JP2023544254A - 無細胞タンパク質合成系を用いた抗体の大規模産生方法 - Google Patents

Abstract

本明細書において、無細胞タンパク質合成系を用いた抗体の大規模産生方法を記載する。この方法は、軽鎖（ＬＣ）ポリペプチドの存在下、無細胞細菌抽出物中、抗体の重鎖（ＨＣ）ポリペプチドを、前記重鎖をコードする核酸から発現し、それにより、前記抗体を産生することを含む。この方法は、例えば、約１０リットル以上の反応体積、例えば、約１０リットル～約２５，０００リットルの反応体積において、抗体の商業的産生に適しているように大規模に行われる。この方法は、前記重鎖ポリペプチドと同じ無細胞タンパク質合成系で前記軽鎖の合成とは対照的に、適切にフォールディング及びアセンブリされた抗体の単位体積当たりの収量増加をもたらす。

Description

関連出願
本願は、２０２０年９月１４日に出願された米国特許仮出願第６３／０７８，２５４号の優先権の利益を主張し、この開示は全目的のためその全文を参照することにより本明細書に援用されるものとする。

配列リスト
本願は、ＡＳＣＩＩ書式で電子的に提出された配列リストを含み、これはその全文の参照により本明細書に援用される。２０２１年９月８日に作成された前記ＡＳＣＩＩ複製物は、０９１２００－１２６０２３３－００６９１０ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、６５，７８２バイトのサイズである。

本開示は、商業的製造に適している、大規模に対象とするタンパク質を産生するための方法及びシステムを提供する。前記方法は、適切にフォールディングされアセンブリされた抗体などの対象とするタンパク質の全収量及び／又は収量を増加させることができる。

本明細書において、無細胞タンパク質合成系において適切にフォールディングされた抗体の収量の増加方法及び増加するための組成物を記載する。１つの態様では、この方法を、適切にフォールディングされた抗体の比較的大量の商業的産生に適切な規模で行う。したがって、無細胞タンパク質合成系を用いた抗体の大規模産生方法であって、前記方法は、軽鎖（ＬＣ）ポリペプチドの存在下で、抗体の重鎖（ＨＣ）ポリペプチドを、前記重鎖をコードする核酸から発現させて、前記抗体を産生することを含む、方法を記載する。いくつかの実施形態では、この無細胞タンパク質合成系は、約１０リットル～約２５，０００リットルの体積を有する反応混合物を含む。いくつかの実施形態では、前記ＨＣの発現は、約１０リットル～約１０，０００リットルの体積を有する反応混合物中で行われる。いくつかの実施形態では、前記ＨＣの発現は、約１５，０００リットル～約２５，０００リットルの体積を有する反応混合物中で行われる。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、約１０リットル～約２５，０００リットル以上の体積を有する。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、約１０リットル～約２５，０００リットル以下の体積を有する。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、約１０，０００リットル～約２０，０００リットルの体積を有する。

いくつかの実施形態では、この反応混合物は、細菌抽出物を含み、前記ＨＣの発現は、（ｉ）前記細菌抽出物を、前記ＨＣをコードする核酸と配合すること；及び（ｉｉ）前記無細胞タンパク質合成系を、前記ＨＣの前記発現を可能とする条件下でインキュベートすること、を含む。

いくつかの実施形態では、全抗体タンパク質と適切にフォールディングされた抗体の１リットル当たりの収量は、前記重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとの両方が同じ反応混合物中で発現される反応混合物と比べて増加する。いくつかの実施形態では、適切にフォールディングされた抗体の１リットル当たりの収量は、前記重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとの両方が同じ反応混合物中で発現される反応混合物と比べて増加する。いくつかの実施形態では、全抗体タンパク質の１リットル当たりの収量及び適切にフォールディングされた抗体タンパク質の１リットル当たりの収量を、前記重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとの両方が同じ反応混合物中で発現される反応混合物と比べて増加する。いくつかの実施形態では、全抗体タンパク質の１リットル当たりの収量及び／又は適切にフォールディングされた抗体タンパク質の１リットル当たりの収量は、前記重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとの両方が同じ反応混合物中で同時に発現される反応混合物と比べて増加する。

いくつかの実施形態では、前記適切にフォールディングされた抗体タンパク質の１リットル当たりの収量は、前記重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方が発現される反応混合物と比較して約３０％～約９０％高い。いくつかの実施形態では、前記適切にフォールディングされた抗体タンパク質の１リットル当たりの収量は、前記重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方が発現される反応混合物と比較して約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上又は約９０％以上高い。いくつかの実施形態では、前記重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとの二量体化を増大する。いくつかの実施形態では、重鎖ポリペプチド単量体及び軽鎖ポリペプチド単量体に対する重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとの二量体の比が増大する。

いくつかの実施形態では、前記軽鎖ポリペプチドを、前記発現工程前に前記反応混合物に添加する。

いくつかの実施形態では、前記軽鎖ポリペプチドは、前記反応混合物に添加する前に、別の反応で産生される。いくつかの実施形態では、前記軽鎖ポリペプチドは、前記反応混合物に添加する前に、合成又は前もって製造される（prefabricate）。いくつかの実施形態では、前記軽鎖ポリペプチドは、無細胞タンパク質合成系、反応混合物、又は無細胞抽出物中で前記軽鎖ポリペプチドをコードする核酸から発現される。いくつかの実施形態では、前記軽鎖ポリペプチドは、インタクトな生細胞内で前記軽鎖ポリペプチドをコードする核酸から発現される。いくつかの実施形態では、前記インタクトな生細胞は、細菌細胞又は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、前記軽鎖ポリペプチドは、前記反応混合物に添加される前に、無細胞タンパク質合成系、反応混合物、無細胞抽出物、及び／又は細胞の培養物から精製又は部分的に精製される。

いくつかの実施形態では、前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、若しくはＩｇＤサブタイプ、又はこれらの組合せである。いくつかの実施形態では、前記抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、前記抗体は、抗Ｂ細胞成熟抗原（抗ＢＣＭＡ）抗体、抗分化抗原群７４（抗ＣＤ７４）抗体、又は抗葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）抗体から選択される。いくつかの実施形態では、前記抗体は、ＦＡＢ断片を含む。

いくつかの態様では、前記抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、前記二重特異性抗体は、ＩｇＡ由来の配列及びＩｇＧ ＣＨ３ドメイン由来の配列を含む２つの非対称のＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、前記二重特異性抗体は、ドメイン交換抗体であり、前記ＨＣは、前記ＬＣと二量体化する。いくつかの実施形態では、前記二重特異性抗体は、立体的相補性又は静電的相補性に基づいてＨＣヘテロ二量体化が増強された改変ＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記改変ＣＨ３ドメインは、安定なＣＨ３ヘテロ二量体の生成を促進するノブ変異及びホール変異を含む。いくつかの実施形態では、前記二重特異性抗体は、１つのＦａｂドメイン及び１つのｓｃＦｖドメインを含み、Ｆａｂドメイン及びｓｃＦｖドメインは、異なる抗原と結合する。

いくつかの実施形態では、前記ＨＣ及び／又はＬＣは、少なくとも１つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含む。いくつかの実施形態では、前記ＨＣは、少なくとも１つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含む。いくつかの実施形態では、前記ＨＣ中の前記ｎｎＡＡは、同じ又は前記ＬＣ中の前記ｎｎＡＡと異なり得る。いくつかの実施形態では、前記ｎｎＡＡは、ｐ－アセチルフェニルアラニン又はｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニンである。

いくつかの実施形態では、前記方法は、前記抗体を産生する非還元条件下、前記ＨＣ及びＬＣのアセンブリを更に含む。

いくつかの実施形態では、前記無細胞タンパク質合成系は、関連補助因子を有する細菌抽出物を含む。いくつかの実施形態では、前記無細胞タンパク質合成系は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株から調製された細菌抽出物を含む。いくつかの実施形態では、前記無細胞タンパク質合成系は、ＡＴＰを産生する酸化的リン酸化反応を含む。いくつかの実施形態では、前記無細胞タンパク質合成系は、再構成リボソーム系を含む。

いくつかの実施形態では、前記無細胞タンパク質合成系は、外因性タンパク質シャペロンを含む。いくつかの実施形態では、前記外因性タンパク質シャペロンは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、ペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼ（ＰＰＩ）、及びデアグリガーゼから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＰＤＩは、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ及びＤｓｂＧから選択され；前記ＰＰＩは、ＦｋｐＡ、ＳｌｙＤ、ｔｉｇ、ＳｕｒＡ、及びＣｐｒ６から選択され；並びに前記デアグリガーゼは、ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、及びＳｋｐから選択される。

いくつかの実施形態では、前記無細胞タンパク質合成系は、変異放出因子１タンパク質（ＲＦ１）を含む。

無細胞タンパク質合成系も提供する。１つの態様では、前記無細胞タンパク質合成系は、（ｉ）細菌細胞抽出物を含む反応混合物；（ｉｉ）重鎖ポリペプチドをコードする核酸；及び（ｉｉｉ）軽鎖ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、この無細胞タンパク質合成系は、約１０リットル～約２５，０００リットルの体積を有する反応混合物を含む。

前記無細胞タンパク質合成系のいくつかの実施形態では、前記軽鎖ポリペプチドは前記反応混合物に添加される。いくつかの実施形態では、前記軽鎖ポリペプチドは、前記反応混合物中で発現されないか、又は前記反応混合物は、前記軽鎖をコードするプラスミドを含まない。いくつかの実施形態では、前記軽鎖ポリペプチドは、前記反応混合物に添加する前に、別の反応で産生されるか、合成されるか、又は前もって製造される（prefarbirate）。いくつかの実施形態では、前記軽鎖ポリペプチドは、無細胞タンパク質合成系、反応混合物、又は無細胞抽出物中で前記軽鎖ポリペプチドをコードする核酸から発現される。いくつかの実施形態では、前記軽鎖ポリペプチドは、インタクトな生細胞内で前記ＬＣポリペプチドをコードする核酸から発現される。いくつかの実施形態では、前記インタクトな生細胞は、細菌細胞又は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、前記軽鎖ポリペプチドは、前記反応混合物に添加される前に、無細胞タンパク質合成系、反応混合物、無細胞抽出物、及び／又は細胞の培養物から精製又は部分的に精製される。

いくつかの実施形態では、前記反応混合物は、リボソーム、ＡＴＰ、アミノ酸、及びｔＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記細菌細胞抽出物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株から調製する。

いくつかの実施形態では、前記無細胞タンパク質合成系は、外因性タンパク質シャペロンを更に含む。いくつかの実施形態では、前記外因性タンパク質シャペロンは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、ペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼ（ＰＰＩ）、及びデアグリガーゼから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、前記ＰＤＩは、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ及びＤｓｂＧから選択され；前記ＰＰＩは、ＦｋｐＡ、ＳｌｙＤ、ｔｉｇ、ＳｕｒＡ、及びＣｐｒ６から選択され；並びに前記デアグリガーゼは、ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、及びＳｋｐから選択される。

いくつかの実施形態では、前記無細胞タンパク質合成系は、変異放出因子１タンパク質（ＲＦ１）を更に含む。

図１は、重鎖（ＨＣ）ポリペプチド及び軽鎖（ＬＣ）ポリペプチドをコードする発現プラスミドを含む反応物における抗ＢＣＭＡ抗体力価を示し、前記ＬＣを、前もって製造された軽鎖（ＰＦＬＣ）ポリペプチドとして提供あるいは前記ＬＣポリペプチドをコードする発現プラスミドから発現した。バイオリアクター内又はＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅ（登録商標）（ＦＰ）系（ｍ２ｐ－ｌａｂｓ ＧｍｂＨ）を用いて反応を行った。抗ＢＣＭＡ抗体の収量（力価）は、前記ＬＣポリペプチドをコードする発現プラスミドの添加と比較して、ＰＦＬＣポリペプチドを前記反応物に添加した場合に増加した。 図２は、抗葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）抗体力価は、ＰＦＬＣ濃度の増加と共に用量依存的に増加すること、及び前記ＬＣが前記ＬＣをコードするプラスミドから発現される場合の力価（０ｇ／Ｌ ＰＦＬＣ）と比較して、力価の増加は、１．０ｇ／Ｌ～１．２ｇ／Ｌ ＰＦＬＣを用いた場合のほとんど２倍であることを示す。抗体力価を、ＰｈｙＴｉｐ（登録商標）カラム（ＰｈｙＮｅｘｕｓ，Ｉｎｃ．）又はＨＰＬＣを用いて測定した。 図３は、バイオリアクター及びＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅ系における抗ＦＯＬＲ１抗体力価を示し、ＬＣは、ＰＦＬＣとして提供又はプラスミドから発現された。抗体力価を、ＰｈｙＴｉｐ（登録商標）カラムを用いて測定した。抗ＦＯＬＲ１抗体の収量は、前記ＬＣポリペプチドをコードする発現プラスミドの添加と比較して、ＰＦＬＣポリペプチドを反応物に添加した場合０．２Ｌバイオリアクターにおいて増加した。 図４は、バイオリアクターにおける抗ＦＯＬＲ１抗体力価を示し、ＬＣは、ＰＦＬＣとして提供又はプラスミドから発現された。抗体力価を、ＨＰＬＣを用いて測定した。抗ＦＯＬＲ１抗体の収量は、前記ＬＣポリペプチドをコードする発現プラスミドの添加と比較して、ＰＦＬＣポリペプチドを反応物に添加した場合０．２Ｌバイオリアクターにおいて増加した。 図５は、２つの異なる濃度のＰＦＬＣ（０．５ｇ／Ｌ及び０．７５ｇ／Ｌ）を有するＨＣ ｐＤＮＡプラスミドを含む抽出物（３ｍｇ／Ｌ及び６ｍｇ／Ｌ）を用いた抗ＦＯＬＲ１抗体滴定データを示す。コントロールは、重鎖発現プラスミド及び軽鎖発現プラスミドを含む抽出物（３ｍｇ／Ｌ）の３７％であった。 図６は、バイオリアクター及びＦＰ系反応物における抗ＣＤ７４抗体力価を示し、ＨＣはプラスミドから発現され、ＬＣはＰＦＬＣとして提供又はプラスミドから発現された。抗ＣＤ７４抗体力価は、ＬＣがＰＦＬＣとして提供された場合、０．２Ｌバイオリアクター及び５ｍＬバイオリアクターにおいて約８０％増加した。抗ＣＤ７４抗体力価は、ＬＣがＰＦＬＣとして提供された場合、１ｍＬ ＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅにおいて約５０％増加した。図６のデータは、反応器に供給しないバッチＸＣＦからである。 図７は、ＰＦＬＣを含む抽出物は、軽鎖をコードするプラスミドＤＮＡを含むコントロール抽出物と比較して、抗ＣＤ７４抗体の力価を増加させた。 図８は、精製ＰＦＬＣ試薬又は粗ＰＦＬＣライセート試薬を含む反応物中の発現に対し、プラスミドからのＨＣ／ＬＣ同時発現と比較したトラスツズマブＩｇＧの相対的発現を示す。精製ＰＦＬＣ試薬又は粗ＰＦＬＣ試薬のいずれかを含む反応物は、前記ＨＣ及びＬＣがプラスミドから同時発現される反応物と比較して、同様な力価増加を示した。 図９は、プラスミドから発現されたＬＣを含む反応物と比較して、ＳＥＥＤボディＦａｂ／ｓｃＦｖ二重特異性抗体の収量は、精製ＰＦＬＣ試薬を含む反応において増加したことを示す。ＨＣ－ＧＡ及びｓｃＦｖ－ＡＧタンパク質は、両反応物においてプラスミドから発現された。 図１０は、反応物に添加されたＨＣ発現プラスミド及びＰＦＬＣの濃度に対する、用量依存性関係で増加した抗ＢＣＭＡ抗体の力価を示す。結果を、ＪＭＰで作成したコンター図として表した。 図１１は、反応物に添加されたＨＣ発現プラスミド及びＰＦＬＣの濃度に対する、用量依存性関係で増加した抗ＦＬＯＲ１抗体の力価を示す。結果を、ＪＭＰで作成したコンター図として表した。 図１２は、ＨＣ発現プラスミド及びＰＦＬＣを含む反応物中の抗ＣＤ７４抗体の力価を示す。結果を、ＪＭＰで作成したコンター図として表した。

定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｌａｃｋｉｅ，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（４^ｔｈ ｅｄ．２００７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ，ＣＬＯＮＩＮＧ， Ａ ＬＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ １９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＹ １９９５）参照。用語「ａ」又は「ａｎ」は、「１又は複数」を意味するものとする。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などのその変化形は、工程又は要素の記述に先行する場合、更なる工程又は要素を付加してもよく、この付加は排除されないことを意味するものとする。本明細書に記載されているものと類似又は均等であるいずれの方法、デバイス及び物質も、本発明の実践において使用することができる。以下の定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提供され、本開示の範囲を限定するものではない。

用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、基準値又は数値の±１０％、例えば、基準値又は数値の±１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％の範囲を示す。

用語「抗体」は、結合タンパク質として機能的に定義されるタンパク質及び当業者が動物産生抗体の遺伝子をコードする免疫グロブリンのフレームワーク領域から誘導されると認識するアミノ酸配列を含むと構造的に定義されるタンパク質を表す。この用語は、所定の抗原特異性を有する機能的抗原結合部位を形成する少なくとも１セット若しくは１対の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む一本鎖ポリペプチド又は二本鎖ポリペプチド二量体を含む。この用語は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体及びヘテロ二量体の形成を促進する改変Ｆｃ領域を含む二重特異性抗体を含む。この用語は、第一抗原と結合するＦＡＢ及び第二抗原と結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体も含む。抗体は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされる１又は複数のポリペプチドから成り得る。ヒトでは、認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、並びに多種多様な免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κ又はλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、又はεとして分類され、次に、これらは、それぞれ、免疫グロブリン分類、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを定義する。

典型的免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含むことが分かっている。各四量体は、２つの同じ対のポリペプチド鎖から成り、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０ｋＤ～７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に寄与する約１００～１１０以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）は、それぞれ、これらの軽鎖及び重鎖を表す。

抗体は、インタクトな免疫グロブリン、その複合体（例えば、キメラ抗体又は二重特異性抗体）、その抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖ断片、Ｆｄ断片及びＦｄ’断片、ジ抗体又はジアボディ（ｄＡｂ）、ミニ抗体）並びに一本鎖抗体（一本ポリペプチド鎖として存在する抗体）、可変重鎖及び可変軽鎖が一緒になって（直接又はペプチドリンカーにより）連続融合ポリペプチドを形成する一本鎖Ｆｖ抗体（ｓＦｖ又はｓｃＦｖ）、ならびにｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質など他の組成物として存在する。用語「抗体断片」は、完全長より小さいが、抗原結合部位を形成するのに充分な抗体の可変領域の少なくとも一部（例えば、１又は複数のＣＤＲ）を含み、したがって、完全長抗体の結合特異性及び／又は活性を保持する完全長抗体のいずれかの部分を表す。この断片は、ジスルフィド架橋及び／又はペプチドリンカーによるなど、結合された複数の鎖を含む可能性がある。抗体断片のより詳細な説明は、例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ ２０７：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （２００３）；Ｃｈａｐｔｅｒ １；ｐｐ．３－２５，Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ；及びＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３），を参照。

用語「重鎖ポリペプチド」は、抗体由来の完全長重鎖、又は軽鎖ポリペプチドと対又は二量体化する場合に抗原結合部位を形成することができるその断片を含むＩｇポリペプチドを表す。この用語は、重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む断片を含む。

用語「軽鎖ポリペプチド」は、抗体由来の完全長軽鎖、又は重鎖ポリペプチドと対又は二量体化する場合に抗原結合部位を形成することができるその断片を含むＩｇポリペプチドを表す。この用語は、軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含む断片を含む。

用語「前もって製造された軽鎖」又は「前もって製造された軽鎖ポリペプチド」は、別の無細胞タンパク質合成系、反応混合物、又は無細胞抽出物に添加する前に、作製、産生又は合成されるＬＣポリペプチドを表す。この用語は、当技術分野において公知のいずれかの方法を用いて製造又は産生されるＬＣポリペプチドを含む。この用語は、無細胞タンパク質合成系、反応混合物、又は無細胞抽出物中ＬＣポリペプチドをコードする核酸から発現されるＬＣポリペプチドも含む。この用語は、細菌細胞又は哺乳類細胞などのインタクトな生細胞内でＬＣポリペプチドをコードする核酸から発現されるＬＣポリペプチドも含む。この用語は、無細胞タンパク質合成系、反応混合物、若しくは無細胞抽出物、又は細胞の培養液から精製又は部分的に精製されるＬＣポリペプチドも含む。

用語「細菌由来無細胞抽出物」は、ＤＮＡをｍＲＮＡに転写及び／又はｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳することができるｉｎ ｖｉｔｒｏ反応混合物の調製を表す。この混合物は、リボソーム、ＡＴＰ、アミノ酸、及びｔＲＮＡを含む。これらは、溶解細菌、精製成分又は両方の組合せから直接的に誘導してよい。

用語「無細菌細胞合成系」は、生物抽出物及び／又は定義された試薬を含む反応混合物中ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を表す。反応混合物は、巨大分子、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、その他の産生のための鋳型；合成される巨大分子のための単量体、例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、その他；並びに補助因子、酵素及び合成に必要な他の試薬、例えば、リボソーム、荷電されていないｔＲＮＡ、非天然アミノ酸と共に荷電されたｔＲＮＡ、ポリメラーゼ、転写因子、ｔＲＮＡ合成酵素、その他を含むだろう。

用語「ペプチド」、「タンパク質」、及び「ポリペプチド」は本明細書において互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを表す。この用語は、１又は複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーに当てはまる。本明細書で使用されるとき、用語は、完全長タンパク質及び短縮タンパク質を含むいずれもの長さのアミノ酸鎖を包含し、アミノ酸残基はペプチド共有結合により結合される。

本明細書で使用されるとき、用語「Ｆａｂ断片」は、完全長免疫グロブリンのパパインによる消化から得られる完全長抗体の部分を含む抗体断片、又は合成的に、例えば、組み換えで製造される同じ構造を有する断片である。Ｆａｂ断片は、軽鎖（可変（Ｖ_Ｌ）及び定常（Ｃ_Ｌ）領域ドメインを含む）並びに重鎖（Ｖ_Ｈ）の可変ドメイン及び重鎖の１つの定常領域ドメイン部分（Ｃ_Ｈ１）を含むもう１つの鎖を含む。

本明細書で使用されるとき、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、ｐＨ４．０～４．５においてペプシンによる免疫グロブリンの消化から得られる抗体断片、又は同じ構造を有する合成的、例えば、組み換えで製造された抗体である。Ｆ（ａｂ’）_２断片は、２つのＦａｂ断片を含むが、各重鎖部分は、前記２つの断片を結合するジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む付加的数個のアミノ酸を含む。

本明細書で使用されるとき、抗体に関連する「可変ドメイン」は、異なる抗体によって異なるアミノ酸配列を含む抗体重鎖又は軽鎖の特定の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインである。各軽鎖及び各重鎖は、１つの可変領域ドメイン（Ｖ_Ｌ、及びＶ_Ｈ）を有する。可変ドメインは、抗原特異性を提供し、したがって、抗原認識に関与する。各可変領域は、抗原結合部位ドメイン及びフレームワーク領域（ＦＲ）の部分であるＣＤＲを含む。

したがって、「抗原結合部位を形成するのに充分である抗体又はその部分」は、抗体又はその部分は、全６ＣＤＲを含む対応する完全長抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持するのに充分なＶ_Ｈ及びＶ_Ｌの少なくとも１若しくは２、通常３、４、５又は全６ＣＤＲを含むことを含む。総じて、充分な抗原結合部位は、重鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）を少なくとも必要とする。抗原結合部位は、通常、軽鎖のＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）を更に必要とする。本明細書に記載されているように、当業者は、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａナンバリングに基づいてＣＤＲを知り、特定することができる（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７参照）。

表１は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａスキームにより特定されたＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３の位置を示す。ＣＤＲ－Ｈ１に関して、残基ナンバリングは、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ両方のナンバリングスキームを用いて提供される。

本明細書で使用されるとき、用語「抗原」及び同様な用語は、抗体、その複合体（例えば、キメラ抗体若しくは二重特異性抗体又はｓｃＦｖ）、又はその断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ及び他の組成物）により認識される分子、化合物、又は複合体を表すために本明細書において使用される。この用語は、抗体、その複合体又はその断片により特異的に認識することができるいずれもの分子、例えば、ペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、化学部分、又はこれらの組合せ（例えば、リン酸化又はグリコシル化ペプチド、クロマチン部分、その他）を表すことができる。

用語「に対して特異的」、「特異的に結合する」、及び同様なものは、非標的化合物より２倍以上大きい親和性、例えば、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、２０倍以上、２５倍以上、５０倍以上、又は１００倍以上大きい親和性を有する標的（抗原、エピトープ、抗体標的、その他）との分子（例えば、抗体又は抗体断片）の結合を表す。例えば、その標的抗原と特異的に結合、又はその標的抗原に対して特異的であるＦａｂ断片は、非標的抗原より２倍以上大きい親和性を有するその標的抗原と通常結合するＦａｂ断片である。

抗体標的（例えば、抗原、検体、免疫複合体）と関連する用語「結合する」は、抗体が純粋な集団（適切なモル比と仮定）中の抗体標的の大多数と結合することを通常示す。例えば、所与の抗体標的と結合する抗体は、溶液中の抗体標的の３分の２以上（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）と通常結合する。当業者は、いくつかの変動性は、方法及び／又は結合を決定する閾値に応じて生じるだろうと認識する。

本明細書で使用されるとき、用語「結合親和性」は、（Ｆａｂ断片の）結合部位と標的分子（標的抗原）との結合の強度を表す。標的分子Ｙに対する結合部位Ｘの親和性は、解離常数（Ｋ_ｄ）により表され、溶液中に存在するＸの結合部位の半数を占めるのに必要なＹの濃度である。より低いＫ_ｄは、より強い又はより高いＸとＹとの相互作用を示し、より低い濃度のリガンドは前記部位を占有するために必要である。

用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及び一本鎖又は二本鎖形態のいずれかのそのポリマー、並びにその補体を表す。用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの直鎖配列を表す。用語「ヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドの単一単位、すなわち、単量体を通常表す。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はその修飾バージョンであり得る。本明細書中に考えられるポリヌクレオチドの例としては、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡの混合物を有するハイブリッド分子が挙げられる。この用語は、対象とするタンパク質のアミノ酸配列に転写及び翻訳することができる分子の直鎖配列中のヌクレオチドの特定の順序を含む用語「核酸配列」と互換的に使用することもできる。したがって、この用語は、重鎖ポリペプチド及び／又は軽鎖ポリペプチドをコードする核酸を含む。

用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を表す。天然アミノ酸は、遺伝コードによりコードされたもの、並びに後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、例えば、水素、カルボキシ基、アミノ基、及びＲ基と結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを表す。かかる類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有してよいが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的化学構造と異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を表す。

別段に明示的に指定されない限り、用語「収量」及び「力価」は、反応混合物体積に対して産生された抗体の量（ＨＣ及びＬＣの総量を含む）を表す。例えば、２００ｍｇ／Ｌは、反応混合物の１リットル当たり産生された抗体２００ｍｇを表す。

用語「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のサブタイプを表し、この細胞は、特定の生物形態を有し、特定の遺伝子構造を共有する。用語「酸化的細胞質を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株」は、株由来細胞の一部又は全てが各々酸化的細胞質を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を表す。

用語「単位体積当たりの収量」は、所定の反応体積単位で無細胞合成系により発現又は産生されたタンパク質（例えば、抗体）の量を表す。この用語は、反応体積の１リットル当たり発現又は産生されたタンパク質の量（濃度）、例えば、反応体積の１リットル当たりのグラム（ｇ／Ｌ）又は１リットル当たりのミリグラム（ｍｇ／Ｌ）を含むことができる。

本明細書に記載されている全範囲は、範囲のエンドポイント値及びエンドポイント間の全値を含むと理解される。例えば、範囲が整数で表される場合、範囲は、エンドポイント値を含むエンドポイント値間の全整数、及び第一有効桁までの値を含み得る。したがって、１～１０の範囲は、値１．０、１．１、１．２、・・・９．８、９．９、及び１０．０を含む。

本開示は、無細胞タンパク質合成系を用いた抗体の大規模産生のための組成物及び産生方法を記載する。前記方法は、軽鎖（ＬＣ）ポリペプチドを含む反応混合物中、抗体の重鎖（ＨＣ）ポリペプチドを、前記重鎖をコードする核酸から発現させることを含む。この方法は、例えば、約１０リットル以上の反応体積、例えば、約１０リットル～約１０，０００リットルの反応体積において、抗体の商業的産生に適しているように大規模に行われる。前記方法により産生される抗体の単位体積当たりの収量は、例えば、大量と比較して少量の異なる反応体積にわたって同様であり、この収量は、室内実験の典型的反応体積から抗体の商業的産生に適している反応体積まで拡張可能であることを示した。

本明細書に記載されている方法は、予想外に、対象の抗体の単位体積当たりの収量増加をもたらす。前記方法は、対象の抗体の品質向上ももたらす可能性がある。皮質向上により、抗体のＨＣポリペプチド及びＬＣポリペプチドは、適切にフォールディングされ、組み立てられて機能的抗原結合部位を形成する必要があると理解される。したがって、本明細書に記載されている方法は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方とも発現される反応混合物と比較して、単位体積当たりの適切にフォールディング及び／又はアセンブリされた抗体の収量を増加させ得る。例えば、適切にフォールディングされた抗体の単位体積当たりの収量は、ＨＣ及びＬＣをコードする核酸から重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチド両方とも発現される反応混合物と比較して、３０％以上高い可能性がある。

いくつかの態様では、ＨＣポリペプチドの発現工程前に、無細胞タンパク質合成系反応混合物にＬＣポリペプチドが添加される。いくつかの実施形態では、この軽鎖ポリペプチドは、前もって製造された軽鎖（ＰＦＬＣ）である。例えば、前記ＬＣポリペプチドを、ＨＣポリペプチドを発現させるために使用される無細胞タンパク質合成系と別の又は異なる無細胞タンパク質合成系、反応混合物、又は無細胞抽出物中前記ＬＣポリペプチドをコードする核酸から発現してよい。他の実施形態では、前記ＬＣポリペプチドを、細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞又はＣＨＯ細胞内で発現し、かかる細胞の培養液から精製してよい。それから、ＰＦＬＣポリペプチドを、ＨＣポリペプチドをコードする核酸を含む無細胞タンパク質合成反応混合物に添加してよい。いくつかの実施形態では、発現されたＬＣポリペプチドを含む無細胞抽出物の一部を、発現工程前に、ＨＣポリペプチドをコードする核酸を含む反応混合物に添加する。いくつかの実施形態では、発現されたＬＣポリペプチドを、ＨＣポリペプチドをコードする核酸を含む無細胞タンパク質合成反応混合物に添加する前に、精製又は部分的に精製する。

本明細書に記載されている実施形態のいくつか又はいずれかでは、ＨＣポリペプチドをコードする核酸を含む反応混合物に添加する前に、前記ＬＣポリペプチドを作製、産生又は合成する。当技術分野において公知のいずれかの方法を用いて、前記ＬＣポリペプチドを作製、産生又は合成してよい。例えば、軽鎖ポリペプチドは、反応混合物に添加される前に、別の反応で産生されてもよく、又は軽鎖ポリペプチドは、反応混合物に添加される前に、合成若しくは前もって製造されてもよい。前記軽鎖ポリペプチドは、無細胞タンパク質合成系、反応混合物、又は無細胞抽出物中で前記軽鎖ポリペプチドをコードする核酸から発現されてもよい。前記軽鎖ポリペプチドは、細菌細胞又は哺乳類細胞などのインタクトな生細胞内で前記軽鎖ポリペプチドをコードする核酸から発現されてもよい。前記軽鎖ポリペプチドは、反応混合物に添加される前に、無細胞タンパク質合成系、反応混合物、無細胞抽出物、及び／又は細胞の培養物から精製又は部分的に精製されてもよい。

一般的方法
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。実務者は、特に、Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２），及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ９９），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）を対象とし、これらは、定義及び当技術分野の用語のため、参照により本明細書に援用される。標準的方法は、ＲＮＡ操作及び分析のための詳細な方法を記載しているＢｉｎｄｅｒｅｉｆ，Ｓｃｈｏｎ，＆ Ｗｅｓｔｈｏｆ（２００５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＲＮＡ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙにも見られ、これは参照により本明細書に援用される。組み換え核酸を作製するための適切な分子技術の例、及び多くのクローニング実行による当業者を指導するのに十分な説明書は、Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．，ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，（Ｉｄ．）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（Ｉｄ．）；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌｕｍｅ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．１９８７）；ａｎｄ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．１９９０）に見られ、これらは参照により本明細書に援用される。

タンパク質精製、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、及び結晶化は、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。無細胞合成方法は、Ｓｐｉｒｉｎ ＆ Ｓｗａｒｔｚ（２００８）Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ．に記載されている。無細胞合成を用いた非天然アミノ酸のタンパク質への組込み方法は、Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，２７３，４１３３－４１４０に記載されている。

ＰＣＲ増幅方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９０に記載されている。増幅反応は、通常、増幅されることになるＤＮＡ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、２つのオリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）、反応バッファ及びマグネシウムを含む。通常、望ましい熱サイクル数は、１～２５サイクルである。ＰＣＲ条件のプライマー設計及び最適化の方法は、当技術分野において周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，２００２，及びＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９０などの標準的分子生物学本で見ることが可能である。コンピュータプログラムは、必要な特異性及び最適増幅特性を有するプライマーの設計に有用である（例えば、Ｏｌｉｇｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。いくつかの実施形態では、ＰＣＲプライマーは、制限酵素に対する認識部位を付加的に含み、ベクター中の特異的制限酵素部位への増幅されたＤＮＡ断片の挿入を促進し得る。制限部位がＰＣＲプライマーの５’末端に付加されるものである場合、酵素がより効率的に切断することを可能とするように数個（例えば、２又は３個）の余分の５’塩基を含むことが好ましい。いくつかの実施形態では、ＰＣＲプライマーは、その後のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を可能とするように、Ｔ７又はＳＰ６などのＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含んでもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の方法は、当業者に周知である（例えば、Ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１６６３－１６６７，１９９０；Ｅｂｅｒｗｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３０１０－３０１４，１９９２参照）。

本明細書に記載されているタンパク質が名称により表される場合、これは、同様の機能及び同様のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。したがって、本明細書に記載されているタンパク質としては、野生型原型タンパク質、並びに相同体、多形バリエーション及び組み換えにより作製された変異タンパク質が挙げられる。タンパク質が原型タンパク質と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する場合、タンパク質は、同様なアミノ酸配列を有すると定義される。タンパク質の配列同一性を、ＢＬＡＳＴＰプログラムで、デフォルトのワード長３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を用いて決定することができる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９，１９９２参照）。

タンパク質相同体、多形バリアント又は組み換え変異タンパク質が本明細書に記載されているタンパク質に含まれるか否かを容易に決定する従来試験は、原型タンパク質に対して生成されたポリクローナル抗体と特異的結合することによる。

無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）技術
本明細書に記載されている対象の生物活性タンパク質を発現させるために、無細胞タンパク質合成系を使用することができる。精製ｍＲＮＡ転写又はｉｎ ｖｉｔｒｏ合成反応中にＤＮＡから転写されるｍＲＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成を支持する細胞抽出物を開発した。本明細書に記載されている無細胞タンパク質合成系は、大反応体積、例えば、約１０リットル以上、約２０リットル、約３０リットル、約４０リットル、約５０リットル、約６０リットル、約７０リットル、約８０リットル、約９０リットル、約１００リットル、約１５０リットル、約２００リットル、約３００リットル、約４００リットル、約５００リットル、約６００リットル、約７００リットル、約８００リットル、約９００リットル、約１０００リットル、約２０００リットル、約３０００リットル、約４０００リットル、約５０００リットル、約６０００リットル、約７０００リットル、約８０００リットル、約９０００リットル、約１０，０００リットル、約１５，０００リットル、約２０，０００リットル、又は約２５，０００リットルなどの約１０リットル以上の反応体積を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている無細胞タンパク質合成系は、約１０リットル以下、約２０リットル、約３０リットル、約４０リットル、約５０リットル、約６０リットル、約７０リットル、約８０リットル、約９０リットル、約１００リットル、約１５０リットル、約２００リットル、約３００リットル、約４００リットル、約５００リットル、約６００リットル、約７００リットル、約８００リットル、約９００リットル、約１０００リットル、約２０００リットル、約３０００リットル、約４０００リットル、約５０００リットル、約６０００リットル、約７０００リットル、約８０００リットル、約９０００リットル、約１０，０００リットル、約１５，０００リットル、約２０，０００リットル、又は約２５，０００リットルなどの約１０リットル以下の反応体積を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている無細胞タンパク質合成系は、約１０，０００リットル～２０，０００リットルの反応体積、又は約１０，０００リットル以下～２０，０００リットルの反応体積、又は約１０，０００リットル～２０，０００リットルの最大体積、例えば、１０，０００リットル、１１，０００リットル、１２，０００リットル、１３，０００リットル、１４，０００リットル、１５，０００リットル、１６，０００リットル、１７，０００リットル、１８，０００リットル、１９，０００リットル、又は２０，０００リットルの最大体積を含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている無細胞タンパク質合成系は、約１０，０００リットルの反応体積、約１０，０００リットル以下の反応体積、又は約１０，０００リットルの最大反応体積を含むことができる。

いくつかの実施形態では、この無細胞タンパク質合成系は、約１０リットル～約２５，０００リットルの体積を有する反応混合物を含む。いくつかの実施形態では、この無細胞タンパク質合成系は、約１０リットル～約１０，０００リットルの体積を有する反応混合物を含む。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、約１０，０００リットル～約２０，０００リットルの体積を含む。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、約１５，０００リットル～約２５，０００リットルの体積を含む。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、約１０リットル～約２５，０００リットル以上の体積を含む。いくつかの実施形態では、この反応混合物は、約１０リットル～約２５，０００リットル以下の体積を含む。

いくつかの実施形態では、対象とするタンパク質は、抗体である。

反応混合物におけるポリペプチドのＣＦＰＳは、細菌抽出物及び／又は定義されている試薬を含む。この反応混合物は、少なくともＡＴＰ又はエネルギー源；巨大分子、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、その他の産生のための鋳型；アミノ酸、並びにポリペプチド合成に必要な補助因子、酵素及び他の試薬、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、ポリメラーゼ、転写因子、アミノアシル合成酵素、伸長因子、開始因子、その他を含む。本発明の１つの実施形態では、エネルギー源は、恒常性エネルギー源である。高エネルギーリン酸結合からＡＴＰの再生を触媒する酵素、例えば、酢酸キナーゼ、クレアチンキナーゼ、その他も含まれ得る。かかる酵素は、翻訳に使用される抽出物中に存在してもよく、反応混合物に添加してもよい。かかる合成反応系は、当技術分野において周知であり、文献に記載されている。

本明細書で使用されるとき、用語「反応混合物」は、核酸鋳型からポリペプチドの合成を触媒することができる反応混合物を表す。反応混合物は、細菌細胞からの抽出物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓ３０抽出物を含む。Ｓ３０抽出物は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｌｅｓｌｅｙ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２６３２－８に記載されている。好気性条件下又は嫌気性条件下のいずれかで合成を行うことができる。

いくつかの実施形態では、細菌抽出物は乾燥している。乾燥細菌抽出物は、出発物質の固形パーセントの測定により決定される元の固形物の１１０％のミリＱ水（例えば、逆浸透水）中に再調製することができる。１つの実施形態では、抽出物１０ｍＬの元の固形物の１１０％である乾燥抽出物の精秤されたアリコートを、マグネティックスターラー上に撹拌バーを含むガラス製ビーカー内の１０ｍＬのミリＱ水に添加する。得られた混合物を、粉末が溶解するまで撹拌する。一旦溶解すれば、物質を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、もし直ぐに使用しなければ、－８０℃に貯蔵する。

反応混合物中の抽出物の体積パーセントは変わり、抽出物は、通常総体積の約１０％以上であり；より通常、約２０％以上であり；場合によっては、総体積の約５０％以上又は約６０％以上；通常約７５％以下で提供される場合、更なる効果を提供する可能性がある。

一般的系としては、対象とするタンパク質をコードする核酸鋳型が挙げられる。この核酸鋳型は、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）又はｍＲＮＡをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）であり、いずれかの形態（例えば、直鎖、環状、超らせん状、一本鎖、二本鎖、その他）である。核酸鋳型は、所望のタンパク質の産生を誘導する。

鋳型を維持するため、抽出物を製造するために使用される細胞を、有害な酵素の活性を低下、実質的に低下若しくは排除するため、又は改良された活性を有する酵素のために選択してよい。修飾されたヌクレアーゼ又は脱リン酸酵素活性（例えば、少なくとも１つの変異脱リン酸酵素若しくはヌクレアーゼ遺伝子又はこれらの組合せ）を有する細菌細胞を、合成効率を増強するための細胞抽出物の合成のために使用することができる。例えば、ＣＦＰＳのＳ３０抽出物を作製するために使用される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、ＲＮアーゼＥ又はＲＮアーゼＡ欠乏性であり得る（例えば、変異による）。

ＣＦＰＳ系を、検出可能に標識化されたアミノ酸、又は慣例に従わない若しくは非天然アミノ酸の所望タンパク質への組込みを誘導するように改変することもできる。アミノ酸を、別の生物源から合成又は誘導することができる。これに限定されないが検出可能に標識化されたアミノ酸を含む様々な種類の非天然アミノ酸を、ＣＦＰＳ反応物に添加し、特定の目的のためにタンパク質に効果的に組み込むために付加することができる。例えば、Ａｌｂａｙｒａｋ，Ｃ．ａｎｄ Ｓｗａｒｔｚ，ＪＲ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４３１（２）：２９１－５；Ｙａｎｇ ＷＣ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２０１２），２８（２）：４１３－２０；Ｋｕｅｃｈｅｎｒｅｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，（２０１２），７（９）：ｅ４５８５０；及びＳｗａｒｔｚ ＪＲ．，ＡＩＣｈＥ Ｊｏｕｒｎａｌ，５８（１）：５－１３参照。

一般的ＣＦＰＳ反応では、対象とするタンパク質をコードする遺伝子は、転写バッファ中で発現され、ＣＦＰＳ抽出物及び翻訳バッファ中対象とするタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡを得る。転写バッファ、無細胞抽出物及び翻訳バッファを、別々に添加することができ、又はこれらの溶液の２又は複数を、これらの添加前に配合してもよく、又は同時に添加してもよい。

対象とするタンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏ合成するため、ある時点でＣＦＰＳ抽出物は、対象とするタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を含む。いくつかのＣＦＰＳ系では、ｍＲＮＡを、天然源から精製された後に外因的に添加するか、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ及び／又はファージ由来ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼを用いてクローン化されたＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ合成で調製する。他の系では、ｍＲＮＡを、鋳型ＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏで産生し；転写及び翻訳両方とも、この種類のＣＦＰＳ反応で起こる。いくつかの実施形態では、転写及び翻訳系は、相補的転写及び翻訳系を結合又は含み、これは、同じ反応におけるＲＮＡ及びタンパク質両方の合成を行う。かかるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳系では、ＣＦＰＳ抽出物は、転写（ｍＲＮＡを産生）及び翻訳（タンパク質を合成）の両方に必要な全成分（外因性又は内因性）を単一系に含む。本明細書に記載されている結合された転写及び翻訳系は、大腸菌を用いた無細胞タンパク質合成（ＯＣＦＳ）系と呼ぶこともあり、対象の適切にフォールディングされたタンパク質の高力価、例えば、抗体発現の高力価を得ることが可能である。

無細胞タンパク質合成反応混合物は、以下の成分を含む：ＤＮＡなどの、少なくとも１つのプロモーターと機能的に結合された対象の遺伝子、所望により、１若しくは複数の他の調節配列（例えば、対象の遺伝子を含むクローニングベクター又は発現ベクター）又はＰＣＲ断片を含む鋳型核酸；対象の遺伝子が機能的に結合されたプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）及び、所望により、鋳型核酸が機能的に結合された所望により存在する調節配列に指令された１若しくは複数の転写因子；リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）；所望により存在する他の転写因子及びその補助因子；リボソーム；転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）；他又は所望により存在する翻訳因子（例えば、翻訳開始因子、伸長因子及び翻訳終了因子）及びその補助因子；１又は複数のエネルギー源（例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ）；所望により存在する１又は複数のエネルギー再生成分（例えば、ＰＥＰ／ピルビン酸キナーゼ、ＡＰ／酢酸キナーゼ又はクレアチンリン酸／クレアチンキナーゼ）；所望により存在する収率及び／又は有効率を増強する因子（例えば、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質安定剤、シャペロン）及びその補助因子；並びに：所望により存在する可溶化剤。反応混合物は、塩（例えば、酢酸、グルタミン酸、又は硫酸のカリウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、及びマンガン塩）を含むタンパク質合成に特に必要なアミノ酸及び他の物質、高分子化合物（例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、第四級アミノエチル及びアミノエチルデキストラン、その他）、環状ＡＭＰ、タンパク質又は核酸分解酵素の阻害剤、タンパク質合成の阻害剤又は制御因子、酸化／還元調整剤（例えば、ＤＴＴ、アスコルビン酸、グルタチオン、及び／又はその酸化物）、非変性界面活性剤（例えば、トリトンＸ－１００）、バッファ成分、スペルミン、スペルミジン、プトレシン、その他を更に含む。ＣＦＰＳ反応物の成分は、米国特許第７，３３８，７８９号及び同第７，３５１，５６３号、並びに米国特許出願公開第２０１０／０１８４１３５号及び同第２０１０／００９３０２４号により詳細に論じられておりこれらの各々の開示は、全目的のためその全文を参照することにより援用される。

抽出物中に存在する特定の酵素に応じて、例えば、多くの公知のヌクレアーゼ、ポリメラーゼ又は脱リン酸酵素阻害剤の１又は複数を選択し、合成効率を向上するために有利に使用することができる。

タンパク質及び核酸合成は、通常、エネルギー源を必要とする。エネルギーは、ｍＲＮＡを産生する転写開始するために必要である（例えば、ＤＮＡ鋳型を使用し、翻訳開始のため、高エネルギーリン酸を例えばＧＴＰの形態で使用する場合）。リボソームによる１つのコドンの各後続工程（３ヌクレオチド；１アミノ酸）は、ＧＤＰへの追加のＧＴＰの加水分解を必要とする。ＡＴＰも通常必要である。タンパク質合成中重合されるアミノ酸のため、ＡＴＰは、先ず活性化されなければならない。したがって、高エネルギーリン酸結合からのエネルギーの有意量は、タンパク質及び／又は核酸合成が進行するために必要である。

エネルギー源は、所望の化学反応を達成するためのエネルギーを提供するために酵素的に進行することができる化学基質である。ヌクレオシド三リン酸、例えば、ＡＴＰに見られるものなど、高エネルギーリン酸結合の切断による合成のためのエネルギー放出を可能とするエネルギー源を、通常使用する。高エネルギーリン酸結合に変換可能ないずれかの源は、特に適している。ＡＴＰ、ＧＴＰ、及び他の三リン酸は、タンパク質合成を支持するための均等なエネルギー源として通常見做すことができる。

合成反応のためのエネルギーを得るため、系は、グルコース、ピルビン酸、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、カルバモイルリン酸、アセチルリン酸、クレアチンリン酸、ホスホピルビン酸、グリセルアルデヒド３－リン酸、３－ホスホグリセリン酸及びグルコース－６－リン酸などの追加されるエネルギー源を含むことができ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、他のＮＴＰ、その他などの高エネルギー三リン酸化合物を生成又は再生することができる。

充分なエネルギーが最初に合成系に存在しない場合、追加のエネルギー源を、好ましくは補充する。エネルギー源を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成反応中に追加又は補充することもできる。

いくつかの実施形態では、無細胞タンパク質合成反応を、ＮＴＰ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡ、アミノ酸、Ｍｇ^２＋酢酸塩、Ｍｇ^２＋グルタミン酸塩、Ｋ^＋酢酸塩、Ｋ^＋グルタミン酸塩、フォリン酸、トリスｐＨ８．２、ＤＴＴ、ピルビン酸キナーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、ＮＡＤ、ＣｏＡ、Ｎａ^＋シュウ酸塩、プトレシン、スペルミジン、及びＳ３０抽出物を含むＰＡＮＯｘ－ＳＰ系を用いて行う。

いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含むタンパク質を合成してよい。かかる実施形態では、反応混合物は、非天然アミノ酸、２０天然アミノ酸と直交するｔＲＮＡ、及びｎｎＡＡを直交ｔＲＮＡと結合することができるｔＲＮＡ合成酵素を含んでよい。例えば、米国特許出願公開第２０１０／００９３０２４号参照。あるいは、反応混合物は、天然ｔＲＮＡ合成酵素が枯渇するｔＲＮＡと結合されたｎｎＡＡを含んでよい。例えば、国際公開第２０１０／０８１１１１号参照。ｎｎＡＡを、当技術分野において公知のいずれかのｎｎＡＡから選択することができる。例えば、ｎｎＡＡを、米国特許第９，７３８，７２４号及び米国特許第１０，６１０，５７１号に記載されているものから選択することができる。いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡは、ｐ－アセチルフェニルアラニンである。いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡは、ｐ－アミノメチルフェニルアラニンである。いくつかの実施形態では、ｎｎＡＡは、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニンである。

場合によっては、無細胞合成反応は、一般的な二次エネルギー源の添加を必要としないが、酸化的リン酸化及びタンパク質合成の共活性化を使用する。場合によっては、ＣＦＰＳを、サイトミム（細胞質模倣体）系などの反応で行う。サイトミム系は、最適化されたマグネシウム濃度を有し、ポリエチレングリコールの非存在下で行う反応条件として定義される。この系は、リン酸を蓄積せず、タンパク質合成を阻害することが分かっている。

活性酸化的リン酸化反応経路の存在を、電子伝達系阻害剤など、経路中の工程を特異的に阻害する阻害剤を用いて試験することができる。酸化的リン酸化反応経路の阻害剤の例としては、シアン化物、一酸化炭素、アジド、カルボニルシアニドｍ－クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）などの毒素、及び２，４－ジニトロフェノール、オリゴマイシンなどの抗生物質、ロテノンなどの駆除薬、並びにマロン酸及びオキサロ酢酸などのコハク酸脱水素酵素の競合阻害剤が挙げられる。

いくつかの実施形態では、無細胞タンパク質合成反応を、ＮＴＰ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔＲＮＡ、アミノ酸、Ｍｇ^２＋酢酸塩、Ｍｇ^２＋グルタミン酸塩、Ｋ^＋酢酸塩、Ｋ^＋グルタミン酸塩、フォリン酸、トリスｐＨ８．２、ＤＴＴ、ピルビン酸キナーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、ピルビン酸ナトリウム、ＮＡＤ、ＣｏＡ、Ｎａ^＋シュウ酸塩、プトレシン、スペルミジン、及びＳ３０抽出物を含むサイトミム系を用いて行う。いくつかの実施形態では、サイトミム系のためのエネルギー基質は、ピルビン酸、グルタミン酸、及び／又はグルコースである。系のいくつかの実施形態では、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を、ヌクレオシド一リン酸（ＮＭＰ）で置換する。

細胞抽出物を、ジスルフィド結合を減少及び適切なタンパク質フォールディングを損ない得る酵素を不活性化するために、ヨードアセトアミドで処理することができる。さらに本明細書に記載されているように、細胞抽出物に、適切なタンパク質フォールディングを促進するシャペロンを補充することもできる。いくつかの実施形態では、シャペロンは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）又はペプチジルプロリルイソメラーゼ（ＰＰＩ）である。したがって、細胞抽出物に、これに限定されないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｓｂＣなどのＰＤＩ、若しくはこれに限定されないが、ＦｋｐＡなどのＰＰＩ、又はＰＤＩ及びＰＰＩの組合せを補充することができる。適切なシャペロンの例は、本明細書に更に記載されている。グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）及びグルタチオン（ＧＳＨ）を、適切なタンパク質フォールディングを促進し、異所のタンパク質ジスルフィドの形成を防止する比で抽出物に添加することもできる。

いくつかの実施形態では、ＣＦＰＳ反応物は、酸化的リン酸化を行う反転膜小胞を含む。これらの小胞を、本明細書に記載されているように細胞抽出過程の調製の高圧均質化工程中に形成し、反応混合物中で使用される抽出物中に保持することができる。

無細胞抽出物を、ＣＦＰＳ反応において使用する前に、室温において解凍することができる。この抽出物を、ジスルフィド結合を有するタンパク質を合成する場合、５０μＭヨードアセトアミドと共に３０分間インキュベートすることができる。いくつかの実施形態では、ＣＦＰＳ反応物は、約８ｍＭグルタミン酸マグネシウム、約１０ｍＭグルタミン酸マグネシウム、約１３０ｍＭグルタミン酸マグネシウム、約３５ｍＭピルビン酸ナトリウム、約１．２ｍＭ ＡＭＰ、約０．８６ｍＭのＧＭＰの各々、ＵＭＰ、及びＣＭＰ、約２ｍＭアミノ酸（チロシンについては約１ｍＭ）、約４ｍＭシュウ酸ナトリウム、約０．５ｍＭプトレシン、約１．５ｍＭスペルミジン、約１６．７ｍＭリン酸カリウム、約１００ｍＭ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、約２～１０μｇ／ｍＬプラスミドＤＮＡ鋳型、約１～１０μＭ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｓｂＣ、及び総濃度約２ｍＭ酸化（ＧＳＳＧ）グルタチオンを含む約３０％（体積／体積）ヨードアセトアミド処理抽出物が挙げられる。所望により、無細胞抽出物は、１ｍＭの還元（ＧＳＨ）を含むことができる。

無細胞合成反応条件を、当技術分野において公知のバッチ式、連続流、又は反連続流として行ってよい。反応条件は、直線的にスケーラブル、例えば、約０．５Ｌ撹拌槽反応器において約０．３Ｌ規模から、約１０Ｌ反応器において約４Ｌ規模まで、約２００Ｌ反応器において約１００Ｌ規模まで、約５００Ｌ反応器において約２００Ｌ規模まで、約１０００Ｌ反応器において約５００Ｌ規模まで、約２０００Ｌ反応器において約１０００Ｌ規模まで、約４０００Ｌ反応器において約２０００Ｌ規模まで、約６０００Ｌ反応器において約３０００Ｌ規模まで、約８０００Ｌ反応器において約４０００Ｌ規模まで、約１０，０００Ｌ反応器において約５０００Ｌ規模まで、約１２，０００Ｌ反応器において約６０００Ｌ規模まで、約１４，０００Ｌ反応器において約７０００Ｌ規模まで、約１６，０００Ｌ反応器において約８０００Ｌ規模まで、約１８，０００Ｌ反応器において約９０００Ｌ規模まで、約２０，０００Ｌ反応器において約１０，０００Ｌ規模まで、約４０，０００Ｌ反応器において約２０，０００Ｌ規模まで、及び約５０，０００Ｌ反応器において約２５，０００Ｌ規模までである。

無細胞合成反応条件は、約０．３リットル以上、約１リットル、約５リットル、約１０リットルの反応体積、その例としては、約１０リットル以上、約２０リットル、約３０リットル、約４０リットル、約５０リットル、約６０リットル、約７０リットル、約８０リットル、約９０リットル、約１００リットル、約１５０リットル、約２００リットル、約３００リットル、約４００リットル、約５００リットル、約６００リットル、約７００リットル、約８００リットル、約９００リットル、約１０００リットル、約２０００リットル、約３０００リットル、約４０００リットル、約５０００リットル、約６０００リットル、約７０００リットル、約８０００リットル、約９０００リットル、約１０，０００リットル、約１５，０００リットル、約２０，０００リットル、又は約２５，０００リットルの反応体積を含むことができる。いくつかの実施形態では、無細胞合成反応条件は、約０．３リットル以下、約１．０リットル、約５リットル、約１０リットル、約２０リットル、約３０リットル、約４０リットル、約５０リットル、約６０リットル、約７０リットル、約８０リットル、約９０リットル、約１００リットル、約１５０リットル、約２００リットル、約３００リットル、約４００リットル、約５００リットル、約６００リットル、約７００リットル、約８００リットル、約９００リットル、約１０００リットル、約２０００リットル、約３０００リットル、約４０００リットル、約５０００リットル、約６０００リットル、約７０００リットル、約８０００リットル、約９０００リットル、約１０，０００リットル、約１５，０００リットル、約２０，０００リットル、又は約２５，０００リットル以下の反応体積を含む。いくつかの実施形態では、無細胞合成反応条件は、約１０，０００リットル～２５，０００リットル、若しくは約１０，０００リットル以下～２５，０００リットルの反応体積、又は約１０，０００リットル～２５，０００リットルの最大体積、例えば、１０，０００リットル、１１，０００リットル、１２，０００リットル、１３，０００リットル、１４，０００リットル、１５，０００リットル、１６，０００リットル、１７，０００リットル、１８，０００リットル、１９，０００リットル、２０，０００リットル、２１，０００リットル、２２，０００リットル、２３，０００リットル、２４，０００リットル、若しくは２５，０００リットルの最大体積を含むことができる。いくつかの実施形態では、無細胞合成反応条件は、約１０リットル～約２５，０００リットル、約１０リットル～約１０，０００リットル、約１０，０００リットル～約２０，０００リットル、又は約１５，０００リットル～約２５，０００リットルの反応体積を含むことができる。

Ｓｐｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１１６２－１１６４による連続流ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成の開発は、この反応が数時間まで延長することができることを証明した。それ以来、多数のグループは、この系を再現及び改良した（例えば、Ｋｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０：１６６－１６８；Ｅｎｄｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：２２１－２３０参照）。Ｋｉｍ及びＣｈｏｉ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１２：６４５－６４９，１９９６）は、バッチ式及び連続流系の利点を、簡単な透析膜反応器を用いて「半連続操作」の導入により組み合わせることができることを報告した。これらは、従来のバッチ系の開始速度を維持しながら連続流系の延長された反応時間を再現することができた。しかしながら、連続式及び半連続式アプローチ両方とも、多量の高価な試薬を必要とし、高価な試薬は、製品収量増加よりかなり大きい倍数に増加しなければならない。

いくつかの改良を、従来のバッチ系で行った（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９：８８１－８８６；Ｋｕｌｄｌｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０６：３８９－３９３；Ｋａｗａｒａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６：３２０－３２４）。反連続系は延長された時間にわたってタンパク質合成の開始速度を維持するが、従来のバッチ系は、いくつかの利点、例えば、操作の簡便さ、容易なスケールアップ、より低い試薬費用及び優れた再現性をなお提供する。さらに、バッチ系を、同時に様々な遺伝物質を発現する多重化フォーマットで容易に行うことができる。

Ｐａｔｎａｉｋ及びＳｗａｒｔｚ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：８６２－８６８，１９９８）は、タンパク質合成の開始比速度を、反応条件の広範な最適化によりｉｎ ｖｉｖｏ発現と同様なレベルに増強することができることを報告した。これは、濃縮工程なしで調製された従来の細胞抽出物を用いてタンパク質合成のかかる高速度を達成することは注目すべきである（Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４６：２７５－２８２；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９：８８１－８８６）。Ｋｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４４２：１５－１９は、濃縮抽出物及びエネルギー源としてクレアチンリン酸を用いた高レベルのタンパク質合成を報告している。これらの結果は、特にタンパク質合成反応の持続時間に関してバッチ系の更なる改良は、バッチ式ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成の生産性を実質的に増大することを示唆している。しかしながら、従来のバッチ系におけるタンパク質合成の早期停止の理由は不明なままである。

本明細書に記載されているタンパク質合成反応は、大規模反応器を利用してもよく、小規模反応器を利用してもよく、又は複数の同時合成を行うために多重化されていてもよい。いくつかの実施形態では、記載されているタンパク質合成反応は、試薬流を導入する供給機構を使用する連続式反応であり、プロセスの部分として最終産物を単離してよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているタンパク質合成反応は、追加試薬を活性合成の時間を延長するために導入し得るバッチ式反応である。反応器は、バッチ式、延長バッチ式、半バッチ式、反連続式、フェッドバッチ式及び連続式などのいずれかの方式で運転することができ、適用目的に合わせて選択される。

ライセートの作製
本明細書に記載されている方法及び系は、対象とする標的タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳のための細胞ライセートを使用する。便宜上、ライセートの供給源として使用される生物は、供給源生物又は宿主細胞と呼んでよい。宿主細胞は、細菌、酵母、哺乳類細胞若しくは植物細胞であってよく、又はタンパク質合成可能な他の型の細胞であってもよい。ライセートは、所望のタンパク質をコードするメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）を翻訳することができる成分を含み、所望により、所望のタンパク質をコードするＤＮＡを転写することができる成分を含む。かかる成分としては、例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ）、所望のタンパク質をコードするＤＮＡの転写の開始に必要ないずれかの転写活性化因子、転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）、アミノアシル－ｔＲＮＡ合成酵素、７０Ｓリボソーム、Ｎ^１０－ホルミルテトラヒドロ葉酸、ホルミルメチオニン－ｔＲＮＡｆ^Ｍｅｔ合成酵素、ペプチジルトランスフェラーゼ、ＩＦ－１、ＩＦ－２、及びＩＦ－３などの開始因子、ＥＦ－Ｔｕ、ＥＦ－Ｔｓ、及びＥＦ－Ｇなどの伸長因子、ＲＦ－１、ＲＦ－２、及びＲＦ－３などの終結因子、並びに同様のものが挙げられる。

実施形態は、ライセートが誘導される細菌細胞を使用する。細菌のいずれかの株由来の細菌ライセートを、本発明の方法で使用することができる。細菌ライセートを以下の通り得ることができる。選択の細菌を、いくつかの成長培地のいずれか並びに当技術分野において周知されている及び特定の細菌の成長のために熟練者により容易に最適化された成長条件下対数期まで増殖する。例えば、合成のための自然環境は、グルコース及びホスフェートを含む培地中で増殖された細菌細胞由来の細胞ライセートを利用し、グルコースは、約０．２５％（重量／体積）以上、より通常は、約１％以上；及び通常は約４％以下、より通常は約２％以下の濃度で存在する。かかる培地の例は、２ＹＴＰＧ培地であるが、内容の明確及び明確でない両方の栄養源を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌の増殖に適した多くの公開されている培地が存在するので、当業者は、多くの培養培地をこの目的のために適用することができると考えるだろう。一夜で収穫された細胞を、適切な細胞懸濁バッファ中に細胞ペレットを懸濁し、懸濁細胞を超音波、懸濁細胞をフレンチプレス、連続流高圧ホモジナイズ、又は効果的細胞溶解に有用な当技術分野で公知の他の方法により破壊することにより溶解することができる。それから、細胞ライセートを遠心分離又はろ過して大きいＤＮＡ断片及び細胞デブリスを除去する。

細胞ライセートを作製するために使用される細菌株は、総じて、無細胞合成効率を増大するヌクレアーゼ及び／又は脱リン酸酵素の低下された活性を有する。例えば、無細胞抽出物を作製するために使用される細菌株は、ヌクレアーゼＲＮアーゼＥ及びＲＮアーゼＡをコードする遺伝子の変異を有する可能性がある。前記株は、無細胞合成反応において、それぞれ、アミノ酸トリプトファン、アルギニン、セリン及びシステインの分解を防止するｔｎａＡ、ｓｐｅＡ、ｓｄａＡ又はｇｓｈＡなどの遺伝子中の欠失などの細胞合成反応の成分を安定化する変異も有するかも知れない。加えて、前記株は、プロテアーゼｏｍｐＴ又はｌｏｎＰ中のノックアウトなどの無細胞合成のタンパク質産生物を安定化する変異を有するかも知れない。

いくつかの実施形態では、細菌抽出物を、ＣＦＰＳ反応において使用する前に、室温において解凍することができる。この抽出物を、ジスルフィド結合を有するタンパク質を合成する場合、５０μＭヨードアセトアミドと共に３０分間インキュベートすることができる。いくつかの実施形態では、ＣＦＰＳ反応物は、約８ｍＭグルタミン酸マグネシウム、約１０ｍＭグルタミン酸マグネシウム、約１３０ｍＭグルタミン酸マグネシウム、約３５ｍＭピルビン酸ナトリウム、約１．２ｍＭ ＡＭＰ、約０．８６ｍＭのＧＭＰの各々、ＵＭＰ、及びＣＭＰ、約２ｍＭアミノ酸（チロシンについては約１ｍＭ）、約４ｍＭシュウ酸ナトリウム、約０．５ｍＭプトレシン、約１．５ｍＭスペルミジン、約１６．７ｍＭリン酸カリウム、約１００ｍＭ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、約２～１０μｇ／ｍＬプラスミドＤＮＡ鋳型、約１～１０μＭ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｓｂＣ、及び総濃度約２ｍＭ酸化（ＧＳＳＧ）グルタチオンを含む約３０％（体積／体積）ヨードアセトアミド処理抽出物が挙げられる。所望により、無細胞抽出物は、１ｍＭの還元（ＧＳＨ）グルタチオンを含むことができる。

対象とするタンパク質
本明細書に記載されている方法及び系は、適切にフォールディングされた生物活性の対象とするタンパク質の発現の増加に有用である。対象とするタンパク質は、細菌無細胞合成系において発現することができるいずれかのタンパク質であり得る。非限定例としては、ジスルフィド結合を有するタンパク質及び少なくとも２つのプロリン残基を有するタンパク質が挙げられる。対象とするタンパク質は、例えば、抗体又はその断片、治療用タンパク質、成長因子、受容体、サイトカイン、酵素、リガンド、その他であり得る。対象とするタンパク質の更なる例を以下に記載する。

抗体
本明細書で提供される方法を、無細胞タンパク質合成系においていずれかの工程の組み換え産生のために使用することができる。抗体のＨＣをコードするポリヌクレオチドを、無細胞タンパク質合成系に導入して、ＨＣを発現することができ、次いで、ＬＣと対（二量体化）にして適切にアセンブリされた抗体を産生することができる。ジスルフィド結合は、抗体中に存在し、したがって、本系は分解の防止及び抗体の収量の増加に有益である。いずれかの抗体を、培養培地の１リットル当たりのタンパク質量を表す収量、すなわち、約２００ｍｇ／Ｌ以上、又は約２５０ｍｇ／Ｌ以上、約５００ｍｇ／Ｌ以上、約７５０ｍｇ／Ｌ以上、又は約１０００ｍｇ／Ｌ以上で本明細書に記載されている方法を用いて産生することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法は、約２００ｍｇ／Ｌ～約１０００ｍｇ／Ｌの抗体、例えば、約２００ｍｇ／Ｌ、３００ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ、７００ｍｇ／Ｌ、８００ｍｇ／Ｌ、９００ｍｇ／Ｌ又は１０００ｍｇ／Ｌの抗体を得る。

いくつかの実施形態では、前記抗体は、モノクローナル抗体、例えば、モノクローナルＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、前記抗体は、２つのＦａｂアーム及び１つのＦｃドメインを含む二重特異性抗体であり、各Ｆａｂは異なる抗原と結合する。いくつかの実施形態では、前記抗体は、１又は複数の機能的抗原結合部位を含み、各抗原結合部位は、一対の重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む。この一対の重鎖及び軽鎖可変ドメインを、単一Ｂ細胞又はＢ細胞クローンにより発現された天然又は同属の一対の重鎖及び軽鎖可変ドメインから誘導することができる。あるいは、この一対の重鎖及び軽鎖可変ドメインは、非同族又はランダム対の重鎖及び軽鎖可変ドメインを含むことができる。

前記抗体を、治療用の分子、薬剤又は薬物と結合していてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、前記抗体を使用して、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製することができる。いくつかの実施形態では、前記薬物は、細胞傷害性又は抗がん性の薬物である。ＡＤＣは、通常、前記抗体と前記薬剤又は薬物とのリンカーを含む。適切なリンカーの例としては、切断可能及び切断可能でないリンカーが挙げられる。切断可能なリンカーを、標的細胞内で酵素によりＡＤＣ複合体から薬剤又は薬物を遊離するように設計することができる。前記薬物が細胞傷害性又は抗がん性薬物である場合、前記薬物は、標的に近いがん細胞に対する遊離薬物を可能とする（いわゆる、「バイスタンダー殺傷」）。切断可能でないリンカーは、通常、標的細胞への侵入後、ＡＤＣ複合体から遊離されないように設計される。適切な切断可能なリンカーは、ジスルフィド、ヒドラゾン又はペプチドを含み、適切な切断可能でないリンカーはチオエーテルを含み得る。

いくつかの実施形態では、前記抗体は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む二重特異性抗体である。例えば、前記抗体は、ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、ＩｇＡ及びＩｇＧ ＣＨ３ドメインからの配列を含む２つの非対称ＣＨ３ドメインを含む抗体であり得る（米国特許第９，５０５，８４８（Ｂ２）号（Ｄａｖｉｓ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．／Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ ＧｍｂＨ）参照；Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．ＳＥＥＤボディ：非対称バインダー又は免疫融合及び二重特異性抗体のためのＦｃ類似体プラットフォーム中の鎖交換遺伝子操作ドメイン（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ヘテロ二量体をベースとする融合タンパク質、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ ２３，Ｉｓｓｕｅ ４，Ａｐｒｉｌ ２０１０，Ｐａｇｅｓ １９５－２０２）；ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む抗体は、一価又は二重特異性であり得、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ組合せ、又はラクダ科単一ドメイン抗体断片（ＶＨＨ）を有する融合分子として発現され得る。Ｍ． Ｍｕｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ＳＥＥＤ：ａ ｎｅｗ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｍｏｎｏ－ ａｎｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ ２４，Ｉｓｓｕｅ ５，Ｍａｙ ２０１１，Ｐａｇｅｓ ４４７－４５４参照。

いくつかの実施形態では、前記抗体は、軽鎖（ＬＣ）、及び重鎖（ＨＣ）を含むドメイン交換抗体であり、前記ＬＣは前記ＨＣと二量体化する。いくつかの実施形態では、前記抗体は、ＶＬ－ＣＨ３を含む軽鎖（ＬＣ）、及びＶＨ－ＣＨ３－ＣＨ２－ＣＨ３を含む重鎖（ＨＣ）を含むドメイン交換抗体であり、前記ＬＣのＶＬ－ＣＨ３は、前記ＨＣのＶＨ－ＣＨ３と二量体化し、それにより、ＣＨ３_ＬＣ／ＣＨ３_ＨＣドメイン対を含むドメイン交換ＬＣ／ＨＣ二量体を形成する。かかるドメイン交換抗体の例は、米国特許出願公開第２０１８／００１６３５４号（ＷＯＺＮＩＡＫ－ＫＮＯＰＰ，Ｇ． ｅｔ ａｌ．／Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ ＧｍｂＨ）に記載されている。

いくつかの実施形態では、前記抗体は、立体的又は静電相補性に基づいて著しく増強されたＨＣヘテロ二量体化された改変ＣＨ３ドメインを含む二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、前記抗体は、ヘテロ二量体化を促進する各重鎖において「ノブ」又は「ホール」のいずれかを作る改変ＣＨ３ドメインを含む二重特異性抗体である。ノブ・イントゥー・ホール技術の例は、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１；Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２７０（１９９７），２６－３５；国際公開第１９９６／０２７０１１（Ａ１）号、米国特許第７，６４２，２２８（Ｂ２）号（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）に対応；Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１；欧州特許出願公開第１８７０４５９（Ａ１）号、及びＸｕ Ｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ “ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ” ｕｓｉｎｇ ａ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．ＭＡｂｓ．２０１５；７（１）：２３１－２４２に記載されている。

いくつかの実施形態では、前記抗体は、第一抗原と結合するＦＡＢ及び第二抗原と結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、前記抗体は、１つのアーム上の第一抗原と結合するＦＡＢ及び第二アーム上の第二抗原と結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、前記二重特異性抗体は、Ｆｃ中の相補的変異及び／又はヘテロ二量体化を増強する重鎖を含む。かかる相補的変異の例としては、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＴ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｗが挙げられる。かかる二重特異性抗体（「バイポッド」と呼ぶ）の代表例は、Ｎｅｓｓｐｏｒ，Ｔ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｐｏｄ（Ｆａｂ×ｓｃＦｖ）Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｅｘｐｌｏｉｔｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｃｈａｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃａｐｔｕｒｅ，Ｓｃｉ Ｒｅｐ １０，７５５７（２０２０）、及びその中に引用されている参考文献に記載されている。

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆａｂ断片の軽鎖又は重鎖と融合されたｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆａｂ断片の軽鎖又は重鎖のＣ末端と融合されたｓｃＦｖを含む。二重特異性抗体フォーマットの総説については、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｍＡｂｓ，Ｖｏｌ．９，２０１７，１８２－２１２参照。

本明細書に記載されている方法により産生された例示的抗体は、米国特許出願公開第２０１７／０２５３６５６（Ａ１）号（抗分化抗原群７４（ＣＤ７４）抗体）；米国特許出願公開第２０１９／０２３３５１２（Ａ１）号（抗葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）抗体）及び国際公開第２０１９／１９０９６９号（米国特許仮出願第６２／６４８，２６６号に対応）（高Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）抗体）に記載されている。

いくつかの態様では、前記抗体は、ＳＥＥＤボディである。いくつかの実施形態では、前記ＳＥＥＤボディは、抗Ｍｕｃ１－ｓｃＦｖ－ＡＧアームと対のＨＣ及びＬＣを含む抗ＥＧＦＲ－Ｆａｂ－ＧＡアームを含む。

いくつかの実施形態では、前記抗体は、Ｂ１０抗体（抗葉酸受容体α抗体）、Ｈ０１抗体（抗葉酸受容体α抗体）、７２０９抗体（抗ＣＤ７４抗体）、抗ＰＤ１抗体、抗Ｔｉｍ３抗体、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ）、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ細胞成熟抗原（抗ＢＣＭＡ）抗体、抗分化抗原群７４（抗ＣＤ７４）抗体、抗葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）抗体、及びＳＥＥＤボディから成る群から選択される。抗体の非限定例を、表２に一覧する。

Ｉ．プロモーター
前記ＨＣの転写を誘導するために本発明の方法において使用することができるプロモーターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に適しているいずれかの適切なプロモーター配列であってよい。かかるプロモーターは、変異、切断、及びハイブリッドプロモーターを含み得、細胞に対して内因性（天然）又は異種性（外来性）のいずれかの細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから得られ得る。本明細書で使用されるプロモーターは、構成的プロモーターであってもよく、誘導性プロモーターであってもよい。

いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、構成的プロモーターである。プロモーターは、Ｔ７と同じプロモーター強度を実質的に有するものであってよく、すなわち、プロモーターの強度は、Ｔ７プロモーターの６０％以上、７０％以上、８０％以上である。いくつかの実施形態では、前記Ｔ７プロモーターは、配列番号１９を含むか、又はから成る。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、Ｔ７プロモーターの強度の５０％～２００％、例えば、８０％～１５０％、又は９０％～１４０％の範囲内である強度を示し得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において前記ＨＣの転写を誘導するために適しているプロモーターの非限定例としては、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｐＢａｄ、ＸｙｌＡ、又はＰｈｏＡプロモーターが挙げられる。

ＩＩ．ベクター
抗体のＬＣ及びＨＣをコードするポリヌクレオチドを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のための１又は２つの複製可能なベクターに挿入することができる。多くのベクターは、この目的のために利用可能であり、当業者は、本明細書に開示されている方法において使用するための適切なベクターを容易に選択することができる。遺伝子の発現を誘導する対象とする遺伝子及びプロモーターに加えて、ベクターは、通常、次のもの：シグナル配列、複製開始点、１又は複数のマーカー遺伝子の１又は複数を含む。

シャペロン
対象とする生物活性タンパク質の発現を向上するため、本方法及び系は、外因性タンパク質シャペロンを含む細菌抽出物を使用することができる。分子シャペロンは、非共有結合性フォールディング又はアンフォールディング及び他の巨大分子構造物のアセンブリ又は脱アセンブリを支援するタンパク質である。シャペロンの１つの主要な機能は、新たに合成されたポリペプチド鎖及びアセンブリされたサブユニットの両方が非機能性構造物へ凝集しないようにすることである。同定された第一タンパク質シャペロン、ヌクレオプラスミンは、ＤＮＡからのヌクレオソームアセンブリ及び適切にフォールディングされたヒストンを支援する。かかるアセンブリシャペロンは、オリゴマー構造物へのフォールディングされたサブユニットのアセンブリの助けとなる。シャペロンが、リボゾーム、タンパク質の細胞内輸送、並びにミスフォールディングされた又は変性されたタンパク質のタンパク質分解から押し出されるので、シャペロンは、初期タンパク質フォールディングに関係している。最も新しく合成されたタンパク質はシャペロンの非存在下でフォールディングし得るが、小数の合成されたタンパク質はシャペロンを厳密に必要とする。通常、シャペロンの内部は、疎水性であるが、表面構造物は親水性である。シャペロンが基質タンパク質のフォールディングを促進する正確な機序は分かっていないが、部分的にフォールディングされた構造物と天然型との活性化障壁を低下させることにより、シャペロンが適切なフォールディングを保証するために所望のフォールディング工程を加速すると考えられる。さらに、特定のシャペロンは、ミスフォールディング又は凝集されたタンパク質をアンフォールディングして、順次アンフォールディング及びリフォールディングして天然及び生物活性型に戻すことにより前記タンパク質を救出する。

これらのフォールディングされている基質をカプセル化するシャペロンのサブユニットは、シャペロンとして公知である（例えば、第Ｉ群シャペロンＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ複合体）。第ＩＩ群シャペロン、例えば、ＴＲｉＣ（ＴＣＰ－１リング複合体、ＴＣＰ－１を含むシャペロンのためのＣＣＴとも呼ぶ）は、他の基質の中でも細胞骨格タンパク質アクチン及びチューブリンをフォールディングすると考えられている。シャペロンは、積層二重リング構造を特徴とし、原核生物、真核生物の細胞基質、及びミトコンドリア中で見られる。

他の種類のシャペロンは、ミトコンドリア中の膜輸送及び真核生物中の小胞体（ＥＲ）に関する。細菌移行特異的シャペロンは、新たに合成された前駆体ポリペプチド鎖をトランスロケーション成分（総じてアンフォールディングされた）状態に維持し、前記前駆体ポリペプチド鎖をトランスロケーター又はトランスロケーションチャネルとしてよく知られているトランスロコンに導く。原核生物及び真核生物におけるタンパク質の同様な複合体は、最も一般的に、標的シグナル配列を有する新生ポリペプチドを、細胞基質からの小胞体（ＥＲ）の内部（大槽又は内腔）空間に輸送するが、新生タンパク質を膜自体（膜タンパク質）に統合するためにも使用される複合体を表す。小胞体（ＥＲ）では、一般的シャペロン（ＢｉＰ、ＧＲＰ９４、ＧＲＰ１７０）、レクチン（カルネキシン及びカルレティキュリン）及びタンパク質のフォールディングを助ける非古典的分子シャペロン（ＨＳＰ４７及びＥＲｐ２９）が存在する。フォールディングシャペロンタンパク質としては、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ）及びペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼ（ＰＰＩ、ＦｋｐＡ、ＳｌｙＤ、ＴＦ）が挙げられる。

多くのシャペロンはヒートショックなどの細胞ストレス中に極めて上方制御され、凝集する傾向はタンパク質が高温又は他の細胞ストレスにより変性されるときに増加するので、これらは、ヒートショックタンパク質（Ｈｓｐ）としても分類される。タンパク質の分解を標識するユビキチンは、ヒートショックタンパク質の特徴も有する。いくつかの極めて特異的な「立体的シャペロン」は、自然にフォールディングされ得ないタンパク質に、固有の構造的コンフォメーション（立体的）情報を伝達する。シャペロンの他の機能としては、タンパク質分解における補助、細菌接着作用、及びタンパク質凝集と関連されるプリオン病に対する応答が挙げられる。

フォルダーゼとして公知の酵素は、合成タンパク質の天然及び機能性コンフォメーションの形成に必須の共有結合の変化を触媒する。フォルダーゼの例としては、天然ジスルフィド結合の形成を触媒作用するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、及びタンパク質の機能的フォールドに必要なシス構造への安定なトランスペプチジルプロリル結合の異性化を触媒作用するペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼ（ＰＰＩ）が挙げられる。天然ジスルフィドの形成及びプロリルイミド結合のシス－トランス異性化は共に共有結合性反応であり、タンパク質フォールディング過程において律速段階であることが多い。近年、シャペロンタンパク質であることが提案され、化学量論的濃度では、フォルダーゼは、いくつかの変性タンパク質の再活性化収量を増大する。シャペロンタンパク質の他の例としては、Ｓｋｐなどのデアグリガーゼ、及び酸化還元タンパク質Ｔｒｒ１及びＧｌｒ１が挙げられる。

いくつかの実施形態では、タンパク質シャペロンを、所望のタンパク質シャペロンの活性を増大する機能を有する別のタンパク質と同時発現することができる。例えば、Ｄｓｂタンパク質ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣを、ＤｓｂＢ及びＤｓｂＤと同時発現することができ、それぞれ、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣを酸化及び還元する。

細菌を、シャペロンをコードする遺伝子を用いた形質転換
本明細書に記載されている方法及び系において使用される細菌抽出物は、１又は複数の外因性タンパク質シャペロンを含むことができる。外因性タンパク質シャペロンを、抽出物に添加してもよく、無細胞抽出物を調製するために使用される細菌により発現してもよい。後者の実施形態では、外因性タンパク質シャペロンを、遺伝子の転写を開始するプロモーターと機能的に結合された外因性タンパク質シャペロンをコードする遺伝子から発現してもよい。

外因性タンパク質シャペロンをコードする遺伝子を発現するために使用してよいプロモーターとしては、構成的プロモーター及び調節（誘導可能）プロモーターの両方が挙げられる。プロモーターは、宿主に応じて原核生物でもよく、真核生物でもよい。原核生物（バクテリオファージを含む）の中でも、本発明の実践に有用なプロモーターは、ｌａｃ、Ｔ３、Ｔ７、λＰｒ’Ｐ１’及びｔｒｐプロモーターである。真核生物（ウイルスを含む）の中でも、本発明の実践に有用なプロモーターは、ユビキタスなプロモーター（例えば、ＨＰＲＴ、ビメンチン、アクチン、チューブリン）、中間体フィラメントプロモーター（例えば、デスミン、神経フィラメント、ケラチン、ＧＦＡＰ）、治療用遺伝子プロモーター（例えば、ＭＤＲ型、ＣＦＴＲ、因子ＶＩＩＩ）、組織特異的プロモーター（例えば、平滑筋細胞内のアクチンプロモーター）、刺激に応答するプロモーター（例えば、ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体）、テトラサイクリン調節される転写調節物質、最初期のサイトメガロウイルス、レトロウイルスＬＴＲ、メタロチオネイン、ＳＶ－４０、Ｅ１ａ、及びＭＬＰプロモーターである。テトラサイクリン調節される転写調節物質及びＣＭＶプロモーターは、国際公開第９６／０１３１３号、米国特許第５，１６８，０６２号及び同第５，３８５，８３９号に記載されており、この開示は参照により本明細書に援用される。

いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、構成的プロモーターである。細菌中の構成的プロモーターの例としては、ｓｐｃリボソームタンパク質オペロンプロモーターＰ_ｓｐｃ、プラスミドｐＢＲ３２２のβ－ラクタマーゼプロモーターＰ_ｂｌａ、ファージλのＰ_Ｌプロモーター、プラスミドｐＢＲ３２２の複製制御プロモーターＰ_ＲＮＡＩ及びＰ_{ＲＮＡＩＩ}、ｒｒｎＢリボソームＲＮＡオペロンのＰ１及びＰ２プロモーター、ｔｅｔプロモーター、並びにｐＡＣＹＣプロモーターが挙げられる。

適切なシャペロン及びこれを使用及び産生する方法の例は、米国特許第１０，１９０，１４５号（Ｙａｍ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。

ＯＭＰＴ１プロテアーゼ切断部位を含む改変タンパク質
いくつかの態様では、本明細書に記載されている無細胞タンパク質合成系は、外膜タンパク質Ｔ１（ＯｍｐＴ１）プロテアーゼ切断部位を含む改変タンパク質を含む。無細胞合成系においてＯｍｐＴ１プロテアーゼ切断部位を含む改変タンパク質を含むことは、アンバーコドンにおける非天然アミノ酸を含む抗体の収量を増加させることができる。例えば、終結因子１（ＲＦ１）は、停止複合体の部分であり、ＵＡＧ（アンバー）終止コドンを認識する。アンバーコドンのＲＦ１認識は、ｎｎＡＡ取込みの部位における成熟前連鎖停止を促進することができ、抗体などの所望のタンパク質の収量を減少させる。アンバーコドンに導入されたｎｎＡＡを含むタンパク質の収量を、細菌細胞ライセート中のＲＦ１の機能活性を低下させることにより増加することができる。したがって、いくつかの実施形態では、ＲＦ１の機能活性は、ＲＦ１へのＯｍｐＴ１プロテアーゼ切断部位の導入により減少する。いくつかの実施形態では、ＯｍｐＴ１プロテアーゼ切断部位を含む改変タンパク質は、終結因子１（ＲＦ１）タンパク質又は終結因子２（ＲＦ２）タンパク質である。ＯｍｐＴ１プロテアーゼ切断部位を含む改変タンパク質の例は、米国特許出願公開第２０１５／０２５９６６４（Ａ１）号及び米国特許第９，６５０，６２１号に記載されている。

ｎｎＡＡを含む抗体の収量を、１）ＲＦ１の抗体不活性化を中和すること、２）ＲＦ１のゲノムノックアウト（ＲＦ２強化株）、及び３）アフィニティクロマトグラフィーによる除去のためのタンパク質タグを含むＲＦ１を発現するように改変された株を用いたＲＦ１の部位特異的除去（キチン結合ドメイン及びＨｉｓタグ）によるＲＦ１活性の減弱により増加してもよい。

対象とするタンパク質の定量測定
本明細書に記載されている方法及び系により産生される抗体などの対象とするタンパク質の量を、当技術分野において公知のいずれかの方法を用いて決定することができる。例えば、発現される対象とするタンパク質を、ゲル電気泳動（例えば、ＰＡＧＥ）、ウェスタン分析又はキャピラリー電気泳動（例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ）を用いて精製及び定量することができる。無細胞翻訳反応におけるタンパク質合成を、放射性標識されたアミノ酸、通常、^３５Ｓ標識メチオニン又は^１４Ｃ標識ロイシンの組込みによりモニターしてよい。放射性標識されたタンパク質を、分子サイズを可視化し、電気泳動後オートラジオグラフィーにより定量又は免疫沈降により単離することができる。組み換えＨｉｓタグの組込みは、Ｎｉ^２＋アフィニティカラムクロマトグラフィーによる精製の別の手段を提供する。発現系からのタンパク質産生を、可溶性タンパク質収量として又は酵素活性若しくは結合活性のアッセイの使用により測定することができる。

発現されたタンパク質の生物活性及び適切なフォールディングの定量測定
本明細書に記載されている方法により産生された対象とするタンパク質の生物活性を、対象とするタンパク質に対して特異的なｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイを用いて定量することができる。対象とするタンパク質の生物活性を、無細胞タンパク質合成反応混合物の単位体積当たりの生物活性として表すことができる。発現された対象とするタンパク質の適切なフォールディングを、可溶性タンパク質量に対して産生された総タンパク質量を比較することにより定量することができる。例えば、タンパク質の総量及びこの産生されたタンパク質の可溶性画分を、^１４Ｃロイシンなどの放射性標識されたアミノ酸を含む対象とするタンパク質の放射活性標識、及びＴＣＡを用いたこの標識されたタンパク質の沈降により決定することができる。フォールディング及びアセンブリされたタンパク質の量を、正確な分子量に移動する可溶性タンパク質の画分を測定するため、還元及び非還元条件下ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により決定することができる。非還元条件下、タンパク質凝集を、ゲルマトリックス上に捕捉することができるか、又は別々の実体として見做すことが難しいより高分子量のスメアとして移動する可能性があるが、還元条件下及びサンプルの加熱により、ジスルフィド結合を含むタンパク質は変性し、凝集物は解離し、発現されたタンパク質は単一のバンドとして移動する。適切なフォールディング及びアセンブリされた抗体タンパク質の量の決定方法を、実施例に記載する。抗体分子の機能活性を、免疫アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて決定することができる。

細菌株
本明細書に記載されている無細胞タンパク質合成系は、細菌又は細菌株から調製された無細胞抽出物を含むことができる。いくつかの実施形態では、細菌株は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、当業者に公知であるいずれもの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から選択することができる。いくつかの実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、Ａ（Ｋ－１２）、Ｂ、Ｃ又はＤ株である。

実施例１
この実施例は、無細胞合成反応において発現された重鎖及び前もって製造された軽鎖タンパク質を用いた異なるタンパク質の産生方法を記載する。

物質及び方法

前もって製造された軽鎖タンパク質（ＰＦＬＣ）を、当技術分野においてよく知られている標準的組み換えタンパク質発現及び精製方法を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現した。タンパク質Ｌをベースとする市販アフィニティ樹脂を、精製方法で使用したが、他の精製方法を使用してもよい。

ＸｐｒｅｓｓＣＦ＋（商標）反応を、ＰＦＬＣを用いたか、又は軽鎖タンパク質のプラスミド指令された発現を用いたかにかかわらず同じ方法で行った。ＰＦＬＣについては、ＬＣプラスミドを取り除き、ＰＦＬＣ原液を最適化された濃度で添加して力価及び産物の品質を最大化した。通常、約１．０ｇ／ＬのＰＦＬＣを、最大力価のためにＸＣＦ反応で使用した。約０．４ｇ／Ｌ～１．５ｇ／ＬのＰＦＬＣ濃度は、良好な結果も得るが、力価の効果は、より低いＰＦＬＣ濃度において最大でないかも知れない。より高濃度のＰＦＬＣでは、力価の増加は特定の点を超えて続かなかった。

一般的なＸｐｒｅｓｓＣＦ＋（商標）手順は、当技術分野において公知である（Ｚａｗａｄａ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ，（２０１１）Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ ｔｏ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｓｃａｌｅ‐ｕｐ ｏｆ ｃｅｌｌ‐ｆｒｅｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ－ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｉｍｅｌｉｎｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０８：１５７０－１５７８；及びＧｒｏｆｆ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１４） Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏｗａｒｄ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ “ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ” ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｍＡｂｓ，６：３，６７１－６７８参照）。

前に記載されているＸｐｒｅｓｓＣＦ＋（商標）手順を、追加のエネルギー源、アミノ酸、ヌクレオチド、及びＸｐｒｅｓｓＲＮＡＰを供給する発現過程の間に栄養フィードを添加することにより改善した。このフィードの添加は、産物の力価を増加させた。

結果

ＳＰ８８９３（抗ＢＣＭＡ抗体）。

抗ＢＣＭＡ抗体を、ＰＦＬＣを用いて３反応器フォーマットで発現した：フィーディング並びにｐＨ及び溶存酸素（ＤＯ）の制御を有する２バイオリアクター（７Ｌ及び０．２Ｌ反応体積）、並びにフィーディングもＰＨとＤＯ制御もないＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅ（登録商標）（ＦＰ）振とうプレート。比較のため、０．２Ｌバイオリアクター及び軽鎖タンパク質のプラスミド指令された同時発現（ＬＣ ｐＤＮＡ）を有するＦＰフォーマットで、追加の反応を行った。抗ＢＣＭＡ抗体の力価は、ＬＣ ｐＤＮＡと比較してＰＦＬＣを用いる場合、０．２Ｌバイオリアクターで約４３％増加した。７Ｌバイオリアクターの力価は、０．２Ｌバイオリアクターと本質的に同じであり、これは、反応条件及びＰＦＬＣの力価効果はスケーラブルであったことを実証している。１ｍＬ「ＦＰ」ＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅ系は、フィーディングもｐＨ制御も有しないので、力価はバイオリアクターより通常低い。たとえそうであっても、ＦＰは、プラスミドベースの系（ＬＣ ｐＤＮＡ）に対してＰＦＬＣによりかなり力価の改善を示す。ＬＣ ｐＤＮＡ系は、この実験では、７Ｌバイオリアクターにおいて運転しなかった。この実験では、ＰＦＬＣを０．６ｇ／Ｌで使用した。この力価を、ＰｈｙＴｉｐ（登録商標）カラム（ＰｈｙＮｅｘｕｓ，Ｉｎｃ．）を用いて測定した。結果を図１に示す。

結果は、反応が軽鎖タンパク質を発現したプラスミドと比較して前もって製造された軽鎖タンパク質を含んだ場合に、より高い力価の抗ＢＣＭＡ抗体を得た。

ＰＦＬＣを用いた力価の増加における可変性は異なる実験条件下で観察されたが、上記実験両方とも、軽鎖タンパク質をプラスミドから発現した反応と比較して、ＰＦＬＣを用いた抗ＢＣＭＡ抗体の力価の増加を実証している。

ＳＰ８１６６（抗葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）抗体）。

ＰＦＬＣ濃度の効果を、別の抗体産物、ＳＰ８１６６（抗葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）抗体）に関して、フィーディング並びにｐＨ及びＤＯ制御も有する０．２Ｌバイオリアクターで検査した。結果を図３に示す。

結果
図２に示されているように、抗ＦＯＬＲ１抗体の力価は、約１ｇ／ＬのＰＦＬＣにおいて最大までより高いＰＦＬＣ濃度と共に増加した。この実験（図２中、０ｇ／Ｌ ＰＦＬＣ）では、ＬＣ ｐＤＮＡ系の力価と比較して、１．０ｇ／Ｌ～１．２ｇ／ＬのＰＦＬＣを用いた場合、力価はほとんど２倍であった。この実験では、２つの方法により力価を測定した：ＰｈｙＴｉｐ（登録商標）カラム（ＰｈｙＮｅｘｕｓ，Ｉｎｃ．）及びタンパク質ＡベースのＨＰＬＣ法（ＰｒｏＡ ＨＰＬＣ）。両方法は、ＰＦＬＣを用いた力価において同様な傾向を示す。

ＰＦＬＣを用いた抗ＦＯＬＲ１抗体（ＳＰ８１６６）に関して得られた力価は、０．２Ｌ～２４Ｌバイオリアクターで同等の結果を示した（図３参照）。ＬＣ ｐＤＮＡ系での力価の増加は、０．２Ｌバイオリアクターにおいて約１６％であった。ＬＣ ｐＤＮＡ系は、この実験では、２４Ｌバイオリアクターにおいて運転せず、ＰＦＬＣの濃度は、０．４８ｇ／Ｌであった。２４Ｌバイオリアクターにおいてより高いＰＦＬＣ濃度を使用した場合、ＰＦＬＣ対ＬＣ ｐＤＮＡを含む反応における力価の更により大きい増加が期待されるはずである（力価に対するより高いＰＦＬＣ濃度の影響に関して図２参照）。

図４は、ＨＰＬＣにより得られた抗ＦＯＬＲ１抗体力価データを示す。

図５は、２つの異なる濃度のＨＣ ｐＤＮＡプラスミド（３ｍｇ／Ｌ及び６ｍｇ／Ｌ）及びＰＦＬＣ（０．５ｇ／Ｌ及び０．７５ｇ／Ｌ）と共に様々な量のＸｔｒａｃｔＣＦを用いた抗ＦＯＬＲ１抗体滴定データを示す。コントロールは、重鎖及び軽鎖発現プラスミド（３ｍｇ／Ｌ総プラスミド、ＰＦＬＣなし）を用いた３７．５％のＸｔｒａｃｔＣＦであった。

図５の結果は、ＸｔｒａｃｔＣＦが抗ＦＯＬＲ１抗体の用量依存的増加を示すこと、及びプラスミドから重鎖及び軽鎖両方を発現するより、ＰＦＬＣを用いて力価が実質的により高いことを実証している。

ＳＰ７２１９（抗ＣＤ７４抗体）

図６に示されているように、ＰＦＬＣは、０．２Ｌ及び５ｍＬバイオリアクターにおいて約８０％抗ＣＤ７４抗体の力価を増加させた。ＰＦＬＣ反応は、１ｇ／Ｌ ＰＦＬＣ及び６ｍｇ／Ｌ重鎖プラスミドを使用した。ＬＣ ｐＤＮＡ反応は、重鎖及び軽鎖両方をコードする３ｍｇ／Ｌのプラスミドを使用した。力価は、この抗体に関して１ｍＬ ＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅフォーマットにおいて約５０％増加した。図６のデータは、反応器に供給しないバッチＸＣＦからである。

図７に示されているように、ＰＦＬＣを用いるＸｐｒｅｓｓＣＦ＋（商標）は、軽鎖をコードするプラスミドＤＮＡを含むＸｐｒｅｓｓＣＦ＋（商標）抽出物と比較して、抗ＣＤ７４抗体の力価を増加させた。ＰＦＬＣ反応は、１．２５ｇ／Ｌ ＰＦＬＣ及び３．７５ｍｇ／Ｌ重鎖プラスミドを使用した。ＬＣ ｐＤＮＡ反応は、合計５ｍｇ／Ｌのプラスミド（重鎖及び軽鎖プラスミドを合わせて；０．７１ｍｇ／Ｌ ＬＣプラスミド及び４．２９ｍｇ／Ｌ ＨＣプラスミド）を使用した。

まとめると、この実験で得られたデータは、ＨＣをコードする発現プラスミド及び反応物に添加された前もって製造されたＬＣを含む反応物は、ＨＣ及びＬＣ両方をコードする発現プラスミドを含む反応物と比較して、より高い力価の抗体を産生したことを示している。

実施例２
この実施例は、ＨＣ及びＬＣ両方のための発現プラスミドを含む反応物と比較して、ＩｇＧ発現は、精製ＰＦＬＣ及びＰＦＬＣを含む細胞ライセート両方を用いて増加したことを実証する。

トラスツズマブＬＣをコードするプラスミドで形質転換された株ＳＢＤＧ４１９の細胞ライセートを、１６．６７％（重量／重量）の濃度においてバッファＳ３０－５（５ｍＭトリス・ＨＣｌ ｐＨ８．２、１ｍＭ酢酸マグネシウム及び２５０ｍＭ酢酸カリウム）中で作製した。ＰＦＬＣライセート試薬（４％ 体積／体積）、精製ＰＦＬＣ試薬（０．５ｇ／Ｌ）又はＨＣ及びＬＣの同時発現のいずれかを用いたトラスツズマブＩｇＧの発現を、Ｃ１４ロイシン組込みにより検出する無細胞反応と比較した。標準的ＣＦ反応物に、２％（体積／体積）Ｌ－［１４Ｃ（Ｕ）］－ロイシン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を補充し、合成されたタンパク質と対応する酸地位高可能な画分におけるカウント数と、前記反応物における総カウント数を比較して、シンチレーション測定により力価を算出した（Ｚａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１１参照）。９６ウェルプレートにおいて１００μＬ規模で反応を行った。

図８は、精製ＰＦＬＣ試薬及び粗ＰＦＬＣライセート試薬を用いた発現と、ＨＣ／ＬＣ同時発現を比較して、Ｃ１４ロイシン組込みにより測定されたトラスツズマブＩｇＧの相対的発現を示す。力価の同様な増加を、精製ＰＦＬＣ試薬及び粗ＰＦＬＣ試薬両方において観察する。

この実施例で得られたデータは、ＨＣ及びＬＣ両方のための発現プラスミドを含む反応物と比較して、ＩｇＧ発現は、精製ＰＦＬＣ又はＰＦＬＣを含む細胞ライセートのいずれかを用いて増加したことを実証している。

実施例３
この実施例は、二重特異的ＳＥＥＤボディの収量は、ＬＣをコードする発現プラスミドを含む反応物と比較して、精製ＰＦＬＣを含む反応物において増加したことを実証する。

３鎖二重特異性抗体フォーマットへのＰＦＬＣストラテジーの適用性を実証するために、抗Ｍｕｃ１－ｓｃＦｖ－ＡＧアーム（ＳＰ９２０３）と対となるＨＣ及びＬＣから成る抗ＥＧＦＲ－Ｆａｂ－ＧＡから成るＳＥＥＤボディフレームワークをベースとする二重特異性抗体を、小規模Ｃ１４無細胞反応において発現した（Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｈ．，Ａｐｅｒｌｏ，Ｃ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｋｕｒｏｓａｗａ，Ｅ．，Ｌａｎ，Ｙ．，Ｌｏ，Ｋ．－Ｍ．，ａｎｄ Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．（２０１０）．ＳＥＥＤｂｏｄｉｅｓ：ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｔｒａｎｄ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ（ＳＥＥＤ）ＣＨ３ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ ｉｎ ａｎ Ｆｃ ａｎａｌｏｇｕｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｂｉｎｄｅｒｓ ｏｒ ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２３，１９５－２０２参照）。３鎖同時発現反応物は、３μｇ／ｍＬの総プラスミド濃度においてＨＣ－ＧＡ、ＬＣ及びｓｃＦｖ－ＡＧをコードするプラスミドを含まれていた。ＰＦＬＣ試薬反応物は、３μｇ／ｍＬの総プラスミド濃度のＨＣ－ＧＡ及びｓｃＦｖ－ＡＧプラスミドと共に０．５ｍｇ／ｍＬの精製ＰＦＬＣ試薬を含まれていた。９６ウェルプレートにおいて１００μＬ規模のタンパク質小規模Ｃ１４タンパク質発現により、力価を測定した。標準的ＣＦ反応物に、２％（体積／体積）Ｌ－［１４Ｃ（Ｕ）］－ロイシン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を補充し、合成されたタンパク質と対応する酸地位高可能な画分におけるカウント数と、前記反応物における総カウント数を比較して、シンチレーション測定により力価を算出する（Ｚａｗａｄａ，Ｊ．Ｆ．，Ｙｉｎ，Ｇ．，Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｒ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｎａｒｅｓｈ，Ａ．，Ｒｏｙ，Ｓ．Ｍ．，Ｇｏｌｄ，Ｄ．Ｓ．，Ｈｅｉｎｓｏｈｎ，Ｈ．Ｇ．，ａｎｄ Ｍｕｒｒａｙ，Ｃ．Ｊ．（２０１１）．Ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ ｔｏ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｓｃａｌｅ－ｕｐ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ－－ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｉｍｅｌｉｎｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０８，１５７０－１５７８参照）。
図９は、プラスミドから発現されたＬＣを含む反応物と比較して、ＳＥＥＤボディＦａｂ／ｓｃＦｖ二重特異性抗体の収量は、精製ＰＦＬＣ試薬を含む反応において増加したことを示す。

この実施例で得られたデータは、二重特異的ＳＥＥＤボディの収量は、ＬＣをコードする発現プラスミドを含む反応物と比較して、精製ＰＦＬＣを含む反応物において増加したことを実証している。

実施例４
この実施例は、無細胞合成反応物で発現された重鎖及び前もって製造された軽鎖（ＰＦＬＣ）を用いた抗ＢＣＭＡ抗体の産生方法を例証する。

方法：

４ｍｌバッチ反応物及び標準的無細胞フィード（初期バッチ体積の２５％を添加）を含むマイクロ２４バイオリアクター（ＰＡＬＬ（登録商標）Ｃｏｒｐ．のＭｉｃｒｏ－２４ ＭｉｃｒｏＲｅａｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ）で反応を行った。溶存酸素（ＤＯ）及びｐＨを、それぞれ、２０％及び６．９５に制御した。１４時間目に、ＤＯ及びｐＨを、それぞれ、８０％及び８．０に調整した。バイオリアクター温度を２５℃に維持した。

抽出物は、ＤＡＳｂｏｘ発酵運転から作製されたＳＢＤＧ３８１抽出物を含んでいた。重鎖プラスミド反応物濃度は、１．５ｍｇ／Ｌ、２．１５ｍｇ／Ｌ及び２．８ｍｇ／Ｌであった。（２つのプラスミド系ＨＣ運転濃度は、２．２５ｍｇ／Ｌであった）。ＰｒｅＦａｂ軽鎖（ＰＦＬＣ）濃度は、０．５ｇ／Ｌ、０．８７５ｇ／Ｌ及び１．２５ｇ／Ｌであった。ＰｈｙＴｉｐロードは、１５０μＬであった。

結果

抗ＢＣＭＡ抗体の力価は、反応物に添加されたＨＣ発現プラスミド及びＰＦＬＣの濃度に対する、用量依存性関係で増加した。図１０は、ＰＦＬＣ及びＨＣ両方の濃度が増加した場合に、最も高い抗ＢＣＭＡ抗体力価（１．２ｇ／Ｌ以上）を得た、すなわち、それぞれ、１．２５ｇ／Ｌ及び２．８ｍｇ／Ｌ。０．７ｇ／Ｌ未満までの著しい力価減少は、ＰＦＬＣ及びＨＣの減少により同時に観察された、すなわち、それぞれ、０．５ｇ／Ｌ及び１．５ｍｇ／Ｌ。この実験に関して、コントロール運転（重鎖及び軽鎖の２プラスミド系）発現力価は、０．６１５±０．０１１ｇ／Ｌ（ＨＣ濃度２．２５ｍｇ／Ｌ；ＬＣ濃度２．７５ｍｇ／Ｌ）。抗ＢＣＭＡ抗体の許容可能な収量を、０．７５ｇ／Ｌ～０．９ｇ／Ｌの最小ＰＦＬＣ濃度及び２．３ｍｇ／Ｌ～２．８ｍｇ／Ｌの重鎖プラスミド濃度で得た。

この実験で示されたデータは、抗ＢＣＭＡ抗体の力価は、反応物に添加されたＨＣ発現プラスミド及びＰＦＬＣの濃度に対する用量依存性関係で増加したことを実証している。

実施例５
この実施例は、無細胞合成反応物で発現された重鎖及び前もって製造された軽鎖（ＰＦＬＣ）を用いた抗葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）抗体の産生方法を例証する。

方法：

４ｍｌバッチ反応物及び標準的無細胞フィード（初期バッチ体積の２５％を添加）を含むマイクロ２４バイオリアクター（ＰＡＬＬ（登録商標）Ｃｏｒｐ．のＭｉｃｒｏ－２４ ＭｉｃｒｏＲｅａｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ）（ｘＣＦ１９０６２６ＩＵ）で反応を行った。溶存酸素（ＤＯ）及びｐＨを、それぞれ、２０％及び６．９５に制御した。１４時間目に、ＤＯ及びｐＨを、それぞれ、８０％及び８．０に調整した。バイオリアクター温度を２５℃に維持した。

抽出物は、ＳＢＤＧ３８１抽出物を含んでいた。重鎖プラスミド反応物濃度は、０．７ｍｇ／Ｌ、１．１ｍｇ／Ｌ及び１．５ｍｇ／Ｌであった。（２つのプラスミド系ＨＣ運転濃度は、１．０８ｍｇ／Ｌであった）。ＰｒｅＦａｂ軽鎖（ＰＦＬＣ）濃度は、０．５ｇ／Ｌ、０．８７５ｇ／Ｌ及び１．２５ｇ／Ｌであった。ＰｈｙＴｉｐロードは、１５０μＬであった。

結果

抗葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）抗体の力価は、反応物に添加されたＨＣ発現プラスミド及びＰＦＬＣの濃度に対する、用量依存性関係で増加した。図１１は、ＰＦＬＣ及びＨＣ両方が増加した場合に、抗葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）抗体の最も高い力価（１．１ｇ／Ｌ以上）を得た、すなわち、それぞれ、１．２５ｇ／Ｌ及び１．５ｍｇ／Ｌ。著しい力価減少（０．７ｇ／Ｌ未満）は、ＰＦＬＣ及びＨＣの減少により同時に観察された、すなわち、それぞれ、０．５ｇ／Ｌ及び０．７ｍｇ／Ｌ。この実験に関して、プラスミド系コントロール運転はなかった。抗葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）抗体の許容可能な収量を、０．９ｇ／Ｌ～１．０ｇ／Ｌの最小ＰＦＬＣ濃度及び１．５ｍｇ／Ｌ～２．０ｍｇ／Ｌの重鎖プラスミド濃度で得た。ＨＣプラスミド濃度が１．５ｍｇ／Ｌ超（２．０ｍｇ／Ｌ及び２．５ｍｇ／Ｌまで）増加し、ＰＦＬＣ濃度が１．２５ｇ／Ｌ（データ示さず）であった場合、抗体力価の更なる増加は観察されなかった。

この実験で示されたこのデータは、抗葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）抗体の力価は、反応物に添加されたＨＣ発現プラスミド及びＰＦＬＣの濃度に対する用量依存性関係で増加したことを示している。

実施例６
この実施例は、無細胞合成反応物で発現された重鎖及び前もって製造された軽鎖（ＰＦＬＣ）を用いた抗ＣＤ７４抗体の産生方法を例証する。

方法：

４ｍｌバッチ反応物及び標準的無細胞フィード（初期バッチ体積の２５％を添加）を含むマイクロ２４バイオリアクター（ＰＡＬＬ（登録商標）Ｃｏｒｐ．のＭｉｃｒｏ－２４ ＭｉｃｒｏＲｅａｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ）（ｘＣＦ１９０７０２ＩＵ）で反応を行った。溶存酸素（ＤＯ）及びｐＨを、それぞれ、２０％及び７．２に制御した。１４時間目に、ＤＯ及びｐＨを、それぞれ、８０％及び８．０に調整した。バイオリアクター温度を２８℃に維持した。

抽出物は、ＳＢＤＧ３８１抽出物を含んでいた。重鎖プラスミド反応物濃度は、３．５ｍｇ／Ｌ、４．５ｍｇ／Ｌ及び５．５ｍｇ／Ｌであった。（２つのプラスミド系ＨＣ運転濃度は、４．２８６ｍｇ／Ｌであった）。ＰｒｅＦａｂ軽鎖（ＰＦＬＣ）濃度は、０．６ｇ／Ｌ、０．９５ｇ／Ｌ及び１．３０ｇ／Ｌであった。ＰｈｙＴｉｐロードは、１５０μＬであり、プレートリーダーロードは、５０μＬであった。

結果

図１２は、抗ＣＤ７４抗体の最高発現を、ＨＣ発現プラスミド濃度を３．５ｍｇ／Ｌまで減少し、ＰＦＬＣを１．３ｇ／Ｌまで増加することにより得た。重鎖プラスミドを４．５ｍｇ／Ｌ超の濃度まで増加することは、より高いＰＦＬＣ濃度（０．９ｇ／Ｌ～１．３ｇ／Ｌ）において抗体力価を減少させる傾向であった。抗ＣＤ７４抗体の許容可能な収量を、０．８ｇ／Ｌ～０．９ｇ／Ｌの最小ＰＦＬＣ濃度及び３．５ｍｇ／Ｌ～３．８ｍｇ／ＬのＨＣプラスミド濃度で得た。この実験では、２プラスミドコントロール系は含まれなかった。

上記実施例は、ＨＣをコードする発現プラスミド及び反応物に添加された前もって製造されたＬＣを含む反応物は、ＨＣ及びＬＣ両方をコードする発現プラスミドを含む反応物と比較して、より高い力価の抗体を産生したことを実証している。

本明細書に記載されている実施例及び実施形態は例証する目的のためであり、その観点から様々な修正又は変更は当業者に示唆され、本願の趣旨及び範囲並びに付属のクレームの範囲内に含まれるものとする。本明細書に引用されている全ての出版物、配列アクセッション番号、特許、及び特許出願は、全ての目的のためその全文を参照することにより本明細書に援用される。
例示的配列
ＩｇＧ ＨＣ及びＬＣのタンパク質配列
^＊は、ＮＮＡＡの部位を示す
ＷＴ Ｂ１０ ＨＣ （配列番号１）
ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＴＴＴＫＳＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＥＩＹＰＲＤＧＩＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＷＨＷＲＳＧＹＳＹＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

ＷＴ Ｂ１０ ＬＣ ｏｒ Ｈ０１ ＬＣ （配列番号２）
ＭＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

Ｂ１０ Ｆ４０４ＴＡＧ ＨＣ （配列番号３）
ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＴＴＴＫＳＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＥＩＹＰＲＤＧＩＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＷＨＷＲＳＧＹＳＹＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳ^＊ＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

Ｂ１０ Ｙ１８０ＴＡＧ ＨＣ （配列番号４）
ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＴＴＴＫＳＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＥＩＹＰＲＤＧＩＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＷＨＷＲＳＧＹＳＹＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬ^＊ＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

Ｂ１０ Ｋ４２ＴＡＧ ＬＣ （配列番号５）
ＭＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧ^＊ＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

Ｂ１０ Ｙ１８０ＴＡＧ Ｆ４０４ＴＡＧ ＨＣ （配列番号６）
ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＴＴＴＫＳＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＥＩＹＰＲＤＧＩＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＷＨＷＲＳＧＹＳＹＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬ^＊ＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳ^＊ＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

Ｂ１０ ２４１ＴＡＧ ＨＣ （配列番号７）
ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＴＴＴＫＳＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＥＩＹＰＲＤＧＩＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＷＨＷＲＳＧＹＳＹＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ^＊ＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

Ｈ０１ Ｙ１８０ＴＡＧ Ｆ４０４ＴＡＧ ＨＣ （配列番号８）
ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＲＴＱＳＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＤＩＦＰＩＤＧＩＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＷＳＷＰＳＧＭＤＹＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬ^＊ＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳ^＊ＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

７２１９ ＬＣ （配列番号９）
ＭＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＤＲＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＨＴＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

７２１９ Ｆ４０４ＴＡＧ ＨＣ （配列番号１０）
ＭＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＦＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＩＳＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＴＶＥＨＧＡＶＹＧＴＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳ^＊ＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

αＰＤ１ ＨＣ （配列番号１１）
ＭＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＤＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧＲＶＴＭＴＴＤＴＳＴＮＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＶＤＹＧＴＧＳＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＥＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

αＰＤ１ ＬＣ （配列番号１２）
ＭＳＹＥＬＴＱＰＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＲＩＴＣＳＧＤＡＬＰＫＱＹＡＹＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＭＶＩＹＫＤＴＥＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＳＳＧＴＫＶＴＬＴＩＳＧＶＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＡＤＮＳＩＴＹＲＶＦＧＧＧＴＫＶＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ

αＴｉｍ３ ＨＣ （配列番号１３）
ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＤＲＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＧＩＴＰＶＲＧＹＴＥＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＶＹＲＭＷＤＳＹＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＥＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

αＴｉｍ３ ＬＣ （配列番号１４）
ＭＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

αＬＡＧ３ ＨＣ （配列番号１５）
ＭＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＹＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＥＡＰＥＮＷＤＹＡＬＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＥＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

αＬＡＧ３ ＬＣ （配列番号１６）
ＭＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＲＳＰＦＳＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

Ｈ０１ ＨＣ （配列番号１７）
ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＲＴＱＳＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＤＩＦＰＩＤＧＩＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＳＷＳＷＰＳＧＭＤＹＹＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

７２１９ ＨＣ （配列番号１８）
ＭＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＦＳＤＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＩＳＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＴＶＥＨＧＡＶＹＧＴＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

Ｔ７プロモーター（配列番号１９）
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ

トラスツズマブＨＣ（配列番号２０）
ＭＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

重鎖のリボソーム結合配列（配列番号２１）：
ＡＸ_１ＧＡＧＸ_２Ｔ（Ｘ_１はＡ又はＧであり、及びＸ_２はＡ又はＧである）

軽鎖のリボソーム結合配列（配列番号２２）：
ＡＸ_１Ｘ_２ＡＸ_３ＡＴ（Ｘ_１はＧ又はＡであり、Ｘ_２はＧ又はＡであり、及びＸ_３はＧ又はＴである）

Claims (54)

1. 軽鎖（ＬＣ）ポリペプチドの存在下で、抗体の重鎖（ＨＣ）ポリペプチドを、前記重鎖をコードする核酸から発現させて、前記抗体を産生することを含み、
   前記発現は、約１０リットル～約２５，０００リットルの体積を有する反応混合物中で行われる、
   無細胞タンパク質合成系を用いた抗体の大規模産生方法。
2. 前記反応混合物が、約１０リットル～約１０，０００リットルの体積を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記反応混合物が、約１５，０００リットル～約２５，０００リットルの体積を有する、請求項１に記載の方法。
4. 前記反応混合物が、約１０，０００リットル～約２０，０００リットルの体積を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記反応混合物が細菌抽出物を含み、
   前記発現が、
   （ｉ）前記細菌抽出物を、前記ＨＣをコードする核酸と配合すること；及び
   （ｉｉ）前記無細胞タンパク質合成系を、前記ＨＣの前記発現を可能とする条件下でインキュベートすること、
   を含む、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の方法。
6. 全抗体タンパク質及び適切にフォールディングされた抗体の１リットル当たりの収量が、前記重鎖ポリペプチド及び前記軽鎖ポリペプチドの両方が同じ反応混合物中で発現される反応混合物と比べて増加する、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記適切にフォールディングされた抗体の１リットル当たりの収量が、前記重鎖ポリペプチド及び前記軽鎖ポリペプチドの両方が同じ反応混合物中で発現される反応混合物と比較して約３０％以上高い、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記適切にフォールディングされた抗体の１リットル当たりの収量が、前記重鎖ポリペプチド及び前記軽鎖ポリペプチドの両方が同じ反応混合物中で発現される反応混合物と比較して約４０％以上高い、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記適切にフォールディングされた抗体の１リットル当たりの収量が、前記重鎖ポリペプチド及び前記軽鎖ポリペプチドの両方が同じ反応混合物中で発現される反応混合物と比較して約５０％以上高い、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記適切にフォールディングされた抗体の１リットル当たりの収量が、前記重鎖ポリペプチド及び前記軽鎖ポリペプチドの両方が同じ反応混合物中で発現される反応混合物と比較して７０％以上高い、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記適切にフォールディングされた抗体の１リットル当たりの収量が、前記重鎖ポリペプチド及び前記軽鎖ポリペプチドの両方が同じ反応混合物中で発現される反応混合物と比較して８０％以上高い、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとの二量体化が、前記重鎖ポリペプチド及び前記軽鎖ポリペプチドの両方が同じ反応混合物中で発現される反応混合物と比べて増加する、請求項１～請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 重鎖ポリペプチド単量体及び軽鎖ポリペプチド単量体に対する重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドとの二量体の比が、前記重鎖ポリペプチド及び前記軽鎖ポリペプチドの両方が同じ反応混合物中で発現される反応混合物と比べて増加する、請求項１～請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記軽鎖ポリペプチドを、前記発現工程前に前記反応混合物に添加する、請求項１～請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記軽鎖ポリペプチドは、前記反応混合物に添加する前に、別の反応で産生されるか、合成されるか、又は前もって作製される（prefabricate）、請求項１４に記載の方法。
16. 前記軽鎖ポリペプチドは、無細胞タンパク質合成系、反応混合物、又は無細胞抽出物中で前記軽鎖ポリペプチドをコードする核酸から発現される、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。
17. 前記軽鎖ポリペプチドは、インタクトな生細胞内で前記ＬＣポリペプチドをコードする核酸から発現される、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。
18. 前記インタクトな生細胞は、細菌細胞又は哺乳類細胞である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記軽鎖ポリペプチドは、前記反応混合物に添加される前に、無細胞タンパク質合成系、反応混合物、無細胞抽出物、又は細胞の培養物から精製又は部分的に精製される、請求項１４～請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、若しくはＩｇＤサブタイプ、又はこれらの組合せである、請求項１～請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１～請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記抗体が、抗Ｂ細胞成熟抗原（抗ＢＣＭＡ）抗体、抗分化抗原群７４（抗ＣＤ７４）抗体、又は抗葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）抗体から選択される、請求項１～請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記抗体がＦＡＢ断片を含む、請求項１～請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記抗体が二重特異性抗体である、請求項１～請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記二重特異性抗体が、ＩｇＡ由来の配列及びＩｇＧ ＣＨ３ドメイン由来の配列を含む２つの非対称のＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記二重特異性抗体がドメイン交換抗体であり、
    前記ＨＣが前記ＬＣと二量体化する、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
27. 前記二重特異性抗体が、立体的相補性又は静電的相補性に基づいてＨＣヘテロ二量体化が増強された改変ＣＨ３ドメインを含む、請求項２４～請求項２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記改変ＣＨ３ドメインが、安定なＣＨ３ヘテロ二量体の生成を促進するノブ変異及びホール変異を含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記二重特異性抗体が、１つのＦａｂドメイン及び１つのｓｃＦｖドメインを含み、前記Ｆａｂドメイン及び前記ｓｃＦｖドメインは、異なる抗原と結合する、請求項２４～請求項２７のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記ＨＣ及び／又は前記ＬＣが、少なくとも１つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含む、請求項１～請求項２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記ＨＣが、少なくとも１つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含む、請求項１～請求項３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記ＨＣ中の前記ｎｎＡＡが、前記ＬＣ中の前記ｎｎＡＡと同じであるか又は異なっている、請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
33. 前記ｎｎＡＡが、ｐ－アセチルフェニルアラニン又はｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニンである、請求項３０～請求項３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記方法が、前記抗体を産生する非還元条件下、前記ＨＣ及びＬＣをアセンブリすることを更に含む、請求項１～請求項３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記無細胞タンパク質合成系が、関連補助因子を有する細菌抽出物を含む、請求項１～請求項３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記無細胞タンパク質合成系が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株から調製された細菌抽出物を含む、請求項１～請求項３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記無細胞タンパク質合成系が、ＡＴＰを産生する酸化的リン酸化反応を含む、請求項１～請求項３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記無細胞タンパク質合成系が、再構成リボソーム系を含む、請求項１～請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記無細胞タンパク質合成系が、外因性タンパク質シャペロンを含む、請求項１～請求項３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記外因性タンパク質シャペロンが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、ペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼ（ＰＰＩ）、及びデアグリガーゼから成る群から選択される、請求項３９に記載の方法。
41. 前記ＰＤＩが、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ及びＤｓｂＧから選択され；
    前記ＰＰＩが、ＦｋｐＡ、ＳｌｙＤ、ｔｉｇ、ＳｕｒＡ、及びＣｐｒ６から選択され；
    前記デアグリガーゼが、ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、及びＳｋｐから選択される、請求項４０に記載の方法。
42. 前記無細胞タンパク質合成系が、変異放出因子１タンパク質（ＲＦ１）を含む、請求項１～請求項４１のいずれか一項に記載の方法。
43. （ｉ）細菌細胞抽出物を含む反応混合物；
    （ｉｉ）重鎖ポリペプチドをコードする核酸；及び
    （ｉｉｉ）軽鎖ポリペプチド
    を含み、
    前記反応混合物は、約１０リットル～約２５，０００リットルの体積を有する、無細胞タンパク質合成系。
44. 前記軽鎖ポリペプチドは、前記反応混合物に添加される前に、別の反応で産生されるか、合成されるか、又は前もって作製される（prefabricate）、請求項４３に記載の無細胞タンパク質合成系。
45. 前記軽鎖ポリペプチドは、無細胞タンパク質合成系、反応混合物、又は無細胞抽出物中で前記軽鎖ポリペプチドをコードする核酸から発現される、請求項４３又は請求項４４に記載の無細胞タンパク質合成系。
46. 前記軽鎖ポリペプチドは、インタクトな生細胞内で前記ＬＣポリペプチドをコードする核酸から発現される、請求項４３又は請求項４４に記載の無細胞タンパク質合成系。
47. 前記インタクトな生細胞が細菌細胞又は哺乳類細胞である、請求項４６に記載の無細胞タンパク質合成系。
48. 前記軽鎖ポリペプチドは、前記反応混合物に添加される前に、無細胞タンパク質合成系、反応混合物、無細胞抽出物、又は細胞の培養物から精製又は部分的に精製される、請求項４３～請求項４７のいずれか一項に記載の無細胞タンパク質合成系。
49. 前記反応混合物が、リボソーム、ＡＴＰ、アミノ酸、及びｔＲＮＡを含む、請求項４３～請求項４８のいずれか一項に記載の無細胞タンパク質合成系。
50. 前記細菌細胞抽出物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株から調製される、請求項４３～請求項４９のいずれか一項に記載の無細胞タンパク質合成系。
51. 前記無細胞タンパク質合成系が、外因性タンパク質シャペロンを更に含む、請求項４３～請求項５０のいずれか一項に記載の無細胞タンパク質合成系。
52. 前記外因性タンパク質シャペロンが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、ペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼ（ＰＰＩ）、及びデアグリガーゼから成る群から選択される、請求項５１に記載の無細胞タンパク質合成系。
53. 前記ＰＤＩが、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ及びＤｓｂＧから選択され；
    前記ＰＰＩが、ＦｋｐＡ、ＳｌｙＤ、ｔｉｇ、ＳｕｒＡ、及びＣｐｒ６から選択され；
    前記デアグリガーゼが、ＩｂｐＡ、ＩｂｐＢ、及びＳｋｐから選択される、請求項５２に記載の無細胞タンパク質合成系。
54. 前記無細胞タンパク質合成系が、変異放出因子１タンパク質（ＲＦ１）を更に含む、請求項４３～請求項５３のいずれか一項に記載の無細胞タンパク質合成系。