KR20170078831A - Cd3/cd38 t 세포 재표적화 헤테로-이량체성 면역글로불린 및 이들의 제조 방법 - Google Patents

Cd3/cd38 t 세포 재표적화 헤테로-이량체성 면역글로불린 및 이들의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 CD3 항원의 성분 및 인간 CD38 항원의 성분 둘 다를 표적화하는 헤테로-이량체성 면역글로불린 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 치료 시약 또는 진단 시약으로 사용하기 위한 인간 CD38 항원 또는 이의 유도체에 결합하는 항체 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

CD3/CD38 T 세포 재표적화 헤테로-이량체성 면역글로불린 및 이들의 제조 방법 {CD3/CD38 T CELL RETARGETING HETERO-DIMERIC IMMUNOGLOBULINS AND METHODS OF THEIR PRODUCTION}
본 발명은 인간 CD3 항원의 성분 및 인간 CD38 항원의 성분 둘 다를 표적화하는 헤테로-이량체성 면역글로불린 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 치료 시약 또는 진단 시약으로 사용하기 위한 인간 CD38 항원 또는 이의 유도체에 결합하는 항체 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
모노클로날 항체(mAb)의 생체내 사용은 다양한 인간 질환의 치료에서 통상의 임상적 진료의 주류로 되어 있고, mAb를 사용한 표적화된 면역요법은 다수 형태의 암의 치료에 유효하다. 이는, 여포성 림프종 등의 몇몇 B 세포 악성 종양의 치료에 혁명을 가져온 키메라 CD20 항체인 리툭시맵에 의해 예시된다. 그러나, B 세포는 혈장 세포로의 최종 분화시에 CD20 발현을 상실하고, 리툭시맵은 결과적으로 기타 암 중에서 다발성 골수종의 치료로 매우 제한된 이익을 가져왔다.
CD38 분자는 이의 발현 패턴 및 수용체와 세포외효소로서의 이의 쌍둥이 역할 때문에 매력적인 표적이다. CD38의 표적화는 다발성 골수종 및 만성 림프성 백혈병(CLL)의 치료 수단으로서 특히 제안되었다.
T 세포의 재지시된(redirected) 사멸은 많은 치료 분야에서 바람직한 작용 방식이다. 다양한 이중특이적 항체 포맷은 전임상 및 임상 연구 둘 다에서 T 세포의 재지시를 매개하는 것으로 밝혀졌다[참조: May C et al., (2012) Biochem Pharmacol, 84(9): 1105-12; Frankel SR & Baeuerle PA, (2013) Curr Opin Chem Biol, 17(3): 385-92]. 이중특이적 항체 또는 이의 단편을 재표적화하는 모든 T 세포는 적어도 하나의 부위가 표적 세포에서 표면 항원에 결합하고 나머지 부위가 T 세포 표면 항원에 결합하는 적어도 2개의 항원 결합 부위를 갖도록 조작된다. T 세포 표면 항원 중에서, TCR 단백질 복합체로부터 인간 CD3 엡실론 아단위는 T 세포 사멸을 재지시하도록 최대한 표적화되어 있다.
다수의 이중특이적 항체 포맷이 T 세포 사멸을 재지시하기 위해 사용되었고, 이들은 주로 탠덤형 scFv 단편, 및 보고된 Fc-기반 이중특이적 항체 포맷의 몇몇 예만을 갖는 디아바디(diabody) 기반 포맷을 포함한다[참조; Moore PA et al., (2011) Blood, 117(17): 4542-51; May C et al., (2012) supra; Frankel SR & Baeuerle PA, (2013) supra]. 인간 Fc 영역을 포함하는 이중특이적 포맷은 보다 긴 순환 반감기를 갖고, 이것은 증강된 유효성 및/또는 빈도가 보다 낮은 투여 섭생을 실현할 수 있다. 가능한 Fc 기반의 이중특이적 포맷 사이에서, T 세포 사멸을 재지시하는 하나의 바람직한 포맷은 소위 중쇄 헤테로-이량체 포맷이다. 이러한 포맷은, T 세포 표면에서 인간 CD3 분자의 복수의 카피의 응집을 가능하게 하지 않고 이에 의해 임의의 T 세포 불활성화를 방지하기 때문에 특히 흥미롭다[참조: Klein C et al., (2012) MAbs, 4(6): 653-63].
중쇄 헤테로-이량체를 조작하는 것에 대해 최초로 기재된 방법은 "노브-인투-홀(knob-into-hole)" 방법으로 공지되어 있는 방법이다[참조: PCT 공개번호: WO199627011; Merchant AM et al., (1998) Nat Biotechnol, 16(7): 677-81]. 최근 2개의 항체가 환원 및 시험관내 절반-면역글로블린의 재셔플링(reshuffling)을 통해 1개의 이중특이적 항체에 조합되는 FAB-암(arm) 교환 방법으로 공지된 화학적 방법이 보고되고 있다[참조: PCT 공개번호: WO2008119353 (Schuurman J et al.) and WO2013060867 (Gramer M et al.); Labrijn AF et al., (2013) Proc Natl Acad Sci USA, 110(13): 5145-50].
본 발명은 서열번호 25 또는 서열번호 208의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및/또는 서열번호 26 또는 서열번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호 27 또는 서열번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하고/하거나; 서열번호 28 또는 서열번호 211 또는 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 및/또는 서열번호 29 또는 서열번호 212의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 서열번호 30 또는 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하거나;
CD38 단백질 복합체에 결합하는 에피토프 결합 영역이 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 양태에 따르면, 항 CD38 항체 또는 이의 단편은 뮤린 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체이다.
특히, 항체 또는 이의 단편은 서열번호 52, 서열번호 58, 서열번호 60으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 또는 상기 중쇄 가변 영역 서열의 어느 하나의 서열의 비-CDR 영역과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하고/하거나 상기 항체 또는 이의 단편은 서열번호 55, 서열번호 59, 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 또는 상기 경쇄 가변 영역 서열의 어느 하나의 서열의 비-CDR 영역과 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다.
특히, 항체 또는 이의 단편은 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 145, 서열번호 147, 서열번호 149로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열 또는 상기 중쇄 가변 영역 서열의 어느 하나의 서열의 비-CDR 영역과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하고/하거나 항체 또는 이의 단편은 서열번호 74, 서열번호 77, 서열번호 146, 서열번호 148, 서열번호 150의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열 또는 상기 경쇄 가변 영역 서열의 어느 하나의 서열의 비-CDR 영역과 적어도 80% 동일한 서열을 포함한다.
특히, 항체 또는 단편은 인간 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 인간 중쇄 불변 영역은 IGHG1, 비 푸코실화된 IGHG1 및 IGHG4로 이루어진 인간 면역글로불린의 그룹으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 신규한 항-인간 CD3/CD38 이중특이적 항체를 제공한다.
본 발명에 따르면, 항-인간 CD3 결합 암의 표적 결합 부분은 바람직하게는 SP34 또는 OKT3의 단일 쇄 가변 단편(scFv)를 포함한다. 특히, 항-인간 CD3 결합 암이 SP34인 경우, 이는, 이의 CD3 결합 특성을 유지하면서, 서열번호 1 및 2에 의해 코딩된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 scFv-Fc와 비교하여 우수한 발현 프로파일을 갖는다.
특히, scFv-Fc로서 발현되는 경우, 이는 서열번호 1 및 2에 의해 코딩된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 scFv-Fc로서 포맷된 SP34 키메라와 비교하여 적어도 2배의 발현 개선을 갖는다. 바람직하게는, 개선된 SP34 scFv는 서열번호 1 및 2에 의해 코딩된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 scFv로서 포맷된 SP34 키메라와 비교하여 적어도 6배의 발현 개선, 및 가장 바람직하게는 서열번호 1 및 2에 의해 코딩된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 scFv로서 포맷된 SP34 키메라와 비교하여 발현의 12배 개선을 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, BEAT 포맷에서 FAB 암을 포함하는 이중특이적 항체에서 scFv로서 발현되는 경우, 이는 서열번호 1 및 2에 의해 코딩된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 scFv로서 포맷된 SP34 키메라와 비교하여 적어도 2배의 발현 개선을 갖는다. 바람직하게는, BEAT 이중특이적 항체의 성분으로서 개선된 SP34 scFv는, BEAT 이중특이적 항체의 성분으로서, 서열번호 1 및 2에 의해 코딩된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, scFv로서 포맷된 SP34 키메라와 비교하여 적어도 5배의 발현 증가를 갖는다.
본 발명에 따르면, 항-인간 CD3 이중특이적 항체의 2개의 결합 암은 각각 면역글로불린 불변 영역를 포함하는데, 여기서 제1 암 또는 폴리펩티드는 프로테인 A (Protein A)에 결합하고, 제2 암 또는 폴리펩티드는 프로테인 A에 결합하지 않는다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, CD3 단백질 복합체에 결합하는 폴리펩티드의 에피토프 결합 영역은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 5 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 7 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하거나;
CD3 단백질 복합체에 결합하는 에피토프 결합 영역은 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 166의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 168의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, CD38 단백질에 결합하는 폴리펩티드의 에피토프 결합 영역은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하거나;
CD38 단백질 복합체에 결합하는 에피토프 결합 영역은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하거나;
CD38 단백질에 결합하는 폴리펩티드의 에피토프 결합 영역은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하거나;
CD38 단백질 복합체에 결합하는 에피토프 결합 영역은 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다.
이러한 신규한 항-인간 CD3/CD38 이중특이적 항체의 용도는, 이로써 한정되지 않지만, 다양한 인간 암, 자가면역 및 염증성 질환의 치료를 포함한다. 건강한 세포 및 조직에 비해 암 세포의 특이적 파괴는 종양학에서 주요 목표임을 나타낸다. T 세포 사멸을 종양 연관된 세포 표면 항원에 대해 안전하게 재지시할 수 있는 치료법은 개선된 임상적 효능을 제공할 것이다. 종양학에서 임상적으로 충족되지 않은 니즈의 공지된 분야는, 이로써 한정되지 않지만, 유방암, 전이성 유방암, 자궁암, 췌장암, 폐암, 림프종 및 다발성 골수종을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 헤테로-이량체성 면역글로불린 또는 이의 단편의 제2 폴리펩티드의 불변 영역은 IgG3 CH3 영역을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 헤테로-이량체성 면역글로불린 또는 이의 단편의 제2 폴리펩티드의 불변 영역은, IgG로부터의 그것 외의 CH3 영역을 포함하고, 비-IgG3 CH3 영역은 적어도 하나의 치환을 포함하여 프로테인 A 결합을 감소/없앤다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 헤테로-이량체성 면역글로불린 또는 이의 단편의 제2 폴리펩티드의 에피토프 결합 영역은, 프로테인 A 결합을 감소시키는 적어도 하나의 변형을 포함하는 VH3 영역을 포함한다.
본 발명은 또한 재조합 포유동물 숙주 세포주로부터 적어도 하나의 VH3 기반의 항원 결합 부위를 갖는 항-인간 CD3/CD38 이중특이적 중쇄 헤테로-이량체를 생산하는 방법을 제공하고, 여기서 이중특이적 항체 생성물은 고도의 순도로 단일 프로테인 A 크로마토그래피 단계 이후에 단리된다.
특히, 변형된 VH3 영역은 57, 65, 81, 82a 및 조합 19/57/59(Kabat 넘버링)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하고, 더욱 바람직하게는 변형된 VH3 영역은 57A, 57E, 65S, 81E, 82aS, 및 조합 19G/57A/59A(Kabat 넘버링)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 헤테로-이량체성 면역글로불린 또는 이의 단편은 추가의 치환을 포함할 수 있고, 여기서 중쇄 가변 프레임워크 영역은 I34M, V48I, A49G, R58N/Y, I69L, A71T 및 T73K(Kabat 넘버링)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하고 경쇄 가변 프레임워크 영역은 M4L, V33M, A34N, L46R, L47W, T51A, R66G, F71Y 및 P96F(Kabat 넘버링)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하거나; 중쇄 가변 프레임워크 영역은 I34M, A49G 및A71T(Kabat 넘버링)의 아미노산 치환을 포함하고 경쇄 가변 프레임워크 영역은 M4L, L46R, L47W 및 F71Y(Kabat 넘버링)의 아미노산 치환을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, CD3 단백질 복합체에 결합하는 에피토프 결합 영역은 인간 VH3 아부류의 생성물 또는 이로부터 유래된 중쇄 가변 프레임워크 영역을 포함한다. 바람직하게는, 중쇄 가변 프레임워크 영역은 인간 IGHV3-23의 생성물 또는 이로부터 유래된 것이다. 더욱 바람직하게는, 중쇄 가변 프레임워크 영역은 인간 IGHV3-23*04(서열번호 37)의 생성물 또는 이로부터 유래된 것이다. 상기 중쇄 가변 프레임워크 영역은 서열번호 38 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 상응하는 뮤린 항체의 중쇄 가변 영역의 상응하는 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, CD3 단백질 복합체에 결합하는 제1 폴리펩티드의 에피토프 결합 영역은 인간 VK1 아부류 또는 인간 VK3 아부류의 생성물 또는 이로부터 유래된 경쇄 가변 프레임워크 영역을 포함한다. 바람직하게는, 경쇄 가변 프레임워크 영역은 인간 VK1-39 또는 VK3-20의 생성물 또는 이로부터 유래된 것이다. 더욱 바람직하게는, 경쇄 가변 프레임워크 영역은 인간 IGKV1-39*01(서열번호 39) 또는 IGKV3-20*01(서열번호 40)의 생성물 또는 이로부터 유래된 것이다. 상기 경쇄 가변 프레임워크 영역은 서열번호 41 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 상응하는 뮤린 항체의 경쇄 가변 영역의 상응하는 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다.
바람직한 실시형태에 따르면, CD3 단백질 복합체에 결합하는 에피토프 결합 영역은 I34M, V48I, A49G, R58N/Y, I69L, A71T 및 T73K(Kabat 넘버링)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 역 돌연변이를 갖는 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 M4L, V33M, A34N, L46R, L47W, R66G, F71Y 및 P96F(Kabat 넘버링)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 역 돌연변이를 갖는 인간화 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 더욱 바람직하게는, CD3 단백질 복합체에 결합하는 에피토프 결합 영역은 I34M, A49G 및 A71T(Kabat 넘버링)의 역 돌연변이를 갖는 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 M4L, L46R, L47W 및 F71Y(Kabat 넘버링)의 역 돌연변이를 갖는 인간화 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 헤테로-이량체성 면역글로불린 또는 이의 단편의 CD3 단백질 복합체에 결합하는 에피토프 결합 영역은, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
CD3 단백질 복합체에 결합하는 에피토프 결합 영역은 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
CD3 단백질 복합체에 결합하는 에피토프 결합 영역은 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
CD3 단백질 복합체에 결합하는 에피토프 결합 영역은 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나;
CD3 단백질 복합체에 결합하는 에피토프 결합 영역은 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
상기 CD3 단백질 복합체는 아단위의 숫자를 포함하는데, 예를 들면, 델타, 엡실론 및 감마이다. 바람직한 실시형태에서, CD3 단백질 복합체에 결합하는 에피토프 결합 영역은 CD3 엡실론 아단위에 결합한다.
본원에 기재된 에피토프 결합 영역은 헤테로-이량체성 면역글로불린 또는 이의 단편의 하나 이상의 에피토프로의 특이적인 결합을 가능하게 하는 결합 부위를 함께 형성하는, 하나 이상의 중쇄 가변 도메인 및 하나 이상의 상보적인 경쇄 가변 도메인의 조합을 포함한다. 본 발명의 실시형태에서, 제1 폴리펩티드의 에피토프 결합 영역은 FAB를 포함하고, 제2 폴리펩티드의 에피토프 결합 영역은 scFv를 포함한다. 대안적으로, 상기 제1 폴리펩티드의 에피토프 결합 영역은 scFv를 포함하고, 제2 폴리펩티드의 에피토프 결합 영역은 FAB를 포함한다.
CD38에 결합하는 에피토프 결합 영역은 인간 VH3 아부류, 바람직하게는 인간 VH3-23, 더욱 바람직하게는 인간 IGHV3-23*04(서열번호 37)의 생성물 또는 이로부터 유래된 중쇄 가변 프레임워크 영역을 포함한다. 상기 중쇄 가변 프레임워크 영역은 서열번호 50 또는 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 상응하는 뮤린 항체의 중쇄 가변 영역의 상응하는 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 상기 에피토프 결합 영역은 추가로 인간 VK1 아부류, 바람직하게는 인간 VK1-39, 더욱 바람직하게는 인간 IGKV1-39*01(서열번호 39)의 생성물 또는 이로부터 유래된 경쇄 가변 프레임워크 영역을 포함한다. 상기 경쇄 가변 프레임워크 영역은 서열번호 53 또는 54 또는 55의 아미노산 서열을 포함하는 상응하는 뮤린 항체의 경쇄 가변 영역의 상응하는 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다.
특히, CD38 결합 폴리펩티드는 서열번호 56/57, 58/59, 60/61 및 62/63에 의해 코딩된 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인 쌍을 포함한다.
항-CD3 항체는 직접 및 간접 메카니즘 모두에 의하여 독성을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 간접 메카니즘은 Fc 수용체 발현 면역 세포와 함께 작용하는 CD3 항체의 Fc 영역에 의해 매개되고 일시적 T 세포 활성화 및 사이토킨 방출을 유도한다. 따라서, 본원에 기재된 헤테로-이량체성 면역글로불린 또는 이의 단편의 안전성을 개선시키기 위해, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 면역글로불린 불변 영역은 효과기 면역 세포 및/또는 보체 C1q에 대한 감소된 또는 제거된 결합을 갖는다. 바람직하게는, 면역글로불린 불변 영역은 낮은 힌지 영역에서 Fc 수용체 결합을 무효화하기 위하여 조작된다. 더욱 바람직하게는, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 면역글로불린 불변 영역은 L234A 및/또는 L235A의 치환(EU 넘버링)을 포함한다. 가장 바람직하게는, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 면역글로불린 불변 영역은 L234A 및 L235A의 치환(EU 넘버링)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 헤테로-이량체성 면역글로불린 또는 이의 단편을 기재하고, 여기서 에피토프 결합 영역은 CD3 단백질 복합체의 CD3 엡실론 아단위에 결합하고, 표 1에서 시차 주사 열량측정(DSC)에 의해 측정된 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 2의 아미노산 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 SP34 키메라의 FAB 열-안정성에 비해 우수한 FAB 열-안정성을 갖는 FAB를 포함한다. 이러한 증가된 열안정성은 이들 개선된 SP34 결합 암이 증가된 생체내 및 시험관내 안정성을 갖는 것을 의미하고, 이는 치료제로서 및 이의 안정성/저장/저장 수명의 측면에서 보다 우수한 성능을 의미한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은,
i) 제1 폴리펩티드가 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 66의 아미노산 서열의 동족 (cognate) 경쇄와 조립되며 CD38에 결합하고, 제2 폴리펩티드가 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖고 CD3 엡실론에 결합하는, CD3 단백질 복합체 및 CD38;
ii) 제1 폴리펩티드가 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 72의 아미노산 서열의 동족 경쇄와 조립되며 CD38에 결합하고, 제2 폴리펩티드가 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖고 CD3 엡실론에 결합하는, CD3 단백질 복합체 및 CD38;
iii) 제1 폴리펩티드가 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 74의 아미노산 서열의 동족 경쇄와 조립되며 CD38에 결합하고, 제2 폴리펩티드가 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖고 CD3 엡실론에 결합하는, CD3 단백질 복합체 및 CD38
에 결합하는 헤테로-이량체성 면역글로불린 또는 이의 단편을 제공한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은, 제1 폴리펩티드가 서열번호 75 또는 76의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 77의 아미노산 서열의 경쇄와 조립되며 CD38에 결합하고, 제2 폴리펩티드가 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69 및 서열번호 70으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고 CD3 엡실론에 결합하는, CD3 단백질 복합체 및 CD38;
제1 폴리펩티드가 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖고 서열번호 66의 아미노산 서열의 경쇄와 조립되며 CD38에 결합하고, 제2 폴리펩티드가 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69 및 서열번호 70으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고 CD3 엡실론에 결합하는, CD3 단백질 복합체 및 CD38
에 결합하는 헤테로-이량체성 면역글로불린 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태에 따라서, (a) CH2 도메인 및 제1 조작된 CH3 도메인을 갖는 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드; (b) CH2 도메인 및 제2 조작된 CH3 도메인을 갖는 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드(여기서, 제1 폴리펩티드는 프로테인 A 또는 프로테인 G에 결합하지 않고, 제2 폴리펩티드는 단지 이의 면역글로불린 불변 영역을 통해 프로테인 A 및/또는 프로테인 G에 결합하고, 제1 조작된 CH3 도메인은 하기 잔기 20, 22, 26, 79, 85.1, 86, 88, 90 중의 하나 이상에서 치환을 갖고, 제2 조작된 CH3 도메인은 그룹 3, 5, 20, 22, 26, 27, 81, 84, 85.1, 86, 88로부터 선택된 적어도 하나의 잔기에서 치환을 갖고, 상기 제2 쇄는 또한 IMGT 넘버링에 따라 잔기 84.4에서 치환을 포함한다)를 포함하는, 헤테로-이량체성 면역글로불린 또는 이의 단편이 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에 따라서, 위치 84.4에서의 치환은 그룹 84.4Q, 84.4V, 84.4A, 84.4S, 84.4T, 84.4N, 84.4G, 84.4L, 84.4L, 84.4Y, 84.4F, 84.4M로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 양태에 따라서, 제1 조작된 CH3 도메인은 적어도 하기 잔기 22, 86, 88에서 치환을 갖고, 제2 조작된 CH3 도메인은 IMGT 넘버링에 따라 적어도 하기 잔기 7, 84.4, 85.1, 86에서 치환을 갖는다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 제1 조작된 CH3 도메인은 적어도 하기 잔기 20, 22, 79, 86, 88에서 치환을 갖고, 제2 조작된 CH3 도메인은 IMGT 넘버링에 따라 적어도 하기 잔기 7, 26, 84, 84.4, 85.1, 86에서 치환을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에 따라서, 제1 조작된 CH3 도메인은 적어도 하기 잔기 20, 22, 26, 79, 85.1, 86, 88, 90에서 치환을 갖고, 제2 조작된 CH3 도메인은 적어도 하기 잔기 3, 5, 7, 20, 22, 26, 81, 84, 84.2, 84.4, 85.1, 86, 88, 90에서 치환을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에 따라서, 제1 조작된 CH3 도메인은 적어도 하기 잔기 3, 20, 22, 26, 79, 85.1, 86, 88, 90에서 치환을 갖고, 제2 조작된 CH3 도메인은 적어도 하기 잔기 3, 5, 7, 20, 22, 26, 81, 84, 84.2, 84.4, 85.1, 86, 88, 90에서 치환을 갖는다.
본 발명의 추가의 양태에 따라서, 헤테로이량체성 면역글로불린은 BTA CH3 도메인 및 비-VH3 가변 도메인, 또는 (예를 들면, G65S 또는 N82aS 치환을 사용하여) 프로테인 A 결합을 무효화하거나 가변 도메인을 갖지 않고 따라서 프로테인 A에 대한 결합을 갖지 않는 VH3 기반 가변 도메인을 포함하는 IgG3 이소형의 Fc 영역을 포함하는 제1 쇄를 갖거나, BTB D401Q CH3 도메인(예를 들면, 인간 IgG1 이소형으로부터 유래), 및 비-VH3 가변 도메인 또는 (예를 들면, G65S 또는 N82aS 치환을 사용하여) 프로테인 A 결합을 무효화하거나 가변 도메인을 갖지 않는 VH3 가변 도메인을 포함하는 프로테인 A에 결합하는 제2 쇄를 갖는다.
도 1A-F: 이들 도면은 모두 안정한 인간 프레임워크에 OKT3 인간화에 관련된 것이다. 도 1A-C: 인간 IgG1 항체로 포맷된 인간화 후보의 요약. 키메라 OKT3 항체에 대한 상대적 HPB-ALL 염색: (-)은 결합하지 않은 것, (+)는 약한 결합, (++)는 중간 결합 및 (+++)은 유사한 결합을 나타낸다. 도 1D: 선택된 후보 항체의 DSC 프로파일. 도 1E: scFv-Fc 융합으로 포맷된 인간화 후보의 요약. 키메라 OKT3 항체에 대한 상대적 HPB-ALL 염색: (-)은 결합하지 않은 것, (+)는 약한 결합, (++)는 중간 결합 및 (+++)은 유사한 결합을 나타낸다. 도 1F: 선택된 scFv-Fc 후보의 DSC 프로파일.
도 2A-B: 이들 도면은 모두 안정한 인간 프레임워크에 SP34 인간화에 관련된 것이다. 도 2A: 인간 IgG1 항체로 포맷된 인간화 후보의 요약. 도 2B: scFv-Fc 융합 단백질로 포맷된 인간화 후보의 요약(인간 IgG1 이소형의 Fc). 인간 및 사이토몰구스 원숭이 CD3 엡실론 1-26_Fc 융합 단백질에 대한 키메라 SP34 항체에 대한 상대적 SPR 데이타: (-)은 결합하지 않은 것, (+)는 약한 결합, (++)는 중간 결합 및 (+++)은 유사한 결합을 나타낸다.
도 3은 SP34 H1L21 뿐만 아니라 SP34 키메라에 대해 IgG1으로부터 scFv-Fc로 재포맷한 후의 상대적 발현 수준을 나타낸다.
도 4는 위치 T27, G27a, V27c, T28, T29, S30, N31, Y32, N52, K53, R54, P56, L90, Y92, S93, N94 및 L95에서 알라닌 주사에 의해 SP34 H1L21 scFv-Fc의 발현 수준에 대한 효과를 나타낸다.
도 5A는 SP34 H3L23 ScFv-Fc의 위치 29에서 랜덤 돌연변이의 발현 수준에 대한 효과를 나타내고; 도 5B는 SP34 H3L23 ScFv-Fc의 위치 30에서 랜덤 돌연변이의 발현 수준에 대한 효과를 나타내고; 도 5C는 SP34 H5L23 ScFv-Fc의 위치 95에서 랜덤 돌연변이의 발현 수준에 대한 효과를 나타낸다.
도 6은 몇몇 인간화 SP34에 대한 정규화 발현 수준을 나타낸다.
도 7A: 키메라 HB-7 항체 및 인간 CD38 항원 사이의 SPR에 의해 측정된 항체-항원 상호작용. CM5 센서 칩은 단백질 G와 공유결합하고 200RU의 키메라 HB-7 항체는 포획되었다. 인간 CD38 단백질(폴리-히스티딘 태그를 갖는 인간 CD38 세포외 도메인)은 HBS-P의 유속 30㎕/min으로 125, 31, 7.8, 3.9, 1.9, 1 및 0.5nM에서 주입했다. 도 7B: 인간화된 HB-7 최고-적합 (best-fit) 항체 및 인간 CD38 항원 사이의 SPR에 의해 측정된 항체-항원 상호작용. CM5 센서 칩은 단백질 G와 공유결합하고 200RU의 인간화된 HB-7 최고-적합 항체는 포획되었다. 인간 CD38 단백질(폴리-히스티딘 태그를 갖는 인간 CD38 세포외 도메인)은 HBS-P 중에서 유속 30㎕/min으로 50, 25, 12.5, 6.25 및 0.39nM에서 주입했다. 도 7C: 인간화된 9G7 최고-적합 항체 및 인간 CD38 항원 사이의 SPR에 의해 측정된 항체-항원 상호작용. CM5 센서 칩은 단백질 G와 공유결합하고 200RU의 인간화된 9G7 최고-적합 항체는 포획되었다. 인간 CD38 단백질(폴리-히스티딘 태그를 갖는 인간 CD38 세포외 도메인)은 HBS-P 중에서 유속 30㎕/min으로 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.56, 0.78, 0.39, 0.19 및 0.1nM에서 주입했다. 도 7D: 인간화된 9G7 최고-프레임워크 항체 및 인간 CD38 항원 사이의 SPR에 의해 측정된 항체-항원 상호작용. CM5 센서 칩은 단백질 G와 공유결합하고 200RU의 인간화된 9G7 최고-프레임워크 항체는 포획되었다. 인간 CD38 단백질(폴리-히스티딘 태그를 갖는 인간 CD38 세포외 도메인)은 HBS-P 중에서 유속 30㎕/min으로 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.56, 0.78, 0.39, 0.19 및 0.1nM에서 주입했다. 도 7E: 인간 767 항체 및 인간 CD38 항원 사이의 SPR에 의해 측정된 항체-항원 상호작용. CM5 센서 칩은 단백질 G와 공유결합하고 200RU의 인간 767 항체는 포획되었다. 인간 CD38 단백질(폴리-히스티딘 태그를 갖는 인간 CD38 세포외 도메인)은 HBS-P 중에서 유속 30㎕/min으로 500, 250, 125, 62.5, 31.25 및 15.6nM에서 주입했다. 친화성는 다음 식에 따라 평형 반응(Req) 대 분석물 농도(C)의 플롯으로부터 수득되었다: Req=KA*C*Rmax/(KA*C*n+1), 50% 포화 농도는 KD이다. 모든 SPR 데이터는 반응 단위(RU로 약칭; Y 축) 대 시간(X 축)의 수로 표시된다. 도 7F: 키메라 HB-7 및 인간화된 HB-7 최고-적합 항체의 DSC 프로파일. 도 7G: 키메라 9G7 및 인간화된 9G7 최고-적합 항체의 DSC 프로파일. 도 7H: 인간화된 9G7 최고-프레임워크 항체의 DSC 프로파일. 도 7I: 인간 클론 767 항체의 DSC 프로파일. 도 7J: 9G7 인간화 항체에 대한 요약 표.
도 8: BEAT CD38-HB7 최고-적합/CD3(포맷 A) 및 BEAT CD38-767/CD3(포맷 B) 항체의 개략도. [(A+)]는 기능성 프로테인 A 결합 부위를 의미한다. [(A-)]는 비기능성 프로테인 A 결합 부위를 의미한다.
도 9A: BEAT CD38-HB7 최고-적합/CD3 항체 및 인간 CD38 항원 사이의 SPR에 의해 측정된 항체-항원 상호작용. CM5 센서 칩은 단백질 G와 공유결합하고, 200RU의 BEAT CD38-HB7 최고-적합/CD3 항체는 포획되었다. 인간 CD38 단백질(폴리-히스티딘 태그된 단백질)은 HBS-P 중에서 유속 30㎕/min으로 50, 25, 12.5, 6.25 및 0.39nM에서 주입했다. 데이터는 반응 단위(RU로 약칭; Y 축) 대 시간(X 축)의 수로 표시되었다. 도 9B: BEAT CD38-HB7 최고-적합/CD3 항체 DSC 프로파일.
도 10: BEAT CD38-HB7 최고-적합/CD3 항체에 의한 T 세포 재지시된 사멸의 예. 판독: RDL-FACS 방법. 효과기 세포: 정제된 인간 T 세포. 효과기 세포 대 표적 세포의 비율 10:1. 48시간 인큐베이션을 통한 2개 공여자의 평균치. 표적 세포: RPMI 8226. 항체 농도는 nM로 제시되어 있다.
도 11: BEAT CD38-767/CD3(SP34) 항체에 의한 T 세포 재지시된 사멸의 예. 판독: RDL-FACS 방법. 효과기 세포: 인간 PBMC. 효과기 세포 대 표적 세포의 비율 10:1. 24시간 인큐베이션을 통한 3개 공여자의 평균치. 표적 세포: 다우디(Daudi). 항체 농도는 nM로 제시되어 있다.
도 12: BEAT CD38-HB7 최고-적합/CD3(SP34)(포맷 A) 및 BEAT CD38-9G7 최고-적합/CD3(SP34-Kappa2)(포맷 B) 항체의 개략도. [(A+)]는 기능성 프로테인 A 결합 부위를 의미한다.
도 13: BEAT CD38-HB7 최고-적합/CD3(SP34) 항체에 의한 T 세포 재지시된 사멸의 예. 판독: RDL-FACS 방법. 효과기 세포: 인간 PBMC. 효과기 세포 대 표적 세포의 비율 10:1. 24시간의 인큐베이션을 통한 3개 공여자의 평균치. 표적 세포: 다우디(Daudi) 세포. 항체 농도는 nM로 제시되어 있다.
도 14: BEAT CD38-9G7 최고-적합/CD3(SP34-Kappa2) 항체 및 인간 CD3 엡실론 1-24_Fc 융합 단백질 사이의 SPR에 의해 측정된 항체-항원 상호작용. CM5 센서 칩은 500RU의 인간 CD3 엡실론 1-24_Fc 융합 단백질과 공유결합되었다. BEAT CD38-9G7 최고-적합/CD3(SP34-Kappa2) 항체는 HBS-P 중에서 유속 30㎕/min으로 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 0.8 및 0.4nM에서 주입했다. 데이터는 반응 단위(RU로 약칭; Y 축) 대 시간(X 축)의 수로 표시되었다.
도 15: BEAT CD38/CD3(SP34-Kappa2) 항체에 의한 T 세포 재지시된 사멸의 예. 판독: RDL-FACS 방법. 효과기 세포: 인간 PBMC. 효과기 세포 대 표적 세포의 비율 10:1. 24시간의 인큐베이션을 통한 3개 공여자의 평균치. 표적 세포: 다우디(Daudi) 세포. 항체 농도는 nM로 제시되어 있다.
도 16은 몇몇 CD38/CD3 이중특이적 항체의 RDL 검정에서 성능을 나타내고, 여기서 CD3 결합 암은 scFv(서열번호 137)로 재포맷된 본래 마우스 SP34, 또는 중쇄/경쇄 조합 H1/L21(서열번호 67), H5/L32(서열번호 68), H5/L65(서열번호 69) 및 H5/L67(서열번호 70)을 포함하는 변형된 인간화 SP34 scFv를 포함한다.
도 17은 프로테인 A 결합 scFv 잔기의 존재(레인 그룹 1) 및 부재(레인 그룹 2)하에 BTB 호모이량체의 비-환원 SDS-PAGE 분석. 친화성 크로마토그래피를 사용한 정제: 용출된 및 중화된 분획은 프로테인 A 크로마토그래피(A) 또는 프로테인 G 크로마토그래피(G) 후에 분석했다. 그룹 2의 경우, 유동 또는 비결합된 분획을 수집하고, 프로테인 A 또는 G에 대한 어떠한 결합도 나타내지 않았다(각각 A ft 및 G ft로 약칭됨). 용출은 pH 3.0에서 수행했다. [(A+)]는 프로테인 A 결합 부위를 의미한다. 분자량 마커는 (kDa)로 나타냈다.
도 18A: D401Q 치환을 담지하는 BTB 쇄에서 단일 프로테인 A 부위만을 함유하는 BEAT 헤테로이량체의 비-환원 SDS-PAGE 분석. 친화성 크로마토그래피를 사용한 정제: 용출된 및 중화된 분획은 프로테인 A 크로마토그래피(A) 또는 프로테인 G 크로마토그래피(G) 후에 분석했다. 용출은 pH 3.0에서 수행했다. [(A+)]는 프로테인 A 결합 부위를 의미한다. 분자량 마커는 (kDa)로 나타냈다. 18B: D401Q 치환을 결여하는 BTB 쇄에서 단일 프로테인 A 부위를 함유하는 BEAT 헤테로이량체의 SDS-PAGE 분석. 친화성 크로마토그래피를 사용한 정제: 용출된 및 중화된 분획은 프로테인 A 크로마토그래피(A) 또는 프로테인 G 크로마토그래피(G) 후에 분석했다. 용출은 pH 3.0에서 수행했다.[(A+)]는 프로테인 A 결합 부위를 의미한다. 분자량 마커는 (kDa)로 나타냈다.
도 19: 이 그래프는 CD4+ 모집단(평범한 라인) 및 CD8+ 모집단(점선)에 대한 혈액 ㎕당 계수를 나타내고, 양 동물은 CD3/CD38 BEAT로 주사했다. 상부 그래프는 1㎍/kg으로 투약한 동물의 계수를 나타낸다. 하부 그래프는 10㎍/kg으로 투약한 동물의 계수를 나타낸다. 시점 0에서의 계수는 투약 1일 전에 수거한 샘플에 상응한다.
도 20: 이 그래프는 CD14+ CD38+ 단핵구 모집단에 대한 혈액 ㎕당 계수를 나타내고, 양 동물은 CD3/CD38 BEAT로 주사했다. 상부 그래프는 1㎍/kg으로 투약한 동물의 계수를 나타낸다. 하부 그래프는 10㎍/kg으로 투약한 동물의 계수를 나타낸다. 시점 0에서의 계수는 투약 1일 전에 수거한 샘플에 상응한다.
도 21: 그래프는 시간(초)의 함수로서 fluo-4 염료의 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다. 이소형 대조군 조건은 각 그래프에 포함되어 있다. 40초 동안 기준선 취득 (acquiwition) 후, 지시된 항체를 샘플에 첨가하고, 취득을 재개했다. 이소형 대조군은 인간 IgG1 항체였다. MFI의 증가는 세포의 세포질 내로의 칼슘 동원 (mobilization)을 나타낸다.
도 22: 인간 CD38의 세포외 도메인으로부터 유래되는 펩티드-Fc 융합체를 사용하여 SPR에 의한 인간화 9G7 항체의 에피토프 맵핑. 데이터는 반응 단위 수(RU로 약칭; Y 축) 대 시간(X 축)으로 표시된다.
도 23: 인간 CD38의 세포외 도메인의 3D 렌더링. F6 펩티드 서열은 회색으로 착되어 있고, 위치 M110 및 T148은 흑색으로 착색되어 있다.
도 24: 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD38의 세포외 도메인을 사용하여 SPR에 의한 인간화 9G7 및 SAR650984 항체의 에피토프 맵핑. 데이터는 반응 단위 수(RU로 약칭; Y 축) 대 시간(X 축)으로 표시된다.
도 25: 인간 CD38의 세포외 도메인으로부터 유래되는 펩티드-Fc 융합체를 사용하여 SPR에 의한 인간 767 항체의 에피토프 맵핑. 데이터는 반응 단위 수(RU로 약칭; Y 축) 대 시간(X 축)으로 표시된다.
도 26: 인간 CD38의 세포외 도메인의 3D 렌더링. F6 펩티드 서열은 회색으로 착되어 있고, 위치 E76 및 H79는 흑색으로 착색되어 있다.
도 27: 인간 CD38의 세포외 도메인으로부터 유래되는 펩티드-Fc 융합체를 사용하여 SPR에 의한 인간화된 SAR650984 항체의 에피토프 맵핑. 데이터는 반응 단위 수(RU로 약칭; Y 축) 대 시간(X 축)으로 표시된다.
본 발명은 일반적으로 CD3 단백질 복합체 및 CD38 항체에 결합하는 신규한 헤테로-이량체성 면역글로불린에 관한 것이다.
또한, 이러한 헤테로-이량체성 면역글로불린은 프로테인 A에 대한 감소 또는 제거된 결합을 갖고, 따라서 친화성 크로마토그래피를 사용하여 매우 고도의 순도로 정제될 수 있다.
본 명세서를 해석하는 목적을 위해, 하기 정의가 적용될 수 있고, 적절한 경우, 단수에 사용되는 용어는 복수에 또한 포함될 수 있으며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 본 발명에 사용된 용어는 단지 특정한 실시양태만을 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭하고, 여기서 아미노산은 탈수 합성을 통해 함께 연결된 아미노산 쇄를 형성하는 펩티드 결합을 통해 조합된다. 폴리펩티드 및 단백질은 화학적 합성 및 재조합 발현을 통해 합성될 수 있으며, 최소 아미노산 길이로 한정되지 않는다.
본 발명에 따르면, 폴리펩티드 그룹은 단백질이 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어지는한 "단백질들"을 포함한다. 폴리펩티드는 추가로 이량체, 삼량체, 및 하나 이상의 폴리펩티드 분자로 이루어진 고차 올리고머와 같은 다량체를 형성할 수 있다. 이러한 이량체, 삼량체 등을 형성하는 폴리펩티드 분자들은 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 이러한 다량체의 상응하는 고차 구조는 순차로 호모- 또는 헤테로-이량체, 호모- 또는 헤테로-삼량체 등으로 명명된다. 헤테로-다량체에 대한 예는 항체 분자이고, 이는, 자연 발생 형태에 있어서, 2개의 동일한 폴리펩티드 경쇄 및 2개의 동일한 폴리펩티드 중쇄로 이루어진다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 또한 자연적으로 변형된 폴리펩티드/단백질을 지칭하고, 여기서 상기 변형은, 예를 들면, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등과 같은 번역후 변형에 의해 수행된다. 이러한 변형은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 또한, 본 발명의 목적을 위해, "폴리펩티드"는 천연 서열에 대해 결실, 부가 및 치환(이는 본래 보존적일 수 있다)과 같은 변형을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이러한 변형은 부위 지시된 돌연변이유발을 통해 계획적일 수 있고, PCR 증폭에 기인하여 단백질 또는 에러를 생산하는 숙주의 돌연변이유발을 통한 우발적일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "CD3 복합체"는 CD3(분화 클러스터 3) T 세포 공-수용체로 공지된 단백질 복합체를 지칭한다[참조: Wucherpfennig KW et al., (2010) Cold Spring Harb Perspect Biol, 2(4): a005140]. CD3 단백질 복합체는 4개의 상이한 쇄로 구성된다. 포유동물에서, 상기 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄 및 2개의 CD3ε 쇄를 포함한다. 이러한 쇄는 T 림프구에서 활성화 신호를 생성하는 T 세포 수용체(TCR) 및 ζ-쇄로 공지된 분자와 회합한다[참조: van der Merwe PA & Dushek O (2011) Nat Rev Immunol, 11(1): 47-55]. TCR, ζ-쇄 및 CD3 분자는 TCR 복합체를 함께 포함한다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 쇄는 단일 세포외 면역글로불린 도메인을 함유하는 면역글로불린 수퍼패밀리의 고도 관련된 세포 표면 단백질이다. CD3 분자의 세포내 테일은 TCR의 신호전달 능력에 필수적인 짧은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 단일 보존된 모티프를 함유한다. CD3은 T 세포 활성화를 위해 요구되기 때문에, CD3을 표적화하는 약물(종종 모노클로날 항체)은 면역억제제 요법으로 연구되고 있다.
본원에서 지칭된 용어 "면역글로불린"은 용어 "항체"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 면역글로불린은 전장 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 이들의 단일 쇄를 포함한다. 면역글로불린은 호모-이량체 또는 헤테로-이량체일 수 있다. 면역글로불린 및 특히 자연 발생 항체는 Y 형상 유닛의 하나 이상의 카피로 존재하는 당단백질이며, 4개의 폴리펩티드 쇄로 구성된다. 각각의 "Y" 형상은 2개의 동일한 카피의 중쇄(H) 및 2개의 동일한 카피의 경쇄(L)를 함유하며, 이들의 상대적 분자량에 의해 명명된다. 각각의 경쇄는 중쇄와 쌍을 이루고, 각각의 중쇄는 또 다른 중쇄와 쌍을 이룬다. 공유 쇄간 디설파이드 결합 및 비공유 상호작용은 쇄를 함께 연결한다. 면역글로불린 및 특히 자연 발생 항체는 가변 영역을 함유하며, 이는 항원 결합 부위의 2개 카피이다. 단백질분해 효소인 파파인은 "Y" 형상을 3개의 분자로 분할하고, 2개의 소위 "Fab" 또는 "FAB" 단편(Fab = 항원 결합 단편)과 1개의 소위 "Fc" 단편 또는 "Fc 영역(Fc = 단편 결정화)으로 분할한다. Fab 단편은 전체 경쇄 및 일부 중쇄로 이루어진다. 중쇄는 1개의 가변 영역(VH) 및 3개 또는 4개의 불변 영역(항체 부류 또는 이소형에 따라 CH1, CH2, CH3 및 CH4)을 함유한다. CH1 및 CH2 영역 사이의 영역은 힌지 영역으로 불리며, Y 형상 항체 분자의 2개 Fab 암 사이의 유연성을 가능하게 하여, 이들을 고정된 거리에 의해 분리된 2개 항원 결정기에 대한 결합을 수용하도록 개폐할 수 있게 한다. 본원에서 지칭된 "힌지 영역"은 길이에서 6-62 아미노산의 서열 영역이며, 오직 IgA, IgD 및 IgG에 존재하고, 이는 2개의 중쇄를 연결하는 시스테인 잔기를 포함한다. IgA, IgD 및 IgG의 중쇄는 각각 4개 영역, 즉 1개의 가변 영역(VH) 및 3개의 불변영역(CH1-3)을 갖는다. IgE 및 IgM은 중쇄에서 1개의 가변 영역 및 4개의 불변 영역(CH1-4)을 갖는다. 면역글로불린의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포(예를 들면, 효과기 세포) 및 보체 시스템 고전적 경로의 최초 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 결합을 매개할 수 있다. 각 경쇄는 1개의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결된다. 각 경쇄는 1개의 가변 영역(VL) 및 1개의 경쇄 불변 영역을 함유한다. 경쇄 불변 영역은 본원에서 IGKC로 지정된 카파(kappa) 경쇄 불변 영역이거나, 본원에서 IGLC로 지정된 람다(lambda) 경쇄 불변 영역이다. IGKC는 본원에서 Cκ 또는 CK와 등가적으로 사용되며, 동일한 의미를 갖는다. IGLC는 본원에서 Cλ 또는 CL로 등가적으로 사용되며, 동일한 의미를 가진다. 본원에서 사용된 용어 "IGLC 영역"은 모든 람다 경쇄 불변 영역을 지칭하고, 예를 들면, IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 및 IGLC7으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모든 람다 경쇄 불변 영역을 지칭한다. VH 및 VL 영역은 초가변적 영역으로 추가로 분할될 수 있으며, 이는 프레임워크 영역(FR 또는 FW)이라 명명되는 보다 보존되는 영역으로 산재된 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명된다. VH 및 VL 각각은 3개 CDR 및 4개 FR로 구성되고, 다음과 같은 순서로 아미노-말단에서부터 카복시-말단까지 배열되었다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 에티토프 결합 영역을 함유한다. 조작된 면역글로불린은 scFv, FAB 또는 dAb 단편과 같은 상이한 에피토프 결합 영역 포맷을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 일반적으로 IgG Fc 영역에 대한 유전적 융합에 의해 항체-형 구조로 조립된다. 조작된 면역글로불린은 헤테로-이량체화 증강 기술의 사용 또는 사용 없이 호모- 또는 헤테로-이량체로서 작제될 수 있으며, 모노- 또는 이중특이적 결합 특성을 가질 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "전장 항체"는 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 항체의 자연 생물학적 형태를 구성하는 구조를 포함한다. 예를 들면, 인간 및 마우스를 포함하는 대부분의 포유동물에서, IgG 부류의 전장 항체는 사량체이고, 항원 부류 또는 이소형에 따라, 2개의 면역글로불린 쇄의 2개의 동일한 쌍으로 이루어지며, 여기서 각 쌍은 1개의 경쇄 및 중쇄를 갖고, 각 경쇄는 면역글로불린 영역 VL 및 경쇄 불변 영역을 포함하며, 각 중쇄는 면역글로불린 영역 VH, CH1(Cγ1), CH2(Cγ2), CH3(Cγ3) 및 CH4(Cγ4)을 포함한다. 일부 포유동물, 예를 들면, 낙타 및 라마에 있어서, IgG 항체는 2개 중쇄만으로 이루어질 수 있고, 각 중쇄는 Fc 영역에 부착된 가변 영역을 포함한다.
불변 영역에 의해 유전적으로 결정된 항체는 이소형으로 또한 지칭되는 부류로 분류된다. 인간 불변 경쇄는 카파(Cκ) 및 람다(Cλ) 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤(μ), 델타(δ), 감마(γ), 알파(α) 또는 엡실론(ε)으로 분류되며, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE으로 정의한다. 따라서, 본원에서 사용된 "이소형"은 화학적 및 이들의 불변 영역의 항원적 특성에 의해 정의된 면역글로불린의 임의의 부류 및/또는 아부류를 의미한다. 공지된 인간 면역글로불린 이소형은 IGHG1(IgG1), IGHG2(IgG2), IGHG3(IgG3), IGHG4(IgG4), IGHA1(IgA1), IGHA2(IgA2), IGHM(IgM), IGHD(IgD) 및 IGHE(IgE)이다. 이른바 인간 면역글로불린 유사-감마 IGFGP 유전자는 변경된 스위치 영역으로 인해 단백질을 코딩하지 않지만 서열분석된 추가의 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자를 나타낸다[참조: Bensmana M et al., (1988) Nucleic Acids Res, 16(7): 3108]. 변경된 스위치 영역을 갖는 것에도 불구하고, 인간 면역글로불린 유사-감마 IGHGP 유전자는 모든 중쇄 불변 영역(CH1-CH3) 및 힌지에 대한 개방 판독 프레임을 갖는다. 중쇄 불변 영역에 대한 모든 개방 판독 프레임은 예측된 구조적 특징을 갖는 모든 인간 면역글로불린 불변 영역과 잘 정렬하는 단백질 영역을 코딩한다. 이러한 추가의 유사-감마 이소형은 IgGP 또는 IGHGP로 본원에서 지칭된다. 다른 유사 면역글로불린 유전자는 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 엡실론 P1 및 P2 유사-유전자(IGHEP1 및 IGHEP2)와 같은 것이 보고되고 있다. IgG 부류는 치료 목적을 위해 가장 일반적으로 사용된다. 인간에서, 이러한 부류는 아부류 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 마우스에서, 이러한 부류는 아부류 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c 및 IgG3를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "면역글로불린 단편"은, 이로써 한정되지 않지만, (i) 예를 들면, CH1, CH2 또는 CH3 영역을 포함하는 영역, (ii) Fab'및 Fab'-SH를 포함하는 VL, VH, CL 또는 CK 및 CH1 영역으로 이루어진 Fab 단편, (ii) VH 및 CH1 영역으로 이루어진 Fd 단편, (iii) 단일 가변 영역으로 이루어진 dAb 단편[참조: Ward ES et al., (1989) Nature, 341(6242): 544-6], (iv) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, F(ab')2 단편, (v) 단일 쇄 Fv 단편(scFv), 여기서 VH 영역 및 VL 영역은 2개 영역이 항원 결합 부위를 형성할 수 있도록 회합하게 하는 펩티드 링커에 의해 연결됨[참조: Bird RE et al., (1988) Science, 242(4877): 423-6; Huston JS et al., (1988) Proc Natl Acad Sci U S A, 85(16): 5879-83], (vi) "디아바디" 또는 "트리아바디", 유전자 융합에 의해 작제된 다가 또는 다중특이적 단편[참조: Holliger P et al., (1993) Proc Natl Acad Sci U S A, 90(14): 6444-8; Tomlinson I & Holliger P, (2000) Methods Enzymol, 326:461-79], (vii) scFv, 디아바이 또는 Fc 영역에 융합된 영역 항체 및 (viii) 동일 또는 상이한 항체에 융합된 scFv를 포함한다.
용어 "가변 영역"은 항원-결합을 매개하는 영역 또는 도메인을 지칭하고, 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 자연 발생 항체에서, 항원-결합 부위는 특이성을 정의하는 2개 가변 영역으로 이루어진다: 중쇄 가변 영역(VH)으로 본원에서 지칭되는 중쇄에 위치한 하나 및 경쇄 가변 영역(VL)으로 본원에서 지칭되는 경쇄에 위치한 다른 하나. 인간에서, 중쇄 가변 영역(VH)은 7개의 하위 그룹 또는 아부류로 세분할 수 있다: VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6 및 VH7. 일부 경우에, 특이성은 독점적으로 낙타에서 발견되는 중쇄 항체로부터 단일 도메인 항체와 같이 2개 영역의 하나에만 소재할 수도 있다. V 영역은 일반적으로 약 110 아미노산 길이이며, 7-17 아미노산 길이인 "초가변 영역"이라 불리는 극단적인 가변성의 짧은 영역에 의해 분리된 15-30 아미노산의 프레임워크 영역(FR 또는 "비-CDR 영역")으로 불리는 아미노산 서열의 상대적 불변 영역으로 이루어진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 4개의 FR을 포함하며, 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 베타-시트 구성을 주로 채택한다. 각 쇄에서 초가변 영역은 FR에 의해 인접하게 함께 유지되며, 다른 쇄로부터 초가변 영역과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다[참조: Kabat EA et al., supra.]. 본원에서 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원 결합에 관여하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터 아미노산 잔기를 포함하고, 후자는 고도의 서열 변이성이 존재하고/하거나 항원 인식에 관여한다. 모든 변이 영역 넘버링은 Kabat에 따른다[참조: Kabat EA et al., supra.].
다수의 CDR 정의가 사용되며 본원에 포함된다. Kabat 정의는 서열 가변성에 기반하고, 가장 통상적으로 사용되는 것이다[참조: Kabat EA et al., supra.]. Chothia는 구조적 루프의 위치를 대신 지칭한다[참조: Chothia & Lesk J. (1987) Mol Biol, 196: 901-917]. AbM 정의는 Kabat 및 Chothis 정의 사이의 절충이고, 옥스포드 분자 AbM(Oxford Molecular's AbM) 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다[참조: Martin ACR et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9268-9272; Martin ACR et al., (1991) Methods Enzymol, 203: 121-153; Pedersen JT et al., (1992) Immunomethods, 1: 126-136; Rees AR et al., (1996) In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172]. 접촉 정의는 최근 도입되었으며[참조: MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol, 262: 732-745], 단백질 데이터뱅크(Protein Databank)에서 이용가능한 복잡한 구조의 분석에 기반한다. 국제 임뮤노제네틱스 정보 시스템(ImMunoGeneTics information system®)(http://www.imgt.org) IMGT®에 의한 CDR의 정의는 모든 면역글로불린 및 모든 종의 T 세포 수용체 V-RESION에 대한 IMGT 넘버링에 기반한다[참조: IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®; Lefranc MP et al., (1999) Nucleic Acids Res, 27(1): 209-12; Ruiz M et al., (2000) Nucleic Acids Res, 28(1): 219-21; Lefranc MP (2001) Nucleic Acids Res, 29(1): 207-9; Lefranc MP (2003) Nucleic Acids Res, 31(1): 307-10; Lefranc MP et al., (2005) Dev Comp Immunol, 29(3): 185-203; Kaas Q et al., (2007) Briefings in Functional Genomics & Proteomics, 6(4): 253-64]. 본 발명에서 지칭된 모든 상보성 결정 영역(CDR)은 다음과 같이 정의되는 것이 바람직하다[참조: Kabat EA et al., supra에 따른 넘버링): LCDR1: 24-34, LCDR2: 50-56, LCDR3: 89-98, HCDR1: 26-35, HCDR2: 50-65, HCDR3: 95-102.
가변 도메인의 "비-CDR 영역"은 프레임워크 영역(FR)으로 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 VL 영역의 "비-CDR 영역"은 아미노산 서열: 1-23(FR1), 35-49(FR2), 57-88(FR3) 및 99-107(FR4)을 포함한다. 본원에서 사용되는 VH 영역의 "비-CDR 영역"은 아미노산 서열: 1-25(FR1), 36-49(FR2), 66-94(FR3) 및 103-113(FR4)을 포함한다.
본 발명의 CDR은 상기 정의에 기초한 "확장된 CDR"를 포함할 수 있고, 다음과 같은 가변 도메인 잔기를 갖는다: LCDR1: 24-36, LCDR2: 46-56, LCDR3:89-97, HCDR1: 26-35, HCDR2:47-65, HCDR3: 93-102. 이러한 확장된 CDR은 Kabat 등(Kabat et al., supra)에 따라 넘버링된다. 본원에서 사용된 VL 영역의 "비-확장된 CDR 영역"은 다음의 아미노산 서열: 1-23(FR1), 37-45(FR2), 57-88(FR3) 및 98-대략 107(FR4)을 포함한다. 본원에서 사용된 VH 영역의 "비-확장된 CDR 영역"은 다음의 아미노산 서열: 1-25(FR1), 37-46(FR2), 66-92(FR3) 및 103-대략 113(FR4)을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "Fab" 또는 "FAB" 또는 "Fab 영역" 또는 "FAB 영역" 은 VH, CH1, VL 및 경쇄 불변 면역글로불린 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. Fab는 단리에 있어서 이러한 영역을 지칭하거나, 전장 항체 또는 항체 단편의 맥락에서 이러한 영역을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "Fc" 또는 "Fc 영역"은 면역글로불린 영역의 제1 불변 영역을 제외한 항체 중쇄의 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개 불변 영역 면역글로불린 영역을 지칭하거나, IgE 및 IgM의 마지막 3개 불변 영역 면역글로불린 영역, 및 이러한 영역의 유연한 힌지 N-말단을 지칭한다. IgA 및 IgM의 경우, Fc는 J 쇄를 포함할 수 있다. IgG의 경우, Fc는 면역글로불린 영역 Cgamma2 및 Cgamma3(Cγ2 및 Cγ3)을 포함하고, Cgamma1(Cγl) 및 Cgamma2(Cγ2) 사이의 힌지를 포함한다. Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상 이의 카복실-말단의 C226 또는 P230 잔기를 포함하는 것으로 정의되며, 여기서 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. Fc는 단리에 있어서 이러한 영역을 지칭할 수 있거나, 예를 들면, 항체와 같이 Fc 폴리펩티드의 맥락에서 이러한 영역을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "면역글로불린 불변 영역"은 인간 또는 동물 종으로부터의 면역글로불린 또는 항체 중쇄 불변 영역을 지칭하며, 모든 이소형을 포함한다. 바람직하게는, 면역글로불린 불변 영역은 인간 유래이고, 이로써 한정되지 않지만, 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: IGHG1 CH1, IGHG2 CH1, IGHG3 CH1, IGHG4 CH1, IGHA1 CH1, IGHA2 CH1, IGHE CH1, IGHEP1 CH1, IGHM CH1, IGHD CH1, IGHGP CH1, IGHG1 CH2, IGHG2 CH2, IGHG3 CH2, IGHG4 CH2, IGHA1 CH2, IGHA2 CH2, IGHE CH2, IGHEP1 CH2, IGHM CH2, IGHD CH2, IGHGP CH2, IGHG1 CH3, IGHG2 CH3, IGHG3 CH3, IGHG4 CH3, IGHA1 CH3, IGHA2 CH3, IGHE CH3, IGHEP1 CH3, IGHM CH3, IGHD CH3, IGHGP CH3, IGHE CH4 및 IGHM CH4. 바람직한 "면역글로불린 불변 영역"은 인간 IGHE CH2, IGHM CH2, IGHG1 CH3, IGHG2 CH3, IGHG3 CH3, IGHG4 CH3, IGHA1 CH3, IGHA2 CH3, IGHE CH3, IGHM CH3, IGHD CH3 및 IGHGP CH3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 더욱 바람직한 "면역글로불린 불변 영역"은 인간 IGHG1 CH3, IGHG2 CH3, IGHG3 CH3, IGHG4 CH3, IGHA1 CH3, IGHA2 CH3, IGHE CH3, IGHM CH3, IGHD CH3 및 IGHGP CH3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
용어 "에피토프 결합 영역"은 하나 이상의 에피토프에 대한 면역글로불린 분자의 특이적 결합을 가능하게 하도록 최소 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함한다. 자연 발생 항체는 항원 결합 또는 조합 부위 또는 파라토프(paratopes)로 공지된 2개 에피토프 결합 영역을 갖는다. 자연 발생 항체에서 에피토프 결합 영역은 아미노산 매개 에피토프 결합이 발견되는 VH 및/또는 VL 도메인의 CDR 영역 내에 한정된다. 자연 발생 항체에 추가하여, 인공 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 이의 단편 및 이들의 조합은 에피토프 결합 영역을 제공하기 위해 조작될 수 있다[참조: Holt LJ et al., (2003) Trends Biotechnol, 21(11): 484-490; Polonelli L et al., (2008) PLoS ONE, 3(6): e2371]. 비-면역글로불린 기반 에피토프 결합 영역의 예는 에피토프 결합 영역의 조작을 위해 "스캐폴드"로 사용되는 인공 단백질 도메인에서 찾을 수 있다[참조: Binz HK et al., (2005) Nat Biotechnol, 23(10): 1257-1268) or peptide mimetics (Murali R & Greene MI (2012) Pharmaceuticals, 5(2): 209-235]. 바람직하게는, 용어 '에피토프 결합 영역'은 하나 이상의 중쇄 가변 도메인 및 하나 이상의 상보적 경쇄 가변 도메인의 조합을 포함하며, 이는 하나 이상의 에피토프에 대한 면역글로불린 분자의 특이적 결합을 가능하게 하는 결합 부위를 함께 형성한다. 본 발명에서 예시된 에피토프 결합 영역의 예는 scFv 및 FAB를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 폴리펩티드의 단편 또는 동물에서, 바람직하게는 포유동물 및 가장 바람직하게는 인간에 있어서 항원성 또는 면역원성 활성을 갖는 단백질 또는 비-단백질 분자를 포함한다. 면역원성 활성을 갖는 에피토프는 폴리펩티드의 단편이거나 동물에서 항체 반응을 유도하는 단백질이다. 항원 활성을 갖는 에피토프는, 예를 들면, 면역검정에 의해 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 측정된 바와 같이, 항체 또는 폴리펩티드가 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 단편 또는 단백질이다. 항원 에피토프는 반드시 면역원성일 필요 없다. 바람직하게는, 본원에서 사용된 용어 "에피토프"는 적어도 약 3 내지 5, 바람직하게는 약 5 내지 10 또는 15개 또는 약 1,000개(또는 이 사이의 정수) 이하의 아미노산의 폴리펩티드 서열을 지칭하며, 이는 단독으로 또는 보다 큰 서열의 일부로서의 서열을 정의하며, 이러한 서열에 반응하여 생성된 항체에 결합한다. 단편의 길이에 대한 상한 임계치는 없으며, 이는 거의 단백질 서열의 전장을 포함할 수 있거나, 하나 이상의 에피토프를 포함하는 융합 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용된 에피토프는 이것이 유래되는 모 단백질 부분의 정확한 서열을 갖는 폴리펩티드로 한정되지 않는다. 따라서, 용어 "에피토프"는 천연 서열과 동일한 서열 뿐만 아니라 결실, 부가 및 치환(일반적으로 본질적으로 보존성)과 같은 천연 서열에 대한 변형을 포함한다. 단백질 항원의 에피토프는 이들의 구조 및 에피토프 결합 부위와의 상호작용에 기반하여 입체형태적 에피토프 및 선형 에피토프의 2개 카테고리로 분류된다[참조: Goldsby R et al., (2003) "Antigens (Chapter 3)" Immunology (Fifth edition ed.), New York: W. H. Freeman and Company. pp. 57-75, ISBN 0-7167-4947-5]. 입체형태적 에피토프는 항원의 아미노산 서열의 불연속적인 부분으로 구성된다. 이들 에피토프는 3D 표면 특징 및 형태 또는 항원의 3차 구조에 기반한 파라토프와 상호작용한다. 대부분의 에피토프는 입체구조적이다. 대조적으로, 선형 에피토프는 이들의 초기 구조에 기반한 파라토프와 상호작용한다. 선형 에피토프는 항원으로부터 아미노산의 연속 서열에 의해 형성된다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로-이량체성 면역글로불린" 또는 "헤테로-이량체 단편" 또는 "헤테로-이량체" 또는 "중쇄의 헤테로-이량체"는 면역글로불린 분자 또는 제1 및 제2 영역과 같은 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 부분을 포함하고, 여기서 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드와 아미노산 서열이 상이하다. 바람직하게는, 헤테로-이량체성 면역글로불린은, 제1 쇄가 제2 쇄과 동일하지 않은 적어도 하나의 영역을 갖고, 여기서 양 쇄를 조립하여, 즉 이들의 동일하지 않은 영역을 통해 상호작용하는 2개 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 헤테로-이량체성 면역글로불린은 적어도 2개의 상이한 리간드, 항원 또는 결합 부위에 대한 결합 특이성을 갖고, 즉 이중특이적이다. 본원에서 사용되는 헤테로-이량체성 면역글로불린은, 이로써 한정되지 않지만, 전장 이중특이적 항체, 이중특이적 Fab, 이중특이적 F(ab')2, Fc 영역에 융합된 이중특이적 scFv, Fc 영역에 융합된 디아바디 및 Fc 영역에 융합된 도메인 항체를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "호모-이량체 면역글로불린" 또는 "호모-이량체 단편" 또는 "호모-이량체" 또는 "중쇄의 호모-이량체"는 면역글로불린 분자 또는 제1 및 제2 영역과 같이 제1 및 제2 폴리펩티드를 적어도 포함하는 부분을 포함하고, 여기서 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드와 아미노산 서열이 동일하다. 바람직하게는, 호모-이량체성 면역글로불린은 2개 폴리펩티드 쇄를 포함하며, 여기서 제1 쇄는 제2 쇄과 동일한 적어도 하나의 영역을 갖고, 양 쇄를 조립하여, 즉 이들의 동일한 영역을 통해 상호작용한다. 바람직하게는, 호모-이량체 면역글로불린 단편은 적어도 2개 영역을 포함하며, 여기서 제1 영역은 제2 영역과 동일하고, 양 쇄를 조립하여, 이들의 단백질-단백질 계면을 통해 상호작용한다.
본 발명에서 포함된 모든 면역글로불린 불변 영역의 경우, 넘버링은 IMGT® (IMGT®; supra)에 따를 수 있다.
IGHG1, IGHG2, IGHG3 및 IGHG4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 모든 인간 CH1, CH2, CH3 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 있어서, 넘버링은 "EU 넘버링 시스템"에 따를 수 있다[참조: Edelman GM et al., (1969) Proc Natl Acad Sci USA, 63(1): 78-85]. IGHG1의 인간 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 불변 영역에 대한 완전한 대응은 IMGT 데이터베이스(IMGT®; supra)에서 찾을 수 있다.
인간 카파 면역글로불린 경쇄 불변 영역(IGKC)에 있어서, 넘버링은 "EU 넘버링 시스템"에 따를 수 있다[참조: Edelman GM et al., supra]. 인간 CK 영역에 대한 완전한 대응은 IMGT 데이터베이스(IMGT®; supra)에서 찾을 수 있다.
인간 람다 면역글로불린 경쇄 불변 영역(IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 및 IGLC7)에 있어서, 넘버링은 "Kabat 넘버링 시스템"에 따를 수 있다[참조: Kabat EA et al., supra]. 인간 IGLC 영역에 대한 완전한 대응은 IMGT 데이터베이스(IMGT®; supra)에서 찾을 수 있다.
본원에서 지칭된 인간 IGHG1 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 다음과 같은 영역 경계를 갖는다: CH1 영역(EU 넘버링: 118-215), 힌지 γ1 영역(EU 넘버링: 216-230), CH2 영역(EU 넘버링: 231-340) 및 CH3 영역(EU 넘버링: 341-447). 본원에서 지칭된 인간 CK 영역은 잔기 108 내지 214(EU 넘버링)에 걸쳐 있다. 본원에서 지칭된 인간 IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 및 IGLC7 영역은 잔기 108-215(Kabat 넘버링)에 걸쳐 있다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산" 또는 "아미노산 잔기"는 천연 아미노산 뿐만 아니라 비-천연 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 천연 아미노산이 포함된다.
본원에서 용어 "변형" 또는 "아미노산 변형"은 폴리펩티드 서열에서 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "치환" 또는 "아미노산 치환" 또는 "아미노산 잔기 치환"은 아미노산 서열에서 제1 아미노산 잔기가 제2 아미노산 잔기로 치환되는 것을 지칭하고, 반면에 제1 아미노산 잔기는 제2 아미노산 잔기와 상이하며, 즉 치환된 아미노산 잔기는 치환된 아미노산 잔기와 상이하다. 예를 들면, 치환 R94K는 94 위치의 아르기닌이 리신으로 치환된 변이체 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들면, 94K는 리신으로 위치 94의 치환을 나타낸다. 본원에서의 목적을 위해, 다중 치환은 일반적으로 슬래시 또는 쉼표로 구분된다. 예를 들면, "R94K/L78V" 또는 "R94K, L78V"는 R94K 및 L78V 치환을 포함하는 이중 변이체를 지칭한다. 본원에서 사용되는 "아미노산 삽입" 또는 "삽입"은 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 아미노산의 부가를 의미한다. 예를 들면, 삽입 -94는 94 위치에서의 삽입을 나타낸다. 본원에서 사용되는 "아미노산 결실" 또는 "결실"은 모 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 아미노산의 제거를 의미한다. 예를 들면, R94-는 94 위치에서 아르기닌의 결실을 지칭한다.
특정 실시형태에서, 프로테인 A에 대한 결합에서 용어 "저하", "감소하다" 또는 "감소"는, 변형되지 않은 면역글로불린 또는 야생형 IgG 또는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG와 같은 모체와 비교하여, 본원에 기재된 것과 같은 공지된 표준 기술에 의해 검출된 프로테인 A에 대한 변형된 면역글로불린 또는 이의 단편의 결합에 있어서 적어도 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99%, 최대 100%(제거)의 전반적 감소를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 이러한 용어는 대안적으로 10-배(즉, 1 로그), 100-배(2 로그), 1,000-배(또는 3 로그), 10,000-배(또는 4 로그) 또는 100,000-배(또는 5 로그)의 전반적 감소를 지칭한다.
프로테인 A에 대한 결합의 "제거한다", "무효화한다", "제거" 또는 "무효화"는 프로테인 A에 대한 변형된 면역글로불린 또는 이의 단편의 결합에 있어서 100%의 전체 감소를 지칭하며, 즉, 변형되지 않은 면역글로불린 또는 야생형 IgG 또는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG와 같은 모체와 비교하여, 본원에 기재된 것들과 같은 공지된 표준 방법에 의해 검출된 프로테인 A에 대한 변형된 면역글로불린 또는 이의 단편의 결합의 완전한 손실을 지칭한다.
유사하게는, 친화성 시약에 대한 결합에서 상기 용어 "저하하다", "감소하다" 또는 "감소"는, 변형되지 않은 면역글로불린 또는 야생형 IgG 또는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG와 같은 모체와 비교하여, 본원에 기재된 것들과 같은 공지된 표준 방법에 의해 검출된 친화성 시약에 대한 변형된 면역글로불린 또는 이의 단편의 결합에 있어서 적어도 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%, 최대 100%(제거)의 전반적 감소를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 이러한 용어는 대안적으로 10-배(즉 1 로그), 100-배(2 로그), 1,000-배(또는 3 로그), 10,000-배(또는 4 로그) 또는 100,000-배(또는 5 로그)의 전반적 감소를 지칭한다.
친화성 시약의 결합의 용어 "제거하다", "무효화하다", "제거" 또는 "무효화"는 프로테인 A에 대한 변형된 면역글로불린 또는 이의 단편의 결합에 있어서 100%의 전반적 감소를 지칭하며, 즉, 변형되지 않은 면역글로불린 또는 야생형 IgG 또는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG와 같은 모체와 비교하여, 본원에 기재된 것들과 같은 공지된 표준 방법에 의해 검출된 친화성 시약에 대한 변형된 면역글로불린 또는 이의 단편의 결합의 완전한 손실을 의미한다.
"이중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시형태에서, 이중특이적 항체는 모 항체에 대하여 VH 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 이중특이적 항체이다. 특정 실시형태에서, 이중특이적 항체는 인간 또는 인간화 항체일 수 있다. 이중특이적 항체는 표적 항원을 발현하는 세포에 세포 독성제를 국지화하기 위해 사용할 수 있다. 이들 항체는 표적-항원-결합 암, 및 사포린, 항-인터페론 알파, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐과 같은 세포독성제에 결합하는 암을 포함한다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조할 수 있다. 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은, 2개의 중쇄가 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시 발현에 기초한다[참조: Milstein and Cuello, (1983) Nature, 305: 537-40]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 분류로 인해, 이러한 하이브리도마는 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산한다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 복잡하고 생성물 수율도 낮다. 유사한 절차가 WO1993/08829 및 문헌[Traunecker et al., (1991) EMBO J, 10: 3655-9]에 개시되어 있다. 상이한 접근법에 따라, 목적하는 결합 특이성(항체-항원 조합 부위)을 갖는 항체 가변 영역은 면역글로불린 불변 영역 서열과 융합된다. 예를 들면, 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 일부를 적어도 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 갖는다. 특정 실시형태에서, 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)은 상기 융합 중 적어도 하나에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합을 코딩하는 DNA 및, 필요한 경우, 면역글로불린 경쇄는 별개의 발현 벡터에 삽입되고, 적합한 숙주 유기체에 동시-형질감염된다. 이는, 이 구성에 사용되는 3개 폴리펩티드 쇄의 불균등한 비율이 최적 수율을 제공하는 실시형태에서 3개 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는 유연성을 제공한다. 그러나, 동등한 비율에서 적어도 2개 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율을 나타내거나 비율이 특별히 중요하지 않을 때, 하나의 발현 벡터에서 2개 또는 모든 3개 폴리펩티드 쇄를 위한 코딩 서열을 삽입할 수 있다.
이중특이적 항체는 가교-결합 또는 "헤테로접합" 항체를 포함한다. 예를 들면, 헤테로접합에서 하나의 항체는 아비딘(avidin)에 결합될 수 있고, 다른 하나는 비오틴(biotin)에 결합될 수 있다. 예를 들면, 이러한 항체는 원하지 않는 세포 에 대한 면역계 세포의 표적화(US4,676,980) 및 HIV 감염의 치료(WO1991/00360, WO1992/00373 및 EP03089)를 위해 제안되어 있다. 헤테로접합 항체는 임의의 편리한 가교-결합 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교 결합제는 다수의 가교-결합 기술과 함께 공지되어 있다[참조: US4,676,980]. 2개 이상의 원자가를 갖는 항체도 고려되고 있다. 예를 들면, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다[참조: Tutt A et al. (1991) J. Immunol. 147: 60-9].
프로테인 A: 프로테인 A는 단일 폴리펩티드 쇄로 구성된 스타필로콕쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 몇몇 균주에 의해 생산되는 세포벽 성분이다. 프로테인 A 유전자 생성물은 병원균의 세포벽에 직렬 방식으로 부착된 5개 상동성 반복체로 이루어진다. 5개 도메인은 길이가 약 58 아미노산이며, 각각 면역글로불린 결합 활성을 나타내는 EDABC를 나타낸다[참조: Tashiro M & Montelione GT (1995) Curr. Opin. Struct. Biol., 5(4): 471-481]. 5개 상동성 면역글로불린 결합 도메인은 3개-나선형 다발로 접힌다. 각 도메인은 다수의 포유동물의 단백질, 가장 현저하게는 IgG에 결합할 수 있다[참조: Hober S et al., (2007) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 848(1): 40-47]. 프로테인 A는 인간 VH3 패밀리의 경우에 있어서 Fc 영역 내에서 뿐만 아니라 Fab 영역 내에서 대부분의 면역글로불린의 중쇄에 결합한다[참조: Jansson B et al, (1998) FEMS Immunol. Med. Microbiol., 20(1): 69-78]. 프로테인 A는 인간, 마우스, 래빗 및 기니 피그를 포함하는 다양한 종의 IgG에 결합하지만, 인간 IgG3에는 결합하지 않는다[참조: Hober S et al., (2007) supra]. 프로테인 A에 결합하는 인간 IgG3의 불능은 인간 IgG3 Fc 영역에서 H435R 및 Y436F 치환에 의해 설명될 수 있다[참조: EU 넘버링, Jendeberg et al., (1997) J. Immunol. Methods, 201(1): 25-34]. IgG 이외에, 프로테인 A는 또한 IgM 및 IgA와 상호작용한다.
인간 VH 아부류 중에서, VH3는 프로테인 A에 결합하는 유일한 아부류이고[참조: Graille M et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(10): 5399-5404], 프로테인 A의 모든 5개 도메인은 이러한 가변 도메인 아부류에 결합하는 것으로 공지되어 있다[참조: Jansson B et al, (1998) FEMS Immunol. Med. Microbiol., 20(1): 69-78]. VH3 기반 면역글로불린 또는 이의 단편은 생명공학 산업에서 매우 중요하다. VH3 기반 분자는 프로테인 A에 결합하는 이들의 능력이 이들의 기능성 사전-스크리닝을 용이하게 하기 때문에 광범위하게 개발되었으며, 다수의 합성 또는 공여자 기반 파지 디스플레이 라이브러리 또는 항체 발견에 사용된 유전자조합 동물 기술은 VH3 아부류에 기초한다. 또한, VH3 기반 분자는 종종 공지된 기타 중쇄 가변 도메인 아부류에 비해 이들의 양호한 발현 및 안정성을 위해 선택된다.
이러한 높은 친화성으로 항체에 결합하는 프로테인 A의 능력은 생물 의약품에서 산업적 규모의 사용을 위한 구동 동기이다. 바이오-의약품에서 항체의 생산에 사용되는 프로테인 A는 통상 이. 콜라이(E. coli)에서 재조합에 의해 생산되고 천연 프로테인 A와 실질적으로 동일한 기능을 한다[참조: Liu HF et al., (2010) MAbs, 2(5): 480-499]. 가장 일반적으로, 재조합 프로테인 A는 항체의 정제를 위해 정지상 크로마토그래피 수지에 결합된다. 결합은 중성 또는 생리학적 조건(pH 7.0-7.6)에서 양호하지만, 최적 결합은 pH 8.2에서 발생한다. 용출은 통상 산성 pH로의 pH 이동을 통해 달성된다(글리신-HCl, pH2.5-3.0). 이것은 영구적으로 단백질 구조에 영향을 미치지 않고서 대부분 단백질-단백질 및 항체-항원 결합 상호작용을 효과적으로 해리시킨다. 그럼에도 불구하고, 일부 항체 및 단백질은 낮은 pH에 의해 손상되며, 낮은 pH 조건에서 지속 시간을 최소화하기 위해 1M 트리스-HCl, pH 8.0과 같은 알칼리 완충제의 1/10 용적을 첨가함으로써 회수 직후 중화하는 것이 최선이다.
다양하게 이용가능한 프로테인 A 크로마토그래피 수지가 있다. 이러한 배지 사이의 주요 차이점은 지지 매트릭스 타입, 프로테인 A 리간드 변형, 기공 크기 및 입자 크기이다. 이러한 인자의 차이는 압축성, 화학적 및 물리적 안정성, 확산 저항 및 흡착제의 결합능에서의 차이를 나타낸다[참조: Hober S et al., (2007), supra]. 프로테인 A 크로마토그래피 수지의 예는, 이로써 한정되지 않지만, 실시예에서 사용된 것과 같이 GE 헬스케어로부터의 MabSelect SuRe™ 프로테인 A 수지 및 MabSelect™ 프로테인 A 수지를 포함한다.
용어 "크로마토그래피"는 단백질 액체 크로마토그래피를 지칭하며, 종종 단백질의 혼합물의 분석 또는 정제에 사용하는 액체 크로마토그래피의 형태인 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)를 포함한다. 크로마토그래피의 다른 형태로서, 혼합물의 상이한 성분은 다공성 고체(정지상)을 통과하는 이동 액체(이동상)인 2개 물질에 대해 상이한 친화성를 가졌기 때문에 분리가 가능하다. FPLC에서, 이동상은 수용액 또는 "완충제"이다. 완충제 유속은 중력 유동하에서 작동되거나, 완충제의 조성이 2개 이상의 외부 저장소에서 상이한 비율로 유체를 유도하여 변화될 수 있지만, 일반적으로 일정한 속도로 유지하는 용적 이동식 펌프에 의해 제어될 수 있다. 정지상은 비드, 통상 가교결합된 아가로즈로 구성되고 원통형 유리 또는 플라스틱 컬럼에 팩킹된 수지이다. FPLC 수지는 용도에 따라서 광범위한 비드 크기 및 표면 리간드로 이용가능하다.
"친화성 크로마토그래피"의 프로세스는 정지상에 가교결합되는 리간드로서 친화성 시약의 사용을 수반하고, 특이적 분자 또는 분자 부류에 대한 결합 친화성을 갖는다. 리간드는 단백질 리간드와 같은 바이오-분자일 수 있고, 합성 분자일 수 있다. 리간드의 양 타입은 양호한 특이성을 갖는 경향이 있다. 생산시에 가장 일반적으로 사용되는 단백질 리간드는 친화성 시약 프로테인 A이다. 용액(예를 ㄷ르면, 목적하는 단백질을 함유하는 조세포 상청액)이 컬럼에 부하되는 친화성 크로마토그래피에서, 표적 단백질은, 오염물질(다른 단백질, 지질, 탄수화물, DNA, 안료 등)이 컬럼을 통과하게 하면서 통상 흡수된다. 흡착제 자체는 크로마토그래피 컬럼에 일반적으로 흡착되며; 흡착 단계는 배치식 결합 모드에서 교반 슬러리로서 흡착제를 사용하여 수행할 수 있다. 흡착 후, 후속 단계는 잔류 오염물을 제거하기 위해 흡착제를 세척하는 세척 단계이다. 이어서, 결합된 단백질은 반-순수 또는 순수한 형태로 용출된다. 용출은 일반적으로 단백질이 더 이상 고정된 리간드와 상호 작용하지 않고 방출되도록 완충제 또는 염 조성을 변경함으로써 달성된다.　일부 경우에, 목적하는 단백질은 친화성 수지에 결합할 수 없고, 친화성 크로마토그래피는 원치 않는 오염물질을 결합하고, 따라서 결합되지 않은 분획은 목적하는 단백질을 단리하기 위해 수집된다. 친화성 크로마토그래피는 고정층 또는 유동층에서 수행할 수 있다.
용어 "구배 모드 크로마토그래피"는 "용출" 완충제(완충제 B)의 비율이 0%에서 100%까지 단계적 또는 점진적으로 증가하는 크로마토그래피 방법을 지칭한다.
용어 "포획-용출 모드 크로마토그래피" 또는 "포획-용출 정제 모드" 또는 "포획-용출 정제"는, 용출 완충제(완충제 B)의 비율이 0%에서 100%까지 점진적 또는 단계적으로 증가하지 않으나, 포획 및 임의로 작동 완충제(완충제 A)를 사용한 세척 단계후 직접 100%를 적용하는 크로마토그래피 방법을 지칭한다.
CD3 및 CD38을 표적화하는 헤테로- 이량체성 면역글로불린의 개발
본 발명은 상기에 기재된 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함하고 추가로 인간 유전자 IGHV3-23*04(서열번호 37)의 생성물 또는 이로부터 유래된 중쇄 가변 프레임워크 영역을 포함하는 CD3 단백질 복합체에 결합하는 에피토프 결합 영역을 제공한다. 중쇄 가변 프레임워크 영역은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 상응하는 뮤린 항체 OKT3의 중쇄 가변 영역의 상응하는 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 변형은 아미노산 치환이다. 일반적으로, 7개 이하, 바람직하게는 6개 이하, 바람직하게는 5개 이하, 바람직하게는 4개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하, 가장 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 변형이 프레임워크 영역 내에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 CD3 단백질 복합체에 결합하는 에피토프 결합 영역을 제공하고, 여기서 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역의 아미노산 변형은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에서 아미노산 치환을 포함하고: 34, 48, 49, 58, 69, 71 및 73, 각 그룹 멤버의 아미노산 위치는 Kabat 넘버링에 따라 표시된다. 바람직하게는, 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역의 아미노산 치환은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: I34M, V48I, A49G, R58N, R58Y, I69L, A71T 및 T73K. 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역의 바람직한 아미노산 치환은 34, 49 및 71로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치이다. 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역의 더욱 바람직한 아미노산 치환은 I34M, A49G 및 A71T로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 양태에서, CD3 단백질 복합체에 결합하는 제1 폴리펩티드의 에피토프 결합 영역은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 인간 유전자로부터의 생성물 또는 이로부터 유래된 경쇄 가변 프레임워크 영역을 포함한다: IGKV1-39*01(서열번호 39) 및 IGKV3-20*01(서열번호 40). 경쇄 가변 프레임워크 영역은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 상응하는 뮤린 항체 OKT3의 경쇄 가변 영역의 상응하는 프레임워크 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 변형은 아미노산 치환이다. 일반적으로, 8개 이하, 바람직하게는 7개 이하, 바람직하게는 6개 이하, 바람직하게는 5개 이하, 바람직하게는 4개 이하, 바람직하게는 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하, 가장 바람직하게는 1개 이하의 아미노산 변형이 프레임워크 영역 내에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 CD3 단백질 복합체에 결합하는 에피토프 결합 영역을 제공하고, 여기서 상기 경쇄 가변 영역 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 변형은 4, 33, 34, 46, 47, 66, 71 및 96으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함한다. 바람직하게는, 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역의 아미노산 치환은 M4L, V33M, A34N, L46R, L47W, R66G, F71Y 및 P96F로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역의 바람직한 아미노산 치환은 4, 46 및 47로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치이다. 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역의 더욱 바람직한 아미노산 치환은 M4L, L46R, L47W 및 F71Y으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, CD3 단백질 복합체에 결합하는 제1 폴리펩티드의 에피토프 결합 영역은 상기 설명한 바와 같이 중쇄 가변 영역 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 변형, 및 상기 설명한 바와 같이 경쇄 가변 영역 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 79 내지 90, 91-95 및 64로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 바람직하게는 서열번호 64로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 서열을 포함하는, CD3 단백질 복합체에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 본 발명은 또한, 서열번호 96 내지 104, 105 내지 126, 127, 128 및 129로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 바람직하게는 서열번호 127로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경쇄 서열을 포함하는, CD3 단백질 복합체에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
이들 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 각각이 CD3 단백질 복합체에 결합할 수 있음을 감안할 때, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 본 발명의 항-CD3 결합 분자를 생성하기 위해 "혼합 및 매칭"될 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 항체의 CD3 결합은, 예를 들면, 실시예에 기재된 결합 검정을 이용하여 시험할 수 있다.
호모-이량체 형성에 비해 헤테로-이량체 형성을 촉진하기 위한 면역글로불린 불변 영역의 조작
헤테로-이량체성 면역글로불린의 생산 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 가장 간단한 방법 중 하나는 단일 세포에서 2가지 상이한 면역글로불린 쇄를 발현시키는데 의존한다[참조: WO95/33844, Lindhofer H & Thierfelder S]. 조작 없이, 이 간단한 방법은 목적하는 헤테로-이량체에 비해 호모-이량체 종의 형성에 의해 제한된다[참조: Kufer P et al., (2004) Trends Biotechnol., 22(5): 238-244]. 중쇄 헤테로-이량체화를 증강시키는 보조 기술을 이용할 때[참조: Merchant AM et al., (1998) Nat. Biotechnol., 16(7): 677-681], 보다 많은 헤테로-이량체 생산이 달성될 수 있지만, 상당량의 원하지 않는 호모-이량체의 생산을 초래할 수 있다[참조: Jackman J et al., (2010) J Biol Chem., 285(27):20850-9, Klein C et al., (2012) MAbs, 4(6):653-63]. 따라서, 본 발명은 종래 기술의 방법보다 우수한 헤테로-이량체화를 나타내는 생체 모방의 고유 개념에 기반하는, BEAT® 기술(PCT 공개번호: WO2012/131555)을 이용한다. BEAT 기술은 Fc 기반 이중특이적 항체를 위한 빌딩 블록으로서 사용될 수 있는 새로운 헤테로-이량체를 생산하기 위해 자연 발생 호모- 또는 헤테로-이량체성 면역글로불린 도메인 쌍 사이의 인터페이스 교환에 기반한다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 단백질-단백질 인터페이스를 갖는 변형된 CH3 도메인을 갖는 조작된 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 헤테로-이량체성 면역글로불린 또는 이의 단편을 제공하고, 여기서 상기 제1 폴리페티드의 단백질-단백질 인터페이스는 3, 5, 7, 20, 22, 26, 27, 79, 81, 84, 84.2, 85.1, 86, 88 및 90(IMGT® 넘버링)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드의 단백질-단백질 인터페이스는 84.4 위치 및 3, 5, 7, 20, 22, 26, 27, 79, 81, 84, 84.2, 85.1, 86, 88 및 90(IMGT® 넘버링)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 헤테로-이량체성 면역글로불린 또는 이의 단편을 제공하고, 여기서 제1 및 제2 폴리펩티드는 단백질-단백질 인터페이스를 갖는 변형된 CH3 도메인을 갖는 조작된 면역글로불린 불변 영역을 포함하며, 상기 제1 폴리페티드의 단백질-단백질 인터페이스는 3, 5, 7, 20, 22, 26, 27, 79, 81, 84, 84.2, 85.1, 86 및 90(IMGT® 넘버링)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드의 단백질-단백질 인터페이스는 85.1 및/또는 86 위치 및 3, 5, 7, 20, 22, 26, 27, 79, 81, 84, 84.2, 84.4, 88 및 90(IMGT® 넘버링)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 제1 조작된 면역글로불린 불변 영역에서 88 위치에서 치환된 아미노산 잔기는 제2 조작된 면역글로불린 불변 영역에서 85.1 및/또는 86 위치에서 치환된 아미노산 잔기와 상호작용하며, 각 그룹 멤버의 아미노산 위치는 IMGT® 넘버링에 따라 표시된다.
바람직하게는, 위치 88에서 제1 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환되는 아미노산 잔기는 88W 및 이들의 보존적 아미노산 치환이고, 여기서 상기 아미노산 위치는 MGT® 넘버링에 따라 표시된다. 더욱 바람직하게는, 위치 88에서 제1 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환되는 아미노산 잔기는 88W이고, 여기서 제1 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환된 추가의 아미노산 잔기는 3A, 20V, 20T, 20A, 20N, 20Q, 20E, 20S, 20K, 20W, 22A, 22G, 22T, 22L, 22I, 22V, 26R, 26Q, 26T, 26K, 26V, 26S, 26N, 26E, 79Y, 85.1T, 85.1M, 85.1A, 85.1S, 85.1R, 85.1H, 85.1K, 85.1F, 85.1C, 85.1N, 85.1W, 86S, 86I, 86T, 86H, 86Q, 86V, 86W, 86Y, 86F 및 90N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 아미노산 위치는 MGT® 넘버링에 따라 표시된다.
바람직하게는, 제2 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 위치 85 및 86에서 치환되는 아미노산 잔기는 85.1A, 85.1S, 85.1C 및 86S로 이루어진 그룹 및 이들의 보존적 아미노산 치환(MGT® 넘버링)으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 제2 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환되는 아미노산 잔기는 85.1A, 85.1S, 85.1C 및 86S로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 제2 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환된 추가의 아미노산 잔기는 3E, 5A, 7F, 20T, 22V, 26T, 81D, 84L, 84.2E, 88R 및 90R로 이루어진 그룹, 및 이들의 보존적 아미노산 치환(MGT® 넘버링)으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 위치 88에서 제1 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환되는 아미노산 잔기는 88W이고, 여기서 제1 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환된 추가의 아미노산은 3A, 20K, 22V, 26T, 79Y, 85.1S, 86V 및 90N이고, 85.1 및 86 위치에서 제2 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환되는 아미노산 잔기는 85.1A, 85.1S 또는 85.1A 및 86S이며, 제2 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환된 추가의 아미노산 잔기는 3E, 5A, 7F, 20T, 22V, 26T, 81D, 84L, 84.2E, 84.4Q, 88R 및 90R(IMGT® 넘버링)이다.
대체 실시형태에서, 본 발명은 헤테로-이량체성 면역글로불린 또는 이의 단편을 제공하고, 여기서 제1 및 제2 폴리펩티드는 단백질-단백질 인터페이스를 갖는 변형된 CH3 도메인을 갖는 조작된 면역글로불린 불변 영역을 포함하고, 제1 폴리펩티드의 단백질-단백질 인터페이스는 위치 20에서, 및 3, 5, 7, 22, 26, 27, 79, 81, 84, 84.2, 85.1, 86, 88 및 90으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 제2 폴리펩티드의 단백질-단백질 인터페이스는 위치 26에서, 및 3, 22, 27, 79, 81, 84, 85.1, 86 및 88로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함하고, 제1 조작된 면역글로불린 불변 영역에서 위치 20에서 치환된 아미노산 잔기는 제2 조작된 면역글로불린 불변 영역에서 위치 26에서 치환된 아미노산 잔기와 상호작용하며, 여기서 각 그룹 멤버의 아미노산 위치는 IMGT® 넘버링에 따라 표시된다.
바람직하게는, 제1 조작된 면역글로불린 쇄의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환되는 아미노산 잔기는 위치 20 및 22에서 아미노산 잔기를 포함하고, 3, 5, 7, 26, 27, 79, 81, 84, 84.2, 84.4, 85.1, 86, 88 및 90으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 위치에서 추가의 아미노산 잔기를 임의로 포함하고, 여기서 제2 조작된 면역글로불린 쇄의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환된 아미노산 잔기는 위치 26에서 및 3, 5, 7, 20, 22, 27, 79, 81, 84, 84.2, 84.4, 85.1, 86, 88 및 90으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 추가의 위치에서 아미노산 잔기를 포함하고, 각 그룹의 멤버의 아미노산 위치는 IMGT® 넘버링에 따라 표시된다. 바람직하게는, 제1 조작된 면역글로불린 쇄의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환되는 아미노산 잔기는 위치 20 및 22에서 아미노산 잔기를 포함하고, 3, 5, 7, 26, 27, 79, 81, 84, 84.2, 84.4, 85.1, 86, 88 및 90으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 위치에서 추가의 아미노산 잔기를 임의로 포함하고, 제2 조작된 면역글로불린 쇄의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환되는 아미노산 잔기는 위치 26 및 86에서 및 임의로 3, 5, 7, 20, 22, 27, 79, 81, 84, 84.2, 84.4, 85.1, 88 및 90으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 추가의 위치에서 아미노산 잔기를 포함하고, 각 그룹 멤버의 아미노산 위치는 IMGT® 넘버링에 따라 표시된다.
더욱 바람직하게는, 제1 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 위치 20에서 치환되는 아미노산 잔기는 20V, 20T, 20A, 20N, 20Q, 20K, 20S, 20W 및 20E으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 제1 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환된 추가의 아미노산 잔기는 3A, 22A, 22G, 22L, 22I, 22V, 22T, 26K, 26R, 26Q, 26T, 26V, 26S, 26N, 26E, 79Y, 85.1W, 85.1F, 85.1T, 85.1M, 85.1A, 85.1S, 85.1R, 85.1H, 85.1K, 85.1C, 85.1N, 86W, 86Y, 86S, 86I, 86H, 86Q, 86V, 86T, 86F, 88Q, 88L, 88V, 88R, 88E, 88T, 88I, 88Y, 88K, 88W 및 90N으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 제2 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 위치 26에서 치환된 아미노산 잔기는 26T 및 26E로 이루어진 그룹 및 이들의 보존적 아미노산 치환으로부터 선택되며, 아미노산 위치는 IMGT® 넘버링에 따라 표시된다.
가장 바람직한 실시형태에서, 위치 20에서 제1 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환되는 아미노산 잔기는 20K이고, 여기서 제1 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환된 추가의 아미노산 잔기는 3A, 22V, 26T, 79Y, 85.1S, 86V, 88W 및 90N이며, 위치 26에서 제2 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환되는 아미노산 잔기는 26T이고, 제2 조작된 면역글로불린 불변 영역의 단백질-단백질 인터페이스에서 치환된 추가의 아미노산 잔기는 3E, 5A, 7F, 20T, 22V, 81D, 84L, 84.2E, 84.4Q, 85.1C/S/A, 86S, 88R 및 90R(IMGT® 넘버링)이다.
실시예
실시예 1. 재료 및 방법
일시적 포유동물 세포 발현을 위한 발현 벡터 작제
상이한 폴리펩티드 쇄를 일부 또는 완전히 코딩하는 cDNA는 제네아트 아게(GENEART AG)(Regensburg, Germany)에 의해 합성하였고, 표준 분자생물학 기술을 사용하여 변형되었다. PCR 생성물은 적절한 DNA 제한효소를 사용하여 소화시키고, 정제하고, CMV 프로모터를 담지하는 변형된 pcDNA3.1 플라스미드(Invitrogen AG, Zug, Switzerland) 내에서 결찰시키고, 소 호르몬 폴리-아데닐화(poly(A))는 동일한 DNA 제한효소로 사전에 소화시켰다. 모든 폴리펩티드 쇄는 이러한 발현 벡터 내에서 독립적으로 결찰되었고, 분비는 뮤린 VJ2C 리더 펩티드에 의해 유도되었다.
재조합 단백질의 발현
항체, scFv-Fc 융합 단백질, BEAT 항체 및 항원은, 달리 언급하지 않는 한, 후술하는 바와 같이 발현되었다. 일시적 발현을 위해서, 동일량의 각 조작된 쇄 벡터는 폴리에틸렌이민(PEI; Sigma, Buchs, Switzerland)을 사용하여 현탁-순응된 (suspension-adopted) HEK293-EBNA 세포(ATCC-LGL 표준, Teddington, UK; Cat. No: CRL-10852)로 동시-형질감염시켰다. 통상적으로, 0.8-12×105/ml 밀도의 현탁액 중의 100ml의 세포를 DNA-PEI의 혼합물을 이용하여 형질감염시킨다. 각각의 조작된 쇄 유전자들을 코딩하는 재조합 발현 벡터를 숙주 세포내로 도입하는 경우, 면역글로불린 작제물은 4 내지 5일 동안 세포를 추가로 배양하여 배양 배지(EX-CELL 293, HEK293-혈청-비함유 배지(Sigma), 0.1% 플루로닉산, 4mM 글루타민 및 0.25㎍/ml의 제네티신 보충) 내로 분비되도록 함으로써 생산한다. 분비된 면역글로불린을 함유하는 세포-비함유 배양 상청액은 원심분리에 의해 제조한 다음, 멸균 여과를 수행하고, 추가 분석에 사용했다.
차등 단백질 A 친화성 크로마토그래피
생산 후, 세포-비함유 상청액은 0.2M 포스페이트 시트레이트 완충제(pH 6.0)으로 사전 평형화시킨 1ml HiTrap™ MabSelect SuRe™ 프로테인 A 컬럼에 부하하고, AKTApurifier™ 크로마토그래피 시스템(GE Healthcare Europe GmbH; 컬럼 카탈로그 번호: 11-0034-93)에서 1ml/분의 유속으로 작동시켰다. 작동 완충제는 0.2M 포스페이트 시트레이트 완충제(pH 6)였다. 목적하는 헤테로-이량체의 용출은 20mM 시트르산나트륨(pH 4)를 사용하여 수행한 반면, 호모-이량체 종은 0.1M 글리신(pH3.0)으로 용출시켰다. 용출 후, 280nm에서 OD를 판독하고, 목적하는 헤테로-이량체를 함유하는 분획을 풀링하고, 0.1용적의 1M 트리스(pH 8.0; Sigma)으로 중화시켰다. 상청액, 유동 및 용출 분획은 비환원 조건에서 SDS-PAGE에 의해 분석했다(NuPAGE 비스-트리스 4-12% 아크릴아미드, Invitrogen AG, Basel, Switzerland).
시차 주사 열량측정( DSC )
항체의 열 안정성은 열량 측정을 사용하여 비교했다. 열량 측정은 VP-DSC 시차 주사 마이크로열량측정기(MicroCal-GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland)로 수행했다. 세포 용적는 0.128ml, 가열 속도는 1℃/분 및 과잉 압력은 64p.s.i.로 유지했다. 모든 단백질 단편은 PBS(pH 7.4)에서 0.5-1mg/ml의 농도로 사용했다. 각 단백질의 몰 열 용량은 단백질이 생략된 동일한 완충제를 함유하는 이중 샘플과 비교하여 추정했다. 부분 몰 열 용량 및 용융 곡선은 표준 방법을 사용하여 분석했다. 써모그램은 소프트웨어 오리진(Origin) v7.0의 비-2상태 모델을 이용하여 추가로 분석하기 전에 기준선 보정하고 농도 정규화했다.
인간 IgG 아부류에 대한 예상 용융 프로파일은 공지되어 있고[참조: Garber E & Demarest SJ (2007) Biochem Biophys Res Commun, 355(3): 751-7], 모든 프로파일은 독립적 비폴딩에 상응하는 3개 비폴딩 변화 CH2, CH3 및 FAB 도메인을 함유한다. 4개 인간 IgG 아부류 중, IGHG1는 가장 안정적인 CH3 도메인(약 85℃)을 갖고, 다른 아부류 CH3 도메인은, 어떤 것도 70℃ 이하에서 용융하는 것으로 공지되어 있지 않지만, 덜 안정적이다. 유사하게는, 모든 아부류는 CH2 도메인 약 70℃의 융해 온도를 갖는 것으로 공지되어 있다.
모세관 겔 전기영동에 의한 순도 평가
비 환원된 샘플 제조
40㎍의 탈염된 단백질 샘플을 5mM의 요오도아세트아미드(Sigma)를 함유하는 SDS 샘플 완충제에 완충시켰다[참조: Beckman Coulter International S.A., Nyon, Switzerland; IgG Purity Kit, Cat. No: A10663]. 10kDa의 내부 표준을 샘플에 첨가했다. 상기 샘플-혼합물을 10분 동안 70℃에서 가열했다.
모세관 겔 전기영동
샘플 제조 후, 샘플은 220nM으로 설정한 포토다이오드 어레이 검출기(DAD)가 장착된 ProteomeLab PA 800[참조: Beckman Coulter International S.A., Nyon, Switzerland]에서 작동시켰다. 50㎛ ID×30.2cm의 베어-용융(bare-fused) 실리카 모세관(20.2cm 검출기 유효 길이)을 분리 매체로 사용했다. 시료 주입 및 분리는 SDS 분자량 겔 완충제에 역 극성으로 각각 5 및 15kV의 일정 전압에서 수행했다. 데이터는 2Hz의 속도에서 기록하고, 전류는 분리 동안 안정했다. 모세관 및 샘플은 25℃에서 열-제어했다.
SPR에 의한 친화성 측정
SPR 분석은 상이한 항체(뮤린 및 인간화 항체)의 결합 동역학의 회합 및 해리 속도 상수를 측정하기 위해 사용했다. 항체의 결합 동역학은 상온에서 비아코어 2000 장치(BIAcore-GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland)으로 측정하고, BiaEvaluation 소프트웨어를 사용하여 분석했다(버전 4.1, BIAcore-GE Healthcare Europe GmbH). 측정은 상업적 아민 커플링 키트(GE Healthcare Europe GmbH, Cat. No: BR-1000-50)를 사용하여 목적하는 리간드와 개별적으로 커플링된 CM5 센서 칩(GE Healthcare Europe GmbH, Cat. No: BR-1000-14)에서 수행했다. 단백질 G 리간드는 피어스(Pierce)에서 구입했다(Thermo Fisher Scientific-Perbio Science S.A., Lausanne, Switzerland, Cat. No: 21193).
데이터(센서그램: fc2-fc1)는 지시된 바와 같이 물질 이동의 존재 또는 부재하에 1:1 랭뮤어(Langmuir)에 적합시켰다. 포획 실험에서, 각 측정의 개시시에 실험 변수를 고려하기 위해, Rmax 값은 모든 적합에서 로컬로 설정했다. 해리 시간은 적어도 350초로 했다. 측정은 3중으로 수행하고, 참조용으로 농도 0의 샘플을 포함시켰다. Chi2 및 잔류 값 둘 다는 실험 데이터 및 개별 결합 모델 사이의 적합 품질을 평가하기 위해 사용했다.
FACS에 의한 HPB -ALL 세포에 대한 친화성 측정
HPB-ALL 세포(DSMZ, Braunschweig, Germany, Cat. No: ACC483)는 FACS 염색을 위한 CD3 양성 세포주로 사용되었다. HPB-ALL은 10% FCS, 100U/ml 페니실린 및 100㎍/ml의 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지에서 유지했다. 키메라 OKT3 항체 및 인간화 변이체의 100㎕ 희석 시리즈는 1% BSA 및 0.1% 나트륨 아지드(FACS 완충제로 지칭됨)이 보충된 PBS에서 4×105 HPB-모든 세포와 함께 아이스에서 45분 동안 인큐베이션했다. 무관한 (irrelevant) 인간 IgG1을 이소형 대조군으로 사용했고, 키메라 OKT3 항체를 양성 대조군으로서 사용했다. 세척 후, 세포는 1/200 희석된 항-인간 Fc-PE(EBioscience, Vienna, Austria)와 함께 배양했다. 이어서, 세포를 다시 세척하고, 200㎕ FACS 완충제에 재현탁시켰다. 각 샘플의 상대적 평균 형광은 FACSCalibur(BD Biosciences, Allschwil, Switzerland)로 측정했다. 그 결과는 키메라 OKT3 항체와 비교하여 HBP-ALL의 상대적 염색으로 도 9에 요약되어 있다.
시험관내 검정을 위한 세포주
인간 CD38 양성 세포주
CD38 항원을 발현하는 인간 세포는 PCT 공개공보 WO2005103083, WO2008047242, WO2011154453 및 WO2012092612에 기재되어 있다. 본원에 사용된 CD38 양성 인간 세포주는 하기와 같다:
안정한 재조합 CHO[CD38] 세포
인간 CD38을 코딩하는 유전자는 소우스 바이오사이언시스(Source Biosciences)(Berlin, Germany, 카탈로그 번호: IRAU37D11, 4309086)에서 주문했다. 인간 CD38은, 코작(kozak) 서열을 부가하는 프라이머, 개시 코돈, 이어서 5' 말단에 신호 펩티드(뮤린 V 리더), 및 3' 말단에 NheI 제한 부위를 사용하여 증폭시켰다. 앰플리콘은 NheI 및 HindIII를 사용하여 절단하고, pT1 발현 카세트, 자체 (in-house) 개발된 pcDNA3.1(Invitrogen AG) 유래 벡터에 클로닝시켰다. pT1의 발현 카세트는 2개 IRES(내부 리보솜 도입 부위)를 사용하여 폴리시스트로닉 mRNA에서 목적하는 유전자의 발현을 GFP 및 PAC 발현(퓨로마이신 내성 유전자)과 연결한다. 플라스미드의 미니프랩을 제조하고, 클로닝된 CD38 개방 판독 프레임은 DNA 서열분석에 의해 확인했다. CHO-S 세포(Invitrogen AG) 현탁액은 폴리에틸렌이민(JetPEI®, Polyplus-형질감염, Illkirch, France)을 사용하여 50ml 생물반응기 포맷(TubeSpin 50 생물반응기, TPP, Trasadingen, Switzerland)에서 형질감염시켰다. 이를 위하여 지수 성장 세포는 OptiMEM 배지(Invitrogen AG, 카탈로그 번호: 31985-047)에 파종했다. JetPEI®:DNA 복합체는 세포에 부가되었다. 내포작용을 위해 진탕(200RPM)하에 JetPEI®:DNA 복합체와 함께 세포를 37℃에서 5시간 인큐베이션한 후, 4mM Gln이 보충된 1용적의 PowerCHO2(Lonza, 판매업자 RUWAG Lifescience, Bettlach, Switzerland, 카탈로그 번호: BE12-771Q) 배양 배지를 세포 현탁액에 첨가했다. 이어서, 상기 세포는 37℃, 5% CO2 및 80% 습도에서 진탕 플랫폼에서 인큐베이션했다. 형질감염 1일 후, 세포는 96-웰 플레이트에 퓨로마이신(Sigma, 카탈로그 번호: P8833-25mg)을 함유하는 선택 배지에서 상이한 농도로 파종했다. 정적 조건 (static condition)에서 선택의 약 14일 후, 46개 높은 GFP 발현 세포 풀은 튜브스핀50 생물반응기(TubeSpin 50 생물반응기)를 사용하여 현탁 배양으로 확장시켰다. 성공적으로 현탁액에 순응되면, 상기 세포를 FACS로 CD38에 대해 분석했다. 균질한 CD38 염색 프로파일을 갖는 안정한 CHO [CD38] 클론을 선택하여 본원에서 사용했다.
다른 CD38 양성 세포주는 하기를 포함했다:
NCI-H929(ATCC-LGL 표준; 카탈로그 번호: CRL-9068).
Namalwa(ATCC-LGL 표준; 카탈로그 번호: CRL-1432)
U266(ATCC-LGL 표준; 카탈로그 번호: TIB-196)
RPMI 8226(ATCC-LGL 표준; 카탈로그 번호: CCL-155)
배양 조건: 10% 열-불활성화 FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen AG) 및 1% GlutaMAX-1(Invitrogen AG)이 보충된 RPMI 1640 배지.
Raji(ATCC-LGL 표준; 카탈로그 번호: CCL-86)
Daudi(ATCC-LGL 표준; 카탈로그 번호: CCL-213)
재조합 표적 항원
인간 CD3 감마-엡실론- Fc 융합 단백질
26-잔기 펩티드 링커(서열: GSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDGS; 서열번호 169)에 의해 인간 CD3 엡실론 세포외 영역(UniProt 수탁 번호: P07766, 잔기 22-118(서열번호 185))과 융합된 인간 CD3 감마의 세포외 영역을 코딩하는 cDNA(UniProt 수탁 번호: P09693 잔기 23-103(서열번호 184); UniProt Consortium (2013) Nucleic Acids Res., 41(Database issue): D43-7; http://www.uniprot.org/)는 먼저 GENEART AG (Regensburg, Germany)로 합성했다. 상기 합성 유전자는 표준 오버랩 PCR 기술을 사용하여 인간 IgG1 Fc 부분과 융합시키고, 인간 IgG1 Fc cDNA 주형은 제네아트 아게(Geneart AG)로부터 수득했다. 수득된 cDNA를 상기에 언급된 변형된 pcDNA3.1 플라스미드에 클로닝했다.
CD3 감마 엡실론-Fc 단백질(서열번호 170)의 일시적 발현을 위해, 재조합 벡터는 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 전술한 바와 같이 현탁액 순응된 HEK-EBNA 세포(ATCC-CRL-10852) 내로 형질감염시켰다. 이어서, CD3 감마-엡실론-Fc 작제물은 재조합 스트림라인 알프로테인(Streamline rProtein) A 배지(GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland)를 사용하여 세포-비함유 상청액으로부터 정제하고, 추가 분석을 위해 사용했다.
인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD3 엡실론 1-26_Fc 융합 단백질
인간 CD3 엡실론 펩티드 1-26 코딩하는 cDNA(UniProt 수탁 번호: P07766, 아미노산 23-48, 서열번호 171) 및 사이노몰구스 원숭이 CD3 엡실론 펩티드 1-26을 코딩하는 cDNA(UniProt 수탁 번호: Q95LI5, 아미노산 22-47, 서열번호 172)는 각각 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD3 엡실론 세포외 영역에 대해 제네아트 아.게.(GENEART A.G.)로부터 수득된 합성 cDNA로부터 PCR 증폭시켰다. 상기 증폭된 생성물은 후속적으로 표준 오버랩 PCR 기술을 사용하여 인간 IgG1의 Fc 부분에 융합시켰다. 인간 IgG1 Fc cDNA 주형은 제네아트 아게(Geneart AG)로부터 수득했다. 수득된 cDNA를 상기에 언급된 변형된 pcDNA3.1 플라스미드에 클로닝했다.
인간 및 사이노몰구스 CD3 엡실론 작제물(각각 서열번호 173 및 174)의 일시적 발현을 위해, 재조합 벡터는 상술한 바와 같이 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 현탁액 순응된 HEK-EBNA 세포(ATCC-CRL-10852) 내로 형질감염시켰다. 이어서, CD3 엡실론 융합 작제물은 재조합 스트림라인 알프로테인 A 배지(GE Healthcare Europe GmbH, Glattbrugg, Switzerland)를 사용하여 세포-비함유 상청액으로부터 정제하고, 추가 분석을 위해 사용했다. 상기 2개 융합 단백질은 본원에서 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD3 엡실론 1-26_Fc 융합 단백질로 지칭된다.
인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD38 세포외 영역
인간 CD38을 위한 cDNA는 소우스 바이오사이언시스(Source Biosciences)(Erwin-Negelein-Haus, Germany, 카탈로글 번호: IRAU37D11, 4309086)에서 수득했고, 이의 세포외 영역(UniProt 수탁 번호: P28907 잔기 43-300)을 PCR 증폭시키고, pcDNA3.1(Invitrogen AG) 유래된 자체 발현 벡터에 클로닝시켰다. 상기 발현 벡터는 코작 서열 및 개시 코돈, 이어서 5' 말단에 뮤린 VJ2C 리더 펩티드 및 이의 멀티플 클로닝 부위의 3' 말단에 6-His-태그를 포함했다. 6-His-태그(서열번호 175)에 융합된 인간 CD38의 가용성 세포외 영역은 다음과 같이 발현되고 정제되었다: HEK 세포, 0.1% 플루오닉산(Invitrogen AG), 발현 벡터 및 폴리에틸렌이민(JetPEI®, Polyplus-형질감염, Illkirch, France)을 함유하는 1용적의 RPMI 1640 배지(PAA Laboratories, 카탈로그 번호: E15-039)는 37℃, 5% CO2 및 80% 습도에서 진탕 플라스크에서 인큐베이션했다. 6mM의 글루타민이 보충된 1용적의 ExCell293 배지를 4시간 후에 혼합물에 첨가하고, 총 5일간 추가로 인큐베이션했다. 생산 후, 세포-비함유 상청액을 원심분리하여 제조하고, 0.2㎛ 필터를 사용하여 여과하고, pH는 트리스 1M pH 8.7을 사용하여 7.4(4℃)로 조절했다. Ni-세파로즈 엑셀 비드(GE Healthcare, 카탈로그 번호: 17-3712-03)를 용액에 첨가하고, 교반하에 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 상기 용액은 중력-유동 정제를 위해 에코노-컬럼(Econo-Column)(Bio-Rad Laboratories AG, Reinach, Switzerland, 카탈로그 번호: 737-4252)에 부하했다. 상기 비드를 PBS(2x) 및 20mM 이미다졸로 세척하고, 단백질을 PBS, 500mM 이미다졸로 용출시켰다. 용출된 분획을 풀링하고, 완충제를 PBS로 2개 투석 단계로 4℃에서 교환했다. 정제된 인간 CD38 세포외 영역은 0.22㎛의 시린지 필터를 사용하여 여과했다.
상술한 바와 같은 방법을 사용하여, 6-His-태그(서열번호 176)에 융합된 사이노몰구스 원숭이 CD38 항원의 가용성 세포외 영역을 클로닝, 발현 및 정제했다.
시험관내 T 세포 재지시 사멸 검정
말초혈 단핵구의 제조
말초혈 단핵구(PBMC)를 제조하기 위해, 인간 백혈구를 함유하는 혈액 필터를 스위스, 라 샤우-드-폰즈(La Chaux-de-Fonds)의 혈액 수집 센터(Centre de Transfusion Sanguine et Laboratoire de Serologie, rue Sophie-Mairet 29, CH-2300)에서 수집했다. 세포는 10U/ml의 리퀴민(Drossapharm AG, Lucern, Switzerland)를 함유하는 60ml의 PBS로 역-플러싱하여 (back-flushing) 필터로부터 제거했다. 이어서, PBMC는 50ml Blood-Sep-Filter 튜브(Brunschwig, Basel, Switzerland)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 정제했다. 상기 튜브는 800g에서 20분 동안 실온에서 원심분리(중단 없이)하고, 세포를 인터페이스로부터 수집했다. 상기 세포는 FBS 또는 인산염 완충 염수(PBS)의 부재하에 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute)(RPMI, PAA Laboratories, Pasching, Austria) 배지로 3회 세척했다. PBMC를 RDL 배지(10% 열 불활성화된 소 태아 혈청(FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI)에서 10e6 세포/mL로 재현탁시키고, 검정 전에 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 밤새 배양했다.
T 세포 제조
T 세포 정제는 PBMC를 분리한 직후에 범-T (pan-T) 세포 단리 키트 II(Myltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany, 카탈로그 번호: 130-091-156)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행했다. 정제 후, T 세포를 10e6 세포/mL로 RDL 배지에 재현탁시키고, 검정 전에 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 밤새 배양했다.
검정 판독
매우 유사한 결과를 제공하는 2개의 상이한 판독은 재지시된 사멸을 정량하기 위해 사용했다.
본원에서 RDL-FACS 방법으로 지칭되는 유세포 분석법은 문헌[참조: Schlereth B et al.((2005) Cancer Res, 65: 2882-2889), Moore PA et al. ((2011) Blood, 117(17): 4542-51) 및 문헌[Friedrich M et al.((2012) Mol Cancer Ther, 11: 2664-2673]에 기재된 형광-세포분석에 기반한다. 표적 세포를 수거하고, 계수하고, 1회 세척하고, PBS + 1μM 카복시형광 석신이미딜 에스테르(CFSE, Sigma)에 5×10e6 세포/mL로 재현탁시켰다. 세포를 5분마다 부드럽게 교반하면서 37℃에서 15 분 동안 인큐베이션했다. CFSE 부하된 세포를 RDL 배지로 3회 세척하고, RDL 배지에 2×10e5 세포/mL로 재현탁시켰다. PBMC를 수거하고, 계수하고, RDL 배지에 2×10e6 세포/mL로 재현탁시켰다. RDL 배지에서 항체의 연속 희석액(3× 용액)을 제조했다. 표적 세포(50㎕/웰), T 세포(50㎕/웰) 및 3× 항체 용액(50㎕/웰)을 평저 96 웰 플레이트(TPP, Trasadingen, Switzerland)에 분배했다. 효과기:표적 비율은 10:1이었다. 플레이트를 37℃로 5% CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 플레이트를 300g에서 3분간 원심분리하고, 상청액은 플레이트를 플리킹하여 제거했다. 플레이트를 200㎕의 PBS로 1회 세척하고, 다시 원심분리하고, PBS를 제거했다. 아큐테이즈(Invitrogen AG)의 미리 가온한 용액을 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 10분간 인큐베이션했다. 분리된 부착 세포는 RDL 배지 100㎕의 첨가 후에 상하 피펫팅에 의해 재현탁시켰다. 상기 용액을 U자 바닥 96-웰 플레이트(TPP)에 옮겼다. U자 바닥 플레이트를 300g에서 3분간 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 7-AAD(Becton Dickinson AG, Allschwil, Switzerland)가 1/40 희석으로 보충된 차가운 FACS 완충제(PBS+2% FBS+10% Versene) 200㎕에 재현탁시켰다. 상기 플레이트는 Guava easyCyte™ 유세포 분석기(Millipore AG, Zug, Switzerland)로 즉시 획득했다. 각 웰의 경우, 살아있는 표적 세포의 절대 수는 Flowjo® 소프트웨어(Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany)을 사용하여 CFSE 양성 7ADD 음성 모집단에 대해 게이팅에 의해 결정했다. 각 샘플에 대한 특이적 세포독성의 백분율은 표적 세포만이 인큐베이션된 조건을 기준선으로 사용하여 측정했다. EC50 값은 프리즘 소프트웨어 (GraphPad software, La Jolla, CA, USA)와 함께, 비선형 가변 슬로프 회귀 방법을 사용하여 측정했다. 특이적 재지시된 용해(RDL)의 비율은 시험 항체가 첨가되는 조건에 항체 부재하의 조건의 세포 독성의 백분율을 빼서 계산했다.
세포 생존률을 평가하기 위해 비색 방법에 기반한 RDL-MTS 방법으로 본원에서 지칭되는 세포 생존율 방법은 문헌[참조: Buhler P. et al.((2008) Cancer Immunol Immunother, 57: 43-52, Labrijn AF et al. ((2013) Proc Natl Acad Sci USA, 110(13): 5145-50] 및 PCT 공개공보 제WO2012143524호에 기재되어 있다. 표적 세포를 수거하고, 계수하고, 1회 세척하고, RDL 배지에 2×10e5 세포/ml로 재현탁시켰다. PBMC를 수거하고, 계수하고, RDL 배지에 2×10e6 세포/ml로 재현탁시켰다. RDL 배지에서 항체 연속 희석물(3×용액)을 제조했다. 표적 세포(50㎕/웰), T 세포(50㎕/웰) 및 3×항체 용액(50㎕/웰)을 평저 96 웰 플레이트(TPP)에 분배했다. 효과기:표적 비율은 10:1이었다. 플레이트를 37℃로 5% CO2 인큐베이터서 48시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 상청액을 제거하고, PBMC를 제거하기 위해 200㎕의 플레이트를 PBS로 3회 세척하고, 100㎕의 RDL 배지를 각 웰에 첨가했다. 판독은 셀티터(CellTiter) 96® 키트(Promega AG, Dubendorf, Switzerland)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행했다. 간단하게는, 10-20㎕의 MTS 시약을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃로 5% CO2 인큐베이터에서 2-6시간 인큐베이션했다. 바이오텍 시너지 플레이트 판독기(BioTek AG, Luzern, Switzerland)로 490nM 흡광도를 판독했다. 특이적 사멸의 퍼센트는 다음 공식을 사용하여 계산했다: 특이적 사멸 = 100×[(SD-Sp)/(SD-MD)]. SD는 표적 세포가 단독 인큐베이션되는 자연 사멸 조건에서 측정된 흡광도이다. SP는 각 시험 조건에서 측정한 흡광도(표적 세포 + PBMCs + 항체)이다. MD는 표적 세포를 3회 동결 및 해동 사이클에 의해 용해시킨 최대 사멸 조건에서 측정한 흡광도이다. 특이적 재지시된 용해(RDL)의 비율은 시험 항체가 첨가된 조건으로부터 항체 부재하의 조건의 백분율 특이적 세포독성을 빼서 계산했다. EC50 값은 프리즘 소프트웨어(GraphPad software)와 비선형 가변 슬로프 회귀 방법을 사용하여 측정했다.
실시예 2: 인간 CD3 항원 및 CD38 항원을 표적화하는 항원 결합 부위
2.1 인간 CD3 항원에 대한 항원 결합 부위
인간 CD3 엡실론 아단위는 이중특이적 관여 (enegagement)에 의한 T 세포 재지시 사멸을 유도하도록 선별되었다.
2.1A 마우스 OKT3 항체의 인간화 변이체
본원에서 사용된 항-인간 CD3 엡실론 항원 결합 부위는 마우스 OKT3 항체(Muromonab-CD3, 상표명 Orthoclone OKT3, Janssen-Cilag에 의해 판매되었으나 그 후 중단되었다; 각각 서열번호 38 및 41의 뮤린 가변 중쇄 및 경쇄 도메인)로부터 유래한다. OKT3 뮤린 가변 도메인은 인간화되었고, scFv 및 FAB 단편으로 포맷되었다.
인간화는 FAB 및 scFv 포맷 모두에 적합한 매우 안정한 인간화된 변이체를 생산하기 위해 문헌[참조: Jung S & Pluckthun A (1997, Protein Eng, 10(8): 959-66)]에 기재된 방법에 따랐다. 상기 방법은 Herceptin® 항체(rhuMAbHER2, huMAB4D5-8, 트라스트주맙(trastuzumab) 또는 상표명 Herceptin®; 미국 특허 번호 제5,821,337호; 각각 서열번호 20 및 21의 가변 중쇄 및 경쇄 도메인)에서 발견되는 VH/VL 도메인의 매우 안정한 쌍의 사용을 가능하게 하고, 고정된 프레임워크로 인간화 프로세스의 작업흐름(workflow)을 따른다[참조: Almagro JC & Fransson J (2008), Front Biosci, 13: 1619-33]. Herceptin® 항체가 본래 생식세포계 프레임워크 VH3 및 VK1의 매우 안정한 인간 패밀리로부터 유래되었기 때문에, 이들 2개 패밀리로부터 생식세포계 프레임워크는 고정된 프레임워크의 공급원으로 동일하게 사용될 수 있다. 대안적으로, 인간 VK3 생식세포계 경쇄 프레임워크 패밀리는 VK1 대신에 사용될 수 있는데, 이는 또한 우수한 안정성 특성을 갖기 때문이다[참조: Ewert S et al., (2003) J Mol Biol, 325: 531-553]. 마우스 항체에 추가하여, 인간 항체는 안정성을 개선시키기 위해 이러한 고정된 프레임워크 방법을 사용하여 조작될 수 있다. 각각 서열번호 37, 39 및 40을 갖는 인간 생식세포계 프레임워크 IGHV3-23*04, IGKV1-39*01 및 IGKV3-20*01의 사용이 바람직하다(IMGT®에 따른 참조문헌[참조: the international ImMunoGeneTics information system (Lefranc MP et al. (1999) Nucleic Acids Res, 27(1): 209-12; Ruiz M et al. (2000) Nucleic Acids Res, 28(1): 219-21; Lefranc MP (2001) Nucleic Acids Res, 29(1): 207-9; Lefranc MP (2003) Nucleic Acids Res, 31(1): 307-10; Lefranc MP et al., (2005) Dev Comp Immunol, 29(3): 185-203; Kaas Q et al., (2007) Briefings in Functional Genomics & Proteomics, 6(4): 253-64; http://www.imgt.org]).
이러한 목적으로, Herceptin® 항체의 가변 도메인 중의 CDR을 각각 마우스 OKT3 항체로부터의 CDR로 대체하고 마우스 OKT3 항체의 키메라에 대해 벤치마킹한 제1 인간화 항체를 작제했다(서열번호 130 및 131의 가변 중쇄 및 경쇄, 본원에서 키메라 OKT3 항체로서 지칭됨).
원형 항체 (prototype antibody)(서열번호 79 및 96을 갖는 가변 중쇄 및 경쇄, VH/VL로 약칭됨)는 일시적 발현 시험에서 증가된 생산 수준, 및 시차 주사 열량측정법에 의해 측정하였을 때에 증가된 FAB 안정성을 가졌지만, 인간 CD3 엡실론 양성 T 세포 종양 세포주인 HPB-ALL 세포(FACS 실험에서 중간 형광 강도로서 평가됨, 재료 및 방법 섹션 참조)에 대한 결합을 갖지 않았다(도 1A).
가변 도메인의 제1 원형 쌍의 3D 모델에 기반하여, 역 돌연변이체의 서브세트(CDR 이식된 Herceptin® 원형으로부터 마우스 OKT3 서열까지)을 선별하였고, 시험했다: 가변 중쇄 도메인 내의 I34M, V48I, A49G, R58N, R58Y, I69L, A71T 및 T73K, 및 가변 경쇄 내의 M4L, V33M, A34N, L46R, L47W, R66G, F71Y 및 P96F(Kabat 넘버링). R58N 치환은 CDR 이식된 Herceptin® 원형-대-마우스 OKT3 돌연변이에 상응하고, R58Y 치환은 CDR 이식된 Herceptin® 원형-대-인간 IGHV3-23*04 생식세포계 치환에 상응한다. 치환의 조합에 관한 조작 전략은 CDR 영역 및/또는 가변 도메인 팩킹(packing) 및/또는 면역성에 대한 이들의 추정 영향의 관점에서 상이한 치환의 상보성에 기반했다.
제1 접근법에서, 모든 후보는 인간 IgG1 항체로서 포맷했다. 최고 변이체는 FACS에 의하여 발현 수준, FAB 단편 열-안정성 및 HPB-ALL 세포에 대한 결합능에 따라 선택되었다. 최고 인간화된 변이체는 G65S 또는 N82aS 치환을 사용하여 무효화된 이들의 VH 도메인 내에 존재하는 프로테인 A 결합 부위를 갖는다. 이러한 조작 단계는 항-CD3 호모-이량체를 함유하지 않는 안전한 T 세포 재표적화 BEAT 항체를 추가로 생산하기 위해 필요했다.
M4L, L46R, L47W 및 F71Y의 VL에서 역 돌연변이와 함께 I34M, A49G 및 A71T의 VH에서 역 돌연변이는 친화성을 회복했다. 가변 도메인의 최고 조합은 VH8/VL4, VH8/VL8, VH11/VL4 및 VH11/VL8이었는데, 이들은 모체 세포 결합의 대부분을 유지했기 때문이다(도 1A-C). 또한, VH8/VL8(각각 서열번호 131 및 132의 가변 도메인) 및 VH11/VL8(각각 서열번호 133 및 132의 가변 도메인)은 증강된 FAB 안정성을 가졌다(각각 +2.8℃ 및 +1.6℃, 도 1D).
최종적으로, 최고 인간화 변이체는 scFv-Fc 융합으로 재포맷되었고, 일시적으로 발현되었다. 변이체는 이 포맷에서 이들의 상대적 친화성, 안정성, 일시적 형질감염에서의 발현 수준으로 등급화했다(도 1E). scFv-Fc 융합 포맷에서 가변 도메인의 최고 조합은 항체 포맷에서 동정된 조합과 유사했다: VH8-VL4(서열번호 135를 갖는 scFv 단편) 및 VH8-VL8(서열번호 136을 갖는 scFv 단편). scFv 단편 둘 다는 scFv-Fc 융합 포맷으로 양호한 열 안정성을 가졌다(도 1F).
2.1B 마우스 SP34 항체의 인간화 변이체
마우스 항체 SP34는 1985년에 최초로 기재되었다[참조: Pessano S et al., (1985) EMBO J, 4(2):337-44]. 이는 HPB-ALL 세포로부터의 변성된 단백질 추출물로 면역화된 마우스로부터 수득된 하이브리도마에 의해 생산되었고, 상기 항체는 인간 특이성 및 사이노몰구스 원숭이에 대해 교차-반응성을 갖는다.
상기 본 실시예에 기재된 방법 및 작업에 따라, 서열번호 1의 VH 도메인 및 서열번호 2의 VL 도메인을 갖는 뮤린 SP34 항체에 대한 인간화된 VH 및 VL 도메인은 각각 VH3-23 및 VK3 생식세포계 프레임워크 상으로 CDR 이식을 통해 조작했다. 수득되는 VH3 기반 가변 도메인은 BEAT 항체 포맷에서 이들의 용도에 따라 G65S 또는 N82aS(Kabat 넘버링) 치환을 사용하여 프로테인 A 결합을 추가로 무효화할 수 있다.
이 목적으로, 생식세포계 VH3 중쇄 도메인 및 생식세포계 VK3 경쇄 도메인을 갖는 인간 항체의 가변 도메인 내의 CDR이 각각 마우스 SP34 항체로부터 CDR로 대환되어 있는 제1 인간화 항체를 작제했다. 수득되는 인간화 항체는 추가의 친화성 개선을 위한 개시점을 사용했고, SP34 항체의 키메라에 대해 벤치마킹했다(각각 서열번호 137 및 138의 중쇄 및 경쇄, 본원에서 키메라 SP34 항체로서 지칭됨).
원형 항체(서열번호 91 및 105의 가변 중쇄 및 경쇄, 및 VH1/VL1로 약칭됨)는 인간 CD3 엡실론 1-26_Fc 융합 단백질에 대해 낮은 결합을 가졌다(SPR에 의해 평가됨, 재료 및 방법 섹션 및 도 2A 참조).
가변 도메인의 제1 원형 쌍의 3D 모델에 기반하여, CDR 이식된 인간 생식세포계 VH3/VK3 원형 및 마우스 SP34 서열(인간-대-마우스 또는 마우스-대 인간 치환체) 간의 역 돌연변이 또는 합리적으로 디자인된 아미노산 변화에 상응하는 치환의 서브세트를 선별했다. 하기 변화를 수행했고, 다양한 조합으로 시험했다: 가변 중쇄 도메인에서 W100eF 및 W100eY, 및 가변 경쇄 도메인에서 A2I, S25A, T27A, G27aA, V27cA, T28A, T29A, S30A, N31A, Y32A, E38Q, F44P, G46L, T51A, N52A, K53A, R54A, P56A, L66G, D69T, F87Y, Q89A, W91F, Y92A, S93A, N94A, 및 Q100G(Kabat 넘버링; 도 2A 참조). 치환의 조합에 관한 조작 전략은 CDR 영역 및/또는 가변 도메인 팩킹 및/또는 면역성에 대한 이들의 추정적 영향 및/또는 포유동물 세포에서 일시적 발현에 대한 영향의 관점에서 상이한 치환의 상보성에 기반했다.
제1 접근법에서, 모든 후보는 인간 IgG1 항체로 포맷하고, 그 후에 G65S를 사용하여 무효화되는 이들의 VH 도메인 내에 존재하는 프로테인 A 결합 부위를 갖는 일부 변이체로 scFv-Fc 융합 단백질 포맷(도 2B)에서 추가로 시험했다. 최고 인간화 후보는 SPR에 의하여 발현 수준 및 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD3 엡실론 1-26_Fc 융합 단백질에 대한 결합능에 따라 선별되었다.
놀랍게도, scFc로서 재포맷되는 경우, SP34 키메라 및 H1L21은 IgG1 포맷과 비교하여 발현의 현저한 손실을 유도한다(도 3). 그러나, scFv-Fc 발현은 VH에서 치환 W100eY 및 VL에서 W91F의 조합에 의해 증강했다(도 2B).
CD3 기반 이중특이성의 제조능을 추가로 개선시키기 위해, 인간화 SP34 scFv는 따라서 추가로 조작했다. SP34 scFv-Fc 발현에 영향을 미치는 중요 위치를 동정하기 위해, 알라닌 스캔을 VL21 CDR에서 수행했다. 하기 변화를 수행했다: T27A, G27aA, V27cA, T28A, T29A, S30A, N31A, Y32A, N52A, K53A, R54A, P56A, L90A, Y92A, S93A, N94A 및 L95A. 흥미롭게도, 위치 29, 30(VH1/VL26 서열번호 139) 및 95(VH1/VL34 서열번호 140)에서의 치환만이 scFv-Fc 발현의 현저한 증가를 유도했고(도 4), 더욱이 이들 돌연변이는 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD3 엡실론에 대한 완전한 결합을 유지하는 것들 뿐이었다.
이들 결과에 기반하여, 보다 많은 치환을 경쇄의 위치 29, 30 및 95에서 시험했다.
위치 29 및 30은 모든 상이한 가변 경쇄 패밀리에서 초가변성을 나타내기 때문에, 이들 2개 위치는 부위 지시된 PCR에 의해 랜덤으로 돌연변이되었다. 생산된 모든 돌연변이로부터, 치환 T29A, T29E, T29S, S30A 및 S30D만이 인간 CD3 엡실론에 대한 결합을 유지하면서 일시적 발현 수준을 현저하게 개선시켰다(도 5a 및 5b).
상이한 접근법에서, 낙타 (canonical) 구조 잔기로서 당해 기술분야에 공지된 L95를 가변 람다 패밀리 내의 이와 매우 동일한 위치에서 가장 빈번하게 발견되는 잔기로 치환시켰다. 하기 변화를 수행했다: L95A, L95G, L95T, L95S, L95D 및 L95N. 예상치 않게, L95G 및 L95T만이 표적에 대한 결합을 유지하면서 발현을 현저히 개선시켰다(도 5c).
이 연구로부터, 몇몇 인간화 SP34 기반 BEAT를 설계하고, 발현 및 CD3 엡실론에 대한 결합에 대해 시험했다. 이들 모든 작제물 중에서, 이중특이성 함유 H5L65(서열번호 69) 및 H5L67(서열번호 70) scFv는 H5L32 scFv 기반 BEAT 대조군과 비교하여 발현의 2배 증가를 나타냈다(도 6).
H5L65 및 H5L67은 IgG1 또는 scFv-Fc로서 DSC에 의해 추가로 특성화되었고, H5L32, H1L21 및 SP34 키메라와 비교한다. H5L65은 IgG1보다 우수한 열안정성을 나타냈지만, 보다 흥미롭게는 scFv-Fc 포맷에서 다른 인간화 변이체와 비교하여 5 내지 2℃의 증가를 나타냈다(표 1). 따라서, 개선된 항체의 생체내 안정성은 시험관 내와 마찬가지로 증가했다.
SP34 버젼 Fab
Tm (℃) 		IgG ( Fab )
Tm (℃) 		scFvFc
Tm (℃)
SP34 키메라 66.9 66.7 N/A
hSP34 H1/L21 75.1 73.1 56.7
hSP34 H5/L32 77.5 75.9 59.7
hSP34 H5/L65 78.1 77.3 61.6
hSP34 H5/L67 77.4 76.5 59.9
항원 결합 및 재조합 발현과 관련하여 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 바람직한 조합은 다음과 같다: 경쇄 도메인 VL21(서열번호 46), VL32(서열번호 47), VL65(서열번호 48) 및 VL67(서열번호 49)와 쌍을 이루는 VH1(서열번호 42) 또는 VH2(서열번호 43) 또는 VH3(서열번호 44) 또는 VH5(서열번호 45).
2.2 인간 CD38 항원에 대한 항원 결합 부위
CD38은 조혈 세포 및 고형 조직에서 일반적으로 발견되는 타입 II 막관통 당단백질이다. CD38은 또한 다양한 악성 조혈성 질환에서 발현된다. CD38 양성 암 세포를 사멸시키도록 T 세포를 재지시하는 이중특이적 항체는, 다발성 골수종, B-세포 만성 림프구성 백혈병, B-세포 급성 림프구성 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈종, 1차 전신성 아밀로이드증, 맨틀-세포 림프종, 프로-림프구성/골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 소포성 림프종, NK-세포 백혈병 및 혈장-세포 백혈병을 포함하는 다양한 악성 혈액 질환의 치료에 유용할 수 있다. 몇몇 항-CD38 항체들은 연구 시약 또는 치료 후보로서 기재되어 있다(PCT 공개공보 제WO2006099875호). 이 중에서, 최고 특정화된 항-인간 CD38 항체는 OKT-10 및 HB-7 마우스 하이브리도마이다[참조: Hoshino S et al., (1997) J Immunol, 158(2): 741-7].
제1 접근법에서, 항-인간 CD38 항원 결합 부위는 마우스 하이브리도마 OKT10(각각 서열번호 50 및 53을 갖는 가변 중쇄 및 경쇄) 또는 HB-7(각각 서열번호 51 및 서열번호 54를 갖는 가변 중쇄 및 경쇄) 및 이들의 인간화된 버전으로부터 유래될 수 있고, 이는 FAB 또는 scFv 단편으로 추가로 포맷될 수 있다. 실시예 2.1에 기재된 방법 및 작업흐름을 따라, HB-7 하이브리도마에 대한 인간화된 VH 및 VL 도메인은 각각 VH3-23 및 VK1 생식세포계 프레임워크로 CDR 이식을 통해 조작될 수 있다.
제2 접근법에서, 문헌[참조: Almagro JC & Fransson J (Front Biosci, (2008) 13: 1619-33)]에 기재된 소위 최고-적합 인간화 방법에 따라서, HB-7 하이브리도마에 대한 최고-적합 인간화 VH 및 VL 도메인은 각각 IGHV4-59*03 및 IGKV1-NL1*01 생식세포계 프레임워크로의 CDR 이식을 통해 조작되었다(IMGT® 상기 참조). 상이한 정도의 역 돌연변이를 갖는 인간화 VH 및 VL 변이체를 인 실리코(in silico)에서 조사하였고, 인간화 VH 및 VL의 하나의 바람직한 선별은 인간 IgG1 포맷으로 일시적으로 발현되었고, 본원에서 인간화 HB-7 최고-적합 VH(서열번호 56) 및 VL(서열번호 57) 도메인으로 지칭된다. 하기 마우스 역 돌연변이가 도입되었다: (VH) S35H, I37V, I48L, V67L, V71K, T73N, F78V, Y91F 및 (VL): M4L, L48I, Y49S, T69K(Kabat 넘버링).
인간화 HB-7 최고-적합 항체(서열번호 141의 중쇄 및 서열번호 142의 경쇄)는 FACS에 의해 CHO[CD38] 제조합 세포를 염색했다(데이터는 제시되지 않음). 인간화 HB-7 최고-적합 항체는, SPR에 의해 검정하는 경우, 키메라 HB-7 항체(서열번호 143의 중쇄 및 서열번호 144의 경쇄)와 유사하게 CD38 세포외 영역에 대한 결합 친화성을 갖는다(각각 3.6 및 2.5nM의 KD; 도 7A(키메라) 및 도 7B(인간화)). 놀랍게도, 인간화 HB-7 최고-적합 항체는 열량계 프로파일로 판단한 바와 같이 키메라 HB-7 항체와 비교하여 FAB 단편 안정성에서 현저한 증강(+14.6℃)를 나타냈다(76.4℃(키메라) vs 91.0℃(인간화), 도 7F).
제3 접근법에서, 인간 CD38 세포외 도메인 및 인간 CD38+ 세포로 면역화시킨 마우스는 인간 CD38에 대한 신규한 하이브리도마 후보를 생성하기 위하여 사용되었다. 하이브리도마를 생성하는 방법은 공지되어 있고, 본원에서 사용된 방법은 PCT 공개번호 제WO2013008171호에 개시된 방법과 유사하다. 9G7 마우스 항체 후보는 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD38(각각 서열번호 52 및 55의 가변 중쇄 및 경쇄) 둘 다에 대해 높은 친화성을 갖는다. 상기 마우스 항체는 상기 본 실시예에 기재된 방법에 따라 먼저 인간화되었다. 최고-적합 접근법을 사용하여, 생식세포계 VH 프레임워크 IGHV2-5*09 및 VK 프레임워크 IGKV1-33*01(IMGT® 상기 참조)는 인간화 프로세스를 위한 개시점으로 선택되었다. CDR 이식 후에, 제1 항체 원형(인간 IgG1 이소형으로 포맷됨, 서열번호 145의 중쇄 및 서열번호 146의 경쇄)은 인간 CD38에 강력한 결합을 나타냈는데, 이는 SPR로 판단한 바와 같이 마우스 모체 항체보다 단지 3배 낮았다(각각 서열번호 147의 중쇄 및 서열번호 148의 경쇄를 갖는 키메라 9G7; 키메라 9G7 항체(데이터는 제시되지 않음) 및 제1 인간화 원형(데이터는 제시되지 않음)에 대하여 각각 0.3nM 및 1nM의 KD). 항체의 가변 경쇄에서 F36Y 역 돌연변이의 도입으로 친화성은 2배 개선되었다(Kabat 넘버링)(수득되는 항체는 본원에서 서열번호 145의 중쇄 및 서열번호 74의 경쇄를 갖는 인간화 9G7 최고-적합 항체로 지칭된다; 인간 CD38에 대해 0.5nM의 KD; 도 7C). 인간화 9G7 최고-적합 항체는 또한 사이노몰구스 원숭이 CD38 항원에 대해서도 높은 친화성(3.2nM의 KD, 데이터는 제시되지 않음), 및 키메라 9G7 항체보다 증강된 FAB 열-안정성(DSC 주사로부터 FAB Tm)을 나타냈다(인간화 9G7 최고-적합 항체 및 키메라 9G7 항체 각각에 대하여 94℃ vs. 82.2℃; 도 7G 참조). 인간화 9G7 최고-적합 항체는 서열번호 58의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 59의 경쇄 가변 도메인을 갖는다.
또한, 9G7 마우스 항체는 VH3-23 및 VK1 생식세포계 프레임워크로 CDR 이식을 통한 최고-프레임워크 접근법에 따라 인간화되었다. 상이한 정도의 역 돌연변이를 갖는 인간화 VH 및 VL 변이체는 인 실리코에서 조사했고, 인간화 VH 및 VL 조합의 하나의 바람직한 선택은 인간 IgG1 항체로서 일시적으로 발현시켰다(수득되는 항체는 본원에서 서열번호 149의 중쇄 및 서열번호 150의 경쇄를 갖는 인간화 9G7 최고-프레임워크 항체로서 지칭된다). 하기 마우스 역 돌연변이를 도입했다: (VH) A24F, V37I, V48L, S49A, F67L, R71K, N73T, L78V 및 K94R, 및 (VL) F36Y(Kabat 넘버링). 이 항체는 인간화 9G7 최고-적합 항체와 유사하게 친화성 상수와 함께 인간 CD38 및 사이노몰구스 원숭이 CD38에 대해 강력한 결합을 나타냈다(각각 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD38에 대하여 0.4 및 1nM의 KD; 도 7D). FAB 열-안정성(DSC 주사로부터의 FAB Tm)은 또한 9G7 최고-적합 F36Y 인간화 변이체의 것과 매우 유사했다(89.2℃, 도 7H 참조). 도 7J는 상기 기재된 상이한 인간화 9G7 항체를 요약한 것이다. 인간화 9G7 최적-프레임워크 항체는 서열번호 60의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 61의 경쇄 가변 도메인을 갖는다.
제4 접근법에서, 항체 파지 라이브러리는 인간 CD38에 대한 추가의 scFv 단편을 생성하기 위하여 스크리닝했다. 라이브러리는 자연 발생 인간 V 유전자에 기반한 다양성을 갖는다. 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유래된 공여자는 70%가 자가면역 질환(맥관염, 전신 홍반성 루프스, 척추 관절 장애, 류마티스성 관절염 및 강피증)을 갖는 48명 인강 공여자로부터 유래된 혈액 림프구로부터 증폭된 cDNA를 사용했다. 라이브러리 작제는 총 2.53×10e10 클론의 전체 다양성과 함께 문헌[참조: Schofield et al. (2007, Genome Biol., 8(11): R254]에 기재된 프로토콜에 따랐다. 인간 및/또는 사이노몰구스 원숭이 CD38을 인식하는 scFv 단편은 다음과 같이 파지 디스플레이 라이브러리로부터 유래된 이러한 공여자로부터 단리했다. scFv 단편은 재조합에 의해 유래된 인간 및/또는 사이노몰구스 원숭이 CD38 항원 상에서 일련의 반복적 선별 사이클로 단리했다(재료 및 방법 섹션 참조). 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 공지되어 있다[참조: Viti F et al., (2000) Methods Enzymol, 326: 480-505]. 요약하면, 라이브러리와 함께 인큐베이션한 후, 플라스틱 면역튜브 상에 사전 코팅되거나(20㎍/ml의 농도로 PBS에서 밤새) 또는 스트렙트아비딘 비드에 포획된(항원의 비오틴 표지된 형태를 사용하는 경우, 항원은 선별 프로세스에 걸쳐서 50nM의 농도에서 포획된다) 고정화된 항원, 결합된 파지는 회수되었고, 비결합 파지는 세척하여 제거되었다. 결합된 파지는 문헌[참조: Marks et al (Marks JD et al., (1991) J Mol Biol, 222(3): 581-97]에 기재된 바와 같이 회복시켰고, 상기 선별 프로세스는 3회 반복했다. 제2 및 제3 라운드의 패닝으로부터 1000개 초과의 클론을 발현시키고, 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD38 항원에 대하여 ELISA에 의해 분석했다. 양성 클론은 DNA 서열분석을 수행하였고, 일부 특이적 클론은 인간 CD38을 발현하는 세포주에 결합하는 이들의 능력에 대해 추가로 분석했다. 스트렙트아비딘 비드 상에 고정된 인간 CD38 항원의 비오틴 표지된 버젼에서 제1 라운드의 패닝 및 스트렙트아비딘 비드 상에 고정된 사이노몰구스 원숭이 CD38 항원의 비오틴 표지된 버젼의 제2 라운드의 패닝 후, 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD38 둘 다에 결합하는 이의 능력에 대하여 서열번호 62의 가변 중쇄 서열 및 서열번호 63의 가변 경쇄를 갖는 하나의 바람직한 scFv 단편(클론 번호 767)을 선별했다. 인간 IgG1 항체로 포맷되는 경우, 클론 767은 인간 CD38에 대하여 약 300nM(도 7E) 및 사이노몰구스 원숭이 CD38에 대하여 약 1.2μM의 KD를 가졌다(데이터는 제시되지 않음)(클론 767 IgG1 항체는 본원에서 서열번호 151의 중쇄 및 서열번호 152의 경쇄를 갖는 인간 767 항체로서 지칭된다). FAB 열-안정성(DSC 주사으로부터 FAB Tm)은 70.2℃였다(도 7I). 클론 767 VH 도메인은 VH3 도메인 아부류에 속한다.
실시예 3: CD38/CD3 표적화 BEAT 항체
항-CD38 및 항-CD3 엡실론 암은 BEAT 쇄에 융합되는 scFv 단편으로 이루어진 중쇄의 scFv-Fc 타입 또는 자연 발생 항체와 유사한 BEAT 쇄에 융합되는 FAB 단편으로 이루어진 중쇄로서 포맷될 수 있다. FAB 기반 중쇄는 기능성 항원 결합 부위로 조립하기 위해 동족 경쇄와의 회합을 필요로 한다.
L234A 및 L235A 치환은 CH2 영역에 도입되었고, 잔류 프로테인 A 결합은, 적절한 경우, G65S 또는 N82aS 치환(Kabat 넘버링)을 사용하여 무효화시켰다. 인간 CD38 항원 및 인간 CD3 엡실론 둘 다를 표적화하는 BEAT 항체의 예는 하기와 같이 포맷했다:
인간화 HB7 최고-적합 VH 및 VL 서열을 사용하는 인간 CD38 항원 및 인간 CD3 엡실론 둘 다를 표적화하는 BEAT 항체의 제1 예는 하기와 같이 포맷했다: BEAT CD38/CD3 항체는 각각 항-인간 CD3 엡실론 및 항-인간 CD38 암에 대하여 실시예 2.1 및 2.2에 기재된 항원 결합 부위의 조합을 사용하여 조작했다. 헤테로-이량체성 면역글로불린의 항-인간 CD38 암은 가변 중쇄 영역, CH1 γ1 영역, γ1 힌지 영역, L234A 및 L235A 치환(EU 넘버링)을 갖는 γ1 CH2 영역, 및 이의 동족 경쇄(서열번호 72)과 조립되는 γ1 기반 BEAT CH3 도메인을 포함하는 BEAT 중쇄(서열번호 153)로 이루어졌다. 헤테로-이량체성 면역글로불린의 항-인간 CD3 엡실론 암은 scFv 단편, CH1 γ1 영역, γ1 힌지 영역, L234A 및 L235A 치환(EU 넘버링)을 갖는 γ3 CH2 영역, 및 γ3 기반 BEAT CH3 도메인을 포함하는 BEAT 중쇄(서열번호 154)로 이루어졌다. 이러한 중쇄는 인간 IgG3 Fc 영역의 일부를 포함하고, 따라서 프로테인 A에 대한 결합을 갖지 않으나, 본원에서 사용된 중쇄는 VH3 프레임워크로부터 유래한 이의 중쇄 가변 도메인을 갖기 때문에, VH 도메인은 N82aS 치환을 포함하도록 돌연변이되어 중쇄 내의 임의의 추가 프로테인 A 결합을 제거할 수 있다. 이중특이적 항체는 본원에서 BEAT CD38-HB7 최고-적합/CD3 항체로서 지칭된다(도 8 포맷 A).
BEAT CD38-HB7최고적합/CD3 항체를 일시적으로 발현시키고, 정제하고, CD38 및 CD3 엡실론 항원에 대한 이들의 친화성, 이의 안정성, T 세포 사멸을 재지시하는 이의 능력에 대하여 시험관에서 시험했다. 인간 CD38 항원에 대한 KD 값은 3.2nM이었다(SPR에 의해 측정됨, 도 9A). 이중특이적 항체에 대한 DSC 프로파일은 scFv 부분에 대하여 약 68℃의 Tm을 갖는 우수한 열-안정성 프로파일을 나타냈다. FAB 부분은 대략 91℃의 Tm을 가졌다(도 9B).
CD38 발현 세포주(재료 및 방법 섹션 참조)는 검정에서 재지시된 T 세포 사멸을 평가하기 위해 사용했다. 도 10은 BEAT CD38-HB7최고-적합/CD3 항체를 사용하여 RPMI 8226 골수종 세포의 T 세포 재지시된 사멸을 나타낸다. 검정은 정제된 T 세포를 효과기 세포로서 사용했고, 효과기 세포 대 표적 세포 비율은 10 대 1이었다. RDL-FACS 방법으로 측정하는 경우, BEAT CD38-HB7최고-적합/CD3 항체는 2.2pM의 EC50를 가졌다(2명 공여자의 평균, 48시간 인큐베이션).
인간 클론 767 VH 및 VL 서열을 사용하는 인간 CD38 항원 및 인간 CD3 엡실론 둘 다를 표적화하는 BEAT 항체의 제2 예는 하기와 같이 포맷했다: BEAT CD38/CD3 항체는 각각 항-인간 CD3 엡실론 및 항-인간 CD38 암에 대하여 실시예 2.1 및 2.2에 기재된 항원 결합 부위의 조합을 사용하여 조작했다. 헤테로-이량체성 면역글로불린의 항-인간 CD38 암은 가변 중쇄 영역, CH1 γ1 영역, γ1 힌지 영역, L234A 및 L235A 치환(EU 넘버링)을 갖는 γ1 CH2 영역, 및 이의 동족 경쇄(서열번호 138)과 조립되는 γ1 기반 BEAT CH3 도메인을 포함하는 BEAT 중쇄(서열번호 65)로 이루어졌다. 헤테로-이량체성 면역글로불린의 항-인간 CD3 엡실론 암은 scFv 단편, CH1 γ1 영역, γ1 힌지 영역, L234A 및 L235A 치환(EU 넘버링)을 갖는 γ3 CH2 영역, 및 γ3 기반 BEAT CH3 도메인을 포함하는 BEAT 중쇄(서열번호 155)로 이루어졌다. 이러한 중쇄는 인간 IgG3 Fc 영역의 일부를 포함하고, 따라서 프로테인 A에 대한 결합을 갖지 않으나, 본원에서 사용된 중쇄는 VH3 프레임워크로부터 유래한 이의 중쇄 가변 도메인을 갖기 때문에, VH 도메인은 G65S 치환을 포함하도록 돌연변이되어 중쇄 내의 임의의 추가 프로테인 A 결합을 제거할 수 있다. 이러한 이중특이적 항체는 본원에서 BEAT CD38-767/CD3 항체로서 지칭된다(도 8 포맷 B).
BEAT CD38-767/CD3 항체를 일시적으로 발현시키고, 정제하고, CD38 및 CD3 엡실론 항원에 대한 이들의 친화성, 이의 안정성, 및 T 세포 사멸을 재지시하는 이의 능력에 대하여 시험관내에서 시험했다. CD38 발현 세포주(재료 및 방법 섹션 참조)는 실시예 3.2.1에 기재된 것과 유사한 검정에서 재지시된 T 세포 사멸을 평가하기 위해 사용했다. 도 11은 BEAT CD38-767/CD3 항체를 사용한 다우디(Daudi) 세포의 T 세포 재지시된 사멸을 나타낸다. 분석은 10:1의 효과기 세포 대 표적 세포 비율과 함께 인간 PBMC를 효과기 세포로서 사용했다. RDL-FACS 방법으로 측정하는 경우, BEAT CD38-767/CD3 항체는 224pM의 EC50 값을 갖는다(3명 공여자의 평균값, 24시간 인큐베이션).
인간화된 9G7 최고-프레임워크 VH 및 VL 서열을 사용하여 인간 CD38 항원 및 인간 CD3 엡실론 둘 다를 표적화하는 BEAT 항체의 또 다른 예는 하기와 같이 포맷했다: BEAT CD38/CD3는 각각 항-인간 CD3 엡실론 및 항-인간 CD38 항원 결합 부위에 대하여 실시예 2.1 및 2.2에 기재된 항원 결합 부위의 조합을 사용하여 조작했다.
헤테로-이량체성 면역글로불린의 항-인간 CD38 암은 가변 중쇄 영역, CH1 γ1 영역, γ1 힌지 영역, L234A 및 L235A 치환(EU 넘버링)을 갖는 γ3 CH2 영역, 및 이의 동족 경쇄(서열번호 77)과 조립되는 γ3 기반 BEAT CH3 도메인을 포함하는 BEAT 중쇄(서열번호 75 또는 155)로 이루어졌다. 이러한 중쇄는 인간 IgG3 Fc 영역의 일부를 포함하고, 따라서 프로테인 A에 대한 결합을 갖지 않으나, 본원에서 사용된 중쇄는 VH3 프레임워크로부터 유래한 중쇄 가변 도메인을 갖기 때문에, VH 도메인은 G65S 치환을 포함하도록 돌연변이되어 중쇄 내의 임의의 추가 프로테인 A 결합을 제거할 수 있다. 헤테로-이량체성 면역글로불린의 항-인간 CD3 엡실론 암은 scFv 단편, CH1 γ1 영역, γ1 힌지 영역, L234A 및 L235A 치환(EU 넘버링)을 갖는 γ1 CH2 영역, 및 γ1 기반 BEAT CH3 도메인을 포함하는 BEAT 중쇄(서열번호 68)로 이루어졌다. 이러한 이중특이적 항체는 본원에서 BEAT CD38-9G7최고-프레임워크/CD3(SP34-Kappa2) 항체로서 지칭된다.
인간 클론 767 VH 및 VL 서열을 사용하여 인간 CD38 항원 및 인간 CD3 엡실론 둘 다를 표적화하는 BEAT 항체의 또 다른 예는 하기와 같이 포맷화된다: BEAT CD38/CD3는 각각 항-인간 CD3 엡실론 및 항-인간 CD38 항원 결합 부위에 대하여 실시예 2.1 및 2.2에 기재된 항원 결합 부위의 조합을 사용하여 조작되었다.
헤테로-이량체성 면역글로불린의 항-인간 CD38 암은 가변 중쇄 영역, CH1 γ1 영역, γ1 힌지 영역, L234A 및 L235A 치환(EU 넘버링)을 갖는 γ3 CH2 영역, 및 이의 동족 경쇄(서열번호 66)과 조립되는 γ3 기반 BEAT CH3 도메인을 포함하는 BEAT 중쇄(서열번호 78)로 이루어졌다. 이러한 중쇄는 인간 IgG3 Fc 영역의 일부를 포함하고, 따라서 프로테인 A에 대한 결합을 갖지 않으나, 본원에서 사용된 중쇄는 VH3 프레임워크로부터 유래한 이의 중쇄 가변 도메인을 갖기 때문에, VH 도메인은 G65S 치환을 포함하도록 돌연변이되어 중쇄 내의 임의의 추가 프로테인 A 결합을 제거할 수 있다. 헤테로-이량체성 면역글로불린의 항-인간 CD3 엡실론 암은 scFv 단편, CH1 γ1 영역, γ1 힌지 영역, L234A 및 L235A 치환(EU 넘버링)을 갖는 γ1 CH2 영역, 및 γ1 기반 BEAT CH3 도메인을 포함하는 BEAT 중쇄(서열번호 68)로 이루어졌다. 이러한 이중특이적 항체는 본원에서 BEAT CD38-767/CD3(SP34-Kappa2) 항체로서 지칭된다.
제1 세트의 실험에서, BEAT 9G7/SP34는, PBMC와 조합되는 경우에 T 세포의 활성화를 나타냈지만, 단리되는 경우에는 나타내지 않았다.
실시예 4: 하나의 VH3 도메인만을 포함하는 CD3/CD38 BEAT 항체
인간화 HB7/최고-적합 VH 및 VL 서열을 사용한 인간 CD38 항원 및 인간 CD3 엡실론 둘 다를 표적화하는 BEAT 항체의 예는 하기와 같이 포맷했다: BEAT CD38/CD3는 각각 항-인간 CD3 엡실론 암 및 항-인간 CD38 암에 대하여 실시예 2.1 및 2.2에 기재된 항원 결합 부위의 조합을 사용하여 조작했다. 헤테로-이량체성 면역글로불린의 항-인간 CD38 암은 가변 중쇄 영역, CH1 γ1 영역, γ1 힌지 영역, L234A 및 L235A 치환(EU 넘버링)을 갖는 γ3 CH2 영역, 및 이의 동족 경쇄(서열번호 72)와 조립되는 γ3 기반 BEAT CH3 도메인을 포함하는 BEAT 중쇄(서열번호 71)로 이루어진다. 이러한 중쇄는 인간 IgG3 Fc 영역의 일부를 포함하기 때문에 프로테인 A에 대한 결합을 갖지 않고, 비-VH3 도메인 아부류로부터 기원한 이의 중쇄 가변 도메인을 갖는다. 헤테로-이량체성 면역글로불린의 항-인간 CD3 엡실론 암은 scFv 단편, CH1 γ1 영역, γ1 힌지 영역, L234A 및 L235A 치환(EU 넘버링)을 갖는 γ1 CH2 영역, 및 γ1 기반 BEAT CH3 도메인을 포함하는 BEAT 중쇄(서열번호 157)로 이루어진다. 이러한 중쇄 및 경쇄 조립체는 PCT 공개번호 제WO2008119565호에 기재된 항-인간 CD3 엡실론 항체(SP34)의 인간화 버젼을 포함한다. 이러한 BEAT 항체 포맷은 본원에서 BEAT CD38-HB7최고-적합/CD3(SP34) 항체로서 지칭된다(도 12 포맷 A).
BEAT CD38-HB7최고-적합/CD3(SP34) 항체가 CD38+ 세포에 대해 T 세포 사멸을 재지시하는 능력을 시험관내에서 조사했다. CD38+ B 림프원구(lymphoblast) 세포주 다우디를 사멸 검정에 사용했다. 도 13은 BEAT CD38-HB7최고-적합/CD3(SP34) 항체에 의한 다우디 세포의 T 세포 재지시된 사멸을 나타낸다. 검정은 10 대 1의 효과기 세포 대 표적 세포 및 24시간 인큐베이션 기간 후에 RDL-FACS 판독 방법과 함께 인간 PBMC를 효과기 세포로서 사용했다(재료 및 방법 섹션 참조). 결과는, BEAT CD38-HB7최고-적합/CD3(SP34) 항체가 1.8pM의 EC50과 함께 다우디 CD38+ 세포주에 대한 T 세포 사멸을 재지시하는데 매우 강력했음을 나타낸다.
인간화 9G7 최고-적합 VH 및 VL 서열(각각 서열번호 58 및 59)을 사용한 인간 CD38 항원 및 인간 CD3 엡실론 둘 다를 표적화하는 BEAT 항체의 제2 예는 하기와 같이 포맷했다:
BEAT CD38/CD3는 각각 항-인간 CD3 엡실론 암 및 항-인간 CD38 암에 대하여 실시예 2.1 및 2.2에 기재된 항원 결합 부위의 조합을 사용하여 조작했다. 헤테로-이량체성 면역글로불린의 항-인간 CD38 암은 가변 중쇄 영역, CH1 γ1 영역, γ1 힌지 영역, L234A 및 L235A 치환(EU 넘버링)을 갖는 γ3 CH2 영역, 및 이의 동족 경쇄(서열번호 74)과 조립되는 γ3 기반 BEAT CH3 도메인을 포함하는 BEAT 중쇄(서열번호 73)로 이루어진다. 이러한 중쇄는 인간 IgG3 Fc 영역의 일부를 포함하기 때문에 프로테인 A에 대한 결합을 갖지 않고, 비-VH3 도메인 아부류로부터 기원한 이의 중쇄 가변 도메인을 갖는다. 헤테로-이량체성 면역글로불린의 항-인간 CD3 엡실론 암은 scFv 단편, CH1 γ1 영역, γ1 힌지 영역, L234A 및 L235A 치환(EU 넘버링)을 갖는 γ1 CH2 영역, 및 γ1 기반 BEAT CH3 도메인을 포함하는 BEAT 중쇄(서열번호 158)로 이루어진다. 이중특이적 항체의 이러한 암은 실시예 2.1에 기재된 인간화 SP34 VH5/VL32 항체의 가변 도메인을 포함한다. 이러한 BEAT 항체 포맷은 본원에서 BEAT CD38-9G7최고-적합/CD3(SP34-Kappa2) 항체로서 지칭된다(도 12 포맷 B). CD38-9G7최고-적합/CD3(SP34-Kappa2) 항체는 인간 CD3 1-26_Fc 융합 단백질에 대하여 18nM의 KD를 갖는다(도 14).
BEAT CD38-9G7최고-적합/CD3(SP34-Kappa2) 항체가 인간 CD38+ 세포에 대해 T 세포 사멸을 재지시하는 능력을 시험관내에서 조사했다. CD38+ B 림프원구 세포주 다우디를 사멸 검정에 사용했다. 도 15는 BEAT CD38-9G7최고-적합/CD3(SP34-Kappa2) 항체에 의한 다우디 세포의 T 세포 재지시된 사멸을 나타낸다. 분석은 10 대 1의 효과기 세포 대 표적 세포 비율, 및 24시간 인큐베이션 기간후 RDL-FACS 판독 방법과 함께 인간 PBMC를 효과기 세포로서 사용했다(재료 및 방법 섹션 참조). 결과는 BEAT CD38-9G7최고-적합/CD3(SP34-Kappa2) 항체가 2pM의 EC50과 함께(3명 공여자의 평균), 다우디 CD38+ 세포주에 대한 T 세포 사멸을 재지시하는데 매우 강력했음을 나타낸다.
실시예 5. scFv 포맷에서 개선된 SP34의 기능성 등가물
이들의 발현을 개선하도록 다양한 SP34 scFv에 대해 수행된 변형이 기능적 특성, 즉 CD3의 결합에 또한 영향을 미치는지를 측정하기 위해, 이들은 CD38×CD3 이중특이성의 맥락에서 시험했다. FAB로서 존재하는 CD38 결합 암은 서열번호 60에 의해 코딩된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 61에 의해 코딩된 경쇄 가변 영역을 포함한다. CD3 결합 암은 scFv(서열번호 207)으로 재포맷된 본래 마우스 SP34, 또는 중쇄/경쇄 조합 H1/L21(서열번호 67), H5/L32(서열번호 68), H5/L65(서열번호 69) 및 H5/L67(서열번호 70)을 포함하는 변형된 인간화 SP34 scFv를 포함한다.
상이한 버젼의 SP34를 사용하는 각각의 CD3/CD38 BEAT를 일시적으로 발현시키고, 정제했다. 이들은 T 세포 사멸을 재지시하는 이들의 능력을 비교하기 위해 시험관내에서 시험했다. Raji CD38 발현 세포주(재료 및 방법 섹션 참조)를 사용하여 재지시된 T 세포 사멸을 평가했다. 검정은 10:1의 효과기 세포 대 표적 세포 비율과 함께 PBMC를 효과기 세포로서 사용했다.
RDL-FACS 방법으로 측정하는 경우, 모든 BEAT는 6 내지 10pM의 비교가능한 EC50을 나타냈다(2명 공여자의 평균, 24시간 인큐베이션)(도 16).
실시예 6: D401Q 치환은 2개 호모이량체 종 중의 하나에서 프로테인 A 및 G 결합을 무효화한다.
분석 목적을 위해, 본 발명자들은 FAB×scFv BEAT 항체의 BTA 및 BTB 호모이량체를 생성했고, 여기서 FAB 암(BTA 호모이량체)은 프로테인 A에 대한 결합을 갖지 않았는데, 이는 비-VH3 가변 도메인 및 상기 기재된 것과 유사하게 인간 IgG3 Fc 영역의 일부를 포함했기 때문이며, scFv 암(BTB 호모이량체)는 이의 VH3 기반 가변 도메인 및 이의 인간 IgG1 Fc 영역 둘 다를 사용하여 프로테인 A에 결합시켰다. 발현 및 정제(상기 기재된 바와 같음)할 때, 본 발명자들은 BTA 호모이량체를 프로테인 G(서열번호 156의 중쇄 및 서열번호 74의 경쇄)에 의해 용이하게 정제할 수 있지만, BTB 호모이량체는 프로테인 A에 의해서만 단리할 수 있고 프로테인 G에 결합하지 않음을 발견했고, 이는, 예를 들면, BTB CH3 도메인(서열번호 159)을 담지하는 Fc 영역에서 프로테인 G 결합 부위의 미스폴딩 또는 입체구조 변화를 시사한다. 프로테인 G는 프로테인 A가 (CH2-CH3 인터페이스에서) 하는 것과 같이 Fc 영역의 거의 동일한 부분에 결합하는 것을 고려하면, BTB 호모이량체가 프로테인 A에 결합하지만 프로테인 G에 결합하지 않는다는 것은 놀라운 것이다. 이어서, BTB 호모이량체에 의한 프로테인 A 결합은, 상기 언급한 바와 같이 VH3 기반 가변 도메인을 포함하는 scFv 잔기에 위치된 프로테인 A 결합 부위에 의해 단독으로 매개될 수 있음을 가정했다. 프로테인 A에 대한 scFv 결합의 기여를 평가하기 위해, VH3 기반 scFv를 결여하는 작제물을 생산하고, 프로테인 A(서열번호 160, 도 17 참조)에 더이상 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다. BTB 호모이량체에서, Fc 영역 내의 프로테인 A 및 G 결합 부위는 둘 다 비-기능성인 것으로 결론지었다.
이러한 이후의 결과는, BTB 호모이량체가 프로테인 A/G 결합 영역에서 실제로 미스폴딩되거나 구조적으로 변화되었음을 시사했다. 그러나, BTB CH3 도메인이 헤테로이량체성 면역글로불린과 관련하여 사용된 이전 데이터는 다른 것을 제안했다. 프로테인 A 결합과 관련하여 헤테로이량체 문맥에서 BTB CH3 도메인의 기능성을 추가로 조사하기 위해, 본 발명자들은, 비-VH3 가변 도메인을 포함하기 때문에 프로테인 A에 대한 결합을 갖지 않는 FAB 암(BTA 암), 인간 IgG1 힌지, 인간 IgG3 CH2 도메인 및 인간 IgG3 이소형으로부터 유래하는 조작된 BTA CH3 도메인(서열번호 156의 FAB 암 중쇄 및 서열번호 74의 경쇄), 및 프로테인 A 결합을 무효화한 VH3 기반 scFv 단편, 인간 IgG1 힌지, 인간 IgG1 CH2 도메인 및 인간 IgG1 이소형(서열번호 161의 scFv 암 중쇄)로부터 기원하는 조작된 BTB CH3 도메인을 포함하는 scFv 암(BTB 암)으로 이루어진 FAB×scFv BTAT 항체를 생산했다 - 따라서 헤테로이량체는 단독으로 scFv 암의 Fc 영역에서 프로테인 A에 결합할 것으로 예상되었다. 발현 및 정제(상기한 바와 같음)할 때, 실제로 이러한 분자는 프로테인 A 및 G에 결합했고(도 18A) BTB 호모이량체의 흔적을 갖지 않는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 프로테인 A 및 G는 헤테로이량체성 면역글로불린의 맥락에서 완전하고 BTA 및 BTB 쇄가 회합되는 경우에만 기능성 프로테인 A/G 결합 부위가 형성되는 것으로 결론지었다.
BTB 호모이량체 내에서 프로테인 A/G 무효화의 분자 기준을 이해하기 위해, 인간 IgG1 이소형으로부터 유래하는 사전 조작된 BTB CH3 도메인을 조사했다. 치환 D401Q, EU 넘버링, EU 및 IMGT 넘버링 사이의 비교는 http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGH Gnber.html에서 제공되고, BTB 내에서 CH3 도메인을 모델링 연구로부터 동정했고, 이러한 상호작용이 호모이량체성 복합체를 안정화시킬 수 있음에 비추어 BTB 호모이량체의 제2 쇄의 Asp401과 함께 BTB 호모이량체의 제1 쇄의 Arg411 사이의 추정 정전기 접촉을 배제하도록 조작했다. 이러한 치환은 단지 BTB CH3 도메인 조작의 최종 단계에서 실시되기 때문에, 상기 기재된 FAB×scFv BTAT 항체는 BTB CH3 도메인 내에 상기 D401Q 치환의 부재하에 생산되었다(각각 서열번호 156 및 74의 중쇄 및 경쇄를 갖는 FAB 암; 서열번호 162의 중쇄를 갖는 scFv 암). 발현 및 정제(상기 기재된 바와 같음)할 때, 이러한 분자는 프로테인 A 및 G(도 18B)에 결합했지만 BTB 호모이량체의 존재를 나타내는 것으로 밝혀졌고, 따라서 이는 D401Q 치환이 BTB 호모이량체에서 관찰된 프로테인 A/G 결합의 결여에 관여하고, 이에 의해 상기 BTB 오염물질을 감소시키는데 있어서 헤테로이량체성 면역글로불린 내의 현저한 기여를 했다. 중요하게는 잔기 401 자체는 프로테인 A/G 결합 부위의 일부가 아니지만, CH3-CH3 인터페이스에서 반대로 위치되어 있다. 따라서, 프로테인 A/G 무효화는 프로테인 A/G 및 Fc 영역 사이의 상호작용을 직접 파괴하는 결과는 아니다. 오히려, 예상치 않게, D401Q는 서로 BTB 쇄의 불량한 페어링 능력의 결과로서 CH2-CH3 인터페이스에서 보다 긴 범위의 입체구조 변화를 유도하는 것을 시사한다. 헤테로이량체의 경우에, 인터페이스는 함께 완전하게 적합하고, 따라서 CH2/CH3 인터페이스에서 적절한 입체구조는 프로테인 A/G 결합 부위를 기능성으로 되게 한다.
이러한 놀라운 결과는 다음과 같은 특정 설계를 사용하여 호모이량체 오염물질의 부재하에 헤테로이량체성 면역글로불린을 효율적으로 단리하는 새로운 전략을 개발할 수 있다: 헤테로이량체성 변역글로불린은 BTA CH3 도메인, 및 프로테인 A 결합(예를 들면, G65S 또는 B82aS 치환을 사용)을 무효화하거나 가변 도메인을 갖지 않고 따라서 프로테인 A에 대한 결합을 갖지 않는 비-VH3 가변 도메인 또는 VH3 기반 가변 도메인을 포함하는 IgG3 이소형의 Fc 영역을 포함하는 제1 쇄, 및 BTB D401Q CH3 도메인(예를 들면, 인간 IgG1 이소형으로부터 유래) 및 프로테인 A 결합(예를 들면, G65S 또는 N82aS 치환을 사용)을 무효화하거나 가변 도메인을 갖지 않는 비-VH3 가변 도메인 또는 VH3 가변 도메인을 포함하는 프로테인 A에 결합하는 제2 쇄를 갖는다. 이러한 설정에서, 양 호모이량체는 프로테인 A 결합 부위를 함유하지 않는다. 제1 호모이량체는 제1 쇄의 이량체이고, 프로테인 A 결합 부위를 갖지 않기 때문에 프로테인 A에 결합하지 않는 반면, 제2 호모이량체는 비-기능성인 프로테인 A 결합 부위를 갖는 제2 쇄의 이량체이다. 수득되는 헤테로이량체는 제2 쇄에서 발견된 하나의 프로테인 A 결합 부위만을 갖는다(BTB 쇄 프로테인 A 결합 부위는 BTA 쇄과 쌍을 이루는 경우에만 기능성이다). 따라서, 헤테로이량체는 프로테인 A 크로마토그래피 수지에 결합하는 유일한 종인 반면, BTA 및 BTB 쇄의 원하지 않는 호모이량체는 세척 제거될 것이다.
실시예 7: 사이노몰구스 원숭이에서 생체내 CD3/CD38 BEAT 활성
사이노몰구스 원숭이(마카카 혈관형성, 1마리 수컷, 용량당 1마리 암컷)은, CD3/CD38 BEAT로서 본 실시예에서 지칭되는, CD3/CD38(cFv 서열번호 69로서 포맷된 CD3 중쇄/경쇄 조합 SP34 H5/L65 및 서열번호 60에 의해 코딩된 CD38 중쇄 가변 영역 및 FAB로서 포맷된 서열번호 61에 의해 코딩된 경쇄 가변 영역을 포함)의 정맥내 볼러스 주사에 의해 투약했다.
면역표현형은 처리 전 및 CD3/CD38 BEAT의 각 투여 후에 상이한 시점에 취한 혈액 샘플(EDTA)로부터 모든 동물에 대해 실시했다. 림파구 서브세트의 평가는 하기 마커를 사용하여 유세포 분석에 의해 실시했다: 전체 T 림프구(CD4 및 CD8), 단핵구(CD14) 및 CD38. 샘플은 FACSCanto™ II 유세포 분석기로 획득했다. 데이터는 다음과 같이 FACSDiva™ 분석을 사용하여 분석했다: 먼저, 전방 및 측방 산란 특성에 기반하는 전자 게이트는 림파구 또는 단핵구 모집단(모체 모집단)을 선택하기 위해 작성했다. T 림파구 모집단(CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포) 및 CD38 양성 단핵구 모집단(CD14+CD38+)의 전혈의 μL당 절대 계수는 모체 모집단 게이트로부터 유래된 이들의 상태 퍼센트 및 하기 식에 따라 검증 혈액 분석기로부터 전체 모체 모집단 계수로부터 계산했다: 절대 모집단 계수(×103/μL) = (모집단 상대 % × 전체 모체 모집단 계수)/100.
1 및 10㎍/kg의 용량(도 19)에 따라, T 세포 계수(둘 다 CD4 및 CD8 양성)의 명백한 초기 감소가 있었다. 투약 1일 전에 수득한 세포 계수와 비교하여, 4시간 시점에서 1㎍/kg 투약 후에 CD4 T 세포 계수의 48 및 78% 감소 및 10㎍/kg 투약 후에 90% 초과가 있었다. CD8 T 세포 계수는 보다 현저히 영향을 받았고, 1㎍/kg 투여 후에 86% 저하되었다. CD4 T 세포 계수는 신속하게 재결합했고, 48시간 후에 투약전 계수와 전체적으로 유사했다. 그러나, CD8 T 세포 계수는 1주일 후에 투여전과 유사한 수준을 회복 및 도달하는데 보다 늦었다. 말초혈 T 세포의 일시적 감소를 예상했고, CD3/CD38 BEAT에 의한 이들 모집단의 활성화를 반영한다. 이들 관찰은 T 림파구, 및 특히 세포독성 CD8 T 세포가 조직에서 사멸 활성에 관여한다는 것을 시사한다.
또한, 순환 CD38+ 단핵구 모집단에서 명백한 감소가 있었다(도 20). 매우 급속한 소실이 관찰되었고, 이어서 24 내지 48시간 사이에 재결합했다. 이러한 재결합은 일반적으로 CD38+ 단핵구 계수의 2차 실질적 감소를 따랐고, 이는 이러한 모집단이 T 림파구의 세포독성 작용에 의해 표적화 및 고갈되는 것을 시사한다.
실시예 8: 9G7 -기반 BEAT 항체는 OKT10xOKT3 BEAT보다 증강된 사멸 활성을 나타낸다.
2개의 상이한 9G7-기반 BEAT 항체 대 OKT10-기반 BEAT 항체의 효력을 RDL 검정으로 조사했다.
본원에서 BEAT CD38-9G7Mouse/CD3로서 지칭되는 이중특이적 항체는 실시예 2에 기재된 항원 결합 부위의 조합에 기반한 BEAT CD38/CD3 항체이다(항-인간 CD3 엡실론 암을 위한 OKT3 VH11/VL8 scFv 및 항-인간 CD38 암을 위한 마우스-인간 키메라 9G7 FAB). 이중특이적 항체의 항-인간 CD38 암은 이의 동족 경쇄(서열번호 178)과 조립되는 BEAT 중쇄(서열번호 177)로 이루어졌다. 이중특이적 항체의 항-인간 CD3 엡실론 암은 항-인간 CD3 엡실론 scFv 단편을 포함하는 BEAT 중쇄(서열번호 179)로 이루어졌다. 이중특이적 항체를 일시적으로 발현시키고, 상기 기재된 바와 같이 정제했다.
본원에서 BEAT CD38-OKT10Mouse/CD3로서 지칭되는 이중특이적 항체는 실시예 2에 기재된 항원 결합 부위의 조합에 기반하여 BEAT CD38/CD3 항체이다(항-인간 CD3 엡실론 암을 위한 OKT3 VH11/VL8 scFv 및 항-인간 CD38 암을 위한 마우스-인간 키메라 OKT10 FAB). 이중특이적 항체의 항-인간 CD38 암은 이의 동족 경쇄(서열번호 181)로 조립되는 BEAT 중쇄(서열번호 180)로 이루어졌다. 이중특이적 항체의 항-인간 CD3 엡실론 암은 항-인간 CD3 엡실론 scFv 단편을 포함하는 BEAT 중쇄(서열번호 179)로 이루어졌다. 이중특이적 항체를 일시적으로 발현시키고 상기한 바와 같이 정제했다.
본원에서 BEAT CD38-9G7best-fit/CD3(SP34-Kappa2) 항체로서 지칭되는 BEAT 항체는 실시예 4에서 상기 기재되어 있다.
9G7 또는 OKT10 항 CD38 mAb에 기반한 상이한 BEAT 항체의 세포독성 가능성은 CD38+ 표적 다우디 세포(ATCC)에 대해 사멸 검정으로 평가했다. 유세포 분석 기반 판독은 표적 세포 사멸을 정량하기 위해 실시했다. 유사한 유세포 분석-기반 판독을 문헌[참조: Moore et al. Blood. 2011 Apr 28;117(17):4542-51; Friedrich et al. Mol Cancer Ther 2012;11:2664-2673; Schlereth et al. Cancer Res 2005;65:2882-2889]에서 사용했다. 효과기 세포는 건강한 공여자로부터 비-자극된 PBMC였다. 효과기:표적 비율은 전형적으로 10:1이고, 배양 시간은 48시간이었다. 요약하면, 표적 세포(다우디)를 CFSE 등의 형광 세포질 염료로 표지하고, 96-웰 플레이트(TPP)에 분배했다. 이어서, 항체 연속 희석(3배 용액) 및 PBMC(50μL/웰)을 상응하는 웰에 분배했다. 플레이트를 37℃로 5% CO2 배양기에서 48시간 동안 배양했다. 세포를 피펫팅에 의해 재현탁시키고, U-하부 96-웰 플레이트(TPP)로 옮겼다. U-하부 플레이트를 300g에서 3분간 원심분리하고, 상청액을 버리고, 세포를 7-AAD(Becton Dickinson)가 1/40 희석으로 보충된 200μL의 차가운 FACS 완충제(PBS+2% FBS+10% Versene)에 재현탁시켰다. 플레이트는 구아바 easyCyte™ 유세포 분석기(Millipore) 상에서 즉시 획득했다. 각 웰에 대해, 살아있는 표적 세포의 절대 수는 플로우조 소프트웨어(Treestar)를 사용하여 염료(CFSE) 양성 7ADD 음성 모집단 상에 게이팅하여 측정했다. 각 샘플에 대한 특이적 세포독성(%)은 표적 세포만이 기준선으로 배양되는 조건을 사용하거나, 표적 세포가 PBMC(항체 부재 조건)과 혼합되는 조건을 사용하여 측정했다. EC50 값은 프리즘 소프트웨어(GraphPad 소프트웨어)로 비선형 가변 구배 회귀 방법을 사용하여 측정했다.
표 2에서 데이터는 상이한 BEAT 작제물로 수득한 EC50 값을 나타낸다. 9G7-기반 BEAT 항체(BEAT CD38-9G7Mouse/CD3 및 BEAT CD38-9G7best-fit/CD3(SP34-Kappa2))는 BEAT CD38-OKT10Mouse/CD3 항체보다 명백하게 낮은 EC50을 특징으로 하는 사멸 활성을 나타냈고(9G7 기반 BEAT 항체에 대해 3.2 및 1.9pM 대 OKT10 기반 BEAT 항체에 대해 125.6pM), 이는 9G7-기반 항-CD38/CD3 BEAT 항체의 보다 높은 세포독성 가능성을 나타낸다.
9G7-기반 BEAT 항체는 OKT10xOKT3 BEAT보다 증강된 사멸 활성을 나타낸다.
BEAT CD38-9G7Mouse/CD3 BEAT CD38-9G7best-fit/CD3(SP34-Kappa2) BEAT CD38-OKT10Mouse/CD3
EC50 (pM)* 3.2 1.9 126
* 지시된 EC50은 상이한 PBMC 공여자로 실시한 사멸 검정의 평균 값이다. 9G7xOKT3의 경우에 N= 8, OKT10xOKT3의 경우에 N= 2 및 9G7xSP34(GV2)의 경우에 n=1.
실시예 9: 9G7 및 767 결합제는 HB7 항체와 대조적으로 효능작용을 나타내지 않는다.
CD38은 신호전달에 유능하고, 9G7 및 767 항체의 효능제 성질은, 천연 CD38을 발현하는 유르캣(Jurkat) 인간 T 세포 림프종 세포주에 대한 칼슘 유동 검정으로 HB7 클론 비교하여 시험했다. 유르캣 세포에 37℃에서 1시간 동안 2μM(Invitrogen)에서 Fluo-4 염료를 부하했다. 세포를 세척하고, 1mM Ca2+ 및 1mM Mg2+가 보충된 PBS에 재현탁시켰다. 샘플은 40초 동안 기준선을 위해 FACScalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson)로 획득했다. 이어서, 시험 항체를 10㎍/ml의 농도로 샘플에 첨가하고, 획득은 7분까지 재개했다. 도 G는 Fluo-4 염료(FL-1 채널)의 평균 형광 강도(MFI)를 나타내고, 이는 시간의 함수로서 세포의 세포질 내로 칼슘 동원의 판독이다. 이소형 대조군(IgG1 인간 항체)은 어떠한 칼슘 유동을 유발하지 않지만, HB7 항-CD38 항체는 강력한 신호를 유도했다. 놀랍게도, 9G7 또는 767 항체는 칼슘 동원 신호를 유발할 수 없었고, 이는 이들 항체가 HB7 항체와 대조적으로 작용제 특성을 갖지 않았음을 나타낸다.
동일한 일련의 실험 동안, 이들이 특정 방식으로 CD38 발현 세포에 특이적으로 결합하는 9G7 및 767을 위해 제시되어 있다.
실시예 10: 에피토프 맵핑
h9G7 에피토프 맵핑
선형 펩티드 맵핑을 사용하여 인간화 9G7의 에피토프(최고-적합 버젼)를 측정했다. 인간 CD38(잔기 43-300)의 세포외 도메인을 19개 연속 펩티드, 13개 아미노산 길이 및 11개 아미노산 길이의 최종 펩티드로 분할했다. 펩티드를 Fc 및 펩티드 서열 사이의 2개 아미노산 링커(Ala-Ser)로 인간 IgG1 Fc 영역(CH2-CH3)에 융합했다. 이들 작제물은 F1-F20(서열번호 182-201)으로 명명했고, 이들의 결합은 SPR에 의해 분석했다. 인간화된 9G7 항체(서열번호 145의 중쇄 및 서열번호 146의 경쇄)를 CM5 센서 칩(약 1800RU) 상에 공유결합에 의해 고정시켰다. 펩티드 Fc-융합체를 240초 동안 15nM로 주입했다. 인간 CD38 세포외 도메인을 대조군으로 주입했다. F6 및 대조군만이 결합 신호를 제공했다(도 22). 모든 단편을 200nM로 재-주입하고, F6은 보다 강력한 신호를 제공한 반면(도 23) 나머지 단편은 여전히 결합을 나타내지 않았다(데이터는 제시하지 않음). F6는 PCT 공개번호 제WO2008047242호에 개시된 SAR650984 항체의 에피토프(서열번호 202의 중쇄 및 서열번호 203의 경쇄)의 일부이기 때문에, 이들의 상호작용을 SPR에 의해 검증하고 확인했다(데이터는 제시하지 않음). 따라서, h9G7 및 SAR650984는 인간 CD38 상에서 결합을 위해 경쟁한다. 추가로, F6 서열을 인간 CD38의 세포외 도메인의 3D 표면 상에 맵핑하는 경우, 이는 SAR650984 에피토프와 중첩한다. 그러나, SAR650984는 사이노몰구스 CD38과 교차-반응하는 것으로 나타나지 않은 반면, 인간화 9G7은 높은 친화성으로 사이노몰구스 CD38에 결합하고(도 24), 이는 2개 항체가 중첩하지만 상이한 에피토프를 갖는 것을 시사한다.
F6 서열 내에서, 잔기 M110은 사이노몰구스 CD38에서 발린이다. 따라서, 인간 CD38의 완전한 세포외 도메인의 맥락에서, 본 발명자들은 M110을 발린(서열번호 204)로 돌연변이시켰고, h9G7 및 SAR650984의 결합을 비교했다. SAR650984는 야생형 인간 CD38에 대한 이의 결합과 비교하여 감소된 결합을 나타낸 반면, 인간화된 9G7의 결합은 영향을 받지 않았다(데이터는 제시하지 않음). 인간 CD38 세포외 도메인과의 복합체에서 SAR650984의 결정 구조에 기반하여(PDB 가맹 코드 4CMH, Deckert et al., 2014 Clin. Cancer Res. 20: 4574), 본 발명자들은 SAR650984 결합에 잠재적으로 중요하고 인간 및 사이노몰구스 CD38 사이에 상이한 추가의 잔기를 동정했다. 이 잔기는 T148이고, 사이노몰구스 CD38에서 메티오닌이다. 인간 CD38의 세포외 도메인(서열번호 205)에서 T148의 메티오닌으로의 돌연변이는 SAR650984의 결합을 현저히 감소시킨 반면, 인간 9G7 결합은 영향을 받지 않았다(데이터는 제시하지 않음). 돌연변이 M110V 및 T148M(서열번호 206, 도 23 참조)를 함유하는 인간 CD38의 세포외 도메인의 이중 돌연변이는 SAR650984으 결합을 무효화한 반면, 인간화된 9G7 결합은 영향을 받지 않았다(도 24). 따라서, 인간화된 9G7 및 SAR650984은 인간 CD38에 대한 결합을 위해 경쟁하는 반면, 이들 항체에 의해 결합되는 잔기는 동일하지 않은 것으로 결론지을 수 있다.
767 에피토프 맵핑
767 항체의 에피토프는 상기 기재된 에피토프 맵핑 실험에 사용된 동일한 세트의 선형 펩티드-Fc 융합체를 사용하여 맵핑했다. 767 항체(서열번호 151의 중쇄 및 서열번호 152의 경쇄)를 CM5 센서 칩(약 700RU) 상에 공유결합에 의해 고정시켰다. 펩티드 Fc-융합체(F1-F20, 서열번호 182-201)를 240초 동안 1000nM로 주입했다. 인간 CD38 세포외의 세포외 도메인은 대조군으로 주입했다. F3 및 대조군만이 결합 신호를 제공했다(도 25). F3 서열을 인간 CD38의 세포외 도메인의 3D 표면 상에 맵핑하는 경우(도 26), SAR650984 에피토프, 보다 구체적으로는 2개 잔기: E76 및 H79와 부분적으로 중첩한다. 그러나, 767은 사이노몰구스 CD38과 교차-반응성(낮은 친화성)인 반면, SAR650984는 교차-반응성이 아니고, 이는 2개 항체가 중첩하지만 상이한 에피토프를 갖는 것을 시사한다. 추가로, SAR650984는 SPR에 의해 F3 작제물에 결합하지 않았다(도 27). 따라서, 767 및 SAR650984는 인간 CD38 상의 결합을 위해 경쟁하지만, 이들 항체에 의해 결합되는 잔기는 동일하지 않다.
SEQUENCE LISTING <110> Glenmark Pharmaceuticals S.A. <120> CD3/CD38 T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins and methods of their production <130> IPA170509-CH <150> PCT/EP2014/073738 <151> 2015-11-04 <150> EP 15167034.6 <151> 2015-05-08 <160> 214 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO: 1 SP34 scFv hevay chain variable <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 125 <210> 2 <211> 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Met Leu Leu Gly Tyr Leu Ala 100 105 110 Asp Asp Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr 115 120 125 Gln Ser Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser 130 135 140 Val Phe Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp 145 150 155 160 Val Val His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys 165 170 175 Asn Ser Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys 180 185 190 Val Gln Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser 195 200 205 Arg Asp Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile 210 215 220 Ser Lys Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp 225 230 235 240 Lys Phe Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser 245 250 255 Glu Ile His His His His His His 260 <210> 207 <211> 481 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO: 207 mouse SP34 reformatted as an scFv <400> 207 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val 130 135 140 Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu 145 150 155 160 Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 165 170 175 Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly 180 185 190 Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu 195 200 205 Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp 210 215 220 Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe 225 230 235 240 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Thr Asp Lys 245 250 255 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 260 265 270 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 275 280 285 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 290 295 300 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 305 310 315 320 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 325 330 335 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 340 345 350 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 355 360 365 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 370 375 380 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 385 390 395 400 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 405 410 415 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 420 425 430 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 435 440 445 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 450 455 460 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 465 470 475 480 Lys <210> 208 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO: 208 Extended Kabat 9G7 mouse CDRH1 <400> 208 Gly Leu Ser Leu Ser Thr Ser Gly Lys Gly Val Gly 1 5 10 <210> 209 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO: 209 Extended Kabat 9G7 mouse CDRH2 <400> 209 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 1 5 10 15 Leu Lys Ser <210> 210 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO: 210 Extended Kabat 9G7 mouse CDRH3 <400> 210 Ala Arg Ile Glu Leu Gly Arg Ser Tyr Val Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 211 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO: 211 Extended Kabat 9G7 mouse CDRL1 <400> 211 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Thr Ser Val Ala Trp Phe 1 5 10 <210> 212 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO: 212 Extended Kabat 9G7 mouse CDRL2 <400> 212 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 10 <210> 213 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO: 213 Extended Kabat 9G7 mouse CDRL3 <400> 213 Gln Gln His Tyr Thr Ile Pro Leu Thr 1 5 <210> 214 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO: 214 Extended Kabat 9G7 best fit CDRL1 <400> 214 Gln Ala Ser Gln Asp Val Ile Thr Ser Val Ala Trp Phe 1 5 10

Claims (15)

  1. 서열번호 25 또는 서열번호 208의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및/또는 서열번호 26 또는 서열번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 서열번호 27 또는 서열번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하고/하거나; 서열번호 28 또는 서열번호 211 또는 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 및/또는 서열번호 29 또는 서열번호 212의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 서열번호 30 또는 서열번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, 인간 CD38에 결합하는 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편이 뮤린 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체인, 항체 또는 이의 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편이 서열번호 52, 서열번호 58, 서열번호 60으로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열 또는 상기 중쇄 가변 영역 서열의 어느 하나의 서열의 비-CDR 영역과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하고/하거나, 상기 항체 또는 이의 단편이 서열번호 55, 서열번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 또는 상기 경쇄 가변 영역 서열의 어느 하나의 서열의 비-CDR 영역과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 단편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편이 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 145, 서열번호 147, 서열번호 149로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 서열 또는 상기 중쇄 가변 영역 서열의 어느 하나의 서열의 비-CDR 영역과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하고/하거나, 상기 항체 또는 이의 단편이 서열번호 74, 서열번호 77, 서열번호 146, 서열번호 148, 서열번호 150의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열 또는 상기 경쇄 가변 영역 서열의 어느 하나의 서열의 비-CDR 영역과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 단편.
  5. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 인간 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 인간 중쇄 불변 영역이 IGHG1, 비 푸코실화된 IGHG1 및 IGHG4로 이루어진 인간 면역글로불린의 그룹으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 단편.
  6. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따르는 항-CD38 항체 단편을 포함하는 이중특이적 항체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항-CD38 항체 단편이 Fab, Fab', Fab'-SH, Fd, Fv, dAb, F(ab')2, scFv, 이중특이적 단일 쇄 Fv 이량체, 디아바디, 트리아바디 및 scFv로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 이중특이적 항체.
  8. 제6항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab', Fab'-SH, Fd, Fv, dAb, F(ab')2, scFv, 이중특이적 단일 쇄 Fv 이량체, 디아바디, 트리아바디 및 scFv로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항-CD3 항체 단편을 추가로 포함하는, 이중특이적 항체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항-CD3 항체 단편이 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 5 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하고; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 및 서열번호 7, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하거나,
    상기 항-CD3 항체 단편이 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 및 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하고; 서열번호 166의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 및 서열번호 167의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 168의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, 이중특이적 항체.
  10. 인간 및 사이노몰구스 CD38에 결합하고, 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 상기 항체 또는 이의 단편 또는 제6항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따르는 상기 이중특이적 항체와 동일한 에피토프에 결합하는, 항체 또는 이의 단편.
  11. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 따르는 상기 항체 또는 이의 단편 또는 제6항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따르는 상기 이중특이적 항체에 의해 결합되는, 가용성 인간 CD38 상의 에피토프.
  12. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편 또는 제6항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따르는 상기 이중특이적 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  13. 치료제에 연결된, 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항의 항체 또는 이의 단편 또는 제6항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 따르는 상기 이중특이적 항체를 포함하는, 면역접합체.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한, 항체 또는 이의 단편 또는 이중특이적 항체.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 다발성 골수종, B-세포 만성 림프구성 백혈병, B-세포 급성 림프구성 백혈병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈종, 1차 전신성 아밀로이드증, 맨틀-세포 림프종, 프로-림프구성/골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 소포성 림프종, NK-세포 백혈병 및 혈장-세포 백혈병을 포함하는 악성 혈액 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환의 치료에서 의약으로 사용하기 위한, 항체 또는 이의 단편 또는 이중특이적 항체.
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