1和VL1-CLb的第一臂，以及与第二抗原结合且包括VH2-CH1-Fc2和VL2-CL的第二臂，
其中，VH1和VH2各自是包括相同或不同抗原结合区的重链可变区，
VL1和VL2各自是包括相同或不同抗原结合区的轻链可变区，
CHa包括i)IgG重链恒定区或IgD重链恒定区CH1，和IgG重链恒定区CH2或CH3，或ii)IgM重链恒定区CH3，
CLb包括i)含有IgG轻链恒定区λ或κ的CL1，和选自由IgG重链恒定区CH1、CH2和CH3组成的组的至少一个，或ii)IgM重链恒定区CH3，
CH1是IgG重链恒定区CH1，以及CL是IgG轻链恒定区CL，并且
第一臂的Fc1与第二臂的Fc2连接，以形成重链恒定区二聚体。
如本文所用，术语“双特异性”是指结合蛋白特异性结合两种不同类型靶标以控制靶标活性的能力。例如，双特异性可以通过单克隆抗体或其片段的缀合来获得，该单克隆抗体或其片段特异性结合每个靶标，具有两个不同的抗原结合臂(臂：对两个靶标具有特异性)并且对每个结合的抗原是一价的。
VH1和VH2各自是包括相同或不同抗原结合区的重链可变区。VL1和VL2各自是包括相同或不同抗原结合区的轻链可变区。
术语“多肽”是指任何氨基酸的聚合链。术语“肽”和“蛋白质”可与术语“多肽”互换使用，“多肽”也指任何氨基酸的聚合链。术语“多肽”包括天然或合成的蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。
关于抗体、多肽、蛋白质或肽的相互作用，术语“特异性结合”或“特异地结合”意指相互作用取决于化学物类的特异性构建体(例如，抗原决定簇或表位)的存在。例如，抗体通常识别并结合特异性蛋白质构建体，而不是蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，在涉及经标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或释放的未标记的A)的分子的存在减少了与抗体结合的经标记的A的量。
抗体是指由四条多肽链，两条重(H)链和两条轻(L)链组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或者具有这种Ig分子不可缺少的表位结合特性的任何功能片段、突变体、变体或衍生物。这种突变体、变体或衍生物的具体实例如下所述，但不限于此。
术语“单克隆抗体”是指从基本上均一的抗体群体中获得的相同抗体，即构成该群体的每个抗体，其中排除了可能以微量存在的可能的天然发生的突变。单克隆抗体是高度特异性的，并且因此针对单一抗原位点进行诱导。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。
术语“表位”是指抗体可以特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由一组化学活性表面分子诸如氨基酸或糖侧链组成，并且一般不仅具有特定的三维结构特征，还具有特定的电荷特征。三维表位与非三维表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，前者的键断裂，而后者的键不会断裂。
“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体是一种嵌合抗体，该嵌合抗体包括衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基被具有期望的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区的残基取代。
如本文所用，术语“人抗体”是指衍生自人免疫球蛋白的分子，其中构成抗体的所有氨基酸序列(包括互补性决定区和结构区)由人免疫球蛋白组成。
在完整的抗体中，每个重链由重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可细分为称为“互补性决定区”(CDR)的高变区和分布在CDR中的称为“框架区”(FR)的另外保守区。如本文所用，术语“可变结构域”是指包括互补性决定区(CDR；即，CDR1、CDR2和CDR3)和框架区(FR)的氨基酸序列的抗体分子的轻链和重链区。VH指重链的可变结构域。VL指轻链的可变结构域。
术语“互补决定区”(CDR；即，CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其对于抗原结合是必需的。每个可变结构域通常具有三个CDR区，其标识为CDR1、CDR2和CDR3。
术语“框架区”(FR)是指除CDR残基以外的可变结构域残基。每个可变结构域通常具有四个FR，其标识为FR1、FR2、FR3和FR4。
它们从氨基末端至羧基末端的排列顺序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或亚类。
Fab片段是指包括重链和轻链的每一条的可变区、轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)的结构，各自都具有一个抗原结合位点。Fab'与Fab的不同之处在于它还包括铰链区，该铰链区在位于重链的CH1结构域的C-末端包括至少一个半胱氨酸残基。F(ab')2由Fab'的铰链区中的半胱氨酸残基之间的二硫键产生。Fv是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段。双链Fv是其中重链可变区和轻链可变区通过非共价键连接的片段，并且单链Fv(scFv)是其中重链可变区和轻链可变区通常经由其间的肽接头通过共价键连接，或者直接在C-末端处连接，形成二聚体样结构(如双链Fv)的片段。这种抗体片段可以使用蛋白酶来获得(例如，Fab可通过用木瓜蛋白酶限制性切割完整抗体来获得，以及F(ab')2片段可通过用胃蛋白酶限制性切割完整抗体来获得)，并且可以使用基因重组技术产生。
根据本发明的抗体包括“抗原结合部分”，其包括具有特异性结合抗原的能力的至少一个抗体片段，并且可以特异性结合其它抗原，并且因此可以是双特异性或多特异性。在本发明中，抗原结合部分包括在VH1或VH2的重链可变区以及VL1或VL2的轻链可变区中，并且各自包括相同或不同的抗原结合区。
两个不同的可变区可以结合两种抗原。为了最小化轻链的错配，可以将IgG CH3二聚体另外引入Fab的C-末端部分或者两个Fab区中的一个中的Fab可变区和恒定区之间。通过另外将CH3二聚体引入Fab区中的一个，Fab区的两条臂可以彼此不对称。可以将各种类型的CH1结构域引入Fab区中的一个中的CH1/CL部分。因此，有可能产生具有优异生产率和稳定性的双特异性或多特异性抗体。
根据本发明，抗体并没有明显偏离IgG样结构。大幅偏离IgG结构的结构极有可能使蛋白质不稳定。
此外，将免疫球蛋白结构的恒定区另外引入错配的轻链部分，以大大降低错配的频率。通过将已知的重链恒定区结构域引入两个Fab臂中的一个中来防止轻链错配。
第一双特异性抗体候选物在与靶标结合的两个Fab部分中的左臂(第二臂)中没有结构修饰，并且可以具有被另外引入到右臂(第一臂)中的Ig恒定结构域(CH3)，可以具有IgG1 CH1以及引入来替代IgG1 CH1的各种类型的CH1，并且可以具有作为重链的异二聚体结构的杵臼(knob-in-hole)结构。
在第二候选双特异性抗体中，可以改变与靶标结合的两个Fab部分中的右Fab臂部分。所改变的部分可以改变在第一双特异性抗体候选物中CH3结构域和CH1结构域的位置。
在一些情况下，第三双特异性抗体候选物可以具有其中CH1/CL被IgM的CH3置换的构型。
CHa包括i)IgG重链恒定区或IgD重链恒定区CH1，和IgG重链恒定区CH2或CH3，或ii)IgM重链恒定区CH3，
CHa可以衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM。具体地，CHa可以包括选自由以下组成的组的至少一个：衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的重链恒定区CH1、CH2和CH3。例如，CHa可以在第一臂中从N-末端至C-末端按顺序包括衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的重链恒定区CH1，并且包括衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD和IgM的重链恒定区CH3。例如，CHa可以在第一臂中从N-末端至C-末端按顺序包括衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的重链恒定区CH3，并且包括衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD和IgM的重链恒定区CH1。在一些情况下，CHa可以包括IgM衍生的重链恒定区CH3。
CLb包括i)含有IgG轻链恒定区λ或κ的CL1，和选自由IgG重链恒定区CH1、CH2和CH3组成的组的至少一个，或ii)IgM重链恒定区CH3，
CLb可以衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM。具体地，CLb可以包括含有衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的轻链恒定区λ或κ的CL1，和选自由以下组成的组的至少一个：衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的重链恒定区CH1、CH2和CH3。例如，CLb可以在第一臂中从N-末端至C-末端按顺序包括含有衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的轻链恒定区λ或κ的CL1，和衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的重链恒定区CH3。例如，CLb可以在第一臂中从N-末端至C-末端按顺序包括衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的重链恒定区CH3，以及含有衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的轻链恒定区λ或κ的CL1。在一些情况下，CLb可以包括衍生自IgM的重链恒定区CH3。
CH1是IgG重链恒定区CH1，以及CL是IgG轻链恒定区CL。CH1和CL中的每一个可以衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgD。CH1和CL可以通过非共价相互作用具有Fab片段样结构。
如本文所用，术语“Fc区”用于定义可通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生的免疫球蛋白重链的C-末端区。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区通常包括两个恒定结构域，CH2结构域和CH3结构域，并任选包括CH4结构域。
在一种实施方式中，CHa和CLb中的每一个都可以包括CH3。具体地，CHa和CLb中的每一个可以包括衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH3。CHa和CLb可以通过共价或非共价相互作用形成二聚体。
CHa和CLb可以通过经由或不用二硫键的链来连接。具体地，通过包括在第一臂的CHa和CLb的每一个中的CH3形成的二聚体，和包括分别包括在CHa和CLb中的CH1和CL1的Fab区中的CH3二聚体通过二硫键连接，并且CH1和CL1可以不用二硫键连接。
在一些情况下，CH3结构域和CH1结构域可以通过接头连接。接头可以是肽接头，并且可以包括约5-25个氨基酸(aa)残基，或具体地约5-10个氨基酸残基。例如，接头可以包括亲水性氨基酸，诸如甘氨酸和/或丝氨酸，但不限于此。
具体地，为了赋予结构柔性，接头例如包括甘氨酸接头(G，Gly)p(p为1至10)或GS接头(GnS)m(n和m各自为1至10)。具体地，接头可以包括GGGGS或(GGGGS)2，或(G，Gly)p 5-10个氨基酸的甘氨酸，其中p为5至10。
第一臂的Fc1和第二臂的Fc2各自包括重链恒定区的CH2和CH3单体。单体意指通过具有重链恒定区Fc的相同氨基酸序列的两个恒定结构域CH2-CH3形成的二聚体中的一个结构域。第一臂的Fc1和第二臂的Fc2相互连接形成重链恒定区二聚体。
二聚体可以包括通过在具有相同氨基酸序列的恒定结构域CH3之间键合形成的同二聚体，或者通过在具有不同氨基酸序列的恒定结构域CH3之间键合形成的异二聚体。
任选地，在CHa的CH3和CLb的CH3或Fc的一对CH3之间可以存在二硫键，或者在它们之间可以不用二硫键而形成链间连接。
在一种实施方式中，CHa的CH1和CLb的CL1可以经由二硫键或不用二硫键连接。具体地，CHa的CH1和CLb的CL1可以不用二硫键连接。
CHa和CLb各自包括CH3，并且CHa的CH3和CLb的CH3连接形成二聚体。CHa和CLb各自包括CH3，并且CH3可以通过二硫键形成二聚体。
CHa和CLb各自包括CH3，并且CHa的CH3和CLb的CH3连接形成二聚体。CHa和CLb各自包括CH3，并且CH3可以通过二硫键形成二聚体。
在一种实施方式中，通过将CHa的CH3与CLb的CH3键合而形成的二聚体中的一个包括选自由Y349C、S354C、T366S、T366W、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以及选自由S354C、Y349C、T366W、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，并且因此可以具有杵臼结构。
二聚体中的一个包括选自由T366W、S354C和Y349C组成的组的至少一个，以及另一个包括选自由S354C、Y349C、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以形成杵臼结构。具体地，通过将CHa的CH3与CLb的CH3键合而形成的二聚体中的一个包括S354C、T366S、L368A和Y407V，以及另一个包括Y349C和T366W，以形成杵臼结构。
具体地，CHa的CH1和CLb的CL1不用二硫键连接，i)CHa的CH3和CLb的CH3中的任何一个包括选自由Y349C、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以及另一个包括S354C和/或T366W，或者ii)CHa的CH3和CLb的CH3中的任何一个包括选自由S354C、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以及另一个包括Y349C和/或T366W。
CHa的CH1和CLb的CL1不用二硫键连接，i)CHa的CH3和CLb的CH3中的任何一个包括Y349C、T366S、L368A和Y407V，以及另一个包括S354C和/或T366W，或者ii)CHa的CH3和CLb的CH3中的一个包括S354C、T366S、L368A和Y407V，以及另一个包括Y349C和/或T366W。
在一种实施方式中，Fc的CH3二聚体中的一个包括选自由Y349C、S354C、T366S、T366W、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以及选自由S354C、Y349C、T366W、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以形成二聚体中的杵臼结构。
通过在IgG(免疫球蛋白G)的Fc结构域中形成突变，而稳定地形成不对称异二聚体。另外，重链的异二聚体结构可以是已知的杵臼结构。
由Genentech于1997年在一篇论文中首次发表的“杵臼结构”是目前被各种开发者最广泛采用的结构。虽然引入了杵臼结构，但是在杵臼结构中没有形成100％的异二聚体。因此，通过建立最佳转染条件获得高异二聚体比率以提高产量。
通过在两条不同Ig重链的CH3结构域中诱导突变，在一条Ig重链的CH3结构域中产生臼结构，并且在另一条Ig重链的CH3结构域中产生杵结构，从而两条Ig重链形成异二聚体。
针对于位于一个重链CH3结构域中CH3结构域相互作用位点的疏水性核心中的残基，杵臼技术将具有大侧链的疏水性氨基酸残基转化为具有小侧链的疏水性氨基酸，以形成臼结构。在另一个重链CH3结构域中，具有小侧链的疏水性氨基酸残基被具有大侧链的疏水性氨基酸置换以形成杵结构。因此，引入两对突变的重链恒定区突变对共表达以形成异二聚体重链恒定区。
在一种实施方式中，为了形成杵结构，CHa和CLb的CH3或者Fc的CH3可以包括选自由以下组成的组的至少一个：S354C、Y349C、T366W、T366S、L368A和Y407V。例如，为了形成臼结构，CHa和CLb的CH3或者Fc的CH3可以包括选自由以下组成的组的至少一个：Y349C、S354C、T366S、T366W、L368A和Y407V。
在另一实施方式中，例如，CHa和CLb的CH3或者Fc的CH3可以包括T366W以形成杵结构。为了形成臼结构，例如，CHa和CLb的CH3或者Fc的CH3可以包括选自由以下组成的组的至少一个：T366S、L368A和Y407V。具体地，为了形成杵结构，例如，可以包括Y349C和T366W。为了形成臼结构，例如，CHa和CLb的CH3或者Fc的CH3可以包括选自由以下组成的组的至少一个：S354C，T366S、L368A和Y407V。
贝伐珠单抗(bevacizumab)和曲司珠单抗(trastuzumab)的VH/VL氨基酸序列可以在各种类型的双特异性或多特异性抗体中用作两种类型的VH/VL氨基酸序列。氨基酸编号可以基于IMGT编号系统(基于根据http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs的Eu指数)。
每个候选物中使用的具体序列如下。
[表1]
[表2]
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[表3]
从图10可以看出，[A]在与一个(左边第二臂)表位结合的重链区的CH3结构域中具有杵结构，并且具有S354C和T366W突变以引入二硫键。在一些情况下，可以不引入二硫键。
在与另一个表位结合的重链区(右边第一臂)，与CH1结构域的C-末端连接的CH3结构域具有臼结构，并具有T366S、L368A和Y407V突变。在一些情况下，可以不引入二硫键。此时，CH3结构域具有Y349C突变。与重链区的CH2结构域的C-末端键合的CH3结构域具有臼结构，并通过二硫键具有Y349C、T366S、L368A和Y407V突变。在一些情况下，可以不引入二硫键。与轻链区的CL结构域的C-末端连接的CH3结构域具有杵结构，并具有T366W突变。在一些情况下，可以不引入二硫键。此时，CH3结构域具有S354C突变。可以将各种类型的CH1结构域引入重链区CH1结构域中。
E216、P217、K218、S219和C220可以添加到与另一个表位结合的重链区(右边第一臂)的IgG1 CH1结构域的C-末端。该目的在于与CL结构域形成二硫键。CH3结构域序列基于Uniprot网站(https://www.uniprot.org/uniprot/P01857)。IgD CH1结构域序列对应于在https://www.uniprot.org/uniprot/P01880中的氨基酸1至98的氨基酸序列。IgM CH1结构域序列对应于在https://www.uniprot.org/uniprot/P01871中的氨基酸1至105的氨基酸序列。
[H]在与一个(左边第二臂)表位结合的重链区的CH3结构域中具有杵结构，并且具有S354C和T366W突变以引入二硫键。
在一些情况下，可以不引入二硫键，并且可以保持S354。
与结合另一个表位的重链区(右边第一臂)中VH结构域的C-末端连接的CH3结构域具有臼结构，并具有T366S、L368A和Y407V突变。在一些情况下，可以不引入二硫键。CH3结构域具有Y349C突变。与重链区的CH2结构域的C-末端连接的CH3结构域具有臼结构，并且具有Y349C、T366S、L368A和Y407V突变以引入二硫键。在一些情况下，可以不引入二硫键，并且可以保持Y349。与轻链区的VL构域的C-末端连接的CH3结构域具有杵，并具有T366W突变。在一些情况下，可以不引入二硫键。CH3结构域具有S354C突变。可以将各种类型的CH1结构域引入重链区CH1结构域中。
将肘序列A118和S119添加到与另一个表位结合的重链区(右边第一臂)的VH结构域的C-末端，并且接下来，各种类型的CH3结构域与其键合。此处，CH3结构域的序列包括来自https://www.uniprot.org/uniprot/P01857中所示序列的P343至K447，无肘序列G341和Q342。将肘序列R108和T109添加至轻链区的VL结构域的C-末端，并且接下来，各种类型的CH3结构域与其键合。
[N]在与一个(左边第二臂)表位结合的重链区的CH3结构域中具有杵结构，并且具有S354C和T366W突变以引入二硫键。
将肘序列A118和S119添加至与另一个表位结合的重链区(右边第一臂)的VH结构域的C-末端，并且接下来，IgM CH3结构域与其键合。将肘序列R108和T109添加至轻链区的VL结构域的C-末端，并且接下来，IgM CH3结构域与其键合。IgM CH3结构域序列对应于在https://www.uniprot.org/uniprot/P01871中的氨基酸220至323的氨基酸序列。
[S，U]在与一个(左边第二臂)表位结合的重链区的CH3结构域中具有杵结构，并且具有S354C和T366W突变以引入二硫键。将肘序列A118和S119添加至与另一个表位结合的重链区(右边第一臂)的VH结构域的C-末端，并且接下来，GGGGS接头与其键合。另外，各种类型的CH3结构域与其键合。GGGGS接头包括具有不同长度的一至五个GGGGS重复序列。
每个候选物的具体序列如下。
[表4]
[表5]
[表6]
[表7]
[表8]
[表9]
[表10]
[表11]
[表12]
[表13]
[表14]
[表15]
[表16]
[表17]
[表18]
[表19]
[表20]
[表21]
[表22]
[表23]
[表24]
[表25]
另一方面，本发明涉及一种双特异性抗体，该双特异性抗体包括与第一抗原结合且包括VH1-CHa-Fc1和VL1-CLb的第一臂，以及与第二抗原结合且包括VH2-CH1-Fc2和VL2-CL的第二臂，
其中，VH1和VH2各自是包括相同或不同抗原结合区的重链可变区，
VL1和VL2各自是包括相同或不同抗原结合区的轻链可变区，
CHa包括IgG重链恒定区CH3和IgG重链恒定区CH1，
CLb包括含有IgG轻链恒定区λ或κ的CL1，和IgG重链恒定区CH3，CH1是IgG重链恒定区CH1，以及CL是IgG轻链恒定区CL，并且
第一臂的Fc1与第二臂的Fc2连接，以形成重链恒定区二聚体。
IgG重链恒定区CH3可以包括衍生自IgG1、IgG2、IgG3或Ig4的重链恒定区CH3。
IgG重链恒定区CH1可以包括衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区CH1。具体地，IgG重链恒定区CH1可以包括衍生自IgG1或Ig4的重链恒定区CH1。
CHa可以从第一臂的N-末端至C-末端按顺序包括IgG重链恒定区CH1和IgG重链恒定区CH3。CHa可以从第一臂的N-末端至C-末端按顺序包括IgG重链恒定区CH3和IgG重链恒定区CH1。
CLb可以从第一臂的N-末端至C-末端按顺序包括含有IgG轻链恒定区λ或κ的CL1和衍生自IgG的重链恒定区CH3。例如，CLb可以在第一臂中从N-末端至C-末端按顺序包括衍生自IgG的重链恒定区CH3，以及含有衍生自IgG的轻链恒定区λ或κ的CL1。
在一种实施方式中，CHa的CH1和CLb的CL1可以经由二硫键或不用二硫键连接。具体地，CHa的CH1和CLb的CL1可以不用二硫键连接。
CHa和CLb各自包括CH3，并且CHa的CH3和CLb的CH3连接以形成二聚体。CHa和CLb各自包括CH3，并且CH3可以通过二硫键形成二聚体。
具体地，通过包括在第一臂的CHa和CLb的每一个中的CH3形成的二聚体，和包括包括在CHa和CLb中的每一个中的CH1和CL1的Fab区中的CH3二聚体通过二硫键连接，并且CH1和CL1可以不用二硫键连接。
二聚体中的一个包括选自由T366W、S354C和Y349C组成的组的至少一个，以及另一个包括选自由S354C、Y349C、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以形成杵臼结构。具体地，通过将CHa的CH3与CLb的CH3键合而形成的二聚体中的一个包括S354C、T366S、L368A和Y407V，以及另一个包括Y349C和T366W，以形成杵臼结构。
具体地，CHa的CH1和CLb的CL1不用二硫键连接，i)CHa的CH3和CLb的CH3中的任何一个包括选自由Y349C、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以及另一个包括S354C和/或T366W，或者ii)CHa的CH3和CLb的CH3中的任何一个包括选自由S354C、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以及另一个包括Y349C和/或T366W。
CHa的CH1和CLb的CL1不用二硫键连接，i)CHa的CH3和CLb的CH3中的任何一个包括Y349C、T366S、L368A和Y407V，以及另一个包括S354C和/或T366W，或者ii)CHa的CH3和CLb的CH3中的任何一个包括S354C、T366S、L368A和Y407V，并且另一个包括Y349C和/或T366W。
CHa的CH3或CLb的CH3可以包括SEQ ID NO:8至13的序列。CHa的CH3或CLb的CH3可以包括IgG1 CH3结构域的杵(T366W)(SEQ ID NO:8)或臼(T366S/L368A/Y407V)(SEQ IDNO:9)的突变。IgG1 CH3结构域可以包括突变，即，杵(S354C/T366W)(SEQ ID NO:10)、臼(Y349C/T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:11)、杵(Y349C/T366W)(SEQ ID NO:12)、或臼(S354C/T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:13)，以生成二硫键的半胱氨酸。
在一些情况下，CHa的CH3和CH1以及CLb的CH3和CL1可以通过接头连接。接头可以是肽接头，并且可以包括约5-25个氨基酸(aa)残基，或具体地约5-10个氨基酸残基。例如，接头可以包括亲水性氨基酸，诸如甘氨酸和/或丝氨酸，但不限于此。
具体地，为了赋予结构柔性，接头例如包括甘氨酸接头(G，Gly)p(p为1至10)或GS接头(GnS)m(n和m各自为1至10)。具体地，接头可以包括GGGGS或(GGGGS)2，或(G，Gly)p 5-10个氨基酸的甘氨酸，其中p为5至10。
在由第一臂的Fc1和第二臂的Fc2形成的二聚体中，CH3二聚体可以包括可以用或不用二硫键连接的单体。在一种实施方式中，Fc的CH3二聚体中的一个包括选自由Y349C、S354C、T366S、T366W、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以及包括选自由S354C、Y349C、T366W、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以形成二聚体中的杵臼结构。
第一臂和第二臂可以通过铰链连接。第一臂和第二臂可以通过铰链连接，该铰链包括选自由以下组成的组的一个或多个序列：
DKTHTCPPCP；
EPKSSDKTHTCPPCP；以及
ESKYGPPCPPCP。
同时结合第一抗原和第二抗原的双特异性抗体形式的构型如下。双特异性抗体形式由总共四种多肽，两条重(H)链和两条轻链的组合形成。与第一抗原结合的第一臂的重链和轻链的构型如下。重链包括VH-CH3a-CH1a-铰链-CH2-CH3b或VH-CH1a-CH3a-铰链-CH2-CH3b。此处，CH3a可以包括IgG1 CH3结构域的序列，以及CH1a可以包括IgG1 CH1结构域(SEQID NO:5)或IgG4 CH1结构域(SEQ ID NO:18和19)或IgD CH1结构域(SEQ ID NO:20)的序列。CH3a或CH3b可以包括IgG1 CH3结构域的杵(T366W)(SEQ ID NO:8)或臼(T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:9)的突变。IgG1CH3结构域可以包括突变，即，杵(S354C/T366W)(SEQ IDNO:10)、臼(Y349C/T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:11)、杵(Y349C/T366W)(SEQ ID NO:12)、或臼(S354C/T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:13)，以生成二硫键的半胱氨酸。与第一抗原结合的第一臂的轻链由VL-CH3c-CLb或VL-CLb-CH3c组成。此处，CH3c代表IgG1 CH3结构域，并包括杵(T366W)(SEQ ID NO:8)或臼(T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:9)的突变。IgG1CH3结构域可以包括突变，即，杵(S354C/T366W)(SEQ ID NO:10)、臼(Y349C/T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:11)、杵(Y349C/T366W)(SEQ ID NO:12)、或臼(S354C/T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:13)，以生成二硫键的半胱氨酸。CLb可以是κ型(SEQ ID NO:14和15)或λ型(SEQ ID NO:16和17)。
与第二抗原结合的第二臂的重链和轻链的构型如下。构型包括VH-CH1-铰链-CH2-CH3d或VH-CH1-铰链-CH2-CH3d。IgG1 CH3d结构域可以包括杵(T366W)(SEQ ID NO:8)或臼(T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:9)的突变。IgG1 CH3d结构域还可以包括突变，即，杵(S354C/T366W)(SEQ ID NO:10)或臼(Y349C/T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:11)以生成二硫键的半胱氨酸。轻链的构型可以包括VL-CLb。CLb可以是κ型(SEQ ID NO:14)或λ型(SEQID NO:16)。
在Q-SBL1(SEQ ID NO:31、32、62、63)双特异性抗体形式中，与第一抗原结合的第一臂的重链和轻链的构型如下。第一臂的重链的构型包括VH-CH3a-接头-CH1a-铰链-CH2-CH3b。此处，接头的氨基酸序列确定为GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:28)。CH1a结构域可以是IgG1CH1结构域(SEQ ID NO:5)。为了去除CH1a结构域和CLb之间的二硫键，铰链区可以具有DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列。CH3a结构域包括臼突变和用于与轻链的CH3c形成二硫键的突变，并且CH3a结构域的突变可以是臼(Y349C/T366S/L368A/Y407V)(SEQ IDNO:11)。CH3b结构域可以包括臼突变(T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:9)。可以将肘序列AS(SEQ ID NO:25)添加在VH区和CH3a区之间。
第一臂轻链的构型可以包括VL-CH3c-接头-CLb。CH3c结构域包括杵突变和用于与重链的CH3a结合的二硫键的突变，并且CH3c结构域的突变可以是杵(S354C/T366W)(SEQ IDNO:10)。接头的氨基酸序列可以是GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:28)。CLb结构域可以是κ型，并且可以包括C216S(Eu编号)突变以去除与第一臂重链的CH1结构域结合的二硫键(SEQ ID NO:17)。当CLb结构域是λ型时，它可以包括C214S(Eu编号)突变以去除与第一臂重链的CH1结构域结合的二硫键。这意指形成CH1a/CLb二聚体的二硫键被完全去除。可以将肘序列RT(SEQID NO:26)添加在VL区和CH3a区之间。
与第二抗原结合的第二臂的重链和轻链的构型如下。第二臂的重链的构型可以包括VH-CH1-CH2-CH3d，并且CH3d结构域可以包括杵(T366W)(SEQ ID NO:8)突变。第二臂的轻链的构型是VL-CLb。CLb可以是κ型(SEQ ID NO:14)或λ型(SEQ ID NO:16)。
R-SBL1(SEQ ID NO:31、32、62和63)双特异性抗体形式与Q-SBL1的不同之处在于，它具有其中只有与第一抗原结合的第一臂的重链区中的CH1a结构域部分的构型，并且可以包括C131S突变(SEQ ID NO:19)。
另一方面，本发明涉及包括上述双特异性抗体的多特异性抗体。
如本文所用，术语“多特异性”是指结合蛋白特异性结合三种不同类型靶标以控制靶标活性的能力。例如，多特异性可以通过单克隆抗体或其片段的缀合来获得，该单克隆抗体或其片段特异性结合每个靶标，具有三个或更多个不同的抗原结合臂并且对每个结合的抗原是一价的。
例如，在第一臂或第二臂的N-末端处，或者在第一臂的Fc1末端或第二臂的Fc2末端处可以另外包括与额外抗原结合的一个或多个抗体片段。在第一臂或第二臂的N-末端处可以另外包括与额外抗原结合的抗原结合片段，或者在第一臂的Fc1或Fc2末端处可以另外包括与额外的抗原结合的抗原结合片段。因此，构建靶向三种或更多种抗原的多特异性抗体是可行的。
抗体片段包括完整抗体的一部分，或完整抗体的抗原结合区或可变区。例如，抗体片段可以包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv或双抗体。
在一种实施方式中，在第一臂的N-末端处可以包括含有与第三抗原结合的VH3-CHa和VL3-CLb的抗体片段。在一些情况下，在Fc末端处可以包括呈与第三抗原结合的scFv形式的抗体片段(图7)。
在另一实施方式中，在第一臂的N-末端处包括含有与第三抗原结合的VH3-CHa和VL3-CLb的抗体片段，并且在Fc末端处可以包括与第四抗原结合的scFv形式的抗体片段。在一些情况下，在Fc末端处可以包括呈与第三抗原和第四抗原结合的scFv形式的抗体片段(图8)。
双特异性靶标形式可以扩展为三价多特异性抗体和四价多特异性抗体。在代表性双特异性靶抗体的形式中，三价多特异性抗体可以通过以下来构建：将靶向第三抗原的scFv或Fab形式通过接头连接到第一臂的重链区或第二臂的重链区的N-末端或C-末端(图16)。另外，四价多特异性抗体可以通过以下来构建：将靶向第四抗原的scFv或Fab形式通过接头连接到其上来构建(图17)。
如本文所用，术语“突变(变异)”可以意指构成重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸序列的突变(变异)，例如置换、添加和/或缺失，并且可以包括不损害抗原结合和效力的任何突变，但不限于此。将突变引入根据本发明的结合蛋白可以应用于例如外部可变区或内部可变区，或者外部可变区和内部可变区两者。
当考虑具有生物学等同活性的突变时，将根据本发明的多肽、结合蛋白或编码其的核酸分子解释为包括与序列号中所示的序列具有基本同一性的序列。术语“基本同一性”意指当与本发明的序列和任何其它序列进行比对以使它们尽可能相互对应并使用本领域常用的算法分析经比对的序列时，序列具有至少61％的同源性，优选至少70％的同源性，更优选至少80％，最优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的同源性。用于序列比较的比对方法是本领域公知的。NCBI基本局部比对搜索工具(BLAST)可通过NCBI等访问，并可以通过互联网连同序列分析程序诸如BLASTP、BLASTM、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX一起使用。BLAST可在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获取。使用该程序比较序列同源性的方法可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html找到。
基于此，与本文公开的序列或其整体相比，根据本发明的序列可以具有60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。同源性可以通过本领域已知的方法进行序列比较和/或比对来确定。例如，根据本发明的核酸或蛋白质的百分比序列同源性可以使用序列比较算法(即BLAST或BLAST 2.0)、手动比对或目测来确定。
另一方面，本发明涉及编码双特异性抗体的核酸。
双特异性抗体的第一臂和/或第二臂可以以重组方式产生。分离核酸并将其插入可复制载体，随后进一步克隆(扩增DNA)或进一步表达。基于此，在另一方面，本发明涉及包括核酸的载体。
术语“核酸”旨在涵盖DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子两者，并且作为核酸基本组成单位的核苷酸包括天然来源的核苷酸及其类似物，其中糖或碱基部分被修饰。编码本发明重链和轻链可变区的核酸序列可以变化。这种变异包括核苷酸的添加、缺失或者非保守或保守置换。
使用常规程序(例如，使用能够特异性结合DNA的寡核苷酸探针)，可以容易地分离或合成编码结合蛋白的第一臂和/或第二臂的DNA。多种载体是可获得的。载体组分通常包括但不限于一种或多种以下组分：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
如本文所用，术语“载体”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的工具，并且包括质粒载体、粘粒载体以及病毒载体诸如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体。载体中编码抗体的核酸与启动子可操作地连接。
术语“可操作地连接”意指核酸表达调控序列(例如，启动子、信号序列或转录调控子的结合位点的阵列)和另一核酸序列之间的功能性连接，并使调控序列能够调控另一核酸序列的转录和/或翻译。
当原核细胞用作宿主时，它通常包括能够进行转录的有效启动子(诸如tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子或T7启动子)、起始翻译的核糖体结合位点以及转录/翻译终止序列。另外，例如，当真核细胞用作宿主时，它包括衍生自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子或人肌肉肌酸启动子)，或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、HSV tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV LTR启动子、莫洛尼病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒(EBV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子)，并且通常具有作为转录终止序列的多腺苷酸化序列。
任选地，载体可以与另一序列融合，以便于纯化由此表达的抗体。与之融合的序列可以包括，例如，谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，USA)、麦芽糖结合蛋白质(NEB，USA)、FLAG(IBI，USA)、6x His(六组氨酸；Qiagen，USA)等。
载体包括本领域通常用作选择性标志物的抗生素抗性基因，其实例包括赋予针对以下抗性的基因：氨苄西林(ampicillin)、庆大霉素(gentamycin)、羧苄西林(carbenicillin)、氯霉素(chloramphenicol)、链霉素(streptomycin)、卡那霉素(kanamycin)、遗传霉素(geneticin)、新霉素(neomycin)和四环素(tetracycline)。
另一方面，本发明涉及用上述载体转化的细胞。用于产生本发明双特异性抗体的细胞可以是原核细胞、酵母或高等真核细胞，但不限于此。
可以使用原核宿主细胞诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)属的菌株(诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis))、链霉菌属(Streptomyces spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)(例如，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)和葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)(例如，肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus))。
对动物细胞的兴趣是最大的，有用的宿主细胞系的实例包括但不限于COS-7、BHK、CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、u20和HT1080。
另一方面，本发明涉及产生双特异性抗体的方法，其包括(a)培养细胞，和(b)从经培养的细胞中回收双特异性抗体。
细胞可以在各种培养基中培养。任何可商购的培养基都可以无限制地用作培养基。可以以适当的浓度包括本领域技术人员公知的所有其他必需补充剂。培养条件诸如温度和pH是常规用于选择用于表达的宿主细胞的条件，这对本领域技术人员来说是显而易见的。
双特异性抗体的回收可以通过例如离心或超滤来除去杂质并使用例如亲和色谱法进一步纯化所得产物来进行。可以使用其他额外的纯化技术，诸如阴离子或阳离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法和羟基磷灰石(HA)色谱法。
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员来说，显然这些实施例仅用于说明本发明，而不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物来限定。
实施例1.抗VEGF x抗HER2双特异性抗体设计
将第一抗原确定为HER2蛋白质，并将与HER2结合的曲司珠单抗的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:3)和轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:4)用于双特异性抗体形式的VH或VL。将第二抗原确定为VEGF-A靶标，并将贝伐珠单抗的重链可变区氨基酸序列(SEQ IDNO:1)和轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO:2)用于双特异性抗体形式的VH或VL。氨基酸序列信息通过https://go.drugbank.com/获得。
建立了各种候选物来选择最佳的双特异性抗体形式。使用Q-SBL1和R-SBL1作为基本形式的抗体进行了总共三次工程尝试，并得到了对第一臂的Fab区中的CH3二聚体和CH1/CL之间的接头长度多样性(图12A和12B)。将i)GGGGS(SEQ ID NO:27)，ii)GGGGSGGGGS(SEQID NO:28)，iii)GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:29)，和GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:30)应用于Q-SBL1(SEQ ID NO:31、32、62、63)和R-SBL1(SEQ ID NO:49、50、62和63)的接头。应用GGGGS的接头的候选物是Q-SBL2(SEQ ID NO:33、34、62和63)和R-SBL2(SEQ ID NO:51、52、62和63)，应用GGGGSGGGGS的接头的候选物是Q-SBL1(SEQ ID NO:33、34、62和63)和R-SBL1(SEQ ID NO:49、50、62和63)，应用GGGGSGGGGSGGGGS的接头的候选物是Q-SBL3(SEQ IDNO:35、36、62和63)和R-SBL3(SEQ ID NO:53、54、62和63)，以及应用GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS的接头的候选物是Q-SBL4(SEQ ID NO:37、38、62和63)和R-SBL4(SEQ ID NO:55、56、62和63)。
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第二，通过将IgG1铰链(EPKSSDKTHTCPPCP)(SEQ ID NO:23)或IgG4铰链(ESKYGPPCPPCP)(SEQ ID NO:24)引入Q-SBL1和R-SBL1中的第一臂的铰链区氨基酸序列中，在相同条件下衍生所有候选物组，并且第二臂的铰链区的氨基酸序列是EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:21)(图13A和13B)。当IgG1铰链(EPKSSDKTHTCPPCP)(SEQ ID NO:23)用作Q-SBL1中的第一臂的重链区的铰链区时，获得了Q-SBL5(SEQ ID NO:39、40、62和63)。当IgG1铰链(EPKSSDKTHTCPPCP)(SEQ ID NO:23)用作R-SBL1中的第一臂的重链区的铰链区时，获得了R-SBL5(SEQ ID NO:57、58、62、63)，而当IgG4铰链(ESKYGPPCPPCP)(SEQ ID NO:24)用作一个臂的重链区的铰链区时，获得了R-SBL6(SEQ ID NO:59、60、62和63)。此处，当使用第一臂的IgG1铰链时，存在C220S(Eu编号)突变(SEQ ID NO:23)。形成突变是为了去除与CLb结合的二硫键。
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第三，通过交换突变为包括在CH3结构域中的杵或臼的CH3结构域的位置而衍生得到候选物组(图14)。更具体地，在Q-SBL1中，第一臂的重链区中的Fab区的CH3结构域包括臼(Y349C/T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:11)，而Fc区的CH3结构域包括臼(T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:9)。第一臂的轻链区中的Fab区的CH3结构域包括杵(S354C/T366W)(SEQID NO:10)。另外，第二臂的重链区中的Fc区的CH3结构域包括杵(T366W)(SEQ ID NO:8)。
在Q-SBL6(SEQ ID NO:41、42、62和63)中，第一臂的重链区中的Fab区的CH3结构域包括杵(S354C/T366W)(SEQ ID NO:10)，而Fc区的CH3结构域包括臼(T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:9)。第一臂的轻链区中的Fab区的CH3结构域包括臼(Y349C/T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:11)。另外，第二臂的重链区中的Fc区的CH3结构域包括杵(T366W)(SEQID NO:8)。
在Q-SBL7(SEQ ID NO:43、44、62和64)中，第一臂的重链区中的Fab区的CH3结构域包括臼(Y349C/T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:11)，而Fc区的CH3结构域包括杵(T366W)(SEQ ID NO:8)。第一臂的轻链区中的Fab区的CH3结构域包括杵(S354C/T366W)(SEQ IDNO:10)。另外，第二臂的重链区中的Fc区的CH3结构域包括臼(Y349C/T366S L368A/Y407V)(SEQ ID NO:11)。在Q-SBL8(SEQ ID NO:45、46、62、64)中，第一臂的重链区中的Fab区的CH3结构域包括杵(S354C/T366W)(SEQ ID NO:10)，而Fc区的CH3结构域包括杵(T366W)(SEQ IDNO:8)。第一臂的轻链区中的Fab区的CH3结构域包括臼(Y349C/T366S/L368A/Y407V)(SEQID NO:11)。另外，第二臂的重链区中的Fc区的CH3结构域包括臼(T366S/L368A/Y407V)(SEQID NO:9)。
第四，Q-SBL9(SEQ ID NO:47、48、61和62)具有二硫键，其通过第一臂的重链区的CH3结构域的杵和臼部分的其它氨基酸中的点突变形成，并且这是最显著的特征(图15)。更具体地，Q-SBL9双特异性抗体形式具有与第一抗原结合的第一臂的重链和轻链的以下结构。第一臂的重链具有VH-CH3a-接头-CH1-铰链-CH2-CH3b的结构。此处，将接头的氨基酸序列确定为GGGGS(SEQ ID NO:27)。本文所用的CH1区是IgG1 CH1结构域。去除与CH1结构域结合的二硫键二硫键的铰链区氨基酸序列是EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:23)。CH3a结构域包括臼突变和用于与轻链的CH3c结合的二硫键的突变，并且CH3a结构域的突变部分可以是臼(S354C/T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:13)。CH3b结构域包括臼中的突变(Y349C/T366S/L368A/Y407V)(SEQ ID NO:11)。第一臂的CH3b结构域与第二臂的CH3d结构域形成二硫键。将肘序列(SEQ ID NO:25)添加在VH区和CH3a区之间。
第一臂的轻链具有VL-CH3c-接头-CLb的构型。轻链的CH3c结构域包括杵突变和与重链的CH3a结合的二硫键的突变，并且CH3c结构域的突变部分是杵(Y349C/T366W)(SEQ IDNO:12)。接头的氨基酸序列是GGGGS(SEQ ID NO:27)。CLb结构域是κ型(SEQ ID NO:15)，并且CLb结构域包括C216S(Eu编号)突变，以去除与第一臂重链的CH1结构域结合的二硫键。可以将肘序列(SEQ ID NO:26)添加在VL区和CH3a区之间。
与第二抗原结合的第二臂的重链和轻链具有以下构型。第二臂的重链具有VH-CH1-CH2-CH3d，并且CH3d结构域包括杵(S354C/T366W)(SEQ ID NO:10)突变。该部分与第一臂重链区的CH3b结构域形成二硫键。第二臂的轻链具有VL-CLb的结构。CLb是κ型(SEQ IDNO:14)或λ型(SEQ ID NO:16)。
每个候选物的具体构型如下。
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实施例2.双特异性抗体产生
产生了含有第一臂的重链和轻链区的编码基因的载体质粒和含有第二臂的重链和轻链区的编码基因的载体质粒。将编码两条重链和轻链的基因插入一个载体质粒中。将CMV用作启动子，并在编码基因后插入WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)，以在瞬时表达期间提高表达水平。
用含有第一臂的重链和轻链区的编码基因的载体质粒和含有第二臂的重链和轻链区的编码基因的载体质粒共转染ExpiCHO-S动物细胞(Thermo Fisher A29127)。根据相应的手册，使用ExpiFectamine CHO转染试剂盒(Thermo Fisher A29130)进行共转染。共转染两周后，通过离心(10000xg，15min)获得上清液以获得双特异性抗体，并且过滤上清液(0.22μm)以去除残留的细胞碎片。图18示出了在非还原条件下上清液通过SDS-PAGE的表达模式。
实施例3.双特异性抗体表达
将基于蛋白质A生物传感器(Fortebio 18-5010)的Octet定量测定用于测定双特异性抗体。使用已知的IgG1型样品作为标准物质获得校准曲线，并通过校准曲线计算样品的表达水平。
[表26]通过octet测定定量的培养物上清液中的抗体浓度
样品ID 浓度(ug/ml)
Q-SBL1 471.5
Q-SBL2 415.2
Q-SBL3 354.9
Q-SBL4 343.8
R-SBL1 337.8
R-SBL2 338.0
R-SBL3 211.8
R-SBL4 223.4
Q-SBL5 493.1
R-SBL5 407.1
R-SBL6 351.4
Q-SBL6 272.7
Q-SBL7 438.8
Q-SBL8 284.6
Q-SBL9 322.0
实施例4.双特异性抗体纯化
使用AKTA avant 25/150(Cytiva)作为蛋白质纯化系统，通过蛋白质A亲和色谱法、离子交换色谱法(IEX)和疏水相互作用色谱法(HIC)等来分离具有纯度大于95％的经纯化的双特异性抗体，以进行本发明的双特异性抗体的各种研究和分析。使用8％bis-Tris凝胶和MES缓冲液，通过SDS-PAGE鉴别在每个纯化步骤中获得的双特异性抗体材料。还利用TSKgel G3000SWxl(Tosoh Bioscience)柱使用尺寸排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)来测量双特异性抗体的纯度。
使用0.22μm滤纸过滤通过表达本发明的双特异性抗体候选物获得的培养溶液，并且然后使用MabSelect SuRe(Cytiva)柱(该柱是蛋白质A亲和色谱法的一种类型)进行初级纯化。
初级纯化具体如下进行。用50mM Tris(pH 7.0)缓冲溶液平衡MabSelect Sure柱，并且然后将经过滤的培养溶液上样到柱上。未结合到柱上的蛋白质用5cv的平衡缓冲溶液洗涤。然后，用含有0.5M氯化钠的50mM Tris(pH7.0)缓冲溶液和20mM Bis-Tris(pH 5.5)缓冲溶液去除非特异性结合到MabSelect Sure柱上的杂质。然后，使用4cv的0.2M甘氨酸(pH3.2)缓冲溶液洗脱特异性结合至MabSelect Sure柱的双特异性抗体。用1.0M Tris缓冲溶液将经洗脱的双特异性抗体样品中和至pH 5.0，并且然后通过0.22μm滤纸过滤。
接下来的纯化是使用基于离子交换色谱法中的阳离子交换色谱法的Capto SP(Cytiva)柱来进行的，并且细节如下。用50mM乙酸钠(pH 5.0)缓冲溶液稳定Capto SP柱，向其中施加中和至pH 5.0的双特异性抗体样品，并用相同的缓冲溶液去除未结合到柱上的杂质。用0.1M至1.0M氯化钠洗脱结合到柱上的双特异性抗体。
在最终纯化过程中，进行疏水相互作用色谱法以从二级纯化的双特异性抗体样品中去除高分子量(HMW)和低分子量(LMW)杂质。在该过程中，使用丁基琼脂糖凝胶柱，并且通过用高浓度盐缓冲溶液替换离子交换色谱法后获得的双特异性抗体纯化产物来制备样品，使得双特异性抗体中的盐浓度为1.0M至1.5M。用具有与应用的样品相同的盐浓度的50mM乙酸钠(pH 5.0)缓冲溶液平衡该柱，并且然后将制备的样品上样于其上。用50mM不含盐的乙酸钠(pH 5.0)的梯度法以20cv将结合的双特异性抗体洗脱。使用10kDa截留分子量超滤管将以95％或更高纯度洗脱的最终纯化的双特异性抗体浓缩至1至2mg/mL的浓度，并且然后根据分析条件在合适的缓冲溶液中使用。
图19是SDS-PAGE凝胶的示意图，其示出了通过使用疏水相互作用色谱法对本发明的双特异性抗体候选物进行三次纯化而获得的蛋白质含量。
图20A、20B、20C和20D是使用尺寸排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)分析的经过本发明最终纯化的双特异性抗体候选物的色谱图。
[表27]通过尺寸排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)分析rPA纯化和三步纯化后双特异性抗体的纯度
实施例5.双特异性抗体特征
5-1.CE-SDS分析
将Maurice(Protein Simple)和Maurice CE-SDS PLUS应用试剂盒(ProteinSimple)用于十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)以分析在非还原或还原条件下双特异性抗体候选物的纯度。在一项分析中，在使用蛋白质A树脂纯化后的样品分析中，使用以2mg/mL的最大浓度的25μL蛋白质，并且在用蛋白质A树脂/阳离子交换色谱法(CEX)/疏水结合色谱法(HIC)纯化后的样品分析中，使用以1mg/mL的最大蛋白质浓度的25μL蛋白。为了进行分析，将每个样品与2.5μL的250mM碘乙酰胺或14.2M 2-巯基乙醇、2μL的内标材料和25μL的十二烷基硫酸钠样品缓冲液混合，随后在70℃下加热10分钟。分析完成后，使用由制造商提供的Compass for iCE软件版本2.2.0分析数据。
图21示出了在3步(rPA+CEX+HIC)纯化后，在非还原条件下在CE-SDS上分析的数据。在双特异性抗体候选物的3步(rPA+CEX+HIC)纯化后，通过十二烷基钠毛细管电泳(CE-SDS)确定纯度。结果，在其中第一臂的Fab区中的CH3二聚体和CH1/CL之间的接头长度变化的候选物组中，应用GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS的接头的候选物Q-SBL4或R-SBL4具有最低的纯度。第二，通过将IgG1铰链(EPKSSDKTHTCPPCP)或IgG4铰链(ESKYGPPCPPCP)引入第一臂的铰链区氨基酸序列而衍生得到的所有候选物的纯度即使在3步(rPA+CEX+HIC)纯化后也没有得到提高。最后，在通过交换突变为包括在CH3结构域中的杵或臼的结构域的位置而衍生得到的候选物组中，其中杵和臼结构域位置改变的Q-SBL8具有最高纯度。总的来说，Q-SBL2和Q-SBL9具有高纯度。
[表28]非还原条件下经1步和3步纯化后的双特异性抗体的纯度
5-2.热稳定性
使用差示扫描量热法(Microcal PEAQ-DSC自动化，Malvern)测量双特异性抗体候选物的热稳定性。此时，用于测量的蛋白质浓度高达1mg/mL。样品以200℃/小时的速度从25℃加热到110℃。归一化热容(Cp)数据根据缓冲溶液基线进行校准。用由制造商提供的Microcal PEAQ-DSC自动化软件版本1.60分析数据。熔点(Tm)用于确定双特异性抗体在50mM乙酸盐pH 5.0条件下的温度稳定性。这是双特异性抗体候选物组的热稳定性数据。仅测试基于SEC分析结果的具有纯度为90％或更高的样品组。图22示出了作为代表性实例的Q-SBL2和Q-SBL9的DSC分析结果。
[表29]双特异性抗体的DSC测量
5-3.双重抗原结合ELISA
具体的ELISA过程如下。用使用1x PBS pH 7.4的rhVEGF 165(R&D Systems)包被96孔高吸附ELISA板，并且包被浓度为0.5μg/ml(100μl/孔)。在4℃下进行包被过夜，并用0.05％PBS-T洗涤5次。将所得物用2％BSA以200μl/孔封闭，在37℃下温孵2小时，并用0.05％PBS-T洗涤5次。将等量的在2％BSA中连续稀释(10至0.0005μg/ml)的双特异性抗体和稀释至1μg/ml的rhHER2-his(R&D Systems)混合，并在37℃下温孵1小时。用0.05％PBS-T洗涤微孔板5次，向每个孔中加入100μl异二聚体抗体和rhHER2-his样品的混合物，并在37℃下温孵2小时，随后用0.05％PBS-T洗涤5次。然后，以100μl/孔的量加入用含有2％BSA的PBS以1∶10000稀释的HRP缀合的抗his抗体(Abcam)，在37℃下温孵1小时，并用0.05％PBS-T洗涤5次。以100μl/孔加入比色底物TMB(Bio-Rad)，并在室温下显色5分钟。以100μl/孔加入1M H2SO4，并终止显色。使用SpectraMax ABS Plus(Molecular Devices)仪器在450nm波长下测量吸光度。Q-SBL1、Q-SBL2、Q-SBL3和Q-SBL4之间的EC50的比较结果以及R-SBL1、R-SBL2、R-SBL3和R-SBL4之间的EC50的比较结果如下。与Q-SBL1和R-SBL1相比，铰链区发生变化的Q-SBL5、R-SBL5和R-SBL6的EC50如下。最后，Q-SBL6、Q-SBL7、Q-SBL8(其是取决于杵/臼的位置的候选物)与Q-SBL1之间的EC50的比较结果如下所示。仅测试基于SEC分析结果的具有纯度为90％或更高的样品组。图14A和14B是双抗原结合亲和力测定的4参数拟合图。
[表30]双抗原结合ELISA中双特异性抗体的EC50
5-4.HUVEC增殖测定
为了确定双特异性抗体的细胞增殖抑制作用，从Lonza购买人脐静脉内皮细胞(HUVEC)并用于实验。使用含有EGM-2Single Quot(Lonza)的EBM-2(Lonza)进行HUVEC(Lonza)细胞培养，并且用于测试的HUVEC细胞是传代5次或更少的细胞。在37℃、5％CO2温孵箱中传代培养细胞，并在25-T烧瓶中将细胞融合度控制在80％以内。为了分析血管内皮细胞的增殖抑制作用，将血管内皮细胞在含有0.25％FBS(Lonza)的EBM-2培养基中以4000个细胞/孔的密度在96孔板中培养6小时。在96孔板中用VEGF预处理各种浓度的抗体，并使其在室温下反应15分钟。用含有0.25％胎牛血清的EBM-2培养基替换含有HUVEC细胞的96孔板中的培养基。然后，用不同浓度的抗体和20ng/ml的VEGF处理每个板孔。培养70小时后，将结果用WST-8(DOJINDO)处理5小时，并在450nm的波长下测量吸光度，以比较相应条件下的细胞增殖程度(图24)。
[表31]双特异性抗体在HUVEC增殖测定中的IC50
样品ID IC50(nM)
Q-SBL1 5.347
Q-SBL2 5.014
Q-SBL3 3.472
R-SBL1 6.535
R-SBL2 5.032
R-SBL3 7.772
Q-SBL5 6.437
R-SBL5 7.988
R-SBL6 6.770
Q-SBL9 5.481
当经培养的人血管内皮细胞单独用VEGF处理或与双特异性抗体组合处理时，与单独的VEGF处理组相比，血管内皮细胞的生长率降低，并且除双特异性抗体R-SBL3之外的九种双特异性抗体具有10nM或更小的IC50。基于SEC分析结果，所有样品组仅在纯度为90％或更高时进行测试。
5-5.C1q结合测定
IgG1的Fc区与Fcγ受体(FcγR，Fcγ受体)和补体蛋白质(C1q，补体组分1q)相互作用以诱导免疫效应子功能。这在通过经由抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)或补体依赖的细胞毒性(CDC)去除靶细胞来增加疗效方面起着重要作用。因此，进行了ELISA实验来确定包括IgG1骨架的双特异性抗体候选物组的C1q结合活性。具体的ELISA过程如下。用在1×PBS pH 7.4(540.5～0.3nM)中连续稀释的双特异性抗体以100μl/孔包被96孔高吸附ELISA板。在4℃下包被过夜，用0.05％PBS-T洗涤5次。将所得物用5％BSA(PBS)以200μl/孔封闭，在25℃下温孵2小时，并用0.05％PBS-T洗涤5次。用5％BSA(PBS-T)将C1q蛋白稀释至5μg/ml，将100μl的所得物加入每个孔中，并在25℃下温孵2小时。用0.05％PBS-T洗涤微孔板5次，以100μl/孔的量加入用含2％BSA的PBS以1∶2000稀释的HRP缀合的抗his抗体(Abcam)，并在25℃温孵1小时。用0.05％PBS-T洗涤所得物5次，并以100μl/孔加入比色底物TMB(Bio-Rad)，并在室温下显色5分钟。以100μl/孔加入1M H2SO4，并终止显色。使用SpectraMax ABS Plus(Molecular Devices)仪器在450nm波长下测量吸光度。曲司珠单抗、Q-SBL2和Q-SBL9的EC50比较结果如下。仅测试基于SEC分析结果的具有纯度为90％或更高的样品组。图25是C1q结合ELISA的4参数拟合图。
[表32]C1q结合ELISA中双特异性抗体的EC50
样品ID EC50(nM) R2
曲司珠单抗 5.115 0.991
Q-SBL2 7.289 0.990
Q-SBL9 8.270 0.987
尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但是本领域的技术人员将会理解，提供该描述是为了说明的目的而阐述优选实施方式，并且不应该被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物来限定。
【工业实用性】
根据本发明的新型双特异性或多特异性抗体形式能够同时结合两种或更多种靶标，并能够抑制或提高期望靶标的活性，因此与单靶抗体相比，其在治疗或诊断疾病中非常有效。
另外，根据本发明的新型双特异性或多特异性抗体形式在重链和轻链之间很少存在非特异性结合并且几乎不形成同源二聚体的状态下形成异源二聚体。因此，新型双特异性或多特异性抗体形式在动物细胞中高度表达，并且其纯化过程与单克隆抗体没有太大不同。新型双特异性或多特异性抗体表现出优于或相当于普通单克隆抗体的稳定性。双特异性抗体形式可用于开发各种双特异性抗体药物和治疗患有复杂疾病的患者。
<110> 三星生物株式会社
<120> 双特异性或多特异性抗体
<130> PWKR2123171180P
<160> 68
<170> PatentIn版本3.2
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贝伐珠单抗(Bevacizumab) VH
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 贝伐珠单抗 VL
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲司珠单抗(Trastuzumab) VH
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲司珠单抗 VL
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH1
<400> 5
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 6
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH2
<400> 6
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH3
<400> 7
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH3-杵
<400> 8
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH3-臼
<400> 9
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH3-杵 S354C
<400> 10
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH3-臼 Y349C
<400> 11
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH3-杵 Y349C
<400> 12
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH3-臼 S354C
<400> 13
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CL-κ
<400> 14
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CL-κ-C214S
<400> 15
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 16
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CL-λ
<400> 16
Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 17
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CL-λ-C214S
<400> 17
Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Ser Ser
100 105
<210> 18
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 CH1
<400> 18
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 19
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 CH1 C131S
<400> 19
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 20
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgD CH1
<400> 20
Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys Arg
1 5 10 15
His Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly
20 25 30
Tyr His Pro Thr Ser Val Thr Val Thr Trp Tyr Met Gly Thr Gln Ser
35 40 45
Gln Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr
50 55 60
Met Thr Ser Ser Gln Leu Ser Thr Pro Leu Gln Gln Trp Arg Gln Gly
65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu
85 90 95
Ile Phe
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 铰链 野生型
<400> 21
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 铰链 del EPKSC
<400> 22
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 铰链 EPKSS
<400> 23
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 铰链
<400> 24
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 25
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肘序列 1
<400> 25
Ala Ser
1
<210> 26
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肘序列 2
<400> 26
Arg Thr
1
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头1
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头2
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头3
<400> 29
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头4
<400> 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 31
<211> 562
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Q-SBL1 HC 第一臂
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr
225 230 235 240
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
245 250 255
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
260 265 270
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
275 280 285
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
290 295 300
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
305 310 315 320
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Asp
325 330 335
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
340 345 350
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
355 360 365
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
370 375 380
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
385 390 395 400
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
405 410 415
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
420 425 430
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
435 440 445
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
450 455 460
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
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Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
485 490 495
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
515 520 525
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
530 535 540
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> Q-SBL1 LC 第一臂
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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<213> 人工序列
<220>
<223> Q-SBL2 HC 第一臂
<400> 33
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1 5 10 15
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<223> Q-SBL2 LC 第一臂
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325
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<223> Q-SBL3 HC 第一臂
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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565
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<223> Q-SBL3 LC 第一臂
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Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<223> Q-SBL4 HC 第一臂
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1 5 10 15
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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<213> 人工序列
<220>
<223> Q-SBL4 LC 第一臂
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<213> 人工序列
<220>
<223> Q-SBL5 HC 第一臂
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
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Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
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Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565
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<213> 人工序列
<220>
<223> Q-SBL5 LC 第一臂
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210 215 220
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
225 230 235 240
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
245 250 255
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
260 265 270
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
275 280 285
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
290 295 300
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
305 310 315 320
Phe Asn Arg Gly Glu Ser
325
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<213> 人工序列
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr
225 230 235 240
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg Ser Thr Ser
245 250 255
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
260 265 270
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
275 280 285
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
290 295 300
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
305 310 315 320
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Asp
325 330 335
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
340 345 350
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
355 360 365
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
370 375 380
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
385 390 395 400
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
405 410 415
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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
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Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
485 490 495
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
500 505 510
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
530 535 540
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> R-SBL1 LC 第一臂
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<223> R-SBL2 HC 第一臂
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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<223> R-SBL2 LC 第一臂
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
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<223> R-SBL3 HC 第一臂
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
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Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
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Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
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Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
355 360 365
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
370 375 380
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
405 410 415
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
450 455 460
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565
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R-SBL3 LC 第一臂
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
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Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
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Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
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Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser
325 330 335
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<213> 人工序列
<220>
<223> R-SBL4 HC 第一臂
<400> 55
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<220>
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<400> 56
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65 70 75 80
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165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
245 250 255
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
260 265 270
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
275 280 285
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
290 295 300
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
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Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
325 330 335
Asn Arg Gly Glu Ser
340
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<211> 567
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R-SBL5 HC 第一臂
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr
225 230 235 240
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg Ser Thr Ser
245 250 255
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
260 265 270
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
275 280 285
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
290 295 300
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
305 310 315 320
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
325 330 335
Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
340 345 350
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
355 360 365
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
370 375 380
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
385 390 395 400
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
405 410 415
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
420 425 430
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
435 440 445
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
450 455 460
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
465 470 475 480
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
485 490 495
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
500 505 510
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
515 520 525
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
530 535 540
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
545 550 555 560
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565
<210> 58
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R-SBL5 LC 第一臂
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Pro Arg Glu
100 105 110
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
115 120 125
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
260 265 270
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
275 280 285
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
290 295 300
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
305 310 315 320
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser
325 330
<210> 59
<211> 564
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R-SBL6 HC 第一臂
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr
225 230 235 240
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Arg Ser Thr Ser
245 250 255
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
260 265 270
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
275 280 285
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
290 295 300
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
305 310 315 320
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
325 330 335
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
340 345 350
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
355 360 365
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
370 375 380
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
385 390 395 400
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
405 410 415
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
435 440 445
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450 455 460
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
465 470 475 480
Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
485 490 495
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
500 505 510
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr
515 520 525
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
530 535 540
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
545 550 555 560
Ser Pro Gly Lys
<210> 60
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R-SBL6 LC 第一臂
<400> 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
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115 120 125
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
225 230 235 240
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
245 250 255
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
260 265 270
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
275 280 285
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
290 295 300
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
305 310 315 320
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser
325 330
<210> 61
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-1 HC 第二臂
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 62
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-1 LC 第二臂
<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 63
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-3 HC 第二臂
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 64
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC-3-H-K HC 第二臂
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 65
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 65
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 66
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2 CH1
<400> 66
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val
<210> 67
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgM CH1
<400> 67
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 5 10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser
35 40 45
Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln
65 70 75 80
Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn
85 90 95
Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val
100 105
<210> 68
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgM CH3
<400> 68
Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe
1 5 10 15
Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr
20 25 30
Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val
35 40 45
Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser
50 55 60
Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu
65 70 75 80
Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys
85 90 95
Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly
100

Claims (28)

1.一种双特异性抗体，包括：
第一臂，所述第一臂结合第一抗原并包括VH1-CHa-Fc1和VL1-CLb；和
第二臂，所述第二臂结合第二抗原并包括VH2-CH1-Fc2和VL2-CL，
其中，所述VH1和所述VH2各自是包括相同或不同抗原结合区的重链可变区，
所述VL1和VL2各自是包括相同或不同抗原结合区的轻链可变区，
所述CHa包括i)IgG重链恒定区或IgD重链恒定区CH1，和IgG重链恒定区CH2或CH3，或ii)IgM重链恒定区CH3，
所述CLb包括i)含有IgG轻链恒定区λ或κ的CL1，以及选自由IgG重链恒定区CH1、CH2和CH3组成的组的至少一个，或ii)IgM重链恒定区CH3，
所述CH1是IgG重链恒定区CH1，以及CL是IgG轻链恒定区CL，并且
所述第一臂的Fc1与所述第二臂的Fc2连接，以形成重链恒定区二聚体。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述CHa和所述CLb衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM。
3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，在所述第一臂中，所述CHa从N-末端至C-末端按顺序包括衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的重链恒定区CH1和衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的重链恒定区CH3。
4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，在所述第一臂中，所述CHa从所述N-末端至所述C-末端按顺序包括衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的重链恒定区CH3和衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的重链恒定区CH1。
5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述第一臂的所述CHa包括衍生自IgM的重链恒定区CH3。
6.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，在所述第一臂中，所述CLb从所述N-末端至所述C-末端按顺序包括衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的轻链恒定区CL1和衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的重链恒定区CH3。
7.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，在所述第一臂中，所述CLb从所述N-末端至所述C-末端按顺序包括衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的CH3和衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD或IgM的CL1。
8.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，在所述第一臂中，所述CLb包括衍生自IgM的重链恒定区CH3。
9.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述CHa的CH1和所述CLb的CL1不用二硫键连接。
10.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述CHa和所述CLb各自包括CH3，并且所述CH3通过二硫键形成二聚体。
11.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述CHa和CLb各自包括CH3，并且通过键合CH3形成的二聚体中的一个包括选自由Y349C、S354C、T366S、T366W、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以及包括选自由S354C、Y349C、T366W、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以形成杵臼结构。
12.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述CHa的CH1和所述CLb的CL1不用二硫键连接，并且i)所述CHa的CH3和所述CLb的CH3中的任何一个包括选自由Y349C、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以及另一个包括S354C和/或T366W，或者ii)所述CHa的CH3和所述CLb的CH3中的任何一个包括选自由S354C、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以及另一个包括Y349C和/或T366W。
13.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，所述Fc的CH3二聚体中的一个包括选自由Y349C、S354C、T366S、T366W、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以及选自由S354C、Y349C、T366W、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以形成所述二聚体中的杵臼结构。
14.一种双特异性抗体，包括：
第一臂，所述第一臂结合第一抗原并包括VH1-CHa-Fc1和VL1-CLb；和
第二臂，所述第二臂结合第二抗原并包括VH2-CH1-Fc2和VL2-CL，
其中，所述VH1和所述VH2各自是包括相同或不同抗原结合区的重链可变区，
所述VL1和VL2各自是包括相同或不同抗原结合区的轻链可变区，
所述CHa包括IgG重链恒定区CH3和IgG重链恒定区CH1，
所述CLb包括含有IgG轻链恒定区λ或κ的CL1，和含有IgG重链恒定区的CH3，
所述CH1是IgG重链恒定区CH1，以及CL是IgG轻链恒定区CL，并且
所述第一臂的Fc1与所述第二臂的Fc2连接，以形成重链恒定区二聚体。
15.根据权利要求14所述的双特异性抗体，其中，所述IgG重链恒定区CH1衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
16.根据权利要求14所述的双特异性抗体，其中，所述CHa的CH1和所述CLb的CL1不用二硫键连接。
17.根据权利要求14所述的双特异性抗体，其中，所述CHa的CH3和所述CLb的CL3通过二硫键形成二聚体。
18.根据权利要求14所述的双特异性抗体，其中，通过将所述CHa的CH3与所述CLb的CH3键合而形成的二聚体中的一个包括选自由T366W、S354C和Y349C组成的组的至少一个，以及另一个包括选自由S354C、Y349C、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以形成杵臼结构。
19.根据权利要求14所述的双特异性抗体，其中，通过将所述CHa的CH3与所述CLb的CH3键合而形成的二聚体中的一个包括选自由S354C、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以及另一个包括Y349C和T366W，以形成杵臼结构。
20.根据权利要求14所述的双特异性抗体，其中，所述CHa的CH3或所述CLb的CH3包括由SEQ ID NO.8至13所示的序列。
21.根据权利要求14所述的双特异性抗体，其中，所述CHa的CH1和所述CLb的CL1不用二硫键连接，并且i)所述CHa的CH3和所述CLb的CH3中的任何一个包括选自由Y349C、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以及另一个包括S354C和/或T366W，或者ii)所述CHa的CH3和所述CLb的CH3中的任何一个包括选自由S354C、T366S、L368A和Y407V组成的组的至少一个，以及另一个包括Y349C和/或T366W。
22.根据权利要求14所述的双特异性抗体，其中，所述CHa的CH3和所述CH1以及所述CLb的CH3和CL1经由接头连接。
23.根据权利要求22所述的双特异性抗体，其中，所述接头具有5至10个氨基酸残基。
24.根据权利要求14所述的双特异性抗体，其中，由所述第一臂的Fc1和所述第二臂的Fc2形成的CH3二聚体的单体用二硫键或不用二硫键连接。
25.根据权利要求14所述的双特异性抗体，其中，所述第一臂和所述第二臂经由铰链连接。
26.根据权利要求14所述的双特异性抗体，其中，所述第一臂和所述第二臂通过铰链连接，所述铰链包括选自由以下组成的组的一种或多种序列：
DKTHTCPPCP；
EPKSSDKTHTCPPCP；以及
ESKYGPPCPPCP。
27.一种包括根据权利要求1至26中任一项所述的双特异性抗体的多特异性抗体。
28.根据权利要求27所述的多特异性抗体，其中，在所述双特异性抗体中的所述第一臂或所述第二臂的N-末端处还包括与额外的抗原结合的抗原结合片段，或者在所述双特异性抗体中的所述第一臂的Fc1末端或所述第二臂的Fc2末端处还包括与额外的抗原结合的抗原结合片段。
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